CN112999236A - 乌本苷用于治疗脑干胶质瘤的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乌本苷用于治疗脑干胶质瘤的用途。具体而言，本发明涉及式(I)所示的乌本苷及含有其的药物组合物在制备用于预防和/或治疗脑干胶质瘤特别是弥漫内生型脑干胶质瘤的药物中的用途。本发明通过具体实验证明乌本苷对于原代弥漫内生型脑干胶质瘤细胞具有优异的细胞凋亡和杀伤作用。

Description

乌本苷用于治疗脑干胶质瘤的用途

技术领域

本申请涉及医药技术领域。具体而言，涉及一种钠钾ATP酶抑制剂乌本苷在医药领域的新用途，是一种关于乌本苷用于治疗脑干胶质瘤特别是弥漫内生型脑干胶质瘤的用途。

背景技术

儿童中枢神经系统肿瘤发病率居于儿童恶性肿瘤的第二位。脑干胶质瘤比例约占儿童脑肿瘤的20％，好发于5-10岁的儿童，其中80％为弥漫内生型脑干胶质瘤(DiffuseIntrinsic Pontine Glioma，DIPG)，以纤维性星形细胞瘤为主，多位于脑桥基底部。

过去几十年，由于弥漫内生型脑干胶质瘤特殊的解剖位置，导致它们不能被切除，并在许多临床试验中心没有进行活检。目前针对DIPG的治疗，仍然面临巨大挑战。由于脑干解剖结构复杂，肿瘤与正常脑干组织浸润分布，无法进行根治性手术切除肿瘤。放疗虽然暂时缓解症状，但是无法延长患儿的有效生存期，因此药物治疗成为重要的治疗手段。然而，弥漫内生型脑干胶质瘤发病分子机制与慕上脑胶质瘤不同，针对慕上脑胶质瘤的标准化疗方案对于儿童弥漫内生型脑干胶质瘤无效。目前尚无能够有效治疗或预防弥漫内生型脑干胶质瘤的药物。

因此，寻找有效小分子药物对于弥漫内生型脑干胶质瘤的治疗有着重大的意义。

发明内容

乌本苷是一种甾类糖苷，别名哇巴因、箭毒苷、G毒毛旋花苷，从产于非洲的夹竹桃科的羊角拗属(St-rophanthus gratus)的种子或同科的Ac-ocanthera ouabaio的木材中获得。其具体结构如下式(I)所示：

乌本苷是一种强心苷，较低剂量可用于医学上治疗低血压和心律失常。其通过抑制Na/K-ATP酶发挥作用。

本发明人发现乌本苷对弥漫内生型脑干胶质瘤细胞具有很好的杀伤和抑制作用，因此可被开发为用于治疗这类疾病的有效治疗剂。

因此，本发明的目的是提供一种化合物在制备用于预防和/或治疗受试者中脑干胶质瘤的药物中的用途，其中所述化合物是上式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶性物、或前药。

本发明另一个目的是提供一种药物组合物在制备用于预防和/或治疗受试者中脑干胶质瘤的药物中的用途，其中所述药物组合物含有上式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶性物、或前药作为活性成分，以及药学上可接受的载体。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的用途，其中所述脑干胶质瘤选自弥漫内生型脑干胶质瘤、局灶性脑干胶质瘤、背外生性脑干胶质瘤、颈延交界性脑干胶质瘤，优选弥漫内生型脑干胶质瘤，特别是III级或IV级弥漫内生型脑干胶质瘤。

本发明所述的“受试者”是指动物。典型地，所述动物是哺乳动物，例如人、猴、猿、牛、羊、马、犬、猫、兔、鼠。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的用途，其中所述的受试者为哺乳动物如人；特别地，所述的受试者为儿童，特别是4～10岁的儿童。

本发明所述的受试者特别指患有弥漫内生型脑干胶质瘤的患者，即患有弥漫内生型脑干胶质瘤的成人或儿童。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的用途，其中所述化合物或药物组合物用于改善弥漫内生型脑干胶质瘤受试者特别是弥漫内生型脑干胶质瘤儿童的预后。

