KR101799114B1 - 진피세포의 트리코겐 효능을 증가시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
진피세포의 트리코겐 효능을 증가시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 배양에서 세포의 트리코게니시티를 증가시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 한 실시예는 처리되지 않은 분리된 포유동물 진피세포에 비해 분리된 포유동물 진피세포의 트리코게니시티를 증가시키기 위해서, 유효량의 1종 이상의 소닉 헤지호그(Shh) 경로 효능제의 존재하에 시험관 내에서 분리된 포유동물 진피세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 세포 배양물은 임의선택적으로 표피세포를 함유한다. 바람직한 Shh 효능제에는 큐리스 인코포레이션으로부터 시중 구입가능한 CUR-0236715 및 CUR-0201365가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 트리코게니시티는 아더란스 헤어 패치 분석(Aderans Hair Patch AssayTM)을 이용하여 측정된다. 배양된 진피세포는 수확 전에 적어도 1일 내지 7일 이상 동안 1종 이상의 Shh 효능제 존재 하에 배지 속에서 유지될 수 있다. 처리된 배양 진피세포는 모낭 형성을 유도하기에 효과적인 양으로 이식시킴으로써, 포유동물 대상, 바람직하게는 인간의 탈모를 치료하는데 사용될 수 있다.
Description
본 출원은 2009년 6월 17일 출원된 미국 가출원 제 61/187,894 호 및 2009년 7월 22일 출원된 미국 가출원 제 61/227,540 호에 대해 그 이익 및 우선권을 청구하며, 이들 특허 출원서는 본 명세서에서 참고문헌으로 기재되어 있다.
본 발명은 진피세포의 트리코겐 효능(trichogenic potency)을 증가시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것으로, 특히 소닉 헤지호그 경로(sonic hedgehog pathway)를 활성화 또는 자극시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
탈모(hair loss) 또는 탈모증(alopecia)은 연령과 상관없이 남성 및 여성에 있어서 공통적인 문제이다. 탈모에는 예를 들어, 안드로겐 탈모증(androgenetic alopecia), 원형탈모증, 휴지기 탈모증(telogen effluvium), 또는 갑상선 질환, 약물 부작용 및 영양 결핍 상태와 같은 체계성 의학적 문제로 인한 탈모 뿐만 아니라, 두피나 모발 외상, 원판상 홍반성 낭창(discoid lupus erythematosus), 편평 태선(lichen planus), 및 구조적 모간 이상으로 인한 탈모 등 여러 유형이 있다(Hogan and Chamberlain, South Med J, 93(7): 657-62 (2000)). 안드로겐 탈모증은 가장 일반적인 탈모의 원인으로, 심한 탈모 가족력이 있는 대상자의 약 50%를 차지한다. 안드로겐 탈모증은 3가지 상호의존적인 인자, 즉 남성 호르몬인 디하이드로테스토스테론(DHT), 유전적 소인 및 연령 증가에 의해 유발된다. 유전적으로 민감한 숙주 DHT는 모낭(hair follicle)의 축소화를 유발함으로써, 모발을 약화시키고 모낭 성장 주기의 첫 단계인 성장기(anagen phase)를 단축시킨다. 또 시간이 흐름에 따라, 긴 모간은 탈락되고 그 자리에 매우 짧고 가는 모간이 대체됨으로써, 다량의 탈모가 초래된다.
가능한 탈모 치료 방법에는 인조 모발, 시술, 국소용/경구용 약물 치료 등이 있다((Hogan and Chamberlain, 2000; Bertolino, J Dermatol, 20(10): 604-10 (1993)). 미녹시딜, 피나스테라이드(finasteride) 및 듀타스테라이드(dutasteride)와 같은 약물은 남성형 탈모의 치료에 있어서 상당한 진전을 이루었지만, 그 작용이 일시적이고 치료를 중단한 후에는 모발이 탈락된다는 점이 큰 한계점이다(Bouhanna, Dermatol Surg, 29(11): 1130-1134 (2003); Avram, et al., Dermatol Surg, 28: 894-900 (2002)). 이러한 면에서 볼 때, 모발 복원 시술, 및 조직 공학(tisseue engineering) 만이 영구적인 남성형 대머리 치료법이 될 수 있다. 모발 이식술로 인한 결과는 다양할 수 있다. 초기 공여 펀치 기법은 이식받은 부위(recipient area)에 걸쳐 매우 부자연스러운 "인형머리카락 룩" 또는 "논(paddy field) 룩"을 종종 연출한다. 예를 들어, 단일 모낭 이식피부 또는 1 mm 펀치와 같은 모발 이식술에서 진전이 이루어지고 있으나, 그 절차가 시간 및 비용이 많이 들고, 대상 환자에 대한 공여자 모낭의 수가 제한적이다.
탈모 치료를 위한 조직/세포 공학은 모낭 형성 및 그 이후의 모간 형성을 유도하기 위해 대상 부위에 세포를 이식시키는 단계를 포함한다. 이론적으로, 조직/세포 공학은 다양한 질환, 증후군 및 상해로 인한 탈모를 치료하는데 이용될 수 있다. 모낭 유도 및 성장은 활성적이고 연속적인 상피-중간엽 상호작용(epithelial mesenchymal interaction)과 관련이 있다(Stenn & Paus, Physiol Reviews, 81: 449-494, (2001)). 배아에 있어서, 초기 모낭은 원시 표피가 두꺼워지면서부터 성장하는데 이는 표피 그 자체 및 그 밑에 있는 진피에서 발생하는 미세 조정 신호에 의해 제어된다. 성숙한 설치류의 모낭을 사용한 초기 연구(Cohen, J Embryol Exp Morphol, 9: 117-127 (1961))에서, 모낭, 모낭유두(follicular papilla) 또는 진피유두의 절개된 깊은 중간엽 부위를 성인 표피에 이식하면 새로운 모낭을 유도할 수 있다는 사실이 알려졌다. 이러한 강력한 조직 유도는 모유두 및 결직초(dermal sheath)의 세포의 독특한 특성 때문인 것으로 생각된다(McElwee et al., J Invest Dermatol, 121: 1267-1275 (2003)).
다수의 연구에서, 모낭 형태발생(Wang, L.C., et al., J Invest Dermatol, 114: 901-908 (2000); Mill et al., Genes Dev, 17: 282-294(2003); Lehman, J Invest Dermatol, 129: 438-448 (2009); St Jacques, B., Current Biology, 8: 1058-1068(1998)) 및 모발 주기의 진행(Oro, A.E., & Higgins, K., Dev Biol, 255: 238-248 (2003); Paladini, R.D., et al., J Clin Invest Dermatol, 125: 638-646 (2005); Sato, N., et al., J Natl Cancer Inst, 93: 1858-1864(2001))은 소닉 헤지호그(Shh) 신호전달에 의존한다는 사실이 알려졌다. Shh 경로가 차단되면(항체를 이용하여), 모낭 형성은 이루어지지 않는다(Wang, L.C., et al., J Invest Dermatol, 114: 901-908 (2000)). 손상되지 않은 그대로의 Shh를 휴지기 피부 속에 주입하면, 아나겐(성장기의 굵은) 모발 성장이 개시된다(Sato, N., et al., J Clin Invest Dermatol, 104: 855-864 (1999)). 후자의 경우, 합성 Shh 효능제를 사용하는 때에도 달성된다(Paladini, R.D., et al., J Clin Invest Dermatol, 125: 638-646 (2005)).
