JP5164567B2

JP5164567B2 - 慢性副鼻腔炎の重症度および再発性の検査方法

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Publication number: JP5164567B2
Application number: JP2007516307A
Authority: JP
Inventors: 良博裏出; 直美江口; 浩介有竹; 佐和子兵; 洋竹中; 了河田
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2013-03-21
Anticipated expiration: 2026-05-17
Also published as: EP1882937B1; US8568967B2; US20100138937A1; EP1882937A1; EP1882937A4; JPWO2006123677A1; WO2006123677A1

Description

本発明は、好酸球性炎症疾患の重症度を診断し、これら疾患の再発性を予測する方法に関するものである。更に詳しくは、本発明は慢性副鼻腔炎（特に鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎）、アレルギー性鼻炎、気管支喘息（特にアレルギー性気管支喘息）、アレルギー性皮膚炎等の疾患による炎症部位に集積した好酸球の活性化を、好酸球での造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）遺伝子あるいはタンパク質の発現量を指標として測定し、これら好酸球性炎症疾患の重症度を診断し、再発性を予測することに関するものである。

鼻茸の成立は未だに明らかではないが、慢性副鼻腔炎に伴って認められる炎症性の病変であることから、古くは感染による炎症がその成因に関与していると考えられていた。一方、鼻茸を組織学的に観察すると、好酸球浸潤を伴うものが多いので、その成因に気管支喘息やアレルギー性鼻炎といった好酸球性炎症の関与も推察されている。
鼻茸は慢性副鼻腔炎の症状のうち鼻閉や頭重感を引き起こすのみならず、鼻副鼻腔の換気障害による副鼻腔炎の重症化や、後鼻漏による下気道の障害を引き起こす。
したがって、鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎の治療は手術療法であるが、喘息を合併した症例や、局所の好酸球浸潤の強い症例は２〜３年以内に再発が認められる。

花粉症に代表されるアレルギー性鼻炎の患者あるいはアレルギー性気管支喘息は、抗原に暴露されると肥満細胞からプロスタグランジン（ＰＧ）Ｄ_２、ＰＧＥ_２、ヒスタミンやロイコトリエン（ＬＴ）Ｃ_４、ＬＴＤ_４、ＬＴＥ_４等のケミカルメディエーターが過剰に産生・放出された後に好酸球に代表される炎症細胞が局所に集積する。集積した好酸球は活性化されると主要塩基性蛋白（ＭＢＰ）、好酸球カチオン蛋白（ＥＣＰ）等の組織傷害性タンパク質を放出して更に炎症を増悪すると考えられている。

これまで、慢性副鼻腔炎（鼻茸）やアレルギー性鼻炎、気管支喘息（特にアレルギー性気管支喘息）、アレルギー性皮膚炎等の疾患と、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ_２）の関与は知られている（例えば、非特許文献１，２）。一方これらの疾患ではＰＧＥ_２やＬＴＣ_４、ＬＴＤ_４、ＬＴＥ_４産生や好酸球の浸潤数が重症度の指標とされてきた。しかしながら、炎症部位での造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）タンパク質の発現を調べることにより、これらの疾患の重症度を診断し、再発性を予測する方法は、これまで知られていない。

これら疾患の治療にはステロイド（糖質コルチコイド）の投与が著効を示すが、副作用の問題から長期投与が困難である。そこで、非ステロイド性抗炎症薬や抗アレルギー薬、抗ヒスタミン薬、抗ロイコトリエン薬の投与が行われているが、その薬効には個人差が大きい。
アレルギー, Vol.54, No.3/4, Page.384 アレルギー, Vol.52, No.8/9, Page.759

