ES2339125T3 - Sp1 fosforilado como marcador en el diagnostico de esteatohepatitis no alcoholica (ehna) y diana en el cribado de farmacos para ehna. - Google Patents

Sp1 fosforilado como marcador en el diagnostico de esteatohepatitis no alcoholica (ehna) y diana en el cribado de farmacos para ehna. Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para detectar esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha afección, que comprende: a) cuantificar el nivel de fosforilación de la proteína Sp1 en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto; y b) comparar dicho nivel con el de una muestra control; en donde un aumento en dicho nivel relativo al del control es indicativo de EHNA.

Description

Sp1 fosforilado como marcador en el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y diana en el cribado de fármacos para EHNA.
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Campo de la invención
La invención se refiere, en general, al diagnóstico in vitro de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA); más específicamente al diagnóstico temprano de EHNA o para confirmar la enfermedad basado en una sobreexpresión del factor de transcripción Sp1 fosforilado en células hepáticas. La invención también se refiere al seguimiento del efecto de la terapia administrada a un individuo con EHNA. Además, la invención se refiere a cribar, buscar, identificar, desarrollar y evaluar la eficacia de compuestos para la prevención y/o tratamiento de EHNA en un intento de desarrollar nuevos productos médicos así como agentes que inhiben la expresión y/o actividad de Sp1 en hígado y/o los efectos de su expresión.
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Antecedentes de la invención
La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una enfermedad progresiva del hígado de etiología desconocida caracterizada histológicamente por la acumulación de ácidos grasos, daño a hepatocitos e inflamación parecida a la hepatitis alcohólica. EHNA es una fase crítica en el proceso que abarca desde la esteatosis hepática a cirrosis e insuficiencia hepática. La obesidad y la diabetes de tipo 2 están asociadas con EHNA. Puesto que la prevalencia de estas enfermedades está en aumento, también se espera que aumente la prevalencia de EHNA y por tanto, esta enfermedad se ha convertido en un asunto público emergente en los Estados Unidos [Reid AE. Nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology 2001;121:710-723] así como en otros países [Farell GC. Non-alcoholic steatohepatitis: what is it, and why is it important in the Asia-Pacific region? J Gastroenterol Hepatol 2003;18:124-138].
Se piensa que EHNA se origina de la interacción de muchos genes diferentes y factores del estilo de vida. Se han implicado el deterioro mitocondrial, agresión oxidativa y desregulación metabólica en la patogénesis de la esteatohepatitis.
Como es cierto para otras enfermedades complejas, los factores genéticos que contribuyen al desarrollo de EHNA se pueden identificar más fácilmente combinando estudios en pacientes con EHNA y en modelos animales de la enfermedad. Uno de estos modelos es el ratón deficiente en MAT1A (MAT1A-KO). Estos ratones desarrollan espontáneamente EHNA y carcinoma hepatocelular aproximadamente a los 8 y 15 meses de edad, respectivamente [Lu SC et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 5560-5565 (2001); Martínez-Chantar ML et al. FASEB J 2002]. El gen MAT1A codifica la metionina adenosiltransferasa I y III, las principales enzimas responsables de la síntesis de S-adenosilmetionina (SAMe) en el hígado. Estudios anteriores concluyeron que los pacientes con cirrosis hepática y hepatitis alcohólica son deficientes en la síntesis de SAMe y que el tratamiento con SAMe mejora la supervivencia en pacientes con cirrosis hepática alcohólica.
El diagnóstico temprano de EHNA se ha refrenado por la falta de marcadores tempranos fiables del desarrollo de EHNA. La identificación de genes y proteínas diferencialmente expresados en EHNA con potencial como marcadores biológicos o dianas terapéuticas podría llevar al desarrollo de nuevas herramientas para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de esta enfermedad.
Se ha divulgado un método de diagnóstico de EHNA usando marcadores moleculares basado en la determinación proteómica de un conjunto de proteínas detectadas en muestras de tejido hepático (WO2004/055520).
El solicitante también ha descrito otro método para el diagnóstico de EHNA basado en la identificación de un agrupamiento de 85 marcadores génicos tempranos discriminantes específicos de EHNA en muestras de tejido hepático (de esta manera, constituyen lo que se ha denominado la "firma o huella genómica de EHNA") (EP 04103540.3). La técnica usada en ese caso combina muestras hepáticas de ratones MAT1A-KO y de pacientes con EHNA de fase temprana con métodos bioinformáticos y estadísticos para analizar los datos generados de la determinación del perfil de expresión en todo el genoma de las muestras hepáticas mencionadas, permitiendo así la identificación de un agrupamiento de marcadores génicos tempranos discriminantes de esteatohepatitis en ratones y seres humanos. Entre los genes que comprenden la firma genómica de EHNA hay enzimas (la mayoría son hidrolasas, transferasas y oxidorreductasas), genes de unión a ligandos (unión a metales pesados, unión a nucleótidos, unión a proteínas, receptores y factores de transcripción); transportadores (de hidratos de carbono, transportadores de electrones y transportadores de proteínas); reguladores de apoptosis; chaperonas; factores de coagulación sanguínea y varios genes con función
desconocida.