在本发明的另一个实施方案中，根据本发明所述的用途，其中所述化合物或药物组合物用于延长弥漫内生型脑干胶质瘤受试者特别是弥漫内生型脑干胶质瘤儿童的生存。

本发明所述的式(I)所示的化合物可以各种形式施用至受试者，例如立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、或前药。

术语“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体、几何异构体、阻转异构体。立体化学定义和规则参见McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms，McGraw-HillBook Company；Stereochemistry of Organic Compounds，John Wiley&Sons出版社。

术语“互变异构体”是指具有不同能量的可通过低能垒互相转化的结构异构体。

术语“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与化合物分子所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包含，但并不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙酸、氨基乙醇。当形成溶剂化物的溶剂为水时，所形成溶剂化物即称为“水合物”。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明所述式(I)化合物与酸或碱形成的酸式加成盐或碱式加成盐。本领域技术人员熟知这些药学上可接受的盐。所述酸式加成盐，包括但并不限于，无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硫酸盐、半硫酸盐、重硫酸盐、过硫酸盐、高氯酸盐、硝酸盐、硼酸盐；有机酸盐，如甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐、乙醇酸盐、草酸盐、丙酸盐、环戊基丙酸盐、2-羟基丙酸盐、丙二酸盐、特戊酸盐、庚酸盐、己酸盐、己二酸盐、十一酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、3-苯基丙酸盐、藻酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、十二烷基硫酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、烟酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、苦味酸盐、硬脂酸盐、硫氰酸盐。碱式加成盐可以为式(I)化合物与无机碱或有机碱形成的盐，所述无机碱，包括但不限于：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钙；所述有机碱，包括但不限于：氢氧化铵、三乙胺、N,N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其他羟基烷基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、精氨酸或赖氨酸；所述碱式加成盐还可以为碱金属盐，包括但不限于：锂、钾和钠盐；或碱土金属盐，包括但不限于：钡、钙和镁盐；或可以为过渡金属盐，包括但不限于锌盐。

术语“前药”代表一个化合物在体内转化为式(I)所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。例如一个化合物包含羟基，即可以将其酰化得到前体药物形式的化合物。其他的前体药物形式包含磷酸酯，如这些磷酸酯类化合物是经母体上的羟基磷酸化得到的。

术语“多晶型物”指由于分子或离子排列方式的不同而形成的晶体。多晶型物在化学性质上没有区别，但其物理性质有所不同。

术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其药学上可接受的盐或前药与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

本发明所述的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。术语“药学可接受的载体”在本领域中是公知的，其为适于将本申请的化合物施用于受试者的药学可接受的材料。各载体中与其他成分相兼容且对受试者无害的意义上必须是“可接受的”。药学可接受的载体的一些示例包括填充剂、稀释剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、助流剂、增溶剂、崩解剂、助悬剂、乳化剂、防腐剂、表面活性剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂、缓冲剂等，例如可以为糖、淀粉、纤维素及其衍生物、明胶、滑石粉、醇、酯(如油酸乙酯和月桂酸乙酯)、水、林格氏溶液等。

本发明所述的式(I)所示的化合物或包含其的药物组合物可以通过各种途径施用至受试者。在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的用途，其中所述化合物或药物组合物经口服、胃肠外施用或局部施用。

用于口服施用的本申请的药物组合物可以为以下形式：片剂、锭剂、溶液剂、水或油混悬剂、粉末剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、硬或软胶囊、糖浆剂、酏剂、酊剂等。

片剂含有活性成分和用于混合的适宜制备片剂的无毒的可药用的赋形剂。这些赋形剂可以是惰性赋形剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯胶和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。这些片剂可以不包衣或可通过掩盖药物的味道或在胃肠道中延迟崩解和吸收，因而在较长时间内提供缓释作用的已知技术将其包衣。例如，可使用水溶性味道掩蔽物质，例如羟丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素，或延长时间物质例如乙基纤维素、醋酸丁酸纤维素。

也可用其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬明胶胶囊，或其中活性成分与水溶性载体例如聚乙二醇或油溶媒例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊提供口服制剂。

水混悬剂含有活性物质和用于混合的适宜制备水悬浮液的赋形剂，此类赋形剂例如悬浮剂，例如羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂，例如卵磷脂。水混悬剂也可以含有防腐剂例如尼泊金乙酯或尼泊金正丙酯、着色剂、矫味剂和甜味剂，例如蔗糖、糖精或阿司帕坦。