好酸球性炎症疾患の重症度を診断したり、これら疾患の再発性を予測したりする方法であって、炎症部位での造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）タンパク質の発現を調べて、重症度を診断し、再発性を予測する診断方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成する本発明者は鋭意研究を行い、次のような知見を得たことに基づいて本発明を完成させた。
１）副鼻腔炎に伴う重症の鼻茸では好酸球の浸潤が顕著である。
２）通常、好酸球にはＨ−ＰＧＤＳが検出されないが、病変部位ではＥＧ２あるいはＭＢＰ陽性の活性化好酸球でＨ−ＰＧＤＳの発現が亢進する。
３）好酸球でのＨ−ＰＧＤＳの発現量は、好酸球性炎症疾患の重症度と相関する。すなわちＨ−ＰＧＤＳの発現量が高いほど好酸球性炎症疾患が重症である。
４）好酸球でのＨ−ＰＧＤＳの発現量は、鼻茸の再発率と相関する。すなわちＨ−ＰＧＤＳの発現量が高いほど鼻茸の再発率が高い。

従って本願発明は、好酸球性炎症疾患の重症度を診断する方法であって、炎症部位での造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）タンパク質の発現量を測定するか、またはプロスタグランジンＤ_２（ＰＧＤ_２）量を測定することを含む、重症度を診断する方法を要旨とする。

本願発明はまた、好酸球性炎症疾患の再発性を予測する方法であって、炎症部位での造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）タンパク質の発現量を測定するか、またはプロスタグランジンＤ_２（ＰＧＤ_２）量を測定することを含む再発性を予測する方法をも要旨とする。

本願発明はまた、１）ヒト造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）大量発現トランスジェニックマウスに抗原を感作してアレルギー疾患モデルを作製し、鼻腔、気道あるいは皮膚に抗原を暴露して好酸球性アレルギー疾患を惹起し、
２）好酸球性疾患を誘導する前または後に造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）阻害物質またはプロスタグランジン受容体（ＤＰ）拮抗薬候補化合物をトランスジェニックマウスに投与し、
３）トランスジェニックマウスにおける好酸球性炎症疾患の状態を、候補物質を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、
ことを含む好酸球性炎症疾患の進行を防止し、または再発の予防に用いる化合物のスクリーニング方法をも要旨とする。

本発明によれば、好酸球性炎症疾患の重症度の新たな診断方法と、これらの疾患の再発性を予測する方法を提供することができる。また本発明によれば好酸球性炎症疾患の進行を防止し、再発予防に用いる化合物をスクリーニングすることができる。

ＭＢＰ（好酸球の指標）抗体とＨ−ＰＧＤＳとの蛍光抗体染色を示す。上段の非好酸球性疾患患者では、Ｈ−ＰＧＤＳとＭＢＰ陽性細胞はほとんど一致しないが、好酸球の浸潤が顕著な患者ではＭＢＰ陽性細胞のほとんどが、Ｈ−ＰＧＤＳを発現する．

ＥＧ２（活性化好酸球）抗体とＨ−ＰＧＤＳとの蛍光抗体染色を示す。上段の好酸球浸潤が軽度な患者では、Ｈ−ＰＧＤＳ陽性細胞とＥＧ２陽性細胞（活性化好酸球）はほとんど一致しないが、好酸球浸潤が著明な患者では、ＥＧ２陽性細胞のほとんどが、Ｈ−ＰＧＤＳ陽性細胞であった。目盛りは１０μｍである。

鼻茸のＨ−ＰＧＤＳ，ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２に対するウェスタンブロッティングを示す。左側７例は、好酸球浸潤が著明な患者で、右側７例は好酸球浸潤が軽微な患者である。

鼻茸のＨ−ＰＧＤＳ、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２に対するウェスタンブロッティングを示す。左側４例は、術後２年以内にポリープが再発した症例、右側４例は再発しなかった経過が良好な症例を示す。再発群は経過良好群と比較してＨ−ＰＧＤＳの発現が多い。

