KR20040031782A - 헤지호그 신호전달 경로의 조절물질, 이를 함유하는조성물 및 이의 용도 - Google Patents

헤지호그 신호전달 경로의 조절물질, 이를 함유하는조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function),smoothened기능 획득으로 인한 이상 성장 상태를 저해하는 방법과 시제에 관하는데, 상기 방법은 예로써 정상ptc경로를 항진하거나smoothened또는hedgehog활성을 길항하는 충분한 함량으로hedgehog길항제, 예를 들면 소형 분자를 이상 성장 상태의 세포와 접촉시키는 단계로 구성된다.

Description

헤지호그 신호전달 경로의 조절물질, 이를 함유하는 조성물 및 이의 용도{Mediators of Hedgehog Signaling Pathways, Compositions and Uses Related Thereto}
패턴 형성은 배아 세포가 분화된 조직의 정연한 공간적 정렬을 형성하는 활동이다. 고등 생물의 신체적 복잡성은 세포-내인성 계통 및 세포-외인성 신호전달의 상호작용을 통하여 배형성(embryogenesis)동안 발생한다. 유도성 상호작용은 체형(body plan) 최초 확립에서부터 장기 체계의 패턴화, 조직 분화동안 다양한 세포 유형의 발생까지 척추동물 발달에서 배아 패턴화(embryonic patterning)에 필수적이다(Davidson, E., (1990) Development 108: 365-389; Gurdon, J. B., (1992) Cell 68: 185-199; Jessell, T. M. et al., (1992) Cell 68: 257-270). 발달 세포 상호작용의 효과는 다양하다. 전형적으로, 반응 세포는 반응 세포의 유도되지 않은 상태와 유도된 상태 모두와 구별되는 세포를 유도함으로써 세포 분화의 한 경로에서 다른 경로로 전환시킨다(유도). 일부 경우에, 세포는 이웃 세포가 자신과 유사하게 분화되도록 유도한다; 다른 경우에, 세포는 이웃 세포가 자신과 유사하게 분화되는 것을 저해한다. 초기 발달에서 세포 상호작용은 연속적으로 진행되고, 따라서, 2가지 세포 유형간 최초 유도는 다양성의 점진적인 증폭을 결과한다. 게다가, 유도성 상호작용은 배아에서뿐만 아니라 성숙 세포에서도 진행되고, 형태형성 패턴(morphogenetic pattern)을 확립하고 유지하며 분화를 유도하는 기능을 할 수 있다(J. B. Gurdon (1992) Cell 68:185-199).
Hedgehog계통의 신호 분자 구성원은 무척추동물과 척추동물 발달동안 다수의 중요한 단기와 장기 패턴화 과정을 매개한다. 파리에서, 단일hedgehog유전자는 분절과 성충아(imaginal disc) 패턴화를 조절한다. 대조적으로, 척추동물에서,hedgehog유전자 계통은 좌우 비대칭(left-right asymmetry); CNS, 체절(somites), 손발에서 극성(polarity); 장기 생성(organogenesis); 연골세포 분화(chondrogenesis); 정자 형성(spermatogenesis)의 조절에 관여한다.
첫 번째hedgehog유전자는 초파리(Drosophila melanogaster)에서 유전자 선별로 동정되었다(Nusslein-Volhard, C. and Wieschaus, E. (1980) Nature 287, 795-801). 이런 선별에서 배아와 유충 발달에 영향을 주는 다수의 돌연변이가 확인되었다. 1992년과 1993년에, 초파리hedgehog(hh) 유전자의 분자구조가 보고되었고(C. F., Lee et al. (1992) Cell 71, 33-50), 이후, 여러hedgehog상동체가 다양한 척동물 종으로부터 분리되었다. 초파리 및 다른 무척추동물에서는 한 종류의hedgehog유전자가 확인된 반면, 척추동물에서는 복수의hedgehog유전자가 존재한다.
hedgehog유전자의 척추동물 계통에는 적어도 4가지 구성원, 예를 들면 단일 초파리hedgehog유전자의 파라로그(paralog)가 포함된다. 전형적인hedgehog유전자와 단백질은 PCT 출원 WO 95/18856과 WO 96/17924에서 기술한다.Deserthedgehog(Dhh);Sonic hedgehog(Shh);Indian hedgehog(Ihh)라고 하는 상기 구성원중 3가지는 어류, 조류, 포유동물을 비롯한 모든 척추동물에 존재한다.tiggie-winkle hedgehog(Thh)라고 하는 네 번째 구성원은 어류에 특이적인 것으로 보인다.Desert hedgehog(Dhh)는 생쥐 배아 발달 및 성숙 설치류와 인간 모두의 고환에서 일차적으로 발현된다;Indian hedgehog(Ihh)는 배형성동안 골 발달 및 성체에서 골형성에 관여한다;Shh는 전술한 바와 같이 형태형성과 신경유도 활성에 주로 관여한다. 척추동물 장기의 발달과 유지에서hedgehog폴리펩티드의 중요한 유도 역할을 고려하면,hedgehog상호작용 단백질의 동정은 임상과 연구 환경에 매우 중요하다.
다양한 hedgehog 단백질은 단일 펩티드, 고도로 보조된 N-말단 부위, 다소 변이성 C-말단 도메인으로 구성된다. 분비 경로에서 신호 서열 절단(Lee, J. J. et al. (1992) Cell 71: 33-50; Tabata, T. et al. (1992) Genes Dev. 2635-2645; Chang, D. E. et al. (1994) Development 120: 3339-3353) 이외에,hedgehog전구물질 단백질은 C-말단 영역에서 보조된 서열에 의존하는 내부 자가단백분해 절단(internal autoproteolytic cleavage)을 겪는다(Lee et al. (1994) Science266: 1528-1537; Porter etal. (1995) Nature 374: 363-366). 이런 자가절단은 19 kD N-말단 펩티드와 26-28 kD C-말단 펩티드를 결과한다(Lee etal. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra; Lee etal. (1994) supra; Bumcrot, D. A., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 2294-2303; Porter et al. (1995) supra; Bidder, S. C. et al. (1995) Curr. Biol. 5: 944-955; Lai, C. J. et al. (1995) Development 121: 2349-2360). N-말단 펩티드는 세포 표면에서 합성되고 여기에 단단하게 결합된 상태로 유지되는 반면, C-말단 펩티드는 시험관내와 생체내 모두에서 자유롭게 확산된다(Porter et al. (1995) Nature 374: 363; Lee etal. (1994) supra; Bumcrot et al. (1995) supra; Mart', E. etal. (1995) Development 121: 2537-2547; Roelink, H.et al. (1995) Cell 81: 445-455). 흥미롭게도, N-말단 펩티드의 세포 표면 유지는 자가절단에 의존하는데, 그 이유는 내부 절단의 정상 위치에서 정확하게 종결되는 RNA에 의해 인코드되는 HH의 절두형이 시험관내(Porter etal. (1995) supra) 및 생체내(Porter, J. A. et al. (1996) Cell 86,21-34)에서 확산가능하기 때문이다. 생화학적 연구에서 HH 전구물질 단백질의 자가단백분해 절단은 내부 티오에스테르 중간생성물을 통하여 진행되고, 상기 중간생성물은 이후 친핵성 치환으로 절단된다. 친핵체는 N-펩티드의 C-말단에 공유 결합하여(Porter et al. (1996) supra), 이를 세포 표면에 구속하는 소형 지질친화성 분자로 생각된다. 이의 생물학적 의미는 심대하다. 구속의 결과로, N-말단hedgehog펩티드의 높은 국소 농도가hedgehog생산 세포의 표면에서 발생한다. 이런 N-말단 펩티드는 초파리와 척추동물에서 단기와 장기hedgehog신호전달 활성에 필요충분하다(Porter et al. (1995) supra; Eldker et al. (1995) supra; Lai et al. (1995) supra; Roelink, H. etal. (1995) Cell 81: 445-455; Porter et al. (1996) supra: Fietz. M. J. etal. (1995) Curr. Biol. 5: 643-651; Fan, C.-M. et al. (1995) Cell 81: 457-465;Mart', E., et al. (1995) Nature 375: 322-325; Lopez-Martinez et al. (1995) Curr. Biol 5: 791-795; Ulcer, S. C. etal. (1995) Development 121: 2337-2347; Forbes, A. J. et al.(1996) Development 122: 1125-1135).
HH는 초파리 발달동안 다양한 부위에서 단기와 장기 패턴화 과정에 관여한다. 초기 배아에서 분절 극성의 확립동안 이는 직접 매개되는 것으로 생각되는 단기 효과를 유도하는 반면, 성충아의 패턴화에서 이는 이차 신호의 유도를 통하여 장기 효과를 유도한다.
척추동물에서, 과거 수년동안 여러hedgehog유전자가 클론되었다. 이들 유전자 중에서Shh가 실험적으로 가장 많은 주목을 받았는데, 그 이유는 상기 유전자가 이웃 조직을 패턴화시키는 신호의 출처인 서로 다른 형성 부위(organizing center)에서 발현되기 때문이다. 최근의 증거는SHH가 이들 상호작용에 관여한다는 것을 시사한다.
SHH의 발현은 추정 중선 중배엽; 생쥐(Chang et al. (1994) supra; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75: 1417-1430), 쥐(Roelink, H. et al. (1994) Cell 76: 761-775), 병아리(Riddle, R. D. et al. (1993) Cell 75: 1401-1416)의 결절; 제브라피시(zebrafish)의 실드(Ekker et al. (1995) supra; Krauss, S. etal.(1993) Cell 75: 1431-1444)에서 낭배형성(gastrulation)의 개시 직후에 시작된다. 병아리 배아에서, 결절에서Shh발현 패턴은 좌우 비대칭이 발생하고, 이것이 심장의 좌우 정상 위치를 유도하는 것으로 생각된다(Levin, M. et al. (1995) Cell 82: 803-814).
CNS에서, 척색(notochord)과 상판(floorplate)으로부터 유래된Shh는 복부 세포 죽음을 유도하는 것으로 생각된다. 이소성으로 발현된 SHH는 쥐(Echelard et al. (1993) supra; Goodrich, L. V. et al. (1996) Genes Dev. 10: 301-312), 제노푸스(Xenopus)(Roelink, H. et al. (1994) supra; Ruiz i Altaba, A. et al. (1995) Mol. Cell. Neurosci. 6:106-121), 제브라피시(zebrafish)(EKKer et al. (1995) supra; Krauss et al. (1993) supra; Hammerschmidt, M., et al.(1996) Genes Dev. 10: 647-658)의 중뇌와 후뇌에서 넓은 영역의 벤트럴라이제이션(ventralization)을 유도한다. 척색 수준에서 중간 신경외배엽(neuroectoderm)의 외식체에서,Shh단백질은 분명한 농도 역치로 상판과 운동 신경원 발달(높은 농도에서 상판, 좀더 낮은 농도에서 운동 신경원)을 유도한다(Roelink etal. (1995) supra; Mart'et al. (1995) supra; Tanabe, Y. etal. (1995) Curr. Biol. 5: 651-658). 게다가, 항체 차단은 척색에 의해 생산된Shh가 운동 신경원 죽음의 척색-매개된 유도에 요구된다는 것을 암시한다(Mart'et al. (1995) supra). 이런 이유로,Shh-생산 중선 세포의 표면에서 높은 농도의Shh는 시험관내에서 관찰되는 상판의 접촉-매개된 유도(Placzek, M. et al. (1993) Development 117: 205-218) 및 생체내에서 척색 바로 위에 상판의 중선 위치 정립의 원인이 되는 것으로 생각된다. 척색과 상판으로 방출된 좀더 낮은 농도의Shh는 시험관내에서 접촉-독립된 과정으로 좀더 원부의 배쪽외측(ventrolateral) 영역에서 운동 신경원을 유도하는 것으로 추정된다(Yamada, T. et al.(1993) Cell 73: 673-686). 중뇌와 후뇌 수준에서 채취된 외식체에서도Shh는 적절한 배쪽외측 신경원 세포형, 각각 도파민성 전구물질(Heynes, M. et al. (1995) Neuron 15: 35-44; Wang, M. Z. etal. (1995) Nature Med. 1: 1184-1188) 및 콜린성 전구물질(Ericson, J. et al. (1995) Cell 81: 747-756)을 유도하는데, 이는Shh가 CNS의 전체 범위에서 복부 특정화의 공통 유도물질임을 시사한다.
또한, 중선으로부터 유래된Shh는 척추동물 배아의 측옆 영역, 뇌랑간(trunk)에서 체절(Fan et al. (1995) supra), 체절의 머리 중간엽 입쪽(Hammerschmidt etal. (1996)supra)을 패턴화시킨다. 병아리와 생쥐 측옆 중배엽 외식체에서,Shh는 피부근절(dermamyotomal) 마커Pax3을 희생하고Paxl와Twist와 같은 경절(sclerotome) 특이적 마커의 발현을 촉진한다. 게다가, 필터 장벽 실험은Shh가 이차 신호전달 경로의 활성화보다는 직접적으로 경절의 유도를 매개한다는 것을 암시한다(Fan, C. -M. and Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79,1175-1186).
최근 실험에서 드라소필라 윈그레스(Drosophila wingless)의 척추동물 상동체인 WNT 계통의 구성원이 공동으로 요구되는 것으로 나타났긴 하지만(Munsterberg etal. (1995) supra),Shh는 근절 유전자 발현을 또한 유도한다(Hammerschmidt et al. (1996) supra; Johnson, R. L. et al. (1994) Cell 79: 1165-1173;Miinsterberg, A. E. et al. (1995) Genes Dev. 9: 2911-2922; Weinberg, E. S. et al. (1996) Development 122: 271-280). 당혹스럽게도, 경절이 척색에 훨씬 근접하여 위치하는 체절 세포로부터 기원하긴 하지만, 병아리에서 근절 유도는 경절 마커의 유도보다 높은Shh농도를 요구한다(Munsterberg etal. (1995) supra). 제브라피시에서 유사한 결과가 달성되었는데, 여기서 높은 농도의 hedgehog는 근절을 유도하고 경절 마커 유전자 발현을 억제한다(Hammerschmidt etal.(1996) supra). 하지만, 이들 결과는 유양막류(amniotes)와는 대조적으로 어류 배아의 체계와 일치하는데, 그 이유는 근절이 체절의 현저한 좀더 축성의 구성요소이기 때문이다. 이런 이유로,Shh신호전달의 조절과 새로운 신호전달 인자의 획득은 척추동물 진화동안 체절 구조를 변화시켰다.
후배부 중간엽 세포의 아단위인 척추동물 지아(limb bud)에서, "극성 활성 지역"(Zone of polarizing activity)(ZPA)은 전후방 디지트 동일성(digit identity)을 조절한다(reviewed in Honig, L. S. (1981) Nature 291: 72-73).Shh의 이소성 발현 또는Shh펩티드에 스며든 비드의 적용은 전방 ZPA 이식편의 효과를 모방하고 디지트의 거울상 중복을 발생시킨다(Chang et al. (1994) supra; Lopez Martinez et al. (1995) supra; Riddle et al. (1993) supra)(도 2g). 이런 이유로, 다른 신호가 AP 패턴화에 요구되는 상당한 거리(100-150 ㎛)에서 정보를 전달할 수 있긴 하지만, 디지트 상동성은Shh농도에 주로 의존하는 것으로 생각된다. 초파리 성충아에서 HH와 DPP의 상호작용과 유사하게, 척추동물 지아에서Shh는 dpp 상동체인Bmp2의 발현을 활성화시킨다(Francis, P. H. etal. (1994)Development 120: 209218). 하지만, 초파리에서 DPP와 달리,Bmp2는 병아리 지아에서 이소성 적용직후에Shh의 극성 효과를 모방하지 않는다(Francis etal. (1994) supra). 전후방 패턴화 이외에,Shh는 후방 전단엽배영릉(posterior apicalectodermal ridge)에서 섬유아세포 성장 인자 FGF4의 합성을 유도함으로써 손발의 근처-원처 외생(proximodistal outgrowth) 조절에도 관여하는 것으로 보인다(Laufer, E. et al. (1994) Cell 79: 993-1003; Niswander, L. et al.(1994) Nature 371: 609-612).
hedgehog 단백질과 BMP의 밀접한 상관관계는 척추동물hedgehog발현의 상당한 부위에서 보존되는 것으로 생각된다. 가령, 병아리 후장(hindgut)에서Shh는 다른 척추동물dpp상동체인Bmp4의 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Roberts, D. J. et al. (1995) Development 121: 3163-3174). 더 나아가,Shh과Bmp2,4또는6은 위, (비뇨생식기관), 폐, 치아순(tooth bud), 모낭의 상피와 중간엽 세포에서 발현에 현저한 상관관계를 보인다(Bitgood, M. J. and McMahon, A. P. (1995) Dev. Biol. 172: 126-138). 이에 더하여, 2가지 다른 생쥐hedgehog유전자중 하나인Ihh는 장 및 발달중인 연골에서Bmp발현 세포에 인접하여 발현된다(Bitgood and McMahon (1995) supra).
최근의 증거는Ihh가 연골세포 발달의 조절에 중요한 역할을 하는 한가지 모델을 암시한다(Roberts etal. (1995) supra). 연골 형성동안, 연골세포는 중간 전비후성(prehypertrophic) 단계를 통하여, 증식 상태에서 분화된 비후성(hypertrophic) 연골세포로 진행한다.Ihh는 전비후성 연골세포에서 발현되고 연골세포 분화의 차단을 유도하는 신호전달 캐스케이드를 개시한다. 이의 직접적인 표적은Ihh발현 도메인 주변에서 연골막(perichondrium)인데, 이는hedgehog신호의 보존된 전사 표적인Gli와Patched(Ptc)의 발현으로 반응한다. 이는 관절주위(periarticular) 연골막에서 부갑상선 호르몬-관련된 단백질(PTHrP)의 합성을 결과하는 이차 신호를 유도할 가능성이 높다. PTHrP 자체는 전비후성 연골세포에 역으로 신호하여 이들의 추가 분화를 차단한다. 동시에, PTHrP는Ihh의 발현을 억제하여 연골세포 분화의 속도를 조절하는 네거티브 피드백 고리(negative feedback loop)를 형성한다.
Patched는 배아의 전후방 축을 따라 동족 계열(homologous series)로 발생하는 개별 분절내에서 세포 분화에 영향을 주는 일군의 발달 유전자중 하나인 분절 극성 유전자로서 초파리에 처음 동정되었다(Hooper, J. E. et al. (1989) Cell 59:751; Nakano, Y. et al.(1989) Nature 341: 508).Patched의 척추동물 상동체의 발현 패턴은 신경관(neural tube), 골격, 손발, 악안면(craniofacial) 구조, 피부의 발달에 관여를 암시한다.
유전적ㆍ기능적 연구에서patched는 다수 하류 유전자의 발현을 조절하는 진화적으로 보존된 경로인hedgehog신호전달 경로의 일부인 것으로 확인되었다(Perrimon, N. (1995) Cell 80: 517; Perrimon, N. (1996) Cell 86: 513).Patched는 표적 유전자의 구성적 전사 억제에 참여한다; 이의 효과는 전사 활성화를 유도하는hedgehog에 의해 인코드되는 분비된 당단백질, 또는 척추동물 상동체에 의해 상쇄된다. 이런 경로에 의해 조절되는 유전자에는 Wnt와 TGF-베타계통의 구성원이 포함된다.
Patched단백질은 2개의 대형 세포외 도메인, 12개의 막통 분절, 여러 세포질 분절을 보유한다(Hooper, supra; Nakano, supra; Johnson, R. L. et al. (1996) Science 272: 1668; Hahn, H. et al.(1996) Cell 85: 841).hedgehog신호전달 경로에서patched의 생화학적 역할은 분명하지 않다. 하지만, hedgehog 단백질과의 직접적인 상호작용이 보고되었고(Chen, Y. et al. (1996) Cell 87: 553),patched는smoothened유전자에 의해 인코드되는 다른 막통 단백질과 함께hedgehog수용체 복합체에 참여할 수 있다(Perrimon, supra; Chen, supra).
최근에patched의 사람 상동체가 최근에 클론되었는데, 이는 크로모좀 9q22.3에 위치하였다(Johnson, supra; Hahn, supra). 상기 영역은 늑골과 악안면 변형, 손발의 비정상, 이분 척추증(spina bifida)으로 특성화되는 기저 세포 모반 증후군(BCNS)에 관여하였다.
BCNS은 다중 종양 유형, 특히 신체의 여러 부위에서 발생하고 생후 첫 20년동안 나타나는 기저 세포 암종(BCC)의 소인이다. 하지만, 대부분의 BCC 사례는 상기 증후군과 무관하고 북유럽 출신의 일부 중년이나 노인에서 일광-노출된 부위에 산발적으로 발생한다.
BCNS-관련된 산발성 BCC에 관한 최근의 연구에서Patched의 양 대립유전자의 기능적 상실이 BCC의 발병을 초래하는 것으로 나타났다(Johnson, supra; Hahn, supra; Gailani, M. R. et al. (1996) Nature Genetics 14: 78). 크로모좀 9q22.3의 단일 대립유전자 결실은 산발성과 유전성 BCC 모두에서 빈번하게 발생한다. 연쇄 분석에서 BCNS 환자의 종양에서 유전된 결함성 대립유전자는 유지되고 정상 대립유전자는 상실되는 것으로 밝혀졌다.
산발성 종양 역시patched의 양 기능성 대립유전자의 상실을 보였다. 단일 가닥 형태 다형성(single strand conformational polymorphism) 스크리닝 분석으로patched돌연변이가 확인된 12가지 종양 중에서, 9가지는 제 2 대립유전자의 크로모좀 결실을 보였고 다른 3가지는 양 대립유전자에서 불활화 돌연변이를 보였다(Gailani, supra). 이런 변형은 상응하는 생식세포 DNA에서 발생하지 않았다.
확인된 대부분의 돌연변이는 미성숙 종결 코돈 또는 구조 이동(frame shift)을 결과하였다(Lench, N. J., et al., Hum. Genet. 1997 Oct; 100(5-6): 497-502). 하지만, 일부는 세포외 또는 세포질 도메인에서 아미노산 치환을 유도하는 점 돌연변이였다. 이들 돌연변이 부위는 세포외 단백질, 또는 하류 신호전달 경로의 세포질 구성원과의 상호작용에 기능적 중요성을 시사한다.
유전자 발현의 저해에patched의 관여 및 BCC에서 빈번한 대립유전자 결실의 발생은 상기 유전자의 종양 억제 기능을 뒷받침한다. 세포 신호전달과 세포내 전달에 관여하는 것으로 알려진 유전자 계통의 조절에서 이의 역할은 종양 억제의 가능 기전을 제공한다.
본 발명의 요약
본 발명은hedgehog신호전달 경로의 활성화, 예를 들면ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function),smoothened기능획득과 같은 표현형으로 기인하는 이상 성장 상태를 저해하는 방법과 시제에 관하는데, 상기 방법은 예로써 이상 성장 상태를 역전시키거나 조절하기 위하여 정상ptc활성을 항진하거나, 정상hedgehog활성을 길항하거나, 또는smoothened활성을 길항하는 충분한 함량으로 소형 분자와 같은 작용제를 이상 성장 상태 세포와 접촉시키는 단계로 구성된다.
본 발명은ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog(헤지호그) 기능 획득(gain-of-function),smoothened기능 획득으로 인한 이상 성장 상태를 저해하는 방법과 시제에 관하는데, 상기 방법은 예로써 정상ptc경로를 항진하거나smoothened또는hedgehog활성을 길항하는 충분한 함량으로hedgehog길항제, 예를 들면 소형 분자를 이상 성장 상태의 세포와 접촉시키는 단계로 구성된다.
도 1-31에서는 본 발명에 따른 화합물을 합성하는데 유용한 반응을 도시한다.
도 32a-j에서는 본 발명에 따른 대표적인 화합물을 도시한다.
도 33에서는 사람 기저 세포 암종(BCC)에서hedgehog신호전달에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과를 도시한다.
도 34에서는 BCC 조직에서 아폽토시스에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과를 도시한다.
도 35에서는 S-12와 HT-29 세포에서hedgehog신호전달에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과를 도시한다.
도 36에서는 PC-3과 RT-4 세포에서hedgehog신호전달에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과를 도시한다.
도 37에서는 세포에서hedgehog활성을 평가하는데 사용되는 프로브와 프라이머의 서열을 제시한다.
도 38과 40에서는 pct-무효 세포에서 GLI-1과 GAPDH 발현에 대한 본 발명에따른 화합물의 차별적 효과를 도시한다.
도 39와 41에서는 HEPM 세포에서는 GLI-1과 GAPDH 발현에 대한 본 발명에 따른 화합물의 차별적 효과를 도시한다.
I. 개요
본 발명은hedgehog,patched(ptc),gli및/또는smoothened에 의해 조절되는 신호 전달 경로가 소형 분자에 의해 적어도 부분적으로 저해될 수 있다는 사실에 관한다. 임의의 특정 이론에 제한됨없이, 수용체의 활성화는 이들 작용제가 작용하는 기전일 수 있다. 가령,patched기능 상실(ptclof) 세포의 증식을 저해하는 이들 작용제의 능력은hedgehog,patched(ptc) 또는smoothened와 상호작용하거나, 또는edgehog,patched(ptc) 및/또는smoothened-매개된 신호 전달 경로를 활성화시키는 단백질의 능력을 적어도 간섭하는 이런 분자의 능력에 기인할 수 있다.
따라서,hedgehog,patched(ptc) 또는smoothened신호 전달 활성을 간섭하는 이들 소형 분자는 정상 세포 및/또는patched기능 상실,hedgehog기능 획득(gain-of-function) 또는smoothened기능 획득을 보유하는 세포에서 증식(또는 다른 생물학적 결과)을 저해하는 것으로 사려된다. 따라서, 특정 구체예에서 이들 화합물은 정상 세포, 예를 들면hedgehog경로를 활성화시키는 유전자 돌연변이가 없는 세포에서hedgehog활성을 저해하는데 유용할 것으로 사려된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 저해물질은 2500 미만 amu, 적절하게는 1500 amu 미만,좀더 적절하게는 750 미만 amu의 분자량을 갖는 유기 분자이며, 특히 표적 세포에서 hedgehog 단백질의 생물학적 활성중 적어도 일부를 저해할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function) 또는smoothened기능 획득의 표현형을 보유하는 세포뿐만 아니라 정상 세포, 조직, 장기를 비롯한 다양한 범위의 세포, 조직, 장기의 회복 및/또는 기능적 수행의 조절에서, 예로써 신호 경로의smoothened또는 하류 성분의 활성화를 저해함으로써hedgehog신호전달의ptc저해를 항진하는 소형 분자의 사용을 수반한다. 가령, 본 발명에 따른은 신경 조직의 조절; 골과 연골세포의 생성과 회복; 정자 형성(spermatogenesis)의 조절; 평활근의 조절; 폐, 간 및 원시 장관(primitive gut)으로부터 기원하는 다른 장기의 조절; 조혈 기능의 조절; 피부와 머리카락 성장의 조절 등의 치료와 미용 용도로 이용된다. 이에 더하여, 본 발명은 배양중인 세포(시험관내) 또는 동물 세포(시험관내)에서 실시될 수 있다(WO 95/18856; WO 96/17924).
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른은ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function) 또는smoothened기능 획득의 표현형을 보유하는 상피 세포를 치료하는데 이용될 수 있다. 가령, 본 발명에 따른은 기저 세포 암종 또는 다른hedgehog경로-관련된 질환을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은smoothened에 결합함으로써hedgehog경로의 활성화를 저해한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 길항제는patched에 결함함으로써hedgehog경로의 활성화를 저해한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 악성 속질모세포종(medulloblastoma) 및 다른 원시 CNS 악성 신경외배엽 종양에 대한 치료 섭생의 일부로 이용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function) 또는smoothened기능 획득의 증식이나 다른 생물학적 결과를 생체내에서 저해할 만큼 충분한 함량으로hedgehog길항제,ptc항진제 또는smoothened길항제를 활성 성분으로 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다.
hedgehog길항제,ptc항진제 또는smoothened길항제를 이용한 치료는 사람과 동물 개체 모두에 효과적일 수 있다. 본 발명이 적용될 수 있는 동물 개체는 애완용이나 상업용으로 사육되는 가축과 가금까지 확대된다. 이의 예는 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소이다.
Ⅱ. 정의
유전자의 "이상 변형 또는 돌연변이"는 유전자에서 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 부가와 같은 유전자 손상; 유전자의 전체 크로모좀 전위; 또는 유전자의 비정상적 메틸화를 의미한다. 유사하게, 유전자의 이상-발현은 유사한 조건하에 정상 세포에서 수준과 비교하여 유전자의 비정상적 전사 수준 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 비-야생형 절단접합을 의미한다.
