CN102802621A

CN102802621A - 用于增强真皮细胞的毛原性能力的方法和组合物

Info

Publication number: CN102802621A
Application number: CN2010800363081A
Authority: CN
Inventors: 郑英; 马里莱内·鲍彻; 英·霍曼; 查尔斯·霍尔沃; 波利娜·马蒙托夫; 库尔特·斯滕恩
Original assignee: Aderans Research Institute Inc
Current assignee: Aderans Research Institute Inc
Priority date: 2009-06-17
Filing date: 2010-06-16
Publication date: 2012-11-28
Also published as: WO2010148094A1; BRPI1014021A2; CA2765706A1; EP2442802A1; JP2012530492A; KR20120034167A; KR101799114B1; AU2010260063A1; US20120095445A1

Abstract

本发明提供用于增强培养的细胞的毛原性(trichogenicity)的方法和组合物。一项实施例提供，在使用有效量的一种或多种音猬因子(sonic hedgehog；Shh)通路激动剂的情况下在体外培养分离的哺乳动物真皮细胞，以相对于未处理的分离的哺乳动物真皮细胞，增强所述分离的哺乳动物真皮细胞的毛原性。细胞培养物选择性地包括表皮细胞。优选的Shh激动剂包括，但不限于由库里斯公司(Curis，Inc)提供的CUR-0236715和CUR-0201365。毛原性用爱德兰丝发片分析(Aderans Hair Patch Assay^TM)进行测量。经过培养的真皮细胞可在使用所述一种或多种Shh激动剂的情况下，在收获之前于培养物中维持至少1到7天或7天以上。通过以可诱导毛囊形成的有效量植入，经过处理和培养的真皮细胞可用于治疗哺乳动物受试对象，最好是人类的脱发。

Description

用于增强真皮细胞的毛原性能力的方法和组合物

相关申请案的交叉参考

本专利申请案主张2009年6月17日申请的第61/187,894号美国临时专利申请案和2009年7月22日申请的第61/227,540号美国临时专利申请案的权利和优先权，且这两个申请案都可以引用方式全文并入本专利申请案中。

技术领域

本发明大体涉及用于增强真皮细胞的毛原性能力的方法和组合物，确切地说，涉及用于激活或刺激音猬因子通路的方法和组合物。

背景技术

无论年龄和性别，人们总是受到毛发脱落或脱发症的困扰。有几种类型的毛发脱落，例如雄激素性脱发；斑秃；静止期脱发；基于甲状腺疾病、药品不良反应和营养缺乏状态等系统医学问题的毛发脱落；以及基于头皮或头发损伤、盘状红斑狼疮、扁平苔藓和结构性毛干异常的毛发脱落。(霍根(Hogan)和张伯伦(Chamberlain)，南方医学杂志(South Med J)，93(7)：657-62(2000))。雄激素性脱发是引起毛发脱落的最常见的原因，涉及约50％具有毛发脱落严重家族病史的人群。雄激素性脱发由以下三个相互依存的因素引起：雄性激素二氢睾酮(DHT)、遗传特性和年龄的逐渐增长。在遗传易感宿主中，DHT导致毛囊萎缩，从而导致毛发脆弱，且缩短了毛囊生长周期中的生长期。随着时间的推移，大的毛干会脱落并由非常短而细的毛干代替，从而给人一种大量脱发的印象。

可治疗脱发症的方法包括头发修复、外科手术和外敷/内服药物。(霍根(Hogan)和张伯伦(Chamberlain)，2000；贝尔托利诺(Bertolino)，皮肤病杂志(J Dermatol)，20(10)：604-10(1993))。尽管米诺地尔(minoxidil)、非那雄胺(finasteride)、度他雄胺(dutasteride)等药物在治疗男性型脱发方面取得了显著进展，但仍存在缺点，即此类药物的效果是暂时的，停止治疗后，头发仍会脱落(布哈娜(Bouhanna)，皮肤外科(Dermatol Surg)，29(11)：1130-1134(2003)；艾弗拉姆(Avram)等人，皮肤外科(DermatolSurg)，28：894-900(2002))。基于这一事实，手术性头发修复和组织工程可能是永久性治疗斑秃的唯一方法。手术性植发的效果可能各有不同。早期供体打孔(punch)技术通常导致接受区中的头发极不自然，如同“玩偶的头发”(doll hair look)或“稻田”(paddy field look)一般。尽管手术性植发领域已取得进展，例如，单个毛囊毛干或1毫米打孔，但这些步骤极为耗时且昂贵，最重要的是，给定的病人所具有的供体毛囊的数量是有限的。

用于治疗脱发的组织/细胞工程包括将细胞移植到某一区域中，以促使形成毛囊并随后形成毛干。从理论上说，可使用组织/细胞工程来治疗由各种疾病、综合症和创伤所引起的脱发。毛囊的诱导和生长涉及到活跃且持续的上皮和间充质相互作用。(斯坦(Stenn)和波斯(Paus)，生理学评论(Physiol Reviews)，81：449-494，(2001))。在胚胎中，第一毛囊通过原始表皮增厚而生长，其由来源于表皮本身和其下真皮的经过精确调制的信号来控制。使用成年啮齿动物毛囊的早期研究(科恩(Cohen)，胚胎实验形态学杂志(J Embryol Exp Morphol)，9：117-127(1961))显示，当植入成熟表皮下时，解剖的毛囊、毛乳头或真皮乳头的深层间充质部分将诱发形成新的毛囊。这种有效的组织诱导归因于乳头和真皮鞘中细胞的独特性质(迈克尔威(McElwee)等人，实验皮肤病学(J Invest Dermatol)，121：1267-1275(2003))。

