CN104602763B - 用于调节毛发生长的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节毛发生长的组合物和方法。具体地，本发明涉及通过调节前列腺素D2(PGD2)受体之一DP‑2(GPR44)的活性来调节毛发生长。用于调节毛发生长的组合物和方法包括：通过施用DP‑2激动剂来抑制毛发生长，或通过施用DP‑2拮抗剂来刺激毛发生长。

Description

用于调节毛发生长的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年3月21日提交的美国临时专利申请61/613,829的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于调节毛发生长的组合物和方法。具体地，本发明涉及通过调节前列腺素D2(PGD2)受体之一DP-2(GPR44)的活性来调节毛发生长。
背景技术
80％的高加索男性在70岁之前经历一定程度的雄激素性脱发(AGA)。睾酮是AGA发展所必需的，并且雄激素受体中的遗传易感性基因座存在于少数具有AGA的男性中；但是，促成该障碍的额外因素仍然未知。对AGA的研究具有洞察其它雄激素介导的疾病(诸如良性前列腺肥大和前列腺癌)的潜力。AGA的当前合法治疗包括非那雄胺、米诺地尔和毛发移植。非那雄胺会抑制5-a还原酶2(SRD5A2)，所述SRD5A2将睾酮转化成更有效的雄激素二氢睾酮。尚未最终鉴别出米诺地尔在AGA治疗中的活性靶标。
在AGA中，形成厚毛干的大“末端”毛囊随时间小型化成小毛囊，所述小毛囊产生极微小的衰老毛发。毛囊小型化伴随着毛囊生长期(毛发生长初期)的持续时间的减小，所述毛囊生长期通常持续数年以生长超过1m长的毛发，但是其在AGA中减小至仅数天或数周。这导致光秃头皮中含有极微小毛发的静止(静止期)毛囊的百分比的增加。
除了毛囊的这些内在变化以外，已经在小型化毛囊周围(特别是在富含干细胞的凸起区域中)鉴别出浸润性淋巴细胞和肥大细胞。皮脂腺(其附着于每个毛囊)在光秃头皮中是肥大的。在光秃头皮中，毛囊干细胞的数目保持完整，而更活跃地繁殖的祖细胞的数目显著减少。这指示，光秃头皮要么缺少活化剂，要么具有毛囊生长的抑制剂。
因此，需要鉴别和表征调节毛囊生长的药剂。
发明内容
在一个方面，本文提供了用于在受试者中调节毛发生长的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的DP-2激动剂或拮抗剂。
在另一个方面，本文提供了用于在受试者中刺激毛发生长的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的DP-2拮抗剂。
在另一个方面，本文提供了用于在受试者中抑制毛发生长的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的DP-2激动剂。
在另一个方面，本文提供了用于在受试者中调节毛发生长的组合物，所述组合物(例如，局部制剂)包含：有效地调节所述受试者中的毛发生长的量的DP-2激动剂或拮抗剂。
在另一个方面，本文提供了用于在受试者中刺激毛发生长的组合物，所述组合物(例如，局部制剂)包含：有效地增强所述受试者中的毛发生长的量的DP-2拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中抑制毛发生长的组合物，所述组合物(例如，局部制剂)包含：有效地抑制所述受试者中的毛发生长的量的DP-2激动剂。
在另一个方面，本文提供了用于筛选化合物作为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的方法，所述方法包括下述步骤：在有疑似为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性；在相同条件下，在没有所述疑似为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性，其中在有所述化合物存在下与在没有所述化合物存在下相比更低的DP-2活性，指示治疗雄激素性脱发的潜在药剂。在某些实施方案中，所述方法还包括：在有所述疑似为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性；在相同条件下，在没有所述疑似为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性，其中在有和没有所述化合物存在下更低的DP-2活性和大约相等的DP-1活性，指示治疗雄激素性脱发的潜在药剂。在某些实施方案中，筛选多个化合物。
在另一个方面，本文提供了用于筛选化合物作为刺激毛发生长的潜在药剂的方法，所述方法包括下述步骤：在有疑似为刺激毛发生长的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性；在相同条件下，在没有所述疑似为刺激毛发生长的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性，其中在有所述化合物存在下与在没有所述化合物存在下相比更低的DP-2活性，指示刺激毛发生长的潜在药剂。在某些实施方案中，所述方法还包括：在有所述疑似为刺激毛发生长的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性；在相同条件下，在没有所述疑似为刺激毛发生长的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性，其中在有和没有所述化合物存在下更低的DP-2活性和大约相等的DP-1活性，指示刺激毛发生长的潜在药剂。在某些实施方案中，筛选多个化合物。
在另一个方面，本文提供了用于筛选化合物作为抑制毛发生长的潜在药剂的方法，所述方法包括下述步骤：在有疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物存在下，测量DP-2活性；在相同条件下，在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性，其中在有前列腺素D2存在下等于或大于DP-2活性的所述疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物的DP-2活性，指示抑制毛发生长的潜在药剂。在某些实施方案中，所述方法还包括：在有所述疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物存在下，测量DP-1活性；在相同条件下，在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性，其中在有前列腺素D2存在下等于或大于DP-2活性的所述疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物的DP-2活性和在有前列腺素D2存在下等于或小于DP-1的活性的所述疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物的DP-1活性，指示抑制毛发生长的潜在药剂。在某些实施方案中，筛选多个化合物。
从下述详细描述实施例和附图将明白本发明的其它特征和优点。但是，应当理解，所述详细描述和具体实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅仅通过例证给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
本专利申请文件含有至少一幅彩色绘制的附图。在请求并支付必要的费用后，含有彩图的该专利申请公开的复制件将由官方提供。
图1.得自5个具有AGA的男性的有毛发头皮相对于光秃头皮的基因表达谱的总结。(A)对于所有有毛发样品之间、所有光秃样品之间、或个体内有毛发样品相对于光秃样品之间的差异程度的相关系数。数据是平均值±SEM(n＝5)。***P<0.001，相对于仅毛发和仅光秃二者。(B)标有A至E的5个男性中有毛发头皮和光秃头皮中的250个显著基因的基因簇集算法。(C)在y轴上具有基因表达水平的不连续图，并将沿着250个最显著基因的x轴分组成对的样品分成在有毛发(H)头皮中较高的那些(169；左)和在光秃(B)头皮中较高的那些(81；右)。在每一对中，第一个样品(线开始)是有毛发头皮，第二个样品(线结束)是光秃头皮。(D)有毛发头皮(左)相对于光秃头皮(右)中的基因本体论分类。列出的百分比是每个种类中的转录物的数目除以独特基因转录物的总数。P值是每个功能种类的显著富集的经修改的Fisher精确EASE(Expression Analysis Systematic Explorer)评分。(E)光秃头皮与有毛发头皮相比的PTGDS表达的倍数变化。数据是平均值±SEM(n＝5)。***P<0.0001，对于覆盖PTGDS基因内的不同区域的每个探针集合，在有毛发头皮和光秃头皮之间。(F)PGD2途径的示意图。
