JP2003511411A - ヘッジホッグシグナル伝達経路のメディエーター、それらと関連する組成物及び利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヘッジホッグ機能亢進、ｐｔｃ機能欠損又はスムースンド機能亢進により生じた異常型の増殖状態を、その細胞を例えば正常なｐｔｃ経路を代行し又はスムースンド若しくはヘッジホッグ活性と拮抗するヘッジホッグアンタゴニスト例えば小分子と、異常型増殖状態に対して十分な量で接触させることにより阻止するために利用可能な方法及び試薬を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 パターン形成は、胚細胞が分化した組織の秩序だった空間的配置を形成する活
動である。高等生物の身体的複雑さは、細胞固有の系列と細胞の外からのシグナ
リングとの相互作用によって胚形成中に増大する。誘導的相互作用は、最初期の
ボディプランの確立から臓器系のパターン形成までの、脊椎動物発生における胚
のパターン形成及び、組織分化中の様々な細胞型の発生に必須である(Davidson,
E.,(1990)Development 108:365-389；Gurdon,J.B.,(1992)Cell 68:185-199；Jes
sell,T.M.等、(1992)Cell 68:257-270)。発生中の細胞の相互作用の効果は、変
化する。典型的には、応答する細胞は、細胞分化の一つの経路から他の経路へ、
応答する細胞の未誘導の及び誘導された状態の両方と異なる細胞を誘導すること
によりによりそらされる(誘導)。ときには、細胞は、それらの隣接細胞にそれら
と同じに分化することを誘導し(ホメオジェネティック誘導)；他の場合には、細
胞は、その隣接細胞にそれと同じに分化することを禁止する。初期発生における
細胞相互作用は、順次的であり、それで、２つの細胞型間での初期の誘導は、多
様性の漸進的増幅へと導く。その上、誘導的相互作用は、胚においてだけでなく
、成体の細胞においても起き、形態形成パターンを確立して維持するように作用
し並びに分化を誘導することができる(J.B.Gurdon(1992)Cell 68:185-199)。

【０００２】 シグナル伝達分子のヘッジホッグファミリーのメンバーは、無脊椎動物及び脊
椎動物の発生中に、多くの重要な短距離及び長距離パターニング過程を媒介する
。ハエにおいては、単一のヘッジホッグ遺伝子が、体節及び成虫原基のパターニ
ングを調節する。対照的に、脊椎動物では、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーは、
左右非対称性、ＣＮＳ、体節及び肢におけるポラリティー、器官形成、軟骨形成
並びに精子形成の制御に関与している。

【０００３】 最初のヘッジホッグ遺伝子は、ショウジョウバエDrosophila melanogasterに
おける遺伝的スクリーニングにより同定された(Nusslein-Volhard,C.及びWiesch
aus,E.(1980) Nature 287,795-801)。このスクリーニングは、胚及び幼虫の発生
に影響を及ぼす突然変異を同定した。１９９２年と１９９３年に、Drosophilaの
ヘッジホッグ(hh)遺伝子の分子的性質が報告され(C.F.,Lee等(1992)Cell 71,33-
50)、その後、幾つかのヘッジホッグ同族体が種々の脊椎動物種から単離された
。Drosophilaと他の無脊椎動物において唯一つのヘッジホッグ遺伝子が発見され
たのに対して、脊椎動物には多数のヘッジホッグ遺伝子が存在する。

【０００４】 ヘッジホッグ遺伝子の脊椎動物ファミリーには、少なくとも４つのメンバー(
例えば、単一のショウジョウバエのヘッジホッグ遺伝子のパラログ)が含まれる
。典型的なヘッジホッグ遺伝子及びタンパク質は、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８
５６及びＷＯ９６／１７９２４に記載されている。これらのメンバーの内の３つ
{ここでは、デザートヘッジホッグ(Dhh)、ソニックヘッジホッグ(Shh)及びイン
ディアンヘッジホッグ(Ihh)と呼ぶ}は、明らかに、魚類、鳥類及び哺乳類を含む
すべての脊椎動物中に存在する。第４のメンバー{ここでは、tiggie-winkleヘッ
ジホッグ(Thh)と呼ぶ}は、魚類に特徴的であるようである。デザートヘッジホッ
グ(Dhh)は、マウスの胚発生並びに成体のゲッ歯動物及びヒトの両者において、
主として、精巣で発現されており；インディアンヘッジホッグ(Ihh)は、胚形成
中の骨の発生及び成体における骨の形成に関与しており；そして、Ｓｈｈは、上
記のように、主に、形態形成及び神経誘導活動に関与している。脊椎動物の器官
の発生及び維持におけるヘッジホッグポリペプチドの臨界的な誘導的役割を仮定
すれば、ヘッジホッグと相互作用するタンパク質の同定は、臨床及び研究の両方
の関係において、最も重要である。

【０００５】 様々なヘッジホッグタンパク質は、シグナルペプチド、高度に保存されたＮ−
末端領域、及び一層分岐したＣ末端ドメインよりなる。分泌経路でのシグナル配
列の開裂に加えて(Lee,J.J.等(1992)Cell 71:33-50；Tabata,T.等(1992)Genes D ev. 2635-2645；Chang,D.E.等(1994)Development 120:3339-3353)、ヘッジホッグ
の前駆体タンパク質は、Ｃ末端部分の保存された配列に依存する内部自己タンパ
ク質分解性開裂を受ける(Lee等(1994)Science 266:1528-1537；Porter等(1995)N ature 374:363-366)。この開裂は、１９ｋＤのＮ末端ペプチドと２６〜２８ｋＤ
のＣ末端ペプチドへと導く(Lee等(1992)前出；Tabata等(1992)前出；Chang等(19
94)前出；Lee等(1994)前出；Bumcrot,D.A.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2294-2303
；Porter等(1995)前出；Ekker,S.C.等(1995)Curr.Biol.5:944-955；Lai,C.J.等(
1995)Development 121:2349-2360)。このＮ末端ペプチドは、それが合成された
細胞の表面にきつく結合したままでいるが、Ｃ末端ペプチドは、イン・ビトロ及
びイン・ビボの両方で自由に拡散しうる(Porter等(1995)Nature 374:363；Lee等
(1994)前出；Bumcrot等(1995)前出；Mart',E.等(1995)Development 121:2537-25
47；Roelink,H.等(1995)Cell 81:445-455)。興味深いことに、このＮ末端ペプチ
ドの細胞表面保持は、内部開裂の正常位置で正確に停止するＲＮＡによりコード
されたＨＨの切り詰め型は、イン・ビトロ(Porter等(1995)前出)及びイン・ビボ
(Porter,J.A.等(1996)Cell 86,21-34)において拡散しうるので、自己開裂に依存
している。生化学的研究は、ＨＨ前駆体タンパク質の自己タンパク質分解性開裂
が、内部チオエステル中間体を経て進行し、続いて、該中間体が親核置換にて開
裂されるということを示した。親核試薬が小さい親油性分子であって、それがＮ
ペプチドのＣ末端に共有結合して(Porter等(1996)前出)それを細胞表面に繋ぎ留
めるということはありそうなことである。それらの生物学的意味は、深淵である
。この繋ぎ留めの結果、Ｎ末端ヘッジホッグの局所的高濃度が、ヘッジホッグ産
生細胞の表面に生じる。Drosophila及び脊椎動物における短距離及び長距離のヘ
ッジホッグシグナル伝達活性に必要且つ十分であるのは、このＮ末端ペプチドで
ある(Porter等(1995)前出；Ekker等(1995)前出；Lai等(1995)前出；Roelink,H.
等(1995)Cell 81:445-455；Porter等(1996)前出；Fietz,M.J.等(1995)Curr.Biol . 5:643-651；Fan,C.-M.等(1995)Cell 81:457-465；Mart',E.等(1995)Nature 375
:322-325；Lopez-Martinez等(1995)Curr.Biol 5:791-795；Ekker,S.C.等(1995)D evelopment 121:2337-2347；Forbes,A.J.等(1996)Development 122:1125-1135)
。

【０００６】 ＨＨは、Drosophilaの発生中に様々な部位で短距離及び長距離のパターニング
過程に関係付けられてきた。初期胚におけるセグメントポラリティーの確立にお
いて、それは、直接媒介されるように見える短距離効果を有するが、成虫原基の
パターニングにおいては、それは、二次的シグナルの誘導を介する長距離効果を
誘導する。

【０００７】 脊椎動物において、幾つかのヘッジホッグ遺伝子が、過去数年間にクローン化
されてきた。これらの遺伝子の内で、Ｓｈｈは、隣接組織をパターン形成するシ
グナルの源である種々のオーガナイズセンターで発現されるので、実験的注意の
殆どを受けてきた。最近の証拠は、Ｓｈｈがこれらの相互作用に関与しているこ
とを示している。

【０００８】 Ｓｈｈの発現は、予定正中線中胚葉、マウス(Chang等(1994)前出；Echelard,Y
.等(1993)Cell 75:1417-1430)、ラット(Roelink,H.等(1994)Cell 76:761-775)及
びニワトリ(Riddle,R.D.等(1993)Cell 75:1401-1416)の節板、並びにゼブラフィ
ッシュの盾状部(Ekker等(1995)前出；Krauss,S.等(1993)Cell 75:1431-1444)に
おける原腸形成の開始の少し後で開始する。ニワトリ胚において、節板でのＳｈ
ｈの発現パターンは、左右非対称になり、これは、心臓の左右位置の原因である
ようである(Levin,M.等(1995)Cell 82:803-814)。

【０００９】 ＣＮＳにおいて、脊索及び底板由来のＳｈｈは、腹側細胞の運命を誘導するよ
うである。Ｓｈｈは、異所的に発現した場合には、マウス(Echelard等(1993)前
出；Goodrich等(1996)Genes Dev.10:301-312)、アフリカツメガエル(Roelink,H.
等(1994)前出；Ruiz i Altaba,A.等(1995)Mol.Cell.Neurosci.6:106-121)、及び
ゼブラフィッシュ(Ekker等(1995)前出；Krauss等(1993)前出；Hammerschmidt,M.
等(1996)Genes Dev.10:647-658)の中脳及び菱脳の広い領域の腹側化へと導く。
脊髄レベルでの中間神経外胚葉の外植片において、Ｓｈｈタンパク質は、底板及
び運動ニューロンの発生を別個の濃度閾値で誘導するが、高濃度では底板を誘導
し、一層低濃度では運動ニューロンを誘導する(Roelink等(1995)前出；Mart'等(
1995)前出；Tanabe,Y.等(1995)Curr.Biol.5:651-658)。その上、抗体ブロッキン
グは、脊索により生成されたＳｈｈが、脊索媒介の運動ニューロン運命の誘導に
必要であることを示唆する(Mart'等(1995)前出)。従って、Ｓｈｈ産生正中線細
胞の表面における高濃度のＳｈｈは、イン・ビトロで認められる底板の接触媒介
性誘導及びイン・ビボでの脊索の直ぐ上の底板の正中線位置決めを説明するよう
に見える(Placzek等(1993)Development 117:205-218)。脊索と底板から放出され
る一層低濃度のＳｈｈは、おそらく、一層遠位の腹側外側領域で運動ニューロン
を、イン・ビトロで接触に依存しないように見えたプロセスにおいて誘導するの
であろう(Yamada,T.等(1993)Cell 73:673-686)。中脳及び菱脳レベルで採取した
外植片において、Ｓｈｈは又、適当な腹側外側の神経細胞型、ドーパミン作動性
(Heynes,M.等(1995)Neuron 15:35-44；Wang,M.Z.等(1995)Nature Med.1:1184-11
88)及びコリン作動性(Ericson,J.等(1995)Cell 81:747-756)前駆細胞をもそれぞ
れ誘導し、これは、ＳｈｈがＣＮＳの全長にわたって腹側の特定化の一般的イン
デューサーであることを示唆している。これらの観察は、Ｓｈｈに対する差次的
応答が特定の前後位置で、如何にして制御されているのかについての疑問を起こ
させる。

【００１０】 正中線からのＳｈｈは又、脊椎動物胚の軸傍領域、体幹中の(Fan等(1995)前出
)体節及びそれらの体節の上部間充織吻(Hammerschmidt等(1996)前出)をもパター
ン形成する。ニワトリとマウスの軸傍中胚葉外植片において、Ｓｈｈは、皮膚筋
節マーカーＰａｘ３を犠牲にしてＰａｘ１及びＴｗｉｓｔのような硬節特異的な
マーカーの発現を促進する。その上、フィルターバリヤー実験は、Ｓｈｈが、硬
節の誘導を、二次的なシグナル伝達機構の活性化によるのではなく直接媒介する
ことを示唆している(Fan,C.-M.及びTessier-Lavigne,M.(1994)Cell 79,1175-118
6)。

【００１１】 Ｓｈｈは又、筋節遺伝子発現をも誘導する(Hammerschmidt等(1996)前出；John
son,R.L.等(1994)Cell 79:1165-1173；Munsterberg,A.E.等(1995)Genes Dev.9:2
911-2922；Weinberg,E.S.等(1996)Development 122:271-280){もっとも、最近の
実験は、ＷＮＴファミリー(Drosophila winglessの脊椎動物同族体)のメンバー
が協調して必要とされることを示しているが(Munsterberg等(1995)前出)}。訳の
分からないことに、ニワトリにおける筋節の誘導は、硬節マーカーの誘導よりも
一層高濃度のＳｈｈを必要とする(Munsterberg等(1995)前出)が、硬節は、脊索
の一層近くに位置する体節細胞から生じている。同様の結果が、ゼブラフィッシ
ュにおいて得られ、高濃度のヘッジホッグが筋節を誘導し且つ硬節マーカー遺伝
子の発現を抑制した(Hammerschmidt等(1996)前出)。しかしながら、羊膜動物と
対照的に、これらの観察は、魚類胚の構成と一致して、筋節が優勢で一層軸性の
構成要素である。従って、Ｓｈｈシグナリングの調節及び新規なシグナリング因
子の獲得は、脊椎動物の進化において、体節構造を改変しえた。

【００１２】 脊椎動物の肢芽において、後部間充織細胞のサブセット、「極性化活性帯」(
ＺＰＡ)は、前後足指の同定を調節する(Honig,L.S.(1981)Nature 291:72-73に総
説されている)。Ｓｈｈの異所的発現又はＳｈｈペプチドに浸したビーズの適用
は、前側ＺＰＡ移植片の効果を真似て、足指の鏡像複製を生じる(Chang等(1994)
前出；Lopez-Martinez等(1995)前出；Riddle等(1993)前出)(図２)。従って、足
指の同定は、主として、Ｓｈｈ濃度に依存しているようであるが、他のシグナル
がＡＰパターニングに必要であるらしいかなりの距離(１００〜１５０μｍ)を超
えて、この情報を中継するということはあり得る。Drosophila成虫原基における
ＨＨとＤＰＰの相互作用と同様に、脊椎動物の肢芽において、Ｓｈｈは、Ｂｍｐ
２(ｄｐｐ同族体)の発現を活性化する(Francis,P.H.等(1994)Development 120:2
09-218)。しかしながら、DrosophilaにおけるＤＰＰと異なり、Ｂｍｐ２は、ニ
ワトリの肢芽における異所的適用に際してＳｈｈの極性化効果を真似できない(F
rancis等(1994)前出)。前後パターニングに加えて、Ｓｈｈは又、後端外胚葉隆
起における繊維芽細胞成長因子ＦＧＦ４の合成の誘導により、肢の近遠生長にも
関与するらしい(Laufer,E.等(1994)Cell 79:993-1003；Niswander,L.等(1994)Na ture 371:609-612)。

【００１３】 ヘッジホッグタンパク質とＢＭＰの間の近い関係が、脊椎動物のヘッジホッグ
の発現の多くの部位(但し、おそらく、すべてではない)で保存されてきたことは
、ありそうなことである。例えば、ニワトリの後腸において、Ｓｈｈは、Ｂｍｐ
４(別の脊椎動物のｄｐｐ同族体)の発現を誘導することが示されている(Roberts
,D.J.等(1995)Development 121:3163-3174)。更に、ＳｈｈとＢｍｐ２、４又は
６は、胃、泌尿生殖器系、肺、歯蕾及び毛嚢の上皮及び間充織細胞におけるそれ
らの発現において、著しい相関関係を示す(Bitgood,M.J.及びMcMahon,A.P.(1995
)Dev.Biol.172:126-138)。更に、Ｉｈｈ(２つの他のマウスヘッジホッグ遺伝子
の一つ)は、消化管及び発生中の軟骨において、Ｂｍｐを発現する細胞に隣接し
て発現される(Bitgood及びMcMahon(1995)前出)。

【００１４】 最近の証拠は、Ｉｈｈが、軟骨発生の調節において重大な役割を演じるモデル
を示唆している(Roberts等(1995)前出)。軟骨形成中に、軟骨細胞は、増殖状態
から中間、前肥大状態を経て、分化した肥大軟骨細胞に進行する。Ｉｈｈは、前
肥大軟骨細胞において発現されて、軟骨細胞の分化のブロックに導くシグナル伝
達カスケードを開始する。その直接の標的は、Ｉｈｈ発現ドメインの周囲の軟骨
膜であり、それは、Ｇｌｉ及びパッチト(Ｐｔｃ)(ヘッジホッグシグナルの保存
された転写標的)の発現により応答する(下記参照)。最もありそうなことには、
これは、関節周囲の軟骨膜における副甲状腺ホルモン関連タンパク質(ＰＴＨｒ
Ｐ)の合成を生じる二次的シグナリングへと導く。ＰＴＨｒＰ自体は、前肥大軟
骨細胞にシグナルを返して、それらの更なる分化をブロックする。同時に、ＰＴ
ＨｒＰは、Ｉｈｈの発現を抑制し、それにより、軟骨細胞の分化の速度を調節す
る負のフィードバックループを形成する。

【００１５】 パッチトは、最初、Drosophilaにおいて、セグメントポラリティー遺伝子(胚
の前後軸に沿った同族列に生じる個々のセグメント内の細胞分化に影響を与える
発生遺伝子のグループの一つ)として同定された。Hooper,J.E.等(1989)Cell 59:
751；及びNakano,Y.等(1989)Nature 341:508を参照されたい。パッチトの脊椎動
物同族体の発現パターンは、それが、神経管、骨格、肢、頭蓋顔面構造及び皮膚
の発生に関与することを示唆する。

【００１６】 遺伝及び機能の研究は、パッチトが、ヘッジホッグシグナリングカスケード(
下流の多くの遺伝子の発現を調節する進化的に保存された経路)の部分であるこ
とを示している。Perrimon,N.(1995)Cell 80:517；及びPerrimon,N.(1996)Cell
86:513を参照されたい。パッチトは、標的遺伝子の構成的な転写の抑制に関係し
ており；その効果は、ヘッジホッグ又は脊椎動物の同族体にコードされる転写を
活性化する分泌糖タンパク質に妨害される。この経路の制御下の遺伝子には、Ｗ
ｎｔ及びＴＧＦβファミリーのメンバーが含まれる。

【００１７】 パッチトタンパク質は、２つの大きい細胞外ドメイン、１２の膜貫通セグメン
ト及び幾つかの細胞質セグメントを有する。Hooper前出；Nakao前出；Johnson,R
.L.等(1996)Science 272:1668；及びHahn,H.等(1996)Cell 85:841を参照された
い。パッチトのヘッジホッグシグナリング経路における生化学的役割は、不明で
ある。しかしながら、ヘッジホッグタンパク質との直接的相互作用が報告されて
おり(Chen,Y.等(1996)Cell 87:553)、パッチトは、ヘッジホッグレセプター複合
体に、スムースンド遺伝子によりコードされる他の膜貫通タンパク質と共に関係
しうる。Perrimon,前出；及びChen,前出を参照されたい。

【００１８】 パッチトのヒトの同族体が、最近、クローン化され、染色体９ｑ２２．３にマ
ップされた。Johnson,前出；及びHahn,前出を参照されたい。この領域は、肋骨
及び頭蓋顔面変性、手及び脚の異常、並びに二分脊椎を含む発生異常を特徴とす
る、基底細胞母斑症候群(ＢＣＮＳ)に関係している。

【００１９】 ＢＣＮＳは又、多数の腫瘍型にかかりやすくもし、最も高頻度なのは、身体の
多くの場所に生じ生涯の最初の２０年以内に現れる基底細胞癌(ＢＣＣ)である。
しかしながら、ＢＣＣの殆どの症例は、この症候群に関係なく、北欧の家系の中
年又は一層年配の人々の日光にさらされる部位に少数散発的に生じる。

【００２０】 ＢＣＮＳ関連の及び散発性のＢＣＣにおける最近の研究は、パッチトの両アレ
ルの機能欠損がＢＣＣの発生へと導くことを示唆している。Johnson,前出；Hahn
,前出及びGailani,M.R.等(1996)Nature Genetics 14:78を参照されたい。染色体
９ｑ２２．３の単一アレル欠損は、散発性及び遺伝性のＢＣＣの両者において頻
繁に生じている。連鎖分析は、ＢＣＮＳ患者由来の腫瘍において、欠損した遺伝
性のアレルが保持されて正常なアレルが失われていることを示した。

【００２１】 散発性の腫瘍も又、パッチトの両機能性アレルの喪失を示した。一本鎖コンホ
メーション多形スクリーニングアッセイによりパッチト変異が同定された１２の
腫瘍の内で、９つが、第２アレルの染色体欠失を有し、他の３つは、両アレルに
不活性化変異を有した(Gailani,前出)。対応する生殖細胞系列のＤＮＡには、変
化は生じなかった。

【００２２】 殆どの同定された突然変異は、時期尚早の停止コドン又はフレームシフトを生
じた。Lench,N.J.等、Hum.Genet.1997 Oct; 100(5-6):497-502。しかしながら、
幾つかは、細胞外又は細胞質ドメインにおけるアミノ酸置換へと導く点突然変異
であった。これらの変異部位は、細胞外タンパク質又は細胞質の下流のシグナル
伝達経路のメンバーとの相互作用についての機能的重要性を示しうる。

【００２３】 パッチトの遺伝子発現の阻止への関与及びＢＣＣにおけるパッチトの頻繁なア
レル欠失の出現は、この遺伝子についての腫瘍サプレッサー機能を支持する。細
胞シグナル伝達及び細胞間コミュニケーションに関与することが知られた遺伝子
ファミリーの調節におけるその役割は、腫瘍抑制の可能な機構を与える。

【００２４】発明の要約 本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化例えばｐｔｃ機能欠損、ヘ
ッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進などの表現型から生じる異常型の
増殖状態を阻止するために、細胞をその異常型の増殖状態を逆転させ又は制御す
る(例えば、正常なｐｔｃ活性を代行し、正常なヘッジホッグ活性と拮抗し又は
スムースンド活性と拮抗する)のに十分な量の小型分子などの薬剤と接触させる
ことを含む利用可能な方法及び試薬を提供する。

【００２５】発明の詳細な説明 Ｉ．概観 本発明は、ヘッジホッグ、パッチト(ｐｔｃ)、ｇｌｉ及び／又はスムースンド
により調節されるシグナル変換経路が、少なくとも部分的に、小型分子によって
阻害されうるという発見に関係する。如何なる特定の理論に拘束されることも望
まないが、レセプターの活性化は、これらの因子が作用する機構でありうる。例
えば、これらの因子の、パッチト機能欠損(ｐｔｃ^lof)細胞の増殖を阻止する能
力は、かかる分子のヘッジホッグ、パッチト若しくはスムースンドと相互作用し
又は少なくともそれらのタンパク質のヘッジホッグ、ｐｔｃ及び／若しくはスム
ースンド媒介のシグナル変換経路を活性化する能力を邪魔する能力のためであり
うる。

【００２６】 それ故、ヘッジホッグ、ｐｔｃ又はスムースンドシグナル変換活性の状況を邪
魔するこれらの小型分子が、同様に、正常細胞及び／又はパッチト機能欠損表現
型、ヘッジホッグ機能亢進表現型若しくはスムースンド機能亢進表現型を有する
細胞において増殖(又は他の生物学的結果)を阻害することができるということが
特に予期される。従って、ある具体例において、これらの化合物が、正常細胞例
えばヘッジホッグ経路を活性化する遺伝子変異を有しない細胞におけるヘッジホ
ッグ活性の阻害に有用でありうることが予想される。好適具体例において、主題
のインヒビターは、２５００ａｍｕ未満の、一層好ましくは１５００ａｍｕ未満
の、尚一層好ましくは７５０ａｍｕ未満の分子量を有して、ヘッジホッグタンパ
ク質の生物学的活性の少なくとも幾つかを特に標的細胞において阻害することの
できる有機分子である。

【００２７】 従って、本発明の方法は、正常な細胞、組織及び器官並びにｐｔｃ機能欠損、
ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進表現型を有するものを含む広範
囲の細胞、組織及び器官の修復及び／又は機能性能の調節におけるヘッジホッグ
シグナル伝達のｐｔｃ阻害を例えばそのシグナル経路のスムースンド又は下流の
構成要素の活性化を阻害することにより代行する小型分子の利用を含む。例えば
、主題の方法は、神経組織、骨及び軟骨組織の形成及び修復の調節から、精子形
成の調節、平滑筋の調節、肺、肝及び他の原始腸管から生じる臓器の調節、造血
機能の調節、皮膚及び毛の成長の調節などに及ぶ治療及び化粧用応用を有する。

【００２８】 好適具体例において、主題の方法は、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進
又はスムースンド機能亢進の表現型を有する上皮細胞を処理することであってよ
い。例えば、主題の方法は、基底細胞癌又は他のヘッジホッグ経路関連疾患の治
療又は予防において利用することができる。

【００２９】 ある具体例において、主題のアンタゴニストは、スムースンドに結合すること
によりヘッジホッグ経路の活性化を阻止することができる。ある具体例において
は、主題のアンタゴニストは、パッチトに結合することによりヘッジホッグ経路
の活性化を阻止することができる。

【００３０】 他の好適具体例において、主題の方法は、悪性の髄芽細胞腫及び他の原発性の
ＣＮＳ悪性神経外胚葉性腫瘍の治療養生法の部分として利用することができる。

【００３１】 他の面において、本発明は、活性成分として、ここに記載したようなヘッジホ
ッグアンタゴニスト、ｐｔｃアゴニスト又はスムースンドアンタゴニストを、イ
ン・ビボで、増殖又は他のｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムース
ンド機能亢進の生物学的結果を阻害するのに十分な量で配合して含む医薬製剤を
提供する。

【００３２】 主題のヘッジホッグアンタゴニスト、パッチトアゴニスト又はスムースンド亜
アンタゴニストを用いる治療は、ヒト及び動物の患者の両者に効果的であってよ
い。この発明を適用しうる動物患者は、ペットとして又は商業目的で飼われてい
る家庭の動物及び家畜の両方に及ぶ。例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、
ブタ及びヤギである。

【００３３】 ＩＩ．定義 便宜のために、本明細書、実施例、及び添付の請求の範囲で用いている幾つか
の用語を、ここに集めた。

【００３４】 遺伝子の「異常型の改変又は突然変異」なる語句は、例えば、遺伝子のヌクレ
オチドの欠失、置換又は付加などの遺伝子損傷並びに遺伝子の大きな染色体再配
列及び／又は異常なメチル化をいう。同様に、遺伝子の誤発現は、遺伝子の発現
の正常細胞におけるレベルと比較しての同様の条件下での異常型のレベル並びに
遺伝子から転写されたｍＲＮＡの非野生型のスプライシングをいう。

【００３５】 「基底細胞癌」は、様々な臨床的及び組織学的形態例えば結節性潰瘍性、浅在
性、着色した、限局性強皮症様、繊維上皮腫及び母斑様で存在する。基底細胞癌
は、ヒトで見出される最も一般的な皮膚の新生物である。メラノーマでない皮膚
癌の新たな症例の大多数は、このカテゴリーに入る。

【００３６】 「火傷創」は、熱及び／又は化学剤のために個体の皮膚の大きい表面積が除去
され又は失われた症例をいう。

【００３７】 用語「癌」は、上皮細胞よりなり、周囲の組織に浸潤する傾向及び転移を生じ
る傾向のある悪性の新規な増殖をいう。典型的な癌には、めったに転移しないが
局所的浸潤及び破壊の可能性を有する皮膚の上皮性腫瘍である「基底細胞癌」；
鱗状の上皮から生じる立方体様の細胞を有する癌をいう「扁平上皮細胞癌」；癌
性組織と肉腫性組織とからなる悪性腫瘍を含む「癌肉腫」；小さい上皮細胞の集
団又は帯により分離され又は囲まれたヒアリン又はムチン間質のシリンダー又は
バンドを特徴とし、乳腺及び唾液腺並びに気道の粘液腺に生じる癌である「腺嚢
腫癌」；表皮と同様に分化する傾向がある(即ち、有棘細胞を形成し、角質化を
受ける傾向がある)癌細胞をいう「類表皮癌」；鼻の後ろの空間の上皮性の内層
に生じる悪性腫瘍をいう「鼻咽頭癌」；及び配置の変化する管状細胞よりなる腎
臓実質組織の癌に属する「腎細胞癌」が含まれる。他の癌性上皮増殖は、上皮に
由来し、パピローマウイルスを原因因子として有する良性腫瘍をいう「乳頭腫」
；及び神経溝の閉じるときに外胚葉エレメントの封入により形成される脳又は髄
膜の腫瘍をいう「類表皮腫」である。

【００３８】 「真皮」は、上皮の深部にある皮膚の層をいい、血管結合組織の密な層よりな
り且つ神経及び末端感覚器官を含む。毛根及び皮脂腺及び汗腺は、真皮に深く埋
められた表皮の構造である。

【００３９】 「歯組織」は、上皮組織と類似する口内の組織例えば歯肉組織をいう。本発明
の方法は、歯周病の治療に有用である。

【００４０】 「真皮潰瘍」は、組織表面の喪失により引き起こされる皮膚の病変(通常、炎
症を伴う)をいう。本発明の方法により治療することのできる真皮潰瘍には、褥
瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、静脈鬱血性潰瘍及び動脈性潰瘍が含まれる。褥瘡は、
長時間にわたって皮膚の領域に加えられる圧力により生じる慢性的潰瘍をいう。
この種の傷は、しばしば、床ずれと呼ばれる。静脈鬱血性潰瘍は、欠陥のある静
脈の鬱血又は他の液体の停滞により生じる。動脈性潰瘍は、血流の乏しい動脈の
周囲の領域における壊死した皮膚をいう。

【００４１】 用語「ＥＤ₅₀」は、最大の応答又は効果の５０％を生じる薬物の投与量を意味
する。

【００４２】 主題の治療方法に関して、例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの「有効量」
は、所望の投薬養生法の部分として適用した場合に、例えば、細胞増殖速度の及
び／又は細胞の分化状態の及び／又は細胞の生存率の変化を引き起こす製剤中の
アンタゴニストの量(治療すべき疾患又は化粧目的について臨床的に許容し得る
標準に従う)をいう。

【００４３】 用語「上皮性」及び「上皮」は、内部及び外部の体表面の細胞性の被覆(皮膚
、粘膜及び漿膜)をいい、それから生じた腺その他の構造例えば角膜、食道、真
皮、毛嚢及び上皮細胞を含んでいる。他の典型的な上皮組織には、鼻腔の嗅覚器
領域の内表面となっている擬似層化上皮であって嗅覚のためのセンサーを含んで
いる嗅覚上皮；分泌細胞よりなる上皮をいう腺上皮；平らな板状の細胞からなる
上皮をいう扁平上皮が含まれる。用語上皮は又、縮小及び拡大のために大きな機
械的変化を受ける中空臓器を裏打ちすることが特徴的に見出される過渡的上皮例
えば層化扁平上皮と円柱上皮の間の過渡的上皮をもいう。

【００４４】 用語「上皮形成」は、剥離された表面を覆う上皮組織の増殖による治癒をいう
。

【００４５】 用語「表皮腺」は、表皮と関係して、通常の代謝の必要性と関係なく物質を分
泌又は排出する細胞の凝集をいう。例えば、「皮脂腺」は、油性物質と皮脂を分
泌する真皮中の全分泌腺である。用語「汗腺」は、真皮又は皮下組織に位置され
て管によって体表面に開口している汗を分泌する腺をいう。

【００４６】 用語「表皮」は、胚の外胚葉に由来する厚さ０．０７〜１．４ｍｍの皮膚の最
も外側の非脈管層をいう。手掌及び足底表面においては、それは、内側から外側
に向かって、５つの層：直立して配置された円柱細胞よりなる基底層；短い突起
又はとげを有する平らな多面細胞よりなる有棘細胞又は有棘層；平らな顆粒細胞
よりなる顆粒層；核がはっきりしないか又は存在しない透明な細胞の幾つかの層
よりなる透明層；及び平らな角化した無核の細胞よりなる角質層よりなる。全身
の体表面の表皮において、透明層は、通常、存在しない。

【００４７】 「切り出し傷」は、皮膚の上皮層中の裂き傷、擦り傷、切り傷、刺し傷又は破
傷を含み、真皮層に及び得るし、皮下脂肪以下にさえ及び得る。切り出し傷は、
外科的手順により生じ得るし又は不慮の皮膚貫通によって生じ得る。

【００４８】 細胞の「増殖状態」は、細胞の増殖の速度及び／又は細胞の分化状態をいう。
「変化された増殖状態」は、異常な増殖速度を特徴とする増殖状態(例えば、正
常細胞に比べて増大した又は減少した増殖速度を示す細胞)である。

【００４９】 用語「毛」は、糸状構造、特に、ケラチンよりなり、真皮中に埋められた乳頭
状突起から発生する特殊化された表皮構造であって、哺乳動物によってのみ生成
され、動物のグループに特徴的である表皮構造をいう。又、「毛」は、かかる毛
の集合を指すこともある。「毛嚢」は、毛を含む表皮の管状の陥入の一つをいい
、それから毛が成長する。「毛嚢上皮細胞」は、毛嚢中の真皮の乳頭状突起を囲
む上皮細胞例えば幹細胞、外毛根鞘細胞、マトリクス細胞及び内毛根鞘細胞をい
う。かかる細胞は、正常の非悪性細胞であっても、トランスフォームされた／不
死化細胞であってもよい。

【００５０】 用語「ヘッジホッグアンタゴニスト」は、例えば標的遺伝子の転写を抑制する
ためにパッチトの生物学的活性を強化し又は再現する薬剤をいう。好適なヘッジ
ホッグアンタゴニストは、ｐｔｃ機能欠損及び／又はスムースンド機能亢進を克
服するために用いることができる。後者は又、スムースンドアンタゴニストとも
呼ばれる。用語「ヘッジホッグアンタゴニスト」は、ここで用いる場合、ヘッジ
ホッグタンパク質の正常機能を直接阻害することにより作用し得る何れかの薬剤
のみを指すのではなく、ヘッジホッグシグナリング経路を阻害し、そうして、ｐ
ｔｃの機能を再現する任意の薬剤をも指す。

【００５１】 用語「ヘッジホッグ機能亢進」は、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させ
た場合と似た表現型(例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化)を生じるｐｔｃ
遺伝子、ヘッジホッグ遺伝子若しくはスムースンド遺伝子の異常型の改変若しく
は突然変異又はかかる遺伝子の発現レベルの減少(又は喪失)をいう。この機能亢
進は、Ｃｉ遺伝子Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３の発現レベルを調節するｐｔ
ｃ遺伝子産物の能力の喪失を含み得る。用語「ヘッジホッグ機能亢進」は又、こ
こでは、ヘッジホッグシグナル変換経路の何処かの変化(ヘッジホッグ自体の改
変又は突然変異を含むが、それに限らない)のために生じた任意の類似の細胞表
現型(例えば、過剰増殖を示すもの)を指すためにも用いる。例えば、ヘッジホッ
グシグナリング経路の活性化のための異常に高い増殖速度を有する腫瘍細胞は、
たとえその細胞においてヘッジホッグが変異してなくても「ヘッジホッグ機能亢
進」表現型を有する。

【００５２】 ここで用いる場合、「不死化細胞」は、化学的及び／又は組換え手段により、
培養において無限回分裂して増殖する能力を有するように変えられた細胞をいう
。

【００５３】 「内部上皮組織」は、皮膚における表皮層に類似する特徴を有する体内の組織
をいう。例には、腸の内面が含まれる。本発明の方法は、ある種の内部の傷例え
ば外科手術により生じた傷の治癒の促進に有用である。

【００５４】 用語「角化症」は、表皮の角質層の過形成を特徴とする増殖性皮膚疾患をいう
。典型的な角化症には、毛包性角化症、点状掌蹠角化症、咽頭角化症、毛髪角化
症及び光線性角化症が含まれる。

【００５５】 用語「ＬＤ₅₀」は、試験被験者の５０％に致死的である薬物の投与量を意味す
る。 用語「爪」は、指又は足指の遠心端の背側表面上の角質の皮膚板をいう。

【００５６】 用語「パッチト機能欠損」は、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させた場
合と似た表現型(例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化)を生じるｐｔｃ遺伝
子の異常型の改変若しくは突然変異又はこの遺伝子の減少した発現レベルをいう
。同機能亢進は、Ｃｉ遺伝子例えばＧｌｉ１、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３の発現レベ
ルを調節するｐｔｃ遺伝子産物の能力の喪失を含むことができる。

【００５７】 主題の方法により治療を受ける「患者」又は「被験者」は、ヒトを意味しても
、非ヒト動物を意味してもよい。

【００５８】 用語「プロドラッグ」は、生理的条件下で、本発明の治療上活性な薬剤に変換
される化合物を包含することを意図している。プロドラッグを作成するための一
般的方法は、生理的条件下で加水分解されて所望の分子が出現する選択した部位
を含むことである。他の具体例において、プロドラッグは、宿主の動物の酵素活
性により変換される。