Al buscar la presencia de secuencias consenso para factores de transcripción de vertebrados entre los promotores de los genes enumerados en la tabla 1 (EP 04103540.3), los inventores han encontrado ahora, de forma sorprendente, que sólo el factor de transcripción Sp1 estaba presente significativamente en los promotores de un gran número de los genes enumerados en dicha tabla 1, más de los que se esperaría por casualidad, lo que sugiere que la activación de Sp1 puede estar implicada en los mecanismos subyacentes que producen EHNA.
Sp1 fue uno de los primeros factores de transcripción eucariotas en ser identificado y clonado como un factor que se unía al promotor temprano de SV40 (Dynan y Tjian, Cell 35:79-87, 1983). Es el miembro fundador de una familia de proteínas con dominios de dedo de zinc muy homólogos en la región C-terminal que se unen a cajas GC o GT, mientras que los dominios ricos en glutamina en el N-terminal son esenciales para la activación transcripcional. Sp1 activa la transcripción mediante asociación con uno de los coactivadores asociados con la proteína de unión a TATA (TBP) en el complejo TFIID. Otros papeles sugeridos para Sp1 en procesos nucleares incluyen la remodelación de estructuras de cromatina y el mantenimiento de islas CpG sin metilar. Por tanto, Sp1 es fundamental para el establecimiento de competencia transcripcional, además de su papel como factor de transcripción. En una gran mayoría de promotores que contienen sitios de unión de Sp1, Sp1 proporciona un nivel basal de transcripción. Desempeña un papel importante en la expresión de numerosos elementos de la maquinaria del ciclo celular, tales como ciclinas, proteína similares a Rb y EF2. La desorganización dirigida del gen Sp1 de ratón ha mostrado que Sp1 es crítico para la embriogénesis normal. Los embriones Sp1 (-/-) están gravemente retrasados en su desarrollo y muestran una marcada heterogeneidad en su fenotipo. De forma interesante, la inactivación del gen Sp1 es compatible con un cierto grado de crecimiento y diferenciación celular, y la expresión de varios genes diana putativos, incluyendo la de ciertos genes relacionados con el ciclo celular, no está alterada en embriones Sp1 (-/-). Además, las islas CpG permanecieron sin metilar y se formó cromatina activa en los loci de la globina. Esto puede suceder posiblemente porque otros miembros de la familia Sp1 compensan parcialmente para la ausencia de Sp1, mejorando de esta manera la deficiencia en Sp1. Sp1 está implicado en la expresión basal de genes de la matriz extracelular (MEC) y es importante en procesos fibróticos. De esta manera, el bloqueo de Sp1 inhibe la expresión génica de la MEC lo que se puede usar en el tratamiento de trastornos fibróticos (WO 02/066701).
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Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra el resultado de un análisis de unión in vivo de Sp1 a promotores de genes seleccionados. La inmunoprecipitación de cromatina entrecruzada con formaldehído se llevó a cabo en muestras de tejido hepático de ratones control (tipo salvaje, WT) y en muestras de tejido hepático de ratones MAT1A-KO usando un anticuerpo anti-Sp1 (ejemplo 1). Se hicieron alícuotas de los inmunoprecipitados y posteriormente se analizaron mediante PCR con cebadores específicos para cada promotor de gen. En cada caso, se incluyó una muestra de cromatina total (Carga) en las reacciones de PCR. Sin Ac: sin anticuerpo. Sp1: fracción de inmunoprecipitación. Se incluyó el promotor de \alpha-actina como control negativo.
La figura 2 muestra la fosforilación de Sp1 en tejido hepático de ratón. Se inmunoprecipitó (Ip) extracto crudo total de hígado de ratones WT y MAT1A-KO con un anticuerpo anti-Sp1 y se examinó la presencia de fosfoserina con un anticuerpo anti-fosfoserina (panel superior) o se examinó el contenido total de Sp1 con un anticuerpo anti-Sp1 (panel inferior). Los resultados muestran que el estado de fosforilación de Sp1 aumenta en muestras de tejido hepático de ratones MAT1A-KO frente al estado de fosforilación de Sp1 en muestras de tejido hepático de ratones WT. El panel inferior muestra que la cantidad de contenido total de Sp1 examinado con un anticuerpo anti-Sp1 es la misma en ratones MAT1A-KO y WT en el extracto crudo total.
La figura 3 muestra la fosforilación de Sp1 en tejidos hepáticos humanos. Se inmunoprecipitó (Ip) extracto crudo total de tejidos hepáticos humanos de sujetos control (CONTROL) y sujetos diagnosticados con EHNA (EHNA) con un anticuerpo anti-fosfoserina y se examinó la presencia de Sp1 con un anticuerpo anti-Sp1 (panel superior) o se examinó el contenido total de Sp1 usando un anticuerpo anti-Sp1 (panel inferior) (figura 3A). Los cambios densitométricos se muestran en la figura 3B, expresados como veces de inducción de la fosforilación de Sp1 sobre el valor de la muestra control. Las diferencias entre EHNA y control fueron estadísticamente significativas, p<0,05.
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Descripción detallada de la invención Definiciones
Para facilitar la comprensión de la presente solicitud de patente a continuación se enumeran el significado de algunos términos y expresiones dentro del contexto de la invención.
El término "sujeto" se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no está restringido a, animales domésticos y de granja, primates y seres humanos. El sujeto es preferiblemente un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza.