"기저 세포 암종"은 결절성-궤양성 표면 착색된 반사경피증유사 섬유상피증 및 모반 증후군과 같은 다양한 임상적ㆍ조직학적 형태로 존재한다. 기저 세포 암종은 사람에서 가장 일반적으로 발견되는 피부 신생물이다. 새로운 비흑색종 피부암 사례의 대부분이 이 범주에 속한다.
"화상"은 피부의 많은 표면 부위가 열 및/또는 화학약품으로 인하여 개체로부터 제거되거나 손실되는 사례를 의미한다.
"암종"은 주변조직을 침투하고 전이를 유발하는 경향이 있는 상피 세포로 구성되는 악성 신성장(new growth)을 의미한다.
전형적인 암종은 다음과 같다: 좀처럼 전이하지 않으면서 국소 침입과 파괴의 잠재력이 있는 피부의 상피 종양인 "기저 세포 암종"; 편평 상피로부터 기원하고 입방형 세포를 보유하는 암종인 "편평 세포 암종"; 암종과 육종 조직으로 구성되는 악성 종양을 수반하는 "암육종"; 젖샘과 침샘 및 호흡기의 점액샘에서 발생하고 소형 상피 세포의 네스트나 코드에 의해 분리되거나 둘러싸인 유리나 점액성 실질의 실린더 또는 밴드로 특성화되는 암종인 "아데노낭포성 암종"; 표피에서와 동일한 방식으로 분화하는 경향이 있는, 다시 말하면 바늘모양 세포를 형성하고 각질화(cornification)되는 경향이 있는 암성 세포인 "표피양 암종"; 코 뒷공간의 상피 내층에서 발생하는 악성 종양인 "비인후 암종"; 다양하게 배열된 관상 세포로 구성되는 신실질(renal parenchyma)의 암종과 관련된 "선세포 암종". 다른 암종 상피 성장은 상피로부터 유래되고 파필로마바이러스를 원인균으로 하는 양성 종양인 "유두종" 및 신경구(neural groove)의 폐쇄 시점에서 외배엽 요소의 봉입에 의해 생성된 대뇌 또는 뇌막 종양인 "표피양종"이다.
"진피"는 밀집된 혈관 결합 조직으로 구성되고 신경과 감각 말단 기관을 포함하는 표피에 깊이 파묻힌 피부층을 의미한다. 모근 및 피지선과 땀샘은 진피에 깊이 파묻힌 표피 구조이다.
"치아 조직"은 입에서 상피 조직과 유사한 조직, 예를 들면 잇몸 조직을 의미한다. 본 발명의 방법은 치주 질환을 치료하는데 유용하다.
"진피 궤양"은 염증으로 인한 조직의 표면 상실로 야기된 피부 병소를 의미한다. 본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 진피 궤양에는 욕창 궤양, 당뇨병성 궤양, 정맥성 울혈 궤양, 동맥성 궤양이 포함된다. 욕창은 장기간동안 피부 부위에 가해지는 압력으로 인한 만성 궤양을 의미한다. 정맥성 울혈 궤양은 결함성 정맥으로 혈액이나 다른 유체의 정체에 기인한다. 동맥성 궤양은 혈류가 불량한 동맥 주변에서 괴사된 피부를 의미한다.
ED50은 최대 반응이나 효과의 50%를 유도하는 약물 용량을 의미한다.
예로써hedgehog길항제의 "효과량"은 본 발명의 치료 방법과 관련하여, 원하는 용량 섭생의 일부로 도포될 때 치료 질환 또는 미용 목적으로 임상적으로 수용가능한 기준에 따라 세포 증식의 속도, 세포 분화의 상태 및/또는 세포의 생존 비율을 변화시키는 제제내에서 길항제의 함량을 의미한다.
"상피"는 샘 및 이로부터 유래된 다른 구조, 예를 들면 각막, 식도, 표피, 모낭 상피 세포를 비롯한 내부와 외부 신체 표면(피부, 점막, 장액)의 세포 덮개를 의미한다. 다른 전형적인 상피 조직은 다음과 같다: 비강의 후각 영역에 정렬되고 후각 수용체를 보유하는 거짓중층 상피인 후각 상피; 분비 세포로 구성되는 상피인샘 상피; 편평한 판-유사 세포로 구성되는 상피인 편평 상피. 상피에는 수축과 팽창으로 인해 상당한 물리적 변화를 받는 특징적인 내층의 유강 기관, 예를 들면 중층 편평 세포와 원주 상피 사이에서 이행하는 조직과 같은 이행 상피 역시 포함된다.
"상피화(epithelialization)"는 껍질이 벗겨진 표면에서 상피 조직의 성장에 의한 치료를 의미한다.
"표피선"은 표피와 결합하고 일상적인 대사 요구와 무관한 물질을 분비하거나 배출하도록 전문화된 세포의 응집을 의미한다. 가령, "피지선"은 기름 물질과 피지를 분비하는 진피에서 전분비선이다. "땀샘"은 땀을 분비하고 진피나 피하 조직에 위치하며 신체 표면에서 도관에 의해 개방되는 샘을 의미한다.
"표피"는 배자외배엽으로부터 유래되는 0.07-1.4 ㎜ 두께의 최외각의 비혈관 피부층을 의미한다. 손바닥과 발바닥에서, 표피는 외부로부터 5개 층으로 구성된다: 직각으로 배열된 원주 세포로 구성되는 기저층; 짧은 가시를 보유하는 편평 다각형 세포로 구성되는 유극층; 편평 과립 세포로 구성되는 과립층; 핵이 불분명하거나 부재하는 맑고 투명한 세포의 여러 층으로 구성되는 투명층; 편평하고 각화된 비핵 세포로 구성되는 각질층. 전신의 표피에는, 투명층이 일반적으로 부재한다.
"외상"에는 피부 상피층에서 손상된 상처, 벗겨짐, 베인 상처, 찔린 상처 또는 열상이 포함되는데, 이는 진피층 및 심지어 피하 지방 이상까지 확대될 수 있다.
세포의 "성장 상태"는 세포의 증식 속도 및/또는 세포의 분화 상태를 의미한다. "변형된 성장 상태"는 비정상적인 증식 속도로 특성화되는 성장 상태, 예를 들면 정상 세포와 비교하여 증가되거나 감소된 증식 속도를 보이는 세포이다.
"머리카락"은 실과 유사한 구조, 특히 각질로 구성되고 진피에 매몰된 유두(papilla)로부터 발생하며 포유동물에서만 특징적으로 만들어지는 분화된 표피 구조를 의미한다. 또한, "머리카락"은 이런 머리카락의 집합체를 의미한다. "모낭"은 머리카락을 둘러싸고 있으며 머리카락이 성장하는 표피의 관상-함입(invagination)중 하나를 의미한다. "모낭 상피 세포"는 모낭에서 진피 유도를 둘러싸는 상피 세포, 예를 들면 줄기 세포, 외모근초, 기질 세포, 내모근초를 의미한다. 이런 세포는 정상적인 비-악성 세포, 또는 형질전환된/영속화된 세포이다.
"hedgehog길항제"는 표적 유전자의 전사를 억제하기 위하여patched의 생활성을 가능하게 하거나 또는 재현하는 작용제를 의미한다. 바람직한hedgehog길항제는ptc기능 상실 및/또는smoothened기능 획득을 극복하는데 사용될 수 있는데, 후자는smoothened길항제라고 한다. 본원에서'hedgehog길항제'는hedgehog단백질의 정상적인 기능을 직접적으로 저해하는 작용제뿐만 아니라 hedge 신호전달 경로를 저해하여ptc의 기능을 재현시키는 작용제를 의미한다.
"hedgehog기능 획득"은ptc유전자,hedgehog유전자 또는smoothened유전자의 비정상적 변형이나 돌연변이, 또는 상기 유전자의 발현 수준 감소(또는 상실)를 의미하는데, 이는 세포와 hedgehog 단백질의 접촉을 공통하는 표현형, 예를 들면 hedgehog 경로의 비정상적 활성화를 결과한다. 기능 획득에는 Ci 유전자, 예를들면Gli1,Gli2,Gli3의 발현 수준을 조절하는ptc유전자 산물의 능력 상실이 포함된다. 또한, 'hedgehog기능 획득'은hedgehog자체의 변형이나 돌연변이를 비롯하여 hedgehog 신호 전달 경로에서 변형으로 발생하는 유사한 세포 표현형(예, 과도한 증식을 보이는 표현형)을 의미한다. 가령, hedgehog 신호 전달 경로의 활성화로 인한 비정상적으로 높은 증식 속도를 갖는 종양 세포는 상기 세포에서hedgehog가 변이되지 않는다 하더라도 'hedgehog기능 획득'표현형을 갖게 된다.
본원에서 "영속화된 세포"는 배양중에 무제한적 분열을 통하여 성장하는 능력을 갖도록 화학적 및/또는 재조합 수단으로 변형된 세포를 의미한다.
"내부 상피 조직"은 피부에서 표피층과 유사한 특징을 갖는 체내 조직을 의미한다. 이의 한가지 예는 장의 내층(lining)이다. 본 발명의 방법은 특정한 내부 상처, 예를 들면 수술로 인한 상처의 회복을 촉진하는데 유용하다.
"각화증"은 표피 각질층의 과형성으로 특성화되는 증식성 피부 질환을 의미한다. 전형적인 각화 질환은 모낭 각화증, 수장족 저각화증, 인두 각화증, 모공 각화증, 화학선 각화증 등이다.
"LD50"은 검사 개체의 50%를 치사시키는 약물의 용량을 의미한다.
"손톱"은 손가락이나 발가락 말단의 등면에서 각질성 피부 플레이트를 의미한다.
"patched기능 상실(loss-of-function)"은ptc유전자의 비정상적 변형이나 돌연변이, 또는 상기 유전자의 발현 수준 감소를 의미하는데, 이는 세포와hedgehog 단백질의 접촉을 공통하는 표현형, 예를 들면 hedgehog 경로의 비정상적 활성화를 결과한다. 기능 상실에는 Ci 유전자, 예를 들면Gli1,Gli2,Gli3의 발현 수준을 조절하는ptc유전자 산물의 능력 상실이 포함된다. 또한, 'ptc기능 상실'은ptc자체의 변형이나 돌연변이를 비롯하여 hedgehog 신호 전달 경로에서 변형으로 발생하는 유사한 세포 표현형(예, 과도한 증식을 보이는 표현형)을 의미한다. 가령, hedgehog 신호 전달 경로의 활성화로 인한 비정상적으로 높은 증식 속도를 갖는 종양 세포는 상기 세포에서ptc가 변이되지 않는다 하더라도 'ptc기능 상실'표현형을 갖게 된다.
본 발명의 방법으로 치료되는"환자" 또는 "개체"는 사람 또는 사람아닌 동물을 의미한다.
"프로드러그"는 생리 조건하에 본 발명의 치료 활성제로 전환되는 화합물을 의미한다. 프로드러그를 제조하는 일반적인 방법은 생리 조건하에 가수분해되어 원하는 분자를 노출시키는 선택된 성분을 포함시키는 것이다. 다른 구체예에서, 프로드러그는 숙주 동물의 효소 활성으로 전환된다.
본원에서 "증식"은 유사분열을 겪고 있는 세포를 의미한다.
본원에서 "증식성 피부 질환"은 피부 조직의 원치않거나 비정상적인 증식으로 특성화되는 피부의 질환을 의미한다. 이들 질환은 표피 세포 증식 또는 불완전 세포 분화로 특성화되고, 예로써 반성 어린선(X-linked ichthyosis), 건선, 아토피 피부염, 알레르기 접촉 피부염, 표피 박리성 과각화증(epidermolytic hyperkeratosis), 지루성 피부염 등이 포함된다. 가령, 표피이상증은 표피의 불완전한 발달의 일형이다. 다른 예는 "표피 박리증"인데, 이는 자발적으로 또는 외상 부위에서 물질과 수포의 형성으로 인한 표피의 성긴 상태를 의미한다.
본원에서 "건선"은 피부의 조절 기전을 변화시키는 과증식성 피부 질환을 의미한다. 특히, 표피 증식, 피부의 염증 반응, 림포카인과 염증 인자와 같은 조절 분자의 발현에서 일차와 이차 변형을 수반하는 병소가 형성된다. 건선 피부는 표피 세포의 증가된 턴오버(turnover), 두터워진 표피, 비정상적 각질화, 진피층으로 염증성 세포 침윤물, 기저 세포 주기를 증가시키는 표피층으로 다형핵 백혈구 침윤으로 형태적으로 특성화된다. 이에 더하여, 과각화성 세포와 부각화성 세포가 존재한다.
"피부"는 진피와 표피로 구성되는 신체의 외부 보호 덮개이며, 모낭 구조뿐만 아니라 땀샘과 피지선을 포괄한다.
"smoothened기능 획득"은smo유전자의 비정상적 변형이나 돌연변이, 또는 상기 유전자의 발현 수준 증가를 의미하는데, 이는 세포와 hedgehog 단백질의 접촉을 공통하는 표현형, 예를 들면 hedgehog 경로의 비정상적 활성화를 결과한다.ptc는 세포로 직접 신호하지 않고hedgehog신호전달에서ptc의 하류에 위치하는 다른 막-결합된 단백질인smoothened와 상호작용하는 것으로 보고되었다(Marigo et al., (1996) Natue 384: 177-179).smo유전자는 초파리에서 각 분절의 정확한 패턴화에 요구되는 분절-극성 유전자이다(Alcedo et al., (1996) Cell 86: 221-232).smo의 사람 상동체가 동정되었다(Stone et al.(1996) Nature 384: 129-134; GenBank accession U84401).smoothened유전자는 헤테로삼량체형 G-단백질-결합된 수용체, 다시 말하면 7-막통 영역의 특징을 갖는 내재성 막 단백질을 인코드한다. 상기 단백질은 초파리wingless경로의 구성원인Frizzled(Fz) 단백질에 상동성을 보인다. 초기에는smo가 Hh 신호의 수용체를 인코드하는 것으로 생각되었다. 하지만, 이런 제안은ptc가 Hh 수용체라는 증거가 나오면서 반증되었다.smo를 발현하는 세포는 Hh에 결합하지 않는데, 이는smo가 Hh와 직접적으로 상호작용하지 않음을 시사한다(Nusse, (1996) Nature 384: 119-120). 오히려,Sonic hedgehog(SHH)의 수용체PTCH에 대한 결합이 7-막통 단백질인smoothened(SMO)의PTCH에 의한 정상적인 저해를 예방하는 것으로 생각된다.
최근에, 활성화smoothened돌연변이가 산발성 기저 세포 암종(Xie et al. (1998) Nature 391: 90-2) 및 중추 신경계의 원시 신경외배엽 종양(Reifenberger et al.(1998) Cancer Res 58: 1798-803)에서 발생하는 것으로 보고되었다.
"치료 지수"는 LD50/ED50으로 정의되는 약물의 치료 지수를 의미한다.
본원에서 "형질전환된 세포"는 억제되지 않는 성장 상태로 자발적으로 전환되는 세포를 의미한다, 다시 말하며 이들은 배양중에 무제한적 분열을 통하여 성장하는 능력을 획득한다. 형질전환된 세포는 성장 조절의 상실과 관련하여, 신생물, 미분화 및/또는 과형성과 같은 용어로 특성화된다.
"아실아미노"는 다음의 화학식으로 표시된다:
여기서, R9는 앞서 밝힌 바와 동일하고, R'11은 수소, 알킬, 알케닐 또는 -(CH2)m-R8(m과 R8은 앞서 밝힌 바와 동일하다)이다.
"지방족 작용기"는 직쇄, 분지쇄 또는 환형 지방족 탄화수소를 의미하며, 여기에는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기와 같은 포화와 불포화 지방족 작용기가 포함된다.
"알케닐"과 "알키닐"은 앞서 밝힌 알킬에서와 길이가 유사하고 치환이 가능하지만 각각 적어도 하나의 이중이나 삼중 결합을 보유하는 불포화 지방족 작용기를 의미한다.
본원에서 "알콕실"또는 "알콕시"는 앞서 정의한 바와 같이 산소 라디칼이 부착된 알킬기를 의미한다. 대표적인 알콕실기는 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, tert-부톡시 등이다. "에테르"는 산소에 의해 공유결합된 2개의 탄화수소이다. 따라서, 알킬을 에테르로 변화시키는 알킬의 치환체는 알콕실이며, 이는 -O-알킬, -O-알케닐, -O-알키닐, -(CH2)m-R8(m과 R8은 앞서 밝힌 바와 동일하다)중 하나로 표시될 수 있다.
"알킬"은 직쇄 알킬기, 분지쇄 알킬기, 사이클로알킬(지환족)기, 알킬-치환된 사이클로알킬기, 사이클로알킬-치환된 알킬기를 비롯한 포화 지방족 작용기의 라디칼을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 직쇄나 분지쇄 알킬은 골격에 30개 이하의 탄소 원자(예, 직쇄의 경우 C1-C30, 분지쇄의 경우 C3-C30), 적절하게는 20개 이하의 탄소 원자를 보유한다. 유사하게, 바람직한 사이클로알킬은 고리 구조에 3-10개의 탄소 원자, 적절하게는 고리 구조에 5, 6 또는 7개의 탄소 원자를 보유한다.
이에 덧붙여, 본 발명의 상세한 설명, 실시예, 특허청구범위에서 "알킬"(또는 "저급 알킬")에는 "치환되지 않은 알킬"과 "치환된 알킬"모두 포함되며, 후자는 탄화수소 골격의 하나 이상 탄소에서 수소를 대체하는 치환체를 갖는 알킬 부분을 의미한다. 이런 치환체는 예로써 수소, 하이드록실, 카르보닐(예, 카르복실, 알콕시카르보닐, 포밀 또는 아실), 티오카르보닐(예, 티오에스테르, 티오아세테이트 또는 티오포메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설피드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 방향족이나 헤테로방향족 부분이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 탄화수소 사슬에서 치환된 부분은 자체적으로 치환될 수 있다. 가령, 치환된 알킬의 치환체는 치환되거나 치환되지 않은 형태의 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스포네이트와 포스피네이트 포함), 설포닐(설페이트, 설폰아미도, 설파모일, 설포네이트 포함), 실릴기, 에테르, 알킬티오, 카르보닐(케톤, 알데하이드, 카르복실레이트, 에스테르 포함), -CF3, -CN 등이다. 전형적인 치환된 알킬은 하기에 기술한다. 사이클로알킬은 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬토오, 아미노알킬, 카르보닐-치환된 알킬, -CF3, -CN 등으로 더욱 치환될 수 있다.
탄소 원자를 달리 명시하지 않는 경우, 본원에서 "저급 알킬"은 앞서 정의된바와 동일하지만 골격 구조에 1 내지 10개의 탄소 원자, 적절하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 보유하는 알킬기를 의미한다. 유사하게, "저급 알케닐"과 "저급 알키닐"은 유사한 사슬 길이를 갖는다. 본원에서 바람직한 알킬기는 저급 알킬이다. 바람직한 구체예에서, 알킬로 표시된 치환체는 저급 알킬이다.
"알킬티오"는 앞서 밝힌 바와 같이, 황 라디칼이 부착된 알킬기를 의미한다. 바람직한 구체예에서, "알킬티오"부분은 -S-알킬, -S-알케닐, -S-알키닐, -S-(CH2)m-R8(m과 R8은 앞서 밝힌 바와 동일하다)중 하나로 표시된다. 대표적인 알킬티오기는 메틸티오, 에틸티오 등이다.
"아민"과 "아미노"는 다음의 화학식으로 표시되는 치환되거나 치환되지 않은 아민이다:
여기서, R9, R10, R'10은 독립적으로, 수소, 알킬, 알케닐, (CH2)m-R8이거나, 또는 R9와 R10이 N 원자와 결합하여 고리 구조에 4 내지 8개 원자를 갖는 헤테로환을 완결하고; R8은 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로환 또는 다중환이고; m은 0 또는 1 내지 8의 정수이다. 바람직한 구체예에서, R9또는 R10중 하나만 카르보닐이다, 예를 들면 R9, R10, 질소가 서로 결합하여 이미드를 형성하지 않는다. 이런 구체예에서, R9와 R10중 하나는 카르보닐에 의해 N에 부착되고, 예를 들면, 아민은 아마이드 또는 이미드가 아니고, 아민은 염기성이다, 예를 들면, 이의 짝산은 7이상의 pKa를 보유한다. 좀더 바람직한 구체예에서, R9와 R10(선택적으로 R'10)은 독립적으로, 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R8이다. 따라서, 본원에서 "알킬아민"은 앞서 밝힌 바와 같이 치환되거나 치환되지 않은 알킬을 보유하는 아민기를 의미한다, 다시 말하면 R9와 R10중 적어도 하나는 알킬기이다.
"아미도"는 아미노-치환된 카르보닐으로 인지되며 다음의 화학식으로 표시되는 부분을 보유한다:
여기서, R9와 R10은 앞서 정의한 바와 동일하다. 아마이드의 바람직한 구체예에는 불안정한 이미드가 포함되지 않는다.
본원에서 "아르알킬"은 아릴기(예, 방향족이나 헤테로방향족 작용기)로 치화되는 알킬기를 의미한다.
본원에서 "아릴"은 0 내지 4개의 헤테로원자, 예를 들면 벤젠, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘 등을 보유하는 5-, 6-, 7-각형 단일-고리 방향족 작용기를 의미한다. 고리 구조에 헤테로원자를 보유하는 이들 아릴기는 "아릴 헤테로환" 또는 "헤테로방향족"이라고도 한다. 방향족 고리는 앞서 밝힌 바와 같은 치환체, 예를 들면 할로겐, 아지드, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 하이드록실, 알콕시, 아미노, 니트로, 설피드릴, 이미노, 아미도, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 설폰아미도, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로사이클릴, 방향족이나 헤테로방향족 부분, , -CF3, -CN 등으로 하나 이상의 고리 위치에서 치환될 수 있다. "아릴"에는 폴리환 고리 시스템이 포함되는데, 여기서 2개 이상의 탄소가 2개의 접하는 고리(이들 고리는 "융합된 고리"이다)에 공통하고 고리중 적어도 하나는 방향족이다. 예를 들면 다른 환형 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다.
본원에서 "카르보환"은 고리의 각 원자가 탄소인 방향족이나 비-방향족 고리를 의미한다.
"카르보닐"은 다음의 화학식으로 표시되는 부분을 보유한다:
여기서, X는 결합이나 산소 또는 황이고, R11은 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R8또는 제약학적으로 수용가능한 염이고, R'11은 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R8(m과 R8은 앞서 밝힌 바와 동일하다)이다. X가 산소이고 R11또는 R'11이 수소가 아니면, 상기 화학식은 "에스테르"를 나타낸다. X가 산소이고 R11이 앞서밝힌 바와 동일하면 상기 부분은 카르복실기이고, 특히 R11이 수소이면 상기 화학식은 "카르복실산"을 나타낸다. X가 산소이고 R'11이 수소이면, 상기 화학식은 "포메이트"를 나타낸다. 일반적으로, 상기 화학식의 산소 원자가 황으로 치환되면, 상기 화학식은 "티오카르보닐"기를 나타낸다. X가 황이고 R11또는 R'11이 수소가 아니면, 상기 화학식은 "티오에스테르"를 나타낸다. X가 황이고 R11이 수소이면 상기 화학식은 "티오카르복실산"을 나타낸다. X가 황이고 R'11이 수소이면, 상기 화학식은 "티오포메이트"를 나타낸다. 다른 한편, X가 결합이고 R11이 수소가 아니면, 상기 화학식은 "케톤"기를 나타낸다. X가 결합이고 R11이 수소이면, 상기 화학식은 "알데하이드"기를 나타낸다.
본원에서 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소를 제외한 다른 원소의 원자를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 붕소, 질소, 산소, 인, 황, 셀레늄이다.
"헤테로사이클릴" 또는 헤테로환 작용기"는 3- 내지 10-각형 고리 구조, 적절하게는 3- 내지 7-각형 고리 구조를 의미하는데, 이런 고리 구조는 1 내지 4개의 헤테로원자를 보유한다. 헤테로환은 다중환일 수도 있다. 헤테로사이클릴기는 예로써 티오펜, 티안트렌, 푸란, 피란, 이소벤조푸란, 크로멘, 잔텐, 페녹사틴, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 이소티아졸, 이속사졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 이돌리진, 이소인돌, 인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카르바졸, 카르볼린,페나트리딘, 아크리딘, 피리미딘, 펜안트롤린, 페나진, 페나르사진, 페노티아진, 푸라잔, 페녹사진, 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 옥사졸, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 락톤, 락탐(예, 아제티디논과 피롤리디논), 설탐, 설톤 등이다. 헤테로환 고리는 앞서 밝힌 바와 같은 치환체, 예를 들면 할로겐, 아지드, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 하이드록실, 알콕시, 아미노, 니트로, 설피드릴, 이미노, 아미도, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 설폰아미도, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로사이클릴, 방향족이나 헤테로방향족 부분, , -CF3, -CN 등으로 하나 이상의 고리 위치에서 치환될 수 있다.
본원에서 "니트로"는 -NO2를 의미한다; "할로겐은 F-, Cl, -Br 또는 -I를 의미한다; "설피드릴"은 -SH를 의미한다; "하이드록실"은 -OH를 의미한다; "설포닐"은 -SO2-를 의미한다.
"포스폰아미디트"는 다음의 화학식으로 표시될 수 있다;
여기서, R9와 R10은 앞서 밝힌 바와 동일하고, Q2는 O, S 또는 N이고, R48은 저급 알킬 또는 아릴이고, Q2는 O, S 또는 N이다.
"포스포르아미디트"는 다음의 화학식으로 표시될 수 있다;
여기서, R9와 R10은 앞서 밝힌 바와 동일하고, Q2는 O, S 또는 N이다.
"포스포릴"은 다음의 화학식으로 표시될 수 있다;
여기서, Q1은 O 또는 S이고, R48은 수소, 저급 알킬 또는 아릴이다. 예로써 알킬을 치환하는데 사용되는 경우에, 포스포릴알킬의 포스포릴기는 다음의 화학식으로 표시될 수 있다:
여기서, Q1은 O 또는 S이고, R48은 수소, 저급 알킬 또는 아릴이고, Q2는 O, S 또는 N이다. Q1이 S인 경우에, 포스포릴 부분은 "포스포로티오에이트"이다.
"폴리사이클릴"또는 "다중환 작용기"는 2개 이상의 고리(예, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴 및/또는 헤테로사이클릴)을 의미하는데, 여기서 2개 이상의 탄소는 2개의 접하는 고리(이들 고리는 "융합된 고리"이다)에 공통한다. 인접하지 않은 원자를 통하여 결합된 고리는 "가교된"고리라고 한다. 다중환의 각 고리는 앞서 밝힌 바와 같은 치환체, 예를 들면 할로겐, 아지드, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 하이드록실, 알콕시, 아미노, 니트로, 설피드릴, 이미노, 아미도, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 설폰아미도, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로사이클릴, 방향족이나 헤테로방향족 부분, , -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다.
본원에서 "보호기"는 원치않는 화학적 변환으로부터 잠재적 반응성 작용기를 보호하는 일시적 치환체를 의미한다. 이런 보호기의 예는 카르복실산의 에스테르, 알코올의 실릴 에테르, 알데하이드의 아세탈, 케톤의 케탈 등이다. 보호기 화학 분야는 면밀하게 조사되었다(Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective group in Organic Synthesis, 2nd ed.; Wiley: New York, 1991).
"셀레노알킬"은 치환된 셀로노기를 보유하는 알킬기를 의미한다. 알킬에서 치환되는 전형적인 "셀로노에테르"는 -Se-알킬-, -Se-알케닐, -Se-알키닐, -Se-(CH2)m-R8(m과 R8은 앞서 밝힌 바와 동일하다)에서 선택된다.
본원에서 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용가능한 치환체를 포괄한다. 넓은 의미에서, 허용가능한 치환체에는 유기 화합물의 비환형과 환형 치환체, 분지되고 분지되지 않은 치환체, 카르보환과 헤테로환 치환체, 방향족과 비방향족 치환체가 포함된다. 전형적인 치환체는 예로써 앞서 밝힌 치환체가 포함된다. 허용가능한 치환체는 적절한 유기 화합물에 대하여 하나이상일 수 있고 동일하거나 상이하다. 본 발명에서 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환체 및/또는 유기 화합물에서 이들 헤테로원자의 원자가(valence)를 충족시키는 임의의 허용가능한 치환체를 보유할 수 있다. 본 발명은 유기 화합물의 허용가능한 치환체에 의해 전혀 제한받지 않는다.