【００５９】 ここで用いる場合、「増殖性」及び「増殖」は、有糸分裂を受ける細胞をいう
。 この出願中で、用語「増殖性皮膚疾患」は、皮膚組織の望ましくない又は異常
な増殖の著しい任意の皮膚の病気／疾患をいう。これらの病気は、典型的には、
表皮細胞の増殖又は不完全な細胞分化により特徴付けられ、例えば、Ｘ染色体性
魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、表皮剥離性角化
症及び脂漏性皮膚炎を含む。例えば、表皮異形成は、表皮の不完全な発生形態で
ある。他の例は、自発的な又は外傷部位の水疱の形成を伴う表皮のゆるんだ状態
をいう「表皮剥離」である。

【００６０】 ここで用いる場合、用語「乾癬」は、皮膚の調節機構を変える増殖過剰性皮膚
疾患をいう。特に、表皮の増殖における一次的及び二次的変化、皮膚の炎症性応
答及び調節分子例えばリンホカイン及び炎症性因子の発現を含む病変が形成され
る。乾癬の皮膚は、形態的に、表皮細胞の増大したターンオーバー、肥厚した表
皮、異常な角質化、真皮層への炎症性細胞浸潤及び多形核白血球の表皮層への浸
潤(基底細胞サイクルの増大を生じる)を特徴とする。加えて、過角化症及び不全
角化細胞が存在する。

【００６１】 用語「皮膚」は、身体の外側の保護用の被覆であり、真皮と表皮よりなり、汗
腺及び皮脂腺並びに毛嚢構造を含むと理解されている。本願中で、形容詞「皮膚
の」は、一般に、それらを用いる分脈において適当であれば、皮膚の属性をいう
ように用いられ且つ理解されるべきである。

【００６２】 用語「スムースンド機能亢進」は、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させ
た場合と似た表現型(例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化)を生じるｓｍｏ
遺伝子の異常型の改変若しくは突然変異又はこの遺伝子の増大した発現レベルを
いう。如何なる特定の理論に拘束されることも望まないが、ｐｔｃが、直接細胞
にシグナルを送ることができず、むしろ、ヘッジホッグシグナリングにおいてｐ
ｔｃの下流に位置する他の膜結合タンパク質であるスムースンドと相互作用する
ということは注意される(Marigo等(1996) Nature 384: 177-179)。遺伝子ｓｍｏ
は、Drosophilaの各セグメントの正しいパターニングに必要なセグメントポラリ
ティー遺伝子である(Alcedo等(1996) Cell 86:221-232)。ｓｍｏのヒトの同族体
が同定されている。例えば、Stone等(1996) Nature 384:129-134及びＧｅｎＢａ
ｎｋ受理番号Ｕ８４４０１を参照されたい。スムースンド遺伝子は、ヘテロ三量
体Ｇタンパク質共役レセプターの特徴を有する不可欠な膜タンパク質；即ち、７
回膜貫通領域をコードする。このタンパク質は、wingless経路のメンバーである
Drosophila Frizzled (Fz)タンパク質に対する相同性を示す。元々、ｓｍｏは、
Ｈｈシグナルのレセプターをコードすると考えられていた。しかしながら、この
示唆は、その後、ｐｔｃがＨｈレセプターである証拠が得られたことにより反証
が示された。Ｓｍｏを発現する細胞が、Ｈｈを結合することができず、これは、
ｓｍｏがＨｈと直接には相互作用しないことを示している(Nusse,(1996) Nature
384:119-120)。むしろ、ソニックヘッジホッグ(Ｓｈｈ)のそのレセプターＰＴ
ＣＨへの結合は、７回膜貫通タンパク質であるスムースンド(ＳＭＯ)のＰＴＣＨ
による正常な阻害を妨げると考えられている。

【００６３】 最近、スムースンド変異の活性化が、散発性の基底細胞癌(Xie等(1998) Natur
e 391:90-2)及び中枢神経系の原始神経外胚葉腫瘍(Reifenberger等(1998) Cance
r Res 58:1798-803)に生じるということが報告された。

【００６４】 用語「治療指数」は、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀として規定される薬物の治療指数をいう
。

【００６５】 ここで用いる場合、「トランスフォームされた細胞」は、無制限の増殖の状態
に自発的に変換された(即ち、培養において無限回の分裂によって増殖する能力
を得た)細胞をいう。トランスフォームされた細胞は、それらの増殖制御の喪失
に関して、新生物の、未分化の及び／又は過形成の等の用語によって特徴付けら
れ得る。

【００６６】 用語“アシルアミノ”は斯界で認識されており、一般式：

【化１３】 （ここで、Ｒ₉は上で定義した通りであり、Ｒ'₁₁は水素、アルキル、アルケニル
又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₈（ｍ及びＲ₈は上で定義した通りである）を表わす） により表わすことができる部分である。

【００６７】 ここで、用語“脂肪族基”とは、直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素
基をいい、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基のような飽和及び不飽和
の脂肪族基を包含する。

【００６８】 用語“アルケニル”及び“アルキニル”とは、上記のアルキルと鎖長及び可能
な置換の点で類似するが、少なくとも１個の二重結合又は三重結合をそれぞれ含
有する不飽和の脂肪族基をいう。

【００６９】 用語“アルコキシル”又は“アルコキシ”とは、ここで使用するときは、酸素
基を結合させた上で定義したようなアルキル基をいう。代表的なアルコキシル基
は、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔ−ブトキシなどが包含される。“
エーテル”は、酸素に共有結合した２個の炭化水素である。従って、そのアルキ
ルをエーテルにするアルキルの置換基は、アルコキシルであり又はこれに類似し
、例えば、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（Ｃ
Ｈ₂）_m−Ｒ₈（ｍ及びＲ₈は上で定義した通りである）の一つにより表わすことが
できる。

【００７０】 用語“アルキル”とは、直鎖状アルキル基、分岐鎖状アルキル基、シクロアル
キル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基及びシクロアルキル置換アル
キル基も含めて飽和脂肪族基をいう。好ましい具体例では、直鎖状又は分岐鎖状
アルキル基は、その主鎖内に３０個以下（直鎖のものについてはＣ₁〜Ｃ₃₀、分
岐鎖状のものについてはＣ₃〜Ｃ₃₀）、好ましくは２０個以下の炭素原子を有す
る。同様に、好ましいシクロアルキルはその環構造内に３〜１０個の炭素原子を
、好ましくは環構造内に５、６又は７個の炭素原子を有する。

【００７１】 更に、用語“アルキル”（又は、“低級アルキル”）とは、明細書、実施例及
び請求の範囲を通じて使用するときは、“置換されていないアルキル”及び“置
換されたアルキル”の双方を包含するものとし、後者のものは炭化水素の主鎖の
１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分をいう。このよ
うな置換基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボ
キシル、アルコキシカルボニル、ホルミル又はアシル）、チオカルボニル（例え
ば、チオエステル、チオアセテート又はチオホルメート）、アルコキシル、ホス
ホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミ
ジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドロリル、アルキルチオ、サ
ルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘ
テロシクリル、アラルキル、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分を包含できる
。炭化水素連鎖上に置換した部分が適当ならばそれ自身置換され得ることは当業
者ならば理解される。例えば、置換アルキルの置換基は、置換された及び置換さ
れていない形のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネート及
びホスフィネートも含めて）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、ス
ルファモイル又はスルホネートも含めて）及びシリル基並びにエーテル、アルキ
ルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート及びエステルを含
めて）、−ＣＦ₃、−ＣＮなどを包含し得る。置換アルキルの例は、以下に説明
する。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、
アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ₃、−ＣＮなどにより更に置
換され得る。

【００７２】 炭素数が別に特定されていない限り、“低級アルキル”とは、ここで使用する
ときは、その主鎖構造内に１〜１０個、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する
上で定義したようなアルキル基を意味する。同様に、“低級アルケニル”及び“
低級アルキニル”は、類似の鎖長を有する。明細書を通じて、好ましいアルキル
基は低級アルキルである。好ましい具体例では、アルキルとしてここに示した置
換基は低級アルキルである。

【００７３】 用語“アルキルチオ”は、硫黄基を結合してなる上で定義したようなアルキル
基をいう。好ましい具体例では、“アルキルチオ”は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−
アルケニル、−Ｓ−アルキニル及び−Ｓ−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₈（ここで、ｍ及びＲ₈ は上で定義した通りである）の一つにより表わされる。

【００７４】 用語“アミン”及び“アミノ”は斯界で認識されており、置換されていないア
ミン及び置換されたアミンの両方をいい、例えば、一般式：

【化１４】 （ここで、Ｒ₉、Ｒ₁₀及びＲ'₁₀はそれぞれについて独立して水素、アルキル、ア
ルケニル又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₈を表わし、Ｒ₉とＲ₁₀はこれらが結合しているＮ
原子と一緒になって４〜８個の原子を環構造内に有する複素環を完成し、Ｒ₈は
アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環又は多環を表わし、ｍは
０又は１〜８の整数である） により表わされる部分である。好ましい具体例では、Ｒ₉又はＲ₁₀の１個のみが
カルボニルであることができ、例えば、Ｒ₉、Ｒ₁₀及び窒素がイミドを形成しな
い。更に好ましい具体例では、Ｒ₉及びＲ₁₀（及び随意にＲ'₁₀）がそれぞれ水素
、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₈を表わす。しかして、用語“ア
ルキルアミン”は、ここで使用するときは、置換された又は置換されていないア
ルキル結合してなる上記のようなアミン基、即ち、Ｒ₉及びＲ₁₀の少なくとも１
個がアルキル基であるものを意味する。

【００７５】 用語“アミド”は、アミノ置換カルボニルとして斯界で認識されており、一般
式：

【化１５】 （ここで、Ｒ₉及びＲ₁₀は上で定義した通りである） により表わすことができる部分を包含する。アミドの好ましい例は、不安定であ
り得るイミドを包含しない。

【００７６】 用語“アラルキル”とは、ここで使用するときは、アリール基（例えば、芳香
族又はヘテロ芳香族基）により置換されたアルキル基をいう。

【００７７】 用語“アリール”は、ここで使用するときは、０〜４個の複素原子を含有でき
る５、６及び７員の単環式芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チ
オフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾー
ル、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジンなどを包含する。環構造に複
素原子を有するアリール基も“アリール複素環”又は“ヘテロ芳香族”というこ
とができる。芳香族環は、１個以上の環の位置で、上記したような置換基、例え
ば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シク
ロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、
イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、
カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド
、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部
分、−ＣＦ₃、−ＣＮなどにより置換できる。また、用語“アリール”は、２個
以上の環であって２個以上の炭素が２個の接する環に共通であるもの（その環は
縮合環である）を有し、しかも環の少なくとも１個が芳香族であり、他の環がシ
クロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び（又は）ヘ
テロシクリルであってよい多環式環系も包含する。

【００７８】 用語“炭素環”とは、ここで使用するときは、環のそれぞれの原子が炭素であ
る芳香族環又は非芳香族環をいう。

【００７９】 用語“カルボニル”は、斯界で認識されており、一般式：

【化１６】 （ここで、Ｘは結合であるか又は酸素若しくは硫黄を表わし、Ｒ₁₁は水素、アル
キル、アルケニル、−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₈又は製薬上許容できる塩を表わし、Ｒ'₁₁ は水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₈（ｍ及びＲ₈は上で定義し
た通りである）を表わす） により表わすことができるような部分を包含する。Ｘが酸素であり且つＲ₁₁又は
Ｒ'₁₁が水素でないときは、該式は“エステル”を表わす。Ｘが酸素であり且つ
Ｒ₁₁が上で定義した通りであるときは、該部分はここではカルボキシル基といい
、特に、Ｒ₁₁が水素であるときは、該式は“カルボン酸”を表わす。Ｘが酸素で
あり且つＲ'₁₁が水素であるときは、該式は“ホルメート”である。一般に、上
記の式の酸素原子が硫黄で置き換えられた場合には、該式は“チオカルボニル”
基を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ₁₁又はＲ'₁₁が水素でないときは、該式は“
チオエステル”を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ₁₁が水素であるときは、該式は
“チオカルボン酸”を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ'₁₁が水素であるときは、
該式は“チオールホルメート”を表わす。 他方、Ｘが結合であり且つＲ'₁₁が
水素でない場合は、該式は“ケトン基”を表わす。Ｘが結合であり且つＲ₁₁が水
素である場合には、上記の式は“アルデヒド”基を表わす。

【００８０】 用語“複素原子”は、ここで使用するときは、炭素又は水素以外の任意の元素
を意味する。好ましい複素元素は硼素、窒素、酸素、燐、硫黄及びセレンである
。

【００８１】 用語“ヘテロシクリル”又は“複素環式基”とは、３〜１０員の環構造、好ま
しくは３〜７員の環であって、その環構造が１〜４個の複素原子を含有するもの
をいう。複素環は多環であることができる。ヘテロシクリル基は、例えば、チオ
フェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサン
テン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾー
ル、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インド
リジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イ
ソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン
、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、ア
クリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェ
ノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、
オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノン
及びピロリジノンのようなラクタム、スルタム、スルトンなどを包含する。複素
環は、上で定義したような置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、
アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、ス
ルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート
、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、
ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分
、−ＣＦ₃、−ＣＮなどにより置換できる。

【００８２】 ここで使用するとき、用語”ニトロ”とは−ＮＯ₂を意味し、用語“ハロゲン
”とは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを示し、用語“スルフヒドリル”とは−Ｓ
Ｈを意味し、用語“ヒドロキシル”とは−ＯＨを意味し、用語“スルホニル”と
は−ＳＯ₂−を意味する。

【００８３】 “ホスホンアミダイト”は、一般式：

【化１７】 （ここで、Ｒ₉及びＲ₁₀は上で定義した通りであり、Ｑ₂はＯ、Ｓ又はＮを表わし
、Ｒ₄₈は低級アルキル又はアリールを表わす） で表わすことができる。

【００８４】 “ホスホルアミダイト”は、次式：

【化１８】 （ここで、Ｒ₉及びＲ₁₀は上で定義した通りであり、Ｑ₂はＯ、Ｓ又はＮを表わす
） で表わすことができる。

【００８５】 “ホスホリル”は、次式：

【化１９】 （ここで、Ｑ₁はＳ又はＯを表わし、Ｒ₄₆は水素、低級アルキル又はアリールを
表わす） で表わすことができる。例えば、アルキルを置換するのに使用するとき、ホスホ
リルアルキルのホスホリル基は、一般式：

【化２０】 （ここで、Ｑ₁はＳ又はＯを表わし、それぞれＲ₄₆は水素、低級アルキル又はア
リールを表わし、Ｑ₂はＯ、Ｓ又はＮを表わす） により表わすことができる。Ｑ₁がＳであるときは、ホスホリル部分は“ホスホ
ロチオエート”である。

【００８６】 用語“ポリシクリル”又は“多環式基”とは、２個以上の環（例えば、シクロ
アルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び（又は）ヘテロ
シクリル）であって２個以上の炭素が２個の接する環（この環は“縮合環”であ
る）に共通するものをいう。隣接しない炭素により結合される環は“架橋環”と
称する。多環式基の環のそれぞれは、上で定義したような置換基、例えば、ハロ
ゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒド
ロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、
ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル
、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル
、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ₃、−ＣＮなどにより
置換できる。

【００８７】 用語“保護基”とは、ここで使用するときは、望まない化学的変換から潜在的
に反応性の官能基を保護する一次的な置換基を意味する。このような保護基の例
は、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、アルデヒド及びケト
ンのそれぞれアセタール及びケタールを包含する。保護基の化学の分野は論評さ
れている（Ｔ．Ｗ．グリーン、Ｐ．Ｇ．Ｍ．ウッツ、「有機化学における保護基
」第２版、ウイリー社、ニューヨーク、１９９１）。

【００８８】 “セレノアルキル”とは、置換セレノ基を結合させてなるアルキル基をいう。
アルキル上に置換基を有し得る“セレノエーテル”の例は、−Ｓｅ−アルキル、
−Ｓｅ−アルケニル、−Ｓｅ−アルキニル及び−Ｓｅ−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₈（ｍ及
びＲ₈は上で定義した通りである）の一つから選択される。

【００８９】 用語“置換”とは、ここで使用するときは、有機化合物の全ての許容できる置
換基を含有させることを意図する。広い観点では、許容できる置換基は、有機化
合物の非環式及び環状の、分岐状の及び分岐状でない、炭素環式及び複素環式の
、芳香族及び非芳香族の置換基を包含する。置換基の例は、例えば、上で定義し
通りのものを包含する。許容できる置換基は、適当な化合物について１個又はそ
れ以上で且つまた同一又は異なったものであることができる。本発明のためには
、窒素のような複素原子は、水素置換基及び（又は）複素原子の原子価を安定化
させるここに記載する有機化合物の任意の許容できる置換基を有することができ
る。本発明は、有機化合物のこの許容できる置換基により何ら限定されるもので
はない。

【００９０】 “置換”又は“置換された”は、そのような置換が置換された原子及び置換基
の許された原子価と一致し並びにその置換が安定な化合物、例えば、転位、環化
、脱離などのような変換を自発的に受けない安定な化合物をもたらすという暗黙
の条件を包含するものと理解される。

【００９１】 用語“スルファモイル”とは、斯界で認識されており、一般式：

【化２１】 （ここで、Ｒ₉及びＲ₁₀は上で定義した通りである） により表わされる部分を包含する。

【００９２】 用語“サルフェート”とは、斯界で認識されており、一般式：

【化２２】 （ここで、Ｒ₄₁は上で定義した通りである） により表わされる部分を包含する。

【００９３】 用語“スルホンアミド”とは、斯界で認識されており、一般式：

【化２３】 （ここで、Ｒ₉及びＲ'₁₁は上で定義した通りである） により表わされる部分を包含する。

【００９４】 用語“スルホネート”とは、斯界で認識されており、一般式：

【化２４】 （ここで、Ｒ₄₁は電子対、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールである
） により表わされる部分を包含する。

【００９５】 用語“スルホキシド”又は“スルフィニル”とは、ここで使用するときは、一
般式：

【化２５】 （ここで、Ｒ₄₄は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、
ヘテロシクリル、アラルキル又はアリールよりなる群から選択される） により表わされる部分をいう。

【００９６】 類似の置換を、アルケニル及びアルキニルに対して、例えば、アミノアルケニ
ル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニ
ル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アル
ケニル又はアルキニルを生成するように行なうことができる。

【００９７】 それぞれの表現、例えば、アルキル、ｍ、ｎなどの定義は、ここで使用すると
きは、それが任意の構造式において１度よりも多く現われるときは、同じ構造式
において他の箇所でのその定義と独立であることが意図される。

【００９８】 用語“トリフリル”、“トシル”、“メシル”及び“ノナフリル”は、斯界で
認識されており、それぞれトリフルオルメタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホ
ニル、メタンスルホニル及びナノフルオルブタンスルホニル基をいう。用語“ト
リフレート”、“トシレート”、“メシレート”及び“ナノフレート”は、斯界
で認識されており、それぞれトリフルオルメタンスルホン酸エステル、ｐ−トル
エンスルホン酸エステル、メタンスルホン酸エステル及びナノフルオルブタンス
ルホン酸エステル官能基並びにこのような基をそれぞれ含有する分子をいう。

【００９９】 略語Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ及びＭｓは、それぞれメチル、エチ
ル、フェニル、トリフルオルメタンスルホニル、ナノフルオルブタンスルホニル
、ｐ−トルエンスルホニル及びメタンスルホニルを表わす。斯界で通常の知識を
有する有機化学者により利用される略号のより包括的なリストがＪｏｕｎａｌ
ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのそれぞれの巻の第１号に見られる
。このリストは、「略号の標準リスト」の名称の表に典型的に存在する。該リス
トに含まれる略号並びに斯界で通常の知識を有する有機化学者により利用される
略号の全てをここで引用することにより本明細書に含めるものとする。

【０１００】 本発明のある種の化合物は、特に幾何学的異性体又は立体異性体の形態で存在
し得る。本発明は、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオ
マー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、これらのラセミ混
合物、並びにこれらの混合物を含めて、本発明の範囲に入るものとして、上記の
化合物の全てを意図するものである。更に、不斉炭素原子がアルキル基のような
置換基に存在し得る。このような異性体の全て並びにそれらの混合物は本願発明
に包含されるものとする。

【０１０１】 例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーを望むならば、それは、不斉
合成により又はキラルな助剤による誘導化により製造することができ、この場合
には生じたジアステレオマー混合物が分離され、助剤基が純粋な所望エナンチオ
マーを与えるように開裂される。別法として、分子がアミノのような塩基性の官
能基又はカルボキシルのような酸性の官能基を含有するときは、適当な光学活性
の酸又は塩基によりジアステレオマー塩を形成し、次いで形成されたジアステレ
オマーを斯界で知られた分別結晶化又はクロマトグラフィー手段によって分割し
、続いて純粋なエナンチオマーを回収することができる。

【０１０２】 上記した化合物の意図される均等物には、これに対応し且つ同じ一般的性質（
例えば、ヘッジホッグシグナル伝達を阻止する能力）を有し、しかも化合物の有
効性に悪影響を及ぼさない置換基の簡単な変更が１回以上なされている化合物が
包含される。一般に、本発明の化合物は、容易に入手できる出発物質、反応剤及
び周知の合成操作を使用して、例えば、以下に説明するような一般的反応式によ
り又はその変更によって製造することができる。これらの反応においては、それ
自体知られているが、ここでは述べない別法を使用することも可能である。

【０１０３】 本発明のためには、化学元素は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、６７版、１９８６−８７」の表紙内の「元素の
周期律表、ＣＡＳ版」に従って同定される。また、本発明のためには、用語“炭
化水素”とは、少なくとも１個の水素と１個の炭素原子を有する全ての許容でき
る化合物を包含するものとする。広い観点では、許容できる炭化水素は、置換さ
れていてよく又は置換されていない非環式の及び環式の、分岐した及び分岐して
いない、炭素環式の及び複素環式の、芳香族及び非芳香族の有機化合物を包含す
る。

【０１０４】III．本発明の化合物の例 以下に詳細に説明するように、主題である方法は、例えば、ここで説明するよ
うな薬物スクリーニング検定法によって容易に同定できる種々の異なった小さい
分子を使用して実施できることが意図される。例えば、この主題方法に有用な化
合物は、一般式（Ｉ）：

【化２６】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
（ＣＨ₂）_nアリール（例えば、置換又は非置換の）又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリ
ール（例えば、置換又は非置換の）を表わし、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−、−
アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（ＣＨ₂）_nアル
キニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂）_p−、−
（ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂
）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n−又は−Ｓ
（ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｘ及びＤは、独立して、−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ₈）Ｎ−Ｎ（
Ｒ₈）−、−ＯＮ（Ｒ₈）−及び直接結合から選択され、 Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、 ＥはＯ、Ｓ又はＮＲ₅（Ｒ₅はＬＲ₈又は−（Ｃ＝Ｏ）ＬＲ₈を表わす）を表わし
、 Ｒ₈は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリー
ル（例えば、置換又は非置換の）又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリール（例えば、置
換又は非置換の）を表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になって４員〜８員の環
を形成し、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜３の整数を表わ
し、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜５の整数を表わ
し、 ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］ により表わすことができる。

【０１０５】 ある種の具体例では、ＤはＮ−低級アルキルを表わさない。ある種の具体例で
は、Ｄはアラルキル−ヘテロアラルキル−置換アミンを表わす。 ある種の具体例では、Ｒ₁は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シク
ロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピ
ルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−
ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。 ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。 ある種の具体例では、ｑとｒの和は４未満であり、例えば２又は３である。 ある種の具体例では、ＸＬＲ₄は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラ
ジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。

【０１０６】 ある種の具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なくとも１個はアリール又はヘテ
ロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なく
とも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の具体例では、Ｒ₁は
低級アルキルである。 ある種の具体例では、Ｒ₁に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ₈、例えばＮＨを表わ
す。 ある種の具体例では、ＥはＮＲ₈である。ある種の具体例では、Ｅは、例えば
多環式Ｒ₈も含めて、アラルキル−又はヘテロアラルキル−置換アミンを表わす
。 ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含ま
れ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。

【０１０７】 ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（II）：

【化２７】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₈、Ｌ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは上で定
義した通りであり、 Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ₂Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし
、 ｓはそれぞれについて独立して、０〜２の整数である］ により表わすことができる。

【０１０８】 ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。 ある種の具体例では、Ｒ₁は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シク
ロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピ
ルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−
ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。 ある種の具体例では、ｑとｒとｓの和は５未満であり、例えば２、３又は４で
ある。 ある種の具体例では、ＸＬＲ₄は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラ
ジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。 ある種の具体例では、Ｒ₁に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ₈、例えばＮＨを表わ
す。 ある種の具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なくとも１個はアリール又はヘテ
ロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なく
とも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。 ある種の具体例では、Ｍは不存在である。 ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含ま
れ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。

【０１０９】 ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式(III) ：

【化２８】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₈、Ｌ、Ｍ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは上で定
義した通りである］ により表わすことができる。

【０１１０】 ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。 ある種の具体例では、Ｒ₁は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シク
ロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピ
ルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−
ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。 ある種の具体例では、ｑとｒの和は４未満であり、例えば２又は３である。 ある種の具体例では、ＸＬＲ₄は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラ
ジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。 ある種の具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なくとも１個はアリール又はヘテ
ロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なく
とも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の具体例では、Ｒ₁は
低級アルキルである。 ある種の具体例では、Ｒ₁に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ₈、例えばＮＨを表わ
す。 ある種の具体例では、Ｍは不存在である。 ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含ま
れ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。

【０１１１】 ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式(IV) ：

【化２９】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₈、Ｌ、Ｍ、Ｘ、ｎ及びｐは上で定義した通りである
］ により表わすことができる。

【０１１２】 ある種の具体例では、ＸＬＲ₄は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラ
ジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。 ある種の具体例では、Ｒ₁は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シク
ロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピ
ルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−
ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。 ある種の具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なくとも１個はアリール又はヘテ
ロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なく
とも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の具体例では、Ｒ₁は
低級アルキルである。 ある種の具体例では、Ｒ₁に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ₈、例えばＮＨを表わ
す。 ある種の具体例では、Ｍは不存在である。 ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含ま
れ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。 ある種の具体例では、Ｌは全ての存在について直接結合を表わす。

【０１１３】 ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式(Ｖ) ：

【化３０】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｙ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは上で定義した通りであり、 Ｚ’は−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｓ）−、−（＝ＮＨ）−ＳＯ₂又はＳＯ、好
ましくは−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｓ）−であり、 Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ₈を表わし、 Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−若しくは−ＳＯ₂−を表わし、 Ｊは、それぞれについて独立して、水素又はＪに接するＮの両方の存在がＪの
少なくとも一つの存在により結合されるようにＮＣ（＝Ｙ）に結合した置換若し
くは非置換の低級アルキル若しくはアルキレン、例えばメチル、エチル、メチレ
ン、エチレンなどを表わし、 Ｒ₉は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アル
キルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ₉の一つの存在と
一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は両方の存在を含み、 Ｒ₅は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分
岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又は
シクロアルキルアルキルを表わし、 Ｒ₆は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラル
キル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロア
ルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、 Ｒ₇は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラ
ルキルを表わす］ により表わすことができる。

【０１１４】 ある種の具体例では、ＹはＯである。ある種の具体例では、Ｚ’はＳＯ₂、−
（Ｃ＝Ｏ）−又は−（Ｃ＝Ｓ）−を表わす。 ある種の具体例では、ｑとｒの和は４未満である。 ある種の具体例では、ＮＪ₂Ｎは、一緒になって、ピペラジンなどのような環
状ジアミンを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキ
ルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換
であってよい。ある種の具体例では、ＮＪ₂又はＮＪＲ₉は、一緒になって、他の
Ｎの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例
では、Ｊの一つ又は両方上の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低
級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。あ
る種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。 ある種の具体例では、Ｒ₅は分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアル
キルアルキルを表わす。 ある種の具体例では、Ｒ₆は、少なくとも１個の複素環式環、例えば、チオフ
ェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロー
ル、インドールなどを含む。 ある種の具体例では、Ｒ₇は、ベンジル基のようなフェニル基を表わし、これ
はハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、ニトロ、シアノ、低級アルキルエー
テル（例えば、ＣＨＦ₂ＣＦ₂Ｏのように置換されていてよい）又は低級アルキル
チオエーテル（例えば、ＣＦ₃Ｓのように置換されていてよい）により置換され
ていてよい。 ある種の具体例では、Ｒ₈は、Ｖに存在するときは、Ｈ又は低級アルキルを表
わし、好ましくはＨである。

【０１１５】 ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式(VI) ：

【化３１】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｇ、Ｊ、Ｖ、Ｙ、Ｚ’、ｎ及びｐは上で定
義した通りである］ により表わすことができる。

【０１１６】 ある種の具体例では、ＹはＯである。ある種の具体例では、Ｚ’はＳＯ₂、−
（Ｃ＝Ｏ）−又は−（Ｃ＝Ｓ）−を表わす。 ある種の具体例では、ＮＪ₂Ｎは、一緒になって、ピペラジンなどのような環
状ジアミンを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキ
ルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換
であってよい。ある種の具体例では、ＮＪ₂又はＮＪＲ₉は、一緒になって、他の
Ｎの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例
では、Ｊの一つ又は両方の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低級
アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。ある
種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。 ある種の具体例では、Ｒ₅は分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアル
キルアルキルを表わす。 ある種の具体例では、Ｒ₆は、少なくとも１個の複素環式環、例えば、チオフ
ェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロー
ル、インドールなどを含む。 ある種の具体例では、Ｒ₇は、ベンジル基のようなフェニル基を表わし、これ
はハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、ニトロ、シアノ、低級アルキルエー
テル（例えば、ＣＨＦ₂ＣＦ₂Ｏのように置換されていてよい）又は低級アルキル
チオエーテル（例えば、ＣＦ₃Ｓのように置換されていてよい）により置換され
ていてよい。 ある種の具体例では、Ｒ₈は、Ｖに存在するときは、Ｈ又は低級アルキルを表
わし、好ましくはＨである。 ある種の具体例では、主題化合物は、図３２に示した化合物から選択される。

【０１１７】 ある具体例においては、主題のアンタゴニストを、それらのヘッジホッグ経路
に対する選択性に基づいて選択することができる。この選択性は、他の経路に対
してヘッジホッグ経路を選択するものであってよく、特定のヘッジホッグ経路(
例えば、ｐｔｃ−１、ｐｔｃ−２等)の間の選択性であってよい。

【０１１８】 ある好適具体例においては、主題のインヒビターは、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジ
ホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を、１ｍＭ以下の
、一層好ましくは１μＭ以下の、尚一層好ましくは１ｎＭ以下のＥＤ₅₀で阻害す
る。同様に、ある好適具体例において、主題のインヒビターは、ヘッジホッグ経
路の活性を、１０ｎＭより小さい好ましくは１ｎＭより小さい尚一層好ましくは
０．１ｎＭより小さいＫ_iで阻害する。

【０１１９】 特別の具体例において、この小分子を、それが一つのパッチトイソ型に対して
隣のものより一層選択的であるので、例えば、一つのパッチト経路(ｐｔｃ−１
、ｐｔｃ−２)に対して、他のものの１０倍、一層好ましくは少なくとも１００
倍又は１０００倍も選択的であるので選択する。

【０１２０】 ある具体例においては、ＰＫＡ以外のプロテインキナーゼ例えばＰＫＣより一
層選択的にヘッジホッグ活性と拮抗するヘッジホッグ経路のアンタゴニストであ
る化合物を選択し、例えば、その化合物は、ヘッジホッグ経路の活性を、他のプ
ロテインキナーゼの活性を調節する場合より少なくとも一桁強力に、好ましくは
少なくとも２桁強力に、尚一層好ましくは少なくとも３桁強力に調節する。従っ
て、例えば、ヘッジホッグ経路の好適なインヒビターは、ヘッジホッグ活性を、
ＰＫＣの阻害のＫ_iより少なくとも一桁低い、好ましくは少なくとも２桁低い、
尚一層好ましくは少なくとも３桁低いＫ_iで阻害することができる。ある具体例
において、ＰＫＡ阻害のＫ_iは、１０ｎＭ未満であり、好ましくは１ｎＭ未満で
あり、尚一層好ましくは０．１ｎＭ未満である。

【０１２１】主題化合物の製造方法 本発明は、更に、上記したような主題化合物の製造方法を提供する。例えば、
ある種の具体例では、式Ｘの化合物は、以下の反応式：

【化３２】 ［ここで、 ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して、ｑ＋ｒ＋ｓの和が２〜４の範囲の整数で
あるように、０〜２の範囲の整数を表わし、 ＬＧはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）又はスルホン酸エステル（例え
ば、トシレート、メシレート、トリフレートなど）のような脱離基を表わし、 Ａは酸を保護する基に結合した酸素若しくは硫黄又は式：ＸＬＲ₄を有する基
を表わし、 Ｂは窒素を保護する基又は式：ＭＲ₃を有する基を表わし、 Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_n アリール（置換又非置換の）又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリール（置換又非置換の
）を表わし、 ＹはＯ及びＳから選択でき、 Ｘは−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は直接結合から選択され、 Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ₂Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし
、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−アル
キル−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（Ｃ
Ｈ₂）_nアルキニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂ ）_p−、−（ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、
−（ＣＨ₂）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n
−又は−Ｓ（ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｒ₈はそれぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリール
（例えば、置換又非置換の）又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリール（例えば、置換又
非置換の）を表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になって４員〜８員の環を形成
し、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜３の整数を表わ
し、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜５の整数を表わ
す］ に従って変換することができ、 工程Ａはヒドロキシルを脱離基に転化することからなり、 工程Ｂは該脱離基をアジド基で置換することからなり、 工程Ｃはアジドをアミンに還元することからなる。

【０１２２】 ある種の具体例では、ヒドロキシルの脱離基への転化は、ヒドロキシルをハロ
ゲン化スルホニルと反応させてスルホン酸エステルを生じさせることによって、
例えば、塩化トシル若しくはトシル無水物を使用してトシレートを生じさせ、又
は塩化メシル若しくはメシル無水物を使用してメシレートを生じさせ、又は塩化
トリフリル若しくはトリフリル無水物を使用してトリフレートを生じさせること
などにより達成することができる。ある種の具体例では、ヒドロキシルの脱離基
への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化チオニル、三ハロゲン化燐、五ハロゲン
化燐、オキシハロゲン化燐などのようなハロゲン化反応剤と反応させることによ
り達成することができる。ヒドロキシル基を脱離基に転化するためのその他の技
術は斯界で周知であり、工程Ａに使用することができる。

【０１２３】 ある種の具体例では、工程Ａは、第一脱離基を第二脱離基により置換し、脱離
基を有する炭素の立体化学を逆転させることを更に含む。従って、例えば、式Ｘ
の化合物のヒドロキシルがＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係を有する
ならば、この化合物と塩化メシルとの反応はＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化
学的関係でメシレートを生じさせる。このメシレートとＮａＩのような求核性ハ
ロゲン化物反応剤との反応は、メシレートを沃化物で置き換えて、脱離基である
沃素とＹとＡを有する基とがｔｒａｎｓ−立体化学的関係を有する式XIの化合物
を生じさせる。この技術の使用は、ジアステレオマー的に純粋な出発物質からｃ
ｉｓ−又はｔｒａｎｓ−立体化学のいずれかを有する化合物、例えば、ヒドロキ
シルとＹとＡを有する基との間にｃｉｓ−立体化学的関係を有する純粋な化合物
を選択的に得るのを可能にさせる。

【０１２４】 ある種の具体例では、脱離基をアジドで置換することは、斯界で周知のように
、ナトリウムアジドのようなアジド陰イオンのアルカリ若しくはアルカリ土類金
属塩を使用して、トリメチルシリルアジドのようなシリルアジド反応剤を使用し
て、又は任意のその他のアジド反応剤、例えば求核性アジド源を使用して達成す
ることができる。

【０１２５】 ある種の具体例では、アジドからアミンへの還元は、水素化アルミニウムリチ
ウム、トリアルキル硼水素化リチウムなどのような水素化物反応剤を使用して、
亜鉛金属若しくは二沃化サマリウムと酢酸のような還元性金属と酸源を使用して
、水素と白金若しくはパラジウムのような遷移金属触媒の如き接触水素化を使用
して、又は任意のその他の好適な手段により達成することができる。

【０１２６】 ある種の具体例では、ｑ＋ｓ＋ｒは２〜３の整数である。ある種の具体例では
、ｓは０である。ある種の具体例では、ｑ及びｒはそれぞれ１を表わす。

【０１２７】 ある種の具体例では、Ａは、酸の保護基に結合した酸素を表わす。例えば、酸
保護基は、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又は
アラルキル基であることができる。このような基には、メチル、エチル、トリメ
チルシリルエチル、メチルチオメチル、アリル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル
、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、ｔ−ブチル又は任意のその他の好適な基が
包含される。広範な酸保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から
離れることなくこの方法に使用することができる。他の具体例では、Ａはアルキ
ルチオ基を表わす。

【０１２８】 ある種の具体例では、Ｂは窒素を保護する基、例えば、置換又は非置換のアシ
ル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基、或いはＮ
と一緒になったときにカルバメート基を形成する基を表わす。普通の窒素保護基
二は、ベンジル、アリル、ｐ−メトキシベンジル、アセチル、トリフルオルアセ
チル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが包含される。
広範な窒素保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れること
なくこの方法に使用することができる。