Shh 경로의 구성요소는 상피 및 진피 성분 내에서 발현된다. 따라서 진피세포가 모낭 형태발생 및 주기에 중요한 역할을 하기 때문에, 진피세포의 트리코게니시티(trichogenicity)를 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 환자의 탈모를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 배양에서 진피세포의 트리코게니시티를 증가 또는 유지시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진피세포의 트리코게니시티를 증가 또는 유지시키기 위해 Shh 신호 변환 경로를 활성화 또는 자극시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상자의 모낭 형성을 유도하기 위해 트리코겐성 진피세포를 형성시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 배양에서 진피세포의 트리코게니시티를 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 한 실시예에 있어서, 시험관 내에서 유효량의 1종 이상의 소닉 헤지호그(Shh) 경로 효능제의 존재하에 분리된 포유동물 진피세포를 배양한다. 이 효능제는 처리되지 않은 분리된 포유동물 진피세포에 비해, 분리된 포유동물 진피세포의 트리코게니시티를 증가시키기 위해서 신호 변환 경로를 활성화하기 위해 Shh 경로의 어느 지점에서도 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 효능제는 활면화(Smoothened)되어 Shh 경로의 신호 변환자로 될 수 있다. 세포 배양물은 임의선택적으로 표피세포를 함유할 수 있다. 바람직한 Shh 경로 효능제 또는 활면화된 효능제에는 큐리스 인코포레이션((Curis Inc.)에서 구입할 수 있는 CUR-0201365 및 CUR-0236715가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 트리코게니시티는 아더란스 헤어 패치 분석(Aderans Hair Patch AssayTM)을 이용하여 측정된다. 배양된 진피세포는 1종 이상의 Shh 경로 효능제의 존재하에, 수확 이전 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상 동안 배양물 내에서 유지될 수 있다.
이 처리된 진피세포는 포유동물 대상, 바람직하게는 인간의 탈모를 치료하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료가 필요한 대상으로부터 피부 조직 외식편(explant)을 얻는다. 이 외식편을 처리하여 세포 현탁액으로 세포를 분리시킨 후에, 1종 이상의 Shh 경로 효능제의 존재하에 배양시킨다. 한 실시예에서, 세포를 7일 이상 동안 배양한 후에, 이 세포를 대상자의 피부에 이식한다. 세포는 자기유래 세포인 것이 바람직하지만, 동종이계 세포도 가능하다는 점은 높게 인정받아야 할 것이다. 유효량의 배양된 진피세포를 대상자의 피부에 이식함으로써 모낭을 형성시키거나 모낭 형성을 유도할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 분리된 진피세포군은 아더란스 헤어 패치 분석에 의해 측정시, 비처리된 세포에 비해 트리코게니시티가 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30% 이상 300% 까지 증가되었다. 처리된 세포는 아더란스 헤어 패치 분석에 의해 측정시, 동일량의 비처리된 세포에 비해 모낭 수가 약 3배가 되었다.
일부의 경우, 세포가 배양물 내에서 유지되는 경우 배양된 진피세포의 트리코게니시티가 감소되는 것이 관측되었다. 이는 세포를 유효량의 1종 이상의 Shh 경로 효능제의 존재하에 배양함으로써 트리코게니시티의 감소를 방지하거나 그 감소량을 줄일 수 있다는 것이 밝혀졌다. 바람직하게, 진피세포의 트리코게니시티 레벨은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 패시지 후에 유지된다.
도 1은 소닉 헤지호그(Shh) 경로 효능제 B(CUR-0236715)로 처리된 진피세포 속의 h-GLi1 및 h-PTCH1의 발현량 배수 변화를 보여주는 그래프이다. "P"는 세포 패시지를 의미한다. 세포는 한 디쉬 내에서 일정시간 동안 성장한다. 세포가 두번째 디쉬로 이동되었을 때, 그 세포는 패스된 것으로 간주한다. 첫 번째 세포 플레이팅은 패시지 0(P0)로 간주한다. 세포가 디쉬로부터 이동되어 새 용기로 패스되면, 그 패시지가 P1이다. 세포 배양 시간은 종종 패시지 수에 의해 기재된다.
도 2A는 아더란스 헤어 패치 분석시, 효능제 A(CUR-201365)로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 2B는 하이브리드 패치 분석시, 배양에서 1 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 2C는 아더란스 헤어 패치 분석시, 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 2D는 아더란스 헤어 패치 분석시, 배양에서 3 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 2E는 아더란스 헤어 패치 분석시, 배양에서 4 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
도 3A는 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포의 세포수 2배 증가 기간(population doubling time)을 보여주는 그래프이다. 도 3B는 합류점에서 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포의 세포수(밀리온)를 보여주는 그래프이다.
도 4A는 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포를 사용한 하이브리드 패치 분석에서 형성된 평균 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 4B는 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포를 사용한 아더란스 헤어 패치 분석에서 형성된 평균 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
도 5A는 배양에서 1 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포를 사용한 플라스크 속의 평균 세포 수(밀리온)를 보여주는 그래프이다. 도 5B는 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포를 사용한 플라스크 속의 평균 세포 수(밀리온)를 보여주는 그래프이다. 도 5C는 배양에서 1 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포의 세포수 2배 증가 기간(일)을 보여주는 그래프이다. 도 5D는 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포의 세포수 2배 증가 기간(일)을 보여주는 그래프이다.
도 6A는 세포 배양에서 1 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 단기간 동안(수확전 7일 동안) 지속적으로 처리된 진피세포를 사용한 아더란스 헤어 패치 분석에서 형성된 평균 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 6B는 세포 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 단기간 동안(수확전 7일 동안) 지속적으로 처리된 진피세포를 사용한 아더란스 헤어 패치 분석에서 형성된 평균 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
도 7은 아더란스 헤어 패치 분석시, 인간의 태아 세포 배양물 대 제시된 세포 배양 패시지 P0, P1, P2 또는 P3에서 Shh 경로 효능제로 처리된 세포 배양물에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 각 패시지에 대해 한 쌍의 막대 그래프가 도시되어 있는데, 왼쪽 막대 그래프는 세포를 효능제로 처리하지 않았을 때 도출되는 결과이고 오른쪽 막대 그래프는 효능제로 처리된 세포에서 도출되는 결과를 보여준다.
도 8은 아더란스 헤어 패치 분석시, 제시된 세포 배양 패시지에서, 처리되지 않은 또는 처리된 인간의 태아 세포 배양물로부터 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
도 9는 아더란스 헤어 패치 분석시, 제시된 배지 내에서 인간의 태아 세포 배양물로부터 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
도 2A는 아더란스 헤어 패치 분석시, 효능제 A(CUR-201365)로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 2B는 하이브리드 패치 분석시, 배양에서 1 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 2C는 아더란스 헤어 패치 분석시, 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 2D는 아더란스 헤어 패치 분석시, 배양에서 3 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 2E는 아더란스 헤어 패치 분석시, 배양에서 4 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
도 3A는 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포의 세포수 2배 증가 기간(population doubling time)을 보여주는 그래프이다. 도 3B는 합류점에서 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포의 세포수(밀리온)를 보여주는 그래프이다.
도 4A는 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포를 사용한 하이브리드 패치 분석에서 형성된 평균 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 4B는 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포를 사용한 아더란스 헤어 패치 분석에서 형성된 평균 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
도 5A는 배양에서 1 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포를 사용한 플라스크 속의 평균 세포 수(밀리온)를 보여주는 그래프이다. 도 5B는 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포를 사용한 플라스크 속의 평균 세포 수(밀리온)를 보여주는 그래프이다. 도 5C는 배양에서 1 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포의 세포수 2배 증가 기간(일)을 보여주는 그래프이다. 도 5D는 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 처리된 진피세포의 세포수 2배 증가 기간(일)을 보여주는 그래프이다.