鼻茸におけるＨ−ＰＧＤＳｍＲＮＡの発現量を示す。再発例は経過良好例と比較して、発現量が高かった。

好酸球ＥＧ２抗体とＨ−ＰＧＤＳとの蛍光抗体染色を示す。再発群ではＥＧ２陽性細胞のほとんどが、Ｈ−ＰＧＤＳ陽性細胞であった。目盛りは１０μｍである。

本発明の対象となる好酸球性炎症疾患には慢性副鼻腔炎（特に、鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎）、鼻アレルギー性鼻炎、気管支喘息（特にアレルギー性気管支喘息）、またはアレルギー性皮膚炎を含む。
本発明において「重症度」とは、好酸球性炎症疾患を軽症、中等症、重症に分ける指標を示し、それぞれの疾患の診断基準や重症度分類等（例えば、2002年版鼻アレルギー診療ガイドライン、厚生労働省21世紀型医療開拓推進研究事業[ＥＢＭ分野]アレルギー鼻炎ガイドライン班作成）により診断される。
本発明において「再発性」とは、好酸球性炎症疾患（特に鼻茸）症状の再燃性を示し、例えば鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎の場合には、鼻茸切除後、２年以内に副鼻腔粘膜の腫脹が見られた場合を「再発」とする。

本発明の方法において用いる試料は、炎症部位から採取されるが、鼻アレルギー性鼻炎、気管支喘息（特にアレルギー性気管支喘息）等の場合には鼻腔洗浄液や気管支肺胞洗浄液を用いることができる。例えば生理食塩水にて鼻腔洗浄し、回収された液を遠心分離し、沈殿物を塗沫標本とした後に、Ｈ−ＰＧＤＳ抗体染色あるいはライト・ギムザ染色を行い、Ｈ−ＰＧＤＳ陽性の好酸球を同定する。また回収された液を遠心分離して得た上清中のプロスタグランジン（ＰＧＤ_２）量をEIA法（Krawiec ME, Westcott JY, Chu HW, Balzar S, Trudeau JB, Schwartz LB, Wenzel SE, Persistent wheezing in very young children is associated with lower respiratory inflammation, Am J Respir Crit Care Med 2001;163:1338-1343 および Shichijo M, Inagaki N, Nakai N, Kimata M, Nakahata T, Serizawa I, Iikura Y, Saito H, Nagai H, The effects of anti-asthma drugs on mediator release from cultured human mast cells, Clin Exp Allergy. 1998 Oct;28(10):1228-36 を参照）、あるいはＬＣ−ＭＳ法（Sugimoto M, Sugiyama S, Yanagita N,Ozawa T, Laser high performance liquid chromatography determination of prostaglandins in nasal lavage fluid in allergic rhinitis, Clin Exp Allergy. 1994 Apr;24(4):324-9 を参照）によって定量する。

炎症局所で好酸球が発現するＨ−ＰＧＤＳは、以下の実施例で説明するように、組織染色法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウェスタンブロッティング法あるいはｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によって検出する。これらの方法は当業者に周知である。Ｈ-ＰＧＤＳの測定にこれらの方法を適用した例は、以下の文献： Hematopoietic prostaglandin D synthase is expressed in microglia in the developing postnatal mouse brain. Glia. 2003,May, 42(3):263-74; Induction of hematopoietic prostaglandin D synthase in hyalinated necrotic muscle fibers: its implication in grouped necrosis. Neuropathol (Berl). 2002, Oct,104(4):377-84. Epub 2002 Jun 6; Essential role for hematopoietic prostaglandin D2 synthase in the control of delayed type hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 28;103(13):5179-84. Epub 2006 Mar 17 に記載されている。これらの文献は本明細書の１部を構成する。