【０１２９】 ある種の具体例では、ＹはＯである。 ある種の具体例では、Ａは、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、
モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含み得るＸＬＲ₄を表わす。 ある種の具体例では、Ｒ₃はアリール又はヘテロアリール基を含む。 ある種の具体例では、Ｍは不存在である。 ある種の具体例では、ＸはＮＲ₈であり、好ましくはＮＨではない。ある種の
具体例では、Ｘは環に含まれ、又は、−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミド
基を表わす。

【０１３０】 ある種の具体例では、式XIIIの化合物は、アミンとＹとＡを含む基とがｃｉｓ
−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５
％＞のｃｉｓ−異性体のために濃縮される。その他の具体例では、式XIIIの化合
物は、二つの置換基がｔｒａｎｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７
５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。
好ましくは、このような濃縮は、異性体的に濃縮された出発物質を使用してもた
らされ、例えば、式Ｘの化合物は工程Ａを開始する前に＞７５％、＞８５％、又
は更に＞９５％のｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。

【０１３１】 同様に、他の具体例では、式XIVの化合物は、以下の反応式：

【化３３】 ［ここで、 ｑ及びｒは、それぞれ独立して、ｑ＋ｒの和が２〜４の範囲の整数であるよう
に、０〜２の範囲の整数を表わし、 ＬＧはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）又はスルホン酸エステル（例え
ば、トシレート、メシレート、トリフレートなど）のような脱離基を表わし、 Ａは酸を保護する基に結合した酸素若しくは硫黄又は式：ＮＪ₂Ｎ（Ｒ₉）₂を
有する基を表わし、 Ｂは窒素を保護する基又は式：ＧＲ₆を有する基を表わし、 Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−又は−ＳＯ₂−を表
わし、 Ｊは、それぞれについて独立して、水素又はＪに接するＮの両方の存在がＪの
少なくとも一つの存在により結合されるようにＮＣ（＝Ｙ）に結合する置換若し
くは非置換の低級アルキル若しくはアルキレンを表わし、 Ｒ₉は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アル
キルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ₉の一つの存在と
一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は両方の存在を含み、 Ｒ₆は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラル
キル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロア
ルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、 ＹはＯ及びＳから選択できる］ に従って変換することができ、 工程Ａはヒドロキシルを脱離基に転化することからなり、 工程Ｂは該脱離基をアジド基で置換することからなり、 工程Ｃはアジドをアミンに還元することからなる。

【０１３２】 ある種の具体例では、ヒドロキシルから脱離基への転化は、ヒドロキシルをハ
ロゲン化スルホニルと反応させてスルホン酸エステルを生じさせることによって
、例えば、塩化トシル若しくはトシル無水物を使用してトシレートを生じさせ、
又は塩化メシル若しくはメシル無水物を使用してメシレートを生じさせ、又は塩
化トリフリル若しくはトリフリル無水物を使用してトリフレートを生じさせるこ
となどにより達成することができる。ある種の具体例では、ヒドロキシルから脱
離基への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化チオニル、三ハロゲン化燐、五ハロ
ゲン化燐、オキシハロゲン化燐などのようなハロゲン化反応剤と反応させること
により達成することができる。ヒドロキシル基を脱離基に転化するためのその他
の技術は斯界で周知であり、工程Ａに使用することができる。

【０１３３】 ある種の具体例では、工程Ａは、第一脱離基を第二脱離基により置換し、脱離
基を有する炭素の立体化学を逆転させることを更に含む。従って、例えば、式Ｘ
の化合物のヒドロキシルがＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係を有する
ならば、この化合物と塩化メシルとの反応はＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化
学的関係でメシレートを生じさせる。このメシレートとＮａＩのような求核性ハ
ロゲン化物反応剤との反応は、メシレートを沃化物で置き換えて、脱離基である
沃素とＹとＡを有する基とがｔｒａｎｓ−立体化学的関係を有する式XVの化合物
を生じさせる。この技術の使用は、ジアステレオマー的に純粋な出発物質からｃ
ｉｓ−又はｔｒａｎｓ−立体化学のいずれかを有する化合物、例えば、ヒドロキ
シルとＹとＡを有する基との間にｃｉｓ−立体化学的関係を有する純粋な化合物
を選択的に得るのを可能にさせる。

【０１３４】 ある種の具体例では、脱離基をアジドで置換することは、斯界で周知のように
、ナトリウムアジドのようなアジド陰イオンのアルカリ若しくはアルカリ土類金
属塩を使用して、トリメチルシリルアジドのようなシリルアジド反応剤を使用し
て、又は任意のその他のアジド反応剤、例えば求核性アジド源を使用して達成す
ることができる。

【０１３５】 ある種の具体例では、アジドからアミンへの還元は、水素化アルミニウムリチ
ウム、トリアルキル硼水素化リチウムなどのような水素化物反応剤を使用して、
亜鉛金属若しくは二沃化サマリウムと酢酸のような還元性金属と酸源を使用して
、水素と白金若しくはパラジウムのような遷移金属触媒の如き接触水素化を使用
して、又は任意のその他の好適な手段により達成することができる。

【０１３６】 ある種の具体例では、ｑ＋ｒは２〜３の整数である。ある種の具体例では、ｑ
及びｒはそれぞれ１を表わす。

【０１３７】 ある種の具体例では、Ａは、酸保護基に結合した酸素を表わす。例えば、酸保
護基は、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はア
ラルキル基であることができる。このような基には、メチル、エチル、トリメチ
ルシリルエチル、メチルチオメチル、アリル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、
テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、ｔ−ブチル又は任意のその他の好適な基が包
含される。広範な酸保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離
れることなくこの方法に使用することができる。他の具体例では、Ａはアルキル
チオ基を表わす。

【０１３８】 ある種の具体例では、Ｂは窒素を保護する基、例えば、置換又は非置換のアシ
ル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基、或いはＮ
と一緒になったときにカルバメート基を形成する基を表わす。普通の窒素保護基
二は、ベンジル、アリル、ｐ−メトキシベンジル、アセチル、トリフルオルアセ
チル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが包含される。
広範な窒素保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れること
なくこの方法に使用することができる。

【０１３９】 ある種の具体例では、ＹはＯである。 ある種の具体例では、ＢはＧＲ₆（ここで、Ｒ₆は少なくとも１個の複素環式環
、例えばチオフェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキ
ソール、ピロール、インドールなどを含む）である。

【０１４０】 ある種の具体例では、Ａは、一緒になって、環状ジアミン、例えばピペラジン
などを表わし得るＮＪ₂Ｎを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキ
ル、低級アルキルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていて
よく又は非置換であってよい。ある種のその他の具体例では、ＮＪ₂又はＮＪＲ₉ は、一緒になって、他のＮの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を
表わす。ある種の具体例では、Ｊの一つ又は両方の存在は、低級アルキル、低級
アルキルエーテル、低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上
により置換される。ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員
を有する。

【０１４１】 ある種の具体例では、式XVIIの化合物は、アミンとＹとＡを含む基とがｃｉｓ
−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５
％のｃｉｓ−異性体のために濃縮される。その他の具体例では、式XVIIの化合物
は、二つの置換基がｔｒａｎｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５
％、＞８５％、又は更に＞９５％のｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。好
ましくは、このような濃縮は、異性体的に濃縮された出発物質を使用してもたら
され、例えば、式ＸIVの化合物は工程Ａを開始する前に＞７５％、＞８５％、又
は更に＞９５％のｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。

【０１４２】 ある種の具体例では、式XIII又はXVIIの構造を有するアミンは、例えば、式Ｉ
〜VIの化合物を生じさせる方に向けて追加の工程を実施することによって更に変
換することができる。しかして、例えば、本発明に従う方法は、下記の工程： Ｄ）環外アミンに基：−Ｃ（＝Ｚ）ＬＲ₁又は−Ｚ’ＶＲ₅をカップリングさせ
ること、 Ｅ）環外アミンに基：−Ｒ₇又は−ＬＲ₂をカップリングさせること、 Ｆ）Ｙを有する基に基：−ＮＪ₂Ｎ（Ｒ₉）又は−ＸＬＲ₄をカップリングさせ
ること、 Ｇ）環の窒素に基：−ＭＲ₃又は−ＧＲ₆をカップリングさせること Ｈ）環の窒素から保護基を除去すること、 Ｉ）Ｙを有する基から保持基を除去すること、 Ｊ）環外アミンに窒素保護基を置くこと、 Ｋ）環外アミンから保持基を除去すること ［ここで、 Ｌ、Ｊ、Ｒ₉、Ｍ、Ｒ₃及びＲ₆は上で定義した通りであり、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
（ＣＨ₂）_nアリール（置換又は非置換の）又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリール（置
換又は非置換の）を表わし、 ＺはＯ又はＳであり、 Ｚ’は不存在であるか又は−ＳＯ₂−、−（Ｃ＝Ｓ）−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）
−を表わし、 Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ₈を表わし、 Ｒ₅は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分
岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又は
シクロアルキルアルキルを表わし、 Ｒ₇は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラ
ルキルを表わす］ の一つ以上を含む。

【０１４３】 工程Ｄ〜Ｋのどれも、選択できるときは、斯界で周知であるように、種々の反
応及び保護基に応じて、任意の順序で達成することができる。本法で使用するの
に好適な種々の保護基を上で概説したが、これらは、このような保護基を結合さ
せ及び除去するための多くの技術と同じように、斯界で周知であり、これらのど
れも本法の範囲及び精神から離れることなく本法で使用することができる。

【０１４４】 ある種の具体例では、工程Ｄは、環外アミンをアシル化剤、例えば、酸ハロゲ
ン化物、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホーメート、ハロチオホー
メート、無水物、重炭酸エステル、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化スルフィ
ニル、塩化カルバモイル、塩化チオカルバモイル又は現場で製造される活性化ア
シル化部分と反応させることによって達成することができる。アシル化剤は、現
場で、例えば、カルボン酸を、カルボジイミド（例えば、ジイソプロピルカルボ
ジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミドなど）、燐系反応剤（例えば、ＢＯＰ−Ｃｌ、
ＰｙＢＲＯＰなど）、塩化オキサリル、ホスゲン、トリホスゲンのような活性化
剤、又はカルボン酸基と反応してアミンとのカップリングに向けて該カルボン酸
と比べて感受性が増大した反応性中間体をもたらす任意のその他の反応剤と反応
させることによって達成することができる。有機合成、特にペプチドのカップリ
ングの分野では広範囲のこのような反応剤が周知である。同様に、第一アミン又
はアルコールを、例えば、カルボニルジイミダゾール、ホスゲン、トリホスゲン
、ジホスゲンなどのようなホスゲンの均等物、又はチオホスゲン、チオカルボニ
ルジイミダゾールなどのようなチオホスゲンの均等物により処理して、アミンと
反応して尿素又はチオ尿素を形成できるアシル化剤（例えば、イソシアネート、
イソチオシアネート、クロルホルムアミド又はクロルチオホルムアミド）を、そ
の単離又は精製を必要とすることなく、発生させることができる。

【０１４５】 Ｍ又ＧがＳＯ₂、Ｃ＝Ｏ又はＣ＝Ｓを表わす具体例では、工程Ｇは、上記の工
程Ｄについて説明したような反応剤及び技術を強い使用して達成することができ
る。Ｍ又はＧが不存在である具体例では、工程Ｇは、環外アミンを親電子性反応
剤、例えばハロゲン化又はスルホン酸アルキル、ハロゲン化又はスルホン酸アラ
ルキル、ハロゲン化又はスルホン酸ヘテロアラルキル、ハロゲン化又はスルホン
酸シクロアルキル、ハロゲン化又はスルホン酸シクロアルキルアルキル、ハロゲ
ン化又はスルホン酸ヘテロシクシル、或いはハロゲン化又はスルホン酸ヘテロシ
クシルアルキルと反応させることによって達成することができる。別法として、
工程Ｇは、還元的アルキル化、例えば、環外アミンを適当に置換されたアルデヒ
ドと、硼水素化ナトリウムのような還元剤の存在下に反応させるころによって達
成することができる。

【０１４６】 ある種の具体例では、工程Ｅは、還元的アルキル化を使用して又は環外アミン
をハロゲン化物若しくはスルホン酸エステルのような求電子性試薬と反応させる
ことによって達成することができる。

【０１４７】 ある種の具体例では、工程Ｆは、エステル、チオエステル又はキサントゲン酸
エステルを、例えば、式：ＨＮＪ₂Ｎ（Ｒ₉）₂又はＨＸＬＲ₄を有する化合物と、
例えば、ルイス酸の存在下に、高められた温度で反応させるなどして達成するこ
とができる。その他の具体例では、工程Ｆは、カルボン酸を活性化剤、例えば、
カルボジイミド（例えば、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミ
ドなど）、燐系反応剤（例えば、ＢＯＰ−Ｃｌ、ＰｙＢＲＯＰなど）、塩化オキ
サリル、ホスゲン、トリホスゲンのような活性化剤、又はカルボン酸基と反応し
てアミンとのカップリングの法に向けて該カルボン酸と比べて感受性が増大した
反応性中間体をもたらす任意のその他の反応剤と反応させることによって達成す
ることができる。求核性反応剤をカルボン酸又はその誘導体（例えば、エステル
、チオエステル）とカップリングさせるためのその他の技術も斯界で周知であり
、ここに特に列挙したものの代わりに使用することができる。

【０１４８】 ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。 ある種の具体例では、Ｒ₁は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シク
ロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピ
ルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−
ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。 ある種の具体例では、ＸＬＲ₄は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラ
ジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。 ある種の具体例では、Ｒ₁に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ₈、例えばＮＨを表わ
す。 ある種の具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なくとも１個はアリール又はヘテ
ロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なく
とも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。 ある種の具体例では、Ｍは不存在である。 ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含ま
れ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。

【０１４９】 ある種の具体例では、ＮＪ₂Ｎは、一緒になって、ピペラジンなどのような環
状ジアミンを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキ
ルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換
であってよい。ある種の具体例では、ＮＪ₂又はＮＪＲ₉は、一緒になって、他の
Ｎの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例
では、Ｊの一つ又は１個以上の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、
低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。
ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。 ある種の具体例では、Ｒ₅は分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアル
キルアルキルを表わす。 ある種の具体例では、Ｒ₆は、少なくとも１個の複素環式環、例えば、チオフ
ェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロー
ル、インドールなどを含む。 ある種の具体例では、Ｒ₇は、ベンジル基のようなフェニル基を表わし、これ
はハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、ニトロ、シアノ、低級アルキルエー
テル（例えば、ＣＨＦ₂ＣＦ₂Ｏのように置換されていてよい）又は低級アルキル
チオエーテル（例えば、ＣＦ₃Ｓのように置換されていてよい）により置換され
ていてよい。 ある種の具体例では、Ｒ₈は、Ｖに存在するときは、Ｈ又は低級アルキルであ
り、好ましくはＨである。

【０１５０】 ＩＶ．方法及び組成物の典型的適用 本発明の他の特徴は、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースン
ド機能亢進を有する細胞の分化状態、生存及び／又は増殖を、主題の方法に従っ
てヘッジホッグアンタゴニストに細胞を接触させて調節する方法に関する。

【０１５１】 例えば脊椎動物において、分化した組織が秩序だって空間的に配置されること
に、ヘッジホッグ、ｐｔｃ及びスムースンドが明らか広く関与しているという発
見に照らし合わせると、主題の方法はイン・ビトロ及びイン・ビボ両方において
、異なる脊椎動物組織系列の作成及び／又は維持処置の一部として用いることが
できる。所与の組織の増殖及び分化に関して、誘導性の有無に関わらず、適当な
ものであれば、ヘッジホッグアンタゴニストは上記した調製物のいずれでもあり
うる。

【０１５２】 例えば、本発明の方法は、遺伝上又は生化学上のいずれかの理由から、細胞が
ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の表現型を有
する場合、細胞培養技術に適用することができる。イン・ビトロのニューロン培
養系が、ニューロン発達の研究及び神経向性因子［神経成長因子（ＮＧＦ）、毛
様体向性因子（ＣＮＴＦ）及び脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）など］の同定に
おいて基本的で不可欠なものだということがわかっている。本発明の方法の使用
法の一つとして、神経幹細胞の培養において用いるもの（例えば新しいニューロ
ン及びグリアの作成を目的に、そのような培養において用いる）が挙げられる。
主題の方法のそのような態様においては、培養細胞を本発明のヘッジホッグアン
タゴニストと接触させて、培養中の神経幹細胞の増殖率及び／又は分化の速度を
変化させるか、ある種の末期分化神経細胞の培養の完全性を保持する。例証的な
態様においては、主題の方法を用いて、例えば感覚ニューロン又は運動ニューロ
ンを培養することができる。そのようなニューロン培養を、簡易なアッセイ系並
びに治療用の移植可能細胞源として用いることができる。

【０１５３】 本発明によると、大量の非腫瘍形成性神経幹細胞をイン・ビトロで永久保存す
ることができ、本発明のヘッジホッグアンタゴニストと接触させることによって
それらの増殖率及び／又は分化率に影響を及ぼすことができる。一般に、動物か
ら神経幹細胞を単離する段階；これらの細胞を、好ましくは成長因子の存在下に
、イン・ビトロ又はイン・ビボで永久保存する段階；及びこれらの細胞をヘッジ
ホッグアンタゴニストに接触させることによって細胞の特定の神経表現型（例え
ばニューロン及びグリア）への分化を調節する段階を包含する方法が提供される
。

【０１５４】 幹細胞は、分化が必要とされるまで抑制した状態に保持される、持続性抑制の
影響下にあると考えられる。しかし、最終的な分化にいたる（従って非分裂性の
）ニューロンとは違って、これらの細胞を増殖させる方法が近年開発されている
。細胞は無限に産生され、神経変性疾患を有する異種及び自己宿主内への移植に
非常に好適である。

【０１５５】 「幹細胞」とは、制限無く分裂することができ、特殊な条件下で、最終的にニ
ューロン及びグリアなどに分化する娘細胞を産生することができる、少分化能（
oligopotent）又は多分化能（multipotent）を有する細胞を意味する。これらの
細胞を、異種又は自己宿主への移植に用いることができる。「異種」とは、幹細
胞が由来する動物以外の宿主であることを意味する。「自己」とは、細胞が由来
するのと同一の宿主であることを意味する。

【０１５６】 細胞は、神経組織を有するあらゆる動物において、胎芽、生後、幼若、又は成
人の神経組織から得ることができる。より具体的には、あらゆる魚類、は虫類、
鳥類、両生類又はほ乳類などが挙げられる。最も好ましいドナーはほ乳類、特に
マウス及びヒトである。

【０１５７】 異種ドナー動物を用いる場合、動物を安楽死させ、脳及び対象とする特異な領
域を無菌の処理工程によって取り出す。特に対象となる脳の領域としては、宿主
の脳の変質した領域の機能を回復するのに用いられる幹細胞が得られる領域であ
れば、どのような領域でも含まれる。そのような領域の例としては、大脳皮質、
小脳、中脳、脳幹、脊髄及び脳室組織などの中枢神経系（ＣＮＳ）の領域、頸動
脈小体及び副腎髄質などの末梢神経系（ＰＮＳ）の領域が挙げられる。特に、大
脳基底核における領域、好ましくは尾状核及び被殻からなる線条、又は淡蒼球、
視床下核などの様々な細胞群、アルツハイマー病患者中で変質がみられる核基底
、又はパーキンソン病患者で変質がみられる黒質緻密部が挙げられる。

【０１５８】 ヒト異種神経幹細胞は、人工妊娠中絶から得た胎児組織に由来するものでもよ
いし、生後、幼若又は成人の臓器ドナーから得たものであってもよい。自己神経
組織はバイオプシーによって得ることもできるし、神経外科、具体的には癲癇手
術、さらに具体的には側頭葉切除術及び海馬切除術で、神経組織を除去した患者
から得ることもできる。

【０１５９】 ドナー組織の連結細胞外基質から個々の細胞を解離することによって、細胞を
得ることができる。解離は、公知の方法、例えばトリプシン、コラゲナーゼなど
の酵素による処理によって、（先端の尖っていない器具を用いる）物理的な解離
方法によって、又はメスを用いる微塵切りによって実施する。これにより組織か
ら得た特異な細胞型の増殖が可能になる。胎児細胞の解離は、組織培養基内で行
うことができるが、幼若及び成人細胞の解離に好ましい培養基は、人工脳脊髄液
（ａＣＳＦ）である。一般的なａＣＳＦは、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ3及
び１０ｍＭ Ｄ−グルコースを含んでいる。ＭｇＣｌ2を３．２ｍＭの濃度で、
ＣａＣｌ２を０．１ｍＭの濃度で含むことを除いては、低Ｃａ2+ａＣＳＦは同じ
成分を含んでいる。

【０１６０】 解離した細胞は、細胞成長を支持する公知のあらゆる培養基で培養することが
できる。培養基の例としては、細胞の代謝に必要な追加成分（グルタミン及び他
のアミノ酸、ビタミン、ミネラルなど）及び有用な蛋白質（トランスフェリンな
ど）を含む、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２などが挙げられる。培養基
は、酵母菌、バクテリア及び菌類などによる汚染を防ぐ抗生物質（ペニシリン、
ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなど）を更に含んでいてもよい。ある場合
には、培養基はウシ、ウマ、ニワトリなどに由来する血清を含んでいてもよい。
特に好ましい細胞培養基は、ＤＭＥＭ及びＦ−１２の混合物である。

【０１６１】 培養条件は、生理条件に近いものでなければならない。培養基のｐＨは、生理
的ｐＨに近いもの、好ましくはｐＨ６−８、より好ましくはｐＨ７、更により好
ましくはｐＨ７．４に近いものでなければならない。細胞は生理的温度に近いも
の、好ましくは３０−４０℃、より好ましくは３２−３８℃、更により好ましく
は３５−３７℃で培養されなければならない。

【０１６２】 細胞は懸濁液中で又は固定基質上で育成することができるが、幹細胞の増殖は
、多数の細胞が「凝集塊」を形成するように好ましくは懸濁液中で行われる（例
えばReynolds他（１９９２）Science２５５：１０７０−１７０９；及びＰＣＴ
公開番号ＷＯ９３／０１２７５、ＷＯ９４／０９１１９、ＷＯ９４／１０２９２
、及びＷＯ９４／１６７１８参照）。増殖中（又は分裂中）の懸濁細胞の場合、
フラスコを十分に振盪し、凝集塊をフラスコ底角に沈殿させる。凝集塊を５０ｍ
ｌ遠心分離管に移し、低速で遠心分離する。培養基を吸引して、成長因子を含む
少量の培養基に細胞を再懸濁する。細胞を機械的に解離して、培養基の別々のア
リコートに再懸濁する。

【０１６３】 培養基中の細胞懸濁液に、幹細胞の増殖を可能にする成長因子を補充し、細胞
を支持することのできる容器に入れるが、上記したように、好ましくは培養フラ
スコ又はローラーボトルに入れる。細胞は一般に３−４日間、３７℃の保温器内
に入れることで増殖する。細胞を解離し、成長因子を含む培養基中に再懸濁する
ことによっていつでも増殖を再開することができる。

【０１６４】 基質の非存在下では、細胞はフラスコの床を離れて懸濁液中で増殖を続け、未
分化細胞の中空凝集塊を形成する。イン・ビトロにて約３−１０日後から、増殖
群（凝集塊）を２−７日ごと、好ましくは２−４日ごとに、緩やかな遠心分離に
よって供給し、成長因子を含む培養基に再懸濁する。

【０１６５】 イン・ビトロで６−７日後に、凝集塊中の個々の細胞を、先端の尖っていない
器具で物理的に解離して（より具体的にはピペットで凝集塊を砕いて）分離する
。解離した凝集塊からの個々の細胞を、成長因子を含む培養基に再懸濁し、ヘッ
ジホッグアンタゴニストの存在下で細胞を培養する（又は再懸濁する）ことによ
って、細胞の分化を培養中で制御する。

【０１６６】 主題のヘッジホッグアンタゴニストの他の使用法をさらに例証するものとして
、脳内移植が中枢神経系治療の更なる方法として用いられるようになったことを
挙げておく。例えば、損傷した脳組織を修復する一つの方法として、胎児又は新
生児の細胞を成人の脳に移植する方法が挙げられる（Dunnett他（１９８７）J E
xp Biol１２３：２６５−２８９；及びFreund他（１９８５）J Neurosci５：６
０３−６１６）。様々な脳領域から取った胎児ニューロンを、成人の脳にうまく
組み込むことができ、その結果、行動上の欠陥を緩和することができる。例えば
、脳幹神経節に対するドーパミン作用性突起物における損傷によって起こる運動
障害は、胎芽のドーパミン作用性ニューロンを移植することによって避けること
ができる。新皮質の損傷によって起こる複雑認識機能の障害は、胎芽の皮質細胞
を移植することによって部分的に回復させることができる。主題の方法を用いて
培養の成長状態を調節することができ、胎児組織が用いられる場合には、特に神
経幹細胞を用いて、幹細胞の分化率を調節することができる。

【０１６７】 本発明で用いることのできる幹細胞は、公知のものである。例えば、幾つかの
神経冠細胞が同定されているが、そのうちの幾つかは多分化能を有しており拘束
されていない（uncommitted）神経冠細胞を代表し、その他は一種類のみの細胞
を産生する拘束された（comiitted）幹細胞を代表する。本発明の方法において
、そのような幹細胞の培養に用いられるヘッジホッグアンタゴニストの役割とし
ては、拘束されていない幹細胞の分化の調節；又は拘束された幹細胞の、神経細
胞になる最終的分化へ向かう発達の更なる制限の調節が挙げられる。例えば、本
発明の方法をイン・ビトロで用いて、神経冠細胞のグリア細胞、シュワン細胞、
クロム親和性細胞、コリン作動性交感ニューロン又は副交感ニューロン、並びに
ペプチド作動性及びセロトニン作動性ニューロンへの分化を調節することができ
る。ヘッジホッグアンタゴニストは単独で用いることもできるし、神経幹細胞の
特定の分化をさらに促進する他の神経向性因子と組み合わせて用いることもでき
る。

【０１６８】 本発明の主題のヘッジホッグアンタゴニストの存在下で培養した細胞の移植に
加えて、本発明のさらに他の特徴は、ヘッジホッグアンタゴニストを適用して、
中枢神経系と末梢神経系両方のニューロン及び他のニューロン細胞の成長状態を
調節することに関する。ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが、神経系発達
中と、おそらくは成人期にニューロンの分化を調節する能力を有する。このこと
は、主題のヘッジホッグアンタゴニストがある場合において、正常細胞の保持、
機能遂行及び老化；化学的又は機械的に損傷を受けた細胞の修復及び再生；及び
ある種の病理学上の条件下での変質の治療に関して、成人ニューロンを制御する
であろうことを示している。これに鑑みて、本発明は特に主題の方法を下記に由
来する神経系状態の治療プロトコル（予防及び／又は病状の低減）に適用するこ
とを企図する。（ｉ）外傷、化学的損傷、血管損傷及び欠陥（例えば脳卒中によ
る虚血）、感染性／炎症性及び腫瘍性損傷などの神経系の急性、亜急性、又は慢
性の損傷；（ｉｉ）アルツハイマー病などの神経系の老化；（ｉｉｉ）パーキン
ソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性などの慢性神
経変性疾患；及び（ｉｖ）多発性硬化症などの、神経系の又は神経系に影響を与
える慢性免疫疾患。

【０１６９】 適正に行えば、主題の方法を用いて中枢及び末梢神経損傷を修復する、人工神
経を作成することができる。特に、潰れた又は切断された軸索に、人工器具を用
いて管を取り付ける場合には、人工器具にヘッジホッグアンタゴニストを添加し
て、成長速度及び樹状突起の再生を調節することができる。神経導入経路の例は
、米国特許第５，０９２，８７１号及び第４，９５５，８９２号に記載がある。

【０１７０】 他の態様においては、主題の方法を（例えば中枢神経系において起こる）悪性
又は過形成性形質転換の治療に用いることができる。例えば、ヘッジホッグアン
タゴニストを用いて、そのような形質転換細胞を分裂終了又は自死状態にするこ
とができる。従って本発明の方法は、例えば悪性神経膠腫、髄膜腫、髄芽細胞腫
、神経外胚葉腫及び脳室上皮腫の治療の一部に用いることができる。

【０１７１】 好ましい態様においては、主題の方法を、悪性髄芽細胞腫及び他の一次ＣＮＳ
悪性神経外胚葉腫の治療養生法の一部として用いることができる。

【０１７２】 ある態様においては、主題の方法を髄芽細胞腫の治療プログラムの一部として
用いることができる。一次脳腫瘍である髄芽細胞腫は、子供にみられる最も一般
的な脳腫瘍である。髄芽細胞腫は後窩に発生する初期神経外胚葉腫（ＰＮＥＴ）
である。これは小児脳腫瘍の原因の約２５％を占めている（Miller）。髄芽細胞
腫は組織構造的には、一般にロゼット状に配置された小型の丸い細胞腫であるが
、いくつかは星状細胞、上衣細胞又はニューロンに分化する（Rorke；Kleihues
）。ＰＮＥＴは松果体（松果体芽細胞腫）及び大脳を含む脳の他の領域に起こり
うる。テント上方領域に起こるこれらは、一般にＰＦ同等物より病状が重い。

【０１７３】 髄芽細胞腫／ＰＮＥＴは切除術の後ＣＮＳのどこにでも再発し、骨にまで移転
することが知られる。従って前処理評価において、「脱落（dropped）移転」の
可能性を除外するための脊髄の検査が行われる。このため一般に、脊髄造影法の
代わりにガドリニウム促進ＭＲＩが行われており、術後の日常操作としてＣＳＦ
細胞診断が得られる。

【０１７４】 他の態様においては、主題の方法が脳室上皮腫の治療プログラムの一部として
用いられる。脳室上皮腫は、小児脳腫瘍の原因の約１０％を占めている。概して
、脳室上皮腫は脳室の上衣ライニングに起こる腫瘍であり、顕微鏡的な大きさの
ロゼット、カナル及び血管周囲のロゼットを形成する。脳室上皮腫について報告
された５１人の小児のＣＨＯＰにおいて、３／４が組織構造上は良性であった。
約２／３が第４の脳室に由来した。１／３がテント上方領域に存在した。ＳＥＥ
Ｒのデータ及びＣＨＯＰのデータが示すように、０歳から４歳の間にそれらがピ
ークに達した。中央値の年齢は５歳であった。この疾病を有する小児の多くが乳
児なので、多様な治療法が必要とされる。

【０１７５】 本発明のさらに他の特徴は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及び／又はスムースンドが
、上記した神経分化に加えて、他の脊椎動物有機物質経路に関与する形態発生シ
グナルに関与し、内胚葉のパターン形成、中胚葉及び内胚葉の分化過程に明らか
に役割を果たしているという観察に関する。従って本発明は、ヘッジホッグアン
タゴニストを包含する組成物を、非神経組織の産生及び保持に関わる細胞培養及
び治療法の両方に用いることを企図する。

【０１７６】 一つの態様において、本発明はｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが、原
腸に由来する消化管、肝臓、肺及び他の臓器の形成に関与する幹細胞の発達の制
御に明らかに関与しているという発見を利用するものである。Ｓｈｈは内胚葉か
ら中胚葉への誘導シグナルとして提供されるが、これは腸管形態形成に非常に重
要である。従って、例えば本発明の方法のヘッジホッグアンタゴニストを用いて
、正常な肝臓の複数の代謝機能を有する人工肝臓の発達及び維持を調節すること
ができる。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、消化管幹細胞の増殖
及び分化を調節し、肝細胞培養を形成して、細胞外基質を稠密にさせるのに用い
るかあるいは生体適合性重合体に封入して移植可能及び体外人工肝臓を形成する
ことができる。

【０１７７】 他の態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストの治療組成物を、人工肝臓
、胎芽肝臓構造などの移植とともに用いて、腹腔内移植、血管新生及び生体内分
化の取り込み並びに移植された肝臓組織の維持を調節することができる。

【０１７８】 さらに他の態様においては、主題の方法を治療に用いて、物理的、化学的又は
病理学的損傷を受けた後の上記のような臓器を調節することができる。例えば、
ヘッジホッグアンタゴニストを包含する治療用組成物を、肝切除術に次ぐ肝臓修
復に用いることができる。

【０１７９】 胎芽の腸管からの膵臓及び小腸の形成は、腸管の内胚葉細胞と中胚葉細胞との
間の細胞間シグナリングに依存している。特に、腸の中胚葉の平滑筋への分化は
、隣接する内胚葉細胞からのシグナルに依存することが示唆されている。胎芽の
後腸における内胚葉に由来するシグナル媒介物の候補の一つとして、Sonicヘッ
ジホッグがある（例えばApelqvist他（１９９７）Curr Biol７：８０１−４参照
）。Ｓｈｈ遺伝子は胎芽の腸管内胚葉に渡って発現されるが、これには例外があ
って、膵臓芽内胚葉では、膵臓発達初期の必須レギュレーターであるホメオドメ
インタンパク質Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１ （インシュリンプロモーター因子１／膵臓
及び十二指腸ホメオボックス１）が高レベルで発現される。Apelqvist他（上述
）では、胎芽の腸管におけるＳｈｈの差異発現が、取り巻く中胚葉から小腸及び
膵臓といった特異な中胚葉誘導体への分化を制御するかどうかを研究している。
該文献ではこれを調べるために、Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターを用
いて、発達中の膵臓上皮におけるＳｈｈを選択的に発現している。Ｉｐｆ１／Ｐ
ｄｘ１−Ｓｈｈトランスジェニックマウスにおいて、膵臓中胚葉は膵臓間充織及
び脾臓へ分化せず、平滑筋及び腸管カハル細胞（腸管に特徴的な細胞）に発達し
た。さらに、Ｓｈｈに接触させた膵臓外植は、同様の腸管分化を経た。これらの
結果は、内胚葉に由来するＳｈｈの差異発現が、腸管の異なる領域における隣接
する中胚葉の分化を制御することを意味している。

【０１８０】 従って本発明の文脈では、主題のヘッジホッグアンタゴニストを用いて、イン
・ビボ及びイン・ビトロの両方において膵臓組織の増殖及び／又は分化を制御又
は調節することを企図する。

【０１８１】 本発明の阻害剤が治療効果をもたらす、様々な病理学上の細胞増殖及び分化条
件がある。例えば異常なインシュリン発現の修正、又は分化の調節などが挙げら
れる。しかしより一般的には、本発明は、膵臓細胞を主題の阻害剤に接触させる
ことによって、細胞の分化状態を誘導及び／又は維持し、生存を強化し及び／又
は増殖へ影響を与える方法に関する。例えば、膵臓組織の秩序だった空間的配置
形成にｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが明らかに関与していることから
、イン・ビトロ及びイン・ビボの両方でそのような組織を産生及び／又は維持す
る方法の一部として主題の方法を用いることが本発明によって企図される。例え
ば、ヘッジホッグの機能の調節は、細胞及びおそらくは非膵臓組織の産生及び維
持に関与する、細胞培養及び治療法の両方に（例えば原腸に由来する消化管、脾
臓、肺、泌尿生殖器(例えば、膀胱)及び他の臓器からの組織の発達及び維持の制
御に）用いることができる。

【０１８２】 例証的な態様においては、本発明の方法を、特に膵臓細胞の異常な増殖によっ
て特徴づけられる、膵臓組織の過形成性及び腫瘍性疾患の治療に用いることがで
きる。例えば膵臓癌は、膵臓のインシュリン分泌量に調節をきたす、膵臓細胞の
異常な増殖によって特徴付けられる。例えば膵癌などのある種の膵臓過形成は、
β細胞の機能不全又は島細胞重量の減少によって、低インシュリン血症を引き起
こす。病状の進行において異常なｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドシグナ
リングが示される程度まで、主題のインヒビターを用いて抗腫瘍治療の後の組織
再生を促進することができる。

【０１８３】 その上さらに、異なる点でヘッジホッグシグナリング特性を操作することは、
イン・ビボ及びイン・ビトロの両方における膵臓組織復元／再生技術の一部とし
て有用である。一つの態様においては本発明は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスム
ースンドが膵臓組織の発達の調節に関与していることを利用する。一般に、主題
の方法を治療的に用いて、物理的、化学的又は病理的傷害の後に膵臓を調節する
ことができる。さらに他の態様において、主題の方法を細胞培養技術に適用する
ことができ、特に人工膵臓組織の初期形成の促進に用いることができる。例えば
ヘッジホッグ活性を変化させることによる膵臓組織の増殖及び分化の操作は、培
養組織の特徴をより注意深く制御する手段を提供する。例証的な態様においては
、主題の方法を用いて、例えば下記に記載のある封入装置に用いることのできる
、β島細胞を必要とする人工器官の産生を増加させることができる（Aebischer
他、米国特許第４，８９２，５３８号、Aebischer他、米国特許第５，１０６，
６２７号、Lim、米国特許第４，３９１，９０９号、及びSefton、米国特許第４
，３５３，８８８号）。膵島の初期幹細胞は多分化能を有し、最初に出現したと
きから、全ての島細胞特異的遺伝子を共活性化するのは明らかである。分化が進
むにつれて、島細胞特異的ホルモン（例えばインシュリン）の発現は、成熟島細
胞に特徴的な発現パターンに制限される。しかし、成熟β細胞における胎芽の特
徴の再発が観察できるようになると、成熟島細胞の表現型は培養中では安定しな
い。主題のヘッジホッグアンタゴニストを利用することによって、細胞の分化経
路又は増殖率を調節することができる。