油混悬剂可通过使活性成分悬浮于植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或矿物油例如液体石蜡中配制而成。油悬浮液可含有增稠剂、甜味剂和矫味剂。

乳剂可以为水包油乳剂的形式，油相可以是植物油例如橄榄油或花生油，或矿物油例如液体石蜡或其混合物。乳剂可以含有乳化剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂和抗氧剂等。

胃肠外施用的形式可以为静脉内、皮下、皮内、肌肉内注射的无菌注射水溶液、无菌注射水或油混悬液形式。

无菌注射水溶液形式可在可接受的溶媒和溶剂中如水、林格氏液和等渗氯化钠溶液中制得。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本发明化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。

肌肉内和皮下注射的无菌注射水或油混悬液的形式可以用适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。

局部施用及其它施用形式可以为贴剂、膏剂、霜剂、凝胶剂、气雾剂或喷雾剂。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的用途，其中所述药物组合物为以下形式：片剂、锭剂、溶液剂、水或油混悬剂、粉末剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、硬或软胶囊、糖浆剂、酏剂、酊剂、脂质体，通过静脉内、皮下、皮内、肌肉内注射的无菌注射水溶液、无菌注射水或油混悬液形式，贴剂、膏剂、霜剂、凝胶剂、气雾剂或喷雾剂。

本领域技术人员熟知药物的给药剂量依赖于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用的具体化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、情况、一般健康状况和病史以及医学领域中公知的其他因素。具有本领域普通技能的医师或兽医可容易地确定和开具出所需的活性成分的有效量。例如，医师或兽医可以以低于获得所需治疗作用所需要的剂量的水平开始活性成分的剂量并逐渐增加其剂量直至实现所需的作用。一般而言，本发明所述化合物的合适的日剂量将是有效产生治疗作用的最低剂量的化合物量。该类有效剂量一般将取决于上述因素。

一般而言，本发明所述化合物用于患者的静脉内、颅内、瘤内、或皮下剂量为约100ug至10mg/kg体重/天，更优选约200ug至2mg/kg/kg/天，还更优选为约400ug至1mg/kg/天。有效量是治疗与脑胶质瘤有关的病症的量。如果需要的话，活性化合物的有效日剂量可以在一天中以分开施用的二、三、四、五、六或更多个亚剂量以适宜的时间间隔施用，任选地，所述亚剂量是单位剂型。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的用途，其中所述化合物以100ug至10mg/kg体重/天，优选400ug至2mg/kg体重/天，更优选200ug至1mg/kg体重/天的量施用给受试者。

虽然本发明所述的化合物可以单独施用，但优选以药物组合物的形式施用所述化合物。

本发明所述的式(I)所示的化合物或含有其的药物组合物可以与其它治疗方法或治疗剂组合用于治疗受试者中的脑干胶质瘤特别是弥漫内生型脑干胶质瘤。

本发明所述的其它治疗方法可以为化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法等。

本发明所述的其它治疗剂可以为抗癌剂(如细胞信号传导抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢药、嵌合(intercalating)抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、免疫治疗剂或抗激素剂)、类固醇药物、甲氨蝶呤、来氟米特、抗TNF-α剂、钙调神经磷酸酶(calcineurin)抑制剂、抗组胺药物、抗增殖剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗炎性试剂或它们的组合。

本发明所述的抗癌剂可以选自烷化剂(如环磷酰胺、一环磷酰胺、美法仑、白消安、尼莫司丁、雷莫司汀、达卡巴嗪、替莫唑胺、盐酸氮芥、二溴甘露醇等)、铂络合剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂等)、代谢拮抗剂(如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、替加氟、吉西他滨、卡倍他滨、氟维司群、培美曲塞等)、植物生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春地辛、依托泊苷、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、长春瑞滨、米托蒽醌、长春氟宁、拓扑替康等)、抗体药物(例如曲妥单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗等)、激素抗癌剂(例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、度他雄胺、地塞米松、他莫西芬等)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、来那度胺等)、芳香化酶抑制剂(例如依西美坦、来曲唑、阿那曲唑等)、VEGFR抑制剂(例如舒尼替尼、索拉菲尼、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、凡德他尼、帕唑替尼、拉帕替尼等)、mTOR抑制剂(例如依维莫司、西罗莫司、佐他莫司等)。