"치환"은 이런 치환이 치환된 원자와 치환체의 허용된 원자가에 따르고 치환에 의해 안정한 화합물, 예를 들면 재정렬, 고리화, 제거 등에 의해 자발적으로 변환되지 않는 화합물이 생성된다는 암묵적인 단서(但書)를 포함한다.
"설파모일"은 다음의 화학식으로 표시될 수 있다;
여기서, R9와 R10은 앞서 정의한 바와 동일하다.
"설페이트"는 다음의 화학식으로 표시될 수 있다;
여기서, R41은 앞서 정의한 바와 동일하다.
"설폰아미도"는 다음의 화학식으로 표시될 수 있다;
여기서, R9와 R'11은 앞서 정의한 바와 동일하다.
"설포네이트"는 다음의 화학식으로 표시될 수 있다;
여기서, R41은 전자쌍, 수소, 알킬, 사이클로알킬 또는 아릴이다.
본원에서 "설폭시도"또는 "설피닐"은 다음의 화학식으로 표시될 수 있다;
여기서, R44는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아르알킬 또는 아릴에서 선택된다.
유사한 치환을 알케닐과 알키닐 작용기에 실시하여 예로써 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미도알케닐, 아미도알키닐, 이미노알케닐, 이미노알키닐, 티오알케닐, 티오알키닐, 카르보닐-치환된 알케닐이나 알키닐을 만들 수 있다.
본원에서 임의의 구조에 한번이상 표시되는 각 표현, 예를 들면 알킬, m, n 등의 정의는 동일한 구조에서 다른 경우에 정의와 무관하다.
트리프릴, 토실, 메실, 노나프릴은 각각 트리플루오르메탄설포닐, p-톨루엔설포닐, 메탄설포닐, 노나플루오르부탄설포닐 작용기를 의미한다. 트리플레이트, 토실레이트, 메실레이트, 노나플레이트는 각각 트리플루오르메탄설포네이트 에스테르, p-톨루엔설포네이트 에스테르, 메탄설포네이트 에스테르, 노나플루오르부탄설포네이트 에스테르 작용기 및 상기 작용기를 보유하는 분자를 의미한다.
약어 Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms는 각각 메틸, 에틸, 페닐, 트리플루오르메탄설포닐, 노나플루오르부탄설포닐, p-톨루엔설포닐, 메탄설포닐을 의미한다. 당분야에 통상의 지식을 가진 유기 화학자에 의해 이용되는 약어의 좀더 포괄적인 목록은 Journal of Organic Chemistry에서 확인할 수 있다; 이런 목록은 전형적으로, Standard List of Abbreviation 표로 제공된다. 상기 목록에 포함된 약어 및 당분야에 통상의 지식을 가진 유기 화학자에 의해 이용되는 모든 약어는 본원에 참고로 한다.
본 발명의 특정 화합물은 특정 기하학적이나 입체이성질체 형태로 존재한다. 본 발명은 cis-와 trans-이성질체, R-와 S-이성질체, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 이들의 라세미 혼합물, 이들의 다른 혼합물을 비롯한 이런 모든 화합물을 본 발명의 일부로 포괄한다. 알킬기와 같은 치환체에 추가의 비대칭 탄소 원자가 존재할 수 있다. 이런 모든 이성질체 및 이들의 혼합물 역시 본 발명에 포함된다.
가령, 본 발명에 따른 화합물의 특정 거울상이성질체가 요구되면, 이는 비대칭 합성, 또는 키랄 보조제에 의한 유도로 제조할 수 있는데, 여기서 결과의 부분입체이성질성 혼합물은 분리되고 보조제는 절단되어 원하는 순수한 거울상이성질체가 수득된다. 대안으로, 분자가 염기성 작용기, 예를 들면 아미노, 또는 산성 작용기, 예를 들면 카르복실기를 보유하는 경우에, 적절한 광학적 활성 산이나 염기로 부분입체이성질성 염을 생성시키고, 이후 이렇게 만들어진 부분입체이성질체를 당분야에 공지된 분별 결정이나 크로마토그래피 수단으로 분리하고 순수한 거울상이상질체를 회수한다.
앞서 밝힌 화합물의 계획된 등가물에는 이에 상응하는 화합물 및 효능에 부정적인 영향을 주지 않으면서 하나 이상의 단순한 치환체 변화가 진행된 동일한 일반적 특성(예, hedgehog 신호전달을 저해하는 능력)을 보유하는 화합물이 포함된다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은 용이하게 입수가능한 출발 물질, 시약, 통상적인 합성 과정을 이용하여, 후술된 전반적인 반응식에서 예시된 방법 또는 이의 변형으로 만들 수 있다. 이들 반응에는 잘 알려져 있지만 본원에는 언급되지 않은 이형(異形)이 사용될 수도 있다.
본 발명에서 화학적 원소는 Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87, inside cover에 따라 확인한다. 또한, 본 발명에서 "탄화수소"는 적어도 하나의 수소와 탄소 원자를 보유하는 모든 허용가능한 치환체를 포괄한다. 넓은 의미에서, 허용가능한 탄화수소에는 치환되거나 치환되지 않은 비환형과 환형 유기 화합물, 분지되고 분지되지 않은 유기 화합물, 카르보환과 헤테로환 유기 화합물, 방향족과 비방향족 유기 화합물이 포함된다.
Ⅲ. 본 발명의 전형적인 화합물
하기에 구체적으로 밝힌 바와 같이, 본 발명의 방법은 본원에서 밝힌 약물 스크리닝 분석으로 동정되는 다양한 소형 분자를 이용하여 실시할 수 있다. 가령, 이런 본 발명의 방법에 유용한 화합물은 화학식 I로 표시되는 화합물이다:
여기서, 결합가(valence)와 안정도가 허락되면,
X와 Z는 독립적으로 -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- 또는 직접 결합, 적절하게는 -N(R7)-, -0-, -S- 또는 직접 결합이고;
Y는 -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NR7)-, SO2또는 SO, 적절하게는 -C(=O)-, SO2또는 -C(=S)-이고;
A는 O, S 또는 NR7, 적절하게는 O 또는 NH, 가장 적절하게는 NH이고;
G는 고리에 융합된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 고리, 적절하게는 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
Ar은 치환되거나 치환되지 않은 아릴이나 헤테로아릴 고리, 예를 들면 치환되거나 치환되지 않은 페닐 고리이고;
R1은 H, 또는 다중환 작용기를 비롯한 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬이고;
R2는 고리에서 0-4개 치환체, 예를 들면 할로겐, 저급 알킬, 저급 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 카르보닐기(예, 에스테르, 카르복실 또는 포밀), 티오카르보닐(예, 티오에스테르, 티오카르복실레이트 또는 티오포메이트), 케톤, 알데하이드, 아미노, 아실아미노, 아미도, 아미디노, 시아노, 니트로, 아지도, 설포닐, 설폭시도, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, J-R8, J-OH, J-저급 알킬, J-저급 알케닐, J-SH, J-NH2, 이들의 보호된 형태이거나, 또는 환이나 다중환 구조에서 1회 이상 존재하는 경우에 임의의 2가지 R2는 서로 결합하여 4각형 내지 8각형 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성하고;
R7은 독립적으로 H, 저급 알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-사이클로알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-헤테로사이클릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-헤테로아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은)이고;
R8은 독립적으로 H, 저급 알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), 사이클로알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), 헤테로사이클릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), 아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은) 또는 헤테로아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은)이고;
J는 독립적으로 CK2, NK, O, S에서 선택되는 0-8개(적절하게는, 0-4개) 단위를 갖는 사슬이고, 여기서 K는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다.
특정 구체예에서, Z와 X중 적어도 하나는 직접 결합이 아니다. 특정 구체예에서, X-Y-Z는 아마이드, 요소 또는 설폰아마이드를 포함한다. 특정 구체예에서,X는 -N(R8)-, -O-, -S-, 적절하게는 NH이다.
특정 구체예에서, R1에는 1-5개 치환체, 예를 들면 니트로, 할로겐, 시아노, 저급 알킬, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 알콕시, 알킬아미노, 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 아릴이나 헤테로아릴 고리에 융합된 헤테로아릴로 선택적으로 치환되는 아릴 또는 헤테로아릴 고리가 포함된다.
특정 구체예에서, X 및 A-포함 고리는 메타(즉, 1,3) 관계로 Ar에 배치된다.
특정 구체예에서, G는 페닐이나 피페리딘 고리이다.
특정 구체예에서, J는 부재한다.
특정 구체예에서, R2는 할로겐, 시아노, 니트로, 알콕시, 아미노, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, G에 융합된 헤테로아릴, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬에서 선택되는 1-4개의 치환체이다
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 도 32에 도시된 화합물에서 선택된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 화합물은 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물이다:
여기서, 결합가(valence)와 안정도가 허락되면,
X와 Z는 독립적으로 -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- 또는 직접 결합, 적절하게는 -N(R7)-, -0-, -S- 또는 직접 결합이고;
Y는 -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NR7)-, SO2또는 SO, 적절하게는 -C(=O)-, SO2또는 -C(=S)-이고;
A는 O, S 또는 NR7, 적절하게는 O 또는 NH, 가장 적절하게는 NH이고;
G는 고리에 융합된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 고리, 적절하게는 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
R1은 H, 또는 다중환 작용기를 비롯한 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬이고;
R2는 고리에서 0-4개 치환체, 예를 들면 할로겐, 저급 알킬, 저급 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 카르보닐기(예, 에스테르, 카르복실 또는 포밀), 티오카르보닐(예, 티오에스테르, 티오카르복실레이트 또는 티오포메이트), 케톤, 알데하이드, 아미노, 아실아미노, 아미도, 아미디노, 시아노, 니트로, 아지도, 설포닐, 설폭시도, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, J-R8, J-OH, J-저급 알킬, J-저급 알케닐, J-SH, J-NH2, 이들의 보호된 형태이거나, 또는 환이나 다중환 구조에서 1회 이상 존재하는 경우에 임의의 2가지 R2는 서로 결합하여 4각형 내지 8각형 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성하고;
R3은 고리에서 0-4개 치환체, 예를 들면 할로겐, 하이드록실, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 시아노, 니트로, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬 또는 아실, 적절하게는 할로겐, 저급 알콕시 또는 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이고;
R7은 독립적으로 H, 저급 알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-사이클로알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-헤테로사이클릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-헤테로아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은)이고;
R8은 독립적으로 H, 저급 알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), 사이클로알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), 헤테로사이클릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), 아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은) 또는 헤테로아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은)이고;
J는 독립적으로 CK2, NK, O, S에서 선택되는 0-8개(적절하게는, 0-4개) 단위를 갖는 사슬이고, 여기서 K는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다.
특정 구체예에서, Z와 X중 적어도 하나는 직접 결합이 아니다. 특정 구체예에서, X-Y-Z는 아마이드, 요소 또는 설폰아마이드를 포함한다. 특정 구체예에서, X는 -N(R8)-, -O-, -S-, 적절하게는 NH이다.
특정 구체예에서, R1에는 1-5개 치환체, 예를 들면 니트로, 할로겐, 시아노, 저급 알킬, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 알콕시, 알킬아미노, 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 아릴이나 헤테로아릴 고리에 융합된 헤테로아릴로 선택적으로 치환되는 아릴 또는 헤테로아릴 고리가 포함된다.
특정 구체예에서, G는 페닐이나 피페리딘 고리이다.
특정 구체예에서, J는 부재한다.
특정 구체예에서, R2는 할로겐, 시아노, 니트로, 알콕시, 아미노, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, G에 융합된 헤테로아릴, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬에서 선택되는 1-4개의 치환체이다
특정 구체예에서, R3은 X 또는 A-포함 고리와 파라 위치에 치환체, 예를 들면 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 할로겐을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 도 32에 도시된 화합물에서 선택된다.
하기에 구체적으로 밝힌 바와 같이, 본 발명의 방법은 본원에서 밝힌 약물 스크리닝 분석으로 동정되는 다양한 소형 분자를 이용하여 실시할 수 있다. 가령,이런 본 발명의 방법에 유용한 화합물은 화학식 Ⅲ으로 표시되는 화합물이다:
여기서, 결합가(valence)와 안정도가 허락되면,
X와 Z는 독립적으로 -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- 또는 직접 결합, 적절하게는 -N(R7)-, -0-, -S- 또는 직접 결합이고;
Y는 -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NR7)-, SO2또는 SO, 적절하게는 -C(=O)-, SO2또는 -C(=S)-이고;
A는 O, S 또는 NR7, 적절하게는 O 또는 NH, 가장 적절하게는 NH이고;
G는 고리에 융합된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 고리, 적절하게는 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
Q는 부재하거나, 또는 K가 독립적으로 H 또는 저급 알킬인 경우에 CK2, NK, O 또는 S이고;
Ar은 치환되거나 치환되지 않은 아릴이나 헤테로아릴 고리, 예를 들면 치환되거나 치환되지 않은 페닐 고리이고;
R1은 H, 또는 다중환 작용기를 비롯한 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬이고;
R2는 고리에서 0-4개 치환체, 예를 들면 할로겐, 저급 알킬, 저급 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 카르보닐기(예, 에스테르, 카르복실 또는 포밀), 티오카르보닐(예, 티오에스테르, 티오카르복실레이트 또는 티오포메이트), 케톤, 알데하이드, 아미노, 아실아미노, 아미도, 아미디노, 시아노, 니트로, 아지도, 설포닐, 설폭시도, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, J-R8, J-OH, J-저급 알킬, J-저급 알케닐, J-SH, J-NH2, 이들의 보호된 형태이거나, 또는 환이나 다중환 구조에서 1회 이상 존재하는 경우에 임의의 2가지 R2는 서로 결합하여 4각형 내지 8각형 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성하고;
R7은 독립적으로 H, 저급 알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-사이클로알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-헤테로사이클릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-헤테로아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은)이고;
R8은 독립적으로 H, 저급 알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), 사이클로알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), 헤테로사이클릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), 아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은) 또는 헤테로아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은)이고;
J는 독립적으로 CK2, NK, O, S에서 선택되는 0-8개(적절하게는, 0-4개) 단위를 갖는 사슬이고, 여기서 K는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다.
특정 구체예에서, Z와 X중 적어도 하나는 직접 결합이 아니다. 특정 구체예에서, X-Y-Z는 아마이드, 요소 또는 설폰아마이드를 포함한다. 특정 구체예에서, X는 -N(R8)-, -O-, -S-, 적절하게는 NH이다.
특정 구체예에서, R1에는 1-5개 치환체, 예를 들면 니트로, 할로겐, 시아노, 저급 알킬, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 알콕시, 알킬아미노, 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 아릴이나 헤테로아릴 고리에 융합된 헤테로아릴로 선택적으로 치환되는 아릴 또는 헤테로아릴 고리가 포함된다.
특정 구체예에서, X 및 A-포함 고리는 메타(즉, 1,3) 관계로 Ar에 배치된다.
특정 구체예에서, G는 페닐이나 피페리딘 고리이다.
특정 구체예에서, J는 부재한다.
특정 구체예에서, R2는 할로겐, 시아노, 니트로, 알콕시, 아미노, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, G에 융합된 헤테로아릴, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬에서 선택되는 1-4개의 치환체이다
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 도 32에 도시된 화합물에서 선택된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 화합물은 화학식 Ⅳ로 표시되는 화합물이다:
여기서, 결합가(valence)와 안정도가 허락되면,
X와 Z는 독립적으로 -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- 또는 직접 결합, 적절하게는 -N(R7)-, -0-, -S- 또는 직접 결합이고;
Y는 -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NR7)-, SO2또는 SO, 적절하게는 -C(=O)-, SO2또는 -C(=S)-이고;
A는 O, S 또는 NR7, 적절하게는 O 또는 NH, 가장 적절하게는 NH이고;
G는 고리에 융합된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 고리, 적절하게는 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
Q는 부재하거나, 또는 K가 독립적으로 H 또는 저급 알킬인 경우에 CK2, NK, O 또는 S이고;
R1은 H, 또는 다중환 작용기를 비롯한 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬이고;
R2는 고리에서 0-4개 치환체, 예를 들면 할로겐, 저급 알킬, 저급 알케닐,아릴, 헤테로아릴, 카르보닐기(예, 에스테르, 카르복실 또는 포밀), 티오카르보닐(예, 티오에스테르, 티오카르복실레이트 또는 티오포메이트), 케톤, 알데하이드, 아미노, 아실아미노, 아미도, 아미디노, 시아노, 니트로, 아지도, 설포닐, 설폭시도, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, J-R8, J-OH, J-저급 알킬, J-저급 알케닐, J-SH, J-NH2, 이들의 보호된 형태이거나, 또는 환이나 다중환 구조에서 1회 이상 존재하는 경우에 임의의 2가지 R2는 서로 결합하여 4각형 내지 8각형 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성하고;
R3은 고리에서 0-4개 치환체, 예를 들면 할로겐, 하이드록실, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 시아노, 니트로, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬 또는 아실, 적절하게는 할로겐, 저급 알콕시 또는 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이고;
R7은 독립적으로 H, 저급 알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-사이클로알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-헤테로사이클릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), J-헤테로아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은)이고;
R8은 독립적으로 H, 저급 알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), 사이클로알킬(예, 치환되거나 치환되지 않은), 헤테로사이클릴(예, 치환되거나 치환되지 않은), 아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은) 또는 헤테로아릴(예, 치환되거나 치환되지 않은)이고;
J는 독립적으로 CK2, NK, O, S에서 선택되는 0-8개(적절하게는, 0-4개) 단위를 갖는 사슬이고, 여기서 K는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다.
특정 구체예에서, Z와 X중 적어도 하나는 직접 결합이 아니다. 특정 구체예에서, X-Y-Z는 아마이드, 요소 또는 설폰아마이드를 포함한다. 특정 구체예에서, X는 -N(R8)-, -O-, -S-, 적절하게는 NH이다.
특정 구체예에서, R1에는 1-5개 치환체, 예를 들면 니트로, 할로겐, 시아노, 저급 알킬, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 알콕시, 알킬아미노, 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 아릴이나 헤테로아릴 고리에 융합된 헤테로아릴로 선택적으로 치환되는 아릴 또는 헤테로아릴 고리가 포함된다.
특정 구체예에서, G는 페닐이나 피페리딘 고리이다.
특정 구체예에서, J는 부재한다.
특정 구체예에서, R2는 할로겐, 시아노, 니트로, 알콕시, 아미노, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, G에 융합된 헤테로아릴, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬에서 선택되는 1-4개의 치환체이다
특정 구체예에서, R3은 X 또는 A-포함 고리와 파라 위치에 치환체, 예를 들면 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 할로겐을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 도 32에 도시된 화합물에서 선택된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 길항제는hedgehog경로에 대한 선택성에 기초하여 선택할 수 있다. 이런 선택성은hedgehog경로 vs 다른 경로에 대한 선택성, 또는 특정hedgehog경로, 예를 들면ptc-1,ptc-2 등 사이의의 선택성일 수 있다.
바람직한 특정 구체예에서, 본 발명의 저해물질은 1 mM 이하, 적절하게는 1 μM 이하, 좀더 적절하게는 1 nM 이하의 ED50으로ptc기능 손실,hedgehog기능 획득 또는smoothened기능 획득 매개된 신호 전달을 저해한다. 유사하게, 바람직한 특정 구체예에서, 본 발명의 저해물질은 10 nM 미만, 적절하게는 1 nM 미만, 좀더 적절하게는 0.1 nM 미만의 Ki로hedgehog경로의 활성을 저해한다.
특정 구체예에서, 소형 분자가 사용에 선택되는데, 그 이유는 소형 분자가 다른 것보다patched경로(ptc-1,ptc-2)에 대하여 10배, 적절하게는 적어도 100배, 좀더 적절하게는 1000배 더 선택적이기 때문이다.
특정 구체예에서,hedgehog경로에 대한 길항제 화합물은 PKC와 같은 PKA 이외의 단백질 키나아제에서hedgehog활성을 선택적으로 길항하기 위하여 선택된다, 예를 들면 상기 화합물은 다른 단백질 키나아제의 활성을 조절하는 것보다 적어도 1 크기 자리수, 적절하게는 적어도 2 크기 자리수, 좀더 적절하게는 적어도 3 크기 자리수 강하게hedgehog경로의 활성을 조절한다. 가령,hedgehog경로의 바람직한 저해물질은 PKC의 저해에서 Ki보다 적어도 1 크기 자리수, 적절하게는 적어도 2 크기 자리수, 좀더 적절하게는 적어도 3 크기 자리수 낮은 Ki로hedgehog활성을 저해할 수 있다.
Ⅳ. 방법과 조성물의 전형적인 실용
본 발명의 다른 측면은 발명에 따른hedgehog길항제를 세포와 접촉시켜ptc기능 손실,hedgehog기능 획득 또는smoothened기능 획득을 보유하는 세포의 분화된 상태, 생존 및/또는 증식을 조절하는 방법에 관한다.
가령, 본 발명의 방법은 척추동물에서 분화된 조직의 정연한 공간 배열의 형성에서ptc,hedgehog,smoothened의 광범위한 개입에 비추어, 시험관내와 생체내 모두에서 서로 다른 척추동물 조직의 어레이를 만들거나 유지하는 과정의 일부로 이용될 수 있다. 일정한 조직의 증식이나 분화의 측면에서 유도성 또는 비-유도성인 지와 상관없이 상기hedgehog길항제가 앞서 밝힌 제형에 적합할 수 있다.
가령, 본 발명의 방법은 세포 배양 기술에 적용될 수 있는데, 여기서 세포는 유전적이나 생화학적 이유로,ptc기능 손실,hedgehog기능 획득 또는smoothened기능 획득을 보유한다. 시험관내 신경 배양 시스템은 신경 발달의 연구 및 신경향성 인자, 예를 들면 신경 성장 인자(NGF), 모양체 영양성 인자(CNTF), 뇌 유래된 신경향성 인자의 동정을 위한 근본적이고 필수불가결한 도구로 입증되었다. 본 발명의 한가지 용도는 신경 줄기 세포의 배양, 예를 들면 새로운 신경원과 신경교의 생산을 위한 배양에 이용하는 것이다. 본 발명의 이런 구체예에서, 배양된 세포는 배양중인 신경 줄기 세포의 증식 속도와 분화 속도를 변화시키거나, 또는 최종 분화된 특정 신경 세포 배양액의 완전성을 유지하기 위하여, 본 발명의hedgehog길항제와 접촉시킬 수 있다. 전형적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 예로써 감각 신경 또는 운동 신경을 배양하는데 이용될 수 있다. 이런 신경 배양액은 통상적인분석 시스템 및 치료용 이식 세포의 공급원으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따라, 다수의 비-종양원성 신경 선조 세포가 시험관내에서 영속될 수 있고, 이들의 증식이나 분화 속도가 본 발명의hedgehog길항제와의 접촉으로 영향을 받을 수 있다. 전반적으로, 동물로부터 신경 선조 세포를 분리하고, 이들 세포를 가급적 성장 인자의 존재하에 시험관내 또는 생체내에서 영속화시키고, 상기 세포를hedgehog길항제와 접촉시켜 이들 세포의 특정 신경 표현형, 예를 들면 신경원과 신경교로의 분화를 조절하는 단계로 구성되는 방법을 제시한다.
선조 세포는 분화가 요구될 때까지 이들 선조 세포를 억제된 상태로 유지시키는 저해 영향을 받는 것으로 생각된다. 하지만, 최근에 이들 세포를 증식할 수 있는 기술이 개발되었는데, 최종 분화되어 더 이상 분열하지 않는 신경원과 달리, 이들 세포는 무제한적으로 생산될 수 있고 신경퇴행성 질환이 있는 이형과 동형 숙주로의 이식에 매우 적합하다.
"선조세포"는 제한없이 분열할 수 있고, 특정 조건하에 신경원과 신경교로 최종 분화되는 딸 세포를 만들 수 있는 전능이나 다능 줄기 세포를 의미한다. 이들 세포는 이형과 동형 숙주로의 이식에 사용될 수 있다. 이형은 선조 세포가 유래된 동물 이외의 숙주를 의미한다. 동형은 선조 세포가 유래된 동일한 숙주를 의미한다.
세포는 임의 동물의 배아, 출생후, 아동, 성체 신경 조직으로부터 구할 수 있다. 동물은 신경 조직을 보유하는 다세포 동물을 의미한다. 좀더 구체적으로, 동물은 임의의 어류, 파충류, 조류, 양서류, 포유동물 등을 의미한다. 가장 바람직한 공여체는 포유동물, 특히 생쥐와 사람이다.
이형 공여체 동물의 경우에, 동물은 안락사시키고, 관심있는 뇌와 특정 부위는 무균 절차로 떼어낸다. 관심있는 특정 뇌 부위는 숙주의 퇴행된 뇌 부위에 기능을 회복시키는 기능을 하는 선조 세포를 수득할 수 있는 부위를 포함한다. 이들 부위에는 대뇌 피질, 소뇌, 중뇌, 뇌간, 척수, 뇌실 조직을 비롯한 중추 신경계(CNS) 부위 및 경동맥체와 부신 수질을 비롯한 말초 신경계 부위(PNS)가 포함된다. 좀더 구체적으로, 이들 부위에는 뇌저, 적절하게는 미상과 난각막으로 구성되는 선조체, 또는 다양한 세포군, 예를 들면 담창구, 시상하부 핵, 알츠하이머병 환자에서 퇴행하는 것으로 밝혀진 기저핵 또는 파킨슨병 환자에서 퇴행하는 것으로 밝혀진 흑색질 치밀부가 포함된다.
사람 이형 신경 선조 세포는 선택적 낙태로부터 얻은 태아 조직, 또는 출생후, 아동 또는 성인 장기 공여자로부터 유래된다. 동형 신경 조직은 생검으로, 또는 신경 조직이 제거되는 신경수술, 특히 간질 수술, 좀더 구체적으로 폐엽절제술과 해마절제술을 실시하는 환자로부터 수득할 수 있다.
세포는 조직의 연결 세포외 기질로부터 개별 세포의 분리로 공여 조직으로부터 수득할 수 있다. 분리는 트립신, 콜라게나제 등과 같은 효소 처리를 비롯한 임의의 공지된 과정을 이용하거나, 블런트 장치와 같은 물리적 분리 방법을 이용하거나, 또는 조직으로부터 특정 세포형의 외생을 가능하게 하는 외과용 메스로 잘게 잘라 달성할 수 있다. 태아 세포의 분리는 조직 배양 배지에서 실시하는 반면, 아동과 성체 세포의 분리에 적합한 배지는 인공 대뇌 척수액(aCSF)이다. 통상적인aCSF는 124 mM NaCl. 5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-글루코오스를 함유한다. 낮은 Ca2+aCSF는 3.2 mM MgCl2와 0.1 mM CaCl2를 제외하고 동일한 성분을 함유한다.
분리된 세포는 세포 대사에 요구되는 보조제, 예를 들면 글루타민과 다른 아미노산, 비타민, 미네랄 및 트랜스페린 등과 같은 유용한 단백질을 함유하고 세포 성장을 뒷받침할 수 있는 임의의 공지된 배양 배지, 예를 들면 MEM, DMEM, RPMI, F-13 등에 위치시킨다. 또한, 배지는 효모, 박테리아, 진균의 오염을 예방하는 항생제, 예를 들면 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 등을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 배지는 소, 말, 병아리 등으로부터 유래된 혈청을 함유한다. 세포에 특히 바람직한 배지는 DMEM과 F-12의 혼합물이다.
배양 조건은 생리 조건에 가깝도록 한다. 배양 배지의 pH는 생리 pH, 적절하게는 pH 6-8, 좀더 적절하게는 pH 7, 가장 적절하게는 pH 7.4에 가깝도록 한다. 세포는 생리 온도에 가까운 온도, 적절하게는 30-40℃, 좀더 적절하게는 32-38℃, 가장 적절하게는 35-37℃에서 배양한다.
세포는 현탁액이나 고정된 기질에서 성장시킬 수 있지만, 선조 세포의 증식은 가급적 현탁액에서 실시하여 "신경구(neurosphere)"의 형성으로 다수의 세포를 생산한다(Reynolds et al. (1992) Science 255: 1070-1709; WO 93/01275, WO 94/09119, WO 94/10292, WO 94/16718). 현탁 세포를 증식시키는 경우에, 플라스크를 잘 흔들어 신경구가 플라스크의 바닥 모퉁이에 정착할 수 있도록 한다. 이후,이들 신경구는 50 ㎖ 원심분리기에 튜브로 옮기고 저속으로 원심분리한다. 배지는 흡입하고, 세포는 성장 인자를 함유하는 소량의 배지에 재현탁시키고, 기계적으로 분리하며, 별도의 배지 분량에 재현탁시킨다.