图2.具有AGA的男性的光秃头皮中增加的PGD2途径活性。(A)如通过qPCR所试验的，光秃头皮相对于有毛发头皮中的脂质运载蛋白型PTGDS mRNA的表达。数据是平均值±SEM(n＝4)。(B和C)成对的光秃头皮(B)和有毛发头皮(H)(n＝4)中PTGDS蛋白的量，如使用用于验证等量负载的丽春红染料的蛋白质印迹法所证实的(B)和归一化至有毛发头皮的它的定量(C)。数据是平均值±SEM。(D)如通过ELISA试验的，光秃头皮中的PGD2产生。数据是平均值±SEM(n＝3)。(E和F)光秃头皮与有毛发头皮相比，PGD2(n＝17)、15-dPGJ2)(n＝7)和PGE2(n＝17)表达的倍数变化(E)。在(F)中定量了总前列腺素含量。数据是平均值±SEM。*P<0.05；**P<0.01。在(F)中，P值对比了每种前列腺素的有毛发样品相对于光秃样品。
图3.在毛发生长中期中，鼠毛囊中的Ptgds表达的增加先于PGD2水平的升高。(A和B)在PN18至PN53，在毛囊周期的不同阶段测量了Ptgds(n＝4)、Ptgfr(n＝4)和Fgf5(n＝4)mRNA(A和B)和PGD2脂质(n＝3)(B)。字母对应于毛发周期阶段：A，毛发生长初期；C，毛发生长中期；T，静止期。数据是平均值±SEM。在(A)中，**P<0.01，对于Ptgds和Fgf5而言，毛发生长初期晚期相对于第一静止期，对于Ptgfr而言，第一静止期相对于第二静止期。在(B)中，*P<0.05，对于PGD2而言，毛发生长中期相对于毛发生长初期早期。(C)在脱毛诱导的毛囊周期中，在鼠皮肤中Ptgds的表达(n＝3)和PGD2的产生(n＝3)。数据是平均值±SEM。*P<0.05，对于Ptgds而言，第17天相对于第0天；**P<0.01，对于PGD2而言，第19.5天相对于第37天。(D)脱毛后17天，针对Ptgds将富含干细胞的凸起区域下面的鼠外根鞘角质形成细胞染色(棕色)。虚线描绘了完整毛囊。比例条，100mm。(E至G)在脱毛后第0天(毛发生长初期)(E)、第17天(毛发生长初期晚期)(F)和第19天(毛发生长中期)(G)，在毛囊的永久隔室和非永久隔室中的Krt15(红色)和Ptgds(绿色)。比例条，100mm。
图4.PTGDS在有毛发头皮的选定人毛囊的非永久部分中表达，且更可变地在光秃头皮中表达。(A至C)正常人毛囊(A和B)和光秃头皮毛囊(C)中用蓝色核复染色进行的PTGDS免疫染色(棕色)。(A)针对PTGDS染色的有毛发头皮中的单个毛囊低于峡部。(B)有毛发头皮的大部分毛发生长初期毛囊几乎没有针对PTGDS染色。(C)在皮脂腺细胞和毛囊角质形成细胞中具有PTGDS染色的小型化毛囊。比例条，100mm。(D至F)在光秃头皮的毛囊和邻接皮脂腺中针对PTGDS(绿色)、核(蓝色)、以及KRT15(红色)(D)或类胰蛋白酶(红色)(E和F)的免疫荧光染色。具有一些PTGDS-阳性细胞的毛发生长中期毛囊也表达肥大细胞标志物类胰蛋白酶(E)。毛囊周围细胞显示具有重叠表达的PTGDS-和类胰蛋白酶-阳性细胞的不同群体(F)。比例条，100mm。
图5.具有脱发、皮脂腺增生和皮肤中升高的PGD2水平的K14-Ptgs2转基因小鼠皮肤表型模拟AGA。(A和B)与野生型(WT)对照(A)相比，K14-Ptgs2动物发展脱发(B)。(C和D)得自WT(C)和K14-Ptgs2动物(D)的苏木精和曙红染色的皮肤显示了皮脂腺(黄色箭头)和毛囊(黑色箭头)形态学。比例条，100mm。(E)得自WT小鼠(n＝5)和K14-Ptgs2转基因小鼠(n＝3)的皮肤组织中存在的不同前列腺素的量。数据是平均值±SEM。**P<0.01，WT相对于K14-Ptgs2。
图6.PGD2通过GPR44抑制小鼠和人毛发生长。(A)脱毛后16天中的毛发生长。从脱毛后第8天开始，将15-dPGJ2(10mg)或媒介物局部地施用于小鼠皮肤。数据是平均值±SEM(n＝3/治疗组)。*P<0.05，相对于对照。(B)局部PGD2(1mg；n＝3)、15-dPGJ2(1mg；n＝3)或媒介物(n＝3)治疗以后10天的毛发长度。数据是平均值±SEM。*P<0.05；**P<0.01。(C)Ptgdr(n＝8)、Ptgds(n＝6)和Gpr44(n＝11)敲除的(KO)小鼠响应于PGD2的毛发生长。数据是平均值±SEM，且代表每只小鼠的3个独立实验。*P<0.05，相对于媒介物。(D)在用PGD2(n＝3)、15-dPGJ2(n＝3)或媒介物(n＝3)培养的7天中，外植的人毛囊的体外生长。数据是平均值±SEM。***P<0.001，相对于媒介物。
图7.根据它们对GPR44的相对激动，PGD2的类似物抑制人毛发延长。在用列出的PGD2类似物、前列腺素I2或媒介物对照(n＝3/治疗组)培养的7天中，外植的人毛囊的体外生长。*P<0.05，除非另外指出，相对于媒介物，Student氏t检验。
具体实施方式
本发明涉及用于调节毛发生长的组合物和方法。具体地，本发明涉及通过调节前列腺素D2(PGD2)受体之一DP-2(GPR44)的活性来调节毛发生长。
本发明的申请人令人惊讶地和意外地发现了得自具有AGA的男性的光秃头皮相对于有毛发头皮在信使和蛋白水平升高的前列腺素D2合酶(PTGDS)水平。鉴于在人毛囊中的前列腺素代谢，本发明的申请人聚焦于小鼠(Ptgds)和人(PTGDS)中的合酶。还发现PTGDS的酶产物前列腺素D2(PGD2)在光秃人头皮组织中升高。本发明的申请人证实了小鼠中PtgdsmRNA和PGD2水平的升高与正常毛囊周期中的毛囊消退之间的密切暂时关联。本发明的申请人进一步提供的功能数据表明，PGD2和它的非酶促代谢物15-脱氧-D12,14-前列腺素J2(15-dPGJ2)会抑制小鼠和人毛囊中的毛发生长。在小鼠和人类中，PGD2介导的毛发生长抑制需要G蛋白(异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白)偶联的受体44(GPR44或DP-2)，但是不需要前列腺素D2受体1(Ptgdr或DP-1)。另外，本发明的申请人提供了这样的小鼠模型(K14-Ptgs2)：其在表型模拟人AGA的皮肤中具有升高的PGD2水平。这些结果尤其证实了PGD2和DP-2在AGA的发病机制中的作用，用于毛发护理。
本文提供了用于在受试者中调节毛发生长的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的DP-2激动剂或拮抗剂。
本文还提供了用于在受试者中刺激毛发生长的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的DP-2拮抗剂。本文提供了用于在受试者中治疗雄激素性脱发或秃发或掉发的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的DP-2拮抗剂。
本文还提供了用于抑制或预防受试者脱发的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的DP-2拮抗剂。本文还提供了用于预防受试者脱发的方法，所述方法包括：抑制所述受试者中的DP-2。
本文提供了用于筛选化合物作为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的方法，所述方法包括下述步骤：在有疑似为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性；在相同条件下，在没有所述疑似为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性，其中在有所述化合物存在下与在没有所述化合物存在下相比更低的DP-2活性，指示治疗雄激素性脱发的潜在药剂。在某些实施方案中，所述方法还包括：在有所述疑似为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性；在相同条件下，在没有所述疑似为治疗雄激素性脱发的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性，其中在有和没有所述化合物存在下更低的DP-2活性和大约相等的DP-1活性，指示治疗雄激素性脱发的潜在药剂。在某些实施方案中，筛选多个化合物。