特别地，本发明所述的其它治疗剂为其它可以用于治疗脑胶质瘤的试剂，如替莫唑胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、替尼泊苷(VM-26)、或它们的组合。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的用途，其中所述化合物或药物组合物与另一种或多种活性成分或含有其的药物组合物同时、分开或相继施用，其中所述另一种活性成分优选抗癌剂如细胞信号传导抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢药、嵌合抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、免疫治疗剂或抗激素剂；类固醇药物、甲氨蝶呤、来氟米特、抗TNF-α剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、抗组胺药物、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗炎性试剂、或它们的组合；更优选抗癌剂，进一步优选用于治疗脑胶质瘤的抗癌剂；特别优选替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、替尼泊苷、或它们的组合。

本发明的另一目的是提供一种化合物或含有其的药物组合物与另一种或多种活性成分组合在制备用于预防和/或治疗受试者中脑干胶质瘤特别是弥漫内生型脑干胶质瘤的药物中的用途，其中所述化合物为式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶性物、或前药；所述另一种活性成分优选抗癌剂如细胞信号传导抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢药、嵌合抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、免疫治疗剂或抗激素剂；类固醇药物、甲氨蝶呤、来氟米特、抗TNF-α剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、抗组胺药物、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗炎性试剂、或它们的组合；更优选抗癌剂，进一步优选用于治疗脑胶质瘤的抗癌剂，特别优选替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、替尼泊苷、或它们的组合。

根据本发明所述的另一种或多种活性成分可与本发明所述的式(I)所示的化合物或包含其的药物组合物一起作为单个剂量形式施用，或者与式(I)所示的化合物或包含其的药物组合物组合物分开作为多剂量形式同时、分开或相继施用。在后一种情况下，给药可以错开，例如：6小时、12小时、1天、2天、3天、1周、2周、3周、1个月或2个月。

本发明还涉及一种联合疗法，其治疗或预防与脑干胶质瘤特别是弥漫内生型脑干胶质瘤相关的疾病和病症，该疗法包括向有此种需要的受试者同时、分开或相继施用式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶性物、或前药或含有其的药物组合物，以及任选地另一种或多种活性成分；所述另一种活性成分优选抗癌剂如细胞信号传导抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢药、嵌合抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、免疫治疗剂或抗激素剂；类固醇药物、甲氨蝶呤、来氟米特、抗TNF-α剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、抗组胺药物、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗炎性试剂、或它们的组合；更优选抗癌剂，进一步优选用于治疗脑胶质瘤的抗癌剂，特别优选替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、替尼泊苷、或它们的组合。

当本发明所述的式(I)所示的化合物或含有其的药物组合物与另一种或多种活性成分组合施用时，可以有两种方式：1)将所述化合物或药物组合物与可联用的其它治疗剂分别制成单独的制剂，两种剂型可以相同或不同，施用时可以先后施用，也可以同时施用；先后施用时，给予在后的活性剂是在前活性剂还未丧失其在体内的有效作用时；2)将所述化合物或药物组合物与可联用的其它治疗剂制成单一制剂，同时施用。

本发明还涉及一种药盒，其特征在于，所述药盒用于预防和/或治疗脑干胶质瘤特别是弥漫内生型脑胶质瘤，包括：第一容器，所述第一容器中设置有式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶性物、或前药或含有其的药物组合物。

附图说明

图1为乌本苷杀伤弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17的细胞存活率-药物浓度曲线图，其中横坐标为药物浓度的log₂值，纵坐标为细胞活力百分比。

