CN102803246A - Hedgehog途径拮抗剂及其治疗应用 - Google Patents

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Abstract

可调节Hedgehog信号途径的杂环化合物、其药物组合物及其治疗应用。

Description

HEDGEHOG途径拮抗剂及其治疗应用
发明领域
本发明涉及有机化合物、其药物组合物及其用于哺乳动物的治疗和/或预防的用途，尤其涉及可调节Hedgehog信号途径的杂环化合物。
发明背景
45kDa人Shh前体蛋白的自体溶解产生负责正常的Hedgehog信号传导的20kDa N-末端片段和涉及自体加工活性的25kDa C-末端片段，其中N-末端片段与胆固醇结合(Lee等人Science 266 1528-1537(1994)和Bumcrot等人Mol.Cell Biol.15 2294-2303(1995))。
正常功能的Hedgehog(Hh)信号传导通过指引细胞分化和增殖规定胚胎的模式，这一点首次在黑腹果蝇(Drosophilia melanogaster)中进行了报道(Nusslein-Vollhard等人Roux.Arch.Dev.Biol.193：267-282(1984))。对于分泌的Hh多肽的细胞响应通过两种完整的膜蛋白Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)介导。Hh与十二跨膜蛋白Ptc结合并由此逆转Ptc-介导的七跨膜蛋白Smo抑制。这种Smo活化然后触发一系列胞内事件，最终导致转录因子Cubitus interruptus(Ci)的稳定和Ci-依赖性基因的表达。这些事件在哺乳动物发育和肿瘤发生过程中通过多种蛋白同源物重现，包括三种不同的Hh家族成员[Sonic(Shh)、Indian(Ihh)和Desert(Dhh)]、两种Ptc蛋白(Ptch1和Ptch2)和三种Ci-样转录因子(Gli1、Gli2和Gli3)。然而，存在Smo的单一脊椎动物同源物，通过在果蝇属(Drosophila)、小鼠和斑马鱼中的遗传分析发现它牵涉于所有形式的Hh信号传导(Chen等人PNAS 99(22)：14071-14076(2002))。
Smo启动信号级联，导致Gli转录因子活化及其随后的核易位，从而产生对靶基因转录的控制。通过负反馈环，Gli影响着抑制Hh途径的Ptc和Hip1(Hedgehog-相互作用蛋白1(Hip1))的转录。对Hh途径活化的失控与不断增加的癌症范围有关，包括影响脑部的癌症，例如髓母细胞瘤(Romer和Curran，Cancer Res 65(12)4975-4978(2005))和胶质母细胞瘤(Bar等人，Stem Cells，25(10)：2524-33(2007))；前列腺癌(Sanchez等人，PNAS 101(34)12561-12566(2004))；胰腺癌(Thayer等人，Nature423 851-856(2003))；非小细胞肺癌(Yuan等人，Oncogene 26 1046-1055(2007)；小细胞肺癌(Watkins等人，Nature 422 313-317(2003))；乳腺癌(Kubo等人，Cancer Res，64 6071-6074(2004))；各种消化道肿瘤(Berman等人，Nature 425 846-851(2003))和(Lees 等人，Gastroenterology 129(5)1696-1710(2006))；基底细胞癌(Williams等人，PNAS 100(8)4616-4621(2003))；恶性黑素瘤(Pons和Quintanilla，ClinTrans Oncol.8(7)466-474(2006))；鳞状细胞癌(Xuan等人，Mod Pathol.19(8)1139-47(2006))；B-细胞恶性肿瘤例如多发性骨髓瘤和淋巴瘤(Dierks等人，Nat.Med.13(8)944-951(2007)；Peacock等人，PNAS104(10)4048-4053(2007))；间质癌例如软骨肉瘤(Tiet等人，Am.J.Pathol.168(1)321-330(2006))、肾的透明细胞肉瘤(Cutclifie等人，Clin CancerRes.11(22)：7986-94(2005))和横纹肌肉瘤(Tostar等人，J.Pathol.208(1)17-25(2006))；慢性髓样白血病(Sengupta等人，Leukemia 21(5)949-955(2007))；子宫内膜癌(Feng等人，Clin.Cancer Res.13(5)1389-1398(2007)；肝细胞癌(Huang等人，Carcinogenesis 27(7)133401340(2006))；卵巢肿瘤(Chen等人，Cancer Sci.98(1)68-76(2007))。
还发现Hh信号传导调节ABC转运蛋白多药抗药性蛋白-1(MDR1、ABCB1、P-糖蛋白)和(BCRP、ABCG2)的表达，并且发现通过小的干扰性RNA靶向敲除MDR1和BCRP的表达部分逆转了Hh-诱导的化学抗性。这表明Hh途径也许是克服MDR和增加化疗响应的靶标(Sims-Mourtada等人，Oncogene 26(38)5674-5679(2007))。发现对SonicHedgehog信号途径的阻断促进了EGFR抑制剂在胰腺癌细胞(Hu等人，Acta Pharmacol Sin.28(8)1224-30(2007))和前列腺癌细胞(Mimeault等人，Int.J Cancer 118(4)1022-31(2006))中的抗增殖效果。
Hedgehog途径还涉及化放疗后的肿瘤再生以及作为改善辐射反应的潜在靶标(Sims-Mourtada等人，Clin.Cancer Res.12(21)6565-6572(2006))，并且一种Hedgehog途径的拮抗剂--环杷明增加了紫杉醇和辐射在表达Hh的胰腺癌细胞中的细胞毒性效果(Shafaee等人，CancerChemother.Pharmacol.58(6)765-70(2006))。
还报道了对Hedgehog信号传导途径的抑制可用于治疗一系列涉及炎症、上皮细胞增生、组织纤维化或免疫病症的疾病(Lamb等人，EP1183040)。已报道在大鼠的原位小肠移植模型中，Sonic Hedgehog信号传导的抑制减少了慢性排斥并且延长了同种移植物的存活。尽管急性移植物排斥可通过免疫抑制剂控制，但是特征在于供体器官血管的动脉硬化的慢性排斥是长期同种移植物存活的主要障碍。在大鼠的原位小肠移植模型中，移植物的存活在抗-Shh抗体治疗后与免疫球蛋白G对照相比显著延长(116对比77.5天)。在抗-Shh抗体接受者中，肠系膜中的胶原蛋白沉积和血管闭塞显著减少(Chen等人，Transplantation 83(10)1351-1357(2007)；Lamb等人EP1183040B1)。
还报道了sFRP-1是Hh信号传导的下游靶基因，且Hh途径活化后升高的分泌的卷曲相关蛋白-1(sFRP-1)的表达提供了对Wnt信号传导抑制效果的分子关联(He等人，J.Biol.Chem.281(47)35598-35602(2006))。因此，通过经由sFRP-1拮抗Hh途径来调节Wnt信号传导可以为一系列疾病例如骨质疏松症(Ai等人，Mol.Cell.Biol.25(12)4946-4955(2005))等(Luo等人，Laboratory Investigation，87，97-103(2007))提供治疗方法。
已经研究了Hh途径的各种抑制剂，包括天然产物环杷明，认为它通过与Smo的七螺旋区结合起作用。另外，近年来报道了Smo受体的许多合成小分子拮抗剂：有关综述参见Kiselyov Anti-Cancer Agents inMedicinal Chemistry 6 445-449(2006)。
现有技术
Lubisch等人公开了作为PARP抑制剂用于治疗包括癌症在内的各种疾病(WO2000026192)和用于化妆品领域(WO2001082877)的一系列2-苯基-苯并咪唑。共同的特征是在苯并咪唑环的4-位上存在氨基甲酰基部分。
Arienti等人(WO2003032984)和Ameriks等人(WO2004093873和US2004214857)公开了作为检查点激酶2抑制剂用于治疗癌症的一系列2-苯基-苯并咪唑衍生物，进一步的特征在于苯并咪唑环的5-位总是被羧酸酯、氨基甲酰基或氨磺酰基所取代。
Ohemeng等人(WO9911627和US5942532)公开了作为抗菌剂的一系列5-甲脒-2-苯基-苯并咪唑化合物。
Mjalli等人(WO2003075921)记载了一系列2-苯基-苯并咪唑衍生物的药物应用。
Alekshun等人(WO2004041209和WO2006076009)公开了一系列具有抗生素活性的2-苯基-苯并咪唑醇衍生物。
Khaled等人1(Bulletin of the Faculty of Pharmacy(Cairo University)，40(1)，7-13，(2002))描述了2-苯基-苯并咪唑衍生物的合成和抗高血压活性，而Kobuta等人描述了某些其它物质的DNA结合性能(Nucleic AcidsResearch Supplement，2(第29届核酸化学研讨会)，193-194(2002)和Nucleic Acids Symposium Series，35(第23届核酸化学研讨会，1996)，151-152(1996))。
Guicherit等人(WO2006050506)、Beachy等人(WO2003088970)、Rubin等人(WO2003011219)、Yuach等人(Nature，455，406(2008)和Dakin等人(WO2009027746)公开了作为Hedgehog途径的拮抗剂用于治疗各种形式的癌症的的2-苯基-苯并咪唑的芳基-和烷基-酰氨基/脲衍生物。Guicherit等人(WO2006050506)和Rubin等人(WO2003011219)还公开了用于相同目的的2-苯基-咪唑并吡啶的芳基酰氨基衍生物。下面的22种化合物公开于同一申请人的共同未决申请WO2009074300中。
Figure BDA0000118099040000051
发明详述
本发明提供了式I化合物
Figure BDA0000118099040000061
其中，在化合价和稳定性允许的情况下，
i可以是1或2；
R1可以是H；直链、支链或环状(C1-C4)烷基；
R2可以是H、Cl或F；
X可以是N或CR3
R3可以是H；卤素；直链、支链或环状(C1-C4)烷基或烷氧基；
Y可以是
Figure BDA0000118099040000062
Z可以是O或NRx；
Rx可以是H或直链、支链或环状(C1-C4)烷基；
k可以是1、2、3或4；
n和p可以独立地是1、2或3并且n+p之和不能超过5；
T可以是H或直链或支链(C1-C4)烷基；
T’可以是直链或支链C1-C3烷基链，其被(C1-C6)-二烷基氨基或4至6元饱和杂环所取代，该杂环含有1个氮原子并且任选地含有第二个选自N和O的杂原子，所述的杂环在氮原子上任选地被(C1-C4)烷基链所取代；或4至6元饱和杂环，该杂环含有1个氮原子并且任选地含有第二个选自N和O的杂原子，所述的杂环在氮原子上任选地被(C1-C4)烷基链所取代，
r是0、1、2或3；
R’是卤素；羟基；氨基；氰基；硝基；氧代；直链或支链(C1-C6)烷基、二卤代烷基、氮杂烷基、氧杂烷基、烷基羰基、氧杂烷基羰基、烷氧基羰基、烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、链烯基、氧杂链烯基、氮杂链烯基、链烯基羰基、氧杂链烯基羰基、链烯基氧基羰基、链烯基氨基羰基、烷基氨基、二烷基氨基、巯基烷基、烷氧基、任选地被一个或多个氟原子取代的烷硫基；其中两个R’基团可形成具有螺或稠合连接的5-至8-元环。
并且排除：
Figure BDA0000118099040000081
在一种实施方案中，i等于2、-C(＝O)-Y在产生的哌啶环的4位上并且R1、R2、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义。在另一种实施方案中，i等于2、-C(＝O)-Y在产生的哌啶环的3位上并且R1、R2、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义；在其它实施方案中，i等于1且R1、R2、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义；在一种实施方案中，R1是H、R2不是H且i、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义；在另一种实施方案中，R2是H、R1不是H且i、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义。在一种实施方案中，X是N且i、R1、R2、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义；在另一种实施方案中，X是CR3且i、R1、R2、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义。在一种实施方案中，R3是H且i、R1、R2、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义。在另一种实施方案中，R3是Cl、F、OMe和Me且i、R1、R2、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义。在另一种实施方案中，r等于0且i、R1、R2、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T和T′如上式I所定义。
在优选的实施方案中，提供了上式I的化合物，其中Y是
Figure BDA0000118099040000091
k等于2、r等于1、R’是二甲基氨基且i、R1、R2、X，和R3如上式I所定义。
在另一个优选的实施方案中，提供了上式I的化合物，其中Y是
并且其中n和p都等于2、Z是O、r等于0且i、R1、R2、X和R3如上式I所定义。
在第三个优选的实施方案中，提供了上式I的化合物，其中i等于2且-C(＝O)-Y在产生的哌啶环的4位上，X是CR3、R3是甲基、R2是F且R1、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如上式I所定义。