本文提供了用于筛选化合物作为刺激毛发生长的潜在药剂的方法，所述方法包括下述步骤：在有疑似为刺激毛发生长的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性；在相同条件下，在没有所述疑似为刺激毛发生长的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性，其中在有所述化合物存在下与在没有所述化合物存在下相比更低的DP-2活性，指示刺激毛发生长的潜在药剂。在某些实施方案中，所述方法还包括：在有所述疑似为刺激毛发生长的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性；在相同条件下，在没有所述疑似为刺激毛发生长的潜在药剂的化合物存在下和在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性，其中在有和没有所述化合物存在下更低的DP-2活性和大约相等的DP-1活性，指示刺激毛发生长的潜在药剂。在某些实施方案中，筛选多个化合物。
本文提供了用于筛选化合物作为抑制毛发生长的潜在药剂的方法，所述方法包括下述步骤：在有疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物存在下，测量DP-2活性；在相同条件下，在有前列腺素D2存在下，测量DP-2活性，其中在有前列腺素D2存在下等于或大于DP-2活性的所述疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物的DP-2活性，指示抑制毛发生长的潜在药剂。在某些实施方案中，所述方法还包括：在有所述疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物存在下，测量DP-1活性；在相同条件下，在有前列腺素D2存在下，测量DP-1活性，其中在有前列腺素D2存在下等于或大于DP-2活性的所述疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物的DP-2活性和在有前列腺素D2存在下等于或小于DP-1的活性的所述疑似为抑制毛发生长的潜在药剂的化合物的DP-1活性，指示抑制毛发生长的潜在药剂。在某些实施方案中，筛选多个化合物。
本文中使用的“DP-2激动剂”是能够增加细胞内或生理系统内的DP-2的量或活性的分子。例如，DP-2激动剂是可以选择性地结合DP-2并引起DP-2受体的生理学作用的物质。
DP-2激动剂是本领域已知的，例如，在下面的表1中所示的那些：
表1
在某些实施方案中，所述DP-2激动剂选自高度选择性的DP-2激动剂15(R)PGD2、15(R)-15-甲基PGD2或13,14-二氢-15-氧代PGD2。
本文中使用的“DP-2拮抗剂”是能够减少细胞内或生理系统内的DP-2的量或活性的分子。例如，DP-2拮抗剂是可以选择性地结合DP-2并抑制DP-2受体的生理学作用的物质。
DP-2拮抗剂是本领域已知的。一些DP-2拮抗剂的例子显示在表2中：
表2
DP-2拮抗剂可以分成许多类别。一类是雷马曲班及其类似物，其例子显示在表2和3中(TM30642-3-{3-[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基}-丙酸；TM30643-[3-(4-氟-苯磺酰基氨基)-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基]-乙酸；TM30089-{3-[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基}-乙酸。
表3
另一类DP-2拮抗剂是吲哚乙酸衍生物。这类化合物的例子是表2的化合物6-9。
另一类DP-2拮抗剂是苯基乙酸衍生物。基于芬氯酸的这类化合物的一个例子是表2的化合物11。
另一类DP-2拮抗剂是四氢喹啉衍生物。这类化合物的例子是表2的化合物12、K117和K-104。
用在本文提供的方法中的某些优选的DP-2拮抗剂是已经成为至少一个临床试验的对象的DP-2拮抗剂。这样的已经成为至少一个临床试验的对象的拮抗剂的例子包括、但不限于在下面的表4中列出的DP-2拮抗剂：
表4临床阶段DP-2拮抗剂
a可以在以下网站检索NCT编号:www.clinicaltrials.gov
预见到用在本文提供的方法中的一种DP-2拮抗剂是DP-2拮抗剂雷马曲班。它的结构提供在下面：
预见到用在本文提供的方法中的一种DP-2拮抗剂是具有下面提供的结构的DP-2拮抗剂：
预见到用在本文提供的方法中的一种DP-2拮抗剂是DP-2拮抗剂Setipiprant。它的结构提供在下面：
预见到用在本文提供的方法中的一种DP-2拮抗剂是具有下面提供的结构的DP-2拮抗剂：
预见到用在本文提供的方法中的一种DP-2拮抗剂是DP-2拮抗剂AZD1981。它的结构提供在下面：
预见到用在本文提供的方法中的一种DP-2拮抗剂是具有下面提供的结构的DP-2拮抗剂：
预见到用在本文提供的方法中的一种DP-2拮抗剂是具有下面提供的结构的DP-2拮抗剂：
预见到用在本文提供的方法中的一种DP-2拮抗剂是DP-2拮抗剂AMG853。它的结构提供在下面：
可以在以下出版物中找到其它DP-2拮抗剂：EP1,170,594、EP1,435,356 WO2003/066046、WO2003/066047、WO2003/097042、WO2003/101961、WO2003/101981、WO2004/007451、WO2004/032848、WO2004/035543、WO2004/106302、WO2005/019171、WO2005/054232、WO2005/018529、WO2005/040112、GB2,407,318、WO2005/040114、WO2005/044260、WO2005/095397、WO2005/100321、WO2005/102338、WO2006/095183、WO2007/107772、US7,405,215，它们中的每一篇特此通过引用整体并入。
本发明的另一个方面是包含DP-2激动剂或拮抗剂的组合物。例如，本文提供了用于在受试者中调节毛发生长的组合物，所述组合物包含：有效地调节所述受试者中的毛发生长的量的DP-2激动剂或拮抗剂。
在另一个实施例中，本文提供了用于在受试者中刺激毛发生长的组合物，所述组合物包含：有效地增强所述受试者中的毛发生长的量的DP-2拮抗剂。在另一个实施例中，本文提供了用于治疗受试者的雄激素性脱发或秃发或掉发的组合物，所述组合物包含：有效地治疗所述受试者的所述雄激素性脱发或秃发或掉发的量的DP-2拮抗剂。
在另一个方面，本文提供了用于在受试者中抑制毛发生长的组合物，所述组合物包含：有效地抑制所述受试者中的毛发生长的量的DP-2激动剂。
在另一个实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含DP-2激动剂或DP-2拮抗剂和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
本文提供了药物组合物，其包含本发明的小分子、抗体、核酸、肽、载体、宿主细胞或其它药剂和一种或多种药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”包括在采用的剂量和浓度对向其暴露的细胞或受试者无毒的任意赋形剂。所述药物组合物可以包括一种或额外的治疗剂。
药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、缓冲剂、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、润湿剂、防腐剂、bugger、螯合剂、抗氧化剂、等渗剂和吸收延迟剂。
药学上可接受的载体包括水；盐水；磷酸盐缓冲盐水；右旋糖；甘油；醇诸如乙醇和异丙醇；磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；EDTA；形成盐的抗衡离子诸如钠；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS；等渗剂诸如糖、多元醇诸如甘露醇和山梨醇、和氯化钠；以及它们的组合。抗细菌剂和抗真菌剂包括对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。
