WO2006123677A1 - 好酸球性炎症疾患の重症度および再発性の予測診断方法 - Google Patents

好酸球性炎症疾患の重症度および再発性の予測診断方法 Download PDF

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nasal
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inflammatory disease
eosinophilic
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Yoshihiro Urade
Naomi Eguchi
Kosuke Aritake
Sawako Hyo
Hiroshi Takenaka
Ryo Kawata
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Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing the severity of eosinophilic inflammatory diseases and predicting recurrence of these diseases. More specifically, the present invention relates to sites of inflammation caused by diseases such as chronic sinusitis (especially chronic sinusitis with nasal polyposis), allergic rhinitis, bronchial asthma (especially allergic bronchial asthma), and allergic dermatitis.
  • diseases such as chronic sinusitis (especially chronic sinusitis with nasal polyposis), allergic rhinitis, bronchial asthma (especially allergic bronchial asthma), and allergic dermatitis.
  • the activity of accumulated eosinophils was measured using the expression level of hematopoietic prostaglandin D synthase (H-PGDS) gene or protein in eosinophils as an index. It relates to diagnosing the severity of the disease and predicting recurrence.
  • H-PGDS hematopoietic prostaglandin D synthase
  • nasal polyposis The formation of nasal polyposis is not yet clear, but since it is an inflammatory lesion observed with chronic sinusitis, it has long been thought that inflammation caused by infection is involved in its origin. On the other hand, nasal observation of nasal fins is often accompanied by infiltration of eosinophils, and it is assumed that eosinophilic inflammation such as bronchial asthma and allergic rhinitis is involved in the cause.
  • Nasal fins not only cause a severe sensation of the nasal sinus among the symptoms of chronic sinusitis, but also cause severe sinusitis due to impaired ventilation of the nasal sinuses and damage to the lower respiratory tract due to postnasal drip.
  • Leukotrien (LT) Excessive production and release of chemical mediators such as C, LTD, LTE, etc.
  • eosinophils After being released, inflammatory cells represented by eosinophils accumulate locally. When the accumulated eosinophils are activated, it is thought that tissue damage proteins such as major basic protein (MBP) and eosinophil cation protein (ECP) are released to further aggravate inflammation.
  • MBP major basic protein
  • ECP eosinophil cation protein
  • diseases such as chronic sinusitis (nasal fins), allergic rhinitis, bronchial asthma (especially allergic monobronchial asthma), allergic dermatitis, and prostaglandin D2 (PGD)
  • Non-Patent Documents 1 and 2 are known (for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • PGE PGE
  • H-PGDS hematopoietic prostaglandin D synthase
  • Non-Patent Document 1 Allergy, Vol.54, No.3 / 4, Page.384
  • Non-Patent Document 2 Allergy, Vol.52, No.8 / 9, Page.759
  • a method for diagnosing the severity of eosinophilic inflammatory diseases and predicting the recurrence of these diseases which involves hematopoietic prostaglandin D synthase (H-PGDS) )
  • H-PGDS hematopoietic prostaglandin D synthase
  • Eosinophil infiltration is prominent in severe nasal polyps associated with sinusitis.
  • H-PGDS is not detected in eosinophils, but H-PGDS expression is enhanced by EG2 or MBP positive active eosinophils at the lesion site.
  • H-PGDS The expression level of H-PGDS in eosinophils correlates with the severity of eosinophilic inflammatory disease. In other words, the higher the expression level of H—PGDS, the more severe the eosinophilic inflammatory disease.
  • H-PGDS The expression level of H-PGDS in eosinophils correlates with the recurrence rate of nasal polyposis. Ie H—PG The higher the expression level of DS, the higher the recurrence rate of the nasal fin!
  • the present invention is a method for diagnosing the severity of eosinophilic inflammatory disease, which measures the expression level of hematopoietic prostaglandin D synthase (H-PGDS) protein at the inflammatory site. Severity, including measuring prostaglandin D (PGD) levels
  • the gist is a method of diagnosing the above.
  • the present invention is also a method for predicting recurrence of an eosinophilic inflammatory disease, wherein the expression level of hematopoietic prostaglandin D synthase (H-PGDS) protein at the inflammatory site is measured. Or prognostic relapse including measuring prostaglandin D (PGD) levels.
  • H-PGDS hematopoietic prostaglandin D synthase
  • the gist is also the method of measurement.
  • the present invention also provides: 1) A human hematopoietic prostaglandin D synthase (H-PGDS) overexpressing transgenic mouse is sensitized with an antigen to produce an allergic disease model, and the nasal cavity, respiratory tract or Exposure of the antigen to the skin to cause eosinophilic allergic disease,
  • H-PGDS human hematopoietic prostaglandin D synthase
  • H—PGDS hematopoietic prostaglandin D synthase
  • DP prostaglandin receptor
  • the gist of the present invention is also a screening method for compounds used to prevent the progression of eosinophilic inflammatory diseases including the above or to prevent recurrence.
  • the invention's effect is also a screening method for compounds used to prevent the progression of eosinophilic inflammatory diseases including the above or to prevent recurrence.
  • the present invention it is possible to provide a new diagnostic method for the severity of eosinophilic inflammatory diseases and a method for predicting the recurrence of these diseases. Further, according to the present invention, progression of eosinophilic inflammatory disease can be prevented, and a compound used for preventing recurrence can be screened.
  • FIG. 1 shows fluorescent antibody staining of MBP (eosinophil index) antibody and H-PGDS.
  • MBP eosinophil index
  • FIG. 2 shows fluorescent antibody staining of EG2 (active eosinophil) antibody and H-PGDS.
  • EG2 active eosinophil
  • FIG. 2 shows fluorescent antibody staining of EG2 (active eosinophil) antibody and H-PGDS.
  • EG2 active eosinophil
  • EG2-positive cells activated eosinophils
  • the scale is 10 m.
  • FIG. 3 Western blotting of nasal fin for H-PGDS, COX-1 and COX-2. Seven patients on the left side had significant eosinophil infiltration, and seven patients on the right side had minimal eosinophil infiltration.
  • FIG. 4 Western blotting of nasal fin for H-PGDS, COX-1 and COX-2.
  • the 4 cases on the left show cases in which polyps recurred within 2 years after the operation, and the 4 cases on the right show cases in which the recurrence did not recur well.
  • the relapse group has more H-PGDS than the good progress group.
  • FIG. 5 shows the expression level of H-PGDS mRNA in the nasal fin. Recurrent cases had higher expression levels compared to those with good progress.
  • FIG. 6 shows fluorescent antibody staining of eosinophil EG2 antibody and H-PGDS.
  • EG2 positive cells were H-PGDS positive cells.
  • the scale is 10 m.
  • Eosinophilic inflammatory diseases that are the subject of the present invention include chronic sinusitis (especially chronic sinusitis with nasal polyposis), nasal allergic rhinitis, bronchial asthma (especially allergic bronchial asthma), and Includes allergic dermatitis.