배양 배지에서 세포 현탁액은 선조 세포의 증식을 가능하게 하는 임의의 성장 세포로 보충하고 세포를 배양할 수 있는 임의의 용기, 적절하게는 배양 플라스크 또는 롤러병에 접종한다. 전형적으로, 세포는 37℃ 배양기에서 3-4일내에 증식하는데, 증식은 세포의 분리와 성장 인자를 함유하는 새로운 배지에 재현탁이후 언제든지 재개될 수 있다.
기질이 부재하면, 세포는 플라스크의 바닥으로부터 상승하고 현탁액에서 계속 증식하여 미분화된 세포의 속이 빈 구형을 형성한다. 대략 3-10일후, 증식 덩어리(신경구)는 부드러운 원심분리와 성장 인자를 함유하는 배지에 재현탁으로, 매 2-7일, 적절하게는 2-4일 마다 영양을 공급한다.
시험관내에서 6-7일후, 신경구에서 개별 세포는 블런트 장치로 신경구의 물리적 분리, 좀더 구체적으로 피펫으로 신경구를 분쇄하여 분리할 수 있다. 분리된 신경구로부터 유래된 단일 세포는 성장 인자를 함유하는 배양 배지에 현탁시키고, 세포의 분화는hedgehog길항제의 존재하에 세포를 도말(또는 재현탁)함으로써 배양중에 조절할 수 있다.
본 발명의hedgehog길항제의 다른 용도를 예시하면, 뇌내 이식(grafting)이 중추 신경계 용법의 다른 대안으로 부상하였다. 가령, 손상된 뇌 조직을 회복하는 한가지 방법은 동물 태아 또는 신생아로부터 유래된 세포의 성체 뇌로의이식이다(Dunnett et al. 1987) J Exp Biol 123: 265-289; Freund et al.(1985) J Neurosci 5: 603-616). 다양한 뇌 부위로부터 유래된 태아 신경원은 성체 뇌에 성공적으로 통합될 수 있는데, 이런 이식편은 행동 결함을 완화시킬 수 있다. 가령, 기저핵에 도파민성 투사의 병소에 의해 유도된 운동 장애가 배아 도파민성 신경원의 이식편으로 예방될 수 있다. 신피질의 병소이후 손상된 복합적 인식 기능 역시 배아 피질 세포의 이식편에 의해 부분적으로 회복될 수 있다. 본 발명의 방법은 배양중에 성장 상태를 조절하거나, 또는 태아 조작, 특히 신경 줄기 세포가 사용되는 경우에 줄기 세포의 분화 속도를 조절하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 유용한 줄기 세포는 공지되어 있다. 가령, 여러 신경제 세포가 동정되었는데, 이들중 일부는 다능이고 비수임된 신경제 세포를 대표하고, 다른 일부는 감각 신경과 같은 한가지 유형의 세포를 발생시킬 수 있고 수임된 선조 세포를 대표한다. 이런 줄기 세포를 배양하기 위하여 본 발명의 방법에 사용되는hedgehog길항제의 역할은 비수임된 선조 세포의 분화를 조절하거나, 또는 수임된 선조 세포의 최종 분화된 신경 세포로의 발달 운명의 제한을 조절할 수 있다. 가려아, 본 발명의 방법은 시험관내에서 신경제 세포의 신경교세포, 슈반 세포, 크로마핀 세포, 콜린성 교감이나 부교감 신경원, 해교성과 세로토닌성 신경원으로의 분화를 조절하는데 이용될 수 있다.hedgehog길항제는 단독으로 사용되거나, 또는 신경 선조 세포의 특정 분화 운명을 좀더 강화시키는 다른 신경향성 인자와 병용될 수 있다.
본 발명에 따른hedgehog길항제의 존재하에 배양된 세포의 이식 이외에, 본발명의 다른 측면은 중추 신경계와 말초 신경계 모두에서 신경원과 다른 신경 세포의 성장 상태를 조절하는hedgehog길항제의 치료 용도에 관한다. 신경계의 발달 과정 및 성체 상태에서 신경 분화를 조절하는 ptc,hedgehog,smoothened의 능력은 특정 경우에hedgehog길항제가 정상 세포의 유지, 기능적 수행, 노화; 화학적으로 또는 기계적적으로 손상된 세포에서 회복과 재생 과정; 특정 병리학적 질환에서 퇴행 치료의 측면에서 성체 신경원의 조절을 촉진할 수 있다는 것을 시사한다. 이런 인식에 비추어, 본 발명에서는 (i) 감염성/염증성 손상과 종양-유도된 손상과 함께 외상적 손상, 화학적 손상, 혈관 손상과 결함(예, 발작으로 인한 허혈)을 비롯한 신경계에 급성, 아급성 또는 만성 손상; (ii) 알츠하이머병을 비롯한 신경계의 노화; (iii) 척수 퇴행뿐만 아니라 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 등을 비롯한 신경계의 만성 신경퇴행성 질환; (iv) 다발성 경화증을 비롯하여 신경계에 영향을 주는 만성 면역학적 질환에 기인하는 신경 질환의 예방 및/또는 심각도 감소를 위한 치료 프로토콜에 본 발명의 적용을 계획한다.
본 발명의 방법은 중추 신경과 말초 신경 손상의 회복을 위한 신경 인공 기관을 만드는데 이용될 수도 있다. 특히, 붕괴되거나 손상된 축색이 인공 장치의 사용으로 회복되는 경우에,hedgehog길항제를 인공 장치에 첨가하여 수지상 과정의 성장과 재생 속도를 조절할 수 있다. 전형적인 신경 유도 채널은 미국 특허 5,092,871과 4,955,892에서 기술한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 중추 신경계에서 발생하는 신생물성이나 과형성 형질전환의 치료에 이용될 수 있다. 가령,hedgehog길항제는 이런 형질전환된 세포에 포스트-유사분열 또는 아폽토시스를 유도하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 예로써 악성 신경교종, 수막염, 수아세포종, 신경외배엽 종양, 상의 세포종에 대한 치료의 일부로 이용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 악성 수아세포종 및 다른 원시 CNS 악성 신경외배엽 종양에 대한 치료 섭생의 일부로 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 수아세포종에 대한 치료 프로그램의 일부로 이용된다. 일차 뇌 종양인 수아세포종은 아동에서 가장 흔한 뇌 종양이다. 수아세포종은 후두와에서 발생하는 원시 신경외배엽 종양이다. 이들은 모든 소아 뇌 종양의 대략 25%를 차지한다(Miller). 조직학적으로, 이들은 실제 국좌(rosette)로 배열된 작은 원형 세포 종양이긴 하지만 성상 세포, 상의 세포 또는 신경원으로 약간의 분화를 보인다(Rorke; Kleihues). PNET는 송과체(송과체 아세포종)과 대뇌를 비롯한 뇌의 다른 부위에서 발생할 수도 있다. 일반적으로, 천막상 부위에서 발생하는 이들 종양은 PF에서보다 악성이다.
수아세포종/PNTF는 절제술 이후에 CNS 전역에서 재발하고 심지어 뼈까지 전이되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 전처리 평가에는 "떨어진 전이"의 가능성을 배제하기 위한 척수 시험이 포함되어야 한다. 이런 목적으로 가돌리늄-강화된 MRI가 척수강 조영술을 거의 대체하였고, CSF 세포진단은 수술후 일상적인 과정으로 달성한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 상의 세포종에 대한 치료 프로그램의 일부로 이용된다. 상의 세포종은 소아 뇌 종양의 대략 10%를 차지한다. 전체적으로,이들은 뇌실의 상의 내층에서 발생하고 현미경적으로 국좌, 도관, 혈관주위 국좌를 형성하는 종양이다. 51명의 상의 세포종 어린이중에서, 3/4는 조직학적으로 양성이었다. 대략 2/3은 4번째 뇌실 부위에서 발생하였다. 1/3은 천막상 부위에서 나타났다. SEER 데이터와 CHOP 데이터에서 발생 연령은 출생에서부터 4살까지 가장 높았다. 평균 연령은 대략 5살이다. 이런 질환을 앓는 많은 아동이 유아이기 때문에, 이들은 다형식 치료법을 필요로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은ptc,hedgehog,smoothened가 앞서 밝힌 바와 같이 신경 분화 이외에 다른 척추동물 기관발생 경로와 관련된 형태발생 신호에 관여하고 중배엽과 내배엽 분화 과정뿐만 아니라 다른 내배엽 패턴화에서 분명한 역할을 갖는다는 관찰에 관한다. 따라서,hedgehog길항제를 함유하는 조성물은 비-신경 조직의 생산과 유지를 수반하는 세포 배양과 치료 방법에도 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에서는ptc,hedgehog,smoothened가 소화관, 간, 폐 및 원시 장관으로부터 유래된 다른 장기의 형성을 담당하는 줄기 세포의 발달 조절에 관여한다는 발견을 이용한다.Shh는 내배엽에서 중배엽으로 유도 신호로 기능하는데, 이런 신호는 장관 형태형성에 필수적이다. 가령, 본 발명의hedgehog길항제는 정상적인 간의 여러 대사 기능을 가지는 인공 간의 개발과 유지를 조절하는데 사용될 수 있다. 전형적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 소화관 줄기 세포의 증식과 분화를 조절하여 세포외 기질을 식민하는데 사용되거나 생체적합성 중합체에 피포될 수 있는 간세포 배양액을 생산하고 이식가능 외용 인공 간을 만드는데 이용될 수 있다.
다른 구체예에서,hedgehog길항제의 치료 조성물은 배아 간 조직뿐만 아니라 이런 인공 간의 이식과 병용하여, 복강내 이식의 흡수, 혈관화, 이식된 간 조직의 생체내 분화와 유지를 조절할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 물리적, 화학적 또는 병리학적 손상이후 이런 기관을 조절하는 치료에 이용될 수 있다. 가령,hedgehog길항제를 포함하는 치료 조성물은 부분적인 간 절제후 간 회복에 사용될 수 있다.
배아 장관으로부터 췌장과 소장의 생성은 장관의 내배엽과 중배엽 세포 사이의 세포내 신호전달에 의존한다. 특히, 장 중배엽의 평활근으로의 분화는 인접한 내배엽 세포로부터 신호에 의존하는 것으로 제안되었다. 배아 후장에서 내배엽 유래된 한가지 신호 매개물질은 Sonic Hedgehog이다(Apelqvist et al.(1997) Curr Biol 7:801-4). Shh 유전자는 췌장 출아 내배엽을 제외하고 배아 장관 내배엽 전체에서 발현되는데, 이는 초기 췌장 발달의 필수 조절물질인 호메오도메인 단백질 Ipf1/Pdx1(인슐린 프로모터 인자 1/췌장과 십이지장 호메오박스 1)을 높은 수준으로 발현한다. Apelqvist 등은 배아 장관에서 Shh의 차별적 발현이 주변 중배엽의 소장과 췌장의 전문화된 중배엽 유도체로의 분화를 조절하는 지를 조사하였다. 이를 조사하기 위하여, 이들은 발생중인 췌장 상피에서 Shh를 선택적으로 발현하는 Ipf1/Pdx1 유전자의 프로모터를 사용하였다. Ipf1/Pdx1-Shh 유전자도입에서, 췌장 중배엽은 췌장 중배엽과 비장보다는 소장의 특징적인 평활근과 Caja1 장 세포로 발달하였다. 또한, Shh에 노출된 췌장 외식체에서 유사한 장 분화 프로그램이 진행되었다. 이들 결과는 내배엽 유래된 Shh의 차별적 발현이 장관의 서로 다른 부위에서 인접한 중배엽의 운명을 조절한다는 증거를 제시한다.
따라서, 본 발명의hedgehog길항제는 생체내와 시험관내에서 췌장 조직의 증식 및/또는 분화를 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 저해물질이 치료 이점을 제공할 수 있는 병리학적 세포 증식과 분화 질환이 존재하며, 전반적인 전략은 예로써 비정상적 인슐린 발현의 수정 또는 분화의 조절이다. 좀더 일반적으로, 본 발명은 본 발명의 저해물질과 세포를 접촉시킴으로써, 분화된 상태를 유도하거나 조절하고 췌장 세포의 생존을 강화시키거나 증식에 영향을 주는 방법에 관한다. 가령, 본 발명의 방법은 췌장 조직의 정연한 공간 배열의 형성에서ptc,hedgehog,smoothened의 광범위한 개입에 비추어, 시험관내와 생체내 모두에서 이런 조직을 생산하거나 유지하는 기술의 일부로 이용될 수 있다. 가령,hedgehog기능의 조절은 소화관, 비장, 폐, 비뇨생식기관(예, 방광) 및 원시 장관으로부터 유래된 다른 기관으로부터 조직 발달과 유지의 조절에서처럼, β-세포 및 비-췌장 조직의 생산과 유지를 수반하는 세포 배양과 치료 방법에 이용될 수 있다.
전형적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 췌장 세포의 비정상적 증식으로 특성화되고 췌장 조직에 영향을 주는 과형성과 신생물성 질환의 치료에 이용될 수 있다. 가령, 췌장암은 췌장의 인슐린 분리 능력을 변화시킬 수 있는 췌장 세포의 비정상적 증식으로 특성화된다. 가령, 특정한 췌장 과형성증, 예를 들면 췌장 암종은 β-세포의 기능이상 또는 줄어든 도(islet)세포 단괴로 인한 저인슐린혈증을 유발할 수 있다. 비정상적ptc,hedgehog,smoothened신호전달이 병의 진행에 관여하는 경우에, 본 발명의 저해물질은 항-종양 요법후 조직의 재생을 강화시키는데 사용될 수 있다.
게다가, 상이한 시점에서hedgehog신호전달 특성의 조절은 생체내와 시험관내에서 췌장 조직을 재형성/회복하기 위한 전략의 일부로서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 췌장 조직의 발생 조절에서ptc,hedgehog,smoothened의 관여를 이용한다. 전반적으로, 본 발명의 방법은 물리적, 화학적 또는 병리학적 손상이후 췌장을 조절하는 치료에 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 세포 배양 기술에 적용될 수 있고, 특히 인공 췌장 조직 장치의 초기 생산을 강화하는데 이용될 수 있다. 예로써hedgehog활성의 변경에 의한 췌장 조직의 증식과 분화 조절은 배양된 조직의 특성을 좀더 면밀하게 조절하는 수단을 제공할 수 있다. 전형적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 예로써 Aebischer et al. U.S. 특허 No. 4,892,538, Aebischer et al. U.S. 특허 No. 5,106,627, Lim, U.S. 특허 No. 4,391,909, Sefton U.S. 특허 No. 4,353,888에서 밝힌 캡슐화 장치에서처럼, β-도세포를 요구하는 인공 장치의 생산을 증폭하는데 이용될 수 있다. 췌장 도세포의 초기 선구 세포는 다능이며 처음 출현한 시점에서부터 모든 도세포-특이적 유전자를 동시활성화시킨다. 발달이 진행되면서, 인슐린과 같은 도세포-특이적 호르몬의 발현이 성숙 도세포의 특징적인 발현 패턴으로 국한된다. 하지만, 성숙 도세포의 표현형은 배양중에 불안정하며 성숙 β-세포에서 배아 형질의 재현이 관찰될 수 있다. 본 발명의hedgehog길항제를 사용함으로써, 상기 세포의 분화 경로 또는 증식 지수를 조절할 수 있다.
게다가, 췌장 조직의 분화 상태의 조작은 이식, 혈관화, 이식된 조직의 시험과내 분화와 유지와 함께 이용될 수 있다. 가령, 조직 분화에 영향을 주는hedgehog기능의 조작은 이식편 생존력을 유지하는 수단으로 이용될 수 있다.
Bellusci et al.(1997) Development 124:53에서는Sonic hedgehog가 시험관내에서 폐 중간엽 세포 증식을 조절한다고 보고하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 예로써 폐기종과 호흡 곤란 증후군의 치료에서 폐 조직의 재생을 조절하는데 이용될 수 있다.
Fujita et al.(1997) Biochem Biophys Res Commun 238:658에서는Sonic hedgehog가 사람 폐 편평세포 암종과 선암종에서 발현된다고 보고하였다.Sonic hedgehog의 발현은 사람 폐 편평세포 암종 조직에서뿐만 아니라 동일 환자의 정상 폐 조직에서도 탐지되었다. 또한,Sonic hedgehog는 BrdU의 암종 세포로의 통합을 촉진하고 이들의 세포 성장을 촉진하는 반면, 항-Shh-N은 이들의 세포 성장을 저해하는 것으로 보고되었다. 이들 결과는ptc,hedgehog및/또는smoothened가 이런 형질전환된 폐 조직의 세포 성장에 관여한다는 것을 암시하고, 따라서 본 발명의 방법이 폐 암종과 선암종 및 폐 상피와 관련된 다른 증식 질환 치료의 일부로서 이용될 수 있다는 것을 시사한다.
이들 종양에 hedgehog 경로의 관여, 또는 발달동안 이들 조직에서 hedgehog나 이의 수용체의 탐지된 발현과 같은 증거에 기초하여 많은 다른 종양이 본 발명의 화합물 치료에 의한 영향을 받을 수 있다. 이런 종양에는 골린 증후군(예, 기저 세포 암종, 속질모세포종, 수막종 등),pct적중 생쥐에서 확인된 생쥐(예, 혈관종, 횡문근육종 등),gli-1 증폭에 의한 종양(예, 교모세포종, 육종 등),ptc상동체와 관련된 종양(예, 신장 암종, 갑상선 암종 등), Ext-1 연관된 종양(예, 골암 등), Shh-유도된 종양(예, 폐암, 연골육종 등), 다른 종양(예, 유방암, 비뇨생식기 암(예, 신장, 방광, 요관, 전립선 등), 부신암, 위장암(예, 위, 장 등) 등)이 포함된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서,hedgehog길항제를 함유하는 조성물은 예로써 골격발생 줄기 세포로부터 골격 조직의 시험관내 생성 및 골격 조직 결함의 생체내 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에서는 연골생성 및/또는 골생성의 속도를 조절하는데hedgehog길항제의 사용을 계획한다. "골격 조질 결함"은 결함이 어떻게 기원했는지, 예를 들면 외과적 개입, 종양의 제거, 궤양, 이식물, 골절 또는 다른 외상성이나 퇴행성 질환의 결과인지에 상관없이 골이나 연결 조직이 요구되는 임의의 부위에서 골이나 다른 골격 연결 조직의 결함을 의미한다.
가령, 본 발명의 방법은 연결 조직에 연골 기능을 회복시키는 섭생의 일부로 이용될 수 있다. 이런 방법은 예로써 관절염을 유발하는 퇴행성 마모의 결과인 연골 조직에서 결함이나 병소 및 찢어진 슬부 연골 조직의 치환, 관절원판절제술, 찢어진 연골에 의한 관절의 이완, 관절의 악성, 골절, 또는 유전 질환과 같은 조직에 대한 외상으로 유발되는 다른 기계적인 내장증(derangement)의 회복에 유용하다. 본원의 회복 방법은 예로써 성형이나 재건 수술 및 치주 수술에서 연골 매트릭스를 리모델링하는 데에도 유용하다. 또한, 본 발명의 방법은 예로써 슬부 연골, 인대, 또는 연골의 외과적 회복이후 이전의 회복 과정을 개선하는 데에도 적용될 수 있다. 게다가, 이는 외상후 조기에 적용되는 경우에 퇴행성 질환의 발병이나 악화를 예방할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 조직에 묻혀있는 연골세포의 분화 및/또는 증식 속도를 관리함으로써 연골 회복 반응을 조절하는hedgehog길항제, 특히 Indianhedgehog신호 전달에 선택적인 길항제의 치료요법적으로 충분한 함량으로 병든 연골 조직을 치료하는 단계로 구성된다. 관절 연골, 관절간 연골(반월상 연골), 늑막 연골(늑골과 흉골 연결), 인대, 힘줄과 같은 이런 연결 조직은 본 발명을 이용한 재건 및/또는 재생 요법으로 치료될 수 있다. 본원에서, 재생 요법에는 조직의 손상이 분명하게 나타나는 상황까지 진행된 퇴행 상태의 치료 및 퇴행이 초기 단계이거나 임박한 조직의 예방적 치료가 포함된다.
전형적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 무릎, 발목, 팔꿈치, 엉덩이, 손목, 손가락이나 발가락의 관절과 같은 가동 관절, 또는 측두하악골 관절의 연골 치료에서 치료적 개입의 일부로 이용될 수 있다. 이런 치료는 관절의 슬부 연골, 관절의 관절 연골 또는 둘 모두를 목표할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 예로써 외성 손상(예, 운동 손상 또는 과도한 마모) 또는 골관절염으로 인한 무릎의 퇴행성 손상을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 길항제는 예로써 관절경 주사로 관절에 주사로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 주사된 작용제는 작용제와 치료 조직의 좀더 확대되고 규칙적인 접촉이 가능하도록 하이드로겔 또는 앞서 밝힌 지연 방출 부형약의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에서는 연골 이식과 인공 장치 요법의 분야에서 본 발명의 사용을 계획한다. 하지만, 서로 다른 조직 사이에, 예를 들면 관절 연골, 슬부 연골, 인대, 힘줄 사이에, 동일 인대 또는 힘줄의 양 단부 사이에, 조직의 표면 부위와 깊은 부위 사이에 연골과 섬유연골의 특성이 상이하기 때문에 문제가 발생한다. 이들 조직의 띠 모양 배열은 기계적 특성에서 점진적인 변화를 반영하고, 이런 조건하에 분화되지 않는 이식된 조직이 적절히 반응하는 능력을 상실하면 부전이 발생한다. 가령, 반월상 연골이 전 십자 인대를 회복하는데 사용되는 경우에, 조직은 순수한 섬유성 조직으로 화생(metaplasia)을 겪는다. 연골생성 속도를 조절함으로써, 본 발명의 방법은 이식된 세포가 새로운 환경에 적응하고 조직의 초기 발달 단계의 연골세포를 효과적으로 공통하도록 하여 이런 문제를 해결하는데 이용될 수 있다.
유사한 방식으로, 본 발명의 방법은 인공 연골 장치의 생성 강화 및 이들의 이식에 적용될 수 있다. 개선된 치료의 요구로 인하여, 콜라겐-글리코사미노글리칸 주형(Stone et al. (1990) Clin Orthop Relat Red 252: 129), 분리된 연골세포(Grande et al. (1989) J Orthop Res 7:208; Takigawa et al. 91987) Bone Miner 2:449), 자연이나 합성 중합체에 부착된 연골세포(Walitani et al. (1989) J Bone Jt Surg 71B: 74; Vacanti et al. (1991) Plast Reconstr Surg 88: 753; Von Schroeder et al. (1991) J Biomed mater Res 25:329; Freed et al.(1993) J Biomed Mater Res 27:11; Vacanti et al. U.S. Patent No. 5,041,138)에 기초한 새로운 연골을 목표하는 연구가 진행되었다. 가령, 연골세포는 폴리클리콜산, 폴리락트산, 아가로즈 겔, 또는 중합체 골격의 가수분해 기능으로 무해한 단량체로 분해되는 다른 중합체와 같은 중합체로부터 생성된 생분해성 생체적합성 고도 다공성 골격에서 배양될 수 있다. 매트릭스는 접목이 발생할 때까지 세포로 적절한 영양과 가스 교환을 제공하도록 설계한다. 세포는 이식될 세포에서 적절한 세포 부피와 밀도가 달성될 때까지 시험관내에서 배양할 수 있다. 매트릭스의 한가지 장점은 최종 산물이 예로써 환자의 귀나 코와 유사하도록 이들 매트릭스가 개별적으로 원하는 형태로 성형되거나, 또는 관절로의 이식 시점에서 조작이 가능한 탄력성 매트릭스가 사용될 수 있다는 점이다.
본 발명의 한 구체예에서, 이식물은 연골세포의 분화 및 배양중인 비후성 연골세포의 생성을 속도를 조절하기 위하여 배양 과정의 특정 단계동안hedgehog길항제와 접촉시킨다.
다른 구체예에서, 이식된 장치는hedgehog길항제로 처리하여 이식된 매트릭스를 활발하게 리모델링하고 이를 의도한 기능에 더욱 적합하도록 할 수 있다. 조직 이식물과 관련하여 앞서 밝힌 바와 같이, 인공 이식물은 매트릭스가 이식되는 실제 기계적 환경에 필적하는 환경에서 유래되지 않는 동일한 결함이 발생한다. 본 발명의 방법으로 매트릭스에서 연골세포를 조절하는 능력은 이식물이 대체하려는 조직과 유사한 특징을 획득할 수 있도록 한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 인공 장치의 부착을 강화시키는데 이용된다. 가령, 본 발명의 방법은 주변 연결 조직의 치료가 보철 주변에 치주 인대의 형성을 촉진하는 경우에 인공 치주의 이식에 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 이런 골격 조직이 결핍된 동물의 부위에서 골생성을 위한 섭생의 일부로 이용될 수 있다. Indian hedgehog는 골아세포에 의해 궁극적으로 대체되는 비후성 연골세포와 특히 연관한다. 가령, 본 발명에 따른hedgehog길항제의 투여는 개체에서 골 손실 속도를 조절하는 방법의 일부로 이용될 수 있다. 가령,hedgehog길항제를 함유하는 조성물은 예로써 골화의 "모델"생성에서 연골내 골화를 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서,hedgehog길항제는 정자생성을 조절하는데 사용될 수 있다.hedgehog길항제, 특히 Dhh는 고환 생식 세포의 분화, 증식, 유지에 관여하는 것으로 밝혀졌다. Dhh 발현은 Sry(고환 결정 유전자)의 활성화 직후에 Sertoli 세포 전구체에서 개시되고 성체 때까지 고환에 존속한다. 수컷은 성숙 정액의 완전한 부재로 인하여, 생존하지만 불임이다. 여러 유전 배경에서 발달 고환의 검사에서 Dhh가 정자생성의 초기와 후기 단계 모두를 조절하는 것으로 보고되었다(Bitgood et al. (1996) Curr Biol 6:298). 바람직한 구체예에서,hedgehog길항제는 피임제로 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 본 발명의hedgehog길항제는 정상 난소 기능을 조절하는데 잠재적으로 유용하다.
본 발명의 방법은 상피 조직에 영향을 주는 질환의 치료나 예방 및 미용 용도로 사용된다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 치료된 상피 조직의 성장 상태를 변화시키는 효과량의hedgehog길항제를 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 투여 양식과 용량 섭생은 치료되는 상피 조직에 좌우된다. 가령, 국소 조성물은 치료된 조직이 표피 조직, 예를 들면 진피나 점막 조직인 경우에 바람직하다.
"상처 치료를 촉진하는"방법은 이런 치료의 부재에서 유사한 상처 치료에서보다 치료 결과로 좀더 빠른 상처 회복을 결과한다. "상처 치료의 촉진"은 상기 방법이 각화세포의 증식 및/또는 성장을 조절하거나 또는 상처가 좀더 적은 흉터, 좀더 적은 상처 수축, 좀더 적은 콜라겐 침착, 좀더 얕은 표면 부위로 치료된다는 것을 의미할 수도 있다. 특정 경우에, "상처 치료의 촉진"은 특정 상처 치료 방법을 본 발명의 방법과 병용하는 경우에 성공률(예, 피부 이식의 착생율)이 개선된다는 것을 의미할 수도 있다.
재건 수술 기술에서 현저한 진보에도 불구하고, 흉터는 치료된 피부의 정상적인 기능과 외형을 회복하는데 중요한 장애물이 될 수 있다. 이는 켈로이드 또는 손이나 얼굴의 비후성 흉터와 같은 병리 흉터가 기능적 무능력이나 신체적 기형을 유발하는 경우에 특히 그러하다. 가장 심각한 경우에, 이런 흉터는 심리적인 고민과 경제적 박탈을 유발할 수 있다. 상처 회복은 지혈, 염증, 증식, 리모델링 단계로 구성된다. 증식 단계는 섬유아세포 및 내피와 상피 세포의 증가를 수반한다. 본 발명의 방법으로, 상처에 인접하는 상피 세포의 증식 속도를 조절하여 상처의 닫힘을 가속화시키거나 흉터 조직의 생성을 최소화시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 예로써 방사선 및/또는 화학요법에 기인하는 구강과 부구강 궤양을 치료하는 섭생의 일부로서 효과적일 수 있다. 일반적으로, 이런 궤양은 화학요법 또는 방사선요법 수일후에 발생한다. 이들 궤양은 섬세한 회색 괴사 막으로 덮이고 염증 조직으로 둘러싸인 작고 고통스런 부정형의 병소로 시작한다. 많은 경우에, 치료 부재는 염증 기초에서 병소의 주위에 조직의 증식을 결과한다. 가령, 궤양과 접하는 상피는 증식 활성을 보이고, 따라서 표면 상피의 연속성을 상실한다. 이들 병소는 크기 및 상피 완전성 상실로 인하여, 신체를 잠재적 2차 감염에 노출시킨다. 음식과 물의 일상적인 섭취가 매우 고통스러워지고, 궤양이 소화관 전체로 증식하게 되면 설사가 발생한다. 본 발명에 따라,hedgehog길항제의 도포를 비롯한 이런 궤양의 치료는 병든 상피의 비정상적인 증식과 분화를 감소시켜, 후속 염증 현상의 심각도를 감소시키는데 도움이 될 수 있다.