本发明的药物组合物可以以多种方式配制，包括例如固体、半固体(例如，乳膏剂、软膏剂和凝胶)和液体剂型，诸如液体溶液(例如，局部洗剂或喷雾剂)、分散体或混悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。在某些实施方案中，所述组合物呈可注射的或可输注的溶液的形式。所述组合物呈适合于口服、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、透粘膜、透皮或局部施用形式。优选地，将所述组合物配制成用于局部施用。可以将所述组合物配制为立即、受控、延长或延迟释放组合物。
更具体地，适合使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于即时制备无菌溶液或分散体的无菌粉末。它应当在制备和贮存条件下是稳定的，且优选地保存免于微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣剂诸如卵磷脂通过维持所需的粒度(在分散系的情况下)和通过使用表面活性剂。用在本文中公开的治疗方法中的合适制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,第16版(1980)。
在某些实施方案中，所述组合物包括等渗剂，例如，糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
可以如下制备无菌溶液：将单独的或与其它活性剂组合的分子以所需量掺入含有一种或多种本文列举的成分(根据需要)的适当溶剂中，随后过滤除菌。通常，如下制备分散体：将活性化合物掺入到无菌媒介物中，后者含有基本分散介质以及所需的以上列出的其它成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，一种制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从前面无菌过滤的溶液产生活性成分与任何额外期望成分的粉末。加工用于注射的制品，填充进容器诸如安瓿、袋子、瓶子、注射器或管形瓶中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，可以将所述制品包装并以试剂盒的形式销售，诸如在美国申请公开号2002/0102208 A1中描述的那些，其通过引用整体并入本文。这样的制成品优选地具有标记或包装说明书，其指示伴随的组合物可用于治疗遭受或易感自身免疫或肿瘤障碍的受试者。
用于治疗本文所述的病症或疾病的本发明组合物的有效剂量依据许多不同的因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是，还可以治疗非人哺乳动物，包括转基因的哺乳动物。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量，以优化安全性和效力。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”。“治疗有效量”表示在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。分子的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及所述分子在个体中引起期望的应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是分子的治疗有益作用超过任何有毒或有害作用时的量。
本发明还提供了包含治疗有效量的DP-2激动剂或拮抗剂的试剂盒。
本发明还提供了治疗疾病或病症的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的DP-2激动剂或拮抗剂。
如本文中使用的，关于抑制或刺激的术语“选择性的”分别是指，第一种活性相对于第二种活性的优先抑制或刺激(例如，一种途径相对于另一种途径的优先抑制；相对于其它受体的优先抑制；或突变体相对于野生型的优先抑制，或反之亦然)。在某些实施方案中，与不希望的分子靶标或途径相比，所述抑制剂对期望的分子靶标或途径的选择性高了超过5倍、高了超过10倍、高了超过50倍、高了超过100倍、或高了超过1000倍。在某些实施方案中，与在相同条件下的第二种活性相比，拮抗剂或激动剂将分别抑制或刺激分子靶标或途径的第一种活性至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍。应当理解，在优选的实施方案中，所述DP-2拮抗剂或激动剂就DP-1而言的选择性是任意前述量。通过任意可再现的方式，可以测量分子靶标或途径的活性。可以在体外或在体内测量分子靶标或途径的活性。
本文中使用的“调节”表示“刺激”或“抑制”分子靶标或途径的活性。例如，如果与在相同条件、但是仅缺乏组合物的存在下的分子靶标或途径的活性相比，组合物刺激或抑制分子靶标或途径的活性至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约99％或更多，那么所述组合物调节分子靶标或途径的活性。在另一个实施例中，如果与在相同条件、但是仅缺乏组合物的存在下的分子靶标或途径的活性相比，组合物刺激或抑制分子靶标或途径的活性至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍，那么所述组合物调节分子靶标或途径的活性。通过任意可再现的方式，可以测量分子靶标或途径的活性。可以在体外或在体内测量分子靶标或途径的活性。例如，通过本领域已知的测量活性的适当测定，可以在体外或在体内测量分子靶标或途径的活性。可以给对照样品(未用组合物处理)分配100％的相对活性值。可以在测定中测量由组合物造成的活性的变化。
应当理解，本文描述的许多拮抗剂是它们的靶标的强抑制剂。例如，拮抗剂可以对它的期望分子靶标(即，DP-2)具有1000μm或更小、1000nM或更小、100nM或更小、10nM或更小或尤其是1nM或更小的结合抑制活性(IC50值)。在另一个实施例中，抑制剂对它的期望分子靶标具有1000μM至1nM、1000μM至10nM、1000μM至100nM、1000μM至1000nM、1000nM至1nM、1000nM至10nM、1000nM至100nM、100nM至10nM、100nM至1nM或10nM至1nM的结合抑制活性(IC50值)。
在某些实施方案中，本文中公开的拮抗剂将它们的分子靶标或途径抑制了至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或约99％或更多。
应当理解，本文描述的许多激动剂是它们的靶标的强刺激物。例如，激动剂对它的期望分子靶标(即，DP-2)具有1000μm或更小、1000nM或更小、100nM或更小、10nM或更小或尤其是1nM或更小的半数最大有效浓度(EC50值)。在另一个实施例中，激动剂对它的期望分子靶标具有1000μM至1nM、1000μM至10nM、1000μM至100nM、1000μM至1000nM、1000nM至1nM、1000nM至10nM、1000nM至100nM、100nM至10nM、100nM至1nM或10nM至1nM的半数最大有效浓度(EC50值)。
在某些实施方案中，本文中公开的激动剂将它们的分子靶标或途径刺激了至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或约99％或更多。
本文中使用的术语“治疗”表示治疗性处理，包括预防性的或防止性的措施，其中目的是防止或减慢(减轻)不希望的与疾病或病症相关的生理变化。有益的或期望的临床结果包括、但不限于：征状的减轻、疾病或病症的程度减小、疾病或病症的稳定(即，其中疾病或病症不再恶化)、疾病或病症的进展的延缓或减缓、疾病或病症的改善或减轻、以及疾病或病症的(部分或全部)缓解，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以指，与不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的受试者包括已经具有所述疾病或病症的受试者，以及易于患有所述疾病或病症的受试者，或要预防所述疾病或病症的受试者。
本文还提供了用于治疗受试者的脱发的方法，所述方法包括：抑制所述受试者中的DP-2。通过本领域技术人员已知的转基因方法，可以在细胞或组织中实现抑制，并且可以将这样的细胞或组织移植至需要毛发生长的皮肤区域。
