JP2005507860A5 - - Google Patents

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ヘッジホッグシグナル伝達経路メディエーター、それに関連した組成物及び利用
発明の背景
パターン形成は、胚細胞が分化した組織の秩序だった空間的配置を形成する活動である。高等生物の身体的複雑さは、細胞固有の系列と細胞の外からのシグナリングとの相互作用によって胚形成中に増大する。誘導的相互作用は、最初期のボディプランの確立から臓器系のパターン形成までの、脊椎動物発生における胚のパターン形成及び、組織分化中の様々な細胞型の発生に必須である(Davidson,E.,(1990)Development 108:365-389；Gurdon,J.B.,(1992)Cell 68:185-199；Jessell,T.M.等、(1992)Cell 68:257-270)。発生中の細胞の相互作用の効果は、変化する。典型的には、応答する細胞は、細胞分化の一つの経路から他の経路へ、応答する細胞の未誘導の及び誘導された状態の両方と異なる細胞を誘導することによりそらされる(誘導)。ときには、細胞は、それらの隣接細胞にそれらと同じに分化することを誘導し(ホメオジェネティック誘導)；他の場合には、細胞は、その隣接細胞にそれと同じに分化することを禁止する。初期発生における細胞相互作用は、順次的であり、それで、２つの細胞型間での初期の誘導は、多様性の漸進的増幅へと導く。その上、誘導的相互作用は、胚においてだけでなく、成体の細胞においても起き、形態形成パターンを確立して維持するように作用し並びに分化を誘導することができる(J.B.Gurdon(1992)Cell 68:185-199)。
シグナル伝達分子のヘッジホッグファミリーのメンバーは、無脊椎動物及び脊椎動物の発生中に、多くの重要な短距離及び長距離パターニング過程を媒介する。ハエにおいては、単一のヘッジホッグ遺伝子が、体節及び成虫原基のパターニングを調節する。対照的に、脊椎動物では、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーは、左右非対称性、ＣＮＳ、体節及び肢におけるポラリティー、器官形成、軟骨形成並びに精子形成の制御に関与している。
最初のヘッジホッグ遺伝子は、ショウジョウバエDrosophila melanogasterにおける遺伝的スクリーニングにより同定された(Nusslein-Volhard,C.及びWieschaus,E.(1980) Nature 287,795-801)。このスクリーニングは、胚及び幼虫の発生に影響を及ぼす突然変異を同定した。１９９２年と１９９３年に、Drosophilaのヘッジホッグ(hh)遺伝子の分子的性質が報告され(C.F.,Lee等(1992)Cell 71,33-50)、その後、幾つかのヘッジホッグ同族体が種々の脊椎動物種から単離された。Drosophilaと他の無脊椎動物において唯一つのヘッジホッグ遺伝子が発見されたのに対して、脊椎動物には多数のヘッジホッグ遺伝子が存在する。
ヘッジホッグ遺伝子の脊椎動物ファミリーには、少なくとも４つのメンバー(例えば、単一のショウジョウバエのヘッジホッグ遺伝子のパラログ)が含まれる。典型的なヘッジホッグ遺伝子及びタンパク質は、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５６及びＷＯ９６／１７９２４に記載されている。これらのメンバーの内の３つ{ここでは、デザートヘッジホッグ(Dhh)、ソニックヘッジホッグ(Shh)及びインディアンヘッジホッグ(Ihh)と呼ぶ}は、明らかに、魚類、鳥類及び哺乳類を含むすべての脊椎動物中に存在する。第４のメンバー{ここでは、tiggie-winkleヘッジホッグ(Thh)と呼ぶ}は、魚類に特徴的であるようである。デザートヘッジホッグ(Dhh)は、マウスの胚発生並びに成体のゲッ歯動物及びヒトの両者において、主として、精巣で発現されており；インディアンヘッジホッグ(Ihh)は、胚形成中の骨の発生及び成体における骨の形成に関与しており；そして、Ｓｈｈは、上記のように、主に、形態形成及び神経誘導活動に関与している。脊椎動物の器官の発生及び維持におけるヘッジホッグポリペプチドの臨界的な誘導的役割を仮定すれば、ヘッジホッグと相互作用するタンパク質の同定は、臨床及び研究の両方の関係において、最も重要である。
様々なヘッジホッグタンパク質は、シグナルペプチド、高度に保存されたＮ−末端領域、及び一層分岐したＣ末端ドメインよりなる。分泌経路でのシグナル配列の開裂に加えて(Lee,J.J.等(1992)Cell 71:33-50；Tabata,T.等(1992)Genes Dev.2635-2645；Chang,D.E.等(1994)Development 120:3339-3353)、ヘッジホッグの前駆体タンパク質は、Ｃ末端部分の保存された配列に依存する内部自己タンパク質分解性開裂を受ける(Lee等(1994)Science 266:1528-1537；Porter等(1995)Nature 374:363-366)。この開裂は、１９ｋＤのＮ末端ペプチドと２６〜２８ｋＤのＣ末端ペプチドへと導く(Lee等(1992)前出；Tabata等(1992)前出；Chang等(1994)前出；Lee等(1994)前出；Bumcrot,D.A.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2294-2303；Porter等(1995)前出；Ekker,S.C.等(1995)Curr.Biol.5:944-955；Lai,C.J.等(1995)Development 121:2349-2360)。このＮ末端ペプチドは、それが合成された細胞の表面にきつく結合したままでいるが、Ｃ末端ペプチドは、イン・ビトロ及びイン・ビボの両方で自由に拡散しうる(Porter等(1995)Nature 374:363；Lee等(1994)前出；Bumcrot等(1995)前出；Marti,E.等(1995)Development 121:2537-2547；Roelink,H.等(1995)Cell 81:445-455)。興味深いことに、このＮ末端ペプチドの細胞表面保持は、内部開裂の正常位置で正確に停止するＲＮＡによりコードされたＨＨの切り詰め型は、イン・ビトロ(Porter等(1995)前出)及びイン・ビボ(Porter,J.A.等(1996)Cell 86,21-34)において拡散しうるので、自己開裂に依存している。生化学的研究は、ＨＨ前駆体タンパク質の自己タンパク質分解性開裂が、内部チオエステル中間体を経て進行し、続いて、該中間体が親核置換にて開裂されるということを示した。親核試薬が小さい親油性分子であって、それがＮペプチドのＣ末端に共有結合して(Porter等(1996)前出)それを細胞表面に繋ぎ留めるということはありそうなことである。それらの生物学的意味は、深淵である。この繋ぎ留めの結果、Ｎ末端ヘッジホッグの局所的高濃度が、ヘッジホッグ産生細胞の表面に生じる。Drosophila及び脊椎動物における短距離及び長距離のヘッジホッグシグナル伝達活性に必要且つ十分であるのは、このＮ末端ペプチドである(Porter等(1995)前出；Ekker等(1995)前出；Lai等(1995)前出；Roelink,H.等(1995)Cell 81:445-455；Porter等(1996)前出；Fietz,M.J.等(1995)Curr.Biol.5:643-651；Fan,C.-M.等(1995)Cell 81:457-465；Marti,E.等(1995)Nature 375:322-325；Lopez-Martinez等(1995)Curr.Biol 5:791-795；Ekker,S.C.等(1995)Development 121:2337-2347；Forbes,A.J.等(1996)Development 122:1125-1135)。
ＨＨは、Drosophilaの発生中に様々な部位で短距離及び長距離のパターニング過程に関係付けられてきた。初期胚におけるセグメントポラリティーの確立において、それは、直接媒介されるように見える短距離効果を有するが、成虫原基のパターニングにおいては、それは、二次的シグナルの誘導を介する長距離効果を誘導する。
脊椎動物において、幾つかのヘッジホッグ遺伝子が、過去数年間にクローン化されてきた。これらの遺伝子の内で、Ｓｈｈは、隣接組織をパターン形成するシグナルの源である種々のオーガナイズセンターで発現されるので、実験的注意の殆どを受けてきた。最近の証拠は、Ｓｈｈがこれらの相互作用に関与していることを示している。
Ｓｈｈの発現は、予定正中線中胚葉、マウス(Chang等(1994)前出；Echelard,Y.等(1993)Cell 75:1417-1430)、ラット(Roelink,H.等(1994)Cell 76:761-775)及びニワトリ(Riddle,R.D.等(1993)Cell 75:1401-1416)の節板、並びにゼブラフィッシュの盾状部(Ekker等(1995)前出；Krauss,S.等(1993)Cell 75:1431-1444)における原腸形成の開始の少し後で開始する。ニワトリ胚において、節板でのＳｈｈの発現パターンは、左右非対称になり、これは、心臓の左右位置の原因であるようである(Levin,M.等(1995)Cell 82:803-814)。
ＣＮＳにおいて、脊索及び底板由来のＳｈｈは、腹側細胞の運命を誘導するようである。Ｓｈｈは、異所的に発現した場合には、マウス(Echelard等(1993)前出；Goodrich等(1996)Genes Dev.10:301-312)、アフリカツメガエル(Roelink,H.等(1994)前出；Ruiz i Altaba,A.等(1995)Mol.Cell.Neurosci.6:106-121)、及びゼブラフィッシュ(Ekker等(1995)前出；Krauss等(1993)前出；Hammerschmidt,M.等(1996)Genes Dev.10:647-658)の中脳及び菱脳の広い領域の腹側化へと導く。脊髄レベルでの中間神経外胚葉の外植片において、Ｓｈｈタンパク質は、底板及び運動ニューロンの発生を別個の濃度閾値で誘導するが、高濃度では底板を誘導し、一層低濃度では運動ニューロンを誘導する(Roelink等(1995)前出；Marti等(1995)前出；Tanabe,Y.等(1995)Curr.Biol.5:651-658)。その上、抗体ブロッキングは、脊索により生成されたＳｈｈが、脊索媒介の運動ニューロン運命の誘導に必要であることを示唆する(Marti等(1995)前出)。従って、Ｓｈｈ産生正中線細胞の表面における高濃度のＳｈｈは、イン・ビトロで認められる底板の接触媒介性誘導及びイン・ビボでの脊索の直ぐ上の底板の正中線位置決めを説明するように見える(Placzek等(1993)Development 117:205-218)。脊索と底板から放出される一層低濃度のＳｈｈは、おそらく、一層遠位の腹側外側領域で運動ニューロンを、イン・ビトロで接触に依存しないように見えたプロセスにおいて誘導するのであろう(Yamada,T.等(1993)Cell 73:673-686)。中脳及び菱脳レベルで採取した外植片において、Ｓｈｈは又、適当な腹側外側の神経細胞型、ドーパミン作動性(Heynes,M.等(1995)Neuron 15:35-44；Wang,M.Z.等(1995)Nature Med.1:1184-1188)及びコリン作動性(Ericson,J.等(1995)Cell 81:747-756)前駆細胞をもそれぞれ誘導し、これは、ＳｈｈがＣＮＳの全長にわたって腹側の特定化の一般的インデューサーであることを示唆している。これらの観察は、Ｓｈｈに対する差次的応答が特定の前後位置で、如何にして制御されているのかについての疑問を起こさせる。
正中線からのＳｈｈは又、脊椎動物胚の軸傍領域、体幹中の(Fan等(1995)前出)体節及びそれらの体節の上部間充織吻(Hammerschmidt等(1996)前出)をもパターン形成する。ニワトリとマウスの軸傍中胚葉外植片において、Ｓｈｈは、皮膚筋節マーカーＰａｘ３を犠牲にしてＰａｘ１及びＴｗｉｓｔのような硬節特異的なマーカーの発現を促進する。その上、フィルターバリヤー実験は、Ｓｈｈが、硬節の誘導を、二次的なシグナル伝達機構の活性化によるのではなく直接媒介することを示唆している(Fan,C.-M.及びTessier-Lavigne,M.(1994)Cell 79,1175-1186)。
Ｓｈｈは又、筋節遺伝子発現をも誘導する(Hammerschmidt等(1996)前出；Johnson,R.L.等(1994)Cell 79:1165-1173；Munsterberg,A.E.等(1995)Genes Dev.9:2911-2922；Weinberg,E.S.等(1996)Development 122:271-280){もっとも、最近の実験は、ＷＮＴファミリー(Drosophila winglessの脊椎動物同族体)のメンバーが協調して必要とされることを示しているが(Munsterberg等(1995)前出)}。訳の分からないことに、ニワトリにおける筋節の誘導は、硬節マーカーの誘導よりも一層高濃度のＳｈｈを必要とする(Munsterberg等(1995)前出)が、硬節は、脊索の一層近くに位置する体節細胞から生じている。同様の結果が、ゼブラフィッシュにおいて得られ、高濃度のヘッジホッグが筋節を誘導し且つ硬節マーカー遺伝子の発現を抑制した(Hammerschmidt等(1996)前出)。しかしながら、羊膜動物と対照的に、これらの観察は、魚類胚の構成と一致して、筋節が優勢で一層軸性の構成要素である。従って、Ｓｈｈシグナリングの調節及び新規なシグナリング因子の獲得は、脊椎動物の進化において、体節構造を改変しえた。
脊椎動物の肢芽において、後部間充織細胞のサブセット、「極性化活性帯」(ＺＰＡ)は、前後足指の同定を調節する(Honig,L.S.(1981)Nature 291:72-73に総説されている)。Ｓｈｈの異所的発現又はＳｈｈペプチドに浸したビーズの適用は、前側ＺＰＡ移植片の効果を真似て、足指の鏡像複製を生じる(Chang等(1994)前出；Lopez-Martinez等(1995)前出；Riddle等(1993)前出)(図２)。従って、足指の同定は、主として、Ｓｈｈ濃度に依存しているようであるが、他のシグナルがＡＰパターニングに必要であるらしいかなりの距離(１００〜１５０μｍ)を超えて、この情報を中継するということはあり得る。Drosophila成虫原基におけるＨＨとＤＰＰの相互作用と同様に、脊椎動物の肢芽において、Ｓｈｈは、Ｂｍｐ２(ｄｐｐ同族体)の発現を活性化する(Francis,P.H.等(1994)Development 120:209-218)。しかしながら、DrosophilaにおけるＤＰＰと異なり、Ｂｍｐ２は、ニワトリの肢芽における異所的適用に際してＳｈｈの極性化効果を真似できない(Francis等(1994)前出)。前後パターニングに加えて、Ｓｈｈは又、後端外胚葉隆起における繊維芽細胞成長因子ＦＧＦ４の合成の誘導により、肢の近遠生長にも関与するらしい(Laufer,E.等(1994)Cell 79:993-1003；Niswander,L.等(1994)Nature 371:609-612)。
ヘッジホッグタンパク質とＢＭＰの間の近い関係が、脊椎動物のヘッジホッグの発現の多くの部位(但し、おそらく、すべてではない)で保存されてきたことは、ありそうなことである。例えば、ニワトリの後腸において、Ｓｈｈは、Ｂｍｐ４(別の脊椎動物のｄｐｐ同族体)の発現を誘導することが示されている(Roberts,D.J.等(1995)Development 121:3163-3174)。更に、ＳｈｈとＢｍｐ２、４又は６は、胃、泌尿生殖器系、肺、歯蕾及び毛嚢の上皮及び間充織細胞におけるそれらの発現において、著しい相関関係を示す(Bitgood,M.J.及びMcMahon,A.P.(1995)Dev.Biol.172:126-138)。更に、Ｉｈｈ(２つの他のマウスヘッジホッグ遺伝子の一つ)は、消化管及び発生中の軟骨において、Ｂｍｐを発現する細胞に隣接して発現される(Bitgood及びMcMahon(1995)前出)。
最近の証拠は、Ｉｈｈが、軟骨発生の調節において重大な役割を演じるモデルを示唆している(Roberts等(1995)前出)。軟骨形成中に、軟骨細胞は、増殖状態から中間、前肥大状態を経て、分化した肥大軟骨細胞に進行する。Ｉｈｈは、前肥大軟骨細胞において発現されて、軟骨細胞の分化のブロックに導くシグナル伝達カスケードを開始する。その直接の標的は、Ｉｈｈ発現ドメインの周囲の軟骨膜であり、それは、Ｇｌｉ及びパッチト(Ｐｔｃ)(ヘッジホッグシグナルの保存された転写標的)の発現により応答する(下記参照)。最もありそうなことには、これは、関節周囲の軟骨膜における副甲状腺ホルモン関連タンパク質(ＰＴＨｒＰ)の合成を生じる二次的シグナリングへと導く。ＰＴＨｒＰ自体は、前肥大軟骨細胞にシグナルを返して、それらの更なる分化をブロックする。同時に、ＰＴＨｒＰは、Ｉｈｈの発現を抑制し、それにより、軟骨細胞の分化の速度を調節する負のフィードバックループを形成する。
パッチトは、最初、Drosophilaにおいて、セグメントポラリティー遺伝子(胚の前後軸に沿った同族列に生じる個々のセグメント内の細胞分化に影響を与える発生遺伝子のグループの一つ)として同定された。Hooper,J.E.等(1989)Cell 59:751；及びNakano,Y.等(1989)Nature 341:508を参照されたい。パッチトの脊椎動物同族体の発現パターンは、それが、神経管、骨格、肢、頭蓋顔面構造及び皮膚の発生に関与することを示唆する。
遺伝及び機能の研究は、パッチトが、ヘッジホッグシグナリングカスケード(下流の多くの遺伝子の発現を調節する進化的に保存された経路)の部分であることを示している。Perrimon,N.(1995)Cell 80:517；及びPerrimon,N.(1996)Cell 86:513を参照されたい。パッチトは、標的遺伝子の構成的な転写の抑制に関係しており；その効果は、ヘッジホッグ又は脊椎動物の同族体にコードされる転写を活性化する分泌糖タンパク質に妨害される。この経路の制御下の遺伝子には、Ｗｎｔ及びＴＧＦβファミリーのメンバーが含まれる。
パッチトタンパク質は、２つの大きい細胞外ドメイン、１２の膜貫通セグメント及び幾つかの細胞質セグメントを有する。Hooper前出；Nakao前出；Johnson,R.L.等(1996)Science 272:1668；及びHahn,H.等(1996)Cell 85:841を参照されたい。パッチトのヘッジホッグシグナリング経路における生化学的役割は、不明である。しかしながら、ヘッジホッグタンパク質との直接的相互作用が報告されており(Chen,Y.等(1996)Cell 87:553)、パッチトは、ヘッジホッグレセプター複合体に、スムースンド遺伝子によりコードされる他の膜貫通タンパク質と共に関係しうる。Perrimon,前出；及びChen,前出を参照されたい。
パッチトのヒトの同族体が、最近、クローン化され、染色体９ｑ２２．３にマップされた。Johnson,前出；及びHahn,前出を参照されたい。この領域は、肋骨及び頭蓋顔面変性、手及び脚の異常、並びに二分脊椎を含む発生異常を特徴とする、基底細胞母斑症候群(ＢＣＮＳ)に関係している。
ＢＣＮＳは又、多数の腫瘍型にかかりやすくもし、最も高頻度なのは、身体の多くの場所に生じ生涯の最初の２０年以内に現れる基底細胞癌(ＢＣＣ)である。しかしながら、ＢＣＣの殆どの症例は、この症候群に関係なく、北欧の家系の中年又は一層年配の人々の日光にさらされる部位に少数散発的に生じる。
ＢＣＮＳ関連の及び散発性のＢＣＣにおける最近の研究は、パッチトの両アレルの機能欠損がＢＣＣの発生へと導くことを示唆している。Johnson,前出；Hahn,前出及びGailani,M.R.等(1996)Nature Genetics 14:78を参照されたい。染色体９ｑ２２．３の単一アレル欠損は、散発性及び遺伝性のＢＣＣの両者において頻繁に生じている。連鎖分析は、ＢＣＮＳ患者由来の腫瘍において、欠損した遺伝性のアレルが保持されて正常なアレルが失われていることを示した。
散発性の腫瘍も又、パッチトの両機能性アレルの喪失を示した。一本鎖コンホメーション多形スクリーニングアッセイによりパッチト変異が同定された１２の腫瘍の内で、９つが、第２アレルの染色体欠失を有し、他の３つは、両アレルに不活性化変異を有した(Gailani,前出)。対応する生殖細胞系列のＤＮＡには、変化は生じなかった。
殆どの同定された突然変異は、時期尚早の停止コドン又はフレームシフトを生じた。Lench,N.J.等、Hum.Genet.1997 Oct; 100(5-6):497-502。しかしながら、幾つかは、細胞外又は細胞質ドメインにおけるアミノ酸置換へと導く点突然変異であった。これらの変異部位は、細胞外タンパク質又は細胞質の下流のシグナル伝達経路のメンバーとの相互作用についての機能的重要性を示しうる。
パッチトの遺伝子発現の阻止への関与及びＢＣＣにおけるパッチトの頻繁なアレル欠失の出現は、この遺伝子についての腫瘍サプレッサー機能を支持する。細胞シグナル伝達及び細胞間コミュニケーションに関与することが知られた遺伝子ファミリーの調節におけるその役割は、腫瘍抑制の可能な機構を与える。
発明の要約
本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化例えばｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進などの表現型から生じる異常型の増殖状態を阻止するために、細胞をその異常型の増殖状態を逆転させ又は制御する(例えば、正常なｐｔｃ活性を代行し、正常なヘッジホッグ活性と拮抗し又はスムースンド活性と拮抗する)のに十分な量の小型分子などの薬剤と接触させることを含む利用可能な方法及び試薬を提供する。
図面の簡単な説明
図１〜３１は、本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
図３２ａ〜ｊは、本発明の代表的な化合物を図解した図である。
図３３は、この発明の化合物のヒト基底細胞癌(ＢＣＣ)におけるヘッジホッグシグナリングに対する効果を示している。
図３４は、この発明の化合物のＢＣＣ組織におけるアポトーシスに対する効果を示している。
図３５は、この発明の化合物のＳ−１２及びＨＴ−２９細胞におけるヘッジホッグシグナリングに対する効果を描いている。
図３６は、この発明の化合物のＰＣ−３及びＲＴ−４細胞におけるヘッジホッグシグナリングに対する効果を描いている。
図３７は、細胞におけるヘッジホッグ活性の評価に用いられるプローブ及びプライマーの配列を与える。
図３８及び４０は、この発明の化合物の、ｐｃｔ−ヌル細胞におけるＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ発現に対する差次的効果を示す。
図３９及び４１は、この発明の化合物の、ＨＥＰＭ細胞におけるＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ発現に対する差次的効果を示す。
発明の実施の最良形態
発明の詳細な説明
Ｉ．概観
本発明は、ヘッジホッグ、パッチト(ｐｔｃ)、ｇｌｉ及び／又はスムースンドにより調節されるシグナル変換経路が、少なくとも部分的に、小型分子によって阻害されうるという発見に関係する。如何なる特定の理論に拘束されることも望まないが、レセプターの活性化は、これらの因子が作用する機構でありうる。例えば、これらの因子の、パッチト機能欠損(ｐｔｃlof)細胞の増殖を阻止する能力は、かかる分子のヘッジホッグ、パッチト若しくはスムースンドと相互作用し又は少なくともそれらのタンパク質のヘッジホッグ、ｐｔｃ及び／若しくはスムースンド媒介のシグナル変換経路を活性化する能力を邪魔する能力のためでありうる。
それ故、ヘッジホッグ、ｐｔｃ又はスムースンドシグナル変換活性の状況を邪魔するこれらの小型分子が、同様に、正常細胞及び／又はパッチト機能欠損表現型、ヘッジホッグ機能亢進表現型若しくはスムースンド機能亢進表現型を有する細胞において増殖(又は他の生物学的結果)を阻害することができるということが特に予期される。従って、ある具体例において、これらの化合物が、正常細胞例えばヘッジホッグ経路を活性化する遺伝子変異を有しない細胞におけるヘッジホッグ活性の阻害に有用でありうることが予想される。好適具体例において、主題のインヒビターは、２５００ａｍｕ未満の、一層好ましくは１５００ａｍｕ未満の、尚一層好ましくは７５０ａｍｕ未満の分子量を有して、ヘッジホッグタンパク質の生物学的活性の少なくとも幾つかを特に標的細胞において阻害することのできる有機分子である。
従って、本発明の方法は、正常な細胞、組織及び器官並びにｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進表現型を有するものを含む広範囲の細胞、組織及び器官の修復及び／又は機能性能の調節におけるヘッジホッグシグナル伝達のｐｔｃ阻害を例えばそのシグナル経路のスムースンド又は下流の構成要素の活性化を阻害することにより代行する小型分子の利用を含む。例えば、主題の方法は、神経組織、骨及び軟骨組織の形成及び修復の調節から、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝及び他の原始腸管から生じる臓器の調節、造血機能の調節、皮膚及び毛の成長の調節などに及ぶ治療及び化粧用応用を有する。その上、主題の方法は、培養で与えられた細胞(イン・ビトロ)においても、動物個体内の細胞(イン・ビボ)においても実施することができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５６及びＷＯ９６／１７９２４(これらの明細書を、特に、参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。
好適具体例において、主題の方法は、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の表現型を有する上皮細胞を処理することであってよい。例えば、主題の方法は、基底細胞癌又は他のヘッジホッグ経路関連疾患の治療又は予防において利用することができる。
ある具体例において、主題のアンタゴニストは、スムースンドに結合することによりヘッジホッグ経路の活性化を阻止することができる。ある具体例においては、主題のアンタゴニストは、パッチトに結合することによりヘッジホッグ経路の活性化を阻止することができる。
他の好適具体例において、主題の方法は、悪性の髄芽細胞腫及び他の原発性のＣＮＳ悪性神経外胚葉性腫瘍の治療養生法の部分として利用することができる。
他の面において、本発明は、活性成分として、ここに記載したようなヘッジホッグアンタゴニスト、ｐｔｃアゴニスト又はスムースンドアンタゴニストを、イン・ビボで、増殖又は他のｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の生物学的結果を阻害するのに十分な量で配合して含む医薬製剤を提供する。
主題のヘッジホッグアンタゴニスト、パッチトアゴニスト又はスムースンドアンタゴニストを用いる治療は、ヒト及び動物の患者の両者に効果的であってよい。この発明を適用しうる動物患者は、ペットとして又は商業目的で飼われている家庭の動物及び家畜の両方に及ぶ。例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ及びヤギである。
ＩＩ．定義
便宜のために、本明細書、実施例、及び添付の請求の範囲で用いている幾つかの用語を、ここに集めた。
遺伝子の「異常型の改変又は突然変異」なる語句は、例えば、遺伝子のヌクレオチドの欠失、置換又は付加などの遺伝子損傷並びに遺伝子の大きな染色体再配列及び／又は異常なメチル化をいう。同様に、遺伝子の誤発現は、遺伝子の発現の正常細胞におけるレベルと比較しての同様の条件下での異常型のレベル並びに遺伝子から転写されたｍＲＮＡの非野生型のスプライシングをいう。
「基底細胞癌」は、様々な臨床的及び組織学的形態例えば結節性潰瘍性、浅在性、着色した、限局性強皮症様、繊維上皮腫及び母斑様で存在する。基底細胞癌は、ヒトで見出される最も一般的な皮膚の新生物である。メラノーマでない皮膚癌の新たな症例の大多数は、このカテゴリーに入る。
「火傷創」は、熱及び／又は化学剤のために個体の皮膚の大きい表面積が除去され又は失われた症例をいう。
用語「癌」は、上皮細胞よりなり、周囲の組織に浸潤する傾向及び転移を生じる傾向のある悪性の新規な増殖をいう。典型的な癌には、めったに転移しないが局所的浸潤及び破壊の可能性を有する皮膚の上皮性腫瘍である「基底細胞癌」；鱗状の上皮から生じる立方体様の細胞を有する癌をいう「扁平上皮細胞癌」；癌性組織と肉腫性組織とからなる悪性腫瘍を含む「癌肉腫」；小さい上皮細胞の集団又は帯により分離され又は囲まれたヒアリン又はムチン間質のシリンダー又はバンドを特徴とし、乳腺及び唾液腺並びに気道の粘液腺に生じる癌である「腺嚢腫癌」；表皮と同様に分化する傾向がある(即ち、有棘細胞を形成し、角質化を受ける傾向がある)癌細胞をいう「類表皮癌」；鼻の後ろの空間の上皮性の内層に生じる悪性腫瘍をいう「鼻咽頭癌」；及び配置の変化する管状細胞よりなる腎臓実質組織の癌に属する「腎細胞癌」が含まれる。他の癌性上皮増殖は、上皮に由来し、パピローマウイルスを原因因子として有する良性腫瘍をいう「乳頭腫」；及び神経溝の閉じるときに外胚葉エレメントの封入により形成される脳又は髄膜の腫瘍をいう「類表皮腫」である。
「真皮」は、上皮の深部にある皮膚の層をいい、血管結合組織の密な層よりなり且つ神経及び末端感覚器官を含む。毛根及び皮脂腺及び汗腺は、真皮に深く埋められた表皮の構造である。
「歯組織」は、上皮組織と類似する口内の組織例えば歯肉組織をいう。本発明の方法は、歯周病の治療に有用である。
「真皮潰瘍」は、組織表面の喪失により引き起こされる皮膚の病変(通常、炎症を伴う)をいう。本発明の方法により治療することのできる真皮潰瘍には、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、静脈鬱血性潰瘍及び動脈性潰瘍が含まれる。褥瘡は、長時間にわたって皮膚の領域に加えられる圧力により生じる慢性的潰瘍をいう。この種の傷は、しばしば、床ずれと呼ばれる。静脈鬱血性潰瘍は、欠陥のある静脈の鬱血又は他の液体の停滞により生じる。動脈性潰瘍は、血流の乏しい動脈の周囲の領域における壊死した皮膚をいう。