도 6A는 세포 배양에서 1 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 단기간 동안(수확전 7일 동안) 지속적으로 처리된 진피세포를 사용한 아더란스 헤어 패치 분석에서 형성된 평균 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 도 6B는 세포 배양에서 2 패시지 후에 제시된 양의 Shh 경로 효능제로 단기간 동안(수확전 7일 동안) 지속적으로 처리된 진피세포를 사용한 아더란스 헤어 패치 분석에서 형성된 평균 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
도 7은 아더란스 헤어 패치 분석시, 인간의 태아 세포 배양물 대 제시된 세포 배양 패시지 P0, P1, P2 또는 P3에서 Shh 경로 효능제로 처리된 세포 배양물에서 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다. 각 패시지에 대해 한 쌍의 막대 그래프가 도시되어 있는데, 왼쪽 막대 그래프는 세포를 효능제로 처리하지 않았을 때 도출되는 결과이고 오른쪽 막대 그래프는 효능제로 처리된 세포에서 도출되는 결과를 보여준다.
도 8은 아더란스 헤어 패치 분석시, 제시된 세포 배양 패시지에서, 처리되지 않은 또는 처리된 인간의 태아 세포 배양물로부터 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
도 9는 아더란스 헤어 패치 분석시, 제시된 배지 내에서 인간의 태아 세포 배양물로부터 형성된 모낭 수를 보여주는 그래프이다.
I. 정의
본 명세서에서 "트리코겐성 세포(trichogenic cell)"라는 용어는 대상의 피부에 투여했을 때 모낭 형성을 유도하는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "분리된" 이라는 용어는 세포가 자연적으로 발생하는 것과 다른 환경에 존재하는, 예를 들어 진피세포를 피부 외식편으로부터 분리함으로써 그 자연적 환경으로부터 격리된 세포를 의미한다.
"개체", "숙주", "대상" 및 "환자"라는 용어는 본 명세서에서 상호 대체해서 사용할 수 있으며, 쥐과, 유인원, 인간, 포유류 가축, 포유류 스포츠 동물 및 포유류 애완동물 등(이에 국한되는 것은 아님)을 포함한 포유 동물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"이라는 용어는 모낭 형성을 유도하거나, 연모(vellus hair)에서 성모(terminal hair)로 되도록 유도하거나, 모발 축소화 과정의 역행을 유도함으로써 성모가 되게 하기에 충분한 세포의 양을 의미한다. 세포 배양에서, 헤지호그 효능제의 "유효량"은 배양된 진피세포의 트리코게니시티를 증가 또는 유지시키는 양으로서 진피세포에 대한 시험관 내 배양 프로토콜의 일부로서 적용되는 효능제의 양을 의미한다. 바람직한 진피세포는 진피세포를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 세포로는 포유동물 세포가 바람직하며, 보다 바람직한 세포는 인간의 세포이다.
본 명세서에서, "피부"라는 용어는 신체 표면을 덮고 있는 외부 보호층을 의미하는 것으로, 진피, 표피 및 피하조직을 포함하며, 또한 땀샘 및 피지샘 뿐만 아니라 모낭 조직도 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서에서, "헤지호그 효능제" 또는 "소닉 헤지호그 효능제" 라는 용어는 헤지호그의 생체활성(bioactivity)을 증가 또는 재현시키는, 예를 들어 타겟 유전자의 전사를 활성화시키는 작용제를 의미한다.
본 명세서에서, "진피세포" 또는 "진피세포군" 이라는 용어는 진피세포를 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 함유하는 세포군을 의미한다. 진피세포 식별 방법은 당해 분야에 알려져 있다.
본 명세서에서, "표피세포" 또는 "표피세포군" 이라는 용어는 표피세포를 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 함유하는 세포군을 의미한다. 표피세포 식별 방법은 당해 분야에 알려져 있다.
II.
소닉
헤지호그
신호전달
노랑초파리(Drosophila melanogaster) 헤지호그 돌연변이체가 매우 유명한데, 그 이유는 이 돌연변이체의 표현형이 일반적으로 확장이 없는 유충 세그먼트의 돌출된 표피 스파이크를 가졌기 때문이다. 포유 동물에 있어서 분비 당단백질의 헤지호그(Hh) 단백질군은 적어도 세가지 부류, 즉, 소닉 헤지호그(Shh), 데저트 헤지호그(Dhh) 및 인디언 헤지호그(Ihh)를 포함한다.
헤지호그(Hh) 단백질은 배아 발생과정에서 많은 조직의 모르포겐이며, 세포간 신호전달에 있어서 중요한 매개자이다. 헤지호그 경로는 배아 및 성체의 세포 패터닝, 분화, 증식, 생존 및 성장을 조절하는데 있어서 중요하다. 척추동물 헤지호그 단백질은 뉴런 발달, 림프 발달, 폐, 뼈, 모낭 및 소화기관 형성 과정에서 다수의 상피-중간엽 유도성 상호작용에 매우 중요하다.
Hh 경로의 신호전달은 Shh가 그 수용체인 패치드(Ptc), 즉 12-트랜스맴브레인 도메인 단백질에 결합되면서 개시된다. 포유 동물 게놈은 2개의 패치드 유전자, 즉, ptc1 및 ptc2를 포함한다. Shh가 존재하지 않는 경우, Ptc는 7-트랜스맴브레인 단백질 스무드(Smo)의 활성을 억제시킨다. Shh이 존재하여 이것이 Ptc에 결합되는 경우, Smo의 억압은 중단되고 퓨즈드(Fu), 즉 세린-트레오닌 키나제의 활성화, 및 미세관-관련 Fu-Gli-Su(fu) 복합체[Su(fu): 퓨즈드의 억제제]로부터 포유동물 Gli 군(가슴줄 초파리의 Ci에 해당)의 아연 핑거 전사 인자의 분리를 유도한다. Gli 전사 인자에는 Gli1, Gli2 및 Gli3가 있다. Shh는 Gli3에 의해 억제자의 형성을 방해하지만, Gli2에 의해서는 아니다. 이러한 전사 인자는 핵으로 전위하고, 타겟 유전자 전사를 유도한다. Gli1 및 Ptc1을 포함하는 경로의 멤버는 그들 자신이 전사 타겟이다.
A.
소닉
헤지호그
Shh는 뇌, 심장, 폐, 골격 및 피부를 포함한 척추동물 기관의 패턴 형성에 관여한다(Sato, N., et al., J Clin Investigation, 104(7): 855-864). 피부에 있어서, Shh는 배발생(embryogenesis)과정 동안 모낭 형태발생 및 성체의 모낭 성장 및 주기 조절에 필요하다(Paladini, R.D., et al., J Clin Invest Dermatol, 125: 638-646 (2005)). 출산 직후 마우스 피부에서의 일시적인 Shh 과다발현은 모낭의 성장기(anagen growth phase)의 개시를 유발한다(Sato, N., et al., J Clin Investigation, 104(7): 855-864); Sato, N., et al., J National Cancer Inst, 93(24): 1858-1864(2001)).
Shh의 발현은 마우스, 랫 및 병아리의 경우 추정 중앙선 중배엽인 관절, 제브라피쉬(zebrafish)의 경우 실드의 장배형성 개시 이후에 시작된다. 병아리 배아의 경우, 관절의 Shh 발현 패턴은 좌우대칭으로 발달한다.