在一个实施方案中，治疗脱发表示，治疗包含光秃的疾病或障碍。在另一个实施方案中，治疗脱发表示治疗雄激素性脱发(AGA)。在另一个实施方案中，治疗脱发表示，治疗为男性型脱发的疾病或障碍。在另一个实施方案中，治疗脱发表示，治疗为女性型脱发的疾病或障碍。在一个实施方案中，治疗脱发表示治疗或预防身体的任意区域(包括、但不限于头皮和眉毛)中的任意类型的脱发。
在另一个实施方案中，治疗脱发表示，治疗与脱发有关的任意疾病或障碍。在另一个实施方案中，治疗脱发表示，治疗与盘状红斑狼疮有关的脱发疾病或障碍。在另一个实施方案中，治疗脱发表示，治疗与先天性稀毛症有关的脱发疾病或障碍。在另一个实施方案中，治疗脱发表示，治疗与毛发扁平苔癣有关的脱发疾病或障碍。在另一个实施方案中，治疗脱发表示，治疗疤痕性脱发。
本文中使用的“抑制毛发生长”表示阻止毛发生长、抑制毛发生长的速率、延迟毛发萌发、延长毛发周期、延长静止期、最大毛发长度或减小最大毛发直径。
可以单独地或与一种或多种治疗上有效的试剂或治疗联合地施用DP-2激动剂或拮抗剂。在一个实施方案中，可以单独地或与一种或多种治疗上有效的毛发促进剂(例如，非那雄胺、米诺地尔或二者)或治疗联合地施用DP-2拮抗剂。在另一个实施方案中，可以单独地或与一种或多种治疗上有效的除去毛发的试剂或治疗联合地施用DP-2激动剂。可以使所述其它治疗上有效的试剂与DP-2激动剂或拮抗剂缀合，掺入与DP-2激动剂或拮抗剂相同的组合物中，或可以作为单独的组合物来施用。可以在施用DP-2激动剂或拮抗剂之前、过程中和/或之后施用所述其它治疗上有效的试剂或治疗。
在一个实施方案中，将DP-2拮抗剂与一种或多种毛发促进剂(例如，非那雄胺、米诺地尔或它们的组合)共同施用。在另一个实施方案中，独立于毛发促进剂的施用来施用DP-2拮抗剂。在一个实施方案中，首先施用DP-2拮抗剂，随后施用毛发促进剂。在另一个实施方案中，首先施用毛发促进剂，随后施用DP-2拮抗剂。
在另一个实施方案中，将DP-2激动剂与一种或多种毛发除去剂共同施用。在另一个实施方案中，独立于毛发除去剂的施用来施用DP-2激动剂。在一个实施方案中，首先施用DP-2激动剂，随后施用毛发除去剂。在另一个实施方案中，首先施用毛发除去剂，随后施用DP-2激动剂。
用于增强毛发生长的联合治疗的其它治疗上有效的试剂/治疗包括，例如，但不限于，移植外科手术和除去真皮或表皮。对于抑制毛发生长的联合治疗而言，其它治疗上有效的试剂/治疗包括，例如，但不限于，通过本领域技术人员已知的机械或化学方法除去皮肤上的毛发。
DP-2激动剂或拮抗剂与其它试剂和/或治疗的施用可以在相同或不同的时间、通过相同或不同的途径同时或分开进行。可以调整剂量方案以提供最适期望的应答(例如，治疗或预防应答)。
在一个实施例中，可以施用单次快速推注(single bolus)。在另一个实施例中，可以随时间施用几个分份剂量。在另一个实施例中，可以根据治疗情况的紧急程度的指示，按比例减少或增加剂量。本文中使用的剂量单位形式表示适合作为用于治疗哺乳动物受试者的单元剂量的物理上离散的单位。每个单位可以含有经计算会产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物。在某些实施方案中，本发明的剂量单位形式取决于且直接依赖于活性化合物的独特特征以及要达到的特定治疗或预防效果。
本发明的组合物可以仅施用一次，或者它可以施用多次。对于多次施用，例如可以每天3次、每天2次、每天1次、每2天1次、每周2次、每周1次、每两周1次、或每月1次施用所述组合物。
如果与在相同条件、但是仅缺乏所述化合物的存在下的活性相比，本文中使用的化合物使期望的活性减小了至少10％，那么所述化合物“抑制”活性。可以通过任意可再现的方式来测量活性。可以在体外或在体内测量活性。在某些实施方案中，在本文所述的方法中使用的化合物使男性中的活性抑制了至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、约95％、约98％或约99％或更多。
应当指出，剂量值可以随待减轻的病症的类型和严重程度而变化。进一步应当理解，对于任何特定受试者，应当根据个体需要以及管理或监督所述组合物的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅仅是示例性的，且无意限制要求保护的组合物的范围或实践。
向受试者的“施用”不限于任何特定递送系统，并且可以包括、但不限于，局部、透皮、口服(例如，胶囊剂、混悬液或片剂)、胃肠外(包括皮下、静脉内、骨髓内、关节内、肌肉内或腹膜内注射)或直肠。可以以单剂量的形式或者以重复施用的形式、并且以多种生理上可接受的盐形式中的任一种的形式和/或与作为药物组合物一部分的可接受的药用载体和/或添加剂(前述)一起进行向受试者的施用。再者，生理上可接受的盐形式和标准的药物制剂技术是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.)。
本发明的另一个方面是，一种用于诊断受试者中的雄激素性脱发或秃发或掉发的原因的方法。所述方法包括：检测所述受试者的皮肤中的前列腺素D2的水平；确定所述受试者的所述皮肤是否具有与预定水平相比升高的前列腺素D2水平，其中所述升高的前列腺素D2水平的存在指示，所述雄激素性脱发或秃发或掉发通过所述DP-2来介导。基于本领域技术人员已知的任何方法或测定，可以测量前列腺素D2的水平。所述预定水平可以表示对照(例如，不具有秃发或掉发的正常皮肤)中的前列腺素D2的水平。
术语”受试者”包括哺乳动物，例如，人类、伴侣动物(例如，狗、猫、禽类等)、家畜(例如，牛、羊、猪、马、家禽等)和实验动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、禽类等)。在某些实施方案中，所述受试者是男人或女人。
本文中使用的短语“药学上可接受的”表示这样的化合物、物质、组合物、载体和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
“药学上可接受的赋形剂”是指可用于制备药物组合物的、通常安全的、无毒的且不是生物上或以其它方式不希望的赋形剂，且包括对于兽医学应用以及人药物应用而言可接受的赋形剂。本文中使用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种和超过一种这样的赋形剂。
本发明的化合物也可以制备成前药，例如药学上可接受的前药。术语“前药”和“前体药物”在本文中可互换地使用，且可以表示在体内释放出活性母体药物的任意化合物。由于已知前药会增强药物的众多合乎需要的性能(例如，溶解度、生物利用度、制备等)，可以以前药形式递送本发明的化合物。
术语“约”或“大约”是指，如本领域普通技术人员确定的在特定值的可接受的误差范围内，这部分地取决于如何测量或确定该值。
在本文中引用的任何专利、专利申请公开或科学出版物通过引用整体并入本文。
为了更充分地举例说明本发明的优选实施方案，提供了下述实施例。但是，所述实施例绝不应当解释为限制本发明的宽范围。
实施例
材料和方法
人组织样品
该研究仅使用匿名地得到的正常抛弃的人头皮，并被宾夕法尼亚机构审查委员会(Penn’s Institutional Review Board)办公室批准为免除方案。在毛发移植过程中得到正常抛弃的人头皮。从没有接受非那雄胺或米诺地尔的40-65岁的成年高加索男性得到组织。所有分析使用在其它实验中没有使用的独特头皮样品。为了计算有毛发头皮和光秃头皮之间的平均倍数差异，我们建立了每位患者的比率，然后取它们的平均值。用公开的方法进行微阵列。对于毛发延长实验，使用得自整容的抛弃组织，其含有终毛。
动物
所有动物方案宾夕法尼亚大学动物实验管理小组(University of PennsylvaniaInstitutional Animal Care and Use Committee)批准。野生型C57BL/6J雌性小鼠购自Jackson Laboratory，要求小鼠具有相同重量和出生日期进行时程研究。从最初来源得到K14-Cox2转基因小鼠和Ptgdr、Gpr44和Ptgds敲除的小鼠。为了减少内源性睾酮的影响，我们仅仅使用雌性小鼠。如所述进行脱毛以同步化毛发周期。如果发现动物在活组织检查当天处于过渡状态，将更晚阶段样品标记为更晚12小时。
实时qPCR