上述のように測定したＰＧＤ_２量、Ｈ−ＰＧＤＳについて、好酸球性炎症疾患の炎症部位でのＰＧＤ_２量、Ｈ−ＰＧＤＳタンパク質の発現量が高いほど、好酸球性炎症疾患が重症であることが明らかとなった。従って、本発明は、患者から採取された好酸球性炎症疾患の炎症部位でのＨ−ＰＧＤＳタンパク質の発現量またはＰＧＤ_２量が高いほど、好酸球性炎症疾患の重症度が重度であると診断する好酸球性炎症疾患の診断方法を提供する。
また上述のように測定したＰＧＤ_２量、Ｈ−ＰＧＤＳについて、好酸球性炎症疾患の炎症部位でのＰＧＤ_２量、Ｈ−ＰＧＤＳタンパク質の発現量が高いほど、好酸球性炎症疾患の再発性が高いことが明らかとなった。特に鼻茸においては、鼻茸におけるＰＧＤ_２量、Ｈ−ＰＧＤＳタンパク質の発現量が高いほど、鼻茸の再発性、特に鼻茸切除後の経過を追跡した２年以内の再発性が高いことが明らかとなった。従って、本発明は、患者から採取された好酸球性炎症疾患の炎症部位でのＨ−ＰＧＤＳタンパク質の発現量またはＰＧＤ_２量が高いほど、好酸球性炎症疾患の再発性が高いと予測する、好酸球性炎症疾患の再発性を予測する方法も提供する。更には、患者から採取された鼻茸でのＨ−ＰＧＤＳタンパク質の発現量またはＰＧＤ_２量が高いほど、鼻茸の再発性が高いことを予測する、鼻茸の再発性を予測する方法も提供する。
本願発明により好酸球性炎症疾患とＨ-ＰＤＧＳの発現が相関性を有する事が明らかになったので、Ｈ-ＰＤＧＳの発現が好酸球性炎症疾患の発症の原因である事が予測し得る。したがってＨ−ＰＧＤＳ阻害物質またはＤＰ拮抗薬が好酸球性炎症疾患の治療剤となりうる可能性がある。

Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤の例は、４−ベンズヒドリルオキシ−１−｛３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−プロピル｝ピペリジン（ＨＱＬ−７９）、１−アミノ−４−｛４−［４−クロロ−６−（２−スルホ−フェニルアミノ）−［１，３，５］トリアジン−２−イルメチル］−３−スルホ−フェニルアミノ｝−９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−アントラセン−２−スルホン酸（チバクローンブルー）、１−アミノ−４−（４−スルファモイルアニリノ）−アントラキノン−２−スルホン酸（ＰＧＤ−０４２）もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物、２−（２’−ベンゾチアゾリル）−５−スチリルー３−（４’−フタルヒドラジディル）テトラゾリウム塩化物（ＰＧＤ−０１６）またはそれらの水和物を含む。
製薬上許容される塩とは、塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のヘテロ環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。酸性塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位していてもよい。

プロスタグランジンＤ受容体の拮抗薬の例は、（±）−３−ベンジル−５−（６−カルボキシヘキシル）−１−（２−シクロヘキシル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ヒダントイン（ＢＷＡ８６８Ｃ）、（＋）−（３Ｒ）−３−（４−フルオロベンゼンスルホンアミド）−１，２，３，４−テトラヒドロカルバゾール−９−プロピオン酸（ラマトロバン）、（Ｚ）−７−［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−２−（５−ヒドロキシベンンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルカルボニルアミノ）−１０−ノルピナン−３−イル］ヘプタ−５−エン酸、（Ｚ）−７−［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルカルボニルアミノ）−１０−ノルピナン−３−イル］ヘプタ−５−エン酸（ピナグラジン）もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物である。

好酸球性炎症疾患者に対するこれらの化合物の投与の前後において、本発明の方法による診断方法を行いＨ-ＰＧＤＳの発現量の測定、またはＰＧＤ_２の生成量を測定すれば、該化合物が好酸球性炎症疾患の治療薬であるか否かを確認できる。

本発明は、１）ヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスに抗原を感作してアレルギー疾患モデルを作製し、鼻腔、気道あるいは皮膚に抗原を暴露して好酸球性アレルギー疾患を惹起し、
２）好酸球性疾患を誘導する前または後にＨ−ＰＧＤＳ阻害物質またはＤＰ拮抗薬候補化合物をトランスジェニックマウスに投与し、
３）トランスジェニックマウスにおける好酸球性炎症疾患の状態を、候補物質を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、
ことを含む好酸球性炎症疾患の進行を防止し、または再発の予防に用いる化合物のスクリーニング方法にも関する。