CNS에 있어서, 척색 및 플로어플레이트의 Shh가 배 세포 운명을 유도하는 것으로 보인다. Shh는 이소적으로(ectopically) 발현되는 경우, 마우스, 아프리카발톱 개구리(Xenopus) 및 제브라피쉬에 있어서 중뇌 및 후뇌의 많은 부위의 조직화를 유도한다. 척수 레벨의 중앙 신경외배엽의 외식편에 있어서, Shh 단백질은 전혀 다른 농도 역치에서 플로어플레이트 및 모터 뉴런 발달을 유도하는데, 고농도에서는 플로어플레이트 뉴런, 저농도에서는 모토 뉴런의 발달을 유도한다. 또한 항체 차단법은 척색에 의해 생성되는 Shh가 척색을 매개로 하는 모터 뉴런 운명의 유도에 필요하다는 것을 시사한다. Shh를 생성하는 중앙선 세포 표면의 고농도 Shh는 시험관 내에서 관찰되는 플로어플레이트의 접촉-매개 유도 및 생체 내에서 상기 척수 바로 위의 플로어플레이트의 중앙선 위치화에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 척수 및 플로어플레이트로부터 생성되는 저농도 Shh는 시험관 내에서 접촉과 무관한 것으로 알려진 과정에서 더욱 뚜렷한 배외측(ventrolateral) 부위에서 모터 뉴런을 유도하는 것으로 추측된다. 또한 중뇌 및 전뇌 레벨에서 취한 외식편에서, Shh는 각각 적절한 배외측 뉴런세포 유형인 도파민 및 콜린 전구체를 유도하는데, 이는 Shh가 CNS 전체 길이에 걸친 배 세분화의 공통적인 유도자라는 것을 시사한다. 이러한 관찰 내용은 Shh에 대한 차별적인 반응이 특정 복배의 위치에서 어떻게 조절되는지에 관한 의문을 제기하게 한다.
또한 중앙선의 Shh는 척추동물 배아의 근축 영역(paraxial region), 줄기의 체절, 체절의 두부 간엽 문측을 패턴화한다. 병아리 및 마우스 근축 중배엽 외식편에 있어서, Shh는 피부근육분절 마커 Pac3의 희생으로 Pax1 및 Twist와 같은 골분절(sclerotome) 특이적 마커의 발현을 촉진한다. 더욱이, 필터 배리어 실험은 Shh가 2차적 신호전달 메카니즘의 활성화에 의해서 보다는 직접적으로 골분절의 유도를 매개한다는 것을 시사한다. 또한, 일부 실험으로부터 WNT 족의 멤버인 노랑초파리 윙레스(wingless)의 척추동물 상동기관이 동시에 필요한 것으로 밝혀졌으나, Shh는 근육분절 유전자 발현을 유도한다.
B. 인디언
헤지호그
Ihh는 연골형성 발달의 조절에 중요한 역할을 한다. 연골 형성과정 동안, 연골세포는 증식 상태로부터 중간상태인 선비대 상태를 거쳐서, 분화된 비대 연골세포로 진행한다. Ihh는 선비대 연골세포 내에 발현되어 연골세포 분화의 차단을 유발하는 신호전달 단계반응을 개시한다. 직접적인 타겟은 Ihh 발현 도메인 주위의 연골막이며, 이것은 Gli 및 Ptc의 발현에 의해 반응한다. 마찬가지로, Ihh는 2차 신호전달을 유도함으로써 관절주위의 연골막의 파라티로이드 호르몬-관련 단백질(PTHrP)의 합성을 유발하게 된다. PTHrP 자체는 선비대 연골세포로 되돌아 가도록 신호를 보냄으로써, 더 이상의 분화가 발생되는 것을 차단한다. 동시에, PTHrP는 Ihh의 발현을 억제함으로써, 음성 피드백 루프를 형성하여 연골세포 분화 속도를 조절하게 된다.
C.
데저트
헤지호그
데저트 헤지호그(Dhh)는 발현 측면에서 가장 제한적이며, Dhh없는 마우스가 생존가능하다. 테스트에서, Dhh는 마우스 배아 발달에서 및 성체 설치류 및 인간에게서 주로 발현된다. 남성 성분화와 관련있는 Dhh 유전자 및 그 쥐 상동기관의 중요성에 대해서는 여러 연구문헌에 발표되어 있다(Bitgood and McMahon, Dev Biol, 172: 126-138(1995); Bitgood, M.J., et al., Curr Biol, 6: 298-304(1996). 한 연구문헌(Clark, A.M., et al., Biol Reprod, 63: 1825-1838(2000))은 대부분의 Dhh없는 수컷 마우스가 반양성(pseudohermaphrodite)으로 발달한다고 보고하고 있다. 다른 연구문헌은 세관주위 유사근육세포 분화 및 그 후속적인 고환삭(testis cord)의 형성이 Dhh에 의해 조절된다고 발표하였다(Pierucci-Aves, F., et al., Biol Reprod 65: 1392-1402(2001)). 또한, Dhh/Ptc1 신호전달이 태아 고환의 스테로이드-생성 레히디히 세포(leydig cell) 분화의 양성 조절자라는 점이 밝혀졌다(Yao, H., et al., Genes Dev, 161433-1440 (2002)). 인간에 관한 연구문헌(Umehara, F., et al., Am J Hum Denet, 67: 1302-1305(2000))에는, 다발성 신경병증과 관련한 46, XY 부분 생식선 형성이상증(gonadal dysgenesis)을 가진 한 환자의 Dhh 유전자의 동형적합성(homozygous) 미스센스 돌연변이(missense mutation)에 대해 보고되어 있다. 이와 마찬가지로, 46, XY 완전 순수 생식선 형성이상증(PGD)을 가진 3명의 환자의 Dhh 유전자의 동형적합성 돌연변이에 대해서도 보고되어 있다(Canto, P., et a., J Clin Endocrinol Metab, 89: 4480-4483 (2004)). 상기 문헌들 모두는 Dhh가 남성 생식선 분화에 관여하는 중요한 분자라는 점을 명시하였다.
II
.
소닉
헤지호그
신호 변환 경로
효능제
소닉 헤지호그 신호 변환 경로 효능제는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 본 참고사항으로 수록되어 있는 미국 특허 제 6,683,108 호(Baxter et al.)는 Shh의 비펩티딜 효능제 소분자에 대해 발표하고 있다. 또한 소닉 헤지호그 신호 변환 경로 효능제는 큐리스 인코포레이션(Curis, Inc.; Cambridge, MA)으로부터 시중 구입가능하다. 바람직한 Shh 경로 효능제에는 CUR-0236715 및 CUR-0201365가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 효능제의 일반 구조식은 미국 특허 제 6,683,108 호에 기술되어 있다. 바람직한 효능제는 하기의 구조를 가진다.
III
. 세포 배양에서
소닉
헤지호그
효능제의 사용
A. 세포 배양에서 트리코게니시티 증가
한 실시예는 처리되지 않은 분리된 포유동물 진피세포에 비해 분리된 포유동물 진피세포의 트리코게니시티를 증가시키기 위해서, 유효량의 소닉 헤지호그 경로 효능제의 존재하에 시험관 내에서 분리된 포유동물 진피세포를 배양함으로써 배양 세포의 트리코게니시티를 증가시키는 방법을 제공한다. 배양 세포는 인간의 진피세포인 것이 바람직하다. 한 실시예에서, Shh 경로 효능제는 0.125㎍/ml 내지 0.625㎍/ml의 범위 내에서 존재한다. 또 다른 실시예는 헤어 패치 분석에 의해 측정시 비처리된 세포에 비해 트리코게니시티가 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30% 증가된, 분리된 진피세포군을 제공한다.