  • “severity” refers to an index that divides eosinophilic inflammatory diseases into mild, moderate, and severe.
  • the diagnostic criteria and severity classification of each disease for example, the 2002 edition of nasal allergy treatment) Guideline, Ministry of Health, Labor and Welfare
  • recurrent indicates relapse of eosinophilic inflammatory disease (especially nasal polyposis) symptoms.
  • eosinophilic inflammatory disease especially nasal polyposis
  • recurrence is assumed.
  • the sample used in the method of the present invention is collected from an inflamed site, but nasal allergy
  • bronchial asthma particularly allergic bronchial asthma
  • nasal washing solution and bronchoalveolar washing solution
  • H-PGDS antibody staining or Wright 'Giemsa staining is performed, and H-PGDS positive positive Identify acid spheres.
  • PGD prostaglandin
  • H-PGDS expressed by eosinophils in the inflamed area is detected by tissue staining, RT-PCR, Western blotting or in situ hybridization as described in the following examples. . These methods are well known to those skilled in the art. An example of applying these methods to the measurement of H-PGDS is as follows: Hematopoietic prostaglandin D synthase is expressed in microglia in the developing postnatal mouse brain, lia. 2003, May, 42 (3): 263-74 ; Induction of hematopoietic prostaglandin D synthase in hyalinat ed necrotic muscle fibers: its implication in grouped necrosis. Neuropathol (Berl).
  • the present invention relates to eosinophils collected from patients.
  • H—PGDS protein expression level or PGD level is high at the site of inflammation in systemic inflammatory diseases
  • the present invention predicts that the higher the expression level or PGD amount of H-PGDS protein at the inflammatory site of eosinophilic inflammatory disease collected by the patient, the higher the recurrence of eosinophilic inflammatory disease. Good
  • It also provides a method for predicting the recurrence of a nasal polyposis that predicts that it is high.
  • H-PGDS inhibitors or DP antagonists may be therapeutic agents for eosinophilic inflammatory diseases.
  • H-PGDS inhibitors are 4 benzhydryloxy-1— ⁇ 3— (1H—tetrazol-5-yl) -propyl ⁇ piperidine (HQL-79), 1-amino 4— ⁇ 4— [ 4 Black mouth —6— (2-sulfo-phenylamino) — [1, 3, 5] triazine—2-ylmethyl] —3-sulfol-amino-amino ⁇ 9, 10 Dixo 9,10 Dihydroanthracene 1-Sulfonic acid (Ciba-clone blue), 1 amino-4 mono (4-sulfamoyl-lino) anthraquinone 2 sulfonic acid (PGD-042) or a pharmaceutically acceptable salt thereof or water thereof Contains Japanese, 2- (2, monobenzothiazolyl) 5-styryl lu 3- (4, -phthalhydrazyl) tetrazolium chloride (PGD-016) or hydrates thereof.
  • the pharmaceutically acceptable salt is, for example, an alkali metal salt such as sodium salt or potassium salt; an alkaline earth metal salt such as calcium salt or magnesium salt; an ammonium salt; Salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, ethanolamine Aliphatic amine salts such as N, N dibenzylethylene diamine; hetero ring such as pyridine salt, picoline salt, quinoline salt, isoquinoline salt Aromatic amine salt; tetramethyl ammonium salt, tetraethyl ammonium salt, benzyl trimethyl ammonium salt, benzyl triethyl ammonium salt, benzyl tributyl ammonium salt, methyl trioctyl ammonium salt Quaternary ammonium salts such as chlorinated salts and tetraptyl ammonium salts; and basic amino acid salts such as arginine salts and lysine salts.
  • alkali metal salt such as sodium
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, phosphate, carbonate, bicarbonate, perchlorate; acetate, propionate, lactate, maleate , Organic acid salts such as fumarate, tartrate, malate, kenate, and ascorbate; sulfonates such as methanesulfonate, isethionate, benzenesulfonate, and p-toluenesulfonate And acidic amino acids such as aspartate and glutamate.
  • These salts can be formed by a conventional method. When forming a hydrate, it may be coordinated with any number of water molecules.
  • prostaglandin D receptor antagonists are ( ⁇ ) —3 Benjirou 5 -— (6 carboxyhexyl) 1— (2-cyclohexyl 2-hydroxyethylamino) monohydantoy (BW A868C), (+) — (3R) — 3— (4 fluorobenzenesulfonamide) — 1, 2, 3, 4, 4-tetrahydrocarbazole-9-propionic acid (ramatroban), (Z)-7 -[(lR, 2R, 3S, 5S) —2— (5 Hydroxybenzo [b] thiophene-3-ylcarboamino) 10 norpinan-3yl] hepter 5 enoic acid, (Z) —7— [ (lR, 2R, 3S, 5S)-2- (Benzo [b] thiophene-3-ylcarbo-lamino)-10 norpinan-3-yl-hepta-5-enoic acid (pina
  • the method of the present invention is used to measure the expression level of H-PGDS or the amount of PGD produced.
  • the compound is a therapeutic drug for eosinophilic inflammatory disease.
  • the present invention relates to 1) sensitizing human H-PGDS overexpressing transgenic mice to produce an allergic disease model and exposing the nasal cavity, respiratory tract or skin to the antigen to eosinophilic. Causing allergic diseases,
  • H-PGDS inhibitor or DP antagonist candidate complement is administered to Transgenic mice,
  • the present invention also relates to a method for screening a compound used for preventing the progression of eosinophilic inflammatory disease including the above or for preventing recurrence.
  • H-PGDS hematopoietic prostaglandin D synthase overexpressing transgenic mouse
  • H-PGDS hematopoietic prostaglandin D synthase
  • This document forms part of this specification. From a cDNA library prepared from human cell mRNA, rat H-PGDS gene cDNA (Cell 90: 1085-10975, 1997; GenBank Accession No. D82071) was probed and human H-PGDS cDNA (Eur. J. Biochem. 267: 3315-33 22, 2000; GenBank Accession No. NM-014485).
  • human H-PGDS cDNA is inserted into the cloning site (Sal I / Not I) of the vector pC AGGS (Gene 108: 193-199 (1991)) to construct an introduction vector.
  • Figure 18 shows the structure of the transgene in this transfer vector.
  • This transgene has a CMV enzyme and a chicken ⁇ -actin promoter upstream of the H-PGDS cDNA, and when introduced into mouse chromosomes, these enhancers and promoters cause H-PGD SmRNA. Is expressed in large quantities.
  • This transfer vector is injected into fertilized eggs of FVB mice (obtained from the National Institute of Health Animal Genetic Resource) by microinjection.
  • Transgenic fertilized eggs are transplanted into the oviduct of the foster parent according to a standard method, and are generated and born into individuals.
  • DNA is extracted from the tail of the mouse and the transgenic mouse is selected by Southern blotting using a probe synthesized based on the transgene sequence.
  • an eosinophilic allergic disease model is prepared using human H-PGDS overexpressing transgenic mice.