特别令人感兴趣的化合物是下列化合物：
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-哌嗪-1-基-甲酮；
氮杂环庚烷-1-基-{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吡咯烷-1-基-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-哌啶-1-基-甲酮；
{(S)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸(3-二甲基氨基-丙基)-甲基-酰胺；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(R)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-{(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(S)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-吡咯烷-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-{(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-甲酮；
(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-{(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-{1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-基}-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(R)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(S)-1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(S)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{1-[4-氯-3-(1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(S)-1-[4-氯-3-(1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氯-3-(1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(S)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；和
{1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮。
一组代表性的式I化合物的药理学活性利用以下所述的两个体外试验进行证实。根据另一个方面，本发明由此涉及治疗癌症或骨质疏松的方法，该方法包括向需要所述治疗的个体、优选人类个体施用有效量的式I化合物。可利用该方法治疗的癌症类型非限制性地包括非小细胞肺癌；小细胞肺癌；乳腺癌；卵巢癌；消化道肿瘤；脑癌例如髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤；前列腺癌；胰腺癌；基底细胞癌；恶性黑素瘤；鳞状细胞癌；多发性骨髓瘤；淋巴瘤；间质癌例如软骨肉瘤，肾的透明细胞肉瘤和横纹肌肉瘤；慢性髓样白血病；子宫内膜癌；肝细胞癌。
一般地，式I化合物可用于治疗可受益于通过化合物与Smo受体的结合而抑制Hedgehog途径的任何疾病、状况或功能障碍，并且非限制性地包括骨质疏松和选自下列的癌症：非小细胞肺癌；小细胞肺癌；乳腺癌；卵巢肿瘤；消化道肿瘤；脑癌例如髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤；前列腺癌；胰腺癌；基底细胞癌；恶性黑素瘤；鳞状细胞癌；多发性骨髓瘤；淋巴瘤；间质癌例如软骨肉瘤，肾的透明细胞肉瘤和横纹肌肉瘤；慢性髓样白血病；子宫内膜癌；肝细胞癌。
用于治疗的化合物的剂量可根据例如给药途径、疾病的性质和严重程度而变化。通常，利用0.01至200mg/kg范围内的日剂量可在人体中得到可接受的药理学效果。
另一方面，本发明涉及含有一种或多种式I化合物以及可药用载体和赋形剂的药物组合物。该药物组合物可以是固体、半固体或液体制剂的形式，优选溶液、混悬液、粉剂、粒剂、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、气溶胶或可控的传送系统的形式。该组合物可通过各种途径给药，包括口服、经皮、皮下、静脉内、肌内、直肠和鼻内，优选以单位剂型配制。口服的单位剂型可含有约1mg至约1000mg本发明化合物。
对于游离碱形式的这些化合物，该发明还包括其酸加成盐，优选与可药用酸所形成的盐。本发明还包括化合物I的单独的异构体和非对映体或其混合物(例如外消旋混合物)。制备药物组合物的原则和方法描述在例如Remington’s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton(PA)。
式I化合物、其光学异构体或非对映体可按照已知的方法纯化或分离，该方法非限制性地包括具有手性基质的色谱和分步结晶。
化合物的合成和实验方法
本发明化合物可利用各种合成路线制备，包括以下一般方法1-11和方法A-T所述的方法。
材料和方法
所有试剂和溶剂都是商购得到的。将对空气和水分敏感的液体溶液通过注射器转移。反应的进程通过薄层色谱(TLC)和/或液相色谱-质谱(LC-MS)进行监测。
所有的核磁共振波谱利用配备有PFG ATB Broadband探针的VarianMercury Plus 400MHz波谱仪记录。
利用配备有Waters Micromass ZQ(ES解离)和Waters PDA 2996的Waters 2795分离模块、利用Waters XTerra MS C18 3.5μm 2.1x50mm柱进行10分钟方法。
利用具有二元Gradient Module Waters 2525泵并连接到WatersMicromass ZQ(ES)或Waters 2487 DAD上的Waters 2767系统、利用Supelco Discovery HS C18 5.0m 10x21.2mm柱进行制备型HLPC。
梯度利用以下方法进行：方法a：0.1％甲酸/水和0.1％甲酸/乙腈，在所示的运行时间内梯度为5/95至95/5(通量：1mL/min)，或方法b：0.1％甲酸/水和0.1％甲酸/甲醇，在所示的运行时间内梯度为5/95至80/20(通量：0.8mL/min)。最终化合物的运行时间是10分钟。
纯化利用硅胶短柱Isolute Flash Si进行。
所有的TLC分析均在硅胶(Merck 60 F254)上进行，并且通过UV显影在254nm处显示斑点和用KMnO4或茚三酮显色。
一般方法1
Figure BDA0000118099040000151
2-(3-溴苯基)-1H-苯并咪唑
方法1-步骤a：将邻苯二胺(81.8g，756.6mmol)和草酸(3.4g，37.8mmol)完全溶于先前在80℃下加热的EtOH-H2O/1∶1(2L)。然后将3-溴苯甲醛(44.10mL，378.30mmol)滴加到溶液中。将反应混合物在70℃下露天搅拌过夜。第二天将固体滤出并用MeOH(150mL)研制以得到浅黄色固体状产物(27.50g)。从母液中回收得到3.8g。总收率31.30g(30％)。
1H-NMR(400MHz DMSO)：δ7.24(2H，m)，7.54(2H，m)，7.70(m，2H)，8.19(1H，m)，8.37(1H，t)，13.2(1H，s)；m/z 273(M+H)+；保留时间(方法a)＝8.60(10分钟运行)
2-(3-溴-苯基)-1-甲基-1H-苯并咪唑
方法1-步骤b：将2-(3-溴苯基)-1H-苯并咪唑(7.8g，28.6mmol)完全溶于干燥的THF(300ml)，然后将NaH 60％m/m(1.49g，37.2mmol)分批加入到澄清的黄色溶液中。将浅棕色悬浮液在室温下搅拌1小时，然后滴加CH3I(2.5ml，40.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。用H2O(300ml)终止反应并用EtOAc萃取(2x450ml)。将有机萃取液用MgSO4干燥，过滤并蒸发得到棕黄色固体状化合物(7.40g，70％)。
1H-NMR(400MHz DMSO)：δ3.90(3H，s)，7.30(2H，m)，7.55(1H，t)，7.64(1H，d)，7.70(1H，d)，7.77(1H，m)，7.88(1H，m)，8.05(1H，m)；m/z＝287[M+H]+，保留时间(方法a)＝7.70(10分钟运行)
(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸乙酯
方法1-步骤c：将2-(3-溴-苯基)-1-甲基-1H-苯并咪唑(0.85g，2.96mmol)、(S)-(+)-哌啶-3-甲酸乙酯(0.60g，3.85mmol)和碳酸铯(4.82g，14.80mmol)在氮气下置于干燥的Schlenk试管中。同时，将乙酸钯(0.14g，0.60mmol)和外消旋-2，2’-二(二苯基膦)-1，1’-联萘(BINAP)(0.57g，0.90mmol)在氮气下置于干燥的7mL小瓶中。然后加入干燥的甲苯(5mL)并将混合物在氮气下搅拌20分钟，然后加入到第一个烧瓶中。将反应混合物在80℃下加热过夜，冷却至室温，滤出，将不溶物用EtOAc洗涤(3x10mL)。将有机溶液减压浓缩并将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂：环己烷：AcOEt梯度，从100％环己烷至环己烷4：AcOEt 1)得到0.75g标题化合物(70％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.25(3H，t)，1.66-1.88(3H，m)，1.95-2.03(1H，m)，2.67-2.74(1H，m)，2.94-3.01(1H，m)，3.16-3.22(1H，m)，3.52-3.57(1H，m)，3.73-3.77(1H，m)，4.15(2H，q)，7.16-7.19(2H，m)，7.28-7.36(3H，m)，7.41-7.45(1H，m)，7.53-7.56(1H，m)，7.66-7.68(1H，m)。
(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸盐酸盐
方法1-步骤d：将(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸乙酯(0.76g，2.09mmol)在6N HCl(4.0mL)中的混合物在微波中在120℃下加热20分钟；需要3次循环以完成转化。然后除去溶剂并将粗产物用丙酮/乙酸乙酯的混合物(1∶1)研制，滤出固体并真空干燥以得到0.60g标题化合物(86％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：1.52-1.84(3H，m)，2.0(1H，m)，2.65(1H，m)，3.02(1H，t)，3.16(1H，t)，3.64(1H，d)，3.80(1h，d)，4.03(3H，s)，7.35-7.51(2H，m)7.51-7.72(4H，m)，7.83-7.90(1H，m)，8.01-8.09(1H，m)；m/z 335(M+H)+，保留时间(方法a)＝1.27(5分钟运行)
一般方法2
2-(5-溴-2-氯苯基)-1H-苯并咪唑
方法2-步骤a：向配备有磁力搅拌器的单颈圆底烧瓶中加入5-溴-2-氯苯甲酸(70.0g，297.3mmol)、邻苯二胺(64.3g，594.6mmol)和甲磺酸(140mL)并加热至170℃以熔化固体。将反应体系在该温度下搅拌5小时，然后降至室温。将蓝色固体用NaOH 35％(200mL)处理得到紫色悬浮液(pH 5)，将其过滤并用NaOH 0.5M(2L)和H2O(2L)洗涤。将产物真空(60℃)干燥得到61.6g纯的紫色固体(67％)。
m/z 307/309(M+H)+；保留时间(方法a)＝8.73(10分钟运行)
2-(5-溴-2-氯-苯基)-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯
方法2-步骤b：在配备有磁力搅拌器的三颈圆底烧瓶中，将2-(5-溴-2-氯苯基)-1H-苯并咪唑(30.7g，99.8mmol)悬浮在THF(1L)中。然后加入50％NaOH(72.0g，598mmol)。将悬浮液在室温下搅拌1小时。将(BOC)2O(37.0g，169.7mmol)溶于THF(200mL)并将其加入到反应混合物中。将反应液在搅拌下放置过夜。减压蒸发溶剂。将得到的残余物用水(500mL)稀释，过滤并真空干燥(60℃)得到39.8g棕色固体(98％)。
m/z 407/409(M+H)+；保留时间(方法a)＝9.14(10分钟运行)
2-[2-氯-5-((R)-3-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-苯基]-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯
方法2-步骤c：将2-(5-溴-2-氯-苯基)-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(1.50g，3.69mmol)、(R)-(-)-哌啶-3-甲酸乙酯(0.75g，4.79mmol)和碳酸铯(6.00g，18.43mmol)在氮气下置于干燥的Schlenk试管中。同时，将乙酸钯(0.17g，0.74mmol)和BINAP(0.71g，1.11mmol)在氮气下置于干燥的7mL小瓶中。加入干燥的甲苯(5mL)并将混合物在氮气下搅拌20分钟，然后将其加入到第一个烧瓶中。将反应混合物在80℃下加热过夜，冷却至室温，过滤并将不溶物用EtOAc洗涤(3x10mL)。将有机溶液减压浓缩并将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂：环己烷：AcOEt梯度，从100％环己烷至环己烷4：AcOEt 1)得到1.33g标题化合物(74％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.23(3H，t)，1.36(9H，s)，1.64-1.84(3H，m)，1.84-2.00(1H，m)，2.65-2.71(1H，m)，2.93-2.98(1H，m)，3.14-3.19(1H，m)，3.45-3.51(1H，m)，3.67-3.71(1H，m)，4.14(2H，q)，7.11-7.16(2H，m)，7.35-7.37(1H，m)，7.40-7.48(2H，m)，7.71-7.73(1H，m)，8.13-8.15(1H，m)。
(R)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-甲酸乙酯
方法2-步骤d：向2-[2-氯-5-((R)-3-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-苯基]-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(1.30g，2.68mmol)的二氯甲烷(2mL)混合物中加入2M HCl的Et2O(10mL)溶液并将形成的混合物在室温下搅拌过夜。滤出固体，然后用10％NaOH(10mL)回收并用二氯甲烷萃取(3x10mL)。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以得到0.81g标题化合物，未进行进一步纯化(85％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.25(3H，t)，1.67-1.87(3H，m)，1.98-2.03(1H，m)，2.66-2.72(1H，m)，2.94-3.01(1H，m)，3.17-3.22(1H，m)，3.50-3.55(1H，m)，3.70-3.75(1H，m)，4.14(2H，q)，7.10-7.13(1H，m)，7.26-7.31(2H，m)，7.40-7.42(2H，m)，7.62(2H，bs)；m/z＝384[M+H]+，保留时间(方法a)＝1.82(5分钟运行)
(R)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-甲酸盐酸盐
方法2-步骤e：将(R)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-甲酸乙酯(0.81g，2.11mmol)在6N HCl(4.0mL)中的混合物在微波中在120℃下加热20分钟；需要2次循环以完成转化。然后除去溶剂并将粗产物用丙酮/乙酸乙酯混合物(1∶1)研制，滤出固体并真空干燥得到0.60g标题化合物(80％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ1.50-1.725(2H，m)，1.72(1H，m)，2.54(1H，m)，2.93(1H，t)，3.06(1H，t)，3.63(1H，d)，3.80(1H，dd)，7.31(1H，dd)，7.54-7.58(2H，m)，7.60-7.62(2H，m)，7.86-7.90(2H，m)；m/z355(M+H)+，保留时间(方法a)＝1.45(5分钟运行)
一般方法3、4
Figure BDA0000118099040000191
N-(2-氨基-5-氟-苯基)-5-溴-2-氯-苯甲酰胺
方法3、4-步骤a：向固体5-溴-2-氯苯甲酸(7.00g，29.79mmol)、4-氟-苯-1，2-二胺(4.65g，36.94mmol)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)(11.89g，31.28mmol)的混合物中加入三乙胺(TEA)(4.60mL，32.77mmol)、二氯甲烷(120mL)和二甲基甲酰胺(DMF)(30mL)。将反应混合物在室温下搅拌，加入水(30mL)并搅拌至形成沉淀物。滤出沉淀物，用二氯甲烷洗涤(3x10mL)并干燥以得到6.90g标题化合物(69％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ5.27(2H，s)，6.34(1H，td)，6.50(1H，dd)，7.17(1H，dd)，7.50(1H，d)，7.67(1H，dd)，7.97(1H，d)，9.72(1H，s)；m/z 345(M+2)+
2-(5-溴-2-氯-苯基)-5-氟-1H-苯并咪唑
方法3、4-步骤b：将N-(2-氨基-5-氟-苯基)-5-溴-2-氯-苯甲酰胺(6.90g，20.12mmol)的乙酸(40mL)溶液在80℃下搅拌过夜，然后减压除去溶剂并将粗产物通过用二乙醚沉淀而纯化，得到6.00g标题化合物(92％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.10(1H，m)，7.35-7.50(1H，m)，7.56和7.70(1H，m)，7.61(1H，m)，7.73(1H，m)，8.08(1H，m)，12.92(1H，s).m/z 327(M+2)+
2-(5-溴-2-氯-苯基)-5-氟-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯
方法3-步骤c：向含有2-(5-溴-2-氯-苯基)-5-氟-1H-苯并咪唑(6.00g，18.46mmol)的烧瓶中加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.23g，1.85mmol)、二碳酸二叔丁酯(Boc2O)(5.23g，24.00mmol)和二氯甲烷(90mL)。将反应混合物在室温下搅拌，减压除去溶剂并将粗产物用环己烷：AcOEt/10∶1混合物沉淀得到4.60g标题化合物(59％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.40(9H，s)，7.10-7.22(1H，m)，7.34(1H，dd)，7.47和7.83(1H，m)，7.55-7.59(1H，m)，7.71(1H，m)，7.74和8.06(1H，m)；m/z 427(M+2)+
2-(5-溴-2-氯-苯基)-5-甲氧基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯
方法4-步骤c：向含有2-(5-溴-2-氯-苯基)-5-甲氧基-1H-苯并咪唑(6.50g，19.29mmol)的烧瓶中加入DMAP(0.23g，1.93mmol)、Boc2O(5.47g，25.07mmol)和二氯甲烷(100mL)。将反应混合物在室温下搅拌并减压除去溶剂。将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂梯度：从环己烷：AcOEt/5∶1至1∶2)得到4.70g标题化合物(56％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ1.32(9H，s)，3.82(3H，d)，7.04(1H，m)，7.29和7.65(1H，m)，7.56(2H，m)，7.75(1H，m)，7.88(1H，m)；m/z438(M+H)+，保留时间(方法a)＝7.47(10分钟运行)。
2-[2-氯-5-(4-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-苯基]-5-氟-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯
方法3、4-步骤d：将2-(5-溴-2-氯-苯基)-5-氟-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(1.04g，2.46mmol)、哌啶-4-甲酸乙酯(0.49mL，3.19mmol)和碳酸铯(3.99g，12.29mmol)在氮气下置于干燥的Schlenk试管中。同时，将乙酸钯(0.11g，0.49mmol)和BINAP(0.46g，0.74mmol)在氮气下置于干燥的7mL小瓶中。然后加入干燥的甲苯(4mL)并将混合物在氮气下搅拌20分钟，然后将其加入到第一个烧瓶中。将反应混合物在80℃下加热过夜，冷却至室温，滤出盐，将有机溶液减压浓缩并将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂：环己烷：AcOEt梯度，从环己烷：AcOEt/5：1至1：2)得到0.84g标题化合物(68％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.35(3H，t)，1.45(9H，s)，1.80(2H，m)，1.99(2H，m)，2.52(1H，m)，2.88(2H，m)，3.72(2H，m)，4.13(2H，q)，7.10-7.28(3H，m)，7.35(1H，d)，7.43和7.86(1H，m)，7.71和8.14(1H，dd)；m/z 502(M+H)+，保留时间(方法a)＝3.10(5分钟运行)
1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐
方法3、4-步骤e：将2-[2-氯-5-(4-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-苯基]-5-氟-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(0.42g，0.84mmol)在6N HCl(4mL)中的混合物在室温下搅拌几分钟，然后在微波中在120℃下加热15分钟。真空除去溶剂以得到标题化合物，定量收率。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.95(2H，m)，2.13(2H，m)，2.65(1H，m)，3.20(2H，m)，3.83(2H，m)，7.53(2H，m)，7.69(3H，m)，7.91(1H，m)；m/z 374(M+H)+，保留时间(方法a)＝1.65(5分钟运行)。
一般方法5
Figure BDA0000118099040000221
2-[2-氯-5-(3-乙氧基羰基-吡咯烷-1-基)-苯基]-5-甲基-苯并咪唑-1-甲酸叔 丁酯
方法5-步骤a：将2-(5-溴-2-氯-苯基)-5-甲基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(按照一般方法4，步骤c所述的方法得到)(1.80g，4.28mmol)、吡咯烷-3-甲酸甲酯(0.92g，5.56mmol)和碳酸铯(6.95g，21.38mmol)在氮气下加入到含有事先在氮气下搅拌了20分钟的乙酸钯(0.19g，0.86mmol)和BINAP(0.80g，1.28mmol)的干燥甲苯(11mL)溶液的烧瓶中。将反应混合物在80℃下加热过夜，冷却至室温，用AcOEt(40mL)稀释，滤出盐，将有机层用水(1x30mL)和盐水(1x20mL)洗涤，用Na2SO4干燥，然后减压浓缩。向粗产物中加入溶剂环己烷：AcOEt/4∶1混合物(15mL)并通过含有Na2SO4的柱子过滤以除去所有盐，用溶剂的混合物洗涤，将有机层通过快速色谱纯化(洗脱剂：环己烷：AcOEt/4∶1)得到1.71g标题化合物(86％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.30(9H，s)，1.38(3H，s)，2.20(2H，m)，3.24-3.51(5H，m)，3.63(3H，s)，6.68(1H，m)，6.74(1H，m)，7.23(1H，m)，7.30(1H，m)，7.54和7.82(1H，m)，7.62和7.86(1H，m)；m/z 470(M+H)+，保留时间(方法a)＝5.12(10分钟运行)
1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-甲酸
方法5-步骤b：按照一般方法3、4步骤e所述的方法，用2-[2-氯-5-(3-乙氧基羰基-吡咯烷-1-基)-苯基]-5-甲基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯作为原料以定量收率得到标题化合物。
一般方法6
N-(2-氨基-5-甲氧基-苯基)-5-溴-2-氟-苯甲酰胺
方法6-步骤a：将5-溴-2-氟-苯甲酸(1.50g，6.85mmol)、4-甲氧基-苯-1，2-二胺二盐酸盐(1.77g，8.49mmol)、HATU(2.73g，7.19mmol)和TEA(2.88mL，20.76mmol)在二氯甲烷(20mL)和DMF(5mL)中的混合物在室温下搅拌，然后加入水(50mL)，将混合物搅拌2小时并在室温下静置过夜。滤出所得到的沉淀物并干燥得到1.45g标题化合物(50％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.65(3H，s)，4.96(2H，bs)，6.15(1H，dd)，6.31(1H，s)，7.05(1H，d)，7.31(1H，m)，7.71(1H，m)，7.91(1H，d)，9.50(1H，s)。
2-(5-溴-2-氟-苯基)-5-甲氧基-1H-苯并咪唑
方法6-步骤b：将N-(2-氨基-5-甲氧基-苯基)-5-溴-2-氟-苯甲酰胺(1.45g，4.28mmol)在乙酸(15mL)中的混合物在80℃下加热过夜。减压除去溶剂并将粗产物通过用AcOEt(20mL)沉淀而纯化，干燥，用二氯甲烷(20mL)和甲醇(1mL)的混合物回收并用饱和NaHCO3溶液洗涤(3x5mL)，将有机层通过用相分离器过滤进行回收，减压除去溶剂得到0.86g标题化合物(63％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.79(3H，s)，6.86(1H，d)，7.04(1H，bs)，7.41(1H，dd)，7.55(1H，bs)，7.69(1H，m)，8.30(1H，m)，11.93(1H，s)。