본 발명과 조성물을 피부 질환에 기인하는 상처, 예를 들면 건선과 같은 자가면역 질환에 의한 병소를 치료하는 데에도 이용될 수 있다. 아토피성 피부염은 화분, 음식, 비듬, 곤충 독, 식물 독소와 같은 알레르기원에 의해 유발되는 면역 반응과 연관된 알레르기에 기인하는 피부 외상을 의미한다.
다른 구체예에서,hedgehog길항제의 항증식성 조성물은 낭외 백내장 적출술의 수술후 합병증을 예방하기 위하여 수정체 상피 세포 증식을 저해하는데 사용될 수 있다. 백내장은 난치성 안 질환으로, 백내장 치료와 관련된 다양한 연구가 실시되었다. 하지만, 현재까지 백내장의 치료는 외과적 수술에 의해 달성된다. 백내장 수술은 오랜 기간동안 실용되었으며, 다양한 수술 방법이 검토되었다. 낭외 안구 적출술은 백내장을 제거하는데 선택되는 방법이다. 낭내 적축술에 비하여 기술의 주요 이점은 무수정체성 낭포 황반 부종과 망막 박리의 낮은 빈도이다. 낭외 적출술은 대부분의 경우에 수정체로 선택되는 안구 후방 수정체의 이식에도 요구된다.
하지만, 낭외 백내장 적출술의 단점은 후-백내장이라고 하는 수정체낭 후막 혼탁의 높은 빈도인데, 이는 수술후 3년 이내에 최대 50%의 환자에서 발생할 수 있다. 후-백내장은 낭외 수정체 적출술이후에 남아있는 적도와 수정체낭 전막 상피 세포의 증식에 의해 유발된다. 이들 세포는 증식하여 소멀링(sommerling)링을 유발하고, 수정체낭 후막에서 침착하고 발생하는 섬유아세포와 함께 수정체낭 후막의 혼탁을 유발하는데, 이는 시야를 간섭한다. 후-백내장의 예방은 치료보다 선호된다. 이차 백내장 형성을 저해하기 위하여, 본 발명의 방법은 남아있는 수정체 상피 세포의 증식을 저해하는 수단을 제공한다. 가령, 이런 세포는 수정체 제거후에 안구 전방에hedgehog길항제 조성물을 함유하는 용액을 주입하여 정지 상태로 유도할 수 있다. 게다가, 상기 용액은 안구 전방에 주입될 때 최소한의 효과량이 제공되도록 삼투압 균형을 맞춤으로써, 피막하 상피 성장을 특이적으로 저해할 수 있다.
본 발명의 방법은 예로써 안구 표면의 상피 성장저하 또는 편평세포 암종과 같은 안구 상피 질환에서 피부각질 상피 세포 증식으로 나타나는 피부각질 병리의 치료에도 이용될 수 있다.
Levine et al. (1997) J Neurosci 17:6277에서는 hedgehog 단백질이 척추동물 망막에서 유사분열과 광수용체 분화를 조절할 수 있고 Ihh가 망막 선조세포 증식과 광수용체 분화를 촉진하는 색소 상피로부터 후보 인자라고 보고하였다. 유사하게, Jenden et al.(1997) Development 124:363에서는 Sonic hedgehog 단백질의 아미노-말단 단편으로 분만전후 생쥐 망막 세포의 배양액을 처리하면 전체 세포수에서 브로모데옥스우리딘을 통합하는 세포 및 간상 광수용체에서 아마크린(amacrine) 세포와 Muller 신경교 세포의 비율이 증가한다고 입증하였다.이는 Sonic hedgehog가 망막 전구세포의 증식을 촉진한다는 것을 암시한다. 따라서, 본 발명의 방법은 망막 세포의 증식 질환을 치료하고 광수용체 분화를 조절하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 머리카락 성장을 조절하는데 본 발명의 방법의 이용에 관한다. 머리카락은 기본적으로, 거친 불용성 단백질인 케라틴으로 구성된다; 이의 강도는 시스테인의 이황화 결합에 주로 기초한다. 개별 머리카락은 실린더형 모간과 모근으로 구성되고, 피부에서 플라스크-유사한 함몰인 모낭에 들어있다. 모낭의 바닥은 유두라고 하는 손가락-유사한 돌출을 보유하는데, 유두는 머리카락이 성장하는 결합 조직으로 구성되고 혈관은 유두를 통하여 세포에 영양을 공급한다. 모간은 피부 표면으로부터 외부로 확장하는 부분인 반면, 모간은 머리카락의 매몰된 부분이다. 모근의 기부는 유두에 놓여 있는 모구로 확장한다. 머리카락이 만들어지는 세포는 모망의 모구에서 성장한다; 이들은 세포가 모낭에서 증식함에 따라 섬유 형태로 돌출된다. 머리카락 "성장"은 분열 세포에 의한 머리카락 섬유의 형성과 신장을 의미한다.
당분야에 공지된 바와 같이, 통상의 머리카락 사이클은 3가지 단계: 성장기(anagen), 퇴축기(catagen), 휴지기(telogen)로 구분된다. 성장기동안, 모유두의 표피 줄기 세포는 급속하게 분열된다. 딸세포는 상향 이동하고 분화되어 머리카락 자체의 집중 층을 형성한다. 퇴축기는 모낭에서 줄기 세포의 유사분열 중지로 특성화된다. 휴지기의 머리카락은 새로이 발달하는 머리카락이 모낭으로부터 휴지기-단계 줄기를 구축하기 전에 수주동안 두피내에 유지된다. 이런 모델로부터, 머리카락 세포로 분화되는 분열 줄기 세포의 풀이 많을수록 좀더 많은 머리카락이 성장한다. 따라서, 머리카락 성장을 증가시키거나 감소시키는 방법은 이들 줄기 세포의 증식을 강화시키거나 저해함으로써 달성할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 컷팅(cutting), 깎음(shaving) 또는 탈모에 의한 통상적인 제거와 달리 사람 머리카락의 성장을 감소시키는 방법으로 이용될 수 있다. 가령, 본 발명의 방법은 머리카락의 비정상적으로 급속하거나 조밀한 성장으로 특성화되는 모발증, 예를 들면 다모증의 치료에 이용될 수 있다. 전형적인 구체예에서,hedgehog길항제는 비정상적인 다모로 특성화되는 질환인 조모증을 관리하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 탈모 기간을 연장하는 과정을 제공할 수도 있다.
게다가,hedgehog길항제는 세포 독성보다는 상피 세포로의 성장을 억제하기 때문에, 효능을 위하여 세포-주기의 S-단계로의 진행을 요구하는 세포독성 작용제, 예를 들면 방사선-유도된 사멸로부터 모낭 세포를 보호하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의한 치료는 예로써 모낭 세포가 S-단계로 진입하는 것을 저해하여 모낭 세포에서 유사분열 재해 또는 예정된 세포 사멸을 예방함으로써, 이들 세포를 정지시켜 보호를 제공할 수 있다. 가령,hedgehog길항제는 통상적으로 머리카락 상실을 초래하는 화학- 또는 방사선-요법을 겪는 환자에 사용될 수 있다. 이런 요법동안 세포-주기 진행을 저해함으로써, 본 발명의 방법은 세포 사멸 프로그램의 활성화에 기인하는 사멸로부터 모낭 세포를 보호할 수 있다. 요법이 완결된 이후에, 본 발명의 방법은 모낭 세포 증식 저해의 동시 완화로 대체될 수 있다.
본 발명의 방법은 모낭염 데칼반, 모낭염 울에리테마토사 레티쿨라타 또는 켈로이드 모낭염과 같은 모낭염의 치료에도 이용될 수 있다. 가령,hedgehog길항제의 미용 조성물은 목의 악하 부위에서 가장 빈번하게 발생하고 면도와 연관된 만성 질환인 가여포염의 치료에 국소적으로 도포될 수 있는데, 이런 질환의 특징적인 병소는 홍반성 구진 및 매몰된 머리카락을 포함하는 농포이다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 상피 유래된 조직의 분화를 유도하거나 및/또는 증식을 저해하는데 이용될 수 있다. 이런 형태의 분자들은 상피 조직과 관련된 과형성 및/또는 신생물성 질환의 치료를 위한 분화 요법의 기초를 제공할 수 있다. 가령, 이런 조성물은 피부 세포의 비정상적인 증식이나 성장이 나타나는 피부 질환의 치료에 사용될 수 있다.
가령, 본 발명의 제약학적 조성물은 각화증과 같은 과형성 표피 질환의 치료 및 기저 세포 암종이나 편평 세포 암종과 같은 다양한 피부 암에서 높은 증식 속도로 특성화되는 신생물성 표피 질환의 치료를 목표한다. 본 발명의 방법은 피부에 영향을 주는 자가 면역 질환, 특히 예로써 건선이나 아토피성 피부염에 의해 유발되는 표피의 병적 증식 및/또는 각화를 수반하는 피부 질환의 치료에도 이용될 수 있다.
건선, 편평 세포 암종, 각화극세포종, 화학선 각화증과 같은 다수의 일반적인 피부 질환은 국소적인 비정상적 증식과 성장으로 특성화된다. 가령, 피부에서 비늘모양의 적색 플라크로 특성화되는 건선에서, 각화세포는 정상보다 훨씬 빠르게 증식하고 다소 불완전하게 분화되는 것으로 알려져 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 피부 세포의 비정상적 증식을 유발하는 각화와 연관된 피부병의 치료에 적합한데, 이런 질환은 염증성이나 비-염증성 구성요소로 특성화된다. 예시하면, 무활동이나 분화를 촉진하는hedgehog길항제의 치료 조성물은 피부, 점막 또는 손톱에서 다양한 형태의 건선을 치료하는데 사용될 수 있다. 앞서 밝힌 바와 같이 건선은 "재생"경로를 통하여 눈에 띄는 증식 활성과 분화를 보이는 표피 각화세포로 전형적으로 특성화된다. 본 발명에 따른 방법의 항증식성 구체예로 치료는 병리학적 표피 활성을 역전시키고 이런 질환의 지속적인 완화를 위한 기초를 제공하는데 이용될 수 있다.
다양한 다른 각화성 병소 역시 본 발명의 방법에 의한 치료의 후보이다. 가령, 화학선 각화증은 일광이나 방사선에 노출된 피부에서 발생하는 표재 염증성 전암 종양이다. 이런 병소는 다양한 스케일링으로 홍반성이나 갈색이다. 현재의 요법은 절개나 냉동결요법(cryosurgery) 등이다. 하지만, 이들 치료는 고통스럽고 미용적으로 받아들이기 어려운 흉터를 유발한다. 따라서, 화학선 각화증과 같은 각화증의 치료에는 병소의 표피 세포의 과다증식을 저해하는 충분한 함량으로hedgehog길항제 조성물의 국소 도포가 포함될 수 있다.
여드름은 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 다른 피부병이다. 가령, 심상성 여드름은 10대와 청소년에서 가장 일반적으로 나타나는 다인자성 질환으로, 얼굴과 상체에 염증성과 비염증성 병소의 출현으로 특성화된다. 심상성 여드름을 유발하는 기본적인 결함은 과다활성 피지선 도관의 과다각화이다. 과다각화는 피부와 모낭 미생물의 정상적인 이동을 차단하여 박테리아 여드름균(Propionibacteriumacnes)과 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis) 및 진균 비듬균(Pityrosporum ovale)에 의한 리파아제의 방출을 촉진한다. 항증식성 hedgehog 길항제, 특히 국소 조성물로 치료는 병소 형성을 유발하는 과다각화와 같은 이런 도관의 과도기적 특성을 예방하는데 효과적이다. 본 발명의 치료제는 예로써 항생제, 레티노이드, 항안드로젠을 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 다양한 형태의 피부염을 치료하는 방법을 제시한다. 피부염은 소양증, 홍반, 비늘모양, 물집, 삼출, 갈라짐 또는 딱딱한 피부로 특성화되는 구별이 불량한 병소를 의미하는 용어이다. 이들 병소는 여러 원인으로부터 기인한다. 가장 일반적인 유형의 피부염은 아토피성 피부염, 접촉 피부염, 기저귀 피부염이다. 가령, 지루성 피부염은 과도한 건조 비늘의 박리로 여러 부위, 특히 두피에 부종, 건조하거나, 축축하거나 기름진 스케일링, 황색의 딱딱한 반점이 나타나는 만성적인 소양증 피부염이다. 본 발명의 방법은 일반적으로 만성적인 습진성 피부염인 울혈성 피부염의 치료에도 이용될 수 있다. 화학선 피부염은 일광. 자외선 또는 X-나 감마-방사선으로부터 기인하는 화학선 방사선에 노출로 인한 피부염이다. 본 발명에 따라, 본 발명의 방법은 상피 세포의 원치않는 증식으로 유발된 피부염의 특정 증상의 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있다. 이들 다양한 형태의 피부염에 대한 이런 요법에는 국소와 전신 코르티코스테로이드, 항소양제, 항생제가 포함될 수 있다.
가령, 본 발명의 방법은 혈관생성을 저해하는데 이용될 수 있다. hedgehog는 혈관생성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. hedgehog 단백질로 채워지고 생쥐에삽입된 마트리겔 플러그(matrigel plug)는 실질적인 혈관신생을 나타내는 반면, hedgehog를 보유하지 않는 마트리겔 플러그(matrigel plug)는 상대적으로 적은 신행혈관을 보인다. hedgehog 단백질은 정상적인 무혈성 생쥐 각막의 신행혈관을 증가시킬 수도 있다.ptc-1유전자는 대동맥의 내피 세포, 혈관 평활근 세포, 대동맥의 뇌막 섬유아세포, 관상 맥관 구조, 동맥과 심실의 심근세포를 비롯한 정상적인 혈관 조직에서 발현된다. 이들 조직 역시 hedgehog 단백질에 민감하다. 외인성 hedgehog로 치료는ptc-1발현의 상향조절을 유도한다. 이에 더하여, hedgehog 단백질은 맥관 평활근 세포의 생체내 증식을 촉진한다. hedgehog 단백질은 섬유아세포가 혈성형성 성장 인자, 예를 들면 VEGF, bFGF, Ang-1, Ang-2의 발현을 증가시키도록 유도한다. 마지막으로, hedgehog 단백질은 허혈성 손상으로부터 회복을 촉진하고 곁맥관의 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
hedgehog가 혈관생성을 촉진한다는 점을 고려하면, hedgehog 길항제는 특히 일부 수준의 hedgehog 신호전달이 혈관생성에 요구되는 상황에서, 혈관생성 저해물질로 기능할 것으로 기대된다.
혈관생성은 많은 질환의 근원이다. 지속적이고 무절제한 혈관생성은 상피 세포에 의한 다양한 병적 상태, 종양 전이, 비정상적 성장에서 나타난다. 혈관생성 과정으로 만들어진 맥관구조는 이들 질환에서 관찰되는 병리학적 손상을 뒷받침한다. 무절제한 혈관생성에 기인하는 다양한 병리학적 상태는 혈관생성 의존 질환과 혈관생성 관련 질환으로 구분된다. 혈관생성 과정의 조절을 목적하는 요법은 이들 질환의 소멸 또는 완화를 유도할 수 있다.
혈관생성에 의해 야기되거나, 지지되거나 또는 이와 연관된 질환은 안구 신생혈관 질환, 퇴행성 각막 질환, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부반응, 신행혈관 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 유행성 각결막염, 비타민 a 결핍증, 콘텍트 렌즈 장기착용, 아토피성 각막염, 상윤부 각막염, 익상편 각막염 건조증상, 쉐그렌 주사, 필렉테눌로시스, 매독, 결핵 감염, 지질 변성, 화학적 화상, 박테리아 궤양, 진균 궤양, 단순 포진 감염, 대상 포진 감염, 원생 동물 감염, 카포시 육종, 무렌 궤양, 테리엔 변연 변성, 변연 융해증, 류머티스 관절염, 전신 루프스, 다발성 동맥염, 외상, 웨그너 유육종증, 공막염, 스트븐 존슨 질환, 페리피고이드 방사상 각막절개술, 골관절염 만성 염증(예, 궤양성 대장염 또는 크론병), 혈관종, Osler-Weber-Rendu 질환, 유전성 출혈성 모세혈관확장 등이다.
이에 더하여, 혈관생성은 암에서 중요한 역할을 수행한다. 종양은 영양분을 공급하고 세포 노폐물을 제거하는 혈액 공급없이 확장할 수 없다. 혈관생성이 중요한 종양에는 횡문근육종, 망막모세포종, 유잉 육종, 신경모세포종, 골육종과 같은 고형 종양 및 청 신경종, 신경섬유종증, 트라코마, 화농 육아종과 같은 양성 종양이 포함된다. 혈관생성의 예방은 이들 종양의 성장 및 종양의 존재로 인한 동물의 결과적 손상을 중단시킬 수 있다. 혈관생성은 혈액 세포의 무절제한 증식이 발생하고 림프절, 간, 비장의 활력 결핍, 손상된 혈전, 확장을 일반적으로 동반하는 백혈병, 골수의 다양한 급성이나 만성 신생물성 질환과 같은 혈액 종양과도 연관한다. 혈관생성은 백혈병-유사 종양을 유발하는 골수 비정상에서 일정한 역할을 수행하는 것으로 생각된다.
종양 성장 이외에, 혈관생성은 전이에도 중요하다. 처음에, 혈관생성은 암성 세포가 혈류로 진입하여 전신을 순환할 수 있도록 하는 종양의 맥관화에 중요하다. 종양 세포가 원발 부위로부터 이차 전위 부위로 이탈한 이후에, 새로운 종양의 성장과 확대에 앞서 혈관생성이 선행하여야 한다. 따라서, 혈관생성의 예방은 종양의 전이를 예방하고 원발 부위에서 신생물 성장을 억제할 수 있다.
혈관생성은 재생과 상처 치료와 같은 생리학적 과정에도 관여한다. 혈관생성은 배란 및 수정이후 포배의 착상에서 중요한 단계이다. 혈관생성의 예방은 무월경을 유도하거나, 배란을 차단하거나 또는 포배에 의한 착상을 예방하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 호흡 곤란 증후군 또는 부적절한 폐 표면장력에 기인하는 다른 질환의 치료 및/또는 예방에 유용할 것으로 기대된다. 호흡 곤란 증후군은 폐의 폐포에서 불충분한 계면활성제에 기인한다. 척추동물의 폐는 표면장력이 폐 들숨동안 상승하고 폐 날숨동안 감소하도록 하는 지질과 단백질의 복합성 혼합물인 계면활성제를 보유한다. 폐 날숨동안 계면활성제는 감소하고, 따라서 폐포 허탈을 조장하는 표면력이 부재한다. 날숨동안 허탈해지지 않은 산소공급된 폐포는 혈액과 폐포 가스 사이에 연속적인 산소와 이산화탄소 전달을 가능하게 하고, 후속 들숨동안 팽창시키는데 훨씬 적은 힘을 요구한다. 팽창동안, 폐포 표면 영역이 증가함에 따라서 폐 계면활성제는 표면장력을 증가시킨다. 확장 폐포에서 상승된 표면장력은 이들 공기층에서 과다-팽창을 억제하고 들숨된 공기를 덜-통기된 폐포로 전이시켜 폐 통기를 더욱 조장한다.
호흡 곤란 증후군은 미숙아에서 특히 많이 나타난다. 일반적으로, 폐 계면활성제는 태아 발생과정의 마지막 6주까지 매우 느린 속도로 합성된다. 정상 출산 기간보다 6주 이상 빨리 태어난 사람 태아는 부족한 함량의 폐 계면활성제 및 부적절한 계면활성제 합성 속도를 안고 태어날 위험이 높다. 태아가 좀더 미숙한 상태로 태어날수록, 계면활성제 부족은 점점 더 심각해진다. 심각한 계면활성제 결핍은 출생 수분이나 수시간이내에 호흡 부전을 초래할 수 있다. 계면활성제 결핍은 최대한의 들숨 노력에도 불구하고 폐가 확장하는 능력의 감소로 인하여, 폐포의 진행성 허탈(무기폐)을 유발한다. 결과적으로, 부적절한 함량의 산소가 유아의 혈액에 도달한다. RDS는 계면활성제 생합성의 부전으로 인하여 성인에서도 발생할 수 있다.
미숙아의 폐 조직은 hedgehog 신호전달 경로의 높은 활성을 보인다. hedgehog 길항제를 이용한 이런 경로의 저해는 박막층체의 형성을 증가시키고 계면활성제 생합성에 관여하는 유전자의 발현을 증가시킨다. 박막층체는 계면활성제 합성과 연관된 아세포 구조이다. 이런 이유로, hedgehog 길항제로 미숙아의 치료는 계면활성제 생합성을 촉진하고 RDS를 완화시킨다. 성체 RDS가 hedgehog 신호전달 경로와 연관하는 환자에서도 hedgehog 길항제 치료가 효과적이다.
hedgehog 길항제는 병든 조직 및/또는 세포가 높은 hedgehog 경로 활성화를 보이는 질환을 특이적으로 표적할 수 있다.gli유전자의 발현은gli-1,gli-2,gli-3발현을 비롯한 hedgehog 신호전달 경로에 의해 활성화된다.gli-1발현은 광범위한 조직과 질환에서 hedgehog 신호전달 경로와 가장 일관되게 상관하는반면,gli-3은 다소 덜하다.gli유전자는 hedgehog 신호전달의 완전 효과를 유도하는데 필요한 많은 유전자의 발현을 활성화시키는 전사 인자를 인코드한다. 하지만, Gli-3 전사 인자는 hedgehog 주효체 유전자의 억제물질로 기능할 수도 있고, 따라서gli-3의 발현은 hedgehog 신호전달 경로의 효과를 감소시킬 수 있다. Gli-3이 전사 활성물질 또는 억제물질로 작용하는 지는 해독후 현상에 좌우되고, 따라서 활성화 형태(vs. 억제 형태)의 Gli-3 단백질을 탐지하는 방법 역시 hedgehog 경로 활성화의 신뢰할만한 척도가 될 것으로 기대된다.gli-2유전자 발현은 hedgehog 경로 활성화에 대한 신뢰할만한 마커를 제공할 것으로 기대된다.gli-1유전자는 광범위한 범위의 암, 과형성, 미성숙 폐에서 강하게 발현되며 hedgehog 경로의 상대적 활성화에 대한 마커로 기능한다. 이에 더하여,gli유전자 발현을 보이는 미성숙 폐와 같은 조직은 hedgehog 저해물질로부터 강한 영향을 받는다. 따라서,gli유전자 발현의 탐지는 hedgehog 길항제 치료로가 특히 유효한 조직과 질환을 동정하는데 강력한 예측 도구로 이용될 수 있다.
바람직한 구체예에서,gli-1발현 수준은 전사체의 직접 탐지 또는 단백질 수준이나 활성의 탐지에 의해 탐지된다. 전사체는 gli-1 전사체 또는 이로부터 합성된 cDNA에 탐침의 혼성화에 주로 기초하는 여러 다양한 기술을 이용하여 탐지할 수 있다. 공지된 기술에는 노던 블랏팅, 역전사효소 PCR, 전사체 수준의 마이크로어레이 분석 등이 포함된다. Gli 단백질 수준을 탐지하는 방법에는 웨스턴 블랏팅, 면역침전, 2차원 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(2D SDS-PAGE)(적절하게는, Gli 단백질의 위치가 결정된 표준과 비교하여), 질량 분광법 등이 포함된다. 질량분광법은 일련의 정제 단계와 결합시켜, 특정 시료에서 서로 다른 다양한 단백질 수준을 대규모로 동정할 수 있다. 질량 분광법과 2D SDS-PAGE 역시 단백분해 현상, 유비퀴틴화, 인산화, 지질 변경 등을 비롯한 단백질의 해독후 수식을 확인하는데 이용될 수 있다. 겔 활성 역시 기질 DNA에 결합 또는 표적 프로모터의 시험관내 전사 활성화를 분석하여 평가할 수 있다. 겔 이동 분석, DNA 풋트프린팅 분석, DNA-단백질 교차결합 분석은 FDNA에서 Gli 결합 부위에 결합할 수 있는 단백질의 존재를 평가하는데 이용되는 방법이다.
바람직한 구체예에서,gli전사체 수준을 측정하고 비정상적으로 높은gli수준을 보이는 병든 조직은 hedgehog 길항제로 치료한다. 미성숙 폐 조직, 폐암(예, 선암종, 기관지-폐포 암종, 소형 세포 암종), 유방암(예, 아래 유관 암종, 아래 소엽상조직 암종, 관상 암종), 전립선암(예, 선암종), 양성 전립성 과형성은 특정 환자에서 매우 높은gli-1발현을 보인다. 따라서,gli-1발현 수준은 이들 조직중 어느 것을 hedgehog 길항제로 치료할 것인지를 결정하는데 강력한 진단 장치이다. 이에 더하여, 상호관련된 여러 증거에 의해, 요로상피 세포의 암(예, 방광암, 다른 요로상피암) 역시 특정 환자에서 상승된gli-1수준을 갖는다는 것이 실질적으로 확인되었다. 가령, 크로모좀 9q22에서 이형접합성의 상실이 방광암에서 흔히 발생한다.ptc-1유전자는 이 지점에 위치하고,ptc-1기능 상실은 많은 다른 암 유형에서처럼 과다증식의 부분적인 원인이 된다. 따라서, 이런 암 역시 높은gli발현을 보이고 hedgehog 길항제 치료에 특히 반응한다.
ptc-1과ptc-2의 발현 역시 hedgehog 신호전달 경로에 의해 활성화되지만,이들 유전자는 hedgehog 경로 활성화의 마커로서gli유전자보다 열등하다. 특정 조직에서는 hedgehog 경로가 매우 활성화되었음에도 불구하고ptc-1과ptc-2중 하나만 발현된다. 가령, 고환 발달에서 Indian hedgehog는 중요한 역할을 수행하고 hedgehog 경로가 활성화되지만,ptc-2만 발현된다. 따라서, 양 유전자의 동시 측정이 hedgehog 길항제로 치료될 조직의 유용한 지표로서 간주되긴 하지만, 이들 유전자 각각은 hedgehog 경로 활성화의 신뢰할만한 마커가 되지 못한다.
본 발명의 방법으로 치료되는 질환은 옴과 같은 비-사람에 특이적인 질환이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 사람 암, 특히 기저 세포 암종 및 피부와 같은 상피 조직의 다른 종양의 치료에 이용될 수 있다. 가령, hedgehog 길항제는 기저 세포 모반 증후군(BCNS) 및 다른 사람 암종, 선암종, 육종 등에 대한 치료의 일부로 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 기저 세포 암종을 치료(또는 예방)하는 치료나 예방 섭생의 일부로 이용된다.hedgehog신호전달 경로의 조절이상은ptc돌연변이에 의해 유발된 기저 세포 암종의 전반적인 특징이다. 사람ptcmRNA의 지속적인 과다발현은 in situ 혼성화 측정에서 가족성과 산발성 BCC의 종양에서 보고되었다.ptc를 불활성화시키는 돌연변이는 변이체Ptc의 과다발현을 유발할 것으로 예상되는데, 그 이유는ptc가 네거티브 자가 조절을 보이기 때문이다. 선행 연구에서는 hedgehog 단백질의 과다발현이 또한 종양형성을 유도한다고 보고하였다. sonic hedgehog(Shh)가 생쥐에서 종양형성에 일정한 역할을 한다는 것은 피부에서Shh를 과다발현하는 외래유전자도입 생쥐에서 수일간의 피부 발생후 전체 피부 표면에서 다중 BCC-유사 표피 증식을 비롯한 BCNS의 특징이 나타난다는 연구로부터 제안되었다. BCC로부터Shh사람 유전자에서 돌연변이 역시 보고되었다; 사람에서Shh또는 다른 Hh 유전자는 사람에서 주도적인 종양유전자로 기능하는 것으로 제안되었다. 산발성ptc돌연변이는 정상적인 개체의 BCC에서도 관찰되었는데, 이들중 일부는 UV-기호 돌연변이이다. 산발성 BCC의 최근 한 연구에서, CT 또는 CCTT 변화의 5가지 UV-기호형 돌연변이가ptc돌연변이를 보유하는 것으로 확인된 15가지 종양에서 발견되었다. BCC와 신경외배엽 종양에서 산발성ptc돌연변이의 다른 최근 분석에서, BCC에서 발견된 3가지ptc돌연변이중 한가지에서 하나의 CT 변화가 확인되었다(Goodrich et al.(1997) Science 277:1109-13; Xie et al.(1997) Cancer Res 57:2369-72; Oro et al.(1997) Science 276:817-21; Xie et al.(1997) Genes Chromosomes Cancer 18:305-9; Stone et al.(1996) Nature 384:129-34; johnson et al.(1996) Science 272:1668-71).
