DE60113823T3 - Kleine organische moleküle als regulatoren der zellproliferation - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Musterbildung ist die Aktivität, durch die Embryonalzellen geordnete räumliche Anordnungen differenzierter Gewebe bilden. Die physische Komplexität höherer Organismen entsteht während der Embryogenese durch die Wechselwirkung der zellintrinsischen Abstammung und des zellextrinsischen Signals. Induktive Wechselwirkungen sind für die embryonale Musterbildung bei der Entwicklung von Wirbeltieren aus der frühesten Anlage des Körperplans, für die Musterbildung der Organsysteme und für die Erzeugung verschiedener Zelltypen während der Gewebedifferenzierung wesentlich (Davidson, E. (1990) Development 108: 365–389; Gurdon, J. B. (1992) Cell 68: 185–199; Jessell, T. M. et al. (1992) Cell 68: 257–270). Die Wirkungen entwicklungsbedingter Zellwechselwirkungen sind unterschiedlich. Typischerweise werden antwortende Zellen von einem Weg der Zelldifferenzierung zu einem anderen umgeleitet, indem Zellen induziert werden, die sich sowohl von den nicht-induzierten als auch den induzierten Zuständen der antwortenden Zellen (Induktionen) unterscheiden. Manchmal veranlassen Zellen ihre Nachbarzellen, sich so zu differenzieren wie sie selbst (homöogenetische Induktion); in anderen Fällen hemmt eine Zelle ihre Nachbarn, sich so zu differenzieren wie sie selbst. Zellwechselwirkungen in der frühen Entwicklung können sequenziell sein, so dass eine anfängliche Induktion zwischen zwei Zelltypen zu einer zunehmenden Verstärkung der Verschiedenheit führt. Ferner finden induktive Wechselwirkungen nicht nur in Embryos sondern auch in erwachsenen Zellen statt und können morphogenetische Muster anlegen und aufrechterhalten sowie eine Differenzierung induzieren (J. B. Gurdon (1992) Cell 68: 185–199).
  • Mitglieder der Hedgehog-Familie von Signalstoffmolekülen vermitteln viele wichtige Musterbildungsprozesse kurzer und langer Reichweite während der Entwicklung von wirbellosen Tieren und Wirbeltieren. In der Fliege reguliert ein einziges Hedgehog-Gen die Musterbildung von Segment- und Imaginalscheiben. Im Gegensatz dazu ist in Wirbeltieren eine Hedgehog-Genfamilie an der Steuerung der Links-rechts-Asymmetrie, Polarität im ZNS, Ursegmente und Extremitäten, Organogenese, Chondrogenese und Spermatogenese beteiligt.
  • Das erste Hedgehog-Gen wurde durch eine genetische Durchmusterung in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster identifiziert (Nüsslein-Volhard, C. und Wieschaus, E. (1980) Nature 287, 795–801). Diese Durchmusterung identifizierte mehrere Mutationen, die die Embryonal- und Larvenentwicklung beeinflussen. 1992 und 1993 wurde die molekulare Natur des Drosophila-Hedgehog-(hh)-Gens berichtet (C. F. Lee et al. (1992) Cell 71, 33–50), und seitdem wurden mehrere Hedgehog-Homologe aus verschiedenen Wirbeltierspezies isoliert. Während in Drosophila und anderen wirbellosen Tieren nur ein Hedgehog-Gen gefunden wurde, sind in Wirbeltieren mehrere Hedgehog-Gene vorhanden.
  • Die Familie der Hedgehog-Gene von Wirbeltieren schließt mindestens vier Mitglieder, z. B. Paraloge des einzigen Hedgehog-Gens von Drosophila, ein. Beispielhafte Hedgehog-Gene und Proteine sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 95/18856 und WO 96/17924 beschrieben. Drei dieser Mitglieder, die hier als Desert-Hedgehog (Dhh), Sonic-Hedgehog (Shh) und Indian-Hedgehog (Ihh) bezeichnet werden, kommen offensichtlich in allen Wirbeltieren, einschließlich Fischen, Vögeln und Säugern, vor. Ein viertes Mitglied, das hier als Tiggie-winkle-Hedgehog (Thh) bezeichnet wird, kommt speziell in Fischen vor. Desert-Hedgehog (Dhh) wird sowohl bei der Embryonalentwicklung in Mäusen als auch im erwachsenen Nager und Menschen hauptsächlich in den Hoden exprimiert; Indian-Hedgehog (Ihh) ist an der Knochenentwicklung während der Embryogenese und an der Knochenbildung in Erwachsenen beteiligt; und Shh, das vorstehend beschrieben ist, ist vor allem an morphogenetischen und neuroinduktiven Aktivitäten beteiligt. In Anbetracht der kritischen induktiven Rollen von Hedgehog-Polypeptiden bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung von Wirbeltierorganen ist die Identifikation von in Wechselwirkung tretenden Hedgehog-Proteinen sowohl in klinischen Kontexten als auch Forschungskontexten von größter Bedeutung.
  • Die verschiedenen Hedgehog-Proteine bestehen aus einem Signalpeptid, einer hochkonservierten N-terminalen Region und einer stärker divergierenden C-terminalen Domäne. Zusätzlich zu der Signalsequenzspaltung in dem sekretorischen Pfad (Lee, J. J. et al. (1992) Cell 71: 33–50; Tabata, T. et al. (1992) Genes Dev. 2635–2645; Chang, D. E. et al. (1994) Development 120: 3339–3353) durchlaufen die Hedgehog-Vorläuferproteine eine innere autoproteolytische Spaltung, die von konservierten Sequenzen in dem C-terminalen Teil abhängt (Lee et al. (1994) Science 266: 1528–1537; Porter et al. (1995) Nature 374: 363–366). Diese Selbstspaltung führt zu einem N-terminalen Peptid mit 19 kD und einem C-terminalen Peptid mit 26 bis 28 kD (Lee et al. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot, D. A. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 2294–2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S. C. et al. (1995) Curr. Biol. 5: 944–955; Lai, C. J. et al. (1995) Development 121: 2349–2360). Das N-terminale Peptid bleibt mit der Oberfläche von Zellen, in denen es synthetisiert wurde, fest verbunden, während das C-terminale Peptid sowohl in vitro als auch in vivo frei diffusionsfähig ist (Porter et al. (1995) Nature 374: 363; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot et al. (1995) supra; Mart', E. et al. (1995) Development 121: 2537–2547; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81: 445–455). Interessanterweise hängt die Retention des N-terminalen Peptids an der Zelloberfläche von der Selbstspaltung ab, da eine verkürzte Form von HH, die durch eine RNA codiert wird, die genau an der normalen Position der inneren Spaltung endet, in vitro (Porter et al. (1995) supra) und in vivo (Porter, J. A. et al. (1996) Cell 86, 21–34) diffusionsfähig ist. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass die autoproteolytische Spaltung des HH-Vorläuferproteins über eine innere Thioesterzwischenverbindung abläuft, die anschließend in einer nukleophilen Substitution gespalten wird. Es ist wahrscheinlich, dass das Nukleophil ein kleines, lipophiles Molekül ist, das kovalent an das C-terminale Ende des N-Peptids gebunden wird (Porter et al. (1996) supra), und es so an die Zelloberfläche bindet. Die biologischen Auswirkungen sind tiefgreifend. Als Folge des Anheftens wird eine hohe lokale Konzentration des N-terminalen Hedgehog-Peptids auf der Oberfläche der Hedgehog produzierenden Zellen erzeugt. Es ist dieses N-terminale Peptid, das für Hedgehog-Signalaktivitäten kurzer und langer Reichweite in Drosophila und Wirbeltieren sowohl notwendig als auch ausreichend ist (Porter et al. (1995 supra; Ekker et al. (1995) supra; Lai et al. (1995) supra; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81: 445–455; Porter et al. (1996) supra; Fietz, M. J. et al. (1995) Curr. Biol. 5: 643–651; Fan, C.-M. et al. (1995) Cell 81: 457–465; Mart', E. et al. (1995) Nature 375: 322–325; Lopez-Martinez et al. (1995) Curr. Biol. 5: 791–795; Ekker, S. C. et al. (1995) Development 121: 2337–2347; Forbes, A. J. et al. (1996) Development 122: 1125–1135).
  • Hh war an Musterbildungsprozessen kurzer und langer Reichweite an verschiedenen Stellen während der Drosophila-Entwicklung beteiligt. Bei der Anlage der Segmentpolarität in frühen Embryos weist es Wirkungen kurzer Reichweite auf, die offensichtlich direkt vermittelt werden, während es bei der Musterbildung der Imaginalscheiben durch die Induktion von Sekundärsignalen Wirkungen langer Reichweite induziert.
  • In Wirbeltieren wurden in den letzten Jahren mehrere Hedgehog-Gene cloniert. Von diesen Genen erlangte Shh die größte experimentelle Aufmerksamkeit, da es in verschiedenen Organisationszentren, die die Quellen von Signalen sind, die benachbarte Gewebe gestalten, exprimiert wird. Neuere Beweise zeigen, dass Shh an diesen Wechselwirkungen beteiligt ist.
  • Die Expression von Shh beginnt kurz nach dem Beginn der Gastrulation in dem vermutlichen Mittellinienmesoderm, dem Knoten in der Maus (Chang et al. (1994) supra; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75: 1417–1430), der Ratte (Roelink, H. et al. (1994) Cell 76: 761–775) und dem Küken (Riddle, R. D. et al. (1993) Cell 75: 1401–1416) und dem Schild im Zebrafisch (Ekker et al. (1995) supra; Krauss, S. et al. (1993) Cell 75: 1431–1444). In Kükenembryos entwickelt das Shh-Expressionsmuster im Knoten eine Links-rechts-Asymmetrie, die offensichtlich für die Links-rechts-Lage des Herzens verantwortlich ist (Levin, M. et al. (1995) Cell 82: 803–814).
  • Im ZNS löst Shh aus der Urwirbelsäule und der Bodenplatte offensichtlich den Tod ventraler Zellen aus. Wenn Shh ektopisch exprimiert wird, führt es zu einer Ventralisation großer Regionen des Mittel- und Rautenhirns in der Maus (Echelard et al. (1993) supra; Goodrich, L. V. et al. (1996) Genes Dev. 10: 301–312), im Xenopus (Roelink, H. et al. (1994) supra; Ruiz i Altabc, A. et al. (1995) Mol. Cell. Neurosci. 6: 106–121) und Zebrafisch (Ekker et al. (1995) supra; Krauss et al. (1993) supra; Hammerschmidt, M. et al. (1996) Genes Dev. 10: 647–658). In Explantaten des intermediären Neuroektoderms in der Höhe des Rückenmarks induziert das Shh-Protein die Entwicklung der Bodenplatte und motorischer Neuronen bei verschiedenen Konzentrationsgrenzwerten, die Bodenplatte bei hohen Konzentrationen und die motorischen Neuronen bei niedrigeren Konzentrationen (Roelink et al. (1995) supra; Mart' et al. (1995) supra; Tanabe, Y. et al. (1995) Curr. Biol. 5: 651–658). Ferner deutet eine Blockierung durch Antikörper darauf hin, dass durch die Urwirbelsäule erzeugtes Shh für die durch die Urwirbelsäule vermittelte Induktion des Tods motorischer Neuronen erforderlich ist (Mart' et al. (1995) supra). Somit ist eine hohe Konzentrationen von Shh auf der Oberfläche von Shherzeugenden Mittellinienzellen offensichtlich der Grund für die in vitro beobachtete Kontaktvermittelte Induktion der Bodenplatte (Placzek, M. et al. (1993) Development 117: 205–218) und die Mittellinienpositionierung der Bodenplatte direkt über der Urwirbelsäule in vivo. Aus der Urwirbelsäule und der Bodenplatte freigesetzte niedrigere Konzentrationen von Shh induzieren vermutlich motorische Neuronen in weiter entfernten ventrolateralen Regionen in einem Prozess, von dem gezeigt wurde, dass er in vitro kontaktunabhängig ist (Yamada, T. et al. (1993) Cell 73: 673–686). In Explantaten, die in der Höhe des Mittelhirns und Vorderhirns entnommen wurden, induziert Shh auch die geeigneten Typen ventrolateraler, neuronaler Zellen, dopaminerger (Heynes, M. et al. (1995) Neuron 15: 35–44; Wang, M. Z. et al. (1995) Nature Med. 1: 1184–1188) beziehungsweise cholinerger (Ericson, J. et al. (1995) Cell 81: 747–756) Vorläufer, was zeigt, dass Shh ein allgemeiner Induktor der ventralen Spezifizierung über die gesamte Lange des ZNS ist. Diese Beobachtungen werfen die Frage auf, wie die differenzielle Antwort auf Shh an besonderen anteroposterioren Positionen reguliert wird.
  • Shh aus der Mittellinie gestaltet auch die paraxialen Regionen des Wirbeltierembryos, die Ursegmente im Rumpf (Fan et al. (1995) supra) und das Kopfmesenchym rostral von den Ursegmenten (Hammerschmidt et al. (1996) supra). In Explantaten des paraxialen Mesoderms von Küken und Mäusen fördert Shh die Expression von Sklerotom-spezifischen Marker wie Pax1 und Twist auf Kosten des dermamyotomalen Markers Pax3. Ferner deuten Experimente mit Filterbarrieren darauf hin, dass Shh die Induktion des Sklerotoms eher direkt als durch Aktivierung eines sekundären Signalmechanismus vermittelt (Fan, C.-M. und Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79, 1175–1186).
  • Shh induziert auch die myotomale Genexpression (Hammerschmidt et al. (1996) supra; Johnson, R. L. et al. (1994) Cell 79: 1165–1173; Münsterberg, A. E. et al. (1995) Genes Dev. 9: 2911–2922; Weinberg, E. S. et al. (1996) Development 122: 271–280), obwohl neuere Experimente zeigen, dass Mitglieder der WNT-Familie, Wirbeltierhomologe von Drosophila wingless, gemeinsam erforderlich sind (Münsterberg et al. (1995) supra). Rätselhafterweise erfordert eine myotomale Induktion in Küken höhere Shh-Konzentrationen als die Induktion sklerotomaler Marker (Münsterberg et al. (1995) supra), obwohl das Sklerotom von viel näher an der Urwirbelsäule liegenden Ursegmentzellen abstammt. Ähnliche Ergebnisse wurden beim Zebrafisch erhalten, wo hohe Konzentrationen von Hedgehog die Genexpression myotomaler Marker induzieren und die Genexpression sklerotomaler Marker unterdrücken (Hammerschmidt et al. (1996) supra). Im Gegensatz zu Amnioten stimmen diese Beobachtungen jedoch mit der Architektur des Fischembryos überein, da hier das Myotom die vorherrschende und mehr axiale Komponente der Ursegmente ist. Somit modifizierten die Modulation des Shh-Signals und der Erwerb neuer Signalfaktoren möglicherweise die Ursegmentstruktur während der Wirbeltierevolution.
  • In den Extremitätenknospen von Wirbeltieren reguliert eine Untergruppe von posterioren Mesenchymzellen die ”Zone polarisierender Aktivität” (ZPA), die anteroposteriore Identität der Finger (ein Überblick wurde in Honig, L. S. (1981) Nature 291: 72–73, gegeben). Die ektopische Expression von Shh oder die Anwendung von in Shh-Peptid eingeweichten Kügelchen ahmt die Wirkung von anterioren ZPA-Transplantaten nach, wobei eine Spiegelbildverdopplung von Fingern erzeugt wird (Chang et al. (1994) supra; Lopez-Martinez et al. (1995) supra; Riddle et al. (1993) supra (2g). Somit hängt die Identität der Finger offensichtlich in erster Linie von der Shh-Konzentration ab, obwohl es möglich ist, dass andere Signale diese Information über die beträchtlichen Entfernungen, die für die AP-Musterbildung (100–150 μm) offensichtlich erforderlich sind, weitergeben können. Ähnlich wie die Wechselwirkung von HH und DPP in den Imaginalscheiben von Drosophila aktiviert Shh in den Extremitätenknospen von Wirbeltieren die Expression von Bmp2 (Francis, P. H. et al. (1994) Development 120: 209–218), einem dpp-Homologen. Im Gegensatz zu DPP in Drosophila kann Bmp2 jedoch die polarisierende Wirkung von Shh bei der ektopischen Anwendung in der Extremitätenknospe von Küken nicht nachahmen (Francis et al. (1994) supra). Zusätzlich zu der anteroposterioren Musterbildung ist Shh offensichtlich auch an der Regulierung des proximodistalen Herauswachsens der Extremitäten beteiligt, indem es die Synthese des Fibroblastenwachstumsfaktors FGF4 in der posterioren, apikalen Ektodermleiste induziert (Laufer, E. et al. (1994) Cell 79: 993–1003; Niswander, L. et al. (1994) Nature 371: 609–612).
  • Die enge Verwandtschaft zwischen Hedgehog-Proteinen und BMPs bleibt wahrscheinlich an vielen, jedoch vermutlich nicht allen Stellen der Hedgehog-Expression von Wirbeltieren erhalten. Von Shh wurde zum Beispiel gezeigt, dass es im Hinterdarm von Küken die Expression von Bmp4, einem anderen dpp-Homologen von Wirbeltieren, induziert (Roberts, D. J. et al. (1995) Development 121: 3163–3174). Ferner zeigen Shh und Bmp2, 4 oder 6 eine auffallende Korrelation in ihrer Expression in Epithel- und Mesenchymzellen des Magens, des Urogenitalsystems, der Lunge, der Zahnknospen und der Haarfollikel (Bitgood, M. J. und McMahon, A. P. (1995) Dev. Biol. 172: 126–138). Ferner wird Ihh, eines der zwei anderen Hedgehog-Gene von Mäusen, benachbart zu Bmp exprimierenden Zellen im Darmkanal und sich entwickelnden Knorpel exprimiert (Bitgood und McMahon (1995) supra).
  • Neuere Beweise schlagen ein Modell vor, in dem Ihh bei der Regulierung der chondrogenen Entwicklung eine entscheidende Rolle spielt (Roberts et al. (1995) supra). Während der Knorpelbildung gehen Chondrocyten von einem proliferierenden Zustand über einen intermediären prähypertrophen Zustand in differenzierte hypertrophe Chondrocyten über. Ihh wird in den prähypertrophen Chondrozyten exprimiert und löst eine Signalkaskade aus, die zur Blockierung der Chondrocytendifferenzierung führt. Sein direktes Ziel ist das Perichondrium in der Nähe der Ihh-Expressionsdomäne, das durch die Expression von Gli und Patched (Ptc), konservierten Transkriptionszielen von Hedgehog-Signalen (siehe nachstehend), antwortet. Dies führt höchstwahrscheinlich zu einem Sekundärsignal, was zur Synthese von Parathormonverwandtem Protein (PTHrP) im periartikulären Perichondrium führt. PTHrP selbst schickt Signale zu den prähypertrophen Chondrocyten zurück, was ihre weitere Differenzierung blockiert. Gleichzeitig unterdrückt PTHrP die Expression von Ihh, wodurch eine negative Rückkopplungsschleife gebildet wird, die die Geschwindigkeit der Chondrocytendifferenzierung moduliert.
  • Patched wurde ursprünglich in Drosophila als ein Segmentpolaritätsgen identifiziert, eines einer Gruppe von Entwicklungsgenen, die die Zelldifferenzierung innerhalb der einzelnen Segmente, die in einer homologen Reihe entlang der anteriorposterioren Achse des Embryos vorkommen, beeinflussen. Siehe Hooper, J. E. et al. (1989) Cell 59: 751; und Nakano, Y. et al. (1989) Nature 341: 508. Expressionsmuster des Wirbeltierhomologen von Patched deuten auf seine Beteiligung an der Entwicklung des Neuralrohrs, des Skeletts, der Extremitäten, der kraniofazialen Struktur und der Haut hin.
  • Genetische und funktionelle Untersuchungen zeigen, dass Patched ein Teil der Hedgehog-Signalkaskade, eines evolutionär konservierten Pfads, der die Expression mehrerer stromabwärts gelegener Genen reguliert, ist. Siehe Perrimon, N. (1995) Cell 80: 517; und Perrimon, N. (1996) Cell 86: 513. Patched beteiligt sich an der konstitutiven Transkriptionsrepression der Zielgene; seine Wirkung wird durch ein sezerniertes Glykoprotein, das durch Hedgehog codiert wird, oder ein Wirbeltierhomologes, das eine Transkriptionsaktivierung induziert, gehemmt. Durch diesen Pfad kontrollierte Gene schließen Mitglieder der Wnt- und TGF-β-Familien ein.
  • Patched-Proteine besitzen zwei große extrazelluläre Domänen, zwölf Transmembransegmente und mehrere cytoplasmatische Segmente. Siehe Hooper, supra; Nakano, supra; Johnson, R. L. et al. (1996) Science 272: 1668; und Hahn, H. et al. (1996) Cell 85: 841. Die biochemische Rolle von Patched in dem Hedgehog-Signalpfad ist unklar. Eine direkte Wechselwirkung mit dem Hedgehog-Protein wurde jedoch berichtet (Chen, Y. et al. (1996) Cell 87: 553), und Patched kann zusammen mit einem anderen Transmembranprotein, das durch das smoothened-Gen codiert wird, an einem Hedgehog-Rezeptorkomplex beteiligt sein. Siehe Perrimon, supra; und Chen, supra.
  • Das menschliche Homologe von Patched wurde kürzlich cloniert und auf dem Chromosom 9q22.3 kartiert. Siehe Johnson, supra; und Hahn, supra. Diese Region ist an dem Basalzellnävus-Syndrom (BCNS) beteiligt, das durch Entwicklungsanomalien, einschließlich Alterationen der Rippen und kraniofazialer Alterationen, Anomalien der Hände und Füße und Spina bifida, gekennzeichnet ist.
  • BCNS fuhrt auch zu einer Prädisposition für mehrere Tumortypen, von denen die häufigsten Basalzellkarzinome (BCC) sind, die an vielen Stellen des Körpers vorkommen und innerhalb der ersten zwei Jahrzehnte des Lebens auftreten. Die meisten Fälle von BCC sind jedoch nicht mit dem Syndrom verbunden und entstehen sporadisch in kleiner Anzahl auf der Sonne ausgesetzten Stellen von Personen mittleren Alters oder älteren Personen nordeuropäischer Abstammung.
  • Neuere Untersuchungen an mit BCNS verbundenem und sporadischem BCC deuten darauf hin, dass ein Funktionsverlust beider Allele von Patched zur Entwicklung von BCC führt. Siehe Johnson, supra; Hahn, supra; und Gailani, M. R. et al. (1996) Nature Genetics 14: 78. Deletionen einzelner Allele des Chromosoms 9q22.3 kommen sowohl bei sporadischem als auch hereditärem BCC häufig vor. Eine Kopplungsanalyse offenbarte, dass das defekte, vererbte Allel beibehalten wurde und das normale Allel in Tumoren von BCNS-Patienten verloren ging.
  • Sporadische Tumoren zeigten auch einen Verlust beider funktioneller Allele von Patched. Von zwölf Tumoren, in denen Patched-Mutationen mit einem Durchmusterungstest für Einzelstrang-Konformationspolymorphismus identifiziert wurden, wiesen neun eine Chromosomendeletion des zweiten Allels auf, und die anderen drei wiesen in beiden Allelen inaktivierende Mutationen auf (Gailani, supra). Die Alterationen kamen nicht in der entsprechenden Keimbahn-DNA vor.
  • Die meisten der identifizierten Mutationen führten zu vorzeitigen Stoppcodons oder Rasterverschiebungen. Lench, N. J. et al., Hum. Genet., Okt. 1997, 100(5–6): 497–502. Mehrere waren jedoch Punktmutationen, die entweder in extrazellulären oder in cytoplasmatischen Domänen zu Aminosäuresubstitutionen führten. Diese Mutationsstellen können eine funktionelle Bedeutung für die Wechselwirkung mit extrazellulären Proteinen oder mit cytoplasmatischen Mitgliedern des stromabwärts gelegenen Signalpfads aufweisen.
  • Die Beteiligung von Patched an der Hemmung der Genexpression und das Vorkommen häufiger Alleldeletionen von Patched im BCC unterstützen eine Tumorunterdrückungsfunktion für dieses Gen. Seine Rolle bei der Regulierung von Genfamilien, von denen bekannt ist, dass sie an Zellsignalisierung und interzellulärer Kommunikation beteiligt sind, stellt einen möglichen Mechanismus der Tumorunterdrückung bereit.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Modulierung von Differenzierung oder Proliferation einer Zelle zur Verfügung, wie durch die Patentansprüche gekennzeichnet.
  • In bestimmten Ausführungsformen können in der vorliegenden Erfindung verwendbare Verbindungen durch die allgemeine Formel (II) dargestellt werden:
    Figure 00090001
    Formel II
  • wobei, wie es die Valenz und Stabilität möglich machen,
    Ar und Ar' unabhängig voneinander substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Heteroarylringe bedeuten;
    Y unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist;
    X ausgewählt ist aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)- und einer Methylengruppe, die gegebenenfalls mit 1 bis 2 Resten substituiert ist, wie Niederalkyl-, -alkenyl- oder -alkinylresten;
    M unabhängig bei jedem Vorkommen eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe, wie -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C=O-, etc. bedeutet; oder zwei M zusammengenommen substituiertes oder unsubstituiertes Ethen oder Ethin bedeuten, wobei jedes vorkommende M in Mj die ganze oder einen Teil einer cyclischen Struktur bilden;
    Cy' ein substituiertes oder unsubstituiertes Benzothiophen bedeutet;
    j unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10, bevorzugt von 2 bis 7, bedeutet; und
    i unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5, bevorzugt von 0 bis 2, bedeutet.
  • In bestimmten Ausführungsformen bedeutet M unabhängig bei jedem Vorkommen eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe wie -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C=O- etc.
  • In bestimmten Ausführungsformen bedeuten Ar und Ar' Phenylringe, die z. B. unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Resten, einschließlich Heteroatomen wie O, N und S, substituiert sind. In bestimmten Ausführungsformen bedeutet mindestens eines von Ar und Ar' einen Phenylring. In bestimmten Ausführungsformen bedeutet mindestens eines von Ar und Ar' einen Heteroarylring, z. B. ein Pyridyl, Thiazolyl, Thienyl, Pyrimidyl etc. In bestimmten Ausführungsformen sind Y und Ar' in einer meta- und/oder 1,3-Beziehung an Ar gebunden.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist Cy' direkt an X gebunden.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist X ausgewählt aus -C(=O)-, -C(=S)- und -S(O2)-.
  • R bedeutet H oder Niederalkyl, z. B. H oder Me.
  • NR2 bedeutet ein sekundäres oder tertiäres Amin, das mit einem oder zwei Niederalkylresten substituiert ist, bevorzugt ein sekundäres Amin.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind Substituenten an Ar oder Ar' ausgewählt aus Halogen, Niederalkyl, Niederalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Carbonyl, Thiocarbonyl, Keton, Aldehyd, Amino, Acylamino, Cyano, Nitro, Hydroxyl, Azido, Sulfonyl, Sulfoxido, Sulfat, Sulfonat, Sulfamoyl, Sulfonamido, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphinat, -(CH2)pAlkyl, -(CH2)pAlkenyl, -(CH2)pAlkinyl, -(CH2)pAryl, -(CH2)pAralkyl, -(CH2)pOH, -(CH2)pO-Niederalkyl, -(CH2)pO- Niederalkenyl, -O(CH2)nR, -(CH2)pSH, -(CH2)pS-Niederalkyl, -(CH2)pS-Niederalkenyl, -S(CH2)nR, -(CH2)pN(R)2, -(CH2)pNR-Niederalkyl, -(CH2)pNR-Niederalkenyl, -NR(CH2)nR und geschützten Formen der vorstehenden Substituenten, wobei p und n einzeln bei jedem Vorkommen ganze Zahlen von 0 bis 10, bevorzugt von 0 bis 5, bedeuten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verbindungen der Formel X, die nachstehend weiter ausführlich beschrieben sind, bereit.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann eine in der vorliegenden Erfindung verwendbare Hedgehog-unabhängige Verbindung, wie vorstehend beschrieben, einen EC50-Wert zur Induktion oder Verstärkung einer oder mehrerer Hedgehog-Aktivitäten (wie einer Hochregulierung der Gli-Expression) von weniger als etwa 1000 nM, weniger als etwa 100 nM, weniger als etwa 10 nM oder sogar weniger als etwa 1 nM aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen verstärkt eine in der vorliegenden Erfindung verwendbare Hedgehogabhängige Verbindung, wie vorstehend beschrieben, eine oder mehrere Hedgehog-Aktivitäten (wie eine Hochregulierung der Gli-Expression) um mindestens eine, zwei oder sogar drei Größenordnungen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1–31 stellen zur Herstellung von Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbare Reaktionen dar.
  • Die 32 veranschaulicht repräsentative Verbindungen gemäß der vorliegenden Offenbarung.
  • Die 34a und 34b stellen Ergebnisse aus Reportertests des Hedgehog-Pfads unter Verwendung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung dar.
  • Die 35 stellt Testergebnisse, die die Hochregulierung von Ptc und Gli durch Hedgehog-Agonisten der vorliegenden Erfindung zeigen, dar.
  • Die 36 und 37 beschreiben die erhöhte Proliferation von Vorläufern der Kleinhirnneuronen in Gegenwart von vorliegenden Agonisten.
  • Die 38A und B zeigen die Wirkung von vorliegenden Agonisten auf die Heilung eines gequetschten Ischiasnervs, was in einem Greiftest gemessen wurde.
  • Die 39A–D zeigen die Wirkung von vorliegenden Agonisten auf die Heilung eines gequetschten Ischiasnervs, was in einem Zehenspreiztest gemessen wurde.
  • Die 40 zeigt die Wirkung von vorliegenden Agonisten in Kombination mit einer niedrigen Dosis von Hedgehog-Protein auf Lungen-, Schulterblatt-, Haut- und Schädelgewebe von Mäusen in der Entwicklung.
  • Die 41 stellt die Wirkung von vorliegenden Agonisten mit und ohne hinzugefügtem Hedgehog-Protein auf Bauchspeicheldrüsen-, Nieren-, Haut- und Herzgewebe von Mäusen in der Entwicklung dar.
  • Die 42 zeigt die Wirkung eines vorliegenden Agonisten auf die Vorderextremitäten einer neugeborenen Maus.
  • Die 43 stellt die Wirkung eines vorliegenden Agonisten auf die Vorderextremitäten einer neugeborenen Maus in verschiedenen Konzentrationen dar.
  • Die 44 beschreibt die Wirkungen eines vorliegenden Agonisten auf sich entwickelndes Lungengewebe.
  • Die 45 zeigt die Wirkungen eines vorliegenden Agonisten auf sich entwickelndes Nierengewebe.
  • Die 46A und B zeigen die Wirkungen vorliegender Agonisten auf Hautgewebe von Mäusen in Gegenwart und Abwesenheit von Hedgehog-Protein.
  • Die 47A und B vergleichen die Wirksamkeit von vorliegenden Agonisten in Reporterzellen von Mäusen und Menschen.
  • Die 48 stellt die Hochregulierung von Gli in HEPM-Zellen, die mit einem modifizierten N- terminalen Fragment von Sonic-Hedgehog oder mit einem vorliegenden Agonisten behandelt wurden, dar.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • I. Überblick
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Erkenntnis, dass durch Hedgehog, Patched (Ptc), Gli und/oder Smoothened regulierte Signaltransduktionspfade durch kleine Moleküle, wenigstens teilweise, moduliert werden können. Ohne an einer besonderen Theorie festhalten zu wollen, kann die Aktivierung eines Patched-Smoothened-Pfads durch eine Änderung von Zelloberflächenassoziationen (wie Komplexen) der Mechanismus sein, durch den diese Mittel wirken. Es wird angenommen, dass der Hedgehog-Pfad durch die Assoziation von Patched und Smoothened wie in Form von Proteinkomplexen negativ reguliert wird, wobei die Assoziation durch die Bindung von Hedgehog an Patched zerstört wird. Folglich kann die Fähigkeit dieser Mittel, den Hedgehog-Pfad zu aktivieren, auf die Fähigkeit dieser Moleküle, mit Smoothened in Wechselwirkung zu treten oder daran zu binden, zurückgeführt werden. Diese Wirkungsweise, z. B. die Modulierung eines Smoothened-abhängigen Pfads, muss von Verbindungen unterschieden werden, die den Hedgehog-Pfad durch direkte Aktivierung des cAMP-Pfads, z. B. durch Bindung an oder Wechselwirkung mit PKA, Adenylatcyclase, cAMP-Phosphodiesterase etc., modulieren.
  • Bestimmte hier offenbarte Hedgehog-Agonisten modulieren die Hedgehog-Aktivität in Abwesenheit von Hedgehog-Protein selbst, wobei die Verbindungen z. B. eher die Aktivität von Hedgehog nachahmen als lediglich die Aktivität von Hedgehog-Protein ergänzen oder erhöhen. Diese Verbindungen werden hier als Hedgehog-unabhängige Agonisten bezeichnet und können allein den Phänotyp oder die aus einer Hedgehog-Behandlung resultierende Wirkung nachahmen. Bestimmte andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung erhöhen die Aktivität von Hedgehog-Protein und benötigen die Gegenwart oder Zugabe von Hedgehog-Protein, damit der Phänotyp oder die aus einer Hedgehog-Induktion resultierende Wirkung beobachtet wird. Solche Hedgehog-abhängigen Agonisten können in therapeutischen Zubereitungen oder Behandlungen, die Hedgehog-Protein einschließen, verwendet werden, oder können verwendet werden, um die Aktivität von Hedgehog-Protein, das durch die Zellen oder Gewebe natürlich erzeugt wird, die/das mit dem Agonisten behandelt werden sollen/soll, zu verstärken. Die hier offenbarten Hedgehog-Agonisten können eine Spaltung eines Patched-Smoothened-Komplexes induzieren oder die Wechselwirkungen zwischen Patched und Smoothened zerstören, indem sie an Smoothened binden und dadurch den Hedgehog-Pfad aktivieren.
  • In bestimmten Ausführungsformen induzieren in der vorliegenden Erfindung verwendbare Hedgehog-Agonisten eine Hedgehog-abhängige Transkriptionsregulierung wie eine Expression der Gli1- oder Ptc-Gene. Solche Agonisten können somit die Aktivierung des Hedgehogabhängigen Pfads, die zum Beispiel aus erhöhten Konzentrationen von Hedgehog-Protein resultiert, induzieren oder verstärken.
  • Es ist daher besonders beabsichtigt, dass diese kleinen Moleküle, die Aspekte der Signaltransduktionsaktivität von Hedgehog, Ptc oder Smoothened modulieren, ebenfalls die Proliferation (oder andere biologische Konsequenzen) in Zellen mit einem funktionellen Ptc-Smo-Pfad fördern können. In bevorzugten Ausführungsformen sind die vorliegenden Agonisten organische Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 2500 Atommasseneinheiten, stärker bevorzugt weniger als 1500 Atommasseneinheiten und noch stärker bevorzugt weniger als 750 Atommasseneinheiten und können wenigstens einige der biologischen Aktivitäten von Hedgehog-Proteinen, bevorzugt spezifisch in Zielzellen, induzieren oder verstärken. Eine Aktivierung des Hedgehog-Pfads durch einen Hedgehog-Agonisten kann quantitativ bestimmt werden, indem zum Beispiel die Zunahme der Ptc- oder Gli1-Transkription in Gegenwart des Agonisten, bezogen auf eine Kontrolle in Abwesenheit eines Agonisten, ermittelt wird. Eine Zunahme von mindestens 5%, mindestens 10%, mindestens 20% oder sogar mindestens 50% kann zum Beispiel auf eine Aktivierung des Hedgehog-Pfads durch eine Testverbindung hinweisen. In bestimmten Ausführungsformen wird die Agonistenaktivität der vorliegenden Verbindungen nicht durch den Hedgehog-Antikörper 5E1 gehemmt, sondern wird durch Jervin oder einen Antagonisten mit der Formel:
    Figure 00140001
    gehemmt. Diese Eigenschaft kann quantitativ bestimmt werden, indem zum Beispiel ermittelt wird, ob der Antikörper oder Antagonist eine Abnahme der durch den Agonisten in Abwesenheit des Hedgehog-Antagonisten induzierten Ptc- oder Gli1-Hochregulierung von mehr als 50%, mehr als 20%, mehr als 10% oder sogar mehr als 5% etc. induziert. In bestimmten Ausführungsformen kann eine in der vorliegenden Erfindung verwendbare Verbindung, wie vorstehend beschrieben, eine EC50 zur Induktion oder Verstärkung einer oder mehrerer Hedgehog-Aktivitäten (wie einer Hochregulierung der Ptc- oder Gli1-Expression) von weniger als etwa 1000 nM, weniger als etwa 100 nM, weniger als etwa 10 nM oder sogar weniger als etwa 1 nM aufweisen. Die für beispielhafte menschliche Gli-Gene codierenden Sequenzen schließen zum Beispiel die Gli1-Gensequenz der GenBank-Eintragung X07384 und die Gli2-Gensequenz der GenBank-Eintragung AB007298 ein. Siehe auch Kinzler et al., Nature 1988, 332, 371. Der Grad der Gli- oder Ptc-Expression kann bestimmt werden, indem zum Beispiel die Konzentration an mRNA (Transkription) oder die Konzentration an Protein (Translation) gemessen wird.