图2为乌本苷杀伤弥漫内生型脑干胶质瘤细胞TT150630的细胞存活率-药物浓度曲线图，其中横坐标为药物浓度的log₂值，纵坐标为细胞活力百分比。

图3为乌本苷杀伤弥漫内生型脑干胶质瘤细胞TT150714的细胞存活率-药物浓度曲线图，其中横坐标为药物浓度的log₂值，纵坐标为细胞活力百分比。

图4为乌本苷杀伤弥漫内生型脑干胶质瘤细胞TT150728的细胞存活率-药物浓度曲线图，其中横坐标为药物浓度的log₂值，纵坐标为细胞活力百分比。

图5为乌本苷诱导弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17的PI-酶联蛋白的荧光强度散点图。其中横坐标为酶联蛋白的荧光强度，纵坐标为PI的荧光强度。

图6为不同浓度的乌本苷处理弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17的凋亡细胞比例-药物浓度柱状图。其中横坐标为药物的浓度，纵坐标为凋亡细胞比例，其中**代表p＜0.01。

图7为乌本苷对弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17的处于不同细胞周期的细胞比例-药物浓度柱状图。其中横坐标为药物的浓度，纵坐标为处于不同细胞周期(G0/G1期、S期、G2/M期)的细胞比例。

具体实施方式

以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。

实验材料

患者组织来源的弥漫内生型脑干胶质瘤细胞；乌本苷(TargetMol)；细胞活力检测试剂盒CellTiter-Glo(G7572，Promega)；基底膜基质(356243，BD，1％，4-12h，37℃)；DMEM(Gibcol)；B27(1：50，Gibcol)、N₂(1：100，Gibcol)、bFGF(20ng/mL，Peprotech)、EGF(20ng/mL，Peprotech)、PDGF-AB(20ng/mL，Peprotech)；PBS缓冲液(索莱宝)。

实施例1细胞模型的建立

1)弥漫内生型脑干胶质瘤组织样本来自首都医科大学附属北京天坛医院神经外科开颅手术或者立体定向活检。获取组织及构建细胞系已通过首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会审批(伦理号KY2014 021 02)。

细胞系标号为TT150630、TT150714、TT150728、DIPG17，细胞的来源如下：

TT150630：细胞来源于一名4岁的女童，于2015年6月30日于天坛医院神经外科7病区行脑干胶质瘤活检手术，术后病理检测为WHOⅢ级。

TT150714：细胞来源于一名7岁的女童，于2015年7月14日于天坛医院神经外科7病区行脑干胶质瘤肿瘤切除术，术后病理检测为WHOⅢ级。

TT150728：细胞来源于一名7岁的女童，于2015年7月28日于天坛医院神经外科7病区行脑干胶质瘤活检手术，术后病理检测为WHOⅣ级。

DIPG17：为国外报道中已建立的DIPG细胞系，参见Mount CW,Majzner RG,Sundaresh S,Arnold EP,Kadapakkam M,Haile S,et al.Potent antitumor efficacy ofanti-GD2 CAR T cells in H3-K27M(+)diffuse midline gliomas.Nat Med 2018,24:572-579。

3)成熟DIPG细胞系的构建方法，具体操作如下：

根据本研究团队前期技术经验，肿瘤组织处理过程如下：肿瘤组织离体后立即放置于4℃预冷的Hibernation缓冲液(Gibco)中，4℃冰上转运至实验室。将肿瘤组织离心后弃去冬眠缓冲液，加入2ml DMEM剪碎组织，加入IV性胶原酶和DNA酶I(Sigma，5Kunitz单位/ml)后，置于37℃细胞培养箱中消化30分钟，每隔10分钟吹打混匀数次，直至形成单细胞悬液。300g离心5分钟，去除上清，以DMEM重悬细胞，300g离心5分钟，弃除DMEM，重复上述步骤2次。以DIPG培养基(DMEM 96％、B27(50×)2％、N₂(100×)1％、Pen/Strep 1％、EGF 20ng/ml、bFGF 20ng/ml、PDGF-AB 20ng/ml)重悬细胞。计数细胞后以3-6万/cm²的密度接种于预先包被(1％Matrigel基质胶，37℃)过夜的培养板。将培养的原代细胞经过传代培养，去除杂质细胞，最终筛选获得原代DIPG细胞系，加入冻存液(7mL DIPG培养基+1mL DMSO+2mLFBS)，液氮中保存。本实施例另外选取了国外报道(Nat Med 2018,24:572-579)中已建立的DIPG细胞系SU-DIPG17作为对照。