  • Mice are administered (sensitized) intraperitoneally or in the respiratory tract with egg white albumin suspended in hydroxyaluminum gel. 2-3 weeks after sensitization, the ovalbumin solution, which is the antigen, is exposed to the nasal cavity, respiratory tract or skin. causess allergies. The antigen is not exposed 24 to 72 hours after the antigen exposure! As compared to the group (control group), significant eosinophil infiltration is observed in the nasal cavity, respiratory tract or skin.
  • a resection operation of the nasal fin was performed. Histochemical examination was performed using nasal fin tissue to examine the infiltration of eosinophils in the removed nasal fold. First, 10% neutral formalin was fixed to the extracted nasal fin, and then a paraffin section was prepared. The section was stained with hematoxylin-eosin (HE) by a conventional method, and then observed under a microscope to measure the number of eosinophils per infiltrating cell. The following were classified as non-eosinophilic nasal polyps.
  • HE hematoxylin-eosin
  • Table 1 shows the patient background.
  • the nasal fins used in the experiment are 7 cases of high severity and 7 cases of mild cases shown in Table 1. Among them, 7 cases were positive for specific IgE antibody in peripheral blood against mites. There was no significant difference between the two groups in the ratio of peripheral blood eosinophils before surgery.
  • H-PGDS In order to examine the cellular distribution of H-PGDS in the nasal fin, enzyme immunostaining was performed using antibodies against H-PGDS and the major basic protein (MBP), which is an indicator of eosinophils.
  • MBP major basic protein
  • MBP basic basic protein
  • EG2 antigen Espinophil Cationic Protein (ECP)
  • ECP Eosinophil Cationic Protein
  • Antibodies that specifically recognize toxic proteins found in eosinophils (Bentley AM, Ja cobson MR, Cumberworth V, Barkans JR, Moqoel R. et ai.Immunohistology of the n asal mucosa in seasonal allergic rhinitis The expression of J allergy Clin Immunol. 1992; 89 (4): 877-83.) was compared by immunohistochemical staining method: increases in activated eosinophils and epith elial mast cells.
  • HPGDS antibody polyclonal rabbit anti-human HPGDS antibody, purchased from Cayman Chamical Co., Ltd., blocking solution 1: 10000 [diluted], ⁇ ⁇ [MA, anti-EG2 antibody (monoclonal anti-human eosinophil cationi) c protein antibody, clone EG2, manufactured by Pharmacia), and immunized with Alexa488-labeled anti-rabbit IgG antibody and Alexa546-labeled anti-mouse IgG antibody (Molecular Probes dilution 1: 500) as secondary antibodies as described above Staining was carried out and observed with a confocal fluorescent microscope (Radance 2000 manufactured by BIO-RAD).
  • COX cycloxygenase
  • 1 antibody polyclonal rabbit anti-hu man COX-1 antibody, purchased from Cayman Chamical; used at 1: 1000 dilution
  • COX — 2 rod monoclonal mouse anti-human OX— 2 antibody, ayman Chamical Purchased; diluted with lmgZml) and diluted with 5% skim milk and PBS containing 0, l% Tween 20 and reacted at 4 ° C.
  • HRP-labeled anti-mouse Ig G antibody or anti-rabbit IgG antibody purchased from Jackson Laboratories Inc., diluted 1: 1000 with Tris buffer
  • ECL detection reagent manufactured by Amasham International
  • Kodak X OMAT AR film manufactured by Eastman Kodak
  • the left 7 cases were the group (Hl-7) in which eosinophil infiltration was remarkable in the lesion site, and the right 7 cases were the group in which eosinophil infiltration was mild (Ll ⁇ 7).
  • Cases H1-7 and L1-7 are shown from the left. Regardless of the presence or absence of allergic rhinitis, the expression of H-PG DS was remarkable in the left side (Hl-7) in all cases. There was a strong correlation between the expression of H-PGDS and the severity of the disease. On the right side (Ll-7), strong expression is observed in 3 out of 7 cases. However, there was no correlation between cycloxygenase (COX) -1 or COX-2 expression and disease severity.
  • COX cycloxygenase
  • Quantitative PCR is Light Cycler— FastStart DNA Master SYBR Greenl (Roche) was used.
  • H-PGDS primer is designed as Fl: 5, G AATAGAACAAGCTGACTGGC (SEQ ID NO: 1), Rl: 5, AGCCAAATGTGT GTTTTTGG (SEQ ID NO: 2), heat-denatured at 95 ° C for 10 minutes, then 95 ° C for 15 seconds 57 ° C for 5 seconds; 72 ° C for 10 seconds under 40 cycle conditions.
  • the GAPDH gene was measured as an internal standard.
  • Primers for GAPDH are designed as F1: 5 'TGAACGGGAAGCT CACTGG (SEQ ID NO: 3), R1: 5' TCCACCACCCTGTTGCTGTA (SEQ ID NO: 4), and heat-denatured at 95 ° C for 10 minutes, then 95 ° C for 15 seconds; 63 ° C for 20 seconds; 72 ° C for 10 seconds under 40 cycle conditions. Quantification of cDNA was performed by fluorescence measurement using Light Cycler TM System (Ro che).
  • the present invention detects H-PGDS induced by eosinophils accumulated at the lesion site in eosinophilic inflammatory diseases such as nasal polyps, nasal lavage fluid and bronchoalveolar alveoli.
  • eosinophilic inflammatory diseases such as nasal polyps, nasal lavage fluid and bronchoalveolar alveoli.