  • Somit schließen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verwendung kleiner Moleküle, die die Hemmung des Hedgehog-Signals durch Ptc wie durch die Aktivierung von Smoothened oder stromabwärts gelegenen Komponenten des Signalpfads antagonistisch beeinflussen, für die Regulierung der Wiederherstellung und/oder funktionellen Leistung eines breiten Bereiches von Zellen, Geweben und Organen ein. Das vorliegende Verfahren weist beispielsweise therapeutische Anwendungen wie in den Ansprüchen definiert auf. Ferner können die vorliegenden Verfahren an Zellen, die in Kultur (in vitro) bereitgestellt werden, oder an Zellen in einem ganzen Tier (in vivo) durchgeführt werden. Siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichungen WO 95/18856 und WO 96/17924 (deren Beschreibungen hier ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen sind).
  • In einer Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren zur Behandlung von Epithelzellen dienen. Im Allgemeinen kann eine Epithelzelle mit einer Menge eines Hedgehog-Agonisten in Kontakt gebracht werden, um ein Wachstum und/oder eine Bildung von Epithelgewebe zu induzieren. Das vorliegende Verfahren kann an Epithelzellen, die entweder in Kultur dispergiert werden können oder ein Teil eines intakten Gewebes oder Organs sein können, durchgeführt werden. Ferner kann das Verfahren an Zellen, die in Kultur (in vitro) bereitgestellt werden, oder an Zellen in einem ganzen Tier (in vivo) durchgeführt werden.
  • Die Hedgehog-Agonisten der vorliegenden Erfindung können als Teil von Schemata für die Behandlung von Erkrankungen oder der chirurgischen oder kosmetischen Wiederherstellung solcher Epithelgewebe wie Haut und Hautorgane; Hornhaut-, Linsen- und anderes Augengewebe; Schleimhautmembranen; und periodontales Epithel verwendet werden. Die hier offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen stellen die Behandlung oder Vorbeugung einer Vielzahl von geschädigten Epithel- und Schleimhautgeweben bereit. Das vorliegende Verfahren kann beispielsweise zur Steuerung von Wundheilungsprozessen verwendet werden, wie es zum Beispiel in Verbindung mit einem beliebigen chirurgischen Eingriff, der Epithelgewebe betrifft, wie bei dermatologischen oder periodontalen chirurgischen Eingriffen erwünscht sein kann. Eine beispielhafte chirurgische Wiederherstellung, für die Hedgehog-Agonisten verwendet werden können, schließt die Regeneration schwerer Verbrennungen und der Haut, Hauttransplantate, Druckgeschwüre, Hautgeschwüre, Fissuren, postoperative Narbenreduzierung und ulzerative Colitis ein.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Hedgehog-Agonist verwendet werden, um Haarwachstum zu bewirken, wie zum Beispiel für die Behandlung von Alopezie, wobei das Haarwachstum verstärkt wird.
  • Hier beschrieben werden auch Arzneimittelzubereitungen, umfassend einen Hedgehog-Agonisten, Ptc-Antagonisten oder Smoothened-Agonisten, wie hier beschrieben, als Wirkstoff, der in einer Menge formuliert wurde, die zur Förderung der Proliferation oder anderer biologischer Konsequenzen in vivo ausreicht.
  • Die vorliegenden Behandlungen unter Verwendung von Hedgehog-Agonisten, Patched-Antagonisten oder Smoothened-Agonisten können sowohl bei menschlichen als auch tierischen Patienten wirksam sein. Tierische Patienten, auf die die Erfindung anwendbar ist, erstrecken sich sowohl auf Haustiere als auch auf Vieh, das entweder als Haustier oder für kommerzielle Zwecke gezüchtet wird. Beispiele sind Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine und Ziegen.
  • II. Definitionen
  • Geeigneterweise werden hier bestimmte Begriffe, die in der Beschreibung, den Beispielen und den angefügten Ansprüchen verwendet werden, zusammengetragen.
  • Der Ausdruck ”abweichende Modifikation oder Mutation” eines Gens bezieht sich auf solche genetischen Läsionen, wie zum Beispiel Deletionen, Substitution oder Addition von Nucleotiden an ein Gen sowie umfassende chromosomale Umordnungen des Gens und/oder eine anomale Methylierung des Gens. Desgleichen bezieht sich Fehlexpression eines Gens auf abweichende Transkriptionsmengen des Gens relativ zu den Mengen in einer normalen Zelle unter ähnlichen Bedingungen sowie Nicht-Wildtyp-Spleißen von von dem Gen transkribierter mRNA.
  • ”Brandwunden” beziehen sich auf Fälle, in denen von einem Individuum auf Grund von Hitze und/oder chemischen Mitteln große Hautoberflächen entfernt oder verloren wurden.
  • Das ”Corium” oder die ”Dermis” bezieht sich auf die Schicht der Haut tief unter der Epidermis, die aus einem dichten Bett von vaskulärem Bindegewebe besteht und die Nerven und die endständigen Sinnesorgane enthält. Die Haarwurzeln und Talg- und Schweißdrüsen sind Strukturen der Epidermis, die tief in die Dermis eingebettet sind.
  • ”Zahngewebe” bezieht sich auf Gewebe im Mund, das Epithelgewebe ähnlich ist, zum Beispiel Zahnfleischgewebe. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Behandlung von periodontaler Erkrankung verwendbar.
  • ”Hautgeschwüre” beziehen sich auf Läsionen auf der Haut, die durch einen oberflächlichen Verlust von Gewebe, in der Regel bei einer Entzündung, hervorgerufen werden. Hautgeschwüre, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen Dekubitusgeschwüre, diabetische Geschwüre, venöse Stauungsgeschwüre und arterielle Geschwüre ein. Dekubituswunden beziehen sich auf chronische Geschwüre, die aus Druck, der eine längere Zeitdauer auf Hautbereiche ausgeübt wurde, resultieren. Wunden dieses Typs werden häufig als Bettgeschwüre oder Druckgeschwüre bezeichnet. Venöse Stauungsgeschwüre resultieren aus der Stagnation von Blut oder anderen Flüssigkeiten aus defekten Venen. Arterielle Geschwüre bezeichnen nekrotische Haut im Bereich um Arterien herum mit einem schlechten Blutfluss.
  • Der Begriff ”ED50” bedeutet die Dosis eines Arzneistoffs, die 50% seiner maximalen Antwort oder Wirkung erzeugt.
  • Eine ”wirksame Menge” von z. B. einem Hedgehog-Agonisten hinsichtlich des vorliegenden Behandlungsverfahrens bezieht sich auf eine Menge des Agonisten in einer Zubereitung, die, wenn sie als Teil eines gewünschten Dosierungsschemas angewendet wird, z. B. eine Änderung der Zellproliferationsgeschwindigkeit und/oder des Differenzierungszustandes einer Zelle und/oder der Überlebensrate einer Zelle gemäß klinisch verträglichen Standards für die zu behandelnde Erkrankung oder den kosmetischen Zweck bewirkt.
  • Die Begriffe ”Epithelien”, ”epithelial” und ”Epithel” beziehen sich auf die zelluläre Bedeckung innerer und äußerer Körperoberflächen (kutan, mukös und serös), einschließlich der Drüsen und davon abgeleiteter anderer Strukturen, z. B. Epithelzellen der Hornhaut, Speiseröhre, Epidermis und Haarfollikel. Ein anderes beispielhaftes Epithelgewebe schließt das Riechepithel, das das mehrschichtige Pseudoepithel ist, das die Riechregion der Nasenhöhle auskleidet und die Rezeptoren für den Geruchssinn enthält; Drüsenepithel, das sich auf ein Epithel bezieht, das aus sezernierenden Zellen besteht; Plattenepithel, das sich auf ein Epithel bezieht, das aus abgeflachten, plattenartigen Zellen besteht, ein. Der Begriff Epithel kann sich auch auf Übergangsepithel beziehen, wie das, das charakteristischerweise in der Auskleidung von Hohlorganen gefunden wird, die auf Grund von Kontraktion und Dehnung einer großen mechanischen Änderung ausgesetzt sind, z. B. Gewebe, das einen Übergang zwischen mehrschichtigem Pattenepithel und hochprismatischem Epithel darstellt.
  • Der Begriff ”Epithelisierung” bezieht sich auf die Heilung durch das Wachstum von Epithelgewebe über einer freigelegten Oberfläche.
  • Der Begriff ”epidermale Drüse” bezieht sich auf eine Aggregation von Zellen, die mit der Epidermis verbunden sind und auf die Sezernierung und Ausscheidung von Materialien spezialisiert sind, die nicht mit ihren gewöhnlichen metabolischen Notwendigkeiten zusammenhängen. ”Talgdrüsen” sind zum Beispiel holokrine Drüsen im Corium, die eine ölige Substanz und Talg sezernieren. Der Begriff ”Schweißdrüsen” bezieht sich auf im Corium oder subkutanen Gewebe befindliche Drüsen, die Schweiß sezernieren und sich durch einen Gang an die Körperoberfläche öffnen.
  • Der Begriff ”Epidermis” bezieht sich auf die äußerste und nicht-vaskuläre Schicht der Haut, die aus dem embryonalen Ektoderm abgeleitet ist, wobei die Dicke von 0,07–1,4 mm variiert. An den Handflächen- und Fußsohlenflächen umfasst sie von innen nach außen fünf Schichten: die Basalzellenschicht, die aus senkrecht angeordneten hochprismatischen Epithelzellen besteht; die Stachelzellenschicht oder Stratum-spinosum-Schicht, die aus abgeflachten, polyedrischen Zellen mit kurzen Fortsätzen oder Stacheln besteht; die Körnerzellenschicht, die aus abgeflachten Körnerzellen besteht; die Glanzschicht, die aus mehreren Schichten heller, durchsichtiger Zellen, in denen die Kerne undeutlich sind oder fehlen, besteht; und die Hornzellenschicht, die aus abgeflachten, verhornten, kernlosen Zellen besteht. In der Epidermis der allgemeinen Körperoberfläche fehlt in der Regel die Glanzschicht.
  • ”Exzisionswunden” schließen Risse, Abschürfungen, Schnitte, Stiche oder Lazerationen in der Epithelschicht der Haut ein und können sich in die Hautschicht und sogar in das subkutane Fett und darüber hinaus ausdehnen. Exzisionswunden können aus chirurgischen Verfahren oder aus einer versehentlichen Durchdringung der Haut resultieren.
  • Der ”Wachstumszustand” einer Zelle bezieht sich auf die Proliferationsgeschwindigkeit der Zelle und/oder den Differenzierungszustand der Zelle. Ein ”veränderter Wachstumszustand” ist ein Wachstumszustand, der durch eine anomale Proliferationsgeschwindigkeit gekennzeichnet ist, indem z. B. eine Zelle eine erhöhte oder erniedrigte Proliferationsgeschwindigkeit, bezogen auf eine normale Zelle, zeigt.
  • Der Begriff ”Haar” bezieht sich auf eine fadenförmige Struktur, besonders die spezialisierte epidermale Struktur, die aus Keratin besteht und sich aus einer im Corium eingebetteten Papille entwickelt und nur durch Säuger erzeugt wird und für diese Gruppe von Tieren charakteristisch ist. ”Haar” kann sich auch auf die Ansammlung solcher Haare beziehen. Ein ”Haarfollikel” bezieht sich auf eine der röhrenförmigen Einstülpungen der Epidermis, die die Haare einschließen und aus denen die Haare wachsen. ”Epithelzellen der Haarfollikel” beziehen sich auf Epithelzellen, die die Hautpapille in dem Haarfollikel umgeben, z. B. Stammzellen, Zellen der äußeren Wurzelscheide, Matrixzellen und Zellen der inneren Wurzelscheide. Solche Zellen können normale, nicht-maligne Zellen oder transformierte/immortalisierte Zellen sein.
  • Der Begriff ”Hedgehog-Agonist” bezieht sich auf ein Mittel, das die biologische Aktivität von Hedgehog verstärkt oder wiederaufnimmt, wie durch Aktivierung der Transkription von Zielgenen. Bevorzugte Hedgehog-Agonisten können verwendet werden, um die Aktivität oder Wirkung von Hedgehog-Protein auf eine Smoothened-abhängige Art und Weise nachzuahmen oder zu erhöhen. Der hier verwendete Begriff ”Hedgehog-Agonist” bezieht sich nicht nur auf ein beliebiges Mittel, das durch eine direkte Aktivierung der normalen Funktion des Hedgehog-Proteins wirken kann, sondern auch auf ein beliebiges Mittel, das den Hedgehog-Signalpfad aktiviert und somit die Funktion von Ptc hemmt.
  • Der Begriff ”Hedgehog-Funktionsverlust” bezieht sich auf eine abweichende Modifikation oder Mutation eines ptc-Gens, hedgehog-Gens oder smoothened-Gens oder eine Abnahme (oder einen Verlust) des Expressionsgrads eines solchen Gens, was zu einem Phänotyp führt, der dem Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Hedgehog-Inhibitor, z. B. einer abweichenden Hemmung eines Hedgehog-Pfads, ähnelt. Der Funktionsverlust kann eine Zunahme der Fähigkeit des Ptc-Genprodukts, den Expressionsgrad von Ci-Genen, z. B. Gli1, Gli2 und Gli3, zu regulieren, einschließen. Der Begriff ”Hedgehog-Funktionsverlust” wird hier auch verwendet, um auf einen beliebigen ähnlichen zellulären Phänotyp Bezug zu nehmen (der z. B. eine verringerte Proliferation zeigt), der auf Grund einer Alteration irgendwo in dem Hedgehog-Signaltransduktionspfad vorkommt, die eine Modifikation oder Mutation von Hedgehog selbst einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Eine Zelle mit einer anomal niedrigen Proliferationsgeschwindigkeit auf Grund einer Inaktivierung des Hedgehog-Signalpfads würde zum Beispiel den Phänotyp des 'Hedgehog-Funktionsverlusts' aufweisen, sogar wenn Hedgehog in dieser Zelle nicht mutiert ist.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich ”immortalisierte Zellen” auf Zellen, die durch chemische und/oder rekombinante Mittel so verändert wurden, dass die Zellen die Fähigkeit aufweisen, durch eine unbestimmte Anzahl von Teilungen in Kultur zu wachsen.
  • ”Inneres Epithelgewebe” bezieht sich auf Gewebe im Inneren des Körpers, das ähnliche Eigenschaften wie die epidermale Schicht in der Haut aufweist. Beispiele schließen die Auskleidung des Darms ein. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Förderung der Heilung bestimmter innerer Wunden, zum Beispiel Wunden, die aus einem chirurgischen Eingriff resultieren, verwendbar.
  • Der Begriff ”Keratose” bezieht sich auf eine proliferierende Hautkrankheit, die durch Hyperplasie der Hornschicht der Epidermis gekennzeichnet ist. Beispielhafte keratotische Erkrankungen schließen Keratosis follicularis, Keratosis palmaris et plantaris, Keratosis pharyngea, Keratosis pilaris und aktinische Keratose ein.
  • Der Begriff ”LD50” bedeutet die Dosis eines Arzneistoffs, die bei 50% der Versuchstiere letal ist.
  • Der Begriff ”Nagel” bezieht sich auf die hornige, kutane Platte auf der dorsalen Oberfläche des distalen Endes eines Fingers oder Zehs.
  • Der Begriff ”Patched-Funktionszunahme” bezieht sich auf eine abweichende Modifikation oder Mutation eines ptc-Gens oder einen erhöhten Expressionsgrad des Gens, was zu einem Phänotyp führt, der dem Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Hedgehog-Inhibitor, z. B. einer abweichenden Desaktivierung eines Hedgehog-Pfads, ähnelt. Die Funktionszunahme kann eine Zunahme der Fähigkeit des ptc-Genprodukts, den Expressionsgrad von Ci-Genen, z. B. Gli1, Gli2 und Gli3, zu regulieren, einschließen.
  • Ein ”Patient” oder ”Individuum”, der/das durch das vorliegende Verfahren behandelt werden soll, kann entweder einen Menschen oder ein nicht-menschliches Tier bedeuten.
  • Der Begriff ”Prodrug” soll Verbindungen umfassen, die unter physiologischen Bedingungen in die therapeutisch wirksamen Mittel der vorliegenden Erfindung umgewandelt werden. Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung eines Prodrug soll ausgewählte Einheiten einschließen, die unter physiologischen Bedingungen hydrolysiert werden, um das gewünschte Molekül freizugeben. In anderen Ausführungsformen wird das Prodrug durch eine enzymatische Aktivität des Wirtstiers umgewandelt.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich ”Proliferieren” und ”Proliferation” auf Zellen, die eine Mitose erfahren.
  • In dieser ganzen Anmeldung bezieht sich der Begriff ”proliferierende Hautkrankheit” auf eine beliebige Krankheit/Störung der Haut, die durch eine unerwünschte oder abweichende Proliferation von kutanem Gewebe gekennzeichnet ist. Diese Krankheiten sind typischerweise durch eine Proliferation epidermaler Zellen oder eine unvollständige Zelldifferenzierung gekennzeichnet und schließen zum Beispiel X-chromosomal rezessive Ichthyose, Psoriasis, atopische Dermatitis, allergische Kontaktdermatitis, epidermolytische Hyperkeratose und seborrhoische Dermatitis ein. Epidermodysplasie ist zum Beispiel eine Form einer Fehlentwicklung der Epidermis. Ein anderes Beispiel ist ”Epidermolyse”, die sich auf einen aufgelockerten Zustand der Epidermis mit Bildung von Bläschen und Blasen entweder spontan oder an der Stelle eines Traumas bezieht.
  • Der Begriff ”Haut” bezieht sich auf die äußere Schutzbedeckung des Körpers, die aus dem Corium und der Epidermis besteht und selbstverständlich die Schweiß- und Talgdrüsen sowie die Haarfollikelstrukturen einschließen soll. In der ganzen vorliegenden Anmeldung kann das Adjektiv ”kutan” verwendet werden, und sollte sich selbstverständlich allgemein auf Merkmale der Haut beziehen, wie es für den Kontext, in dem sie verwendet werden, geeignet ist.
  • Der Begriff ”kleines Molekül” bezieht sich auf eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 2500 Atommasseneinheiten, bevorzugt weniger als etwa 2000 Atommasseneinheiten, sogar noch stärker bevorzugt weniger als etwa 1500 Atommasseneinheiten, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 1000 Atommasseneinheiten oder am meisten bevorzugt weniger als etwa 750 Atommasseneinheiten.
  • Der Begriff ”Smoothened-Funktionsverlust” bezieht sich auf eine abweichende Modifikation oder Mutation eines Smo-Gens oder einen erniedrigten Expressionsgrad des Gens, was zu einem Phänotyp führt, der dem Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Hedgehog-Inhibitor, z. B. einer abweichenden Desaktivierung eines Hedgehog-Pfads, ähnelt. Ohne an einer besonderen Theorie festhalten zu wollen, wird angemerkt, dass Ptc nicht direkt in die Zelle Signale übertragen kann, sondern vielmehr mit Smoothened, einem anderen membrangebundenen Protein, das sich stromabwärts von Ptc im Hedgehog-Signalweg befindet, in Wechselwirkung tritt (Marigo et al. (1996) Nature 384: 177–179). Das Gen smo ist ein Segmentpolaritätsgen, das für die korrekte Musterbildung jedes Segments in Drosophila erforderlich ist (Alcedo et al. (1996) Cell 86: 221–232). Menschliche Homologe von Smo wurden identifiziert. Siehe zum Beispiel Stone et al. (1996) Nature 384: 129–134, und GenBank-Eintragung U84401. Das Smoothened-Gen codiert ein integrales Membranprotein mit Eigenschaften heterotrimerer, G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, d. h. 7 Transmembranregionen. Dieses Protein zeigt eine Homologie zu dem Frizzled-(Fz)-Protein von Drosophila, einem Mitglied des Wingless-Pfads. Ursprünglich wurde angenommen, dass Smo einen Rezeptor des Hh-Signals codiert. Dieser Vorschlag wurde jedoch später widerlegt, da bewiesen wurde, dass Ptc der Hh-Rezeptor ist. Zellen, die Smo exprimieren, können Hh nicht binden, was zeigt, dass Smo nicht direkt mit Hh in Wechselwirkung tritt (Nusse (1996) Nature 384: 119–120). Es wird vielmehr angenommen, dass die Bindung von Sonic- Hedgehog (Shh) an seinen Rezeptor, PTCH, eine normale Hemmung von Smoothened (Smo), eines 7-fach die Membran durchspannenden Protein, durch PTCH verhindert. Der Begriff ”therapeutischer Index” bezieht sich auf den als LD50/ED50 definierten therapeutischen Index eines Arzneistoffs.
  • Der Begriff ”Acylamino” ist in dem Fachgebiet bekannt und bezieht sich auf eine Einheit, die durch die allgemeine Formel:
    Figure 00230001
    dargestellt werden kann, wobei R9 wie vorstehend definiert ist, und R'11 Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 bedeutet, wobei m und R8 wie vorstehend definiert sind.
  • Der Begriff ”aliphatischer Rest” bezieht sich hier auf einen unverzweigten, verzweigten oder cyclischen, aliphatischen Kohlenwasserstoffrest und schließt gesättigte und ungesättigte, aliphatische Reste wie einen Alkylrest, einen Alkenylrest und einen Alkinylrest ein.
  • Die Begriffe ”Alkenyl” und ”Alkinyl” beziehen sich auf ungesättigte, aliphatische Reste, die in der Länge und möglichen Substitution zu den vorstehend beschriebenen Alkylresten analog sind, die jedoch mindestens eine Doppel- beziehungsweise Dreifachbindung enthalten.
  • Die Begriffe ”Alkoxyl” oder ”Alkoxy”, wie hier verwendet, beziehen sich auf einen Alkylrest, wie vorstehend definiert, mit einem daran gebundenen Sauerstoffrest. Repräsentative Alkoxylreste schließen Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, tert-Butoxy und dergleichen ein. Ein ”Ether” besteht aus zwei Kohlenstoffen, die durch einen Sauerstoff kovalent verbunden sind. Folglich ist der Substituent eines Alkylrestes, der den Alkylrest zu einem Ether macht, ein Alkoxyl oder ähnelt diesem, wie durch einen der Reste -O-Alkyl-, -O-Alkenyl, -O-Alkinyl, -O-(CH2)m-R8 dargestellt werden kann, wobei m und R8 wie vorstehend beschrieben sind.
  • Der Begriff ”Alkyl” bezieht sich auf den Rest aus gesättigten, aliphatischen Resten, einschließlich unverzweigter Alkylreste, verzweigter Alkylreste, Cycloalkylreste (alicyclischer Reste), alkylsubstituierter Cycloalkylreste und cycloalkylsubstituierter Alkylreste. In bevorzugten Ausführungsformen weist ein unverzweigter oder verzweigter Alkylrest 30 oder weniger Kohlenstoffatome (z. B. C1-C30 für unverzweigte Ketten, C3-C30 für verzweigte Ketten) und stärker bevorzugt 20 oder weniger in seinem Gerüst auf. Desgleichen weisen bevorzugte Cycloalkylreste 3 bis 10 Kohlenstoffatome in ihrer Ringstruktur und stärker bevorzugt 5, 6 oder 7 Kohlenstoffe in der Ringstruktur auf.
  • Ferner soll der Begriff ”Alkyl” (oder ”Niederalkyl”), wie in der ganzen Beschreibung, den Beispielen und Ansprüchen verwendet, sowohl ”unsubstituierte Alkylreste” als auch ”substituierte Alkylreste” einschließen, wobei sich die letztgenannten auf Alkyleinheiten mit Substituenten, die ein Wasserstoff an einem oder mehreren Kohlenstoff des Kohlenwasserstoffgerüsts ersetzen, beziehen. Solche Substituenten können zum Beispiel ein Halogen, ein Hydroxyl, ein Carbonyl (wie ein Carboxyl, ein Alkoxycarbonyl, ein Formyl oder ein Acyl), ein Thiocarbonyl (wie einen Thioester, ein Thioacetat oder ein Thioformiat), ein Alkoxyl, ein Phosphoryl, ein Phosphat, ein Phosphonat, ein Phosphinat, ein Amino, ein Amido, ein Amidin, ein Imin, ein Cyano, ein Nitro, ein Azido, ein Sulfhydryl, ein Alkylthio, ein Sulfat, ein Sulfonat, ein Sulfamoyl, ein Sulfonamido, ein Sulfonyl, ein Heterocyclyl, ein Aralkyl oder eine aromatische oder heteroaromatische Einheit einschließen. Für Fachleute ist es selbstverständlich, dass die an der Kohlenstoffkette substituierten Einheiten, falls geeignet, selbst substituiert sein können. Die Substituenten eines substituierten Alkylrestes können beispielsweise substituierte und unsubstituierte Formen von Amino-, Azido-, Imino-, Amido-, Phosphoryl-(einschließlich Phosphonat und Phosphinat), Sulfonyl-(einschließlich Sulfat, Sulfonamido, Sulfamoyl und Sulfonat) und Silylgruppen sowie Ether, Alkylthioreste, Carbonylgruppen (einschließlich Ketonen, Aldehyden, Carboxylaten und Ester), -CF3, -CN und dergleichen einschließen. Beispielhafte substituierte Alkylreste sind nachstehend beschrieben. Cycloalkylreste können mit Alkylresten, Alkenylresten, Alkoxyresten, Alkylthioresten, Aminoalkylresten, carbonylsubstituierten Alkylresten, -CF3, -CN und dergleichen weiter substituiert sein.
  • Wenn die Anzahl an Kohlenstoffatomen nicht anders angegeben ist, bedeutet ”Niederalkyl”, wie hier verwendet, einen Alkylrest, wie vorstehend definiert, der jedoch eins bis zehn Kohlenstoffatome und stärker bevorzugt eins bis sechs Kohlenstoffatome in seiner Gerüststruktur aufweist. Desgleichen weisen ”Niederalkenyl” und ”Niederalkinyl” ähnliche Kettenlängen auf. In der ganzen Beschreibung bevorzugte Alkylreste sind Niederalkylreste. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein hier als Alkyl bezeichneter Substituent ein Niederalkyl.
  • Der Begriff ”Alkylthio” bezieht sich auf einen Alkylrest, wie vorstehend definiert, mit einem daran gebundenem Schwefelrest. In bevorzugten Ausführungsformen ist die ”Alkylthio”einheit durch einen der Reste -S-Alkyl, -S-Alkenyl, -S-Alkinyl und -S-(CH2)m-R8 dargestellt, wobei m und R8 wie vorstehend definiert sind. Repräsentative Alkylthioreste schließen Methylthio, Ethylthio und dergleichen ein.
  • Die Begriffe ”Amin” und ”Amin” sind in dem Fachgebiet bekannt und beziehen sich sowohl auf unsubstituierte als auch substituierte Amine, zum Beispiel auf eine Einheit, die durch die allgemeine Formel:
    Figure 00250001
    dargestellt werden kann, wobei R9, R10 und R'10 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl, -(CH2)m-R8 bedeuten, oder R9 und R10 zusammengenommen mit dem N-Atom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen; R8 ein Aryl, ein Cycloalkyl, ein Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycyclus bedeutet und m null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist. In bevorzugten Ausführungsformen kann nur einer der Reste R9 oder R10 ein Carbonyl sein, z. B. bilden R9, R10 und der Stickstoff zusammen kein Imid. In noch stärker bevorzugten Ausfühungsformen umfasst der Begriff ”Amin” keine Amide, z. B. wenn einer der Reste R9 und R10 ein Carbonyl bedeutet. In noch stärker bevorzugten Ausführungsformen bedeuten R9 und R10 (und gegebenenfalls R'10) jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8. Somit bedeutet der Begriff ”Alkylamin”, wie hier verwendet, eine Amingruppe, wie vorstehend definiert, mit einem daran gebundenen substituierten oder unsubstituierten Alkyl, d. h. mindestens einer der Reste R9 und R10 ist ein Alkylrest.
  • Der Begriff ”Amido” ist als ein aminosubstituiertes Carbonyl in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel:
    Figure 00260001
    dargestellt werden kann, wobei R9 und R10 wie vorstehend definiert sind. Bevorzugte Ausführungsformen des Amids schließen keine Imide, die instabil sein können, ein.
  • Der Begriff ”Aralkyl”, wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Alkylrest, der mit einem Arylrest (z. B. einem aromatischen oder heteroaromatischen Rest) substituiert ist. Der Begriff ”Aryl”, wie hier verwendet, schließt aromatische Reste mit einem 5-, 6- und 7-gliedrigen einzelnen Ring, der null bis vier Heteroatome einschließen kann, zum Beispiel Benzol, Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Triazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin und Pyrimidin und dergleichen, ein. Diese Arylreste mit Heteroatomen in der Ringstruktur können auch als ”Arylheterocyclen” oder ”heteroaromatische Verbindungen” bezeichnet werden. Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen mit solchen Substituenten, wie vorstehend beschrieben, zum Beispiel Halogen, Azid, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Alkoxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Sulfonamido, Keton, Aldehyd, Ester, Heterocyclyl, aromatischen oder heteroaromatischen Einheiten, -CF3, -CN oder dergleichen, substituiert sein. Der Begriff ”Aryl” schließt auch polycyclische Ringsysteme mit zwei oder mehr cyclischen Ringen ein, in denen zwei oder mehr Kohlenstoffe zwei benachbarten Ringen (die Ringe sind ”kondensierte Ringe”) gemeinsam sind, wobei mindestens einer der Ringe aromatisch ist und z. B. die anderen cyclischen Ringe Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Cycloalkinyl-, Aryl- und/oder heterocyclische Reste sein können.
  • Der Begriff ”Carbocyclus”, wie hier verwendet, bezieht sich auf einen aromatischen oder nichtaromatischen Ring, in dem jedes Atom des Ringes Kohlenstoff ist.
  • Der Begriff ”Carbonyl” ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt solche Einheiten ein, wie durch die allgemeine Formel:
    Figure 00260002
    dargestellt werden können, wobei X eine Bindung ist oder Sauerstoff oder Schwefel bedeutet, und R11 Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl, -(CH2)m-R8 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz bedeutet, R'11 Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 bedeutet, wobei m und R8 wie vorstehend definiert sind. Wenn X Sauerstoff ist, und R11 oder R'11 kein Wasserstoff ist, stellt die Formel einen ”Ester” dar. Wenn X Sauerstoff ist, und R11 wie vorstehend definiert ist, wird die Einheit hier als Carboxylgruppe bezeichnet, und besonders, wenn R11 Wasserstoff ist, stellt die Formel eine ”Carbonsäure” dar. Wenn X Sauerstoff ist, und R'11 Wasserstoff ist, stellt die Formel ein ”Formiat” dar. Wenn das Sauerstoffatom der vorstehenden Formel durch Schwefel ersetzt ist, stellt die Formel im Allgemeinen eine ”Thiocarbonyl”gruppe dar. Wenn X Schwefel ist, und R11 oder R'11 kein Wasserstoff ist, stellt die Formel einen ”Thioester” dar. Wenn X Schwefel ist, und R11 Wasserstoff ist, stellt die Formel eine ”Thiocarbonsäure” dar. Wenn X Schwefel ist, und R'11 Wasserstoff ist, stellt die Formel ein ”Thioformiat” dar. Andererseits, wenn X eine Bindung ist, und R11 kein Wasserstoff ist, stellt die vorstehende Formel eine ”Keton”gruppe dar. Wenn X eine Bindung ist, und R11 Wasserstoff ist, stellt die vorstehende Formel eine ”Aldehyd”gruppe dar.
  • Der Begriff ”Heteroatom”, wie hier verwendet, bedeutet ein Atom eines beliebigen anderen Elements als Kohlenstoff oder Wasserstoff, Bevorzugte Heteroatome sind Bor, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel und Selen.
  • Die Begriffe ”Heterocyclyl” oder ”heterocyclischer Rest” beziehen sich auf 3- bis 10-gliedrige Ringstrukturen und stärker bevorzugt 3- bis 7-gliedrige Ringe, deren Ringstrukturen ein bis vier Heteroatome einschließen. Heterocyclen können auch Polycyclen sein. Heterocyclylreste schließen zum Beispiel Thiophen, Thianthren, Furan, Pyran, Isobenzofuran, Chromen, Xanthen, Phenoxathiin, Pyrrol, Imidazol, Pyrazol, Isothiazol, Isoxazol, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Pyridazin, Indolizin, Isoindol, Indol, Indazol, Purin, Chinolizin, Isochinolin, Chinolin, Phthalazin, Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Pteridin, Carbazol, Carbolin, Phenanthridin, Acridin, Pyrimidin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenarsazin, Phenothiazin, Furazan, Phenoxazin, Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Oxazol, Piperidin, Piperazin, Morpholin, Lactone, Lactame wie Azetidinone und Pyrrolidinone, Sultame, Sultone und dergleichen ein. Der heterocyclische Ring kann an einer oder mehreren Positionen mit solchen Substituenten, wie vorstehend beschrieben, wie zum Beispiel Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclyl, einer aromatischen oder heteroaromatischen Einheit, -CF3, -CN oder dergleichen substituiert sein.
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff ”Nitro” -NO2; bezeichnet der Begriff ”Halogen” -F, -Cl, -Br oder -I; bedeutet der Begriff ”Sulfhydryl” -SH; bedeutet der Begriff ”Hydroxyl” -OH; und bedeutet der Begriff ”Sulfonyl” -SO2-.
  • Ein ”Phosphonamidit” kann in der allgemeinen Formel:
    Figure 00280001
    dargestellt werden, wobei R9 und R10 wie vorstehend definiert sind, Q2 O, S oder N bedeutet, und R48 ein Niederalkyl oder ein Aryl bedeutet, und Q2 O, S oder N bedeutet.
  • Ein ”Phosphoramidit” kann in der allgemeinen Formel:
    Figure 00280002
    dargestellt werden, wobei R9 und R10 wie vorstehend definiert sind, und Q2 O, S oder N bedeutet.
  • Ein ”Phosphoryl” kann allgemein durch die Formel:
    Figure 00280003
    dargestellt werden, wobei Q1 S oder O bedeutet, und R46 Wasserstoff, ein Niederalkyl oder ein Aryl bedeutet. Wenn der Phosphorylrest als Substituent, zum Beispiel eines Alkyls, verwendet wird, kann der Phosphorylrest des Phosphorylalkyls durch die allgemeine Formel:
    Figure 00290001
    dargestellt werden, wobei Q1 S oder O bedeutet, und jedes R46 unabhängig Wasserstoff, ein Niederalkyl oder ein Aryl bedeutet, und Q2 O, S oder N bedeutet. Wenn Q1 S bedeutet, ist die Phosphoryleinheit ein ”Phosphorothioat”.
  • Die Begriffe ”Polycyclyl” oder ”polycyclischer Rest” beziehen sich auf zwei oder mehr Ringe (z. B. Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Cycloalkinyl-, Aryl- und/oder heterocyclische Reste), in denen zwei oder mehr Kohlenstoffe zwei benachbarten Ringen gemeinsam sind, wobei die Ringe z. B. ”kondensierte Ringe” sind. Ringe, die durch nicht-benachbarte Atome verbunden sind, werden als ”verbrückte” Ringe bezeichnet. Jeder der Ringe des Polycyclus kann mit solchen Substituenten, wie vorstehend beschrieben, wie zum Beispiel Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclyl, einer aromatischen oder heteroaromatischen Einheit, -CF3, -CN oder dergleichen, substituiert sein.
  • Der Ausdruck ”Schutzgruppe”, wie hier verwendet, bedeutet temporäre Substituenten, die eine möglicherweise reaktive funktionelle Gruppe vor unerwünschten chemischen Umwandlungen schützen. Beispiele solcher Schutzgruppen schließen Ester von Carbonsäuren, Silylether von Alkoholen und Acetale und Ketale von Aldehyden beziehungweise Ketonen ein. Über das Gebiet der Schutzgruppenchemie wurde ein Überblick gegeben (Greene, T. W.; Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Aufl.; Wiley: New York, 1991).
  • Ein ”Selenoalkyl” bezieht sich auf einen Alkylrest mit einer daran als Substituent gebundenen Selengruppe. Beispielhafte ”Selenoether”, die an dem Alkyl substituiert sein können, sind ausgewählt aus -Se-Alkyl, -Se-Alkenyl, -Se-Alkinyl und -Se-(CH2)m-R8, wobei m und R8 wie vorstehend definiert sind.