【０１８４】 さらに、膵臓組織の分化状態の操作を、人工膵臓の移植と組み合わせて利用し
て、移植、血管新生及び生体内分化、並びに移植された組織の維持を促進するこ
とができる。例えば、組織分化に影響するヘッジホッグ機能の操作を、移植片の
生存能力を維持する手段として利用することができる。 Bellusci他（１９９７）Development１２４：５３には、Sonicヘッジホッグが
肺間充織細胞増殖をイン・ビボで調節することが報告されている。従って、本発
明の方法を用いて、（例えば肺気腫の治療における）肺組織の再生を調節するこ
とができる。

【０１８５】 Fujita他（１９９７）Biochein Biophys Res Commun２３８：６５８には、Son
icヘッジホッグがヒト肺扁平上皮癌及び腺癌において発現することが報告されて
いる。Sonicヘッジホッグの発現は、ヒト肺扁平上皮癌組織において検出された
が、同じ患者の正常な肺組織においては検出されなかった。上記文献は、Sonic
ヘッジホッグがＢｒｄＵの癌細胞への取り込みを刺激し、細胞成長を刺激する一
方で、抗Ｓｈｈ−Ｎが細胞成長を阻害することも報告している。これらの結果は
、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及び／又はスムースンドが、そのように形質転換した肺
組織の細胞成長に関与していることを示唆し、従って主題の方法を、肺癌及び腺
癌、並びに肺上皮に関する増殖疾患の治療の一部として用いることができること
を示している。

【０１８６】 これらの腫瘍にヘッジホッグ経路が関与していること、又は発達の際にこれら
の組織中にヘッジホッグ及びその受容体の発現が検出されることに鑑みて、主題
の化合物による処置によって、他の多くの腫瘍に影響を与えうる。そのような腫
瘍の例としては、ゴーリン症候群に関する腫瘍（例えば基底細胞癌、髄芽細胞腫
、髄膜腫など）、ｐｃｔノックアウトマウスにみられる腫瘍（例えば血管腫、横
紋筋肉腫など）、ｇｌｉ−１増幅の結果起こる腫瘍（例えば神経グリア芽細胞腫
、肉腫など）、ＴＲＣ８、ｐｔｃ相同体に連結した腫瘍（例えば腎臓癌、甲状腺
癌など）、Ｅｘｔ−１関連腫瘍（例えば骨癌など）、Ｓｈｈ誘導腫瘍（例えば肺
癌、軟骨肉腫など）及び他の腫瘍（例えば乳癌、尿生殖器（例えば腎臓、膀胱、
尿管、前立腺など）癌、副腎癌、胃腸（例えば胃、腸など）癌など）が挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。

【０１８７】 本発明の更に他の態様において、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する組成
物を用いて、例えば骨格形成性幹細胞から骨格組織をイン・ビトロで産生するこ
と、並びにイン・ビボで骨格組織欠陥を治療することができる。本発明は特に、
ヘッジホッグアンタゴニストを用いて軟骨形成軟骨形成及び／又は骨形成の速度
を調節することを企図する。ここでいう「骨格組織欠陥」とは、欠陥がどのよう
な由来（例えば外科手術的介入、腫瘍の除去、潰瘍形成、移植、骨折又は他の外
傷あるいは変性状態）であれ、骨又は結合組織の回復が望まれる場所における、
骨又は他の骨格結合組織の欠陥のことをいう。

【０１８８】 例えば本発明の方法を、結合組織の軟骨機能の回復を目的とする養生法の一部
として用いることができる。そのような方法は、例えば変性摩耗（関節炎など）
、並びに組織の外傷（摩耗した半月板組織の置き換え、半月板切除、靱帯の摩耗
による関節の緩み、関節の悪性腫瘍、骨折などの組織の外傷により生じる、又は
遺伝病により生じうるもの）などの他の機械的傷害の結果起こる、軟骨組織にお
ける欠陥又は損傷の回復において有用である。本発明の修復方法は、成形外科、
再建術及び歯周手術などの、軟骨基質の再構成に有用である。本発明の方法は、
半月板、靱帯又は軟骨の手術による修復に続く、前修復段階の改善に適用するこ
とができる。その上更に、本発明の方法は、外傷を受けた後の早い時期に適用さ
れた場合には、変性疾患の発症又は病状再燃を防ぎうる。

【０１８９】 本発明の一つの態様において、主題の方法は、治療上十分な量のヘッジホッグ
アンタゴニスト(特に、インディアンヘッジホッグシグナル変換に対して選択的
なアンタゴニスト)によって疾患のある結合組織を処置し、組織の有する軟骨細
胞の分化及び／又は増殖速度を操作することによって、結合組織における軟骨修
復応答を調節することを包含する。関節軟骨、関節間軟骨（半月板）、肋軟骨（
真肋と胸骨を連結する）、靱帯及び腱などの結合組織は、主題の方法を用いる再
建及び／又は再生治療における処置に特に敏感に反応する。ここで言う「再生治
療」には、組織の欠陥が明らかに現れる点まで進行した変性状態の治療、変性が
初期段階又は切迫した状態である組織の予防治療が含まれる。

【０１９０】 例証的な態様において、主題の方法を、膝、足首、肘、臀部、手首、手又は足
の指関節、又は上顎関節などの可動関節の軟骨の治療における治療的介入の一部
として用いることができる。治療は関節の半月板、関節軟骨、又はその両方を対
象とすることができる。更に例証すると、主題の方法は外傷（例えばスポーツに
よる傷害又は過度の摩耗）又は変性関節炎の結果起こりうる膝の変性疾患の治療
に用いることができる。主題のアンタゴニストは、例えば関節鏡検査針を用いて
、関節に注射して投与してもよい。ある場合には投与される薬剤は、薬剤と治療
組織との接触を延長させ定常的なものとするために、ヒドロゲル又は上記した他
の緩効性賦形剤の形状をとることができる。

【０１９１】 本発明は、軟骨移植及び人工器官治療の分野において主題の方法を使用するこ
とを更に企図する。しかし、例えば軟骨と繊維軟骨の特性は組織によって（例え
ば関節、半月板軟骨、靱帯及び腱の間で；同じ靱帯又は腱の両端の間で；そして
同じ組織の表面部と深淵部との間で）異なるので、問題が生じる。これらの組織
の空間的配置は、機械的特性上の緩やかな変化を反映しうるので、これらの条件
下にある未分化の移植組織が、適当に応答する能力を有していない場合には、機
能不全が起こる。例えば、半月板軟骨が前十字靱帯の修復に用いられる場合、組
織に化生が起こり純粋な繊維組織になる。軟骨形成の速度を調節することによっ
て、新しい環境に移植細胞を適合させ、組織の初期発達段階の肥大軟骨細胞に類
似させるように制御して、主題の方法を特にこの問題を対処するように用いるこ
とができる。

【０１９２】 同様に、主題の方法を適用して、人工軟骨の作成及び移植の両方を促進するこ
とができる。改善された治療法が必要とされているため、コラーゲン−グリコサ
ミノゲン鋳型［Stone他（１９９０）Clin Orthop Relat Red２５２：１２９］、
単離軟骨細胞［Grande他（１９８９）J Orthop Res７：２０８；及びTakigawa他
（１９８７）Bone Miner２：４４９］及び天然又は合成重合体に連結した軟骨細
胞［Walitani他（１９８９）J Bone Jt Surg７１Ｂ：７４；Vacanti他（１９９
１）Plast Reconstr Surg８８：７５３；von Schroeder他（１９９１）JBiomed
Mater Res２５：３２９；Freed他（１９９３）J Biomed Mater Res２７：１１；
及びVacanti他、米国特許第５，０４１，１３８号］に基づいて、新たな軟骨の
作成を目的に研究がされてきた。例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロ
ースなどの重合体、あるいは重合体主鎖の加水分解機能で長期にわたって無害の
モノマーに分解される他の重合体から形成される、生分解性及び生体適合性を有
する多孔質の骨格上の培養基で、軟骨細胞を育成することができる。基質は、移
植までに、細胞の適当な栄養供給とガス交換が可能なように設計されている。細
胞は、移植する細胞の体積及び密度が適当に大きくなるまでイン・ビトロで培養
することができる。基質を用いると、個々が望ましい形状に型どりでき、最終産
物を患者自身の例えば耳又は鼻に似せることができるという利点がある。あるい
は柔軟な基質を用いて、例えば関節に移植する際に整復することができる。

【０１９３】 主題の方法の一つの態様においては、培養工程のある段階において、移植組織
片をヘッジホッグアンタゴニストに接触させて、軟骨細胞の分化の速度及び培養
内の肥大軟骨細胞の形成を制御する。

【０１９４】 他の態様においては、移植された人工組織をヘッジホッグアンタゴニストで処
置して、移植された基質を能動的に形作って意図する機能に好適なものとする。
組織移植に関して上記したように、人工移植には、移植された実際の機械的環境
との比較が可能な環境に基質が由来するものではないという、同じ欠点がある。
主題の方法の有する、基質において軟骨細胞を調節する能力によって、置換され
る予定の組織と同様の特徴を移植片が獲得できるようになる。

【０１９５】 更に他の態様において、主題の方法は、人工器官の付着を促進するのに用いら
れる。例えば主題の方法を、人工歯周器官の移植に用いることができる。ここで
は周辺の結合組織を処置することによって、人工器官を取り巻く歯周靱帯の形成
が刺激される。

【０１９６】 更に他の態様においては、主題の方法を、動物の骨格組織の欠陥部位における
骨形成を目的とした養生法の一部として用いることができる。Indianヘッジホッ
グは、最終的に骨芽細胞に置換される肥大軟骨細胞に特に関連している。例えば
被験者の骨損失を調節する方法の一部として、本発明のヘッジホッグアンタゴニ
ストを投与することができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを包含する調
製物を用いて、例えば骨化の「モデル」形成における軟骨内骨化を制御すること
ができる。

【０１９７】 本発明の更に他の態様において、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて精子形
成を調節することができる。ヘッジホッグタンパク質、特にＤｈｈは、精巣生殖
細胞の分化及び／又は増殖及び維持に関連していることが示されている。Ｄｈｈ
の発現は、Ｓｒｙ（精巣決定遺伝子）活性化の直後にセルトリ細胞前駆体におい
て誘導され、成人の精巣においても持続する。成熟精子が全く存在しないので、
男性は生存可能であるが不妊である。様々な遺伝子背景において発達中の精巣を
検査したところ、Ｄｈｈは精子形成の初期段階及び後期段階の両方を調節するこ
とが示唆された［Bitgood他（１９９６）Curr Biol６：２９８］。好ましい態様
においては、ヘッジホッグアンタゴニストを避妊薬として用いることができる。
同様に、主題の方法のヘッジホッグアンタゴニストは、正常な卵巣機能の調節に
有用である可能性がある。

【０１９８】 主題の方法は、上皮組織に起こる疾患の予防処置、化粧などに幅広く適用する
ことができる。一般にこの方法は、処置を行った上皮組織の成長状態が変化する
のに有効な量のヘッジホッグアンタゴニストを、動物に投与する段階を含むこと
を特徴とする。投与の方法及び用量計画は、処置される上皮組織に応じて異なる
。例えば、処置される組織が表皮組織（皮膚組織又は粘膜組織）である場合には
、局所的な投与が好ましい。

【０１９９】 「傷の治癒を促進する」方法で処置を行った場合には、この処置を用いない場
合の傷の治癒と比較して、より速く傷が治癒する。「傷の治癒の促進」とは、と
りわけケラチン合成細胞の増殖及び／又は成長を調節する方法、又はより少ない
傷跡、より少ない傷収縮、より少ないコラーゲン付着及びより表層でおこるの傷
の治癒を意味する。ある場合においては、「傷の治癒の促進」とは、本発明の方
法を用いたときに、ある種の傷治癒の方法が改善された継代速度（例えば皮膚移
植の生着速度）を有することも意味する。

【０２００】 現在まで再建術に有意な進歩があったにもかかわらず、治癒される皮膚の正常
機能及び外観の回復において、傷跡は重大な障害になりうる。これは、手や顔の
ケロイド又は肥大性傷跡などの病理的傷跡が機能障害及び肉体的変形の原因とな
っている場合に特にあてはまる。最も厳しい状況においては、そのような傷跡は
心理的な悩みを引き起こし、経済的な負担にもなる。傷の回復は、止血作用、炎
症、増殖及び再形成の段階を含む。増殖段階は、繊維芽細胞並びに内皮及び上皮
細胞の増加を含む。傷の閉鎖を促進する及び／又は瘢痕組織の形成を最小化する
ために、主題の方法の使用を通じて、傷内及び周辺の上皮細胞の増殖速度を制御
することができる。

【０２０１】 本発明の処置は、例えば放射線療法及び／又は化学療法の結果起こる口内炎及
び口腔傍炎の治療を目的とした、治療養生法の一部として有効である。そのよう
な潰瘍は一般に化学療法又は放射線療法の後、数日以内に発達する。一般に、こ
れらの潰瘍は始めには、灰色の壊死性膜によって覆われ炎症組織によって囲まれ
る、痛みを伴う、小さな不定形の傷である。多くの場合、処置を施さないでいる
と、炎症基部上の傷周辺の組織が増殖する。例えば、潰瘍の周縁にある上皮組織
が増殖活性を示し、その結果表面上皮組織の連続性が失われる。傷が大きくなり
上皮組織の保全性が失われるので、二次感染を起こす可能性がある。食物及び水
を摂取する度に痛みを感じ、潰瘍が消化管を通じて増殖した場合には、様々な要
因が加わり下痢が起こる。本発明によると、ヘッジホッグアンタゴニストを適用
してそのような潰瘍を処置することによって、患部上皮組織の異常な増殖及び分
化を低減することができ、それに続く炎症に伴う苦痛を低減することができる。

【０２０２】 主題の方法及び組成物を用いて、自己免疫疾患に由来する傷（例えば乾癬）な
どの皮膚科学疾患に由来する傷を治療することができる。アトピー性皮膚炎とは
、花粉、食物、鱗屑、昆虫毒及び植物毒などのアレルゲンによって引き起こされ
る免疫応答に関連したアレルギーの結果起こる皮膚の外傷のことをいう。

【０２０３】 他の態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストの抗増殖調製物を用いて、
水晶体上皮細胞増殖を阻害して、嚢外白内障摘出の術後合併症を防ぐことができ
る。白内障は、難治性の眼病であり、白内障の治療について様々な研究がなされ
てきた。現在、白内障の治療は外科手術によって行われている。白内障の外科術
は、長い間用いられており、様々な手術法が研究されてきた。嚢外水晶体摘出が
、白内障除去の手段として用いられている。嚢外摘出に用いるこの方法には、無
水晶体類嚢胞黄斑浮腫及び網膜剥離が起こりにくいという医療上の利点がある。
嚢外摘出は、後眼房型眼内水晶体（ほとんどの場合に用いられるべき水晶体と考
えられている）の移植に必要である。

【０２０４】 しかし嚢外白内障摘出には、後水晶体嚢の不透明化（後白内障と称される）が
起こりやすいという欠点がある。この不透明化は術後３年以内に５０％までの確
立で起こる。後白内障は、嚢外水晶体摘出の後に残る、赤道及び後嚢水晶体上皮
細胞の増殖によって起こる。これらの細胞は増殖してゾンマーリング（Sommerli
ng）環を形成し、同じく後嚢に蓄積する繊維芽細胞とともに後嚢の不透明化を起
こして、視界を妨げる。後白内障を予防する処置をとることが好ましい。二次白
内障形成を阻害するために、主題の方法は、残った水晶体上皮細胞の増殖を阻害
する手段を提供する。例えば水晶体除去の後に、後眼房にヘッジホッグアンタゴ
ニストの調製物を含む溶液を点眼することによって、そのような細胞を静止状態
に保つことができる。更に、溶液の浸透圧のバランスを保つことによって、後眼
房内に適用したときに効果的な投与量を最小限にすることができ、嚢下上皮の成
長をある特異性で阻害することができる。

【０２０５】 主題の方法を、角膜上皮細胞の増殖に特徴付けられる角膜疾患（例えば上皮の
下方成長、眼表面の扁平上皮細胞癌といった眼の上皮の疾患）治療に用いること
もできる。

【０２０６】 Levine他［（１９９７）J Neurosci１７：６２７７］は、ヘッジホッグタンパ
ク質が脊椎動物網膜における有糸分裂及び光受容体分化を調節し、Ｉｈｈが、網
膜幹細胞の増殖及び光受容器の分化を促進しうる色素上皮からの要素であること
を示している。同様に、Jensen他［（１９９７）Development１２４：３６３］
は、周生期のマウス網膜細胞の培養を、Sonicヘッジホッグのアミノ末端断片で
処置すると、ブロモデオキシウリジンを取り込む細胞の割合が、全細胞、桿体光
受容体、無軸索細胞、ミュラー神経膠細胞において増加することを示している。
このことは、Sonicヘッジホッグが網膜前駆体細胞の増殖を促進することを示唆
している。従って、本発明の方法を、網膜細胞の増殖疾患の治療に用いて、光受
容体分化を調節することができる。

【０２０７】 本発明の更に他の特徴は、毛の成長の制御に主題の方法を使用することに関す
る。毛は基本的には強靱で不溶性の蛋白質ケラチンから構成される。強度はシス
チンのジスルフィド結合に由来する。各毛は、円筒状の毛幹及び毛根を包含し、
皮膚にフラスコ状の陥没部である毛嚢を有する。毛嚢の底部には、毛乳頭と呼ば
れる指のような突起物がある。この毛乳頭を構成する結合組織から毛が成長し、
結合組織を通じて血管が細胞に栄養を供給する。毛幹は皮膚表面から外部に突き
出た部分であり、一方毛根とは埋没した毛の部分である。毛根の基部は毛球内で
伸張し、毛乳頭上に収まっている。毛を産生する細胞は、毛嚢の毛球内で成長す
る。細胞が毛嚢内で増殖するにつれて、細胞は繊維の形で押し出される。毛の「
成長」とは、分裂する細胞によって毛繊維が形成され伸張することをいう。

【０２０８】 当分野で知られるように、一般的な毛周期は、発育期、休止期、終止期の３つ
の段階に分けられる。活性期（発育期）の間、皮膚毛乳頭の表皮幹細胞は急速に
分裂する。娘細胞は上方に移動し、分化して円錐状の層を形成する。移行期（休
止期）は、毛嚢における幹細胞の有糸分裂の休止を特徴とする。停止段階は終止
期として知られる。ここでは毛は頭皮内に数週間保持され、その下に現れる新し
い毛が、終止期の毛幹を毛嚢から押し出す。このモデルから明なのは、毛細胞に
分化する、分裂幹細胞の集まりが大きいほど、毛の成長が起こりやすいというこ
とである。従って、これらの幹細胞の増殖を助長する又は阻害することによって
、毛の成長をそれぞれ増加又は低減する方法が得られる。

【０２０９】 ある態様においては、切断、剃毛又は脱毛などの従来の除去方法の代わりに、
主題の方法をヒトの毛の成長を押さえる方法として用いることができる。例えば
、本発明の方法を、異常に速い又は濃い毛の成長に特徴付けられる毛髪病（例え
ば多毛症）の治療に用いることができる。例証的な態様においては、ヘッジホッ
グアンタゴニストを用いて、異常な発毛に特徴付けられる、女性の多毛症を制御
することができる。主題の方法は、脱毛期間を延長する工程を提供することもで
きる。

【０２１０】 その上更に、ヘッジホッグアンタゴニストは、上皮細胞に細胞毒を与えるので
はなく細胞分裂を停止するので、化合物は、効能を得るために細胞周期のＳ期へ
の進行を必要とする細胞毒剤（例えば放射線誘導死）から毛嚢細胞を保護するこ
とができる。主題の方法による処置を行うことで、毛嚢細胞を休止させることに
よって（例えば細胞がＳ期に入るのを阻害し、従って毛嚢細胞の有糸分裂不能と
プログラム細胞死を防ぐことによって）細胞を保護することができる。例えばヘ
ッジホッグアンタゴニストを、通常は毛喪失が起こってしまう化学療法又は放射
線療法を受けている患者に用いることができる。そのような療法の間に主題の処
置を用いて、通常はプログラム細胞死に結びつく細胞周期の進行を阻害すること
によって、毛嚢細胞死を防ぐことができる。療法の終了後、毛嚢細胞増殖の阻害
の停止と同時に、本発明の処置を停止することができる。

【０２１１】 主題の方法は、脱毛性毛嚢炎、網状瘢痕性紅斑毛嚢炎又はケロイド毛嚢炎など
の毛嚢炎の治療に用いることができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを
化粧に調製したものを局所的に適用して、擬毛嚢炎を治療することができる。こ
の毛嚢炎は、首の下顎領域における、髭剃りに関連して最もよく起こる慢性的疾
患であり、紅斑性の丘疹及び毛が埋没した膿疱に特徴付けられる。

【０２１２】 本発明の他の特徴において、主題の方法を、上皮に由来する組織の分化を促進
する及び／又は増殖を阻害するのに用いることができる。これら分子のそのよう
な形態は、上皮組織に関する過形成性及び／又は腫瘍性状態を処置するための分
化治療の基礎を提供することができる。例えばそのような調製物を、皮膚細胞の
異常な増殖及び成長が起こる皮膚疾患の処置に用いることができる。

【０２１３】 例えば本発明の薬学的調製物は、角化症などの過形成性の表皮状態の処置、並
びに様々な皮膚癌（扁平上皮細胞癌など）の高増殖率に特徴付けられる腫瘍性の
表皮状態の処置に用いることを企図する。主題の方法は、皮膚に影響を与える自
己免疫疾患、特に（乾癬又はアトピー性皮膚炎によって起こる）病的な増殖及び
／又は表皮のケラチン化を含む、皮膚科学疾患の処置に用いることができる。

【０２１４】 乾癬、扁平上皮細胞癌、角化棘細胞腫及び光線性角化症などの多くの一般的な
皮膚疾患は、局所的な異常増殖及び成長によって特徴付けられる。例えば皮膚上
の落屑性の赤い隆起したプラークによって特徴付けられる乾癬においては、正常
な細胞に比較してケラチン合成細胞が非常に速く増殖し、ほとんど分化しないこ
とが知られている。

【０２１５】 一つの態様において、本発明の調製物は、炎症又は非炎症要素のいずれかによ
って特徴付けられる、異常な皮膚細胞の増殖を起こすケラチン化疾患に関連した
皮膚科学的疾患の処置に好適である。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの治
療用調製物（例えば休止又は分化を促進する）を、皮膚、粘膜又は爪などの様々
な形態の乾癬の治療に用いることができる。上記したように、乾癬は一般に、「
再生」経路に沿った増殖活性及び分化を示す表皮ケラチン合成細胞によって特徴
付けられる。主題の方法の、抗増殖的な態様を用いた処置は、異常な表皮活性化
を反転させるのに用いることができ、疾患の軽減の維持を提供することができる
。

【０２１６】 他の様々な角化症損傷も、主題の方法を用いた治療の対象となりうる。例えば
光線性角化症は、日光にさらされた及び光線照射を受けた皮膚に起こる表面炎症
性前癌性腫瘍である。傷は、紅斑から茶色まで様々なものにわたる。現在行われ
ている治療には、切除術及び冷凍外科手術がある。しかしこれらの処置は苦痛を
伴い、しばしば化粧に不適格な傷跡を生じる。従って、光線性角化症といった角
化症の処置として、損傷の表皮／類表皮腫細胞の過増殖を阻害するのに十分な量
の、ヘッジホッグアンタゴニスト組成物を好ましくは局所的に適用することが挙
げられる。

【０２１７】 座瘡は、主題の方法によって処置されうる、別の皮膚科学的疾患である。例え
ば尋常性座瘡は、十代の若者及び成人初期において最もよく見られる多因性の疾
患であり、顔及び胴体上部にみられる、炎症及び非炎症性損傷として特徴付けら
れる。尋常性座瘡を起こす元になる欠陥は、活動過多な皮脂腺管の過角質化であ
る。過角質化は、皮膚及び毛嚢微生物の正常な移動を妨げ、それによってバクテ
リアPropinobacterium acnes、Staphylococcus epidermidis及び酵母菌Pitrospo
rum ovaleによるリパーゼの放出が刺激される。抗増殖的なヘッジホッグアンタ
ゴニスト、好ましくは局所用調製物で処置することが、損傷形成に結びつく管の
変化（例えば過角質化）を防ぐのに有用であろう。主題の処置は、例えば抗生物
質、レチノイド及び抗アンドロゲンをさらに含んでいてもよい。

【０２１８】 本発明は又、様々な形態の皮膚炎を治療する方法を提供する。皮膚炎とは、掻
痒性、紅斑性、落屑性、疱疹性、湿潤性、亀裂性又は痂皮性の損傷を漠然と画定
する用語である。これらの損傷は、様々な理由で起こる。最も一般的な皮膚炎は
アトピー性、接触性及びおむつ皮膚炎である。脂漏性皮膚炎は慢性で通常は掻痒
性の、紅斑、乾燥、湿潤又は脂様の鱗片を伴う皮膚炎で、乾燥鱗片の過度な量の
剥離を伴う、様々な領域（特に頭皮）における黄色の痂皮性斑点である。主題の
方法は、しばしば慢性であり通常は湿疹性皮膚炎である、鬱血性皮膚炎の処置に
用いることができる。光線性皮膚炎は、太陽光線、紫外線、Ｘ又はγ放射線など
の光線放射にさらされた結果起こる皮膚炎である。本発明によると、主題の方法
を、上皮細胞の望まれない増殖によって起こる皮膚炎の、ある種の症状を処置及
び／又は予防するのに用いることができる。様々な皮膚炎の形態に対するこうし
た治療法は、局所的及び全身性投与のコルチコステロイド、止痒剤及び抗生物質
をさらに含むことができる。

【０２１９】 例えば、主題の方法を用いて、血管形成を阻止することができるであろうとい
うことが予想される。ヘッジホッグは、血管形成を刺激することが知られている
。ヘッジホッグタンパク質を浸透させてマウスに挿入されたたマトリゲルプラグ
は、実質的な新血管新生を示すが、ヘッジホッグを有しないマトリゲルプラグは
、比較的僅かの血管新生しか示さない。ヘッジホッグタンパク質は又、通常無血
管のマウス角膜の血管新生を増大させることもできる。ｐｔｃ−１遺伝子は、大
動脈の内皮細胞、血管平滑筋細胞、大動脈の動脈血管外膜繊維芽細胞、心房及び
心室の冠状動脈管構造及び心筋細胞を含む正常な血管組織において発現される。
これらの組織も又、ヘッジホッグタンパク質に感受性である。外因性ヘッジホッ
グでの処理は、ｐｔｃ−１発現のアップレギュレーションを引き起こす。加えて
、ヘッジホッグタンパク質は、血管平滑筋細胞の増殖をイン・ビボで刺激する。
ヘッジホッグタンパク質は又、繊維芽細胞に、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ−１
及びＡｎｇ−２などの血管形成成長因子の発現を増大させる。最後に、ヘッジホ
ッグタンパク質は、虚血性の損傷からの回復を刺激すること及び側副血管の形成
を刺激することが知られている。

【０２２０】 ヘッジホッグが血管形成を促進するとすれば、ヘッジホッグアンタゴニストは
、特に、あるレベルのヘッジホッグシグナリングが血管形成に必要である状況に
おいて、血管形成阻害剤として作用することが予想される。

【０２２１】 血管形成は、多くの疾患にとって基本的に重要である。持続性の、無秩序な血
管形成が、ある範囲の病気状態、腫瘍の転移及び内皮細胞の異常増殖において生
じる。血管形成過程の結果として造られた脈管構造は、これらの病気においてみ
られる病的ダメージを支持するものである。無秩序な血管形成により造られた種
々の病的状態は、血管形成依存性又は血管形成関連疾患としてグループにまとめ
られている。血管形成過程の制御に向けられた治療は、これらの疾患の排除又は
緩和へと導くことができた。

【０２２２】 血管形成により引き起こされ、支持され又はそれに関係する疾患には、眼の新
血管新生疾患、加齢関連黄斑変性、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植の
拒絶、新血管新生性緑内障、水晶体後繊維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ
欠乏症、コンタクトレンズ疲労症、アトピー性角膜炎、上輪部角結膜炎、表皮爪
膜乾燥症、シェーグレン酒性座瘡、、梅毒、ミコバクテリア感染症、脂質退行変
性、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹、原
虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁表皮剥離、慢性
関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナー類肉腫症、鞏膜炎
、スティーヴンズ-ジョンソン病、周辺放射角膜切開、角膜移植片拒絶、慢性関
節リウマチ、骨関節症慢性的炎症(例えば、潰瘍性大腸炎又はクローン病)、血管
腫、遺伝性出血性毛細管拡張症及び遺伝性出血性毛細管拡張症が含まれる。

【０２２３】 加えて、血管形成は、癌においても重要な役割を演じている。腫瘍は、栄養を
供給し且つ細胞老廃物を除去する血液の供給なしでは拡大できない。血管形成が
重要である腫瘍には、固形腫瘍例えば横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉
腫、神経芽細胞腫及び骨肉腫、並びに良性腫瘍例えば聴神経腫、神経繊維腫、ト
ラコーマ及び化膿性肉芽腫が含まれる。血管形成因子は、幾つかの固形腫瘍と関
連することが見出されている。血管形成の防止は、これらの腫瘍の成長及び腫瘍
の存在の結果生じる動物のダメージを停止させることができるであろう。血管形
成は又、血液から生じる腫瘍例えば白血病(これは、何れかの骨髄の様々な急性
又は慢性の新生物疾患で、通常、貧血症、血液凝固機能障害及びリンパ節、肝臓
及び脾臓の肥大を伴う)とも関係している。血管形成は、骨髄における白血病様
腫瘍を生じさせる異常において役割を演じているということが考えられる。

【０２２４】 腫瘍の成長に加えて、血管形成は、転移においても重要である。初期において
は、血管形成は、腫瘍の血管新生において重要であり、それは、癌細胞が血流に
入って身体中を循環することを可能にする。腫瘍細胞が原発部位を離れて二次的
な転移部位に定着した後は、新たな腫瘍が成長して拡大しうる前に、血管形成が
起きなければならない。それ故、血管形成の防止は、腫瘍の転移の防止(おそら
く原発部位の新生物成長を含む)に導くことができよう。

【０２２５】 血管形成は又、再生及び傷の治癒などの正常な生理的過程にも関与している。
血管形成は、排卵において(及び受精後の胞胚の着床においても)重要なステップ
である。血管形成の防止は、無月経の誘導、排卵のブロック又は胞胚の着床の防
止に利用することができよう。

【０２２６】 この発明は、呼吸障害症候群又は他の不適当な肺表面張力から生じる疾患の治
療及び／又は予防において有用であろうということが予想される。呼吸障害症候
群は、肺の肺胞における不十分な表面活性物質から生じる。脊椎動物の肺は、肺
の膨張中に表面張力を上昇させ且つ肺の収縮中には減少する脂質とタンパク質の
複雑な混合物である表面活性物質を含んでいる。肺の収縮中、表面活性物質は、
肺胞をつぶす表面力がなくなるように減少する。呼息中つぶれなかった膨らんだ
肺胞は、血液と肺胞ガスの間での連続的な酸素と二酸化炭素の輸送を可能にし、
その後の吸息中に膨張するのにずっと小さい力しか必要としない。膨張中、肺の
表面活性物質は、肺胞表面積が増大するにつれて表面張力を増大させる。膨張中
の肺胞におけるすすぎ表面張力は、それらの空気を含んだ空間における過剰膨張
に対抗し、吸入された空気を十分空気を含んでいない肺胞へそらし、それにより
一様な肺の吸気を促進する傾向がある。

【０２２７】 呼吸障害症候群は、特に、未熟児に多い。肺の表面活性物質は、通常は、胎児
期の最後の６週間まで非常に低速で合成される。正常な妊娠期間より６週間以上
前に生まれたヒトの幼児は、不適当な量の肺表面活性物質及び不適当な表面活性
物質合成速度を有して生まれるリスクが高い。生まれた幼児が未熟であるほど、
表面活性物質欠乏は重症でありそうである。重い表面活性物質欠乏症は、誕生後
数分から数時間以内に呼吸不全を生じうる。この表面活性物質欠乏症は、最大呼
吸努力にもかかわらず、肺の広がる能力の減少の故に、進行性の肺胞崩壊(肺拡
張不全)を生じる。その結果、幼児の血液に到達する酸素の量は不十分となる。
ＲＤＳは、成人においても、典型的には表面活性物質の生合成不全の結果として
生じうる。

【０２２８】 未熟児の肺組織は、ヘッジホッグシグナリング経路の高い活性を示す。この経
路のヘッジホッグアンタゴニストを用いた阻害は、ラメラ体の形成を増大させ且
つ表面活性物質の生合成に関与する遺伝子の発現を増大させる。ラメラ体は、表
面活性物質の生合成に関係する細胞内構造である。これらの理由から、未熟児の
ヘッジホッグアンタゴニストでの処理は、表面活性物質の生合成を刺激してＲＤ
Ｓを改善するはずである。成人のＲＤＳがヘッジホッグ経路の活性化に関係して
いる場合には、ヘッジホッグアンタゴニストでの処理はやはり有効なはずである
。

【０２２９】 ヘッジホッグアンタゴニストの利用は、特に、冒された組織及び／又は細胞が
高いヘッジホッグ経路の活性化を示す病気を標的としうるということが更に予想
される。ｇｌｉ遺伝子の発現は、ヘッジホッグシグナリング経路により活性化さ
れる(ｇｌｉ−１、ｇｌｉ−２及びｇｌｉ−３を含む)。ｇｌｉ−１発現は、最も
首尾一貫して、広範囲の組織及び病気にわたって、ヘッジホッグシグナリング活
性と相関しているが、ｇｌｉ−３は、それ程でない。このｇｌｉ遺伝子は、ヘッ
ジホッグシグナリングの完全な効果を誘出するのに必要な多くの遺伝子の発現を
活性化する転写因子をコードしている。しかしながら、Ｇｌｉ−３転写因子は又
、ヘッジホッグエフェクター遺伝子のリプレッサーとしても作用し得て、それ故
、ｇｌｉ−３の発現は、ヘッジホッグシグナリング経路の減少した効果を引き起
こすことができる。Ｇｌｉ−３が転写アクチベーターとして作用するかリプレッ
サーとして作用するかは、転写後事象に依存しており、それ故、Ｇｌｉ−３タン
パク質の活性化型(抑制型に対して)を検出する方法がヘッジホッグ経路活性化の
信頼できる測定でもあろうということが予想される。ｇｌｉ−２遺伝子発現は、
ヘッジホッグ経路活性化についての信頼できるマーカーを与えることが予想され
る。ｇｌｉ−１遺伝子は、多くの癌において強く発現されており、ヘッジホッグ
経路の相対的な活性化のマーカーとして機能する。加えて、高いｇｌｉ遺伝子発
現を有する未熟な肺などの組織は、ヘッジホッグ阻害剤により強く影響される。
従って、ｇｌｉ遺伝子発現の検出は、ヘッジホッグアンタゴニストでの治療から
特に利益を得るであろう組織及び病気を同定するための強力な予測ツールとして
用いることができるということが予想される。

【０２３０】 好適具体例において、ｇｌｉ−１発現レベルは、転写物の直接的検出により、
又はタンパク質のレベル若しくは活性の検出によって検出される。転写物は、主
としてプローブのｇｌｉ−１転写物又はそれから合成されたｃＤＮＡへのハイブ
リダイゼーションに依存する任意の広範囲の技術を用いて検出することができる
。周知技術には、ノーザンブロッティング、逆転写ＰＣＲ及び転写物レベルのマ
イクロアレイ分析が含まれる。Ｇｌｉタンパク質レベルを検出する方法には、ウ
エスタンブロッティング、免疫沈降、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(
２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)(好ましくは、Ｇｌｉタンパク質の位置が決定されてい
る標準と比較する)、及び質量分析法が含まれる。質量分析法は、一連の精製ス
テップと連結させて、特定の試料中の多くの異なるタンパク質レベルの高スルー
プットの同定を可能にすることができる。質量分析法及び２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅは又、タンパク質分解事象、ユビキチン化、リン酸化、脂質修飾などを含むタ
ンパク質に対する転写後修飾を同定するためにも利用することができる。Ｇｌｉ
活性は又、基質ＤＮＡに対する結合又は標的プロモーターのイン・ビトロ転写活
性化を分析することによっても評価することができる。ゲルシフトアッセイ、Ｄ
ＮＡフットプリンティングアッセイ及びＤＮＡ−タンパク質架橋アッセイは、す
べて、ＤＮＡ上のＧｌｉ結合部位に結合することのできるタンパク質の存在を評
価するために利用することのできる方法である。

【０２３１】 好適具体例において、ｇｌｉ転写物レベルを測定し、異常に高いｇｌｉレベル
を示す病気又は障害のある組織をヘッジホッグアンタゴニストで治療する。未熟
肺組織、肺癌(例えば、腺癌、気管支肺胞腺癌、小細胞癌)、乳癌(例えば、下方
腺管癌、下方小葉癌、管状癌)、前立腺癌(例えば、腺癌)、及び良性前立腺過形
成は、すべて、ある場合において、強く上昇したｇｌｉ−１発現レベルを示す。
従って、ｇｌｉ−１発現レベルは、これらの組織のどれをヘッジホッグアンタゴ
ニストで処理すべきであるかを測定するための強力な診断デバイスである。加え
て、ウロセリアル細胞の癌(例えば、膀胱癌、他の泌尿生殖器癌)がやはりある場
合に上昇したｇｌｉ−１レベルを有するであろうという実質的な相関の形跡があ
る。例えば、染色体９ｑ２２上のヘテロ接合性の喪失が膀胱癌に共通しているこ
とが知られている。このｐｔｃ−１遺伝子は、この位置に位置され、ｐｔｃ−１
機能欠損は、おそらく、他の多くの種類の癌におけるように、増殖過剰の部分的
原因である。従って、かかる癌は又、高いｇｌｉ発現をも示し、特に、ヘッジホ
ッグアンタゴニストでの治療に従順であろう。

