CN116801788A - 用于评估肝脏疾病的试剂盒、试剂和方法 - Google Patents

用于评估肝脏疾病的试剂盒、试剂和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116801788A
CN116801788A CN202180088535.7A CN202180088535A CN116801788A CN 116801788 A CN116801788 A CN 116801788A CN 202180088535 A CN202180088535 A CN 202180088535A CN 116801788 A CN116801788 A CN 116801788A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nafld
vegfa
leu
antibody
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180088535.7A
Other languages
English (en)
Inventor
S·K·格林斯彭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
General Hospital Corp
Original Assignee
General Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by General Hospital Corp filed Critical General Hospital Corp
Publication of CN116801788A publication Critical patent/CN116801788A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/25—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及用于评估患者非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)随时间推移的严重程度和/或受试者患有NAFLD的可能性的方法、试剂和试剂盒。所述方法、试剂和试剂盒基于对受试者的生物样品(如血浆样品)中VEGFA、TGFB1和/或CSF1水平的测定。所述方法、试剂和试剂盒可用于例如评估患者NAFLD的进展和/或患者对治疗的应答。

Description

用于评估肝脏疾病的试剂盒、试剂和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年10月30日提交的美国临时申请序号63/107,730的权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有标题为“11718_419_SeqList.txt”的计算机可读形式的序列表，其创建于2021年10月1日并且具有约25kb的大小。将计算机可读形式通过引用并入本文。
技术领域
本公开总地涉及肝病领域，并且更具体地涉及非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝纤维化的状态和进展的评估。
背景技术
NAFL通过肝细胞中甘油三酯的过量储存(脂肪变性)来定义，并且经常以由此引起的炎症、细胞气球样变性和损伤以及纤维化为特征。这方面的显著变化导致NASH。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)可能进展为纤维化并最终发展为肝硬化，并且在一般人群中是终末期肝病的越来越重要的原因，并且也已经在感染HIV的人中进行了研究(1-6)。NAFL/NASH在HIV患者中具有更高的患病率，并且倾向于比在一般人群中进展更快。与随着HIV疾病严重程度增加而恶化的许多HIV相关的合并症相反，NAFLD可能更常见于体重增加的HIV患者，并且它与中心性肥胖相关。在感染HIV的人(people living with HIV,PLWH)中，体重增加、腹部脂肪积累和内脏脂肪增加是常见的，并且即使使用更新的抗逆转录病毒药物也可见。
目前没有简单可靠的测定来监测患者的NAFLD/NASH发展和进展。NASH的存在是肝纤维化发展和进展的主要预测因子，并且肝纤维化的进展是不良肝相关临床结局的主要决定因素。因此，鉴定和监测NAFLD/NASH和晚期纤维化具有重要的预后和疾病管理意义。
在肝酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平增加的受试者中可能怀疑有NAFLD/NASH，但这些标志物在其他肝脏病症中也上调。诸如超声、计算机断层摄影(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、超声弹性成像(USE)、基于定量超声的技术、磁共振弹性成像(MRE)和基于磁共振的脂肪定量技术的成像技术也用于检测肝脏中的脂肪，但它们通常无法检测肝脏炎症和/或纤维化。此外，这些技术需要专门的成像装置和放射科医师对图像的分析。肝活检仍然是NASH诊断和分期的金标准，主要是由于缺乏可靠的非侵入性方法。然而，肝活检是昂贵的、主观的，并且与患者的风险相关。
因此，需要开发简单的、可靠的用于评估患者中NAFLD/NASH和肝纤维化的状态和进展的非侵入性测定。
本说明书涉及许多文献，其内容通过引用整体并入本文。
公开内容概述
本公开总地涉及肝病领域，并且更具体地涉及非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝纤维化的状态和进展的评估。
在各个方面和实施方案中，本公开提供以下项目：
1.一种用于评估患者非酒精性脂肪肝病(NAFLD)随时间推移的严重程度的方法，所述方法包括