ＷＯ０１／２４６２７号に開示されている方法に従って造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）大量発現トランスジェニックマウスを作製できる。この文献は本明細書の一部を構成する。ヒト細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーから、ラットＨ−ＰＧＤＳ遺伝子のｃＤＮＡ（Cell 90:1085-10975,1997; GenBank Accession No. D82071）をプローブしてヒトＨ−ＰＧＤＳのｃＤＮＡ（Eur. J. Biochem. 267:3315-3322, 2000; GenBank Accession No.NM-014485）をクローニングする。次にベクターｐＣＡＧＧＳ（Gene 108: 193-199 (1991)）のクローニング部位（ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ）にヒトＨ−ＰＧＤＳのｃＤＮＡを挿入結合し、導入ベクターを構築する。図１８はこの導入ベクターにおける導入遺伝子の構成である。この導入遺伝子はＣＭＶエンハンサーとチキンβ―アクチンプロモーターをＨ−ＰＧＤＳｃＤＮＡの上流に有しており、マウスの染色体に導入されると、これらのエンハンサーおよびプロモーターの作用によりＨ−ＰＧＤＳｍＲＮＡを大量に発現される。この導入ベクターをマイクロインジェクション法によりＦＶＢ系マウス（National Institute of Health Animal Genetic Resourceより入手）の受精卵に注入する。遺伝子導入受精卵は定法に従って仮親の卵管に移植し、個体へと発生させ出生させる。得られたマウスの尾部からＤＮＡを抽出し、導入遺伝子の配列に基づき合成されたプローブを用いて、サザンブロット法によりトランスジェニックマウスを選別する。

次に、ヒトＨ−ＰＧＤＳ大量発現トランスジェニックマウスを用いて好酸球性アレルギー性疾患モデルを作製する。マウスに水酸化アルミニウムゲルに懸濁した卵白アルブミンを抗原として腹腔内あるいは気道内に投与(感作)する。感作から2-3週間後に、鼻腔、気道あるいは皮膚に抗原である卵白アルブミン溶液を暴露して好酸球性アレルギー疾患を惹起する。抗原暴露後24時間から72時間後には抗原を暴露しない群(対照群)に比べて鼻腔、気道あるいは皮膚に顕著な好酸球の浸潤が観察される。

以下に本発明を慢性副鼻腔炎に対して実施した例を説明する。これら実施例は説明のためのものであって、本発明が実施例に限定されるものではないことは勿論である。

実施例１

慢性副鼻腔炎の患者に対する治療として、鼻茸の切除手術を施行した。摘出した鼻茸での好酸球の浸潤を調べる目的で、鼻茸組織を用いて組織化学的な検査を行った。まず、摘出した鼻茸を１０％中性ホルマリン固定したのち、パラフィン切片を作成した。その切片を常法によりヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を行った後、顕微鏡下で観察して浸潤細胞あたりの好酸球数を測定し２０％以上を好酸球浸潤高度例、１０％以下を非好酸球性鼻茸として分類した。

表１に患者背景を示す。実験に用いた鼻茸は表１の高度例７例と軽度例７例である。その中で７例はダニに対して末梢血中特異的ＩｇＥ抗体が陽性であった。術前の末梢血好酸球の割合では２群間に有意差は無かった。

ＭＢＰ陽性活性化好酸球でのＨ−ＰＧＤＳの発現
鼻茸でのＨ−ＰＧＤＳの細胞分布を調べる目的で、Ｈ−ＰＧＤＳと好酸球の指標である主要塩基性蛋白質（ＭＢＰ）に対する抗体を用いた酵素免疫染色を行った。

まず、１０％中性ホルマリンで固定した鼻茸のパラフィン切片を１００％キシレンに浸して脱パラフィンを行った。その後０．３％ペプシン溶液にて室温で１０分間反応させて抗原性の賦活化を行った。その後１０％正常ヤギ血清と０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含むリン酸緩衝液に室温で１時間反応させて蛋白質の非特異的結合部位を塞いだ。そして、Ｈ−ＰＧＤＳ抗体 (polyclonal rabbit anti-human HPGDS antibody，Cayman Chamical 社製, ブロッキング液で1：１００００に希釈）、及び、抗ＭＢＰ抗体（monoclonal anti-human eosinophil major basic protein antibody, clone BMK, Biodesign International社より購入。ブロッキング液で１：１０００に希釈）と４℃で一晩反応させ、洗浄後、２次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体とＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（Molecular Probes 社製、希釈１：５００）と室温で１時間反応させた。充分に洗浄後、共焦点蛍光顕微鏡（BIO-RAD 社製 Radiance 2000）を用いて、常法（Nantel F, Fong C, Lamontague S, et al. Expression of prostaglandin D₂ receptors DP and CRTH2 in human nasal mucosa. Prostaglandins and Other Lipid Mediat. 2004; 73: 87-101.）により観察した。