多项研究显示，毛囊形态发生(王(Wang)等人，实验皮肤病学(J Invest Dermatol)，114：901-908(2000)；米尔(Mill)等人，基因发展(Genes Dev)，17：282-294(2003)；莱曼(Lehman)·J.等人，实验皮肤病学(JInvestDermatol)，129：438-448(2009)；圣雅克(St Jacques)·B.，当代生物学(Current Biology)，8：1058-1068(1998))和毛发周期的发展(欧若(Oro)·A.E.和希金斯·K.，发育生物学(Dev Biol)，255：238-248(2003)；帕拉迪尼(Paladini)·R.D.等人，实验皮肤病学(J Invest Dermatol)，125：638-646(2005)；佐藤(Sato)·N.等人，临床研究杂志(J Clin Invest)，104：855-864(1999)；佐藤(Sato)，N·等人，J Natl Cancer Inst，93：1858-1864(2001))取决于音猬因子(Shh)信号传导。当Shh通路被阻断(使用抗体)时，则不会形成毛囊(王(Wang)·L.C.等人，实验皮肤病学(J Invest Dermatol)，114：901-908(2000))。将完整的Shh注入静止期皮肤后，将开始毛发生长周期中的生长期(佐藤(Sato)·N.等人，临床研究杂志(J Clin Invest)，104：855-864(1999))。后面一种发现还将在使用合成Shh激动剂时出现(帕拉迪尼(Paladini)·R.D.等人，实验皮肤病学(J Invest Dermatol)，125：638-646(2005))。

Shh通路的各个要素在上皮和真皮组分中表达。由于真皮细胞有助于毛囊的形态发生和循环，因此本发明的一个目的在于提供用于增强真皮细胞的毛原性的方法和组合物。

本发明的另一个目标在于提供用于治疗受试对象的脱发的方法和组合物。

本发明的另一个目的在于提供用于增强或维持培养的真皮细胞的毛原性的方法。

本发明的另一个目的在于提供用于激活或刺激Shh信号转导通路，以增强或维持真皮细胞的毛原性的方法和组合物。

本发明的另一个目的在于提供用于产生毛原性真皮细胞，以诱导受试对象中的毛囊的方法和组合物。

发明内容

本发明提供用于增强培养的细胞的毛原性的方法和组合物。本发明的一项实施例实现了在使用有效量的一种或多种音猬因子(Shh)通路激动剂的情况下，在体外培养分离的哺乳动物真皮细胞。所述激动剂可在通路中的任一点相互作用，以激活信号转导通路，从而相对于未处理的分离的哺乳动物真皮细胞而言，增强分离的哺乳动物真皮细胞的毛原性。例如，所述激动剂可以是Smoothened基因，它是Shh通路的信号转导物。细胞培养物可选择性地包括表皮细胞。优选Shh通路激动剂或Smoothened激动剂包括，但不限于，库里斯公司(Curis，Inc)提供的CUR-0201365和CUR-0236715。毛原性是用爱德兰丝发片分析(Aderans Hair Patch Assay^TM)进行测量的。在收获之前，培养的真皮细胞可在使用一种或多种Shh通路激动剂的情况下，保持培养至少1、2、3、4、5、6、7天或7天以上。

经过处理的真皮细胞可用于治疗哺乳动物受试对象的脱发问题，受试对象最好是人类。通常情况下，可从打算治疗的受试对象取得皮肤组织的外植体。对所述外植体进行处理，以将细胞离解成细胞悬液，随后在使用一种或多种Shh通路激动剂的情况下对所述细胞悬液进行培养。在一项实施例中，在将细胞植入受试对象的皮肤之前，所述细胞需要培养至少7天。细胞最好是自体的，但应了解，细胞也可以是异源的。将有效量的培养的真皮细胞植入受试对象的皮肤中，以形成毛囊或诱导毛囊形成。

另一项实施例提供分离的真皮细胞群体，相对于未经处理的细胞而言，所述分离群体的毛原性增强了至少1、5、10、15、20、25、30％到300％，具体由爱德兰丝发片分析确定。在爱德兰丝发片分析中，经处理细胞所具有的毛囊数量约为相同量的未经处理的细胞的3倍。

在某些情况下，已观察到当细胞维持在培养状态时，培养的真皮细胞的毛原性下降。已发现，可通过在使用有效量的一种或多种Shh通路激动剂的情况下培养细胞，减少毛原性下降的量或阻止毛原性下降。优选地，在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个传代之后，培养的真皮细胞中的毛原性水平仍得到维持。

附图说明

图1描绘的是使用音猬因子(Shh)通路激动剂B(CUR-0236715)处理的真皮细胞中的h-GLi1和h-PTCH1表达的倍数变化。“P”是指细胞传代。细胞在一个培养皿中生长一段时间。当细胞转移到另一个培养皿时，细胞视为传代。细胞的第一次平板接种视为传代零(P0)。当细胞从培养皿中提出并转到新容器中时，传代为P1，依此类推。细胞的培养时间长度通常用传代数表示。

图2A描绘的是在爱德兰丝发片分析中，用激动剂A(CUR-201365)处理的真皮细胞所产生的毛囊数量。图2B描绘的是在混合发片分析中，由在培养了一个传代以后用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞所产生的毛囊数量。图2C描绘的是在爱德兰丝发片分析中，由在培养了两个传代以后用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞所产生的毛囊数量。图2D描绘的是在爱德兰丝发片分析中，由在培养了三个传代以后用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞所产生的毛囊数量。图2E描绘的是在爱德兰丝发片分析中，由在培养了四个传代以后用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞所产生的毛囊数量。

图3A描绘的是用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞的群体倍增时间。图3B描绘的是在汇合时，用Shh通路激动剂处理的真皮细胞的细胞数(百万)。

图4A描绘的是在使用了用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞的混合发片分析中，形成的平均毛囊数。图4B描绘的是，对于在培养了两个传代后用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞，在使用了所述真皮细胞的爱德兰丝发片分析中形成的平均毛囊数。