2-(5-溴-2-氟-苯基)-5-甲氧基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯
方法6-步骤c：向搅拌着的2-(5-溴-2-氟-苯基)-5-甲氧基-1H-苯并咪唑(0.87g，2.70mmol)的二氯甲烷(10mL)混合物中加入Boc2O(0.76g，3.50mmol)和DMAP(0.03g，0.27mmol)并将反应混合物在室温下放置一个周末。然后加入二氯甲烷(20mL)并将反应混合物用饱和NaHCO3溶液(4mL)、柠檬酸(10％溶液)洗涤，将有机层通过用相分离器过滤进行回收，然后减压除去溶剂。然后将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂：环己烷：乙酸乙酯/10∶1)得到0.82g标题化合物，为两种非对映体的混合物(72％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.45(9H，s)，1.47(9H，s)，3.88(3H，s)，3.90(3H，s)，6.98-7.06(4H，m)，7.25-7.27和7.80-7.83(3H，m)，7.54-7.61(3H，m)，7.93(1H，m)；m/z 423(M+2H)+，保留时间(方法a)＝3.02(5分钟运行)。
一般方法7
Figure BDA0000118099040000251
N-(2-氨基-5-氯-苯基)-5-溴-2-氟-苯甲酰胺
方法7-步骤a：将5-溴-2-氟-苯甲酸(3.00g，13.70mmol)、4-氯-苯-1，2-二胺(2.42g，16.99mmol)、HATU(5.47g，14.38mmol)和TEA(1.91mL，13.83mmol)的二氯甲烷(70mL)和DMF(16mL)混合物在室温下搅拌，然后加入水(80mL)并在室温下静置过夜。分出有机层并减压除去溶剂，将得到的粗油状物用溶剂混合物二氯甲烷：环己烷/3∶1(30mL)结晶得到2.19g标题化合物(52％)。
m/z 344(M+H)+，保留时间＝5.33(10分钟运行)a
2-(5-溴-2-氟-苯基)-5-氯-1H-苯并咪唑
方法7-步骤b：将N-(2-氨基-5-氯-苯基)-5-溴-2-氟-苯甲酰胺(1.60g，4.67mmol)的乙酸(10mL)混合物在85℃下加热过夜。减压除去溶剂，将得到的固体用二氯甲烷洗涤并干燥得到1.40g标题化合物(93％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.27-7.33(2H，m)，7.60-7.64(2H，m)，7.69(1H，m)，8.33(1H，dd)。
2-(5-溴-2-氟-苯基)-5-氯-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯
方法7-步骤c：向搅拌着的2-(5-溴-2-氟-苯基)-5-氯-1H-苯并咪唑(1.41g，4.33mmol)的二氯甲烷(28mL)混合物中加入Boc2O(1.23g，5.63mmol)和DMAP(0.05g，0.43mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用饱和NaH4Cl溶液洗涤(2x5mL)，然后将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂梯度：环己烷：EtOAc从8∶1至5∶1)得到1.31g标题化合物(71％)，为两种区域异构体的混合物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.45(9H，2s)，7.05(1H，m)，7.39(1H，m)，7.60(1H，m)，7.71(0.5H，d)，7.78(0.5H，d)，7.83(1H，m)，7.99(0.5H，d)，8.10(0.5H，d)。
一般方法8
Figure BDA0000118099040000261
2-[5-(4-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-2-氟-苯基]-5-甲基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁 酯
方法8-步骤a：将2-(5-溴-2-氟-苯基)-5-甲基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(按照一般方法6，步骤c所述的方法得到)(0.94g，2.40mmol)、哌啶-4-甲酸乙酯(0.48g，3.12mmol)和碳酸铯(3.90g，12.01mmol)置于干燥的Schlenk试管中并进行3次真空/氮气的循环，然后加入干燥的甲苯(4mL)。同时，将乙酸钯(II)(0.82g，0.36mmol)和BINAP(0.45g，0.72mmol)在氮气下置于干燥的Schlenk试管中并进行3次真空/氮气的循环。在室温下在氮气下加入干燥的甲苯(2mL)并将混合物加入到第一个Schlenk试管中。将反应混合物在80℃下加热过夜，加入水(5mL)，将有机层通过Na2SO4过滤，然后通过快速色谱纯化(洗脱剂：环己烷：EtOAc 8∶2)得到1.15g标题化合物，定量收率。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.27(3H，t)，1.43(9H，s)，1.89(2H，m)，2.02(2H，m)，2.41(1H，m)，2.50(3H，s)，2.80(2H，m)，3.59(2H，m)，4.16(2H，q)，7.01(2H，m)，7.21(2H，m)，7.66(1H，d)，7.91(1H，d)。
1-[4-(氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐
方法8-步骤b：将2-[5-(4-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-2-氟-苯基]-5-甲基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(1.15g，2.39mmol)在6N HCl(10mL)中的混合物在微波中在120℃下加热15分钟(需要循环2次)。真空除去溶剂得到标题混合物，定量收率。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.19(2H，m)，2.34(2H，m)，2.59(3H，s)，2.80(1H，m)，3.55(2H，m)，3.85(2H，m)，7.53(1H，d)，7.63-7.70(2H，m)，7.78(1H，d)，7.91-7.96(1H，m)，8.27-8.33(1H，m)。
一般方法9
Figure BDA0000118099040000271
2-[5-(4-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-2-氟-苯基]-5-甲氧基-苯并咪唑-1-甲酸叔 丁酯
方法9-步骤a：将2-(5-溴-2-氟-苯基)-5-甲氧基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(按照一般方法6，步骤c所述的方法得到)(1.05g，2.50mmol)、哌啶-4-甲酸乙酯(0.51g，3.25mmol)和碳酸铯(4.07g，12.50mmol)置于干燥的Schlenk试管中并进行3次真空/氮气的循环，然后加入干燥的甲苯(4mL)。同时，将乙酸钯(II)(0.11g，0.50mmol)和BINAP(0.48g，0.75mmol)在氮气下置于干燥的Schlenk试管中并进行3次真空/氮气的循环。然后在室温下在氮气下加入干燥的甲苯(2mL)并将混合物加入到第一个Schlenk试管中。将反应混合物在80℃下加热过夜，冷却至室温，加入EtOAc(20mL)并将混合物滤出。除去溶剂并将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂梯度：环己烷：EtOAc从4∶1至3∶1)得到0.82g标题化合物(69％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD，两种区域异构体)：δ1.25(6H，t)，1.40(18H，s)，1.76-1.88(4H，m)，1.96-2.04(4H，m)，2.42-2.51(2H，m)，2.80(4H，t)，3.58-3.65(4H，m)；3.85(3H，s)；3.87(3H，s)；4.13(4H，q)；6.99-7.06(2H，m)，7.07-7.18(4H，m)，7.19-7.23(3H，m)，7.58(1H，d)，7.62(1H，d)；7.94(1H，d)；m/z 498(M+H)+
1-[4-(氟-3-(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐
方法9-步骤b：将2-[5-(4-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-2-氟-苯基]-5-甲氧基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(0.92g，1.91mmol)在6N HCl(4mL)中的混合物在室温下搅拌1小时，然后在微波中在120℃下加热15分钟。真空除去溶剂，然后加入丙酮：二乙醚的1∶1混合物(20mL)，将固体过滤，用二乙醚洗涤并干燥得到0.22g标题化合物(29％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.98-2.10(2H，m)，2.18-2.26(2H，m)，2.63-2.71(1H，m)，3.24-3.32(2H，m)，3.77-3.84(2H，m)；3.95(3H，s)；7.26-7.31(2H，m)，7.54(1H，dd)，7.65-7.71(1H，m)，7.75(1H，dd)，7.92-7.98(1H，m)；m/z 370(M+H)+
一般方法10
Figure BDA0000118099040000291
5-氯-2-[5-(4-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-2-氟-苯基]-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯
方法10-步骤a：将2-(5-溴-2-氟-苯基)-5-氯-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(按照一般方法7，步骤c所述的方法得到)(1.06g，2.50mmol)、Pd2(dba)3(0.36g，0.50mmol)、2-二-叔丁基膦-2′，4′，6′-三异丙基-1，1′-联苯(t-BuXphos)(0.32g，0.75mmol)和叔丁醇钠(0.48g，5.00mmol)置于干燥的小瓶中并进行几次真空/氮气的循环。然后加入干燥的甲苯(5mL)和哌啶-4-甲酸乙酯(0.50mL，3.25mmol)，将反应混合物在85℃下加热过夜，用饱和Na2CO3溶液(3x5mL)和水(3x3mL)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂：梯度从EtOAc：环己烷/1∶5至1∶2)得到0.30g标题化合物(24％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.26(3H，t)，1.43(9H，s)，1.60(2H，m)，1.90(2H，m)，2.42(1H，m)，2.81(2H，m)，3.60(2H，m)，4.16(2H，q)，7.05(2H，m)，7.36(2H，m)，7.69(1H，d)，8.09(1H，s)。
1-[3-(5-氯-1H-苯并咪唑-2-基)-4-氟-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐
方法10-步骤b：将5-氯-2-[5-(4-乙氧基羰基-哌啶-1-基)-2-氟-苯基]-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(0.30g，0.60mmol)在6N HCl(10mL)中的混合物在微波中在120℃下加热15分钟，需要2个循环。真空除去溶剂，然后将固体过滤并用二乙醚洗涤，干燥得到0.17g标题化合物(70％)。
一般方法11
Figure BDA0000118099040000301
1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸乙酯
方法11-步骤a：将2-(3-溴-苯基)-1-甲基-1H-苯并咪唑(按照一般方法1，步骤b所述的方法得到)(5.00g，17.40mmol)、哌啶-4-甲酸乙酯(3.56g，22.62mmol)和碳酸铯(28.34g，87mmol)在氮气下置于圆底烧瓶中。同时，将乙酸钯(0.79g，3.48mmol)和BINAP(3.33g，5.22mmol)在氮气下置于烧瓶中。然后加入干燥的甲苯(18mL)并将混合物在氮气下搅拌20分钟，然后将其加入到第一个烧瓶中。将反应混合物在80℃下加热两天，然后用乙酸乙酯(100mL)稀释，通过Na2SO4过滤并用水(2x50mL)和盐水(1x50mL)洗涤。将有机溶液减压浓缩并将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂：环己烷：AcOEt/4∶1)得到3.45g标题化合物(55％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.19(3H，t)，1.68(2H，qd)，1.93(2H，dd)，2.49-2.58(1H，m)，2.86(2H，td)；3.75(2H，dt)；3.86(3H，s)；4.09(2H，q)，7.10-7.42(6H，m)，7.59(1H，d)，7.67(1H，d)。
1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐
方法11-步骤b：将1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸乙酯(3.10g，8.54mmol)在6N HCl(25.0mL)中的混合物在微波中在120℃下加热20分钟。然后除去溶剂得到标题化合物，定量收率。