  • Wie hier verwendet, soll der Begriff ”substituiert” alle erlaubten Substituenten organischer Verbindungen einschließen. Unter einem breiten Aspekt schließen die erlaubten Substituenten acyclische und cyclische, verzweigte und urverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht-aromatische Substituenten organischer Verbindungen ein. Beispielhafte Substituenten schließen zum Beispiel die hier vorstehend beschriebenen ein. Die erlaubten Substituenten können einer oder mehrere und dieselben oder verschiedene für geeignete organische Verbindungen sein. Für die Zwecke dieser Erfindung können die Heteroatome wie Stickstoff Wasserstoffsubstituenten und/oder beliebige erlaubte Substituenten organischer Verbindungen, die hier beschrieben werden und die die Valenzen der Heteroatome absättigen, aufweisen. Diese Erfindung soll durch die erlaubten Substituenten organischer Verbindungen in keiner Weise eingeschränkt werden.
  • Es ist selbstverständlich, dass ”Substitution” oder ”substituiert mit” die implizierte Maßgabe einschließt, dass eine solche Substitution gemäß der erlaubten Valenz des substituierten Atoms und des Substituenten erfolgt und dass die Substitution zu einer stabilen Verbindung führt, die z. B. nicht spontan eine Umwandlung wie durch eine Umlagerung, Cyclisierung, Elimierung etc. erfährt.
  • Der Begriff ”Sulfamoyl” ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel:
    Figure 00300001
    dargestellt werden kann, wobei R9 und R10 wie vorstehend definiert sind.
  • Der Begriff ”Sulfat” ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel:
    Figure 00300002
    dargestellt werden kann, wobei R41 wie vorstehend definiert ist.
  • Der Begriff ”Sulfonamido” ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel:
    Figure 00310001
    dargestellt werden kann, wobei R9 und R'11 wie vorstehend definiert sind.
  • Der Begriff ”Sulfonat” ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel:
    Figure 00310002
    dargestellt werden kann, wobei R41 ein Elektronenpaar, Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl ist.
  • Die Begriffe ”Sulfoxido” oder ”Sulfinyl”, wie hier verwendet, beziehen sich auf eine Einheit, die durch die allgemeine Formel:
    Figure 00310003
    dargestellt werden kann, wobei R44 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aralkyl oder Aryl.
  • Analoge Substitutionen können an Alkenyl- oder Alkinylresten durchgeführt werden, um zum Beispiel Aminoalkenyl-, Aminoalkinyl-, Amidoalkenyl-, Amidoalkinyl-, Iminoalkenyl-, Iminoalkinyl-, Thioalkenyl-, Thioalkinyl-, carbonylsubstituierte Alkenyl- oder Alkinylreste herzustellen.
  • Wie hier verwendet, soll die Definition jedes Ausdrucks, z. B. Alkyl, m, n etc., wenn er in einer beliebigen Struktur mehr als einmal vorkommt, unabhängig von seiner Definition anderswo in derselben Struktur sein.
  • Die Begriffe Triflyl, Tosyl, Mesyl und Nonaflyl sind in dem Fachgebiet bekannt und beziehen sich auf eine Trifluormethansulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, Methansulfonyl- beziehungsweise Nonafluorbutansulfonylgruppe. Die Begriffe Triflat, Tosylat, Mesylat und Nonaflat sind in dem Fachgebiet bekannt und beziehen sich auf eine funktionelle Trifluormethansulfonsäureester-, p-Toluolsulfonsäureester-, Methansulfonsäureester- und Nonafluorbutansulfonsäureestergruppen beziehungsweise Moleküle, die die Gruppen enthalten.
  • Die Abkürzugen Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts und Ms bedeuten Methyl, Ethyl, Phenyl, Trifluormethansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, p-Toluolsulfonyl beziehungsweise Methansulfonyl. Eine umfassendere Liste der Abkürzungen, die von Durchschnittsfachleuten der organischen Chemie verwendet werden, erscheint in der ersten Ausgabe jedes Bandes des Journal of Organic Chemistry; diese Liste wird typischerweise in einer Tabelle mit dem Titel Standard List of Abbrevations vorgelegt. Die in der Liste enthaltenen Abkürzungen und alle Abkürzungen, die von Durchschnittsfachleuten der organischen Chemie verwendet werden, sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Bestimmte Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in besonderen geometrischen oder stereoisomeren Formen vorkommen. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, dass alle diese Verbindungen, einschließlich der cis- und trans-Isomere, R- und S-Enantiomere, Diastereomere, (D)-Isomere, (L)-Isomere, der racemischen Gemische davon und anderer Gemische davon, in den Umfang der Erfindung fallen. In einem Substituenten wie einem Alkylrest können zusätzliche asymmetrische Kohlenstoffatome vorhanden sein. Alle diese Isomere sowie Gemische davon sollen in dieser Erfindung eingeschlossen sein.
  • Wenn beispielsweise ein besonderes Enantiomer einer Verbindung der vorliegenden Erfindung gewünscht ist, kann es durch asymmetrische Synthese oder durch Derivatisierung mit einem chiralen Hilfsmittel hergestellt werden, wobei das so erhaltene diastereomere Gemisch getrennt und die Hilfsgruppe abgespalten wird, um die gewünschten reinen Enantiomere bereitzustellen. In einer anderen Ausführungsform können, wenn das Molekül eine basische funktionelle Gruppe wie eine Aminogruppe oder eine saure funktionelle Gruppe wie eine Carboxylgruppe enthält, mit einer geeigneten optisch aktiven Säure oder Base diastereomere Salze gebildet werden, gefolgt von der Auflösung der so geformten Diastereomere durch fraktionierte Kristallisation oder Chromatographievorrichtungen, die in dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, und nachfolgende Gewinnung der reinen Enantiomere.
  • Beabsichtigte Äquivalente der vorstehend beschriebenen Verbindungen schließen Verbindungen ein, die ihnen im Übrigen entsprechen und dieselben allgemeinen Eigenschaften wie sie aufweisen (z. B. die Fähigkeit, den Hedgehog-Signalweg zu aktivieren), wobei eine oder mehrere einfache Änderungen von Substituenten, die die Wirksamkeit der Verbindung nicht nachteilig beeinflussen, durchgeführt werden. Im Allgemeinen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch Verfahren, die in allgemeinen Reaktionsschemata, wie zum Beispiel nachstehend beschrieben, veranschaulicht sind, oder durch Modifikationen davon unter Verwendung von leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien, Reagenzien und herkömmlichen Syntheseverfahren hergestellt werden. In diesen Reaktionen ist es auch möglich, von Varianten Gebrauch zu machen, die an sich bekannt sind, jedoch hier nicht erwähnt werden.
  • Für die Zwecke dieser Erfindung werden die chemischen Elemente gemäß dem Periodensystem der Elemente, CAS-Version, Handbook of Chemistry und Physics, 67. Aufl., 1986–87, auf der Innenseite des Schutzumschlags, identifiziert. Ebenfalls für die Zwecke dieser Erfindung ist es beabsichtigt, das der Begriff ”Kohlenwasserstoff' alle möglichen Verbindungen mit mindestens einem Wasserstoff- und einem Kohlenstoffatom einschließt. Im weitesten Sinn schließen die erlaubten Kohlenwasserstoffe acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht-aromatische, organische Verbindungen, die substituiert oder unsubstituiert sein können, ein.
  • III. Beispielhafte Verbindungen der Erfindung
  • Wie es nachstehend ausführlicher beschrieben wurde, ist es beabsichtigt, dass die vorliegenden Verfahren unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen kleinen Molekülen durchgeführt werden können, die zum Beispiel durch Arzneistoff-Durchmusterungstests, wie hier beschrieben, leicht identifiziert werden können.
  • In bestimmten Ausführungsformen können in der vorliegenden Erfindung verwendbare Verbindungen durch die allgemeine Formel (II):
    Figure 00340001
    Formel II dargestellt werden, wobei, wie es die Valenz und Stabilität möglich machen,
    Ar und Ar' unabhängig voneinander substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Heteroarylringe bedeuten;
    Y unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist;
    X ausgewählt ist aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)- und einer Methylengruppe, die gegebenenfalls mit 1 bis 2 Resten wie Niederalkyl-, -alkenyl- oder -alkinylresten substituiert ist;
    M unabhängig bei jedem Vorkommen eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe wie -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)- etc. bedeutet; oder zwei M zusammengenommen substituiertes oder unsubstituiertes Ethen oder Ethin bedeuten, wobei einige oder jedes vorkommende M in Mj die ganze oder einen Teil einer cyclischen Struktur bilden;
    Cy' ein substituiertes oder unsubstituiertes Benzothiophen bedeutet;
    j unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10, bevorzugt von 2 bis 7, bedeutet; und
    i unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5, bevorzugt von 0 bis 2, bedeutet.
  • In bestimmten Ausführungsformen bedeutet M unabhängig bei jedem Vorkommen eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe wie -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)- etc.
  • In bestimmten Ausführungsformen bedeuten Ar und Ar' Phenylringe, die z. B. unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Resten, einschließlich Heteroatomen wie O, N und S substituiert sind. In bestimmten Ausführungsformen bedeutet mindestens eines von Ar und Ar' einen Phenylring. In bestimmten Ausführungsformen bedeutet mindestens eines von Ar und Ar' einen Heteroarylring, z. B. ein Pyridyl, Thiazolyl, Thienyl, Pyrimidyl etc. In bestimmten Ausführungsformen sind Y und Ar' in einer meta- und/oder 1,3-Beziehung an Ar gebunden.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist X ausgewählt aus -C(=O)-, -C(=S)- und -S(O2)-.
  • R bedeutet H oder Niederalkyl, z. B. H oder Me.
  • NR2 bedeutet ein sekundäres oder tertiäres Amin, das mit einem oder zwei Niederalkylresten substituiert ist, bevorzugt ein sekundäres Amin.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind Substituenten an Ar oder Ar' ausgewählt aus Halogen, Niederalkyl, Niederalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Carbonyl, Thiocarbonyl, Keton, Aldehyd, Amino, Acylamino, Cyano, Nitro, Hydroxyl, Azido, Sulfonyl, Sulfoxido, Sulfat, Sulfonat, Sulfamoyl, Sulfonamido, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphinat, -(CH2)pAlkyl, -(CH2)pAlkenyl, -(CH2)pAlkinyl, -(CH2)pAryl, -(CH2)pAralkyl, -(CH2)pOH, -(CH2)pO-Niederalkyl, -(CH2)pO-Niederalkenyl, -O(CH2)nR, -(CH2)pSH, -(CH2)pS–Niederalkyl, -(CH2)pS-Niederalkenyl, -S(CH2)nR, -(CH2)pN(R)2, -(CH2)pNR-Niederalkyl, -(CH2)pNR-Niederalkenyl, -NR(CH2)nR und geschützten Formen der vorstehenden Substituenten, wobei p und n einzeln bei jedem Vorkommen ganze Zahlen von 0 bis 10, bevorzugt von 0 bis 5, bedeuten.
  • In bestimmten Ausführungsformen können in der vorliegenden Erfindung verwendbare Verbindungen durch die allgemeine Formel (X):
    Figure 00350001
    Formel X dargestellt werden, wobei, wie es die Valenz und Stabilität möglich machen,
    Ar einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring bedeutet; Z nicht vorhanden ist oder einen substituierten oder unsubstituierten Aryl-, Carbocyclyl-, Heterocyclyl- oder Heteroarylring oder einen Nitro-, Cyano- oder Halogensubstituenten bedeutet;
    Y bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist;
    X ausgewählt ist aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)- und einer Methylengruppe, die gegebenenfalls mit 1 bis 2 Resten wie Niederalkyl-, -alkenyl- oder -alkinylresten substituiert ist;
    R unabhängig bei jedem Vorkommen H oder Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet;
    M unabhängig bei jedem Vorkommen eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe wie -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)- etc. bedeutet;
    j unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 2 bis 10, bevorzugt von 2 bis 7, bedeutet;
    i unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5, bevorzugt von 0 bis 2, bedeutet; und
    k bei jedem Vorkommen 0 bedeutet.
  • NR2 bedeutet ein sekundäres oder tertiäres Amin, das mit einem oder zwei Niederalkylresten, substituiert ist, bevorzugt ein sekundäres Amin.
  • In bestimmten Ausführungsformen bedeutet Ar einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring, der z. B. unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Resten, gegebenenfalls einschließlich Heteroatomen wie O, N und S substituiert ist. In bestimmten Ausführungsformen bedeutet mindestens eines von Ar und Ar' einen Phenylring. In bestimmten Ausführungsformen bedeutet mindestens eines von Ar und Ar' einen Heteroarylring, z. B. ein Pyridyl, Thiazolyl, Thienyl, Pyrimidyl, Furanyl etc. In bestimmten Ausführungsformen ist jedes vorkommende Y, das an Ar gebunden ist, in einer meta- und/oder 1,3-Beziehung angeordnet.
  • Cy' bedeutet ein substituiertes oder unsubstituiertes Benzo(b)thien-2-yl.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist X ausgewählt aus -C(=O)-, -C(=S)- und -S(O2)-.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind Substituenten an Ar oder Z, wenn Z ein Aryl- oder Heteroarylring ist, ausgewählt aus Halogen, Niederalkyl, Niederalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Carbonyl, Thiocarbonyl, Keton, Aldehyd, Amino, Acylamino, Cyano, Nitro, Hydroxyl, Azido, Sulfonyl, Sulfoxido, Sulfat, Sulfonat, Sulfamoyl, Sulfonamido, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphinat, -(CH2)pAlkyl, -(CH2)pAlkenyl, -(CH2)pAlkinyl, -(CH2)pAryl, -(CH2)pAralkyl, -(CH2)pOH, -(CH2)pO-Niederalkyl, -(CH2)pO-Niederalkenyl, -O(CH2)nR, -(CH2)pSH, -(CH2)pS-Niederalkyl, -(CH2)pS-Niederalkenyl, -S(CH2)nR, -(CH2)pN(R)2, -(CH2)pNR-Niederalkyl, -(CH2)pNR-Niederalkenyl, -NR(CH2)nR und geschützten Formen der vorstehenden Substituenten, wobei n und p einzeln bei jedem Vorkommen ganze Zahlen von 0 bis 10, bevorzugt von 0 bis 5, bedeuten.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist Z direkt an Ar gebunden oder durch eine Kette aus einem oder zwei Atomen an Ar gebunden. In bestimmten Ausführungsformen ist Z-Y-M zusammengenommen nicht vorhanden.
  • In bestimmten Ausführungsformen können die vorliegenden Agonisten auf der Basis ihrer Selektivität für den Hedgehog-Pfad ausgewählt werden. Diese Selektivität kann für den Hedgehog-Pfad gegenüber anderen Pfaden bestehen oder eine Selektivität zwischen besonderen Hedgehog-Pfaden, z. B. Ptc1, Ptc2 etc., sein.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen modulieren die vorliegenden Agonisten die Ptc-Smo-vermittelte Signaltransduktion mit einer ED50 von 1 mM oder weniger, stärker bevorzugt von 1 μM oder weniger und sogar noch stärker bevorzugt von 1 nM oder weniger. Hinsichtlich Hedgehog-abhängiger Agonisten verstärken die vorliegenden Agonisten die Aktivität von Hedgehog 10-fach, 100-fach oder sogar 1000-fach.
  • In besonderen Ausführungsformen wird das kleine Molekül für die Verwendung ausgewählt, da es für eine Patched-Isoform selektiver ist als für die nächste, z. B. 10-fach, und stärker bevorzugt mindestens 100- oder sogar 1000-fach selektiver für einen Patched-Pfad (Ptc1, Ptc2) als für einen anderen.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird eine Verbindung, die ein Agonist des Hedgehog-Pfads ist, ausgewählt, um die Hedgehog-Aktivität gegenüber anderen Proteinkinasen als PKA, wie PKC, selektiv agonistisch zu beeinflussen, wobei z. B. die Verbindung die Aktivität des PKA/Hedgehog-Pfads um mindestens eine Größenordnung stärker, bevorzugt mindestens zwei Größenordnungen stärker und sogar noch stärker bevorzugt mindestens drei Größenordnungen stärker moduliert als sie die Aktivität einer anderen Proteinkinase moduliert. Somit kann zum Beispiel ein bevorzugter Aktivator des Hedgehog-Pfads die Hedgehog-Aktivität mit einer Ki, die mindestens eine Größenordnung niedriger, bevorzugt mindestens zwei Größenordnungen niedriger und sogar noch stärker bevorzugt mindestens drei Größenordnungen niedriger als seine Ki für die Aktivierung von PKC ist, aktivieren. In bestimmten Ausführungsformen ist die Ki für die PKA/Hedgehog-Aktivierung kleiner als 10 nM, bevorzugt kleiner als 1 nM und sogar noch stärker bevorzugt kleiner als 0,1 nM.
  • Synthese der vorliegenden Verbindungen
  • Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch Standardverfahren der organischen Synthese, z. B. gemäß der in der nachstehenden Veranschaulichung dargestellten Beispielen leicht hergestellt werden. Eine vorliegende Verbindung kann zum Beispiel durch Umsetzung einer Verbindung oder eines Verbindungspaars, die/das als A bezeichnet wird, mit einer Verbindung oder einem Verbindungspaar, die/das als B bezeichnet wird, und einer Verbindung, die als C bezeichnet wird, wie nachstehend dargestellt, hergestellt werden:
    Figure 00380001
  • Entsprechend kann eine Verbindung, die vorstehend als C bezeichnet wird, mit einer Verbindung oder einem Verbindungspaar, die/das als D bezeichnet wird, und einer Verbindung oder einem Verbindungspaar, die/das als E bezeichnet wird, umgesetzt werden:
    Figure 00390001
  • In einer anderen Ausführungsform kann eine Verbindung oder ein Verbindungspaar, die/das vorstehend als A bezeichnet wird, und eine Verbindung oder ein Verbindungspaar, die/das vorstehend als E bezeichnet wird, mit einer Verbindung, die als F bezeichnet wird, umgesetzt werden:
    Figure 00390002
  • Kombinationen von Verbindungen, wie vorstehend gezeigt, werden bevorzugt in Reihe miteinander umgesetzt, wobei z. B. zwei Verbindungen miteinander umgesetzt werden, das Produkt mit einer dritten Verbindung umgesetzt wird, etc., und die Verbindungen im Allgemeinen in einer beliebigen Reihenfolge in Reihe gekuppelt werden können, wie es für einen Fachmann selbstverständlich ist. In bestimmten Ausführungsformen können funktionelle Gruppen an einer oder mehreren Verbindungen während einer oder mehrerer Reaktionen einen Schutz erfordern, wie es in dem Fachgebiet allgemein selbstverständlich ist, und beliebige geeignete Schutzgruppen können für diesen Zweck verwendet werden. Ein Fachmann kann für eine besondere funktionelle Gruppe und eine besondere Reaktion leicht geeignete Schutzgruppen auswählen. Aufarbeitungsschritte können jederzeit durchgeführt werden, um funktionelle Gruppen oder Einheiten an dem Reaktionsprodukt zu modifizieren, zum Beispiel um N(R)2=NH2 durch z. B. nukleophile Substitution, reduktive Alkylierung oder ein beliebiges anderes geeignetes Verfahren in N(R)2=NHR umzuwandeln.
  • In den vorstehend als A bis F bezeichneten Verbindungen sind die Elemente M, X, Y, Z, Cy, Cy', Ar, i, k, R etc. wie vorstehend definiert (was durch die nachstehende Beschreibung erweitert werden kann), und bedeutet R' unabhängig bei jedem Vorkommen H, eine Schutzgruppe oder eine unbeständige reaktive Gruppe wie eine Trialkylsilylgruppe (z. B. Trimethylsilylgruppe), und bedeutet R'' unabhängig bei jedem Vorkommen 1) eine Abgangsgruppe wie ein Halogen (z. B. F, Cl, Br oder I), Alkylthio, Cyano, Alkoxy oder eine beliebige andere Gruppe die durch ein Aminnukleophil ersetzt werden kann, wenn sie an X gebunden ist, 2) eine aktivierbare Gruppe, wie OH, die durch ein Aktivierungsmittel wie ein Carbodiimid (z. B. Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid etc.), Reagenzien auf Phosphorbasis (wie BOP-Cl, PyBROP etc.), Oxalylchlorid, Phosgen, Triphosgen oder ein beliebiges ähnliches Reagenz aktiviert werden kann, wobei sich eine reaktive Zwischenverbindung mit einer erhöhten Empfindlichkeit, bezogen auf die Verbindung, in der R'' = OH, gegenüber einer Kupplung mit einem Amin ergibt, oder 3) bedeuten X und R'' zusammengenommen eine elektrophile Gruppe, die mit einem Amin reagieren kann, wie Isocyanat, Isothiocyanat oder eine andere ähnliche reaktive Einheit. Die verschiedenen Untereinheiten, die als A bis F bezeichnet wurden, können unter Verwendung von einer beliebigen vieler verschiedener Reaktionen, die Fachleuten allgemein bekannt sind, abhängig von den zu kuppelnden besonderen Einheiten kombiniert werden. Ein Amin wie eine der NH2-Gruppen, die an den Untereinheiten A bis F gezeigt sind, kann zum Beispiel durch reduktive Alkylierung (z. B. das endständig vorkommende M ist ein Aldehyd), durch nukleophilen Ersatz einer Abgangsgruppe (wie eines Halogens, Sulfonats oder eines anderen geeigneten Substituenten), durch nukleophile Öffnung eines Epoxids oder durch eine beliebige andere geeignete Reaktion, die Fachleuten bekannt ist, mit einem Alkylrest gekuppelt werden. Entsprechend können Amine mit aktivierten Carbonsäurederivaten oder Thiocarbonsäurederivaten, die z. B. aus einer Carbonsäure oder Thiocarbonsäure und einem Aktivierungsmittel in situ hergestellt wurden oder als isolierte Verbindungen wie Isocyanate, Carbonsäurechloride etc. hergestellt wurden, gekuppelt werden, wobei Amide, Harnstoffe, Thioharnstoffe, Thioamide etc. bereitgestellt werden, mit Chlorameisensäureestern, Sulfonylchloriden oder anderen derartigen Verbindungen gekuppelt werden, wobei Urethane, Sulfonamide etc. bereitgestellt werden, oder mit anderen elektrophilen Reagenzien, die mit einem Amin eine kovalente Bindung bilden, gekuppelt werden.
  • Aryl- und/oder Heteroarylringe können unter Verwendung der Stille-Reaktion, Suzuki-Reaktion oder anderer verwandter Reaktionen wie Palladium-vermittelter Kreuzkupplungsreaktionen leicht gekuppelt werden. Aryl- und/oder Heteroarylringe können durch ein Heteroatom, z. B. unter Verwendung von Reaktionen wie der Ullman-Reaktion, einer beliebigen der verschiedenen Palladium-vermittelten Reaktionen, die von S. Buchwald und anderen entwickelt wurden, durch nukleophile aromatische Substitution oder andere derartige Reaktionen leicht gekuppelt werden. Entsprechend können Amine, Alkohole, Thiole und andere derartige Heteroatome tragende Verbindungen unter Verwendung von Palladium-vermittelten Reaktionen, die von S. Buchwald und anderen entwickelt wurden, nukleophiler aromatischer Substitution etc. an Aryl- und/oder Heteroarylringe gekuppelt werden. Aryl- und/oder Heteroarylringe, die durch substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffketten verbunden sind, können durch die Stille-Reaktion, Suzuki-Reaktion, Heck-Reaktion, Friedel-Crafts-Reaktion und andere Reaktionen, wie sie für Fachleute offensichtlich sind, hergestellt werden.
  • Ein Überblick über mehrere allgemeine Synthesereaktionen, die möglicherweise zur Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, ist nachstehend und in den 1 bis 31 ausführlicher beschrieben. Die unterschiedlichen Gruppen, die in den als A bis F bezeichneten Untereinheiten eingeschlossen sind, können, um einer beliebigen der Formeln II oder X zu entsprechen, verändert werden, ohne von den vorstehend dargestellten allgemeinen Syntheseverfahren abzuweichen.
  • Entsprechend können Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch Kupplung einer geeigneten Einheit zu einer teilweise zusammengesetzten Struktur hergestellt werden.
  • Zum Beispiel kann eine Verbindung der Formel X durch einen beliebigen der Schritte in dem nachstehenden Schema hergestellt werden.
  • Figure 00420001
  • In den vorstehenden Schemata entsprechen M, Cy, Ar, X, Cy', Y, Z, R, i, k, R' und R'' ihrer vorstehenden Verwendung und können enger, als in der Beschreibung der Formel X dargestellt, definiert werden oder entsprechen Elementen der Formel II, die gegebenenfalls durch die Beschreibung, die die Formel II begleitet, modifiziert sind.
  • Reaktionen, die zur Durchführung von Schritt I geeignet sind, schließen Palladium-vermittelte Reaktionen, die von S. Buchwald und anderen entwickelt wurden, nukleophile aromatische Substitution, oxidative Kupplung etc. ein.
  • Reaktionen, die zur Durchführung von Schritt II geeignet sind, schließen den nukleophilen Ersatz einer Abgangsgruppe an M, reduktive Alkylierung, eine Reaktion des Amins mit einem elektrophilen Carbonsäure-/Thiocarbonsäure-Derivat (Säurechlorid, Isocyanat, Isothiocyanat oder einer Carbonsäure, die durch BOP-Cl, PyBrOP, Carbodiimid oder ein anderes aktivierendes Reagenz (wie sie in dem Fachgebiet der Peptidkupplung allgemein verwendet werden) aktiviert wurde) oder andere ähnliche Reaktionen, einschließlich der in bestimmten der 1 bis 31 und der nachstehenden Begleitbeschreibung ausführlich dargestellten, oder, wenn M und Y nicht vorhanden sind, eine Palladium-vermittelte Kupplung, wie sie von Buchwald und anderen entwickelt wurde, ein.
  • Reaktionen, die zur Durchführung von Schritt III oder IV geeignet sind, schließen eine Reaktion von Y-R' mit einem elektrophilen Carbonyl- oder Sulfonylderivat (X-R'' = Säurechlorid, Isocyanat, Isothiocyanat, Chlorformiat, Sulfonylchlorid oder eine Säure, die durch BOP-Cl, PyBrOP, Carbodiimid oder ein anderes aktivierendes Reagenz (wie sie in dem Fachgebiet der Peptidkupplung allgemein verwendet werden) aktiviert wurde) oder andere ähnliche Reaktionen wie die in bestimmten der 1–31 und der nachstehenden Begleitbeschreibung ausführlich dargestellten ein.
  • Reaktionen, die zur Durchführung von Schritt V geeignet sind, schließen den nukleophilen Ersatz einer Abgangsgruppe, reduktive Alkylierung, eine Reaktion des Amins mit einem elektrophilen Carbonsäure-/Thiocarbonsäure-Derivat (Säurechlorid, Isocyanat, Isothiocyanat oder einer Carbonsäure, die durch BOP-Cl, PyBrOP, Carbodiimid oder ein anderes aktivierendes Reagenz (wie sie in dem Fachgebiet der Peptidkupplung allgemein verwendet werden) aktiviert wurde) oder andere ähnliche Reaktionen, einschließlich der in bestimmten der 1–31 und der nachstehenden Begleitbeschreibung ausführlich dargestellten, ein.
  • Reaktionen, die zur Durchführung von Schritt VI geeignet sind, schließen den nukleophilen Ersatz einer Abgangsgruppe, reduktive Alkylierung, eine Reaktion des Amins mit einem elektrophilen Carbonsäure-/Thiocarbonsäure-Derivat (Säurechlorid, Isothiocyanat, Isocyanat oder einer Carbonsäure, die durch BOP-Cl, PyBrOP, Carbodiimid oder ein anderes aktivierendes Reagenz (wie sie in dem Fachgebiet der Peptidkupplung allgemein verwendet werden) aktiviert wurde) oder andere ähnliche Reaktionen, einschließlich der in bestimmten der 1–31 und der nachstehenden Begleitbeschreibung ausführlich dargestellten, ein.
  • Reaktionen, die zur Durchführung von Schritt VII geeignet sind, wobei Y mit einem vorkommenden M gekuppelt wird, schließen den nukleophilen Ersatz einer Abgangsgruppe, reduktive Alkylierung, eine Reaktion des Amins mit einem elektrophilen Carbonsäure-/Thiocarbonsäure-Derivat (Säurechlorid, Isocyanat, Isothiocyanat oder einer Carbonsäure, die durch BOP-Cl, PyBrOP, Carbodiimid oder ein anderes aktivierendes Reagenz (wie sie in dem Fachgebiet der Peptidkupplung allgemein verwendet werden) aktiviert wurde) oder andere ähnliche Reaktionen, einschließlich der in bestimmten der 1–31 und der nachstehenden Begleitbeschreibung ausführlich dargestellten, ein. In Ausführungsformen, in denen M nicht vorhanden ist, schließen geeignete Kupplungsreaktionen Palladium-vermittelte Reaktionen, die von S. Buchwald und anderen entwickelt wurden, nukleophile aromatische Substitution, oxidative Kupplung etc. ein. In Ausführungsformen, in denen M und Y nicht vorhanden sind und Z einen Aryl- oder Heteroarylring bedeutet, schließen geeignete Reaktionen die Stille-Reaktion, Suzuki-Reaktion und andere zur Bildung von Biarylsystemen geeignete Reaktionen ein.
  • Verfahren, die ferner die Umsetzung einer Verbindung der Formel II, wobei mindestens einer der Reste R von NR2 H bedeutet, unter Bedingungen, die diese Verbindung in eine Verbindung derselben Formel umwandeln, einschließen, wobei das entsprechend vorkommende R einen Niederalkylrest bedeutet, sind ebenfalls beschrieben. Reduktive Alkylierungen mit einem Aldehyd und einem Reduktionsmittel, nukleophile Alkylierungen mit einem Alkylhalogenid wie MeI oder andere ähnliche Reaktionen können zum Beispiel verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen können solche Reaktionen über eine silylierte Zwischenverbindung (z. B. R = SiMe3) ablaufen.
  • Für einen Fachmann ist es leicht ersichtlich, dass Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch Synthesen gemäß einer umfassenden Reihe von Vorschriften, die in dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, zusätzlich zu den hier beschriebenen zugänglich sind, die alle in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen sollen.
  • IV. Beispielhafte Anwendungen des Verfahrens und der Zusammensetzungen
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft in den Ansprüchen definierte Verfahren und Verwendungen der Modulierung eines differenzierten Zustandes, oder der Proliferation einer Zelle durch Inkontaktbringen der Zelle mit einem Hedgehog-Agonisten gemäß dem vorliegenden Verfahren und wie es die Umstände rechtfertigen können.
  • Von der Erfindung ist es beispielsweise beabsichtigt, dass, angesichts der Erkenntnisse einer offensichtlich starken Beteiligung von Hedgehog, Ptc und Smoothened an der Bildung von geordneten räumlichen Anordnungen differenzierter Gewebe in Wirbeltieren, das vorliegende Verfahren als Teil eines Verfahrens zur Erzeugung und/oder Aufrechterhaltung einer Reihe von verschiedenen Wirbeltiergeweben sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden kann. Der Hedgehog-Agonist, ob hinsichtlich der Proliferation oder Differenzierung eines bestimmten Gewebes induktiv oder anti-induktiv, kann, wie geeignet, eine beliebige der vorstehend beschriebenen Zubereitungen sein.
  • Das vorliegende Verfahren ist zum Beispiel auf Zellkulturverfahren anwendbar. Neuronale Kultursysteme in vitro erwiesen sich als fundamentale und unentbehrliche Hilfsmittel für die Untersuchung der neuralen Entwicklung sowie die Identifizierung neurotropher Faktoren wie des Nervenwachstumsfaktors (NGF), der ziliaren trophischen Faktoren (CNTF) und des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF). Eine Verwendung des vorliegenden Verfahrens kann aus Kulturen neuronaler Sternzellen bestehen, wie bei der Verwendung solcher Kulturen zur Erzeugung neuer Neuronen und Glia. In solchen Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens können die gezüchteten Zellen mit einem Hedgehog-Agonisten der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht werden, um die Proliferationsgeschwindigkeit neuronaler Stammzellen in der Kultur zu ändern und/oder die Differenzierungsgeschwindigkeit zu ändern oder um die Integrität einer Kultur bestimmter terminal differenzierter neuronaler Zellen aufrechtzuerhalten. In einer beispielhaften Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um zum Beispiel sensorische Neuronen oder alternativ motorische Neuronen zu züchten. Solche neuronalen Kulturen können als geeignete Testsysteme sowie Quellen implantierbarer Zellen für therapeutische Behandlungen verwendet werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können sehr viele nicht-tumorerzeugende neurale Vorläuferzellen in vitro aufrechterhalten werden, und ihre Proliferationsgeschwindigkeit und/oder Differenzierungsgeschwindigkeit können durch den Kontakt mit Hedgehog-Agonisten der vorliegenden Erfindung beeinflusst werden. Allgemein wird ein Verfahren, umfassend die Schritte des Isolierens neuraler Vorläuferzellen aus einem Tier, des Aufrechterhaltens dieser Zellen in vitro oder in vivo, bevorzugt in Gegenwart von Wachstumsfaktoren, und des Regulierens der Differenzierung dieser Zellen zu besonderen neuralen Phänotypen, z. B. Neuronen und Glia, indem die Zellen mit einem Hedgehog-Agonisten in Kontakt gebracht werden, bereitgestellt.
  • Von Vorläuferzellen wird angenommen, dass sie unter einem tonischen hemmenden Einfluss stehen, der die Vorläufer in einem unterdrückten Zustand hält, bis ihre Differenzierung erforderlich ist. Neuere Verfahren wurden jedoch bereitgestellt, die diesen Zellen eine Proliferation ermöglichen, und anders als Neuronen, die terminal differenziert und daher nicht-teilend sind, können sie in unbegrenzter Anzahl erzeugt werden und sind zur Transplantation in heterologe und autologe Wirte mit neurodegenerativen Erkrankungen äußerst geeignet.
  • ”Vorläufer” bedeutet eine oligopotente oder multipotente Stammzelle, die sich ohne Einschränkung teilen kann und, unter speziellen Bedingungen, Tochterzellen erzeugen kann, die sich zum Beispiel in Neuronen und Glia terminal differenzieren. Diese Zellen können zur Transplantation in heterologe oder autologe Wirte verwendet werden. Heterolog bedeutet einen anderen Wirt als das Tier, aus dem die Vorläuferzellen ursprünglich gewonnen wurden. Analog bedeutet den identischen Wirt, aus dem die Vorläuferzellen ursprünglich gewonnen wurden.
  • Zellen können aus embryonalem, welches nicht menschlich ist, postnatalem, juvenilem oder adultem, neuralem Gewebe aus einem beliebigen Tier erhalten werden. Tier bedeutet ein beliebiges vielzelliges Tier, das Nervengewebe enthält. Insbesondere bedeutet es einen beliebigen Fisch, ein beliebiges Reptil, einen beliebigen Vogel, eine beliebige Amphibie oder einen beliebigen Säuger und dergleichen. Die am meisten bevorzugten Spender sind Säuger, besonders Mäuse und Menschen.
  • Im Fall eines heterologen Spendertiers kann das Tier getötet werden, und das Gehirn und ein spezieller Bereich von Interesse können unter Verwendung eines sterilen Verfahrens entfernt werden. Hirnbereiche von besonderem Interesse schließen einen beliebigen Bereich ein, aus dem Vorläuferzellen erhalten werden können, die zur Wiederherstellung der Funktion eines degenerierten Bereiches des Wirthirns dienen. Diese Regionen schließen Bereiche des Zentralnervensystems (ZNS), einschließlich der Großhirnrinde, des Kleinhirns, Mittelhirns, Hirnstamms, Rückenmarks und Ventrikelgewebes, und Bereiche des peripheren Nervensystems (PNS), einschließlich des Karotiskörpers und des Nebennierenmarks, ein. Insbesondere schließen diese Bereiche Regionen in den Basalganglien, bevorzugt das Striatum, das aus dem Kaudatum und Putamen besteht, oder verschiedene Zellgruppen wie den Globus pallidus, den Nucleus subthalamicus, den Nucleus basalis, von dem festgestellt wurde, dass er bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit degeneriert ist, oder die Substantia nigra pars compacta, von der festgestellt wurde, dass sie bei Patienten mit Parkinson-Krankheit degeneriert ist, ein.