その結果、従来、好酸球の指標とされてきた主要塩基性蛋白質（ＭＢＰ）とＨ−ＰＧＤＳを比較すると、好酸球の浸潤が軽度な患者の組織（Ｌ３）では、ＭＢＰ陽性細胞（好酸球）とＨ−ＰＧＤＳ陽性細胞はほとんど一致しないが、好酸球の浸潤が顕著な患者（Ｈ６）の組織では、ＭＢＰ陽性細胞のほとんどにＨ−ＰＧＤＳが発現することが判明した（図１参照）。単位面積あたりでの陽性染色細胞を比較すると、ＭＢＰ陽性細胞のうちＨ−ＰＧＤＳタンパク質を発現している細胞の割合は、好酸球浸潤高度例の方が有意に高いことが判明した（表１参照）

実施例２
ＥＧ２陽性活性化好酸球でのＨ−ＰＧＤＳの発現
鼻茸でのＨ−ＰＧＤＳの活性化好酸球への分布を調べる目的で、Ｈ−ＰＧＤＳと活性化好酸球の指標であるＥＧ２抗原（Eosinophil Cationic Protein （ECP）活性化された好酸球に認められる、傷害性の蛋白質)を特異的に認識する抗体（Bentley AM, Jacobson MR, Cumberworth V, Barkans JR, Moqbel R. et al. Immunohistology of the nasal mucosa in seasonal allergic rhinitis: increases in activated eosinophils and epithelial mast cells. J Allergy Clin Immunol. 1992;89(4): 877-83.）の発現を免疫組織化学染色法によって比較した。

まず、１０％中性ホルマリンで固定した鼻茸のパラフィン切片を１００％キシレンに浸して脱パラフィンを行った後、０．３％ペプシン溶液にて抗原性の賦活化を行った。その後１０％正常ヤギ血清、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ含有ＰＢＳにてブロッキングを行い、一次抗体を添加して４℃で１晩反応させた。一次坑体として、ＨＰＧＤＳ抗体（polyclonal rabbit anti-human HPGDS antibody, Cayman Chamical 社より購入。ブロッキング液で１：１００００に希釈），あるいは、抗ＥＧ２抗体（monoclonal anti-human eosinophil cationic protein antibody, clone EG2, Pharmacia社製）と反応させ、上述と同様に、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体とＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（Molecular Probes 希釈１：５００）を用いて免疫染色を行い、共焦点蛍光顕微鏡（BIO-RAD社製 Radiance 2000）にて観察した。

その結果、好酸球の浸潤が軽度な患者の組織（Ｌ３）では、ＥＧ２陽性細胞（好酸球）とＨ−ＰＧＤＳ陽性細胞はほとんど一致しないが、好酸球の浸潤が顕著な患者の組織（Ｈ６）では、ＥＧ２陽性細胞のほとんどにＨ−ＰＧＤＳが発現することが判明した。（図２参照）。さらに、単位面積あたりでＥＧ２陽性細胞のうちＨ−ＰＧＤＳ陽性細胞を発現している割合を好酸球浸潤の程度について比較すると、好酸球浸潤高度例の方が有意に高いことが判明した（表１参照）。

実施例３
慢性副鼻腔炎患者から採取した鼻茸組織検体のウェスタンブロッティング（１）
鼻茸でのＨ−ＰＧＤＳ蛋白質の発現を調べる目的で、鼻茸組織の抽出液を用いてＳＤＳゲル電気泳動を行い、泳動後の蛋白質の転写ナイロン膜を用いてＨ−ＰＧＤＳに対する抗体によるウェスタンブロッティングを行った。