1H-NMR(400MHz，MeOD)：δ1.65-1.85(2H，m)，1.94(2H，d)，2.48-2.57(1H，m)，3.04(2H，t)，3.79(2H，d)，4.05(3H，s)，7.37-7.54(2H，m)，7.55-7.71(4H，m)，7.84-7.91(1H，m)，8.03-8.09(1H，m)；m/z 333(M+H)+，保留时间(方法b)＝1.95(10分钟运行)
方法A
Figure BDA0000118099040000311
实施例1：{(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-哌嗪 -1-基-甲酮盐酸盐
4-{(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-羰基}-哌嗪-1-甲酸 叔丁酯
方法A-步骤a：向含有(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸(0.10g，0.30mmol)(按照一般方法1，步骤d所述的方法得到)、HATU(0.12g，0.31mmol)的小瓶中加入TEA(0.09mL，0.66mmol)和叔丁基-1-哌嗪甲酸酯(0.07g，0.37mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液并将反应混合物在35℃下加热过夜。将反应液冷却至室温，除去溶剂并将粗产物通过制备型HPLC和NH2柱过滤纯化得到0.04g标题化合物(27％)。
m/z 503(M+H)+，保留时间(方法a)＝2.52(10分钟运行)
{(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-哌嗪-1-基-甲酮 盐酸盐
方法A-步骤b：向4-{(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-羰基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.04g，0.08mmol)的二氯甲烷(0.5mL)混合物中加入2M HCl的Et2O(2mL)溶液并将形成的混合物在室温下搅拌过夜。除去溶剂以定量收率得到0.04g盐酸盐形式的标题化合物。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ1.74(1H，m)，1.92-2.17(1H，m)，3.03-3.51(7H，m)，3.89(6H，m)，4.14(3H，s)，7.54-7.81(4H，m)，7.83-7.91(2H，m)，7.96-8.02(2H，m)；m/z 404(M+H)+，保留时间(方法a)＝0.20(10分钟运行)
方法B
Figure BDA0000118099040000321
实施例2：{(R)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-吡咯烷 -1-基-甲酮
方法B-步骤a：向含有(R)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-甲酸盐酸盐(按照一般方法2，步骤e所述的方法得到)(0.10g，0.28mmol)(按照一般方法2所述的方法得到)、HATU(0.11g，0.30mmol)、三乙胺(TEA)(0.09mL，0.66mmol)和叔丁基.1.哌嗪甲酸酯(0.08g，0.62mmol)的小瓶中加入二氯甲烷(2mL)并将反应混合物在35℃下加热过夜。将反应液冷却至室温，除去溶剂并将粗产物通过制备型HPLC和NH2柱过滤进行纯化，得到0.06g标题化合物(55％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ1.59-2.06(8H，m)，2.75-2.89(2H，m)，2.94(2H，t)，3.35-3.48(2H，m)，3.84(2H，t)，7.12(1H，dd)，7.24-7.32(2H，m)，7.37-7.44(2H，m)，7.55-7.72(1H，bs)；m/z 409(M+H)+，保留时间(方法a)＝2.27(10分钟运行)
方法C
Figure BDA0000118099040000331
实施例3：{1-[4-氯-3-(3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-哌 啶-1-基-甲酮
5-溴-2-氯-N-(4-硝基-吡啶-3-基)-苯甲酰胺
方法C-步骤a：向5-溴-2-氯苯甲酸(5.00g，21.23mmol)的DMF(40mL)混合物中加入HATU(8.48g，22.29mmol)和三乙胺(2.97mL，21.44mmol)。在室温下搅拌30分钟后加入4-硝基-吡啶-3-基胺(2.36g，16.99mmol)，将反应混合物在40℃下搅拌过夜并除去溶剂。然后将粗产物用EtOAc(40mL)稀释并用饱和Na2CO3溶液(6x30mL)和1N HCl(3x30mL)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并静置。将得到的沉淀物过滤得到4.75g标题化合物(63％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ7.56(1H，d)，7.77-7.92(3H，m)，8.82(1H，d)，9.14(1H，s)，11.35(1H，s)；m/z 355(M+H)+，保留时间(方法a)＝2.32(5分钟运行)
2-(5-溴-2-氯-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶
方法C-步骤b：向5-溴-2-氯-N-(4-硝基-吡啶-3-基)-苯基胺(0.50g，1.47mmol)的乙酸(6mL)混合物中加入铁(0.16g，2.94mmol)并将反应液在80℃下加热1.5小时。然后将反应混合物冷却至室温。加入水(30mL)并用二氯甲烷(20mL)萃取以除去未反应的原料。然后向水层中加入饱和Rochelle盐溶液(50mL)和饱和Na2CO3溶液(30mL)，然后用二氯甲烷(20mL)萃取。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压蒸发得到0.28g标题化合物(65％)，未对其进一步纯化。
1H-NMR(400MHz，MeOD)：δ7.45(1H，d)，7.59-7.68(2H，m)，7.98(1H，d)，8.26(1H，d)，8.87(1H，s)；m/z 309(M+H)+，保留时间(方法a)＝1.13(5分钟运行)
2-(5-溴-2-氯-苯基)-咪唑并[4，5-c]吡啶-3-甲酸叔丁酯
方法C-步骤c：向2-(5-溴-2-氯-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶的二氯甲烷(50mL)混合物中加入Boc2O(0.36g，16.36mmol)和DMAP(0.20g，1.63mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后减压除去溶剂并将粗产物通过Si柱过滤进行纯化(乙酸乙酯作为洗脱剂)得到4.80g标题化合物(80％)。
1H-NMR(400MHz，MeOD)：δ1.41(18H，d)，7.52(2H，dd)，7.73-7.87(5H，m)，8.15(1H，dd)，8.56(2H，t)，9.02(1H，s)，9.38(1H，s)；m/z 409(M+H)+，保留时间(方法b)＝2.03(5分钟运行)
1-[4-氯-3-(3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸乙酯
方法C-步骤d：将2-(5-溴-2-氯-苯基)-咪唑并[4，5-c]吡啶-3-甲酸叔丁酯(0.50g，1.23mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(Pd2dba3)(0.13g，0.18mmol)、2-二环己基膦-2′，4′，6′-三异丙基联苯(Xphos)(0.17g，0.37mmol)和碳酸铯(1.20g，3.68mmol)置于干燥的Schlenk中并进行几个真空/氮气循环。然后加入干燥的二恶烷(2.00mL)和哌啶-4-甲酸乙酯(0.38mL，2.45mmol)，将反应混合物在80℃下加热4小时，冷却至室温并通过硫酸钠(Na2SO4)过滤。将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂梯度：EtOAc 100％至EtOAc：MeOH/95∶5)得到0.60g标题化合物和脱保护的原料的混合物(7∶3)。将混合物用于下一步骤。
1H-NMR(400MHz，MeOD)：δ1.26(3H，t)，1.71-1.92(2H，m)，1.92-1.94(2H，m)，2.45-2.59(1H，m)，2.88(2H，t)，3.71-3.80(2H，m)，4.06-4.22(2H，q)，7.11-7.18(dd，1H)，7.42(2H，q)，7.67(1H，d)，8.35(1H，d)，8.94(1H，s)；m/z 384(M+H)+，保留时间(方法b)＝2.42(5分钟运行)
1-[4-氯-3-(3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐
方法C-步骤e：将1-[4-氯-3-(3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]哌啶-4-甲酸乙酯(0.60g，1.56mmol)在6N HCl(15mL)中的混合物在微波中在120℃下加热20分钟；需要2个循环以完成转化。然后真空除去溶剂得到0.61g标题化合物和2-(5-溴-2-氯-苯基)-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶(来自前一步骤)的混合物，比率为7∶3。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ2.27-2.38(4H，m)，2.90(1H，m)，3.80-3.87(4H，m)，7.63(1H，dd)，7.91(1H，m)，8.25(1H，d)，8.37(1H，m)，8.64(1H，d)，9.43(1H，s)。
{1-[4-氯-3-(3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-哌啶-1-基-甲 酮
方法C-步骤f：将1-[4-氯-3-(3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐(0.09g，0.25mmol)、HATU(0.10g，0.26mmol)、三乙胺(TEA)(0.08mL，0.55mmol)、哌啶(0.03g，0.31mmol)和二氯甲烷(2mL)的混合物在35℃下加热过夜。将反应液冷却至室温，用氯化铵溶液(3mL)洗涤并将粗产物通过SCX(洗脱剂：NH3 2N的MeOH溶液)和快速色谱(洗脱剂：AcOEt：MeOH，9∶1)纯化得到0.04g标题化合物(37％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.54-1.70(6H，m)，1.79-1.91(4H，m)，2.83-2.92(3H，m)，3.53-3.59(4H，m)，3.86(2H，d)，7.16(1H，dd)，7.43(2H，m)，7.69(1H，d)，8.36(1H，d)，8.94(1H，s)；m/z 424(M+H)+，保留时间(方法b)＝3.38(10分钟运行)
方法D
实施例4：(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-{(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑 -2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-甲酮
方法D-步骤a：向含有(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸盐酸盐(按照一般方法1，步骤d所述的方法得到)(0.10g，0.27mmol)(按照方法A，步骤d所述的方法得到)和HATU(0.11g，0.28mmol)的小瓶中加入TEA(0.08mL，0.59mmol)和二氯甲烷(2mL)，然后加入二甲基-吡咯烷-3-基-胺(0.04mL，0.33mmol)。将反应混合物在35℃下加热过夜，然后加入氯化铵溶液(2mL)并将该两相的溶液搅拌几分钟。将有机层回收并将粗产物通过SCX柱(洗脱剂：从二氯甲烷：MeOH1∶1至2N NH3的MeOH溶液)和制备型HPLC纯化得到0.07g标题化合物的非对映体混合物，为甲酸盐(65％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：1.62-2.11(m，10H)；2.66-2.39(m，2H)；2.53(d，J＝2.3Hz，6H)；2.61(d，J＝2.3Hz，6H)；2.78-2.99(m，6H)，3.35(m，4H)，3.50(m，1H)；3.62-3.73(m，2H)；3.82-3.90(m，12H)；4.02(m，1H)，7.19(m，4H)；7.32(m，6H)；7.44(m，2H)；7.56(m，2H)；7.68(m，2H)8.33(s，2H)；m/z 432(M+H)+，保留时间(方法a)＝0.70(10分钟运行)。
方法E
Figure BDA0000118099040000371
实施例5：{1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-基}-吗啉 -4-基-甲酮