用語「ＥＤ50」は、最大の応答又は効果の５０％を生じる薬物の投与量を意味する。
主題の治療方法に関して、例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの「有効量」は、所望の投薬養生法の部分として適用した場合に、例えば、細胞増殖速度の及び／又は細胞の分化状態の及び／又は細胞の生存率の変化を引き起こす製剤中のアンタゴニストの量(治療すべき疾患又は化粧目的について臨床的に許容し得る標準に従う)をいう。
用語「上皮性」及び「上皮」は、内部及び外部の体表面の細胞性の被覆(皮膚、粘膜及び漿膜)をいい、それから生じた腺その他の構造例えば角膜、食道、真皮、毛嚢及び上皮細胞を含んでいる。他の典型的な上皮組織には、鼻腔の嗅覚器領域の内表面となっている擬似層化上皮であって嗅覚のためのセンサーを含んでいる嗅覚上皮；分泌細胞よりなる上皮をいう腺上皮；平らな板状の細胞からなる上皮をいう扁平上皮が含まれる。用語上皮は又、縮小及び拡大のために大きな機械的変化を受ける中空臓器を裏打ちすることが特徴的に見出される過渡的上皮例えば層化扁平上皮と円柱上皮の間の過渡的上皮をもいう。
用語「上皮形成」は、剥離された表面を覆う上皮組織の増殖による治癒をいう。
用語「表皮腺」は、表皮と関係して、通常の代謝の必要性と関係なく物質を分泌又は排出する細胞の凝集をいう。例えば、「皮脂腺」は、油性物質と皮脂を分泌する真皮中の全分泌腺である。用語「汗腺」は、真皮又は皮下組織に位置されて管によって体表面に開口している汗を分泌する腺をいう。
用語「表皮」は、胚の外胚葉に由来する厚さ０．０７〜１．４ｍｍの皮膚の最も外側の非脈管層をいう。手掌及び足底表面においては、それは、内側から外側に向かって、５つの層：直立して配置された円柱細胞よりなる基底層；短い突起又はとげを有する平らな多面細胞よりなる有棘細胞又は有棘層；平らな顆粒細胞よりなる顆粒層；核がはっきりしないか又は存在しない透明な細胞の幾つかの層よりなる透明層；及び平らな角化した無核の細胞よりなる角質層よりなる。全身の体表面の表皮において、透明層は、通常、存在しない。
「切り出し傷」は、皮膚の上皮層中の裂き傷、擦り傷、切り傷、刺し傷又は破傷を含み、真皮層に及び得るし、皮下脂肪以下にさえ及び得る。切り出し傷は、外科的手順により生じ得るし又は不慮の皮膚貫通によって生じ得る。
細胞の「増殖状態」は、細胞の増殖の速度及び／又は細胞の分化状態をいう。「変化された増殖状態」は、異常な増殖速度を特徴とする増殖状態(例えば、正常細胞に比べて増大した又は減少した増殖速度を示す細胞)である。
用語「毛」は、糸状構造、特に、ケラチンよりなり、真皮中に埋められた乳頭状突起から発生する特殊化された表皮構造であって、哺乳動物によってのみ生成され、動物のグループに特徴的である表皮構造をいう。又、「毛」は、かかる毛の集合を指すこともある。「毛嚢」は、毛を含む表皮の管状の陥入の一つをいい、それから毛が成長する。「毛嚢上皮細胞」は、毛嚢中の真皮の乳頭状突起を囲む上皮細胞例えば幹細胞、外毛根鞘細胞、マトリクス細胞及び内毛根鞘細胞をいう。かかる細胞は、正常の非悪性細胞であっても、トランスフォームされた／不死化細胞であってもよい。
用語「ヘッジホッグアンタゴニスト」は、例えば標的遺伝子の転写を抑制するためにパッチトの生物学的活性を強化し又は再現する薬剤をいう。好適なヘッジホッグアンタゴニストは、ｐｔｃ機能欠損及び／又はスムースンド機能亢進を克服するために用いることができる。後者は又、スムースンドアンタゴニストとも呼ばれる。用語「ヘッジホッグアンタゴニスト」は、ここで用いる場合、ヘッジホッグタンパク質の正常機能を直接阻害することにより作用し得る何れかの薬剤のみを指すのではなく、ヘッジホッグシグナリング経路を阻害し、そうして、ｐｔｃの機能を再現する任意の薬剤をも指す。
用語「ヘッジホッグ機能亢進」は、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させた場合と似た表現型(例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化)を生じるｐｔｃ遺伝子、ヘッジホッグ遺伝子若しくはスムースンド遺伝子の異常型の改変若しくは突然変異又はかかる遺伝子の発現レベルの減少(又は喪失)をいう。この機能亢進は、Ｃｉ遺伝子Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３の発現レベルを調節するｐｔｃ遺伝子産物の能力の喪失を含み得る。用語「ヘッジホッグ機能亢進」は又、ここでは、ヘッジホッグシグナル変換経路の何処かの変化(ヘッジホッグ自体の改変又は突然変異を含むが、それに限らない)のために生じた任意の類似の細胞表現型(例えば、過剰増殖を示すもの)を指すためにも用いる。例えば、ヘッジホッグシグナリング経路の活性化のための異常に高い増殖速度を有する腫瘍細胞は、たとえその細胞においてヘッジホッグが変異してなくても「ヘッジホッグ機能亢進」表現型を有する。
ここで用いる場合、「不死化細胞」は、化学的及び／又は組換え手段により、培養において無限回分裂して増殖する能力を有するように変えられた細胞をいう。
「内部上皮組織」は、皮膚における表皮層に類似する特徴を有する体内の組織をいう。例には、腸の内面が含まれる。本発明の方法は、ある種の内部の傷例えば外科手術により生じた傷の治癒の促進に有用である。
用語「角化症」は、表皮の角質層の過形成を特徴とする増殖性皮膚疾患をいう。典型的な角化症には、毛包性角化症、点状掌蹠角化症、咽頭角化症、毛髪角化症及び光線性角化症が含まれる。
用語「ＬＤ50」は、試験被験者の５０％に致死的である薬物の投与量を意味する。
用語「爪」は、指又は足指の遠心端の背側表面上の角質の皮膚板をいう。
用語「パッチト機能欠損」は、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させた場合と似た表現型(例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化)を生じるｐｔｃ遺伝子の異常型の改変若しくは突然変異又はこの遺伝子の減少した発現レベルをいう。同機能亢進は、Ｃｉ遺伝子例えばＧｌｉ１、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３の発現レベルを調節するｐｔｃ遺伝子産物の能力の喪失を含むことができる。用語「ｐｔｃ機能欠損」も又、ここでは、ヘッジホッグシグナル変換経路の何処かしらの変化(ｐｔｃ自身の修飾又は突然変異を含むが、限定はしない)のために生じた任意の同様の(例えば、過剰増殖を示す)細胞表現型を指すのに用いられる。例えば、ヘッジホッグシグナリング経路の活性化のために異常に大きい増殖速度を有する腫瘍細胞は、たとえその細胞においてｐｔｃが変異してなくても、「ｐｔｃ機能欠損」表現型を有するであろう。
主題の方法により治療を受ける「患者」又は「被験者」は、ヒトを意味しても、非ヒト動物を意味してもよい。
用語「プロドラッグ」は、生理的条件下で、本発明の治療上活性な薬剤に変換される化合物を包含することを意図している。プロドラッグを作成するための一般的方法は、生理的条件下で加水分解されて所望の分子が出現する選択した部位を含むことである。他の具体例において、プロドラッグは、宿主の動物の酵素活性により変換される。
ここで用いる場合、「増殖性」及び「増殖」は、有糸分裂を受ける細胞をいう。
この出願中で、用語「増殖性皮膚疾患」は、皮膚組織の望ましくない又は異常な増殖の著しい任意の皮膚の病気／疾患をいう。これらの病気は、典型的には、表皮細胞の増殖又は不完全な細胞分化により特徴付けられ、例えば、Ｘ染色体性魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、表皮剥離性角化症及び脂漏性皮膚炎を含む。例えば、表皮異形成は、表皮の不完全な発生形態である。他の例は、自発的な又は外傷部位の水疱の形成を伴う表皮のゆるんだ状態をいう「表皮剥離」である。
ここで用いる場合、用語「乾癬」は、皮膚の調節機構を変える増殖過剰性皮膚疾患をいう。特に、表皮の増殖における一次的及び二次的変化、皮膚の炎症性応答及び調節分子例えばリンホカイン及び炎症性因子の発現を含む病変が形成される。乾癬の皮膚は、形態的に、表皮細胞の増大したターンオーバー、肥厚した表皮、異常な角質化、真皮層への炎症性細胞浸潤及び多形核白血球の表皮層への浸潤(基底細胞サイクルの増大を生じる)を特徴とする。加えて、過角化症及び不全角化細胞が存在する。
用語「皮膚」は、身体の外側の保護用の被覆であり、真皮と表皮よりなり、汗腺及び皮脂腺並びに毛嚢構造を含むと理解されている。本願中で、形容詞「皮膚の」は、一般に、それらを用いる分脈において適当であれば、皮膚の属性をいうように用いられ且つ理解されるべきである。
用語「スムースンド機能亢進」は、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させた場合と似た表現型(例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化)を生じるｓｍｏ遺伝子の異常型の改変若しくは突然変異又はこの遺伝子の増大した発現レベルをいう。如何なる特定の理論に拘束されることも望まないが、ｐｔｃが、直接細胞にシグナルを送ることができず、むしろ、ヘッジホッグシグナリングにおいてｐｔｃの下流に位置する他の膜結合タンパク質であるスムースンドと相互作用するということは注意される(Marigo等(1996) Nature 384: 177-179)。遺伝子ｓｍｏは、Drosophilaの各セグメントの正しいパターニングに必要なセグメントポラリティー遺伝子である(Alcedo等(1996) Cell 86:221-232)。ｓｍｏのヒトの同族体が同定されている。例えば、Stone等(1996) Nature 384:129-134及びＧｅｎＢａｎｋ受理番号Ｕ８４４０１を参照されたい。スムースンド遺伝子は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役レセプターの特徴を有する不可欠な膜タンパク質；即ち、７回膜貫通領域をコードする。このタンパク質は、wingless経路のメンバーであるDrosophila Frizzled (Fz)タンパク質に対する相同性を示す。元々、ｓｍｏは、Ｈｈシグナルのレセプターをコードすると考えられていた。しかしながら、この示唆は、その後、ｐｔｃがＨｈレセプターである証拠が得られたことにより反証が示された。Ｓｍｏを発現する細胞が、Ｈｈを結合することができず、これは、ｓｍｏがＨｈと直接には相互作用しないことを示している(Nusse,(1996) Nature 384:119-120)。むしろ、ソニックヘッジホッグ(Ｓｈｈ)のそのレセプターＰＴＣＨへの結合は、７回膜貫通タンパク質であるスムースンド(ＳＭＯ)のＰＴＣＨによる正常な阻害を妨げると考えられている。
最近、スムースンド変異の活性化が、散発性の基底細胞癌(Xie等(1998) Nature 391:90-2)及び中枢神経系の原始神経外胚葉腫瘍(Reifenberger等(1998) Cancer Res 58:1798-803)に生じるということが報告された。
用語「治療指数」は、ＬＤ50／ＥＤ50として規定される薬物の治療指数をいう。
ここで用いる場合、「トランスフォームされた細胞」は、無制限の増殖の状態に自発的に変換された(即ち、培養において無限回の分裂によって増殖する能力を得た)細胞をいう。トランスフォームされた細胞は、それらの増殖制御の喪失に関して、新生物の、未分化の及び／又は過形成の等の用語によって特徴付けられ得る。
用語“アシルアミノ”は斯界で認識されており、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ9は上で定義した通りであり、Ｒ'11は水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ2）m−Ｒ8（ｍ及びＲ8は上で定義した通りである）を表わす）
により表わすことができる部分である。
ここで、用語“脂肪族基”とは、直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基をいい、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基のような飽和及び不飽和の脂肪族基を包含する。
用語“アルケニル”及び“アルキニル”とは、上記のアルキルと鎖長及び可能な置換の点で類似するが、少なくとも１個の二重結合又は三重結合をそれぞれ含有する不飽和の脂肪族基をいう。
用語“アルコキシル”又は“アルコキシ”とは、ここで使用するときは、酸素基を結合させた上で定義したようなアルキル基をいう。代表的なアルコキシル基は、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔ−ブトキシなどが包含される。“エーテル”は、酸素に共有結合した２個の炭化水素である。従って、そのアルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、アルコキシルであり又はこれに類似し、例えば、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ2）m−Ｒ8（ｍ及びＲ8は上で定義した通りである）の一つにより表わすことができる。
用語“アルキル”とは、直鎖状アルキル基、分岐鎖状アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基及びシクロアルキル置換アルキル基も含めて飽和脂肪族基をいう。好ましい具体例では、直鎖状又は分岐鎖状アルキル基は、その主鎖内に３０個以下（直鎖のものについてはＣ1〜Ｃ30、分岐鎖状のものについてはＣ3〜Ｃ30）、好ましくは２０個以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルはその環構造内に３〜１０個の炭素原子を、好ましくは環構造内に５、６又は７個の炭素原子を有する。
更に、用語“アルキル”（又は、“低級アルキル”）とは、明細書、実施例及び請求の範囲を通じて使用するときは、“置換されていないアルキル”及び“置換されたアルキル”の双方を包含するものとし、後者のものは炭化水素の主鎖の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分をいう。このような置換基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル又はアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート又はチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドロリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分を包含できる。炭化水素連鎖上に置換した部分が適当ならばそれ自身置換され得ることは当業者ならば理解される。例えば、置換アルキルの置換基は、置換された及び置換されていない形のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネート及びホスフィネートも含めて）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイル又はスルホネートも含めて）及びシリル基並びにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート及びエステルを含めて）、−ＣＦ3、−ＣＮなどを包含し得る。置換アルキルの例は、以下に説明する。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ3、−ＣＮなどにより更に置換され得る。
炭素数が別に特定されていない限り、“低級アルキル”とは、ここで使用するときは、その主鎖構造内に１〜１０個、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する上で定義したようなアルキル基を意味する。同様に、“低級アルケニル”及び“低級アルキニル”は、類似の鎖長を有する。明細書を通じて、好ましいアルキル基は低級アルキルである。好ましい具体例では、アルキルとしてここに示した置換基は低級アルキルである。
用語“アルキルチオ”は、硫黄基を結合してなる上で定義したようなアルキル基をいう。好ましい具体例では、“アルキルチオ”は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル及び−Ｓ−（ＣＨ2）m−Ｒ8（ここで、ｍ及びＲ8は上で定義した通りである）の一つにより表わされる。
用語“アミン”及び“アミノ”は斯界で認識されており、置換されていないアミン及び置換されたアミンの両方をいい、例えば、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ9、Ｒ10及びＲ'10はそれぞれについて独立して水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ2）m−Ｒ8を表わし、Ｒ9とＲ10はこれらが結合しているＮ原子と一緒になって４〜８個の原子を環構造内に有する複素環を完成し、Ｒ8はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環又は多環を表わし、ｍは０又は１〜８の整数である）
により表わされる部分である。好ましい具体例では、Ｒ9又はＲ10の１個のみがカルボニルであることができ、例えば、Ｒ9、Ｒ10及び窒素がイミドを形成しない。ある具体例においては、Ｒ9及びＲ10は、カルボニルによってＮに結合され、そのアミンは、アミド又はイミドではなく、好ましくは塩基性であり、例えば、その共役酸は、７を超えるｐＫaを有する。更に好ましい具体例では、Ｒ9及びＲ10（及び随意にＲ'10）がそれぞれ水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ2）m−Ｒ8を表わす。しかして、用語“アルキルアミン”は、ここで使用するときは、置換された又は置換されていないアルキル結合してなる上記のようなアミン基、即ち、Ｒ9及びＲ10の少なくとも１個がアルキル基であるものを意味する。
用語“アミド”は、アミノ置換カルボニルとして斯界で認識されており、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ9及びＲ10は上で定義した通りである）
により表わすことができる部分を包含する。アミドの好ましい例は、不安定であり得るイミドを包含しない。
用語“アラルキル”とは、ここで使用するときは、アリール基（例えば、芳香族又はヘテロ芳香族基）により置換されたアルキル基をいう。
用語“アリール”は、ここで使用するときは、０〜４個の複素原子を含有できる５、６及び７員の単環式芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジンなどを包含する。環構造に複素原子を有するアリール基も“アリール複素環”又は“ヘテロ芳香族”ということができる。芳香族環は、１個以上の環の位置で、上記したような置換基、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ3、−ＣＮなどにより置換できる。また、用語“アリール”は、２個以上の環であって２個以上の炭素が２個の接する環に共通であるもの（その環は縮合環である）を有し、しかも環の少なくとも１個が芳香族であり、他の環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び（又は）ヘテロシクリルであってよい多環式環系も包含する。
用語“炭素環”とは、ここで使用するときは、環のそれぞれの原子が炭素である芳香族環又は非芳香族環をいう。
用語“カルボニル”は、斯界で認識されており、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｘは結合であるか又は酸素若しくは硫黄を表わし、Ｒ11は水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ2）m−Ｒ8又は製薬上許容できる塩を表わし、Ｒ'11は水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ2）m−Ｒ8（ｍ及びＲ8は上で定義した通りである）を表わす）
により表わすことができるような部分を包含する。Ｘが酸素であり且つＲ11又はＲ'11が水素でないときは、該式は“エステル”を表わす。Ｘが酸素であり且つＲ11が上で定義した通りであるときは、該部分はここではカルボキシル基といい、特に、Ｒ11が水素であるときは、該式は“カルボン酸”を表わす。Ｘが酸素であり且つＲ'11が水素であるときは、該式は“ホルメート”である。一般に、上記の式の酸素原子が硫黄で置き換えられた場合には、該式は“チオカルボニル”基を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ11又はＲ'11が水素でないときは、該式は“チオエステル”を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ11が水素であるときは、該式は“チオカルボン酸”を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ'11が水素であるときは、該式は“チオールホルメート”を表わす。他方、Ｘが結合であり且つＲ'11が水素でない場合は、該式は“ケトン基”を表わす。Ｘが結合であり且つＲ11が水素である場合には、上記の式は“アルデヒド”基を表わす。
用語“複素原子”は、ここで使用するときは、炭素又は水素以外の任意の元素を意味する。好ましい複素元素は硼素、窒素、酸素、燐、硫黄及びセレンである。
用語“ヘテロシクリル”又は“複素環式基”とは、３〜１０員の環構造、好ましくは３〜７員の環であって、その環構造が１〜４個の複素原子を含有するものをいう。複素環は多環であることができる。ヘテロシクリル基は、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノンのようなラクタム、スルタム、スルトンなどを包含する。複素環は、上で定義したような置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ3、−ＣＮなどにより置換できる。
ここで使用するとき、用語“ニトロ”とは−ＮＯ2を意味し、用語“ハロゲン”とは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを示し、用語“スルフヒドリル”とは−ＳＨを意味し、用語“ヒドロキシル”とは−ＯＨを意味し、用語“スルホニル”とは−ＳＯ2−を意味する。
“ホスホンアミダイト”は、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ9及びＲ10は上で定義した通りであり、Ｑ2はＯ、Ｓ又はＮを表わし、Ｒ48は低級アルキル又はアリールを表わす）
で表わすことができる。
“ホスホルアミダイト”は、次式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ9及びＲ10は上で定義した通りであり、Ｑ2はＯ、Ｓ又はＮを表わす）
で表わすことができる。
“ホスホリル”は、次式：
Figure 2005507860
 “ホスホリル”は、次式：
（ここで、Ｑ1はＳ又はＯを表わし、Ｒ46は水素、低級アルキル又はアリールを表わす）
で表わすことができる。例えば、アルキルを置換するのに使用するとき、ホスホリルアルキルのホスホリル基は、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｑ1はＳ又はＯを表わし、それぞれＲ46は水素、低級アルキル又はアリールを表わし、Ｑ2はＯ、Ｓ又はＮを表わす）
により表わすことができる。Ｑ1がＳであるときは、ホスホリル部分は“ホスホロチオエート”である。
用語“ポリシクリル”又は“多環式基”とは、２個以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び（又は）ヘテロシクリル）であって２個以上の炭素が２個の接する環（この環は“縮合環”である）に共通するものをいう。隣接しない炭素により結合される環は“架橋環”と称する。多環式基の環のそれぞれは、上で定義したような置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ3、−ＣＮなどにより置換できる。
用語“保護基”とは、ここで使用するときは、望まない化学的変換から潜在的に反応性の官能基を保護する一次的な置換基を意味する。このような保護基の例は、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、アルデヒド及びケトンのそれぞれアセタール及びケタールを包含する。保護基の化学の分野は論評されている（Ｔ．Ｗ．グリーン、Ｐ．Ｇ．Ｍ．ウッツ、「有機化学における保護基」第２版、ウイリー社、ニューヨーク、１９９１）。
“セレノアルキル”とは、置換セレノ基を結合させてなるアルキル基をいう。アルキル上に置換基を有し得る“セレノエーテル”の例は、−Ｓｅ−アルキル、−Ｓｅ−アルケニル、−Ｓｅ−アルキニル及び−Ｓｅ−（ＣＨ2）m−Ｒ8（ｍ及びＲ8は上で定義した通りである）の一つから選択される。
用語“置換”とは、ここで使用するときは、有機化合物の全ての許容できる置換基を含有させることを意図する。広い観点では、許容できる置換基は、有機化合物の非環式及び環状の、分岐状の及び分岐状でない、炭素環式及び複素環式の、芳香族及び非芳香族の置換基を包含する。置換基の例は、例えば、上で定義し通りのものを包含する。許容できる置換基は、適当な化合物について１個又はそれ以上で且つまた同一又は異なったものであることができる。本発明のためには、窒素のような複素原子は、水素置換基及び（又は）複素原子の原子価を安定化させるここに記載する有機化合物の任意の許容できる置換基を有することができる。本発明は、有機化合物のこの許容できる置換基により何ら限定されるものではない。
“置換”又は“置換された”は、そのような置換が置換された原子及び置換基の許された原子価と一致し並びにその置換が安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離などのような変換を自発的に受けない安定な化合物をもたらすという暗黙の条件を包含するものと理解される。
用語“スルファモイル”とは、斯界で認識されており、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ9及びＲ10は上で定義した通りである）
により表わされる部分を包含する。
用語“サルフェート”とは、斯界で認識されており、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ41は上で定義した通りである）
により表わされる部分を包含する。
用語“スルホンアミド”とは、斯界で認識されており、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ9及びＲ'11は上で定義した通りである）
により表わされる部分を包含する。
用語“スルホネート”とは、斯界で認識されており、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ41は電子対、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールである）
により表わされる部分を包含する。
用語“スルホキシド”又は“スルフィニル”とは、ここで使用するときは、一般式：
Figure 2005507860
 （ここで、Ｒ44は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アラルキル又はアリールよりなる群から選択される）
により表わされる部分をいう。
類似の置換を、アルケニル及びアルキニルに対して、例えば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニル又はアルキニルを生成するように行なうことができる。
それぞれの表現、例えば、アルキル、ｍ、ｎなどの定義は、ここで使用するときは、それが任意の構造式において１度よりも多く現われるときは、同じ構造式において他の箇所でのその定義と独立であることが意図される。
用語“トリフリル”、“トシル”、“メシル”及び“ノナフリル”は、斯界で認識されており、それぞれトリフルオルメタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニル及びナノフルオルブタンスルホニル基をいう。用語“トリフレート”、“トシレート”、“メシレート”及び“ナノフレート”は、斯界で認識されており、それぞれトリフルオルメタンスルホン酸エステル、ｐ−トルエンスルホン酸エステル、メタンスルホン酸エステル及びナノフルオルブタンスルホン酸エステル官能基並びにこのような基をそれぞれ含有する分子をいう。
略語Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ及びＭｓは、それぞれメチル、エチル、フェニル、トリフルオルメタンスルホニル、ナノフルオルブタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル及びメタンスルホニルを表わす。斯界で通常の知識を有する有機化学者により利用される略号のより包括的なリストがＪｏｕｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのそれぞれの巻の第１号に見られる。このリストは、「略号の標準リスト」の名称の表に典型的に存在する。該リストに含まれる略号並びに斯界で通常の知識を有する有機化学者により利用される略号の全てをここで引用することにより本明細書に含めるものとする。