바람직하게 외편식 조직으로부터 유도되는 진피세포군은 상기 언급된 1종 이상의 Shh 경로 효능제와 접촉시킴으로써 시험관 내에서 지속(perpetuate)시킬 수 있으며, 비처리된 세포에 비해 트리코게니시티를 증가 또는 유지시킬 수 있다. 특정 실시예에서는, 진피세포와 표피세포의 배합물을 공동배양(co-culture)시킨다. 바람직한 Shh 경로 효능제에는 큐리스 인코포레이션(Curis, Inc.; Cambridge, MA)으로부터 시중 구입가능한 CUR-0236715 및 CUR-0201365가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 일반적으로, 배양 방법은 포유동물로부터 진피세포를 분리시키고, 이 세포를 시험관 내에서, 바람직하게 성장 인자, 영양제, 보조인자 및 당해 분야에 잘 알려져 있는 통상적인 세포배양 첨가물 및/또는 보충재를 함유하는 성장 배지 속에서 지속시키는 단계를 포함한다. 그리고, 대상자, 바람직하게는 인간으로부터 외식편 조직을 확보한다. 일반적으로, 외식편 조직은 모낭을 포함하는 피부의 외식편이다. 외식편은 자기유래 세포일 수도 있고, 동종이계 세포일 수도 있다.
외식편 또는 공여자 조직의 세포는 개개의 세포로, 또는 소수의 세포로 구성된 응집체(aggregate)로 분리된다. 분리는 트립신이나 콜라게나제와 같은 효소로 처리하거나, 뭉툭한 도구 사용과 같은 물리적인 분리 방법에 의하거나, 조직으로부터 특정 세포 유형의 부산물을 얻을 수 있도록 외과용 메스로 민싱(mincing)하는 것을 포함하여 어떠한 공지의 절차를 이용해서도 달성될 수 있다.
분리된 세포는 세포 성장을 지원할 수 있는 어떠한 공지의 배양 배지 내에도 투입될 수 있으며, 이러한 배지에는 글루타민 및 기타 아미노산, 비타민, 무기질 및 트랜스페린과 같은 유용한 단백질 등의 세포 물질대사에 필요한 보충재를 함유하는 MEM, DMEM 및 RPMI, F-12 등이 있다. 배지는 또한 효모, 박테리아, 및 페니실린, 스트렙토마이신 및 젠타마이신과 같은 진균류로 오염되는 것을 방지하기 위해 항생물질을 함유할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 배지는 소, 말, 닭으로부터 유래된 혈청을 함유할 수 있다. 특히 바람직한 세포 배지는 DMEM과 F-12의 혼합물이다.
배양 조건은 생리학적 상태에 가까워야 한다. 배양 배지의 pH는 생리학적 pH에 가까워야 하며, 바람직하게는 pH 6-8, 보다 바람직하게는 약 pH 7, 특히 바람직하게는 약 pH 7.4이다. 세포는 생리학적 온도에 가까운 온도에서 배양되어야 하며, 바람직하게는 30℃-40℃, 보다 바람직하게는 32℃-38℃, 가장 바람직하게는 35℃-37℃이다.
세포는 현탁액 속에서 또는 기질 상에서 성장될 수 있다. 현탁액 세포가 번식(분열 또는 패시징으로도 불림)되면, 세포를 수확하여 저속에서 원심분리시킨다. 배지를 흡인시키고 세포를 소량의 성장인자 함유 배지 속에 재현탁시킨 다음, 세포를 기계적으로 분리하고 별도의 분취량의 세포 배지 속에 재현탁시킨다.
배지 속의 세포 현탁액에 세포 증식을 유발하는 성장인자를 보충시키고, 바람직하게 배양 플라스크 또는 롤러병 속에서 세포를 지속시킬 수 있는 용기 내에 파종(seeding)한다. 일반적으로 세포는 37℃에서 3-4일 내에 증식한다.
증식은 세포를 분리하거나 성장인자를 함유하는 새 배지 속에 재현탁시킴으로써 다시 시작될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 진피세포는 1종 이상의 Shh 효능제 존재하에 수확전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상 동안 배양된다.
B. 배양에서 트리코게니시티 유지
진피세포의 트리코게니시티는 배양시 세포 배지 내에 1종 이상의 Shh 효능제를 주입함으로써 유지될 수 있다. 한 실시예에서, 진피세포는 비처리된 세포에 비해, 세포 배양에서 적어도 1, 2, 3 또는 4 패키지 후에 트리코게니시티를 유지한다. 사실상, 세포가 더 이상 기능성을 가지지 않거나 성장 배지를 다 소모하여 사망하기 시작하기 전에 일정 플라스크 속에서 효과적으로 성장할 수 있는 특정 세포수가 존재한다. 한 플라스크가 그 용량에 도달하게 되면, 세포군을 여러 개의 플라스크 속으로 나누어 넣고 계대배양(sub-culture)시킨다. 이러한 과정을 패시징이라고 한다. 패시지 시점은 주관적으로 또는 실험적으로 결정될 수 있다. 실험실 규모에서는 배양 플라스크를 시각적으로 관찰함으로써 덮여진 플레이드의 면적, 세포 연결성 및 세포 분포을 평가한다.
한 실시예에서, 진피세포의 트리코게니시티 레벨은 유효량의 1종 이상의 Shh 경로 효능제의 존재하에 세포를 배양함으로써 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 패시지 후까지 유지된다. 진피세포의 트리코게니시티를 유지한다는 것은 대상자의 피부로 이식되었을 때 배양세포의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%가 모낭을 형성할 수 있거나 모낭 형성을 유도할 수 있는 능력을 가진다는 것을 의미한다.
또 다른 실시예에서, 진피세포의 트리코게니시티는 Shh 경로 효능제를 주입하지 않고 배양되는 진피세포에 비해 세포배양 동안 5%, 10%, 15% 또는 20%이상 증가한다.
C.
트리코게니시티
측정
진피세포군의 트리코겐 활성은 아더란스 헤어 패치 분석(Aderans Hair Patch AssayTM; Zheng, Y., J Invest Dermato, 124:867-876(2005))을 이용함으로써 결정될 수 있다. 이 분석에서, 분리된 진피세포 및 표피세포를 면역부전(immunoincompetent) 마우스의 진피 또는 피하조직에 이식한다. 이 분석에서, 갓 태어난 마우스 피부세포를 사용하면, 일반적으로 8일 내지 10일 이내에 새 모낭이 형성된다. 새로 형성된 모낭은 정상적인 모간, 성숙한 피지선 및 자연적인 모낭 주기를 명백하게 나타낸다. 이 분석에서 정상적인 모낭 주기가 형성되지만, 이 분석은 주로 세포 또는 세포 혼합물이 새 모낭을 형성하는 능력을 측정한다. 마우스의 진피세포는 마우스의 신생아 표피세포와 함께 분석된다.