【０２３２】 ｐｔｃ−１及びｐｔｃ−２の発現は又、ヘッジホッグシグナリング経路によっ
ても活性化されるが、これらの遺伝子は、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーと
してはｇｌｉ遺伝子に劣る。ある組織においては、ヘッジホッグ経路が高度に活
性であるにもかかわらず、ｐｔｃ−１又はｐｔｃ−２の一方のみが発現される。
例えば、精巣の発生において、インディアンヘッジホッグは重要な役割を演じ、
そのヘッジホッグ経路が活性化されるが、ｐｔｃ−２しか発現されない。従って
、これらの遺伝子は、両遺伝子の同時測定はヘッジホッグアンタゴニストで処理
すべき組織の有用な指標として企図されるが、ヘッジホッグ経路活性化のマーカ
ーとしては個別的には信頼できない。

【０２３３】 主題の方法によって処置しうる疾患としては、ヒト以外に特異に見られる疾患
、例えば疥癬が挙げられる。

【０２３４】 更に他の態様において、主題の方法を、ヒトの癌、特に基底細胞癌及び例えば
皮膚などの上皮組織の腫瘍の処置に用いることができる。例えばヘッジホッグア
ンタゴニストを、主題の方法で、ヒトの癌、特に基底細胞母斑症候群(ＢＣＮＳ)
及び他のヒトの癌、腺癌、肉腫などの処置の一部として用いることができる。

【０２３５】 好ましい態様において、主題の方法を、基底細胞癌の治療（又は予防）のため
の予防養生法の一部として用いる。ｐｔｃ突然変異により生じる基底細胞癌の一
般的な特徴と思われるのが、ヘッジホッグシグナリング経路の調節停止である。
家族性及び散在性ＢＣＣ（基底細胞癌）の腫瘍において、インシトゥハイブリダ
イゼーションで調べたところ、ヒトｐｔｃ ｍＲＮＡが一貫性を有して過剰発現
することが報告されている。ｐｔｃは負の自己調節を示すので、ｐｔｃを不活性
化する突然変異がｐｔｃ突然変異体の過剰発現を引き起こしていると考えられる
。これまでの研究によると、ヘッジホッグ蛋白質の過剰発現が、腫瘍発生を引き
起こしうることが示されている。皮膚発達のわずか数日後に皮膚表面全体にわた
る複数のＢＣＣ様皮膚増殖を含むＢＣＮＳの特徴を発達させた皮膚内で、Ｓｈｈ
を過剰発現するトランスジェニックマウスにおける研究から、マウスの腫瘍発生
にSonicヘッジホッグ（Ｓｈｈ）が役割を担っているということが示唆されてい
る。これまでの研究にはＢＣＣから得たＳｈｈヒト遺伝子における突然変異につ
いての記載もあり、ヒトにおけるＳｈｈ又は他のＨｈ遺伝子が、ヒトにおける優
性腫瘍誘発遺伝子として作用しうることを示唆している。散在性ｐｔｃ突然変異
が、正常な個人から得たＢＣＣにおいて観察されており、そのうちのいくつかは
ＵＶ標識突然変異であった。散在性ＢＣＣについて行われた近年の研究の一つに
おいて、ＣＴ又はＣＣＴＴのいずれかが変化した５個のＵＶ標識型突然変異が、
ｐｔｃ突然変異を含む１５の腫瘍に見つかっている。近年行われた、ＢＣＣ及び
神経外胚葉腫における散在性ｐｔｃ突然変異の分析によると、ＢＣＣにおいて発
見された３個のｐｔｃ突然変異の一つにおいて、１個のＣＴが変化していること
が示されている（例えばGoodrich他（１９９７）Science２２７：１１０９−１
３；Xie他（１９９７）Cancer Res５７：２３６９−７２；Oro他（１９９７）Sc ience ２７６：８１７−２１；Xie他（１９９７）Genes Chromosomes Cancer１８
：３０５−９；Stone他（１９９６）Nature３８４：１２９−３４；及びJohnson
他（１９９６）Science２７２：１６６８−７１参照）。

【０２３６】 主題の方法は、ＢＣＮＳを有する患者の処置、例えばＢＣＣ又はｐｔｃ機能欠
損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の結果起こりうる疾患によ
る他の影響の予防に用いることもできる。基底細胞母斑症候群は、若年期に現れ
る複数のＢＣＣにより特徴付けられる、希有な常染色体優性疾患である。ＢＣＮ
Ｓ患者はこれらの腫瘍を発達させやすく、１０歳から２０歳にかけて、主に日光
にさらされた皮膚領域に大量に現れる。この疾患は、肋骨、頭及び顔の変性、時
として多指症、合指症及び脊椎披裂を含む、多くの発達異常も引き起こす。又、
これらの患者はＢＣＣに加えて卵巣及び心臓の繊維腫、皮膚及び顎の嚢腫、中枢
神経系における髄芽細胞腫及び髄膜腫などの多くの腫瘍型を発達させる。主題の
方法を、ＢＣＮＳ及び非ＢＣＮＳ患者におけるそのような腫瘍型の予防及び処置
に用いることができる。研究によって、ＢＣＮＳ患者がｐｔｃ遺伝子に遺伝子性
及び散在性突然変異の両方を有することが示されており、このことは、これらの
突然変異体がこれらの疾患の根本的な要因となっていることを示唆している。

【０２３７】 他の特徴において、本発明はヘッジホッグアンタゴニストを包含する薬剤調製
物を提供する。主題の方法に用いられるヘッジホッグアンタゴニストは、生物学
的に許容可能な媒体［水、緩衝食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロ
ピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）又はそれらの好適な混合
物］を用いて、投与に都合よく調合することができる。選択された媒体中での活
性成分の最適濃度は、医化学者に公知の方法に従って経験的に決定することがで
きる。ここでいう「生物学的に許容可能な媒体」には、薬剤調製物の投与経路に
適したあらゆる溶媒、分散媒などが含まれる。薬学的に活性な物質におけるその
ような媒体の使用は、当分野において公知のものである。従来の媒体又は薬剤が
ヘッジホッグアンタゴニストの活性に不適合な場合を除いて、本発明の薬剤調製
物に主題の化合物を使用することが企図される。好適な賦形剤及び他の蛋白質を
含む調合については、例えばRemington Pharmaceutical Sciences［Remington's
Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、米国ペンシルバニア州
イーストン（１９８５）］に記載がある。これらの賦形剤は、注射可能な「沈殿
（deposit）配合物」を含む。

【０２３８】 本発明の薬剤調製物は、例えば家畜や犬などのペットの処置といった獣医学的な
使用に好適なヘッジホッグアンタゴニストの薬剤調製物などの、獣医学的な組成
物を含むこともできる。

【０２３９】 導入の方法は、再充填可能な又は生分解性の装置を用いて提供することができ
る。近年、様々な緩効性重合体装置が開発され、蛋白質様生物薬剤といった薬剤
の、制御された投与がイン・ビボで試されている。生分解性及び非分解性重合体
の両方を含む様々な生体適合性重合体（ヒドロゲルなど）を用いて、ヘッジホッ
グアンタゴニストを特定の標的部位において持続的に放出する移植片を形成する
ことができる。

【０２４０】 本発明の調製物は、経口、非経口、局所、又は直腸内で投与することができる
。調製物はもちろん各投与経路に適した形状で投与される。例えば、錠剤、カプ
セル形状などによる注射、吸入投与；目薬、軟膏、座薬、制御された放出パッチ
などによる注射、浸剤又は吸入投与；ローション剤又は軟膏による局所投与；及
び座薬による直腸投与が挙げられる。経口及び局所投与が好ましい。

【０２４１】 ここでいう「非経口投与」及び「非経口に投与する」とは、腸内及び局所投与
を除く投与方法、通常は注射による投与を意味する。例としては静脈内、筋肉内
、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮
下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内及び胸骨内注射及び浸剤が挙げられるが
、これらに限定されるものではない。

【０２４２】 ここでいう「全身投与」「全身に投与する」「末梢投与」及び「末梢に投与す
る」とは、中枢神経系に直接投与するのではなく、化合物、薬剤又は他の物質を
患者の系に入るように投与し、従って代謝や他の類似方法（例えば皮下投与）の
影響を受ける投与のことを言う。

【０２４３】 これらの化合物は、好適な投与経路によって、治療を目的としてヒト及び他の
動物に投与することができる。例えば、噴霧の形での経口、経鼻の投与、粉末、
軟膏又は滴下の形での直腸内、膣内、非経口、槽内及び局所投与、並びに口腔及
び舌下投与が挙げられる。

【０２４４】 選択された投与経路に関わらず、好適な水和形態で用いることのできる本発明
の化合物及び／又は本発明の薬剤組成物を、下に記すような又は当業者に知られ
る従来法で、薬学的に許容可能な投与形態に調合することができる。

【０２４５】 本発明の薬剤組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性を与える
ことなく、特定の患者、組成物及び投与方法について望ましい治療的応答を達成
できるのに有効な量の活性成分が得られるように変えることができる。

【０２４６】 選択される投与レベルは、本発明の特定の化合物、エステル、塩又はそのアミ
ドの活性、投与経路、投与時間、該特定の化合物の排出速度、処置時間、該特定
のヘッジホッグアンタゴニストとともに用いられた他の薬剤、化合物及び／又は
物質、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、体調、健康状態及び病歴、医療分
野で知られるその他の要因といった様々な要因に依存する。

【０２４７】 当分野で通常の技術を有する医者又は獣医は、必要とされる薬剤組成物の有効
量を容易に決定し処方することが可能である。例えば、医者又は獣医は、薬剤組
成物に用いられる本発明の化合物の用量を、必要とされる量より低いレベルから
始めて、望ましい効果が達成できるまで徐々に用量を増加させることができる。

【０２４８】 一般に、好ましい一日の用量は、治療効果を生み出すのに有効な最も低い化合
物量である。そのような有効な量は、一般に上記したような要因に依存する。一
般に、患者に対する本発明の化合物の静脈内、脳内及び皮下投与の量は、約０．
０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。

【０２４９】 望ましい場合には、活性化合物の有効な一日分の用量は、２、３、４、５、６
回以上の副次用量で、一日を通じて適当な間隔をおいて（随意に回分服用の形態
をとることができる）、分けて投与することができる。

【０２５０】 ここでいう「処置」とは、予防法、療法及び治療を含むことを意図する。

【０２５１】 この処置を受ける対象は、霊長類（特にヒト）及び他のほ乳類（ウマ、ウシ、
ブタ及びヒツジ）、家禽類及びペットを含む、処理を必要とするあらゆる動物を
含む。

【０２５２】 本発明の化合物はそのままで又は薬学的に許容でき且つ／若しくは無菌の担体
との混合物として投与することができ、ペニシリン、セファロスポリン、アミノ
グリコシド及びグリコペプチドなどの抗菌剤と併せて投与することもできる。従
って併合治療は、最初の投与の治療効果が完全に消えないうちに次の投与を行う
、活性化合物の連続的、同時及び分離投与を含む。

【０２５３】Ｖ．製薬組成物 本発明の化合物は単独で投与することが可能であるが、これを製薬処方物（組
成物）として投与することが好ましい。本発明に従うヘッジホッグアンタゴニス
トは、人用又は獣医用の医薬品に使用するために任意の都合のよい方法で投与す
るために処方することができる。ある種の具体例では、製薬製剤に含有させる化
合物は、それ自体活性であってよく、又は例えば生理学的環境で活性化合物に転
化できるプロドッラグであることができる。 従って、本発明の他の観点は、治療学的に有効な量の前記の化合物の１種以上
を１種以上の製薬上許容できるキャリアー（添加剤）及び（又は）希釈剤と共に
処方してなる製薬上許容できる組成物を提供する。以下に詳細に説明するように
、本発明の製薬組成物は、以下のもの：（１）経口投与に適合した形態、例えば
、飲薬（水性又は非水性の溶液又は懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌
に適用するためのペースト、（２）例えば皮下、筋肉内又は静脈内注射による非
経口的投与に適合した形態、例えば、無菌溶液又は懸濁液、（３）局所適用に適
合した形態、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏又はスプレー、（４）膣
内又は直腸内投与に適合した形態、例えば、ペッサリー、クリーム又はフォーム
も含めて、固体又は液体形態で投与するために特に処方することができる。しか
し、ある種の具体例では、主題化合物は、無菌水に単に溶解又は懸濁させること
ができる。ある種の具体例では、製薬製剤は発熱性ではない。即ち、患者の体温
を上昇させない。

【０２５４】 語句“製薬上有効な量”とは、ここで使用するときは、少なくとも動物細胞の
亜集団におけるｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢
進に打ち勝ち、しかして処置された細胞におけるその経路の生物学的結果を、ど
んな医療的処置にも適用できる合理的な利益／危険の比で持って、ブッロクする
ことによって何らかの所望の治療的効果を生じさせるのに有効である本発明の化
合物を含む化合物、材料又は組成物についてのそのような量を意味する。

【０２５５】 語句“製薬上許容できる”とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、
刺激、アレルギー反応又はその他の問題若しくは合併症なしに、人間及び動物の
組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／危険の比で適合する化
合物、材料、組成物及び（又は）投薬の形態をいうのに使用する。

【０２５６】 語句“製薬上許容できるキャリアー”とは、ここで使用するときは、主題アン
タゴニストを体の一つの器官又は一部から他の器官又は一部に運び又は輸送する
際に係わる液体又は固体状の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材の
ような製薬上許容できる材料、組成物又はビヒクルを意味する。それぞれのキャ
リアーは、処方物の他の成分と適合でき且つ患者に有害でないという意味で“許
容できる”ものでなければならない。製薬上許容できるキャリアーとして使用で
きる材料のいくつかの例には、（１）糖類、例えばラクトース、グルコース及び
サッカロース、（２）でんぷん、例えばコーンスターチ及びジャガイモでんぷん
、（３）セルロース及びその誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロ
ース、エチルセルロース及び酢酸セルロース、（４）粉末状トラガンタ、（５）
麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えばココアバター及び
座薬用ワックス、（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ
油、オリーブ油、コーンオイル及び大豆油、（１０）グリコール、例えばプロピ
レングリコール、（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビット、マンニ
ット及びポリエチレングリコール、（１２）エステル、例えばオレイン酸エチル
及びラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシ
ウム及び水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）発熱原を含まない
水、（１７）等張性塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、
（２０）燐酸塩緩衝溶液及び（２１）製薬処方物に使用されるその他の非毒性の
許容できる物質が包含される。

【０２５７】 上記したように、本発明のヘッジホッグアンタゴニストのある種の具体例は、
アミノ又はアルキルアミノのような塩基性官能基を含有し、しかして、製薬上許
容できる酸により製薬上許容できる塩を形成することができる。この観点で、用
語“製薬上許容できる塩”とは、本発明の化合物の比較的毒性でない無機及び有
機酸との付加塩をいう。これらの塩類は、本発明の化合物の最終の単離及び精製
中に現場で、或いは遊離塩基の形の精製された本発明の化合物を好適な有機又は
無機酸と別途反応させ、次いでそのように形成された塩を単離することによって
製造することができる。代表的な塩類には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重
硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、
ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、燐酸塩、トシレート、く
えん酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、こはく酸塩、酒石酸塩、ナフタリン酸塩
、メシレート、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリルスルホン酸塩
などが包含される（例えば、ベルジ他による「製薬用塩類」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．
Ｓｃｉ．（１９７７）６６：１−１９を参照）。

【０２５８】 主題化合物の製薬上許容できる塩類は、例えば、非毒性の有機又無機酸からの
化合物の周知の非毒性の塩類又は第四アンモニウム塩を包含する。例えば、この
ような周知の非毒性の塩類には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、燐
酸、硝酸などのような無機酸から誘導されるもの、酢酸、プロピオン酸、こはく
酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸、アスコ
ルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、
グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香
酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、
しゅう酸、イセチオン酸などのような有機酸から製造される塩類が包含される。

【０２５９】 その他の場合には、本発明の化合物は、１個以上の酸性官能基を含有すること
ができ、しかして、製薬上許容できる塩基により製薬上許容できる塩類を形成す
ることができる。これらの場合に、用語“製薬上許容できる塩類”とは、本発明
の化合物の比較的非毒性の有機又無機塩基との付加塩をいう。これらの塩類は、
同様に、本発明の化合物の最終の単離及び精製中に現場で、或いは遊離酸の形の
精製された本発明の化合物を好適な塩基、例えば製薬上許容できる金属陽イオン
の水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩と、アンモニアと又は製薬上許容できる有機第
一、第二若しくは第三アミンと別途反応させることによって製造することができ
る。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩類には、リチウム、ナトリウム、
カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム塩などが包含される。塩基
付加塩を形成させるのに有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチ
ルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラ
ジンなどが包含される（例えば、上記のベルジ他を参照）。

【０２６０】 湿潤剤、乳化剤及び滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マ
グネシウム、並びに着色剤、剥離剤、被覆剤、甘味剤、香料及び芳香剤、保存剤
及び酸化防止剤も組成物中に存在できる。

【０２６１】 製薬上許容できる酸化防止剤の例には、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアス
コルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、
亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性酸化防止剤、例えばパルミチン酸アスコル
ビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン
（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど、（３）金
属キレート剤、例えばくえん酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソ
ルビット、酒石酸、燐酸などが包含される。

【０２６２】 本発明の処方物は、経口、経鼻、局所（口腔及び舌下を含めて）、直腸、膣及
び（又は）非経口投与に好適なものを包含する。これらの処方物は、単位投薬形
態で具合良く提供でき、医薬品分野で周知の任意の方法により製造することがで
きる。単位投薬形態を生じさせるためにキャリアー材料と混合できる活性成分の
量は、処理する宿主、特定の投与方法によって変動する。単位投薬形態を生じさ
せるためにキャリアー材料と混合できる活性成分の量は、一般に、治療効果を生
じさせる化合物のそういう量である。一般に、１００％からみて、この量は約１
％〜約９９％の活性成分、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０
％〜約３０％の活性成分の範囲にある。

【０２６３】 これらの処方物又は組成物を製造するための方法は、本発明の化合物をキャリ
アー及び随意の１種以上の補助成分と会合させる工程を包含する。一般に、処方
物は、本発明の化合物を液状キャリアー又は微細状の固体キャリアー又はこれら
の両者と均質に且つ緊密に会合させ、次いで必要ならば生成物を賦形させること
によって製造される。

【０２６４】 経口投与に好適な本発明の処方物は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、ロゼ
ンジ（風味付けベース、例えばサッカロース及びアカシア又はトラガンタを使用
）、粉末、顆粒の形態で、或いは水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として
、或いは水中油型又は油中水型液状エマルジョンとして、或いはエレキシル又は
シロップとして、或いは香錠（不活性ベース、例えばゼラチン及びグリセリン、
又はサッカロース及びアカシアを使用）として及び（又は）口腔洗浄液などであ
って、それぞれ活性成分として本発明の化合物を所定量で含有するものであるこ
とができる。また、本発明の化合物はボーラス、舐剤又はペーストとして投与す
ることができる。

【０２６５】 本発明の経口投与用の固形投薬形態（カプセル、錠剤、ピル、糖剤、粉末、顆
粒など）では、活性成分は、１種以上の製薬上許容できるキャリアー、例えば、
くえん酸ナトリウム若しくは燐酸二カルシウム及び（又は）下記のいずれか：（
１）充填剤又は増量剤、例えばでんぷん、ラクトース、サッカロース、グルコー
ス、マンニット及び（又は）珪酸、（２）結合材、例えばカルボキシメチルセル
ロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、サッカロース及び（
又は）アカシア、（３）保湿剤、例えばグリセリン、（４）崩壊剤、例えば寒天
、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカでんぷん、アルギン酸、ある種の珪
酸塩及び炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン、（６）吸収促
進剤、例えば第四アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール
及びグリセリンモノステアレート、（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナ
イトクレー、（９）滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン
酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びこ
れらの混合物、（１０）着色剤と混合される。カプセル、錠剤及びピルの場合に
は、製薬組成物は、緩衝剤も含むことができる。類似のタイプの固形組成物は、
ラクトース又は乳糖のような賦形剤並びに高分子量ポリエチレングリコールなど
を使用する軟質及び硬質ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用できる。

【０２６６】 錠剤は、１種以上の補助成分と共に圧縮又は成形によって製造することができ
る。圧縮錠剤は、結合材（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセル
ロース）、滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、でんぷんグリコール
酸ナトリウム又は架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性又は
分散剤を使用して製造することができる。成形錠剤は、加湿した粉末状化合物と
不活性液体希釈剤との混合物を適当な機械で成形することによって製造すること
ができる。

【０２６７】 本発明の製薬組成物の錠剤及びその他の固形投薬形態、例えば糖剤、カプセル
、ピル及び顆粒は、要すれば、被覆及び外殻、例えば腸用被覆及び製薬処方分野
において周知のその他の被覆で得ることができ又は調製することができる。また
、それらは、例えば、所望の放出プロフィルを与えるように割合を変えてヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、その他の重合体マトリックス、リプソーム及び
（又は）マイクロスフェアーを使用して活性成分の遅延された又は制御された放
出を与えるように処方することもできる。それらは、例えば、細菌保持性フィル
ターによるろ過により、又は使用直前に無菌水若しくはその他の無菌注射可能媒
体に溶解できる無菌固形組成物の形で滅菌剤を配合することによって滅菌するこ
とができる。これらの組成物は随意に不透明剤も含有でき、またこれらが活性成
分のみを又は優先的に、胃腸器官のある部分で、場合により遅延された態様で放
出させるような組成物であることができる。使用できる包封用組成物の例は重合
体物質及びワックスを包含する。また、活性成分は、適当ならば、上記した賦形
剤の１種以上によりマイクロカプセル化された形態であることができる。

【０２６８】 本発明の化合物の経口投与用の液状投薬形態は、製薬上許容できるエマルジョ
ン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを包含する
。液状投薬形態は、活性成分に加えて、斯界で普通に使用される不活性希釈剤、
例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、
イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息
香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に
、綿実油、グラウンドナッツ油、コーンオイル、胚芽油、オリーブ油、ひまし油
及びゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアリール、ポリエチレングリコ
ール及びソルビタンの脂肪酸エステル、これらの混合物を含有することができる
。

【０２６９】 不活性希釈剤以外に、経口投与用組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味
料、風味料、着色剤、香料及び保存剤のような補助剤も含有することができる。

【０２７０】 懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリ
ルアルコール、ポリオキシエチレンソルビット及びソルビタンエステル、微結晶
質セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガンタ並
びにこれらの混合物を含有することができる。

【０２７１】 コレステロールのようなステリン類がシクロデキストリンと錯体を形成するこ
とが知られている。しかして、抑止剤がステロイド性アルカロイドである好まし
い具体例では、それは、α−、β−及びγ−シクロデキストリン、ジメチル−β
−シクロデキストリン及び２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの
ようなシクロデキストリンと処方することができる。

【０２７２】 直腸又は膣投与用の本発明の製薬組成物の処方物は坐薬として提供でき、これ
は本発明の１種以上の化合物を、例えばココアバター、ポリエチレングリコール
、座薬用ワックス又はサリチル酸エステルを含む１種以上の好適な非刺激性賦形
剤又はキャリアーであって、室温で固体であるが体温で液状であり、従って直腸
又は膣内で溶融して活性なヘッジホッグアンタゴニストを放出するものと混合す
ることによって製造することができる。 膣に投与するのに好適な本発明の処方物は、斯界で適切であることが知られて
いるようなキャリアーを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペー
スト、フォーム又はスプレー処方物も包含する。

【０２７３】 本発明の化合物の局所又は経皮投与のための投薬形態は、粉末、スプレー、軟
膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を包含す
る。活性成分は、製薬上許容できるキャリアーと、要求されるかもしれない任意
の保存剤、緩衝剤又は吸入剤とを無菌条件下で混合することができる。 軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本発明の活性成分に加えて、動物性及
び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、でんぷん、トラガンタ、セルロース
誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルク、
酸化亜鉛及びこれらの混合物のような賦形剤を含有することができる。 粉末及びスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、珪酸、
水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム、ポリアミド粉末及びこれらの物質の混合
物のような賦形剤を含有することができる。スプレーは、さらにクロルフルオル
炭化水素や、ブタン及びプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような慣用の
発射剤を含有することができる。

【０２７４】 経皮用パッチは、皮膚に対する本発明の化合物の制御された送出を提供すると
いう付加的な利点を有する。このような投薬形態は、ヘッジホッグアンタゴニス
トを適切な媒質に溶解又は分散することによって製造することができる。皮膚を
介するヘッジホッグアンタゴニストの流れを増大させるために吸収向上剤を使用
することができる。このような流れの速度は、速度制御膜を備えるか又は化合物
を重合体マトリックス若しくはゲルに分散させることによって制御することがで
きる。 眼科用処方物、眼用軟膏、粉末、溶液なども本発明の範囲内にあるものとして
意図される。

【０２７５】 非経口的投与のために好適な本発明の製薬組成物は、１種以上の本発明の化合
物を１種以上の製薬上許容できる無菌で等張性の水溶液又は非水溶液、分散液、
懸濁液又はエマルジョン、或いは使用直前に無菌注射可能溶液又は分散液に再構
成できる無菌粉末と組合わせて含み、これは酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤や、処
方物を意図された受容体の血液により又は懸濁若しくは増粘剤により等張性にさ
せる溶質を含有することができる。

【０２７６】 本発明の製薬組成物に使用できる好適な水性及び非水性キャリアーの例には、
水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレ
ングリコールなど）及びこれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油、オ
レイン酸エチルのような注射可能有機エステルが包含される。適切な流動性は、
例えば、レシチンのような被覆材を使用して、分散液の場合には所要の粒度を維
持することによって、及び界面活性剤を使用することによって保持することがで
きる。

【０２７７】 これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助剤を含有
することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤及び抗菌剤、例えば
、パラベン、クロルブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含有させること
によって確実にすることができる。また、糖、塩化ナトリウムなどのような等張
剤を組成物中に含有させることが望ましいであろう。更に、注射可能な製薬形態
の持続された吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収
を遅延させる剤を含有させることによりもたらすことができる。

【０２７８】 ある場合には、薬物の効果を持続させるために、皮下又は筋肉内注射からの薬
物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水溶解度が劣った結晶質又は非
晶質材料の液状懸濁液を使用することにより達成することができる。この場合に
、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、後者も結晶寸法及び結晶形態に依存
しよう。別法として、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油
性ビヒクルに溶解又は懸濁させることにより達成される。

【０２７９】 注射可能なデポー剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性
重合体中の主題化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成させることにより
製造される。薬物対重合体の比率及び使用された特定の重合体の種類に応じて、
薬物の放出速度は制御することができる。その他の生分解性重合体の例には、ポ
リ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が包含される。また、デポー剤注射可
能処方物も薬物を体の組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルジョン中に
包封することによって製造される。

【０２８０】 本発明の化合物が人及び動物に薬剤として投与されるときは、それらは、それ
自体で又は例えば０．１〜９９．５％（更に好ましくは０．５〜９０％）の活性
成分を製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて含有する製薬組成物として与
えることができる。

【０２８１】 本発明の化合物の動物飼料への添加は、好ましくは、活性化合物を有効量で含
有する適当な供給プレミックスを製造し、このプレミックスを配合して完全な糧
食にすることによって達成される。 別法として、活性成分を含有する中間濃厚物又は供給補充物を飼料に配合する
ことができる。このような供給プレミックス及び完全糧食を製造し投与できる方
法は、参照文献（例えば、“応用動物栄養”（Ｗ．Ｈ．フリーマン他、サンフラ
ンシスコ、１９６９）又は“家畜飼料及び飼育”（Ｏ−Ｂブックス、コーバリス
、オレゴン、１９７７））に記載されている。

【０２８２】ＶＩ．活性アンタゴニストの合成方法及び同定 主題のステロイド性アルカロイド及びその同族体は、Suzuki, Stille等の架橋
カップリング技術を用いて容易に調製することができる。これらのカップリング
反応は比較的緩やかな条件下で行われ、幅広い「傍観」機能性を許容することが
できる。

【０２８３】 ａ．組み合わせライブラリー 本発明の化合物、特に様々な置換基の代表的なクラスを有する変異体のライブ
ラリーは、組み合わせ化学及び他の並行合成方法で扱いやすい（例えばＰＣＴＷ
Ｏ９４／０８０５１）。従って、ヘッジホッグアンタゴニストになりうる先導化
合物を同定するために、並びに先導化合物の特異性、毒性及び／又は細胞毒性−
速度プロファイルを細かに区別するために、関連化合物の大型ライブラリー、例
えば上記した化合物の多様性ライブラリーを高処理量アッセイにおいて迅速にス
クリーンする。例えば、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースン
ド機能亢進のいずれかを有する細胞を用いるアッセイなどの、ｐｔｃ、ヘッジホ
ッグ又はスムースンド対生物活性アッセイを用いて、ｐｔｃに対するアゴニスト
活性あるいはヘッジホッグ又はスムースンドに対するアンタゴニスト活性を有す
るものについて、主題の化合物のライブラリーをスクリーンすることができる。

【０２８４】 本発明に用いるための組み合わせライブラリーの例として、望ましい特性に関
して一緒にスクリーンすることのできる、化学的に関連する化合物の混合物が挙
げられる。一つの反応において多くの関連化合物の調製することで、実施すべき
スクリーニングの回数を減少し単純化する。適当な物理的特性についてのスクリ
ーニングは、従来法によって行うことができる。

【０２８５】 ライブラリーにおける多様性は、様々に異なるレベルで作成することができる
。例えば、組み合わせ反応に用いられる基質アリール基は、中心となるアリール
基について（例えば環状構造について）多様性を与えることができ、及び／又は
他の置換基について変えることもできる。

【０２８６】 例えば主題のヘッジホッグアンタゴニストなどの小さな有機分子の組み合わせ
ライブラリーを作成する技術に、様々な方法を用いることができる［例えばBlon
delle他（１９９５）Trends Anal. Chem.１４：８３；Affymax、米国特許第５，
３５９，１１５号及び第５，３６２，８９９号；Eliman、米国特許第５，２８８
，５１４号；Still他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８０５１；ArQule、米国特
許第５，７３６，４１２号及び第５，７１２，１７１号；Chen他（１９９４）JA CS １１６：２６６１；Kerr他（１９９３）JACS１１５：２５２；ＰＣＴ公開番号
ＷＯ９２／１００９２、ＷＯ９３／０９６６８及びＷＯ９１／０７０８７；並び
にLerner他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２参照］。従って、約１００〜
１，０００，０００以上の主題のヘッジホッグアンタゴニストの多様体（divers
omer）の、様々なライブラリーを合成し、特定の活性又は特質についてスクリー
ンすることができる。

【０２８７】 例証的な態様において、多様体となりうるヘッジホッグアンタゴニストのライ
ブラリーを、Still他（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８０５１）に記載の方法に
適応させた計画を用いて合成することができる。例えば、アンタゴニスト候補又
は合成中間体の置換基の位置の一つに位置させることのできる、加水分解可能な
又は光分解可能な基によって重合体ビーズに連結する。Still他の方法によると
、ライブラリーは一連のビーズ上で合成される（各ビーズはビーズ上の特定の多
様体を同定する標識セットを含む）。次いでビーズライブラリーを、ヘッジホッ
グアンタゴニストが探されるｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムー
スンド機能亢進の細胞とともに「培養」することができる。多様体は、例えば加
水分解によってビーズから放出することができる。

【０２８８】 本発明において有用な化合物の構造は、それら自身、容易に、効率的な合成に
役立つ。式Ｉ及びＩＶにより一般的に記載されたこれらの構造の性質は、かかる
化合物のアセンブリを、上記のＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄部分のある組合せを用いて
可能にする。例えば、これらのサブユニットを一般的なアシル化又はアルキル化
反応によってコアリングに結合させることができる。かかる反応の大部分は、図
１１、１２、１５及び１６に描いたものを含み、極めて温和で且つ極めて確実で
あり、従って、コンビナトリアルケミストリーに完全に適している。試験化合物
のライブラリーの生成へのかかるコンビナトリアルアプローチの容易な性質は、
下記の典型的な図式において明らかであり(Ｐ＝保護基)、上記の式による化合物
の様々な基は、組合せ的に結合する(例えば、上記の方法の一つを利用して)。一
層大きい多様性さえも、例えば、サブユニットを追加する際にある範囲の反応性
官能基を用いることにより、例えば、Ｒ₁サブユニットを追加する際にＲ−Ｌ−
Ｃ(Ｏ)Ｃｌ、ＰＯ−Ａｒ−Ｌ−ＮＣＯ、ＰＯ−Ａｒ−Ｌ−ＳＯ₂Ｃｌなどの範囲
を用いることによって達成されうる。

【化３４】

【０２８９】 上記及び関連の経路についての様々な改変によって、ヘッジホッグ機能を阻止
する能力について試験される化合物の様々なライブラリーを合成することができ
る。

【０２９０】本発明の例示化合物の製造 ここに開示した一般的構造に従う一連の化合物を製造し、生物学的性質につい
て試験した（以下を参照）。好適なコア構造は、以下の反応式に要約されるよう
な商業的に入手できるｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンから容易に製
造することができる。

【化３５】

【０２９１】ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩 塩化アセチル（２４９ｍｌ、３．４７モル）をメタノール（２０９０ｍＬ）に
温度を３０℃以下に保持するように撹拌し冷却しながら滴下した。完全に添加し
た後に、さらに６０分間撹拌し続けてからｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリン（３２５ｇ、２．４８モル）を固体状で添加した。反応混合物を２４時間
加熱還流し、０℃に冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、５２２０ｍ
Ｌ）を３０分間でゆっくりと添加した。沈殿した固体をフィルター上に集め、氷
冷ＴＢＭＥで洗浄した（２×１Ｌ）。この生成物を４０℃で終夜真空乾燥して４
２４ｇの所望のエステルを得た。

【０２９２】ｔｒａｎｓ−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン メチルエステル 上記反応の生成物エステル（４２３ｇ、２．３２モル）をジクロルメタン（６
．５Ｌ）に懸濁させた。撹拌しかつ冷却しながら、トリエチルアミン（１０１９
ｍＬ、７．３２モル）を３０分間で添加し、次いで重炭酸ジ−ｔ−ブチル（５８
８ｇ、２．７０モル）を３０分間で添加して内部温度を１５℃以下に保持した。
完全に転化した後に、混合物を室温で３時間撹拌し、次いで１Ｍくえん酸水溶液
（６５０ｍＬ）を添加する。混合物を１時間撹拌し、有機相を分離し、１ＭのＫ
ＨＣＯ₃水溶液（９２０ｍＬ）、水（２×１Ｌ）で洗浄し、活性炭（１５ｇ）の
存在下にＭｇＳＯ₄で乾燥した。溶媒を真空下に除去し、残留物をフラッシュク
ロマトグラフィー（２×１８００ｇのシリカゲル、３：１〜２：１のヘキサン：
ＥｔＯＡｃの溶離剤）により精製して所望のカルバメート（４８９ｇ）を得た。

【０２９３】（４Ｒ）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−４−［（メチルスルホニル）オキ シ］−Ｌ−プロリンメチルエステル 上記のカルバメート（４７８ｇ、１．９５モル）、Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＰＥＡ、３７３ｍＬ、２．１５モル）及び４−ジメチルアミノピリ
ジン（ＤＭＡＰ、２３．８ｇ、０．１９５モル）をジクロルメタン（７６５０ｍ
Ｌ）に溶解した。塩化メタンスルホニル（１６７ｍＬ、２．１５モル）をジクロ
ルメタン（９５０ｍＬ）に溶解してなる溶液を、冷却して温度を１０℃以下に保
持しながら、５０分間で滴下した。混合物を−６℃で２時間撹拌し、水（７５０
ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間以上撹拌し、層を分離させた。有機相を１Ｍ
のＫＨＣＯ₃水溶液（９５０ｍＬ）、１Ｍくえん酸水溶液（２×９５０ｍＬ）及
び水（７５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。溶媒を真空下に除去し、
残留物をヘキサン（１．９Ｌ）で結晶化させた。結晶質のメシレートをフィルタ
ー上に集め、ヘキサンで洗浄し（２×５００ｍＬ）、４０℃で真空乾燥して６２
４ｇの所期の化合物を与えた。

【０２９４】（４Ｓ）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−４−アジド−Ｌ−プロリンメチル エステル 上記のメシレート（６２４ｇ、１．９３モル）とナトリウムアジド（７１６ｇ
、１１．０１モル）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、３１２０ｍＬ）に溶解し
てなる溶液を６０℃で２２時間撹拌し、この溶液を０℃に冷却し、水（３Ｌ）を
４０分間で添加して温度を２０℃以下に保持し、ＥｔＯＡｃ（３Ｌ）を添加した
。混合物を約２０分間攪拌し、層を分離させ、水性相をＥｔＯＡｃ（３Ｌ）で抽
出した。一緒にした有機相を水（７５０ｍＬ）、０．１ＭのＨＣｌ水溶液（４０
０ｍＬ）、次いで水（７５０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ₄で乾燥した。溶
媒を真空下に除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２×１８００ｇ
のシリカゲル、２：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して所望のアジド（
５１６ｇ）を得た。