本発明のある種の化合物は、特に幾何学的異性体又は立体異性体の形態で存在し得る。本発明は、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、これらのラセミ混合物、並びにこれらの混合物を含めて、本発明の範囲に入るものとして、上記の化合物の全てを意図するものである。更に、不斉炭素原子がアルキル基のような置換基に存在し得る。このような異性体の全て並びにそれらの混合物は本願発明に包含されるものとする。
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーを望むならば、それは、不斉合成により又はキラルな助剤による誘導化により製造することができ、この場合には生じたジアステレオマー混合物が分離され、助剤基が純粋な所望エナンチオマーを与えるように開裂される。別法として、分子がアミノのような塩基性の官能基又はカルボキシルのような酸性の官能基を含有するときは、適当な光学活性の酸又は塩基によりジアステレオマー塩を形成し、次いで形成されたジアステレオマーを斯界で知られた分別結晶化又はクロマトグラフィー手段によって分割し、続いて純粋なエナンチオマーを回収することができる。
上記した化合物の意図される均等物には、これに対応し且つ同じ一般的性質（例えば、ヘッジホッグシグナル伝達を阻止する能力）を有し、しかも化合物の有効性に悪影響を及ぼさない置換基の簡単な変更が１回以上なされている化合物が包含される。一般に、本発明の化合物は、容易に入手できる出発物質、反応剤及び周知の合成操作を使用して、例えば、以下に説明するような一般的反応式により又はその変更によって製造することができる。これらの反応においては、それ自体知られているが、ここでは述べない別法を使用することも可能である。
本発明のためには、化学元素は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、６７版、１９８６−８７」の表紙内の「元素の周期律表、ＣＡＳ版」に従って同定される。また、本発明のためには、用語“炭化水素”とは、少なくとも１個の水素と１個の炭素原子を有する全ての許容できる化合物を包含するものとする。広い観点では、許容できる炭化水素は、置換されていてよく又は置換されていない非環式の及び環式の、分岐した及び分岐していない、炭素環式の及び複素環式の、芳香族及び非芳香族の有機化合物を包含する。
ＩＩＩ．この発明の典型的化合物
下記に更に詳述するように、主題の方法は、例えば、ここに記載したような薬物スクリーニングアッセイにより容易に同定することのできる様々な異なる小分子を用いて実施することができるということが企図される。例えば、主題の方法で有用な化合物には、下記の一般式(Ｉ)により表されうる化合物が含まれる：
Figure 2005507860
 {式中、原子価と安定性が許せば、
Ｘ及びＺは、独立に、−Ｎ(Ｒ7)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−(Ｒ7)Ｎ−Ｎ(Ｒ7)−、−ＯＮ(Ｒ7)−又は直接結合、好ましくは−Ｎ(Ｒ7)−、−Ｏ−、−Ｓ−又は直接結合を表し；
Ｙは、−Ｃ(＝Ｏ)−、−Ｃ(＝Ｓ)−、−Ｃ(＝ＮＲ7)−、ＳＯ2又はＳＯ、好ましくは−Ｃ(＝Ｏ)−、ＳＯ2又は−Ｃ(＝Ｓ)−を表し；
Ａは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ7、好ましくはＯ又はＮＨ、最も好ましくはＮＨを表し；
Ｇは、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール環であって、それが結合している環(好ましくは、アリール又はヘテロアリール環)と縮合したものを表す}。
Ａｒは、置換された又はされてないアリール又はヘテロアリール環例えば置換された又はされてないフェニル環を表し；
Ｒ1は、Ｈ又は置換された若しくはされてないアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、又はシクロアルキル(多環式基を含む)を表し；
Ｒ2は、それが結合している環上の０〜４個の置換基例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル基(例えば、エステル、カルボキシル又はホルミル)、チオカルボニル(例えば、チオエステル、チオカルボキシレート又はチオホルメート)、ケトン、アルデヒド、アミノ、アシルアミノ、アミド、アミジノ、シアノ、ニトロ、アジド、スルホニル、スルホキシド、サルフェート、スルホネート、スルファミル、スルホンアミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、Ｊ−Ｒ8、Ｊ−ＯＨ、Ｊ−低級アルキル、Ｊ−低級アルケニル、Ｊ−Ｒ8、Ｊ−ＳＨ、Ｊ−ＮＨ2、上記の保護形態を表し、又は任意の２つのＲ2は、単環式若しくは多環式構造中に２回以上現れる場合には、一緒に、４〜８員のシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールを形成することができ；
Ｒ7は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−シクロアルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−ヘテロシクリル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−アリール(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−ヘテロアリール(例えば、置換された又はされてないもの)を表し；
Ｒ8は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、シクロアルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、ヘテロシクリル(例えば、置換された又はされてないもの)、アリール(例えば、置換された又はされてないもの)、ヘテロアリール(例えば、置換された又はされてないもの)を表し；そして
Ｊは、各出現につき独立に、ＣＫ2、ＮＫ、Ｏ及びＳより選択する０〜８(好ましくは、０〜４)ユニットを有する鎖を表す(ここに、Ｋは、各出現につき独立に、Ｈ又は低級アルキルを表す)。
ある具体例において、Ｚ及びＸの少なくとも１つは、直接結合でない。ある具体例において、Ｘ−Ｙ−Ｚは、アミド、尿素又はスルホンアミドを含む。ある具体例において、Ｘは、−Ｎ(Ｒ8)−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択され、好ましくはＮＨを表す。
ある具体例において、Ｒ1は適宜１〜５個の置換基で置換されたアリール又はヘテロアリール環を包含し、置換基は例えばニトロ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル、アシルアミノ(例えば、Ｒ8−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−)、アルコキシ、アルキルアミノ、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであって該アリール若しくはヘテロアリール環に縮合されたものである。
ある具体例において、Ｘ及びこのＡを含む環は、Ａｒ上で、メタ(即ち、１，３)の関係に配置される。
ある具体例において、Ｇは、フェニル又はピペリジン環を表す。
ある具体例において、Ｊは、存在しない。
ある具体例において、Ｒ2は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ(例えば、Ｒ8−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−)、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであってＧと縮合したもの、及び置換された又はされてない低級アルキルより選択する１〜４個の置換基を表す。
ある具体例において、主題の化合物は、図３２に描いた化合物から選択する。
ある具体例において、本発明において有用な化合物は、下記の一般式(ＩＩ)により表されうる：
Figure 2005507860
 {式中、原子価と安定性が許せば、
Ｘ及びＺは、独立に、−Ｎ(Ｒ7)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−(Ｒ7)Ｎ−Ｎ(Ｒ7)−、−ＯＮ(Ｒ7)−又は直接結合、好ましくは−Ｎ(Ｒ7)−、−Ｏ−、−Ｓ−又は直接結合を表し；
Ｙは、−Ｃ(＝Ｏ)−、−Ｃ(＝Ｓ)−、−Ｃ(＝ＮＲ7)−、ＳＯ2又はＳＯ、好ましくは−Ｃ(＝Ｏ)−、ＳＯ2又は−Ｃ(＝Ｓ)−を表し；
Ａは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ7、好ましくはＯ又はＮＨ、最も好ましくはＮＨを表し；
Ｇは、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール環であって、それが結合している環(好ましくは、アリール又はヘテロアリール環)と縮合したものを表す}。
Ｒ1は、Ｈ又は置換された若しくはされてないアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、又はシクロアルキル(多環式基を含む)を表し；
Ｒ2は、それが結合している環上の０〜４個の置換基例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル基(例えば、エステル、カルボキシル又はホルミル)、チオカルボニル(例えば、チオエステル、チオカルボキシレート又はチオホルメート)、ケトン、アルデヒド、アミノ、アシルアミノ、アミド、アミジノ、シアノ、ニトロ、アジド、スルホニル、スルホキシド、サルフェート、スルホネート、スルファミル、スルホンアミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、Ｊ−Ｒ8、Ｊ−ＯＨ、Ｊ−低級アルキル、Ｊ−低級アルケニル、Ｊ−Ｒ8、Ｊ−ＳＨ、Ｊ−ＮＨ2、上記の保護形態を表し、又は任意の２つのＲ2は、単環式若しくは多環式構造中に２回以上現れる場合には、一緒に、４〜８員のシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールを形成することができ；
Ｒ3は、それが結合している環上の０〜４個の置換基例えばハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、シアノ、ニトロ、置換された又はされてない低級アルキル及びアシル、好ましくはハロゲン、低級アルコキシ、又は置換された若しくはされてない低級アルキルを表し;
Ｒ7は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−シクロアルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−ヘテロシクリル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−アリール(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−ヘテロアリール(例えば、置換された又はされてないもの)を表し；
Ｒ8は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、シクロアルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、ヘテロシクリル(例えば、置換された又はされてないもの)、アリール(例えば、置換された又はされてないもの)、ヘテロアリール(例えば、置換された又はされてないもの)を表し；そして
Ｊは、各出現につき独立に、ＣＫ2、ＮＫ、Ｏ及びＳより選択する０〜８(好ましくは、０〜４)ユニットを有する鎖を表す(ここに、Ｋは、各出現につき独立に、Ｈ又は低級アルキルを表す)。
ある具体例において、Ｚ及びＸの少なくとも１つは、直接結合でない。ある具体例において、Ｘ−Ｙ−Ｚは、アミド、尿素又はスルホンアミドを含む。ある具体例において、Ｘは、−Ｎ(Ｒ8)−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択され、好ましくはＮＨを表す。
ある具体例において、Ｒ1は適宜１〜５個の置換基で置換されたアリール又はヘテロアリール環を包含し、置換基は例えばニトロ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル、アシルアミノ(例えば、Ｒ8−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−)、アルコキシ、アルキルアミノ、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであって該アリール若しくはヘテロアリール環に縮合されたものである。
ある具体例において、Ｇは、フェニル又はピペリジン環を表す。
ある具体例において、Ｊは、存在しない。
ある具体例において、Ｒ2は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ(例えば、Ｒ8−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−)、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであってＧと縮合したもの、及び置換された又はされてない低級アルキルより選択する１〜４個の置換基を表す。
ある具体例において、Ｒ3は、置換基例えば置換された若しくはされてないアルキル又はハロゲンを、Ｘの又はＡを含む環のパラ位に含む。
ある具体例において、主題の化合物は、図３２に描いた化合物から選択する。
下記に更に詳述するように、主題の方法は、例えば、ここに記載したような薬物スクリーニングアッセイにより容易に同定することのできる様々な異なる小分子を用いて実施することができるということが企図される。例えば、主題の方法で有用な化合物には、下記の一般式(ＩＩＩ)により表されうる化合物が含まれる：
Figure 2005507860
 {式中、原子価と安定性が許せば、
Ｘ及びＺは、独立に、−Ｎ(Ｒ7)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−(Ｒ7)Ｎ−Ｎ(Ｒ7)−、−ＯＮ(Ｒ7)−又は直接結合、好ましくは−Ｎ(Ｒ7)−、−Ｏ−、−Ｓ−又は直接結合を表し；
Ｙは、−Ｃ(＝Ｏ)−、−Ｃ(＝Ｓ)−、−Ｃ(＝ＮＲ7)−、ＳＯ2又はＳＯ、好ましくは−Ｃ(＝Ｏ)−、ＳＯ2又は−Ｃ(＝Ｓ)−を表し；
Ａは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ7、好ましくはＯ又はＮＨ、最も好ましくはＮＨを表し；
Ｇは、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール環であって、それが結合している環(好ましくは、アリール又はヘテロアリール環)と縮合したものを表し；
Ｑは、存在しないか又は、ＣＫ2、ＮＫ、Ｏ及びＳを表し(ここに、Ｋは、各出現につき独立にＨ又は低級アルキルを表す)；
Ａｒは、置換された又はされてないアリール又はヘテロアリール環例えば置換された又はされてないフェニル環を表し；
Ｒ1は、Ｈ又は置換された若しくはされてないアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、又はシクロアルキル(多環式基を含む)を表し；
Ｒ2は、それが結合している環上の０〜４個の置換基例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル基(例えば、エステル、カルボキシル又はホルミル)、チオカルボニル(例えば、チオエステル、チオカルボキシレート又はチオホルメート)、ケトン、アルデヒド、アミノ、アシルアミノ、アミド、アミジノ、シアノ、ニトロ、アジド、スルホニル、スルホキシド、サルフェート、スルホネート、スルファミル、スルホンアミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、Ｊ−Ｒ8、Ｊ−ＯＨ、Ｊ−低級アルキル、Ｊ−低級アルケニル、Ｊ−Ｒ8、Ｊ−ＳＨ、Ｊ−ＮＨ2、上記の保護形態を表し、又は任意の２つのＲ2は、単環式若しくは多環式構造中に２回以上現れる場合には、一緒に、４〜８員のシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールを形成することができ；
Ｒ7は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−シクロアルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−ヘテロシクリル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−アリール(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−ヘテロアリール(例えば、置換された又はされてないもの)を表し；
Ｒ8は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、シクロアルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、ヘテロシクリル(例えば、置換された又はされてないもの)、アリール(例えば、置換された又はされてないもの)、ヘテロアリール(例えば、置換された又はされてないもの)を表し；そして
Ｊは、各出現につき独立に、ＣＫ2、ＮＫ、Ｏ及びＳより選択する０〜８(好ましくは、０〜４)ユニットを有する鎖を表す。
ある具体例において、Ｚ及びＸの少なくとも１つは、直接結合でない。ある具体例において、Ｘ−Ｙ−Ｚは、アミド、尿素又はスルホンアミドを含む。ある具体例において、Ｘは、−Ｎ(Ｒ8)−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択され、好ましくはＮＨを表す。
ある具体例において、Ｒ1は、適宜１〜５個の置換基で置換されたアリール又はヘテロアリール環を包含し、置換基は例えばニトロ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル、アシルアミノ(例えば、Ｒ8−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−)、アルコキシ、アルキルアミノ、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであって該アリール若しくはヘテロアリール環に縮合されたものである。
ある具体例において、Ｘ及びこのＡを含む環は、Ａｒ上で、メタ(即ち、１，３)の関係に配置される。
ある具体例において、Ｇは、フェニル又はピペリジン環を表す。
ある具体例において、Ｊは、存在しない。
ある具体例において、Ｒ2は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ(例えば、Ｒ8−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−)、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであってＧと縮合したもの、及び置換された又はされてない低級アルキルより選択する１〜４個の置換基を表す。
ある具体例において、主題の化合物は、図３２に描いた化合物から選択する。
ある具体例において、本発明において有用な化合物は、下記の一般式(ＩＶ)により表されうる：
Figure 2005507860
 {式中、原子価と安定性が許せば、
Ｘ及びＺは、独立に、−Ｎ(Ｒ7)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−(Ｒ7)Ｎ−Ｎ(Ｒ7)−、−ＯＮ(Ｒ7)−又は直接結合、好ましくは−Ｎ(Ｒ7)−、−Ｏ−、−Ｓ−又は直接結合を表し；
Ｙは、−Ｃ(＝Ｏ)−、−Ｃ(＝Ｓ)−、−Ｃ(＝ＮＲ7)−、ＳＯ2又はＳＯ、好ましくは−Ｃ(＝Ｏ)−、ＳＯ2又は−Ｃ(＝Ｓ)−を表し；
Ａは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ7、好ましくはＯ又はＮＨ、最も好ましくはＮＨを表し；
Ｇは、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール環であって、それが結合している環(好ましくは、アリール又はヘテロアリール環)と縮合したものを表す}。
Ｑは、存在しないか又は、ＣＫ2、ＮＫ、Ｏ及びＳを表し(ここに、Ｋは、各出現につき独立にＨ又は低級アルキルを表す)；
Ｒ1は、Ｈ又は置換された若しくはされてないアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、又はシクロアルキル(多環式基を含む)を表し；
Ｒ2は、それが結合している環上の０〜４個の置換基例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル基(例えば、エステル、カルボキシル又はホルミル)、チオカルボニル(例えば、チオエステル、チオカルボキシレート又はチオホルメート)、ケトン、アルデヒド、アミノ、アシルアミノ、アミド、アミジノ、シアノ、ニトロ、アジド、スルホニル、スルホキシド、サルフェート、スルホネート、スルファミル、スルホンアミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、Ｊ−Ｒ8、Ｊ−ＯＨ、Ｊ−低級アルキル、Ｊ−低級アルケニル、Ｊ−Ｒ8、Ｊ−ＳＨ、Ｊ−ＮＨ2、上記の保護形態を表し、又は任意の２つのＲ2は、単環式若しくは多環式構造中に２回以上現れる場合には、一緒に、４〜８員のシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールを形成することができ；
Ｒ3は、それが結合している環上の０〜４個の置換基例えばハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、シアノ、ニトロ、置換された又はされてない低級アルキル及びアシル、好ましくはハロゲン、低級アルコキシ、又は置換された若しくはされてない低級アルキルを表し;
Ｒ7は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−シクロアルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−ヘテロシクリル(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−アリール(例えば、置換された又はされてないもの)、Ｊ−ヘテロアリール(例えば、置換された又はされてないもの)を表し；
Ｒ8は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、シクロアルキル(例えば、置換された又はされてないもの)、ヘテロシクリル(例えば、置換された又はされてないもの)、アリール(例えば、置換された又はされてないもの)、ヘテロアリール(例えば、置換された又はされてないもの)を表し；そして
Ｊは、各出現につき独立に、ＣＫ2、ＮＫ、Ｏ及びＳより選択する０〜８(好ましくは、０〜４)ユニットを有する鎖を表す。
ある具体例において、Ｚ及びＸの少なくとも１つは、直接結合でない。ある具体例において、Ｘ−Ｙ−Ｚは、アミド、尿素又はスルホンアミドを含む。ある具体例において、Ｘは、−Ｎ(Ｒ8)−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択され、好ましくはＮＨを表す。
ある具体例において、Ｒ1は、適宜１〜５個の置換基で置換されたアリール又はヘテロアリール環を包含し、置換基は例えばニトロ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル、アシルアミノ(例えば、Ｒ8−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−)、アルコキシ、アルキルアミノ、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであって該アリール若しくはヘテロアリール環に縮合されたものである。
ある具体例において、Ｇは、フェニル又はピペリジン環を表す。
ある具体例において、Ｊは、存在しない。
ある具体例において、Ｒ2は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ(例えば、Ｒ8−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−)、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであってＧと縮合したもの、及び置換された又はされてない低級アルキルより選択する１〜４個の置換基を表す。
ある具体例において、Ｒ3は、置換基例えば置換された若しくはされてないアルキル又はハロゲンを、Ｘの又はＡを含む環のパラ位に含む。
ある具体例において、主題の化合物は、図３２に描いた化合物から選択する。
ある具体例においては、主題のアンタゴニストを、それらのヘッジホッグ経路に対する選択性に基づいて選択することができる。この選択性は、他の経路に対してヘッジホッグ経路を選択するものであってよく、特定のヘッジホッグ経路(例えば、ｐｔｃ−１、ｐｔｃ−２等)の間の選択性であってよい。
ある好適具体例においては、主題のインヒビターは、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を、１ｍＭ以下の、一層好ましくは１μＭ以下の、尚一層好ましくは１ｎＭ以下のＥＤ50で阻害する。同様に、ある好適具体例において、主題のインヒビターは、ヘッジホッグ経路の活性を、１０ｎＭより小さい好ましくは１ｎＭより小さい尚一層好ましくは０．１ｎＭより小さいＫiで阻害する。
特別の具体例において、この小分子を、それが一つのパッチトイソ型に対して隣のものより一層選択的であるので、例えば、一つのパッチト経路(ｐｔｃ−１、ｐｔｃ−２)に対して、他のものの１０倍、一層好ましくは少なくとも１００倍又は１０００倍も選択的であるので選択する。
ある具体例においては、ＰＫＡ以外のプロテインキナーゼ例えばＰＫＣより一層選択的にヘッジホッグ活性と拮抗するヘッジホッグ経路のアンタゴニストである化合物を選択し、例えば、その化合物は、ヘッジホッグ経路の活性を、他のプロテインキナーゼの活性を調節する場合より少なくとも一桁強力に、好ましくは少なくとも２桁強力に、尚一層好ましくは少なくとも３桁強力に調節する。従って、例えば、ヘッジホッグ経路の好適なインヒビターは、ヘッジホッグ活性を、ＰＫＣの阻害のＫiより少なくとも一桁低い、好ましくは少なくとも２桁低い、尚一層好ましくは少なくとも３桁低いＫiで阻害することができる。ある具体例において、ＰＫＡ阻害のＫiは、１０ｎＭ未満であり、好ましくは１ｎＭ未満であり、尚一層好ましくは０．１ｎＭ未満である。
ＩＶ．方法及び組成物の典型的適用
本発明の他の特徴は、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進を有する細胞の分化状態、生存及び／又は増殖を、主題の方法に従ってヘッジホッグアンタゴニストに細胞を接触させて調節する方法に関する。
例えば脊椎動物において、分化した組織が秩序だって空間的に配置されることに、ヘッジホッグ、ｐｔｃ及びスムースンドが明らか広く関与しているという発見に照らし合わせると、主題の方法はイン・ビトロ及びイン・ビボ両方において、異なる脊椎動物組織系列の作成及び／又は維持処置の一部として用いることができる。所与の組織の増殖及び分化に関して、誘導性の有無に関わらず、適当なものであれば、ヘッジホッグアンタゴニストは上記した調製物のいずれでもありうる。
例えば、本発明の方法は、遺伝上又は生化学上のいずれかの理由から、細胞がｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の表現型を有する場合、細胞培養技術に適用することができる。イン・ビトロのニューロン培養系が、ニューロン発達の研究及び神経向性因子［神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体向性因子（ＣＮＴＦ）及び脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）など］の同定において基本的で不可欠なものだということがわかっている。本発明の方法の使用法の一つとして、神経幹細胞の培養において用いるもの（例えば新しいニューロン及びグリアの作成を目的に、そのような培養において用いる）が挙げられる。主題の方法のそのような態様においては、培養細胞を本発明のヘッジホッグアンタゴニストと接触させて、培養中の神経幹細胞の増殖率及び／又は分化の速度を変化させるか、ある種の末期分化神経細胞の培養の完全性を保持する。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、例えば感覚ニューロン又は運動ニューロンを培養することができる。そのようなニューロン培養を、簡易なアッセイ系並びに治療用の移植可能細胞源として用いることができる。
本発明によると、大量の非腫瘍形成性神経幹細胞をイン・ビトロで永久保存することができ、本発明のヘッジホッグアンタゴニストと接触させることによってそれらの増殖率及び／又は分化率に影響を及ぼすことができる。一般に、動物から神経幹細胞を単離する段階；これらの細胞を、好ましくは成長因子の存在下に、イン・ビトロ又はイン・ビボで永久保存する段階；及びこれらの細胞をヘッジホッグアンタゴニストに接触させることによって細胞の特定の神経表現型（例えばニューロン及びグリア）への分化を調節する段階を包含する方法が提供される。