用剪刀和镊子除去小鼠背侧后背皮肤。用剪刀切割人组织。将组织(25-35mg)溶解在300mL Qiagen RLT缓冲液中。将人头皮和小鼠组织用组织转子匀浆化，并按照生产商的说明书用Fibrous RNA提取试剂盒(Qiagen)和高容量cDNA试剂盒(Applied Biosystems)，收集RNA并转化成互补DNA(cDNA)。将cDNA(50ng)用在使用Fast Mix的实时qPCR中。
定量RT-PCR Master
在Step One Plus System(Applied Biosystems)上的混合和测量.发现b-肌动蛋白和18S RNA探针标准品彼此等效，且在等量负载量的样品之间没有波动。用DDCT方法计算倍数变化。使用的引物是存量TaqMan引物(Applied Biosystems)：PTGDS(人)、Ptgds(小鼠)、Fgf5(小鼠)、Ptgfr(小鼠)、b-肌动蛋白(人)、b-肌动蛋白(小鼠)和18S(人和小鼠)。
蛋白质印迹
将人头皮组织匀浆化，并用BCA试剂盒(Pierce)定量蛋白量。将等量的每种抛弃的组织裂解物(15-35mg)加载进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。用小鼠单克隆抗-PTGDS(CaymanChemical)，随后用与HRP缀合的抗-小鼠第二抗体(Vector)，探测聚偏氟乙烯印迹。将印迹用电化学发光(Amersham)显影，暴露于放射自显影术，并用ImageJ(National Institutesof Health)定量，都按照生产商的说明书。随后将印迹用丽春红(Sigma)染色，以验证试验的所有泳道之间的等量负载。
PGD2酶联免疫吸附测定
从毛发移植物得到人头皮，以测量PGD2的量。在外科手术以后，立即将样品放在4℃的含有10％胎牛血清(FBS)和抗生素/抗霉菌剂的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基中，或者将它们快速冷冻。组织样品重量在0.14-0.94g之间变化。将所有值归一化至起始组织重量。在1-2天内，将样品在液氮中快速冷冻，并在-70℃保存至少24小时。融化以后，将样品在1mL丙酮中稀释并均质化。将样品在5000g离心10min，除去上清液，并对沉淀物进行第二次提取。将合并的上清液在SpeedVac离心机中干燥，并再悬浮于100mL酶免疫测定缓冲液中，所述缓冲液提供在Cayman Chemical Prostaglandin D2-MOX ELISA(酶联免疫吸附测定)试剂盒中。按照生产商的说明书，相对于标准曲线确定PGD2浓度。将值归一化至有毛发头皮。
超高效液相色谱法
如上面关于ELISA所述制备人组织。为了使在小鼠中的前列腺素收率最大化，我们将样品快速冷冻，并在所有时间将它们保持在4℃以下。在生命的第24天，得到来自K14-Ptgs2小鼠的组织和弗林德病毒B-型(FVB)株匹配的动物对照。对于小鼠组织，将切离的表皮和真皮在丙酮中快速冷冻，切碎，并用Omni TH 115V用金属尖在丙酮中均质化小于2min。然后将匀浆化的组织在16,000g离心10min，保留上清液。将丙酮在温和的氮气气流下干燥，此后将样品再溶解在1mL 5％的乙腈水溶液中，用20ml甲酸酸化，并应用于控制条件的Strata-X SPE柱(Phenomenex)。SPE方案包括：用1mL H2O、再用1mL乙腈预调节，上样，用1mLH2O洗涤，通过施加低真空(house vacuum)15min进行干燥，并用1mL 10％的乙腈在乙酸乙酯中的溶液洗脱。然后将洗脱液用氮气流干燥，再溶解在200mL30％的乙腈在H2O中的溶液中，并穿过0.2-mm Nylon Spin-X过滤器(Corning)过滤，然后将100mL注射进仪器中进行UHPLC分析。
UHPLC由Accela溶剂递送系统(Thermo)和Hypersil GOLD C18、200mm×1mm、1.9-mm颗粒大小的柱(Thermo)组成。流动相由水(溶剂A)和乙腈/甲醇(95:5,溶剂B)组成，二者均含有0.005％乙酸，用氢氧化铵调至pH5.7。流动相梯度开始于20％B，并在10min中以线性方式增加至35％，随后在20min中线性增加至80％B，并在80％B保持3min。流速为350ml/min。
质谱法
使用配有加热的电喷射电离(ESI)源和三重四极分析仪的TSQ Quantum Ultra仪器(Thermo)。ESI源使用氮气作为鞘和辅助气体，分别设定至70和5任意单位。以350℃的毛细管温度和0kV的喷雾电压，以负离子模式运行质谱仪。将源偏移设定至6V。以选定的反应监测模式运行分析仪。首先如下监测转变16min：对于内源性PGD2和PGE2，质荷比(m/z)351→271(碰撞能,15V)；对于四氘化的PGD2和PGE2，m/z 355→275(15V)；对于内源性PGF2a，m/z 353→193(24V)；和对于四氘化的PGF2a，m/z 357→197(24V)。关于最后7min，对于内源性15-dPGJ2，监测m/z315→271(15V)，和对于四氘化的类似物，监测m/z 319→275(15V)。所有类花生酸类购自Cayman Chemical。
免疫组织学和免疫荧光
将小鼠后背皮肤或人头皮皮肤在4％低聚甲醛中固定，包埋在石蜡膜中，并以5-10mm切片。用苏木精和伊红(Fisher Scientific)将非免疫载玻片染色。对于免疫染色，施加多克隆兔抗-PTGDS(Cayman Chemical)或单克隆小鼠抗-KRT15(Lab Vision,克隆LHKRT15)，随后分别施加生物素化的抗-兔或抗-小鼠。与辣根过氧化物酶和重氮氨基苯一起使用ABC试剂盒(Vector labs)进行显色。使用甲基绿(Vector Labs)将组织进行免疫组织化学复染色；抗原染色呈现棕色，复染色呈现蓝绿色。在传统光学显微镜(Nikon)中观察染色。用与关于免疫组织化学所述相同的第一抗体处理皮肤。使用抗-兔Alexa Fluor 488(Invitrogen)和抗-小鼠罗丹明(Vector Labs)作为第二抗体。随后在4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)培养基(Vector Labs)中固定组织。在传统荧光显微镜中用红、绿和蓝过滤立方体(Leica)观察染色。
角质形成细胞细胞培养
从新生儿包皮分离人包皮角质形成细胞。在引入6孔培养皿中以后，将等密度的角质形成细胞铺板(50,000个细胞/cm2)在通道2和3之间。将细胞维持在2mL EpiLife培养基(Cascade Biologics)中，并用已经溶解在丙酮中的100nM PGD2、1mM PGE2或10mM 15-dPGJ2(Cayman Chemical)处理12-48小时。除非另有说明，将细胞用10mM前列腺素处理20小时。将单独的丙酮用作对照。
流式细胞计量术
在培养过程中，将人角质形成细胞用0.2mM溴脱氧尿苷(BrdU)脉冲处理，与前列腺素一起温育最终的3小时。用胰蛋白酶处理细胞以将细胞释放进混悬液中，计数，固定，并渗透化处理(Caltech)。每106个细胞用20mL抗活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Becton Dickinson,克隆CPP32)或抗-BrdU异硫氰酸荧光素(Becton Dickinson,克隆B44)将细胞染色。将细胞再悬浮于含有5％FBS和DAPI(5mg/mL)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后在LSRII流式细胞计(Becton Dickinson)上运行。将亚-G1细胞门控为含有小于二倍量的DNA的那些。
小鼠毛发延长研究
为了在野生型和敲除的小鼠中对比媒介物、PGD2和15-dPGJ2对毛发周期的影响，我们在脱毛后第8、10、12、14、16和18天将1mg PGD2在200mL丙酮中的溶液或单独的丙酮施加于背部中央，在第20天测量毛发长度。为了在15-dPGJ2上试验毛发延长的时程，我们使用10mg替代上面的PGD2。如所述测量毛发长度，测量仅直(不弯曲)毛发的选择。为了试验突变体小鼠品系，在三个单独的动物同窝仔上重复实验。
人毛囊培养