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Abstract

　本発明は、鼻茸等の好酸球性炎症疾患において、病変部位に集積した好酸球に誘導されるＨ－ＰＧＤＳを検出し、または鼻腔洗浄液や気管支肺胞液中のＰＧＤ２を測定したりすることにより、病態の重症度を診断したり、これら疾患の再発性を予測する方法を提供する。

Description

明 細 書
好酸球性炎症疾患の重症度および再発性の予測診断方法
技術分野
[0001] 本発明は、好酸球性炎症疾患の重症度を診断し、これら疾患の再発性を予測する 方法に関するものである。更に詳しくは、本発明は慢性副鼻腔炎 (特に鼻茸を伴う慢 性副鼻腔炎）、アレルギー性鼻炎、気管支喘息 (特にアレルギー性気管支喘息)、ァ レルギ一性皮膚炎等の疾患による炎症部位に集積した好酸球の活性ィ匕を、好酸球 での造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H— PGDS)遺伝子あるいはタンパク 質の発現量を指標として測定し、これら好酸球性炎症疾患の重症度を診断し、再発 性を予測することに関するものである。
背景技術
[0002] 鼻茸の成立は未だに明らかではないが、慢性副鼻腔炎に伴って認められる炎症性 の病変であることから、古くは感染による炎症がその成因に関与していると考えられ ていた。一方、鼻茸を組織学的に観察すると、好酸球浸潤を伴うものが多いので、そ の成因に気管支喘息やアレルギー性鼻炎といった好酸球性炎症の関与も推察され ている。
鼻茸は慢性副鼻腔炎の症状のうち鼻閉ゃ頭重感を引き起こすのみならず、鼻副鼻 腔の換気障害による副鼻腔炎の重症化や、後鼻漏による下気道の障害を引き起こ す。
したがって、鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎の治療は手術療法であるが、喘息を合併した 症例や、局所の好酸球浸潤の強い症例は 2〜3年以内に再発が認められる。
[0003] 花粉症に代表されるアレルギー性鼻炎の患者あるいはアレルギー性気管支喘息は 、抗原に暴露されると肥満細胞からプロスタグランジン (PG) D、 PGE、ヒスタミンや
2 2
ロイコトリェン (LT) C、 LTD、 LTE等のケミカルメディエーターが過剰に産生 ·放
4 4 4
出された後に好酸球に代表される炎症細胞が局所に集積する。集積した好酸球は 活性化されると主要塩基性蛋白（MBP)、好酸球カチオン蛋白（ECP)等の組織傷 害性タンパク質を放出して更に炎症を増悪すると考えられている。 [0004] これまで、慢性副鼻腔炎 (鼻茸)やアレルギー性鼻炎、気管支喘息 (特にアレルギ 一性気管支喘息）、アレルギー性皮膚炎等の疾患と、プロスタグランジン D2 (PGD )
2 の関与は知られている（例えば、非特許文献 1, 2)。一方これらの疾患では PGEや
2
LTC、 LTD、 LTE産生や好酸球の浸潤数が重症度の指標とされてきた。しかしな
4 4 4
がら、炎症部位での造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H— PGDS)タンパク質 の発現を調べることにより、これらの疾患の重症度を診断し、再発性を予測する方法 は、これまで知られていない。
[0005] これら疾患の治療にはステロイド (糖質コルチコイド)の投与が著効を示すが、副作 用の問題力も長期投与が困難である。そこで、非ステロイド性抗炎症薬ゃ抗アレルギ 一薬、抗ヒスタミン薬、抗ロイコトリェン薬の投与が行われている力 その薬効には個 人差が大きい。
非特許文献 1 :アレルギー， Vol.54, No.3/4, Page.384
非特許文献 2 :アレルギー， Vol.52, No.8/9, Page.759
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 好酸球性炎症疾患の重症度を診断したり、これら疾患の再発性を予測したりする方 法であって、炎症部位での造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H— PGDS)タ ンパク質の発現を調べて、重症度を診断し、再発性を予測する診断方法を提供する ことを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 上記目的を達成する本発明者は鋭意研究を行い、次のような知見を得たことに基 づ!、て本発明を完成させた。
1)副鼻腔炎に伴う重症の鼻茸では好酸球の浸潤が顕著である。
2)通常、好酸球には H— PGDSが検出されないが、病変部位では EG2あるいは M BP陽性の活性ィ匕好酸球で H— PGDSの発現が亢進する。
3)好酸球での H— PGDSの発現量は、好酸球性炎症疾患の重症度と相関する。す なわち H— PGDSの発現量が高いほど好酸球性炎症疾患が重症である。
4)好酸球での H— PGDSの発現量は、鼻茸の再発率と相関する。すなわち H— PG DSの発現量が高 、ほど鼻茸の再発率が高!、。
[0008] 従って本願発明は、好酸球性炎症疾患の重症度を診断する方法であって、炎症部 位での造血器型プロスタグランジン D合成酵素（H— PGDS)タンパク質の発現量を 測定するか、またはプロスタグランジン D (PGD )量を測定することを含む、重症度
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を診断する方法を要旨とする。
[0009] 本願発明はまた、好酸球性炎症疾患の再発性を予測する方法であって、炎症部位 での造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H— PGDS)タンパク質の発現量を測 定するか、またはプロスタグランジン D (PGD )量を測定することを含む再発性を予
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測する方法をも要旨とする。
[0010] 本願発明はまた、 1)ヒト造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H— PGDS)大量 発現トランスジエニックマウスに抗原を感作してアレルギー疾患モデルを作製し、鼻 腔、気道あるいは皮膚に抗原を暴露して好酸球性アレルギー疾患を惹起し、
2)好酸球性疾患を誘導する前または後に造血器型プロスタグランジン D合成酵素（ H— PGDS)阻害物質またはプロスタグランジン受容体 (DP)拮抗薬候補ィ匕合物をト ランスジェニックマウスに投与し、
3)トランスジ ニックマウスにおける好酸球性炎症疾患の状態を、候補物質を与えな いトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、
ことを含む好酸球性炎症疾患の進行を防止し、または再発の予防に用いる化合物の スクリーニング方法をも要旨とする。 発明の効果
[0011] 本発明によれば、好酸球性炎症疾患の重症度の新たな診断方法と、これらの疾患 の再発性を予測する方法を提供することができる。また本発明によれば好酸球性炎 症疾患の進行を防止し、再発予防に用いる化合物をスクリーニングすることができる
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]MBP (好酸球の指標)抗体と H— PGDSとの蛍光抗体染色を示す。上段の非 好酸球性疾患患者では、 H— PGDSと MBP陽性細胞はほとんど一致しないが、好 酸球の浸潤が顕著な患者では MBP陽性細胞のほとんど力 H— PGDSを発現する [0013] [図 2]EG2 (活性ィヒ好酸球)抗体と H— PGDSとの蛍光抗体染色を示す。上段の好 酸球浸潤が軽度な患者では、 H— PGDS陽性細胞と EG2陽性細胞 (活性化好酸球 )はほとんど一致しないが、好酸球浸潤が著明な患者では、 EG2陽性細胞のほとん ど力 H— PGDS陽性細胞であった。目盛りは 10 mである。
[0014] [図 3]鼻茸の H— PGDS, COX— 1および COX— 2に対するウェスタンブロッテイング を示す。左側 7例は、好酸球浸潤が著明な患者で、右側 7例は好酸球浸潤が軽微な 患者である。