【０２９５】（４Ｓ）−４−アジド−Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩 ＨＣｌのジオキサン飽和溶液（１９４０ｍＬ）を１０〜１６℃で調製し、アジ
ド（５２３ｇ、１．９４モル）をジオキサン（４８０ｍＬ）に溶解してなる溶液
を、３０分間撹拌しかつ冷却して温度を２５℃以下に保持しながら滴下した。完
全に溶解した後に、反応混合物を室温で２時間撹拌し、ＴＢＭＥ（２Ｌ）を添加
し、生じた混合物を０℃で１時間撹拌した。沈殿した固体をろ紙上に集め、ＴＢ
ＭＥ（４×５００ｍＬ）で洗浄し、４０℃で真空下に乾燥して所望の塩酸塩（３
４８ｇ）を得た。

【０２９６】 上記のコア構造から或いは関連する化合物又は誘導体から本発明の主題化合物
を以下に示す反応式に示すように製造することができる。反応式１：溶液相経路１

【化３６】

【０２９７】反応式２：溶液相経路２

【化３７】

【０２９８】反応式３：固体相経路３

【化３８】

【０２９９】 これらの経路は、例示の固相経路と共に、異なった置換基及び立体化学的関係
を有する広範な化合物をもたらす。当業者ならば、上記の反応式におけるピペラ
ジンの使用が例示に過ぎず、従ってその他のアミンも更に各種の主題化合物群を
得るのに使用できることを認識しよう。同様に、ＢＯＣ、ＦＭＯＣ及びその他の
保護基の使用は例示に過ぎず、従って当業者は、本発明の範囲及び精神から離れ
ることなく、官能基に好適なその他の保護基を選択し且つその後の反応条件を容
易に選択することができる。更に、前記の反応式はｔｒａｎｓ−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリン化合物でもって典型的に開始するが、この化合物の全ての異性体は、
ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ及び（又は）Ｄ／Ｌ化合物も含めて、商業的に入手でき、従
って広範な立体化学的に純粋な中間体及び主題化合物を得ることができる。ｔｒ
ａｎｓ−アミノプロリンコア構造は、斯界で周知のように、ｔｒａｎｓ−ヒドロ
キシプロリン出発物質から、中間体ｃｉｓ−ブロムプロリンを形成させ（例えば
、ヒドロキシルのトリフレート又はメシレートを形成させ、そのスルホン酸エス
テルを臭化物イオンで置換することにより）、次いでアジドで第二の置換を行な
ってｔｒａｎｓ−立体化学的関係を純粋に保持することにより得ることができる
。別法として、ジアステレオマー混合物も前記の反応式３におけるようにして製
造し、次いで随意に異性体の分離を行なうことができる。

【０３００】 ｂ．スクリーニングアッセイ 化合物が、ｐｔｃ機能を代行し又はスムースンド若しくはヘッジホッグ機能に
拮抗する能力を有するかどうかを調べるのに、様々なアッセイを用いることがで
きるが、その多くは高処理量フォーマットで処理することができる。化合物及び
天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムにお
いて、所定の期間中に生存する化合物の数量を最大化するために、高処理量アッ
セイを用いるのが望ましい。従って、合成及び天然生産物のライブラリーから、
ヘッジホッグアンタゴニストである他の化合物について見本をとることができる
。

【０３０１】 細胞を含まないアッセイに加えて、細胞に基づくアッセイで試験化合物を試験
することもできる。一つの態様において、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢
進又はスムースンド機能亢進表現型を有する細胞を、例えば試験剤の存在下にお
ける細胞増殖阻害剤について評価するアッセイで、目的の試験剤に接触させるこ
とができる。

【０３０２】 多くの遺伝子産物が、パッチト媒介シグナル変換（パッチト、cubitus interr
uptus（ｃｉ）の転写因子、セリン／トレオニンキナーゼであるfused（ｆｕ）並
びにcostal−２、スムースンド及びsuppressor of fusedの遺伝子産物）におい
て関連づけられている。

【０３０３】 ヘッジホッグ蛋白質による細胞の誘導は、下流エフェクターの活性化及び阻害
に関与する一連の事象を推進し、その結果、ある場合においては遺伝子の転写又
は翻訳における検出可能な変化に至る。ヘッジホッグ媒介シグナリングの転写標
的となりうるものしては、パッチト遺伝子（Hidalgo及びIngham、１９９０ Deve
lopment１１０、２９１−３０１；Mango他、１９９６）及びショウジョウバエ科
cubitus interruptus遺伝子の脊椎動物相同体、ＧＬＩ遺伝子（Hui他（１９９４
）Dev Biol１６２：４０２−４１３）が挙げられる。パッチト遺伝子発現は、Ｓ
ｈｈ応答性の肢芽及び神経板の細胞を誘発することが示されている（Marigo他（
１９９６）PNAS９３：９３４６−５１；Marigo他（１９９６）Development１２
２：１２２５−１２３３）。Ｇｌｉ遺伝子は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合領域
を有する推定転写因子をコードする（Orenic他（１９９０）Genes & Dev４：１
０５３−１０６７；Kinzler他（１９９０）Mol Cell Biol１０：６３４−６４２
）。Ｇｌｉ遺伝子の転写は肢芽のヘッジホッグに応答してアップレギュレーショ
ンを受ける一方、Ｇｌｉ３遺伝子の転写はヘッジホッグ誘導に応答してダウンレ
ギュレーションを受けることが報告されている（Marigo他（１９９６）Developm
ent１２２：１２２５−１２３３）。ヘッジホッグシグナリングに応答する遺伝
子のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを引き起こす転写調節
配列を、そのような標的遺伝子（例えばパッチト又はＧｌｉ遺伝子）から選択し
、そのようなプロモーターをレポーター遺伝子に操作可能に連結することによっ
て、特異な試験化合物の有するヘッジホッグ媒介シグナリング経路を改変する能
力に対して感度の高い、転写に基づくアッセイを作成することができる。従って
、レポーター遺伝子の発現は、ヘッジホッグのアンタゴニストとして作用する化
合物の開発に有用なスクリーニング手段を提供する。

【０３０４】 本発明のレポーター遺伝子に基づくアッセイは、上記した一連の事象の最終段
階、例えば転写調節を測定する。従って、アッセイの一つの態様の実施において
、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進、スムースンド機能亢進に依存する検
出シグナルの発生又はＳＨＨ自体の刺激を得るために、レポーター遺伝子構造体
を標的細胞内に挿入する。レポーター遺伝子からの転写量は、当業者に好適と知
られる方法を用いて測定することができる。例えば、レポーター遺伝子からのｍ
ＲＮＡ発現は、リボヌクレアーゼ保護又はＲＮＡに基づくＰＣＲを用いて検出す
ることができ、あるいはレポーター遺伝子の蛋白質産物は、特徴染色又は固有の
生物学的活性によって同定することができる。次いでレポーター遺伝子からの発
現量を、試験化合物の非存在下において同じ細胞内で発現された量、または実質
的に同一だが標的受容体蛋白質を有さない細胞内での転写量のいずれかと比較す
る。統計的な又は有意な転写量の減少は、試験化合物がある程度正常なｐｔｃシ
グナルを作動させた（又は機能亢進ヘッジホッグ又はスムースンドシグナルに拮
抗した）こと、例えば試験化合物が潜在的なヘッジホッグアンタゴニストである
ことを意味する。

【０３０５】例示 ここでは、本発明を一般的に説明するので、本発明は、そのある種の観点及び
具体例の例示の目的のためだけで含め且つ限定とならない後記の実施例を参照す
ることにより一層容易に理解されるであろう。

【０３０６】 模範的な抑止薬の合成 Ｎ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル
）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリル］−Ｎ１
−（４−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド、“ｔｒａｎｓ−
アミノプロリン”

【化３９】

【０３０７】 （２Ｓ，４Ｓ）−４−ブロムテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン
酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（４） （２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカ
ルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（３）（２．０ｇ、８．１５ミリモル）
をオーブン乾燥フラスコに秤量し、トルエンを使用して共沸的に乾燥した。ジク
ロルメタン（１６ｍｌ）と四臭化炭素（１０．８１ｇ、８．１５ミリモル）を添
加し、溶液を攪拌し、０℃に冷却し、トリフェニルホスフィン（８．５ｇ、３２
．４１ミリモル）で処理した。この混合物を０℃で５時間攪拌し、次いでメタノ
ール（１．８ｍＬ）を添加し、室温で終夜攪拌し続けた。この混合物をジエチル
エーテル（８０ｍＬ）で希釈し、生じた懸濁液をろ過し、ジエチルエーテル（３
０ｍＬ）で洗浄した。溶媒を一緒にし、減圧下に蒸発させ、粗生成物をヘキサン
／酢酸エチル（１９：１〜４：１、ｖ／ｖ）を溶離剤としてシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーにより精製して標記の臭化物（４）（１．０ｇ、４０％）を無
色油状物として得た。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：１．４１及び１．４６（２ｘｓ、９Ｈ、ロ
タマー）；２．３８−２．４６（ｍ、１Ｈ）；２．７５−２．８７（ｍ、１Ｈ）
；３．６７−３．７４（ｍ、１Ｈ）；３．７６（ｓ、３Ｈ）；３．９６−４．０
７（ｍ、１Ｈ）；４．２４−４．４２（ｍ、２Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２１０（１００）

【０３０８】 （２Ｓ，４Ｒ）−４−アジドテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン
酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（５） ナトリウムアジド（０．９０ｇ、１３．８４ミリモル）と（２Ｓ，４Ｓ）−４
−ブロムテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル
）２−メチル（４）（１．０ｇ、３．２４ミリモル）を無水ジメチルホルムアミ
ド（３２ｍＬ）に加えてなる懸濁液を窒素雰囲気下に６４時間加熱した。この混
合物を室温に冷却し、氷冷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を一緒
にし、水洗し、塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させた。粗
生成物をヘキサン／酢酸エチル（３：１〜１：１、ｖ／ｖ）を溶離剤としてシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のアジド（５）（０．８８
ｇ、９３％）を無色油状物として得た。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：１．４１及び１．４６（２ｘｓ、９Ｈ、ロ
タマー）；２．１３−２．２０（ｍ、１Ｈ）；２．２７−２．３８（ｍ、１Ｈ）
；３．４５−３．４９及び３．５７−３．６０（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；３
．６８−３．７３（ｍ、１Ｈ）；３．７４−３．７５（２ｘｍ、３Ｈ、ロタマー
）；４．１５−４．２３（ｍ、１Ｈ）；４．３０−４．３５及び４．３９−４．
４３（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ１７１［（Ｍ＋Ｈ）⁺−Ｃ₅Ｈ₉
Ｏ₂］（１００）

【０３０９】 （２Ｓ，４Ｒ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカル
ボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル クロリド（６） （２Ｓ，４Ｒ）−４−アジドテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボ
ン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（５）（０．８１ｇ、３．０ミリモル）を２
％ｖ／ｖ塩酸エタノール溶液（８ｍＬ）に溶解してなる溶液にパラジウム炭（１
０％、０．５ｇ）を添加した。この反応混合物を減圧し、窒素でパージし（３回
）、次いで水素雰囲気下に置き、室温で終夜激しく撹拌した。混合物をセライト
パッドでろ過し、減圧下に蒸発させて粗生成物とした。これを０℃でジエチルエ
ーテルですり砕き、生じたスラリーをろ過し、氷冷ジエチルエーテルで洗浄し、
真空乾燥した。標記の塩（６）を定量的収率で得た。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）：１．４６及び１．５１（２ｘｓ、９Ｈ、ロ
タマー）；２．３５−２．４７（ｍ、２Ｈ）；３．５０−３．５５（ｍ、１Ｈ）
；３．７４−３．８６［ｍ、４Ｈ、｛３．７９及び３．８０（２ｘｍ、３Ｈ、ロ
タマー）を含む｝］；３．８９−３．９５（ｍ、１Ｈ）及び４．４６−４．５０
（ｍ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２１０（１００）

【０３１０】 （２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ
−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（７） （２Ｓ，４Ｒ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカ
ルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル クロリド（６）（０．８３ｇ、２．９
６ミリモル）と３−メトキシベンズアルデヒド（０．３８ｇ、２．８ミリモル）
をオルトぎ酸トリメチル（８ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で４５分間撹拌し
た。この溶液をシアノ硼水素化ナトリウム（０．２８ｇ、４．４６ミリモル）で
ゆっくりと処理し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモニターした。完了した（〜
１．５時間）ならば、反応を硫酸水素カリウム飽和水溶液により停止させ、ジク
ロルメタンにより抽出した。水性相のｐＨ値を９に調節し、ジクロルメタンによ
り逆抽出した。一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発さ
せて標記のアミン（７）を定量的収率で与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：１．４０及び１．４５（２ｘｓ、９Ｈ、ロ
タマー）；２．０７−２．１９（ｍ、２Ｈ）；３．１８−３．２３及び３．３２
−３．３６（２ｘｍ、１Ｈ）；３．４３−３．５３（ｍ、１Ｈ）；３．７０−３
．７４［ｍ、４Ｈ、｛３．７２及び３．７３（２ｘｍ、３Ｈ、ロタマー）を含む
｝］；３．８１（ｓ、３Ｈ）；４．３２−４．３６及び４．４０−４．４４（２
ｘｍ、１Ｈ）；６．７９−６．８１（ｍ、１Ｈ）；６．８７−６．８９（ｍ、２
Ｈ）及び７．２４（ｔ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２６５［（Ｍ＋Ｈ）⁺−Ｃ₅Ｈ₉
Ｏ₂］（１００）

【０３１１】 （２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジ
ル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）
２−メチル（８） （２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１
Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（７）（０．
３ｇ、０．８２ミリモル）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１０６
ｇ、０．８２ミリモル）を無水ジクロルメタン（０．８ｍＬ）に溶解してなる溶
液を窒素雰囲気下に室温で撹拌した。この溶液を塩化ｔ−ブチルアセチル（０．
１３３ｇ、０．９９ミリモル）により滴下しながら処理し、終夜撹拌した。溶媒
を減圧下に蒸発させ、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン
−酢酸エチル、２：１、ｖ／ｖ）により精製して標記のアミド（８）（１．０ｇ
、４０％）を無色油状物として与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：１．０１及び１．０５（２ｘｓ、９Ｈ、ロ
タマー）；１．３７及び１．４１（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．８７−２．
５６［ｍ、４Ｈ、（２．１６（ｓ、２Ｈ）で含む）］；３．１７−３．３５（ｍ
、１Ｈ）；３．６２−３．８５［ｍ、７Ｈ、｛３．７０及び３．７９（２ｘｓ、
６Ｈ）で含む）］；４．２１−４．２４及び４．２８−４．３５（２ｘｍ、１Ｈ
、ロタマー）；４．４０−４．５８（ｍ、２Ｈ）；４．７３−４．９５及び５．
０３−５．２１（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；６．５４−６．８８（ｍ、３Ｈ）
及び７．１９−７．３１（ｍ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ３６３（１００）

【０３１２】 ２，２，２−トリフルオル酢酸（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタ
ノイル）（３−メトキシアニリノ）］−２−（メトキシカルボニル）テトラヒド
ロ−１Ｈ−２−ピロリウム（９ａ） （２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベン
ジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル
）２−メチル（８）（０．０１ｇ、２１．６μモル）を３０％トリフルオル酢酸
ジクロルメタン溶液（０．５ｍＬ）に室温で添加し、３０分間攪拌する。この溶
液を減圧下に蒸発乾燥させて標記のピロリウム塩（９ａ）を定量的収率で与えた
。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：１．０５（ｓ、９Ｈ）；２．３８−２．５
７（ｍ、４Ｈ）；３．５９−３．６８（ｍ、２Ｈ）；３．７５（ｓ、３Ｈ）；３
．７９（ｓ、３Ｈ）；４．０９−４．１５（ｍ、１Ｈ）；４．５２−４．６３（
ｍ、２Ｈ）；４．７８−４．９４（ｍ、１Ｈ）；６．６６（ｓ、１Ｈ）；６．７
０（ｄ、１Ｈ）；６．８６−６．８８（ｄｄ、１Ｈ）及び７．３１（ｔ、１Ｈ）

【０３１３】 （２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−
［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒ
ドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１０） （２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベン
ジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル
）２−メチル（８）（０．１５ｇ、０．３２ミリモル）を３０％トリフルオル酢
酸ジクロルメタン溶液（３ｍＬ）に室温で添加した。混合物を３０分間攪拌し、
減圧下に蒸発乾燥させた。残留物をジクロルメタンと炭酸カリウム飽和水溶液と
の間で分配させ、５分間激しく振盪させた。有機相を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ ₄ ）、減圧下に蒸発させて１４０ｍｇの粗製の（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３
−ジメチルブタノイル）３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロ
ールカルボン酸メチル（９ｂ）を得た。これは更に精製することなく次の反応に
使用した。 上で製造した粗製のアミン（９ｂ）（１４０ｍｇ）、ピペロナール（７４ｍｇ
、０．４９ミリモル）及び氷酢酸（２滴）を１，２−ジクロルエタン（０．５ｍ
Ｌ）に溶解してなる溶液を室温で３０分間攪拌した。９５％シアノ硼水素化ナト
リウム（３２ｍｇ、０．４８ミリモル）を少量づつ添加し、１時間撹拌し続けた
。反応を重炭酸ナトリウム飽和水溶液（２ｍＬ）で停止させ、ジクロルメタンで
抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させた。残留物を、ジクロルメタ
ン−酢酸エチル（９０：１０〜７５：２５）を溶離剤としてシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーにより精製して標記のピロール（１０）（１１５ｍｇ、７１．
４％）を淡黄色油状物として与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：０．９８−１．０８（ｍ、９Ｈ）；２．０
９−２．５９［ｍ、４Ｈ、｛２．１３（ｓ、２Ｈ）で含む）］；２．９６−３．
０７（ｍ、１Ｈ）；３．４７−３．８５（ｍ、１１Ｈ）；４．４６−４．６３（
ｍ、１Ｈ）；４．８３−４．９４（ｍ、１Ｈ）；５．９２−５．９５（ｍ、２Ｈ
）；６．６３−６．８９（ｍ、６Ｈ）及び７．１５−７．３４（ｍ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４９７［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３１４】 （２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−
［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒ
ドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（１１） （２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４
−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラ
ヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１０）（１００ｍｇ、０．２０
ミリモル）を６６％ｖ／ｖメタノール水溶液（１．０ｍＬ）に溶解してなる溶液
に水酸化リチウム一水和物（１７ｍｇ、０．４０５ミリモル）を添加した。この
混合物を室温で終夜撹拌し、次いで溶媒を減圧下に除去し、残留物をジクロルメ
タン（１．０ｍＬ）と水（１．０ｍＬ）との間で分配させた。水性相を１．０Ｍ
くえん酸水溶液で酸性化し、二つの相を室温で１０分間激しく振盪させた。相を
分離させ、水性相をジクロルメタンで逆抽出した。一緒にしたジクロルメタン抽
出物を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させて標記の酸（１１）（７０ｍｇ
、７２％）をオフホワイトの固体として与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：１．００及び１．０３（２ｘｍ、９Ｈ、ロ
タマー）；２．１７−２．３９（ｍ、３Ｈ）；２．６２−２．７１（ｍ、１Ｈ）
；３．２８−３．３４（ｍ、１Ｈ）；３．４７−３．５６（ｍ、１Ｈ）；３．７
６（ｍ、３Ｈ）；３．９６−４．１３（ｍ、１Ｈ）；４．２１−４．２６（ｍ、
２Ｈ）；４．３６−４．５８（ｍ、３Ｈ）；５．９３（ｄ、２Ｈ）；６．６２−
６．９０（ｍ、６Ｈ）及び７．２１−７．２５（ｍ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４８３［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３１５】 ４−（｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル
）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒ
ドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチ
ル（１２） （２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４
−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラ
ヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（１１）（６０ｍｇ、０．１２ミリモル
）とテトラフルオロ硼酸Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ
’−テトラメチルウロニウム（４８ｍｇ、０．１５ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジイ
ソプロピルエチルアミン（５４μＬ、０．３１ミリモル）をジメチルホルムアミ
ド（１ｍＬ）に加えてなる混合物を室温で１．５時間撹拌した。この混合物を水
で希釈し、酢酸エチルで抽出した。水性相を酢酸エチルで逆抽出し、一緒にした
抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物を、１００％
ジクロルメタン、ジクロルメタン／酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ）及び１００％
酢酸エチルを溶離剤として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより部分的
に精製してＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで汚染された粗生成物を与えた。ジク
ロルメタンを添加し、生じた溶液を水洗した。水性相をジクロルメタンで逆抽出
し、一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させて標記の
ピペラジン（１２）（３３．１ｍｇ、４１％）を与えた。 ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ６５１［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３１６】 Ｎ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル
）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］
−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド ２，２，
２−トリフルオル酢酸塩（１３ａ） ４−（｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチ
ル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラ
ヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブ
チル（１２）（２４ｍｇ、３６．９μモル）をジクロルメタン（０．８ｍＬ）に
溶解してなる溶液をトリフルオル酢酸（０．１ｍＬ、１．３ミリモル）で処理し
た。この混合物を室温で撹拌し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモノターした。
完了したならば、溶媒を減圧下に蒸発させて標記のトリフルオル酢酸塩（１３ａ
）を定量的収率で与えた。この塩は、更に精製することなく次の実験に使用した
。 ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３１７】 Ｎ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル
）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル］−Ｎ１
−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド（１３ｂ） ２６ｍｇの粗製のＮ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソー
ル−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３
−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタ
ンアミド ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（１３ａ）を含有するジクロルメタ
ン（０．８ｍＬ）と水（０．８ｍＬ）との２相混合物を激しく撹拌し、２．０Ｍ
水酸化ナトリウム水溶液により、水性相のｐＨが１２に調節されるまで、滴下し
ながら処理した。相を分離させ、水性相をジクロルメタンで抽出した（２×１ｍ
Ｌ）。有機抽出物を一緒にし、乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させて標記
のピペラジン（１３ｂ）（１２．７ｍｇ、５９％）を与えた。 ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３１８】 Ｎ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル
）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリル］−Ｎ１
−（４−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド、“ｃｉｓ−アミ
ノプロリン”

【化４０】

【０３１９】 （２Ｓ，４Ｓ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカル
ボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル クロリド（１６） パラジウム炭（１０％、０．２５ｇ）と（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドテトラヒ
ドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１
５）（１．００ｇ、３．７ミリモル）を、脱ガスした２％ｖ／ｖ塩酸エタノール
溶液（１０ｍＬ）に加えてなる懸濁液を水素雰囲気（１気圧）下に室温で激しく
撹拌した。終夜撹拌した後、混合物をセライトパッドでろ過し、エタノールで十
分に洗浄した。ろ液を減圧下に蒸発させ、残留物を０℃でｔ−ブチルメチルエー
テルですり砕いた。生じたスラリーをろ過し、氷冷ｔ−ブチルメチルエーテルで
洗浄し、真空乾燥して標記の塩酸塩（１６）（０．７４ｇ、７１％）を白色固体
として与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）：１．２１及び１．２６（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマ
ー）；１．８５−２．０３（ｍ、１Ｈ）；２．５２−２．６５（ｍ、１Ｈ）；３
．２９−３．４８（ｍ、１Ｈ）；３．５８−３．８３（ｍ、５Ｈ）及び４．１４
−４．３４（ｍ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ１８９（１００）

【０３２０】 （２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ
−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１７） （２Ｓ，４Ｓ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカ
ルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル クロリド（１６）（３．００ｇ、１０
．７０ミリモル）と３−メトキシベンズアルデヒド（１．３０ｍＬ、１０．７ミ
リモル）をオルトぎ酸トリメチル（８ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で４５分
間撹拌した。この溶液にトリアセトキシ硼水素化ナトリウム（２．２６ｇ、１０
．７０ミリモル）を３０分間で少量づつ添加し、反応の過程をＴＬＣ分析により
モニターした。完了した（約３０分）ならば、反応を炭酸水素ナトリウム飽和水
溶液（１５ｍＬ）により停止させ、酢酸エチル（１５ｍＬ）により抽出した。有
機抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液により抽出し（２×１５ｍＬ）、乾燥
し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させた。残留物を１００％ジクロルメタン、次
いで１００％酢酸エチルを溶離剤として使用してフラッシュシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーにより精製して標記のアミン（１７）（２．４８ｇ、６４％）
を黄色油状物として与えた。

【０３２１】 （２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジ
ル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）
２−メチル（１８） （２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１
Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１７）（１
．３７ｇ、３．７６ミリモル）とトリエチルアミン（０．６３ｍＬ、４．５２ミ
リモル）を無水ジクロルメタン（１４ｍＬ）に溶解して攪拌した溶液を塩化ｔ−
ブチルアセチル（０．５３ｍＬ、３．８２ミリモル）で滴下しながら処理した。
室温で終夜攪拌した後、混合物をジクロルメタン（５０ｍＬ）で希釈し、１．０
Ｍくえん酸水溶液で洗浄した（２×５０ｍＬ）。相を分離させ、水性相をジクロ
ルメタン（２５ｍＬ）で逆抽出し、一緒にした有機相を炭酸水素ナトリウム飽和
水溶液で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させた。残留物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、２：１、ｖ／ｖ）によ
り精製して標記のアミン（１８）（１．５ｇ、８６％）を淡黄色油状物として与
えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：１．００及び１．０６（２ｘｓ、９Ｈ、ロ
タマー）；１．３８及び１．４２（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．８１−１．
９３（ｍ、１Ｈ）；２．１５（ｓ、２Ｈ）；２．３０−２．５１（ｍ、１Ｈ）；
３．１８−３．２５（ｍ、１Ｈ）；３．６２−３．８５［ｍ、４Ｈ、｛３．６９
（ｓ、３Ｈ）で含む）］；３．７８（ｍ、３Ｈ）；４．１５−４．２５（ｍ、１
Ｈ）；４．４５−４．６１（ｍ、２Ｈ）；５．１０−５．２３（ｍ、１Ｈ）；６
．６４−６．８２（ｍ、３Ｈ）及び７．１３−７．３１（ｍ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ３６３（１００）

【０３２２】 ２，２，２−トリフルオル酢酸（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタ
ノイル）（３−メトキシアニリノ）］−２−（メトキシカルボニル）テトラヒド
ロ−１Ｈ−２−ピロリウム（１９ａ） （２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベン
ジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル
）２−メチル（１８）（５２４ｍｇ、１．１３ミリモル）を２１％ｖ／ｖトリフ
ルオル酢酸ジクロルメタン溶液（６．６ｍＬ）に室温で添加した。この混合物を
５０分間攪拌し、次いで減圧下に蒸発乾燥させて０．９８ｇの標記のピロリウム
塩（１９ａ）とトリフルオル酢酸との混合物を与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：１．０８（ｓ、９Ｈ）；２．３４−２．４
２（ｍ、１Ｈ）；２．４７（ｓ、３Ｈ）；２．６３−２．７２（ｍ、１Ｈ）；３
．６１−３．７１（ｍ、２Ｈ）；３．８２（ｓ、３Ｈ）；３．８３（ｓ、３Ｈ）
；４．０７−４．１４（ｍ、１Ｈ）；４．４３−４．５４（ｍ、１Ｈ）；４．５
７−４．６７（ｍ、２Ｈ）；６．６８−６．７４（ｍ、２Ｈ）；６．９０−６．
９３（ｄｄ、１Ｈ）；及び７．３４（ｔ、１Ｈ）

【０３２３】 （２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−
［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒ
ドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（２０） （２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベン
ジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル
）２−メチル（１８）（１３８ｍｇ、０．３８ミリモル）を３０％ｖ／ｖトリフ
ルオル酢酸ジクロルメタン溶液（３ｍＬ）に室温で添加した。この混合物を３０
分間攪拌し、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物をジクロルメタンと炭酸カリウム
飽和水溶液との間で分配させ、５分間激しく振盪させた。有機相を分離し、乾燥
し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させて１４０ｍｇの粗製の（２Ｓ，４Ｒ）−４
−［（３，３−ジメチルブタノイル）３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１
Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１９ｂ）を得た。これは更に精製すること
なく次の反応に使用した。 （２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベン
ジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１９ｂ）
（１３８ｍｇ、０．３８ミリモル）、ピペロナール（５８ｍｇ、０．３９ミリモ
ル）及び氷酢酸（２２５μＬ、３．９３ミリモル）をテトラヒドロフラン（２．
８ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で３０分間攪拌した。９５％シアノ硼水素化
ナトリウム（１２５ｍｇ、１．８８ミリモル）を少量づつ添加し、同じ温度で４
５分間撹拌し続けた。酢酸エチル（５ｍＬ）で希釈した後、反応混合物を炭酸水
素ナトリウム飽和水溶液（２×５ｍＬ）及び塩水（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（
ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させた。残留物を、１００％ジクロルメタン及びジ
クロルメタン−酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ）を溶離剤としてシリカゲルカラム
クロマトグラフィーにより精製して標記のピロール（２０）を与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：０．８９及び０．９９（２ｘｓ、９Ｈ、ロ
タマー）；１．６５−１．７９（ｍ、１Ｈ）；１．８７−２．１１［ｍ、３Ｈ、
｛１．９４（ｓ、２Ｈ）で含む）］；２．２１−２．６６（ｍ、２Ｈ）；３．０
４−３．１５（ｍ、２Ｈ）；３．５６（ｓ、３Ｈ）；３．６７−３．７４［ｍ、
４Ｈ｛３．６７（ｓ、３Ｈ）で含む）］；４．４３−４．６４（ｍ、２Ｈ）；４
．７４−４．９２（ｍ、１Ｈ）；５．１０−５．１４（ｍ、１Ｈ）；５．７４−
５．８８（ｍ、２Ｈ）；６．４９−６．７８（ｍ、６Ｈ）及び７．０２−７．１
０（ｍ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４９７［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３２４】 （２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−
［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒ
ドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（２１） （２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４
−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラ
ヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（２０）（１００ｍｇ、０．２０
ミリモル）を６％ｖ／ｖメタノール水溶液（１．０ｍＬ）に溶解してなる溶液に
水酸化リチウム一水和物（１７ｍｇ、０．４０５ミリモル）を添加した。この混
合物を室温で終夜撹拌し、次いで溶媒を減圧下に除去し、残留物をジクロルメタ
ン（１．０ｍＬ）と水（１．０ｍＬ）との間で分配させた。水性相を１．０Ｍく
えん酸水溶液で酸性化し、二つの相を室温で１０分間激しく振盪させた。相を分
離させ、水性相をジクロルメタンで逆抽出した。一緒にしたジクロルメタン抽出
物を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発させた。残留物を、溶離剤としてジク
ロルメタン／酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）、次いでジクロルメタン／メタノー
ル（９：１、ｖ／ｖ）を使用してフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーにより精製して標記の酸（２１）（８８ｍｇ、９１％）をオフホワイトの固体
として与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：０．９５（ｓ、９Ｈ）；２．１８［ｍ、３
Ｈ、｛２．１８（ｓ、２Ｈ）で含む）；２．６２−２．８７（ｍ、１Ｈ）；３．
１７−３．２８（ｍ、１Ｈ）；３．４２−３．４７（ｍ、１Ｈ）；３．７３（ｍ
、３Ｈ）；３．８２−３．９３（ｍ、１Ｈ）；３．９４−４．６０（ｍ、１Ｈ）
；４．４１−４．６５（ｍ、４Ｈ）；５．９０−５．９４（ｍ、２Ｈ）；６．６
３−６．９３（ｍ、６Ｈ）及び７．２１−７．２５（ｍ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４８３［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３２５】 ４−（｛（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル
）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒ
ドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチ
ル（２２） （２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４
−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラ
ヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（２１）（９６．５ｍｇ、０．２０ミリ
モル）とテトラフルオロ硼酸Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（７７ｍｇ、０．２４ミリモル）及びＮ，Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミン（８７μＬ、０．５０ミリモル）をジメチルホルム
アミド（１ｍＬ）に加えてなる混合物を室温で１．５時間撹拌した。この混合物
を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。水性相を酢酸エチルで逆抽出し、一緒に
した有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物を、
溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）、次いで１００％酢酸エ
チルを使用して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のピ
ペラジン（２２）（８９ｍｇ、６８％）を与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：０．９５及び０．９７（２ｘｓ、９Ｈ、ロ
タマー）；１．４６（ｓ、９Ｈ）；１．７４（ｓ、２Ｈ）；２．０１−２．２４
及び２．３８−２．４４（２ｘｍ、２Ｈ、ロタマー）；２．５５−２．５９及び
２．７０−２．８１（２ｘｍ、２Ｈ）；３．０９−３．５８（ｍ、９Ｈ）；３．
７４−３．８５［ｍ、３Ｈ、（３．７６及び３．７９（２ｘｓ、３Ｈ、ロタマー
）で含む）］；３．９４−４．０５及び４．０６−４．１９（２ｘｍ、１Ｈ、ロ
タマー）；４．２４−４．４１及び４．６１−４．６９（２ｘｍ、２Ｈ、ロタマ
ー）；４．８６−４．９６及び５．１１−５．２１（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）
；５．８９−６．０１（ｍ、２Ｈ、ロタマー）；６．５８−６．９８（ｍ、６Ｈ
）；７．１３−７．１８及び７．２５−７．２７（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ６５１［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３２６】 Ｎ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル
）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］
−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド ２，２，
２−トリフルオル酢酸塩（２３ａ） ４−（｛（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチ
ル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラ
ヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブ
チル（２２）（２１．７ｍｇ、３３．３μモル）をジクロルメタン（０．５ｍＬ
）に溶解してなる溶液を９５％ｖ／ｖトリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（０
．１ｍＬ、１．２ミリモル）で処理した。この混合物を室温で撹拌し、反応の過
程をＴＬＣ分析によりモノターした。完了した（１時間）ならば、溶媒を減圧下
に蒸発させて２２．８ｍｇの標記のトリフルオル酢酸塩（２３ａ）と酢酸エチル
とトリフルオル酢酸との混合物を与えた。この塩は、更に精製することなく次の
実験に使用した。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：０．９８（ｓ、９Ｈ）；２．０８−２．１
８（ｍ、１Ｈ）；２．３２（ｄ、１Ｈ）；２．４３（ｄ、１Ｈ）；２．７３−２
．８２（ｍ、１Ｈ）；３．３０−３．７３（ｍ、８Ｈ）；３．７７（ｓ、３Ｈ）
；３．９０−３．９６（ｍ、１Ｈ）；４．０６−４．１９（ｍ、１Ｈ）；４．３
６−４．４６（ｍ、２Ｈ）；４．５７（ｄ、１Ｈ）；４．６５−４．７３（ｍ、
１Ｈ）；５．５７−６．０１（ｍ、２Ｈ）；６．６１−６．６６（ｍ、２Ｈ）；
６．７６−６．９１（ｍ、４Ｈ）及び７．２９（ｔ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３２７】 Ｎ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル
）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］
−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド（２３ｂ） ２２．８ｍｇの粗製のＮ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキ
ソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ
−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチル
ブタンアミド ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（２３ａ）を含有するジクロル
メタン（０．５ｍＬ）と水（０．５ｍＬ）との２相混合物を２．０Ｍ水酸化ナト
リウム水溶液により、水性相のｐＨが１２に調節されるまで、処理した。この混
合物を室温で５分間激しく撹拌し、相を分離させた。水性相をジクロルメタンで
抽出し（２×１ｍＬ）、一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、減圧下
に蒸発させて標記のピペラジン（２３ｂ）（１４．５ｍｇ、７９％）を与えた。 δ_H（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：０．９７及び１．０９（２ｘｓ、９Ｈ、ロ
タマー）；１．６６−１．７９［ｍ、３Ｈ、｛１．７９（ｓ、２Ｈ）で含む）］
；２．０３（ｄ、１Ｈ）；２．１３（ｄ、１Ｈ）；２．３２−２．４７（ｍ、１
Ｈ）；２．５４−２．８８（ｍ、５Ｈ）；３．０５−３．１２（ｍ、１Ｈ）；３
．２９−３．６７（ｍ、５Ｈ）；３．７６（ｓ、３Ｈ）；３．８６（ｄ、１Ｈ）
；４．６６（ｄ、１Ｈ）；４．９７（ｄ、１Ｈ）；５．０８−５．２２（ｍ、１
Ｈ）；５．８９−５．９２（ｍ、２Ｈ）；６．５９−６．８１（ｍ、６Ｈ）及び
７．０９−７．１８（ｔ、１Ｈ） ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）⁺］（１０
０）

【０３２８】 保護基の枠の変更は、本発明の化合物を製造し得る効率及び速度を増大させる
ことができる。斯界で知られた方法と相まって前記した開示に基づいて、当業者
により容易に実施することができる以下に説明する反応式は、ヘッジホッグ活性
を示し得る化合物に対する迅速且つ有効な経路を提供する。理解されるように、
特定の部分、基及び反応（例えば、アミンの求電子性又は還元的アルキル化）は
、例えば、式Ｉ〜VIの何れかに従う構造を有する広範な化合物を製造するように
変更することができる。また、Ｊ．Ｗ．ミケルソン、Ｋ．Ｌ．ベロンガ及びＥ．
Ｊ．ヤコブセン、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０；４１７７−４１８３
も参照されたい。