幹細胞は、分化が必要とされるまで抑制した状態に保持される、持続性抑制の影響下にあると考えられる。しかし、最終的な分化にいたる（従って非分裂性の）ニューロンとは違って、これらの細胞を増殖させる方法が近年開発されている。細胞は無限に産生され、神経変性疾患を有する異種及び自己宿主内への移植に非常に好適である。
「幹細胞」とは、制限無く分裂することができ、特殊な条件下で、最終的にニューロン及びグリアなどに分化する娘細胞を産生することができる、少分化能（oligopotent）又は多分化能（multipotent）を有する細胞を意味する。これらの細胞を、異種又は自己宿主への移植に用いることができる。「異種」とは、幹細胞が由来する動物以外の宿主であることを意味する。「自己」とは、細胞が由来するのと同一の宿主であることを意味する。
細胞は、神経組織を有するあらゆる動物において、胎芽、生後、幼若、又は成人の神経組織から得ることができる。より具体的には、あらゆる魚類、は虫類、鳥類、両生類又はほ乳類などが挙げられる。最も好ましいドナーはほ乳類、特にマウス及びヒトである。
異種ドナー動物を用いる場合、動物を安楽死させ、脳及び対象とする特異な領域を無菌の処理工程によって取り出す。特に対象となる脳の領域としては、宿主の脳の変質した領域の機能を回復するのに用いられる幹細胞が得られる領域であれば、どのような領域でも含まれる。そのような領域の例としては、大脳皮質、小脳、中脳、脳幹、脊髄及び脳室組織などの中枢神経系（ＣＮＳ）の領域、頸動脈小体及び副腎髄質などの末梢神経系（ＰＮＳ）の領域が挙げられる。特に、大脳基底核における領域、好ましくは尾状核及び被殻からなる線条、又は淡蒼球、視床下核などの様々な細胞群、アルツハイマー病患者中で変質がみられる核基底、又はパーキンソン病患者で変質がみられる黒質緻密部が挙げられる。
ヒト異種神経幹細胞は、人工妊娠中絶から得た胎児組織に由来するものでもよいし、生後、幼若又は成人の臓器ドナーから得たものであってもよい。自己神経組織はバイオプシーによって得ることもできるし、神経外科、具体的には癲癇手術、さらに具体的には側頭葉切除術及び海馬切除術で、神経組織を除去した患者から得ることもできる。
ドナー組織の連結細胞外基質から個々の細胞を解離することによって、細胞を得ることができる。解離は、公知の方法、例えばトリプシン、コラゲナーゼなどの酵素による処理によって、（先端の尖っていない器具を用いる）物理的な解離方法によって、又はメスを用いる微塵切りによって実施する。これにより組織から得た特異な細胞型の増殖が可能になる。胎児細胞の解離は、組織培養基内で行うことができるが、幼若及び成人細胞の解離に好ましい培養基は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）である。一般的なａＣＳＦは、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ3及び１０ｍＭ Ｄ−グルコースを含んでいる。ＭｇＣｌ2を３．２ｍＭの濃度で、ＣａＣｌ２を０．１ｍＭの濃度で含むことを除いては、低Ｃａ2+ａＣＳＦは同じ成分を含んでいる。
解離した細胞は、細胞成長を支持する公知のあらゆる培養基で培養することができる。培養基の例としては、細胞の代謝に必要な追加成分（グルタミン及び他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルなど）及び有用な蛋白質（トランスフェリンなど）を含む、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２などが挙げられる。培養基は、酵母菌、バクテリア及び菌類などによる汚染を防ぐ抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなど）を更に含んでいてもよい。ある場合には、培養基はウシ、ウマ、ニワトリなどに由来する血清を含んでいてもよい。特に好ましい細胞培養基は、ＤＭＥＭ及びＦ−１２の混合物である。
培養条件は、生理条件に近いものでなければならない。培養基のｐＨは、生理的ｐＨに近いもの、好ましくはｐＨ６−８、より好ましくはｐＨ７、更により好ましくはｐＨ７．４に近いものでなければならない。細胞は生理的温度に近いもの、好ましくは３０−４０℃、より好ましくは３２−３８℃、更により好ましくは３５−３７℃で培養されなければならない。
細胞は懸濁液中で又は固定基質上で育成することができるが、幹細胞の増殖は、多数の細胞が「凝集塊」を形成するように好ましくは懸濁液中で行われる（例えばReynolds他（１９９２）Science２５５：１０７０−１７０９；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２７５、ＷＯ９４／０９１１９、ＷＯ９４／１０２９２、及びＷＯ９４／１６７１８参照）。増殖中（又は分裂中）の懸濁細胞の場合、フラスコを十分に振盪し、凝集塊をフラスコ底角に沈殿させる。凝集塊を５０ｍｌ遠心分離管に移し、低速で遠心分離する。培養基を吸引して、成長因子を含む少量の培養基に細胞を再懸濁する。細胞を機械的に解離して、培養基の別々のアリコートに再懸濁する。
培養基中の細胞懸濁液に、幹細胞の増殖を可能にする成長因子を補充し、細胞を支持することのできる容器に入れるが、上記したように、好ましくは培養フラスコ又はローラーボトルに入れる。細胞は一般に３−４日間、３７℃の保温器内に入れることで増殖する。細胞を解離し、成長因子を含む培養基中に再懸濁することによっていつでも増殖を再開することができる。
基質の非存在下では、細胞はフラスコの床を離れて懸濁液中で増殖を続け、未分化細胞の中空凝集塊を形成する。イン・ビトロにて約３−１０日後から、増殖群（凝集塊）を２−７日ごと、好ましくは２−４日ごとに、緩やかな遠心分離によって供給し、成長因子を含む培養基に再懸濁する。
イン・ビトロで６−７日後に、凝集塊中の個々の細胞を、先端の尖っていない器具で物理的に解離して（より具体的にはピペットで凝集塊を砕いて）分離する。解離した凝集塊からの個々の細胞を、成長因子を含む培養基に再懸濁し、ヘッジホッグアンタゴニストの存在下で細胞を培養する（又は再懸濁する）ことによって、細胞の分化を培養中で制御する。
主題のヘッジホッグアンタゴニストの他の使用法をさらに例証するものとして、脳内移植が中枢神経系治療の更なる方法として用いられるようになったことを挙げておく。例えば、損傷した脳組織を修復する一つの方法として、胎児又は新生児の細胞を成人の脳に移植する方法が挙げられる（Dunnett他（１９８７）J Exp Biol１２３：２６５−２８９；及びFreund他（１９８５）J Neurosci５：６０３−６１６）。様々な脳領域から取った胎児ニューロンを、成人の脳にうまく組み込むことができ、その結果、行動上の欠陥を緩和することができる。例えば、脳幹神経節に対するドーパミン作用性突起物における損傷によって起こる運動障害は、胎芽のドーパミン作用性ニューロンを移植することによって避けることができる。新皮質の損傷によって起こる複雑認識機能の障害は、胎芽の皮質細胞を移植することによって部分的に回復させることができる。主題の方法を用いて培養の成長状態を調節することができ、胎児組織が用いられる場合には、特に神経幹細胞を用いて、幹細胞の分化率を調節することができる。
本発明で用いることのできる幹細胞は、公知のものである。例えば、幾つかの神経冠細胞が同定されているが、そのうちの幾つかは多分化能を有しており拘束されていない（uncommitted）神経冠細胞を代表し、その他は一種類のみの細胞を産生する拘束された（comiitted）幹細胞を代表する。本発明の方法において、そのような幹細胞の培養に用いられるヘッジホッグアンタゴニストの役割としては、拘束されていない幹細胞の分化の調節；又は拘束された幹細胞の、神経細胞になる最終的分化へ向かう発達の更なる制限の調節が挙げられる。例えば、本発明の方法をイン・ビトロで用いて、神経冠細胞のグリア細胞、シュワン細胞、クロム親和性細胞、コリン作動性交感ニューロン又は副交感ニューロン、並びにペプチド作動性及びセロトニン作動性ニューロンへの分化を調節することができる。ヘッジホッグアンタゴニストは単独で用いることもできるし、神経幹細胞の特定の分化をさらに促進する他の神経向性因子と組み合わせて用いることもできる。
本発明の主題のヘッジホッグアンタゴニストの存在下で培養した細胞の移植に加えて、本発明のさらに他の特徴は、ヘッジホッグアンタゴニストを適用して、中枢神経系と末梢神経系両方のニューロン及び他のニューロン細胞の成長状態を調節することに関する。ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが、神経系発達中と、おそらくは成人期にニューロンの分化を調節する能力を有する。このことは、主題のヘッジホッグアンタゴニストがある場合において、正常細胞の保持、機能遂行及び老化；化学的又は機械的に損傷を受けた細胞の修復及び再生；及びある種の病理学上の条件下での変質の治療に関して、成人ニューロンを制御するであろうことを示している。これに鑑みて、本発明は特に主題の方法を下記に由来する神経系状態の治療プロトコル（予防及び／又は病状の低減）に適用することを企図する。（ｉ）外傷、化学的損傷、血管損傷及び欠陥（例えば脳卒中による虚血）、感染性／炎症性及び腫瘍性損傷などの神経系の急性、亜急性、又は慢性の損傷；（ｉｉ）アルツハイマー病などの神経系の老化；（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性などの慢性神経変性疾患；及び（ｉｖ）多発性硬化症などの、神経系の又は神経系に影響を与える慢性免疫疾患。
適正に行えば、主題の方法を用いて中枢及び末梢神経損傷を修復する、人工神経を作成することができる。特に、潰れた又は切断された軸索に、人工器具を用いて管を取り付ける場合には、人工器具にヘッジホッグアンタゴニストを添加して、成長速度及び樹状突起の再生を調節することができる。神経導入経路の例は、米国特許第５，０９２，８７１号及び第４，９５５，８９２号に記載がある。
他の態様においては、主題の方法を（例えば中枢神経系において起こる）悪性又は過形成性形質転換の治療に用いることができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて、そのような形質転換細胞を分裂終了又は自死状態にすることができる。従って本発明の方法は、例えば悪性神経膠腫、髄膜腫、髄芽細胞腫、神経外胚葉腫及び脳室上皮腫の治療の一部に用いることができる。
好ましい態様においては、主題の方法を、悪性髄芽細胞腫及び他の一次ＣＮＳ悪性神経外胚葉腫の治療養生法の一部として用いることができる。
ある態様においては、主題の方法を髄芽細胞腫の治療プログラムの一部として用いることができる。一次脳腫瘍である髄芽細胞腫は、子供にみられる最も一般的な脳腫瘍である。髄芽細胞腫は後窩に発生する初期神経外胚葉腫（ＰＮＥＴ）である。これは小児脳腫瘍の原因の約２５％を占めている（Miller）。髄芽細胞腫は組織構造的には、一般にロゼット状に配置された小型の丸い細胞腫であるが、いくつかは星状細胞、上衣細胞又はニューロンに分化する（Rorke；Kleihues）。ＰＮＥＴは松果体（松果体芽細胞腫）及び大脳を含む脳の他の領域に起こりうる。テント上方領域に起こるこれらは、一般にＰＦ同等物より病状が重い。
髄芽細胞腫／ＰＮＥＴは切除術の後ＣＮＳのどこにでも再発し、骨にまで移転することが知られる。従って前処理評価において、「脱落（dropped）移転」の可能性を除外するための脊髄の検査が行われる。このため一般に、脊髄造影法の代わりにガドリニウム促進ＭＲＩが行われており、術後の日常操作としてＣＳＦ細胞診断が得られる。
他の態様においては、主題の方法が脳室上皮腫の治療プログラムの一部として用いられる。脳室上皮腫は、小児脳腫瘍の原因の約１０％を占めている。概して、脳室上皮腫は脳室の上衣ライニングに起こる腫瘍であり、顕微鏡的な大きさのロゼット、カナル及び血管周囲のロゼットを形成する。脳室上皮腫について報告された５１人の小児のＣＨＯＰにおいて、３／４が組織構造上は良性であった。約２／３が第４の脳室に由来した。１／３がテント上方領域に存在した。ＳＥＥＲのデータ及びＣＨＯＰのデータが示すように、０歳から４歳の間にそれらがピークに達した。中央値の年齢は５歳であった。この疾病を有する小児の多くが乳児なので、多様な治療法が必要とされる。
本発明のさらに他の特徴は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及び／又はスムースンドが、上記した神経分化に加えて、他の脊椎動物有機物質経路に関与する形態発生シグナルに関与し、内胚葉のパターン形成、中胚葉及び内胚葉の分化過程に明らかに役割を果たしているという観察に関する。従って本発明は、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する組成物を、非神経組織の産生及び保持に関わる細胞培養及び治療法の両方に用いることを企図する。
一つの態様において、本発明はｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが、原腸に由来する消化管、肝臓、肺及び他の臓器の形成に関与する幹細胞の発達の制御に明らかに関与しているという発見を利用するものである。Ｓｈｈは内胚葉から中胚葉への誘導シグナルとして提供されるが、これは腸管形態形成に非常に重要である。従って、例えば本発明の方法のヘッジホッグアンタゴニストを用いて、正常な肝臓の複数の代謝機能を有する人工肝臓の発達及び維持を調節することができる。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、消化管幹細胞の増殖及び分化を調節し、肝細胞培養を形成して、細胞外基質を稠密にさせるのに用いるかあるいは生体適合性重合体に封入して移植可能及び体外人工肝臓を形成することができる。
他の態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストの治療組成物を、人工肝臓、胎芽肝臓構造などの移植とともに用いて、腹腔内移植、血管新生及び生体内分化の取り込み並びに移植された肝臓組織の維持を調節することができる。
さらに他の態様においては、主題の方法を治療に用いて、物理的、化学的又は病理学的損傷を受けた後の上記のような臓器を調節することができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する治療用組成物を、肝切除術に次ぐ肝臓修復に用いることができる。
胎芽の腸管からの膵臓及び小腸の形成は、腸管の内胚葉細胞と中胚葉細胞との間の細胞間シグナリングに依存している。特に、腸の中胚葉の平滑筋への分化は、隣接する内胚葉細胞からのシグナルに依存することが示唆されている。胎芽の後腸における内胚葉に由来するシグナル媒介物の候補の一つとして、Sonicヘッジホッグがある（例えばApelqvist他（１９９７）Curr Biol７：８０１−４参照）。Ｓｈｈ遺伝子は胎芽の腸管内胚葉に渡って発現されるが、これには例外があって、膵臓芽内胚葉では、膵臓発達初期の必須レギュレーターであるホメオドメインタンパク質Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１ （インシュリンプロモーター因子１／膵臓及び十二指腸ホメオボックス１）が高レベルで発現される。Apelqvist他（上述）では、胎芽の腸管におけるＳｈｈの差異発現が、取り巻く中胚葉から小腸及び膵臓といった特異な中胚葉誘導体への分化を制御するかどうかを研究している。該文献ではこれを調べるために、Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターを用いて、発達中の膵臓上皮におけるＳｈｈを選択的に発現している。Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１−Ｓｈｈトランスジェニックマウスにおいて、膵臓中胚葉は膵臓間充織及び脾臓へ分化せず、平滑筋及び腸管カハル細胞（腸管に特徴的な細胞）に発達した。さらに、Ｓｈｈに接触させた膵臓外植は、同様の腸管分化を経た。これらの結果は、内胚葉に由来するＳｈｈの差異発現が、腸管の異なる領域における隣接する中胚葉の分化を制御することを意味している。
従って本発明の文脈では、主題のヘッジホッグアンタゴニストを用いて、イン・ビボ及びイン・ビトロの両方において膵臓組織の増殖及び／又は分化を制御又は調節することを企図する。
本発明の阻害剤が治療効果をもたらす、様々な病理学上の細胞増殖及び分化条件がある。例えば異常なインシュリン発現の修正、又は分化の調節などが挙げられる。しかしより一般的には、本発明は、膵臓細胞を主題の阻害剤に接触させることによって、細胞の分化状態を誘導及び／又は維持し、生存を強化し及び／又は増殖へ影響を与える方法に関する。例えば、膵臓組織の秩序だった空間的配置形成にｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが明らかに関与していることから、イン・ビトロ及びイン・ビボの両方でそのような組織を産生及び／又は維持する方法の一部として主題の方法を用いることが本発明によって企図される。例えば、ヘッジホッグの機能の調節は、細胞及びおそらくは非膵臓組織の産生及び維持に関与する、細胞培養及び治療法の両方に（例えば原腸に由来する消化管、脾臓、肺、泌尿生殖器(例えば、膀胱)及び他の臓器からの組織の発達及び維持の制御に）用いることができる。
例証的な態様においては、本発明の方法を、特に膵臓細胞の異常な増殖によって特徴づけられる、膵臓組織の過形成性及び腫瘍性疾患の治療に用いることができる。例えば膵臓癌は、膵臓のインシュリン分泌量に調節をきたす、膵臓細胞の異常な増殖によって特徴付けられる。例えば膵癌などのある種の膵臓過形成は、β細胞の機能不全又は島細胞重量の減少によって、低インシュリン血症を引き起こす。病状の進行において異常なｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドシグナリングが示される程度まで、主題のインヒビターを用いて抗腫瘍治療の後の組織再生を促進することができる。
その上さらに、異なる点でヘッジホッグシグナリング特性を操作することは、イン・ビボ及びイン・ビトロの両方における膵臓組織復元／再生技術の一部として有用である。一つの態様においては本発明は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが膵臓組織の発達の調節に関与していることを利用する。一般に、主題の方法を治療的に用いて、物理的、化学的又は病理的傷害の後に膵臓を調節することができる。さらに他の態様において、主題の方法を細胞培養技術に適用することができ、特に人工膵臓組織の初期形成の促進に用いることができる。例えばヘッジホッグ活性を変化させることによる膵臓組織の増殖及び分化の操作は、培養組織の特徴をより注意深く制御する手段を提供する。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、例えば下記に記載のある封入装置に用いることのできる、β島細胞を必要とする人工器官の産生を増加させることができる（Aebischer他、米国特許第４，８９２，５３８号、Aebischer他、米国特許第５，１０６，６２７号、Lim、米国特許第４，３９１，９０９号、及びSefton、米国特許第４，３５３，８８８号）。膵島の初期幹細胞は多分化能を有し、最初に出現したときから、全ての島細胞特異的遺伝子を共活性化するのは明らかである。分化が進むにつれて、島細胞特異的ホルモン（例えばインシュリン）の発現は、成熟島細胞に特徴的な発現パターンに制限される。しかし、成熟β細胞における胎芽の特徴の再発が観察できるようになると、成熟島細胞の表現型は培養中では安定しない。主題のヘッジホッグアンタゴニストを利用することによって、細胞の分化経路又は増殖率を調節することができる。
さらに、膵臓組織の分化状態の操作を、人工膵臓の移植と組み合わせて利用して、移植、血管新生及び生体内分化、並びに移植された組織の維持を促進することができる。例えば、組織分化に影響するヘッジホッグ機能の操作を、移植片の生存能力を維持する手段として利用することができる。
Bellusci他（１９９７）Development１２４：５３には、Sonicヘッジホッグが肺間充織細胞増殖をイン・ビボで調節することが報告されている。従って、本発明の方法を用いて、（例えば肺気腫及び呼吸障害症候群の治療における）肺組織の再生を調節することができる。
Fujita他（１９９７）Biochein Biophys Res Commun２３８：６５８には、Sonicヘッジホッグがヒト肺扁平上皮癌及び腺癌において発現することが報告されている。Sonicヘッジホッグの発現は、ヒト肺扁平上皮癌組織において検出されたが、同じ患者の正常な肺組織においては検出されなかった。上記文献は、SonicヘッジホッグがＢｒｄＵの癌細胞への取り込みを刺激し、細胞成長を刺激する一方で、抗Ｓｈｈ−Ｎが細胞成長を阻害することも報告している。これらの結果は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及び／又はスムースンドが、そのように形質転換した肺組織の細胞成長に関与していることを示唆し、従って主題の方法を、肺癌及び腺癌、並びに肺上皮に関する増殖疾患の治療の一部として用いることができることを示している。
これらの腫瘍にヘッジホッグ経路が関与していること、又は発達の際にこれらの組織中にヘッジホッグ及びその受容体の発現が検出されることに鑑みて、主題の化合物による処置によって、他の多くの腫瘍に影響を与えうる。そのような腫瘍の例としては、ゴーリン症候群に関する腫瘍（例えば基底細胞癌、髄芽細胞腫、髄膜腫など）、ｐｃｔノックアウトマウスにみられる腫瘍（例えば血管腫、横紋筋肉腫など）、ｇｌｉ−１増幅の結果起こる腫瘍（例えば神経グリア芽細胞腫、肉腫など）、ＴＲＣ８、ｐｔｃ相同体に連結した腫瘍（例えば腎臓癌、甲状腺癌など）、Ｅｘｔ−１関連腫瘍（例えば骨癌など）、Ｓｈｈ誘導腫瘍（例えば肺癌、軟骨肉腫など）及び他の腫瘍（例えば乳癌、尿生殖器（例えば腎臓、膀胱、尿管、前立腺など）癌、副腎癌、胃腸（例えば胃、腸など）癌など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の更に他の態様において、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する組成物を用いて、例えば骨格形成性幹細胞から骨格組織をイン・ビトロで産生すること、並びにイン・ビボで骨格組織欠陥を治療することができる。本発明は特に、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて軟骨形成軟骨形成及び／又は骨形成の速度を調節することを企図する。ここでいう「骨格組織欠陥」とは、欠陥がどのような由来（例えば外科手術的介入、腫瘍の除去、潰瘍形成、移植、骨折又は他の外傷あるいは変性状態）であれ、骨又は結合組織の回復が望まれる場所における、骨又は他の骨格結合組織の欠陥のことをいう。
例えば本発明の方法を、結合組織の軟骨機能の回復を目的とする養生法の一部として用いることができる。そのような方法は、例えば変性摩耗（関節炎など）、並びに組織の外傷（摩耗した半月板組織の置き換え、半月板切除、靱帯の摩耗による関節の緩み、関節の悪性腫瘍、骨折などの組織の外傷により生じる、又は遺伝病により生じうるもの）などの他の機械的傷害の結果起こる、軟骨組織における欠陥又は損傷の回復において有用である。本発明の修復方法は、成形外科、再建術及び歯周手術などの、軟骨基質の再構成に有用である。本発明の方法は、半月板、靱帯又は軟骨の手術による修復に続く、前修復段階の改善に適用することができる。その上更に、本発明の方法は、外傷を受けた後の早い時期に適用された場合には、変性疾患の発症又は病状再燃を防ぎうる。
本発明の一つの態様において、主題の方法は、治療上十分な量のヘッジホッグアンタゴニスト(特に、インディアンヘッジホッグシグナル変換に対して選択的なアンタゴニスト)によって疾患のある結合組織を処置し、組織の有する軟骨細胞の分化及び／又は増殖速度を操作することによって、結合組織における軟骨修復応答を調節することを包含する。関節軟骨、関節間軟骨（半月板）、肋軟骨（真肋と胸骨を連結する）、靱帯及び腱などの結合組織は、主題の方法を用いる再建及び／又は再生治療における処置に特に敏感に反応する。ここで言う「再生治療」には、組織の欠陥が明らかに現れる点まで進行した変性状態の治療、変性が初期段階又は切迫した状態である組織の予防治療が含まれる。
例証的な態様において、主題の方法を、膝、足首、肘、臀部、手首、手又は足の指関節、又は上顎関節などの可動関節の軟骨の治療における治療的介入の一部として用いることができる。治療は関節の半月板、関節軟骨、又はその両方を対象とすることができる。更に例証すると、主題の方法は外傷（例えばスポーツによる傷害又は過度の摩耗）又は変性関節炎の結果起こりうる膝の変性疾患の治療に用いることができる。主題のアンタゴニストは、例えば関節鏡検査針を用いて、関節に注射して投与してもよい。ある場合には投与される薬剤は、薬剤と治療組織との接触を延長させ定常的なものとするために、ヒドロゲル又は上記した他の緩効性賦形剤の形状をとることができる。
本発明は、軟骨移植及び人工器官治療の分野において主題の方法を使用することを更に企図する。しかし、例えば軟骨と繊維軟骨の特性は組織によって（例えば関節、半月板軟骨、靱帯及び腱の間で；同じ靱帯又は腱の両端の間で；そして同じ組織の表面部と深淵部との間で）異なるので、問題が生じる。これらの組織の空間的配置は、機械的特性上の緩やかな変化を反映しうるので、これらの条件下にある未分化の移植組織が、適当に応答する能力を有していない場合には、機能不全が起こる。例えば、半月板軟骨が前十字靱帯の修復に用いられる場合、組織に化生が起こり純粋な繊維組織になる。軟骨形成の速度を調節することによって、新しい環境に移植細胞を適合させ、組織の初期発達段階の肥大軟骨細胞に類似させるように制御して、主題の方法を特にこの問題を対処するように用いることができる。
同様に、主題の方法を適用して、人工軟骨の作成及び移植の両方を促進することができる。改善された治療法が必要とされているため、コラーゲン−グリコサミノゲン鋳型［Stone他（１９９０）Clin Orthop Relat Red２５２：１２９］、単離軟骨細胞［Grande他（１９８９）J Orthop Res７：２０８；及びTakigawa他（１９８７）Bone Miner２：４４９］及び天然又は合成重合体に連結した軟骨細胞［Walitani他（１９８９）J Bone Jt Surg７１Ｂ：７４；Vacanti他（１９９１）Plast Reconstr Surg８８：７５３；von Schroeder他（１９９１）JBiomed Mater Res２５：３２９；Freed他（１９９３）J Biomed Mater Res２７：１１；及びVacanti他、米国特許第５，０４１，１３８号］に基づいて、新たな軟骨の作成を目的に研究がされてきた。例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロースなどの重合体、あるいは重合体主鎖の加水分解機能で長期にわたって無害のモノマーに分解される他の重合体から形成される、生分解性及び生体適合性を有する多孔質の骨格上の培養基で、軟骨細胞を育成することができる。基質は、移植までに、細胞の適当な栄養供給とガス交換が可能なように設計されている。細胞は、移植する細胞の体積及び密度が適当に大きくなるまでイン・ビトロで培養することができる。基質を用いると、個々が望ましい形状に型どりでき、最終産物を患者自身の例えば耳又は鼻に似せることができるという利点がある。あるいは柔軟な基質を用いて、例えば関節に移植する際に整復することができる。
主題の方法の一つの態様においては、培養工程のある段階において、移植組織片をヘッジホッグアンタゴニストに接触させて、軟骨細胞の分化の速度及び培養内の肥大軟骨細胞の形成を制御する。
他の態様においては、移植された人工組織をヘッジホッグアンタゴニストで処置して、移植された基質を能動的に形作って意図する機能に好適なものとする。組織移植に関して上記したように、人工移植には、移植された実際の機械的環境との比較が可能な環境に基質が由来するものではないという、同じ欠点がある。主題の方法の有する、基質において軟骨細胞を調節する能力によって、置換される予定の組織と同様の特徴を移植片が獲得できるようになる。
更に他の態様において、主題の方法は、人工器官の付着を促進するのに用いられる。例えば主題の方法を、人工歯周器官の移植に用いることができる。ここでは周辺の結合組織を処置することによって、人工器官を取り巻く歯周靱帯の形成が刺激される。
更に他の態様においては、主題の方法を、動物の骨格組織の欠陥部位における骨形成を目的とした養生法の一部として用いることができる。Indianヘッジホッグは、最終的に骨芽細胞に置換される肥大軟骨細胞に特に関連している。例えば被験者の骨損失を調節する方法の一部として、本発明のヘッジホッグアンタゴニストを投与することができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを包含する調製物を用いて、例えば骨化の「モデル」形成における軟骨内骨化を制御することができる。
本発明の更に他の態様において、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて精子形成を調節することができる。ヘッジホッグタンパク質、特にＤｈｈは、精巣生殖細胞の分化及び／又は増殖及び維持に関連していることが示されている。Ｄｈｈの発現は、Ｓｒｙ（精巣決定遺伝子）活性化の直後にセルトリ細胞前駆体において誘導され、成人の精巣においても持続する。成熟精子が全く存在しないので、男性は生存可能であるが不妊である。様々な遺伝子背景において発達中の精巣を検査したところ、Ｄｈｈは精子形成の初期段階及び後期段階の両方を調節することが示唆された［Bitgood他（１９９６）Curr Biol６：２９８］。好ましい態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストを避妊薬として用いることができる。同様に、主題の方法のヘッジホッグアンタゴニストは、正常な卵巣機能の調節に有用である可能性がある。