IV
. 트리코게니시티가 향상된 진피세포의 사용방법
A. 모낭 유도
상술한 방법을 이용하여 향상된 트리코겐 활성을 갖는 진피세포는 대상자의 새로운 모낭을 형성시키는데 사용될 수 있다. 향상된 트리코겐 특성을 갖는 진피세포 이식 대상에는 모발 수가 부족하거나 모발 성장 속도가 느린 어떠한 대상도 포함된다. 적합한 대상에는 남성형 탈모증, 특정 원인에 의한 상처, 원형탈모증, 휴지기 탈모증, 갑상선 질환, 영양 결핍, 원판상 홍반성 낭창, 편평 태선, 유전으로 인한 또는 모발 성장을 감소시키거나 탈모를 유발하는 호르몬 이상으로 인한 대머리인 대상이 포함된다. 대상자는 유전적인 요인, 행동적 또는 환경적인 성향이나 다른 인자를 근거로 할 때, 상기 상태에 있거나 상기 상태로 진행될 위험이 있다. 또 다른 적합한 대상에는 모발 성장 저하 또는 탈모를 초래하는 화학요법 또는 방사선 요법과 같은 치료를 받는 대상이 포함된다. 또 다른 적합한 대상에는 두피 또는 모발 외상이 있거나, 구조적인 모간 이상이 있거나, 또는 피부 이식과 같은 외과수술을 받아서 피부 부위에 모발 성장이 필요한 대상이 포함된다. 또 다른 적합한 대상에는 모발이 필요한 부위에 피부 상처가 있는 대상이 포함된다. 이러한 상처는 외상, 화상, 수술, 방사선, 유전적 이상, 선천성 손실 등으로 인한 것이다.
진피세포 및 임의선택적인 표피세포는 대상자의 모발 성장의 개선을 원하는 부위에 이식될 수 있다. 바람직한 이식 위치는 대상자의 두피, 얼굴 또는 눈썹 부위이다.
대상자에 이식되는 세포는 자기유래 세포일 수도 있고, 동종이계 또는 이종발생 세포일 수도 있다. 한 실시예에서, 진피세포 및 표피세포는 단일성 동종이계 공여자의 피부 섹션으로부터 확보될 수도 있고, 자기유래 세포일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 진피세포 및 표피세포는 하나 이상의 공여자의 피부 섹션으로부터 확보된다. 예를 들어, 진피세포는 한 공여자로부터 유래되고 표피세포는 또 다른 공여자로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 이식되는 세포는 자기유래 세포이다.
진피세포 및 표피세포는 임의선택적으로 대상자에 이식되기 이전에 적절한 비율로 배합된다. 표피세포 대 진피세포의 적합한 비는 약 0:1, 1:1, 1:2 또는 1:10이다. 또한 진피세포 및 표피세포는 이식 전에 추가적인 세포 유형, 예를 들어 멜라민세포, 지방세포, 전지방세포(preadipocyte), 내피세포, 골수세포 등과 추가로 혼합될 수 있다. 이식되는 진피세포 및 표피세포는 세포 응집체를 이식 부위 내로 유도 및/또는 유지하기 위해 이식 전에 물리적 및/또는 생화학적으로 응집화될 수 있다. 예를 들어, 세포는 배양 원심분리기를 통해 응집화될 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 이식 시점이나 그 이전에 세포에 적합한 응집 향상제를 첨가할 수 있다. 적합한 응집 향상제에는 피브로넥틴 또는 글리코사미노글리칸과 같은 당단백질, 황산 더마탄(dermatan sulfate), 황산 콘드로이틴, 프로테오글리칸, 황산 헤파린 및 콜라겐 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
세포는 당해 분야에 알려진 통상적인 방법을 사용하여 대상자에 이식될 수 있다. 다양한 투여 경로 및 다양한 투여 부위가 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료 부위의 외피부층의 표피세포와 진피세포 사이에 직접 세포를 주입할 수 있다. 이는 치료 부위의 피부 상에 수포를 발생시키고 이 수포액 속으로 세포를 주입시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 표피를 거쳐 진피에 이르는 적절한 절개부로 세포를 주입할 수 있다. 절개는 예를 들어 외과용 메스나 피하주사침(hypodermic needle)을 사용하여 통상적인 방법으로 이루어질 수 있다. 절개부는 일반적으로 절개부의 어느 한 쪽에 표피와 직접 근접하는 레벨까지 세포로 채워질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 미국 특허출원 공개공보 제 2007/0233038(Pruitt, et al.)에 기술된 바와 같은 장치를 사용하여 세포를 전달한다.
주입되는 세포 양은 일반적으로 약 1 밀리온 내지 약 4 밀리온 세포/제곱센티미터이다.
또 다른 실시예에 있어서, 세포가 이식되어야 하는 피부 속에 다수의, 예를 들어 10, 50, 100, 500 또는 1000 이상의 작은 이식 부위를 형성한다. 각 천공을 다수의 세포로 채운다. 천공의 크기 및 깊이는 다양할 수 있다. 피부 속의 천공은 통상적인 방법에 의해 형성시킬 수 있으며, 예를 들어 외과용 메스나 피하주사침 또는 레이저(예컨대, 저전압 레이저) 등의 피부-커팅 기구의 사용을 포함할 수 있다. 대체 방법으로, 피부 속에 다수의 간격있는 천공을 동시에 형성하도록 배치되어 있는 다수의 간격있는 커팅 에지를 가진 멀티천공 장치를 사용할 수도 있다.
표피세포, 진피세포 또는 이들 혼합물은 식염수 또는 인산염 완충용액과 같은 약리학적으로 적합한 캐리어와 배합될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 캐리어는 둘베코 인산염 완충용액(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline; "DPBS), DMEM, D-MEM-F-12 또는 HYPOTHERMOSOL-FRS와 같은 적합한 배지이다. 또한 세포는 증류수나 탈이온수에 락토비온산 칼륨, 인산 칼륨, 라피노오스, 아데노신, 알로푸리놀, 펜타스타치 프로스타글란딘 El, 니트로글리세린 및/또는 N-아세틸시스테인(이에 국한되는 것은 아님)를 혼합시킨 용액과 같은 보존 용액과 배합될 수 있다. 사용되는 보존 용액은 HYPOTHERMOSOL-FRS와 같은 표준 기관 및 생물학적 조직 보존 수성 저온 저장 용액과 유사한 것이 적합하다.
세포와 캐리어는 주입에 적합한 현탁액을 형성하도록 배합될 수 있다. 각 유효량의 세포를 각 개방부에 이식함으로써 그 개방부 속에 새 모낭이 형성되게 한다. 각 개방부에 주입되는 세포 수는 다양한 요인, 예를 들어 개방부의 크기 및 깊이, 그리고 세포의 총 생존성 및 총 트리코겐 활성 등에 따라 달라질 수 있다. 주입되는 세포의 양은 일반적으로 약 1 밀리온 내지 약 4 밀리온 세포/제곱센티미터이다. 한 실시예에서, 1회 주입시 약 50,000 내지 약 2,000,000의 세포가 전달된다. 세포 농도는 약 5,000 내지 약 1,000,000 세포/㎕이며, 일반적으로는 약 50,000 세포/㎕ 내지 약 750,000 세포/㎕이다. 1회 주입시 전달되는 세포의 일반적인 부피는 약 1 내지 약 10㎕, 바람직하게는 약 4㎕이다. 한 실시예에서, 피부, 바람직하게는 두피 내에 1 내지 100회 주입/cm2, 일반적으로 1 내지 100회 주입/cm2이 이루어진다.
동종이계로부터 유래되는 진피세포 및/또는 표피세포를 사용하는 경우, 면역억제제(immunosuppressant)의 사용, 조직적합성 항원의 변경, 또는 이식 세포의 거부 방지를 위한 차단 수단을 필요로 한다. 세포는 단독으로 투여될 수도 있고, 이식 대상자의 이식 세포에 대한 면역 반응을 억제 또는 감소시키기 위한 물질 또는 차단제와 함께 투여될 수도 있다. 예를 들어 대상자의 정상적인 반응을 억제 또는 방해하기 위해서 대상자에게 면역억제제를 투여할 수 있다. 면역억제제는 대상자 몸속의 T 세포 및/또는 B 세포 활성을 억제시키는 면역억제성 약물이다. 면역억제성 약물은 시중에서 구입가능하다(예를 들어, 사이클로스포린). 면역억제성 물질(예컨대, 약물)은 원하는 치료 효과(예를 들어, 세포의 거부반응을 억제)를 달성하기에 충분한 양으로 대상자에 투여될 수 있다.