在第一时间点测量来自患者的生物样品中的血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和/或集落刺激因子1(CSF1)的第一蛋白质水平；
在第二较晚时间点测量来自患者的相应生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第二蛋白质水平；
其中在所述第一和第二时间点之间VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第二蛋白质水平相对于第一蛋白质水平的降低指示患者中NAFLD严重程度已随时间消退；
其中在所述第一和第二时间点之间VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第二蛋白质水平相对于第一蛋白质水平的增加指示患者中NAFLD严重程度已随时间进展；和
其中在所述第一和第二时间点之间VEGFA、TGFB1和CSF1的第二蛋白质水平相对于第一蛋白质水平没有变化指示患者中NAFLD严重程度随时间推移是稳定的。
2.项目1的方法，其中所述方法包括测量VEGFA的蛋白质水平。
3.项目1或2的方法，其中所述方法包括测量TGFB1的蛋白质水平。
4.项目1至3任一项的方法，其中所述方法包括测量CSF1的蛋白质水平。
5.项目1至4任一项的方法，其中NAFLD严重程度包括纤维化评分和/或NAFLD活动度评分(NAFLD Activity Score,NAS)。
6.项目5的方法，其中NAFLD严重程度包括纤维化评分。
7.项目5或6的方法，其中NAFLD严重程度包括NAS。
8.项目1至7任一项的方法，其中患者在所述第一时间点和所述第二时间点之间接受了针对NAFLD的治疗。
9.项目8的方法，其中治疗包括施用生长激素释放激素(GHRH)分子或其类似物。
10.项目9的方法，其中治疗包括施用反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)-NH2或其药学上可接受的盐。
11.项目1至10任一项的方法，其中生物样品是血液来源的样品。
12.项目11的方法，其中血液来源的样品是血浆。
13.项目1至12任一项的方法，其中测量VEGFA的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合VEGFA的抗体或其抗原结合片段接触，并测量VEGFA与抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
14.项目1至13任一项的方法，其中测量TGFB1的蛋白水平包括使生物样品与特异性结合TGFB1的抗体或其抗原结合片段接触，并测量TGFB1与抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
15.项目1至14任一项的方法，其中测量CSF1的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合CSF1的抗体或其抗原结合片段接触，并测量CSF1和抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
16.项目13至15任一项的方法，其中抗体或其抗原结合片段与可检测部分缀合。
17.项目1至16任一项的方法，其中所述患者患有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
18.一种用于评估受试者患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的可能性的方法，所述方法包括测量来自受试者的生物样品中的血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和/或集落刺激因子1(CSF1)的蛋白质水平，其中相对于相应的对照水平，样品中VEGFA、TGFB1和/或CSF1的水平较高指示受试者患有NAFLD的可能性增加。
19.项目18的方法，其中所述方法包括测量VEGFA的蛋白质水平。
20.项目18或19的方法，其中所述方法包括测量TGFB1的蛋白质水平。
21.项目18至20任一项的方法，其中所述方法包括测量CSF1的蛋白质水平。
22.项目18至21任一项的方法，其中NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
23.项目18至22任一项的方法，其中NAFLD包括肝纤维化。
24.项目18至23任一项的方法，其中生物样品是血液来源的样品。
25.项目23的方法，其中血液来源的样品是血浆。
26.项目18至25任一项的方法，其中测量VEGFA的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合VEGFA的抗体或其抗原结合片段接触，并测量VEGFA与抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
27.项目18至26任一项的方法，其中测量TGFB1的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合TGFB1的抗体或其抗原结合片段接触，并测量TGFB1与抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
28.项目18至27任一项的方法，其中测量CSF1的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合CSF1的抗体或其抗原结合片段接触，并测量CSF1和抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
29.项目26至28任一项的方法，其中抗体或其抗原结合片段与可检测部分缀合。
30.项目18至29任一项的方法，其中所述方法在来自被怀疑患有NAFLD的受试者的生物样品上进行。
31.项目30的方法，其中受试者具有升高水平的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST)。