본 발명의 방법은 예로써ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function) 또는smoothened기능 획득으로 인한 BCC 또는 이런 질환의 다른 효과를 예방하기 위하여 BCNS 환자를 치료하는 데에도 이용될 수 있다. 기저 세포 모반 증후군은 어린 나이에 나타나는 다발성 BCC로 특성화되는 희귀한 상염색체 우성 질환이다. BCNS 환자는 이들 종양의 발달에 매우 취약하다; 10대에서는 피부의 일광-노출된 부위에 주로 나타난다. 이 질환은 늑골, 머리, 얼굴 변형 및 때때로 다지증, 합지증, 척추 이분증을 비롯한 다수의 발육 이상을 초래한다. 이들은 BCC 이외에 다수의 종양 유형: 난소와 심장의 섬유종, 피부와 아래턱의 낭포, 중추 신경계에서 속질모세포종과 뇌수막종을 유발시킨다. 본 발명의 방법은 BCNS와 비-BCNS 환자에서 이런 종양 유형을 예방하거나 치료하는데 이용될 수 있다. BCNS 환자의 연구에서 이들은 ptc 유전자에서 유전체 돌연변이와 산발성 돌연변이를 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이는 이들 돌연변이가 상기 질환의 궁극적 원인이라는 것을 암시한다.
다른 측면에서, 본 발명은hedgehog길항제를 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다. 본 발명에 사용되는hedgehog길항제는 생물학적으로 수용가능한 매체, 예를 들면 물, 완충 염수, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 또는 이들의 적절한 혼합물로 투여용 조성물로 제조될 수 있다. 선택된 매체에서 활성 성분의 최적 농도는 의화학 분야에 공지된 과정에 따라 경험적으로 결정할 수 있다. 본원에서 "생물학적으로 수용가능한 매체"에는 제약학적 조성물의 원하는 투여 루트에 적합한 모든 용매, 분산 매체 등이 포함된다. 제약학적 활성 물질에 이런 매체의 사용은 당분야에 공지된 것이다. 통상적인 매체가hedgehog길항제와 맞지 않는 경우를 제외하고, 본 발명의 제약학적 조성물에서 이의 사용을 계획한다. 다른 단백질을 포함하는데 적합한 부형약과 이들의 조성물은 예로써 Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, pa., USA 1985). 이들 부형약에는 주사가능 "저장소 조성물"이 포함된다.
본 발명의 제약학적 조성물에는 수의 조성물, 예를 들면 개와 같은 가축이나애완동물의 치료에 적합한hedgehog길항제의 제약학적 조성물이 포함될 수 있다.
도입 방법은 충전가능 또는 생분해성 장치에 의해 제공될 수 있다. 최근에 약물의 조절된 전달을 위한 다양한 지연 방출 중합성 장치가 개발되어 생체내 시험중에 있다. 생분해성과 비-생분해성 중합체를 비롯한 다양한 생물적합성 중합체(하이드로겔 포함)가 특정 표적 부위에서hedgehog길항제의 서방용 이식물을 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 장관외, 국소 또는 직장으로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 각 투여 루트에 적합한 형태로 제공된다. 가령, 이들은 정제나 캡슐 형태로 투여; 주사액, 흡입제, 세안제, 연고, 좌약, 조절 방출 패치 등의 형태로 주사, 주입 또는 흡입 투여; 로션이나 연고 형태로 국소 투여; 좌약 형태로 직장 투여된다. 경구와 국소 투여가 선호된다.
본원에서 "장관외 투여"는 장과 국소 투여를 제외한 투여 양식, 일반적으로 주사에 의한 투여 양식을 의미하는데, 여기에는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 수정체낭내, 안구내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 수강내 흉골내 주사와 주입이 포함된다.
본원에서 "전신 투여"는 화합물, 약물 또는 물질의 직접적이지 않은 중추신경계로 투여, 예를 들면 피하 투여를 의미하고, 따라서 상기 화합물은 환자 신체에 진입하여 대사 및 다른 유사 과정을 겪게 된다.
이들 화합물은 분말, 연고 또는 드롭 형태로 구강, 비강 등을 비롯한 임의의 적합한 투여 루트, 예를 들면 설하와 협측을 비롯하여 분무, 직장, 질내, 장관외,대조내로 사람과 다른 동물에 투여될 수 있다.
선택된 투여 루트에 상관없이, 적절한 수화된 형태 및/또는 본 발명의 제약학적 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물은 본원에서 밝힌 방법이나 당업자에게 공지된 다른 통상적인 방법으로 제약학적으로 수용가능한 약형으로 제조된다.
본 발명의 제약학적 조성물에서 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에 독성 없이 특정 환자, 조성물, 투여 양식에서 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 함량을 얻기 위하여 변경될 수 있다.
선택된 용량 수준은 본 발명에 따른 특정 화합물의 활성, 투여 루트, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 다른 약물, 특정hedgehog길항제와 병용되는 화합물이나 물질, 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강, 치료 환자의 이전 병력, 의료 분야에 잘 알려진 인자를 비롯한 다양한 인자에 좌우된다.
당분야에 통상적인 지식을 가진 의사 또는 수의사는 제약학적 조성물의 효과량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 가령, 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위하여 필요한 수준보다 낮은 수준에서 제약학적 조성물에 사용되는 본 발명에 따른 화합물의 용량을 시작하여 원하는 효과가 달성될 때까지 점진적으로 증가시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 화합물의 일일 적량은 치료 효과를 유도하는데 효과적인 화합물의 최소량이다. 이런 효과량은 일반적으로, 앞서 밝힌 인자에 좌우된다. 일반적으로, 환자에서 본 발명에 따른 화합물의 정맥내, 뇌실내, 피하 용량은 일일 체중 ㎏당 0.0001 내지 100 ㎎이다.
원하는 경우, 활성 화합물의 일일 효과량은 선택적으로 단위 약형으로 하루중 적절한 간격으로 개별 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 부분용량으로 투여될 수 있다.
"치료"에는 예방, 치료, 교정이 포함된다.
이런 치료를 받은 환자는 영장류, 특히 사람과 다른 포유동물, 예를 들면 말, 소, 돼지, 양 및 전반적인 가금과 가축을 비롯한 임의의 동물이다.
본 발명의 화합물은 제약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 무균 담체와 혼합물로 투여될 수 있고, 다른 항균제, 예를 들면 페니실린, 세팔로스포린, 아미노글리코시드, 글리코펩티드와 함께 투여될 수도 있다. 따라서, 연속 요법에는 첫 투여의 치료 효과가 완전히 소멸되기 이전에 후속 투여를 실시하는 방식으로 활성 화합물의 순차적, 동시, 개별 투여가 포함된다.
V. 제약학적 조성물
본 발명의 화합물은 단독 투여할 수도 있지만, 제약학적 조성물로 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의hedgehog길항제는 사람이나 가축에 사용하기 용이한 약품으로 투여에 맞게 제조될 수 있다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물에 포함되는 화합물은 자체로서 활성을 보이거나, 또는 예로써 생리 환경에서 활성 화합물로 전환될 수 있는 프로드러그이다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 한가지이상 제약학적으로 수용가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함께, 앞서 밝힌 한가지이상 화합물의 치료요법적 효과량을 함유하는 제약학적으로 수용가능한 화합물을 제시한다. 아래에서 밝힌 바와같이, 본 발명의 제약학적 조성물은 다음에 적합되는 형태를 비롯한 고체 또는 액체 형태로 투여에 맞게 개별적으로 제조될 수 있다: (1) 예로써 혀로 투여되는 물약(수성이나 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제, 거환, 분말, 과립, 페이스트로 경구 투여; (2) 예로써 무균 용액이나 현탁액으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사로 장관외 투여; (3) 예로써 피부에 도포되는 크림, 연고 또는 스프레이로 국소 도포; 또는 (4) 예로써 페서리, 크림 또는 거품으로 질내 또는 직장내. 하지만, 특정 구체예에서 본 발명의 화합물은 무균수에 단순히 용해시키거나 현탁시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 비-발열원성이다, 다시 말하면 환자의 체온을 상승시키지 않는다.
본원에서 "치료요법적 효과량"은 동물에서 세포의 적어도 부차집단에서 합리적인 이익/위험 비율로,ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function),smoothened기능 획득을 극복하고 치료된 세포에서 상기 경로의 생물학적 결과를 차단함으로써 원하는 치료 효과를 유도하는데 효과적인 본 발명에 따른 화합물, 물질, 또는 이런 화합물을 함유하는 조성물의 함량을 의미한다.
본 발명에서 "제약학적으로 수용가능한"은 건전한 의학적 판단 범위에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제점이나 합병증 없이 사람과 동물의 조직과 접촉하여 사용하는데 적합하고 합리적인 위험/위험 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 약형을 의미한다.
본원에서 "제약학적으로 수용가능한 담체"는 본 발명의 길항제를 한 기관이나 신체 일부에서 다른 기관이나 신체 일부로 수송하거나 전달하는 제약학적으로 수용가능한 물질, 조성물 또는 부형약, 예를 들면 액체나 고체 충진제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각 담체는 조성물의 다른 성분과 양립하고 환자에게 유해하지 않다는 점에서 수용가능해야 한다. 제약학적으로 수용가능한 담체로 기능할 수 있는 물질의 일부 예는 다음과 같다: (1) 락토오스, 글루코오스, 수크로오스와 같은 당; (2) 옥수수 전분과 감자 전분과 같은 전분; (3) 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스와 이의 유도체; (4) 분말 트래거캔스; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 코코아 완충액과 좌약 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩기름, 면실기름, 해바라기기름, 참기름, 올리브기름, 옥수수기름, 콩기름와 같은 기름; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 솔비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레이트와 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 아가; (14) 수산화마그네슘과 수산화알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열원-없는 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) 인산염 완충액; (21) 제약학적 조성물에 사용되는 다른 적합한 비-독성 물질.
앞서 밝힌 바와 같이, 본 발명에 따른hedgehog길항제의 특정 구체예는 염기성 작용기, 예를 들면 아미노 또는 알킬아미노를 보유하고, 따라서 제약학적으로 수용가능한 산과 제약학적으로 수용가능한 염을 형성할 수 있다. 이런 측면에서 "제약학적으로 수용가능한 염"은 본 발명에 따른 화합물의 상대적으로 비-독성의 무기와 유기 산 첨가 염을 의미한다. 이들 염은 본 발명에 따른 화합물의 최종 분리와 정제동안in situ로 만들거나, 또는 적합한 유기나 무기산과 유리 염기 형태의 본 발명의 정제된 화합물을 개별적으로 반응시키고 이렇게 생성된 염을 분리함으로써 만들 수 있다. 대표적인 염은 브롬화수소산염, 염화수소산염, 황산염, 이황산염, 인산염, 질산염, 아세테이트, 발레레이트, 올레이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 라우릴설포네이트 염 등이다(Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1-19).
본 발명에 따른 화합물의 제약학적으로 수용가능한 염에는 예로써 비-독성 유기나 무기 산으로부터 상기 화합물의 통상적인 비독성 염이나 사원 암모늄 염이 포함된다. 가령, 이런 통상적인 비독성 염에는 무기산으로부터 유래된 염, 예를 들면 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 인산, 질산 등; 유기산으로부터 유래된 염, 예를 들면 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 구연산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리사이클산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이소티온산 등이 포함된다.
다른 경우에, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 산성 작용기를 보유하고, 따라서 제약학적으로 수용가능한 염기와 제약학적으로 수용가능한 염을 형성할 수 있다. 이들 경우에 "제약학적으로 수용가능한 염"은 본 발명에 따른 화합물의 상대적으로 비-독성의 무기와 유기 염기 첨가 염을 의미한다. 유사하게, 이들 염은 본 발명에 따른 화합물의 최종 분리와 정제동안in situ로 만들거나, 또는 적합한 염기, 예를 들면 제약학적으로 수용가능한 금속 양이온의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염, 암모니아, 또는 제약학적으로 수용가능한 유기 일차, 이차 또는 삼차 아민과 유리 산 형태의 본 발명의 정제된 화합물을 개별적으로 반응시키고 이렇게 생성된 염을 분리함으로써 만들 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토류 금속 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄 염 등이다. 염기 첨가 염의 형성에 유용한 대표적인 유기 아민은 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진 등이다(Berge et al., supra).
적심제, 유화제, 윤활제(예, 소디움 라우릴 설페이트와 마그네슘 스테아레이트), 착색제, 방출제, 코팅제, 감미료, 향료, 방향제, 방부제, 항산화제 역시 조성물에 포함될 수 있다.
제약학적으로 수용가능한 항산화제의 예는 다음과 같다: (1) 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소디움 비설페이트, 소디움 메타비설피트, 소디움 설피트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성 항산화제; (3) 구연산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제.
본 발명의 조성물은 구강, 비강, 국소(협측과 설하 포함), 직장, 질 및/또는 장관외 투여에 적합하다. 조성물은 약학 분야에 공지된 방법으로 단위 약형으로만들 수 있다. 단일 약형을 만들기 위하여 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 함량은 치료 숙주 및 특정 투여 양식에 따라 달라진다. 단일 약형을 만들기 위하여 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 함량은 일반적으로, 치료 효과를 유도하는 화합물의 함량이다. 일반적으로, 함량은 대략 1% 내지 99%, 적절하게는 대략 5% 내지 70%, 가장 적절하게는 대략 10% 내지 30%의 활성 성분이다.
이들 조성물을 제조하는 방법은 본 발명의 화합물과 담체 및 선택적으로 하나 이상의 보조 성분을 결합시키는 단계로 구성된다. 일반적으로, 조성물은 본 발명의 화합물을 액체 담체, 미세하게 갈라진 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하게 결합시키고, 필요한 경우 산물을 형성하여 만든다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 캡슐, 까세(cachet), 알약, 정제, 마름모꼴 정제(풍미 기준, 일반적으로 수크로오스와 아카시아 또는 트래거캔스), 분말, 과립의 형태; 수성이나 비-수성 액체에서 용액 또는 현탁액; 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼; 엘렉시르 또는 시럽; 패스틸(불활성 염기, 예를 들면 젤라틴과 글리신 또는 수크로오스와 아카시아 사용) 및/또는 구강청정제 등으로 투여되며, 이들 각각은 본 발명에 따른 화합물의 미리 결정된 함량을 활성 성분으로 함유한다. 본 발명의 화합물은 거환, 연약 또는 페이스트로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 본 발명의 고체 약형(캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 활성 성분은 한가지이상의 제약학적으로 수용가능한 담체, 예를 들면 구연산나트륨이나 인산이칼슘 및/또는 다음중 임의의 한가지: (1) 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 규산과 같은 충진제나 증량제; (2) 카르복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스, 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤과 같은 습윤제; (4) 아가-아가, 탄산칼슘, 감자나 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염, 탄산나트륨과 같은 붕해제; (5) 파라핀과 같은 용해 지연제; (7) 세틸 알코올과 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 적심제; (8) 카올린과 벤토나이트 점토와 같은 흡수제; (9) 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 라우릴 설페이트, 이들의 혼합물과 같은 윤활제; (10) 착색제와 혼합한다. 캡슐, 정제, 알약의 경우에, 제약학적 조성물은 완충제를 추가로 함유한다. 유사한 유형의 고체 조성물은 락토오스나 유당과 같은 부형제, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용한 연성과 경성 충진된 젤라틴 캡슐에서 충진제로 사용될 수도 있다.
정제는 선택적으로 한가지이상의 보조 성분과 함께, 압착 또는 성형(molding)으로 만들 수 있다. 압착된 정제는 결합제(예, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제(예, 소디움 전분 글리콜레이트 또는 교차-결합된 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스), 표면-활성이나 분산제를 이용하여 만들 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 축축해진 분말 화합물의 혼합물을 적절한 기계에서 성형하여 만들 수 있다.
정제, 또는 본 발명에 따른 제약학적 조성물의 다른 고체 약형, 예를 들면 당의정, 캡슐, 알약, 과립은 코팅, 예를 들면 장용 코팅 및 약물-제조 분야에 공지된 다른 코팅으로 선택적으로 달성할 수 있다. 또한, 이들은 예로써 원하는 방출 프로필을 제공하는 다양한 비율의 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 다른 중합체기질, 리포좀 및/또는 미소구를 사용하여, 활성 성분의 서방을 제공하도록 제조될 수 있다. 이들은 예로써 박테리아-유지 필터를 통한 여과로 멸균하거나, 또는 사용에 앞서 무균수 또는 다른 무균 주사가능 매체에 용해될 수 있는 무균 고체 조성물에 살균제를 혼합하여 멸균할 수 있다. 또한, 이들 조성물은 불투명제를 선택적으로 함유하고, 선택적으로 지연된 방식으로 위장관의 특정 부위에만 활성 성분을 방출할 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 중합성 물질과 왁스이다. 활성 성분은 한가지이상의 앞서 밝힌 부형제로 마이크로-캡슐화된 형태로 존재할 수도 있다.
본 발명에 따른 화합물의 경구 투여용 액체 약형에는 제약학적으로 수용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 엘릭시르 등이 포함된다. 활성 성분 이외에, 액체 약형은 당분야에 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면 물이나 다른 용매; 용해제와 유화제, 예를 들면 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 기름(특히, 면실기름, 땅콩기름, 옥수수기름, 배아기름, 올리브기름, 피마자기름, 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 솔비탄의 지방산 에스테르; 이들의 혼합물을 함유한다.
불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 적심제, 유화제, 현탁제, 감미료, 향료, 착색제, 방향제, 방부제와 같은 어쥬번트를 함유할 수도 있다.
현탁액은 활성 화합물 이외에, 현탁제, 예를 들면 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨과 솔비탄 에스테르, 미세결정 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가, 트래거캔스, 또는 이들의 혼합물을 함유한다.
콜레스테롤과 같은 스테롤은 사이클로덱스트린과 착화물을 형성하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 저해물질이 스테로이드성 알칼로이드인 경우에 이는 사이클로덱스트린, 예를 들면 α-, β-, γ-사이클로덱스트린, 디메틸-β-사이클로덱스트린, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물의 직장이나 질 투여용 제제는 좌약 형태로 제공되고, 본 발명의 한가지이상 화합물을 한가지이상의 적합한 무자극 부형제나 담체, 예를 들면 코코아 완충액, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약 왁스 또는 살리실레이트와 혼합하여 제조할 수 있는데, 이는 실온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이고, 따라서 직장이나 질 강에서 녹아 활성hedge길항제를 방출한다.
질 투여에 적합한 본 발명의 제제에는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 거품 또는 당분야에 공지된 적합한 담체를 함유하는 스프레이 약형이 포함된다.
본 발명에 따른 화합물의 국소 또는 경피 투여용 약형에는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치, 흡입제가 포함된다. 활성 화합물은 무균 조건하에 제약학적으로 수용가능한 담체, 임의의 방부제, 완충제 또는 추진제와 혼합한다.
연고, 페이스트, 크림, 겔은 본 발명의 활성 화합물 이외에, 부형제, 예를 들면 동물과 식물 지방, 기름, 왁스, 파라핀, 전분, 트래거캔스, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석, 아연 옥사이드, 또는 이들의 혼합물을 함유한다.
분말과 스프레이는 본 발명의 화합물 이외에, 부형제, 예를 들면 락토오스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘, 폴리아마이드 중합체, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 통상의 추진제, 예를 들면 클로로플루오르하이드로카르본 및 치환되지 않은 휘발성 탄화수소, 예를 들면 부탄과 프로판을 추가로 함유할 수 있다.
경피 패치는 본 발명에 따른 화합물의 조절된 전달을 신체에 제공하는 부가된 이점을 갖는다. 이런 약형은hedgehog길항제를 적절한 매체에 용해시키거나 분산시켜 만들 수 있다. 또한, 흡수 강화제를 사용하여hedgehog길항제의 피부 유동을 증가시킬 수 있다. 이런 유동 속도는 속도 조절 막을 제공하거나 또는 화합물을 중합체 기질이나 겔에 분산시켜 조절할 수 있다.
안과용 제제, 눈 연고, 분말 용액 역시 본 발명의 범주에 속한다.
장관외 투여에 적합한 본 발명의 제약학적 조성물은 한가지이상의 제약학적으로 수용가능한 무균 등장성 수성이나 비수성 용액, 분산액, 현탁액이나 에멀젼, 또는 사용 직전에 무균 주사가능 용액이나 분산액으로 재구성될 수 있는 무균 분말과 함께, 본 발명의 한가지이상 화합물을 함유하고, 항산화제, 완충액, 제균제, 이런 제제를 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용매, 또는 현탁이나 점증제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물에 사용하는데 적합한 수성과 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 이들의 적절한 혼합물, 식물 오일(예, 올리브 오일), 주사가능 유기 에스테르(예, 에틸 올레이트) 등이다. 적절한 유동성은 예로써 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우에 원하는 입자 크기를 유지하거나, 또는 계면활성제를 사용하여 유지할 수 있다.
이들 조성물은 방부제, 적심제, 유화제, 분산제와 같은 어쥬번트를 함유할 수도 있다. 미생물의 작용 예방은 항생제와 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시켜 담보할 수 있다. 또한, 조성물에 등장제, 예를 들면 당, 염화나트륨 등을 함유하는 것이 바람직하다. 이에 더하여, 주사가능 약형의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트와 젤라틴을 포함시켜 달성할 수 있다.
일부 경우에, 약물의 효과를 연장시키기 위하여, 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는 불량한 수용성을 갖는 결정성이나 무수성 물질의 액체 현탁액을 사용하여 달성할 수 있다. 약물의 흡수 속도는 이의 분해 속도에 좌우되고, 분해 속도는 결정 크기와 결정 형태에 좌우된다. 대안으로, 장관외 투여된 약형의 지연된 흡수는 약물을 기름 부형약에 용해하거나 현탁시켜 달성한다.
주사가능 저장소 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체에 본 발명에 따른 화합물의 마이크로캡슐 기질을 생성시켜 만든다. 약물 방출 속도는 약물 대 중합체의 비율 및 사용된 특정 중합체의 특성으로 조절될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르)와 폴리(무수물)이다. 또한,주사가능 저장소 제제는 신체 조직과 양립하는 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 약물을 피포시켜 만든다.
본 발명의 화합물은 사람과 동물에 약품으로 투여되는 경우에, 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께 예로써 0.1 내지 99.5%(좀더 적절하게는 0.5 내지 90%)를 함유하는 제약학적 조성물로 제공될 수 있다.
동물 사료에 본 발명에 따른 화합물의 첨가는 가급적, 활성 화합물의 효과량을 함유하는 적절한 사료 프레믹스(premix)를 만들고 이를 전체 양식에 혼합하여 달성한다.
대안으로, 활성 화합물을 함유하는 중간 농축물 또는 사료 보조제는 사료에 혼합할 수 있다. 이런 사료 프레믹스와 전체 양식을 만들고 투여하는 방법은 참고 문헌에서 기술한다("Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., san Francisco, U.S.A., 1969; "Livestock Feeds and Feeding" O and B books, Corvallis, Ore., U.S.A., 1977).
VI. 합성 설계 및 활성 길항제의 확인
본 발명의 스테로이드성 알칼로이드와 이의 동족은 Suzuki, Stille 등의 교차-결합 기술을 이용하여 용이하게 만들 수 있다. 이들 결합 반응은 상대적으로 가벼운 조건하에 실시하고 광범위한 "구경꾼"기능성을 관용한다.
a. 조합 라이브러리
본 발명의 화합물, 특히 다양한 대표적인 종류의 치환체를 보유하는 변종 라이브러리는 조합 화학 및 다른 유사한 합성 계획에 가용하다(WO 94/08051). 이의결과는 관련된 화합물의 대형 라이브러리, 예를 들면 앞서 밝힌 화합물의 변화된 라이브러리가 잠재적hedgehog길항제 선도 화합물을 확인하고 선도 화합물의 특이성, 독성 및/또는 세포독성-역학 프로필을 상세하게 규정하는 대규모 효능 분석에서 신속하게 선별될 수 있다. 가령,ptc기능 상실,hedgehog기능 획득 또는smoothened기능 획득을 보유하는 세포를 이용하여 개발된ptc,hedgehog또는smoothened생활성 분석을 이용하여 본 발명의 라이브러리에서ptc에 대한 항진제 활성, 또는hedgehog또는smoothened에 대한 길항제 활성을 보유하는 화합물을 선별할 수 있다.
본 발명에서 목적하는 조합 라이브러리는 원하는 특성에 대하여 함께 선별되는 화학적으로 관련된 화합물의 혼합물이다. 단일 반응에서 많은 관련된 화합물의 제조는 선별 과정을 단순화시키고 이의 회수를 상당히 감소시킨다. 적절한 물리적 특성의 선별은 통상적인 방법으로 실시할 수 있다.
라이브러리에서 다양성은 서로 다른 다양한 수준에서 창조될 수 있다. 가령, 조합 반응에 사용되는 기질 아릴기는 중심 아릴 부분, 예를 들면 고리 구조의 측면에서 및/또는 다른 치환체의 측면에서 변화될 수 있다.
본 발명의hedgehog길항제와 같은 소형 유기 분자의 조합 라이브러리를 만들기 위하여 당분야의 다양한 기술이 이용될 수 있다(Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14:83; Affymax U.S. patents No 5,359,115 and 5,362,899; Ellman U.S. Patent 5,288, 514; Still et al. WO 94/08051; ArQule U.S. Patents 5,736,412 and 5,712,171; Chen et al. (1994) JACS 116: 2661; Kerr et al.(1993) JACS 115: 252; WO 92/10092, WO 93/09668 and WO 91/07087; Lerner et al. WO 93/20242). 따라서, 본 발명에 따른hedgehog길항제의 대략 100 내지 1,000,000 또는 그 이상 다이버소머(diversomer)의 체제에서 다양한 라이브러리가 합성되고 특정 활성이나 특성에 대하여 선별될 수 있다.
전형적인 구체예에서, 후보hedgehog길항제 다이버소머의 라이버러리는 Still et al. WO 94/08051에서 밝힌 기술에 적합된, 예를 들면 선택적으로 후보 길항제의 위치중 하나 또는 합성 중간물질의 치환체에 위치한 가수분해 또는 광분해 작용기에 의해 중합체 비드에 연결된 반응식을 이용하여 합성할 수 있다. Still et al. 기술에 따라, 라이브러리는 일단의 비드에서 합성되고, 각 비드는 상기 비드에서 특정 다이버소머를 확인하는 일단의 태그를 보유한다. 이후, 비드 라이브러리는hedgehog길항제가 표적하는ptc기능 상실,hedgehog기능 획득 또는smoothened기능 획득 세포를 입힐 수 있다. 다이버소머는 예로써 가수분해로 비드로부터 방출할 수 있다.
본 발명에 사용되는 화합물의 구조는 이들이 효과적으로 합성될 수 있도록 한다. 화학식 I 내지 Ⅱ로 표시되는 이런 구조의 특징은 앞서 밝힌 바와 같이, Ar, R1, X, Y, Z 부분의 일부 조합을 이용한 이런 화합물의 조합 어셈블리를 가능하게 한다. 가령, 이들 아단위는 통상의 아실화 또는 알킬화 반응을 통하여 중심 고리에 부착될 수 있다. 도 11, 12, 15, 16에서 밝힌 반응을 비롯한 매우 다양한 반응은 극히 안전하고 신뢰할 수 있기 때문에, 조합 화학에 특히 적합하다. 이런 조합 방식에서는 하기에 개시된 루트중 하나의 이체(異體)가 이용된다.
이런 경로의 많은 이체는hedgehog기능의 저해물질로서 검사되는 다양한 화합물 라이브러리의 합성을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 전형적인 화합물의 제조
a. 전형적인 합성 설계
본 발명에 유용한 hedgehog 길항제 및 본 발명의 화합물을 제조하는 전형적인 합성 설계는 도 1-31에 도시한다.