方法E-步骤a：向含有1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-甲酸(按照一般方法5，步骤b所述的方法得到)(0.09g，0.25mmol)的小瓶中加入HATU(0.10g，0.26mmol)、TEA(0.07mL，0.53mmol)和吗啉(0.03mL，0.33mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液并将反应混合物在35℃下加热过夜。将反应液冷却至室温，在搅拌下加入饱和的NaHCO3溶液(2mL)，将有机层通过相分离器过滤而回收，然后减压除去溶剂。将粗产物通过NH2柱(洗脱剂：二氯甲烷：MeOH从10∶0至5∶5)和SCX纯化得到0.05g标题化合物(46％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ2.20-2.32(2H，m)，2.48(3H，s)，3.34-3.52(3H，m)，3.53-3.63(4H，m)，3.64-3.72(6H，m)，6.71(1H，dd)，7.01(1H，d)，7.12(1H，d)，7.34(1H，d)，7.41(1H，s)，7.50(1H，d)；m/z425(M+H)+，保留时间(方法a)＝2.13(10分钟运行)。
方法F
Figure BDA0000118099040000381
实施例6：{1-[4-氯-3-(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-4-基}- 吡咯烷-1-基-甲酮甲酸盐
2-{2-氯-5-[4-(吡咯烷-1-羰基)-哌啶-1-基]-苯基}-5-甲氧基-苯并咪唑-1-甲 酸叔丁酯
方法F-步骤a：将2-(5-溴-2-氯-苯基)-5-甲氧基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(按照一般方法4，步骤c所述的方法得到)(0.10g，0.23mmol)、哌啶-4-基-吡咯烷-1-基-甲酮(0.05g，0.30mmol)和碳酸铯(0.37g，1.14mmol)置于干燥的小瓶中并进行3个真空/氮气循环，然后加入干燥的甲苯(0.20mL)。同时，将乙酸钯(0.01g，0.05mmol)和BINAP(0.04g，0.07mmol)在氮气下置于干燥的4mL小瓶中并进行3个真空/氮气循环。然后在室温下在氮气下加入干燥的甲苯(0.40mL)并将混合物加入到第一个小瓶中。将反应混合物在80℃下加热过夜，冷却至室温，加入EtOAc(3mL)并将混合物滤出。除去溶剂并将粗产物用EtOAc(3.5mL)回收，通过2g硅胶柱过滤(洗脱剂EtOAc)得到0.10g标题化合物(82％)，未对其进一步纯化。
{1-[4-氯-3-(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-4-基}-吡咯烷-1- 基-甲酮甲酸盐
方法F-步骤b：向2-{2-氯-5-[4-(吡咯烷-1-羰基)-哌啶-1-基]-苯基}-5-甲氧基-苯并咪唑-1-甲酸叔丁酯(0.10g，0.19mmol)在2M HCl的Et2O溶液(2mL)中的混合物中加入几滴二氯甲烷和甲醇以提高原料的溶解度。将形成的混合物在室温下搅拌过夜，加入Et2O(5mL)，将沉淀物滤出，然后通过制备型HPLC纯化以定量收率得到0.03g标题化合物，为盐酸盐。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.83-1.93(6H，m)，1.95-2.04(2H，m)，2.65-2.74(1H，m)，2.79-2.90(2H，m)，3.41(2H，t)，3.60(2H，t)，3.81-3.88(2H，m)，3.86(3H，s)，6.92(1H，dd)，7.07-7.14(2H，m)，7.37-7.41(2H，m)，7.51(1H，d)；m/z 439(M+H)+，保留时间(方法a)＝2.23(10分钟运行)。
方法G
Figure BDA0000118099040000391
实施例7：{1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-吡咯烷-3-基}-哌嗪-1-基- 甲酮
4-{1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-吡咯烷-3-羰基}-哌嗪-1-甲酸叔 丁酯
方法G-步骤a：向1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-吡咯烷-3-甲酸(按照一般方法2，步骤e所述的方法得到)(0.01g，0.26mmol)的二氯甲烷(4mL)混合物中加入HATU(0.10g，0.29mmol)、二异丙基乙基胺(DIPEA)(0.14mL，0.76mmol)和叔丁基-1-哌嗪甲酸酯(0.06g，0.32mmol)。将反应混合物在35℃下加热过夜，冷却至室温并用水(2x5mL)和饱和Na2CO3溶液(2x5mL)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压蒸发以得到粗产物，将其用二乙醚(3mL)研制，过滤并干燥。然后将沉淀物通过快速色谱纯化(洗脱剂梯度：EtOAc 100％至EtOAc：NH3的MeOH溶液(2M)/4∶0.8)，然后在SCX短柱上进行过滤(洗脱剂梯度：DCM：MeOH/1∶1至NH3的MeOH溶液)得到0.11g标题化合物(67％)。
{1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-吡咯烷-3-基}-哌嗪-1-基-甲酮
方法G-步骤b：向4-{1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-吡咯烷-3-羰基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.11g，0.21mmol)的二氯甲烷(1mL)混合物中加入2M HCl的Et2O(4mL)溶液。将混合物在室温下搅拌，滤出所得到的沉淀物，用Et2O洗涤。然后将沉淀物在饱和NaHCO3溶液(3mL)中回收，用二氯甲烷萃取(2x3mL)，除去溶剂并将粗产物通过SCX短柱过滤得到0.05g标题化合物(57％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ2.09-2.23(2H，m)，2.69-2.78(4H，m)，3.28-3.44(3H，m)，3.47-3.56(6H，m)，6.61-6.64(1H，m)，6.92-6.93(1H，m)，7.16-7.20(2H，m)，7.24-7.27(1H，m)，7.53(2H，bs)；m/z 410(M+H)+，保留时间(方法b)＝0.88(10分钟运行)。
方法H
Figure BDA0000118099040000401
实施例8：1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸(3-二甲基 氨基-丙基)-甲基-酰胺
方法H-步骤a：向含有1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸(按照一般方法3、4，步骤e所述的方法得到)(0.10g，0.26mmol)和HATU(0.10g，0.27mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液的小瓶中加入TEA(0.07mL，0.54mmol)和N，N，N’-三甲基-1，3-丙二胺(0.32mmol，0.05mL)。将反应混合物在35℃下加热过夜，除去溶剂并将粗产物通过制备型HPLC和SCX柱纯化得到0.06g标题化合物(49％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ1.50-1.72(6H，m)，2.15(8H，m)，2.80(4H，m)，3.02(2H，s)，3.30(2H，m)，3.70(2H，m)，7.06(2H，m)，7.28-7.56(3H，m)，7.69(1H，m)，12.74(1H，s)；m/z 472(M+H)+，保留时间(方法a)＝1.68(10分钟运行)。
方法I
实施例9：{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-哌嗪 -1-基-甲酮
4-{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-羰基}-哌嗪-1-甲 酸叔丁酯
方法I-步骤a：向含有[1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐(按照一般方法8，步骤b所述的方法得到)(0.10g，0.26mmol)和HATU(0.10g，0.27mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液的小瓶中加入TEA(0.08mL，0.56mmol)和叔丁基-1-哌嗪甲酸酯(0.32mmol，0.06g)。将反应混合物在35℃下加热过夜，用水(3x2mL)和饱和Na2CO3溶液(3x2mL)洗涤。然后将粗产物通过快速色谱(洗脱剂：EtOAc)纯化，然后在NH2短柱上进行过滤(洗脱剂EtOAc)得到0.02g标题化合物(15％)。
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-哌嗪-1-基-甲酮
方法I-步骤b：将4-{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-羰基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.02g，0.04mmol)在2M HCl的Et2O(3mL)溶液中的混合物在室温下搅拌2天，然后除去溶剂并将粗产物通过NH2短柱过滤(洗脱剂EtOAc)，以定量收率得到0.02g标题化合物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.83(2H，m)，1.96-2.07(2H，m)，2.50(3H，s)，2.56-2.63(1H，m)，2.77-2.93(6H，m)，3.58(4H，d)，3.79(2H，d)，6.98(1H，m)，7.10(2H，m)，7.29-7.39(1H，m)，7.62-7.72(1H，m)，8.00(1H，dd)，9.78(1H，bs)；m/z 421(M+H)+，保留时间(方法a)＝1.37(10分钟运行)。
方法J
Figure BDA0000118099040000421
实施例10：1-[3-(5-氯-1H-苯并咪唑-2-基)-4-氟-苯基]-哌啶-4-甲酸甲基 -(1-甲基-吡咯烷-3-基)-酰胺
方法J-步骤a：向1-[3-(5-氯-1H-苯并咪唑-2-基)-4-氟-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐(按照一般方法10，步骤b所述的方法得到)(0.01g，0.25mmol)的二氯甲烷(2mL)混合物中加入HATU(0.10g，0.26mmol)、TEA(0.07mL，0.55mmol)和N，N’-二甲基-3-氨基吡咯烷(0.04g，0.31mmol)。将反应混合物在35℃下加热过夜，冷却至室温并用氯化铵溶液(2mL)、饱和Na2CO3溶液(2mL)和水(2mL)洗涤。然后将有机层在NH2短柱上过滤并进一步通过快速色谱纯化(洗脱剂：EtOAc：NH3 2N的MeOH溶液/9∶1)得到0.03g标题化合物(30％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.79-1.94(5H，m)，2.08-2.30(2H，m)，2.37(3H，s)，2.46-2.54(2H，m)，2.62-2.69(2H，m)，2.72-2.92(2H，m)，3.10(3H，s)，3.79(2H，d)，5.16(1H，m)，7.14-7.20(2H，m)，7.26(1H，dd)，7.58-7.63(2H，m)，7.73(1H，dd)；m/z 470(M+H)+，保留时间(方法b)＝1.80(10分钟运行)。
方法K
Figure BDA0000118099040000431
实施例11：(R)-1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸(2- 吗啉-4-基-乙基)-酰胺
方法K-步骤a：向(R)-1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸盐酸盐(按照一般方法3、4，步骤e所述的方法得到)(0.01g，0.27mmol)的二氯甲烷(2mL)混合物中加入HATU(0.10g，0.28mmol)、TEA(0.08mL，0.56mmol)和2-吗啉代乙基胺(0.04g，0.33mmol)。将反应混合物在室温下搅拌，用氯化铵溶液(2mL)洗涤，通过相分离器过滤并除去有机溶剂。然后将粗产物通过SCX柱和快速色谱纯化(洗脱剂：梯度从EtOAc至EtOAc：NH3的MeOH溶液(2M)/10∶1)得到0.05g标题化合物(40％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.66-1.98(4H，m)，2.40-2.64(7H，m)，2.94(1H，m)，3.06(1H，dd)，3.36(2H，m)，3.57-3.80(6H，m)，7.04-7.16(2H，m)，7.33(13H，bs)，7.42(2H，m)，7.62(1H，bs)；m/z 486(M+H)+，保留时间(方法b)＝2.97(10分钟运行)
方法L
Figure BDA0000118099040000441
实施例12：{(R)-1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗 啉-4-基-甲酮
方法L-步骤a：向(R)-1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸盐酸盐(按照一般方法3，4，步骤e)(0.01g，0.27mmol)的二氯甲烷(2mL)混合物中加入HATU(0.10g，0.28mmol)、TEA(0.08mL，0.56mmol)和2-吗啉代乙基胺(0.04g，0.33mmol)。将反应混合物在室温下搅拌，用氯化铵溶液(2mL)洗涤，通过相分离器过滤并除去有机溶剂。然后将粗产物通过SCX柱和快速色谱纯化(洗脱剂：梯度从环己烷：EtOAc/1∶1至0∶1至EtOAc：NH3的MeOH溶液(2M)/10∶1)。通过制备型HPLC进一步纯化得到0.03g标题化合物(29％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.57-1.88(3H，m)，1.95(1H，m)，2.81(1H，td)，2.98(2H，m)，3.50-3.85(10H，m)，7.10(2H，m)，7.32(1H，m)，7.40(2H，m)，7.60(1H，m)；m/z 443(M+H)+，保留时间(方法b)＝4.98(10分钟运行)。