32.项目18至31任一项的方法，其中所述受试者患有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
33.一种用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的方法，所述方法包括使用项目18至32任一项的方法鉴定患有NAFLD的可能性增加的受试者，并向受试者施用针对NAFLD的治疗。
34.项目33的方法，其中治疗包括施用生长激素释放激素(GHRH)或其类似物。
35.项目34的方法，其中治疗包括施用反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)-NH2或其药学上可接受的盐。
36.一种试剂盒，其用于(a)评估患者中非酒精性脂肪肝病(NAFLD)随时间推移的严重程度，和/或(b)评估受试者患有NAFLD的可能性，所述试剂盒包含用于测量生物样品中血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和/或集落刺激因子1(CSF1)的蛋白质水平的试剂；以及用于将VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平与NAFLD的严重程度和/或患有NAFLD的可能性相关联的说明书。
37.项目36的试剂盒，其中所述试剂盒包含(i)特异性结合VEGFA的抗体或其抗原结合片段，(ii)特异性结合TGFB1的抗体或其抗原结合片段；(iii)特异性结合CSF1的抗体或其抗原结合片段；或(iv)(i)至(iii)的任何组合。
38.项目37的试剂盒，其中抗体或其抗原结合片段与可检测部分缀合。
39.一种测定混合物，其包含(a)用于测量生物样品中血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和/或集落刺激因子1(CSF1)的蛋白质水平的试剂；和(b)来自患有或被怀疑患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的受试者的生物样品。
40.项目39的测定混合物，其中测定混合物包含(i)特异性结合VEGFA的抗体或其抗原结合片段，(ii)特异性结合TGFB1的抗体或其抗原结合片段；(iii)特异性结合CSF1的抗体或其抗原结合片段；或(iv)(i)至(iii)的任何组合。
41.项目40的测定混合物，其中测定混合物包含(i)至(iii)的任何组合。
42.项目40或41的测定混合物，其中抗体或其抗原结合片段与可检测部分缀合。
43.项目39至42任一项的测定混合物，其中生物样品是血液来源的样品。
44.项目43的测定混合物，其中血液来源的样品是血浆。
45.项目39至44任一项的测定混合物，其中生物样品来自患有NAFLD的受试者。
本公开的其他目的、优点和特征将在阅读以下仅通过示例的方式参考附图给出的其具体实施方案的非限制性描述时变得更加明显。
附图简述
在附图中：
图1是在本文所述的研究中进行的分析的示意图。检查了总共13种血浆蛋白，其对应于差异调节的肝基因途径内的顶端领头(leading edge)基因。分析集中于9种蛋白质的子集，其中治疗效果的方向性与肝基因表达变化的方向性一致。缩写：CASP8，半胱天冬酶8；CCL20，C-C基序趋化因子配体20；CRTAM，细胞毒性和调节性T细胞分子；CSF1，巨噬细胞集落刺激因子1；CXCL12，C-X-C基序趋化因子配体12；NCR1，天然细胞毒性触发受体1；TGFB1，转化生长因子β1；TNFRSF21，肿瘤坏死因子受体超家族成员21；VEGFA，血管内皮生长因子A。
图2A-C是显示血浆VEGFA(图2A)、TGFB1(图2B)和CSF1(图2C)随治疗状态的差异变化的图。相对于安慰剂，替莫瑞林(tesamorelin)导致血浆VEGFA(log2-倍数变化，平均值±SD，-0.20±0.35vs.0.05±0.34，p＝0.02)、TGFB1(log2-倍数变化-0.35±0.56vs.-0.05±0.43，p＝0.05)和CSF1(log2-倍数变化-0.17±0.21vs.0.02±0.20，P＝0.004)的显著降低。条形和误差条分别表示平均值和平均值的标准误差。缩写：CSF1，巨噬细胞集落刺激因子1；TGFB1，转化生长因子β1；VEGFA，血管内皮生长因子A。
图3A和B是显示替莫瑞林治疗的参与者中血浆VEGFA(图3A)和CSF1(图3B)变化与NAS评分变化的关系的图。在替莫瑞林治疗的分支内，血浆VEGFA(r＝0.62，P＝0.006)和CSF1(r＝0.50，P＝0.04)的减少与NAS评分的降低相关。显示了具有95％置信区间的线性回归线。缩写：CSF1，巨噬细胞集落刺激因子1；NAS，NAFLD活动度评分；VEGFA，血管内皮生长因子A。
图4A和4B是描绘血浆TGFB1和CSF1变化与基因水平纤维化评分变化的关系的图。在替莫瑞林治疗的参与者中，血浆TGFB1(图4A)(r＝0.61，P＝0.009)和CSF1(图4B)(r＝0.64，P＝0.006)的下降与改善的基因水平纤维化评分相关。显示了具有95％置信区间的线性回归线。缩写：CSF1，巨噬细胞集落刺激因子1；TGFB1，转化生长因子β1。
图5显示了人VEGFA的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。氨基酸1-26(SEQ ID NO:6)定义信号肽；氨基酸27-232(SEQ ID NO:7)定义成熟多肽。
图6显示了人TGFB1的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。氨基酸1-29(SEQ ID NO:9)定义信号肽；氨基酸30-278(SEQ ID NO:10)定义潜伏相关肽；氨基酸279-390(SEQ ID NO:11)定义成熟多肽。