如所述进行毛囊器官培养模型。简而言之，从得自整形外科医生的面部和眉毛提升组织分离出处于生长期(毛发生长初期)的人毛囊。将至少3个不同的人供体(男性和女性的混合物)用于每种试验化合物。所有受试者处于40-60岁的年龄范围内。将皮肤切成1-2mm的薄带，暴露2-3行容易切开的毛囊。将毛囊放在0.5mL补充了L-谷氨酰胺(2mM)、胰岛素(10mg/ml)、氢化可的松(10ng/ml)、青霉素(100U)、链霉素(0.1mg/ml)和两性霉素B(0.25mg/ml)的William氏E培养基(Life Technologies)中。将毛囊在24-孔平板中(1个毛囊/孔)在5％CO2和95％空气的气氛下在37℃温育。将PGD2、PGD2代谢物和PGD2类似物(Cayman Chemical)溶解在二甲亚砜(DMSO)中，作为100×储备溶液(例如，用于5mM治疗的0.5mM和用于10mM治疗的1mM)。以1％(v/v)使用DMSO媒介物对照。用仅DMSO作为对照来处理毛囊。通常在第0天(将毛囊放在培养物中当天)和再在第7天捕获毛囊图像。用VisionBuilder(National Instruments)评估毛发纤维的长度。通过从第7天确定的长度减去在第0天的长度，计算毛发纤维的生长。报道的每个测量结果是14-20个毛囊的结果的平均值。
统计分析
对于所有P值计算，计算具有单尾分布的成对Student氏t检验，且认为P<0.05是显著的。所有数据是平均值±SEM。使用方差分析(ANOVA)检验对得自微阵列的基因排序，因为主要就部位(有毛发相对于光秃)而言是不同的，且不论人员、活组织检查日期或微阵列日期。
结果
实施例1
PTGDS和PGD2在光秃头皮中升高
为了评估具有AGA的男性的光秃头皮中的总基因表达变化，我们在5个具有AGA的男性中进行了基因表达微阵列，将光秃头皮与有毛发头皮进行对比。在有毛发头皮重复样品之间和在光秃头皮重复样品之间的相关系数接近1(图1A)。在个体内对比有毛发头皮与光秃头皮的相关系数也接近1，从而指示成对样品作为内部对照的优点。我们鉴别了在人有毛发头皮相对于光秃头皮中差别表达的250个转录物。作为这些转录物的有效性的证据，簇集算法基于这些基因的表达将样品分类为有毛发或光秃(图1B)。如预期的，在有毛发头皮中增量调节毛发角蛋白。为了不清楚的原因，血红蛋白有关的转录物在光秃头皮中升高。在有毛发头皮中，169个基因升高，且81个基因在光秃头皮中升高，具有预期的表达方向(图1C)。我们确定了这些基因的富集的基因本体论功能分类，并鉴别出重叠分类。在有毛发头皮中，形态发生和发育途径基因过表达，而在光秃头皮中，免疫应答基因过表达(图1D)，这与AGA的已知组织学相一致。
考虑到地诺前列素(PGF2a)相关的化合物用于促进毛发生长的临床应用和前列腺素的常见拮抗功能，我们计划发现PTGDS作为在男人光秃头皮中最高表达的转录物之一(图1,E和F)。在覆盖微阵列上的PTGDS的3个探针集合中，全部都在光秃头皮中升高(图1E)。通过实时定量聚合酶链式反应F2(qPCR)(图2A)和蛋白质印迹法，相对于有毛发人头皮进一步在光秃人头皮中证实了增加的PTGDS表达和PTGDS蛋白水平(图2,B和C)。为了更好地理解PTGDS在光秃中的作用，我们测量了它的合酶产物PGD2在光秃人头皮和有毛发人头皮中的水平。我们通过免疫测定发现了光秃头皮相对于有毛发头皮的PGD2的显著增加(图2D)。PGD2在光秃头皮中的绝对水平为16.3ng/g组织，在有毛发头皮中为1.5ng/g组织。然后使用超高效液相色谱法质谱法(UHPLC-MS)测量PGD2水平，因为报告的它在测量前列腺素方面与免疫测定相比优良的准确度。在得自17个具有AGA的男性的较大系列成对光秃和有毛发样品中，我们注意到与有毛发头皮相比光秃头皮中的PGD2的增加(图2E)。其它前列腺素对毛囊生长具有活性。我们测量了光秃头皮和有毛发头皮中的其它前列腺素物质的水平。与有毛发头皮相比，PGD2的非酶促代谢物15-dPGJ2也在光秃头皮中增加(图2E)。但是，15-dPGJ2的绝对水平(3.8ng/g光秃头皮,1.3ng/g有毛发头皮)低于PGD2(53.5ng/g光秃头皮,25.6ng/g有毛发头皮)(图2F)。与免疫测定相比，UHPLC-MS确实检测到在光秃头皮中更高的PGD2水平(53.5相对于16.3ng/g组织)，尽管两种方法证实了光秃头皮中增加的PGD2质量。与PGD2不同，地诺前列酮(PGE2)(其由PTGES而不是PTGDS合成)的水平在有毛发头皮中比在光秃头皮中更丰富(图2E)，通过UHPLC-MS检测到3.1ng/g光秃头皮和6.4ng/g有毛发头皮(图2F)。
实施例2
非永久毛囊小鼠角质形成细胞在毛发生长初期结束时表达Ptgds
为了更好地理解Ptgds和PGD2对毛发生长的正常生物学功能，我们利用了小鼠的充分表征的、同步化的毛发周期。通过在不同年龄或小鼠毛脱毛(这会诱导同步化的新毛囊周期)以后检查皮肤，可以将基因表达和蛋白水平的波动追踪至毛囊周期的不同阶段。在研究同步化的小鼠毛发周期的特征的过程中，我们在小鼠皮肤活组织检查样品中证实了相对于出生后(PN)天的毛发周期阶段。我们确信，如通过肉眼外观所提示的，处于PN21的小鼠的组织学特征是静止期晚期的那些特征，PN35为毛发生长初期晚期，和PN46为毛发生长中期。如通过qPCR所测量的，Ptgds mRNA在毛发生长初期的晚期阶段达到峰值，且比PN20的静止期(静止期)高7倍(图3A)。因而，Ptgds表达在静止期中最低，并逐渐增加穿过毛发生长初期在毛发生长初期晚期达到峰值，接近转变至毛发生长中期(消退阶段)的时间。为了更密切地检查Ptgds表达峰与毛发生长中期转变的接近，我们将它与成纤维细胞生长因子5(Fgf5)(一种已知的毛发生长中期开始标志物)的表达进行了对比。与静止期相比，Fgf5表达在毛发生长初期晚期达到峰值(图3A)。总之，Fgf5和Ptgds峰表达水平在毛发生长初期晚期重叠，刚好在毛发生长中期开始之前。我们接下来试图鉴别从Fgf5和Ptgds不同地表达的控制基因。作为毛发生长初期早期的标志物，我们测量了PGF2a的受体的表达，已知所述受体的在小鼠中和在人类中诱导毛发生长的能力。与Ptgds和Fgf5的晚期峰不同，前列腺素F受体(Ptgfr)mRNA在毛发生长初期早期或静止期晚期达到峰值，相对于第二静止期(PN52)具有21倍变化(图3A)，和相对于第一静止期(PN20)具有3倍变化。
为了确定Ptgds的表达和PGD2的产生之间的时间关联，我们通过HPLC-MS在相同小鼠中测量了PGD2水平，在图3A中从所述小鼠确定了mRNA数据。我们发现，PGD2产生在Ptgds表达的顶峰以后达到峰值。在毛发生长中期阶段中，在PN46，PGD2达到87.6ng/g组织的峰水平，与此相比，在毛发生长初期早期中在PN24达到7.4ng/g组织的最低值(图3B)。因而，首先在毛发生长初期晚期中在皮肤中表达Ptgds mRNA，随后，在毛发生长中期经由Ptgds蛋白产生PGD2。尽管个别小鼠中的毛囊周期早期阶段被天然地同步化，相同年龄和甚至同窝的动物可以表现出就毛囊周期而言的异质性。因此，我们使用已经被同时脱毛以在动物之间以及在动物内部同步化毛发周期的小鼠重复了以上分析。从自发毛发周期确证我们的结果，Ptgds mRNA也在脱毛的动物中随毛发周期波动。Ptgds mRNA在毛发生长初期晚期达到峰值，继之以在毛发生长中期在PGD2的峰值(图3C)。PGD2产生在第19.5天(毛发生长中期)达到峰值199.9ng/g组织，与此相比，在第37天达到27.6ng/g组织的最低值。我们还注意到在脱毛的1小时内PGD2产生的独特峰，这在图3B的自发毛发周期中没有看到。这与以前在脱毛后观察到的肥大细胞的去粒相符合。标志物在脱毛的毛发周期中的更狭窄峰可能反映了脱毛以后毛囊周期的更紧密同步化。为了更好地定义Ptgds的表达，我们在组织切片上进行了免疫组织化学，所述组织切片得自用于图3C的时程的动物的皮肤。Ptgds在毛发生长初期晚期在外根鞘的角质形成细胞中显而易见，所述外根鞘在用立毛肌标记的富含干细胞的凸起区域下面(图3D)。毛囊的该区域在毛发生长中期中退化。
为了确证通过免疫组织化学看到的该模式，我们接下来检查了Ptgds和角蛋白15(Krt15)(一种毛囊干细胞标志物)的双重免疫荧光标记。在脱毛的第0天(静止期)，Krt15存在于毛囊的最下方永久部分处的凸起区域中，这持续至静止期(图3E)。我们没有鉴别出Ptgds，这与qPCR数据一致，所述qPCR数据表明Ptgds的表达在静止期中的缺乏(图3A)。也与qPCR一致，在第17天(毛发生长初期晚期)，我们通过免疫组织化学发现了可检测的Ptgds模式(图3,D和F)。较低的外根鞘细胞表达(但是凸起细胞不表达)Ptgds。此外，在脱毛后第19天，在毛发生长中期毛囊中的角质形成细胞表达Ptgds，没有重叠的Krt15-阳性的角质形成细胞(图3G)。这些结果证实，在小鼠毛囊的非永久角质形成细胞中富含Ptgds。
实施例3
在人毛囊的非永久角质形成细胞中表达PTGDS