[0015] [図 4]鼻茸の H— PGDS、 COX— 1および COX— 2に対するウェスタンブロッテイング を示す。左側 4例は、術後 2年以内にポリープが再発した症例、右側 4例は再発しな かった経過が良好な症例を示す。再発群は経過良好群と比較して H— PGDSの発 現が多い。
[0016] [図 5]鼻茸における H— PGDSmRNAの発現量を示す。再発例は経過良好例と比 較して、発現量が高力つた。
[0017] [図 6]好酸球 EG2抗体と H— PGDSとの蛍光抗体染色を示す。再発群では EG2陽 性細胞のほとんどが、 H— PGDS陽性細胞であった。目盛りは 10 mである。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 本発明の対象となる好酸球性炎症疾患には慢性副鼻腔炎 (特に、鼻茸を伴う慢性 副鼻腔炎）、鼻アレルギー性鼻炎、気管支喘息 (特にアレルギー性気管支喘息)、ま たはアレルギー性皮膚炎を含む。
本発明において「重症度」とは、好酸球性炎症疾患を軽症、中等症、重症に分ける 指標を示し、それぞれの疾患の診断基準や重症度分類等 (例えば、 2002年版 鼻ァ レルギ一診療ガイドライン、厚生労働省 21世紀型医療開拓推進研究事業 [EBM分野
]アレルギー鼻炎ガイドライン班 作成）により診断される。
本発明にお ヽて「再発性」とは、好酸球性炎症疾患 (特に鼻茸)症状の再燃性を示 し、例えば鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎の場合には、鼻茸切除後、 2年以内に副鼻腔粘 膜の腫脹が見られた場合を「再発」とする。
[0019] 本発明の方法において用いる試料は、炎症部位から採取されるが、鼻アレルギー 性鼻炎、気管支喘息 (特にアレルギー性気管支喘息)等の場合には鼻腔洗浄液や 気管支肺胞洗浄液を用いることができる。例えば生理食塩水にて鼻腔洗浄し、回収 された液を遠心分離し、沈殿物を塗沫標本とした後に、 H— PGDS抗体染色あるい はライト'ギムザ染色を行い、 H— PGDS陽性の好酸球を同定する。また回収された 液を遠心分離して得た上清中のプロスタグランジン（PGD )量を EIA法（Krawiec ME,
2
Westcott JY, Chu HW, Balzar b, Truaeau JB, Schwartz LB, Wenzel SE, Persistent wheezing in very young children is associated with lower respiratory inflammation, A m J Respir Crit Care Med 2001 ;163: 1338- 1343および Shichijo M, Inagaki N, Nakai N, Kimata M, Nakahata T, Serizawa I, Iikura Y, Saito H, Nagai H, The effects of anti -asthma drugs on mediator release from cultured human mast cells, Clin Exp Allergy . 1998 Oct;28(10):1228-36を参照）、あるいは LC— MS法（Sugimoto M, Sugiyama S , Yanagita N.Ozawa T, Laser high performance liquid chromatography determinatio n of prostaglandins in nasal lavage fluid in allergic rhinitis, Clin Exp Allergy. 1994 A pr;24(4):324-9を参照）によって定量する。
[0020] 炎症局所で好酸球が発現する H— PGDSは、以下の実施例で説明するように、組 織染色法、 RT— PCR法、ウェスタンブロッテイング法あるいは in situハイブリダィゼ ーシヨン法によって検出する。これらの方法は当業者に周知である。 H-PGDSの測 定にこれらの方法を適用した例は、以下の文献： Hematopoietic prostaglandin D syn thase is expressed in microglia in the developing postnatal mouse brain, lia. 2003, May, 42(3):263-74; Induction of hematopoietic prostaglandin D synthase in hyalinat ed necrotic muscle fibers: its implication in grouped necrosis. Neuropathol (Berl). 20 02, Oct,104(4) :377-84. Epub 2002 Jun 6; Essential role for hematopoietic prostagla ndin D2 synthase in the control of delayed type hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 28;103(13):5179- 84. Epub 2006 Mar 17に記載されている。これら の文献は本明細書の 1部を構成する。
[0021] 上述のように測定した PGD量、 H— PGDSについて、好酸球性炎症疾患の炎症
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部位での PGD量、 H— PGDSタンパク質の発現量が高いほど、好酸球性炎症疾患
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が重症であることが明らかとなった。従って、本発明は、患者から採取された好酸球 性炎症疾患の炎症部位での H— PGDSタンパク質の発現量または PGD量が高 ヽ
2 ほど、好酸球性炎症疾患の重症度が重度であると診断する好酸球性炎症疾患の診 断方法を提供する。
また上述のように測定した PGD量、 H— PGDSについて、好酸球性炎症疾患の炎
2
症部位での PGD量、 H— PGDSタンパク質の発現量が高いほど、好酸球性炎症疾
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患の再発性が高いことが明ら力となった。特に鼻茸においては、鼻茸における PGD
2 量、 H— PGDSタンパク質の発現量が高いほど、鼻茸の再発性、特に鼻茸切除後の 経過を追跡した 2年以内の再発性が高いことが明ら力となった。従って、本発明は、 患者力 採取された好酸球性炎症疾患の炎症部位での H— PGDSタンパク質の発 現量または PGD量が高いほど、好酸球性炎症疾患の再発性が高いと予測する、好
2
酸球性炎症疾患の再発性を予測する方法も提供する。更には、患者から採取された 鼻茸での H— PGDSタンパク質の発現量または PGD量が高いほど、鼻茸の再発性
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が高 ヽことを予測する、鼻茸の再発性を予測する方法も提供する。
本願発明により好酸球性炎症疾患と H-PDGSの発現が相関性を有する事が明ら かになつたので、 H-PDGSの発現が好酸球性炎症疾患の発症の原因である事が予 測し得る。したがって H— PGDS阻害物質または DP拮抗薬が好酸球性炎症疾患の 治療剤となりうる可能性がある。
H— PGDS阻害剤の例は、 4 ベンズヒドリルォキシ—1— {3— (1H—テトラゾー ル一 5—ィル） -プロピル }ピペリジン（HQL - 79) , 1 -ァミノ 4— {4— [4 クロ口 —6— (2—スルホ—フエ-ルァミノ）— [1, 3, 5]トリアジン— 2—ィルメチル]—3—ス ルホ一フエ-ルァミノ } 9, 10 ジォキソ一 9, 10 ジヒドロ一アントラセン一 2—ス ルホン酸（チバクローンブルー）、 1 アミノー 4一（4ースルファモイルァ-リノ） アン トラキノン 2 スルホン酸 (PGD - 042)もしくはその製薬上許容される塩またはそ れらの水和物、 2—（2，一べンゾチアゾリル） 5—スチリルー 3—（4，ーフタルヒドラ ジディル)テトラゾリゥム塩化物（PGD— 016)またはそれらの水和物を含む。