El término "EHNA" se refiere a esteatohepatitis no alcohólica.
El término "gen" se refiere a una región de una cadena molecular de desoxirribonucleótidos que codifica una proteína y puede representar una parte de una secuencia codificante o una secuencia codificante completa.
El término "ADN" se refiere a ácido desoxirribonucleico. Una secuencia de ADN es una secuencia de desoxirribonucleótidos.
El término "ARN" se refiere a ácido ribonucleico. Una secuencia de ARN es una secuencia de ribonucleótidos.
El término "ARNm" se refiere a ácido ribonucleico mensajero, que es la fracción del ARN total que se traduce a proteína.
El término "ADNc" se refiere a una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARNm.
El término "secuencia de nucleótidos" se refiere a una secuencia de ribonucleótidos (ARN) o a una secuencia de desoxirribonucleótidos (ADN).
El término "proteína" se refiere a al menos una cadena molecular de aminoácidos unidos a través de enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones postraduccionales de proteínas, por ejemplo, glicosilación, fosforilación o acetilación.
El término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que muestra una actividad de unión específica para una molécula diana denominada un "antígeno". El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales y policlonales, bien intactos o fragmentos derivados de ellos; también incluye anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos de origen no humano. "Anticuerpos monoclonales" es una población homogénea de anticuerpos muy específica que se puede unir a un único sitio o "determinante" antigénico en la molécula diana. "Anticuerpos policlonales" es una población heterogénea de anticuerpos que se puede unir a múltiples sitios o "determinantes" antigénicos de la molécula diana.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico de una proteína reconocida por un anticuerpo específico. Un epítopo puede consistir en un tramo contiguo de aminoácidos (epítopo lineal), en aminoácidos no contiguos que se ponen en proximidad entre sí en virtud del plegamiento tridimensional de la cadena polipeptídica (epítopos discontinuos), en modificaciones postraduccionales de una proteína o en una combinación de los mismos.
El término "diana terapéutica" se refiere a secuencias de nucleótidos o péptidos contra las que se puede diseñar y aplicar un fármaco o compuesto terapéutico.
El término "antagonista" se refiere a cualquier molécula que inhibe la actividad biológica de la molécula antagonizada. Los ejemplos de moléculas antagonistas incluyen proteínas, péptidos, variaciones de secuencias peptídicas naturales, moléculas orgánicas pequeñas (normalmente moléculas con un peso molecular por debajo de 500 Dalton), etc.
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Sp1 como marcador de EHNA y/o diana para cribado de fármacos
La invención se basa en el descubrimiento de que la regulación de las proteínas responsables de la fosforilación de Sp1 y la concentración (nivel) de proteína Sp1 fosforilada aumentan en muestras de tejido hepático de pacientes de EHNA pero no en muestras de tejido hepático de sujetos sin EHNA.
Como se ha mencionado previamente, los inventores, al buscar la presencia de secuencias consenso para todos los factores de transcripción de vertebrados enumeradas en la base de datos Gene Regulation (http://www.gene-regulation.com/) entre los promotores de los genes enumerados en la tabla 1 (EP 04103540.3), encontraron que solo el factor de transcripción Sp1 estaba presente significativamente en el promotor de 34 de los genes enumerados en dicha tabla 1, lo que sugiere que la fosforilación de Sp1 puede estar implicada en los mecanismos subyacentes que producen EHNA. Sp1 está entre los factores de transcripción que se activan por oxidorreducción. Puesto que 10 de los genes asociados a EHNA identificados aquí codifican proteínas localizadas en la mitocondria y los ratones MAT1A-KO tienen disfunción mitocondrial y agresión oxidativa, parece que la activación de Sp1 puede estar implicada en los mecanismos subyacentes que producen EHNA.
La tabla I incluye los 85 marcadores génicos discriminantes específicos de EHNA en muestras de tejido hepático humano que constituyen la firma o huella genómica de EHNA en seres humanos, divulgados en la tabla 1 de EP 04103540.3. Dicha tabla I también incluye una indicación de los genes cuyos promotores contienen un sitio de unión de Sp1.
TABLA I
1
2
3
4
Puesto que se ha mostrado que genes que se coexpresan en múltiples conjuntos de datos de micromatrices tienen relación funcional (Lee et al., Co-expression analysis of human genes across many microarray data sets. Genome Res 14:1085-1094 (2004)), un análisis adicional de los genes identificados en la firma genómica de EHNA daría mayor comprensión en los mecanismos subyacentes de EHNA. Para identificar secuencias diana de Sp1 in vivo, se llevó a cabo un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (IPC) (ejemplo 1). Brevemente, se inmunoprecipitó cromatina hepática de ratones salvajes (WT) y MAT1A-KO con un anticuerpo anti-Sp1 y el ADN genómico se usó posteriormente para la amplificación por PCR con cebadores específicos para esos genes identificados cuyos promotores tienen un sitio potencial de unión a Sp1. Los resultados (figura 1) muestran que Sp1 se une a los promotores de dichos 11 genes, estando aumentada la unión de Sp1 a los promotores de dichos 11 genes en hígado de ratones MAT1A-KO comparado con hígado de ratones WT. La expresión de 9 de dichos 11 genes (ID4, PIGPC1, MTHFR, PTGES, SSB1, HNRPA2B1, HARC y GSTM) aumentó en hígado de ratones MAT1A-KO comparado con la expresión de los mismos en hígado de ratones WT. Sin embargo, los niveles de expresión de 2 genes (RGN y GGa2) eran similares en hígados de ratones WT y MAT1A-KO. Además, la fosforilación de Sp1 parece que media la activación de dichos genes (ejemplo 2) porque la proteína Sp1 se encuentra en un estado de mayor fosforilación en muestras de tejido hepático de ratones MAT1A-KO que en muestras de tejido hepático de ratones WT (figura 2).