实施例2乌本苷杀伤弥漫内生型脑干胶质瘤细胞的效果评估

本实验使用如上实施例1中得到的弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17、TT150630、TT150714、TT150728，通过IC₅₀值来评价乌本苷杀伤弥漫内生型脑干胶质瘤细胞的效果。IC₅₀是指被测量的拮抗剂的半数抑制浓度，是指一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞死亡50％，该浓度称为50％抑制浓度。

在96孔细胞培养板中每孔种入起始5000个细胞，在实验组中分别加入10μL用PBS配制的乌本苷溶液处理，终浓度分别为5nM、25nM、50nM、75nM、100nM、150nM，在对照组中加入相同体积的DMSO。分别在加药前(T0)和加药后48小时(T48)用CellTiter-Glo检测细胞存活率，细胞存活率＝T48实验组-T0实验组/T48对照组-T0对照组，IC₅₀为细胞存活率-药物浓度曲线中细胞存活率为50％所对应的药物浓度。

图1～图4显示乌本苷对弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17、TT150630、TT150714、TT150728的细胞存活率-药物浓度曲线图，由这些附图可知，乌本苷对弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17、TT150630、TT150714、TT150728的IC₅₀值分别为69.88nM(图1)、35.34nM(图2)、34.98nM(图3)、20.01nM(图4)。因此。乌本苷对于弥漫内生型脑干胶质瘤细胞具有很好的杀伤作用。

实施例3乌本苷对弥漫内生型脑干胶质瘤细胞凋亡的影响

细胞凋亡检测使用AnnexinV/PI染色试剂盒(FITC AnnexinV ApoptosisDetection Kit,BD,556547)。

取实施例1中得到的贴壁培养细胞，分别将终浓度为0、10、50nM的乌本苷加入DIPG细胞培养液中(每组设3个复孔)，37℃孵育48小时。之后，吸取培养上清，用0.05％胰酶(Invitrogen)消化细胞，DTI(Invitrogen)中和胰酶，将培养上清和细胞悬液共同离心(300g离心5分钟)，弃除上清，以冰冷0.01M PBS(索莱宝)洗细胞两次，离心(300g离心5分钟)后弃除PBS。向每个样本中加入配制好的染色液100ul(PBS 90ul，PI 50ug/ml，RNA酶100ug/ml，索莱宝)，4℃摇床避光孵育30分钟后加入PBS 400ul重悬细胞。使用流式细胞分析仪(BD FACS，Calibur)进行流式分析，选取AnnexinV阳性细胞定义为凋亡细胞，AnnexinV和PI双阴性细胞定义为活细胞。

图5为乌本苷诱导弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17的PI-酶联蛋白的荧光强度散点图。图6为不同浓度的乌本苷处理弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17的凋亡细胞比例-药物浓度柱状图。通过细胞凋亡实验，发现10nM和50nM的乌本苷可以诱导弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17发生凋亡(图5)。凋亡细胞的比例随乌本苷浓度的升高而增大(图6)。

实施例4乌本苷对弥漫内生型脑干胶质瘤细胞周期的影响

运用六孔板贴壁培养细胞培养至细胞融合度为70-80％，分别将0、40、80、160nM的乌本苷加入DIPG细胞培养液中(每组设3个复孔)，37℃孵育48小时。收集细胞，以冰冷PBS洗细胞2次，加入70％预冷乙醇重悬细胞，4℃过夜固定。第二日离心(1500rpm，5分钟)弃去乙醇，以冰冷PBS洗涤细胞2次，每样品加入PI染色液(PBS 90ul、PI 50ug/ml、RNA酶100ug/ml，索莱宝)100μL，37℃水浴中避光染色30min，加入PBS 400μL稀释细胞悬液后上流式分析仪进行检测，记录激发波长488nm处红色荧光。原始数据经FlowJo进行细胞周期分析。

细胞周期是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。在这个过程中，细胞遗传物质复制并加倍，且在分裂结束时平均分配到两个子细胞中去。细胞周期又可以分为间期和有丝分裂期，细胞间期常划分为休眠期(G0)，DNA合成前期(G1)，DNA合成期(S)，DNA合成后期(G2)，整个周期可表示为G1→S→G2→M。DNA周期检测可用来反应细胞周期的各个期的状况，即细胞增殖状况。利用细胞内DNA能够和荧光染料(如碘化丙啶PI)结合的特性，细胞各个时期其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同：G0/G1期DNA为二倍体(2N)，G2/M细胞内的DNA为四倍体(4N)。