まず、摘出標本約５０ｍｇをＰＢＳ０．５ｍｌの中でホモジナイズし、７０００ｇ（４℃、２０分）遠心分離したのち、１０万ｇ（４℃、１時間）で遠心分離して上清とマイクロゾーム分画を得た。上清を１０／２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに、マイクロソームを４／２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（いずれも第一化学）で泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に１００ｍＡにて１時間転写した。非特異的な結合をスキムミルクでブロッキングした後、Ｈ−ＰＧＤＳ抗体（polyclonal rabbit anti-human HPGDS antibody, Cayman Chamical 社より購入;１：５０００希釈で使用)、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１抗体(polyclonal rabbit anti-human COX-1 antibody, Cayman Chamical 社より購入；１：１０００希釈で使用）、ＣＯＸ−２抗体（monoclonal mouse anti-human COX-2 antibody, Cayman Chamical 社より購入；１ｍｇ／ｍｌに希釈して使用）を５％スキムミルクと０，１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈して４℃で一晩反応させた。次に２次抗体として、ＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体または、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧ抗体（Jackson Laboratories社より購入。トリス緩衝液で１：１０００に希釈して使用）と室温で１時間反応させた。その後ＥＣＬｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ（Amasham International 社製）と室温で２分間反応させた後ＫｏｄａｋＸＯＭＡＴＡＲｆｉｌｍ（Eastman Kodak 社製）１５分間焼付けて現像した。

その結果、左側７例は病変部位に好酸球の浸潤が顕著であった群（Ｈ１〜７）で、右側７例は、好酸球の浸潤が軽度であった群（Ｌ１〜７）である。左から症例Ｈ１〜７とＬ１〜７を示す。アレルギー性鼻炎の有無にかかわらず左側（Ｈ１〜７）は全例でＨ−ＰＧＤＳの発現が顕著であった。Ｈ−ＰＧＤＳの発現と病態の重症度に強い相関が認められた。右側（Ｌ１〜７）は７例中３例に強い発現が認められる。ところが、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１あるいはＣＯＸ−２の発現と病態の重症度には相関が認められなかった。また、好酸球浸潤が軽度な群中でＨ−ＰＧＤＳ発現が高かった３例はいずれも末梢血好酸球の割合が高く、好酸球とＨ−ＰＧＤＳの関わりが推察される。（図３参照）。

実施例４
鼻茸切除時点でのＨ−ＰＧＤＳタンパク質の発現と再発率の関係を調べる目的で、鼻茸切除後の経過を追跡し、２年以内に副鼻腔粘膜の腫脹が見られた症例を再発群とし、２年以内に粘膜の腫脹が見られなかった症例を経過良好群として、Ｈ−ＰＧＤＳの発現を調べた。患者背景を表２に示す。

慢性副鼻腔炎患者から採取した鼻茸組織検体のウェスタンブロッティング（２）
実施例３と同様の方法で、Ｈ−ＰＧＤＳ抗体、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１、ＣＯＸ−２抗体にてウェスタンブロッティング（Kanaoka Y, Ago H, Inagaki E, et al. Cloning and crystal structure of hematopoietic prostaglandin D synthase. Cell 1997; 90:10851095.）を行った。

その結果、再発群では（左から症例Ｒ１〜４）鼻茸におけるＨ−ＰＧＤＳの発現量が高かった。一方、経過が良好であった症例では（良好群左から症例Ｒ８〜１１）Ｈ−ＰＧＤＳの発現が低かった。従って、Ｈ−ＰＧＤＳ発現量で、鼻茸の再発性を予測することができる（図４参照）。

実施例５
慢性副鼻腔炎患者から採取した鼻茸組織検体の定量的ＰＣＲ
Ｈ−ＰＧＤＳｍＲＮＡの発現と再発率との関係を調べる目的で、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Kanaoka Y, Ago H, Inagaki E, et al. Cloning and crystal structure of hematopoietic prostaglandin D synthase. Cell 1997; 90:10851095.）を行った。