  • Menschliche, heterologe, neurale Vorläuferzellen können aus einem postnatalen, jugendlichen oder erwachsenen Spender erhalten wurde, gewonnen werden. Autologes neurales Gewebe kann durch eine Biopsie oder von Patienten, die sich einem neurochirurgischen Eingriff unterziehen, bei dem neurales Gewebe entfernt wird, im besonderen während einer Epilepsieoperation und noch mehr während temporalen Lobektomien und Hippokampusektomien erhalten werden.
  • Zellen können aus Donorgewebe durch Spaltung einzelner Zellen aus der extrazellulären Bindegewebsmatrix des Gewebes erhalten werden. Die Spaltung kann unter Verwendung eines beliebigen bekannten Verfahrens, einschließlich einer Behandlung mit Enzymen wie Trypsin, Kollagenase und dergleichen oder unter Verwendung physikalischer Spaltungsverfahren wie mit einem stumpfen Instrument oder durch Zerschneiden mit einem Skalpell, um ein Herauswachsen spezifischer Zelltypen aus einem Gewebe zu ermöglichen, erzielt werden. Die Spaltung nicht menschlicher fetaler Zellen kann in einem Gewebekulturmedium durchgeführt werden, obwohl ein bevorzugtes Medium zur Spaltung juveniler und adulter Zellen künstliche Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit (aCSF) ist. Reguläre aCSF enthält 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 und 10 mM D-Glucose. aCSF mit niedrigem Ca2+-Gehalt enthält dieselben Bestandteile, mit Ausnahme von MgCl2 in einer Konzentration von 3,2 mM und CaCl2 in einer Konzentration von 0,1 mM.
  • Herausgespaltene Zellen können in ein beliebiges bekanntes Kulturmedium, das das Zellwachstum unterstützen kann, einschließlich MEM, DMEM, RPMI, F-12 und dergleichen, das Zusätze, die für den Zellstoffwechsel erforderlich sind, wie Glutamin und andere Aminosäuren, Vitamine, Mineralien und nützliche Proteine wie Transferrin und dergleichen enthält, gegeben werden. Das Medium kann auch Antibiotika wie Penicillin, Streptomycin, Gentamicin und dergleichen enthalten, um eine Kontamination mit Hefe, Bakterien und Pilzen zu verhindern. In einigen Fällen kann das Medium von Rindern, Pferden, Hühnern und dergleichen gewonnenes Serum enthalten. Ein für Zellen besonders bevorzugtes Medium ist ein Gemisch aus DMEM und F-12.
  • Die Bedingungen zur Züchtung sollten physiologischen Bedingungen nahekommen. Der pH-Wert der Kulturmedien sollte in der Nähe von physiologischem pH-Wert, bevorzugt zwischen einem pH-Wert von 6 und 8, stärker bevorzugt in der Nähe eines pH-Werts von 7 und sogar insbesondere bei einem pH-Wert von etwa 7,4 liegen. Die Zellen sollten bei einer Temperatur, die nahe der physiologischen Temperatur liegt, bevorzugt zwischen 30°C und 40°C, stärker bevorzugt zwischen 32°C und 38°C und am meisten bevorzugt zwischen 35°C und 37°C, gezüchtet werden.
  • Man kann die Zellen in Suspension oder auf einem festen Substrat wachsen lassen, jedoch wird die Proliferation der Vorläufer bevorzugt in Suspension durchgeführt, um durch die Bildung von ”Neurosphären” sehr viele Zellen zu erzeugen (siehe zum Beispiel Reynolds et al. (1992) Science 255: 1070–1709; und die PCT-Veröffentlichungen WO 93/01275 , WO 94/09119 , WO 94/10292 und WO 94/16718 ). Im Fall des Züchtens (oder Aufteilens) von Zellen in Suspension werden die Kolben gut geschüttelt, und man lässt die Neurosphären sich auf den Bodenkanten des Kolbens absetzen. Die Sphären werden dann in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert. Das Medium wird abgesaugt, die Zellen werden in einer kleinen Menge von Medium mit Wachstumsfaktor resuspendiert, und die Zellen werden mechanisch getrennt und in getrennten aliquoten Teilen von Medium resuspendiert.
  • Zellsuspensionen in Kulturmedium werden mit einem beliebigen Wachstumsfaktor, der die Proliferation von Vorläuferzellen ermöglicht, ergänzt, und ein beliebiger Behälter, der Zellen aufnehmen kann, wie vorstehend aufgezeigt, bevorzugt Kulturkolben oder Rollflaschen, wird damit angeimpft. Die Zellen proliferieren typischerweise innerhalb von 3 bis 4 Tagen in einem Inkubator mit 37°C, und die Proliferation kann danach jederzeit durch Trennung der Zellen und Resuspension in frischem Medium, das Wachstumsfaktoren enthält, erneut ausgelöst werden.
  • In Abwesenheit von Substrat steigen die Zellen vom Boden des Kolbens auf und proliferieren in Suspension weiter, wobei eine hohle Kugel aus undifferenzierten Zellen gebildet wird. Nach ungefähr 3 bis 10 Tagen in vitro werden die proliferierenden Cluster (Neurosphären) alle 2 bis 7 Tage und insbesondere alle 2 bis 4 Tage durch schwache Zentrifugation und Resuspension in Medium, das Wachstumsfaktor enthält, ernährt.
  • Nach 6 bis 7 Tagen in vitro können einzelne Zellen in den Neurosphären durch physikalische Spaltung der Neurosphären mit einem stumpfen Instrument, insbesondere durch Zerreiben der Neurosphären mit einer Pipette, abgetrennt werden. Einzelne Zellen aus den gespaltenen Neurosphären werden in Kulturmedium, das Wachstumsfaktoren enthält, suspendiert, und die Differenzierung der Zellen kann in Kultur gesteuert werden, indem die Zellen in Gegenwart eines Hedgehog-Agonisten plattiert (oder resuspendiert) werden.
  • Um andere Verwendungen der vorliegenden Hedgehog-Agonisten weiter zu veranschaulichen, wird angemerkt, dass sich eine intrazerebrale Transplantation als zusätzliches Verfahren für Therapien des Zentralnervensystems herausstellte. Ein Verfahren, um geschädigte Hirngewebe wiederherzustellen, umfasst zum Beispiel die Transplantation von Zellen aus fetalen oder neugeborenen nicht menschlichen Tieren in das adulte Gehirn (Dunnett et al. (1987) J Exp Biol 123: 265–289; und Freund et al. (1985) J Neurosci 5: 603–616). Fetale Neuronen aus einer Vielzahl von Hirnregionen können erfolgreich in das adulte Gehirn eingebracht werden, und solche Transplantate können Verhaltensdefekte lindern. Bewegungsstörungen, die durch Läsionen dopaminerger Projektionen auf die Basalganglien ausgelöst werden, können zum Beispiel durch Transplantate von embryonalen, dopaminergen Neuronen verhindert werden. Komplexe kognitive Funktionen, die nach Läsionen des Neokortex beeinträchtigt sind, können durch Transplantate von nicht menschlichen embryonalen, kortikalen Zellen ebenfalls teilweise wiederhergestellt werden. Das vorliegende Verfahren kann zur Regulierung des Wachstumszustands in der Kultur verwendet werden oder, wenn nicht menschliches fetales Gewebe, besonders neuronale Stammzellen, verwendet wird, kann es zur Regulierung der Differenzierungsgeschwindigkeit der Stammzellen verwendet werden.
  • In der vorliegenden Erfindung verwendbare Stammzellen sind allgemein bekannt. Mehrere neurale Kammzellen wurden zum Beispiel identifiziert, von denen einige multipotent sind und wahrscheinlich nicht-determinierte, neurale Kammzellen darstellen und andere davon nur einen Zelltyp wie sensorische Neuronen erzeugen können und wahrscheinlich determinierte Vorläuferzellen darstellen. Die Rolle von in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Hedgehog-Agonisten bei der Züchtung solcher Stammzellen kann in der Regulierung der Differenzierung des nicht-determinierten Vorläufers oder in der Regulierung einer weiteren Einschränkung des Entwicklungsschicksals einer determinierten Vorläuferzelle, eine terminal differenzierte neuronale Zelle zu werden, bestehen. Das vorliegende Verfahren kann zum Beispiel in vitro verwendet werden, um die Differenzierung neuraler Kammzellen in Gliazellen, Schwann'-Zellen, chromaffine Zellen, cholinerge, sympathische oder parasympathische Neuronen sowie peptiderge und serotoninerge Neuronen zu regulieren. Die Hedgehog-Agonisten können allein verwendet werden oder können in Kombination mit anderen neurotrophen Faktoren, die insbesondere ein spezielles Differenzierungsschicksal der neuronalen Vorläuferzelle verstärken, verwendet werden.
  • Zusätzlich zu der Implantation von Zellen, die in Gegenwart der vorliegenden Hedgehog-Agonisten gezüchtet wurden, betrifft noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die therapeutische Anwendung eines Hedgehog-Agonisten zur Regulierung des Wachstumszustandes von Neuronen und anderen neuronalen Zellen sowohl im Zentralnervensystem als auch peripheren Nervensystem. Die Fähigkeit von Ptc, Hedgehog und Smoothened, die neuronale Differenzierung während der Entwicklung des Nervensystems und auch vermutlich im adulten Zustand zu regulieren, zeigt, dass in bestimmten Fällen von den vorliegenden Hedgehog-Agonisten erwartet werden kann, dass sie die Steuerung adulter Neuronen im Hinblick auf die Aufrechterhaltung, die funktionelle Leistung und das Altern normaler Zellen, Wiederherstellungs- und Regenerationsprozesse in chemisch oder mechanisch lädierten Zellen und die Behandlung einer Degeneration bei bestimmten pathologischen Zuständen erleichtern. Angesichts dieses Verständnisses beabsichtigt die vorliegende Erfindung besonders Anwendungen des vorliegenden Verfahrens auf die Behandlungsvorschrift von (Vorbeugung und/oder Verringerung der Schwere von) neurologischen Krankheiten, die sich ableiten von: (i) einer akuten, subakuten oder chronischen Verletzung des Nervensystems, einschließlich einer chemischen Verletzung, vaskulären Verletzung, Ischämie nach einem Schlaganfall, zusammen mit einer infektiösen/entzündlichen und durch einen Tumor ausgelösten Verletzung; (ii) dem Alter des Nervensystems, einschließlich Alzheimer-Krankheit; (iii) chronischen neurodegenerativen Erkrankungen des Nervensystems, einschließlich Parkinson-Krankheit, Chores Huntington, amyotropher Lateralsklerose und dergleichen sowie spinozerebellären Degenerationen; und (iv) chronischen immunologischen Krankheiten des Nervensystems oder die das Nervensystem beeinflussen, einschließlich multipler Sklerose. Im speziellen Fall der Parkinson-Krankheit kann zum Beispiel eine Intervention durch eine Verstärkung der Aktivität von Hedgehog durch einen vorliegenden Agonisten das Überleben fetaler und adulter dopaminerger Neuronen in vivo verbessern und kann somit eine wirksamere Behandlung dieser Krankheit bereitstellen. Somit umfasst das vorliegende Verfahren in einer Ausführungsform das Verabreichen an ein Tier, das an der Parkinson-Krankheit leidet oder gefährdet ist, die Parkinson-Krankheit zu entwickeln, einer Menge eines Hedgehog-Agonisten, die die Überlebensrate dopaminerger Neuronen in dem Tier steigert.
  • Das vorliegende Verfahren ist auf Zellkulturverfahren anwendbar. Neuronale Kultursysteme in vitro erwiesen sich als fundamentale und unentbehrliche Hilfsmittel für die Untersuchung der neuralen Entwicklung sowie die Identifizierung neurotropher Faktoren wie des Nervenwachstumsfaktors (NGF), der ziliaren trophischen Faktoren (CNTF) und des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF). Ist eine neuronale Zelle einmal terminal differenziert, ändert sie sich typischerweise nicht in einen anderen terminal differenzierten Zelltyp. Neuronale Zellen können jedoch trotzdem ihren differenzierten Zustand leicht verlieren. Dies wird häufig beobachtet, wenn man sie in Kultur aus adultem Gewebe wachsen lässt oder wenn sie während der Regeneration ein Blastem bilden. Das vorliegende Verfahren stellt Mittel zur Sicherstellung einer ausreichend eingeschränkten Umgebung bereit, um dopaminerge und GABAerge Zellen in differenzierten Zuständen zu halten, und kann beispielsweise in Zellkulturen, die dafür bestimmt sind, die spezifischen Aktivitäten anderer trophischer Faktoren zu prüfen, verwendet werden.
  • In solchen Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens kann eine Kultur von differenzierten Zellen, einschließlich dopaminerger und/oder GABAerger Zellen, mit einem Hedgehog-Agonisten in Kontakt gebracht werden, um die Integrität einer Kultur von terminal differenzierten neuronalen Zellen aufrechtzuerhalten, indem ein Differenzierungsverlust verhindert wird. Das vorliegende Verfahren kann in Verbindung mit Mitteln verwendet werden, die die Differenzierung neuronaler Vorläufer, z. B. Vorläufer- oder Stammzellen, in dopaminerge oder GABAerge Neuronen induzieren.
  • Viele neurologische Erkrankungen sind mit einer Degeneration von diskreten Populationen neuronaler Elemente verbunden und können mit einem Behandlungsschema, das einen Hedgehog-Agonisten einschließt, behandelt werden. Die Alzheimer-Krankheit ist zum Beispiel mit Defiziten in mehreren Neurotransmittersystemen, sowohl denen, die auf den Neokortex projizieren, als auch denen, die sich im Kortex befinden, verbunden. Bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit wurde beispielsweise beobachtet, dass der Nucleus basalis einen starken Verlust (75%) an Neuronen, verglichen mit altersangepassten Kontrollen, aufweist. Obwohl die Alzheimer-Krankheit die weitaus häufigste Form von Demenz ist, können mehrere andere Erkrankungen Demenz erzeugen. Mehrere dieser Erkrankungen sind degenerative Erkrankungen, die durch den Tod von Neuronen in verschiedenen Teilen des Zentralnervensystems, besonders der Großhirnrinde, gekennzeichnet sind. Einige Formen von Demenz sind jedoch mit einer Degeneration des Thalamus oder der weißen Substanz, die unter der Hirnrinde liegen, verbunden. Hier resultiert die kognitive Dysfunktion aus der Isolation kortikaler Bereiche durch die Degeneration von Efferenzen und Afferenzen. Chorea Huntington schließt die Degeneration von intrastriatalen und kortikalen cholinergen Neuronen und GABAergen Neuronen ein. Die Behandlung von Patienten, die an solchen degenerativen Krankheiten leiden, kann die Anwendung von Hedgehog-Agonisten einschließen, um zum Beispiel Differenzierungs- und apoptotische Vorgänge zu steuern, die zu einem Verlust von Neuronen führen (z. B. um das Überleben vorhandener Neuronen zu steigern), sowie die Differenzierung und Repopulation durch Vorläuferzellen in dem betroffenen Gebiet zu fördern.
  • Zusätzlich zu den durch Degeneration ausgelösten Demenzen kann eine Arzneimittelzubereitung eines oder mehrerer der vorliegenden Hedgehog-Agonisten zweckmäßigerweise für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, die Manifestationen von Tremor und unwillkürlichen Bewegungen aufweisen, angewendet werden. Die Parkinson-Krankheit beeinflusst zum Beispiel vor allem subkortikale Strukturen und ist durch eine Degeneration des nigrostriatalen Pfads, der Raphe-Kerne, des Locus ceruleus und des motorischen Nucleus vagus gekennzeichnet. Ballismus ist typischerweise mit einer Schädigung des Nucleus subthalamicus, häufig auf Grund einer akuten Gefäßschädigung, verbunden. Neurogene und myopathische Krankheiten, die letztlich die somatische Teilung des peripheren Nervensystems beeinflussen und sich als neuromuskuläre Erkrankungen manifestieren, sind ebenfalls eingeschlossen. Beispiele schließen chronische Atrophien wie amyotrophe Lateralsklerose, Guillain-Barre-Syndrom und chronische periphere Neuropathie sowie andere Krankheiten, die sich als progressive Bulbärparalysen oder spinale Muskelatrophien manifestieren, ein. Das vorliegende Verfahren ist zur Behandlung von Erkrankungen des Kleinhirns geeignet, die zu Hypotonie oder Ataxie führen, wie die Läsionen im Kleinhirn, die Erkrankungen in den Extremitäten ipsilateral zu der Läsion erzeugen. Eine Zubereitung eines Hedgehog-Agonisten kann beispielsweise verwendet werden, um eine eingeschränkte Form von Kleinhirnrindendegeneration, die die Vorderlappen (Vermis- und Beinbereiche) umfasst und wie sie bei Alkoholpatienten üblich ist, zu behandeln.
  • In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird das vorliegende Verfahren zur Behandlung von amyotropher Lateralsklerose verwendet. ALS ist ein Name, der einem Komplex von Erkrankungen gegeben wird, die die oberen und unteren motorischen Neuronen umfassen. Patienten können eine progressive spinale Muskelatrophie, eine progressive Bulbärparalyse, eine primäre Lateralsklerose oder eine Kombination dieser Krankheiten zeigen. Die pathologische Hauptanomalie ist durch eine selektive und progressive Degeneration der unteren motorischen Neuronen im Rückenmark und der oberen motorischen Neuronen in der Großhirnrinde gekennzeichnet. Die therapeutische Anwendung eines Hedgehog-Agonisten kann allein oder in Verbindung mit anderen neurotrophen Faktoren wie CNTF, BDNF oder NGF verwendet werden, um einer Degeneration motorischer Neuronen in ALS-Patienten vorzubeugen und/oder sie rückgängig zu machen.
  • Das vorliegende Verfahren kann zur Behandlung von Tachykardie oder atrialer Herzrhythmusstörungen, die aus einer degenerativen Erkrankung der den quergestreiften Herzmuskel innervierenden Nerven entstehen können, verwendet werden.
  • Ferner leitet sich eine mögliche Rolle für bestimmte Hedgehog-Agonisten von der Rolle von Hedgehog-Proteinen bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung dendritischer Fortsätze axonaler Neuronen ab. Mögliche Rollen für Hedgehog-Agonisten schließen folglich eine Steuerung für axonale Projektionen und die Fähigkeit, die Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung der innervierenden Zellen bis zu ihren axonalen Fortsätzen zu fördern, ein. Folglich können Zusammensetzungen, umfassend Hedgehog-Agonisten, verwendet werden, um das Überleben und die Reprojektion mehrerer Typen ganglionärer Neuronen, sympathischer und sensorischer Neuronen sowie motorischer Neuronen zu unterstützen. Im Besonderen können solche therapeutischen Zusammensetzungen bei Behandlungen verwendet werden, die zum Beispiel dafür bestimmt sind, verschiedene Neuronen vor einem durch Läsion ausgelösten Tod zu bewahren sowie eine Reprojektion dieser Neuronen nach einer solchen Schädigung zu steuern. Solche Krankheiten schließen ein Trauma des ZNS, einen Infarkt, eine Infektion (wie eine Virusinfektion mit Varicella-Zoster), eine Stoffwechselerkrankung, Nährstoffmangel und toxische Mittel (wie eine Cisplatinbehandlung) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Das vorliegende Verfahren kann gegebenenfalls auch zur Erzeugung von Nervenprothesen für die Reparatur einer Schädigung des Zentralnervensystems und peripheren Nervensystems verwendet werden. Im Besonderen können, wenn ein gequetschtes oder durchtrenntes Axon unter Verwendung einer Prothesenvorrichtung intubiert wird, Hedgehog-Agonisten zu der Prothesenvorrichtung gegeben werden, um die Wachstumsgeschwindigkeit und Regeneration der dendritischen Fortsätze zu regulieren. Beispielhafte Nervenführungskanäle sind in den U.S.-Patenten 5,092,871 und 4,955,892 beschrieben.
  • Das vorliegende Verfahren weist ein breite Anwendbarkeit auf die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen auf, die die Regulierung peripherer Nerven, einschließlich peripherer ganglionärer Neuronen, sympathischer, sensorischer Neuronen und motorischer Neuronen, beeinflussen. Im Allgemeinen kann das Verfahren so charakterisiert werden, dass es einen Schritt des Verabreichens einer Menge eines Hedgehog-Agonisten, die den Proliferations- und/oder Differenzierungszustand von behandelten peripheren Nervenzellen ändert, an ein Tier einschließt. Solche therapeutischen Zusammensetzungen können bei Behandlungen verwendet werden, die dafür bestimmt sind, zum Beispiel Netzhautganglien, Innenohrnerven und Hörnerven und motorische Neuronen vor einem durch Läsion ausgelösten Tod zu bewahren sowie eine Reprojektion dieser Neuronen nach einer solchen Schädigung zu steuern. Solche Krankheiten und Zustände schließen ein chemisches oder mechanisches Trauma, eine Infektion (wie eine Virusinfektion mit Varicella-Zoster), eine Stoffwechselerkrankung wie Diabetes, Nährstoffmangel und toxische Mittel (wie eine Cisplatinbehandlung) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Ziele der Behandlung in jedem einzelnen Fall können zweifach sein: (1) die Ursache der Krankheit zu beseitigen und (2) ihre Symptome zu lindern.
  • Periphere Neuropathie ist eine Krankheit, die eine Schädigung der Nervenendigungen in den Händen und Füßen umfasst. Periphere Neuropathie betrifft allgemein eine Erkrankung, die die peripheren Nerven beeinflusst und sich am häufigsten als motorische, sensorische, sensomotorische oder autonome neurale Dysfunktion oder eine Kombination davon manifestiert. Die von peripheren Neuropathien gezeigte große Vielzahl von Morphologien kann jede allein auf eine gleich große Vielzahl von Ursachen zurückgeführt werden. Periphere Neuropathien können beispielsweise genetisch erworben sein, können aus einer systemischen Krankheit resultieren oder können durch ein toxisches Mittel ausgelöst sein. Einige toxische Mittel, die Neurotoxizitäten hervorrufen, sind therapeutische Arzneistoffe, antineoplastische Mittel, Verunreinigungssubstanzen in Nahrungsmitteln oder Medikamenten und Umweltschadstoffe und Industrieschadstoffe.
  • Im Besonderen schließen chemotherapeutische Mittel, von denen bekannt ist, dass sie sensorische und/oder motorische Neuropathien hervorrufen, Vincristin, einen antineoplastischen Arzneistoff, ein, der verwendet wird, um maligne Blutkrankheiten und Sarkome zu behandeln. Die Neurotoxizität ist dosisabhängig und zeigt sich als verringerte Darmmotilität und periphere Neuropathie, besonders in den distalen Muskeln der Hände und Füße, orthostatische Hypotonie und Atonie der Harnblase. Ähnliche Probleme wurden mit Taxol und Cisplatin dokumentiert (Mollman, J. E., 1990, New. Eng. Jour. Med. 322: 126–127), obwohl eine Cisplatin-abhängige Neurotoxizität mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) gelindert werden kann (Apfel, S. C. et al., 1992, Annals of Neurology 31: 76–80). Obwohl die Neurotoxizität nach der Entfernung des neurotoxischen Mittels manchmal reversibel ist, kann die Genesung ein sehr langsamer Prozess sein (Legha, S., 1986, Medical Toxicology 1: 421–427; Olesen et al., 1991, Drug Safety 6: 302–314).
  • Es gibt mehrere hereditäre periphere Neuropathien, einschließlich: Refsum-Syndrom, Abetalipoproteinämie, Tangier-Krankheit, Krabbe-Syndrom, metachromatischer Leukodystrophie, Fabry'sche Krankheit, Déjerine-Sottas-Syndrom und anderer. Von allen hereditären Neuropathien ist die bei weitem häufigste die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit.
  • Die Charcot-Marie-Tooth-(CMT)-Krankheit (auch als Wadenmuskelatrophie oder hereditäre motorisch-sensorische Neuropathie (HMSN) bekannt), ist die häufigste hereditäre neurologische Erkrankung. Sie ist durch Schwache und Atrophie, vor allem der Wadenmuskeln, auf Grund segmentaler Demyelinisierung peripherer Nerven und einer damit verbundenen Degeneration von Axonen und Vorderhornzellen gekennzeichnet. Eine autosomal-dominante Vererbung ist üblich und damit verbundene degenerative Erkrankungen des ZNS wie die Friedreich-Ataxie sind häufig.
  • In einer Ausführungsform kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Behandlung und Pflege von hereditären Neuropathien verwendet werden. Diese Gruppe von Neuropathien wird nun auf Grund der drastischen Fortschritte in der Molekulargenetik in zunehmendem Maße erkannt. Die Symptome der verschiedenen hereditären Neuropathien sind breit gefächert. Ein gemeinsamer Nenner ist in der Regel der frühzeitige Beginn eines schwachen Taubheitsgefühls und Kribbelns in den Füßen, das langsam fortschreitet, wobei die Beine und die Hände und später der Rest der oberen Extremitäten in Mitleidenschaft gezogen werden. Die meisten der hereditären Neuropathien weisen eine motorische Komponente auf, die aus einer distalen Schwache in den unteren und oberen Extremitäten besteht. Die Mehrzahl der Patienten mit hereditären Neuropathien weist starke Wölbungen an ihren Füßen oder andere Knochendeformationen auf. Die Symptome sind sehr langsam fortschreitend und die Mehrzahl der Patienten läuft noch zwei Jahrzehnte nach dem Beginn ihrer Symptome.
  • Die Diagnose einer hereditären Neuropathie wird, besonders wenn auch eine positive Familiengeschichte vorliegt, in der Regel mit dem frühzeitigen Beginn neuropathischer Symptome geäußert. Vor den neueren genetischen Fortschritten wurde die Diagnose durch die typischen Befunde einer deutlichen Verlangsamung der Nervenleitung, Untersuchungen durch eine Elektromyographie und eine Nervenbiopsie gestützt. Typische Befunde einer Nervenbiopsie schließen die Gegenwart sogenannter Zwiebelknospen ein, die auf eine wiederkehrende Demyelinisierung und Remyelinisierung der Nervenfasern hinweisen. Mit den neuesten genetischen Fortschritten können zwei hereditäre Hauptneuropathien, die als Charcot-Marie-Tooth-Krankheit und hereditäre Neuropathie mit einer Anfälligkeit für Drucklähmungen bekannt sind, mit einem einfachen Bluttest, der die verschiedenen Mutationen, die für diese zwei Zustände verantwortlich sind, identifiziert.
  • Hereditäre Neuropathien werden durch genetische Anomalien hervorgerufen, die von Generation zu Generation weitergegeben werden. Für mehrere dieser hereditären Neuropathien ist der genetische Defekt bekannt, und für die Diagnose und pränatale Beratung stehen Tests zur Verfügung.
  • Wie vorstehend dargestellt, kann das vorliegende Verfahren als Teil eines therapeutischen Schemas für die Behandlung der Charcot-Marie-Tooth-Krankheit (CMT) verwendet werden. Dies ist ein allgemeiner Begriff, der auf hereditäre sensomotorische Neuropathien angewendet wird. CMT Typ 1 (CMT 1) ist mit einer Demyelinisierung oder einem Abbau der Myelinscheiden verbunden. Mehrere verschiedene Anomalitäten wurden identifiziert. CMT Typ 1A wird am häufigsten durch Verdopplung eines Gens, das ein als PMP-22 bezeichnetes Myelinprotein codiert, hervorgerufen, und CMT Typ 1B wird durch eine Mutation in einem als Po-Glycoprotein bezeichneten Myelinprotein hervorgerufen. CMTX ist eine hereditäre sensomotorische Neuropathie, die vor allem Männer befällt. Sie wird durch eine Mutation in einem Gen, das ein als Connexin 32 bezeichnetes Protein auf dem X-Chromosom codiert, hervorgerufen.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren für die Behandlung von familiärer Amyloidneuropathie und anderen verwandten hereditären Neuropathien verwendet werden. Amyloidneuropathie zeigt sich in der Regel durch Schmerzen, Sinnesverlust und autonome Dysfunktion. Sie wird durch eine Mutation in einem als Transthyretin bezeichneten Protein hervorgerufen, die zu einer Ablagerung des Proteins als Amyloid in den peripheren Nerven führt.
  • Das vorliegende Verfahren kann für die Behandlung von hereditärer Porphyrie, die Komponenten von peripherer Neuropathie aufweisen kann, verwendet werden. Noch eine andere hereditäre Neuropathie, für die die vorliegenden Verfahren zur Behandlung verwendet werden können, ist hereditäre sensorische Neuropathie Typ II (HSN II). Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch für die Behandlung und Pflege von erworbenen Neuropathien verwendet werden.
  • Hedgehog-Agonisten können zum Beispiel zur Vorbeugung von diabetischen Neuropathien verwendet werden. Diabetes ist die häufigste bekannte Ursache einer Neuropathie. Er erzeugt bei ungefähr 10% der Personen mit Diabetes Symptome. In den meisten Fällen ist die Neuropathie überwiegend sensorisch mit Schmerzen und Sinnesverlust in den Händen und Füßen. Einige Diabetiker weisen jedoch eine Mononeuritis oder Mononeuritis multiplex auf, die in einem oder mehreren Nerven Schwäche oder eine lumbosakrale Plexopathie oder Muskelschwund hervorruft, der eine Schwache in den Beinen verursacht.
  • Das vorliegende Verfahren kann auch für die Behandlung von durch das Immunsystem vermittelten Neuropathien verwendet werden. Die Hauptfunktion des Immunsystems besteht in dem Schutz des Körpers vor infektiösen Organismen, die von außen eindringen. In einigen Fällen richtet sich das Immunsystem jedoch gegen den Körper und ruft eine Autoimmunkrankheit hervor. Das Immunsystem besteht aus mehreren Typen weißer Blutzellen, einschließlich T-Lymphocyten, die auch die Immunantwort regulieren; und B-Lymphocyten oder Plasmazellen, die spezialisierte Proteine, die als ”Antikörper” bezeichnet werden, sezernieren. Manchmal greift das Immunsystem aus unbekannten Gründen irrtümlicherweise Teile des Körpers wie periphere Nerven an. Dies stellt eine Periphere ”Autoimmun”neuropathie dar. Es gibt abhängig von dem Teil des peripheren Nerven, der angegriffen wird, und dem Typ der Immunreaktion mehrere verschiedene Typen. Die Folgenden sind kurze Beschreibungen der Neuropathien, die durch das Immunsystem vermittelt werden.
  • Ein Hedgehog-Agonist kann beispielsweise zur Behandlung des Guillain-Barré-Syndroms (GBS), einer akuten Neuropathie, die plötzlich oder schnell auftritt, verwendet werden. Das Guillain-Barré-Syndrom kann innerhalb von Tagen oder Wochen nach dem Beginn zu Paralyse und respiratorischer Insuffizienz fortschreiten. Die Neuropathie wird hervorgerufen, wenn das Immunsystem die Myelinscheiden der motorischen und sensorischen Nerven zerstört. Es geht ihr häufig eine Infektion, eine Impfung oder ein Trauma voraus, und es wird angenommen, dass dies die Autoimmunreaktion auslöst. Die Krankheit ist selbst-begrenzend mit einer spontanen Genesung innerhalb von sechs bis acht Wochen. Die Genesung ist jedoch häufig unvollständig.
  • Andere Neuropathien, die akut beginnen und durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen akute motorische Neuropathie, akute sensorische Neuropathie und akute autonome Neuropathie ein, bei denen ein Immunangriff gegen die motorischen, sensorischen beziehungsweise autonomen Nerven stattfindet. Das Miller-Fisher-Syndrom ist eine andere Variante, bei der eine Paralyse des Blicks, ein Koordinationsverlust und ein unsicherer Gang vorliegen.
  • Noch eine andere erworbene Neuropathie, die durch das vorliegende Verfahren behandelt werden kann, ist chronische entzündliche demyelinisierende Polyneuropathie (CIDP). Es wird angenommen, dass CIDP eine chronische und schmerzlosere Form des Guillain-Barré-Syndroms ist. Die Krankheit schreitet entweder in wiederholten Schüben, die als Rückfälle bezeichnet werden, oder auf eine schrittweise oder gleichmäßige Art und Weise fort. Wie bei GBS liegt offensichtlich eine Zerstörung der Myelinscheide durch Antikörper und T-Lymphocyten vor. Da es jedoch keinen spezifischen Test für CIDP gibt, basiert die Diagnose auf den klinischen Kennzeichen und Laborkennzeichen.
  • Chronische Polyneuropathien mit Antikörpern gegen periphere Nerven stellen noch eine weitere periphere Neuropathie dar, für die die vorliegenden Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung verwendet werden können. Bei einigen Typen von chronischen Neuropathien wurden Antikörper gegen spezifische Nervenkomponenten identifiziert. Diese schließen demyelinisierende Neuropathie, die mit Antikörpern gegen das Myelin-gebundene Glycoprotein (MAG) verbunden ist, motorische Neuropathie, die mit Antikörpern gegen die Ganglioside GM1 oder GD1a verbunden ist, und sensorische Neuropathie, die mit anti-Sulfatid- oder -GD1b-Gangliosidantikörpern verbunden ist, ein. Die Antikörper in diesen Fällen binden an Oligosaccharide oder zuckerähnliche Moleküle, die an Proteine (Glycoproteine) oder Lipide (Glycolipide oder Ganglioside) in den Nerven gebunden sind. Es wird vermutet, dass diese Antikörper für die Neuropathien verantwortlich sein können.
  • Das vorliegende Verfahren kann auch als Teil eines therapeutischen Plans zur Behandlung von Neuropathien, die mit einer Vaskulitis oder Entzündung der Blutgefäße in peripheren Nerven verbunden sind, verwendet werden. Neuropathie kann auch durch eine Vaskulitis – eine Entzündung der Blutgefäße in peripheren Nerven – hervorgerufen werden. Sie erzeugt kleine ”Schlaganfälle” entlang des Verlaufs der peripheren Nerven und kann auf die Nerven beschränkt sein oder sie kann generalisiert sein, einen Hautausschlag einschließen oder andere Organe umfassen. Mehrere rheumatologische Krankheiten wie rheumatoide Arthritis, Lupus, Periarteriitis nodosa oder das Sjögren-Syndrom, sind mit einer generalisierten Vaskulitis, die auch die peripheren Nerven umfassen kann, verbunden. Eine Vaskulitis kann abhängig von der Verteilung und der Schwere der Läsionen eine Polyneuritis, Mononeuritis oder Mononeuritis multiplex hervorrufen.
  • In noch einer anderen Ausführungsform kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Brachialplexitis oder Lumbosakralplexitis verwendet werden. Der Brachialplexus, der unter der Achselhöhle liegt, enthält die Nerven zum Arm und zur Hand. Eine Brachialplexitis ist die Folge einer Entzündung dieses Nervenbündels und erzeugt Schwäche und Schmerzen in einem oder beiden Armen. Eine Lumbosakralplexitis, die im Becken vorkommt, ruft Schwäche und Schmerzen in den Beinen hervor.
  • Hedgehog-Agonisten können auch zur Verwendung für die Behandlung von Neuropathien, die mit monoclonalen Gammopathien verbunden sind, geeignet sein. Bei einer monoclonalen Gammopathie breiten sich einzelne Clone von B-Zellen oder Plasmazellen im Knochenmark oder in den lymphoiden Organen aus, wobei benigne oder maligne Tumoren gebildet und Antikörper sezerniert werden. ”Monoclonal” bedeutet, dass einzelne Clone von Antikörpern vorliegen, und ”Gammopathie” steht für Gammaglobuline, was ein anderer Name für Antikörper ist. In einigen Fällen reagieren die Antikörper mit Nervenkomponenten; in anderen Fällen bilden Fragmente der Antikörper Amyloidablagerungen.
  • Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des vorliegenden Verfahrens für die Behandlung von Neuropathien, die mit Tumoren oder Neoplasmen verbunden sind. Eine Neuropathie kann auf eine direkte Infiltration von Nerven durch Tumorzellen oder auf eine indirekte Wirkung des Tumors zurückzuführen sein. Die letztere wird als paraneoplastische Neuropathie bezeichnet. Mehrere Typen wurden beschrieben. Die vorliegenden Verfahren können beispielsweise verwendet werden, um eine mit Lungenkrebs verbundene sensorische Neuropathie zu behandeln. Diese Neuropathie ist mit Antikörpern gegen ein als Hu bezeichnetes Protein, das in den sensorischen Neuronen der peripheren Nerven vorhanden ist, verbunden. Desgleichen kann das vorliegenden Verfahren zur Behandlung von Neuropathien, die mit einem multiplen Myelom verbunden sind, verwendet werden. Ein multiples Myelom ist ein Knochentumor, der durch Antikörper-sezernierende Plasmazellen im Knochenmark hervorgerufen wird. Der Tumor besteht aus einem einzelnen Clon von Plasmazellen, und die Antikörper, die sie erzeugen, sind identisch oder monoclonal. Einige Personen mit einem multiplen Myelom entwickeln eine sensomotorische Polyneuropathie mit einer Degeneration von Axonen in den peripheren Nerven. In anderen Ausführungsformen kann das vorliegende Verfahren zur Behandlung von Neuropathien, die mit Waldenström-Makroglobulinämie, chronischer Lymphocytenleukämie oder B-Zelllymphom verbunden sind, verwendet werden. Diese sind Tumoren, die durch Antikörper-sezernierende B-Lymphocyten in der Milz, im Knochenmark oder in den Lymphknoten hervorgerufen werden. Diese Antikörper sind monoclonal und reagieren häufig mit Komponenten peripherer Nerven wie MAG, GM1 oder Sulfatid. In noch anderen Ausführungsformen können die Hedgehog-Agonisten der vorliegenden Erfindung als Teil einer therapeutischen Vorschrift zur Behandlung von Patienten mit Krebserkrankungen verwendet werden, bei denen die Neuropathie eine Folge einer lokalen Bestrahlung ist oder durch medikamentöse Behandlung wie mit Vincristin und Cisplatin hervorgerufen wird.