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Métodos de diagnóstico y pronóstico
Como se ha mencionado previamente, la presente invención se basa en el descubrimiento de que el estado de fosforilación de la proteína Sp1 aumenta en muestras de tejido hepático de pacientes de EHNA pero no en muestras de tejido hepático de sujetos sin EHNA. De hecho, los sujetos diagnosticados con EHNA presentan, en muestras de tejido hepático, niveles altos de Sp1 fosforilado relativos a los niveles en muestras de hígado de sujetos sin EHNA (es decir, sujetos sin antecedentes clínicos de EHNA o sujetos control).
Según esto, la evaluación y comparación de los niveles de la proteína Sp1 fosforilada en muestras de tejido hepático puede ser diagnóstico de EHNA. Por ejemplo, un nivel elevado de proteína Sp1 fosforilada en una muestra de tejido hepático es indicativo de EHNA. Por lo tanto, el descubrimiento anteriormente mencionado se puede usar en uno o más de los siguientes métodos: ensayos de diagnóstico, seguimiento de ensayos clínicos y ensayos de cribado como se describe aquí adicionalmente.
Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para detectar EHNA en un sujeto, o para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha afección, de aquí en adelante denominado el método de la invención, que comprende:
a)
cuantificar el nivel de proteína Sp1 fosforilada en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, y
b)
comparar dicho nivel con el de una muestra control;
en donde un aumento en dicho nivel relativo al del control es indicativo de EHNA, es decir, es una indicación de que dicho sujeto padece EHNA. El nivel de proteína Sp1 fosforilada en una muestra de tejido hepático comparado con el de una muestra de tejido hepático control puede ser útil para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha afección.
Para llevar a cabo el método de la invención, se obtiene una muestra del sujeto en estudio. En una forma de realización particular, la muestra es una muestra de tejido hepático, que se puede obtener por métodos convencionales, por ejemplo, mediante biopsia, usando métodos bien conocidos para los expertos en las técnicas médicas relacionadas. Los métodos para obtener la muestra de la biopsia incluyen partición en trozos grandes de una masa o microdisección u otros métodos de separación celular conocidos en la técnica. Las muestras se pueden obtener de sujetos previamente diagnosticados o no con EHNA o de sujetos que están recibiendo o han recibido previamente tratamiento anti-EHNA.
Debido a la variabilidad de los tipos celulares en material de biopsia de tejidos enfermos y a la variabilidad en la sensibilidad de los métodos de diagnóstico usado, el tamaño de la muestra requerido para el análisis puede variar desde 1, 10, 50, 100, 200, 300, 500, 1.000, 5.000, 10.000 a 50.000 células o más. Se puede determinar el tamaño apropiado de muestra basado en la composición celular y el estado de la biopsia. Los pasos preparativos estándar para dicha determinación los conoce bien el experto en la materia.
En una forma de realización particular, con el fin de cuantificar la fosforilación de la proteína Sp1, el método de la invención comprende (i) poner en contacto el extracto de proteínas extraído de la muestra con una composición que comprende uno o más anticuerpos específicos para uno o más residuos de fosfoserina en la proteína Sp1 fosforilada, y (ii) cuantificar los complejos Sp1-anticuerpos formados. Hay una amplia gama de ensayos inmunológicos (inmunoensayos) disponibles para detectar y cuantificar la formación de complejos antígeno-anticuerpo específicos; se han descrito previamente un número de ensayos de unión de proteínas, competitivos y no competitivos, y varios de estos están comercialmente disponibles. Por lo tanto, la cantidad de proteína Sp1 fosforilada se puede cuantificar por medio de anticuerpos específicos a Sp1 fosforilado, es decir, anticuerpos que reconocen (o se unen a) Sp1 fosforilado, tales como anticuerpos fosfo-específicos, anticuerpos que reconocen cualquier epítopo en la proteína Sp1 fosforilada, por ejemplo, anticuerpos que reconocen la unión entre el sitio de fosforilación (por ejemplo, un residuo de serina, treonina o tirosina) y un grupo que contiene fósforo, o cualquier epítopo, por ejemplo, un epítopo conformacional, generado en la proteína Sp1 fosforilada como resultado de la fosforilación de Sp1. Dichos anticuerpos pueden estar en forma de anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos intactos o recombinantes de anticuerpos, combicuerpos y fragmentos de anticuerpo Fab o scFv. Estos anticuerpos pueden ser humanos, humanizados o de origen no humano. Los anticuerpos usados en estos ensayos pueden estar marcados o no marcados; los anticuerpos no marcados se pueden usar en ensayos de aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden usar en una amplia gama de ensayos. Los marcadores de anticuerpos incluyen radionucleótidos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos o cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, partículas, colorantes y derivados. Existe un gran número de ensayos que conocen bien los expertos en la materia que se pueden aplicar a la presente invención, que usan anticuerpos no marcados como reactivos primarios y anticuerpos marcados como reactivos secundarios. Estas técnicas incluyen pero no están limitadas a inmunotransferencia o transferencia Western, ELISA (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (enzimoinmunoanálisis competitivo), DAS-ELISA (ELISA sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en biochips o micromatrices de proteína que usan anticuerpos específicos y ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como tiras reactivas. Otras técnicas para detectar y cuantificar la fosforilación de la proteína Sp1 son la cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando y ensayos de unión a lectina.