图7显示人CSF1的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。氨基酸1-32(SEQ ID NO:13)定义信号肽，和残基33-450定义加工的成熟形式(SEQ ID NO:14)。
图8显示了替莫瑞林(反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)-NH2；SEQ ID NO:1)的结构。
发明详述
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本技术的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)，术语“一个(a)”和“一个(an)”和(该“the”)以及类似指代的使用应被解释为覆盖单数和复数。
除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。
本文提供的任何和所有实例或示例性语言(“例如”、“诸如”)的使用仅旨在更好地说明所要求保护的技术的实施方案，并且不对范围构成限制，除非另有要求。
说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于所要求保护的技术的实施方案的实践是必不可少的。
在本文中，术语“约”具有其普通含义。术语“约”用于表示值包括用于确定该值的装置或方法的固有误差变化，或包括接近所述值的值，例如在所述值(或值范围)的10％内。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。所述范围内的值的所有子集也并入本说明书中，如同它们在本文中单独列举一样。
在根据马库什组或替代物列表描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此根据马库什组或替代物列表的任何单独成员或成员亚组来描述。
除非另有具体定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，干细胞生物学、细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
除非另有说明，否则本公开中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这些技术在以下来源的文献中描述和解释：J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编辑)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning：APracticalApproach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等(编辑)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括直到现在的所有更新)，Ed Harlow and David Lane(编辑)Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，和J.E.Coligan等(编辑)Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(包括直到现在的所有更新)。
在本文所述的研究中，本发明人已经表明了在用替莫瑞林治疗的患有NAFLD的患者的血浆中检测到血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和集落刺激因子1(CSF1)的水平降低。VEGFA、TGFB1和/或CSF1水平的降低显示与NAFLD的病理特征的改善相关，如患者中NAFLD活动度评分(NAS)和/或基因水平纤维化评分的降低。
根据NAS临床研究网络(NAS CRN)评分系统计算的NAFLD活动度评分(NAS)包括脂肪变性(0-3级)、肝细胞气球样变性(0-2级)和小叶炎症(0-3级)的评级总和(Kleiner DE等，Hepatology 2005；41：1313-21)。
在一个方面中，本公开提供了一种用于评估受试者患有NAFLD的可能性的方法，该方法包括测量来自受试者的生物样品中血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和/或集落刺激因子1(CSF1)的蛋白质水平，其中相对于相应的对照水平，样品中VEGFA、TGFB1和/或CSF1的水平较高指示受试者患有NAFLD的可能性增加。
“对照水平”或“参考水平”或“标准水平”在本文中可互换使用，并且广泛地指在一个或多个可比较的“对照”样品中测量的单独的基线水平，所述可比较的“对照”样品可以来自未患有疾病(例如NAFLD)的受试者。相应的对照水平可以是对应于基于在若干参考或对照受试者中测量的水平计算的平均/均值或中值水平的水平(例如，预定或建立的标准水平)。对照水平可以是本领域公认的预定“截止”值，或者基于来自一个或一组对照受试者的样品中测量的水平建立。例如，“阈值参考水平”可以是对应于VEGFA、TGFB1和/或CSF1的最低水平(截止值)的水平，其允许以统计学显著的方式区分患有NAFLD的可能性或风险更高的患者与不具有患有NAFLD的可能性或风险更高的患者，这可以使用例如来自NAFLD患者和来自健康受试者(即，未患有NAFLD)的样品来确定。可以针对年龄、性别、种族或其他参数调整或归一化相应的参考/对照水平。因此，“对照水平”可以是单个数字/值，单独地同样适用于每个患者，或者对照水平可以根据患者的特定亚群而变化。因此，例如，老年男性可能具有与年轻男性不同的对照水平，并且女性可能具有与男性不同的对照水平。预定的标准水平可例如在将测试群体相等(或不等)地分成组(如低风险组、中风险组和高风险组)或分成四分位组或五分位组的情况下排列，最低四分位组或五分位组是具有最低风险(即VEGFA、TGFB1和/或CSF1的最低水平)的个体，并且最高四分位组或五分位组是具有最高风险(即VEGFA、TGFB1和/或CSF1的最高水平)的个体。还应当理解，除了预定水平或标准之外，根据本公开的对照水平可以是在与实验样品平行测试的其他样品(例如，来自健康/正常受试者)中测量的水平。参考或对照水平可以对应于归一化水平，即基于管家基因的表达进行归一化的参考或对照值。