【０３２９】反応式１

【化４１】

【０３３０】反応式２

【化４２】

【０３３１】反応式３

【化４３】

【０３３２】反応式４

【化４４】

【０３３３】 固相経路 このテンプレートでの製造を実施するのに使用される合成経路を反応式５に記
載する。反応式５

【化４５】

【０３３４】 洗浄プロトコル 方法１：水（３ｘ）、アセトン（２ｘ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３
ｘ）、水（２ｘ）、アセトン（１ｘ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｘ）
、水（２ｘ）、アセトン（３ｘ）、メタノール（３ｘ）、アセトン（３ｘ）及び
メタノール（３ｘ）。 方法２：ジクロルメタン、ヘキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロ
ルメタン、ヘキサン、ジクロルメタン及びヘキサン。 方法３：水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水、１．０Ｍ水酸化ナトリウム
水溶液、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水、１．０Ｍ水酸化ナトリウム水
溶液、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、メタノール、ジク
ロルメタン及びメタノール。 方法４：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド、ジクロルメタン、メタノール、ジクロルメタン、メタノール（２
×）及びエーテル（２×）。 方法５：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド、ジクロルメタン、メタノール、ジクロルメタン及びメタノール（
２×）。 溶媒中の樹脂の膨潤は、樹脂１ｇ当たりの溶媒１０ｍＬの標準量に基づいてい
た。

【０３３５】 工程Ａ：（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキ
シメチルポリスチレン（ワングのＰＮＰカーボネートポリスチレン）の製造 ・ヒドロキシベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（ワングの樹脂） クロルメチルポリスチレン（２．４ｋｇ、３．６モルの官能化負荷量）と４−
ヒドロキシベンジルアルコール（５８１ｇ、４．６８モル）をＮ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド（１０Ｌ）に加えて撹拌した混合物にナトリウムメトキシド（２３
３ｇ、４．３１モル）を窒素雰囲気下にゆっくりと添加した。Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド（１３Ｌ）を添加した後、混合物を５０℃に５時間加熱し、次いで
カニューレを経てＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過した。粗生成物
を方法１にリストした順序を使用して十分に洗浄し、次いで６０℃で真空乾燥し
て２６３０ｇの標記の樹脂を与えた。 ・（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチ
ルポリスチレン（ワングのＰＮＰカーボネートポリスチレン） ヒドロキシベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（２０００ｇ、２．５
モルの官能化負荷量）と４−ニトロフェノールクロルぎ酸エステル（１２０９ｇ
、６．０モル）をジクロルメタン（２２Ｌ）に加えて撹拌した混合物に４−メチ
ルモルホリン（６６０ｍＬ、６．０モル）を０℃で窒素雰囲気下に２時間にわた
り滴下した。この混合物を室温まで徐々に加温し、終夜撹拌し、カニューレを経
てＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過した。粗製の樹脂を方法２にリ
ストした順序を使用して十分に洗浄し、次いで室温で真空乾燥して２７２８ｇの
標記の樹脂と４−メチルモルホリン塩酸塩との混合物を与えた。

【０３３６】 工程Ｂ：ワングの樹脂に結合されたジアミンの製造 ・一般的方法（ピペラジン、ホモピペラジン及びｔｒａｎｓ−１，４−ジアミノ
シクロヘキサンのための） 粗製の（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキ
シメチルポリスチレン（１００２．５ｇ、〜０．９モルの官能化負荷量）を無水
ジクロルメタンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合物（１：１、ｖ／ｖ、９
Ｌ）中で窒素雰囲気下に１５分間膨潤させた。Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミン（
６２６ｍＬ、５モル当量）と適当なジアミン（５モル当量）を添加し、混合物を
終夜室温で激しく撹拌した。この混合物をＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）に
よりろ過し、方法３にリストした順序を使用して十分に洗浄し、６０℃で真空乾
燥して樹脂に結合されたジアミンを得た。 ・ワングの樹脂に結合されたエチレンジアミン 粗製の（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキ
シメチルポリスチレン（１００２．５ｇ、〜０．９モルの官能化負荷量）をジク
ロルメタン（７Ｌ）に窒素雰囲気下で１５分間膨潤させ、エチレンジアミン（１
８１ｍＬ、２．７モル）により処理した。生じた濃厚な黄色懸濁液をジクロルメ
タン（２Ｌ）で希釈し、終夜室温で激しく撹拌した。この混合物をＰ−ＥＴＦＥ
メッシュ（７０μｍ）によりろ過し、方法３にリストした順序を使用して十分に
洗浄し、６０℃で真空乾燥して標記の樹脂に結合されたジアミンを得た。 ・ワングの樹脂に結合されたｍ−キシレンジアミン 粗製の（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキ
シメチルポリスチレン（１００２．５ｇ、〜０．９モルの官能化負荷量）をテト
ラヒドロフラン（７Ｌ）に窒素雰囲気下で１５分間膨潤させ、ｍ−キシレンジア
ミン（８２８ｍＬ、６．２７モル）をテトラヒドロフラン（１Ｌ）に溶解してな
る溶液により処理した。生じた濃厚な黄色懸濁液をジクロルメタン（２Ｌ）で希
釈し、終夜室温で激しく撹拌した。この混合物をＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μ
ｍ）によりろ過し、方法３にリストした順序を使用して十分に洗浄し、６０℃で
真空乾燥して標記の樹脂に結合されたジアミンを得た。

【０３３７】 工程Ｃ：ワングのジアミンへの構成ブロックの負荷 適当な樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で１５分間膨潤させ、次いで穏
やかに撹拌し、１−［９Ｈ−９−フルオレニルメトキシカルボニル］−４−オキ
ソ−２（Ｓ）−ピロリジンカルボン酸（２当量）により処理した。３０分後に、
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２当量）とＮ，Ｎ’−ジイソプロピ
ルカルボジイミド（２当量）を添加し、樹脂懸濁液を終夜室温で穏やかに撹拌し
た。ろ過した後、樹脂を方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４０
℃で真空乾燥した。

【０３３８】 工程Ｄ：Ｃ−４での還元的アミノ化 適当な樹脂を無水テトラヒドロフランとメタノールとの５０％ｖ／ｖ混合物中
で１５分間膨潤させ、穏やかに撹拌し、氷酢酸（１０当量）により処理した。適
当なアミン（５当量）とシアノ硼水素化ナトリウム（５当量）を添加し、樹脂懸
濁液を終夜室温で穏やかに撹拌した。ろ過した後、樹脂を方法４にリストした順
序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。

【０３３９】 工程Ｅ：還元的アルキル化又はキャッピング ・還元的アルキル化 適当な樹脂を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で膨潤させ、次いで穏やか
に撹拌し、氷酢酸（１０当量）で処理した。適当なアルデヒド（５当量）とトリ
アセトキシ硼水素化ナトリウム（５当量）を添加し、樹脂懸濁液を室温で１時間
注意深く撹拌した。次いで、この期間中に反応容器内に発生した圧力を解放し、
懸濁液の穏やかな撹拌を終夜室温で継続した。次いで、樹脂をろ過し、方法４に
リストした順序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。 ・酸クロリドによるキャッピング 適当な樹脂を無水テトラヒドロフランとクロロホルムとの５０％ｖ／ｖ混合物
に懸濁させて穏やかに撹拌した懸濁液に、適当な酸クロリド（５当量）とＮ，Ｎ
−ジイソプロピルエチルアミン（１０当量）を添加した。終夜室温で穏やかに撹
拌した後、樹脂をろ過し、方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４
０℃で真空乾燥した。

【０３４０】 工程Ｆ：Ｎ−Ｆｍｏｃの脱保護 樹脂類似体を２０％ｖ／ｖピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液中
に懸濁させ、室温で３０プ間穏やかに撹拌した。次いで、樹脂懸濁液をろ過し、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した。ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド溶液によるこの処理をもう１回繰り返して完全なＮ−Ｆｍｏｃの脱保護
を確実にさせた。３０分間放置した後、樹脂をろ過し、方法４にリストした順序
を使用して洗浄し、４０℃で真空乾燥した。

【０３４１】 工程Ｇ：Ｎ１での還元的アルキル化又はキャッピング ・還元的アルキル化 適当な樹脂（２ｍＬのフィルターブロック内でウエル１個あたり〜６０ｍｇ）
を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中で膨潤させ、次いで穏やかに
撹拌し、氷酢酸（〜５０μＬ、１０当量）で処理した。適当なアルデヒド（５当
量）とトリアセトキシ硼水素化ナトリウム（〜８５ｍｇ、５当量）を添加し、次
いでフィルターブロックを終夜室温で穏やかに撹拌した。次いで、それぞれの樹
脂をろ過し、方法５にリストした順序を使用して洗浄した。 ・酸クロリドによるキャッピング 適当な樹脂（２ｍＬのフィルターブロック内でウエル１個あたり〜６０ｍｇ）
を無水テトラヒドロフランとクロロホルムとの５０％ｖ／ｖ混合物（１ｍＬ）中
で膨潤させ、次いで穏やかに撹拌し、適当な酸クロリド（５当量）及びＮ，Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミン（〜１５０μＬ、１０当量）で処理した。フィルタ
ーブロックを終夜室温で穏やかに撹拌した後、樹脂をろ過し、方法５にリストし
た順序を使用して洗浄した。

【０３４２】 工程Ｈ：ＴＦＡを使用してワングの樹脂からの最終生成物の解裂 適当な樹脂をＤＣＭ中で膨潤させ、９５％ｖ／ｖＴＦＡジクロルメタン溶液を
添加することにより最終生成物を解裂させた。４つの別個のＴＦＡアリコート（
２×３００μＬ、７５μＬ及び５００μＬ）を添加し、これらから得られたろ液
を９６個のウエルを収容するプレート内に集めた。アリコート１、２及び４の添
加により得られたろ液を同じ９６個のウエルのプレートを使用して集めた。また
、アリコート３（７５μＬ）の添加後に得られたろ液を分析用の９６個のウエル
のプレートを使用して別個に集めた。次いで、全ての画分をジェネバック装置を
使用して減圧下に蒸発させて最終生成物を得た。

【０３４３】生物学的アッセイ リード化合物の発見／高スループットスクリーニングアッセイ 試験すべき化合物を、ＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度まで溶解させて、−２０℃に
保存する。アッセイ用細胞中のヘッジホッグ経路を活性化させるために、オクチ
ル化(脂質改変)型のソニックヘッジホッグタンパク質のＮ末端断片(ＯＣＴ−Ｓ
ＨＨ)を利用する。このＮ末端ＳＨＨ断片を細菌により生成する。

【０３４４】 化合物を、下記の「Ｇｌｉ−Ｌｕｃ」アッセイにて、細胞株１０Ｔ(ｓ１２)を
用いて試験することができ、ここに、これらの細胞は、ルシフェラーゼをレポー
ター遺伝子として利用するヘッジホッグ応答性レセプター構築物を含んでいる。
この方法において、ヘッジホッグ経路のシグナル伝達活性を、Ｇｌｉ−Ｌｕｃ応
答により測定することができる。

【０３４５】 １０ｔ１／２(ｓ１２)細胞を、９６ウェルミクロ滴定プレート(ＭＴＰ)中の完
全培地[１０％ ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ]に、２０，０００細胞／ウェルでプレ
ートする。次いで、プレートを、３７℃で５％ＣＯ₂中での一晩(Ｏ／Ｎ)のイン
キュベーションのためにインキュベーター中に置く。２４時間後に、培地をルシ
フェラーゼアッセイ用培地(０．５％ ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ)と交換する。化
合物を解凍し、アッセイ用培地で３：１０００(約３００倍)に希釈して、約３０
μＭの出発濃度を生じる。

【０３４６】 続いて、１５０μｌの各３０μＭの試料を第一のウェルに加える(三連で)。こ
れらのＭＴＰ試料を、次いで、３倍希釈で、全部で７つのウェルに希釈して、最
終的に、各化合物について、７つの希釈物の群を三連で生成する。次に、タンパ
ク質リガンドＯＣＴ−ＳＨＨをルシフェラーゼアッセイ用培地中で希釈し、各ウ
ェルに終濃度０．３μｇ／ｍｌで加える。次いで、プレートを、３７℃で、５％
ＣＯ²中での更なるインキュベーション(Ｏ／Ｎ)のためにインキュベーターに戻
す。２４時間後に、プレートをインキュベーターから取り出して、培地を吸引／
廃棄する。ウェルをアッセイ用緩衝液[ＰＢＳ＋１ｍＭ Ｍｇ²⁺及び１ｍＭ Ｃａ^{2 +} ]で一回洗う。次いで、５０μｌのアッセイ用緩衝液を各ウェルに加える。ルシ
フェラーゼアッセイ用試薬を、販売者(PackardのＬｕｃＬｉｔｅキット)により
記載されたように調製し、５０μｌを各ウェルに加える。プレートを室温(ＲＴ)
で、約３０分間にわたってインキュベートし、その後、シグナルを、やはりＲＴ
で、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ(Packard)にて読む。

【０３４７】 このアッセイで同定された化合物を、図３２に描いた。上記のアッセイにおけ
る描かれた化合物の個々のジアステレオマーの試験は、シス異性体が、一層大き
い活性を示す傾向があり、ときには、トランス異性体化合物の１００倍を超える
ということを示した。その上、主題の化合物のアンモニウム塩誘導体例えばＴＦ
Ａ塩は、上記のアッセイにおいて、同等か一層大きい活性を示すことが示された
。

【０３４８】 特定の化合物の活性を下記の表１に与える：

【表１】

【０３４９】 Ｐｔｃ−ヌルアッセイ方法 Ｐｔｃ−細胞を、３日間、ビヒクル；ジャービン(公知のパッチト経路のアン
タゴニスト(ｉ)ここではポジティブコントロールとして使用)；又は１μＭの化
合物Ｄの存在下で培養した。全リボ核酸(ＲＮＡ)を、細胞から単離して、逆転写
−ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)用に用いた。マウスｇｌｉ−１ｍＲＮＡ
の検出のための特異的プライマーをこのＰＣＲにおいて用い、又、同量のｍＲＮ
Ａ試料をこの実験において比較するためにアクチン遺伝子を用いた。これらのｇ
ｌｉ−１及びアクチンｍＲＮＡ試料を、次いで、１．５％アガロースゲルに載せ
、エチジウムブロミドを用いる染色により検出した。同じ試料を、定量的リアル
タイムポリメラーゼ連鎖反応法により分析してｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルを定
量した。

【０３５０】結果 図３３Ａは、代表的な実験結果を示している。それは、ビヒクルコントロール(
レーン１)；ポジティブコントロール化合物の５μＭ ジャービン(レーン２)；及
び１μＭ Ｄ(レーン３)で処理した細胞におけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を示
している。ビヒクルと比較して、Ｄ及びジャービンは、ｐｔｃ−ヌル細胞におい
て、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を有意に低下させた。アクチンｍＲＮＡのレベル
は、すべての条件において等しかったが、これは、等量のＲＮＡがこの実験にお
いて分析されたことを示している。この定性的結果は、定量的リアルタイムＰＣ
Ｒ分析(図３３Ｂ)により確認されたが、これは、Ｄ及びジャービンがｇｌｉ−１
ｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートしたことを示している。

【０３５１】 まとめると、これらの実験は、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡ転写物の発現の阻害により
示されるように、ｐｔｃ−ヌル細胞のＤへの３日間の暴露がパッチト経路をダウ
ンレギュレートすることを確実にするものである。

【０３５２】 マウス胎児皮膚パンチアッセイ：Ｄへの長期間の暴露の効果方法 新規な細胞培養アッセイを確立して、皮膚におけるパッチト経路の活性化に対
するＤの効果を測定した。この系においては、パッチト経路の活性化は、ｐｔｃ
遺伝子の増大した発現を生じる。

【０３５３】 胎児の皮膚におけるパッチト経路の活性をモニターするために、我々は、トラ
ンスジェニックパッチト経路レポーターマウス由来の皮膚切片を培養した。これ
らのマウスは、外来遺伝子(ｌａｃＺ)を有するように遺伝子工学的に処理したも
のである。このｌａｃＺ遺伝子は、細菌のβ−ガラクトシダーゼをコードしてい
る。この遺伝子を、ｐｔｃ遺伝子座に、正常のｐｔｃ機能が可能なように挿入し
た。次いで、Ｓｈｈ誘導されたパッチト経路の活性化に応答してのｐｔｃの活性
化を、ｌａｃＺ遺伝子産物のβ−ガラクトシダーゼの生成によりモニターするこ
とができる(β−ガラクトシダーゼは、基質のＸ−ｇａｌの青色反応生成物への
酵素的変換により検出することができる)。

【０３５４】 １７．５日齢の胎児の皮膚を、これらのトランスジェニックレポーターマウス
から２ｍｍの円形パンチとして外植して、Ｓｈｈタンパク質の存在下で５〜７日
間培養した(図３４)。Ｓｈｈタンパク質は、これらの培養中のＸ−ｇａｌ染色の
量を増大させるので、ｐｔｃ遺伝子の発現をアップレギュレートするはずである
。Ｄの効果を試験するために、皮膚パンチを、６日間、Ｓｈｈタンパク質とＤの
両者の存在下で培養した(図３５)。

【０３５５】結果 予想されるように、Ｓｈｈタンパク質を培養皮膚外植片に加えることは、これ
らの培養物の青色のＸ−ｇａｌ染色により示されるように、ｐｔｃ活性化を生じ
た（図３４Ａ−Ｘ−ｇａｌ）。

【０３５６】 切片化皮膚パンチのヘマトキシリン及びエオシン(Ｈ＆Ｅ)染色は、強く染色さ
れる好塩基性核及び高い核対細胞質比を有する細胞を示した(図３４Ａ − Ｈ＆
Ｅ[１０×]及びＨ＆Ｅ[４０×])。これらの構造は、皮膚層中でクラスターにて
配置され且つ正常の外観の皮膚細胞の柵により分離された点においてＢＣＣに似
ている。

【０３５７】 Ｘ−ｇａｌ染色は、パッチト経路が、これらのＢＣＣ様構造内の細胞において
活性であることを示した(図３４Ａ − エオシン＋Ｘ−ｇａｌ)。公開された結果
と一致し且つヒトＢＣＣと類似して、このマウス皮膚パンチ中のＢＣＣ様クラス
ターは、ケラチン１４(未分化ケラチノサイトのマーカー)を発現した(図３４Ｂ)
。

【０３５８】 皮膚パンチを、６日間、Ｓｈｈタンパク質とＤの両者の存在下で培養して、Ｄ
の効果を試験した。図３５は、Ｓｈｈ処理した皮膚パンチにおけるパッチト経路
の活性レベルに対するＤの投与量依存性の効果を示している。Ｄの増大する濃度
(０．０１〜１μＭ)は、ｌａｃＺレポーター酵素活性の量によりモニターして、
経路の活性の量の投与量依存性の減少へと導いた(図３５Ａ)。Ｄ処理した外植片
のレポーター酵素染色は、０．２μＭ ＤがＸ−ｇａｌ染色を、Ｓｈｈタンパク
質だけで処理した皮膚パンチの強いＸ−ｇａｌ染色と比較して減少させたことを
示した(図３５Ｂ)。これは、Ｄが、パッチト経路の活性をブロックしてｐｔｃ遺
伝子の発現をダウンレギュレートしたことを示している。

【０３５９】 次の実験は、パッチト経路をＤで阻害することは、ＢＣＣ様構造の形成を防止
するであろうことを示した。図３５Ｃは、Ｄが、正常皮膚細胞の完全性に影響を
与えることなくＢＣＣ様構造の形成を完全にブロックしたことを示している。こ
れは、Ｄが、パッチト経路(ヒトの病気の根底にある同様の経路)の活性化により
生成されるＢＣＣ様構造の出現を防止することができることを確実にしている。

【０３６０】 マウス胎児皮膚パンチのアッセイ：Ｄによる短期の予備処理の効果方法 トランスジェニックマウス由来の皮膚パンチを、Ｓｈｈの非存在下で５時間に
わたって、ビヒクル又はＤにより処理した。この予備処理後に、ビヒクル又はＤ
を除去した。これらの皮膚パンチを、２回洗い、次いで、Ｓｈｈの存在下で、６
日間培養した。実験の終りに、これらの皮膚パンチを固定して、Ｘ−ｇａｌで染
色してパッチト経路活性を測定した。

【０３６１】 結果 外因性Ｓｈｈタンパク質だけで６日間処理した皮膚パンチは、ビヒクルだけで
処理したものと比較して、強いＸ−ｇａｌ染色(即ち、活性化)を示した(図３６
、上段)。１０、２０及び５０μＭのＤにより５時間にわたって予備処理してか
ら外因性Ｓｈｈタンパク質にさらした皮膚パンチは、Ｘ−ｇａｌ染色の存在しな
いことにより示されるように、パッチト経路のＳｈｈタンパク質で誘導されるア
ップレギュレーションの完全な阻止を示した(図３６、下段 − 右側の３スライ
ド)。パッチト経路のアップレギュレーションを示す強いＸ−ｇａｌ染色は、ビ
ヒクルで予備処理してからＳｈｈタンパク質にさらした皮膚パンチにおいて見ら
れた(図３６、下段左側)。この短期間の予備処理は、本質的に、ｐｔｃ阻害のレ
ベルに関して、６日間のＤへの暴露に等しかった(図３６の上段と下段を比較さ
れたい)。

【０３６２】 これらの結果は、Ｄが、その標的にきつく結合すること及び解離の速度論が遅
いか又は不可逆であることを示唆している。このデータは又、ＤがＢＣＣの発生
を予防する能力を有しうることをも示唆している。

【０３６３】 マウス胎児皮膚パンチのアッセイ：先在性ＢＣＣ様構造のＤによる長期処理方法 トランスジェニックパッチト経路レポーターマウス由来の、１７．５日齢胎児
皮膚パンチを、Ｓｈｈタンパク質の存在下で７日間培養して、ＢＣＣ様構造の発
生を可能にした。このＳｈｈタンパク質を、７日間の最後に除去した。これらの
培養物を、次いで、Ｓｈｈタンパク質にビヒクル又はＤを加えたものに、３日間
さらした。これらの培養物を、１０日後に組織学的に分析して、パッチト経路の
活性化を示すＢＣＣ様構造の形成を評価した。

【０３６４】 結果 組織学的分析は、Ｄが、１又は５μＭで、処理した皮膚パンチにおけるＳｈｈ
誘導されたＢＣＣ様構造の大きさと数を、ビヒクルで処理した外植片と比較して
有意に減少させるということを示した(図３７Ａ)。従って、存在するＢＣＣ様構
造をＤに３日間さらすことがこれらの構造の退行を誘導したらしい。その上、Ｄ
は、皮膚細胞に対しては、それらの正常な組織学により測定して、一般的な細胞
障害性効果を有しているようには見えなかった。

【０３６５】 Ｄ誘導されるＢＣＣ様構造の退行の一つの可能な機構は、活性化された細胞の
アポトーシスでありうる。この可能性を調べるために、同時平行的に外植片を、
５μＭ Ｄに２日間さらし、次いで、アポトーシスを起こした核の検出に用いら
れるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介のｄＵＴＰニッ
ク末端標識(ＴＵＮＥＬ)法により染色した。５μＭＤに２日間さらした後に、Ｂ
ＣＣ様構造内のアポトーシスを起こした核(右側のスライド中の褐色により示さ
れている)の数は、左側のビヒクルコントロールより有意に高かった(図３７Ｂ)
。まとめると、これらの結果は、Ｄ誘導されたＢＣＣ様構造の退行が、少なくと
も部分的に、パッチト経路が活性化される細胞自殺経路の刺激から生じることを
示唆してしている。

【０３６６】 マウス胎児皮膚パンチのアッセイ：先在性ＢＣＣ様構造のＤによる短期処理方法 トランスジェニックパッチト経路レポーターマウス由来の、１７．５日齢胎児
皮膚パンチを、Ｓｈｈタンパク質の存在下で７日間培養した。このＳｈｈタンパ
ク質は、７日間の最後に除去した。次いで、これらの皮膚パンチを、ビヒクル又
は１若しくは５μＭ Ｄに、７日目と９日目にさらした。ビヒクル又はＤへの各
暴露の後に、このビヒクル又はＤを洗い去り、これらの皮膚パンチを、Ｓｈｈタ
ンパク質の存在下で再び培養した。培養物を、イン・ビトロで１０日の後に、Ｘ
−ｇａｌ染色により分析して、パッチト経路の活性を評価した。

【０３６７】結果 Ｄによる短期処理は、Ｓｈｈタンパク質への暴露と関連したＸ−ｇａｌ染色の
量を減少させ(図３８Ａ)、これは、皮膚外植片における経路の活性のダウンレギ
ュレーションを示唆している。組織学的分析は、１μＭの濃度でさえ、Ｄは、Ｘ
−ｇａｌ陽性ＢＣＣ様構造の退行を誘導することを示した(図３８Ｂ)。Ｄ処理し
たパンチにおけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルの定量化は、Ｄによる短期処理が、
ｇｌｉ−１転写を完全にダウンレギュレートすることを示した(図３８ｃ、左側)
。この効果は、ハウスキーピング酵素のグリセルアルデヒドー３一ホスフェート
デヒドロゲナーゼ又はＧＡＰＤＨの比較的一定のｍＲＮＡレベルにより示される
ように、パッチト経路に特異的であるようであり、一般的な細胞障害性によるも
のではない(図３８Ｃ、右側)。

【０３６８】 これらの結果は、短期暴露のある条件下で、Ｄが、培養胎児皮膚外植片において
パッチト経路の活性を阻止する能力を有することを示している。その上、Ｄは、
１及び５μＭの濃度で、先在性のＳｈｈ誘導されたＢＣＣ様構造の退行を引き起
こした。

【０３６９】 成体ＢＣＣマウス皮膚パンチアッセイ方法 ｐｔｃヘテロ接合型トランスジェニックマウスを毎週３回６ヵ月間にわたって
照射したが、その間に、多くの小さい(しばしば、顕微鏡的)ＢＣＣ腫瘍が発生し
た。直径４ｍｍの皮膚パンチ外植片(おそらくＢＣＣ構造を含む)を。ビヒクル、
ポジティブコントロール(ジャービン)又は５μＭ Ｄの存在下で６日間培養した
。実験の最後に、これらの外植片を、Ｘ−ｇａｌ染色により分析してパッチト経
路活性のレベルを検出し、組織学的に分析して紫外線商社誘導されたＢＣＣの形
態に対する処理の効果を測定し、そしてｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現レベルを定量
することにより分析して経路の阻害の程度を特性決定した。

【０３７０】結果 処理した外植片のＸ−ｇａｌ染色は、ビヒクルのみの存在下で培養した皮膚パ
ンチが、焦点のパッチト経路及びＢＣＣ構造のアップレギュレーションを示す青
色に強く染色されたフォーカスを生じたことを示している(図３９Ａの青色スポ
ット)。ビヒクルと比較して、５μＭ Ｄは、ポジティブコントロールと同様に、
確立されたＢＣＣ構造の数と大きさを減じた。切片化した外植片の組織学的分析
は、Ｄが、ビヒクルコントロールと比較して、紫外線照射により誘導されるＢＣ
Ｃ腫瘍の退行を誘導したことを示した(図３９Ｂ)。これらのヘテロ接合型トラン
スジェニックマウス由来の皮膚パンチにおいて、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルは
、ｐｔｃ標的遺伝子の活性化の故に非常に高かった。１〜５μＭの濃度のＤも又
、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルを、ビヒクルだけの場合と比較して有意に阻害した
。ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルの定量化は、標的遺伝子活性化のＤによる殆ど完全
な阻害を示している(図３９Ｃ)。この阻害は、処理した状況とビヒクルを用いた
状況の間でのハウスキーピングＧＡＰＤＨ酵素のレベルの統計的比較が、一般的
な細胞代謝活性のグループ間の有意の差異を示さないので、非特異的な細胞障害
性により引き起こされたようには見えなかった。従って、これらの結果は、Ｄが
、パッチト経路を阻害して、紫外線照射により誘導される培養皮膚外植片のＢＣ
ＮＳ様ＢＣＣ腫瘍の退行を誘導することを示している。

【０３７１】 これらのデータは、以前の実験の結果を確実にして、ＤがＢＣＣの治療に効果
的でありうることを示唆する。

【０３７２】 ヒトＢＣＣ外植片の培養方法 外科的手順(モーズ切除法等)から得られた試料を、すべての上皮細胞をディス
パーゼを用いる消化によって除去した、新鮮な、生きている、１７日目のマウス
胎児真皮上で培養した。ディスパーゼ処理は、基底膜成分を消化するので、マト
リゲル(市販の基底膜標品)をこの真皮とＢＣＣの間に適用した。培養を、プラス
チックグリッドの先端に集めて、ヒトの皮膚の長期培養に適した培地中で３日間
インキュベートした(１０μＭの濃度のＤを伴って又は伴わないで)。培養後、こ
れらの試料を、日常的な組織学用に処理し、定量的イン・シトゥーハイブリダイ
ゼーションにかけた。簡単に言うと、パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン
包埋した組織(大きい基底細胞島を含む)の７μｍの切片を清浄化し、再水和し、
プロテイナーゼＫで消化し、アセチル化し、そして[³³Ｐ]標識したＲＮＡプロー
ブと一晩ハイブリダイズさせた。高緊縮ハイブリダイゼーション後洗浄の後に、
スライドを、暗黒中で、室温で、４〜７日間、フォトイメージャースクリーンに
露出した。現像後、[³³Ｐ]シグナルを、ストームスキャナー(Molecular Dynamic
s)を用いてスキャンした。個々の基底細胞島を選択し、イメージクオント１．０
ソフトウェアを用いてシグナルを定量して平均カウント／ピクセルで表した。

【０３７３】結果 ＢＣＣに特徴的な形態学的特徴例えば未分化基底細胞の島及び幾らかの場合に
おける周囲の細胞の柵及び間質クレフティング(図４０Ａ)は、ＢＣＣをこのシス
テムで培養した場合に保持されていた。同様に、発現された分化マーカーは、免
疫組織化学的染色により測定して、予備培養コントロールのものと同じパターン
である(データは示してない)。ＧＬＩ−１遺伝子(パッチトシグナリングの枢要
な指標)は、未処理培養物において、³³Ｐ標識したＲＮＡプローブにさらした切
片で測定して、高レベルで活性なままであった(図４０Ｂ)。定量的イン・シトゥ
ーハイブリダイゼーションは、ＧＬＩ−１発現のレベルが、Ｄ処理した試料にお
いて、ビヒクルで処理したコントロールと比較して、大いに低減されたことを示
した(図４１)。

【０３７４】本発明の化合物の製造 ａ．合成反応式の例 本発明の方法及び組成物に有用なヘッジホッグアンタゴニストを発生させるた
めの合成反応式の例を図１〜３１に示す。 例示した図１〜３１の反応式における反応条件は以下の通りである。 １）R₁CH₂CN,NaNH₂,トルエン (Arzneim-Forsch 1990,40,11,1242) ２）H₂SO₄,H₂O,還流 (Arzneim-Forsch 1990,40,11,1242) ３）H₂SO₄,EtOH,還流 (Arzneim-Forsch 1990,40,11,1242) ４）NaOH,EtOH,還流 ５）(Boc)₂O,2M NaOH,THF ６）LiHDMS,R₁X,THF (メルク,特許出願WO96/06609) ７）Pd-C,H₂,MeOH ８）t-BuONO,CuBr,HBr,H₂O (J.Org.Chem.4977,42,2426) ９）ArB(OH)₂,Pd(PPh₃)₄,ジオキサン (J.Med.Chem.1996,39,217-223) １０）R₁₂(H)C=CR₁₃R₁₄,Pd(OAc)₂,Et₃N,DMF (Org.React.1982,27,345) １１）Tf₂O,THF (J.Am.Chem.Soc.1987,109,5478-5486) １２）ArSnBu₃,Pd(PPh₃)₄,ジオキサン (J.Am.Chem.Soc.1987,109,5478-5486) １３）KMnO₄,Py,H₂O (J.Med.Chem. 1996,39,217-223) １４）NaOR₁,THF １５）NaSR₁,THF １６）HNR₁R₁₃,THF １７）HONO,NaBF₄ (Adv.Fluorine Chem.1965,4,1-30) １８）Pd(OAc)₂,NaH,DPPF,PhCH₃,R₁OH (J.Org.Chem.1977,62,5413-5418) １９）i.R₁X,Et₃N,CH₂Cl₂,ii.R₁₃X ２０）SOCl₃,触媒DMF ２１）CH₂N₂,Et₂O ２２）Ag₂O,Na₂CO₃,Na₂S₂O₃,H₂O (Tetrahed.Lett.1979,2667) ２３）AgO₂CPh,Et₃N,MeOH (Org.Synth.1970,50,77;J.Am.Chem.Soc.1987,109,5432) ２４）LiOH,THF-MeOH ２５）(EtO)₂P(O)CH₂CO₂R,BuLi,THF ２６）MeO₂CCH(Br)=P(Ph)₃,ベンゼン ２７）KOH又はKOtBu ２８）塩基,X(CH₂)_nCO₂R ２９）DPPA,Et₃N,トルエン (Synthesis 1985,220) ３０）HONO,H₂O ３１）SO₂,CuCl,HCl,H₂O (Synthesis 1969,1-10,6) ３２）ロウエッソン試薬,トルエン (Tetrahed.Asym.1996,7,12,3553) ３３）R₂M,溶媒 ３４）30%H₂O₂,氷CH₃CO₂H (Helv.Chim.Acta.1968,349,323) ３５）トリホスゲン,CH₂Cl₂ (Tetrahed.Lett.1996,37,8589) ３６）i,(EtO)₂P(O)CHLiSO₂Oi-Pr,THF,ii,NaI ３７）Ph₃PCH₃I,NaCH₂S(O)CH₃,DMSO (Synthesis 1987,498) ３８）Br₂,CHCl₃又は他の溶媒 (Synthesis 1987,498) ３９）BuLi,Bu₃SnCl ４０）ClSO₂OTMS,CCl₄ (Chem.Ber.1995,128,575-580) ４１）MeOH-HCl,還流 ４２）LAH,Et₂O又はLiBH₄,EtOH又はBH₃-THF (Tetrahed.Lett.1996,37,8589) ４３）MsCl,Et₃N,CH₂Cl₂ (Tetrahed.Lett.1996,37,8589) ４４）Na₂SO₃,H₂O (Tetrahed.Lett.1996,37,8589) ４５）R₂R₄NH,Et₃N,CH₂Cl₂ ４６）R₂M,溶媒 ４７）CH₃NH(OCH₃),EDC,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF (Tetrahed.Lett.1981,22,3815) ４８）MeLi,THF ４９）mCPBA,CH₂Cl₂ ５０）HONO,Cu₂O,Cu(NO₃)₂,H₂O (J.Org.Chem.1977,42,2053) ５１）R₁M,溶媒 ５２）HONO,NaS(S)COEt,H₂O (Org.Synth.1947,27,81 ５３）HSR₂又はHSR₄,CH₂Cl₂ ５４）i-BuOC(O)Cl,Et₃N,NH₃,THF ５５）R₂N₄NH,CH₂Cl₂,NaBH(OAc)₃ ５６）R₂N₄NH,MeOH/CH₃CO₂H,NaBH₃CN ５７）R₂OH,EDC,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF ５８）R₂OH,HBTU,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF ５９）R₂N₄NH,EDC,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF ６０）R₂N₄NH,HBTU,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF ６１）POCl₃,Py,CH₂Cl₂ ６２）R₂R₄NCO,溶媒 ６３）R₂OC(O),Et₃N,溶媒 ６４）R₂CO₂H,EDC又はHBTU,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF ６５）R₂X,Et₃N,溶媒 ６６）(CH₃S)₂C=N(CN),DMF,EtOH (J.Med.Chem.1994,37,57-66) ６７）R₂SO₂Cl,Et₃N,CH₂Cl₂ ６８）R₂-又はR₃-又はR₄-CHO,MeOH/CH₃CO₂H,NaBH₃CN (Synththesis 1975,135-146) ６９）Boc(Tr)-D又はL-CysOH,HBTU,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF ７０）Boc(Tr)-D又はL-CysH,NaBH₃CN,MeOH/CH₃CO₂H (Synththesis 1975,135-146) ７１）S-Tr-N-Bocシステイナル,ClCH₂CH₂Cl又はTHF,NaBH(OAc)₃ (J.Org.Chem.1996,61,3849-3862) ７２）TFA,CH₂Cl₂,Et₃SiH又は(3:1:1)チオアニソール/エタンジチオール/DMS ７３）TFA,CH₂Cl₂ ７４）DPPA,Et₃N,トルエン,HOCH₂CH₂SiCH₃ (Tetrahed.Lett.1984,25,3515) ７５）TBAF,THF ７６）塩基,TrSH又はBnSH ７７）塩基,R₂X又はR₄X ７８）R₃NH₂,MeOH/CH₃CO₂H,NaBH₃CN ７９）N₂H₄,KOH ８０）Pd₂(dba)₃,P(o-tol)₃,RNH₂,NaOtBu,ジオキサン,R₁NH₂ (Tetrahed.Lett.1996,37,7181-7184) ８１）シアナミド ８２）Fmoc-Cl,重炭酸ナトリウム ８３）BnCOCl,炭酸ナトリウム ８４）アリルOCOCl,ピリジン ８５）臭化ベンジル、塩基 ８６）塩化オキサリル,DMSO ８７）RCONH₂ ８８）カルボニルジイミダゾール,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン) ８９）チオカルボニルジイミダゾール,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン)
９０）臭化シアン,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン) ９１）RCOCl,トリエチルアミン ９２）RNHNH₂,EDC ９３）RO₂CCOCl,Et₃N,DCM ９４）MsOH,ピリジン (J.Het.Chem.1980,607 ９５）塩基,中性溶媒(例えば,DCM,トルエン,THF) ９６）H₂NOR,EDC ９７）RCSNH₂ ９８）RCOCHBrR,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン) (Org.Proc.Prep.Intl.1992,24,127) ９９)CH₂N₂,HCl (Synththesis,1993,197) １００）NH₂NHR,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン) １０１）RSO₂Cl,DMAP (Tetrahed.Lett.1993,34,2749) １０２）Et₃N,RX (J.Org.Chem.1990,55,6037) １０３）NOCl又はCl₂ (J.Org.Chem.1990,55,3916) １０４）H₂NOH,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン) １０５）RCCR,中性溶媒(DCM,THF,トルエン) １０６）RCHCHR,中性溶媒(DCM,THF,トルエン) １０７）H₂NOH,HCl １０８）チオカルボニルジイミダゾール,SiO₂又はBF₃OEt₂ (J.Med.Chem.1996,39,5228) １０９)チオカルボニルジイミダゾール,DBU又はDBN (J.Med.Chem.1996,39,5228) １１０)HNO₂,HCl １１１）ClCH₂CO₂Et (Org.Reactions,1959,10,143) １１２）モルホリンエナミン (Eur.J.Med.Chem.1982,17,27) １１３）RCOCHR'CN １１４）RCOCHR'CO₂Et １１５）Na₂SO₃ １１６）H₂NCHRCO₂Et １１７）EtO₂CCHRNCO １１８）RCNHNH₂ １１９)RCOCO₂H (J.Med.Chem.1995,38,3741) １２０）RCHO,KOAc １２１）2-フルオルニトロベンゼン １２２）SnCl₂,EtOH,DMF １２３）RCHO,NaBH₃CN,HOAc １２４）NH₃,MeOH １２５）2,4,6-Me₃PhSO₂NH₂ １２６）Et₂NH,CH₂Cl₂ １２７）MeOC(O)Cl,Et₃N,CH₂Cl₂ １２８）R₂NH₂,EDC,HOBT,Et₃N,CH₂Cl₂ １２９) DBU,PhCH₃ １３０）BocNHCH(CH₂STr)CH₂NH₂,EDC,HOBT,Et₃N,CH₂Cl₂ １３１）R₂NHCH₂CO₂Me,HBTU,HOBT,Et₃N,CH₂Cl₂ １３２）BocNHCH(CH₂STr)CH₂OMs,LiHMDS,THF １３３）R₂NHCH₂CO₂Me,NaBH(OAc)₃,ClCH₂CH₂Cl又はTHF １３４）R₂NHCH₂CH(OEt)₂,HBTU,HOBT,Et₃N,CH₂Cl₂ １３５）NaBH(OAc)₃,ClCH₂CH₂Cl又はTHF,AcOH １３６）ピペリジン,DMF １３７）Pd(Ph₃P)₄,Bu₃SnH １３８）RCO₂H,EDC,HOBT,Et₃N,DCM １３９）RNH₂,中性溶媒 １４０）RCHO,NaBH₃CN,HOAc １４１）RNCO,溶媒 １４２）RCO₂H,EDC又はHBTU,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF １４３）RCOCl,トリエチルアミン １４４）RSO₂Cl,Et₃N,CH₂Cl₂ １４５）SnCl₂,EtOH,DMF １４６）RNH₂,EDC,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF １４７）ジブロムメタン,Et₃N,CH₂Cl₂ １４８）塩化オキサリル,中性溶媒 １４９）LiOH,THF-MeOH １５０）カルボニルジイミダゾール,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン) １５１）RNH₂,Et₃N,CH₂Cl₂ １５２）塩基,RX １５３）DBU,PhCH₃ １５４）DPPA,Et₃N,トルエン (Synththesis 1985,220) １５５）SOCl₂,触媒DMF １５６）ArH,ルイス酸(AlCl₃,SnCl₄,TiCl₄),CH₂Cl₂ １５７）H₂NCHRCO₂Et,中性溶媒 １５８）BocHNCHRCO₂H,EDC又はHBTU,HOBt,DIEA,CH₂Cl₂又はDMF １５９）TFA,CH₂Cl₂