El paso final del método de la invención implica comparar el nivel de proteína Sp1 fosforilada cuantificada en una muestra de tejido hepático del sujeto en estudio con el nivel de proteína Sp1 fosforilada en una muestra control de tejido hepático (es decir, nivel basal o valor de referencia). Los niveles de proteína Sp1 fosforilada en muestras controles de tejido hepático se pueden determinar midiendo los niveles de proteína Sp1 fosforilada en una muestra de tejido hepático de sujetos sin EHNA (es decir, sujetos control con respecto a EHNA). Un aumento en el nivel de fosforilación de la proteína Sp1 en una muestra de tejido hepático del sujeto en estudio respecto al nivel de proteína Sp1 en una muestra de tejido hepático control es indicativo de EHNA, es decir, es una indicación de que dicho sujeto padece EHNA. Además, el nivel de proteína Sp1 fosforilada en una muestra de tejido hepático comparado con el de una muestra de tejido hepático control también puede ser útil para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha afección.
El método de la invención, basado en la medida del nivel (concentración) de proteína Sp1 fosforilada en muestras de tejido hepático es muy sensible y específico.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una proteína Sp1 fosforilada para detectar o diagnosticar in vitro EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha EHNA.
Ensayos de cribado de fármacos
La invención también proporciona un método (también denominado aquí como un "ensayo de cribado") para identificar agentes candidatos (por ejemplo, moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, péptidos, anticuerpos, peptidomiméticos u otros fármacos) que tienen un efecto modulador sobre, por ejemplo, la expresión de Sp1 o sobre la actividad biológica de Sp1.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para identificar y/o evaluar la eficacia de un agente potencialmente terapéutico contra EHNA, que comprende:
a)
poner en contacto un cultivo de células de hígado con un compuesto de prueba en las condiciones apropiadas y durante el periodo de tiempo requerido para que interaccionen;
b)
determinar el nivel de proteína Sp1 fosforilada;
c)
comparar dicho nivel obtenido en el paso b) con el de cultivo control de células de hígado que carece de dicho compuesto de prueba; y
d)
seleccionar un compuesto de prueba que produzca que dicho nivel del paso b) disminuya.
Los compuestos seleccionados se pueden usar, por ejemplo, para ensayos adicionales como un agente potencial para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de EHNA.
La determinación (detección y cuantificación) de los niveles de proteína Sp1 fosforilada se puede realizar de una manera similar a la descrita en relación con el método de la invención.
Puesto que Sp1 fosforilado activa la expresión de algunos genes, y en muestras de tejido hepático de sujetos que padecen EHNA se encuentran niveles aumentados de la proteína Sp1 fosforilada, un agente que disminuya los niveles de proteína Sp1 fosforilada o que invierta los efectos de los niveles aumentados de la misma, por ejemplo, inhibiendo o reduciendo la fosforilación de la proteína Sp1, se convierte en un candidato para terapia de EHNA (profilaxis y/o tratamiento). Los agentes que usando los ensayos de cribado proporcionados por la presente invención se encuentra que son capaces de disminuir la actividad Sp1 en al menos el 5%, más preferiblemente en al menos el 10%, aún más preferiblemente en al menos el 30%, aún más preferiblemente en al menos el 50%, aún más preferiblemente en al menos el 70%, incluso más preferiblemente en al menos el 90%, se pueden seleccionar para pruebas adicionales como un agente profiláctico y/o terapéutico anti-EHNA. Sp1 y Sp1 fosforilado se pueden determinar mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante inmunotransferencia.
Los agentes que se encuentra que son capaces de disminuir la actividad de Sp1 se pueden usar, por ejemplo, para reducir los síntomas de EHNA solos o en combinación con otros agentes o tratamientos apropiados.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una proteína Sp1 fosforilada en un método de cribado para identificar, desarrollar y/o evaluar la eficacia de compuestos potencialmente terapéuticos contra EHNA. Recientemente, los métodos de cribado basados en la unión competitiva o no competitiva de la molécula con potencial terapéutico a la diana terapéutica han atraído mucha atención.
El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la invención.