主題の方法は、上皮組織に起こる疾患の予防処置、化粧などに幅広く適用することができる。一般にこの方法は、処置を行った上皮組織の成長状態が変化するのに有効な量のヘッジホッグアンタゴニストを、動物に投与する段階を含むことを特徴とする。投与の方法及び用量計画は、処置される上皮組織に応じて異なる。例えば、処置される組織が表皮組織（皮膚組織又は粘膜組織）である場合には、局所的な投与が好ましい。
「傷の治癒を促進する」方法で処置を行った場合には、この処置を用いない場合の傷の治癒と比較して、より速く傷が治癒する。「傷の治癒の促進」とは、とりわけケラチン合成細胞の増殖及び／又は成長を調節する方法、又はより少ない傷跡、より少ない傷収縮、より少ないコラーゲン付着及びより表層でおこるの傷の治癒を意味する。ある場合においては、「傷の治癒の促進」とは、本発明の方法を用いたときに、ある種の傷治癒の方法が改善された継代速度（例えば皮膚移植の生着速度）を有することも意味する。
現在まで再建術に有意な進歩があったにもかかわらず、治癒される皮膚の正常機能及び外観の回復において、傷跡は重大な障害になりうる。これは、手や顔のケロイド又は肥大性傷跡などの病理的傷跡が機能障害及び肉体的変形の原因となっている場合に特にあてはまる。最も厳しい状況においては、そのような傷跡は心理的な悩みを引き起こし、経済的な負担にもなる。傷の回復は、止血作用、炎症、増殖及び再形成の段階を含む。増殖段階は、繊維芽細胞並びに内皮及び上皮細胞の増加を含む。傷の閉鎖を促進する及び／又は瘢痕組織の形成を最小化するために、主題の方法の使用を通じて、傷内及び周辺の上皮細胞の増殖速度を制御することができる。
本発明の処置は、例えば放射線療法及び／又は化学療法の結果起こる口内炎及び口腔傍炎の治療を目的とした、治療養生法の一部として有効である。そのような潰瘍は一般に化学療法又は放射線療法の後、数日以内に発達する。一般に、これらの潰瘍は始めには、灰色の壊死性膜によって覆われ炎症組織によって囲まれる、痛みを伴う、小さな不定形の傷である。多くの場合、処置を施さないでいると、炎症基部上の傷周辺の組織が増殖する。例えば、潰瘍の周縁にある上皮組織が増殖活性を示し、その結果表面上皮組織の連続性が失われる。傷が大きくなり上皮組織の保全性が失われるので、二次感染を起こす可能性がある。食物及び水を摂取する度に痛みを感じ、潰瘍が消化管を通じて増殖した場合には、様々な要因が加わり下痢が起こる。本発明によると、ヘッジホッグアンタゴニストを適用してそのような潰瘍を処置することによって、患部上皮組織の異常な増殖及び分化を低減することができ、それに続く炎症に伴う苦痛を低減することができる。
主題の方法及び組成物を用いて、自己免疫疾患に由来する傷（例えば乾癬）などの皮膚科学疾患に由来する傷を治療することができる。アトピー性皮膚炎とは、花粉、食物、鱗屑、昆虫毒及び植物毒などのアレルゲンによって引き起こされる免疫応答に関連したアレルギーの結果起こる皮膚の外傷のことをいう。
他の態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストの抗増殖調製物を用いて、水晶体上皮細胞増殖を阻害して、嚢外白内障摘出の術後合併症を防ぐことができる。白内障は、難治性の眼病であり、白内障の治療について様々な研究がなされてきた。現在、白内障の治療は外科手術によって行われている。白内障の外科術は、長い間用いられており、様々な手術法が研究されてきた。嚢外水晶体摘出が、白内障除去の手段として用いられている。嚢外摘出に用いるこの方法には、無水晶体類嚢胞黄斑浮腫及び網膜剥離が起こりにくいという医療上の利点がある。嚢外摘出は、後眼房型眼内水晶体（ほとんどの場合に用いられるべき水晶体と考えられている）の移植に必要である。
しかし嚢外白内障摘出には、後水晶体嚢の不透明化（後白内障と称される）が起こりやすいという欠点がある。この不透明化は術後３年以内に５０％までの確立で起こる。後白内障は、嚢外水晶体摘出の後に残る、赤道及び後嚢水晶体上皮細胞の増殖によって起こる。これらの細胞は増殖してゾンマーリング（Sommerling）環を形成し、同じく後嚢に蓄積する繊維芽細胞とともに後嚢の不透明化を起こして、視界を妨げる。後白内障を予防する処置をとることが好ましい。二次白内障形成を阻害するために、主題の方法は、残った水晶体上皮細胞の増殖を阻害する手段を提供する。例えば水晶体除去の後に、後眼房にヘッジホッグアンタゴニストの調製物を含む溶液を点眼することによって、そのような細胞を静止状態に保つことができる。更に、溶液の浸透圧のバランスを保つことによって、後眼房内に適用したときに効果的な投与量を最小限にすることができ、嚢下上皮の成長をある特異性で阻害することができる。
主題の方法を、角膜上皮細胞の増殖に特徴付けられる角膜疾患（例えば上皮の下方成長、眼表面の扁平上皮細胞癌といった眼の上皮の疾患）治療に用いることもできる。
Levine他［（１９９７）J Neurosci１７：６２７７］は、ヘッジホッグタンパク質が脊椎動物網膜における有糸分裂及び光受容体分化を調節し、Ｉｈｈが、網膜幹細胞の増殖及び光受容器の分化を促進しうる色素上皮からの要素であることを示している。同様に、Jensen他［（１９９７）Development１２４：３６３］は、周生期のマウス網膜細胞の培養を、Sonicヘッジホッグのアミノ末端断片で処置すると、ブロモデオキシウリジンを取り込む細胞の割合が、全細胞、桿体光受容体、無軸索細胞、ミュラー神経膠細胞において増加することを示している。このことは、Sonicヘッジホッグが網膜前駆体細胞の増殖を促進することを示唆している。従って、本発明の方法を、網膜細胞の増殖疾患の治療に用いて、光受容体分化を調節することができる。
本発明の更に他の特徴は、毛の成長の制御に主題の方法を使用することに関する。毛は基本的には強靱で不溶性の蛋白質ケラチンから構成される。強度はシスチンのジスルフィド結合に由来する。各毛は、円筒状の毛幹及び毛根を包含し、皮膚にフラスコ状の陥没部である毛嚢を有する。毛嚢の底部には、毛乳頭と呼ばれる指のような突起物がある。この毛乳頭を構成する結合組織から毛が成長し、結合組織を通じて血管が細胞に栄養を供給する。毛幹は皮膚表面から外部に突き出た部分であり、一方毛根とは埋没した毛の部分である。毛根の基部は毛球内で伸張し、毛乳頭上に収まっている。毛を産生する細胞は、毛嚢の毛球内で成長する。細胞が毛嚢内で増殖するにつれて、細胞は繊維の形で押し出される。毛の「成長」とは、分裂する細胞によって毛繊維が形成され伸張することをいう。
当分野で知られるように、一般的な毛周期は、発育期、休止期、終止期の３つの段階に分けられる。活性期（発育期）の間、皮膚毛乳頭の表皮幹細胞は急速に分裂する。娘細胞は上方に移動し、分化して円錐状の層を形成する。移行期（休止期）は、毛嚢における幹細胞の有糸分裂の休止を特徴とする。停止段階は終止期として知られる。ここでは毛は頭皮内に数週間保持され、その下に現れる新しい毛が、終止期の毛幹を毛嚢から押し出す。このモデルから明なのは、毛細胞に分化する、分裂幹細胞の集まりが大きいほど、毛の成長が起こりやすいということである。従って、これらの幹細胞の増殖を助長する又は阻害することによって、毛の成長をそれぞれ増加又は低減する方法が得られる。
ある態様においては、切断、剃毛又は脱毛などの従来の除去方法の代わりに、主題の方法をヒトの毛の成長を押さえる方法として用いることができる。例えば、本発明の方法を、異常に速い又は濃い毛の成長に特徴付けられる毛髪病（例えば多毛症）の治療に用いることができる。例証的な態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて、異常な発毛に特徴付けられる、女性の多毛症を制御することができる。主題の方法は、脱毛期間を延長する工程を提供することもできる。
その上更に、ヘッジホッグアンタゴニストは、上皮細胞に細胞毒を与えるのではなく細胞分裂を停止するので、化合物は、効能を得るために細胞周期のＳ期への進行を必要とする細胞毒剤（例えば放射線誘導死）から毛嚢細胞を保護することができる。主題の方法による処置を行うことで、毛嚢細胞を休止させることによって（例えば細胞がＳ期に入るのを阻害し、従って毛嚢細胞の有糸分裂不能とプログラム細胞死を防ぐことによって）細胞を保護することができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを、通常は毛喪失が起こってしまう化学療法又は放射線療法を受けている患者に用いることができる。そのような療法の間に主題の処置を用いて、通常はプログラム細胞死に結びつく細胞周期の進行を阻害することによって、毛嚢細胞死を防ぐことができる。療法の終了後、毛嚢細胞増殖の阻害の停止と同時に、本発明の処置を停止することができる。
主題の方法は、脱毛性毛嚢炎、網状瘢痕性紅斑毛嚢炎又はケロイド毛嚢炎などの毛嚢炎の治療に用いることができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを化粧に調製したものを局所的に適用して、擬毛嚢炎を治療することができる。この毛嚢炎は、首の下顎領域における、髭剃りに関連して最もよく起こる慢性的疾患であり、紅斑性の丘疹及び毛が埋没した膿疱に特徴付けられる。
本発明の他の特徴において、主題の方法を、上皮に由来する組織の分化を促進する及び／又は増殖を阻害するのに用いることができる。これら分子のそのような形態は、上皮組織に関する過形成性及び／又は腫瘍性状態を処置するための分化治療の基礎を提供することができる。例えばそのような調製物を、皮膚細胞の異常な増殖及び成長が起こる皮膚疾患の処置に用いることができる。
例えば本発明の薬学的調製物は、角化症などの過形成性の表皮状態の処置、並びに様々な皮膚癌（扁平上皮細胞癌など）の高増殖率に特徴付けられる腫瘍性の表皮状態の処置に用いることを企図する。主題の方法は、皮膚に影響を与える自己免疫疾患、特に（乾癬又はアトピー性皮膚炎によって起こる）病的な増殖及び／又は表皮のケラチン化を含む、皮膚科学疾患の処置に用いることができる。
乾癬、扁平上皮細胞癌、角化棘細胞腫及び光線性角化症などの多くの一般的な皮膚疾患は、局所的な異常増殖及び成長によって特徴付けられる。例えば皮膚上の落屑性の赤い隆起したプラークによって特徴付けられる乾癬においては、正常な細胞に比較してケラチン合成細胞が非常に速く増殖し、ほとんど分化しないことが知られている。
一つの態様において、本発明の調製物は、炎症又は非炎症要素のいずれかによって特徴付けられる、異常な皮膚細胞の増殖を起こすケラチン化疾患に関連した皮膚科学的疾患の処置に好適である。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの治療用調製物（例えば休止又は分化を促進する）を、皮膚、粘膜又は爪などの様々な形態の乾癬の治療に用いることができる。上記したように、乾癬は一般に、「再生」経路に沿った増殖活性及び分化を示す表皮ケラチン合成細胞によって特徴付けられる。主題の方法の、抗増殖的な態様を用いた処置は、異常な表皮活性化を反転させるのに用いることができ、疾患の軽減の維持を提供することができる。
他の様々な角化症損傷も、主題の方法を用いた治療の対象となりうる。例えば光線性角化症は、日光にさらされた及び光線照射を受けた皮膚に起こる表面炎症性前癌性腫瘍である。傷は、紅斑から茶色まで様々なものにわたる。現在行われている治療には、切除術及び冷凍外科手術がある。しかしこれらの処置は苦痛を伴い、しばしば化粧に不適格な傷跡を生じる。従って、光線性角化症といった角化症の処置として、損傷の表皮／類表皮腫細胞の過増殖を阻害するのに十分な量の、ヘッジホッグアンタゴニスト組成物を好ましくは局所的に適用することが挙げられる。
座瘡は、主題の方法によって処置されうる、別の皮膚科学的疾患である。例えば尋常性座瘡は、十代の若者及び成人初期において最もよく見られる多因性の疾患であり、顔及び胴体上部にみられる、炎症及び非炎症性損傷として特徴付けられる。尋常性座瘡を起こす元になる欠陥は、活動過多な皮脂腺管の過角質化である。過角質化は、皮膚及び毛嚢微生物の正常な移動を妨げ、それによってバクテリアPropinobacterium acnes、Staphylococcus epidermidis及び酵母菌Pitrosporum ovaleによるリパーゼの放出が刺激される。抗増殖的なヘッジホッグアンタゴニスト、好ましくは局所用調製物で処置することが、損傷形成に結びつく管の変化（例えば過角質化）を防ぐのに有用であろう。主題の処置は、例えば抗生物質、レチノイド及び抗アンドロゲンをさらに含んでいてもよい。
本発明は又、様々な形態の皮膚炎を治療する方法を提供する。皮膚炎とは、掻痒性、紅斑性、落屑性、疱疹性、湿潤性、亀裂性又は痂皮性の損傷を漠然と画定する用語である。これらの損傷は、様々な理由で起こる。最も一般的な皮膚炎はアトピー性、接触性及びおむつ皮膚炎である。脂漏性皮膚炎は慢性で通常は掻痒性の、紅斑、乾燥、湿潤又は脂様の鱗片を伴う皮膚炎で、乾燥鱗片の過度な量の剥離を伴う、様々な領域（特に頭皮）における黄色の痂皮性斑点である。主題の方法は、しばしば慢性であり通常は湿疹性皮膚炎である、鬱血性皮膚炎の処置に用いることができる。光線性皮膚炎は、太陽光線、紫外線、Ｘ又はγ放射線などの光線放射にさらされた結果起こる皮膚炎である。本発明によると、主題の方法を、上皮細胞の望まれない増殖によって起こる皮膚炎の、ある種の症状を処置及び／又は予防するのに用いることができる。様々な皮膚炎の形態に対するこうした治療法は、局所的及び全身性投与のコルチコステロイド、止痒剤及び抗生物質をさらに含むことができる。
例えば、主題の方法を用いて、血管形成を阻止することができるであろうということが予想される。ヘッジホッグは、血管形成を刺激することが知られている。ヘッジホッグタンパク質を浸透させてマウスに挿入されたマトリゲル(登録商標)プラグは、実質的な新血管新生を示すが、ヘッジホッグを有しないマトリゲル(登録商標)プラグは、比較的僅かの血管新生しか示さない。ヘッジホッグタンパク質は又、通常無血管のマウス角膜の血管新生を増大させることもできる。ｐｔｃ−１遺伝子は、大動脈の内皮細胞、血管平滑筋細胞、大動脈の動脈血管外膜繊維芽細胞、心房及び心室の冠状動脈管構造及び心筋細胞を含む正常な血管組織において発現される。これらの組織も又、ヘッジホッグタンパク質に感受性である。外因性ヘッジホッグでの処理は、ｐｔｃ−１発現のアップレギュレーションを引き起こす。加えて、ヘッジホッグタンパク質は、血管平滑筋細胞の増殖をイン・ビボで刺激する。ヘッジホッグタンパク質は又、繊維芽細胞に、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２などの血管形成成長因子の発現を増大させる。最後に、ヘッジホッグタンパク質は、虚血性の損傷からの回復を刺激すること及び側副血管の形成を刺激することが知られている。
ヘッジホッグが血管形成を促進するとすれば、ヘッジホッグアンタゴニストは、特に、あるレベルのヘッジホッグシグナリングが血管形成に必要である状況において、血管形成阻害剤として作用することが予想される。
血管形成は、多くの疾患にとって基本的に重要である。持続性の、無秩序な血管形成が、ある範囲の病気状態、腫瘍の転移及び内皮細胞の異常増殖において生じる。血管形成過程の結果として造られた脈管構造は、これらの病気においてみられる病的ダメージを支持するものである。無秩序な血管形成により造られた種々の病的状態は、血管形成依存性又は血管形成関連疾患としてグループにまとめられている。血管形成過程の制御に向けられた治療は、これらの疾患の排除又は緩和へと導くことができた。
血管形成により引き起こされ、支持され又はそれに関係する疾患には、眼の新血管新生疾患、加齢関連黄斑変性、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植の拒絶、新血管新生性緑内障、水晶体後繊維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ疲労症、アトピー性角膜炎、上輪部角結膜炎、表皮爪膜乾燥症、シェーグレン酒性座瘡、、梅毒、ミコバクテリア感染症、脂質退行変性、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁表皮剥離、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナー類肉腫症、鞏膜炎、スティーヴンズ-ジョンソン病、周辺放射角膜切開、角膜移植片拒絶、慢性関節リウマチ、骨関節症慢性的炎症(例えば、潰瘍性大腸炎又はクローン病)、血管腫、遺伝性出血性毛細管拡張症及び遺伝性出血性毛細管拡張症が含まれる。
加えて、血管形成は、癌においても重要な役割を演じている。腫瘍は、栄養を供給し且つ細胞老廃物を除去する血液の供給なしでは拡大できない。血管形成が重要である腫瘍には、固形腫瘍例えば横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫及び骨肉腫、並びに良性腫瘍例えば聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫が含まれる。血管形成因子は、幾つかの固形腫瘍と関連することが見出されている。血管形成の防止は、これらの腫瘍の成長及び腫瘍の存在の結果生じる動物のダメージを停止させることができるであろう。血管形成は又、血液から生じる腫瘍例えば白血病(これは、何れかの骨髄の様々な急性又は慢性の新生物疾患で、通常、貧血症、血液凝固機能障害及びリンパ節、肝臓及び脾臓の肥大を伴う)とも関係している。血管形成は、骨髄における白血病様腫瘍を生じさせる異常において役割を演じているということが考えられる。
腫瘍の成長に加えて、血管形成は、転移においても重要である。初期においては、血管形成は、腫瘍の血管新生において重要であり、それは、癌細胞が血流に入って身体中を循環することを可能にする。腫瘍細胞が原発部位を離れて二次的な転移部位に定着した後は、新たな腫瘍が成長して拡大しうる前に、血管形成が起きなければならない。それ故、血管形成の防止は、腫瘍の転移の防止(おそらく原発部位の新生物成長を含む)に導くことができよう。
血管形成は又、再生及び傷の治癒などの正常な生理的過程にも関与している。血管形成は、排卵において(及び受精後の胞胚の着床においても)重要なステップである。血管形成の防止は、無月経の誘導、排卵のブロック又は胞胚の着床の防止に利用することができよう。
この発明は、呼吸障害症候群又は他の不適当な肺表面張力から生じる疾患の治療及び／又は予防において有用であろうということが予想される。呼吸障害症候群は、肺の肺胞における不十分な表面活性物質から生じる。脊椎動物の肺は、肺の膨張中に表面張力を上昇させ且つ肺の収縮中には減少する脂質とタンパク質の複雑な混合物である表面活性物質を含んでいる。肺の収縮中、表面活性物質は、肺胞をつぶす表面力がなくなるように減少する。呼息中つぶれなかった膨らんだ肺胞は、血液と肺胞ガスの間での連続的な酸素と二酸化炭素の輸送を可能にし、その後の吸息中に膨張するのにずっと小さい力しか必要としない。膨張中、肺の表面活性物質は、肺胞表面積が増大するにつれて表面張力を増大させる。膨張中の肺胞におけるすすぎ表面張力は、それらの空気を含んだ空間における過剰膨張に対抗し、吸入された空気を十分空気を含んでいない肺胞へそらし、それにより一様な肺の吸気を促進する傾向がある。
呼吸障害症候群は、特に、未熟児に多い。肺の表面活性物質は、通常は、胎児期の最後の６週間まで非常に低速で合成される。正常な妊娠期間より６週間以上前に生まれたヒトの幼児は、不適当な量の肺表面活性物質及び不適当な表面活性物質合成速度を有して生まれるリスクが高い。生まれた幼児が未熟であるほど、表面活性物質欠乏は重症でありそうである。重い表面活性物質欠乏症は、誕生後数分から数時間以内に呼吸不全を生じうる。この表面活性物質欠乏症は、最大呼吸努力にもかかわらず、肺の広がる能力の減少の故に、進行性の肺胞崩壊(肺拡張不全)を生じる。その結果、幼児の血液に到達する酸素の量は不十分となる。ＲＤＳは、成人においても、典型的には表面活性物質の生合成不全の結果として生じうる。
未熟児の肺組織は、ヘッジホッグシグナリング経路の高い活性を示す。この経路のヘッジホッグアンタゴニストを用いた阻害は、ラメラ体の形成を増大させ且つ表面活性物質の生合成に関与する遺伝子の発現を増大させる。ラメラ体は、表面活性物質の生合成に関係する細胞内構造である。これらの理由から、未熟児のヘッジホッグアンタゴニストでの処理は、表面活性物質の生合成を刺激してＲＤＳを改善するはずである。成人のＲＤＳがヘッジホッグ経路の活性化に関係している場合には、ヘッジホッグアンタゴニストでの処理はやはり有効なはずである。
ヘッジホッグアンタゴニストの利用は、特に、冒された組織及び／又は細胞が高いヘッジホッグ経路の活性化を示す病気を標的としうるということが更に予想される。ｇｌｉ遺伝子の発現は、ヘッジホッグシグナリング経路により活性化される(ｇｌｉ−１、ｇｌｉ−２及びｇｌｉ−３を含む)。ｇｌｉ−１発現は、最も首尾一貫して、広範囲の組織及び病気にわたって、ヘッジホッグシグナリング活性と相関しているが、ｇｌｉ−３は、それ程でない。このｇｌｉ遺伝子は、ヘッジホッグシグナリングの完全な効果を誘出するのに必要な多くの遺伝子の発現を活性化する転写因子をコードしている。しかしながら、Ｇｌｉ−３転写因子は又、ヘッジホッグエフェクター遺伝子のリプレッサーとしても作用し得て、それ故、ｇｌｉ−３の発現は、ヘッジホッグシグナリング経路の減少した効果を引き起こすことができる。Ｇｌｉ−３が転写アクチベーターとして作用するかリプレッサーとして作用するかは、転写後事象に依存しており、それ故、Ｇｌｉ−３タンパク質の活性化型(抑制型に対して)を検出する方法がヘッジホッグ経路活性化の信頼できる測定でもあろうということが予想される。ｇｌｉ−２遺伝子発現は、ヘッジホッグ経路活性化についての信頼できるマーカーを与えることが予想される。ｇｌｉ−１遺伝子は、多くの癌において強く発現されており、ヘッジホッグ経路の相対的な活性化のマーカーとして機能する。加えて、高いｇｌｉ遺伝子発現を有する未熟な肺などの組織は、ヘッジホッグ阻害剤により強く影響される。従って、ｇｌｉ遺伝子発現の検出は、ヘッジホッグアンタゴニストでの治療から特に利益を得るであろう組織及び病気を同定するための強力な予測ツールとして用いることができるということが予想される。
好適具体例において、ｇｌｉ−１発現レベルは、転写物の直接的検出により、又はタンパク質のレベル若しくは活性の検出によって検出される。転写物は、主としてプローブのｇｌｉ−１転写物又はそれから合成されたｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに依存する任意の広範囲の技術を用いて検出することができる。周知技術には、ノーザンブロッティング、逆転写ＰＣＲ及び転写物レベルのマイクロアレイ分析が含まれる。Ｇｌｉタンパク質レベルを検出する方法には、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)(好ましくは、Ｇｌｉタンパク質の位置が決定されている標準と比較する)、及び質量分析法が含まれる。質量分析法は、一連の精製ステップと連結させて、特定の試料中の多くの異なるタンパク質レベルの高スループットの同定を可能にすることができる。質量分析法及び２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥは又、タンパク質分解事象、ユビキチン化、リン酸化、脂質修飾などを含むタンパク質に対する転写後修飾を同定するためにも利用することができる。Ｇｌｉ活性は又、基質ＤＮＡに対する結合又は標的プロモーターのイン・ビトロ転写活性化を分析することによっても評価することができる。ゲルシフトアッセイ、ＤＮＡフットプリンティングアッセイ及びＤＮＡ−タンパク質架橋アッセイは、すべて、ＤＮＡ上のＧｌｉ結合部位に結合することのできるタンパク質の存在を評価するために利用することのできる方法である。
好適具体例において、ｇｌｉ転写物レベルを測定し、異常に高いｇｌｉレベルを示す病気又は障害のある組織をヘッジホッグアンタゴニストで治療する。未熟肺組織、肺癌(例えば、腺癌、気管支肺胞腺癌、小細胞癌)、乳癌(例えば、下方腺管癌、下方小葉癌、管状癌)、前立腺癌(例えば、腺癌)、及び良性前立腺過形成は、すべて、ある場合において、強く上昇したｇｌｉ−１発現レベルを示す。従って、ｇｌｉ−１発現レベルは、これらの組織のどれをヘッジホッグアンタゴニストで処理すべきであるかを測定するための強力な診断デバイスである。加えて、ウロセリアル細胞の癌(例えば、膀胱癌、他の泌尿生殖器癌)がやはりある場合に上昇したｇｌｉ−１レベルを有するであろうという実質的な相関の形跡がある。例えば、染色体９ｑ２２上のヘテロ接合性の喪失が膀胱癌に共通していることが知られている。このｐｔｃ−１遺伝子は、この位置に位置され、ｐｔｃ−１機能欠損は、おそらく、他の多くの種類の癌におけるように、増殖過剰の部分的原因である。従って、かかる癌は又、高いｇｌｉ発現をも示し、特に、ヘッジホッグアンタゴニストでの治療に従順であろう。
ｐｔｃ−１及びｐｔｃ−２の発現は又、ヘッジホッグシグナリング経路によっても活性化されるが、これらの遺伝子は、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしてはｇｌｉ遺伝子に劣る。ある組織においては、ヘッジホッグ経路が高度に活性であるにもかかわらず、ｐｔｃ−１又はｐｔｃ−２の一方のみが発現される。例えば、精巣の発生において、インディアンヘッジホッグは重要な役割を演じ、そのヘッジホッグ経路が活性化されるが、ｐｔｃ−２しか発現されない。従って、これらの遺伝子は、両遺伝子の同時測定はヘッジホッグアンタゴニストで処理すべき組織の有用な指標として企図されるが、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしては個別的には信頼できない。
主題の方法によって処置しうる疾患としては、ヒト以外に特異に見られる疾患、例えば疥癬が挙げられる。
更に他の態様において、主題の方法を、ヒトの癌、特に基底細胞癌及び例えば皮膚などの上皮組織の腫瘍の処置に用いることができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを、主題の方法で、ヒトの癌、特に基底細胞母斑症候群(ＢＣＮＳ)及び他のヒトの癌、腺癌、肉腫などの処置の一部として用いることができる。
好ましい態様において、主題の方法を、基底細胞癌の治療（又は予防）のための予防養生法の一部として用いる。ｐｔｃ突然変異により生じる基底細胞癌の一般的な特徴と思われるのが、ヘッジホッグシグナリング経路の調節停止である。家族性及び散在性ＢＣＣ（基底細胞癌）の腫瘍において、インシトゥハイブリダイゼーションで調べたところ、ヒトｐｔｃ ｍＲＮＡが一貫性を有して過剰発現することが報告されている。ｐｔｃは負の自己調節を示すので、ｐｔｃを不活性化する突然変異がｐｔｃ突然変異体の過剰発現を引き起こしていると考えられる。これまでの研究によると、ヘッジホッグ蛋白質の過剰発現が、腫瘍発生を引き起こしうることが示されている。皮膚発達のわずか数日後に皮膚表面全体にわたる複数のＢＣＣ様皮膚増殖を含むＢＣＮＳの特徴を発達させた皮膚内で、Ｓｈｈを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける研究から、マウスの腫瘍発生にSonicヘッジホッグ（Ｓｈｈ）が役割を担っているということが示唆されている。これまでの研究にはＢＣＣから得たＳｈｈヒト遺伝子における突然変異についての記載もあり、ヒトにおけるＳｈｈ又は他のＨｈ遺伝子が、ヒトにおける優性腫瘍誘発遺伝子として作用しうることを示唆している。散在性ｐｔｃ突然変異が、正常な個人から得たＢＣＣにおいて観察されており、そのうちのいくつかはＵＶ標識突然変異であった。散在性ＢＣＣについて行われた近年の研究の一つにおいて、ＣＴ又はＣＣＴＴのいずれかが変化した５個のＵＶ標識型突然変異が、ｐｔｃ突然変異を含む１５の腫瘍に見つかっている。近年行われた、ＢＣＣ及び神経外胚葉腫における散在性ｐｔｃ突然変異の分析によると、ＢＣＣにおいて発見された３個のｐｔｃ突然変異の一つにおいて、１個のＣＴが変化していることが示されている（例えばGoodrich他（１９９７）Science２２７：１１０９−１３；Xie他（１９９７）Cancer Res５７：２３６９−７２；Oro他（１９９７）Science２７６：８１７−２１；Xie他（１９９７）Genes Chromosomes Cancer１８：３０５−９；Stone他（１９９６）Nature３８４：１２９−３４；及びJohnson他（１９９６）Science２７２：１６６８−７１参照）。
主題の方法は、ＢＣＮＳを有する患者の処置、例えばＢＣＣ又はｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の結果起こりうる疾患による他の影響の予防に用いることもできる。基底細胞母斑症候群は、若年期に現れる複数のＢＣＣにより特徴付けられる、希有な常染色体優性疾患である。ＢＣＮＳ患者はこれらの腫瘍を発達させやすく、１０歳から２０歳にかけて、主に日光にさらされた皮膚領域に大量に現れる。この疾患は、肋骨、頭及び顔の変性、時として多指症、合指症及び脊椎披裂を含む、多くの発達異常も引き起こす。又、これらの患者はＢＣＣに加えて卵巣及び心臓の繊維腫、皮膚及び顎の嚢腫、中枢神経系における髄芽細胞腫及び髄膜腫などの多くの腫瘍型を発達させる。主題の方法を、ＢＣＮＳ及び非ＢＣＮＳ患者におけるそのような腫瘍型の予防及び処置に用いることができる。研究によって、ＢＣＮＳ患者がｐｔｃ遺伝子に遺伝子性及び散在性突然変異の両方を有することが示されており、このことは、これらの突然変異体がこれらの疾患の根本的な要因となっていることを示唆している。