製薬上許容される塩とは、塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のァ ルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモ-ゥム 塩；トリメチルァミン塩、トリエチルァミン塩、ジシクロへキシルァミン塩、エタノールアミ ン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族ァミン 塩； N, N ジベンジルエチレンジァミン等のァラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン 塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のへテロ環芳香族ァミン塩;テトラメチルアンモ -ゥム 塩、テトラエチルァモ -ゥム塩、ベンジルトリメチルアンモ -ゥム塩、ベンジルトリェチ ルアンモ -ゥム塩、ベンジルトリブチルアンモ -ゥム塩、メチルトリオクチルアンモ-ゥ ム塩、テトラプチルアンモ-ゥム塩等の第 4級アンモ-ゥム塩;アルギニン塩、リジン塩 等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。酸性塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、 硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩;酢酸塩、プロピ オン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クェン酸塩 、ァスコルビン酸塩等の有機酸塩;メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンス ルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；ァスパラギン酸塩、グルタ ミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によつ て形成させることができる。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位してい てもよい。
[0023] プロスタグランジン D受容体の拮抗薬の例は、（±)— 3 べンジルー 5—（6 カル ボキシへキシル） 1— (2—シクロへキシル 2—ヒドロキシェチルァミノ）一ヒダントイ ン（BW A868C)、（ + )— (3R)— 3— (4 フルォロベンゼンスルホンアミド）— 1, 2 , 3, 4—テトラヒドロカルバゾール—9—プロピオン酸（ラマトロバン）、 (Z) - 7- [ (lR , 2R, 3S, 5S)—2— (5 ヒドロキシベンンゾ [b]チォフェンー3—ィルカルボ-ルァ ミノ） 10 ノルピナンー3 ィル]ヘプター 5 ェン酸、（Z)—7—[ (lR, 2R, 3S, 5S) - 2- (ベンゾ [b]チォフェン— 3—ィルカルボ-ルァミノ）— 10 ノルピナン— 3 —ィル]ヘプタ— 5—ェン酸 (ピナグラジン)もしくはその製薬上許容される塩またはそ れらの水和物である。
[0024] 好酸球性炎症疾患者に対するこれらの化合物の投与の前後において、本発明の 方法による診断方法を行い H-PGDSの発現量の測定、または PGDの生成量を測
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定すれば、該化合物が好酸球性炎症疾患の治療薬である力否かを確認できる。
[0025] 本発明は、 1)ヒト H— PGDS大量発現トランスジエニックマウスに抗原を感作してァ レルギ一疾患モデルを作製し、鼻腔、気道あるいは皮膚に抗原を暴露して好酸球性 アレルギー疾患を惹起し、
2)好酸球性疾患を誘導する前または後に H— PGDS阻害物質または DP拮抗薬候 補ィ匕合物をトランスジエニックマウスに投与し、
3)トランスジ ニックマウスにおける好酸球性炎症疾患の状態を、候補物質を与えな いトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、
ことを含む好酸球性炎症疾患の進行を防止し、または再発の予防に用いる化合物の スクリーニング方法にも関する。
[0026] WO 01Z24627号に開示されている方法に従って造血器型プロスタグランジン D 合成酵素 (H— PGDS)大量発現トランスジエニックマウスを作製できる。この文献は 本明細書の一部を構成する。ヒト細胞の mRNAから調製した cDNAライブラリーから 、ラット H— PGDS遺伝子の cDNA (Cell 90:1085-10975,1997; GenBank Accession No. D82071)をプローブしてヒト H— PGDSの cDNA(Eur. J. Biochem. 267:3315-33 22, 2000; GenBank Accession No.NM- 014485)をクロー-ングする。次にベクター pC AGGS (Gene 108: 193- 199 (1991))のクローユング部位（Sal I/Not I)にヒト H— PGDSの cDNAを挿入結合し、導入ベクターを構築する。図 18はこの導入ベクター における導入遺伝子の構成である。この導入遺伝子は CMVェンノヽンサ一とチキン βーァクチンプロモーターを H— PGDScDNAの上流に有しており、マウスの染色 体に導入されると、これらのェンハンサーおよびプロモーターの作用により H— PGD SmRNAを大量に発現される。この導入ベクターをマイクロインジェクション法により F VB系マウス（National Institute of Health Animal Genetic Resourceより入手）の受精 卵に注入する。遺伝子導入受精卵は定法に従って仮親の卵管に移植し、個体へと 発生させ出生させる。得られたマウスの尾部から DNAを抽出し、導入遺伝子の配列 に基づき合成されたプローブを用いて、サザンブロット法によりトランスジエニックマウ スを選別する。
[0027] 次に、ヒト H— PGDS大量発現トランスジヱニックマウスを用いて好酸球性アレルギ 一性疾患モデルを作製する。マウスに水酸ィ匕アルミニウムゲルに懸濁した卵白アル ブミンを抗原として腹腔内あるいは気道内に投与 (感作)する。感作から 2-3週間後に 、鼻腔、気道あるいは皮膚に抗原である卵白アルブミン溶液を暴露して好酸球性ァ レルギ一疾患を惹起する。抗原暴露後 24時間から 72時間後には抗原を暴露しな!、 群 (対照群)に比べて鼻腔、気道あるいは皮膚に顕著な好酸球の浸潤が観察される。
[0028] 以下に本発明を慢性副鼻腔炎に対して実施した例を説明する。これら実施例は説 明のためのものであって、本発明が実施例に限定されるものではないことは勿論であ る。
実施例
[0029] 実施例 1
[0030] 慢性副鼻腔炎の患者に対する治療として、鼻茸の切除手術を施行した。摘出した 鼻茸での好酸球の浸潤を調べる目的で、鼻茸組織を用いて組織化学的な検査を行 つた。まず、摘出した鼻茸を 10%中性ホルマリン固定したのち、パラフィン切片を作 成した。その切片を常法によりへマトキシリン—ェォジン (HE)染色を行った後、顕微 鏡下で観察して浸潤細胞あたりの好酸球数を測定し 20%以上を好酸球浸潤高度例 、 10%以下を非好酸球性鼻茸として分類した。
[0031] 表 1に患者背景を示す。実験に用いた鼻茸は表 1の高度例 7例と軽度例 7例である 。その中で 7例はダニに対して末梢血中特異的 IgE抗体が陽性であった。術前の末 梢血好酸球の割合では 2群間に有意差は無力つた。
[表 1]
Figure imgf000012_0001
[0032] MBP陽性活性化好酸球での H— PGDSの発現
鼻茸での H— PGDSの細胞分布を調べる目的で、 H— PGDSと好酸球の指標であ る主要塩基性蛋白質 (MBP)に対する抗体を用いた酵素免疫染色を行った。