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Ejemplo 1 Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina 1.1 Preparación de cromatina entrecruzada
Se cortaron muestras de tejido hepático tanto de ratones control (WT) como MAT1A-KO [Lu SC et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5560-5565 (2001)], a los 15 días, 1, 3, 5 y 8 meses y se sumergieron en 10 ml de PBS 1x pH 7,4 y formaldehído al 1% y se agitaron suavemente durante 12 minutos a temperatura ambiente, para entrecruzar los factores de transcripción al ADN (cromatina entrecruzada). Las reacciones se pararon mediante la adición de glicina a una concentración final de 0,125 M. Las muestras de tejido hepático se lavaron dos veces con 10 ml de PBS 1x pH 7,4 frío y se sumergieron en 8 ml de PBS 1x pH 7,4 suplementado con 2 \mul/ml de un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma). Las muestras de tejido hepático se disgregaron con un homogenizador Dounce, se pasaron a través de filtro de 200 \mum de poro y se centrifugaron a 1.500 g durante 5 minutos. Los precipitados celulares se resuspendieron en 3 ml de tampón de lisis celular (HEPES 5 mM pH 8,0, KCl 85 mM, NP40 al 0,5%) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma), se incubaron en hielo durante 15 minutos y se centrifugaron a 3.500 g durante 5 minutos para precipitar los núcleos. Los precipitados nucleares se resuspendieron en tampón de lisis nuclear (Tris HCl 50 mM pH 8,1, EDTA 10 mM, SDS al 1%), suplementado con el mismo cóctel de inhibidores de proteasas mencionado anteriormente, en una relación 1:1 (volumen:peso) relativo al peso inicial del tejido hepático, se incubaron en hielo durante 10 minutos se hicieron alícuotas en fracciones de 1 ml y se almacenaron a -20ºC o a -80ºC hasta su uso para Sp1-IPC.
1.2 Ensayo Sp1-IPC
Se sonicó en hielo 1 ml de cada muestra de cromatina entrecruzada con 7 pulsos de 10 segundos y amplitud del 40% en un sonicador Vibra-Cell VCX-500 (Sonics and Materials). El tamaño medio de cromatina de los fragmentos obtenidos fue alrededor de 500 pb. La cromatina sonicada se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos a 4ºC y los sobrenadantes, que contenían fragmentos solubles de cromatina, se diluyeron 10 veces con tampón de dilución (NaCl 165 mM, SDS al 0,01%, Triton X al 1,1%, EDTA 1,2 mM, Tris HCl 16,7 mM, pH 8,0) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma). Las fracciones de cromatina diluida se preclarificaron añadiendo 30 \muL/mL de proteína A/G sepharosa 1:1 (v/v) (Amersham Biosciencies) (previamente bloqueada durante 1 hora con ADN de lambda 100 \mug/mL, ARNt 500 \mug/mL y BSA 1 mg/mL) y se incubaron a 4ºC durante 4 horas en un placa rotatoria. Las suspensiones se centrifugaron después a 14.000 g durante 30 segundos para desechar proteína A/G sepharosa no unida y fragmentos de cromatina unidos no específicamente y los sobrenadantes se fraccionaron en alícuotas equivalentes a 50 \mug de ADN.
Se realizó el inmunofraccionamiento de complejos añadiendo a cada alícuota 2 \mug de un anticuerpo anti-Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Sp1 sc-59) e incubando a 4ºC durante la noche con rotación en una placa rotatoria. Las muestras se incubaron después con 50 \mul de proteína A/G sepharosa bloqueada durante 4 horas a 4ºC con rotación suave y los inmunocomplejos, que contenían fragmentos de cromatina/anticuerpo Sp1/proteína A/G sepharosa, se recogieron mediante centrifugación a 14.000 g durante 30 segundos, se lavaron dos veces con tampón de bajo contenido en sal (NaCl 150 mM, desoxicolato al 0,5%, SDS al 0,1%, Nonidet P-40 al 1%, EDTA 1 mM, Tris HCl 50 mM, pH 8,0), dos veces con tampón con alto contenido en sal (NaCl 500 mM, desoxicolato al 0,5%, SDS al 0,1%, Nonidet P-40 al 1%, EDTA 1 mM, Tris HCl 50 mM, pH 8,0), dos veces con tampón con LiCl (LiCl 250 mM, desoxicolato al 0,5%, SDS al 0,1%, Nonidet P-40 al 1%, EDTA 1 mM, Tris HCl 50 mM, pH 8,0) y dos veces con tampón TE (Tris HCl 10 mM, EDTA 0,25 mM) pH 8,0. Durante cada lavado, la suspensión se mantuvo con rotación durante 5 minutos a 4ºC. Se trató una alícuota de la cromatina no entrecruzada como anteriormente, pero en ausencia de anticuerpo (fracción sin Ac ) y el primer sobrenadante, después de preclarificar con proteína A/G sepharosa, se guardó como fracción de carga . La cromatina inmunoseleccionada se eluyó de la proteína A/G sepharosa mediante dos extracciones consecutivas con 100 \mul de tampón de elución (SDS al 1%, NaHSO_{3} 100 mM) cada una, con 30 segundos de agitación fuerte en un vortex y centrifugación a 12.000 g durante 2 minutos. Ambos sobrenadantes se combinaron [fracción IP o inmunoprecipitada (Sp1 en la figura 1)] y se incubaron a 65ºC durante la noche para invertir los entrecruzamientos de formaldehído. El ADN de todas las fracciones (fracción sin Ac, fracción de carga, fracción IP) se extrajo después de incubar con proteinasa K y se purificó con un kit de purificación de ADN (kit de purificación de PCR, Qiagen) y se usó para análisis por PCR de los genes diana. Los inventores probaron rutinariamente la especificidad de la inmunoprecipitación de cromatina comprobando la presencia de Sp1 en la fracción IP mediante análisis de inmunotransferencia, llevado a cabo con el anticuerpo usado para inmunoprecipitar los fragmentos de cromatina.