方法M
Figure BDA0000118099040000451
实施例13：(4-甲氧基-哌啶-1-基)-{(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)- 苯基]-哌啶-3-基}-甲酮
方法M-步骤a：向(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸盐酸盐(按照一般方法1，步骤d所述的方法得到)(0.01g，0.30mmol)(按照方法A，步骤d所述的方法得到)的二氯甲烷(2.5mL)混合物中加入HATU(0.12g，0.33mmol)、TEA(0.09mL，0.63mmol)和4-甲氧基哌啶(0.04g，0.33mmol)。将反应混合物在35℃下加热过夜，冷却至室温，用氯化铵溶液(3mL)洗涤，通过相分离器过滤并除去有机溶剂。然后将粗产物通过SCX柱(洗脱剂：首先是二氯甲烷：MeOH/1∶1，然后是NH3的MeOH溶液(2N))和快速色谱(洗脱剂：梯度从EtOAc：环己烷/10∶0至0∶10)纯化得到0.05g标题化合物(38％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.42-1.69(3H，m)，1.73-1.96(5H，m)，2.78-2.93(1H，m)，2.93-3.07(2H，m)，3.25-3.50(6H，m)，3.79-3.94(7H，m)，7.16-7.19(2H，m)，7.28-7.36(3H，m)，7.42-7.46(1H，m)，7.54-7.56(1H，m)，7.66-7.68(1H，m)；m/z 433(M+H)+，保留时间(方法b)＝3.63(10分钟运行)。
方法N
Figure BDA0000118099040000461
实施例14：(4-二甲基氨基-哌啶-1-基)-{(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2- 基)-苯基]-哌啶-3-基}-甲酮
方法N-步骤a：向(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸盐酸盐(按照一般方法1，步骤d所述的方法得到)(0.01g，0.30mmol)(按照方法A，步骤d所述的方法得到)的二氯甲烷(2.5mL)混合物中加入HATU(0.12g，0.33mmol)、TEA(0.09mL，0.63mmol)和4-(N，N-二甲基氨基)哌啶(0.04g，0.35mmol)。将反应混合物在35℃下加热过夜，冷却至室温，用氯化铵溶液(3mL)洗涤，通过相分离器过滤并除去有机溶剂。然后将粗产物通过SCX柱(洗脱剂：首先是二氯甲烷：MeOH/1∶1，然后是NH3的MeOH溶液(2N))和快速色谱(洗脱剂：梯度从EtOAc：NH3的MeOH溶液(2N)/10∶0至9∶1)纯化得到0.05g标题化合物(37％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.26-1.43(2H，m)，1.59-2.00(6H，m)，2.26-2.31(6H，m)，2.43-2.49(1H，m)，2.57-2.64(1H，m)，2.79-3.18(4H，m)，3.79-3.86(2H，m)，3.89(3H，s)，4.12-4.16(1H，m)，4.58-4.61(1H，m)，7.16-7.20(2H，m)，7.28-7.37(3H，m)，7.42-7.46(1H，m)，7.54-7.56(1H，m)，7.66-7.68(1H，m)；m/z 446(M+H)+，保留时间(方法b)＝1.63(10分钟运行)。
方法O
Figure BDA0000118099040000471
实施例15：(R)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸 (2-吗啉-4-基-乙基)-酰胺
方法O-步骤a：向含有(R)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-甲酸盐酸盐(按照一般方法3、4，步骤e所述的方法得到)(0.10g，0.25mmol)、HATU(0.10g，0.26mmol)、TEA(0.07mL，0.53mmol)和2-吗啉-4-基-乙基胺(0.04mL，0.33mmol)的小瓶中加入二氯甲烷(2mL)并将反应混合物在35℃下加热过夜。将反应液冷却至室温，在搅拌下加入饱和NaHCO3溶液(2mL)，将有机层通过相分离器过滤而回收并减压除去溶剂。将粗产物通过SCX和快速色谱纯化(洗脱剂；梯度环己烷：乙酸乙酯从100∶0至3∶1)得到0.05g标题化合物(42％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.66-1.97(4H，m)，2.42-2.50(6H，m)，2.48(3H，s)，2.55-2.62(1H，m)，2.89-2.97(1H，m)，3.06(1H，dd)，3.28-3.41(2H，m)，3.60(4H，dd)，3.63-3.69(1H，m)，3.71-3.77(1H，m)，7.09-7.15(2H，m)，7.38-7.54(4H，m)；m/z 482(M+H)+，保留时间(方法b)＝2.57(10分钟运行)。
方法P
实施例16：{1-[4-氯-3-(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3- 基}-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮
方法P-步骤a：向含有1-[4-氯-3-(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-甲酸盐酸盐(按照一般方法3、4，步骤e所述的方法得到)(0.10g，0.25mmol)、HATU(0.10g，0.26mmol)、TEA(0.07mL，0.53mmol)和1-甲基-哌嗪(0.04mL，0.33mmol)的小瓶中加入二氯甲烷(2mL)并将反应混合物在35℃下加热过夜。将反应液冷却至室温，在搅拌下加入饱和NaHCO3溶液(2mL)，将有机层通过相分离器过滤而回收并减压除去溶剂。将粗产物通过SCX纯化，用二乙醚研制，最后通过制备型HPLC纯化得到0.04g标题化合物(34％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ2.20-2.33(2H，m)，2.41(3H，s)，2.51-2.66(4H，m)，3.37-3.54(3H，m)，3.56-3.76(6H，m)，3.86(3H，s)，6.71(1H，dd)，6.93(1H，ddd)，7.01(1H，d)，7.12(1H，d)，7.34(1H，dd)，7.52(1H，d)；m/z 454(M+H)+，保留时间(方法b)＝2.13(10分钟运行)。
方法Q
Figure BDA0000118099040000491
实施例17：1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸甲基 -(1-甲基-吡咯烷-3-基)-酰胺
方法Q-步骤a：向1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸盐酸盐(按照一般方法3、4，步骤e所述的方法得到)(0.01g，0.25mmol)的二氯甲烷(2mL)混合物中加入HATU(0.10g，0.26mmol)、TEA(0.07mL，0.53mmol)和甲基-(1-甲基-吡咯烷-3-基)-胺(0.03g，0.31mmol)。将反应混合物在35℃下加热过夜，冷却至室温，用氯化铵溶液(2mL)洗涤，通过相分离器过滤并将有机相通过SCX柱过滤(洗脱剂：首先是二氯甲烷：MeOH/1∶1，然后是NH3的MeOH溶液(2N))。该后处理利用Zinsser Speedy(6.1.3版)完成。然后将粗产物通过快速色谱纯化(洗脱剂：梯度从EtOAc至EtOAc：NH3的MeOH溶液(2N)/10∶1)得到0.04g标题化合物(37％)。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.76-1.93(5H，m)，2.08-2.23(2H，m)，2.36-2.48(6H，m)，2.51-3.09(9H，m)，3.83-3.86(2H，m)，5.13-5.20(1H，m)，7.09-7.13(2H，m)，7.38-7.40(3H，m)，7.51(1H，bs)；m/z 466(M+H)+，保留时间(方法b)＝2.30(10分钟运行)。
下表显示了所合成的化合物的精选，这些化合物按照该表第三栏所示的以及以上在实施例1至17的合成中详细讨论的方法来制备。
Figure BDA0000118099040000501
Figure BDA0000118099040000521
Figure BDA0000118099040000531
Figure BDA0000118099040000541
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Figure BDA0000118099040000721
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Figure BDA0000118099040000981
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Figure BDA0000118099040001021
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Figure BDA0000118099040001061
Figure BDA0000118099040001071
Figure BDA0000118099040001081
Smo的克隆和表达稳定重组Smo的细胞系的生成
将人的Smo编码序列通过PCR利用标准条件扩增人。模板是来自Origene(目录号TC122724)的pcMV6-XL5-Smo。将引物指定如下：
正向(5’GATCGGTACCGGGCTTTTGCTGAGTT3’)具有KpnI限制位点；
反向(5’GATCGCGGCCGCCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGAAGTCCGAGTCTGC3’)具有NotI限制位点，终止密码子和5’端上的FLAG-编码序列。
得到的扩增子为2424bp长度并且包含完全Smo-编码序列、FLAG-标记和两个限制位点，一端一个。用KpnI和NotI限制酶和为克隆选择的pcDNA5/FRT质粒(Invitrogen)双重消化该扩增子。Smo-FLAG编码序列连接和克隆入pcDNA5/FRT质粒产生命名为pcDNA5/FRT_Smo-FLAG和7432bp长度的质粒。
FlpIN技术(Invitrogen)用于使用FlpIN293细胞系(Invitrogen，RT50-07)生成稳定表达Smo-FLAG的细胞系。这是一种通过用pFRT/lacZeo质粒稳定转染生成博莱霉素-抗性FlpIN293宿主细胞系而来源于HEK293细胞的品系。FlpIN293细胞适合于生成包含整合的Flp重组靶(FRT)位点的稳定哺乳动物细胞系(Invitrogen)。
同时进行pcDNA5/FRT_Smo-FLAG质粒转染(或在模拟转染的细胞的情况下，用空质粒转染)与携带Flp重组酶的pOG44质粒转染，所述Flp重组酶催化宿主细胞中FRT位点分别与pcDNA5/FRT_Smo-FLAG表达载体或pcDNA5/FRT空载体之间的同源重组。表达Smo-FLAG的细胞和模拟转染的细胞具有潮霉素B抗性并且对β-gal染色呈阴性。还通过蛋白质印迹检查了Smo和FLAG抗原表达。生成的两种细胞系被命名为显示模拟转染的293FlpIN/克隆E-3和显示Smo-FLAG转染细胞系的293FlpIN/克隆3-5。
细胞培养条件
将细胞维持在包含10％胎牛血清的DMEM(均来自Invitrogen)中，其中添加剂了0.25mg/ml潮霉素B(Invitrogen)。将细胞维持在37℃、95％空气-5％二氧化碳、完全加湿的环境中，融化后使用至多22-25个循环。
结合试验研发
通过置换结合试验，使用Smo受体的荧光配体(Bodipy-Cyclopamine，Toronto Research Chemical Inc，目录号B674800)作为待置换的标记配体来测试化合物与Smo受体的相互作用。
为了测定荧光配体的Kd(达到50％最大结合的配体浓度)和Bmax(可以特异性结合生物制品中的受体的配体最大量)，通过从总体结合(TB)中扣除非特异性结合(NSB)计算特异性结合(SB)。通过添加增加浓度的Bodipy-Cyclopamine到细胞中测定TB，同时通过添加增加浓度的Bodipy-Cyclopamine与饱和浓度的充分描述的拮抗剂(在该情况中选择10μM的N-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯苯基]-3，5-二甲氧基-苯甲酰胺(Rubin等人WO2003011219))的混合物到细胞中测定NSB。就Bodipy-Cyclopamine的各浓度而言，通过从TB中扣除NSB值计算SB。从SB曲线计算Bmax和Kd。在该情况中，发现稳定模拟转染的细胞系克隆E-3具有115nM的Kd，而稳定Smo-FLAG转染的细胞系克隆3-5具有44.3nM的Kd。Ki是抑制50％标记配体特异性结合(SB)的未标记配体的浓度，并且对标记配体的有效使用浓度校准。根据Cheng-Prusoff方程计算Ki，Ki＝IC50/[1+[bodipy-Cyclopamine]/Kd)]。
用结合试验测试化合物