图7为乌本苷对弥漫内生型脑干胶质瘤细胞DIPG17的处于不同细胞周期的细胞比例-药物浓度柱状图。细胞周期分析结果检测显示药物处理后的细胞出现了显著的G1期停滞(图7)。

Claims (15)

1.一种化合物在制备用于预防和/或治疗受试者中脑干胶质瘤的药物中的用途，其中：

所述化合物是式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、或前药：

2.一种药物组合物在制备用于预防和/或治疗受试者中脑干胶质瘤的药物中的用途，其中所述药物组合物含有式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、或前药作为活性成分，以及药学上可接受的载体，

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述脑干胶质瘤选自弥漫内生型脑干胶质瘤、局灶性脑干胶质瘤、背外生性脑干胶质瘤、颈延交界性脑干胶质瘤，优选弥漫内生型脑干胶质瘤，更优选III级或IV级弥漫内生型脑干胶质瘤。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物，优选人，更优选儿童，特别是4-10岁的儿童。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中式(I)所示的化合物或药物组合物用于改善弥漫内生型脑干胶质瘤受试者特别是弥漫内生型脑干胶质瘤儿童的预后。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中式(I)所示的化合物或药物组合物用于延长弥漫内生型脑干胶质瘤受试者特别是弥漫内生型脑干胶质瘤儿童的生存。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述化合物或药物组合物经口服、胃肠外施用或局部施用。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的用途，其中所述药物组合物为以下形式：片剂、锭剂、溶液剂、水或油混悬剂、粉末剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、硬或软胶囊、糖浆剂、酏剂、酊剂、脂质体，通过静脉内、皮下、皮内、肌肉内注射的无菌注射水溶液、无菌注射水或油混悬液形式，贴剂、膏剂、霜剂、凝胶剂、气雾剂或喷雾剂。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述化合物以100ug至10mg/kg体重/天，优选400ug至2mg/kg体重/天，更优选200ug至1mg/kg体重/天的量施用给受试者。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述化合物或药物组合物与另一种治疗方法组合，所述另一种治疗方法例如化学疗法、放射疗法、靶向疗法或免疫疗法。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述化合物或药物组合物与另一种或多种活性成分或含有其的药物组合物同时、分开或相继施用，其中所述另一种活性成分优选抗癌剂如细胞信号传导抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢药、嵌合抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、免疫治疗剂或抗激素剂；类固醇药物、甲氨蝶呤、来氟米特、抗TNF-α剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、抗组胺药物、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗炎性试剂、或它们的组合；更优选抗癌剂，进一步优选用于治疗脑胶质瘤的抗癌剂；特别优选替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、替尼泊苷、或它们的组合。

12.一种化合物或含有其的药物组合物与另一种或多种活性成分组合在制备用于预防和/或治疗受试者中脑干胶质瘤特别是弥漫内生型脑干胶质瘤的药物中的用途，其中所述化合物为式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶性物、或前药：

所述另一种活性成分优选抗癌剂如细胞信号传导抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢药、嵌合抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、免疫治疗剂或抗激素剂；类固醇药物、甲氨蝶呤、来氟米特、抗TNF-α剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、抗组胺药物、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗炎性试剂、或它们的组合；更优选抗癌剂，进一步优选用于治疗脑胶质瘤的抗癌剂，特别优选替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、替尼泊苷、或它们的组合。

13.根据权利要求12所述的用途，其中式(I)所示的化合物或含有其的药物组合物与另一种或多种活性成分在分别的制剂中同时、分开或相继施用。

14.根据权利要求12所述的用途，其中式(I)所示的化合物或含有其的药物组合物与另一种或多种活性成分被制成单一制剂同时施用。

15.一种药盒，其特征在于，所述药盒用于预防和/或治疗脑干胶质瘤特别是弥漫内生型脑胶质瘤，包括：第一容器，所述第一容器中设置有式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶性物、或前药或含有其的药物组合物：

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