图5A描绘的是，对于在培养了一个传代后用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞，使用了所述真皮细胞的烧瓶中的平均细胞数(百万)。图5B描绘的是，对于在培养了两个传代后用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞，使用了所述真皮细胞的烧瓶中的平均细胞数(百万)。图5C描绘的是，在培养了一个传代后用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞的群体倍增时间(天)。图5D描绘的是，在培养了两个传代后用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞的群体倍增时间(天)。

图6A描绘的是，对于在培养了一个传代后，在短时间(收获前7天)内连续用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞，在使用了所述真皮细胞的爱德兰丝发片分析中形成的平均毛囊数。图6B描绘的是，对于在培养了两个传代后，在短时间(收获前7天)内连续用指定量的Shh通路激动剂处理的真皮细胞，在使用了所述真皮细胞的爱德兰丝发片分析中形成的平均毛囊数。

图7描绘的是在爱德兰丝发片分析中，相对于使用了Shh通路激动剂的细胞培养中的指定细胞培养传代P0、P1、P2或P3，从人类胎细胞培养物形成的毛囊数。每个传代都具有两列，其中左列对应于在未用激动剂处理细胞的情况下获得的结果，右列显示的是在用激动剂处理细胞的情况下获得的结果。

图8描绘的是在爱德兰丝发片分析中，在指定的细胞培养传代中，在经过处理或未处理的细胞中，从人类胎细胞培养物形成的毛囊数。

图9描绘的是在爱德兰丝发片分析中，在指定培养基中，从人类胎细胞培养物形成的毛囊数。

具体实施方式

I.定义

术语“毛原性细胞”是指当施用于受试对象的皮肤时，用于诱导毛囊形成的细胞。

本文所用术语“分离”是指处于不同于自然形成的细胞所处环境的环境中，例如通过将真皮细胞与皮肤外植体分离等方式与自然环境分离的细胞。

术语“个体”、“宿主”、“受试对象”和“患者”在本文中是通用的，且指哺乳动物，包括，但不限于鼠科动物、猿猴类、人类、哺乳类家畜、哺乳类竞赛动物，以及哺乳类宠物。

本文所用术语“有效量”或“治疗学上的有效量”是指足以诱导毛囊形成，或诱导毫毛形成终毛，或诱导萎缩的头发逆转该过程并成为终毛的细胞量。对于细胞培养而言，刺猬因子激动剂的“有效量”是指作为体外培养方案的一部分应用于真皮细胞的激动剂的量，其中所述激动剂用于增强或维持培养的真皮细胞的毛原性。优选真皮细胞包括，但不限于，真皮细胞。所述细胞优选哺乳动物的细胞，最好是人类细胞。

术语“皮肤”是指躯体的外层保护性覆盖物，包括真皮(corium)、表皮和真皮(dermis)，且理解为包括汗腺和皮脂腺，以及毛囊结构。

术语“刺猬因子激动剂”或“音猬因子激动剂”是指增强或重演刺猬因子的生物活性的制剂，例如激活目标基因的转录。

本文所用术语“真皮细胞”或“真皮细胞群体”是指含有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％真皮细胞的细胞群体。所属领域中已知确定细胞为真皮细胞的方法。

本文所用术语“表皮细胞”或“表皮细胞群体”是指含有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％表皮细胞的细胞群体。所属领域中已知确定细胞为表皮细胞的方法。

II.刺猬因子信号传导

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)刺猬因子变异体的命名原因在于，这种变异体的表型在幼虫期中具有明显的表皮刺突，而所述幼虫期通常没有这些突起。对于哺乳动物而言，分泌糖蛋白的刺猬因子(Hh)蛋白家族包括至少三个成员：音猬因子(SonicHedgehog，Shh)、沙漠刺猬因子(Desert Hedgehog，Dhh)和印度刺猬因子(Ihh)。

刺猬因子(Hh)蛋白是在胚胎发育过程中，许多组织中的成形素，并且是细胞间信号传导的重要介质。对于细胞在胚胎中的图形化(patterning)、分化、增殖、存活和生长，音猬因子通路非常重要，且对于在神经元发育、肢体发育、肺部、骨骼、毛囊和内脏形成过程中的某些上皮间充质诱导性相互作用，成年脊椎动物刺猬因子蛋白十分重要。

Hh通路中的信号传导始于Shh与受体Patched(Ptc)的结合，其中Patched是12次跨膜区蛋白质。哺乳动物基因组包括2个patched基因，ptc1和ptc2。如果不使用Shh，则Ptc抑制七次跨膜蛋白质Smoothened(Smo)的活性。当Shh存在且与Ptc结合时，则暂停对Smo的阻抑，且促使fused(Fu)(一种丝氨酸-苏氨酸激酶)被活化，以及哺乳动物Gli家族(对应于果蝇中的Ci)的锌指转录因子从微管相关Fu-Gli-Su(fu)复合物[Su(fu)：Fused的抑制因子]分离。Gli转录因子包括Gli1、Gli2和Gli3。Shh通过Gli3，而不是Gli2来抑制形成抑制因子。这些转录因子移位到细胞核中，并诱使目标基因进行转录。包括Gli1和Ptc1的通路成员本身就是转录目标。

A.音猬因子

Shh参与包括大脑、心脏、肺部、骨骼和皮肤等脊椎动物器官的图形形成(佐藤(Sato)·N等人，临床研究杂志(J Clincal Investigation)，104(7)：855-864)。在皮肤中，胚胎发生过程中的毛囊形态发生和成年阶段毛囊生长和循环的调控需要Shh(帕拉迪尼(Paladini)·R.D.等人，实验皮肤病学(J Invest Dermatol)，125：638-646(2005))。Shh在出生后小鼠皮肤中的暂时性过度表达导致毛囊的生长期开始。(佐藤(Sato)·N.等人，实验皮肤病学(J Clincal Investigation)，104(7)：855-864)；佐藤(Sato)·N.等人，国立癌症研究所杂志(J.National Cancer Inst)，93(24)：1858-1864(2001))。