  • Die vorliegende Erfindung beabsichtigt auch die Verwendung von Hedgehog-Agonisten zur Behandlung von Neuropathien, die mit Amyloidose verbunden sind. Amyloid ist eine Substanz, die in den peripheren Nerven abgelagert wird und ihre Funktion stört: Die Erkrankung ist Amyloidose. Es gibt zwei Haupttypen: primäre Amyloidose, bei der die Ablagerungen Fragmente monoclonaler Antikörper enthalten (siehe monoclonale Gammopathie vorstehend), und hereditäre Amyloidose, bei der die Ablagerungen ein mutiertes Protein, das Transthyretin bezeichnet wird, enthalten. Primäre Amyloidose ist in der Regel mit monoclonalen Gammopathien oder Myelom verbunden.
  • Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt das vorliegende Verfahren als Mittel zur Behandlung von durch Infektionen hervorgerufenen Neuropathien bereit. Periphere Neuropathien können durch eine Infektion der peripheren Nerven hervorgerufen werden. Viren, die periphere Neuropathien hervorrufen, schließen das AIDS-Virus, HIV-I, das eine langsam fortschreitende sensorische Neuropathie hervorruft, das Cytomegalievirus, das eine schnell fortschreitende paralytische Neuropathie hervorruft, Herpes zoster, der Gürtelrose hervorruft, und das Poliovirus, das eine motorische Neuropathie hervorruft, ein. Infektionen mit Hepatitis B oder C sind manchmal mit einer vaskulitischen Neuropathie verbunden.
  • Bakterielle Infektionen, die eine Neuropathie hervorrufen, schließen Lepra, die eine fleckige sensorische Neuropathie hervorruft, und Diphtherie, die eine schnell fortschreitende paralytische Neuropathie hervorrufen kann, ein. Andere Infektionskrankheiten, die eine Neuropathie hervorrufen, schließen die Lyme-Krankheit, die durch eine Spirochäte hervorgerufen wird, und Trypanosomiasis, die durch einen Parasiten hervorgerufen wird, ein. Beide zeigen sich üblicherweise durch eine multifokale Neuropathie.
  • Durch ein Ernährungsungleichgewicht hervorrufene Neuropathien sind ebenfalls in Frage kommende Erkrankungen für eine Behandlung durch das vorliegende Verfahren. Ein Mangel an den Vitaminen B12, B1 (Thiamin), B6 (Pyridoxin) oder E kann zum Beispiel Polyneuropathien mit einer Degeneration von Axonen peripherer Nerven erzeugen. Dies kann auf eine Diät oder ein Unvermögen, die Nährstoffe aus dem Magen oder Darm zu absorbieren, zurückzuführen sein. Ferner können sehr große Dosen an Vitamin B6 ebenfalls eine periphere Neuropathie hervorrufen, und das vorliegende Verfahren kann als Teil eines Entgiftungsprogramms in solchen Fällen verwendet werden.
  • Noch eine andere Verwendung des vorliegenden Verfahrens besteht in der Behandlung von Neuropathien, die bei Nierenkrankheiten entstehen. Chronisches Nierenversagen kann eine überwiegend sensorische periphere Neuropathie mit einer Degeneration von Axonen peripherer Nerven hervorrufen.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von hypothyreoten Neuropathien bereit. Hypothyreose ist manchmal mit einer schmerzhaften sensorischen Polyneuropathie mit einer axonalen Degeneration verbunden. Mononeuropathie oder Mononeuropathie multiplex kann auch auf Grund einer Kompression der peripheren Nerven durch geschwollene Gewebe auftreten.
  • Das vorliegende Verfahren kann auch für die Behandlung von durch Alkohol und Toxine hervorgerufenen Neuropathien verwendet werden. Bestimmte Toxine können eine periphere Neuropathie hervorrufen. Bleitoxizität ist mit einer motorischen Neuropathie verbunden; Arsen oder Quecksilber rufen eine sensorische Neuropathie hervor, und Thallium kann eine sensorische und autonome Neuropathie hervorrufen. Mehrere organische Lösungsmittel und Insektizide können ebenfalls eine Polyneuropathie hervorrufen. Alkohol ist für die Nerven direkt toxisch, und Alkoholmissbrauch ist ein Hauptgrund von Neuropathie. Das vorliegende Verfahren kann in bestimmten Ausführungsformen als Teil eines breiteren Entgiftungsprogramms verwendet werden.
  • In noch einer anderen Ausführungsform können die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von durch Arzneistoffe hervorgerufenen Neuropathien verwendet werden. Von mehreren Arzneistoffen ist bekannt, dass sie eine Neuropathie hervorrufen. Sie schließen unter anderem Vincristin und Cisplatin bei Krebs, Nitrofurantoin, das bei Pyelonephritis verwendet wird, Amiodaron bei Herzrhythmusstörungen, Disulfiram bei Alkoholismus, ddC und ddI bei AIDS und Dapson, das zur Behandlung von Lepra verwendet wird, ein. Wie vorstehend, kann das vorliegende Verfahren in bestimmten Ausführungsformen als Teil eines breiteren Entgiftungsprogramms verwendet werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch für die Behandlung von durch ein Trauma oder eine Kompression hervorgerufenen Neuropathien verwendet werden. Lokalisierte Neuropathien können aus einer Nervenkompression durch äußeren Druck oder darüberliegende Sehnen und andere Gewebe resultieren. Die am besten bekannten dieser lokalisierten Neuropathien sind das Karpaltunnelsyndrom, das aus einer Kompression an der Handwurzel resultiert, und zervikale oder lumbale Radikulopathien (Ischias), die aus einer Kompression von Nervenwurzeln, wenn sie die Wirbelsäule verlassen, resultieren. Andere häufige Bereiche einer Nervenkompression schließen die Ellenbogen, Achselhöhlen und die Rückseite der Kniee ein.
  • Das vorliegende Verfahren ist auch bei einer Vielzahl von idiopathischen Neuropathien verwendbar. Der Begriff ”idiopathisch” wird verwendet, wann immer die Ursache der Neuropathie nicht gefunden werden kann. In diesen Fällen wird die Neuropathie gemäß ihren Manifestationen, d. h. als sensorische, motorische oder sensomotorische idiopathische Polyneuropathie, klassifiziert.
  • Das vorliegende Verfahren weist eine breite Anwendbarkeit auf die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, die Muskelgewebe betreffen, auf. Im Allgemeinen kann das Verfahren so charakterisiert werden, dass es einen Schritt des Verabreichens einer Menge eines Hedgehog-Agonisten, die den Proliferationszustand eines behandelten Muskelgewebes ändert, an ein Tier einschließt. Die Verabreichungsart und die Dosierungsschemata variieren abhängig von dem/den Muskelgewebe/n, das/die zu behandeln ist/sind.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen trophischen Muskelfaktor und seine Verwendung bei der Stimulierung von Muskelwachstum oder -differenzierung in Säugern. Eine solche Stimulation von Muskelwachstum ist zur Behandlung von Atrophie oder Schwund, im Besonderen Skelettmuskelatrophie und Herzmuskelatrophie, verwendbar. Ferner sind bestimmte Krankheiten, bei denen das Muskelgewebe geschädigt, anomal oder atrophiert ist, wie zum Beispiel normales Alter, Inaktivitätsatrophie, Schwund oder Kachexie, und verschiedene Sekundärkrankheiten, die mit dem Alter und dem Verlust von Muskelmasse verbunden sind, wie Hypertonie, Glucoseintoleranz und Diabetes, Dyslipämie und atherosklerotische kardiovaskuläre Krankheit, unter Verwendung der Erfindung behandelbar. Die Behandlung von muskulären Myopathien wie muskulären Dystrophien ist ebenfalls in der Erfindung enthalten.
  • Bei einer Denervierung oder Inaktivität unterliegen die Skelettmuskeln einer schnellen Atrophie, die zu einer starken Abnahme der Größe, des Proteingehalts und der Kontraktionskraft führt. Diese Atrophie ist eine wichtige Komponente vieler neuromuskulärer Krankheiten bei Menschen. In einem klinischen Umfeld können Zusammensetzungen, umfassend die vorliegenden Hedgehog-Agonisten, zur Hemmung einer Muskeldegeneration, z. B. zur Verringerung des Verlusts von Muskelmasse, wie zum Beispiel als Teil einer Behandlung von solchen Muskelschwunderkrankungen, verwendet werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen werden erfindungsgemäße Arzneimittel an Patienten, die an einer Störung, d. h. einem anomalen körperlichen Zustand, einer Krankheit oder einem pathophysiologischen Zustand leiden, der/die mit einer anomalen und/oder abweichenden Regulierung von Muskelgewebe verbunden ist, verabreicht. Die Störungen, für die die Zusammensetzungen der Erfindung verabreicht werden, sind bevorzugt die, die direkt oder indirekt einen Schwund (d. h. Verlust) von Muskelmasse erzeugen, das heißt eine Muskelschwunderkrankung. Diese schließen Muskeldystrophien, Herzkachexie, Emphysem, Lepra, Mangelernährung, Osteomalazie, akute Leukämie bei Kinder, AIDS-Kachexie und Krebskachexie ein.
  • Die Muskeldystrophien sind genetische Krankheiten, die durch progressive Schwache und Degeneration von Muskelfasern ohne Nachweis einer neuralen Degeneration gekennzeichnet sind. Bei der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) zeigen Patienten eine durchschnittliche Verringerung der Muskelmasse um 67% und von myotonischer Dystrophie wurde gezeigt, dass die fraktionierte Muskelproteinsynthese um durchschnittlich 28% herabgesetzt ist, ohne eine entsprechende Abnahme der Nichtmuskelproteinsynthese (möglicherweise auf Grund einer beeinträchtigten Antwort des Endorgans auf anabole Hormone oder Substrate). Ein beschleunigter Proteinabbau wurde in den Muskeln von DMD-Patienten nachgewiesen. Das vorliegende Verfahren kann als Teil einer therapeutischen Strategie verwendet werden, um den mit solchen Dystrophien verbundenen Muskelschwundzuständen vorzubeugen und sie in einigen Fällen rückgängig zu machen.
  • Eine schwere Stauungsherzinsuffizienz (CHF) ist durch eine ”Herzkachexie”, d. h. einen Muskelproteinschwund sowohl der Herz- als auch Skelettmuskeln, mit einer durchschnittlichen Abnahme des Körpergewichts von 19% gekennzeichnet. Die Herzkachexie wird durch eine erhöhte Abbaugeschwindigkeit von myofibrillärem Protein hervorgerufen. Das vorliegende Verfahren kann als Teil einer Behandlung von Herzkachexie verwendet werden.
  • Das vorliegende Verfahren weist auch eine breite Anwendbarkeit auf die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, die das Epithelgewebe betreffen. Im Allgemeinen kann das Verfahren so charakterisiert werden, dass es einen Schritt des Verabreichens einer Menge eines Hedgehog-Agonisten, die den Wachstumszustand eines behandelten Epithelgewebes ändert, an ein Tier einschließt. Die Verabreichungsart und die Dosierungsschemata variieren abhängig von dem/den Epithelgewebe/n, das/die zu behandeln ist/sind. Topische Formulierungen sind zum Beispiel bevorzugt, wenn das behandelte Gewebe epidermales Gewebe wie Haut- oder Schleimhautgewebe ist.
  • Ein Verfahren, das ”die Heilung einer Wunde fördert”, führt als Ergebnis der Behandlung zu einer viel schnelleren Wundheilung als eine ähnliche Wunde ohne die Behandlung heilt. ”Förderung von Wundheilung” kann auch bedeuten, dass das Verfahren die Proliferation und/oder das Wachstum von, inter alia, Keratinocyten reguliert oder dass die Wunde mit geringerer Narbenbildung, geringerer Wundkontraktion, geringerer Kollagenablagerung und einer größeren Oberfläche heilt. In bestimmten Fällen kann ”Förderung von Wundheilung” auch bedeuten, dass bestimmte Verfahren der Wundheilung bessere Erfolgsquoten (z. B. die Nichtabstoßungsraten von Hauttransplantaten) aufweisen, wenn sie zusammen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Komplikationen stellen bei Wunden, die nicht völlig verheilt sind und offen bleiben, ein konstantes Risiko dar. Obwohl die meisten Wunden ohne Behandlung schnell heilen, widersetzen sich einige Wundtypen der Heilung. Wunden, die große Oberflächen bedecken, bleiben ebenfalls eine längere Zeitdauer offen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um die Heilung von Wunden, die Epithelgewebe umfassen, wie sie aus einem chirurgischen Eingriff, Verbrennungen, einer Entzündung oder Reizung resultieren, zu beschleunigen. Bestimmte der Hedgehog-Agonisten der vorliegenden Erfindung können auch prophylaktisch wie zum Beispiel in Form einer kosmetischen Zubereitung angewendet werden, um Geweberegenerationsprozesse z. B. der Haut, der Haare und/oder der Fingernägel zu verbessern.
  • Trotz des wesentlichen Fortschritts bei rekonstruktiven Operationsverfahren kann die Narbenbildung ein wichtiges Hindernis bei der Wiedererlangung einer normalen Funktion und eines normalen Aussehens von geheilter Haut darstellen. Dies trifft besonders zu, wenn eine pathologische Narbenbildung wie Keloide oder hypertrophe Narben der Hände oder des Gesichts eine funktionelle Behinderung oder eine körperliche Entstellung hervorrufen. Unter den schwersten Umständen kann eine solche Narbenbildung psychosoziales Leid und ein Leben mit wirtschaftlichem Verlust auslösen. Eine Wundheilung schließt die Stufen der Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung ein. Die Proliferationsphase umfasst die Vermehrung von Fibroblasten und Endothel- und Epithelzellen. Durch die Verwendung des vorliegenden Verfahrens kann die Proliferationsgeschwindigkeit von Epithelzellen in der Wunde und proximal zur Wunde gesteuert werden, um den Wundverschluss zu beschleunigen und/oder die Bildung von Narbengewebe möglichst gering zu halten.
  • Verbrennungen dritten und zweiten Grades sind ein Beispiel eines Wundtyps, der häufig große Oberflächen bedeckt und daher eine längere Zeitdauer benötigt, um zu heilen. Als Folge entstehen häufig lebensbedrohliche Komplikationen wie eine Infektion und ein Verlust von Körperflüssigkeiten. Zusätzlich ist die Heilung bei Verbrennungen häufig gestört, was zu Narbenbildung und Entstellung führt. In einigen Fällen führt die Wundkontraktion auf Grund übermäßiger Kollagenablagerung zu einer verringerten Beweglichkeit von Muskeln in der Nähe der Wunde. Die Zusammensetzungen und das Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Heilungsgeschwindigkeit von Verbrennungen zu beschleunigen und um Heilungsprozesse zu fördern, was zu wünschenswerteren kosmetischen Resultaten und geringerer Wundkontraktion und Narbenbildung führt.
  • Schwere Verbrennungen, die große Bereiche bedecken, werden häufig mit Hautautotransplantaten, die aus unversehrten Bereichen des Körpers des Patienten entnommen wurden, behandelt. Das vorliegende Verfahren kann auch in Verbindung mit Hauttransplantaten verwendet werden, um die ”Anwachs”raten des Transplantats zu verbessern, indem das Wachstum sowohl der transplantierten Haut als auch der Haut des Patienten, die sich proximal zum Transplantat befindet, beschleunigt wird.
  • Hautgeschwüre sind noch ein anderes Beispiel von Wunden, die für die Behandlung durch das vorliegende Verfahren geeignet sind, z. B. um eine Heilung des Geschwürs hervorzurufen und/oder um zu verhindern, dass das Geschwür zu einer chronischen Wunde wird. Einer von sieben Individuen mit Diabetes entwickelt zum Beispiel Hautgeschwüre an seinen Extremitäten, die für eine Infektion anfällig sind. Individuen mit infizierten diabetischen Geschwüren benötigen häufig eine Hospitalisierung, intensive Versorgung, teuere Antibiotika und in einigen Fällen eine Amputation. Hautgeschwüre wie die aus einer Venenerkrankung (Geschwüren durch venöse Stauung), übermäßigem Druck (Dekubitusgeschwüren) und arteriellen Geschwüren resultierenden widersetzen sich ebenfalls einer Heilung. Die Behandlungen des Standes der Technik sind im Allgemeinen darauf beschränkt, die Wunde geschützt und infektionsfrei zu halten und in einigen Fällen den Blutfluß durch Gefäßchirurgie wiederherzustellen. Gemäß dem vorliegenden Verfahren kann der betroffene Hautbereich mit einer Therapie behandelt werden, die einen Hedgehog-Agonisten einschließt, der die Epithelisierung der Wunde fördert, z. B. die Heilungsgeschwindigkeit der Hautgeschwüre beschleunigt.
  • Die vorliegende Behandlung kann auch als Teil eines therapeutischen Schemas zur Behandlung von oralen und paraoralen Geschwüren, die zum Beispiel aus einer Bestrahlung und/oder Chemotherapie resultieren, wirksam sein. Solche Geschwüre entwickeln sich gewöhnlich innerhalb von Tagen nach einer Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie. Diese Geschwüre beginnen in der Regel als kleine, schmerzhafte, unregelmäßig geformte Läsionen, die in der Regel mit einer zarten, grauen, nekrotischen Membran bedeckt und von entzündlichem Gewebe umgeben sind. In vielen Fällen führt eine mangelnde Behandlung zu einer Proliferation von Gewebe auf entzündlicher Basis um den Randbereich der Läsion herum. Das Epithel, das das Geschwür begrenzt, zeigt beispielsweise in der Regel eine proliferierende Aktivität, was zu einem Kontinuitätsverlust des Oberflächenepithels führt. Diese Läsionen führen wegen ihrer Größe und dem Verlust der Epithelintegrität zu einer möglichen Sekundärinfektion des Körpers. Eine routinemäßige Aufnahme von Nahrung und Wasser wird zu einem sehr schmerzhaften Ereignis und, wenn die Geschwüre im ganzen Verdauungskanal proliferieren, ist in der Regel eine Diarrhöe mit allen ihren Komplikationsfaktoren offensichtlich. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Behandlung für solche Geschwüre, die die Anwendung eines Hedgehog-Agonisten einschließt, die anomale Proliferation und Differenzierung des betroffenen Epithels verringern, indem sie dazu beiträgt, die Schwere der nachfolgenden entzündlichen Ereignisse zu verringern.
  • Mit dem Alter wird die Epidermis dünner und die Hautanhangsgebilde atrophieren. Das Haar wird schütter, und die Talgsekretion nimmt ab, mit einer daraus folgenden Empfindlichkeit für Trockenheit, Riß- und Fissurenbildung. Die Dermis verringert sich zusammen mit einem Verlust an elastischen Fasern und Kollagenfasern. Ferner nimmt die Keratinocytenproliferation (die auf die Hautdicke und Proliferationsleistung der Haut schließen lässt) mit dem Alter ab. Von einer Zunahme der Keratinocytenproliferation nimmt man an, dass sie der Hautalterung, d. h. Falten, durch Dicke, Elastizität und Wiederherstellung entgegenwirkt. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Proliferationsform eines Hedgehog-Agonisten entweder therapeutisch oder kosmetisch verwendet werden, um wenigstens zeitweise den Wirkungen der Hautalterung entgegenzuwirken.
  • Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des vorliegenden Verfahrens zur Förderung von Haarwachstum wie in den Ansprüchen definiert. Haar besteht im Wesentlichen aus Keratin, einem zähen und unlöslichen Protein; seine Hauptfestigkeit liegt an seinen Cysteindisulfidbindungen. Jedes einzelne Haar umfasst einen zylindrischen Schaft und eine Wurzel und befindet sich in einem Follikel, einer flaschenartigen Vertiefung der Haut. Der Boden des Follikels enthält einen fingerartigen Fortsatz, der als die Papille bezeichnet wird, die aus Bindegewebe besteht, aus dem das Haar wachst und durch das Blutgefäße die Zellen mit Nahrung versorgen. Der Schaft ist der Teil, der sich außerhalb der Hautoberfläche erstreckt, während die Wurzel als begrabener Teil des Haares beschrieben wurde. Die Basis der Wurzel dehnt sich in die Haarzwiebel aus, die auf der Papille ruht. Zellen, aus denen das Haar erzeugt wird, wachsen in der Zwiebel des Follikels; sie werden in Form von Fasern extrudiert, wenn die Zellen in dem Follikel proliferieren. Haar”wachstum” bezieht sich auf die Bildung und Verlängerung der Haarfaser durch die sich teilenden Zellen.
  • Wie in dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, wird der gewöhnliche Haarzyklus in drei Stadien eingeteilt: Anagen-, Katagen- und Telogenphase. Während der aktiven Phase (anagen) teilen sich die epidermalen Stammzellen der Hautpapille schnell. Die Tochterzellen bewegen sich aufwärts und differenzieren sich, um die konzentrischen Schichten des Haares selbst zu bilden. Das Übergangsstadium, katagen, ist durch das Ende der Mitose der Stammzellen in dem Follikel gekennzeichnet. Das Ruhestadium ist als telogen bekannt, in dem das Haar mehrere Wochen innerhalb der Kopfhaut zurückgehalten wird, bevor ein auftauchendes neues Haar, das sich unter ihm entwickelt, den Schaft der Telogenphase aus seinem Follikel herausschiebt. Aus diesem Modell wurde deutlich, dass je größer das Reservoir an sich teilenden Stammzellen ist, die sich in Haarzellen differenzieren, umso mehr Haarwachstum stattfindet. Folglich können Verfahren zur Steigerung oder Verringerung von Haarwachstum durchgeführt werden, indem die Proliferation dieser Stammzellen verstärkt beziehungsweise gehemmt wird.
  • Somit kann in bestimmten Ausführungsformen das vorliegende Verfahren als ein Weg zur Förderung des Wachstums von menschlichem Haar verwendet werden, z. B. um Alopezie zu korrigieren.
  • Das vorliegende Verfahren kann auch für die Behandlung einer Wunde am Augengewebe verwendet werden. Im Allgemeinen kann eine Schädigung von Hornhautgewebe, ob durch Krankheit, einen chirurgischen Eingriff oder eine Verletzung, die Epithel- und/oder Endothelzellen abhängig von der Art der Wunde beeinflussen. Hornhautepithelzellen sind nicht-keratinisierte Epithelzellen, die die äußere Oberfläche der Hornhaut überziehen und eine Schutzbarriere gegen die äußere Umgebung bereitstellen. Die Hornhautwundheilung ist sowohl für klinische Ärzte als auch Forscher von Bedeutung. Augenärzte sind häufig mit Hornhautdystrophien und problematischen Verletzungen, die zu einer anhaltenden und wiederkehrenden Epithelerosion führen, die oft zu einem permanenten Endothelverlust führt, konfrontiert. Die Verwendung von Proliferationsformen der vorliegenden Hedgehog-Agonisten kann in diesen Fällen verwendet werden, um die Epithelisierung des betroffenen Hornhautgewebes zu fördern.
  • Zur weiteren Veranschaulichung schließen spezielle Erkrankungen, die typischerweise mit einer Schädigung von Epithelzellen im Auge verbunden sind und für die das vorliegende Verfahren eine nützliche Behandlung bereitstellen kann, anhaltende Hornhautepitheldefekte, wiederkehrende Erosionen, neurotrophe Hornhautgeschwüre, Keratoconjunktivitis sicca, mikrobielle Hornhautgeschwüre, virale Hornhautgeschwüre und dergleichen ein. Chirurgische Verfahren, die typischerweise eine Verletzung der Epithelzellschichten hervorrufen, schließen Laserverfahren, die an der Augenoberfläche durchgeführt werden, beliebige refraktive chirurgische Verfahren wie radiale Keratotomie und astigmatische Keratotomie, Bindehautlappen, Bindehautransplantate, Epikeratoplastik und Hornhautabschabung ein. Ferner können oberflächliche Wunden wie Kratzer, Oberflächenerosion, Entzündung etc. einen Verlust von Epithelzellen hervorrufen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Hornhautepithel mit einer Menge eines Hedgehog-Agonisten in Kontakt gebracht, die eine Proliferation der Hornhautepithelzellen für eine geeignete Wundheilung hervorruft.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um eine Differenzierung zu induzieren und/oder eine Proliferation von epithelial abgeleitetem Gewebe zu fördern. Solche Formen dieser Moleküle können eine Basis für eine Differenzierungtherapie zur Behandlung von hyperplastischen und/oder neoplastischen Zuständen, umfassend Epithelgewebe, bereitstellen. Solche Zubereitungen können zum Beispiel zur Behandlung von Hautkrankheiten, bei denen eine anomale Proliferation oder ein anomales Wachstum von Hautzellen besteht, verwendet werden.
  • Das vorliegende Verfahren kann zur Verbesserung der ”Anwachsgeschwindigkeit” eines Hauttransplantats verwendet werden. Transplantate von epidermalem Gewebe können, wenn die Anwachsgeschwindigkeit des Transplantats zu gering ist, Blasen bilden und sich ablösen, was die Wahrscheinlichkeit verringert, dass das Autotransplantat ”anwächst”, d. h. an der Wunde haftet und eine Basalmembran mit dem darunter liegenden Granulationsgewebe bildet. Die Anwachsgeschwindigkeiten können durch das vorliegende Verfahren erhöht werden, indem die Proliferation der Keratinocyten induziert wird. Das Verfahren zur Steigerung der Anwachsgeschwindigkeiten umfasst das Inkontaktbringen des Hautautotransplantats mit einer wirksamen wundheilenden Menge eines Hedgehog-Agonisten, der in dem Verfahren der Förderung von Wundheilung und in dem Verfahren der Förderung des Wachstums und der Proliferation von Keratinocyten, wie vorstehend beschrieben, beschrieben wurde.
  • Hautäquivalente finden nicht nur als Ersatz für menschliche oder tierische Haut bei einer Hauttransplantation, sondern auch als Testhaut zur Bestimmung der Wirkungen pharmazeutischer Substanzen und Kosmetika auf der Haut viele Verwendungen. Ein Hauptproblem bei der pharmakologischen, chemischen und kosmetischen Prüfung besteht in den Schwierigkeiten bei der Bestimmung der Wirksamkeit und Sicherheit der Produkte auf der Haut. Ein Vorteil der Hautäquivalente der Erfindung ist ihre Verwendung als Indikator der durch solche Substanzen erzeugten Wirkungen durch eine Prüfung auf einer Testhaut in vitro.
  • Somit kann eine Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens als Teil einer Vorschrift für Hauttransplantationen auf z. B. freigelegten Bereichen, Granulationsgewebe bildenden Wunden und Verbrennungen verwendet werden. Die Verwendung von Hedgehog-Agonisten kann solche Transplantationsverfahren wie Spalthautautotransplantate und epidermale Autotransplantate (gezüchtete autogene Keratinocyten) und epidermale Allotransplantate (gezüchtete allogene Keratinocyten) verbessern. Im Fall des Allotransplantats unterstützt die Verwendung des vorliegenden Verfahrens zur Verbesserung der Bildung von Hautäquivalenten in Kultur die Bereitstellung/Aufrechterhaltung einer schnellen Lieferung solcher Transplantate (z. B. in Gewebebanken), so dass die Patienten in einem einzigen Verfahren mit einem Material, das eine permanente Heilung ermöglicht, bedeckt werden können.
  • In dieser Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung auch zusammengesetzte Äquivalente lebender Haut, umfassend eine epidermale Schicht aus gezüchteten Keratinocytenzellen, die durch die Behandlung mit einem Hedgehog-Agonisten vermehrt worden waren. Das vorliegende Verfahren kann als Teil eines Verfahrens zur Herstellung von zusammengesetzten Äquivalenten lebender Haut verwendet werden. In einer veranschaulichenden Ausführungsform umfasst ein solches Verfahren die Gewinnung einer Hautprobe, die enzymatische Behandlung der Hautprobe, um die Epidermis von der Dermis zu trennen, die enzymatische Behandlung der Epidermis, um die Keratinocytenzellen freizusetzen, die Züchtung der epidermalen Keratinocyten in Gegenwart eines Hedgehog-Agonisten bis zur Konfluenz, die parallele oder getrennte enzymatische Behandlung der Dermis, um die Fibroblastenzellen freizusetzen, die Züchtung der Fibroblastenzellen bis zur Subkonfluenz, das Animpfen einer porösen, vernetzten Kollagenschwammmembran mit den gezüchteten Fibroblastenzellen, das Inkubieren des auf seiner Oberfläche angeimpften Kollagenschwamms um das Wachstum der Fibroblastenzellen im ganzen Kollagenschwamm zu ermöglichen, und dann sein Animpfen mit gezüchteten Keratinocytenzellen und weiteres Inkubieren des zusammengesetzten Hautäquivalentkomplexes in Gegenwart eines Hedgehog-Agonisten, um das Wachstum der Zellen zu fördern.
  • In anderen Ausführungsformen können Hautschichten, die sowohl Epithel- als Mesenchymschichten enthalten, in Kultur isoliert und mit Kulturmedien, die mit einer Proliferationsform eines Hedgehog-Agonisten ergänzt sind, vermehrt werden. Eine beliebige Hautprobe, die für Zellkulturverfahren geeignet ist, kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Hautproben können autogen oder allogen sein.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das vorliegende Verfahren in Verbindung mit verschiedenen periodontalen Verfahren, in denen eine Steuerung der Proliferation von Epithelzellen in und um das periodontale Gewebe herum gewünscht ist, verwendet werden. In einer Ausführungsform können Hedgehog-Agonisten verwendet werden, um die Reepithelisierung in der Umgebung natürlicher und prothetischer Zähne zu steigern, z. B. um die Bildung von Zahnfleischgewebe zu fördern.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Arzneimittelzubereitungen, umfassend Hedgehog-Agonisten, bereit. Die in dem vorliegenden Verfahren zu verwendenden Hedgehog-Agonisten können geeigneterweise für die Verabreichung mit einem logisch verträglichen Medium wie Wasser, gepufferter Kochsalzlösung, einem Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol, flüssigem Polyethylenglykol und dergleichen) oder geeigneten Gemischen davon formuliert werden. Die optimale Konzentration des Wirkstoffs/der Wirkstoffe in dem gewählten Medium kann gemäß Verfahren, die Fachleuten der pharmazeutischen Chemie allgemein bekannt sind, empirisch bestimmt werden. Wie hier verwendet, schließt ”biologisch verträgliches Medium” ein beliebiges und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien und dergleichen, die für den gewünschten Verabreichungsweg der Arzneimittelzubereitung geeignet sind, ein. Die Verwendung solcher Medien für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist in dem Fachgebiet bekannt. Außer wenn ein beliebiges herkömmliches Medium oder Mittel mit der Aktivität des Hedgehog-Agonisten inkompatibel ist, ist seine Verwendung in der Arzneimittelzubereitung der Erfindung beabsichtigt. Geeignete Träger und ihre Formulierung, einschließlich anderer Proteine, sind zum Beispiel in dem Buch Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa, USA 1985) beschrieben. Diese Träger schließen injizierbare ”Depotformulierungen” ein.
  • Arzneimittelformulierungen der vorliegenden Erfindung können auch tiermedizinische Zusammensetzungen, z. B. Arzneimittelzubereitungen der Hedgehog-Agonisten, die für tiermedizinische Verwendungen, z. B. für die Behandlung von Vieh oder Haustieren, z. B. Hunden, geeignet sind, einschließen.
  • Wiederbeladbare oder biologisch abbaubare Vorrichtungen können ebenfalls Verfahren zur Einführung bereitstellen. Verschiedene polymere Vorrichtungen zur langsamen Freisetzung wurden entwickelt und in den letzten Jahren auf die gesteuerte Abgabe von Arzneistoffen, einschließlich proteinartiger Biopharmazeutika, in vivo untersucht. Eine Vielzahl von biokompatiblen Polymeren (einschließlich Hydrogelen), einschließlich sowohl biologisch abbaubarer als auch nicht-abbaubarer Polymere, kann verwendet werden, um ein Implantat für die verlängerte Freisetzung eines Hedgehog-Agonisten an einem besonderen Zielort zu bilden.
  • Die Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können oral, parenteral, topisch oder rektal verabreicht werden. Sie werden natürlich in Formen verabreicht, die für jeden Verabreichungsweg geeignet sind. Sie werden zum Beispiel in Tabletten- oder Kapselform, durch Injektion, Inhalation, als Augenlotion, Salbe, Suppositorium, Pflaster zur gesteuerten Freisetzung etc., durch Verabreichung durch Injektion, Infusion oder Inhalation; topisch durch eine Lotion oder Salbe und rektal durch Suppositorien verabreicht. Orale und topische Verabreichungen sind bevorzugt.
  • Die Ausdrücke ”parenterale Verabreichung” und ”parenteral verabreicht”, wie hier verwendet, bedeuten andere Verabreichungsarten als die enterale und topische Verabreichung, in der Regel durch Injektion, und schließen ohne Einschränkung eine intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre, subkapsuläre, subarachnoidale, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion ein.
  • Die Ausdrücke ”systemische Verabreichung” und ”systemisch verabreicht”, ”periphere Verabreichung” und ”peripher verabreicht”, wie hier verwendet, bedeuten eine andere Verabreichung einer Verbindung, eines Arzneistoffs oder eines anderen Materials als direkt in das Zentralnervensystem, so dass sie/er/es in das System des Patienten gelangt und somit dem Stoffwechsel und anderen ähnlichen Prozessen ausgesetzt ist, zum Beispiel eine subkutane Verabreichung.
  • Diese Verbindungen können Menschen oder anderen Tieren durch einen beliebigen geeigneten Verabreichungsweg, einschließlich oral, nasal wie zum Beispiel durch ein Spray, rektal, intravaginal, parenteral, intrazisternal und topisch wie durch Pulver, Salben oder Tropfen, einschließlich bukkal und sublingual, zur Therapie verabreicht werden.
  • Ungeachtet des gewählten Verabreichungsweges werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die in einer geeigneten hydratisierten Form verwendet werden können, und/oder die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch verträglichen Dosierungsformen, wie nachstehend beschrieben, oder durch andere herkömmliche Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, formuliert.
  • Die tatsächlichen Dosierungshöhen der Wirkstoffe in den Arzneimitteln dieser Erfindung können so variiert werden, dass eine Menge des Wirkstoffs erhalten wird, die die gewünschte therapeutische Antwort für einen besonderen Patienten, eine besondere Zusammensetzung und eine besondere Verabreichungsart erzielt, ohne für den Patienten toxisch zu sein.
  • Die gewählte Dosierungshöhe hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Wirksamkeit der verwendeten besonderen Verbindung der vorliegenden Erfindung oder des Esters, Salzes oder Amids davon, des Verabreichungsweges, der Verabreichungszeit, der Ausscheidungsgeschwindigkeit der verwendeten besonderen Verbindung, der Dauer der Behandlung, anderer Arzneistoffe, Verbindungen und/oder Materialien, die in Kombination mit dem verwendeten besonderen Hedgehog-Agonisten verwendet werden, des Alters, des Geschlechts, des Gewichts, des Zustandes, der allgemeinen Gesundheit und der vorangegangenen medizinischen Geschichte des behandelten Patienten und ähnlicher Faktoren, die in den medizinischen Fachgebieten allgemein bekannt sind.
  • Ein Arzt oder Tierarzt mit einer normalen Fachkenntnis kann die wirksame Menge des erforderlichen Arzneimittels leicht bestimmen und verschreiben. Der Arzt oder Tierarzt kann zum Beispiel mit Dosen der in den Arzneimitteln verwendeten Verbindungen der Erfindung in Konzentrationen beginnen, die niedriger als die sind, die erforderlich sind, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, und die Dosierung allmählich erhöhen, bis die gewünschte Wirkung erreicht ist.