在实施方案中，对照水平是在已知未患有NAFLD的受试者的生物样品中测定的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的相应水平，或已建立的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的参考或标准水平。
本公开还提供了一种用于评估患者中非酒精性脂肪肝病(NAFLD)随时间推移的严重程度的方法，该方法包括：
在第一时间点测量来自患者的生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平；
在第二较晚时间点测量来自患者的相应生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平；
其中VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平在所述第一和第二时间点之间的降低指示患者中NAFLD严重程度已随时间消退；
其中VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平在所述第一和第二时间点之间的增加指示患者中NAFLD严重程度已随时间进展；和
其中VEGFA、TGFB1和CSF1的蛋白质水平在所述第一和第二时间点之间没有变化指示患者中NAFLD严重程度随时间推移是稳定的。
VEGFA(UniProtKB登录号No.P15692)是232个氨基酸的蛋白质(前体，同种型1)，其中氨基酸1-26定义信号肽，而氨基酸27-232定义成熟多肽。VEGFA(同种型1)的氨基酸序列描绘于图5中。
TGFB1(UniProtKB登录号No.P01137)是390个氨基酸的蛋白质(前体)，其中氨基酸1-29限定信号肽，并且其被蛋白水解加工以产生112个氨基酸的成熟肽(残基279-390)。TGFB1的氨基酸序列如图6所示。
CSF1(UniProtKB登录号No.P09603)最初作为膜结合的但在刺激时加工和分泌的前体产生。前体包含554个氨基酸(同种型1)，其中氨基酸1-32定义信号肽，而残基33-450定义加工的成熟形式。CSF1(同种型1)的氨基酸序列描绘于图7中。
上述用于评估NAFLD随时间推移的严重程度的方法可以在几个时间点进行，即VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平可以在第三、第四、第五等时间点从患者的相应生物样品中进行。两个时间点之间的间隔可以是例如1天、2天、3天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年等，并且对于所有时间点可以是相同的或可以变化(例如，第一和第二时间点之间的1周，以及第二和第三时间点之间的1个月)。
该方法允许确定患者的状况是否随时间改善、恶化或是稳定的。在一个实施方案中，TGFB1的蛋白水平在第一和第二时间点之间降低，并且该降低指示患者的NAS评分和/或肝纤维化的减轻。在一个实施方案中，TGFB1的蛋白水平在第一和第二时间点之间升高，并且该升高指示患者中NAS评分和/或肝纤维化的升高。在一个实施方案中，CSF1的蛋白质水平在第一和第二时间点之间降低，并且该降低指示患者中NAS评分和/或肝纤维化的减轻。在一个实施方案中，CSF1的蛋白质水平在第一和第二时间点之间升高，并且该升高指示患者中NAS评分和/或肝纤维化的升高。在一个实施方案中，VEGFA的蛋白质水平在第一和第二时间点之间降低，并且该降低指示NAS评分的降低。在一个实施方案中，VEGFA的蛋白质水平在第一和第二时间点之间增加，并且该增加指示NAS评分的增加。在一个实施方案中，VEGFA和CSF1的蛋白质水平在第一和第二时间点之间降低，并且该降低指示患者中NAS评分的降低。在一个实施方案中，VEGFA和CSF1的蛋白质水平在第一和第二时间点之间升高，并且该升高指示患者中NAS评分的升高。在一个实施方案中，TGFB1和CSF1的蛋白质水平在第一和第二时间点之间降低，并且该降低指示患者中肝纤维化的减轻。在一个实施方案中，TGFB1和CSF1的蛋白质水平在第一和第二时间点之间增加，并且该增加指示患者中肝纤维化的增加。
上述用于评估NAFLD随时间推移的严重程度的方法可用于确定患有NAFLD的患者是否对针对NAFLD的治疗/疗法有反应，即，确定治疗/疗法是否有效并且是否改善患者的状况。因此，在另一个实施方案中，在第一和第二时间点之间向患者施用治疗/疗法。在另一个实施方案中，患者在第一和第二时间点之间经历体重减轻计划，即健康(低热量)饮食和/或体育锻炼。
因此，在另一个方面中，本公开内容涉及一种用于评估治疗是否改善患有NAFLD的患者的状况的方法，该方法包括：
在第一时间点测量来自患者的生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平；
向患者施用针对NAFLD的治疗一段时间；和
在所述时间段后的第二时间点测量来自患者的相应生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平；
其中VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平在所述第一和第二时间点之间的降低指示治疗已改善患者的病症；
其中VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平在所述第一和第二时间点之间没有变化或增加指示治疗没有改善患者的病症。
在一个实施方案中，患者病症的改善包括NAS评分的降低。在另一个实施方案中，患者病症的改善包括NAS评分的降低，并且该方法包括测量VEGFA和/或CSF1的水平。