도 1-31의 전형적인 설계에서 반응 조건은 다음과 같다:
1) R1CH2CN, NaNH2, 톨루엔(Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
2) H2SO4, H2O, 환류(Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
3) H2SO4, EtOH, 환류(Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
4) NaOH, EtOH, 환류
5) (Boc)2O, 2M NaOH, THF
6) LiHDMS, R1X, THF(Merck patent Applic # WO 96/06609)
7) Pd-C, H2, MeOH
8) t-BuONO, CuBr, HBr, H2O(J. Org. Chem. 1997, 42, 2426)
9) ArB(OH)2, Pd(PPh3)4, 디옥산(J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223)
10) R12(H)C=CR13R14, Pd(OAc)2, Et3N, DMF(Org. React. 1982, 27, 345)
11) Tf2O, THF(J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486)
12) ArSnBu3, Pd(PPh3)4, 디옥산(J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486)
13) KMnO4, Py, H2O(J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223)
14) NaOR1, THF
15) NaSR1, THF
16) HNR1R13, THF
17) HONO, NaBF4(Adv. Flourine Chem. 1965, 4, 1-30)
18) Pd(OAc)2, NaH, DPPF, PhCH3, R1OH(J. Org. Chem. 1997, 62, 5413-5418)
19) i. R1X, Et3N, CH2Cl2, ii. R13X
20) SOCl2, cat DMF
21) CH2N2, Et2O
22) Ag2O, Na2CO3, Na2S2O3, H2O(Tetrahedron Lett. 1979, 2667)
23) AgO2CPh, Et3N, MeOH(Org. Syn., 1970, 50, 77; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5432)
24) LiOH, THF-MeOH
25) (EtO)2P(O)CH2CO2R, BuLi, THF
26) MeO2CCH(Br)=P(Ph)3, 벤젠
27) KOH 또는 KOtBu
28) 염기, X(CH2)nCO2R
29) DPPA, Et3N, 톨루엔(Synthesis 1985, 220)
30) HONO, H2O
31) SO2, CuCl, HCl, H2O(Synthesis 1969, 1-10, 6)
32) Lawesson 시약, 톨루엔(Tetrahedron Asym. 1996, 7, 12, 3553)
33) R2M, 용매
34) 30% H2O2, 차가운 CH3CO2H(Helv. Chim. Acta. 1968, 349, 323)
35) 트리포스젠, CH2Cl2(Tetrahedron Lett. 1996, 37, 8589)
36) i. (EtO)2P(O)CHLiSO2Oi-Pr, THF, ii. NaI
37) Ph3PCH3I, NaCH2S(O)CH3, DMSO(Synthesis 1987, 498)
38) Br2, CHCl3또는 다른 용매(Synthesis 1987, 498)
39) BuLi, Bu3SnCl
40) ClSO2OTMS, CCl4(Chem. Ber. 1995, 128, 575-580)
41) MeOH-HCl, 환류
42) LAH, Et2O 또는 LiBH4, EtOH 또는 BH3-THF(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
43) MsCl, Et3N, CH2Cl2(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
44) Na2SO3, H2O(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
45) R2R4NH, Et3N, CH2Cl2
46) R2M, 용매
47) CH3NH(OCH3), EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF(Tetrahedron Lett., 1981, 22, 3815)
48) MeLi, THF
49) mCPBA, CH2Cl2
50) HONO, Cu2O, Cu(NO3)2, H2O(J. Org. Chem. 1977, 42, 2053)
51) R1M, 용매
52) HONO, NaS(S)COEt, H2O(Org. Synth. 1947, 27, 81)
53) HSR2또는 HSR4, CH2Cl2
54) I-BuOC(O)Cl, Et3N, NH3, THF
55) R2R4NH, CH2Cl2, NaBH(OAc)3
56) R2R4NH, MeOH/CH3CO2H, NaBH3CN
57) R2OH, EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF
58) R2OH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF
59) R2R4NH, EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF
60) R2R4NH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF
61) POCl3, Py, CH2Cl2
62) R2R4NCO, 용매
63) R2OC(O)Cl, Et3N, 용매
64) R2CO2H, EDC 또는 HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF
65) R2X, Et3N, 용매
66) (CH3S)2C=N(CN), DMF, EtOH(J. Med. Chem. 1994, 37, 57-66)
67) R2SO2Cl, Et3N, CH2Cl2
68) R2-, R3- 또는 R4CHO, MeOH/CH3CO2H, NaBH3CN(Synthesis 1975, 135-146)
69) Boc(Tr)-D 또는 L-CysOH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF
70) Boc(Tr)-D 또는 L-CysH, NaBH3CN, MeOH/CH3CO2H(Synthesis 1975, 135-146)
71) S-Tr-N-Boc 시스테이날, ClCH2CH2Cl 또는 THF, NaBH(OAc)3(J. Org. Chem. 1966, 61, 3849-3862)
72) TFA, CH2Cl2, Et3SiH 또는 (3:1:1)티오아니솔/에탄디올/DMS
73) TFA, CH2Cl2
74) DPPA, Et3N, 톨루엔, HOCH2CH2SiCH3
75) TBAF, THF
76) 염기, TrSH 또는 BnSH
77) 염기, R2X 또는 R4X
78) R3NH2, MeOH/CH3CO2H, NaBH3CN
79) N2H4, KOH
80) Pd(dba)3, P(o-tol)3, RNH2, NaOtBu, 디옥산, R1NH2(Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7187-7184).
81) 시아나미드
82) Fmoc-Cl, 중탄산나트륨
83) BnCOCl, 탄산나트륨
84) AllylOCOCl, 피리딘
85) 브롬화벤질, 염기
86) 염화옥살릴, DMSO
87) RCONH2
88) 카르보닐디이미다졸, 중성 용매(예, DCM, DMF, THF, 톨루엔)
89) 티오카르보닐디이미다졸, 중성 용매(예, DCM, DMF, THF, 톨루엔)
90) 브롬화시아노겐, 중성 용매(예, DCM, DMF, THF, 톨루엔)
91) RCOCl, 트리에틸아민
92) RNHNH2, EDC
93) RO2CCOCL, Et3N, DCM
94) MsOH, 피리딘(J. Het. Chem., 1980, 607)
95) 염기, 중성 용매(예, DCM, 톨루엔, THF)
96) H2NOR, EDC.
97) RCSNH2
98) RCOCHBrR, 중성 용매(예, DCM, DMF, THF, 톨루엔), (Org. Proc. Prep. Intl., 1992, 24, 127).
99) CH2N2, HCl(Synthesis, 1993, 197)
100) NH2NHR, 중성 용매(예, DCM, DMF, THF, 톨루엔)
101) RSO2Cl, DMAP(Tetrahedron Lett., 1993, 34, 2749)
102) Et3N, R.X.(J. Org. Chem., 1990, 55, 6037)
103) NOCl 또는 Cl2(J. Org. Chem., 1990, 55, 3916)
104) H2NOH, 중성 용매(예, DCM, DMF, THF, 톨루엔)
105) RCCR, 중성 용매(DCM, THF, 톨루엔)
106) RCHCHR, 중성 용매(DCM, THF, 톨루엔)
107) H2NOH, HCl.
108) 티오카르보닐이미다졸, SiO2또는 BF3OEt2(J. Med. Chem., 1996, 39, 5228)
109) 티오카르보닐이미다졸, DBU 또는 DBN(J. Med. Chem., 1996, 39, 5228)
110) HNO2, HCl
111) ClCH2CO2Et(Org. Reactions, 1959, 10, 143)
112) 모르폴린 엔아민(Eur. J. Med. Chem., 1982, 17, 27).
113) RCOCHR'CN
114) RCOCHR'CO2Et
115) Na2SO3
116) H2NCHRCO2Et
117) EtO2CCHRNCO
118) RCNHNH2
119) RCOCO2H(J. Med. Chem., 1995, 38, 3741)
120) RCHO, KOAc
121) 2-플루오르니트로벤젠
122) SnCl2, EtOH, DMF
123) RCHO, NaBH3CN, HOAc
124) NH3, MeOH
125) NH3, MeOH
126) 2,4,6-Me3PhSO2NH2
127) MeOC(O)Cl, Et3N, CH2Cl2
128) R2NH2, EDC, HOBT, Et3N, CH2Cl2
129) DBU, PhCH3
130) BocNHCH(CH2STr)CH2NH2, EDC, HOBT, Et3N, CH2Cl2
131) R2NHCH2CO2Me, HBTU, HOBT, Et3N, CH2Cl2
132) BocNHCH(CH2STr)CH2OMs, LiHMDS, THF
133) R2NHCH2CO2Me, NaBH(OAc)3, CICH2CH2Cl 또는 THF
134) R2NHCH2CH(OEt)2, HBTU, HOBT, Et3N, CH2Cl2
135) NaBH(OAc)3, ClCH2CH2Cl 또는 THF, AcOH
136) 피페리딘, DMF
137) Pd(Ph3P)4, Bu3SnH
138) RCO2H, EDC, HOBT, Et3N, DCM
139) RNH2, 중성 용매
140) RCHO, NaBH3CN, HOAc
141) RNCO, 용매
142) RCO2H, EDC 또는 HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF
143) RCOCl, 트리에틸아민
144) RSO2Cl, Et3N, CH2Cl2.
145) SnCl2, EtOH, DMF
146) RNH2, EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF
147) 디브로모에탄, Et3N, CH2Cl2
148) 염화옥살릴, 중성 용매
149) LiOH, THF-MeOH
150) 카르보닐디이미다졸, 중성 용매(예, DCM, DMF, THF, 톨루엔)
151) RNH2, Et3N, CH2Cl2
152) 염기, BX
153) DBU, PhCH3
154) DPPA, Et3N, 톨루엔(Synthesis 1985, 220)
155) SOCl2, cat DMF
156) ArH, Lewis Acid(AlCl3, SnCl4, TiCl4), CH2Cl2
157) H2NCHRCO2Et, 중성 용매
158) BocHNCHRCO2H, EDC 또는 HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2또는 DMF
159) TFA, CH2Cl2.
b. 스크리닝 분석
ptc기능을 항진하거나smoothened또는hedgehog기능을 길항하는 화합물의 능력을 측정하는데 다양한 분석법이 가용한데, 이들 대부분이 고속처리 형식으로 처리될 수 있다. 화합물 라이브러리와 천연 추출물을 검사하는 많은 약물-스크리닝 프로그램에서는 일정 기간동안 조사되는 화합물의 숫자를 최대화하기 위하여 고속처리 분석법이 바람직하다. 이런 이유로, 합성과 자연 산물의 라이브러리는 hedgehog 길항제인 다른 화합물의 견본으로 선택될 수 있다.
검사 화합물은 세포-없음 분석 이외에, 세포-기초한 분석으로 검사할 수도 있다. 한 구체예에서,ptc기능 손실,hedgehog기능 획득 또는smoothened기능 획득 표현형을 갖는 세포는 예로써 검사 작용제의 존재하에 세포의 증식 저해를 기록하는 분석에서 관심있는 표적 작용제와 접촉시킬 수 있다.
patched; 쿠비투스 인터럽투스(cubitus interruptus)(ci) 계통의 전사 인자; 세린/트레오닌 키나아제fused(fu);coastal-2,smoothened,fused억제유전자의 유전자 산물을 비롯한 다수의 유전자 산물이patched-매개된 신호 전달에 관여한다.
hedgehog 단백질에 의한 세포 유도는 하류 주효체의 활성화와 저해를 수분하는 캐스케이드를 작동시키는데, 이의 궁극적인 결과는 일부 경우에 유전자의 전사나 해독에서 탐지가능한 변화이다. hedgehog-매개된 신호전달의 잠재적 전사 표적은patched유전자(Hidalgo and Ingham, 1990 Development 110, 291-301; Morigo et al., 1996) 및 초파리 쿠비투스 인터럽투스(cubitus interruptus) 유전자의 척추동물 상동체,GLI유전자(Hui et al.(1994) Dev Biol 162:402-413)이다.patched유전자 발현은Shh에 반응하여 지아(limb bud)와 신경판(neural plate) 세포에서 유도되는 것으로 밝혀졌다(Marigo et al.(1996) PNAS 93:9346-51; Marigo et al.(1996) Development 122:1225-1233).Gli유전자는 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 보유하는 추정 전사 인자를 인코드한다(Orenic et al.(1990) Genes & Dev 4:1053-1067; Kinzler et al.(1990) Mol Cell Biol 10:634-642).Gli유전자의 전사는 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 보유하는 추정 전사 인자를 인코드하는 반면,Gli3유전자는 hedgehog 유도에 반응하여 하향조절된다(Marigo et al.(1996) Development 122:1225-1233). 이런 표적 유전자, 예를 들면 hedgehog 신호전달에 반응하여 이들 유전자의 상향- 또는 하향-조절을 담당하는Patched또는Gli유전자로부터 전사 조절 서열을 선택하고 이런 프로모터를 리포터 유전자에 작동적으로 연결함으로써, hedgehog-매개된 신호전달 경로를 변화시키는 특정 검사 화합물의 능력에 민감한 전사 기초한 분석법을 도출할 수 있다. 이런 이유로, 리포터 유전자의 발현은 hedgehog의 길항제로 작용하는 화합물의 개발을 위한 귀중한 스크리닝 도구를 제공한다.
본 발명의 리포터 유전자 기초한 분석법에서는 전술한 캐스케이드 현상, 예를 들면 전사 조절의 최종 단계를 측정한다. 따라서, 본원의 한 구체예에서,ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function),smoothened기능 획득 또는 SHH 자체에 의한 자극에 의존하는 탐지 신호를 발생시키기 위하여 리포터 유전자 구조체를 반응 세포에 삽입한다. 리포터 유전자로부터 전사 결과는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법으로 측정할 수 있다. 가령, RNAse 보호 또는 RNA 기초한 PCR로 리포터 유전자로부터 mRNA 발현을 검출하거나, 또는 특징적인 착색 또는 내인성 생물 활성으로 리포터 유전자의 단백질 산물을 동정할 수 있다. 이후, 리포터 유전자의 발현 결과는 검사 화합물의 부재하에 동일한 세포에서 발현 결과와 비교하거나, 또는 표적 수용체 단백질이 결핍된 실질적으로 동일한 세포에서 전사 결과와 비교할 수 있다.
전사 결과에서 임의의 통계학적으로 유의한 감소는 검사 화합물이 일정한 방식으로 정상적인 ptc 신호를 항진한다(또는 기능 획득hedgehog나smoothened신호를 길항한다), 다시 말하면 검사 화합물이 잠재적hedgehog길항제이라는 것을 시사한다.
Ⅶ. 사업 방법
본 발명의 한가지 측면은 기저 세포 암종을 치료하거나 예방하는 제제의 사용법을 설명하고 부작용 및 약물-약물이나 약물-음식 상호작용을 경고하는 사용설명서(서면 및/또는 화보)에 따라, 환자, 특히 사람 환자에서 기저 세포 암종을 치료하거나 예방하기 위한 본 발명의hedgehog길항제를 포함하는 키트에 관한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의hedgehog길항제를 포함하는 키트에 관하는데, 여기서 상기hedgehog길항제는 기저 세포 암종을 치료하거나 예방하는 제제의 사용법을 설명하고 부작용 및 약물-약물이나 약물-음식 상호작용을 경고하는 사용설명서(서면 및/또는 화보)에 따라, 전술한 바와 같은 치료 또는 미용 목적(신경 조직의 조절; 골과 연골세포의 생성과 회복; 정자 형성(spermatogenesis)의 조절; 평활근의 조절; 폐, 간 및 원시 장관(primitive gut)으로부터 기원하는 다른 장기의 조절; 조혈 기능의 조절; 피부와 머리카락 성장의 조절)의 일환으로 환자, 특히 사람 환자에 투여된다.
또한, 본 발명은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법을 계획하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 무균 제약학적 부형제와hedgehog길항제를 함유하는 제약학적 조성물을 제조하고; (b) 의사, 병원, 클리닉 등과 같은 건강관리 공급자에게 기저 세포 암종의 치료 또는 예방에 제약학적 조성물의 사용 이점을 홍보한다[가령, 홍보용 프레젠테이션(예, 전시, 텔레마케팅, 강연), 제품(예, 시제품) 및/또는 증거자료(전단지, 팸플릿, 웹사이트, 포스터 등)를 제공한다].
본 발명의 또 다른 측면은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법에 관하는데,상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 무균 제약학적 부형제와hedgehog길항제를 함유하는 제약학적 조성물을 제조하고; (b) 신경 조직의 조절; 골과 연골세포의 생성과 회복; 정자 형성(spermatogenesis)의 조절; 평활근의 조절; 폐, 간 및 원시 장관(primitive gut)으로부터 기원하는 다른 장기의 조절; 조혈 기능의 조절; 피부와 머리카락 성장의 조절과 같은 치료 또는 미용 목적의 일환으로 의사, 병원, 클리닉 등과 같은 건강관리 공급자에게 기저 세포 암종의 치료 또는 예방에 제약학적 조성물의 사용 이점을 홍보한다[가령, 홍보용 프레젠테이션(예, 전시, 텔레마케팅, 강연), 제품(예, 시제품) 및/또는 증거자료(전단지, 팸플릿, 웹사이트, 포스터 등)를 제공한다].
본 발명의 또 다른 측면은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 무균 제약학적 부형제와hedgehog길항제를 함유하는 제약학적 조성물을 판매하기 위한 유통망을 제공하고; (b) 기저 세포 암종을 치료하거나 예방하기 위한 제약학적 조성물의 사용설명서를 환자 또는 의사에게 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 무균 제약학적 부형제와hedgehog길항제를 함유하는 제약학적 조성물을 판매하기 위한 유통망을 제공하고; (b) 전술한 바와 같이 신경 조직의 조절; 골과 연골세포의 생성과 회복; 정자 형성(spermatogenesis)의 조절; 평활근의 조절; 폐, 간 및 원시 장관(primitive gut)으로부터 기원하는 다른 장기의 조절; 조혈 기능의 조절; 피부와 머리카락 성장의 조절과 같은 치료 또는 미용 목적의 일환으로 기저 세포 암종을 치료하거나 예방하기 위한 제약학적 조성물의 사용설명서를 환자 또는 의사에게 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 기저 세포 암종을 치료하거나 예방하는데 적합한 제약학적 조성물 및hedgehog길항제의 용량을 결정하고; (b) 동물에서 상기 제약학적 조성물의 효능과 독성에 대한 치료 프로필링(profiling)을 실시하고; (c) 수용가능한 치료 프로필을 갖는 제약학적 조성물을 판매하기 위한 유통망을 제공하고; (d) 선택적으로, 상기 조성물을 건강관리 제공자에게 홍보하기 위한 판매원을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 전술한 의학적 또는 미용적 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 제약학적 조성물 및hedgehog길항제의 용량을 결정하고; (b) 동물에서 상기 질환을 치료하거나 예방하는 상기 제약학적 조성물의 효능과 독성에 대한 치료 프로필링(profiling)을 실시하고; (c) 상기 질환의 치료 또는 예방에서 수용가능한 치료 프로필을 갖는 제약학적 조성물을 판매하기 위한 유통망을 제공하고; (d) 선택적으로, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 상기 조성물을 건강관리 제공자에게 홍보하기 위한 판매원을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 기저 세포 암종을 치료하거나 예방하는데 적합한 제약학적 조성물 및hedgehog길항제의 용량을 결정하고; (b) 상기 제약학적 조성물의 추가 개발과 판매 권리를 제 3자에게 인가한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 전술한 의학적 또는 미용적 질환을 치료하거나 예방하는데 적합한 제약학적 조성물 및hedgehog길항제의 용량을 결정하고; (b) 상기 질환의 치료하거나 예방하는 상기 제약학적 조성물의 추가 개발과 판매 권리를 제 3자에게 인가한다.
예시
본 발명은 앞서 전반적으로 기술되었기 때문에, 다음의 실시예를 참고하면 좀더 용이하게 이해할 수 있다. 하지만, 이런 실시예는 본 발명의 특정 측면과 구체예를 설명한 것으로, 본 발명을 제한하지 않는다.
실험
전형적인 저해물질의 합성
루트 1
전반적인 방법. 달리 명시하지 않는 경우, 모든 반응은 HPLC 등급 용매를 사용하여 오븐-건조된 유리용기에서 실시하였다. 화합물의 정제는 5% Et3N으로 불활성화된 실리카 겔 40-63u 60A(Flash Column Chromatography) 또는 Jones Chromatography Flash Master 11로 실시하였다. 박막 크로마토그래피(TLC)는 플레이트 Kieselgel 60 F254(Merok)에서 실시하였다.lH-NMR은 내부 기준(internal reference)으로 중수소화-용매에서 Bruker 300 NMR 분광계로 측정하였다. 저-분석도 질량 스펙트럼 데이터는 Micromass 플랫폼 LCZ에서 얻었다. 순도(LC 스펙트럼) 측정에는 Hewlett-Packard 1100이 사용되었다.
2-클로로-5-니트로-N-(2-니트로-페닐)벤즈아마이드(1). CH2Cl2(90 ㎖)에 녹인 2-니트로페닐아민(15.00 g, 109 mmol) 용액에 실온에서 피리딘(43 ㎖, 2.86 vols)을 첨가하고, 이후 45분동안 CH2Cl2(100 ㎖)에 용해된 2-클로로-4-니트로-벤질 염화물(27.40 g, 125 mmol)을 0℃에서 방울방울 첨가한다. 반응 혼합물은 실온에서 3시간동안 교반한다. 반응이 완결되면(LCMS로 확인함), 정제되지 않는 혼합물은 증발 건조시킨다. 생성된 정제되지 않은 갈색 잔류물은 에틸 아세테이트에서 슬러리로 만들고 여과하여 황색 고체로 표제 화합물(33 g, 94%)을 수득한다:1H NMR(CDCl13) δ10.91 (s, 1H), 8.85 (dd, 1H), 8.53 (app d, 1H), 8.28-8.21 (m, 2H), 7.70 (dd, 1H), 7.64 (d,1H), 7.25 (dd, 1H); MS (ES, positive mode): 363[M++1+41]과 322[M++l].
3-(lH-벤조이미다졸-2-일)-4-클로로-페닐아민(2). 철 분말(15.42 g, 280 mmol)은 톨루엔(125 ㎖)과 아세트산(60 ㎖)에 녹인 아마이드(1)(15.00 g, 46.7 mmol) 용액에 첨가한다. 혼합물은 1시간동안 125℃에서 가열하고(반응의 완결은 LCMS로 확인한다), 생성된 정제되지 않은 혼합물은 탈지면 마개를 통하여 여과한다(철 입자 제거). 정제되지 않은 용액은 증발 건조시키고, EtOAc로 희석하며, 포화된 NaHCO3과 염수의 순서로 세척하고, MgS04에서 건조시키며, 여과하고, 감압하에 농축한다. 생성된 갈색 고체는 CH2Cl2에 재-용해시키고 헥산 몇방울을 첨가하여 고체를 생성시키고, 이는 여과로 분리하여 베이지색 고체로 표제화합물(2)(5.66 g, 42%)을 수득한다:1H NMR (CD30D) δ7.64 (broad s,2H), 7.30-7.26 (m, 3H), 7.13 (app d, 1H), 6.84 (dd, 1H); MS (ES, positive mode): 244[M++1].
요소(3)의 합성. 피리딘(0.12 ㎖, 1.41 mmol)은 CH2Cl2(3.0 ㎖)에 녹인 아민(2)(300 ㎎, 1.23 mmol) 용액에 첨가한다. CH2Cl2(4.0 ㎖)에 녹인 3,5-디메톡시페닐 이소시아네이트(253 ㎎, 1.41 mmol) 용액을 0℃에서 방울방울 첨가하고 실온에서 3시간동안 교반한다(반응의 완결은 LCMS로 확인한다). 1M 구연산 용액을 첨가하여 반응을 중단시키고, 유기상은 분리하고 증발 건조시킨다. 정제되지 않은 혼합물은 EtOAc로 희석하고, 포화된 NaHCO3과 염수의 순서로 세척하며, MgS04에서 건조시키고, 여과하며, 감압하에 농축한다. 생성된 정제되지 않은 산물은 플래시 크로마토그래피(EtOAc: 헥산, 농도 구배 용출)로 정제하여 표제 화합물(3)(40 ㎎, 8%)을 수득한다:1H NMR (CD30D) δ8.05 (app d, 1H), 7.82 (d, 1H), 7.81 (d, 1H) 7.80 (broad s, 1H), 7.67 (d, 1H), 7.45 (broad m, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.33 (broad m, 1H), 3.91 (s, 6H); MS (ES, positive mode): 423[M++1] ; LC (1.22, 순도 > 97%).
아마이드(4)의 합성. CH2CI2(4.0 ㎖)에 녹인 3,4,5-트리메톡시 벤조일 클로라이드(272 ㎎, 1. 18 mmol)는 CH2Cl2(3.0 ㎖)에 녹인 아민(2)(250 ㎎, 1.03 mmol) 용액에 0℃, 질소하에 첨가한다. 반응 혼합물은 실온에서 하룻밤동안 교반한다(반응의 완결은 LCMS로 확인한다). 정제되지 않은 혼합물은 4% MeOH를 함유하는 EtOAc로 희석하고, 포화된 NaHCO3과 염수의 순서로 세척하며, MgS04에서 건조시키고, 여과하며, 감압하에 농축한다. 생성된 정제되지 않은 산물은 예비 LC로 정제하여 무색 고체로 표제 화합물(4)(25 ㎎, 6%)을 수득한다:1H NMR(CD30D) δ8.31 (app d, 1H), 7.98 (dd, 1H), 7.76-7.74 (m, 2H), 7.67 (d, 1H), 7.46-7.44 (m, 2H), 7.34 (broad s, 2H); MS (ES, positive mode): 438[M++1]; LC (1.15, 순도 > 95%).
티오우레아(5)의 합성. 피리딘(0.2 ㎖, 2.36 mmol)은 CH2Cl2(3.0 ㎖)에 녹인 아민(2)(250 ㎎, 1.03 mmol) 용액에 0℃에서 첨가하고, 이후 CH2Cl2(4.0 ㎖)에 녹인 벤조디옥산 이소티오시아네이트(228 ㎎, 1.18 mmol) 용액에 방울방울 첨가한다. 반응 혼합물은 실온에서 하룻밤동안 교반한다(반응의 완결은 LCMS로 확인한다). 1M 구연산 용액을 정제되지 않은 반응 혼합물에 첨가하고, 유기상은 분리하고 증발 건조시킨다. 정제되지 않은 혼합물은 EtOAc로 희석하고, 포화된 NaHCO3과 염수의 순서로 세척하며, MgS04에서 건조시키고, 여과하며, 감압하에 농축한다. 생성된 정제되지 않은 산물은 플래시 크로마토그래피(헥산에서 30-50% EtOAc)로 정제하여 연한 황색 고체로 표제 화합물(5)(95 ㎎, 21%)을 수득한다:1H NMR (CD30D) δ 7.71 (app d, 1H), 7.55 (dd, 1H), 7.50 (broad s, 2H), 7.40 (d, 1H), 7.19-7.13 (broad m, 2H), 6.79 (s, 1H), 6.67 (s, 2H) 4.08 (s, 4H); MS (ES, positive mode): 438[M++1]; LC (0.941, 순도 > 98%)
설폰아마이드(6)의 합성. 피리딘(0.20 ㎖, 2.36 mmol)은 CH2Cl2(3.0 ㎖)에 녹인 아민(2)(250 ㎎, 1.03 mmol) 용액에 0℃에서 첨가하고, 이후 CH2Cl2(4.0 ㎖)에 녹인 페닐설포닐 클로라이드(0. 15 ㎖, 1.18 mmol)를 방울방울 첨가한다. 반응 혼합물은 하룻밤동안 교반한다(반응의 완결은 LCMS로 확인한다). 1M 구연산 용액을 정제되지 않은 반응 혼합물에 첨가하고, 유기상은 분리하고 증발 건조시킨다. 정제되지 않은 고체는 EtOAc로 희석하고, 포화된 NaHCO3과 염수의 순서로 세척하며, MgS04에서 건조시키고, 여과하며, 감압하에 농축한다.bis-알킬화된 산물을 주로 함유하는 생성된 정제되지 않은 혼합물은 플래시 크로마토그래피(1:39:60, MeOH: EtOAc: 헥산)로 정제하여 무색 고체로 표제 화합물(6)(20 ㎎, 5%)을 수득한다:1H NMR (CD30D) δ8.01-7.99 (broad d, 2H), 7.97 (d, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.84 (app d, 1H), 7.76-7.74 (m, 4H), 7.68 (d, 1H), 7.66 (d,1H), 7.55 (dd, 1H); MS (ES, positive mode): 384 [M++1]; LC (1.190, 순도 > 99%).