他の特徴において、本発明はヘッジホッグアンタゴニストを包含する薬剤調製物を提供する。主題の方法に用いられるヘッジホッグアンタゴニストは、生物学的に許容可能な媒体［水、緩衝食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）又はそれらの好適な混合物］を用いて、投与に都合よく調合することができる。選択された媒体中での活性成分の最適濃度は、医化学者に公知の方法に従って経験的に決定することができる。ここでいう「生物学的に許容可能な媒体」には、薬剤調製物の投与経路に適したあらゆる溶媒、分散媒などが含まれる。薬学的に活性な物質におけるそのような媒体の使用は、当分野において公知のものである。従来の媒体又は薬剤がヘッジホッグアンタゴニストの活性に不適合な場合を除いて、本発明の薬剤調製物に主題の化合物を使用することが企図される。好適な賦形剤及び他の蛋白質を含む調合については、例えばRemington Pharmaceutical Sciences［Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、米国ペンシルバニア州イーストン（１９８５）］に記載がある。これらの賦形剤は、注射可能な「沈殿（deposit）配合物」を含む。
本発明の薬剤調製物は、例えば家畜や犬などのペットの処置といった獣医学的な使用に好適なヘッジホッグアンタゴニストの薬剤調製物などの、獣医学的な組成物を含むこともできる。
導入の方法は、再充填可能な又は生分解性の装置を用いて提供することができる。近年、様々な緩効性重合体装置が開発され、蛋白質様生物薬剤といった薬剤の、制御された投与がイン・ビボで試されている。生分解性及び非分解性重合体の両方を含む様々な生体適合性重合体（ヒドロゲルなど）を用いて、ヘッジホッグアンタゴニストを特定の標的部位において持続的に放出する移植片を形成することができる。
本発明の調製物は、経口、非経口、局所、又は直腸内で投与することができる。調製物はもちろん各投与経路に適した形状で投与される。例えば、錠剤、カプセル形状などによる注射、吸入投与；目薬、軟膏、座薬、制御された放出パッチなどによる注射、浸剤又は吸入投与；ローション剤又は軟膏による局所投与；及び座薬による直腸投与が挙げられる。経口及び局所投与が好ましい。
ここでいう「非経口投与」及び「非経口に投与する」とは、腸内及び局所投与を除く投与方法、通常は注射による投与を意味する。例としては静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内及び胸骨内注射及び浸剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ここでいう「全身投与」「全身に投与する」「末梢投与」及び「末梢に投与する」とは、中枢神経系に直接投与するのではなく、化合物、薬剤又は他の物質を患者の系に入るように投与し、従って代謝や他の類似方法（例えば皮下投与）の影響を受ける投与のことを言う。
これらの化合物は、好適な投与経路によって、治療を目的としてヒト及び他の動物に投与することができる。例えば、噴霧の形での経口、経鼻の投与、粉末、軟膏又は滴下の形での直腸内、膣内、非経口、槽内及び局所投与、並びに口腔及び舌下投与が挙げられる。
選択された投与経路に関わらず、好適な水和形態で用いることのできる本発明の化合物及び／又は本発明の薬剤組成物を、下に記すような又は当業者に知られる従来法で、薬学的に許容可能な投与形態に調合することができる。
本発明の薬剤組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物及び投与方法について望ましい治療的応答を達成できるのに有効な量の活性成分が得られるように変えることができる。
選択される投与レベルは、本発明の特定の化合物、エステル、塩又はそのアミドの活性、投与経路、投与時間、該特定の化合物の排出速度、処置時間、該特定のヘッジホッグアンタゴニストとともに用いられた他の薬剤、化合物及び／又は物質、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、体調、健康状態及び病歴、医療分野で知られるその他の要因といった様々な要因に依存する。
当分野で通常の技術を有する医者又は獣医は、必要とされる薬剤組成物の有効量を容易に決定し処方することが可能である。例えば、医者又は獣医は、薬剤組成物に用いられる本発明の化合物の用量を、必要とされる量より低いレベルから始めて、望ましい効果が達成できるまで徐々に用量を増加させることができる。
一般に、好ましい一日の用量は、治療効果を生み出すのに有効な最も低い化合物量である。そのような有効な量は、一般に上記したような要因に依存する。一般に、患者に対する本発明の化合物の静脈内、脳内及び皮下投与の量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。
望ましい場合には、活性化合物の有効な一日分の用量は、２、３、４、５、６回以上の副次用量で、一日を通じて適当な間隔をおいて（随意に回分服用の形態をとることができる）、分けて投与することができる。
ここでいう「処置」とは、予防法、療法及び治療を含むことを意図する。
この処置を受ける対象は、霊長類（特にヒト）及び他のほ乳類（ウマ、ウシ、ブタ及びヒツジ）、家禽類及びペットを含む、処理を必要とするあらゆる動物を含む。
本発明の化合物はそのままで又は薬学的に許容でき且つ／若しくは無菌の担体との混合物として投与することができ、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド及びグリコペプチドなどの抗菌剤と併せて投与することもできる。従って併合治療は、最初の投与の治療効果が完全に消えないうちに次の投与を行う、活性化合物の連続的、同時及び分離投与を含む。
Ｖ．製薬組成物
本発明の化合物は単独で投与することが可能であるが、これを製薬処方物（組成物）として投与することが好ましい。本発明に従うヘッジホッグアンタゴニストは、人用又は獣医用の医薬品に使用するために任意の都合のよい方法で投与するために処方することができる。ある種の具体例では、製薬製剤に含有させる化合物は、それ自体活性であってよく、又は例えば生理学的環境で活性化合物に転化できるプロドッラグであることができる。
従って、本発明の他の観点は、治療学的に有効な量の前記の化合物の１種以上を１種以上の製薬上許容できるキャリアー（添加剤）及び（又は）希釈剤と共に処方してなる製薬上許容できる組成物を提供する。以下に詳細に説明するように、本発明の製薬組成物は、以下のもの：（１）経口投与に適合した形態、例えば、飲薬（水性又は非水性の溶液又は懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト、（２）例えば皮下、筋肉内又は静脈内注射による非経口的投与に適合した形態、例えば、無菌溶液又は懸濁液、（３）局所適用に適合した形態、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏又はスプレー、（４）膣内又は直腸内投与に適合した形態、例えば、ペッサリー、クリーム又はフォームも含めて、固体又は液体形態で投与するために特に処方することができる。しかし、ある種の具体例では、主題化合物は、無菌水に単に溶解又は懸濁させることができる。ある種の具体例では、製薬製剤は発熱性ではない。即ち、患者の体温を上昇させない。
語句“製薬上有効な量”とは、ここで使用するときは、少なくとも動物細胞の亜集団におけるｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進に打ち勝ち、しかして処置された細胞におけるその経路の生物学的結果を、どんな医療的処置にも適用できる合理的な利益／危険の比で持って、ブッロクすることによって何らかの所望の治療的効果を生じさせるのに有効である本発明の化合物を含む化合物、材料又は組成物についてのそのような量を意味する。
語句“製薬上許容できる”とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又はその他の問題若しくは合併症なしに、人間及び動物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／危険の比で適合する化合物、材料、組成物及び（又は）投薬の形態をいうのに使用する。
語句“製薬上許容できるキャリアー”とは、ここで使用するときは、主題アンタゴニストを体の一つの器官又は一部から他の器官又は一部に運び又は輸送する際に係わる液体又は固体状の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材のような製薬上許容できる材料、組成物又はビヒクルを意味する。それぞれのキャリアーは、処方物の他の成分と適合でき且つ患者に有害でないという意味で“許容できる”ものでなければならない。製薬上許容できるキャリアーとして使用できる材料のいくつかの例には、（１）糖類、例えばラクトース、グルコース及びサッカロース、（２）でんぷん、例えばコーンスターチ及びジャガイモでんぷん、（３）セルロース及びその誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロース、（４）粉末状トラガンタ、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えばココアバター及び座薬用ワックス、（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーンオイル及び大豆油、（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビット、マンニット及びポリエチレングリコール、（１２）エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）発熱原を含まない水、（１７）等張性塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）燐酸塩緩衝溶液及び（２１）製薬処方物に使用されるその他の非毒性の許容できる物質が包含される。
上記したように、本発明のヘッジホッグアンタゴニストのある種の具体例は、アミノ又はアルキルアミノのような塩基性官能基を含有し、しかして、製薬上許容できる酸により製薬上許容できる塩を形成することができる。この観点で、用語“製薬上許容できる塩”とは、本発明の化合物の比較的毒性でない無機及び有機酸との付加塩をいう。これらの塩類は、本発明の化合物の最終の単離及び精製中に現場で、或いは遊離塩基の形の精製された本発明の化合物を好適な有機又は無機酸と別途反応させ、次いでそのように形成された塩を単離することによって製造することができる。代表的な塩類には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、燐酸塩、トシレート、くえん酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、こはく酸塩、酒石酸塩、ナフタリン酸塩、メシレート、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリルスルホン酸塩などが包含される（例えば、ベルジ他による「製薬用塩類」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７）６６：１−１９を参照）。
主題化合物の製薬上許容できる塩類は、例えば、非毒性の有機又無機酸からの化合物の周知の非毒性の塩類又は第四アンモニウム塩を包含する。例えば、このような周知の非毒性の塩類には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、燐酸、硝酸などのような無機酸から誘導されるもの、酢酸、プロピオン酸、こはく酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、しゅう酸、イセチオン酸などのような有機酸から製造される塩類が包含される。
その他の場合には、本発明の化合物は、１個以上の酸性官能基を含有することができ、しかして、製薬上許容できる塩基により製薬上許容できる塩類を形成することができる。これらの場合に、用語“製薬上許容できる塩類”とは、本発明の化合物の比較的非毒性の有機又無機塩基との付加塩をいう。これらの塩類は、同様に、本発明の化合物の最終の単離及び精製中に現場で、或いは遊離酸の形の精製された本発明の化合物を好適な塩基、例えば製薬上許容できる金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩と、アンモニアと又は製薬上許容できる有機第一、第二若しくは第三アミンと別途反応させることによって製造することができる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩類には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム塩などが包含される。塩基付加塩を形成させるのに有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが包含される（例えば、上記のベルジ他を参照）。
湿潤剤、乳化剤及び滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、剥離剤、被覆剤、甘味剤、香料及び芳香剤、保存剤及び酸化防止剤も組成物中に存在できる。
製薬上許容できる酸化防止剤の例には、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性酸化防止剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど、（３）金属キレート剤、例えばくえん酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビット、酒石酸、燐酸などが包含される。
本発明の処方物は、経口、経鼻、局所（口腔及び舌下を含めて）、直腸、膣及び（又は）非経口投与に好適なものを包含する。これらの処方物は、単位投薬形態で具合良く提供でき、医薬品分野で周知の任意の方法により製造することができる。単位投薬形態を生じさせるためにキャリアー材料と混合できる活性成分の量は、処理する宿主、特定の投与方法によって変動する。単位投薬形態を生じさせるためにキャリアー材料と混合できる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じさせる化合物のそういう量である。一般に、１００％からみて、この量は約１％〜約９９％の活性成分、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の活性成分の範囲にある。
これらの処方物又は組成物を製造するための方法は、本発明の化合物をキャリアー及び随意の１種以上の補助成分と会合させる工程を包含する。一般に、処方物は、本発明の化合物を液状キャリアー又は微細状の固体キャリアー又はこれらの両者と均質に且つ緊密に会合させ、次いで必要ならば生成物を賦形させることによって製造される。
経口投与に好適な本発明の処方物は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、ロゼンジ（風味付けベース、例えばサッカロース及びアカシア又はトラガンタを使用）、粉末、顆粒の形態で、或いは水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、或いは水中油型又は油中水型液状エマルジョンとして、或いはエレキシル又はシロップとして、或いは香錠（不活性ベース、例えばゼラチン及びグリセリン、又はサッカロース及びアカシアを使用）として及び（又は）口腔洗浄液などであって、それぞれ活性成分として本発明の化合物を所定量で含有するものであることができる。また、本発明の化合物はボーラス、舐剤又はペーストとして投与することができる。
本発明の経口投与用の固形投薬形態（カプセル、錠剤、ピル、糖剤、粉末、顆粒など）では、活性成分は、１種以上の製薬上許容できるキャリアー、例えば、くえん酸ナトリウム若しくは燐酸二カルシウム及び（又は）下記のいずれか：（１）充填剤又は増量剤、例えばでんぷん、ラクトース、サッカロース、グルコース、マンニット及び（又は）珪酸、（２）結合材、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、サッカロース及び（又は）アカシア、（３）保湿剤、例えばグリセリン、（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカでんぷん、アルギン酸、ある種の珪酸塩及び炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン、（６）吸収促進剤、例えば第四アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセリンモノステアレート、（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイトクレー、（９）滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びこれらの混合物、（１０）着色剤と混合される。カプセル、錠剤及びピルの場合には、製薬組成物は、緩衝剤も含むことができる。類似のタイプの固形組成物は、ラクトース又は乳糖のような賦形剤並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用する軟質及び硬質ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用できる。
錠剤は、１種以上の補助成分と共に圧縮又は成形によって製造することができる。圧縮錠剤は、結合材（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、でんぷんグリコール酸ナトリウム又は架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性又は分散剤を使用して製造することができる。成形錠剤は、加湿した粉末状化合物と不活性液体希釈剤との混合物を適当な機械で成形することによって製造することができる。
本発明の製薬組成物の錠剤及びその他の固形投薬形態、例えば糖剤、カプセル、ピル及び顆粒は、要すれば、被覆及び外殻、例えば腸用被覆及び製薬処方分野において周知のその他の被覆で得ることができ又は調製することができる。また、それらは、例えば、所望の放出プロフィルを与えるように割合を変えてヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他の重合体マトリックス、リプソーム及び（又は）マイクロスフェアーを使用して活性成分の遅延された又は制御された放出を与えるように処方することもできる。それらは、例えば、細菌保持性フィルターによるろ過により、又は使用直前に無菌水若しくはその他の無菌注射可能媒体に溶解できる無菌固形組成物の形で滅菌剤を配合することによって滅菌することができる。これらの組成物は随意に不透明剤も含有でき、またこれらが活性成分のみを又は優先的に、胃腸器官のある部分で、場合により遅延された態様で放出させるような組成物であることができる。使用できる包封用組成物の例は重合体物質及びワックスを包含する。また、活性成分は、適当ならば、上記した賦形剤の１種以上によりマイクロカプセル化された形態であることができる。
本発明の化合物の経口投与用の液状投薬形態は、製薬上許容できるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを包含する。液状投薬形態は、活性成分に加えて、斯界で普通に使用される不活性希釈剤、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、グラウンドナッツ油、コーンオイル、胚芽油、オリーブ油、ひまし油及びゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアリール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、これらの混合物を含有することができる。
不活性希釈剤以外に、経口投与用組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、風味料、着色剤、香料及び保存剤のような補助剤も含有することができる。
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビット及びソルビタンエステル、微結晶質セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガンタ並びにこれらの混合物を含有することができる。
ステロール例えばコレステロールは、シクロデキストリンと複合体を形成することが知られている。従って、インヒビターがステロイド性アルカロイドである好適具体例において、それを、シクロデキストリン例えばα−、β−及びγ−シクロデキストリン、ジメチル−βシクロデキストリン及び２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンと配合させることができる。
直腸又は膣投与用の本発明の製薬組成物の処方物は坐薬として提供でき、これは本発明の１種以上の化合物を、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、座薬用ワックス又はサリチル酸エステルを含む１種以上の好適な非刺激性賦形剤又はキャリアーであって、室温で固体であるが体温で液状であり、従って直腸又は膣内で溶融して活性なヘッジホッグアンタゴニストを放出するものと混合することによって製造することができる。
膣に投与するのに好適な本発明の処方物は、斯界で適切であることが知られているようなキャリアーを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー処方物も包含する。
本発明の化合物の局所又は経皮投与のための投薬形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を包含する。活性成分は、製薬上許容できるキャリアーと、要求されるかもしれない任意の保存剤、緩衝剤又は吸入剤とを無菌条件下で混合することができる。
軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本発明の活性成分に加えて、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、でんぷん、トラガンタ、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルク、酸化亜鉛及びこれらの混合物のような賦形剤を含有することができる。
粉末及びスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム、ポリアミド粉末及びこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有することができる。スプレーは、さらにクロルフルオル炭化水素や、ブタン及びプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような慣用の発射剤を含有することができる。
経皮用パッチは、皮膚に対する本発明の化合物の制御された送出を提供するという付加的な利点を有する。このような投薬形態は、ヘッジホッグアンタゴニストを適切な媒質に溶解又は分散することによって製造することができる。皮膚を介するヘッジホッグアンタゴニストの流れを増大させるために吸収向上剤を使用することができる。このような流れの速度は、速度制御膜を備えるか又は化合物を重合体マトリックス若しくはゲルに分散させることによって制御することができる。
眼科用処方物、眼用軟膏、粉末、溶液なども本発明の範囲内にあるものとして意図される。
非経口的投与のために好適な本発明の製薬組成物は、１種以上の本発明の化合物を１種以上の製薬上許容できる無菌で等張性の水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、或いは使用直前に無菌注射可能溶液又は分散液に再構成できる無菌粉末と組合わせて含み、これは酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤や、処方物を意図された受容体の血液により又は懸濁若しくは増粘剤により等張性にさせる溶質を含有することができる。
本発明の製薬組成物に使用できる好適な水性及び非水性キャリアーの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びこれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能有機エステルが包含される。適切な流動性は、例えば、レシチンのような被覆材を使用して、分散液の場合には所要の粒度を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって保持することができる。
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助剤を含有することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤及び抗菌剤、例えば、パラベン、クロルブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含有させることによって確実にすることができる。また、糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を組成物中に含有させることが望ましいであろう。更に、注射可能な製薬形態の持続された吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる剤を含有させることによりもたらすことができる。
ある場合には、薬物の効果を持続させるために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水溶解度が劣った結晶質又は非晶質材料の液状懸濁液を使用することにより達成することができる。この場合に、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、後者も結晶寸法及び結晶形態に依存しよう。別法として、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油性ビヒクルに溶解又は懸濁させることにより達成される。
注射可能なデポー剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性重合体中の主題化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成させることにより製造される。薬物対重合体の比率及び使用された特定の重合体の種類に応じて、薬物の放出速度は制御することができる。その他の生分解性重合体の例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が包含される。また、デポー剤注射可能処方物も薬物を体の組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルジョン中に包封することによって製造される。
本発明の化合物が人及び動物に薬剤として投与されるときは、それらは、それ自体で又は例えば０．１〜９９．５％（更に好ましくは０．５〜９０％）の活性成分を製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて含有する製薬組成物として与えることができる。
本発明の化合物の動物飼料への添加は、好ましくは、活性化合物を有効量で含有する適当な供給プレミックスを製造し、このプレミックスを配合して完全な糧食にすることによって達成される。
別法として、活性成分を含有する中間濃厚物又は供給補充物を飼料に配合することができる。このような供給プレミックス及び完全糧食を製造し投与できる方法は、参照文献（例えば、“応用動物栄養”（Ｗ．Ｈ．フリーマン他、サンフランシスコ、１９６９）又は“家畜飼料及び飼育”（Ｏ−Ｂブックス、コーバリス、オレゴン、１９７７））に記載されている。
ＶＩ．活性アンタゴニストの合成方法及び同定
主題のステロイド性アルカロイド及びその同族体は、Suzuki, Stille等の架橋カップリング技術を用いて容易に調製することができる。これらのカップリング反応は比較的緩やかな条件下で行われ、幅広い「傍観」機能性を許容することができる。
ａ．組み合わせライブラリー
本発明の化合物、特に様々な置換基の代表的なクラスを有する変異体のライブラリーは、組み合わせ化学及び他の並行合成方法で扱いやすい（例えばＰＣＴＷＯ９４／０８０５１）。従って、ヘッジホッグアンタゴニストになりうる先導化合物を同定するために、並びに先導化合物の特異性、毒性及び／又は細胞毒性−速度プロファイルを細かに区別するために、関連化合物の大型ライブラリー、例えば上記した化合物の多様性ライブラリーを高処理量アッセイにおいて迅速にスクリーンする。例えば、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進のいずれかを有する細胞を用いるアッセイなどの、ｐｔｃ、ヘッジホッグ又はスムースンド対生物活性アッセイを用いて、ｐｔｃに対するアゴニスト活性あるいはヘッジホッグ又はスムースンドに対するアンタゴニスト活性を有するものについて、主題の化合物のライブラリーをスクリーンすることができる。
本発明に用いるための組み合わせライブラリーの例として、望ましい特性に関して一緒にスクリーンすることのできる、化学的に関連する化合物の混合物が挙げられる。一つの反応において多くの関連化合物の調製することで、実施すべきスクリーニングの回数を減少し単純化する。適当な物理的特性についてのスクリーニングは、従来法によって行うことができる。
ライブラリーにおける多様性は、様々に異なるレベルで作成することができる。例えば、組み合わせ反応に用いられる基質アリール基は、中心となるアリール基について（例えば環状構造について）多様性を与えることができ、及び／又は他の置換基について変えることもできる。