Shh的表达在预定中线中胚层中，小鼠、大鼠和鸡中的结节中，以及斑马鱼的外壳中的原肠胚形成期开始后的不久开始。在鸡胚胎中，Shh在结节中的表达图左右不对称。

在CNS中，源自脊索和底板的Shh似乎诱导腹侧细胞命运。当以异位方式表达时，Shh导致小鼠、爪蟾(Xenopus)和斑马鱼的中后脑的大片区域腹型化(ventralization)。在处于脊髓层面的中间神经外胚层的外植体中，Shh蛋白诱使底板和运动神经元分别以不同的浓度阈值发育，底板的浓度高，而运动神经元的浓度较低。此外，抗体阻断显示，对于运动神经元命运的脊索介导性诱导，需要由脊索产生的Shh。产Shh中线细胞表面上的高浓度Shh似乎引起了体外观察到的底板的接触介导性诱导，以及在体内底板直接在脊索上的中线定位。据推测，在已证实为体外不依赖于接触的过程中，从脊索和底板释放的较低浓度的Shh对位于较远腹侧区域中的运动神经元起诱导作用。在从中脑和前脑层面中获取的外植体中，Shh也分别诱导合适的腹侧神经元细胞类型、多巴胺能前体和胆碱能前体，这表示Shh是整个CNS长度上的腹特化(ventral specification)的常规诱导物。这些观察结果提出了一个问题，即如何调控在特定的前后位置上对Shh的差别反应。

源自中线的Shh也可使以下各项图形化：脊椎动物胚胎的近轴区、躯干中的体节，以及体节的头部间充质嘴(head mesenchyme rostral)。在鸡和小鼠的近轴中胚层外植体中，Shh以生皮肌节(dermamyotomal)标记Pax3为代价，促进Pax1和Twist等生骨节特异性标记的表达。此外，过滤屏障实验显示，Shh直接对生骨节的诱导进行介导，而不是通过激活二级信号传导机构来进行介导。Shh也对生肌节基因表达进行诱导，尽管某些实验表明，同时需要WNT家族的成员，也就是无翼果蝇的脊椎动物同源物。

B.印度刺猬因子

Ihh在软骨发育的调节方面具有十分重要的作用。在软骨形成过程中，软骨细胞经由一种前肥大(prehypertrophic)中间状态从增殖状态发展为分化的肥大软骨细胞。Ihh在前肥大软骨细胞中表达，且引发了会阻滞软骨细胞分化的信号级联。它的直接目标是环绕Ihh表达区的软骨膜，所述软骨膜通过Gli和Ptc的表达来做出反应。最有可能的情况是，引发二级信号传导，从而致使关节周软骨膜中合成甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)。PTHrP本身会将信号发送回前肥大软骨细胞，从而阻止细胞进一步分化。同时，PTHrP抑制Ihh的表达，从而形成调节软骨细胞分化速率的负反馈回路。

C.沙漠刺猬因子

在表达方面，沙漠刺猬因子(Dhh)的限制程度最高，且Dhh基因缺失小鼠是可以生存的；它主要在小鼠胚胎发育中，以及成年啮齿动物和人类的睾丸中表达。各类研究中都已证实了在男性分化方面，Dhh基因和它的鼠科动物同源物的重要性(比特古德(Bitgood)和麦克马洪(McMahon)，发育生物学(Dev Biol)，172：126-138(1995)；比特古德(Bitgood)·M.J.等人，当代生物学(Curr Biol)，6：298-304(1996))。克拉克(Clark)·A.M.等人在生殖生物学(Biol Reprod)，63：1825-1838(2000)中报告，大多数Dhh基因缺失雄性小鼠将发育成假两性体。其它研究表明，管周肌样细胞的分化和由此而引起的睾丸索形成是由Dhh控制的(佩鲁奇·阿尔维斯(Pierucci-Alves)·F.等人，生殖生物学(Biol Reprod)，65：1392-1402(2001))。此外，有人指出，Dhh/Patched 1信号传导是胚胎期睾丸中的类固醇生成型睾丸间质细胞(Leydig)的分化的正调节剂(Yao(姚)·H.等人，基因发展(Genes Dev)，161433-1440(2002))。在人体研究中，梅原(Umehara)·F.等人在美国人类遗传学(Am J Hum Genet)，67：1302-1305(2000)中指出，在一位患有与伴微束神经疾病关联的46-XY部分性腺发育障碍症的患者体内发现了Dhh基因的纯合子错义突变；同样的，在三位患有46-XY完全单纯性性腺发育障碍症(PGD)的患者体内发现了Dhh基因的纯合子突变(坎托(Canto)·P.等人，临床内分泌学与代谢(J Clin Endocrinol Metab)，89：4480-4483(2004))。所有这些发现均显示，Dhh是干预性别分化的主要分子。

II.音猬因子信号转导通路的激动剂

音猬因子信号转导通路的激动剂在所属领域中是已知的。授予巴克斯(Baxter)等人的第6,683,108号美国专利公开了Shh的小分子非肽类激动剂，其中所述专利以引用的方式全文并入本文中。也可在市场上购买到库里斯公司(剑桥，马萨诸塞州，Curis，Inc)提供的音猬因子信号传导通路的激动剂。Shh通路的优选激动剂包括，但不限于，CUR-0236715和CUR-0201365。激动剂的一般结构已在第6,683,108号美国专利中提供。优选激动剂具有以下结构：