1.3 Análisis por PCR de la cromatina inmunoprecipitada
Para comprobar si la fracción de cromatina inmunoprecipitada contenía genes con Sp1 unido al promotor entre el conjunto de ADN, se analizaron las fracciones de ADN (fracción sin Ac, fracción de carga, fracción IP) mediante PCR usando cebadores específicos para cada gen para amplificar productos de 180-300 pb de longitud, que corresponden a las regiones del promotor o codificantes de los genes diana. Para el análisis se usaron diluciones 1:5.000 de la fracción de carga, 1:30 de la fracción IP y de la fracción sin Ac. El análisis por PCR de las muestras se hizo usando los siguientes cebadores:
5
1.4 Resultados
Los resultados obtenidos se muestran en la figura 1. El ensayo IPC con un anticuerpo anti-Sp1 confirmó que Sp1 se une a los promotores de los genes seleccionados. De los 11 genes analizados, la expresión de 9 de dichos genes (ID4, PIGPC1, MTHFR, PTGES, SSB1, HNRPA2B1, MRS3, HARC y GSTM) aumentó en hígado de ratones MAT1A-KO comparada con la expresión de los mismos en hígado de ratones WT, mientras que los niveles de expresión de 2 genes (RGN y GGa2) era similar en hígados de ratones WT y MAT1A-KO.
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Ejemplo 2 Determinación de Sp1 fosforilada en tejidos hepáticos de ratones 2.1 Inmunoprecipitación (IP) de SP1 fosforilada
Se homogenizaron muestras congeladas de tejido hepático de hígado de ratones control (WT) y MAT1A-KO, a los 15 días, 1, 3, 5 y 8 meses, en un tampón que contenía Tris ClH 10 mM pH 7,6, EDTA 5 mM, NaCl 50 mM, Triton X-100 al 1%, cóctel completo de inhibidores de proteasas (Sigma) y NaF 50 mM. El homogenado se centrifugó durante 20 minutos a 40.000 g y se recogieron los sobrenadantes. La proteína (500 \mug) se inmunoprecipitó con 4 \mug de anticuerpo anti-Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Sp1 sc-59) y 20 \mul de proteína A Sepharosa 4B (Amersham Pharmacia) en tampón de unión que contenía NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, desoxicolato al 1%, NP-40 al 1%, LiCl 0,25 M. Las muestras se hicieron rotar durante la noche a 4ºC. Los inmunoprecipitados se precipitaron mediante centrifugación (1.500 g) y se lavaron 3 veces con tampón de unión.
2.2 Inmunotransferencia
Los complejos inmunoprecipitados se disolvieron en tampón de SDS, se separaron mediante SDS-PAGE (7,5%) y se analizaron mediante inmunotransferencia usando anticuerpos comerciales. Las inmunotransferencias se desarrollaron con una dilución 1:1.000 de un anticuerpo contra fosfoserina (Sigma) o contra Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Sp1 sc-59) y un anticuerpo secundario anti-conejo o anti-ratón conjugado a peroxidasa de rábano (Invitrogen) y el reactivo quimioluminiscente luminal (ECL, Amersham Biosciences). Las membranas procesadas se expusieron a películas de rayos X y las autorradiografías se analizaron.
2.3 Resultados
Los resultados de las inmunotransferencias se muestran en la figura 2. El panel superior muestra claramente que el estado de fosforilación de Sp1 aumenta en muestras hepáticas de MAT1A-KO relativo a muestras hepáticas de WT. El panel inferior muestra que la cantidad de Sp1 total examinada con el anticuerpo anti-Sp1 es la misma en MAT1A-KO y WT en extracto crudo total. Por consiguiente, un nivel aumentado de Sp1 fosforilada en muestras de tejido hepático relativo al nivel de Sp1 fosforilado en muestras de tejido hepático control es indicativo de EHNA.
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Ejemplo 3 Determinación de Sp1 fosforilado en tejido hepáticos humanos 3.1 Inmunoprecipitación (IP) de SP1 fosforilada
Este ensayo se llevó a cabo con muestras de tejido hepático de:
-
sujetos normales, es decir, sujetos con función hepática normal con histología hepática normal, n=6 (3 mujeres, 3 hombres; edad mediana 57,6 años; intervalo 23-79 años); y
-
sujetos diagnosticados con EHNA, es decir, EHNA de grado 1 histológicamente diagnosticada, n=9 (7 mujeres, 2 hombres; edad mediana 41,1 años; intervalo 24-61 años) [EHNA de grado 1 se estableció histológicamente (esteatosis macrovesicular, inflamación lobulillar portal y cuerpos de Mallory) en ausencia de otras causas (víricas, alcohol, metabólicas) de EHNA [Brunt EM, et al., 1999, Am. J. Gastroenterol. 94, 2467-2474].