例えば主題のヘッジホッグアンタゴニストなどの小さな有機分子の組み合わせライブラリーを作成する技術に、様々な方法を用いることができる［例えばBlondelle他（１９９５）Trends Anal. Chem.１４：８３；Affymax、米国特許第５，３５９，１１５号及び第５，３６２，８９９号；Ellman、米国特許第５，２８８，５１４号；Still他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８０５１；ArQule、米国特許第５，７３６，４１２号及び第５，７１２，１７１号；Chen他（１９９４）JACS１１６：２６６１；Kerr他（１９９３）JACS１１５：２５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１００９２、ＷＯ９３／０９６６８及びＷＯ９１／０７０８７；並びにLerner他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２参照］。従って、約１００〜１，０００，０００以上の主題のヘッジホッグアンタゴニストの多様体（diversomer）の、様々なライブラリーを合成し、特定の活性又は特質についてスクリーンすることができる。
例証的な態様において、多様体となりうるヘッジホッグアンタゴニストのライブラリーを、Still他（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８０５１）に記載の方法に適応させた計画を用いて合成することができる。例えば、アンタゴニスト候補又は合成中間体の置換基の位置の一つに位置させることのできる、加水分解可能な又は光分解可能な基によって重合体ビーズに連結する。Still他の方法によると、ライブラリーは一連のビーズ上で合成される（各ビーズはビーズ上の特定の多様体を同定する標識セットを含む）。次いでビーズライブラリーを、ヘッジホッグアンタゴニストが探されるｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の細胞とともに「培養」することができる。多様体は、例えば加水分解によってビーズから放出することができる。
本発明において有用な化合物の構造は、それら自身、容易に、効率的な合成に役立つ。式Ｉ及びＩＩにより一般的に記載されたこれらの構造の性質は、かかる化合物のコンビナトリアルアセンブリを、上記のＡｒ、Ｒ1、Ｘ、Ｙ及びＺ部分のある組合せを用いて可能にする。例えば、これらのサブユニットを一般的なアシル化又はアルキル化反応によってコアリングに結合させることができる。かかる反応の大部分は、図１１、１２、１５及び１６に描いたものを含み、極めて温和で且つ極めて確実であり、従って、コンビナトリアルケミストリーに完全に適している。かかるコンビナトリアルアプローチは、下記の経路の一つに対する変法を採用することができる。
上記及び関連の経路についての様々な改変によって、ヘッジホッグ機能を阻止する能力について試験される化合物の様々なライブラリーを合成することができる。
本発明の典型的化合物の製造
ａ．合成反応式の例
本発明の方法及び組成物に有用なヘッジホッグアンタゴニストを発生させるための合成反応式の例を図１〜３１に示す。
例示した図１〜３１の反応式における反応条件は以下の通りである。
１）R1CH2CN,NaNH2,トルエン
(Arzneim-Forsch 1990,40,11,1242)
２）H2SO4,H2O,還流
(Arzneim-Forsch 1990,40,11,1242)
３）H2SO4,EtOH,還流
(Arzneim-Forsch 1990,40,11,1242)
４）NaOH,EtOH,還流
５）(Boc)2O,2M NaOH,THF
６）LiHDMS,R1X,THF
(メルク,特許出願WO96/06609)
７）Pd-C,H2,MeOH
８）t-BuONO,CuBr,HBr,H2O
(J.Org.Chem.1977,42,2426)
９）ArB(OH)2,Pd(PPh3)4,ジオキサン
(J.Med.Chem.1996,39,217-223)
１０）R12(H)C=CR13R14,Pd(OAc)2,Et3N,DMF
(Org.React.1982,27,345)
１１）Tf2O,THF
(J.Am.Chem.Soc.1987,109,5478-5486)
１２）ArSnBu3,Pd(PPh3)4,ジオキサン
(J.Am.Chem.Soc.1987,109,5478-5486)
１３）KMnO4,Py,H2O
(J.Med.Chem. 1996,39,217-223)
１４）NaOR1,THF
１５）NaSR1,THF
１６）HNR1R13,THF
１７）HONO,NaBF4
(Adv.Fluorine Chem.1965,4,1-30)
１８）Pd(OAc)2,NaH,DPPF,PhCH3,R1OH
(J.Org.Chem.1977,62,5413-5418)
１９）i.R1X,Et3N,CH2Cl2,ii.R13X
２０）SOCl3,触媒DMF
２１）CH2N2,Et2O
２２）Ag2O,Na2CO3,Na2S2O3,H2O
(Tetrahed.Lett.1979,2667)
２３）AgO2CPh,Et3N,MeOH
(Org.Synth.1970,50,77;J.Am.Chem.Soc.1987,109,5432)
２４）LiOH,THF-MeOH
２５）(EtO)2P(O)CH2CO2R,BuLi,THF
２６）MeO2CCH(Br)=P(Ph)3,ベンゼン
２７）KOH又はKOtBu
２８）塩基,X(CH2)nCO2R
２９）DPPA,Et3N,トルエン
(Synthesis 1985,220)
３０）HONO,H2O
３１）SO2,CuCl,HCl,H2O
(Synthesis 1969,1-10,6)
３２）ロウエッソン試薬,トルエン
(Tetrahed.Asym.1996,7,12,3553)
３３）R2M,溶媒
３４）30%H2O2,氷CH3CO2H
(Helv.Chim.Acta.1968,349,323)
３５）トリホスゲン,CH2Cl2
(Tetrahed.Lett.1996,37,8589)
３６）i,(EtO)2P(O)CHLiSO2Oi-Pr,THF,ii,NaI
３７）Ph3PCH3I,NaCH2S(O)CH3,DMSO
(Synthesis 1987,498)
３８）Br2,CHCl3又は他の溶媒
(Synthesis 1987,498)
３９）BuLi,Bu3SnCl
４０）ClSO2OTMS,CCl4
(Chem.Ber.1995,128,575-580)
４１）MeOH-HCl,還流
４２）LAH,Et2O又はLiBH4,EtOH又はBH3-THF
(Tetrahed.Lett.1996,37,8589)
４３）MsCl,Et3N,CH2Cl2
(Tetrahed.Lett.1996,37,8589)
４４）Na2SO3,H2O
(Tetrahed.Lett.1996,37,8589)
４５）R2R4NH,Et3N,CH2Cl2
４６）R2M,溶媒
４７）CH3NH(OCH3),EDC,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
(Tetrahed.Lett.1981,22,3815)
４８）MeLi,THF
４９）mCPBA,CH2Cl2
５０）HONO,Cu2O,Cu(NO3)2,H2O
(J.Org.Chem.1977,42,2053)
５１）R1M,溶媒
５２）HONO,NaS(S)COEt,H2O
(Org.Synth.1947,27,81)
５３）HSR2又はHSR4,CH2Cl2
５４）i-BuOC(O)Cl,Et3N,NH3,THF
５５）R2N4NH,CH2Cl2,NaBH(OAc)3
５６）R2N4NH,MeOH/CH3CO2H,NaBH3CN
５７）R2OH,EDC,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
５８）R2OH,HBTU,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
５９）R2N4NH,EDC,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
６０）R2N4NH,HBTU,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
６１）POCl3,Py,CH2Cl2
６２）R2R4NCO,溶媒
６３）R2OC(O),Et3N,溶媒
６４）R2CO2H,EDC又はHBTU,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
６５）R2X,Et3N,溶媒
６６）(CH3S)2C=N(CN),DMF,EtOH
(J.Med.Chem.1994,37,57-66)
６７）R2SO2Cl,Et3N,CH2Cl2
６８）R2-又はR3-又はR4-CHO,MeOH/CH3CO2H,NaBH3CN
(Synthesis 1975,135-146)
６９）Boc(Tr)-D又はL-CysOH,HBTU,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
７０）Boc(Tr)-D又はL-CysH,NaBH3CN,MeOH/CH3CO2H
(Synthesis 1975,135-146)
７１）S-Tr-N-Bocシステイナル,ClCH2CH2Cl又はTHF,NaBH(OAc)3
(J.Org.Chem.1996,61,3849-3862)
７２）TFA,CH2Cl2,Et3SiH又は(3:1:1)チオアニソール/エタンジチオール/DMS
７３）TFA,CH2Cl2
７４）DPPA,Et3N,トルエン,HOCH2CH2SiCH3
(Tetrahed.Lett.1984,25,3515)
７５）TBAF,THF
７６）塩基,TrSH又はBnSH
７７）塩基,R2X又はR4X
７８）R3NH2,MeOH/CH3CO2H,NaBH3CN
７９）N2H4,KOH
８０）Pd2(dba)3,P(o-tol)3,RNH2,NaOtBu,ジオキサン,R1NH2
(Tetrahed.Lett.1996,37,7181-7184)
８１）シアナミド
８２）Fmoc-Cl,重炭酸ナトリウム
８３）BnCOCl,炭酸ナトリウム
８４）アリルOCOCl,ピリジン
８５）臭化ベンジル、塩基
８６）塩化オキサリル,DMSO
８７）RCONH2
８８）カルボニルジイミダゾール,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン)
８９）チオカルボニルジイミダゾール,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン)
９０）臭化シアン,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン)
９１）RCOCl,トリエチルアミン
９２）RNHNH2,EDC
９３）RO2CCOCl,Et3N,DCM
９４）MsOH,ピリジン
(J.Het.Chem.1980,607)
９５）塩基,中性溶媒(例えば,DCM,トルエン,THF)
９６）H2NOR,EDC
９７）RCSNH2
９８）RCOCHBrR,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン)
(Org.Proc.Prep.Intl.1992,24,127)
９９)CH2N2,HCl
(Synthesis,1993,197)
１００）NH2NHR,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン)
１０１）RSO2Cl,DMAP
(Tetrahed.Lett.1993,34,2749)
１０２）Et3N,RX
(J.Org.Chem.1990,55,6037)
１０３）NOCl又はCl2
(J.Org.Chem.1990,55,3916)
１０４）H2NOH,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン)
１０５）RCCR,中性溶媒(DCM,THF,トルエン)
１０６）RCHCHR,中性溶媒(DCM,THF,トルエン)
１０７）H2NOH,HCl
１０８）チオカルボニルジイミダゾール,SiO2又はBF3OEt2
(J.Med.Chem.1996,39,5228)
１０９)チオカルボニルジイミダゾール,DBU又はDBN
(J.Med.Chem.1996,39,5228)
１１０)HNO2,HCl
１１１）ClCH2CO2Et
(Org.Reactions,1959,10,143)
１１２）モルホリンエナミン
(Eur.J.Med.Chem.1982,17,27)
１１３）RCOCHR'CN
１１４）RCOCHR'CO2Et
１１５）Na2SO3
１１６）H2NCHRCO2Et
１１７）EtO2CCHRNCO
１１８）RCNHNH2
１１９)RCOCO2H
(J.Med.Chem.1995,38,3741)
１２０）RCHO,KOAc
１２１）2-フルオルニトロベンゼン
１２２）SnCl2,EtOH,DMF
１２３）RCHO,NaBH3CN,HOAc
１２４）NH3,MeOH
１２５）2,4,6-Me3PhSO2NH2
１２６）Et2NH,CH2Cl2
１２７）MeOC(O)Cl,Et3N,CH2Cl2
１２８）R2NH2,EDC,HOBT,Et3N,CH2Cl2
１２９) DBU,PhCH3
１３０）BocNHCH(CH2STr)CH2NH2,EDC,HOBT,Et3N,CH2Cl2
１３１）R2NHCH2CO2Me,HBTU,HOBT,Et3N,CH2Cl2
１３２）BocNHCH(CH2STr)CH2OMs,LiHMDS,THF
１３３）R2NHCH2CO2Me,NaBH(OAc)3,ClCH2CH2Cl又はTHF
１３４）R2NHCH2CH(OEt)2,HBTU,HOBT,Et3N,CH2Cl2
１３５）NaBH(OAc)3,ClCH2CH2Cl又はTHF,AcOH
１３６）ピペリジン,DMF
１３７）Pd(Ph3P)4,Bu3SnH
１３８）RCO2H,EDC,HOBT,Et3N,DCM
１３９）RNH2,中性溶媒
１４０）RCHO,NaBH3CN,HOAc
１４１）RNCO,溶媒
１４２）RCO2H,EDC又はHBTU,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
１４３）RCOCl,トリエチルアミン
１４４）RSO2Cl,Et3N,CH2Cl2
１４５）SnCl2,EtOH,DMF
１４６）RNH2,EDC,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
１４７）ジブロムメタン,Et3N,CH2Cl2
１４８）塩化オキサリル,中性溶媒
１４９）LiOH,THF-MeOH
１５０）カルボニルジイミダゾール,中性溶媒(例えば,DCM,DMF,THF,トルエン)
１５１）RNH2,Et3N,CH2Cl2
１５２）塩基,RX
１５３）DBU,PhCH3
１５４）DPPA,Et3N,トルエン
(Synthesis 1985,220)
１５５）SOCl2,触媒DMF
１５６）ArH,ルイス酸(AlCl3,SnCl4,TiCl4),CH2Cl2
１５７）H2NCHRCO2Et,中性溶媒
１５８）BocHNCHRCO2H,EDC又はHBTU,HOBt,DIEA,CH2Cl2又はDMF
１５９）TFA,CH2Cl2
ｂ．スクリーニングアッセイ
化合物が、ｐｔｃ機能を代行し又はスムースンド若しくはヘッジホッグ機能に拮抗する能力を有するかどうかを調べるのに、様々なアッセイを用いることができるが、その多くは高処理量フォーマットで処理することができる。化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムにおいて、所定の期間中に生存する化合物の数量を最大化するために、高処理量アッセイを用いるのが望ましい。従って、合成及び天然生産物のライブラリーから、ヘッジホッグアンタゴニストである他の化合物について見本をとることができる。
細胞を含まないアッセイに加えて、細胞に基づくアッセイで試験化合物を試験することもできる。一つの態様において、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進表現型を有する細胞を、例えば試験剤の存在下における細胞増殖阻害剤について評価するアッセイで、目的の試験剤に接触させることができる。
多くの遺伝子産物が、パッチト媒介シグナル変換（パッチト、cubitus interruptus（ｃｉ）の転写因子、セリン／トレオニンキナーゼであるfused（ｆｕ）並びにcostal−２、スムースンド及びsuppressor of fusedの遺伝子産物）において関連づけられている。
ヘッジホッグ蛋白質による細胞の誘導は、下流エフェクターの活性化及び阻害に関与する一連の事象を推進し、その結果、ある場合においては遺伝子の転写又は翻訳における検出可能な変化に至る。ヘッジホッグ媒介シグナリングの転写標的となりうるものしては、パッチト遺伝子（Hidalgo及びIngham、１９９０ Development１１０、２９１−３０１；Marigo他、１９９６）及びショウジョウバエ科cubitus interruptus遺伝子の脊椎動物相同体、ＧＬＩ遺伝子（Hui他（１９９４）Dev Biol１６２：４０２−４１３）が挙げられる。パッチト遺伝子発現は、Ｓｈｈ応答性の肢芽及び神経板の細胞を誘発することが示されている（Marigo他（１９９６）PNAS９３：９３４６−５１；Marigo他（１９９６）Development１２２：１２２５−１２３３）。Ｇｌｉ遺伝子は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合領域を有する推定転写因子をコードする（Orenic他（１９９０）Genes & Dev４：１０５３−１０６７；Kinzler他（１９９０）Mol Cell Biol１０：６３４−６４２）。Ｇｌｉ遺伝子の転写は肢芽のヘッジホッグに応答してアップレギュレーションを受ける一方、Ｇｌｉ３遺伝子の転写はヘッジホッグ誘導に応答してダウンレギュレーションを受けることが報告されている（Marigo他（１９９６）Development１２２：１２２５−１２３３）。ヘッジホッグシグナリングに応答する遺伝子のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを引き起こす転写調節配列を、そのような標的遺伝子（例えばパッチト又はＧｌｉ遺伝子）から選択し、そのようなプロモーターをレポーター遺伝子に操作可能に連結することによって、特異な試験化合物の有するヘッジホッグ媒介シグナリング経路を改変する能力に対して感度の高い、転写に基づくアッセイを作成することができる。従って、レポーター遺伝子の発現は、ヘッジホッグのアンタゴニストとして作用する化合物の開発に有用なスクリーニング手段を提供する。
本発明のレポーター遺伝子に基づくアッセイは、上記した一連の事象の最終段階、例えば転写調節を測定する。従って、アッセイの一つの態様の実施において、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進、スムースンド機能亢進に依存する検出シグナルの発生又はＳＨＨ自体の刺激を得るために、レポーター遺伝子構造体を標的細胞内に挿入する。レポーター遺伝子からの転写量は、当業者に好適と知られる方法を用いて測定することができる。例えば、レポーター遺伝子からのｍＲＮＡ発現は、リボヌクレアーゼ保護又はＲＮＡに基づくＰＣＲを用いて検出することができ、あるいはレポーター遺伝子の蛋白質産物は、特徴染色又は固有の生物学的活性によって同定することができる。次いでレポーター遺伝子からの発現量を、試験化合物の非存在下において同じ細胞内で発現された量、または実質的に同一だが標的受容体蛋白質を有さない細胞内での転写量のいずれかと比較する。統計的な又は有意な転写量の減少は、試験化合物がある程度正常なｐｔｃシグナルを作動させた（又は機能亢進ヘッジホッグ又はスムースンドシグナルに拮抗した）こと、例えば試験化合物が潜在的なヘッジホッグアンタゴニストであることを意味する。
ＶＩＩ．業務的方法
本発明の一つの面は、患者(好ましくは、ヒト)における基底細胞癌を治療し又は予防するための、ヘッジホッグアンタゴニスト(例えば、ここに記載のもの)を、基底細胞癌の治療又は予防のための配合物の利用及び適宜、可能な副作用及び薬物間相互作用又は薬物−食品相互作用の警告を記載している説明書(書面及び／又は絵入り)と共に含むキットに関係する。
本発明の他の面は、ヘッジホッグアンタゴニスト(例えば、ここに記載のもの){該ヘッジホッグアンタゴニストは、上記のような治療又は化粧用途(例えば、神経組織の調節、骨及び軟骨の形成及び修復、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝臓その他の原腸から生じる器官の調節、造血機能の調節、並びに皮膚及び毛の成長の調節)の部分として、患者(好ましくは、ヒト)に投与される}を、治療又は予防のための適用及び適宜、可能な副作用及び薬物間相互作用又は薬物−食品相互作用の警告を記載している説明書(書面及び／又は絵入り)と共に含む当該キットに関係する。
この発明は、更に、(ａ)無菌の医薬用賦形剤及びヘッジホッグアンタゴニストを含む医薬調製物の製造；及び(ｂ)健康管理供給者(例えば、医師、病院、医院など)の市場に、基底細胞癌の治療又は予防にこの医薬製剤を利用することの利益を供する{例えば、促進的及び／又は教育的提示(ディスプレー、テレマーケティング及び講義など)、製品(試作品など)及び／又は資料(ちらし広告、パンフレット、ウェブサイト、ポスターなどを含む)を与える}ことを含む医薬事業を実施する方法を企図している。
本発明の他の面は、(ａ)無菌の医薬用賦形剤及びヘッジホッグアンタゴニストを含む医薬調製物の製造；及び(ｂ)健康管理供給者(例えば、医師、病院、医院など)の市場に、治療又は化粧適用(例えば、神経組織の調節、骨及び軟骨の形成及び修復、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝臓その他の原腸から生じる器官の調節、造血機能の調節、並びに皮膚及び毛の成長の調節)の部分としてこの医薬製剤を利用することの利益を供する{例えば、促進的及び／又は教育的提示(ディスプレー、デモンストレーション、テレマーケティング及び講義など)、製品(試作品など)及び／又は資料(ちらし広告、パンフレット、ウェブサイト、ポスターなどを含む)を与える}ことを含む医薬事業を実施する方法に関係する。
この発明の他の面は、医薬事業を実施する方法を提供し、該方法は、(ａ)無菌の賦形剤とヘッジホッグアンタゴニストを含む医薬組成物の販売のための配給ネットワークを用意すること；及び(ｂ)基底細胞癌の治療又は予防のためにこの医薬製剤を使用するための患者又は医師に対する指示材料を用意することを含む。
この発明の他の面は、医薬事業を実施する方法を提供し、該方法は、(ａ)無菌の賦形剤とヘッジホッグアンタゴニストを含む医薬組成物の販売のための配給ネットワークを用意すること；及び(ｂ)上記のような治療又は化粧適用(例えば、神経組織の調節、骨及び軟骨の形成及び修復、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝臓その他の原腸から生じる器官の調節、造血機能の調節、並びに皮膚及び毛の成長の調節)の部分としてこの医薬製剤を使用するための患者又は医師に対する指示材料を用意することを含む。
この発明の他の面は、医薬事業を実施する方法を提供し、該方法は、(ａ)基底細胞癌の治療又は予防のための適当な医薬製剤及びヘッジホッグアンタゴニストの投薬量を決定し；(ｂ)その医薬組成物の動物における効力及び毒性についての治療的プロファイリングを行ない；(ｃ)許容しうる治療プロフィルを有する医薬組成物を販売するための配給ネットワークを用意し；そして適宜(ｄ)この製剤の販売グループを健康管理供給者市場に供給することを含む。
この発明の他の面は、医薬事業を実施する方法を提供し、該方法は、上記の医学的又は化粧の異常を治療し又は予防するための適当な医薬製剤及びヘッジホッグアンタゴニストの投薬量を決定し；(ｂ)該異常の治療又は予防中にその医薬組成物の動物における効力及び毒性についての治療的プロファイリングを行ない；(ｃ)該異常の治療又は予防のための許容しうる治療プロフィルを有する医薬組成物を販売するための配給ネットワークを用意し；そして適宜(ｄ) この製剤の販売グループを該異常の治療又は予防のための健康管理供給者市場に供給することを含む。
この発明の更に別の面は、医薬事業を実施する方法を提供し、該方法は、(ａ)基底細胞癌の治療又は予防のための適当な医薬組成物及びヘッジホッグアンタゴニストの量を決定し；及び(ｂ)第三者にこの医薬組成物の更なる開発及び販売の権利の許諾をすることを含む。
この発明の更に別の面は、医薬事業を実施する方法を提供し、該方法は、(ａ)上記の医学的及び化粧の異常の治療又は予防のための適当な医薬組成物及びヘッジホッグアンタゴニストの量を決定し；及び(ｂ) 第三者に該異常の治療又は予防のためのこの医薬組成物の更なる開発及び販売の権利の許諾をすることを含む。
典型例
この発明を今から一般的に記載するが、それは、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう。該実施例は、単に本発明のある面及び具体例の説明目的のために含むものであり、この発明を制限することを意図するものではない。
実験
代表的インヒビターの合成
Figure 2005507860
一般的方法。別途指示しない限り、すべての反応は、オーブン乾燥したグラスウール中でＨＰＬＣ等級溶媒を用いておこなった。化合物の精製は、５％Ｅｔ3Ｎ(Flash Column Chromatography)で非活性化したシリカゲル４０−６３ｕ ６０Ａ又はJones Chromatography Flash Master 11を用いて行なった。薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)を、Kieselgel 60 F254(Merck)プレート上で行なった。1Ｈ−ＮＭＲを、Bruker 300 ＮＭＲ分光器を用いて測定した(内部標準としての重水素化溶媒中で)。低分解マススペクトルデータが、Micromassplatform LCZにて得られた。Hewlett-Packard 1100を用いて、純度(ＬＣスペクトル)を決定した。
２−クロロ−５−ニトロ−Ｎ−(２−ニトロ−フェニル)ベンズアミド １。ＣＨ2Ｃｌ2(９０ｍｌ)中の２−ニトロ−フェニルアミン(１５．００ｇ、１０９ｍモル)の溶液に、ピリジン(４３ｍｌ、２．８６容)を室温で加えてから、ＣＨ2Ｃｌ2(１００ｍｌ)中に、０℃で４５分間にわたって溶解させた２−クロロ−４−ニトロ−ベンゾイルクロリド(２７．４０ｇ、１２５ｍモル)を滴下した。この反応混合物を３時間室温で攪拌した。一度反応が完結したならば(ＬＣＭＳでモニター)、粗混合物を乾燥するまで蒸発させた。得られた褐色の粗残留物を酢酸エチル中にスラリー化し、濾過して表題の化合物を黄色の固体として与えた(３３ｇ、９４％)：1Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)δ１０．９１(ｓ、１Ｈ)、８．８５(ｄｄ、１Ｈ)、８．５３(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、８．２８−８．２１(ｍ、２Ｈ)、７．７０(ｄｄ、１Ｈ)、７．６４(ｄ、１Ｈ)、７．２５(ｄｄ、１Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：３６３[Ｍ+＋１＋４１]及び３２２[Ｍ+＋１]。
３−(１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル)−４−クロロ−フェニルアミン ２。鉄粉(１５．４２ｇ、２８０ｍモル)を、トルエン(１２５ｍｌ)及び酢酸(６０ｍｌ)中のアミド １(１５．００ｇ、４６．７ｍモル)の溶液に加えた。この混合物を、約１時間にわたって、１２５℃に加熱し(反応の完結は、ＬＣＭＳでモニターした)、その結果生成した粗混合物をコットンウールプラグを通して濾過した(鉄粒子の除去のため)。この粗溶液を蒸発乾燥させ、ＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3で洗ってからブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。その結果生成した褐色の固体を、ＣＨ2Ｃｌ2に再溶解させ、数滴のヘキサンを加えて固体を形成し、それを、濾過により分離して２(５．６６ｇ、４２％)をベージュの固体として与えた：1Ｈ ＮＭＲ(ＣＤ3ＯＤ)δ７．６４(ブロード ｓ、２Ｈ)、７．３０−７．２６(ｍ、３Ｈ)、７．１３(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、６．８４(ｄｄ、１Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：２４４[Ｍ+＋１]。
尿素３の合成。ピリジン(０．１２ｍｌ、１．４１ｍモル)を、ＣＨ2Ｃｌ2(３．０ｍｌ)中のアミン２(３００ｍｇ、１．２３ｍモル)の溶液に加えた。ＣＨ2Ｃｌ2(４．０ｍｌ)中の３，５−ジメトキシフェニルイソシアネート(２５３ｍｇ、１．４１ｍモル)の溶液を０℃で滴下して加え、３時間室温に置いた(反応の完結は、ＬＣＭＳでモニターした)。クエン酸の１Ｍ 溶液を加えて反応を静め、有機層を分離して、蒸発乾燥させた。この粗混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3で洗ってからブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。その結果生成した粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、勾配溶出)により精製して、３(４０ｍｇ、８％)を与えた：1Ｈ ＮＭＲ(ＣＤ3ＯＤ)δ８．０５(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、７．８２(ｄ、１Ｈ)、７．８１(ｄ、１Ｈ)、７．８０(ブロード ｓ、１Ｈ)、７．６７(ｄ、１Ｈ)、７．４５(ブロード ｍ、２Ｈ)、６．８３(ｓ、１Ｈ)、６．８２(ｓ、１Ｈ)、６．３３(ブロード ｍ、１Ｈ)、３．９１(ｓ、６Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：４２３[Ｍ+＋１]；ＬＣ(１．２２、純度＞９７％)。