III.在细胞培养中使用音猬因子激动剂

A.强细胞培养物的毛原性

本发明的一项实施例提供了一种增强培养的细胞的毛原性的方法，其通过在使用有效量的音猬因子通路激动剂的情况下在体外培养分离的哺乳动物真皮细胞，而相对于未经处理的分离的哺乳动物真皮细胞，增强分离的哺乳动物真皮细胞的毛原性。培养的细胞最好是人类真皮细胞。在一项实施例中，Shh通路激动剂的含量范围是0.125μg/ml到0.625μg/ml。另一项实施例提供了由发片分析确定的，相对于未处理细胞而言，毛原性增强了至少1％、5％、10％、15％、20％、25％或30％的分离的真皮细胞群体。

真皮细胞群体，最好是来源于外植体组织的，可持续存在于体外，且通过与一种或多种上述Shh通路激动剂接触，相对于未处理的细胞而言，它们的毛原性可增强或保持不变。在某些实施例中，共同培养真皮细胞和表皮细胞的组合。优选Shh通路激动剂包括，但不限于，由库里斯公司(剑桥，马萨诸塞州，Curis，Inc)提供的CUR-0236715和CUR-0201365。通常情况下，所提供的方法包括以下步骤：将真皮细胞从哺乳动物分离，使这些细胞存活于体外，最好是在包括以下项的生长培养基中：生长因子、营养物、辅因子和其它传统细胞培养添加剂，和/或所属领域中已知的补充物。外植体组织来源于受试对象，最好是人类。外植体组织通常是含有毛囊的皮肤的外植体。外植体可以是自体的，也可以是异源的。

源自外植体或供体组织的细胞被分离成单个细胞或含有少量细胞的聚集体。可使用任何已知的程序，包括用诸如胰蛋白酶和胶原酶等酶进行的处理，或使用用钝器分离或用手术刀切块等物理分离方法来进行所述分离，以从组织中生长出特定类型的细胞。

分离的细胞可置于能够支持细胞生长的任何已知的培养基中，包括MEM、DMEM和RPMI、F-12，其中含有细胞新陈代谢所需的补充物，诸如谷氨酰胺和其它氨基酸、维生素、矿物质和有用的蛋白质(诸如转铁蛋白)。培养基也可含有防止受到酵母菌、细菌和真菌污染的抗生素，例如青霉素、链霉素和庆大霉素。某些情况下，培养基可含有来源于牛、马和鸡的血清。尤其优选的细胞培养基是DMEM和F-12的混合物。

培养条件应接近于生理条件。培养基的pH应接近生理pH，优选介于pH 6-8之间，更好是接近pH 7，最好是接近约pH 7.4。细胞培养温度应接近生理温度，优选30℃到40℃之间，更好是32℃到38℃之间，最好是35℃到37℃之间。

细胞可在悬液中或基质上生长。在繁殖的情况下，细胞称为分裂或传代悬液细胞，其以较低速率收获和离心。培养基被抽吸出，细胞重新在具有生长因子的少量培养基中悬浮，且细胞以机械方式分离并重新在单独的等分细胞培养基中悬浮。

培养基中的细胞悬液补充有允许细胞增殖的任何生长因子，并接种于任何能够保持细胞的容器中，最好是培养瓶或滚瓶中。在37℃的孵育器中，细胞通常在3到4天内增殖，且可在此后的任何时候，通过分离细胞并在含有生长因子的新鲜培养基中重新悬浮来重新开始增殖。在优选实施例中，在收获前，真皮细胞在使用一种或多种Shh激动剂的情况下，培养1、2、3、4、5、6、7天或7天以上。

B.维持培养中细胞的毛原性

可通过将一种或多种Shh激动剂加入细胞培养基来维持培养的真皮细胞的毛原性。在一项实施例中，与未处理的细胞相比，真皮细胞在至少一代、二代、三代或四代细胞培养后仍然保持其毛原性。在实践中，只有特定数量的细胞可在给定的烧瓶中有效地生长，直到其不再起作用或耗尽生长培养基并开始死亡。一旦达到烧瓶的最大容量，其中的细胞群体将分离到多个烧瓶中并被子培养。该过程称为传代。传代点可以主观确定，或根据经验确定。在实验室规模中，培养烧瓶可进行目视检查，以评估平板的覆盖面积、细胞连通性和细胞分布。

在一项实施例中，可在至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个传代之后通过在使用有效量的一种或多种Shh通路激动剂的情况下培养细胞来维持培养的真皮细胞的毛原性水平。维持真皮细胞的毛原性是指，当植入受试对象的皮肤内后，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％的培养细胞保有形成毛囊或诱导毛囊形成的能力。

在又一项实施例中，在细胞培养过程中，与未使用Shh通路激动剂进行培养的真皮细胞相比，真皮细胞的毛原性增强了至少5％、10％、15％或20％。

C.测量毛原性

真皮细胞群体的毛原性活性可使用爱德兰丝发片分析来确定(郑·Y.，实验皮肤病学(J Invest Dermatol)，124：867-876(2005))。在该分析中，分离的真皮细胞和表皮细胞被植入无免疫活性的小鼠的真皮或皮下组织中。在该分析中，通过使用小鼠新生皮肤细胞，新毛囊通常在8到10天内形成。新形成的小囊显现正常毛干、成熟皮脂腺和自然毛发周期。尽管该分析中形成了正常循环的毛囊，但该分析主要测量的是细胞或细胞组合形成新毛囊的能力。小鼠真皮细胞与小鼠新生表皮细胞一起进行分析。