[0033] まず、 10%中性ホルマリンで固定した鼻茸のパラフィン切片を 100%キシレンに浸 して脱パラフィンを行った。その後 0. 3%ペプシン溶液にて室温で 10分間反応させ て抗原性の賦活化を行った。その後 10%正常ャギ血清と 0. l%Triton Xを含むリ ン酸緩衝液に室温で 1時間反応させて蛋白質の非特異的結合部位を塞いだ。そし て、 H— PGDs饥体 ^polyclonal rabbit anti-human HPGOS antibody, し ayman Cham ical社製，ブロッキング液で 1： 10000に希釈）、及び、抗 MBP抗体（monoclonal an ti— human eosinophil major basic protein antibody, clone BMK, Biodesign Internation al社より購入。ブロッキング液で 1 : 1000に希釈）と 4°Cで一晩反応させ、洗浄後、 2次 抗体として、 Alexa488 標識抗ゥサギ IgG抗体と Alexa546 標識抗マウス IgG抗体 (Molecular Probes社製、希釈 1： 500)と室温で 1時間反応させた。充分に洗浄後、 共焦点蛍光顕微鏡（BIO- RAD社製 Radiance 2000)を用いて、常法（Nantel F, Fong し, Lamontague S, et ai. expression of prostaglandin D receptors OP and CRTH2 ι
2
n human nasal mucosa. Prostaglandins and Other Lipid Mediat. 2004; 73: 87-101.) により観察した。
[0034] その結果、従来、好酸球の指標とされてきた主要塩基性蛋白質 (MBP)と H— PG DSを比較すると、好酸球の浸潤が軽度な患者の組織 (L3)では、 MBP陽性細胞（ 好酸球）と H— PGDS陽性細胞はほとんど一致しないが、好酸球の浸潤が顕著な患 者 (H6)の組織では、 MBP陽性細胞のほとんどに H— PGDSが発現することが判明 した（図 1参照)。単位面積あたりでの陽性染色細胞を比較すると、 MBP陽性細胞の うち H— PGDSタンパク質を発現している細胞の割合は、好酸球浸潤高度例の方が 有意に高いことが判明した (表 1参照）
[0035] 実施例 2
EG2陽性活性化好酸球での H— PGDSの発現
鼻茸での H— PGDSの活性化好酸球への分布を調べる目的で、 H— PGDSと活 性化好酸球の指標である EG2抗原（Eosinophil Cationic Protein (ECP)活性化され た好酸球に認められる、傷害性の蛋白質)を特異的に認識する抗体 (Bentley AM, Ja cobson MR, Cumberworth V, Barkans JR, Moqoel R. et ai. Immunohistology of the n asal mucosa in seasonal allergic rhinitis: increases in activated eosinophils and epith elial mast cells. J Allergy Clin Immunol. 1992;89(4): 877- 83.)の発現を免疫組織ィ匕 学染色法によって比較した。
[0036] まず、 10%中性ホルマリンで固定した鼻茸のパラフィン切片を 100%キシレンに浸 して脱パラフィンを行った後、 0. 3%ペプシン溶液にて抗原性の賦活化を行った。そ の後 10%正常ャギ血清、 0. l%Triton X含有 PBSにてブロッキングを行い、一次 抗体を添加して 4°Cで 1晚反応させた。一次坑体として、 HPGDS抗体 (polyclonal ra bbit anti-human HPGDS antibody, Cayman Chamical社より購入。ブロッキング液で 1 ： 10000【こ希釈) ,める ヽ【ま、抗 EG2抗体 (monoclonal anti-human eosinophil cationi c protein antibody, clone EG2, Pharmacia社製）と反応させ、上述と同様に、 2次抗体 として Alexa488 標識抗ゥサギ IgG抗体と Alexa546 標識抗マウス IgG抗体 (Mole cular Probes 希釈 1： 500)を用いて免疫染色を行!ヽ、共焦点蛍光顕微鏡 (BIO-RA D社製 Radiance 2000)にて観察した。
[0037] その結果、好酸球の浸潤が軽度な患者の組織 (L3)では、 EG2陽性細胞 (好酸球） と H— PGDS陽性細胞はほとんど一致しな 、が、好酸球の浸潤が顕著な患者の組織 (H6)では、 EG2陽性細胞のほとんどに H— PGDSが発現することが判明した。（図 2参照)。さらに、単位面積あたりで EG2陽性細胞のうち H— PGDS陽性細胞を発現 して 、る割合を好酸球浸潤の程度にっ 、て比較すると、好酸球浸潤高度例の方が 有意に高いことが判明した (表 1参照)。
[0038] 実施例 3
'I馨件副臝腔炎唐、者から Β¾した臝 組織檢体のウェスタンブロッテイング (1)
鼻茸での H - PGDS蛋白質の発現を調べる目的で、鼻茸組織の抽出液を用 、て S DSゲル電気泳動を行 ヽ、泳動後の蛋白質の転写ナイロン膜を用 V、て H— PGDSに 対する抗体によるウェスタンブロッテイングを行った。
[0039] まず、摘出標本約 50mgを PBS 0. 5mlの中でホモジナイズし、 7000g (4°C、 20 分)遠心分離したのち、 10万 g (4°C、 1時間）で遠心分離して上清とマイクロゾーム分 画を得た。上清を 10Z20%SDS— PAGEに、マイクロソームを 4Z20%SDS— PA GE (V、ずれも第一化学）で泳動し、 PVDFメンブレン（Millipore)に 100mA にて 1 時間転写した。非特異的な結合をスキムミルクでブロッキングした後、 H— PGDS抗 体 (polyclonal rabbit anti— numan HPuDb antibody, Cayman Cnamical社より！ ¾人；1： 5000希釈で使用)、シクロォキシゲナーゼ（COX)—1抗体 (polyclonal rabbit anti-hu man COX- 1 antibody, Cayman Chamical社より購入； 1： 1000希釈で使用）、 COX — 2仇体 (monoclonal mouse anti-humanし OX— 2 antibody, し ayman Chamical社より 購入； lmgZmlに希釈して使用）を 5%スキムミルクと 0, l%Tween 20 含有 PBS で希釈して 4°Cでー晚反応させた。次に 2次抗体として、 HRP標識 anti— mouse Ig G抗体または、 anti— rabbit IgG抗体（Jackson Laboratories社より購入。トリス緩衝 液で 1： 1000に希釈して使用）と室温で 1時間反応させた。その後 ECL detection reagent (Amasham International 社製）と室温で 2分間反応させた後 Kodak X OMAT AR film (Eastman Kodak社製） 15分間焼付けて現像した。
[0040] その結果、左側 7例は病変部位に好酸球の浸潤が顕著であった群 (Hl〜7)で、右 側 7例は、好酸球の浸潤が軽度であった群 (Ll〜7)である。左から症例 Hl〜7と L1 〜7を示す。アレルギー性鼻炎の有無にかかわらず左側（Hl〜7)は全例で H— PG DSの発現が顕著であった。 H— PGDSの発現と病態の重症度に強 、相関が認めら れた。右側 (Ll〜7)は 7例中 3例に強い発現が認められる。ところが、シクロォキシゲ ナーゼ (COX)— 1あるいは COX— 2の発現と病態の重症度には相関が認められな かった。また、好酸球浸潤が軽度な群中で H— PGDS発現が高力つた 3例はいずれ も末梢血好酸球の割合が高ぐ好酸球と H— PGDSの関わりが推察される。（図 3参 照)。
[0041] 実施例 4
鼻茸切除時点での H— PGDSタンパク質の発現と再発率の関係を調べる目的で、 鼻茸切除後の経過を追跡し、 2年以内に副鼻腔粘膜の腫脹が見られた症例を再発 群とし、 2年以内に粘膜の腫脹が見られな力つた症例を経過良好群として、 H-PG DSの発現を調べた。患者背景を表 2に示す。
[表 2] 症例番号 年齢/性別 末梢血中好酸球？ ί アレルギー有無 局所好酸球漫潤
R1 26/F 22 hign
R2 61 /M 4 + high
R3 76/ 13.7 - high