또한 면역억제제는 대상자의 T 세포 활성을 억제시키는 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체일 수도 있다. T 세포를 감소시키거나 억제시킬 수 있는 항체에는 예를 들어 다중클론 항혈청, 예컨대 항림프구 혈청; 및 단일클론 항체, 예컨대 T 세포 표면에 CD2, CD3, CD4, CD8 또는 CD40이 결합되어 있는 단일클론 항체 등이 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 구입할 수 있다(예컨대, OKT3(ATCC CR 8001)). 항체는 이식 후 배양 DP 세포의 거부반응을 억제하기 위해서 적당한 시간 동안, 예를 들어 7일 이상, 10일 이상, 30일 이상 동안 투여될 수 있다. 항체는 약학적으로 허용가능한 캐리어, 예를 들어 식염수 중에 혼입되어 정맥주사에 의해 투여될 수 있다.
일부 실시예에서, 대상자는 모발 성장을 향상시키기 위해 세포 이식 이전에, 동시에, 및/또는 이후에 국소적으로 및/또는 전체적으로 모발성장 촉진제로 처리된다. 적합한 모발 성장 촉진제에는 예를 들어, 미녹시딜, 사이클로스포린, 및 천연 또는 합성 스테로이드 호르몬 및 그 향상제 및 길항제, 예컨대 항안드로겐 등이 있으며, 이들 모두 시중에서 구입가능하다.
B. 성모 유도
또 다른 실시예는 연모가 성모로 되도록 유도하는 방법을 제공한다. 연모는 어린이 및 성인의 신체 표면을 덮고 있는 섬세하고 착색이 안된 털(솜털)이다. 성모는 발달된 털로서, 일반적으로 짧고 섬세한 연모에 비해 길고 뻣뻣하고 굵고 색이 짙다. 상술한 바와 같이, 남성형 대머리 징후의 발현에서는 성모에서 연모로의 모낭의 형태발생적 변경이 발생한다.
한 실시예에서, 트리코겐 특성을 증가시킨 진피세포를 상술한 바와 같이 피부 속에 주입한다. 진피세포는 상술한 바와 같이 확보할 수 있으며, 일반적으로 자기유래 세포이다. 세포를 연모 또는 연모 모낭 내에 또는 그 주변에 주입한다. 가능하면 많은 연모 모낭이 성모 모낭이 되도록 유도하기 위해서 연모를 포함하는 피부 부위에 진피세포를 수회 주입함으로써 진피세포가 전달될 수 있다. 주입되는 세포의 주입 횟수 및 부피는 당업자에 의해 통상적으로 개선될 수 있다는 점을 이해해야 할 것이다.
또 다른 실시예에서, 트리코겐 활성을 증가시킨 진피세포는 모낭 형성을 유도하고 연모 모낭이 성모 모낭이 되도록 유도하기에 효과적인 양으로 피부에 주입된다.
별도의 설명이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 인용된 문헌 및 문헌에 언급되어 있는 자료들은 참고문헌으로 기재되어 있다.
실시예
실시예
1:
소닉
헤지호그
경로의 자극
세포 배양
세포 분리는 트립신이나 콜라게나제와 같은 효소로 처리하거나, 뭉툭한 도구 사용과 같은 물리적인 분리 방법에 의하거나, 조직으로부터 특정 세포 유형의 부산물을 얻을 수 있도록 외과용 메스로 민싱하는 것을 포함하여 어떠한 공지의 절차를 이용해서도 달성될 수 있다.
분리된 세포는 세포 성장을 지원할 수 있는 어떠한 공지의 배양 배지 내에도 투입될 수 있으며, 이러한 배지에는 글루타민 및 기타 아미노산, 비타민, 무기질 및 트랜스페린과 같은 유용한 단백질 등의 세포 물질대사에 필요한 보충재를 함유하는 MEM, DMEM 및 RPMI, F-12 등이 있다. 배지는 또한 효모, 박테리아, 및 페니실린, 스트렙토마이신 및 젠타마이신과 같은 진균류로 오염되는 것을 방지하기 위해 항생물질을 함유할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 배지는 소, 말, 닭으로부터 유래된 혈청을 함유할 수 있다. 특히 바람직한 세포 배지는 DMEM과 F-12의 혼합물이다.
기초 배지(basal medium)에 첨가제로서 원하는 농도의 Shh 경로 효능제를 첨가할 수 있다. 세포를 수확전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상 동안 Shh 경로 효능제로 처리할 수 있다.
결과
도 1은 Shh 경로 효능제 화합물이 소닉 헤지호그 경로의 성분들의 전사를 자극한다는 것을 보여준다. 다양한 환자로부터 확보된 분리 및 응집 진피세포를 사용한 일련의 연구에서, Shh 경로 효능제에 세포를 노출시키면, 여러가지 Shh 성장 인자 패밀리(즉, Gli1 및 Ptc1)의 맴버의 유전자 발현을 자극한다는 것이 밝혀졌다. 전사는 qPCR에 의해 검출되었다.
실시예
2: 사용된 화합물의 용량 반응 및 생물학적 분석
아더란스
헤어
패치 분석
진피세포군의 트리코겐 활성은 아더란스 헤어 패치 분석(Aderans Hair Patch AssayTM; Zheng, Y., J Invest Dermato, 124:867-876(2005))을 이용함으로써 결정되었다. 이 분석에서, 분리된 진피세포 및 표피세포를 면역부전 마우스의 진피 또는 피하조직에 이식하였다. 이 분석에서, 갓 태어난 마우스 피부세포를 사용하면, 일반적으로 8일 내지 10일 이내에 새 모낭이 형성된다. 새로 형성된 모낭은 정상적인 모간, 성숙한 피지선 및 자연적인 모낭 주기를 명백하게 나타낸다. 이 분석에서 정상적인 모낭 주기가 형성되지만, 이 분석은 주로 세포 또는 세포 혼합물이 새 모낭을 형성하는 능력을 측정한다. 전형적인 패치 분석에서는, 마우스의 신생아 진피세포를 마우스의 신생아 표피세포와 함께 분석한다. 수정된 패치 분석에서는, 갓 태어난 마우스의 표피세포의 존재하에 인간 성인의 진피세포를 분석한다.
결과
첫 번째 조사에서는 4가지의 서로 다른 농도의 Shh 경로 효능제(효능제 A; CUR-201365; Curis, Inc.)를 사용하였는데, 그 농도는 0, 0.005, 0.05 및 0.125㎍/ml이었다(도 2A). 두 번째 조사에서는, 사용량을 더 증가시켜 0.625㎍/ml까지 사용하였다(도 2B). 패치 분석시, Shh 경로 효능제 A(CUR-201365)를 함유하는 배지 속에서 성장한 세포는 비처리된 세포에 비해 보다 많은 모낭(주입된 세포수 밀리온 당)을 형성하였다. 더욱이, 용량-반응 관계에 있어서, 배지 중 Shh 경로 효능제의 농도가 증가함에 따라 효과(패치 분석시 모낭 수)가 증가하는 것이 관찰되었다. Shh 경로 효능제 처리로 인해 세포의 트리코게니시티가 이후의 패시기까지 연장되었다. 패시지(P1 내지 P4)가 진행되면서, 효능제 농도가 가장 높은 경우 트리코겐 활성이 높은 수준으로 유지되지만, 효능제로 처리되지 않은 경우 트리코게니시티가 점차 감소된다(도 2B). 농도가 높아지면서 트리코겐 활성이 매우 낮아지는 것으로 보이지는 않지만, 고농도에는 세포 성장 속도가 감소된다(도 3). 효능제 A의 최적 농도는 0.625㎍/ml 이하 0.125㎍/ml 이상인 것으로 추정된다. 헤어 패치 분석에서 형성된 모낭 수는 Shh 경로 효능제의 존재하에 세포가 성장할 때 증가한다.