  • Im Allgemeinen ist eine geeignete tägliche Dosis einer Verbindung der Erfindung die Menge der Verbindung, die die niedrigste Dosis ist, um eine therapeutische Wirkung zu erzeugen. Eine solche wirksame Dosis hängt im Allgemeinen von den vorstehend beschriebenen Faktoren ab. Im Allgemeinen liegen intravenöse, intrazerebroventrikuläre und subkutane Dosen der Verbindungen dieser Erfindung für einen Patienten im Bereich von etwa 0,0001 bis etwa 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag, bevorzugt von etwa 0,001 bis etwa 10 mg pro Kilogramm und noch stärker bevorzugt von etwa 0,01 bis etwa 1 mg pro Kilogramm.
  • Falls gewünscht, kann die wirksame tägliche Dosis des Wirkstoffs als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Subdosen getrennt in geeigneten Zeitabständen über den ganzen Tag, gegebenenfalls in Einheitsdosierungsformen, verabreicht werden.
  • Der Begriff ”Behandlung” soll auch die Prophylaxe, Therapie und Heilung umfassen.
  • Der Patient, der die Behandlung erhält, ist ein Tier, das sie benötigt, einschließlich Primaten, im Besonderen Menschen, und andere Tiere wie Pferde, Rinder, Schweine und Schafe, und Gefügel und Haustiere im Allgemeinen.
  • Die Verbindung der Erfindung kann als solche oder in Gemischen mit pharmazeutisch verträglichen und/oder sterilen Trägern verabreicht werden und kann auch in Verbindung mit anderen antimikrobiellen Mitteln wie Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglycosiden und Glycopeptiden verabreicht werden. Eine gemeinsame Therapie schließt somit die aufeinanderfolgende, gleichzeitige und getrennte Verabreichung des Wirkstoff auf eine Art und Weise ein, dass die therapeutischen Wirkungen des zuerst verabreichten Wirkstoffs nicht ganz verschwunden sind, wenn der nachfolgende Wirkstoff verabreicht wird.
  • V. Arzneimittel
  • Obwohl es möglich ist, eine Verbindung der vorliegenden Erfindung allein zu verabreichen, wird die Verbindung bevorzugt als Arzneimittelformulierung (Zusammensetzung) verabreicht. Die erfindungsgemäßen Hedgehog-Agonisten können für die Verabreichung auf einem beliebigen geeigneten Weg zur Verwendung in der Human- oder Tiermedizin formuliert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die in der Arzneimittelzubereitung enthaltene Verbindung selbst wirksam sein oder kann z. B. ein Prodrug sein, das in einem physiologischen Umfeld in einen Wirkstoff umgewandelt werden kann.
  • Somit stellt eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Verbindungen, die zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern (Zusätzen) und/oder Verdünnungsmitteln formuliert werden, bereit. Wie nachstehend ausführlich beschrieben, können die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung für die Verabreichung in fester oder flüssiger Form speziell formuliert werden, einschließlich der, die den Folgenden angepasst wurden: (1) orale Verabreichung, zum Beispiel Arzneitränke (wässrige oder nicht-wässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, Boli, Pulver, Granulatkörner und Pasten zum Auftragen auf die Zunge; (2) parenterale Verabreichung, zum Beispiel durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion als zum Beispiel eine sterile Lösung oder Suspension; (3) topische Anwendung, zum Beispiel als Creme, Salbe oder Spray, die/das auf die Haut aufgetragen wird; oder (4) intravaginal oder intrarektal, zum Beispiel als ein Pessar, eine Creme oder ein Schaum. In bestimmten Ausführungsformen können jedoch die vorliegenden Verbindungen einfach in sterilem Wasser gelöst oder suspendiert werden. In bestimmten Ausführungsformen ist die Arzneimittelzubereitung nicht-pyrogen, d. h. sie erhöht die Körpertemperatur eines Patienten nicht.
  • Der Ausdruck ”therapeutisch wirksame Menge”, wie hier verwendet, bedeutet die Menge einer Verbindung, eines Materials oder einer Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, die eine gewünschte therapeutische Wirkung in mindestens einer Subpopulation von Zellen in einem Tier erzeugt und dadurch mit einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis, das auf eine beliebige medizinische Behandlung anwendbar ist, die biologischen Folgen dieses Pfads in den behandelten Zellen blockiert.
  • Der Ausdruck ”pharmazeutisch verträglich” wird hier verwendet, um die Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen zu bezeichnen, die innerhalb des Umfangs einer vernünftigen medizinischen Beurteilung zur Verwendung im Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne eine übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktion oder ein anderes Problem oder eine andere Komplikation entsprechend einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis geeignet sind.
  • Der Ausdruck ”pharmazeutisch verträglicher Träger”, wie hier verwendet, bedeutet ein/e/en pharmazeutisch verträgliche/s/n Material, Zusammensetzung oder Träger wie einen flüssigen oder festen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, einen Exzipienten oder ein Einkapselungsmaterial, der/das an der Übertragung oder dem Transport der vorliegenden Agonisten von einem Organ oder einem Teil des Körpers zu einem anderen Organ oder Teil des Körpers beteiligt ist. Jeder Träger muss in der Hinsicht „verträglich” sein, als er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Patienten nicht schädlich ist. Einige Beispiele von Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, schließen ein: (1) Zucker wie Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken wie Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Cellulose und ihre Derivate wie Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; (4) pulverisierten Tragant; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Talk; (8) Exzipienten wie Kakaobutter und Suppositoriumswachse; (9) Öle wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Safloröl, Sesamöl, Olivenöl, Maiskeimöl und Sojabohnenöl; (10) Glykole wie Propylenglykol; (11) Polyole wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglykol; (12) Ester wie Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffersubstanzen wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Kochsalzlösung; (18) Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) Phosphatpufferlösungen und (21) andere nicht-toxische kompatible Substanzen, die in Arzneimittelformulierungen verwendet werden.
  • Wie vorstehend aufgezeigt, können bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Hedgehog-Agonisten eine basische funktionelle Gruppe wie Amino oder Alkylamino enthalten, und können somit pharmazeutisch verträgliche Salze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren bilden. Der Begriff ”pharmazeutisch verträgliche Salze” bezieht sich in dieser Hinsicht auf die verhältnismäßig nicht-toxischen, anorganischen und organischen Säureadditionssalze von Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Diese Salze können während der Endisolierung und Reinigung der Verbindungen der Erfindung oder, indem eine gereinigte Verbindung der Erfindung in Form ihrer freien Base mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure getrennt umgesetzt wird und das so gebildete Salz isoliert wird, in situ hergestellt werden. Repräsentative Salze schließen die Hydrobromid-, Hydrochlorid-, Sulfat-, Hydrogensulfat-, Phosphat-, Nitrat-, Acetat-, Valerat-, Oleat-, Palmitat-, Stearat-, Laurat-, Benzoat-, Lactat-, Phosphat-, Tosylat-, Citrat-, Maleat-, Fumarat-, Succinat-, Tartrat-, Naphthylat-, Mesylat-, Glucoheptanoat-, Lactobionat- und Laurylsulfonatsalze und dergleichen ein. (Siehe zum Beispiel Berge et al. (1977) ”Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66: 1–19).
  • Die pharmazeutisch verträglichen Salze der vorliegenden Verbindungen schließen die herkömmlichen nicht-toxischen Salze oder quartären Ammoniumsalze der Verbindungen, z. B. aus nicht-toxischen organischen oder anorganischen Säuren, ein. Diese herkömmlichen nichttoxischen Salze schließen zum Beispiel die von anorganischen Säuren wie Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Sulfamin-, Phosphor-, Salpetersäure und dergleichen, abgeleiteten; und die aus organischen Säuren wie Essig-, Propion-, Bernstein-, Glykol-, Stearin-, Milch-, Äpfel-, Wein-, Citronen-, Ascorbin-, Palmitin-, Malein-, Hydroxymalein-, Phenylessig-, Glutamin-, Benzoe-, Salicyl-, Sulfanil-, 2-Acetoxybenzoe-, Fumar-, Toluolsulfon-, Methansulfon-, Ethan-, Disulfon-, Oxal-, Isothionsäure und dergleichen hergestellten Salze ein.
  • In anderen Fällen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere saure funktionelle Gruppen enthalten und können somit pharmazeutisch verträgliche Salze mit pharmazeutisch verträglichen Basen bilden. Der Begriff ”pharmazeutisch verträgliche Salze” bezieht sich in diesen Fällen auf die verhältnismäßig nicht-toxischen, anorganischen und organischen Basenadditionssalze von Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Diese Salze können während der Endisolierung und Reinigung der Verbindungen der Erfindung oder indem die gereinigte Verbindung in Form ihrer freien Säure mit einer geeigneten Base wie dem Hydroxid, Carbonat oder Hydrogencarbonat eines pharmazeutisch verträglichen Metallkations mit Ammoniak oder mit einem pharmazeutisch verträglichen organischen, primären, sekundären oder tertiären Amin getrennt umgesetzt wird, entsprechend in situ hergestellt werden. Repräsentative Alkali- oder Erdalkalimetallsalze schließen die Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Aluminiumsalze und dergleichen ein. Repräsentative organische Amine, die zur Bildung von Basenadditionssalzen verwendbar sind, schließen Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergleichen ein. (Siehe zum Beispiel Berge et al., supra).
  • Die Netzmittel, Emulgatoren und Gleitmittel wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat sowie Farbmittel, Abgabemittel, Überzugsmittel, Süßungsmittel, Geschmacksstoffe und Parfümierungsmittel, Konservierungsmittel und Antioxidationsmittel können ebenfalls in den Zusammensetzungen vorhanden sein.
  • Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Antioxidationsmitteln schließen ein: (1) wasserlösliche Antioxidationsmittel wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumhydrogensulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfat und dergleichen; (2) öllösliche Antioxidationsmittel wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, α-Tocopherol und dergleichen; und (3) Metallchelatbildner wie Citronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbit, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
  • Formulierungen der vorliegenden Erfindung schließen die zur oralen, nasalen, topischen (einschließlich bukkalen und sublingualen), rektalen, vaginalen und/oder parenteralen Verabreichung geeigneten ein. Die Formulierungen können geeigneterweise in einer Einheitsdosierungsform dargereicht werden und können durch beliebige Verfahren, die in dem Fachgebiet der Pharmazie allgemein bekannt sind, hergestellt werden. Die Menge des Wirkstoffs, die mit einem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine einzeldosierte Arzneiform herzustellen, variiert abhängig von dem behandelten Wirt und der besonderen Verabreichungsart. Die Menge des Wirkstoffs, die mit einem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine einzeldosierte Arzneiform herzustellen, ist im Allgemeinen die Menge der Verbindung, die eine therapeutische Wirkung erzeugt. Im Allgemeinen liegt diese Menge, bezogen auf 100%, im Bereich von etwa 1% bis etwa 99% des Wirkstoffs, bevorzugt von etwa 5% bis etwa 70% und am meisten bevorzugt von etwa 10% bis etwa 30%.
  • Herstellungsverfahren dieser Formulierungen oder Zusammensetzungen schließen den Schritt des Vereinigens einer Verbindung der vorliegenden Erfindung mit dem Träger und gegebenenfalls einem oder mehreren Hilfsbestandteilen ein. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden gleichmäßig und gründlich vereinigt wird und dann, wenn nötig, das Produkt geformt wird.
  • Formulierungen der Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können in Form von Kapseln, Cachets, Pillen, Tabletten, Pastillen (unter Verwendung einer schmackhaften Basis, in der Regel Saccharose und Gummiarabicum oder Tragant), Pulvern, Granulatkörnern oder als eine Lösung oder eine Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit oder als eine Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsion oder als ein Elixier oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Basis wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummiarabicum) und/oder als Mundwasser und dergleichen vorliegen, die jeweils eine vorher festgelegte Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff enthalten. Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch als Bolus, Electuarium oder Paste verabreicht werden.
  • In festen Dosierungsformen der Erfindung zur oralen Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granulatkörner und dergleichen) wird der Wirkstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder einem beliebigen der Folgenden gemischt: (1) Füllstoffe oder Streckmittel wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und/oder Kieselsäure; (2) Bindemittel wie zum Beispiel Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Gummiarabicum; (3) Feuchthaltemittel wie Glycerin; (4) Sprengmittel wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte Silikate und Natriumcarbonat; (5) Lösungsverzögerer wie Paraffin; (6) Absorptionsbeschleuniger wie quartäre Ammoniumverbindungen; (7) Netzmittel, wie zum Beispiel Ethylalkohol und Glycerinmonostearat; (8) Absorbtionsmittel wie Kaolin und Bentonitton; (9) Gleitmittel wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat und Gemische davon; und (10) Farbmittel. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Arzneimittel auch Puffersubstanzen umfassen. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können ebenfalls als Füllstoffe in gefüllten Weich- und Hartgelatinekapseln unter Verwendung solcher Exzipienten wie Lactose oder Milchzucker sowie von Polyethylenglykolen mit hohem Molekulargewicht und dergleichen verwendet werden.
  • Eine Tablette kann durch Pressen oder Formpressen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsstoffen, hergestellt werden. Gepresste Tabletten können unter Verwendung eines Bindemittels (zum Beispiel Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose), Gleitmittels, inerten Verdünnungsmittels, Konservierungsmittels, Sprengmittels (zum Beispiel Natriumstärkeglykolat oder vernetzter Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktiven Mittels oder Dispergiermittels hergestellt werden. Formgepresste Tabletten können durch Formpressen der pulverisierten Verbindung, die mit einem inerten, flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet wurde, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden.
  • Die Tabletten und anderen festen Dosierungsformen der Arzneimittel der vorliegenden Erfindung wie Dragees, Kapseln, Pillen und Granulatkörner können gegebenenfalls eingekerbt oder mit Überzügen und Hüllen wie magensaftresistenten Überzügen und anderen Überzügen, die in dem Fachgebiet pharmazeutischer Formulierungen allgemein bekannt sind, hergestellt werden. Sie können auch so formuliert werden, dass eine langsame oder gesteuerte Freisetzung des Wirkstoffs darin bereitgestellt wird, wobei zum Beispiel Hydroxypropylmethylcellulose in unterschiedlichen Anteilen, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen, andere Polymermatrizen, Liposomen und/oder Mikrokügelchen verwendet werden. Sie können zum Beispiel durch Filtration durch ein Bakterienrückhaltefilter oder durch Einbringen von Sterilisierungsmitteln in Form steriler, fester Zusammensetzungen, die in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen, injizierbaren Medium gelöst werden können, direkt vor der Verwendung sterilisiert werden. Diese Zusammensetzungen können auch gegebenenfalls Trübungsmittel enthalten und können auch eine Zusammensetzung aufweisen, so dass sie den/die Wirkstoff/e nur oder vorzugsweise in einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltrakts, gegebenenfalls auf eine verzögerte Art und Weise, freisetzen. Beispiele von Einbettungszusammensetzungen, die verwendet werden können, schließen polymere Substanzen und Wachse ein. Der Wirkstoff kann auch, falls geeignet, in mikroverkapselter Form mit einem oder mehreren der vorstehend beschriebenen Exzipienten vorliegen.
  • Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung der Verbindungen der Erfindung schließen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere ein. Zusätzlich zum Wirkstoff können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, die gewöhnlich in dem Fachgebiet verwendet werden, wie zum Beispiel Wasser oder andere Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzolat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Öle (im Besonderen Baumwollsamen-, Erdnuss-, Maiskeim-, Keim-, Oliven-, Rizinus- und Sesamöl), Glycerin, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitan und Gemische davon, enthalten.
  • Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen Hilfsstoffe wie Netzmittel, Emulgier- und Suspendiermittel, Süßungsmittel, Geschmacksstoffe, Farbmittel, Parfümierungsmittel und Konservierungsmittel einschließen.
  • Suspensionen können zusätzlich zu den Wirkstoffen Suspendiermittel wie zum Beispiel ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant und Gemische davon enthalten.
  • Formulierungen der Arzneimittel der Erfindung zur rektalen oder vaginalen Verabreichung können als Suppositorium dargereicht werden, das durch Mischen einer oder mehrerer Verbindungen der Erfindung mit einem oder mehreren nicht-reizenden Exzipienten oder Trägern, umfassend Kakaobutter, Polyethylenglykol, ein Suppositoriumswachs oder ein Salicylat, hergestellt werden kann und das bei Raumtemperatur fest ist, jedoch bei Körpertemperatur flüssig ist und daher im Rektum oder in der Vaginalhöhle schmilzt und den aktiven Hedgehog-Agonisten freisetzt.
  • Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die zur vaginalen Verabreichung geeignet sind, schließen auch Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen ein, die solche Träger enthalten, von denen in dem Fachgebiet bekannt ist, dass sie geeignet sind.
  • Dosierungsformen zur topischen oder transdermalen Verabreichung einer Verbindung dieser Erfindung schließen Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen, Pflaster und Inhalatoren ein. Der Wirkstoff kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und mit beliebigen Konservierungsmitteln, Puffer oder Treibmitteln, die erforderlich sein können, gemischt werden.
  • Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu einem Wirkstoff dieser Erfindung Exzipienten wie tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Gemische davon enthalten.
  • Pulver und Sprays können zu einer Verbindung dieser Erfindung Exzipienten wie Lactose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikate und Polyamidpulver oder Gemische dieser Substanzen enthalten. Sprays können ferner handelsübliche Treibmittel wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige, unsubstituierte Kohlenwasserstoffe wie Butan und Propan, enthalten.
  • Transdermale Pflaster weisen den zusätzlichen Vorteil der Bereitstellung einer gesteuerten Abgabe einer Verbindung der vorliegenden Erfindung an den Körper auf. Solche Dosierungsformen können durch Lösen oder Dispergieren der Hedgehog-Agonisten in dem geeigneten Medium hergestellt werden. Absorptionsverstärker können ebenfalls verwendet werden, um den Fluss der Hedgehog-Agonisten über die Haut zu erhöhen. Die Geschwindigkeit eines solchen Flusses kann gesteuert werden, indem entweder eine geschwindigkeitssteuernde Membran bereitgestellt wird oder die Verbindung in einer Polymermatrix oder einem Gel dispergiert wird.
  • Es ist ebenfalls beabsichtigt, dass ophthalmische Formulierungen, Augensalben, -Pulver, -Lösungen und dergleichen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegen.
  • Arzneimittel dieser Erfindung, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen eine oder mehrere Verbindungen der Erfindung in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch verträglichen, sterilen, isotonischen, wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen oder sterilen Pulvern, die unmittelbar vor der Verwendung in sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen, die Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostatika, gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen, oder Suspendier- oder Verdickungsmittel enthalten können, rekonstituiert werden können.
  • Beispiele geeigneter wässriger und nicht-wässriger Träger, die in den Arzneimitteln der Erfindung verwendet werden können, schließen Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Gemische davon, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat ein. Eine geeignete Fließfähigkeit kann zum Beispiel durch die Verwendung von Überzugsmaterialien wie Lecithin durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Fall von Dispersionen und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden.
  • Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel enthalten. Eine Vorbeugung hinsichtlich der Wirkung von Mikroorganismen kann durch den Einschluss verschiedener antibakterieller und antifungaler Mittel, zum Beispiel Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen, sichergestellt werden. Es kann auch wünschenswert sein, isotonische Mittel wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen in den Zusammensetzungen einzuschließen. Ferner kann eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form durch den Einschluss von Mitteln, die die Absorption verzögern, wie Aluminiummonostearat und Gelatine, zustande gebracht werden.
  • Um die Wirkung eines Arzneistoffs zu verlängern, ist es in einigen Fällen wünschenswert, die Absorption des Arzneistoffs aus einer subkutanen oder intramuskulären Injektion zu verlangsamen. Dies kann durch die Verwendung einer flüssigen Suspension von einem kristallinen oder amorphen Material mit einer geringen Wasserlöslichkeit erreicht werden. Die Absorptionsgeschwindigkeit des Arzneistoffs hängt dann von seiner Auflösungsgeschwindigkeit ab, die wiederum von der Kristallgröße und der kristallinen Form abhängen kann. In einer anderen Ausführungsform wird die verzögerte Absorption eines parenteral verabreichten Arzneistoffs durch Lösen oder Suspendieren des Arzneistoffs in einem Ölträger erreicht.
  • Injizierbare Depotformen können durch Bildung mikroverkapselter Matrizen der vorliegenden Verbindungen in biologisch abbaubaren Polymeren wie Polylactid-Polyglykolid, hergestellt werden. Abhängig von dem Verhältnis des Arzneistoffs zum Polymer und der Art des verwendeten besonderen Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneistofffreisetzung gesteuert werden. Beispiele anderer biologisch abbaubarer Polymere schließen Poly(orthoester) und Poly(anhydride) ein. Injizierbare Depotformulierungen werden auch durch Einschließen des Arzneistoffs in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit dem Körpergewebe kompatibel sind, hergestellt.
  • Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Arzneimittel an Menschen und Tiere verabreicht werden, können sie als solche oder als Arzneimittel, die zum Beispiel 0,1 bis 99,5% (stärker bevorzugt 0,5 bis 90%) des Wirkstoffs in Kombination mit einem pharmazeutisch veträglichen Träger enthalten, verabreicht werden. Die Zugabe des Wirkstoffs der Erfindung zu Tierfutter erfolgt bevorzugt durch die Herstellung einer geeigneten Futtervormischung, die den Wirkstoff in einer wirksamen Menge enthält, und das Einbringen der Vormischung in die vollständige Ration.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein intermediäres Konzentrat oder ein Futterzusatz, das/der den Wirkstoff enthält, in das Futter gemischt werden. Die Art und Weise, auf die solche Futtervormischungen und vollständigen Rationen hergestellt und verabreicht werden können, ist in Nachschlagewerken (wie ”Applied Animal Nutrition”, W. H. Freedman und CO., San Francisco, U. S. A., 1969 oder ”Livestock Feeds and Feeding”, O- und B-Bücher, Corvallis, Ore., U. S. A., 1977) beschrieben.
  • VI. Syntheseschemata und Identifizierung aktiver Agonisten
  • Die vorliegenden Inhibitoren und Vertreter davon können unter Verwendung der Kreuzkupplungsverfahren von Suzuki, Stille und dergleichen leicht hergestellt werden. Diese Kupplungsreaktionen werden unter relativ milden Bedingungen durchgeführt und tolerieren einen breiten Bereich an ”Spektator”funktionalität.
  • a. Kombinatorische Bibliotheken
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, besonders Bibliotheken von Varianten mit verschiedenen repräsentativen Klassen von Substituenten, sind durch die kombinatorische Chemie und andere parallele Syntheseschemata zugänglich (siehe zum Beispiel PCT WO 94/08051 ). Das Ergebnis ist, dass große Bibliotheken verwandter Verbindungen, z. B. eine vielseitige Bibliothek der vorstehend gezeigten Verbindungen, in Tests mit hohem Durchsatz schnell durchmustert werden können, um sowohl mögliche Leitverbindungen von Hedgehog-Agonisten zu identifizieren als auch die Spezifität, Toxizität und/oder das zytotoxisch-kinetische Profil einer Leitverbindung zu verbessern. Tests der biologischen Aktivität von Ptc-, Hedgehog- oder Smoothened können beispielsweise verwendet werden, um eine Bibliothek der vorliegenden Verbindungen auf die mit einer Antagonistenwirksamkeit gegenüber Ptc oder einer Agonistenwirksamkeit gegenüber Hedgehog oder Smoothened zu durchmustern.
  • Nur zur Veranschaulichung, eine kombinatorische Bibliothek für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Gemisch aus chemisch verwandten Verbindungen, die zusammen auf eine gewünschte Eigenschaft durchmustert werden können. Die Herstellung vieler verwandter Verbindungen in einer einzigen Reaktion verringert und vereinfacht die Zahl der Durchmusterungsverfahren, die durchgeführt werden müssen, beträchtlich. Eine Durchmusterung auf die geeigneten physischen Eigenschaften kann durch herkömmliche Verfahren durchgeführt werden.
  • Die Mannigfaltigkeit in der Bibliothek kann in einer Vielzahl von unterschiedlichen Graden erzeugt werden. Die in den kombinatorischen Reaktionen verwendeten Arylsubstratreste können sich beispielsweise bezüglich der Arylkerneinheit unterscheiden, z. B. eine Vielseitigkeit bezüglich der Ringstruktur aufweisen, und/oder können hinsichtlich der anderen Substituenten variiert werden.
  • Eine Vielzahl von Verfahren ist in dem Fachgebiet zur Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken von kleinen organischen Molekülen wie den vorliegenden Hedgehog-Agonisten verfügbar. Siehe zum Beispiel Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14: 83; die US-Patente 5,359,115 und 5,362,899 von Affymax; das US-Patent 5,288,514 von Ellman; die PCT-Veröffentlichung WO 94/08051 von Still et al.; die US-Patente 5,736,412 und 5,712,171 von ArQule; Chen et al. (1994) JACS 116: 2661; Kerr et al. (1993) JACS 115: 252; die PCT-Veröffentlichungen WO 92/10092 , WO 93/09668 und WO 91/07087 ; und die PCT-Veröffentlichung WO 93/20242 von Lemer et al. Folglich kann eine Vielzahl von Bibliotheken in der Größenordnung von etwa 100 bis 1000000 oder mehr Diversomeren der vorliegenden Hedgehog-Agonisten hergestellt und auf eine besondere Aktivität oder Eigenschaft durchmustert werden.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform kann eine Bibliothek möglicher Diversomere von Hedgehog-Agonisten unter Verwendung eines Schemas, das den in der PCT-Veröffentlichung WO 94/08051 von Still et al. beschriebenen Verfahren angepasst wurde, hergestellt werden, indem sie z. B. durch eine hydrolysierbare oder photolysierbare Gruppe, die sich gegebenenfalls an einer der Positionen der möglichen Agonisten oder eines Substituenten einer Synthesezwischenverbindung befindet, an ein Polymerkügelchen gebunden werden. Gemäß dem Verfahren von Still et al. wird die Bibliothek auf einem Satz von Kügelchen hergestellt, wobei jedes Kügelchen einen Satz von Markierungen einschließt, die das besondere Diversomer auf diesem Kügelchen identifizieren. Die Bibliothek auf den Kügelchen kann dann mit auf Hedgehog antwortenden Zellen ”plattiert” werden. Die Diversomere können z. B. durch Hydrolyse von dem Kügelchen freigesetzt werden.
  • Die Strukturen der in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Verbindungen eignen sich selbst leicht für eine effiziente Synthese. Die Art der Strukturen der vorliegenden Verbindungen, wie sie vorstehend allgemein aufgezeigt wurden, ermöglicht die schnelle kombinatorische Zusammensetzung solcher Verbindungen. Wie in dem Schema nachstehend aufgezeigt, kann zum Beispiel ein aktivierter Arylrest wie ein Aryltriflat oder -bromid, der an ein Kügelchen oder einen anderen festen Träger gebunden ist, durch die Durchführung einer Stille- oder Suzuki-Kupplung mit einem Arylstannan oder einer Arylboronsäure an einen anderen Arylrest gebunden werden. Wenn der zweite Arylrest mit einem Aldehyd funktionalisiert ist, kann durch eine reduktive Aminierung ein Aminsubstituent addiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann der zweite Arylrest mit einer Abgangsgruppe wie einem Triflat, Tosylat oder Halogenid funktionalisiert werden, die durch ein Amin ersetzt werden kann. Oder der zweite Arylrest kann mit einem Aminrest funktionalisiert werden, der mit einem Amin, z. B. CyKNH2, einer reduktiven Aminierung unterzogen werden kann. Andere mögliche Kupplungsverfahren schließen Übergangsmetall-vermittelte Aminarylierungsreaktionen ein. Das so erhaltene sekundäre Amin kann dann durch eine Acylierung, Alkylierung oder Arylierung weiter funktionalisiert werden, wobei ein tertiäres Amin oder Amid erzeugt wird, das dann von dem Harz oder Träger abgespalten werden kann. Diese Reaktionen sind im Allgemeinen ziemlich mild und wurden in Schemata der kombinatorischen Festphasensynthese erfolgreich angewendet. Ferner ermöglicht der breite Bereich an Substraten und Kupplungspartnern, die für diese Reaktionen geeignet und verfügbar sind, die schnelle Zusammensetzung großer, mannigfaltiger Bibliotheken von Verbindungen zur Untersuchung in Tests, wie hier dargestellt. Für bestimmte Schemata und für bestimmte Substitutionen an den verschiedenen Substituenten der vorliegenden Verbindungen erkennt ein Fachmann die Notwendigkeit für eine Maskierung bestimmter funktioneller Gruppen mit einer geeigneten Schutzgruppe. Solche Verfahren sind in dem Fachgebiet allgemein bekannt und sind auf die Schemata der kombinatorischen Synthese leicht anwendbar.
  • Figure 00860001
  • Viele Änderungen an den vorstehenden und verwandten Pfaden ermöglichen die Synthese sehr mannigfaltiger Bibliotheken von Verbindungen, die als Agonisten der Hedgehog-Funktion untersucht werden können.
  • b. Durchmusterungstests
  • Es gibt eine Vielzahl von Tests, die zur Bestimmung der Fähigkeit einer Verbindung, die Ptc-Funktion antagonistisch zu beeinflussen oder die Smoothened- oder Hedgehog-Funktion agonistisch zu beeinflussen, verfügbar sind, von denen viele in Formaten mit einem hohen Durchsatz erstellt werden können. In vielen Arzneistoffdurchmusterungsprogrammen, die Bibliotheken von Verbindungen und natürlichen Extrakten untersuchen, sind Tests mit einem hohen Durchsatz wünschenswert, um die Zahl von Verbindungen, die während einer bestimmten Zeitdauer untersucht werden, zu maximieren. Somit können Bibliotheken von synthetischen und natürlichen Produkten für andere Verbindungen, die Hedgehog-Agonisten sind, als Muster dienen.
  • Zusätzlich zu zellfreien Tests können Testverbindungen auch in Tests auf Zellbasis untersucht werden. In einer Ausführungsform können Zellen, die auf die Zugabe von Hedgehog-Protein antworten, mit einem Testmittel von Interesse in Kontakt gebracht werden, wobei der Test z. B. die Förderung der Proliferation der Zelle in Gegenwart des Testmittels bewertet.
  • Mehrere Genprodukte waren an Patched-vermittelter Signaltransduktion beteiligt, einschließlich Patched, Transkriptionsfaktoren der Familie Cubitus interruptus (Ci), der Serin/Threonin-Kinase Fused (Fu) und der Genprodukte von Costal-2, Smoothened und Suppressor of Fused.
  • Die Induktion von Zellen durch Hedgehog-Proteine bringt eine Kaskade in Gang, umfassend die Aktivierung und Hemmung von Effektoren stromabwärts, dessen letzte Konsequenz in einigen Fällen eine nachweisbare Änderung der Transkription oder Translation eines Gens ist. Mögliche Transkriptionsziele des Hedgehog-vermittelten Signals sind das Patched-Gen (Hidalgo und Ingham, 1990 Development 110, 291–301; Marigo et al., 1996) und die Wirbeltierhomologen des Gens Cubitus interruptus von Drosophila und die Gli-Gene (Hui et al. (1994) Dev Biol 162: 402–413). Von der Patched-Genexpression wurde gezeigt, dass sie in Zellen der Extremitätenknospe und der Neuralplatte, die auf Shh antworten, induziert wird (Marigo et al. (1996) PNAS 93: 9346–51; Marigo et al. (1996) Development 122: 1225–1233). Die Gli-Gene codieren vermeintliche Transkriptionsfaktoren, die DNA-bindende Zink-Finger-Domänen aufweisen (Orenic et al. (1990) Genes & Dev 4: 1053–1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10: 634–642). Von der Transkription des Gli-Gens wurde berichtet, dass sie als Antwort auf Hedgehog in Extremitätenknospen hochreguliert wird, während die Transkription des Gli3-Gens als Antwort auf eine Hedgehog-Induktion herunterreguliert wird (Marigo et al. (1996) Development 122: 1225–1233). Durch die Auswahl von transkriptionsregulierenden Sequenzen aus solchen Zielgenen, z. B. aus Patched- oder Gli-Genen, die für die Hoch- oder Herunterregulierung dieser Gene als Antwort auf ein Hedgehog-Signal verantwortlich sind, und die funktionelle Verknüpfung solcher Promotoren mit einem Reportergen kann ein Test auf Transkriptionsbasis abgeleitet werden, der auf die Fähigkeit einer speziellen Testverbindung, Hedgehog-vermittelte Signalpfade zu modifizieren, empfindlich ist. Die Expression des Reportergens stellt somit ein wertvolles Durchmusterungswerkzeug für die Entwicklung von Verbindungen, die als Agonisten von Hedgehog wirken, bereit.
  • Die Tests dieser Erfindung auf Reportergenbasis messen die Endstufe der vorstehend beschriebenen Kaskade von Ereignissen, z. B. eine Transkriptionsmodulation. Folglich wird bei der Durchführung einer Ausführungsform des Tests ein Reportergenkonstrukt in die reagierende Zelle eingeführt, um ein von der Aktivierung des Hedgehog-Pfads oder der Stimulierung durch Shh selbst abhängiges Nachweissignal zu erzeugen. Die Transkriptionsstärke des Reportergens kann unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens, das Fachleuten als geeignet bekannt ist, gemessen werden. Die mRNA-Expression des Reportergens kann zum Beispiel unter Verwendung von RNAse-Schutz oder PCR auf RNA-Basis nachgewiesen werden oder das Proteinprodukt des Reportergens kann durch eine charakteristische Färbung oder eine intrinsische biologische Aktivität identifiziert werden. Die Expressionsstärke des Reportergens wird dann mit der Expressionsstärke entweder in derselben Zelle in Abwesenheit der Testverbindung verglichen oder sie kann mit der Transkriptionsstärke in einer im Wesentlichen identischen Zelle, der das Zielrezeptorprotein fehlt, verglichen werden. Eine beliebige statistische oder sonstige wesentliche Zunahme der Transkriptionsstärke zeigt, dass die Testverbindung auf eine bestimmte Art und Weise das normale Ptc-Signal antagonistisch beeinflusst hat (oder das Hedgehog- oder Smoothened-Signal agonistisch beeinflusst hat), z. B. dass die Testverbindung ein möglicher Hedgehog-Agonist ist.
  • Beispielhafte Darstellung
  • Da die Erfindung jetzt allgemein beschrieben ist, wird sie unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die nur zum Zweck der Veranschaulichung bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind und die Erfindung nicht einschränken sollen, leichter verständlich.
  • In dem nachstehenden experimentellen Abschnitt wird der Begriff 'Hh-Protein' verwendet, um Octyl-Shh-N, eine lipophile Form eines bakteriell abgeleiteten Fragments von menschlichem Sonic-Hedgehog-Protein (Aminosäuren 24 bis 198, Shh-N), zu bezeichnen. Genau gesagt wurde Shh-N in vitro über sein aminoterminales Cystein kovalent an eine Octylmaleinimidgruppe gebunden. Diese modifizierte Form zeigt, wie andere vor kurzem beschriebene (Pepinsky et al., J Biol. Chem. 1998, 273, 14037–45), in mehreren Tests des Hedgehog-Signalisierung auf Zellbasis eine höhere spezifische Wirksamkeit als das entsprechende nicht-modifizierte Fragment.
  • Durchmusterung der Verbindungen
  • Zur Messung der Hedgehog-Agonistenaktivität von Verbindungen wurden [10T1/2(sl2)]-Zellen, die das auf Hedgehog antwortende Gli-Luc-Reporterkonstrukt enthielten, verwendet. Auf jeder MTP (Mikrotiterplatte; Platte mit 96 Vertiefungen) wurden 10000 bis 20000 Zellen pro Vertiefung in Vollmedium (10% FBS) plattiert. Nach etwa 24 bis 48 h wurden die Platten auf Medien mit Niedrigserum (= 0,5% FBS) umgestellt. Anschließend wurde eine Testverbindung mit 1 bis 5 μM in Gegenwart oder Abwesenheit von Octyl-Hedgehog (siehe nachstehend) zugegeben. Nach weiteren 24 h wurden die Medien von den MTP's verworfen und durch ein Luciferase-Testgemisch, das einen Lysepuffer mit einem Luciferasesubstrat enthielt, ersetzt. Die Platten wurden bei RT etwa 15 bis 30 min inkubiert und in einem Luminometer abgelesen.
  • Durchmusterung A
  • Die Platten wurden 48 h inkubiert, bevor sie auf Niedrigserum umgestellt wurden. Die Verbindungen wurden mit 1 bis 2 μM in Gegenwart von Hh-Protein (0,01 μg/ml; EC30 = etwa 30% der maximal induzierten Aktivität) durchmustert.
  • Durchmusterung B
  • Die Platten wurden 24 h inkubiert, bevor sie auf Niedrigserum umgestellt wurden. Die Verbindungen wurden mit 5 μM ohne Zugabe von Hh-Protein durchmustert.