在一个实施方案中，患者病症的改善包括肝纤维化的减轻。在另一个实施方案中，患者病症的改善包括肝纤维化的减轻，并且该方法包括测量TGFB1和/或CSF1的水平。
在一个实施方案中，患者病症的改善包括NAS评分的降低和肝纤维化的减轻。在另一个实施方案中，患者病症的改善包括NAS评分的降低和肝纤维化的减轻，并且该方法包括测量CSF1的水平。
在另一个方面中，本公开涉及一种用于确定候选疗法是否可用于治疗NAFLD的方法，该方法包括：
测量来自患有NAFLD的受试者的生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第一蛋白质水平；
向受试者施用候选疗法一段时间；和
在所述时间段后测量来自受试者的生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第二蛋白质水平；
其中第二蛋白质水平相对于第一蛋白质水平的更低水平指示候选疗法可用于治疗NAFLD。
在一个实施方案中，此类研究在临床试验的背景下进行，所述临床试验通常需要另外向患有NAFLD的第二受试者施用安慰剂。在这种情况下，在一个实施方案中，用于确定候选疗法是否可用于治疗NAFLD的方法包括：
测量来自患有NAFLD的第一和第二受试者的生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第一蛋白质水平；
向第一受试者施用候选疗法并向第二受试者施用安慰剂一段时间；和
在所述时间段后测量来自第一和第二受试者的生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第二蛋白质水平。
类似地，在这样的实施方案中，来自第一受试者的生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第二蛋白质水平相对于第一蛋白质水平的水平降低指示候选疗法可用于治疗NAFLD。第二受试者中第一和第二蛋白质水平的测定在这种试验的背景下提供了另外的对照。
在一个实施方案中，上述方法包括测量VEGFA的蛋白质水平。在一个实施方式中，上述方法包括测量TGFB1的蛋白质水平。在一个实施方案中，上述方法包括测量CSF1的蛋白质水平。在一个实施方案中，上述方法包括测量VEGFA和TGFB1的蛋白质水平。在一个实施方案中，上述方法包括测量VEGFA和CSF1的蛋白质水平。在一个实施方案中，上述方法包括测量TGFB1和CSF1的蛋白质水平。在一个实施方案中，上述方法包括测量VEGFA、TGFB1和CSF1的蛋白质水平。
在另一个方面中，本公开涉及一种用于治疗非酒精性NAFLD的方法，该方法包括向使用本文所述的方法鉴定为患有NAFLD的可能性增加的受试者施用针对NAFLD的治疗。
在另一个方面中，本公开涉及一种用于治疗非酒精性NAFLD的方法，该方法包括使用本文所述的方法鉴定患有NAFLD的可能性增加的受试者，并向受试者施用针对NAFLD的治疗。
在另一个方面中，本公开涉及针对NAFLD的治疗在受试者中的用途，其中受试者通过本文所述的鉴定患有NAFLD的可能性增加的受试者的方法来鉴定。
在另一个方面中，本公开涉及治疗/疗法用于治疗受试者的NAFLD，其中受试者通过本文所述的鉴定患有NAFLD的可能性增加的受试者的方法来鉴定。
在本文所述的方法中向患者施用或对患者进行的治疗/疗法可以是实验性或候选治疗/疗法，例如在临床研究中测试的治疗/疗法，或批准或建立的NAFLD治疗/疗法。
在一个实施方案中，治疗/疗法包括施用或使用降低胆固醇的药物，如他汀类(例如，阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀)、胆汁酸螯合剂(例如，消胆胺、考来维仑、考来替泊)、胆固醇吸收阻断剂(例如，依折麦布)、PCSK9抑制剂(例如，抗PCSK9抗体，如Alirocumab和Evolocumab)、烟酸、贝特类(例如，非诺贝特、吉非贝齐)、三磷酸腺苷-柠檬酸裂解酶(ACL)抑制剂(例如，贝派地酸(Bempedoic acid))或ω-3产品(例如，二十碳五烯酸乙酯、ω-3-酸乙酯)。在另一个实施方案中，治疗/疗法包括生活方式的改变，例如经历体重减轻计划，即健康(低热量)饮食和/或体育锻炼。
在一个实施方案中，治疗/疗法包括施用或使用GHRH分子。在本公开的上下文中使用的术语“GHRH分子”包括但不限于人天然GHRH(1-44)及其片段(例如GHRH(1-40)、GHRH(1-29)，范围在1-29和1-44序列之间的片段)和任何其它片段；来自其他物种的GHRH及其片段；含有氨基酸取代、添加和/或缺失的GHRH变体；GHRH的衍生物或类似物或其片段或变体，其具有例如在N-末端、C-末端或侧链上与GHRH氨基酸序列偶联的有机基团或部分；和GHRH(人或来自其他物种)的药学上可接受的盐，以及天然GHRH或其片段、变体、类似物和衍生物的药学上可接受的盐。本公开的GHRH分子还涵盖本领域目前已知的GHRH分子，包括但不限于白蛋白缀合的GHRH(美国专利号7,268,113)；聚乙二醇化GHRH肽(美国专利号7,256,258和6,528,485)；猪GHRH(1-40)(美国专利号6,551,996)；犬GHRH(美国专利申请号2005/0064554)；1-29至1-44个氨基酸长度的GHRH变体(美国专利号5,846,936、5,696,089、5,756,458和5,416,073，以及美国专利申请号2006/0128615和2004/0192593)；和Pro0-GHRH肽及其变体(美国专利号5,137,872)。
GHRH类似物包括美国专利号5,681,379和5,939,386中描述的那些，其也描述了它们的合成方法。更具体地，这些GHRH类似物由下式A来定义：
X-GHRH肽(A)
其中GHRH肽是下式B(SEQ ID NO:2)的肽：