루트 2
2-(2-메틸-5-니트로-페닐)-lH-벤즈이미다졸(7). 벤젠-1,2-디아민(2.60 g, 25 mmol)과 2-메틸-5-니트로벤조산(5.0 g, 27.6 mmol)은 폴리인산(30 ㎖, 11 vol)에 현탁시키고 140℃로 하룻밤동안 가열한다. 반응이 완결되면(LCMS로 확인함), 정제되지 않은 녹색 혼합물은 물에 용해시키고, NaOH(pH= 14)로 염화시키며, EtOAc(x 2)에 추출한다. 유기상은 염수로 세척하고, MgS04에서 건조시키며, 여과하고, 감압하에 농축하여 오렌지/갈색 고체로 표제 화합물(7)(4.70 g, 74%)을 수득한다:lH NMR (C2D6SO) δ13.20 (s, 1H), 8.80 (app d, 1H), 8.84 (dd, 1H), 7.89-7.87 (m, 2H), 7.74 (d, 1H), 7.40-7.45 (m 2H), 2.90 (s, 3H); MS (ES, positive mode): 254[M++1].
3-(lH-벤즈이미다졸-2-일)-4-메틸-페닐아민(8). 철 분말(3.0 g, 50.9 mmol)은 톨루엔(30 ㎖)과 아세트산(30 ㎖)에 녹인 니트로벤즈이미다졸(7)(4.30 g, 16.9mmol) 용액에 첨가하고, 반응 혼합물은 1시간동안 125℃에서 가열한다(반응의 완결은 LCMS로 확인한다). 생성된 정제되지 않은 혼합물은 탈지면 마개를 통하여 여과한다(철 입자 제거). 정제되지 않은 용액은 증발 건조시키고, EtOAc로 희석하며, 포화된 NaHCO3으로 세척하고(pH = 7), 수상은 EtOAc로 역-추출한다. 모아진 유기물은 염수로 세척하고, MgS04에서 건조시키고, 여과하며, 감압하에 농축하여 갈색 고체로 표제 화합물(8)(2.70 g, 73%)을 수득한다:lH NMR (C2D6SO) δ12.55 (s, 1H), 7.73 (d, 1H), 7.57 (d, 1H), 7.16 (broad m, 2H), 7.09 (d, 1H), 7.01 (app d, 1H), 6.70 (dd, 1H), 5.15 (broad s, 2H), 2.39 (s, 3H); MS (ES, positive mode): 224[M++1].
아마이드(9)의 합성. 벤즈이미다졸페닐아민(8)(250 ㎎, 1.12 mmol)과 3-5-디메톡시 벤조일 클로라이드(246 ㎎, 1.23 mmol)는 CH2Cl2(10.0 ㎖)에 현탁시키고 실온에서 하룻밤동안 교반한다. 정제되지 않은 혼합물은 EtOAc로 희석하고, 이후 구연산으로 세척한다. 수상은 NaOH로 염화시키고 EtOAc에 추출한다. 모아진 유기 추출물은 염수로 세척하고, MgS04에서 건조시키며, 여과하고, 감압하에 증발시켜 무색 고체로 표제 화합물(9)을 수득한다:lH NMR (C2D6SO) δ12.65 (s, 1H), 10.35 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.86 (d, 1H), 7.74 (d, 1H), 7.61 (d, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.42-7.32 (m, 2H), 7.20 (s, 2H), 6.79 (s, 1H), 3.89 (s, 6H), 2.61 (s,3H); MS (ES, positive mode): 388[M++1]; LC (1.19, 순도 > 97%).
아마이드(10)의 합성. 벤즈이미다졸페닐아민(8)(250 ㎎, 1.12 mmol)과 벤조디옥산-4-카르보닐 클로라이드(220 ㎎, 1.23 mmol)은 CH2Cl2(10.0 ㎖)에 현탁시키고 실온에서 하룻밤동안 교반한다. 정제되지 않은 혼합물은 EtOAc로 희석하고, 이후 구연산으로 세척한다. 수상은 NaOH로 염화시키고 EtOAc에 추출한다. 모아진 유기 추출물은 염수로 세척하고, MgS04에서 건조시키며, 여과하고, 감압하에 증발시켜 무색 고체로 표제 화합물(10)을 수득한다:lH NMR (C2D6SO) δ12.55 (s, 1H), 10.49 (s, 1H), 9.07 (app d, 1H), 8.70 (dd, 1H), 8.25 (dd, 1H), 8.15 (app d, 1H), 7.72 (dd, 1H), 7.64 (d, 1H), 7.52-7.48 (m, 1H), 7.38 (d, 1H), 7.31 (d, 1H), 7.17-6.95 (m, 2H), 3.28 (s, 3H); MS (ES, positive mode): 329[M++1]; LC (0.858, 순도 > 97%).
루트 3
2-(2-클로로-5-니트로-페닐)-lH-벤즈이미다졸-5-카르보니트릴(12). 2-아미노-4-시아노-페닐 아민(0.5 g, 3.76 mmol)과 2-클로로-4-니트로-벤즈알데하이드(1.39 g, 7.52 mmol)은 최소 함량의 아세트산에 개별적으로 용해시키고 실온에서 서로 혼합한다. 생성된 오렌지색 고체는 여과하고, 여과액이 무색이 될 때까지 아세트산과 헵탄으로 세척한다. 이 단계에서 분리된 고체는 중간물질(11)(600 ㎎, 45 %)이다:lH NMR (C2D6SO) δ8.99 (app d, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.28 (dd, 1H), 7.84 (d,1H), 7.57 (s, 1H), 7.35 (dd, 1H), 6.75 (d, 1H), 6.36 (s, 2H); MS (ES, positive mode): 301[M++1]. 중간물질(11)의 고리화: 생성된 갈색 고체는 아세트산에 현탁시키고 50℃에서 6시간동안 가열한다. 정제되지 않은 혼합물은 EtOAc로 희석하고, NaHC03용액으로 중화시키며, 염수로 세척하고, MgS04로 건조시키며, 감압하에 농축하여 갈색 고체로 표제 화합물(12)(200㎎, 99%)을 수득한다:lH NMR (C2D6SO) δ13.40(broad s, 1H), 8.66 (app d, 1H), 8.30 (dd, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.90 (d, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.50 (d, 1H); MS (ES, positive mode): 299[M++1].
생물학적 분석
선도 화합물 발견/대규모 효능 분석
검사 화합물은 10 mM 농도로 DMSO에 용해시키고 -20℃에서 저장한다. 분석 세포에서hedgehog경로를 활성화시키기 위하여,Sonic hedgehog단백질(OCT-SHH)의 옥틸화된 (지질-변형된) 형태의 N-말단 단편을 사용한다. 상기 N-말단 SHH 단편은 박테리아에서 생산된다(TaylorFR, et al., Biochemistry 2001, 40, 4359-71).
화합물은 세포주 10T1/2(s12)를 이용한 하기 "Gli-Luc" 분석으로 검사할 수 있는데, 여기서 상기 세포는 루시페라제(Luciferase)를 리포터 유전자로 이용한 hedgehog-반응성 리포터 구조체를 보유한다. 이런 방식으로,hedgehog경로 신호전달 활성은 Gli-Luc 반응을 통하여 측정될 수 있다.
10t1/2(s12) 세포는 완전 배지[10% FBS를 함유하는 DMEM]에서 96-웰 마이크로-역가 평판(MTP)에 20,000 세포/웰로 도말한다. 이후, 평판은 37℃, 5% CO2에서 배양기에 하룻밤(O/N)동안 배양한다. 24시간후, 배지는 루시페라제-분석 배지(0.5% FBS를 함유하는 DMEM)로 교체한다. 화합물은 해동시키고 분석 배지에서 3:1000(대략 300-배)로 희석하여 대략 0.0003 μM 내지 30 μM의 출발 농도를 유도한다.
후속으로, 150 ㎕의 각 시료를 첫 번째 웰(삼중)에 첨가한다. 이후, MTP 시료는 3배 희석으로 전체 7개 웰에 희석하여, 궁극적으로 각 화합물의 7개 희석액(삼중)을 준비한다. 이후, 단백질 리간드 OCT-SHH는 루시페라제-분석 배지에서 희석하고 0.3 ㎍/㎖의 최종 농도로 각 웰에 첨가한다. 이후, 평판은 37℃, 5% C02에서 추가 배양 O/N을 위하여 배양기에 다시 넣는다. 대략 24시간후, 평판은 배양기로부터 빼내고, 배지는 흡출기로 빨아내 버린다. 웰은 분석 완충액[PBS + 1 mM Mg2+와 1 mM Ca2+]로 1회 세척한다. 이후, 50㎕ 분석 완충액을 각 웰에 첨가한다. 루시페라제 분석 시약은 공급자(LucLite kit, Packard)가 밝힌 바와 같이 제조하고, 50㎕을 각 웰에 첨가한다. 평판은 실온(RT)에서 대략 30분동안 배양하고, 이후 신호는 RT에서 Topcount(Packard)에서 판독한다.
유사한 분석은 MEM/소디움 피루베이트 w/10% FBS의 성장 배지와 MEM/소디움 피루베이트 w/0.5% FBS의 분석 배지에서, 사람 세포주(특히, 앞서 밝힌 Gli-Luc 구조체로 변형된 사람 배아 구개골 간엽 세포)를 이용하여 실시한다. OCT-SHH를 첨가하여 최종 농도가 1 ㎍/㎖가 되게 한다.
상기 분석에서 동정된 화합물은 도 32에 도시한다.
특정 화합물의 활성은 하기 표 1에 제시한다(화합물 E-V를 제외하고, 사람에서 분석의 결과에 기초한 활성):
표 1
화합물 IC5O(μM) 화합물 IC50(μM)
A < 0.05 B < 0.05
C < 0.5D < 0.5
E < 5 F < 5
G < 5 H < 5
I < 5 J < 5
K < 5 L < 5
M < 5 N < 1
O< 5P < 5
Q < 10 R < 10
S > 10 T < 5
U < 5V < 5
W < 0.01X < 0.05
Y < 0.05Z < 0.05
A' < 0.01 B' < 0.01
C' < 0.05 D' < 0.05
E' < 0.05 F' < 0.05
G' < 0. 01H' < 0. 01
I' < 0.05 J' < 0.05
K' < 0.01L' < 0.05
M' < 0.05N' < 0.1
O' < 0.1 P' < 0.1
Q' < 0.05 R' < 0.05
S' < 0.05 T' < 0.05
U' < 0.05 V' < 0.05
W' < 0.1X' < 0.1
Y' < 0.5 Z' < 0.5
A'' < 0.5 B'' < 0.5
C'' < 0.5 D'' < 0.5
E'' < 0.5 F'' < 0.5
G'' < 0.5H'' < 0.5
I'' < 0.5 J'' < 0.05
K'' < 0.05 L'' <0.05
M'' < 0.05N' < 0.05
O'' < 0.1P'' < 0.5
Q'' < 0.5 R'' < 0.5
S'' < 0.1 T'' < 0.1
U'' < 0.1 V'' < 0.5
W'' < 0.5 X'' < 0.5
Y'' < 0.5 Z'' < 0.5
A''' < 0.5 B''' < 0.5
C''' < 0.5D''' < 0.5
E''' < 0.5F''' < 1
G''' < 0.1 H''' < 0.5
I''' < 0.5 J''' < 0.5
K''' < 0.01L''' < 0. 5
M''' < 0.5 N''' < 0.01
O''' < 1 1''' < 0.5
Q''' < 0.05 R''' < 0.5
S''' < 0.05T''' < 10
U''' < 0.5 V''' < 0.05
W''' < 0.05 X''' < 0.5
Y''' < 0.5 Z''' < 0.5
A'''' < 0.5 B'''' < 0.05
C'''' < 0.05 D'''' < 0.05
E'''' < 0.5 F'''' < 0.5
G'''' < 0.05 H'''' < 0.5
I'''' < 0.1 J'''' < 0.05
K'''' < 5 L'''' < 0.05
M'''' < 0.01 N'''' < 0.1
O'''' < 0.5 P'''' < 0.5
Q'''' < 0.5 R'''' < 5
S'''' < 0.5 T'''' < 0.5
U'''' < 0.05 V'''' < 0.05
W'''' < 0.5 X'''' < 0.5
Y'''' < 0.001 Z'''' < 0.001
A''''' < 0.05B''''' < 0.05
C''''' < 0.5 D''''' < 0.05
E'''''< 0.05F'''''<0.5
기저 세포 암종(BCC) 시료에 대한 화합물의 효과
BCC 배양: 일부 피부 기질(stroma)을 보유하는 기저 세포 암종의 소파(Curettage) 시료는 기관형적(organotypic) 배양액, 다시 말하면 공기/액체 접촉면에 노출된 배양액에서 배양한다. BCC 시료는 부형약(0.8% 무균 NaCl 용액) 또는 화합물 A를 주사하고, 배양액은 플라스틱 격자의 상부에 모으고 사람 피부의 장기배양에 적합한 배지에서 최대 3일동안(화합물과 함께 또는 화합물 없이) 배양한다.
BCC의 형태학적 특징, 예를 들면 미분화된 기저 세포의 섬 및 일부 경우에 말초 세포의 울타리화(palisading)와 기질 클레프팅(clefting)은 BCC가 이런 시스템에서 배양되는 경우에 유지된다. hedgehog 신호전달의 중심 지표인GLI-1유전자는33P-표지된 RNA 탐침에 노출이후 측정에서, 처리되지 않은 배양액에서 높은 수준의 활성을 유지하는 것으로 확인되었다.
정량적인 in situ 혼성화: 간단히 말하면, 거대 기저 세포 섬을 보유하는 파라포름알데하이드-고정되고 파라핀-포매된 조직의 7㎛ 절편은 깨끗하게 하고, 재-수화시키며, 프로테이나아제 K로 절단하고, 아세틸화시키며33P-표지된 RNA 탐침과 하룻밤동안 혼성화시킨다. 높은 엄격도 포스트-혼성화 세척후, 슬라이드는 실온의 암실에서 여러 시간동안 고감수성 PhosphorImager 스크린에 노출시킨다. 현상후, [33P]-신호는 Cyclone Scanner(Packard)로 스캔한다. 개별 기저 세포 섬은 선별하고, 신호는 OptiQuant 소프트웨어를 사용하여 정량하고 DLU(디지털 광 단위)/㎟으로 표시한다. 대조값은 평균하고 100%으로 설정한다; 화합물 A-처리된 시료로부터 얻은 값은 대조의 %로 표시한다. 결과는 도 33에 도시한다.
카스파제 3 면역조직화학: 예정된 세포 사멸 또는 아폽토시스는 카스파제 활성화, DNA 단편화, 막 기포화, 세포 수축, 식세포작용을 수반하는 원치않는 세포를 제거하는 조직화된 과정이다. 아폽토시스는 초기 아폽토시스 현상을 탐지하는 마커인 활성 카스파제 3의 면역조직화학으로 분석한다. 표준 조직학은 BCC 배양액에서 실시하고, 슬라이드는 재-파라핀처리하고, 사전-차단하며, 일차 항체와 함께 배양하고, 이후 세척하고, 제조업자의 사용설명서에 따라 효소-표지된 이차 항체와 함께 배양한다. 특정 신호는 항원-항체 복합체의 효소 탐지로 가시화시킨다. 슬라이드는 커버-슬립하고 영상 촬영한다. 결과는 도 34에서 도시하는데, 여기서 좌측 패널은 대조 조직이고, 우측 패널은 A가 존재한다.
다른 종양 세포에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과
결장 암 세포: 20,000 결장 암 세포는 10,000 10T (S12) 세포와 혼합하고, 혼합물은 96웰 평판에서 각 웰에 첨가한다. 본 발명의 화합물 또는 대조 부형약은 다음날 배양액에 첨가한다. 72시간 배양후, 세포는 루시페라제 활성을 측정하기 위하여 용해시킨다. 화합물 A는 루시페라제 활성을 저해할 수 있는데, 이는 상기 분석에서 부형약과 비교하여, hedgehog 신호전달 경로의 활성을 간접적으로 반영한다. 도 35는 S12 세포에서 항체 1E6과 5E1 및 화합물 A에 대한 hedgehog-유도된 활성화의 비교 저해, 그리고 결장 암 세포에서 이들 조성물에 대한 내인성 hedgehog 활성의 비교 저해를 도시한다.
전립선과 방광 암 세포: 동일 분석에서 호르몬 무반응성 전립선암 세포주 PC-3 및 요로점막 방광암 세포주 RT-4를 이용한 실험은 도 36에서 도시한다.
다른 조직에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과
도 37에 도시된 탐침과 프라이머를 사용하여 RT-PCR과 Real-Time PCR(Taqman)로 GLI-1과 GAPDH 발현에 대한 본 발명에 따른 저해물질의 효과를 평가한다. HEPM 세포는 Octyl-SHH의 존재하에 성장시키고 24시간동안 화합물 처리한다. 전체 RNA는 수거하고 표준 RT-PCR에 사용하여 GLI-1과 GAPDH 전사체의 발현 수준을 평가한다. 도 38에서는 화합물 A, 0.003-1.0 μM; 화합물 O, 0.003-1.0 μM; -, 네거티브 대조(DMSO 단독); +, 파지티브 대조 (Octyl-SHH @ 1 ㎎/㎖, 저해물질 없음)의 검사 결과를 도시한다.
patched(ptc-null 세포)의 동형접합성 붕괴를 갖는 세포는 본 발명에 따른 화합물의 존재하에 72-96 시간동안 성장시킨다. 전체 RNA는 수거하고 표준 RT-PCR에 사용하여 GLI-1과 GAPDH 전사체의 발현 수준을 평가한다.
도 39에서는 화합물 C, 1 & 10 μM; 화합물 O, 1 & 10 μM; DMSO, 네거티브 대조의 검사 결과를 도시한다.
HEPM 세포는 Octyl-SHH와 본 발명에 따른 화합물의 존재하에 24시간동안 성장시킨다. 전체 RNA는 수거하고 표준 RT 반응으로 cDNA로 전환시킨다. 이후, cDNA는 Real-Time PCR에 사용하여 GLI-1과 GAPDH 전사체의 발현 수준을 평가한다. 도 40에서는 화합물 A, 0.001-0.3 μM; 화합물 O, 0.001-0.3 μM; DMSO(-), 네거티브 대조; OCT-SHH(+), 파지티브 대조의 검사 결과를 도시한다.
CCD-37(폐 섬유종) 세포는 Octyl-SHH와 화합물 A의 존재하에 24시간동안 성장시킨다. 전체 RNA는 수거하고 표준 RT 반응으로 cDNA로 전환시킨다. 이후, cDNA는 Real-Time PCR에 사용하여 GLI-1과 GAPDH 전사체의 발현 수준을 평가한다. 도 40에서는 화합물 A, 0.001-1.0 μM; DMSO(-), 네거티브 대조; OCT-SHH(+), 파지티브 대조의 검사 결과를 도시한다.
앞서 언급된 모든 간행물은 본원에서 참고문헌으로 한다.
등가물
당업자는 통상적인 실험으로, 본원에서 밝힌 발명의 특정 구체예의 다수 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이런 등가물은 하기의 특허청구범위에 포함된다.

Claims (36)

  1. 세포에서hedgehog경로의 활성화를 저해하는 방법에 있어서,hedgehog신호전달을 저해하는 충분한 함량으로hedgehog길항제와 세포를 접촉시키고, 여기서hedgehog길항제는 화학식 I로 대표되는 유기 분자인 것을 특징으로 하는 방법:
    화학식 I
    여기서, 결합가(valence)와 안정도가 허락되면,
    X와 Z는 독립적으로 -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- 또는 직접 결합이고;
    Y는 -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NR7)-, SO2또는 SO이고;
    A는 O, S 또는 NR7이고;
    G는 고리에 융합된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
    Ar은 치환되거나 치환되지 않은 아릴이나 헤테로아릴 고리이고;
    R1은 H, 또는 다중환 작용기를 비롯한치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬이고;
    R2는 고리에서 0-4개 치환체이고;
    R7은 독립적으로 H, 저급 알킬, J-사이클로알킬, J-헤테로사이클릴, J-아릴, J-헤테로아릴이고;
    R8은 독립적으로 H, 저급 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    J는 독립적으로 CK2, NK, O, S에서 선택되는 0-8개 단위를 갖는 사슬이고, 여기서 K는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다.
  2. 제 1 항에 있어서, Z와 X중 적어도 하나는 직접 결합이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, X-Y-Z는 아마이드, 요소 또는 설폰아마이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, X는 -N(R8)-, -O-, -S-에서 선택되고, 적절하게는 NH인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, R1에는 1-5개 치환체로 선택적으로 치환되는 아릴 또는 헤테로아릴 고리가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, R1에서 치환체는 니트로, 할로겐, 시아노, 저급 알킬, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 알콕시, 알킬아미노, 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 아릴이나 헤테로아릴 고리에 융합된 헤테로아릴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, X 및 A-포함 고리는 메타 관계로 Ar에 배치되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, R2는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 카르보닐기, 티오카르보닐, 케톤, 알데하이드, 아미노, 아실아미노, 아미도, 아미디노, 시아노, 니트로, 아지도, 설포닐, 설폭시도, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, J-R8, J-OH, J-저급 알킬, J-저급 알케닐, J-SH, J-NH2, 이들의 보호된 형태에서 선택되는 1-4개 치환체이거나, 또는 환이나 다중환 구조에서 1회 이상 존재하는 경우에 임의의 2가지 R2는 서로 결합하여 4각형 내지 8각형 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성하는것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, R2는 할로겐, 시아노, 니트로, 알콕시, 아미노, 아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, G에 융합된 헤테로아릴, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬에서 선택되는 1-4개의 치환체인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 세포는ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function) 또는smoothened기능 획득의 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,hedgehog길항제는 1μM 이하의 ED50으로ptc기능 상실,hedgehog기능 획득, 또는smoothened기능 획득 매개된 신호 전달을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,hedgehog길항제는 1 nM 이하의 ED50으로ptc기능 상실,hedgehog기능 획득, 또는smoothened기능 획득 매개된 신호 전달을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 세포는 시험관내에서hedgehog길항제와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 세포는 생체내에서hedgehog길항제와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서,hedgehog길항제는 치료 또는 미용 용도로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 치료 또는 미용 용도는 신경 조직의 조절; 골과 연골의 형성과 복구; 정자 형성(spermatogenesis)의 조절; 평활근의 조절; 폐, 간 및 원시 장관(primitive gut)으로부터 기원하는 다른 장기의 조절; 조혈 기능의 조절; 피부와 머리카락 성장의 조절에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 세포에서hedgehog경로의 활성화를 저해하는 방법에 있어서,hedgehog신호전달을 저해하는 충분한 함량으로hedgehog길항제와 세포를 접촉시키고, 여기서hedgehog길항제는 화학식 Ⅱ로 대표되는 유기 분자인 것을 특징으로 하는 방법:
    화학식 Ⅱ
    여기서, 결합가(valence)와 안정도가 허락되면,
    X와 Z는 독립적으로 -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- 또는 직접 결합이고;
    Y는 -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NR7)-, SO2또는 SO이고;
    A는 O, S 또는 NR7이고;
    G는 고리에 융합된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
    R1은 H, 또는 다중환 작용기를 비롯한치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬이고;
    R2는 고리에서 0-4개 치환체이고;
    R3은 고리에서 0-4개 치환체이고;
    R7은 독립적으로 H, 저급 알킬, J-사이클로알킬, J-헤테로사이클릴, J-아릴, J-헤테로아릴이고;
    R8은 독립적으로 H, 저급 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    J는 독립적으로 CK2, NK, O, S에서 선택되는 0-8개 단위를 갖는 사슬이고, 여기서 K는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다.
  18. 제 17 항에 있어서, Z와 X중 적어도 하나는 직접 결합이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, X-Y-Z는 아마이드, 요소 또는 설폰아마이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, X는 -N(R8)-, -O-, -S-에서 선택되고, 적절하게는 NH인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17 항에 있어서, R1에는 1-5개 치환체로 선택적으로 치환되는 아릴 또는 헤테로아릴 고리가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, R1에서 치환체는 니트로, 할로겐, 시아노, 저급 알킬,아실아미노(예, R8-C(=O)NH-), 알콕시, 알킬아미노, 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 아릴이나 헤테로아릴 고리에 융합된 헤테로아릴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 17 항에 있어서, R2는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 카르보닐기, 티오카르보닐, 케톤, 알데하이드, 아미노, 아실아미노, 아미도, 아미디노, 시아노, 니트로, 아지도, 설포닐, 설폭시도, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, J-R8, J-OH, J-저급 알킬, J-저급 알케닐, J-SH, J-NH2, 이들의 보호된 형태에서 선택되는 1-4개 치환체이거나, 또는 환이나 다중환 구조에서 1회 이상 존재하는 경우에 임의의 2가지 R2는 서로 결합하여 4각형 내지 8각형 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, R2는 할로겐, 시아노, 니트로, 알콕시, 아미노, 아실아미노, 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, G에 융합된 헤테로아릴, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬에서 선택되는 1-4개의 치환체인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 17 항에 있어서, 세포는ptc기능 상실(loss-of-function),hedgehog기능 획득(gain-of-function) 또는smoothened기능 획득의 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 17 항에 있어서,hedgehog길항제는 1μM 이하의 ED50으로ptc기능 상실,hedgehog기능 획득, 또는smoothened기능 획득 매개된 신호 전달을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 17 항에 있어서,hedgehog길항제는 1 nM 이하의 ED50으로ptc기능 상실,hedgehog기능 획득, 또는smoothened기능 획득 매개된 신호 전달을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 17 항에 있어서, 세포는 시험관내에서hedgehog길항제와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 17 항에 있어서, 세포는 생체내에서hedgehog길항제와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 17 항에 있어서,hedgehog길항제는 치료 또는 미용 용도로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 치료 또는 미용 용도는 신경 조직의 조절; 골과 연골의 형성과 복구; 정자 형성(spermatogenesis)의 조절; 평활근의 조절; 폐, 간 및 원시 장관(Primitive gut)으로부터 기원하는 다른 장기의 조절; 조혈 기능의 조절; 피부와 머리카락 성장의 조절에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제약학적 무균 부형제 및 화학식 I로 대표되는 화합물을 함유하는 제약학적 조성물:
    화학식 I
    여기서, 결합가(valence)와 안정도가 허락되면,
    X와 Z는 독립적으로 -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- 또는 직접 결합이고;
    Y는 -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NR7)-, SO2또는 SO이고;
    A는 O, S 또는 NR7이고;
    G는 고리에 융합된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
    Ar은 치환되거나 치환되지 않은 아릴이나 헤테로아릴 고리이고;
    R1은 H, 또는 다중환 작용기를 비롯한치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬이고;
    R2는 고리에서 0-4개 치환체이고;
    R7은 독립적으로 H, 저급 알킬, J-사이클로알킬, J-헤테로사이클릴, J-아릴, J-헤테로아릴이고;
    R8은 독립적으로 H, 저급 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    J는 독립적으로 CK2, NK, O, S에서 선택되는 0-8개 단위를 갖는 사슬이고, 여기서 K는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다.
  33. 기저세포 암종(basal cell carcinoma)을 치료하거나 예방하는 방법에 있어서, 기저세포 암종의 진행을 저해하는 충분한 함량으로 제 32항의 제약학적 조성물을 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제약학적 무균 부형제 및 화학식 Ⅱ로 대표되는 화합물을 함유하는 제약학적 조성물:
    화학식 Ⅱ
    여기서, 결합가(valence)와 안정도가 허락되면,
    X와 Z는 독립적으로 -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- 또는 직접 결합이고;
    Y는 -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NR7)-, SO2또는 SO이고;
    A는 O, S 또는 NR7이고;
    G는 고리에 융합된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
    R1은 H, 또는 다중환 작용기를 비롯한치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬이고;
    R2는 고리에서 0-4개 치환체이고;
    R3은 고리에서 0-4개 치환체이고;
    R7은 독립적으로 H, 저급 알킬, J-사이클로알킬, J-헤테로사이클릴, J-아릴, J-헤테로아릴이고;
    R8은 독립적으로 H, 저급 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    J는 독립적으로 CK2, NK, O, S에서 선택되는 0-8개 단위를 갖는 사슬이고, 여기서 K는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다.
  35. 기저세포 암종(basal cell carcinoma)을 치료하거나 예방하는 방법에 있어서, 기저세포 암종의 진행을 저해하는 충분한 함량으로 제 34항의 제약학적 조성물을 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 1 항 또는 17 항에 있어서, 세포는ptc기능 상실(loss-of-function) 표현형,hedgehog기능 획득(gain-of-function) 표현형 또는smoothened기능 획득 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
KR10-2004-7001176A 2001-07-27 2002-07-29 헤지호그 신호전달 경로의 조절물질, 이를 함유하는조성물 및 이의 용도 KR20040031782A (ko)

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