使用Burker室计数293FlpIN/克隆E-3和293FlpIN/克隆3-5细胞，并在两个96孔培养板(U型底，Sigma Aldrich，目录号M8185-100EA)中转染100000个细胞/100μl DMEM 1％FBS。用293FlpIN/克隆E-3细胞作为内标对照以及时检查过表达Smo的293FlpIN/克隆3-5细胞的荧光(FLU)变化。
用DMEM 1％FBS制备对照品和化合物并且将100μl加入到细胞中。将全部对照品和化合物与终浓度为5nM的Bodipy-Cyclopamine一起孵育。
将化合物溶于DMSO(储备溶液10mM)，并且首先在10μM测试(单一浓度试验)；将每种化合物至少重复两次(在两个不同培养板上)。当Bodipy-Cyclopamine被置换超过30％的阈值时，使用浓度-响应试验重新测试化合物，测试通量为8种化合物/培养板，且浓度范围是：100、10、1、0.5、0.1、0.01、0.05、0.001和0.0001μM。
使用293FlpIN/克隆3-5细胞作为阴性对照，其中对单一浓度试验而言加入DMSO按1∶1000稀释，就浓度响应试验而言按1∶100稀释。
作为完全置换Bodipy-Cyclopamine结合的阳性对照，使用10μM浓度的N-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯苯基]-3，5-二甲氧基-苯甲酰胺(Rubin等人WO2003011219)。
将两个培养板在室温、避光的振摇平台上孵育4小时。孵育后，以1600rpm离心培养板5min，用包含2％FBS的PBS洗涤两次。最终将细胞重新混悬于170μl洗涤缓冲液中并用FACScalibur HTS系统(Becton Dickinson)获取荧光信号。
仪器采集参数在每个板开始读数时利用未处理的未标记的293FlpIN/克隆E-3细胞进行设定。所用的HTS采集程序是BDTM Plate Manager(BDBioscience)并且数据分析利用BD CellQuestTM Pro软件(BD Bioscience)进行。
通过重叠阳性和阴性对照的FL1-H直方图并在两条曲线的交叉点设定标记来进行定量。仅定量荧光多于设定标记的情况。然后根据阴性对照(0％Bodipy-Cyclopamine置换)和阳性对照(100％Bodipy-Cyclopamine置换)将数值标准化。
当在以上条件下测试实施例1-193的化合物时，所有显示的Ki值在0.8nM至21.6μM的范围内。
用碱性磷酸酶试验测定化合物
已经在体外小鼠间充质细胞系C3H10T1/2中证实了Shh诱导碱性磷酸酶(AP)--一种成骨细胞分化的标记(Katsuura等人，1999；Kinto等人，1997；Murone等人，1999；Nakamura等人，1997；Wu等人2004。因此，为了分析小分子与Hedgehog-Gli信号传导之间的干扰，应用基于小鼠细胞系中AP活化的功能测定。将
Figure BDA0000118099040001121
试剂盒(Cat S1000，Promega)的底物用于检测溶液中的AP。简单地讲，应用以下方法。
将聚赖氨酸涂覆的透明平底96-孔板(Corning，Cat.3667)用100μl细胞培养溶液/孔的10.000个细胞填充。细胞培养基由DMEM(Cat 21969-035)+1％Glutamax(Cat 35050-038)、1％青霉素/链霉素(Cat 15140-122)和1％Hepes(15630-056)组成。全部试剂均获自Invitrogen。将培养板在37℃、5％二氧化碳中孵育过夜。然后除去培养基，将包含化合物或参比拮抗剂(N-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯苯基]-3，5-二甲氧基-苯甲酰胺(Rubin等人WO2003011219))的100μl新鲜培养基加入到各孔中。全部化合物和参比溶液均包含2μM浓度的激动剂Purmorphamine(Sinha等人Nature Chem.Biol.2，29-30(2005))。一式三份地在100pM至50μM范围的10个浓度下测试化合物。将每一样品的DMSO终浓度调整至在培养基中1％。将细胞与化合物溶液在37℃、在5％二氧化碳的存在下孵育72小时。从培养板中除去细胞培养基，向各孔中加入40μl 1∶5稀释的裂解溶液(Cat E194A，Promega)。然后在黑暗中在振荡器上孵育培养板20分钟。最终将40μl再溶解的AttoPhos底物溶液加入到各孔中，然后在振荡器上再孵育15分钟。根据供应商的说明书再溶解AttoPhos底物，但将底物溶液始终贮存在-80℃。用Safire 2培养板读数器(Tecan)测定样品中的荧光强度变化，其中使用激发波长430nm和发射波长560nm。
当按照上述条件测试实施例1-193的化合物时，所有显示的IC50值在1.1μM至14.8μM的范围内。

Claims (20)

1.式I化合物及其可药用盐
Figure FDA0000118099030000011
其中，在化合价允许的情况下，
i是1或2；
R1是H；直链、支链或环状(C1-C4)烷基；
R2是H、Cl或F；
X是N或CR3；
R3是H；卤素；直链、支链或环状(C1-C4)烷基或烷氧基；
Y是
Figure FDA0000118099030000012
Z是O或NRx
Rx是H或直链、支链或环状(C1-C4)烷基；
k是1、2、3或4；
n和p独立地是1、2或3并且n+p之和不能超过5；
T是H或直链或支链(C1-C4)烷基；
T’是直链或支链C1-C3烷基链，其被(C1-C6)-二烷基氨基或4至6元饱和杂环所取代，该杂环含有1个氮原子并且任选地含有第二个选自N和O的杂原子，所述的杂环在氮原子上任选地被(C1-C4)烷基链所取代；或4至6元饱和杂环，该杂环含有1个氮原子并且任选地含有第二个选自N和O的杂原子，所述的杂环在氮原子上任选地被(C1-C4)烷基链所取代，
r是0、1、2或3；
R’是卤素；羟基；氨基；氰基；硝基；氧代；直链或支链(C1-C6)烷基、二卤代烷基、氮杂烷基、氧杂烷基、烷基羰基、氧杂烷基羰基、烷氧基羰基、烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、链烯基、氧杂链烯基、氮杂链烯基、链烯基羰基、氧杂链烯基羰基、链烯基氧基羰基、链烯基氨基羰基、烷基氨基、二烷基氨基、巯基烷基、烷氧基、任选地被一个或多个氟原子取代的烷硫基；其中两个R’基团可形成具有螺或稠合连接的5-至8-元环；
排除以下化合物：
Figure FDA0000118099030000031
2.权利要求1所述的化合物，其中i等于2且-C(＝O)-Y在产生的哌啶环的4位上并且其中R1、R2、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如权利要求1所定义。
3.权利要求1所述的化合物，其中i等于2且-C(＝O)-Y在产生的哌啶环的3位上并且其中R1、R2、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如权利要求1所定义。
4.权利要求1所述的化合物，其中i等于1并且其中R1、R2、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如权利要求1所定义。
5.权利要求1所述的化合物，其中R1是H、R2是Cl或F并且其中i、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如权利要求1所定义。
6.权利要求1所述的化合物，其中R2是H、R1是直链、支链或环状(C1-C4)烷基并且其中i、X、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T′、r和R′如权利要求1所定义。
7.权利要求1所述的化合物，其中X是N并且其中i、R1、R2、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如权利要求1所定义。
8.权利要求1所述的化合物，X是CR3并且其中i、R1、R2、R3、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T′、r和R′如权利要求1所定义。
9.权利要求8所述的化合物，其中R3是H并且其中i、R1、R2、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T’、r和R′如权利要求8所定义。
10.权利要求1所述的化合物，其中R3是Cl、F、OMe或Me并且其中i、R1、R2、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T′、r和R′如权利要求1所定义。
11.权利要求1所述的化合物，其中r等于0。
12.权利要求1所述的化合物，其中Y是
Figure FDA0000118099030000041
并且其中k等于2、r等于1、R’是二甲基氨基且i、R1、R2、X和R3如权利要求1所定义。
13.权利要求1所述的化合物，其中Y是
并且其中n和p都等于2、Z是O、r等于0并且其中i、R1、R2、X和R3如权利要求1所定义。
14.权利要求1所述的化合物，其中i等于2且-C(＝O)-Y在产生的哌啶环的4位上、X是CR3、R3是甲基、R2是F并且其中R1、Y、Z、Rx、k、n、p、T、T′、r和R′如权利要求1所定义。
15.权利要求1所述的化合物，该化合物选自：
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-哌嗪-1-基-甲酮；
氮杂环庚烷-1-基-{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吡咯烷-1-基-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-哌啶-1-基-甲酮；
{(S)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-甲酸(3-二甲基氨基-丙基)-甲基-酰胺；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(R)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氟-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-{(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(S)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-吡咯烷-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-{(S)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-甲酮；
(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-{(R)-1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-{1-[3-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-基}-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(R)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-吡咯烷-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(S)-1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(S)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{1-[4-氯-3-(1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(R)-1-[4-氯-3-(1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{(S)-1-[4-氯-3-(1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-3-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氯-3-(1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{(S)-1-[3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯基]-哌啶-3-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮；
{1-[4-氯-3-(5-氟-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-(3-二甲基氨基-吡咯烷-1-基)-甲酮；
和{1-[4-氯-3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-哌啶-4-基}-吗啉-4-基-甲酮，或其可药用盐。
16.含有权利要求1-15所述的化合物和可药用载体或赋形剂的药物组合物。
17.权利要求1-15所述的化合物在制备用于治疗或预防骨质疏松或癌症的药物中的用途。
18.权利要求17所述的用途，其用于治疗选自下列的癌症：非小细胞肺癌；小细胞肺癌；乳腺癌；卵巢肿瘤；消化道肿瘤；脑癌；前列腺癌；胰腺癌；基底细胞癌；恶性黑素瘤；鳞状细胞癌；多发性骨髓瘤；淋巴瘤；间质癌；慢性髓样白血病；子宫内膜癌；肝细胞癌。
19.治疗可受益于Hedgehog途径的抑制的疾病、状况或功能障碍的方法，该方法包括向需要所述治疗的个体施用有效量的权利要求1-15所述的化合物。
20.权利要求19所述的方法，其用于治疗骨质疏松或癌症，尤其是非小细胞肺癌；小细胞肺癌；乳腺癌；卵巢肿瘤；消化道肿瘤；脑癌；前列腺癌；胰腺癌；基底细胞癌；恶性黑素瘤；鳞状细胞癌；多发性骨髓瘤；淋巴瘤；间质癌；慢性髓样白血病；子宫内膜癌；肝细胞癌。
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