アミド４の合成。ＣＨ2Ｃｌ2(４．０ｍｌ)中の３，４，５−トリメトキシベンゾイルクロリド(２７２ｍｇ、１．１８ｍモル)の溶液を、ＣＨ2Ｃｌ2(３．０ｍｌ)中のアミン２(２５０ｍｇ、１．０３ｍモル)の溶液に、０℃で、窒素下で加えた。この反応混合物を、一晩室温で攪拌し続けた(反応の完了を、ＬＣＭＳでモニターした)。その粗混合物を、約４％ＭｅＯＨを含むＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3、ブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥させて、減圧下で濃縮した。その結果生成した粗生成物を、調製用ＬＣにより精製して、４(２５ｍｇ、６％)を無色の固体として与えた：1Ｈ ＮＭＲ(ＣＤ3ＯＤ)δ８．３１(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、７．９８(ｄｄ、１Ｈ)、７．７６−７．７４(ｍ、２Ｈ)、７．６７(ｄ、１Ｈ)、７．４６−７．４４(ｍ、２Ｈ)、７．３４(ブロード ｓ、２Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：４３８[Ｍ+＋１]；ＬＣ(１．１５、純度＞９５％)。
チオウレア５の合成。ピリジン(０．２ｍｌ、２．３６ｍモル)を、ＣＨ2Ｃｌ2(３．０ｍｌ)中のアミン２(２５０ｍｇ、１．０３ｍモル)の溶液に０℃で加えてから、ＣＨ2Ｃｌ2(４．０ｍｌ)中のベンゾジオキサンイソチオシアネート(２２８ｍｇ、１．１８ｍモル)の溶液を滴下して加えた。この反応混合物を一晩室温で攪拌し続けた(反応の完了を、ＬＣＭＳでモニターした)。１Ｍ クエン酸の溶液を、この粗反応混合物に加えて、有機層を分離して、蒸発乾燥させた。この粗固体をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3及びブラインで連続的に洗ってから、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。その結果生成した粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン中の３０−５０％ ＥｔＯＡｃ)により精製して、５(９５ｍｇ、２１％)を淡黄色固体として与えた：1Ｈ ＮＭＲ(ＣＤ3ＯＤ)δ７．７１(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、７．５５(ｄｄ、１Ｈ)、７．５０(ブロード ｓ、２Ｈ)、７．４０(ｄ、１Ｈ)、７．１９−７．１３(ブロード ｍ、２Ｈ)、６．７９(ｓ、１Ｈ)、６．６７(ｓ、２Ｈ)、４．０８(ｓ、４Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：４３８[Ｍ+＋１]；ＬＣ(０．９４１、純度＞９８％)。
スルホンアミド６の合成。ピリジン(０．２０ｍｌ、２．３６ｍモル)を、ＣＨ2Ｃｌ2(３．０ｍｌ)中のアミン２(２５０ｍｇ、１．０３ｍモル)の溶液に０℃で加えてから、ＣＨ2Ｃｌ2(４．０ｍｌ)中のフェニルスルホニルクロリド(０．１５ｍｌ、１．１８ｍモル)を滴下して加えた。この反応混合物を１時間にわたって攪拌した(反応の完了をＬＣＭＳによりモニターした)。１Ｍ クエン酸の溶液をこの粗反応混合物に加え、有機層を分離して、蒸発乾燥させた。その粗固体を、ＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで連続的に洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥させて、減圧下で濃縮した。その結果生成した粗混合物(主として、ｂｉｓ−アルキル化生成物を含む)を、フラッシュクロマトグラフィー(１：３９：６０、ＭｅＯＨ：ＥｔＯＨ：ＥｔＯＡｃ：ヘキサン)により精製して、６(２０ｍｇ、５％)を無色の固体として与えた：１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤ3ＯＤ)δ８．０１−７．９９(ブロード ｄ、２Ｈ)、７．９７(ｄ、１Ｈ)、７．９５(ｄ、１Ｈ)、７．８４(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、７．７６−７．７４(ｍ、４Ｈ)、７．６８(ｄ、１Ｈ)、７．６６(ｄ、１Ｈ)、７．５５(ｄｄ、１Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)３８４[Ｍ+＋１]；ＬＣ(１．１９０、純度＞９９％)。
Figure 2005507860
２−(２−メチル−５−ニトロ−フェニル)−１Ｈ−ベンズイミダゾール７。ベンゼン−１，２−ジアミン(２．６０ｇ、２５ｍモル)及び２−メチル−５−ニトロ安息香酸(５．０ｇ、２７．６ｍモル)を、ポリリン酸(３０ｍｌ、１１容)中に懸濁させて、一晩１４０℃に加熱した。一度反応が完結したならば(ＬＣＭＳでモニター)、緑色の粗混合物を水に溶解させ、ＮａＯＨで塩基性にして(ｐＨ＝１４)、ＥｔＯＡｃ中に抽出した(×２)。その有機層をブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥させて、濾過し、減圧下で濃縮して、７(４．７０ｇ、７４％)を橙色／褐色の固体として与えた：1Ｈ ＮＭＲ(Ｃ2Ｄ6ＳＯ)δ１３．２０(ｓ、１Ｈ)、８．８０(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、８．８４(ｄｄ、１Ｈ)、７．８９−７．８７(ｍ、２Ｈ)、７．７４(ｄ、１Ｈ)、７．４０−７．４５(ｍ ２Ｈ)、２．９０(ｓ、３Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：２５４[Ｍ+＋１]。
３−(１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−４−メチル−フェニルアミン８。鉄粉(３．０ｇ、５０．９ｍモル)を、トルエン(３０ｍｌ)及び酢酸(３０ｍｌ)中のニトロベンズイミダゾール７(４．３０ｇ、１６．９ｍモル)の溶液に加えて、この反応混合物を約１時間にわたって１２５℃に加熱した(反応の完結を、ＴＬＣによりモニターした)。その結果生成した粗混合物を、コットンウールプラグを通して濾過した(鉄粒子を除去するため)。この粗溶液を蒸発乾燥させて、ＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3で洗い(ｐＨ＝７まで)、その水相をＥｔＯＨで逆抽出した。合わせた有機物を、ブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮して、８(２．７０ｇ、７３％)を褐色固体として与えた：1Ｈ ＮＭＲ(Ｃ2Ｄ6ＳＯ)δ１２．５５(ｓ、１Ｈ)、７．７３(ｄ、１Ｈ)、７．５７(ｄ、１Ｈ)、７．１６(ブロード ｍ、２Ｈ)、７．０９(ｄ、１Ｈ)、７．０１(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、６．７０(ｄｄ、１Ｈ)５．１５(ブロード ｓ、２Ｈ)、２．３９(ｓ、３Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：２２４[Ｍ+＋１]。
アミン９の合成。ベンズイミダゾールフェニルアミン８(２５０ｍｇ、１．１２ｍモル)及び３−５−ジメトキシベンゾイルクロリド(２４６ｍｇ、１．２３ｍモル)を、ＣＨ2Ｃｌ2(１０．０ｍｌ)中に懸濁させて、一晩室温で攪拌した。その粗混合物を、ＥｔＯＡｃで希釈してから、クエン酸で洗った。その水相を、ＮａＯＨで塩基性にして、ＥｔＯＡｃ中に抽出した。合わせた有機抽出物を、ブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過して、減圧下で蒸発させて、９を無色の固体として与えた：１Ｈ ＮＭＲ(Ｃ2Ｄ6ＳＯ)δ１２．６５(ｓ、１Ｈ)、１０．３５(ｓ、１Ｈ)、８．１９(ｓ、１Ｈ)、７．８６(ｄ、１Ｈ)、７．７４(ｄ、１Ｈ)、７．６１(ｄ、１Ｈ)、７．３２(ｄ、１Ｈ)、７．４２−７．３２(ｍ、２Ｈ)、７．２０(ｓ、２Ｈ)、６．７９(ｓ、１Ｈ)、３．８９(ｓ、６Ｈ)、２．６１(ｓ、３Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：３８８[Ｍ+＋１]；ＬＣ(１．１９、純度＞９７％)。
アミド１０の合成。ベンズイミダゾールフェニルアミン８(２５０ｍｇ、１．１２ｍモル)及びベンゾジオキサン−４−カルボニルクロリド(２２０ｍｇ、１．２３ｍモル)を、ＣＨ2Ｃｌ2(１０．０ｍｌ)に懸濁させて、一晩室温で攪拌した。この粗混合物をＥｔＯＡｃで希釈してから、クエン酸で洗った。その水相をＮａＯＨで塩基性にし、ＥｔＯＡｃ中に抽出した。合わせた有機抽出物を、ブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、１０を無色の固体として与えた：1Ｈ ＮＭＲ(Ｃ2Ｄ6ＳＯ)δ１２．５５(ｓ、１Ｈ)、１０．４９(ｓ、１Ｈ)、９．０７(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、８．７０(ｄｄ、１Ｈ)、８．２５(ｄｄ、１Ｈ)、８．１５(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、７．７２(ｄｄ、１Ｈ)、７．６４(ｄ、１Ｈ)、７．５２−７．４８(ｍ、１Ｈ)、７．３８(ｄ、１Ｈ)、７．３１(ｄ、１Ｈ)、７．１７−６．９５(ｍ、２Ｈ)、３．２８(ｓ、３Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：３２９[Ｍ+＋１]；ＬＣ(０．８５８、純度＞９７％)。
Figure 2005507860
２−(２−クロロ−５−ニトロ−フェニル)−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−カーボニトリル１２。２−アミノ−４−シアノ−フェニルアミン(０．５ｇ、３．７６ｍモル)及び２−クロロ−４−ニトロ−ベンズアルデヒド(１．３９ｇ、７．５２ｍモル)を、最少量の酢酸に別々に溶解させて、室温で混合した。形成された橙色の固体を濾過し、濾液が無色になるまで酢酸及びヘプタンで洗った。この段階で分離された固体は、中間体１１(６００ｍｇ、４５％)であることが示された：1Ｈ ＮＭＲ(Ｃ2Ｄ6ＳＯ)δ８．９９(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、８．９１(ｓ、１Ｈ)、８．２８(ｄｄ、１Ｈ)、７．８４(ｄ、１Ｈ)、７．５７(ｓ、１Ｈ)、７．３５(ｄｄ、１Ｈ)、６．７５(ｄ、１Ｈ)、６．３６(ｓ、２Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：３０１[Ｍ+＋１]。中間体１１の環化：その結果生成した褐色の固体を酢酸に懸濁させて、６時間にわたって５０℃に加熱した。この粗混合物を、ＥｔＯＡｃで希釈して、ＮａＨＣＯ3溶液で中和し、ブラインで洗って、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮して、１２(２００ｍｇ、９９％)を褐色の固体として与えた：1Ｈ ＮＭＲ(Ｃ2Ｄ6ＳＯ)δ１３．４０(ブロード ｓ、１Ｈ)、８．６６(ａｐｐ ｄ、１Ｈ)、８．３０(ｄｄ、１Ｈ)、８．２０(ｓ、１Ｈ)、７．９０(ｄ、１Ｈ)、７．７６(ｄ、１Ｈ)、７．５０(ｄ、１Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ、ポジティブモード)：２９９[Ｍ+＋１]。
生物学的アッセイ
リード化合物の発見／高スループットスクリーニングアッセイ
試験すべき化合物をＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度に溶解させ、−２０℃に貯蔵する。アッセイする細胞中のヘッジホッグ経路を活性化するために、オクチル化形態の(脂質修飾した)ソニックヘッジホッグタンパク質のＮ末端断片(ＯＣＴ−ＳＨＨ)を利用する。このＮ末端ＳＨＨ断片を、細菌により生成する。例えば、Taylor FR等、Biochemistry 2001, 40, 4359-71参照。
化合物を、細胞株１０Ｔ１／２(ｓ１２)を用いて、「Ｇｌｉ−Ｌｕｃ」アッセイ(下記)で試験することができ、該アッセイでは、これらの細胞は、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として利用するヘッジホッグ応答性レポーター構築物を含んでいる。この方法において、ヘッジホッグ経路のシグナリング活性は、Ｇｌｉ−Ｌｕｃ応答により測定することができる。
１０ｔ１／２(ｓ１２)細胞を、９６ウェルミクロ滴定プレート(ＭＴＰ)中に、２０，０００細胞／ウェルで、完全培地[１０％ ＦＢＳを有するＤＭＥＭ]中に置く。次いで、プレートを、３７℃で、５％ ＣＯ2中での一晩(Ｏ／Ｎ)のインキュベーションのためにインキュベーター内に置く。２４時間後に、培地を、ルシフェラーゼアッセイ用培地(０．５％ ＦＢＳを有するＤＭＥＭ)と置き換える。化合物を、アッセイ用培地中で溶解させて、３：１０００(約３００倍)に希釈し、約０．０００３〜３０μＭの出発濃度とする。
その後、各試料１５０μｌを最初のウェルに加える(三連で)。これらのＭＴＰ試料を、次いで、３倍希釈物に希釈して、７ウェルの全量とし、最終的に、各化合物につき三連の７希釈物の編成とする。次に、このタンパク質リガンドＯＣＴ−ＳＨＨを、ルシフェラーゼアッセイ用培地中で希釈し、各ウェルに終濃度０．３μｇ／ｍｌで加える。次いで、プレートを、３７℃で、５％ ＣＯ2中での、Ｏ／Ｎでの更なるインキュベーションのためにインキュベーターに戻す。約２４時間後に、プレートをインキュベーターから取り出し、培地を吸引／廃棄する。ウェルを、アッセイ用緩衝液[ＰＢＳ＋１ｍＭ Ｍｇ2+及び１ｍＭ Ｃａ2+]で１回洗う。次いで、５０μｌのアッセイ用緩衝液を各ウェルに加える。ルシフェラーゼアッセイ用試薬を、販売者(Packardの LucLiteキット)に記載されたように調製し、５０μｌを各ウェルに加える。プレートを、室温(ＲＴ)で、約３０分間インキュベートし、その後、再びＲＴでＴｏｐｃｏｕｎｔ(Packard)にてシグナルを読む。
類似のアッセイをヒトの細胞株(特に、上記のようにＧｌｉ−Ｌｕｃ構築物で改変したヒト胎児口蓋間充織細胞)を用いて、生育培地ＭＥＭ／ピルビン酸ナトリウムｗ／１０％ＦＢＳ及びアッセイ用培地ＭＥＭ／ピルビン酸ナトリウムｗ／０．５％ＦＢＳにて行なった。ＯＣＴ−ＳＨＨを加えて、終濃度を１μｇ／ｍｌとした。
上記のアッセイで同定された化合物は、図３２に描いてある。
特定の化合物の活性は、下記の表１に与えてある(化合物Ｅ〜Ｖを除いて、ヒトベースのアッセイの結果に基づく活性)：
Figure 2005507860
Figure 2005507860

Figure 2005507860
基底細胞癌(ＢＣＣ)試料に対する化合物の効果
ＢＣＣ培養：幾らかの皮膚間質を含む基底細胞癌の掻爬試料を、器官型培養にて(即ち、空気／液体界面に露出させて)培養する。ＢＣＣ試料をビヒクル(０．８％無菌ＮａＣｌ溶液)又は化合物Ａと共に注射し、培養物をプラスチック製グリッドの上部に集めて最長で３日間にわたって、ヒトの皮膚の長期培養に適した培地中で(化合物を伴って又は伴わないで)インキュベートする。３日間の培養後に、試料を日常的組織学用に処理する。
ＢＣＣの形態学的特徴(例えば、未分化基底細胞の島及び、ある場合には、末梢細胞の柵状化及び間質開裂)は、ＢＣＣをこの系で培養した場合に維持される。ＧＬＩ−１遺伝子(ヘッジホッグシグナリングの枢要なインジケーター)は、未処理培養において高レベルに活性なままでいる(33Ｐ標識ＲＮＡプローブに露出後に測定)。
定量的イン・シトゥーハイブリダイゼーション：簡単にいえば、大きい基底細胞島を含むパラホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋した組織の７μｍの切片を、清浄化し、再水和し、プロテイナーゼＫで消化し、アセチル化して、33Ｐ標識ＲＮＡプローブと一晩ハイブリダイズさせた。高緊縮ハイブリダイゼーション後洗浄の後に、スライドを、暗黒中で、高感度ホスホルイメージャースクリーンに、室温で数時間にわたって露出した。現像後、[33Ｐ]シグナルを、サイクロンスキャナー(Packard)を用いてスキャンした。個々の基底細胞島を選択し、シグナルを定量してＯｐｔｉＱｕａｎｔソフトウェアを用いてＤＬＵ(digital light unit)／ｍｍ2で表示した。対照用値を平均して、１００％に設定し；化合物Ａで処理した試料から得られた値を、対照の％として表した。結果は、図３３に描いてある。
カスパーゼ３ 免疫組織化学。プログラムされた細胞死即ちアポトーシスは、カスパーゼの活性化、ＤＮＡ断片化、膜水胞化、細胞収縮及びファゴサイトーシスを含む望ましくない細胞を除去するための組織化されたプロセスである。アポトーシスを、活性なカスパーゼ３(初期アポトーシス事象を検出するマーカー)についての免疫組織化学により分析した。標準的組織学をこのＢＣＣ培養物において実施して、スライドをパラフィン除去し、予備ブロックして、一次抗体とインキュベートしてから、製造者の指示に従って、すすいで、酵素標識した二次抗体とインキュベートした。特異的シグナルを、抗原抗体複合体の酵素的検出により可視化した。スライドにカバーガラスをかけて映像化した。結果は、図３４に描かれている(左パネルは、対照用組織であり、右パネルが、Ａの存在下のものである)。
主題の化合物の他の腫瘍細胞に対する効果
大腸癌細胞：２０，０００の大腸癌細胞を、１０，０００の１０Ｔ(Ｓ１２)細胞(上記)と混合して、混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。主題の化合物及び対照用ビヒクルを、翌日、この培養物に加えた。７２時間のインキュベーション後に、これらの細胞を、ルシフェラーゼ活性の測定のために溶解させた。化合物Ａは、ルシフェラーゼ活性を阻害することができたが、これは、このアッセイにおけるビヒクルと比較した場合に、ヘッジホッグシグナリング経路の活性を間接的に反映するものである。図３５は、Ｓ１２細胞におけるヘッジホッグ誘導された活性の、１Ｅ６及び５Ｅ１抗体並びに化合物Ａによる比較阻害、及び大腸癌細胞における内因性ヘッジホッグ活性の、これらの組成物による比較阻害を描写している。
前立腺癌及び膀胱癌細胞：細胞株ＰＣ−３(ホルモン不応性前立腺癌細胞株)及びＲＴ−４(尿路上皮膀胱癌細胞株)を用いた関連実験を、図３６に描いてある。
主題の化合物の他の組織に対する効果
図３７に描いたプローブ及びプライマーを用いて、主題のインヒビターのＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ発現に対する効果を、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ(Taqman)を利用して評価した。ＨＥＰＭ細胞を、オクチル−ＳＨＨ及び主題の化合物の存在下で２４時間生育させた。全ＲＮＡを収穫し、標準的ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ転写物の発現レベルを評価した。図３８は、試験結果、化合物Ａ、０．００３〜１．０μＭ；化合物Ｏ、０．００３〜１．０μＭ；−、負の対照(ＤＭＳＯ単独)；＋、正の対照(オクチル−ＳＨＨ＠１ｍｇ／ｍｌ、インヒビターなし)を描いている。
パッチトのホモ接合の分配を有する細胞(ｐｔｃ−ヌル細胞)を、主題化合物の存在下で７２〜９６時間にわたって生育させた。全ＲＮＡを収穫し、標準的ＲＴ−ＰＣＲで利用してＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ転写物の発現レベルを評価した。
図３９は、試験結果、化合物Ｃ、１及び１０μＭ；化合物Ｏ、１及び１０μＭ；ＤＭＳＯ、負の対照を描いている。
ＨＥＰＭ細胞を、オクチル−ＳＨＨ及び主題化合物の存在下で２４時間にわたって生育させた。全ＲＮＡを収穫し、標準的ＲＴ反応によってｃＤＮＡに変換した。次いで、このｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで利用して、ＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ転写物の発現レベルを評価した。図４０は、試験結果、化合物Ａ、０．００１〜０．３μＭ；化合物Ｏ、０．００１〜０．３μＭ；ＤＭＳＯ(−)、負の対照；ＯＣＴ−ＳＨＨ(＋)、正の対照を描いている。
ＣＣＤ−３７(肺繊維芽細胞)細胞を、オクチル−ＳＨＨ及び化合物の存在下で２４時間にわたって生育させた。全ＲＮＡを収穫し、標準的ＲＴ反応によりｃＤＮＡに変換した。次いで、このｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲで利用して、ＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ転写物の発現レベルを評価した。図４０は、試験結果、化合物Ａ，０．００１〜１．０μＭ；ＤＭＳＯ(−)、負の対照；ＯＣＴ−ＳＨＨ(＋)、正の対照を描いている。
上で引用したすべての参考文献を、参考として本明細書中に援用する。
同等物
当業者は、ここに記載した発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認識し、又は日常的実験を利用して確認することができるであろう。かかる同等物は、後記の請求の範囲に包含されるものである。
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 本発明の代表的な化合物を図解した図である。 この発明の化合物のヒト基底細胞癌(ＢＣＣ)におけるヘッジホッグシグナリングに対する効果を示している図である。 この発明の化合物のＢＣＣ組織におけるアポトーシスに対する効果を示している図である。 この発明の化合物のＳ−１２及びＨＴ−２９細胞におけるヘッジホッグシグナリングに対する効果を描いている図である。 この発明の化合物のＰＣ−３及びＲＴ−４細胞におけるヘッジホッグシグナリングに対する効果を描いている図である。 細胞におけるヘッジホッグ活性の評価に用いられるプローブ及びプライマーの配列を与える図である。 この発明の化合物の、ｐｃｔ−ヌル細胞におけるＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ発現に対する差次的効果を示す図である。 この発明の化合物の、ＨＥＰＭ細胞におけるＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ発現に対する差次的効果を示す図である。 この発明の化合物の、ｐｃｔ−ヌル細胞におけるＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ発現に対する差次的効果を示す図である。 この発明の化合物の、ＨＥＰＭ細胞におけるＧＬＩ−１及びＧＡＰＤＨ発現に対する差次的効果を示す図である。

Claims (20)

  1. 下記の一般式（ＩＩ）で表されるヘッジホッグアンタゴニスト化合物又はその製薬上許容できる塩を含む細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻害するための医薬製剤：
    Figure 2005507860
    {式中、原子価と安定性が許せば、
    Ｘ及びＺは、独立に、−Ｎ(Ｒ7)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−(Ｒ7)Ｎ−Ｎ(Ｒ7)−、−ＯＮ(Ｒ7)−又は直接結合を表し；
    Ｙは、−Ｃ(＝Ｏ)−、−Ｃ(＝Ｓ)−、−Ｃ(＝ＮＲ7)−、ＳＯ2又はＳＯを表し；
    Ａは、Ｏ又はＮＲ7を表し；
    Ｇは、フェニル環であって、それが結合している環と縮合したものを表し；
    Ｒ1は、Ｈ又は置換された若しくはされてないアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、又はシクロアルキル(多環式基を含む)を表し；
    Ｒ2は、それが結合している環上の０〜４個の置換基を表し；置換基はハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、ヘテロアリール、カルボニル基、チオカルボニル、ケトン、アルデヒド、アミノ、アシルアミノ、アミジノ、シアノ、ニトロ、アジド、スルホニル、スルホキシド、サルフェート、スルホネート、スルファミル、スルホンアミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、Ｊ−Ｒ 8 、Ｊ−ＯＨ、Ｊ−低級アルキル、Ｊ−低級アルケニル、Ｊ−ＳＨ、Ｊ−ＮＨ 2 、上記の保護形態から選択され、又は任意の２つのＲ 2 が、単環式若しくは多環式構造中に２回以上現れる場合には、一緒に、４〜８員のシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールを形成することができ、
    Ｒ3は、それが結合している環上の０〜４個の置換基を表し;置換基はＸの又はＡを含む環のパラ位にあり、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、シアノ、ニトロ、置換された又はされてない低級アルキル及びアシルから選択され、
    Ｒ7は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル、Ｊ−シクロアルキル、Ｊ−ヘテロシクリル、Ｊ−アリール、Ｊ−ヘテロアリールを表し；
    Ｒ8は、各出現につき独立に、Ｈ、低級アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールを表し；そして
    Ｊは、各出現につき独立に、ＣＫ2、ＮＫ、Ｏ及びＳより選択する０〜８ユニットを有する鎖を表す(ここに、Ｋは、各出現につき独立に、Ｈ又は低級アルキルを表す)}。
  2. Ｚ及びＸの少なくとも１つが、直接結合でない、請求項１に記載の医薬製剤。
  3. Ｘ−Ｙ−Ｚが、アミド、尿素又はスルホンアミドを含む、請求項１に記載の医薬製剤。
  4. Ｘが、−Ｎ(Ｒ 7 )−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される、請求項１に記載の医薬製剤。
  5. Ｒ1が、適宜１〜５個の置換基で置換されたアリール又はヘテロアリール環を含む、請求項１〜４何れか一項に記載の医薬製剤。
  6. Ｒ1上の置換基を、ニトロ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル、アシルアミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであって前記アリール又はヘテロアリール環に縮合したものから選択する請求項５に記載の医薬製剤。
  7. Ｒ2が、１〜４個の置換基を表す請求項１〜６何れか一項に記載の医薬製剤。
  8. Ｒ2が、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、置換された又はされてないシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであってＧと縮合したもの、及び置換された又はされてない低級アルキルより選択する１〜４個の置換基を表す、請求項７に記載の医薬製剤。
  9. 細胞が、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の表現型を有する、請求項１〜８何れか一項に記載の医薬製剤。
  10. ヘッジホッグアンタゴニストが、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を、１μＭ以下のＥＤ50で阻害する、請求項１〜９何れか一項に記載の医薬製剤。
  11. ヘッジホッグアンタゴニストが、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を、１ｎＭ以下のＥＤ50で阻害する、請求項１０に記載の医薬製剤。
  12. 細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を、イン・ビトロで阻害するための、請求項１〜１１何れか一項に記載の医薬製剤。
  13. 細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を、イン・ビボで阻害するための、請求項１〜１１何れか一項に記載の医薬製剤。
  14. 神経組織、骨及び軟骨組織の形成及び修復の調節、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝及び他の原始腸管から生じる臓器の調節、造血機能の調節、並びに皮膚及び毛の成長の調節よりなる群から選択する請求項１〜１３何れか一項に記載の医薬製剤。
  15. 治療のための、請求項１〜１３何れか一項に記載の医薬製剤。
  16. 基底細胞癌の治療のための、請求項１〜１３何れか一項に記載の医薬製剤。
  17. Ｘが−ＮＨ−である請求項１〜１６何れか一項に記載の医薬製剤。
  18. 下記から選択されるヘッジホッグアンタゴニスト化合物又はその製薬上許容できる塩を含む細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を阻害するための医薬製剤：
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
    Figure 2005507860
  19. 基底細胞癌の治療のための請求項８の医薬製剤。
  20. 基底細胞癌の治療のための請求項１１の医薬製剤。
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