IV.使用毛原性增强的真皮细胞的方法

A.毛囊诱导

使用所公开的方法获得的毛原性活性增强的真皮细胞可用于在受试对象中生成新毛囊。待植入毛原性能力增强的真皮细胞的受试对象包括毛发量不足或毛发生长率不足的任何受试对象。合适的受试对象包括存在以下情况的受试对象：雄激素性脱发、由任何原因导致的伤疤、斑秃、静止期脱发、甲状腺疾病、营养不良、盘状红斑狼疮、扁平苔藓、基因型脱发，或减少毛发生长或导致脱发的荷尔蒙失调。受试对象可能具有这些病症，或者基于遗传因素、行为因素或环境倾向或其它因素，易于产生这些病症。其它合适的受试对象包括接受导致毛发生长减少或脱发的治疗的受试对象，例如化疗或放射。其它合适的受试对象包括以下受试对象：患有头皮或头发损伤，具有结构性毛干异常，或曾接受皮肤植片等产生需要生长毛发的皮肤区域的外科手术。其它合适的受试对象包括原应生长毛发的区域中存在皮肤伤疤的受试对象。所述伤疤可能由损伤、烧伤、手术、放射、基因型异常、先天性丧失等形成。

真皮细胞且选择性地表皮细胞群体可植入受试对象的需要增进毛发生长的区域中。优选的植入位置包括受试对象的头皮、脸部或眉毛区域。

植入受试对象中的细胞可以是自体的、异源的或异基因的。在一项实施例中，真皮细胞和表皮细胞是从单个异源供体的皮肤切片获得的，或者所述细胞是自体的。在另一项实施例中，真皮细胞和表皮细胞是从一个以上供体的皮肤切片获得的。例如，真皮细胞可来源于一个供体，而表皮细胞可来源于另一供体。在优选实施例中，植入的细胞是自体的。

在植入受试对象中之前，选择性地以合适的比率将真皮细胞与表皮细胞相组合。适当地，表皮细胞与真皮细胞的比率在约0∶1、1∶1、1∶2或1∶10的范围内。在植入之前，真皮细胞和表皮细胞可与额外的细胞类型进一步组合，例如黑素细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、内皮细胞以及骨髓细胞。在植入之前，待植入的真皮细胞和表皮细胞可能发生物理和/或生物化学聚集，以诱导和/或维持细胞在移植部位内的聚集。例如，细胞可通过离心培养物来聚集。作为补充或替代，可在植入之前或之间向细胞中加入合适的聚集增强物质。合适的聚集增强物质包括，但不限于，诸如纤连蛋白或糖胺聚糖、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、蛋白聚糖、硫酸肝素和胶原等糖蛋白。

可使用所属领域中已知的常规方法将细胞植入受试对象中。可使用各种给药途径和各种部位。例如，可将细胞直接引入治疗部位的表层皮肤层的真皮和表皮之间。这可通过使治疗部位的皮肤上起疱，并将细胞引入所述疱的流体中来实现。也可将细胞引入穿过表皮向下延伸到真皮中的合适切口中。可使用常规技术来形成所述切口，例如使用手术刀或皮下注射针。所述切口的每一侧都可填充有细胞，所述细胞大体可达十分接近真皮的位置。在优选实施例中，使用授予普鲁特(Pruitt)等人的第2007/0233038号美国专利申请公开案中描述的装置来输送细胞。

注入的细胞剂量通常介于每平方厘米约1百万个细胞到约4百万个细胞之间。

在另一项实施例中，在植入细胞的皮肤中形成多个小接受部位，例如10、50、100、500或1000或1000以上。每个穿孔可填充有多个细胞。穿孔的大小和深度可改变。皮肤中的穿孔可通过常规技术形成，且可包括使用切皮仪器，例如手术刀或皮下注射针或激光器(例如低功率激光器)。或者，可使用多穿孔设备，其具有经形成和排列以同时在皮肤中形成多个隔开的穿孔的多个刀刃。可同时将细胞引入皮肤中的多个穿孔中。

表皮细胞、真皮细胞或这两者的组合可与药理学上合适的载剂相组合，例如盐水溶液或磷酸盐缓冲盐水溶液。在优选实施例中，所述载剂可为合适的培养基，例如杜尔贝科氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(“DPBS”)、DMEM、D-MEM-F-12或HYPOTHERMOSOL-FRS。细胞也可与保存溶液相组合，例如包括，但不限于蒸馏水或去离子水与乳糖酸钾、磷酸钾、蜜三糖、腺苷、别嘌呤醇、喷他淀粉前列腺素E1(pentastarchprostaglandin E1)、硝酸甘油和/或N-乙酰半胱氨酸混合成溶液的溶液。合适地，所采用的保存溶液可与诸如HYPOTHERMOSOL-FRS等标准器官和生物组织保存水性冷藏溶液类似。

细胞和载剂可组合，以形成适于注射的悬液。每个开口中植入有效量的细胞，以在该开口中生成新的毛囊。引入每个开口中的细胞数可不同，具体取决于各种因素，例如开口的大小和深度，以及细胞的总体成活力和毛原性活性。待注入的细胞剂量通常介于每平方厘米约1百万个到约4百万个细胞之间。在一项实施例中，每次注射输送了约50,000个到约2,000,000个细胞。细胞浓度可为约5,000个到约1,000,000个细胞/微升，通常为约50,000个细胞/微升到约75,000个细胞/微升。每次注射所输送的代表性细胞体积为约1到约10μl，最好为约4μl。在一项实施例中，在皮肤，最好是头皮中，进行每平方厘米1到100次注射，通常为每平方厘米1到30次注射。

使用异体来源的真皮细胞和/或表皮细胞可能需要施用免疫抑制剂，改变组织相容性抗原，或使用屏障装置来防止植入细胞的排斥反应。细胞可以单独施用，或与屏障或制剂组合施用，以抑制或减小受体受试对象中对植入细胞的免疫反应。例如，可将免疫抑制剂施用于受试对象中，以抑制或干扰受试对象体内的正常反应。所述免疫抑制剂可为免疫抑制药物，其抑制受试对象体内的T细胞或B细胞活性。免疫抑制药物的实例可在市场上购买到(例如环孢素)。免疫抑制剂，例如免疫抑制药物可以足够获得所需治疗效果(例如抑制细胞的排斥反应)的剂量施用于受试对象。