  • Gegendurchmusterung der Verbindungen (SV-Luc)
  • Für die Gegendurchmusterung wurden [10T1/2(SV-Luc)]-Zellen verwendet, die eine SV40-Luciferaseexpressionskassette, die einen konstitutiven Grad an Luciferaseaktivität in den Zellen ermöglicht, enthielten. Dieser Test ermöglicht es, die Spezifität der in dem Gli-Luc-Test ausgewählten Verbindungen zu beurteilen, d. h. ob die Verbindungen nur spezifisch den Hedgehog-Signalpfad oder Reporterkonstrukte im Allgemeinen stimulieren. Das Plattieren und die Züchtung der Zellen sowie die Handhabung der Verbindungen wurden wie in dem Gli-Luc-Test durchgeführt. In diesem Test wurde kein Hh-Protein zugegeben, da das Reporterkonstrukt bereits konstitutiv aktiv ist.
  • Aus der Durchmusterung A wurden gemäß den 32 und 33 Treffer identifiziert. Die 1,4-Diaminocyclohexanuntereinheit der Verbindungen von 32, die diese Einheit einschließen, weist die beiden Aminosubstituenten in einer trans-Beziehung angeordnet auf, z. B. beide Substituenten äquatorial an der Cyclohexanuntereinheit. Diese Treffer wurden in der Durchmusterung B bestätigt. Die in den 34a und 34b gezeigten Daten umfassen im Wesentlichen die Zugabe der zwei Verbindungen in beiden Tests (Gli-Luc & SV-Luc).
  • Die Daten aus dem Gli-Luc-Test werden in Aktivität in Prozent umgewandelt, wobei eine volle Aktivität mit dem Hh-Protein als 100% festgelegt wird (35; Tabelle 1). Die Daten zeigen, dass die zwei Verbindungen sogar in Abwesenheit von Hh-Protein aus dem Gli-Luc- Reporterkonstrukt eine Aktivität wesentlich stimulieren (d. h. ein Hedgehog-Signal aktivieren) können; Konzentrationsbereich 0,1 bis 15 μM, EC50 = 2 μM, ECmax = 50 bis 70% der maximal induzierten Aktivität mit Hh-Protein. Ferner zeigen die Verbindungen eine eindrucksvollere Induktion in Gegenwart von Hedgehog (EC50 = 0,2 bis 0,3 μM, ECmax = 70 bis 90% der maximal induzierten Aktivität mit Hh-Protein), was eine Synergie zwischen den Verbindungen und dem Hh-Protein in Übereinstimmung mit den Verbindungen, die als Agonisten für den Hedgehog-Pfad dienen, anzeigt. Tabelle 1
    Verbindung EC50 (μM) Verbindung EC50 (μM)
    A A' < 10
    B < 10 B' < 10
    C < 1 C' < 10
    D < 0,1 D' < 10
    E < 10 E' < 10
    F < 10 F' < 10
    G < 10 G' < 10
    H < 1 H' > 10
    I > 10 I' < 1
    J < 1 J' < 1
    K < 1 K' < 10
    L < 0,05 L' < 0,05
    M < 1 M' < 10
    N < 1 N' < 1
    0 < 1 O' < 1
    P < 1 F < 1
    Q < 1 Q' < 1
    R < 1 R' < 0,05
    S < 1 S' < 0,1
    T < 10 T' < 0,5
    U < 10 U' < 1
    V < 0 V' < 1
    W < 10 W' < 10
    X < 10 X' < 10
    Y < 10 Y' < 10
    Z < 10 Z' < 10
    A'' < 10 B'' < 10
    C'' < 10 D'' < 10
    E'' < 10 F'' < 0,1
    G'' < 0,1 H'' < 0,1
    I'' < 0,5 J'' < 0,5
    K'' < 0,5 L'' < 1
    M'' < 1 N'' < 1
    O'' < 1 P'' < 10
    Q'' < 1 R'' < 1
    S'' < 10 T'' < 10
  • Die Daten aus dem SV-Luc-Test (35) zeigen, dass die zwei Verbindungen die Luciferase-Aktivität über den untersuchten Konzentrationsbereich (bis zu 15 μM) nicht beeinflussen, was darauf hinweist, dass die Verbindungen die Aktivität aus einem Reporterkonstrukt an sich nicht stimulieren, sondern wahrscheinlich für den Hedgehog-Pfad spezifisch sind. Die unbeeinflusste Aktivität weist auch darauf hin, dass die Verbindungen für die Zellen an sich nicht toxisch sind.
  • Hh-Agonist: Quantitative RT-PCR-Messung der Gli-Hochregulierung
  • Die Verbindungen der 32 und 33 wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Transkription von zwei gut untersuchten Zielen des Hedgehog-Pfads zu aktivieren: den Transkriptionsfaktor Gli1 und die vermeintliche Hedgehog-Rezeptorkomponente Ptc1. Wie in
  • 35 dargestellt, wurde festgestellt, dass bei einer Konzentration der Verbindung von 8 μM die Induktion von beiden Zielen für die p-Cyanophenylverbindung B ungefähr 60% und für die m-Nitrophenylverbindung A 40% von der betrug, die mit der optimalen Konzentration von Hh-Protein erzielt wurde.
  • Die Tests wurden wie folgt durchgeführt:
    Eine Platte mit 24 Vertiefungen wurde mit murinen C3H-10T1/2-Zellen mit ungefähr 200000 Zellen pro Vertiefung in Vollmedium (10% FBS) angeimpft. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt und durch ”Hunger”medium (0,5% FBS) ersetzt, das Verdünnungen der Verbindung oder des Hh-Proteins enthielt. Nach 16 bis 18 h wurde unter Verwendung von TriZol (Life Technologies, Inc.) die gesamte RNA hergestellt.
  • Aliquote Teile von 1 μg der gesamten RNA wurden verwendet, um Zufallshexamergeprimte cDNA mit der reversen Transkriptase M-MTV (Life Technologies, Inc.) herzustellen.
  • Zur Messung der relativen Konzentrationen an Gli1- und Ptc1-Iranskripten wurden TaqMan-Tests (PE Biosystems) mit einem Sequenznachweissystem ABI Prism 7700 durchgeführt. Als innere Kontrolle wurden die Konzentrationen von GAPDH-Transkripten gleichzeitig in jeder Reaktion gemessen. Die Daten wurden unter Verwendung eines Sequenzdetektors v1.6.3 (Perkin Elmer) analysiert.
  • Induktion der Proliferation von Vorläufern der Kleinhirnneuronen durch Agonisten des Hedgehog-Signals
  • Um die Wirksamkeit von Agonisten des Hedgehog-Signals zu untersuchen, wurde die Fähigkeit der Agonisten bestimmt, die Proliferation von Vorläufern der Kleinhirnneuronen zu stimulieren. Von Vorläufern von Kleinhirnkörnerneuronen ist bekannt, dass sie auf das Hh-Protein durch Proliferation antworten. Zur Untersuchung der Agonisten wurden Kleinhirnneuronen aus postnatalen (eine Woche) Rattenhirnen herausgeschnitten und in eine primäre Zellkultur gegeben. Die Behandlungsmittel wurden am ersten Tag der Züchtung (0 DIV) einmal zugegeben. Die Zellen wurden bis 2 DIV in der Kultur belassen, und dann wurde 3H-Thymidin 5 Stunden zugegeben; die Menge an Einbau dieses 3H-Thymidins durch die Zellen stellt ein Maß für den Proliferationsgrad der Zellen bereit. Die Zellen wurden dann lysiert, und der Einbau an 3H-Thymidin wurde bestimmt. Die positive Kontrolle war Hh-Protein mit einer Endkonzentration von 1,0 μg/ml. Hh-Protein allein rief eine ungefähr 20-fache Zunahme des 3H-Thymidin-Einbaus hervor, was mit der bekannten Fähigkeit von Shh, die Proliferation dieser Zellen zu stimulieren, übereinstimmt. Nicht durch Hh-Protein stimulierte Zellen, einschließlich mit Kontrollträger (DMSO) behandelter Zellen, wiesen sehr niedrige Proliferationsgrade auf. Es wurde jedoch festgestellt, dass die zwei untersuchten Hh-Agonisten A und B in 32 den 3H-Thymidineinbau in Abwesenheit einer Hh-Proteinbehandlung, wie in 36 dargestellt, wesentlich stimulierten. Bei 5,0 [μM rief die p-Cyanophenylverbindung B eine 10,2-fache Induktion des 3H-Thymidineinbaus hervor. 37 zeigt, dass der Agonist D den 3H-Thymidineinbau in Abwesenheit von Shh ebenfalls stark stimulierte. Bei 1,0, 0,3 oder 0,1 μM rief D eine 16-, 17- beziehungsweise 13-fache Induktion des 3H-Thymidineinbaus in die Zellen hervor. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Hedgehog-Agonisten bekannte biologische Antworten von Hedgehog in Zielzellen stimulieren können.
  • Nervenquetschtest
  • Männliche CD-1-Mäuse wurden mit Avertin, 240 mg/kg i. p., anästhesiert. Der Bereich auf der ventralen Seite des Mäusebeins um das Knie herum wurde rasiert und zur Haarentfernung mit 70%igem Ethanol gereinigt, gefolgt von Abtupfen mit Betadin. Die Haut über dem Oberschenkel wurde mit einer Pinzette hochgezogen, und eine kleine Schere wurde verwendet, um einen Schnitt von 1/4 Zoll in die Haut zu machen. Das Fett wurde entfernt, um den Oberschenkelnerv, die Oberschenkelarterie und Oberschenkelvene freizulegen. Mit den nach unten zeigenden Spitzen der gekrümmten Pinzette Nr. 7 wurde der Muskel genau unter der Oberschenkelarterie/-vene auseinander gespreizt, um den Ischiasnerv tief im Muskel freizulegen. Während eine Pinzette verwendet wurde, um den Muskel auseinander zu halten, wurde eine zweite dazu verwendet, den Nerv vorsichtig anzuheben. Es wurde darauf geachtet, die Muskelfasern nicht anzuheben. Die Pinzette wurde dreimal geöffnet und geschlossen, um den Nerv vom Muskel zu trennen. Der Nerv wurde mit der gekrümmten Pinzette über dem Muskel gehalten, und die Gefäßklemmen wurden auf den Nerv geklammert, um den Nerv in der Mitte der Gefäßklemmen zu halten. Die Gefäßklemmen wurden 10 Sekunden an Ort und Stelle gehalten. Auf diese Art und Weise wurden beide Ischiasnerven (und die Verzweigungen) ungefähr 1 cm über dem Knie gequetscht. Die Gefäßklemmen wurden geöffnet, und der Nerv fiel in den Muskel zurück. Die Spitze einer kleinen Pipette (P2) wurde verwendet, um eine kleine Menge eines histologischen Farbstoffs zur Gewebemarkierung auf den gequetschten Bereich aufzutragen. Eine Wundklammer wurde verwendet, um den Einschnitt zu schließen. Es wurde darauf geachtet, die Haut nicht an dem Muskel zu befestigen. Die Klammern wurden während des ganzen Experiments an ihrem Platz belassen.
  • Mit einer Gruppe von Mäusen wurde eine Kontrolloperation durchgeführt. Diese beinhaltete das Anheben des Nervs mit der Pinzette und das Zurückfallenlassen an seinen Platz ohne eine Quetschung. Diese Stelle kann ebenfalls mit dem histologischen Farbstoff markiert werden.
  • Die Behandlung mit dem Arzneistoff begann am Operationstag. Für das Shh-Protein wurde ein Fusionsprotein aus Shh und Immunoglobulin (wie in der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/164025 beschrieben, die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist) in einer Dosis von 1 mg/kg in einer PBS-Lösung verabreicht, wobei mit einer 28 Gauge, 1/2 cc-Insulinspritze Nr. 28, 1/2 cc eine subkutane Injektion in die Mitte des Rückens des Tieres verabreicht wurde und jeden zweiten Tag bis zum 12. bis 13. Tag wiederholt wurde. (Die Genesung war bis dahin beendet.) Zur Verabreichung des Agonisten wurde eine Lösung des Agonisten in 43% DMSO/PBS (38A und 39B) oder in 10% DMSO/Wasser (38B und 39D) durch eine Minipumpe (1 μl/Stunde) verabreicht. Die Verhaltenstests wurden am 4. postoperativen Tag begonnen und bis zum 12. oder 13. Tag fortgesetzt.
  • Verhaltensuntersuchung – Greiftest
  • Eine Maus wurde auf ein Metalldrahtgitter mit 8''×8'' (wie ein Reagenzglasständer) mit Öffnungen von 1 cm gesetzt, und das Gitter wurde mit einer konstanten Dauerbewegung 10-mal langsam umgewendet. Wie viele Male es der Maus nicht gelang, mit ihren linken und rechten Hinterextremitäten zu greifen, wurde aufgezeichnet. Die Maus wurde von den Kanten des Gitters ferngehalten, indem die Maus, falls notwendig, auf dem Gitter umgesetzt wurde. Wenn die Maus ihr Bein nur um oder durch das Gitter krümmte, wurde es als Fehlschlag angesehen. Eine Umdrehung wurde wiederholt, wenn die Maus herumlief und das Gitter nicht greifen konnte.
  • Die Fehlschläge des linken und rechten Beins wurden mit denen anderer Tiere aus der Versuchsgruppe (6 Tiere/Gruppe × 2 Fußgreifbewertungen/Tier = 12 Greifbewertungen/Gruppe an einem bestimmten Zeitpunkt) vereint. Die Ergebnisse für den Agonisten D sind in 38A dargestellt. Tiere, die nur mit dem Träger behandelt wurden, begannen sich im Allgemeinen am 9. postoperativen Tag von allein zu erholen. 38B stellt Ergebisse dar, die unter Verwendung des Agonisten D, der in der Behandlungsvorschrift in einem Träger aus 10% DMSO/Wasser gelöst wurde, erzielt wurden.
  • Verhaltensuntersuchung – Messungen der Zehenspreizung
  • Die Messung der Zehenspreizung begann am 4. postoperativen Tag und wurde jeden zweiten Tag durchgeführt. Die Maus wurde am proximalen Teil des Schwanzes gehalten, und es wurde ihr ermöglicht, sich mit ihren Vorderextremitäten an der Drahtoberseite des Käfigs festzuhalten. Ein kleiner Pinsel oder ein Watteträger wurde verwendet, um die hinteren Zehen und Fußballen der Maus zu bemalen. Man ließ die Maus über ein sauberes Papierblatt laufen, wobei mindestens zwei klare Abdrücke jeder Hinterextremität zurückblieben. Unter Verwendung eines Lineals wurde durch die am weitesten voneinander entfernten Zehenabdrücke an jedem Fuß eine Linie gezeichnet, und der Abstand zwischen ihnen wurde gemessen. Als sich die Tiere erholt hatten, vergrößerte sich der Abstand auf normale Maße.
  • Die Bewertungen des linken und rechten Beines wurden gemittelt und mit denen der anderen Tiere aus dieser Versuchsgruppe (6 Tiere/Gruppe × 2 Fußgreifbewertungen/Tier = 12 Zehenspreizbewertungen/Gruppe an einem bestimmten Zeitpunkt) vereint. Die Ergebnisse unter Verwendung von Agonist D sind in den 39A und B dargestellt. 39D stellt die Wirkungen des Agonisten D, der in dieser Vorschrift in einem Träger aus 10% DMSO/Wasser gelöst wurde, dar.
  • Reportertests mit Mäusen
  • Mäuse mit einem β-Galactosidasetransgen (Ptc-lacZ-Mäuse) unter der regulatorischen Steuerung des Patched-Genorts exprimieren das β-Galactosidaseprotein in denselben Zellen, in denen das endogene Patched-Gen von Mäusen exprimiert wird. Das β-Galactosidaseprotein kann somit als zuverlässiger Reporter der Expression des endogenen Patched-Gens verwendet werden. Das Patched-Gen ist eine bekannte Komponente des Hedgehog-Signalpfads und wird hochreguliert, wenn der Hedgehog-Pfad aktiviert wird. Daher wird in den Ptc-lacZ-Mäusen das β-Galactosidaseprotein in Mäusen, in denen der Hedgehog-Pfad aktiviert wurde, überexprimiert, was zu einer intensiveren Blaufäbung (auf Grund höherer Konzentrationen des β-Galactosidaseenzyms) führt, wenn Gewebe hinsichtlich der Enzymaktivität mit dem X-Gal-Substrat angefärbt werden.
  • Die Ptc-lacZ-Mäuse wurden in vier Behandlungsgruppen eingeteilt und wurden vier Tage mit den folgenden Verbindungen oder Verbindungskombinationen behandelt, wobei am ersten Tag nach der Geburt begonnen wurde (dipal-Shh = dipalmitoyliertes Sonic-Hedgehog):
    1) dipal-Shh 10 mg/kg/Injektion 2 ×/Tag
    2) dipal-Shh 1 mg/kg/Injektion 2 ×/Tag
    Träger 10–15 μl/Injektion 4 ×/Tag
    3) dipal-Shh 1 mg/kg/Injektion 2 ×/Tag
    Agonist B 15 mg/kg/Injektion 4 ×/Tag
    4) keine Behandlung
  • Der Träger für den Agonisten war 10%iges DMSO in PBS (pH 7,2). Der Agonist wurde aus einer 4,67 mM Stammlösung, die in der Trägerlösung gelöst war, injiziert.
  • 18 Stunden nach den letzten Injektionen wurden die Mäuse getötet, und die folgenden Gewebe wurden gesammelt: Schädel, Niere, Lunge, Schulterblatt, Haut und Herz. Alle Gewebe wurden in 0,2% Glutaraldehyd, 5 mM EDTA (pH 8,0), 20 mM MgCl2 und 100 mM Na2HPO4 30 Minuten fixiert, bevor sie in 1 mg/ml X-Gal, 12,5 mM Kaliumhexacyanoferrat(II), 12,5 mM Kaliumhexacyanoferrat(III), 2 mM MgCl2, 0,01% Desoxycholat, 0,02% NP-40 und 100 mM Na2HPO4 30 Stunden angefärbt wurden. Die Gewebe wurden hinsichtlich der relativen Intensität beurteilt und fotografiert.
  • Alle Gewebe aus der Behandlungsgruppe 3 (Agonist + dipal-Shh in niedriger Dosis) zeigten eine wesentliche Hochregulierung der β-Galactosidase (was durch eine intensivere Blaufärbung sichtbar wurde), verglichen mit denen aus der Behandlungsgruppe 2 (Träger + dipal-Shh in niedriger Dosis), wie aus 40 ersichtlich ist, wobei Gewebe aus der Gruppe 3 auf der rechten Seite jedes Teilbildes dargestellt sind. Die Bilder in 41 zeigen ein Beispiel eines Gewebes aus jeder der vier Behandlungsgruppen. Die in der Gruppe 3 beobachtete Hochregulierung war der in der Behandlungsgruppe 1 (dipal-Shh in hoher Dosis) beobachteten ähnlich. Der Grad an β-Galactosidasefärbung in der Behandlungsgruppe 2 war der in Behandlungsgruppe 4 (keine Behandlung) beobachteten ähnlich.
  • Der Agonist B konnte den Hedgehog-Pfad in Gegenwart einer niedrigen Dosis von dipal-Shh, die selbst nicht ausreicht, um eine nachweisbare Hochregulierung zu erzeugen, in vivo hochregulieren.
  • 42: Die Ptc-lacZ-Mäuse wurden in zwei Behandlungsgruppen eingeteilt und wurden drei Tage mit den folgenden Verbindungen behandelt, wobei am ersten Tag nach der Geburt begonnen wurde:
    1) Träger 8 bis 15 μl/Injektion 4 ×/Tag
    2) Agonist D 4 mg/kg/Injektion 4 ×/Tag
  • Der Träger für den Agonisten war 10%iges DMSO in PBS (pH 7,2). Der Agonist wurde aus einer 1,0 mM Stammlösung, die in der Trägerlösung gelöst war, injiziert.
  • 18 Stunden nach den letzten Injektionen wurden die Mäuse getötet, und die Vorderextremitäten wurden gesammelt und, wie vorstehend beschrieben, behandelt. Die Vorderextremitäten der mit den Agonisten behandelten Mäuse zeigten eine starke Hochregulierung in den Nerven, Blutgefäßen, im Knorpel und Bindegewebe.
  • Der Agonist D konnte den Hedgehog-Pfad in Abwesenheit von dipal-Shh in vivo deutlich hochregulieren. Die bei dieser Dosis von Agonist D beobachtete Hochregulierung ist stärker als die mit Injektionen von dipal-Shh mit 10 mg/kg/Injektion, 2 ×/Tag beobachtete.
  • In einem dritten Experiment wurden die Ptc-lacZ-Mäuse in fünf Behandlungsgruppen eingeteilt und vier Tage mit den folgenden Verbindungen behandelt, wobei am ersten Tag nach der Geburt begonnen wurde:
    1) Träger 9 bis 20 μl/Injektion 4 ×/Tag
    2) Agonist D 0,9 mg/kg/Injektion 4 ×/Tag
    3) Agonist D 0,3 mg/kg/Injektion 4 ×/Tag
    4) Agonist D 0,1 mg/kg/Injektion 4 ×/Tag
    5) Octyl-Shh 10 mg/kg/Injektion 2 ×/Tag
  • Der Träger für den Agonisten war 10%iges DMSO in PBS (pH 7,2). Der Agonist wurde aus 0,3, 0,1 und 0,03 mM Stammlösungen, die in der Trägerlösung gelöst waren, injiziert.
  • 18 Stunden nach den letzten Injektionen wurden die Mäuse getötet, und die Vorderextremitäten wurden gesammelt und, wie vorstehend beschrieben, behandelt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 43 dargestellt, wobei die Trägerkontrolle nicht gezeigt ist. Die Vorderextremitäten von den mit Agonisten behandelten Mäuse zeigten erneut eine starke Hochregulierung in den Nerven, Blutgefäßen, im Knorpel und Bindegewebe (verglichen mit der Trägergruppe). Die Gruppe mit 0,9 mg/kg zeigte den höchten Grad an Hochregulierung in diesem Experiment. Sowohl die Gruppe mit einer Dosis von 0,9 mg/kg als auch die Gruppe mit einer Dosis von 0,3 mg/kg zeigten eine stärkere Hochregulierung als die Gruppe mit 10 mg/kg Hh-Protein. Die Gruppe mit 0,1 mg/kg zeigte eine sehr schwache Hochregulierung, die deutlich geringer als die in der Gruppe mit Hh-Protein beobachtete war.
  • Der Agonist D konnte den Hedgehog-Pfad auf eine dosisabhängige Art und Weise in vivo deutlich hochregulieren. Die Hochregulierung, die mit Dosen von 0,9 und 0,3 mg/kg Agonist D beobachtet wurde, ist stärker als die mit Injektionen von Hh-Protein mit 10 mg/kg/Injektion, 2 ×/Tag beobachtete.
  • Lungenverzweigungstest
  • Die Lungen von E12,5 alten Ptc1-(d11)-lacZ-Embryos wurden entnommen, und transgene Embryos durch den lacZ-Nachweis unter Verwendung der Schwänze identifiziert. Die Explantate wurden auf Polycarbonatfiltern mit 1 μm (Costar), die auf die Oberseite von Kunststoffgittern (Einbettungskammer für die Histologie) gelegt wurden, angeordnet und 48 h auf Standardgewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen, die mit Kulturmedium für Lungenexplantate (auf der Basis von DMEM, wobei die Zusätze für die Züchtung von Mäuselungen optimiert waren) gefült waren, gelegt, in lacZ-Fixiermittel fixiert, gespült und hinsichtlich lacZ Ü/N bei 37°C angefärbt.
  • Die Ergebnisse sind in 44 dargestellt. In dem Kontrollbild links kann die lacZ-Expression im Mesenchym direkt benachbart zu distalen Verästelungsspitzen, einem die endogene Patched-Expression widerspiegelnden Muster, beobachtet werden. Die Behandlung mit 5 μM Agonist B führt zu einer wesentlich erhöhten Reportergenexpression und einer Ausbreitung der Expressionsdomäne des Transgens, was eine Hochregulierung des Hedgehog-Pfads anzeigt. Das Bild ganz rechts zeigt die Ergebnisse der Behandlung mit 5 μg/ml Hh-Protein.
  • Nierenverzweigungstest
  • Die Lungen von E13,5 alten Ptc1-(d11)-lacZ-Embryos wurden entnommen, und transgene Embryos wurden durch den lacZ-Nachweis unter Verwendung der Schwänze identifiziert. Die Explantate wurden auf Polycarbonatfiltern mit 1 μm (Costar), die auf die Oberseite von Kunstoffgittern (Einbettungskammer für die Histologie) gelegt wurden, angeordnet und 48 h auf Standardgewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen, die mit Kulturmedium für Nierenexplantate (auf der Basis von DMEM, wobei die Zusätze für die Züchtung von Mäuselungen optimiert waren) gefüllt waren, gelegt, in lacZ-Fixiermittel fixiert, gespült und hinsichtlich lacZ Ü/N bei 37°C angefärbt.
  • Die Ergebnisse sind in 45 dargestellt. In dem Kontrollbild links kann die lacZ-Expression im Mesenchym direkt benachbart zum Harnleiterepithel ganz proximal, einem die endogene Patched-Expression widerspiegelnden Muster, beobachtet werden. Die Behandlung mit 5 μM Agonist B führt zu einer wesentlich erhöhten Reportergenexpression und einer Ausbreitung der Expressionsdomäne des Transgens, was eine Hochregulierung des Hedgehog-Pfads anzeigt. Es ist zu beachten, dass das Signal in dem Mesenchym lokalisiert bleibt und sich nicht in das mehr distal gelegene Harnleiter- und Tubulusepithel ausbreitet, was anzeigt, dass nur die in der endogenen Situation auf das Hedgehog-Signal antwortende/n Mesenchymzellart/en auf den Agonisten antwortet/antworten, während die Zelltypen, die in der Regel diesen Pfad nicht aktivieren, von der Behandlung mit dem Agonisten unbeeinflusst sind. Das Bild ganz rechts zeigt die Ergebnisse der Behandlung mit 5 μg/ml Hh-Protein
  • Hautexplantate
  • Haut von E17,5 alten Ptc-lacZ-Hundeembryos wurde mit einer Hautstanze mit 2 mm herausgeschnitten. Diese Hautausstanzungen wurden dann 6 Tage in Kontrollmedien oder Medien, die entweder Agonist B oder D oder Hh-Protein enthielten, oder Medien, die sowohl einen Agonisten als auch Hh-Protein enthielten, gezüchtet. Die Explantate wurden dann mit X-Gal-Färbemittel angefärbt. 46A zeigt die Ergebnisse für den Agonisten B. Die Behandlung mit dem Agonisten allein zeigt eine stärkere Anfärbung als die Züchtung mit einer niedrigen Dosis von Hh-Protein allein, und die Behandlung mit dem Agonisten und einer niedrigen Dosis von Hh-Protein zeigt eine ähnliche Anfärbung wie die einer wesentlich höheren Dosis von Hh-Protein. Analoge Ergebnisse für den Agonisten D sind in 46B dargestellt.
  • Aktivität in menschlichen Zellen
  • 47A und B vergleichen die Aktivität der vorliegenden Verbindungen O und R in Mäusereporterzellen (TM3-Zellen mit einem Gli-Luc-Reporterkonstrukt, wie vorstehend beschrieben) und in menschlichen Reporterzellen (menschliche embryonale Gaumenmesenchym-(HEPM)-zellen mit einem Gli-Luc-Konstrukt). 48 zeigt eine quantitative PCR-Analyse der RNA, die von dem Hedgehog-Zielgen Gli1 in mit dem Träger, Hh-Protein und Agonist O behandelten menschlichen Zellen exprimiert wurde. Die Aktivierung der Reporterzelllinie und die erhöhte Gli1-Botschaft als Antwort auf die Verbindungen zeigen, dass dieser Agonist in menschlichen Zellen wirkt.
  • Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung
  • a. Veranschaulichende Syntheseschemata
  • Beispielhafte Syntheseschemata zur Erzeugung von Hedgehog-Agonisten, die in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind in den 1 bis 31 gezeigt.
  • Die Reaktionsbedingungen in den veranschaulichten Schemata der 1 bis 31 sind wie folgt:
    • 1) R1CH2CN, NaNH2, Toluol (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
    • 2) H2SO4, H2O, Rückfluss (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
    • 3) H2SO4, EtOH, Rückfluss (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
    • 4) NaOH, EtOH, Rückfluss
    • 5) (Boc)2O, 2M NaOH, THF
    • 6) LiHDMS, R1X, THF (Merck Patentanmeld. Nr. WO 96/06609 )
    • 7) Pd-C, H2, MeOH
    • 8) t-BuONO, CuBr, HBr, H2O (J. Org. Chem. 1977, 42, 2426)
    • 9) ArB(OH)2, Pd(PPh3)4, Dioxan (J. Med. Chem. 1996, 39, 217–223)
    • 10) R12(H)C=CR13R14, Pd(OAc)2, Et3N, DMF (Org. React. 1982, 27, 345)
    • 11) Tf2O, THF (J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478–5486)
    • 12) ArSnBu3, Pd(PPh3)4, Dioxan (J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478–5486)
    • 13) KMnO4, Py, H2O (J. Med. Chem. 1996, 39, 217–223)
    • 14) NaOR1, THF
    • 15) NaSR1, THF
    • 16) HNR1R13, THF
    • 17) HONO, NaBF4 (Adv. Fluorine Chem. 1965, 4, 1–30)
    • 18) Pd(OAC)2, NaH, DPPF, PhCH3, R1OH (J. Org. Chem. 1997, 62, 5413–5418)
    • 19) i. R1X, Et3N, CH2Cl2, ii. R13X
    • 20) SOCl2, kat. DMF
    • 21) CH2N2, Et2O
    • 22) Ag2O, Na2CO3, Na2S2O3, H2O (Tetrahedron Lett. 1979, 2667)
    • 23) AgO2CPh, Et3N, MeOH (Org. Syn., 1970, 50, 77; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5432)
    • 24) LiOH, THF-MeOH
    • 25) (EtO)2P(O)CH2CO2R, BuLi, THF
    • 26) MeO2CCH(Br)=P(Ph)3, Benzol
    • 27) KOH oder KOtBu
    • 28) Base, X(CH2)nCO2R
    • 29) DPPA, Et3N, Toluol (Synthesis 1985, 220)
    • 30) HONO, H2O
    • 31) SO2, CuCl, HCl, H2O (Synthesis 1969, 1–10, 6)
    • 32) Lawesson-Reagens, Toluol (Tetrahedron Asym. 1996, 7, 12, 3553)
    • 33) R2M, Lösungsmittel
    • 34) 30% H2O2, Eisessig CH3CO2H (Helv. Chim. Acta. 1968, 349, 323)
    • 35) Triphosgen, CH2Cl2 (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
    • 36) i. (EtO)2P(O)CHLiSO2Oi-Pr, THF, ii. NaI
    • 37) Ph3PCH3I, NaCH2S(O)CH3, DMSO (Synthesis 1987, 498)
    • 38) Br2, CHCl3 oder ein anderes Lösungsmittel (Synthesis 1987, 498)
    • 39) BuLi, Bu3SnCl
    • 40) ClSO2OTMS, CCl4 (Chem. Ber. 1995, 128, 575–580)
    • 41) MeOH-HCl, Rückfluss
    • 42) LAH, Et2O oder LiBH4, EtOH oder BH3-THF (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
    • 43) MsCl, Et3N, CH2Cl2 (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
    • 44) Na2SO3, H2O (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
    • 45) R2R4NH, Et3N, CH2Cl2
    • 46) R2M, Lösungsmittel
    • 47) CH3NH(OCH3), EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF (Tetrahedron Lett, 1981, 22, 3815)
    • 48) MeLi, THF
    • 49) mCPBA, CH2Cl2
    • 50) HONO, Cu2O, Cu(NO3)2, H2O (J. Org. Chem. 1977, 42, 2053)
    • 51) R1M, Lösungsmittel
    • 52) HONO, NaS(S)COEt, H2O (Org. Synth. 1947, 27, 81)
    • 53) HSR2 oder HSR4, CH2Cl2
    • 54) i-BuOC(O)Cl, Et3N, NH3, THF
    • 55) R2R4NH, CH2Cl2, NaBH(OAc)3
    • 56) R2R4NH, MeOH/CH3CO2H, NaBH3CN
    • 57) R2OH, EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 58) R2OH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 59) R2R4NH, EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 60) R2R4NH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 61) POCl3, Py, CH2Cl2
    • 62) R2R4NCO3 Lösungsmittel
    • 63) R2OC(O)Cl, Et3N, Lösungsmittel
    • 64) R2CO2H, EDC oder HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 65) R2X, Et3N, Lösungsmittel
    • 66) (CH3S)2C=N(CN), DMF, EtOH (J. Med. Chem. 1994, 37, 57–66)
    • 67) R2SO2Cl, Et3N, CH2Cl2
    • 68) R2- oder R3- oder R4CHO, MeOH/CH3CO2H, NaBH3CN (Synthesis 1975, 135–146)
    • 69) Boc(Tr)-D oder L-CysOH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 70) Boc(Tr)-D oder L-CysH, NaBH3CN, MeOH/CH3CO2H (Synthesis 1975, 135–146)
    • 71) cysteinales S-Tr-N-Boc, ClCH2CH2Cl oder TBF, NaBH(OAc)3 (J. Org. Chem. 1996, 61, 3849–3862)
    • 72) TFA, CH2Cl2, Et3SiH oder Thioanisol/Ethandithiol/DMS (3:1:1)
    • 73) TFA, CH2Cl2
    • 74) DPPA, Et3N, Toluol, HOCH2CH2SiCH3 (Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3515)
    • 75) TBAF, THF
    • 76) Base, TrSH oder BnSH
    • 77) Base, R2X oder R4X
    • 78) R3NH2, MeOH/CH3CO2H, NaBH3CN
    • 79) N2H4, KOH
    • 80) Pd2(dba)3, P(o-tol)3, RNH2, NaOtBu, Dioxan, R1NH2 (Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7181–7184)
    • 81) Cyanamid
    • 82) Fmoc-Cl, Natriumhydrogencarbonat
    • 83) BnCOCl, Natriumcarbonat
    • 84) AllylOCOCl, Pyridin
    • 85) Benzylbromid, Base
    • 86) Oxalylchlorid, DMSO
    • 87) RCONH2
    • 88) Carbonyldiimidazol, neutrale Lösungsmittel (z. B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 89) Thiocarbonyldiimidazol, neutrale Lösungsmittel (z. B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 90) Bromcyan, neutrale Lösungsmittel (z. B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 91) RCOCl, Triethylamin
    • 92) RNHNH2, EDC
    • 93) RO2CCOCl, Et3N, DCM
    • 94) MsOH, Pyridin (J. Het. Chem., 1980, 607)
    • 95) Base, neutrale Lösungsmittel (z. B. DCM, Toluol, THF)
    • 96) H2NOR, EDC
    • 97) RCSNH2
    • 98) RCOCHBrR, neutrale Lösungsmittel (z. B. DCM, DMF, THF, Toluol), (Org. Proc. Prep. Intl., 1992, 24,127)
    • 99) CH2N2, HCl (Synthesis, 1993, 197)
    • 100) NH2NHR, neutrale Lösungsmittel (z. B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 101) RSO2Cl, DMAP (Tetrahedron Lett., 1993, 34, 2749)
    • 102) Et3N, RX (J. Org. Chem., 1990, 55, 6037)
    • 103) NOCl oder Cl2 (J. Org. Chem., 1990, 55, 3916)
    • 104) H2NOH, neutrale Lösungsmittel (z. B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 105) RCCR, neutrale Lösungsmittel (DCM, THF, Toluol)
    • 106) RCHCHR, neutrale Lösungsmittel (DCM, THF, Toluol)
    • 107) H2NOH, HCl
    • 108) Thiocarbonyldiimidazol, SiO2 oder BF3OEt2 (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228)
    • 109) Thiocarbonyldiimidazol, DBU oder DBN (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228)
    • 110) HNO2, HCl
    • 111) ClCH2CO2Et (Org. Reactions, 1959, 10, 143)
    • 112) Morpholinenamin (Eur. J. Med. Chem., 1982, 17, 27)
    • 113) RCOCHR'CN
    • 114) RCOCHR'CO2Et
    • 115) Na2SO3
    • 116) H2NCHRCO2Et
    • 117) EtO2CCHRNCO
    • 118) RCNHNH2
    • 119) RCOCO2H (J. Med. Chem., 1995, 38, 3741)
    • 120) RCHO, KOAc
    • 121) 2-Fluornitrobenzol
    • 122) SnCl2, EtOH, DMF
    • 123) RCHO, NaBH3CN, HOAc
    • 124) NH3, MeOH
    • 125) 2,4,6-Me3PhSO2NH2
    • 126) Et2NH, CH2Cl2
    • 127) MeOC(O)Cl, Et3N, CH2Cl2
    • 128) R2NH2, EDC, HOBT, Et3N, CH2Cl2
    • 129) DBU, PhCH3
    • 130) BocNHCH(CH2STr)CH2NH2, EDC, HOBT, Et3N, CH2Cl2
    • 131) R2NHCH2CO2Me, HBTU, HOBT, Et3N, CH2Cl2
    • 132) BocNHCH(CH2STr)CH2OMs, LiHMDS, THF
    • 133) R2NHCH2CO2Me, NaBH(OAc)3, ClCH2CH2Cl oder THF
    • 134) R2NHCH2CH(OEt)2, HBTU, HOBT, Et3N, CH2Cl2
    • 135) NaBH(OAc)3, ClCH2CH2Cl oder THF, AcOH
    • 136) Piperidin, DMF
    • 137) Pd(Ph3P)4, Bu3SnH
    • 138) RCO2H, EDC, HOBT, Et3N, DCM
    • 139) RNH2, neutrale Lösungsmittel
    • 140) RCHO, NaBH3CN, HOAC
    • 141) RNCO, Lösungsmittel
    • 142) RCO2H, EDC oder HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 143) RCOCl, Triethylamin
    • 144) RSO2Cl, Et3N, CH2Cl2
    • 145) SnCl2, EtOH, DMF
    • 146) RNH2, EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 147) Dibromethan, Et3N, CH2Cl2
    • 148) Oxalylchlorid, neutrale Lösungsmittel
    • 149) LiOH, THF-MeOH
    • 150) Carbonyldiimidazol, neutrale Lösungsmittel (z. B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 151) RNH2, Et3N, CH2Cl2
    • 152) Base, RX
    • 153) DBU, PhCH3
    • 154) DPPA, Et3N, Toluol (Synthesis 1985, 220)
    • 155) SOCl2, kat. DMF
    • 156) ArH, Lewis-Säure (AlCl3, SnCl4, TiCl4), CH2Cl2
    • 157) H2NCHRCO2Et, neutrale Lösungsmittel
    • 158) BocHNCHRCO2H, EDC oder HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 159) TFA, CH2Cl2
  • b. Veranschaulichende Herstellung von Aryluntereinheiten
  • Aryluntereinheiten können unter Verwendung einer großen Vielzahl von Reaktionen, die Fachleuten bekannt sind, funktionalisiert werden. Die Chemie aromatischer und heteroaromatischer Ringe ist vielfältig und nur eine Auswahl verwendbarer Reaktionen kann hier dargestellt werden. Mehrere veranschaulichende Beispiele, die zur Erzeugung des Biarylteils der vorliegenden Verbindungen besonders verwendbar sind, sind nachstehend gezeigt. Suzuki-Kupplung Nr. 1:
    Figure 01070001
    Suzuki-Kupplung Nr. 2:
    Figure 01070002
    Stille-Kupplung Nr. 1:
    Figure 01080001
    Stille-Kupplung Nr. 2:
    Figure 01080002
    Stille-Kupplung Nr. 3
    Figure 01080003
  • c. Veranschaulichende Herstellung von Kupplungssubstraten
  • Die Vertreter der allgemeinen Klassen der vorstehend gezeigten Kupplungssubstrate – Arylstannane, Arylboronsäuren, Aryltriflate und Arylhalogenide – sind aus den Ausgangsheterocyclen erhältlich. Im Allgemeinen sind die zur Herstellung eines Kupplungssubstrats erforderlichen Umwandlungen zuverlässig und für eine Maßstabsvergrößerung geeignet. Veranschaulichende Beispiele sind nachstehend gezeigt. Herstellung eines Aryliodids
    Figure 01090001
    Herstellung eines Arylstannans
    Figure 01090002
    Herstellung eines Aryltriflats
    Figure 01090003
    Herstellung von Arylboronsäure
    Figure 01090004
  • Festphasensynthese der vorliegenden Verbindungen
  • Allgemeines:
  • Waschvorschriften
    • Verfahren 1: Wasser (3 ×), Aceton (2 ×), N,N-Dimethylformamid (3 ×), Wasser (2 ×), Aceton (1 ×), N,N-Dimethylformamid (3 ×), Wasser (2 ×), Aceton (3 ×), Methanol (3 ×), Aceton (3 ×) und Methanol (3 ×);
    • Verfahren 2: Dichlormethan, Hexan, N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, Hexan, Dichlormethan und Hexan;
    • Verfahren 3: Wasser, N,N-Dimethylformamid, Wasser, 1,0 M wässrige Natriumhydroxidlösung, Wasser, N,N-Dimethylformamid, Wasser, 1,0 wässrige Natriumhydroxidlösung, Wasser, N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, Methanol, Dichlormethan und Methanol;
    • Verfahren 4: N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, Methanol, Dichlormethan, Methanol (2 ×) und Ether (2 ×).