A1-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-A13-Leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-A24-A25-Ile-A27-A28-Arg-A30-A31-A32-A33-A34-A35-A36-A37-A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-R0(B)
其中
A1是Tyr或His；
A2是Val或Ala；
A8是Asn或Ser；
A13是Val或Ile；
A15是Ala或Gly；
A18是Ser或Tyr；
A24是Gln或His；
A25是Asp或Glu；
A27是Met、Ile或Nle
A28是Ser或Asn；
A30不存在或是任何氨基酸，优选Gln；
A31不存在或是任何氨基酸，优选Gln；
A32不存在或是任何氨基酸，优选Gly；
A33不存在或是任何氨基酸，优选Glu；
A34不存在或是任何氨基酸，优选Ser；
A35不存在或是任何氨基酸，优选Asn；
A36不存在或是任何氨基酸，优选Gln；
A37不存在或是任何氨基酸，优选Glu；
A38不存在或是任何氨基酸，优选Arg；
A39不存在或是任何氨基酸，优选Gly；
A40不存在或是任何氨基酸，优选Ala；
A41不存在或是任何氨基酸，优选Arg；
A42不存在或是任何氨基酸，优选Ala；
A43不存在或是任何氨基酸，优选Arg；
A44不存在或是任何氨基酸，优选Leu；和
R0是NH2或NH-(CH2)n-CONH2，n＝1至12。
基团X是通过酰胺键锚定到肽的N-末端的疏水性尾部，并且疏水性尾部限定5至7个原子的主链。主链可以被C1-6烷基、C3-6环烷基或C6-12芳基取代，并且主链包含至少一个连接到主链的至少两个原子的刚性化部分。刚性化部分是双键、三键、饱和或不饱和C3-9环烷基或C6-12芳基。
在一个实施方案中，基团X是：
在一个实施方案中，在式B中，A30-A44是：(a)不存在；(b)对应于天然GHRH肽(SEQID NO:3)的位置30-44的氨基酸序列，或(c)从其C-末端具有1-14个氨基酸缺失的(b)的氨基酸序列。
在一个实施方案中，GHRH肽是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，GHRH分子是(己烯酰基反式-3)hGHRH(1-44)NH2(SEQ ID NO:1)或其药学上可接受的盐。反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺(也称为替莫瑞林tesamorelin和(己烯酰基反式-3)hGHRH(1-44)NH2)是合成的人GHRH(hGHRH)类似物，其包含hGHRH的44个氨基酸的序列，其上己烯酰基部分，C6侧链，已经锚定在氨基末端酪氨酸残基上。[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺的结构描绘于图8中。
术语“药学上可接受的盐”是指GHRH分子(例如，反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)NH2)的盐，其是药理学上可接受的并且对其施用的受试者基本上无毒。更具体地，这些盐保留了GHRH分子(例如，反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)NH2)的生物有效性和性质，并且由合适的无毒有机或无机酸或碱形成。
例如，这些盐包括GHRH分子(例如，反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)NH2)的酸加成盐，其碱性足以形成此类盐。此类酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、低级链烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐或乙磺酸盐，芳基磺酸盐，如苯磺酸盐、2-萘磺酸盐或甲苯磺酸盐(也称为甲苯磺酸盐)、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、肉桂酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸氢盐、2-羟基乙磺酸盐、衣康酸盐、乳酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、高氯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、十一酸盐，等等。
另外，例如P.Stahl等，Camille G.Handbook of PharmaceuticalSalts.Properties,Selection and Use.(2002)Zurich:Wiley-VCH；S.Berge等，Journalof Pharmaceutical Sciences(1977)66(1)1-19；P.Gould,International J.ofPharmaceutics(1986)33 201-217；Anderson等，The Practice of Medicinal Chemistry(1996),Academic Press,New York；和The Orange Book(Food&Drug Administration,Washington,D.C.在它们的网站上)，讨论了通常认为适用于从碱性药用化合物形成药学上有用的盐的酸。
本领域技术人员可以使用标准技术非常容易地形成此类盐。实际上，将药物化合物(即药物)化学修饰成盐是药物化学家熟知的技术(参见，例如，H.Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(第6版，1995)，第196和1456-1457页)。反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)NH2的盐可以例如通过使反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)NH2与一定量(如等当量)的酸或碱在介质(如盐在其中沉淀的介质)中或在水性介质中反应，然后冻干来形成。