免疫抑制剂也可为抑制受试对象体内的T细胞活性的抗体、抗体片段或抗体衍生物。能够用尽或螯合T细胞的抗体可为(例如)多克隆抗血清，例如抗淋巴细胞血清；以及单克隆抗体，例如结合到T细胞表面上的CD2、CD3、CD4、CD8或CD40的单克隆抗体。此类抗体可在市场上购买到，例如美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection)产品，例如OKT3(ATCC CRL 8001)。抗体可施用适当的时间，例如至少7天，例如至少10天，例如至少30天，以抑制在植入后培养的DP细胞的排斥反应。可将抗体置于药理学上可接受的载剂，例如盐水溶液中来施用于静脉内。

在某些实施例中，在植入细胞之前、同时和/或之后用促进毛发生长的毛发生长促进物质来局部和/或系统性治疗受试对象。合适的毛发生长促进物质可包括，例如米诺地尔、环孢素，以及天然或合成类固醇激素及其强化剂和拮抗剂，例如抗雄激素类物质，所述这些物质均可在市场上购买到。

B.终毛诱导

另一项实施例提供了一种用于诱导毫毛成为终毛的方法。毫毛是覆盖儿童和成人躯体的很细且非着色的毛发(桃毛)。终毛是成熟的毛发，与更短且更细的毫毛相比，终毛通常更长、更粗、更厚且更黑。如上所述，男性型脱发的表现中存在从终毛到毫毛毛囊的形态发生转变。

在一项实施例中，如上所述，毛原性能力增强的真皮细胞被注入皮肤中。所述真皮细胞是按照上述方式获得的，且通常是自体细胞。所述细胞被注射到毫毛或毫毛毛囊中或附近。多份真皮细胞注射剂可输送到含有毫毛的皮肤区域，以诱导尽可能多的毫毛毛囊成为终毛毛囊。应了解，待注射的注射剂数量和细胞体积可由所属领域的一般技术人员以常规方式制成。

在另一项实施例中，毛原性能力增强的真皮细胞以可诱导毛囊形成并诱导毫毛毛囊成为终毛毛囊的有效量被注射到皮肤中。

除非另行规定，否则本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的一般技术人员所常规理解的意义相同。本文所引用的出版物及其所引用的材料以引用方式明确并入本文中。

实例

实例1：音猬因子通路的刺激

细胞培养

可使用任何已知的程序，包括用诸如胰蛋白酶和胶原酶等酶进行处理，或使用用钝器分离或用手术刀切块等物理分离方法来进行细胞分离，以从组织中生长出特定类型的细胞。

分离的细胞可置于能够支持细胞生长的任何已知的培养基中，包括MEM、DMEM和RPMI、F-12，其中含有细胞新陈代谢所需的补充物，诸如谷氨酰胺和其它氨基酸、维生素、矿物质和有用的蛋白质(诸如转铁蛋白)。培养基也可含有防止受到酵母菌、细菌和真菌污染的各种抗生素，例如青霉素、链霉素和庆大霉素。在某些情况下，培养基可含有来源于牛、马或鸡的血清。尤其优选的细胞培养基是DMEM和F-12的混合物。

Shh通路激动剂可以所需浓度作为添加剂添加到基础培养基中。在收获前，细胞可用Shh通路激动剂处理1、2、3、4、5、6、7天或7天以上。

结果

图1显示，Shh通路激动剂化合物刺激了音猬因子通路的各组分的转录。在使用来源于各种患者的分离和聚集的真皮细胞的一系列研究中显示，细胞暴露于Shh通路激动剂可刺激Shh生长因子家族(也就是Gli1和Ptc)的各种成员的基因表达；qPCR检测到了转录物。

实例2：所用化合物的剂量反应以及生物分析

爱德兰丝发片分析

真皮细胞群体的毛原性活性用爱德兰丝发片分析来确定(郑·Y.，实验皮肤病学(JInvest Dermatol)，124：867-876(2005))。在该分析中，分离的真皮细胞和表皮细胞被植入无免疫活性的小鼠的真皮或皮下组织中。在该分析中，通过使用小鼠新生皮肤细胞，新毛囊通常在8到10天内形成。新形成的小囊显现正常毛干、成熟皮脂腺和自然毛发周期。尽管该分析中形成了正常循环的毛囊，但该分析主要测量的是细胞或细胞组合形成新毛囊的能力。在经典发片分析中，小鼠新生真皮细胞与小鼠新生表皮细胞一起分析。在该分析的变体中，在存在小鼠新生表皮细胞的情况下分析成人真皮细胞。

结果

在初步研究中，使用了四种不同浓度的库里斯公司(Curis，Inc.)的一种Shh通路激动剂(激动剂A-CUR-0201365)，分别为0、0.005、0.05和0.125μg/ml(图2A)。在第二项研究中，剂量被进一步增加到0.625μg/ml(图2B)。与未处理的细胞相比，在发片分析(每注射1百万个细胞)中在含有Shh通路激动剂A(CUR-0201365)的培养基中生长的细胞所生成的毛囊较多。此外，观察结果显示，剂量与反应之间的关系为，培养基中Shh通路激动剂浓度越高，效果越好(发片中的毛囊数)。Shh激动剂处理将细胞毛原性延长到后面的传代。对于未使用激动剂的传代(P1到P4)，毛原性减弱，同时在最高浓度中，细胞活性维持在高水平(图2B)。尽管活性并未趋于平稳，但在较高浓度中，细胞生长率降低(图3)。激动剂A的最佳浓度显示为低于0.625μg/ml，但高于0.125μg/ml。当细胞在使用Shh通路激动剂的情况下生长时，在发片分析中形成的毛囊数较高。