手術で摘出した後、速やかに−８０℃凍結保存した鼻茸から、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔおよびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴＫｉｔ（共にＱＩＡＧＥＮ）を用いｔｏｔａｌＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡへの逆転写を行った。定量的ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔＤＮＡＭａｓｔｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎ１（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。Ｈ−ＰＧＤＳのプライマーをＦ１：５’ＧＡＡＴＡＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣ（配列番号１）、Ｒ１：５’ＡＧＣＣＡＡＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＧ（配列番号２）とデザインし、９５℃、１０分の熱変性した後、９５℃ １５秒；５７℃ ５秒；７２℃ １０秒を４０サイクルの条件で施行した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子について測定した。ＧＡＰＤＨのプライマーはＦ１：５’ＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧ（配列番号３）、Ｒ１：５’ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ（配列番号４）とデザインし、９５℃、１０分の熱変性した後、９５℃ １５秒；６３℃ ２０秒；７２℃ １０秒を４０サイクルの条件で行った。ｃＤＮＡの定量はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭＳｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた蛍光測定法によって行った。

その結果、Ｈ−ＰＧＤＳタンパク質の結果と同様に、２年以内に鼻茸が再発した症例では鼻茸におけるＨ−ＰＧＤＳの発現量が高かった。一方、経過が良好であった症例ではＨ−ＰＧＤＳの発現が低かった（図５参照）。
以上の結果は、患者から採取した組織のＨ−ＰＧＤＳタンパク質やｍＲＮＡ量をウェスタンブロッティング法やＰＣＲ法で定量することによって、鼻茸の再発性を予測することができることを示している。

実施例６
好酸球でのＨ−ＰＧＤＳ発現と再発率との関係を調べる目的で、実施例２と同様の方法で、好酸球ＥＧ２抗体とＨ−ＰＧＤＳとの蛍光抗体染色を行った。
その結果、経過良好群（症例Ｒ１２）では、Ｈ−ＰＧＤＳとＥＧ２陽性細胞（図６、矢印）はほとんど一致しないが、再発群（症例Ｒ６）では、ＥＧ２陽性細胞のほとんどがＨ−ＰＧＤＳ陽性細胞と一致する。以上の結果は、Ｈ−ＰＧＤＳとＥＧ２の両方が陽性の活性化好酸球の多い鼻茸は再発率が高いことを示している。

以上詳述したように、本発明は鼻茸等の好酸球性炎症疾患において、病変部位に集積した好酸球に誘導されるＨ−ＰＧＤＳを検出したり、鼻腔洗浄液や気管支肺胞液中のＰＧＤ_２を測定したりすることにより、病態の重症度を診断したり、これら疾患の再発性を予測する方法を提供するものである。

Claims

患者から採取された炎症部位での造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）タンパク質の発現を測定することを含み、当該測定が主要塩基性蛋白質（ＭＢＰ）陽性細胞数に対するＨ−ＰＧＤＳ陽性細胞数の割合を測定することを含み、その測定された割合が２５．４％より高いことを慢性副鼻腔炎の重症度の指標とすることを特徴とする、慢性副鼻腔炎の重症度を検査する方法。
患者から採取される炎症部位が鼻茸であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
患者から採取された炎症部位での造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）タンパク質の発現を測定することを含み、当該測定がＥＧ２陽性細胞数に対するＨ−ＰＧＤＳ陽性細胞数の割合を測定することを含み、その測定された割合が４４．３％より高いことを慢性副鼻腔炎の重症度の指標とすることを特徴とする、慢性副鼻腔炎の重症度を検査する方法。
患者から採取される炎症部位が鼻茸であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
患者から採取された炎症部位での造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）タンパク質の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定することを含み、その測定されたＨ−ＰＧＤＳタンパク質の発現量が、同じ部位での定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＧＡＰＤＨの発現量に対して０．０４より高いことを慢性副鼻腔炎の再発性の指標とすることを特徴とする、慢性副鼻腔炎の再発性を検査する方法。
患者から採取される炎症部位が鼻茸であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
慢性副鼻腔炎が、鼻茸を伴うことを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。