두 번째 화합물(Shh 경로 효능제 B; CUR-0236715)을 테스트하였다. 첫 번째 화합물과 마찬가지로, 효능제를 다양한 농도로 사용하여 패치 분석한 결과, 처리된 세포는 모낭 수 증가에 도움을 주었다. 모든 농도에 있어서, P1에서 비처리된 대조용에 비해 모낭 수에 현저한 차이를 보여주었다. P2에서 모낭 형성에 최적인 농도는 중간 농도인 0.0375㎍/ml이었다(도 4B). 두 번째 효능제(B)는 테스트된 모든 농도에서 세포 성장 또는 형성에 어떠한 부작용도 보이지 않았다(도 5).
실시예
3: 단기간 처리시 세포 유도성
Shh 경로 효능제가 단기간(수확전 7일) 처리시 세포 유도성을 증가시킬 수 있는지를 조사하기 위해, 효능제 B를 사용하여 3명의 환자 샘플을 테스트하였다. 각 환자에 대해서, 패시지 P1 또는 P2에서 0, 0.0125, 0.0375, 0.05 및 0.15 ㎍/ml의 Shh 경로 효능제 B로 세포를 처리하였다. 그런 다음, 약 7일 후에 P1 및 P2 세포를 수확하고 하이브리드 패치 분석을 실행하였다. 이 단기간 처리된 샘플에서 유사한 결과가 관찰되었는데(도 6A 및 6B), 모든 Shh 경로 효능제 B로 처리된 세포는 대조용에 비해 모낭 수가 증가되었다. 이 조사에서, P1 또는 P2 세포에 대한 최적 농도는 중간 농도(0.0375㎍/ml)인 것이 입증되었다. 중간 농도의 Shh 경로 효능제 B는 단기간(7일) 처리시 모낭 수를 증가시켰다. 세포는 단지 7일 동안만 처리되었으며, 그 이전에는 처리되지 않았다.
연속적인 처리의 결과는 도 4에 나타나 있다. 단기간 처리의 결과는 연속적인 처리의 결과에 비교할 만한 수준이었다.
실시예
4: 인간 태아 세포 및 마우스 세포에 미치는
Shh
효능제의 영향
본 발명자는 Shh 경로 효능제 B(CUR-0236715)가 모발 유도 활성에 미치는 영향에 관한 조사를, 인간 성인 세포에서부터 인간 태아 세포 뿐만 아니라 마우스 세포에까지 확장하였다. P0에서 인간 태아 세포를 Shh 경로 효능제(37.5 ng/ml)로 처리함으로써, 아더란스 헤어 패치 분석시 모발 수가 3배 이상 증가하였으며(도 7), 그 배수 변화가 성인 세포와 매우 유사하였다. Shh 처리에 의한 모발 수 증가는 세포가 Shh 경로 효능제 존재하에 연속적으로 배양된 후속 패시지(P3)까지 연장되었다(도 7).
또 다른 실험에서는, 처음에 세포를 Shh 경로 효능제없이 배지 속에서 배양하였다. 특정 패시지가 시작될 때만 배지에 Shh 경로 효능제 CUR-0236715를 첨가하고 그 패시지 동안만 지속하였다(도 8에 나타낸 바와 같이 P1 및 P4). 이들 후속 패시지에서 Shh 경로 효능제 B(CUR-0236715)를 첨가함으로써 태아 세포 트리코게니시티를 증가시킬 수 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 세포가 P1 또는 P4에서 Shh 경로 효능제 B에 노출된 경우에만 형성된 모낭 수가 Shh 처리되지 않은 대조용 세포에 비해 약 5배 이상 많으며, 또한 배양 과정 동안 효능제에 의해 지속적으로 처리된 세포에 의해 형성되는 모발 수와 동일한 수준이다(도 7).
주목할만한 점은 Shh 경로 효능제 B로 인한 트리코게니시티 향상 효과는 배지에 따라 달라질 수 있다는 것이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포 배지에 효능제를 첨가함으로써 모낭 수를 증가시킬 수 있으나, Amniomax 및 Chang's 배지(Invitrogen, CA)와 Osada 배지(Osada, A., et a., Tissue Eng, 13(5): 975-82 (2007))와 같은 다른 시중 구입가능한 배지의 경우 그 효과가 크지 않다.
배양되는 인간 세포 이외에도 마우스 신생아 진피세포 배양물에 Shh 경로 효능제를 첨가하였다. 예비 데이터는 Shh 경로 효능제로 처리된 마우스 세포도 또한 패치 분석시 형성된 세포수가 시사하는 바와 같이 트리코겐 활성을 증가시킨다는 보여주었다(도 10). 이 결과로부터, Shh 경로 효능제에 의한 트리코게니시티 향상 효과는 인간 세포에 국한되는 것이 아니라는 것을 알 수 있다. 모낭 수의 증가 이외에도, Shh 경로 효능제로 처리된 세포에 의해 형성되는 모낭 크기도 비처리된 세포에 의해 형성되는 모낭 크기에 비해 현저히 증가하였다.
별도의 설명이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
당업자는 단지 일반적인 실험을 통해 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시예에 상응하는 많은 동등물을 알아내거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 본 발명의 특허청구 범위에 포함된다.
Claims (14)
- 배양에서 포유동물 진피세포의 트리코게니시티(trichogenicity)를 증가시키는 방법으로서,
처리되지 않은 분리된 포유동물 진피세포에 비해 분리된 포유동물 진피세포의 트리코게니시티를 증가시키고, 증가된 트리코게니시티를 적어도 2 패시지 동안 유지하기 위하여, 아래 식을 가진 소닉 헤지호그 경로 효능제의 유효량의 존재하에 분리된 포유동물 진피세포를 시험관 내에서 배양하는 단계를 포함하는 포유동물 진피세포의 트리코게니시티를 증가시키는 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 트리코게니시티는 패치 분석을 이용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 포유동물 진피 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 분리된 포유동물 진피세포는 상기 소닉 헤지호그 경로 효능제의 존재하에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항, 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법으로부터 얻어지는 포유동물 진피세포의 분리된 세포군.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 분리된 포유동물 진피세포는 모발 패치 분석에 의해 측정시, 비처리된 포유동물 진피세포에 비해 증가된 트리코게니시티를 적어도 세 번째 패시지까지 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 분리된 진피세포는 모발 패치 분석에 의해 측정시, 비처리된 세포에 비해 증가된 트리코게니시티를 적어도 네 번째 패시지까지 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
배양에서 상기 소닉 헤지호그 경로 효능제의 농도는 0.0125 내지 01500 ㎍/ml 인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 5 항에 있어서,
상기 포유동물 진피세포의 수는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상 동안 배양에서 증가되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 13 항의 방법에 의해 얻어지는 포유동물 진피세포의 분리된 세포군.
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