Se homogenizaron muestras congeladas de tejido hepático tanto de sujetos control (es decir, sujetos normales) como de sujetos diagnosticados con EHNA en un tampón que contenía Tris ClH 10 mM pH 7,6, EDTA 5 mM, NaCl 50 mM, Triton X-100 al 1%, cóctel completo de inhibidores de proteasas (Sigma) y NaF 50 mM. El homogenado se centrifugó durante 20 minutos a 40.000 g, y se recogieron los sobrenadantes. La proteína (500 \mug) se inmunoprecipitó con 4 \mug de anticuerpo anti-Sp1 humano ((H-225):sc-14027, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y 20 \mul de proteína A Sepharosa 4B (Amersham Pharmacia) en tampón de unión que contenía NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, desoxicolato al 1%, NP-40 al 1%, LiCl 0,25 M. Las muestras se rotaron durante la noche a 4ºC. Los inmunoprecipitados se precipitaron mediante centrifugación (1.500 g) y se lavaron 3 veces con tampón de unión.
3.2 Inmunotransferencia
Los complejos inmunoprecipitados se disolvieron en tampón de SDS, se separaron mediante SDS-PAGE (7,5%) y se analizaron mediante inmunotransferencia usando anticuerpos comerciales. Las inmunotransferencias se desarrollaron con una dilución 1:1.000 de un anticuerpo contra fosfoserina (Sigma) o contra Sp1 ((H-225):sc-14027, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y un anticuerpo secundario anti-conejo o anti-ratón conjugado a peroxidasa de rábano (Invitrogen) y el reactivo quimioluminiscente luminal (ECL, Amersham Biosciences). Las membranas procesadas se expusieron a películas de rayos X y las autorradiografías se analizaron.
3.3 Resultados
Los resultados de las inmunotransferencias se muestran en la figura 3A. El panel superior muestra que se encontró que Sp1 estaba ligeramente pero significativamente (p<0,05) hiperfosforilada en muestras de hígado de sujetos diagnosticados con EHNA comparado con sujetos control con función hepática normal. El panel inferior muestra que la cantidad de Sp1 total examinada con el anticuerpo anti-Sp1 es la misma en sujetos diagnosticados con EHNA y en sujetos control en extracto crudo total. Los cambios densitométricos se muestran en la figura 3B, expresados como veces de inducción de fosforilación de Sp1 sobre el valor de la muestra control. Las diferencias entre EHNA y control eran estadísticamente significativas, p<0,05. Estos resultados confirman que un nivel aumentado de Sp1 fosforilada en muestras de tejido hepático humano relativo al nivel de Sp1 fosforilada en muestras de tejido hepático humano control es indicativo de EHNA.

Claims (9)

1. Un método in vitro para detectar esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha afección, que comprende:
a)
cuantificar el nivel de fosforilación de la proteína Sp1 en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto; y
b)
comparar dicho nivel con el de una muestra control;
en donde un aumento en dicho nivel relativo al del control es indicativo de EHNA.
2. Método según la reivindicación 1, en donde la muestra a ser analizada se toma de un sujeto que no ha sido previamente diagnosticado con EHNA o de un sujeto que ha sido previamente diagnosticado con EHNA o de un sujeto que recibe tratamiento anti-EHNA o de un sujeto que ha recibido previamente tratamiento anti-EHNA.
3. Método según la reivindicación 1, que comprende la extracción de la muestra para obtener un extracto de proteína.
4. Método según la reivindicación 3, en donde la cuantificación de la fosforilación de la proteína Sp1 comprende poner en contacto el extracto de proteína con una composición de uno o más anticuerpos específicos para uno o más epítopos de la proteína Sp1 fosforilada y cuantificar los complejos formados.
5. Método según la reivindicación 4, en donde dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales o policlonales, fragmentos intactos o recombinantes de anticuerpos, combicuerpos y fragmentos de anticuerpo Fab o scFv, específicos para la proteína Sp1 fosforilada, ya sean humanos, humanizados o de origen no humano.
6. Método según las reivindicaciones 4 ó 5, en donde la cuantificación de dichos complejos se realiza mediante inmunotransferencia, ELISA (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas ), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (enzimoinmunoanálisis competitivo), DAS-ELISA (ELISA sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips o micromatrices de proteína que incluyen anticuerpos específicos, ensayos basados en la precipitación de oro coloidal en formatos tales como tiras reactivas; o mediante técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligandos o ensayos de unión a lectina.
7. Uso de una proteína Sp1 fosforilada para diagnosticar in vitro EHNA en un sujeto o para seguir in vitro el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha afección.
8. Un método in vitro para identificar y/o evaluar la eficacia de un agente potencialmente terapéutico contra EHNA, que comprende:
a)
poner en contacto un cultivo de células de hígado con un compuesto de prueba en las condiciones apropiadas y durante el periodo de tiempo requerido para que interaccionen;
b)
determinar el nivel de fosforilación de la proteína Sp1;
c)
comparar dicho nivel obtenido en el paso b) con el de un cultivo control de células de hígado que carece de dicho compuesto de prueba; y
d)
seleccionar un compuesto de prueba que produce que dicho nivel del paso b) disminuya.
9. Uso de una proteína Sp1 fosforilada en un método in vitro para cribar, identificar, desarrollar y/o evaluar la eficacia de compuesto potencialmente terapéuticos contra EHNA.
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