【０３７５】 引用した参考文献の全てをここで参照することここに含めるものとする。

【０３７６】 均等物 当業者であれば、ここに説明した本発明の特定の具体例に対して多くの均等な
ものを認識し、また日常の実験によって確認するであろう。そのような均等物は
請求の範囲によって包含されるものとなる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図３】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図４】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図５】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図６】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図７】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図８】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図９】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１０】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１１】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１２】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１３】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１４】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１５】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１６】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１７】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１８】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図１９】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２０】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２１】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２２】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２３】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２４】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２５】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２６】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２７】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２８】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図２９】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図３０】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図３１】 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。

【図３２ａ】 本発明の代表的な化合物を図解した図である。

【図３２ｂ】 本発明の代表的な化合物を図解した図である。

【図３２ｃ】 本発明の代表的な化合物を図解した図である。

【図３３Ａ】 ビヒクル(レーン１)；５μＭ ジャービン、ポジティブコントロール化合物(レ
ーン２)；及び１μＭ Ｄ(レーン３)で処理した細胞におけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡ
の発現を示す図である。ビヒクルと比較して、Ｄ及びジャービンは、ｇｌｉ−１
ｍＲＮＡの発現を有意に減じた。

【図３３Ｂ】 Ｄ及びジャービンが、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルを阻止することを示す図であ
る(定量的リアルタイムＰＣＲにより測定)。

【図３４Ａ】 Ｓｈｈタンパク質を培養皮膚外植片に加えることが、これらの培養物の青色染
色(Ｘ−ｇａｌ)により示されるように、ｐｔｃ活性化を生じたことを示す図であ
る。組織学的試料は、好塩基性核を有して核対細胞質比の大きい強く染色された
細胞を示している(Ｈ＆Ｅ[１０×]及びＨ＆Ｅ[４０×])。これらの構造は、それ
らが皮膚の層中にクラスターで配置されていて正常な外観の皮膚細胞の柵により
分離されている点で、ＢＣＣに似ている。青色染色は、パッチト経路がＢＣＣ様
構造内の細胞において活性であったことを示している(エオシン＋Ｘ−ｇａｌ)。

【図３４Ｂ】 マウス皮膚パンチ内のＢＣＣ様クラスター(その一つを矢印で示してある)が、
未分化ケラチノサイトのマーカーのケラチン−１４(褐色の反応生成物)を発現し
たことを図解する図である。上皮中の未分化基底細胞も又、ケラチン−１４陽性
であった。ヒトＢＣＣは、ケラチン−１４を発現することが報告されている。

【図３５Ａ】 Ｄの濃度の増大が、ｌａｃＺレポーター酵素活性の量の投与量依存性の減少と
関係していることを示す図である。低レベルのｌａｃＺ活性は、Ｓｈｈタンパク
質の存在下での減少したパッチト経路活性を示す。

【図３５Ｂ】 Ｄ処理した外植片の染色を示し又、０．２μＭ Ｄが、Ｓｈｈタンパク質だけ
で処理した皮膚パンチの強いＸ−ｇａｌ染色と比較して、Ｘ−ｇａｌ染色を減じ
たことを示す図である(これは、ｐｔｃ遺伝子の発現のダウンレギュレーション
を示している)。

【図３５Ｃ】 Ｄで処理した皮膚パンチの組織学的試料を描いた図(下段)であり、この処理が
Ｓｈｈ誘導されるＢＣＣ様構造の出現を阻止したことを示唆している。

【図３６】 ６日間外因性Ｓｈｈタンパク質だけで処理した皮膚パンチが、ビヒクルだけで
処理したもの(上段)と比較して強いＸ−ｇａｌ染色を示したことを描いた図であ
る。外因性Ｓｈｈタンパク質にさらす前に、Ｄで５時間にわたって、１０、２０
及び５０μＭで予備処理した皮膚パンチは、パッチト経路のＳｈｈタンパク質誘
導されたアップレギュレーションの完全な阻止を示した(下段右側の３スライド)
。ビヒクルで処理した皮膚パンチを外因性Ｓｈｈタンパク質にさらした場合には
強いＸ−ｇａｌ染色により示されるような如何なる阻止も見られなかった(下段
左)。短期間の予備処理は、本質的に、ｐｔｃ阻止のレベルに関して、Ｄへの６
日間の暴露に等しかった(上段と下段を比較されたい)。

【図３７Ａ】 Ｄが、１又は５μＭで、処理した皮膚パンチにおいてＳｈｈ誘導されたＢＣＣ
様構造の大きさ及び数を、ビヒクルで処理した外植片と比較して有意に減少させ
ることを示す図である。

【図３７Ｂ】 ５μＭ Ｄ(右側)又はビヒクル(左側)にさらした２日後に、アポトーシスを起
こした核(右側のスライド中で褐色により示されている)がＢＣＣ様構造内に出現
したことを図解した図である。

【図３８Ａ】 Ｄでの短期処理が、ビヒクルと比較して、Ｘ−ｇａｌ染色の量を減じたことを
示した図である(経路の活性のダウンレギュレーションを示唆している)。

【図３８Ｂ】 １μＭの濃度でさえ、Ｄが、ビヒクルと比較して、Ｘ−ｇａｌ陽性ＢＣＣ様構
造の退行を誘導したことを示した図である。

【図３８Ｃ】 Ｄでの短期処理が、ｇｌｉ−１転写を完全にダウンレギュレートしたことを描
いた図である(左側)。この効果は、ハウスキーピング酵素ＧＡＰＤＨの適切に一
定のｍＲＮＡレベル(右側)により示されるように、パッチト経路に特異的である
ことが判明し、一般的な細胞障害性のためだけではなかった。

【図３９Ａ】 処理した外植片のＸ−ｇａｌ染色は、ビヒクルだけの存在下で培養した皮膚パ
ンチが、強く染色された青色のフォーカスを生成したことを示したが、これは、
パッチト経路及びＢＣＣ構造のアップレギュレーションを示している。ビヒクル
と比較して、５μＭ Ｄは、ジャービンのポジティブコントロールと同様に、Ｂ
ＣＣ構造(青色スポット)の数と大きさを大いに減じた。

【図３９Ｂ】 組織学的試料は、５μＭ Ｄが、紫外線誘導されたＢＣＣ構造の数を、ビヒク
ルコントロールと比較して減じたことを示した。

【図３９Ｃ】 トランスジェニックマウス由来の皮膚パンチにおいて、Ｄは、１及び５μＭの
濃度で、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルを、ビヒクルだけで処理したマウス由来の
皮膚パンチと比較して有意に阻止した(左側)。この阻止は、ハウスキーピングＧ
ＡＰＤＨ酵素をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルのグループ間での統計的比較
(ＡＮＯＶＡ使用)が一般的な細胞代謝活性の有意の差異を示さなかったので(右
側)、非特異的な細胞障害性により引き起こされるものではないようであった。

【図４０Ａ】 ＢＣＣに特徴的な形態学的特徴(例えば、未分化基底細胞の島、及び幾つかの
場合には、周囲の細胞の柵及び間質クレフティング)は、培養物をＨ＆Ｅで染色
した場合に保持されていた。

【図４０Ｂ】 ＧＬＩ−１遺伝子(パッチトシグナリングの枢要な指標)は、赤色で示されるよ
うに、高レベルで活性のままであった。

【図４１】 定量的なイン・シトゥーハイブリダイゼーションは、ＧＬＩ−１発現のレベル
が、ビヒクル処理したコントロールと比較して、Ｄ処理した試料において誘導さ
れることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/14 Ａ６１Ｐ 17/14 19/08 19/08 21/00 21/00 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｄ 207/14 Ｃ０７Ｄ 207/14 403/14 403/14 405/06 405/06 409/06 409/06 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 オイビン エム．ギシェリット アメリカ合衆国 02478 マサチューセッ ツ、ベルモント、ハミルトン ロード 28 (72)発明者 スティーブン プライス イギリス国 エイチピー22 ５ユージェイ バッキンガムシャー、エイルズバリー、 ストーク マンデビル、エスクデイル ロ ード 25 (72)発明者 リー ルービン アメリカ合衆国 02481 マサチューセッ ツ、ウェルズリー、バーンスタブル ロー ド ２ Ｆターム(参考） 4C063 AA01 AA03 BB03 CC34 CC82 CC92 DD03 EE01 4C069 AA17 4C086 AA01 AA02 AA04 BC50 GA02 GA04 GA12 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA51 ZA59 ZA66 ZA75 ZA89 ZA92 ZA94 ZA96 ZC42

Claims (103)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻止するにあたり
   、該細胞をヘッジホッグシグナリングを阻止するのに十分な量のヘッジホッグア
   ンタゴニストと接触させることからなり、該ヘッジホッグアンタゴニストが一般
   式（Ｉ）： 【化１】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
   （ＣＨ₂）_nアリール又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わし、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−、−
   アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（ＣＨ₂）_nアル
   キニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂）_p−、−
   （ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂
   ）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n−又は−Ｓ
   （ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｘ及びＤは、独立して、−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ₈）Ｎ−Ｎ（
   Ｒ₈）−、−ＯＮ（Ｒ₈）−及び直接結合から選択され、 Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、 ＥはＯ、Ｓ又はＮＲ₅（Ｒ₅はＬＲ₈又は−（Ｃ＝Ｏ）ＬＲ₈を表わす）を表わし
   、 Ｒ₈は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリー
   ル又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になっ
   て４員〜８員の環を形成し、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、 ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］ で表わされる有機分子である、細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻止す
   るための方法。
2. 【請求項２】 Ｙ及びＺがそれぞれＯを表わす請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ｑとｒの和が４未満である請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 Ｄがアラルキル−又はヘテロアラルキル−置換アミンである
   請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 Ｒ₁が分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキル
   アルキルを表わす請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 Ｒ₁に結合したＬがＯ、Ｓ又はＮＲ₈を表わす請求項１に記載
   の方法。
7. 【請求項７】 ＥがＮＲ₈である請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 Ｘが環に含まれる請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 ＸＬＲ₄が環状アミンを含む請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 細胞がｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムー
    スンド機能亢進の表現型を有する請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 ヘッジホッグアンタゴニストがｐｔｃ機能欠損、ヘッジホ
    ッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を１μＭ以下のＥＤ ₅₀ で阻止する請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 ヘッジホッグアンタゴニストがｐｔｃ機能欠損、ヘッジホ
    ッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を１ｎＭ以下のＥＤ ₅₀ で阻止する請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 細胞をインビトロでヘッジホッグアンタゴニストと接触さ
    せる請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 細胞をインビボでヘッジホッグアンタゴニストと接触させ
    る請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 ヘッジホッグアンタゴニストを治療法又は美容法適用の一
    部として投与する請求項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 治療法又は美容法適用が神経組織、骨及び軟骨の形成及び
    修復の調節、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝臓及び原始腸管から生じる
    その他の器官の調節、造血機能の調節、皮膚及び毛髪成長の調節よりなる群から
    選ばれる請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻止するにあた
    り、該細胞をヘッジホッグシグナリングを阻止するのに十分な量のヘッジホッグ
    アンタゴニストと接触させることからなり、該ヘッジホッグアンタゴニストが一
    般式（II）： 【化２】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
    （ＣＨ₂）_nアリール又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わし、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−、−
    アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（ＣＨ₂）_nアル
    キニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂）_p−、−
    （ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂
    ）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n−又は−Ｓ
    （ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｘは、独立して、−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ₈）Ｎ−Ｎ（Ｒ₈）
    −、−ＯＮ（Ｒ₈）−及び直接結合から選択され、 Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、 Ｒ₈は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリー
    ル又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になっ
    て４員〜８員の環を形成し、 Ｍは不存在であるか或いはＬ、−ＳＯ₂Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わ
    し、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、 ｑ、ｒ及びｓは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］ で表わされる有機分子である、細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻止す
    るための方法。
18. 【請求項１８】 Ｙ及びＺがそれぞれＯを表わす請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 ｑとｒとｓの和が５未満である請求項１７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なくとも１個がアリール基である請
    求項１７に記載の方法。
21. 【請求項２１】 ＸＬＲ₄が環状ジアミンを含む請求項１７に記載の方法。
22. 【請求項２２】 Ｘがジアザ炭素環に含まれる請求項１７に記載の方法。
23. 【請求項２３】 Ｒ₁が分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキ
    ルアルキルを表わす請求項１７に記載の方法。
24. 【請求項２４】 Ｒ₁に結合したＬがＯ、Ｓ又はＮＲ₈を表わす請求項１７に
    記載の方法。
25. 【請求項２５】 細胞がｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムー
    スンド機能亢進の表現型を有する請求項１７に記載の方法。
26. 【請求項２６】 ヘッジホッグアンタゴニストがｐｔｃ機能欠損、ヘッジホ
    ッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を１μＭ以下のＥＤ ₅₀ で阻止する請求項１７に記載の方法。
27. 【請求項２７】 ヘッジホッグアンタゴニストがｐｔｃ機能欠損、ヘッジホ
    ッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を１ｎＭ以下のＥＤ ₅₀ で阻止する請求項１７に記載の方法。
28. 【請求項２８】 細胞をインビトロでヘッジホッグアンタゴニストと接触さ
    せる請求項１７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 細胞をインビボでヘッジホッグアンタゴニストと接触させ
    る請求項１７に記載の方法。
30. 【請求項３０】 ヘッジホッグアンタゴニストを治療法又は美容法適用の一
    部として投与する請求項１７に記載の方法。
31. 【請求項３１】 治療法又は美容法適用が神経組織、骨及び軟骨の形成及び
    修復の調節、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝臓及び原始腸管から生じる
    その他の器官の調節、造血機能の調節、皮膚及び毛髪成長の調節よりなる群から
    選ばれる請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 無菌製薬用賦形剤と一般式（Ｉ）： 【化３】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
    （ＣＨ₂）_nアリール又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わし、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−、−
    アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（ＣＨ₂）_nアル
    キニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂）_p−、−
    （ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂
    ）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n−又は−Ｓ
    （ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｘ及びＤは、独立して、−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ₈）Ｎ−Ｎ（
    Ｒ₈）−、−ＯＮ（Ｒ₈）−及び直接結合から選択され、 Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、 ＥはＯ、Ｓ又はＮＲ₅（Ｒ₅はＬＲ₈又は−（Ｃ＝Ｏ）ＬＲ₈を表わす）を表わし
    、 Ｒ₈は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリー
    ル又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になっ
    て４員〜８員の環を形成し、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、 ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］ で表わされる化合物を含む製薬製剤。
33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の製薬製剤を患者に基底細胞癌の進行を
    阻止するのに十分な量で投与することからなる、基底細胞癌を治療し又は予防す
    るための方法。
34. 【請求項３４】 無菌製薬用賦形剤と一般式（II）： 【化４】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
    （ＣＨ₂）_nアリール又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わし、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−、−
    アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（ＣＨ₂）_nアル
    キニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂）_p−、−
    （ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂
    ）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n−又は−Ｓ
    （ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｘは、独立して、−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ₈）Ｎ−Ｎ（Ｒ₈）
    −、−ＯＮ（Ｒ₈）−及び直接結合から選択され、 Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、 Ｒ₈は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリー
    ル又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になっ
    て４員〜８員の環を形成し、 Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ₂Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし
    、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、 ｑ、ｒ及びｓは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］ で表わされるを含む製薬製剤。
35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の製薬製剤を患者に基底細胞癌の進行を
    阻止するのに十分な量で投与することからなる、基底細胞癌を治療し又は予防す
    るための方法。
36. 【請求項３６】 細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻止するにあた
    り、該細胞をヘッジホッグシグナリングを阻止するのに十分な量のヘッジホッグ
    アンタゴニストと接触させることからなり、該ヘッジホッグアンタゴニストが一
    般式(III) ： 【化５】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
    （ＣＨ₂）_nアリール又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わし、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−、−
    アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（ＣＨ₂）_nアル
    キニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂）_p−、−
    （ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂
    ）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n−又は−Ｓ
    （ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｘは、独立して、−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ₈）Ｎ−Ｎ（Ｒ₈）
    −、−ＯＮ（Ｒ₈）−及び直接結合から選択され、 Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、 Ｒ₈は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリー
    ル又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になっ
    て４員〜８員の環を形成し、 Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ₂Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし
    、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、 ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］ で表わされる有機分子である、細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻止す
    るための方法。
37. 【請求項３７】 ｑとｒの和が４未満である請求項３６に記載の方法。
38. 【請求項３８】 Ｒ₁が分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキ
    ルアルキルである請求項３６に記載の方法。
39. 【請求項３９】 ＸＬＲ₄が環状アミンを含む請求項３６に記載の方法。
40. 【請求項４０】 ヘッジホッグアンタゴニストがｐｔｃ機能欠損、ヘッジホ
    ッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を１ｍＭ以下のＥＤ ₅₀ で阻止する請求項３６に記載の方法。
41. 【請求項４１】 ヘッジホッグアンタゴニストがｐｔｃ機能欠損、ヘッジホ
    ッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を１μＭ以下のＥＤ ₅₀ で阻止する請求項３６に記載の方法。
42. 【請求項４２】 ヘッジホッグアンタゴニストがｐｔｃ機能欠損、ヘッジホ
    ッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を１ｎＭ以下のＥＤ ₅₀ で阻止する請求項３６に記載の方法。
43. 【請求項４３】 細胞をインビトロでヘッジホッグアンタゴニストと接触さ
    せる請求項３６に記載の方法。
44. 【請求項４４】 細胞をインビボでヘッジホッグアンタゴニストと接触させ
    る請求項３６に記載の方法。
45. 【請求項４５】 ヘッジホッグアンタゴニストを治療法又は美容法適用の一
    部として投与する請求項３６に記載の方法。
46. 【請求項４６】 治療法又は美容法適用が神経組織、骨及び軟骨の形成及び
    修復の調節、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝臓及び原始腸管から生じる
    その他の器官の調節、造血機能の調節、皮膚及び毛髪成長の調節よりなる群から
    選ばれる請求項４５に記載の方法。
47. 【請求項４７】 細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻止するにあた
    り、該細胞をヘッジホッグシグナリングを阻止するのに十分な量のヘッジホッグ
    アンタゴニストと接触させることからなり、該ヘッジホッグアンタゴニストが一
    般式（IV） ： 【化６】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
    （ＣＨ₂）_nアリール又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わし、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−、−
    アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（ＣＨ₂）_nアル
    キニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂）_p−、−
    （ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂
    ）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n−又は−Ｓ
    （ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｘは、独立して、−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ₈）Ｎ−Ｎ（Ｒ₈）
    −、−ＯＮ（Ｒ₈）−及び直接結合から選択され、 Ｒ₈は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリー
    ル又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になっ
    て４員〜８員の環を形成し、 Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ₂Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし
    、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わす］ で表わされる有機分子である、細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻止す
    るための方法。
48. 【請求項４８】 Ｒ₁が分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキ
    ルアルキルを表わす請求項４７に記載の方法。
49. 【請求項４９】 Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なくとも１個がアリール基である請
    求項４７に記載の方法。
50. 【請求項５０】 ＸＬＲ₄が環状アミンを含む請求項４７に記載の方法。
51. 【請求項５１】 Ｘがジアザ炭素環の一部である請求項４７に記載の方法。
52. 【請求項５２】 細胞がｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムー
    スンド機能亢進の表現型を有する請求項４７に記載の方法。
53. 【請求項５３】 ヘッジホッグアンタゴニストがｐｔｃ機能欠損、ヘッジホ
    ッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を１μＭ以下のＥＤ ₅₀ で阻止する請求項４７に記載の方法。
54. 【請求項５４】 ヘッジホッグアンタゴニストがｐｔｃ機能欠損、ヘッジホ
    ッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を１ｎＭ以下のＥＤ ₅₀ で阻止する請求項４７に記載の方法。
55. 【請求項５５】 細胞をインビトロでヘッジホッグアンタゴニストと接触さ
    せる請求項４７に記載の方法。
56. 【請求項５６】 細胞をインビボでヘッジホッグアンタゴニストと接触させ
    る請求項４７に記載の方法。
57. 【請求項５７】 ヘッジホッグアンタゴニストを治療法又は美容法適用の一
    部として投与する請求項４７に記載の方法。
58. 【請求項５８】 治療法又は美容法適用が神経組織、骨及び軟骨の形成及び
    修復の調節、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝臓及び原始腸管から生じる
    その他の器官の調節、造血機能の調節、皮膚及び毛髪成長の調節よりなる群から
    選ばれる請求項５７に記載の方法。
59. 【請求項５９】 無菌製薬用賦形剤と一般式(III) ： 【化７】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
    （ＣＨ₂）_nアリール又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わし、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−、−
    アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（ＣＨ₂）_nアル
    キニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂）_p−、−
    （ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂
    ）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n−又は−Ｓ
    （ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｘは、独立して、−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ₈）Ｎ−Ｎ（Ｒ₈）
    −、−ＯＮ（Ｒ₈）−及び直接結合から選択され、 Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、 Ｒ₈は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリー
    ル又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になっ
    て４員〜８員の環を形成し、 Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ₂Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし
    、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、 ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］ で表わされる化合物を含む製薬製剤。
60. 【請求項６０】 Ｙ及びＺがＯである請求項５９に記載の製剤。
61. 【請求項６１】 Ｒ₁が分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキ
    ルアルキルを表わす請求項５９に記載の製剤。
62. 【請求項６２】 ｑとｒの和が４未満である請求項５９に記載の製剤。
63. 【請求項６３】 ＸＬＲ₄が一緒になって環状ジアミンを含む請求項５９に
    記載の製剤。
64. 【請求項６４】 Ｒ₁に結合したＬがＯ、Ｓ又はＮＲ₈を表わす請求項５９に
    記載の製剤。
65. 【請求項６５】 Ｍが不存在である請求項５９に記載の製剤。
66. 【請求項６６】 請求項５９に記載の製薬製剤を患者に基底細胞癌の進行を
    阻止するのに十分な量で投与することからなる、基底細胞癌を治療し又は予防す
    るための方法。
67. 【請求項６７】 無菌製薬用賦形剤と一般式（IV） ： 【化８】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
    （ＣＨ₂）_nアリール又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わし、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−、−
    アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（ＣＨ₂）_nアル
    キニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂）_p−、−
    （ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂
    ）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n−又は−Ｓ
    （ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｘは、独立して、−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ₈）Ｎ−Ｎ（Ｒ₈）
    −、−ＯＮ（Ｒ₈）−及び直接結合から選択され、 Ｒ₈は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリー
    ル又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になっ
    て４員〜８員の環を形成し、 Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ₂Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし
    、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わす］ で表わされる化合物を含む製薬製剤。
68. 【請求項６８】 ＸＬＲ₄が一緒になって環状ジアミンを含む請求項６７に
    記載の製剤。
69. 【請求項６９】 Ｒ₁が分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキ
    ルアルキルを表わす請求項６７に記載の製剤。
70. 【請求項７０】 Ｒ₁に結合したＬがＯ、Ｓ又はＮＲ₈を表わす請求項６７に
    記載の製剤。
71. 【請求項７１】 Ｍが不存在である請求項６７に記載の製剤。
72. 【請求項７２】 Ｌがその存在の全てについて直接結合を表わす請求項６７
    に記載の製剤。
73. 【請求項７３】 請求項６７に記載の製薬製剤を患者に基底細胞癌の進行を
    阻止するのに十分な量で投与することからなる、基底細胞癌を治療し又は予防す
    るための方法。
74. 【請求項７４】 無菌製薬用賦形剤と一般式（Ｖ）： 【化９】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 ＹはＯ又はＳであり、 Ｚ’はＳＯ₂、−（Ｃ＝Ｓ）−又は−（Ｃ＝Ｏ）−であり、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、 ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わし、 Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ₈を表わし、 Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−若しくは−ＳＯ₂−を表わし、 Ｊは、それぞれについて独立して、水素又はＪに接するＮの両方の存在がＪの
    少なくとも一つの存在により結合されるようにＮＣ（＝Ｙ）に結合した置換若し
    くは非置換の低級アルキル若しくはアルキレンを表わし、 Ｒ₉は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アル
    キルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ₉の一つの存在と
    一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は二つの存在を含み、 Ｒ₅は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分
    岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又は
    シクロアルキルアルキルを表わし、 Ｒ₆は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラル
    キル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロア
    ルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、 Ｒ₇は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラ
    ルキルを表わす］ で表わされる化合物を含む製薬製剤。
75. 【請求項７５】 Ｙ及びＺがＯである請求項７４に記載の製剤。
76. 【請求項７６】 ｑとｒの和が４未満である請求項７４に記載の製剤。
77. 【請求項７７】 Ｊの少なくとも一つの存在が５〜８員を有する複素環の一
    部である請求項７４に記載の製剤。
78. 【請求項７８】 Ｒ₅が分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキ
    ルアルキルである請求項７４に記載の製剤。
79. 【請求項７９】 Ｒ₆が少なくとも１個の複素環式環を含む請求項７４に記
    載の製剤。
80. 【請求項８０】 Ｒ₇がフェニルアルキルを表わす請求項７４に記載の製剤
    。
81. 【請求項８１】 無菌製薬用賦形剤と一般式（VI）： 【化１０】 ［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、 ＹはＯ又はＳであり、 Ｚ’はＳＯ₂、−（Ｃ＝Ｓ）−又は−（Ｃ＝Ｏ）−であり、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、 Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ₈を表わし、 Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−又は−ＳＯ₂−を表わし、 Ｊは、それぞれについて独立して、水素又は置換若しくは非置換低級アルキル
    、又はＪに接するＮの両存在がＪの少なくとも一つの存在により結合されるよう
    にＮＣ（＝Ｙ）に結合するアルキレンを表わし、 Ｒ₉は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アル
    キルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ₉の一つの存在と
    一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は二つの存在を含み、 Ｒ₅は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分
    岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又は
    シクロアルキルアルキルを表わし、 Ｒ₆は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラル
    キル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロア
    ルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、 Ｒ₇は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラ
    ルキルを表わす］ で表わされる化合物を含む製薬製剤。
82. 【請求項８２】 Ｙ及びＺがＯである請求項８１に記載の製剤。
83. 【請求項８３】 Ｊの少なくとも一つの存在が５〜８員を有する複素環の一
    部である請求項８１に記載の製剤。
84. 【請求項８４】 Ｒ₅が分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキ
    ルアルキルである請求項８１に記載の製剤。
85. 【請求項８５】 Ｒ₆が少なくとも１個の複素環式環を含む請求項８１に記
    載の製剤。
86. 【請求項８６】 Ｒ₇がフェニルアルキルを表わす請求項８１に記載の製剤
    。
87. 【請求項８７】 ｐｔｃ機能欠損表現型、ヘッジホッグ機能亢進表現型又は
    スムースンド機能亢進表現型を有する細胞の変化した増殖状態を阻止するにあた
    り、該細胞を該変化した増殖状態を阻止するのに十分な量の請求項７４又は８１
    に記載の化合物と接触させることからなる該細胞の変化した増殖状態を阻止する
    ための方法。
88. 【請求項８８】 式Ｘの構造式を有する化合物を以下の反応式： 【化１１】 ［ここで、 ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して、ｑ＋ｒ＋ｓの和が２〜４の範囲の整数で
    あるように、０〜２の範囲の整数を表わし、 ＬＧはハロゲン又はスルホネートのような脱離基を表わし、 Ａは酸を保護する基に結合した酸素若しくは硫黄又は式：ＸＬＲ₄を有する基
    を表わし、 Ｂは窒素を保護する基又は式：ＭＲ₃を有する基を表わし、 Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_n アリール（置換又非置換の）又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリール（置換又非置換の
    ）を表わし、 ＹはＯ及びＳから選択でき、 Ｘは−Ｎ（Ｒ₈）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は直接結合から選択され、 Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ₂Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし
    、 Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ₂）_n−アル
    キル−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル−、−（Ｃ
    Ｈ₂）_nアルキニル−、−（ＣＨ₂）_nＯ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nＮＲ₈（ＣＨ₂ ）_p−、−（ＣＨ₂）_nＳ（ＣＨ₂）_p−、−（ＣＨ₂）_nアルケニル（ＣＨ₂）_p−、
    −（ＣＨ₂）_nアルキニル（ＣＨ₂）_p−、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−、−ＮＲ₈（ＣＨ₂）_n
    −又は−Ｓ（ＣＨ₂）_n−を表わし、 Ｒ₈はそれぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ₂）_nアリール
    （例えば、置換又非置換の）又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリール（例えば、置換又
    非置換の）を表わすか、或いは２個のＲ₈は一緒になって４員〜８員の環を形成
    し、 ｐは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜３の整数を表わ
    し、 ｎは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜５の整数を表わ
    す］ に従って変換することからなり、 工程Ａがヒドロキシルを脱離基に転化することからなり、 工程Ｂが該脱離基をアジド基で置換することからなり、 工程Ｃがアジドをアミンに還元することからなる、 環外アミンを製造するための方法。
89. 【請求項８９】 工程Ａが、第一脱離基を第二脱離基で置換し、これにより
    脱離基を有する炭素の立体化学的配置を逆転させることを更に含む請求項８８に
    記載の方法。
90. 【請求項９０】 ｑ＋ｓ＋ｒが２〜３の整数である請求項８８に記載の方法
    。
91. 【請求項９１】 Ａが、一緒になって環状アミンを含むＸＬＲ₄を表わす請
    求項８８に記載の方法。
92. 【請求項９２】 式Ｘの化合物が、工程Ａを達成する前に、７５％以上のｃ
    ｉｓ−異性体のために濃縮される請求項８８に記載の方法。
93. 【請求項９３】 式Ｘの化合物が、工程Ａを達成する前に、７５％以上のｔ
    ｒａｎｓ−異性体のために濃縮される請求項８８に記載の方法。
94. 【請求項９４】 式ＸIVの構造式を有する化合物を以下の反応式： 【化１２】 ［ここで、 ｑ及びｒは、それぞれ独立して、ｑ＋ｒの和が２〜４の範囲の整数であるよう
    に、０〜２の範囲の整数を表わし、 ＬＧはハロゲン又はスルホン酸エステルのような脱離基を表わし、 Ａは酸を保護する基に結合した酸素若しくは硫黄又は式：ＮＪ₂Ｎ（Ｒ₉）₂を
    有する基を表わし、 Ｂは窒素を保護する基又は式：ＧＲ₆を有する基を表わし、 Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−又は−ＳＯ₂−を表
    わし、 Ｊは、それぞれについて独立して、水素又は置換若しくは非置換低級アルキル
    、又はＪに接するＮの両方の存在がＪの少なくとも一つの存在により結合される
    ようにＮＣ（＝Ｙ）に結合するアルキレンを表わし、 Ｒ₉は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アル
    キルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ₉の一つの存在と
    一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は二つの存在を含み、 Ｒ₆は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラル
    キル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロア
    ルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、 ＹはＯ及びＳから選択できる］ に従って変換することからなり、 工程Ａがヒドロキシルを脱離基に転化することからなり、 工程Ｂが該脱離基をアジド基で置換することからなり、 工程Ｃがアジドをアミンに還元することからなる、 環外アミンを製造するための方法。
95. 【請求項９５】 工程Ａが、第一脱離基を第二脱離基で置換し、これにより
    脱離基を有する炭素の立体化学的配置を逆転させることを更に含む請求項９４に
    記載の方法。
96. 【請求項９６】 ｑ＋ｒが２〜３の整数である請求項９４に記載の方法。
97. 【請求項９７】 Ａが、一緒になって環状ジアミンを表わすＮＪ₂Ｎを表わ
    す請求項９４に記載の方法。
98. 【請求項９８】 式ＸIVの化合物が、工程Ａを達成する前に、７５％以上の
    ｃｉｓ−異性体のために濃縮される請求項９４に記載の方法。
99. 【請求項９９】 式ＸIVの化合物が、工程Ａを達成する前に、７５％以上の
    ｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される請求項９４に記載の方法。
100. 【請求項１００】 更に下記の工程： Ｄ）環外アミンに基：−Ｃ（＝Ｚ）ＬＲ₁をカップリングさせること、 Ｅ）環外アミンに基：−ＬＲ₂をカップリングさせること、 Ｆ）Ｙを有する基に基：−ＸＬＲ₄をカップリングさせること、 Ｇ）環の窒素に基：−ＭＲ₃をカップリングさせること ［ここで、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−
     （ＣＨ₂）_nアリール（置換又は非置換の）又は−（ＣＨ₂）_nヘテロアリール（置
     換又は非置換の）を表わし、 ＺはＯ又はＳであり、 Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ₈を表わし、 Ｒ₅は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分
     岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又は
     シクロアルキルアルキルを表わし、 Ｒ₇は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラ
     ルキルを表わす］ 少なくとも一つを含む請求項８８に記載の方法。
101. 【請求項１０１】 工程Ｄ〜Ｇの少なくとも三つを任意の順序で達成するこ
     とからなる請求項記１００に載の方法。
102. 【請求項１０２】 更に下記の工程： Ｄ）環外アミンに基：−Ｚ’ＶＲ₅をカップリングさせること、 Ｅ）環外アミンに基：−Ｒ₇をカップリングさせること、 Ｆ）Ｙを有する基に基：−ＮＪ₂Ｎ（Ｒ₉）₂をカップリングさせること、 Ｇ）環の窒素に基：−ＧＲ₆をカップリングさせること ［ここで、 Ｚ’はＳＯ₂、−（Ｃ＝Ｓ）−又は−（Ｃ＝Ｏ）−であり、 Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ₈を表わし、 Ｒ₅は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分
     岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又は
     シクロアルキルアルキルを表わし、 Ｒ₇は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラ
     ルキルを表わす］ の少なくとも一つを含む請求項９４に記載の方法。
103. 【請求項１０３】 工程Ｄ〜Ｇの少なくとも三つを任意の順序で達成するこ
     とからなる請求項記１０２に載の方法。