  • Allgemeines Schema:
    Figure 01110001
  • Schritt A – Herstellung von (Nitroehen-4'-yloxycarboxy)benz-4-yloxymethylpolysyrol-(Wang-PNP-carbonatpolystyrol)
  • Hydroxybenz-4-yloxymethylpolystyrol (Wang-Harz)
  • Natriummethoxid (233 g, 4,31 mol) wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff und Rühren langsam zu einem Gemisch aus Chlormethylpolystyrol (2,4 kg, 3,6 mol funktionalisierte Beladung) und 4-Hydroxybenzylalkohol (581 g, 4,68 mol) in N,N-Dimethylacetamid (10 l) gegeben. Nach der Verdünnung mit N,N-Dimethylacetamid (13 l) wurde das Gemisch 5 h auf 50°C erwärmt und dann über eine Kanüle durch ein P-ETFE-Sieb (70 μm) filtriert. Das Rohprodukt wurde unter Verwendung der Sequenz von Verfahren 1 ausgiebig gewaschen und dann unter Vakuum bei 60°C getrocknet, wobei sich 2630 g des Titelharzes ergaben.
  • (Nitroehen-4'-yloxycarboxy)benz-4-yloxymethylpolystyrol-(Wang-PNP-carbonatpolystyrol)
  • 4-Methylmorpholin (660 ml, 6,0 mol) wurde bei 0°C unter Stickstoff und Rühren während 2 h tropfenweise zu einem Gemisch aus Hydroxybenz-4-yloxymethylpolystyrol (2000 g, 2,5 mol funktionalisierte Beladung) und 4-Nitrophenolchlorformiat (1209 g, 6,0 mol) in Dichlormethan (22 1) gegeben. Das Gemisch wurde allmählich auf Raumtemperatur erwärmt, über Nacht gerührt und über eine Kanüle durch ein P-ETFE-Sieb (70 um) filtriert. Das rohe Harz wurde unter Verwendung der Sequenz von Verfahren 2 ausgiebig gewaschen und dann unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei sich 2728 g eines Gemisches aus dem Titelharz und 4-Methylmorpholinhydrochlorid ergaben.
  • Schritt B – Herstellung von an Wang-Harz gebundenen Diaminen
  • Allgemeines Verfahren (für Piperazin, Homopiperazin und trans-1,4-Diaminocyclohexan):
  • Man ließ rohes (Nitrophen-4'-yloxycarboxy)benz-4-yloxymethylpolystryrol (1002,5 g, ~0,9 mol funktionalisierte Beladung) unter Stickstoff während 15 min in einem 50%igen Vol./Vol. Gemisch aus wasserfreiem Dichlormethan und N,N-Dimethylformamid (9 l) quellen. N,N-Diisopropylamin (626 ml, 5 Moläquivalente) und das geeignete Diamin (5 Moläquivalente) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Das Gemisch wurde durch ein P-ETFE-Sieb (70 μm) filtriert, unter Verwendung der Sequenz von Verfahren 3 ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 60°C getrocknet, wobei sich das harzgebundene Diamin ergab.
  • An Wang-Harz gebundenes Ethylendiamin
  • Man ließ rohes (Nitroehen-4'-yloxycarboxy)benz-4-yloxymethylpolystyrol (1002,5 g, ~0,9 mol funktionalisierte Beladung) unter Stickstoff während 15 min in Dichlormethan (7 l) quellen und behandelte es mit Ethylendiamin (181 ml, 2,7 mol). Die so erhaltene dicke, gelbe Suspension wurde mit Dichlormethan (2 l) verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Das Gemisch wurde durch ein P-PETFE-Sieb (70 μm) filtriert, unter Verwendung der Sequenz von Verfahren 3 ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 60°C getrocknet, wobei sich das harzgebundene Titeldiamin ergab.
  • An Wang-Harz gebundenes m-Xylylendiamin
  • Man ließ rohes (Nitroehen-4'-yloxycarboxy)benz-4-yloxymethylpolystyrol (1002,5 g, ~0,9 mol funktionalisierte Beladung) unter Stickstoff während 15 min in Tetrahydrofuran (7 l) quellen und behandelte es mit einer Lösung von m-Xylylendiamin (828 ml, 6,27 mol) in Tetrahydrofuran (1 l). Die so erhaltene dicke, gelbe Suspension wurde mit Dichlormethan (2 l) verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Das Gemisch wurde durch ein P-ETFE-Sieb (70 μm) filtriert, unter Verwendung der Sequenz von Verfahren 3 ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 60°C getrocknet, wobei sich das harzgebundene Diamin ergab.
  • Schritt C: Herstellung des Bausteins unter Verwendung eines Suzuki-Kupplungverfahrens
  • Eine Suspension aus dem geeigneten Arylbromid (1 Äquivalent) und Kaliumcarbonat (2,2 Äquivalente) in Toluol (13 Volumina) wurde gerührt und bei Raumtemperatur entgast. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (0,01 Äquivalente) wurde zugegeben, und das Reaktionsgefäß wurde evakuiert und mit Stickstoff (dreimal) gespült. Nach 15 min wurde eine entgaste Lösung von 2-Methoxy-5-formylphenylboronsäure (1,2 Äquivalente) in Ethanol (6,3 Volumina) über eine Kanüle zugegeben, und dann wurde das Gemisch unter Rückfluss erhitzt und über Nacht unter Stickstoff gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoff aus der Lösung abfiltriert und sorgfältig mit Toluol gewaschen. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockene eingedampft, wobei sich das Rohprodukt ergab. Dieses wurde mit Diethylether (5 Volumina) verrieben, und die so erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, mit Diethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Der Biarylaldehyd wurde als gelbes Pulver erhalten.
  • Schritt D: Beladung des Wang-Diamins mit dem Baustein:
  • Reduktive Alkylierung
  • Man ließ das geeignete Harz (1 Äquivalent, ~0,75 mmol funktionalisierte Beladung) in einem Gemisch aus Tetrahydrofuran, Trimethylorthoformiat und Dichlormethan (1:1:1, Vol./Vol./Vol., 10 ml) während 15 min quellen, rührte dann schwach, und behandelte es mit dem geeigneten Aldehyd (2 Äquivalente). Nach schwachen Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Harz abfiltriert, gründlich mit Tetrahydrofuran gewaschen und unter Vakuum bei 40°C getrocknet. Man ließ das getrocknete Harz in Tetrahydrofuran während 15 min quellen und behandelte es mit Essigsäure (0,12 Äquivalente) und Natriumtriacetoxyborhydrid (5 Äquivalente). Die Harzsuspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur schwach gerührt, dann filtriert, unter Verwendung der Sequenz von Verfahren 4 ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 60°C getrocknet.
  • Säurechlorid-Abdeckung
  • Man ließ das geeignete Harz (1 Äquivalent) in Dichlormethan (10 Volumina) während 10 min quellen und behandelte es mit dem geeigneten Säurechlorid (3 Äquivalente) und N,N-Diisopropylethylamin (3 Äquivalente). Die Harzsuspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur schwach gerührt, filtriert und unter Verwendung der Sequenz von Verfahren 4 ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 40°C getrocknet.
  • Lösungsphasensynthese der vorliegenden Verbindungen
  • Das folgende beispielhafte Schema veranschaulicht einen Weg, durch den Hedgehog-Agonisten der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können. Änderungen dieses beispielhaften Pfads werden von Durchschnittsfachleuten ohne weiteres verstanden und durchgeführt, was die Herstellung eines breiten Bereiches von Verbindungen, die unter die offenbarten allgemeinen Formeln fallen, ermöglicht. Die in diesem Schema verwendeten Verbindungsnummern stimmen mit den nachstehenden Verfahren überein und sind von den sonst in der Anmeldung wie in den Figuren verwendeten Verbindungsnummern unabhängig. Synthese von 3-Chlorbenzo[b]thiophen-2-carbonsäure-(4'-cyano-6-methoxybiphenyl-3-ylmethyl)-(4-methylaminocyclohexyl)amidhydrochlorid (7)
    Figure 01150001
  • (4-Aminocyclohexyl)carbaminsäure-t-butylester (1)
  • Eine Lösung aus Di-t-butyldicarbonat (12,0 g, 54,7 mmol) und Tetrahydrofuran (250 ml) wurde unter Stickstoff während 3 h langsam zu einer Suspension von 1,4-Diaminocyclohexan (50,0 g, 0,44 mol) in Tetrahydrofuran (250 ml) gegeben, während die Temperatur unter 10°C gehalten wurde. Man ließ das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen, rührte es anschließend 16 Stunden und filtrierte es dann. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, wobei sich ein Rückstand ergab. Wasser (500 ml) wurde zu dem Rückstand gegeben, gefolgt von ungefähr 15-minütigem Rühren, und danach wurde das Gemisch filtriert, und die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan (3 × 200 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und konzentriert, wobei sich ein Rückstand ergab, der in t-Butylmethylether (350 ml) gelöst und mit Wasser (3 × 50 ml) gewaschen wurde. Der t-Butylmethylether wurde im Vakuum entfernt, wobei sich die Titelverbindung 1 (8,1 g, 69%) als Feststoff ergab: δH (360 MHz: CDCl3) 1,06-1,24 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,83 (d, 2H), 1,98 (d, 2H), 2,56-2,66 (m, 1H), 3,30-3,35 (m, 1H) und 4,31-4,38 (m, 1H).
  • N-Methylcyclohexan-1,4-diamin (2)
  • Das Amin 1 (15,0 g, 0,7 mol) wurde unter Stickstoff während 45 min langsam zu einer 1 N Lösung von Lithiumaluminiumhydrid in THF (450 ml, 0,36 mol) gegeben. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt und dann 5 bis 6 Stunden unter Stickstoff und Rückfluss erhitzt. Wasser (13,2 ml), gefolgt von 15%igem, wässrigem Natriumhydroxid (13,2 ml) und Wasser (39,7 ml) wurden zu dem Gemisch gegeben. Das Gemisch wurde dann 15 bis 30 min gerührt. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit t-Butylmethylether (200 ml), Dichlormethan (200 ml) und t-Butylmethylether (200 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden aufgenommen, getrocknet (MgSO4) und filtriert. Das Trocknungsmittel wurde dann mit Dichlormethan gewaschen, und die organischen Extrakte wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wobei sich die Titelverbindung 2 (7,52 g, 84%) als blassgelber Feststoff ergab: δH (360 MHz: CDCl3) 1,04-1,20 (q, 4H), 1,51 (br s, 3H), 1,80-1,96 (m, 4H), 2,25-2,35 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,61-2,72 (m, 1H).
  • (4-Aminocyclohexyl)methylcarbaminsäure-t-butylester (3)
  • Benzaldehyd (12,8 ml, 0,13 mol) wurde unter Stickstoff auf einmal zu einer Lösung aus N-Methylamin 2 (16,2 g, 0,13 mol) und Toluol (150 ml) gegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde unter Verwendung eines Dean-Stark-Apparates 4 h unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen des Gemisches auf Raumtemperatur wurde Di-t-butyldicarbonat (27,5 g, 0,13 mol) portionsweise zugegeben, und das Gemisch wurde 16 h gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert, wobei ein gelbes Öl zurückblieb, zu dem 1 N wässriges Kaliumhydrogensulfat (90 ml) gegeben wurde, gefolgt von kräftigem Rühren, bis eine DC zeigte, dass die Reaktion beendet war (~2,5 h). Das Gemisch wurde in Ether (3 × 100 ml) extrahiert, und die wässrige Schicht wurde mit wässrigem Natriumhydroxid alkalisch eingestellt (pH ~12). Die wässrige Schicht wurde dann mit Natriumchlorid gesättigt, und das Produkt wurde in Chloroform (3 × 40 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden im Vakuum konzentriert, wobei sich die Titelverbindung 3 (16,3 g, 59%) als gelbes Öl ergab: δH (360 MHz: CDCl3) 1,11-1,34 (m, 5H), 1,45 (s, 9H), 1,66 (br d, 2H), 1,90 (br d, 2H), 2,56-2,66 (m, 1H), 2,71 (s, 3H) und 3,98 (br s, 2H).
  • {4-[(4'-Cyano-6-methoxybiphenyl-3-ylmethyl)amino]cyclohexyl}methylcarbaminsäure-t-butylester (5)
  • Eine Lösung aus dem Amin 3 (5,0 g, 21,92 mmol), Aldehyd 4 (5,19 g, 21,92 mmol) und Trimethylorthoformiat (50 ml) wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff 16 h gerührt. Natriumtriacetoxyborhydrid (6,5 g, 30,7 mmol) wurde dann portionsweise zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis die Reaktion beendet war, was durch LC-MS-Analyse bestimmt wurde. Wasser wurde vorsichtig zugegeben, und Gemisch wurde 5 min gerührt, gefolgt von der Trennung der Schichten. Die Trimethylorthoformiatschicht wurde auf 1 N wässriges Kaliumhydrogensulfat (100 ml) gegossen und 15 min gerührt. Der gefällte Feststoff wurde abfiltriert und mit Wasser (50 ml) und kaltem Tributylmethylether (3 × 30 ml) gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wurde dann in Dichlormethan (150 ml) suspendiert, gesättigtes, wässriges Natriumhydrogencarbonat (50 ml) wurde zugegeben, und der pH-Wert wurde alkalisch (pH ~10) eingestellt, während weiter kräftig gerührt wurde. Die Dichlormethanschicht wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, und der organische Extrakt wurde getrocknet (MgSO4) und im Vakuum konzentriert, wobei sich die Titelverbindung 5 (6,9 g, 69%) als grauweißer Feststoff ergab: δH (360 MHz: CDCl3) 1,18-1,31 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,68 (d, 2H), 2,01 (d, 2H), 2,44-2,56 (m, 1H), 2,69 (s, 3H), 3,76 (s, 2H), 3,80 (s, 3H), 6,92 (d, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,29 (d, 1H), 7,61 (d, 2H) und 7,66 (d, 2H).
  • {4-[(3-Chlorbenzo[b]thiophen-2-carbonyl)-(4'-cyano-6-methoxybiphenyl-3-ylmethyl)amino]cyclohexyl}methylcarbaminsäure-t-butylester(6)
  • N,N-Diisopropylethylamin (2,1 ml, 12,1 mmol) wurde unter Rühren und Argon zu einer Lösung aus dem Amin 5 (2,2 g, 4,9 mmol), 3-Chlorbenzo[b]thiophen-2-carbonylchlorid (1,3 g, 5,86 mmol) und wasserfreiem Dichlormethan (22 ml) gegeben. Sobald das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war, was durch DC kontrolliert wurde (~2,5 Stunden), wurde das Gemisch mit Wasser, gesättigtem, wässrigem Natriumhydrogencarbonat und Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO4) und im Vakuum konzentriert. Der gelbe Rückstand wurde dann durch Silicagelchromatographie unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat, 3:1, gereinigt, wobei sich die Titelverbindung 6 (2,93 g, 93%) als blassgelber Feststoff ergab.
  • 3-Chlorbenzo[b]thiophen-2-carbonsäure-(4'-cyano-6-methoxybiphenyl-3-ylmethyl)-(4-methylaminocyclohexyl)amidhydrochlorid (7)
  • Konzentrierte Salzsäure (27,5 ml) wurde zu einer Lösung aus der Verbindung 6 (11,0 g, 17,1 mmol) und Ethanol (82,5 ml) gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, bis die Reaktion beendet war, was durch DC kontrolliert wurde. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert, und Dichlormethan wurde zugegeben und erneut konzentriert, und dies wurde wiederholt, bis ein Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde dann mit t-Butylmethylether (30 ml) aufgeschlämmt, filtriert, und die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO4) und im Vakuum konzentriert, wobei sich die Titelverbindung 7 (10,0 g, 99%) ergab: δH (360 MHz: DMSO, 70°C) 1,30-1,50 (m, 2H), 1,85 (br s, 4H), 2,12 (br d, 2H), 2,48 (s, 3H), 2,91 (br t, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,87 (br s, 1H), 4,71 (s, 2H), 7,14 (d, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,57-7,68 (m, 4H), 7,80-7,90 (m, 3H), 8,09 (d, 1H), 8,82 (br s, 2H).
  • Alle hier zitierten Veröffentlichungen und Patente sind in ihrer Gesamtheit hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Fachleute erkennen viele Äquivalente zu den speziellen Ausführungsformen der Erfindung, die hier beschrieben wurden, oder können sie unter Verwendung von nicht mehr als routinemäßigem Experimentieren ermitteln. Solche Äquivalente sollen von die folgenden Ansprüchen umfasst werden.

Claims (23)

  1. In vitro-Verfahren zum agonistischen Beeinflussen des Hedgehog-Pfads in einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Hedgehog-Agonisten in einer Menge, die ausreicht, Proliferation oder Differenzierung einer solchen Zelle zu modulieren, wobei der Hedgehog-Agonist ein Molekulargewicht von weniger als 2500 AME hat, mit Smoothened in Wechselwirkung tritt und den Hedgehog-Pfad agonistisch beeinflusst.
  2. In vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Hedgehog-Agonist Hedgehogvermittelte Signaltransduktion mit einer ED50 von 1 mM oder weniger agonistisch beeinflusst.
  3. In vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Hedgehog-Agonist Hedgehogvermittelte Signaltransduktion mit einer ED50 von 1 μM oder weniger agonistisch beeinflusst.
  4. In vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Hedgehog-Agonist Hedgehogvermittelte Signaltransduktion mit einer ED50 von 1 nM oder weniger agonistisch beeinflusst.
  5. Verwendung eines Hedgehog-Agonisten für die Herstellung eines Medikaments zur Modulierung von Proliferation oder Differenzierung einer Zelle in einem Tier, für die Behandlung oder Vorbeugung von chemischer Verletzung, vaskulärer Verletzung, ischämischer Verletzung nach einem Schlaganfall, infektiöser/entzündlicher und Tumor-induzierter Verletzung des Nervensystems; chronischen neurodegenerativen Erkrankungen des Nervensystems; neurologischen Zuständen, die sich vom Altern des Nervensystems ableiten; chronischen immunologischen Erkrankungen des Nervensystems; chronischen Atrophien; für die Behandlung von Tachykardie; Herzvorhofarrhythmie; kardialer Kachexie; Paradontalerkrankungen; oder Alopezie; für die Reparatur epithelialer Gewebe; oder zur Förderung der Wundheilung; wobei der Hedgehog-Agonist ein Molekulargewicht von weniger als 2500 AME hat, mit Smoothened in Wechselwirkung tritt und den Hedgehog-Pfad agonistisch beeinflusst.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Hedgehog-Agonist Hedgehogvermittelte Signaltransduktion mit einer ED50 von 1 mM oder weniger agonistisch beeinflusst.
  7. Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Hedgehog-Agonist Hedgehogvermittelte Signaltransduktion mit einer ED50 von 1 μM oder weniger agonistisch beeinflusst.
  8. Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Hedgehog-Agonist Hedgehogvermittelte Signaltransduktion mit einer ED50 von 1 nM oder weniger agonistisch beeinflusst.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die chronischen Atrophien ausgewählt sind aus amyotropher Lateralsklerose, Guillain-Barre-Syndrom und chronischer peripherer Neuropathie, Bulbarparalysen oder spinalen Muskelatrophien, und Kleinhirnrindedegeneration, die die Vorderlappen (Vermis- und Beinbereiche) einbezieht und die in Alkoholpatienten üblich ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die chronische neurogenerative Erkrankung aus Parkinson-Krankheit, Chores Huntington, amyotropher Lateralsklerose und spinozerebellären Degenerationen ausgewählt ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 5, wobei der neurologische Zustand, der sich vom Altern des Nervensystems ableitet, Alzheimer-Krankheit ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die chronische immunologische Erkrankung des Nervensystems Multiple Sklerose ist.
  13. Verbindung der allgemeinen Formel X:
    Figure 01210001
    Formel X wobei, wie es die Valenz möglich macht, Ar einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring bedeutet; Z nicht vorhanden ist oder einen substituierten oder unsubstituierten Aryl-, Carbocyclyl-, Heterocyclyl- oder Heteroarylring oder einen Nitro-, Cyano- oder Halogensubstituenten bedeutet; Y bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist; X aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)- und einer Methylengruppe, die gegebenenfalls mit 1 bis 2 Resten substituiert ist, ausgewählt ist; R unabhängig bei jedem Vorkommen H oder Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei mindestens ein R in NR2 Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist; Cy' substituiertes oder unsubstituiertes Benzo(b)thien-2-yl bedeutet; M unabhängig bei jedem Vorkommen eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe bedeutet; j unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet; i unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 bedeutet; k bei jedem Vorkommen 0 bedeutet; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
  14. Verbindung der allgemeinen Formel (II):
    Figure 01220001
    Formel II wobei, wie es die Valenz möglich macht, Ar und Ar' unabhängig voneinander substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Heteroarylringe bedeuten; Y unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist; X ausgewählt ist aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)- und einer Methylengruppe, die gegebenenfalls mit 1 bis 2 Resten substituiert ist, ausgewählt aus Niederalkyl-, -alkenyl- und -alkinylresten; M unabhängig bei jedem Vorkommen eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe bedeutet; oder zwei M zusammengenommen substituiertes oder unsubstituiertes Ethen oder Ethin bedeuten, wobei einige oder jedes vorkommende M in M die ganze oder einen Teil einer cyclischen Struktur bilden; R unabhängig bei jedem Vorkommen H oder Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei mindestens ein R in NR2 Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist; Cy' substituiertes oder unsubstituiertes Benzothiophen bedeutet; i unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 bedeutet; und j jeweils bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10 bedeutet; wobei Niederalkyl, Niederalkenyl bzw. Niederalkinyl sich auf einen Rest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen beziehen; wobei jedes vorkommende M in Mj die ganze oder einen Teil einer cyclischen Struktur bilden; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
  15. Verbindung nach Anspruch 13 oder 14, wobei NR2 ein sekundäres Amin ist, wobei R einen unsubstituierten Alkylrest bedeutet.
  16. Verbindung nach Anspruch 13 oder 14, wobei Ar bicyclisch ist.
  17. Verbindung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei X aus -C(=O)-, -C(=S)- und -S(O2)- ausgewählt ist.
  18. Verbindung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei Cy' eine substituierte oder unsubstituierte Benzothiophen-2-yl-gruppe ist.
  19. Verbindung nach Anspruch 14, wobei R H oder Me ist.
  20. Verbindung, ausgewählt aus einer der Verbindungen C1 bis C49
    Figure 01230001
    Figure 01240001
    Figure 01250001
    Figure 01260001
    Figure 01270001
  21. Arzneimittel, umfassend eine der Verbindungen nach Anspruch 20.
  22. In vitro-Verfahren zum agonistischen Beeinflussen des Hedgehog-Pfads in einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einer der Verbindungen nach Anspruch 20.
  23. Verwendung einer der Verbindungen nach Anspruch 20 für die Herstellung eines Medikaments zur Modulierung von Proliferation oder Differenzierung einer Zelle in einem Tier für die Behandlung oder Vorbeugung von chemischer Verletzung, vaskulärer Verletzung, ischämischer Verletzung nach einem Schlaganfall, infektiöser/entzündlicher oder Tumor-induzierter Verletzung des Nervensystems; chronischen neurodegenerativen Erkrankungen des Nervensystems; neurologischen Zuständen, die sich vom Altern des Nervensystems ableiten; chronischen immunologischen Erkrankungen des Nervensystems; chronischen Atrophien; für die Behandlung von Tachykardie; Herzvorhofarrhythmie; kardialer Kachexie; Paradontalerkrankungen; oder Alopezie; für die Reparatur epithelialer Gewebe; oder zur Förderung der Wundheilung.
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Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69841320D1 (de) 1997-02-10 2010-01-07 Harvard College Verfahren zur modulation von hämatopoese und vaskulärem wachstum
US7230000B1 (en) 1999-10-27 2007-06-12 Cytokinetics, Incorporated Methods and compositions utilizing quinazolinones
US6545004B1 (en) 1999-10-27 2003-04-08 Cytokinetics, Inc. Methods and compositions utilizing quinazolinones
US7671200B2 (en) 1999-10-27 2010-03-02 Cytokinetics, Inc. Quinazolinone KSP inhibitors
US6683192B2 (en) * 2000-03-30 2004-01-27 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
US7498304B2 (en) 2000-06-16 2009-03-03 Curis, Inc. Angiogenesis-modulating compositions and uses
JP4954426B2 (ja) * 2000-06-16 2012-06-13 キュリス，インコーポレイテッド 血管形成調節組成物及び利用
AU9684401A (en) 2000-10-13 2002-04-22 Curis Inc Hedgehog antagonists, methods and uses related thereto
US7708998B2 (en) 2000-10-13 2010-05-04 Curis, Inc. Methods of inhibiting unwanted cell proliferation using hedgehog antagonists
WO2003043995A1 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Cytokinetics, Inc. Process for the racemization of chiral quinazolinones
DE60222302T2 (de) 2001-12-06 2008-05-29 Merck & Co., Inc. Inhibitoren von mitotischem kinesin
AU2002357043B2 (en) 2001-12-06 2008-04-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Mitotic kinesin inhibitors
US7262186B2 (en) 2001-12-06 2007-08-28 Merck & Co., Inc. Substituted pyrazolo[3,4-d] pyrimidinones as a mitotic kinesin inhibitor
JP2005515208A (ja) 2001-12-06 2005-05-26 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 有糸分裂性キネシン阻害剤
US7262187B2 (en) 2001-12-06 2007-08-28 Merck & Co., Inc. Substituted oxazolo- and thizaolopyrimidinones as a mitotic kinesin inhibitor
US7390659B2 (en) * 2002-07-16 2008-06-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for inducing differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
US7632679B2 (en) 2002-07-16 2009-12-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for screening for modulators of neural differentiation
CA2561221C (en) 2004-03-26 2016-09-20 Curis, Inc. Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof
WO2007089669A2 (en) * 2006-01-26 2007-08-09 Wyeth Processes for the preparation of compounds which modulate cell proliferation
WO2008057497A2 (en) * 2006-11-02 2008-05-15 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
US8273747B2 (en) 2006-11-02 2012-09-25 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
TWI433674B (zh) 2006-12-28 2014-04-11 Infinity Discovery Inc 環杷明（ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ）類似物類
CN104059124A (zh) 2007-12-27 2014-09-24 无限药品股份有限公司 立体选择性还原的方法
US8193182B2 (en) 2008-01-04 2012-06-05 Intellikine, Inc. Substituted isoquinolin-1(2H)-ones, and methods of use thereof
BRPI0906351A2 (pt) * 2008-01-29 2019-09-24 Novartis Ag uso de agonistas hedgehog no tratamento de distúrbios relacionados ao musculoesquelético
CN101597280B (zh) 2008-08-19 2013-06-05 北京大学深圳研究生院 用作七次穿膜蛋白抑制剂的基于sag结构的化合物
KR101799114B1 (ko) * 2009-06-17 2017-11-17 아데란스 리서치 인스티튜트 인코포레이티드 진피세포의 트리코겐 효능을 증가시키기 위한 방법 및 조성물
FR2948367A1 (fr) 2009-07-24 2011-01-28 Centre Nat Rech Scient Derives d'acyl-guanidines modulateurs de la voie de signalisation des proteines hedgehog
WO2011017551A1 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic transamination of cyclopamine analogs
CN103002738A (zh) 2010-05-21 2013-03-27 英特利凯恩有限责任公司 用于激酶调节的化学化合物、组合物和方法
US9376447B2 (en) 2010-09-14 2016-06-28 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Transfer hydrogenation of cyclopamine analogs
CN103298474B (zh) 2010-11-10 2016-06-29 无限药品股份有限公司 杂环化合物及其用途
FR2967498B1 (fr) 2010-11-16 2015-01-02 Centre Nat Rech Scient Utilisation de derives de quinolinone comme outil de recherche
NZ612909A (en) 2011-01-10 2015-09-25 Infinity Pharmaceuticals Inc Processes for preparing isoquinolinones and solid forms of isoquinolinones
US8969363B2 (en) 2011-07-19 2015-03-03 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
MX2014000648A (es) 2011-07-19 2014-09-25 Infinity Pharmaceuticals Inc Compuestos heterociclicos y sus usos.
TW201311663A (zh) 2011-08-29 2013-03-16 Infinity Pharmaceuticals Inc 雜環化合物及其用途
FR2980477B1 (fr) 2011-09-23 2013-10-18 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes modulateurs de la voie de signalisation des proteines hedgehog, leurs formes marquees, et applications
WO2013049332A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of monoacylglycerol lipase and methods of their use
GB201201298D0 (en) 2012-01-26 2012-03-07 Universitat Leipzig Therapeutic use of activators of zinc finger protein gli3
US8940742B2 (en) 2012-04-10 2015-01-27 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
SI2914296T2 (sl) 2012-11-01 2022-01-31 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Zdravljenje raznih vrst raka z uporabo modulatorjev izooblik PI3-kinaze
US9844541B2 (en) 2012-11-29 2017-12-19 Strasspharma, Llc Methods of modulating follicle stimulating hormone activity
WO2014151386A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Salts and solid forms of isoquinolinones and composition comprising and methods of using the same
US9192609B2 (en) 2013-04-17 2015-11-24 Hedgepath Pharmaceuticals, Inc. Treatment and prognostic monitoring of proliferation disorders using hedgehog pathway inhibitors
SG11201509842SA (en) 2013-05-30 2015-12-30 Infinity Pharmaceuticals Inc Treatment of cancers using pi3 kinase isoform modulators
NZ718430A (en) 2013-10-04 2021-12-24 Infinity Pharmaceuticals Inc Heterocyclic compounds and uses thereof
US9751888B2 (en) 2013-10-04 2017-09-05 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
WO2015061204A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
AU2015231413B2 (en) 2014-03-19 2020-04-23 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds for use in the treatment of PI3K-gamma mediated disorders
US20150320754A1 (en) 2014-04-16 2015-11-12 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies
WO2015168079A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Pyrimidine or pyridine derivatives useful as pi3k inhibitors
US9708348B2 (en) 2014-10-03 2017-07-18 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Trisubstituted bicyclic heterocyclic compounds with kinase activities and uses thereof
WO2016142427A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method ank kit for reprogramming somatic cells
AU2016271468B2 (en) 2015-06-04 2020-01-02 Sol-Gel Technologies Ltd. Topical formulations for delivery of hedgehog inhibitor compounds and use thereof
US20170231968A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 PellePharm, Inc. Method for relief of and treatment of pruritus
WO2017214269A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
JP7054681B2 (ja) 2016-06-24 2022-04-14 インフィニティー ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 組合せ療法
EP3562827A1 (de) 2016-12-30 2019-11-06 Frequency Therapeutics, Inc. 1h-pyrrol-2,5-dion-verbindungen und verfahren zur verwendung davon zur induktion der selbsterneuerung von unterstützenden stamm-/vorläuferzellen

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6022708A (en) * 1998-02-26 2000-02-08 Genentech, Inc. Fused
US20030083242A1 (en) * 1998-11-06 2003-05-01 Alphonse Galdes Methods and compositions for treating or preventing peripheral neuropathies
US6291516B1 (en) * 1999-01-13 2001-09-18 Curis, Inc. Regulators of the hedgehog pathway, compositions and uses related thereto
KR20020014797A (ko) * 1999-05-17 2002-02-25 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 글루카곤 길항제/역 아고니스트
AU780846B2 (en) * 1999-09-16 2005-04-21 Curis, Inc. Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto
DE60027749T3 (de) * 1999-10-14 2012-01-19 Curis, Inc. Vermittler von "hedgehog" übermittelnden bahnen, dazugehörige zusammenetzungen und verwendungen

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Publication number Publication date
DE60113823T2 (de) 2006-07-20
ES2250377T5 (es) 2010-04-06
DK1272168T3 (da) 2006-02-13
CA2404413C (en) 2015-10-20
DE60113823D1 (de) 2006-02-16
JP4808895B2 (ja) 2011-11-02
WO2001074344A3 (en) 2002-05-23
ATE305786T1 (de) 2005-10-15
AU4966401A (en) 2001-10-15
ES2250377T3 (es) 2010-03-29
EP1272168B2 (de) 2009-10-28
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