R4 68/M 5.2 - low
R5 55/F 26 + high
R6 70/M 14 + high
R7 64/M 0J Eow
R8 50/M 10.8 - low
R9 38/F 4.9 一 Sow
R10 34/ 4.2 + iow
R11 23/F 0.6 - low
R12 68/F 0.9 - low
R13 24/F 4.9 + low
R14 65/F 1.4 - low
[0042] 惓件副臝腔炎唐、者から B¾した臝 組織檢体のウェスタンブロッテイング (2)
実施例 3と同様の方法で、 H— PGDS抗体、シクロォキシゲナーゼ（COX)—1、 C OX— 2抗体にてウェスタンブロッテイング（Kanaoka Y, Ago H, Inagaki E, et al. Cloni ng and crystal structure of hematopoietic prostaglandin D synthase. Cell 1997; 90:1 0851095.)を行った。
[0043] その結果、再発群では (左力 症例 Rl〜4)鼻茸における H— PGDSの発現量が 高かった。一方、経過が良好であった症例では（良好群左から症例 R8〜11) H— P GDSの発現が低力つた。従って、 H— PGDS発現量で、鼻茸の再発性を予測するこ とができる（図 4参照)。
[0044] 実施例 5
副蠱^ ^唐、 から探 Β¾した 織檢 ：の ^^IPCR
H-PGDS mRNAの発現と再発率との関係を調べる目的で、定量的 RT—PCR (Kanaoka Y, Ago H, Inaga i E, et al. Cloning and crystal structure of hematopoietic prostaglandin D synthase. Cell 1997; 90: 10851095.)を行った。
[0045] 手術で摘出した後、速やかに 80°C凍結保存した鼻茸から、 RN easy Mini K it および Omniscript RT Kit (共に QIAGEN)を用い total RNAの抽出およ び cDNAへの逆転写を行った。定量的 PCRは Light Cycler— FastStart DNA Master SYBR Greenl (Roche)を用いた。 H— PGDSのプライマーを Fl : 5， G AATAGAACAAGCTGACTGGC (配列番号 1)、 Rl： 5， AGCCAAATGTGT GTTTTTGG (配列番号 2)とデザインし、 95°C、 10分の熱変性した後、 95°C 15秒 ; 57°C 5秒； 72°C 10秒を 40サイクルの条件で施行した。内部標準として GAPDH 遺伝子について測定した。 GAPDHのプライマーは F1： 5 ' TGAACGGGAAGCT CACTGG (配列番号 3)、 R1： 5 ' TCCACCACCCTGTTGCTGTA (配列番号 4) とデザインし、 95°C、 10分の熱変性した後、 95°C 15秒； 63°C 20秒； 72°C 10秒 を 40サイクルの条件で行った。 cDNAの定量は Light Cycler TM System (Ro che)を用いた蛍光測定法によって行った。
[0046] その結果、 H— PGDSタンパク質の結果と同様に、 2年以内に鼻茸が再発した症例 では鼻茸における H— PGDSの発現量が高力つた。一方、経過が良好であった症例 では H— PGDSの発現が低かった（図 5参照）。
以上の結果は、患者力も採取した組織の H— PGDSタンパク質や mRNA量をゥェ スタンプロッテイング法や PCR法で定量することによって、鼻茸の再発性を予測する ことができることを示して！/、る。
[0047] 実施例 6
好酸球での H— PGDS発現と再発率との関係を調べる目的で、実施例 2と同様の 方法で、好酸球 EG2抗体と H— PGDSとの蛍光抗体染色を行った。
その結果、経過良好群 (症例 R12)では、 H— PGDSと EG2陽性細胞（図 6、矢印） はほとんど一致しないが、再発群 (症例 R6)では、 EG2陽性細胞のほとんどが H— P GDS陽性細胞と一致する。以上の結果は、 H— PGDSと EG2の両方が陽性の活性 化好酸球の多 、鼻茸は再発率が高 、ことを示して 、る。
産業上の利用可能性
[0048] 以上詳述したように、本発明は鼻茸等の好酸球性炎症疾患において、病変部位に 集積した好酸球に誘導される H— PGDSを検出したり、鼻腔洗浄液や気管支肺胞液 中の PGDを測定したりすることにより、病態の重症度を診断したり、これら疾患の再
2
発性を予測する方法を提供するものである。

Claims

請求の範囲
[1] 炎症部位での造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H - PGDS)タンパク質の 発現を測定する力、またはプロスタグランジン D (PGD )量を測定することを含む、
2 2
好酸球性炎症疾患の重症度を診断する方法。
[2] 患者力 採取された好酸球性炎症疾患の炎症部位での造血器型プロスタグランジ ン D合成酵素（H— PGDS)タンパク質の発現量またはプロスタグランジン D (PGD
2 2
)量が高いほど、好酸球性炎症疾患の重症度が重度であると診断する、請求項 1に 記載の診断方法。
[3] 好酸球性炎症疾患が、慢性副鼻腔炎、鼻アレルギー性鼻炎、気管支喘息 (特にァ レルギ一性気管支喘息）、またはアレルギー性皮膚炎である請求項 1または 2に記載 の診断方法。
[4] 慢性副鼻腔炎が、鼻茸を伴うことを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の診 断方法。
[5] 炎症部位での造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H - PGDS)タンパク質の 発現を測定する力、またはプロスタグランジン D (PGD )量を測定することを含む、
2 2
好酸球性炎症疾患の再発性を予測する方法。
[6] 患者力 採取された好酸球性炎症疾患の炎症部位での造血器型プロスタグランジ ン D合成酵素（H— PGDS)タンパク質の発現量またはプロスタグランジン D (PGD
2 2
)量が高いほど、好酸球性炎症疾患の再発性が高いと予測する、請求項 5に記載の 再発性を予測する方法。
[7] 好酸球性炎症疾患が、慢性副鼻腔炎、鼻アレルギー性鼻炎、気管支喘息 (特にァ レルギ一性気管支喘息）、またはアレルギー性皮膚炎である請求項 5または 6に記載 の再発性を予測する方法。
[8] 慢性副鼻腔炎が、鼻茸を伴うことを特徴とする請求項 5〜7のいずれかに記載の再発 性を予測する方法。
[9] 患者力も採取された鼻茸での造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H - PGDS )タンパク質の発現を測定する力、またはプロスタグランジン D (PGD )量を測定する
2 2
ことを含む、鼻茸の再発性を予測する方法。
[10] 患者力も採取された鼻茸での造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H— PGDS )タンパク質の発現量、またはプロスタグランジン D (PGD )量が高いほど、鼻茸の再
2 2
発性が高いと予測する、請求項 9に記載の再発性を予測する方法。
[11] 1)ヒト造血器型プロスタグランジン D合成酵素 (H— PGDS)大量発現トランスジェ- ックマウスに抗原を感作してアレルギー疾患モデルを作製し、鼻腔、気道あるいは皮 膚に抗原を暴露して好酸球性アレルギー疾患を惹起し、
2)好酸球性疾患を誘導する前または後に造血器型プロスタグランジン D合成酵素（ H— PGDS)阻害物質またはプロスタグランジン受容体 (DP)拮抗薬である候補ィ匕合 物をトランスジエニックマウスに投与し、
3)トランスジ ニックマウスにおける好酸球性炎症疾患の状態を、候補物質を与えな いトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、
ことを含む好酸球性炎症疾患の進行を防止し、または再発の予防に用いる化合物の スクリーニング方法。
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