测试了第二化合物(激动剂B，CUR-0236715)。与第一化合物类似，经处理细胞实现在使用各种浓度激动剂的所有发片分析中增加毛囊数量。相对于P1中的未处理对照物，所有浓度均显示毛囊数显著不同。中等浓度0.0375μg/ml对于P2中的毛囊形成最佳(图4B)。在测试的所有浓度中，该第二激动剂(B)未显示对于细胞生长或产量的任何不良影响(图5)。

实例3：短期处理的细胞感应性

要调查Shh通路激动剂在使用短期处理(收获前7天)是否可增加细胞的感应性，用激动剂B测试了3个患者样本。对于每个样本，在传代P1或P2用0、0.0125、0.0375、0.05和0.15μg/ml的Shh通路激动剂B处理细胞。P1和P2细胞随后在约7天内收获，且在混合发片分析中进行分析。可在这些短期处理样本中看到相同的结果(图6A和6B)，其中用Shh通路激动剂B处理的所有细胞所产生的毛囊数都多于对照物。在该研究中，中等浓度(0.0375μg/ml)经证实对P1和P2细胞最佳。中等浓度的Shh通路激动剂B在短期处理(7天)中增加了毛囊数。细胞仅在所述7天内处理，而不在之前进行处理。

连续处理结果如图4所示。短期结果可与连续处理的结果相当。

实例4：用于人类胎细胞和小鼠细胞的SHH激动剂

最近，我们已将我们对SHH通路激动剂B(CUR-0236715)对毛发诱导活性的影响的研究从人类成人细胞延伸到人类胎细胞和小鼠细胞。在P0中用SHH通路激动剂B(37.5ng/ml)处理人类胎细胞可使得爱德兰丝发片分析中的毛发数增加3倍以上(图7)，倍数变化与成人细胞的十分相似。当细胞在使用SHH通路激动剂的情况下持续培养时，由SHH处理所引起的毛发数增加延伸到后面的传代(P3)中(图7)。

在另一项实施例中，细胞在不含SHH通路激动剂的培养基中初步培养。SHH通路激动剂CUR-0236715仅在特定传代开始时添加到培养物中，且仅历时所述传代(如图8的P1和P4)。在这些后续传代中添加SHH通路激动剂B(CUR-0236715)仍然能够增强胎细胞的毛原性。如图2所示，当细胞仅在P1或P4暴露于Shh通路激动剂B时，形成的毛囊数量是无SHH对照细胞的约5倍，且等于在整个培养过程中由激动剂一直处理的细胞所形成的毛囊数(图7)。

值得注意的是，SHH通路激动剂B的毛原性增强效应可能是取决于培养基的。如图9所示，当将激动剂添加到细胞培养基时，毛发数量会增加，而在诸如Amniomax和Chang培养基(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚)，以及长田(Osada)·A.等人，组织工程(Tissue Eng)，13(5)：975-82(2007)所用的培养基等其它可在市场上购买到的培养基中，所测试的效果不明显。

除了培养的人类细胞之外，SHH通路激动剂B被添加到小鼠新生真皮细胞培养中。初步数据显示，用SHH通路激动剂处理的小鼠细胞的活性也有增强，如发片分析中形成的毛囊数量所示(图10)。该结果显示，SHH激动剂的毛原性增强效应并不限于人类细胞。除了增加毛发数量之外，相对于由未处理细胞形成的毛囊的大小而言，由经过SHH激动剂处理的细胞形成的毛囊的大小也有显著增加。

除非另行规定，否则本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的一般技术人员所常规理解的意义相同。

所属领域的一般技术人员应了解，或仅仅使用常规实验即可确定，本文所述的本发明的具体实施例的许多等效物。此类等效物意图由以下权利要求涵盖。

Claims

1.一种用于增强培养的细胞的毛原性的方法，包括

在使用有效量的一种或多种音猬因子通路激动剂的情况下在体外培养分离的哺乳动物真皮细胞，以相对于未处理的分离的哺乳动物真皮细胞，增强所述分离的哺乳动物真皮细胞的所述毛原性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述音猬因子通路激动剂具有以下化学式

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述毛原性用发片分析进行确定。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类的。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离的哺乳动物真皮细胞在使用有效量的音猬因子通路激动剂的情况下培养至少1、2、3、4、5、6、7天或7天以上。

6.一种用于治疗脱发的方法，包括

将通过权利要求1到5的方法中的任一种获得的分离的哺乳动物细胞以可形成毛囊的有效量植入有需要的受试对象中。

7.一种通过权利要求1到5的方法中的任一种获得的分离的哺乳动物细胞群体。

8.一种延长培养的真皮细胞的毛原性的方法，包括

将真皮细胞从皮肤外植体分离；

在使用有效量的刺猬因子激动剂的情况下培养分离的真皮细胞，以相对于未处理细胞，将分离的细胞的所述毛原性维持到至少第二个传代；

将所述细胞以可诱导毛囊形成或逆转毛发萎缩的有效量注入受试对象的皮肤中。

9.根据权利要求8所述的方法，其中如发片分析所确定的那样，相对于未处理细胞，分离的真皮细胞的毛原性维持到至少第三个传代。

10.根据权利要求8所述的方法，其中如发片分析所确定的那样，相对于未处理细胞，分离的真皮细胞的毛原性维持到至少第四个传代。

11.一种用于在受试对象中诱导毛囊形成的方法，包括

将真皮细胞从来源于所述受试对象的外植体分离；

在使用有效量的音猬因子激动剂的情况下培养分离的真皮细胞，以相对于未处理的分离的真皮细胞，增强分离的真皮细胞的毛原性；

收获分离的真皮细胞；以及

将有效量的所收获的分离的真皮细胞注入所述受试对象中，以形成毛囊或逆转毛发萎缩。