在正常末端人毛囊中，我们发现了PTGDS的类似存在，主要是在立毛肌下面的非永久毛囊中(图4A)。但是，染色是可变的，许多正常人毛囊表现出微小染色或没有染色(图4B)。这与有毛发头皮相对于光秃头皮的更低PTGDS mRNA水平一致，并且也可能反映人毛囊周期的同步性的缺乏。在光秃人头皮的小型化毛囊中，在凸起外面(图4,C和E)和在某些情况下在上基部凸起内部(图4D)的皮脂腺和毛囊角质形成细胞表达PTGDS。我们还检测到在毛囊上皮外面的PTGDS，从而指示PGD2在真皮中的潜在来源(图4,E和F)。在经历毛发生长中期的毛囊中，PTGDS存在于纤维带内的肥大细胞中，这是退化毛囊的先前位置(图4E)。在小鼠和人中的这些结果证实，在毛囊开始退化时，脂质运载蛋白PTGDS和它的产物PGD2主要在毛囊的短暂部分中表达。这些发现与PGD2途径抑制毛囊生长的假设一致。
实施例4
在表皮表型模拟AGA中过表达Ptgs2的转基因小鼠
鉴于增加的PGD2水平与人类中的光秃头皮的关联和PGD2对小鼠毛囊的假定抑制作用，我们假定，在皮肤中具有高PGD2水平的小鼠可能发展AGA的特征。因为Ptgs2(环加氧酶2,前列腺素G/H合酶)是在Ptgds上游的酶，我们进一步假定，过表达Ptgs2的小鼠将具有升高的PGD2水平。以前已经开发出在表皮中过表达Ptgs2的转基因小鼠用于致癌研究。注意到这些K14-Ptgs2转基因小鼠中的毛囊会过早地进入毛发生长中期，并且据报道这些小鼠发展脱发和皮脂腺扩大。
我们进一步分析了K14-Ptgs2小鼠的皮肤和毛囊。这些小鼠发展脱发，这表现为正常鼠毛被层相对于对照的减少(图5,F5 A和B)。我们还通过组织学检测到皮脂腺增生，如簇集在毛囊周围的扩大皮脂腺细胞所指示的(图5,C和D)。K14-Ptgs2小鼠中的毛囊相对于对照小型化(图5,C和D)，并且这些毛囊具有与人光秃头皮中的小型化毛囊显著的相似性。为了确定K14-Ptgs2小鼠的脱发皮肤的前列腺素含量，我们在毛囊周期的毛发生长初期阶段通过HPLC-MS测量了前列腺素水平。如以前使用免疫测定(其测量活组织检查的小鼠皮肤中的PGE2和PGF2a含量)所证实的，与年龄匹配的野生型对照相比，K14-Ptgs2小鼠中的PGE2升高。PGD2也升高，并且比野生型和K14-Ptgs2小鼠中的PGE2更丰富。K14-Ptgs2小鼠中的15-dPGJ2比对照升高，并且证实了最大倍数增加(～14倍)，尽管基线值较低(5.7ng/g组织)(图5E)。我们发现了PGF2a的低水平(18.4ng/g组织)以及已知不存在于正常皮肤中的前列环素(6k-PGF1a)和血栓烷(TxB2)的缺失(图5E)。总之，这些小鼠中的光秃表型可能是对毛囊的压倒性的PGD2和15-dPGJ2抑制作用的结果，尽管存在PGE2，即一种已知的毛发生长促进剂。
实施例5
15-dPGJ2和PGD2抑制小鼠和人毛囊中的毛发生长
鉴于在细胞凋亡的毛发生长中期阶段之前PGD2的暂时峰和它的代谢物15-dPGJ2在其它细胞类型中诱导细胞凋亡的能力，我们试验了前列腺素对分离自新生儿包皮的角质形成细胞的原代细胞培养物的影响。15-dPGJ2诱导细胞凋亡，如质膜起泡和细胞收缩/皱缩所证实的。15-dPGJ2还减小细胞密度、细胞分裂和活细胞数目。可能是因为这些角质形成细胞的起源不是毛囊，PGD2对细胞不具有这样的作用。但是，15-dPGJ2确实增加亚-G1DNA数量并活化人角质形成细胞中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，这些是细胞凋亡性细胞死亡的特征。因此，我们假定，至少15-dPGJ2(如果PGD2也不是这样的话)可以在体内直接抑制毛发生长。将15-dPGJ2局部地施用于C57BL/6小鼠的背侧后背皮肤，所述皮肤已经脱毛以同步化毛囊周期。从脱毛后第8天开始并每隔天继续，我们施加10mg 15 dPGJ2或丙酮媒介物。在脱毛后第4、12、14和16天测量毛发长度。在第12-16天，在治疗部位的毛发短于媒介物治疗的动物F6(图6A)。为了确定最小有效量，我们如上试验了1mg PGD2和15-dPGJ2的施加，并在脱毛后第20天测量毛发长度。PGD2抑制毛发生长，但是其程度低于15-dPGJ2(图6B)。
我们通过肉眼或通过组织学检查没有发现毛囊周期变化的证据。已经证实了PGD2介导的毛发生长抑制，我们接下来试图确定哪种受体负责该作用。PGD2的2种规范受体是PTGDR(也被称作DP-1)和GPR44(DP-2)。已经报道，除了其它位点以外，DP-1和DP-2由毛囊中的外根鞘角质形成细胞表达。因此，我们使用Ptgds空小鼠作为对照，在Ptgdr空小鼠和Gpr44空小鼠中试验了PGD2的抑制毛发生长的能力。尽管Ptgds和Ptgdr敲除的小鼠都对毛发延长的抑制敏感，Gpr44空小鼠对PGD2的抑制作用具有抗性(图6C)。这些数据表明，GPR44(而不是PTGDR)是PGD2-介导的毛发延长抑制的受体，且因此是AGA的治疗靶标。
为了试验PGD2对人毛发生长的作用，我们使用了在培养物中维持了7天的外植的人毛囊。我们将递增量(0-10mM)的PGD2、15-dPGJ2或媒介物加入培养基中并测量毛发长度(图6D)。在5mM开始，PGD2和15-dPGJ2显著抑制毛发生长。在10mM，PGD2治疗的毛发比媒介物短62±5％，而10mM 15-dPGJ2完全抑制所有毛发生长。我们试验了多种其它PGD2类似物，并发现它们能够抑制毛发延长。对GPR44的激动与抑制毛发延长的能力相关(图7)。例如，弱激动剂11-脱氧-11-亚甲基PGD2具有试验的化合物的最低活性(毛发生长抑制)。应当指出，GPR44对配体具有纳摩尔亲和力，但是如这类实验典型所见，需要较高浓度来克服组织穿透和化合物裂解。因而，在小鼠和人中，PGD2和15-dPGJ2抑制毛发生长，可能是通过GPR44受体。
我们证实，与具有AGA的男性的有毛发头皮相比，光秃头皮中的前列腺素D2合酶(PTGDS)在mRNA和蛋白水平升高。PTGDS酶活性的产物前列腺素D2(PGD2)在光秃头皮中类似地升高。在小鼠的正常毛囊周期中，Ptgds和PGD2水平在消退期之前立即增加，从而提示对毛发生长的抑制作用。我们证实，当局部地施用于小鼠时，PGD2抑制外植的人毛囊中的毛发生长。毛发生长抑制需要PGD2受体G蛋白(异源三聚体鸟嘌呤核苷酸)偶联的受体44(GPR44)，但是不需要PGD2受体1(PTGDR)。此外，我们发现，转基因小鼠K14-Ptgs2(其将前列腺素-内过氧化物合酶2表达靶向皮肤)在皮肤中表现出升高的PGD2水平，并且发展脱发、滤泡小型化和皮脂腺增生，这些都是人AGA的标志。
本领域技术人员将理解，可以对上述实施方案做出变化，而不脱离其广泛发明概念。因此，应当理解，本发明不限于公开的特定实施方案，而是意图涵盖如所附权利要求限定的在本发明的精神和范围内的修改。

Claims (9)

1.DP-2拮抗剂在制备用于通过以下方法在受试者中刺激毛发生长的组合物中的用途，其中所述DP-2拮抗剂就DP-1而言是选择性的DP-2拮抗剂，所述方法包括给所述受试者施用有效量的DP-2拮抗剂；且所述DP-2拮抗剂选自由以下组成的组中：
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述DP-2拮抗剂是Setipiprant。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述施用步骤局部地进行。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述施用步骤口服进行。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述方法还包括：给所述受试者施用另一种调节毛发生长的药剂，其中所述另一种药剂是非那雄胺或米诺地尔。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述方法还包括：给所述受试者移植毛囊的步骤。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述方法还包括：除去所述受试者的皮肤的真皮或表皮。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者具有雄激素性脱发。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者具有与盘状红斑狼疮有关的脱发、先天性稀毛症、毛发扁平苔癣或疤痕性脱发。
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