在一个实施方案中，GHRH分子(优选反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)NH2)的药学上可接受的盐是乙酸盐。
在一个实施方案中，GHRH分子(优选反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)NH2)或其药学上可接受的盐以约1mg/mL至约10mg/mL的剂量存在于药物组合物中。在另一个实施方案中，GHRH分子(优选反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)NH2)或其药学上可接受的盐以约1mg/mL至约10mg/mL，优选约1mg/mL至约8mg/mL或约4mg/mL至约8mg/mL，例如约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL或约8mg/mL的剂量存在于药物组合物中。
在一个实施方案中，GHRH分子(优选反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)NH2)或其药学上可接受的盐存在于包含一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。
如本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”具有其在本领域中的正常含义，并且是本身不是活性成分(药物)的任何成分。赋形剂包括例如粘合剂、润滑剂、稀释剂、增容剂(填充剂)、增稠剂、崩解剂、增塑剂、包衣、屏障层制剂、润滑剂、稳定剂、释放延迟剂和其他组分。如本文所用的“药学上可接受的赋形剂”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对受试者无毒的任何赋形剂，即是一种赋形剂和/或以对受试者无毒的量使用。赋形剂是本领域熟知的，并且本发明的组合物在这些方面不受限制。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种赋形剂，包括例如但不限于一种或多种粘合剂(结合剂)、增稠剂、表面活性剂、稀释剂、释放延迟剂、着色剂、调味剂、填充剂、崩解剂/溶解促进剂、润滑剂、增塑剂、二氧化硅流动调节剂、助流剂、抗结块剂、抗粘着剂、稳定剂、抗静电剂、溶胀剂及其任何组合。如本领域技术人员将认识到的，单一赋形剂可以同时实现两种以上的功能，例如，可以充当结合剂和增稠剂两者。如本领域技术人员还将认识到的，这些术语不一定是相互排斥的。使用本领域已知的标准方法，通过将具有所需纯度的活性成分与一种或多种任选的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合来制备治疗制剂。赋形剂可以适合于例如静脉内、肠胃外、皮下、肌内、颅内、眶内、眼、心室内、囊内、脊柱内、鞘内、硬膜外、脑池内、腹膜内、鼻内或肺(例如气溶胶)施用(参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，LoydV Allen，Jr，2012，第22版，Pharmaceutical Press；Handbook of PharmaceuticalExcipients，Rowe等，2012，第7版，Pharmaceutical Press)。在一个实施方案中，药物组合物是可注射的组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种用于皮下施用/注射的赋形剂。
测量生物样品中蛋白质的量/水平的方法是本领域熟知的。可以使用与蛋白质(成熟蛋白质)特异性结合的配体(如抗体或其片段)直接检测蛋白质水平。在实施方案中，这种结合分子或试剂(例如抗体)被标记/缀合，例如放射性标记、发色团标记、荧光团标记或酶标记的，以促进复合物的检测和定量(直接检测)。或者，可以使用结合分子或试剂间接检测蛋白质水平，然后使用特异性识别结合分子或试剂的第二配体(或第二结合分子)检测[蛋白质/结合分子或试剂]复合物(间接检测)。这样的第二配体可以是放射性标记、发色团标记、荧光团标记或酶标记的，以促进复合物的检测和定量。用于标记用于免疫测定的抗体的酶是本领域已知的，并且最广泛使用的是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。结合分子或试剂的实例包括抗体(单克隆或多克隆)、天然或合成配体等。
测量样品中蛋白质的量/水平的方法的实例包括但不限于：蛋白质印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、放射免疫测定(RIA)、邻近延伸测定(PEA)、免疫沉淀、表面等离子体共振(SPR)、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学(IHC)分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、微细胞术、微阵列、抗体阵列、显微镜(例如，电子显微镜)、流式细胞术、基于蛋白质组学的测定，以及基于蛋白质的性质或活性的测定，包括但不限于配体与其他蛋白质伴侣的结合或相互作用、酶活性、荧光。例如，如果目标蛋白质是已知磷酸化给定靶标的激酶，则可以通过在测试化合物存在下测量靶标的磷酸化水平来确定目标蛋白质的水平或活性。如果目标蛋白质是已知诱导一种或多种给定靶基因表达的转录因子，则可以通过测量靶基因的表达水平来确定目标蛋白质的水平或活性。在一个实施方案中，通过邻近延伸测定(PEA)测量样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的量/水平。PEA是一种基于亲和力的测定，其表征预定蛋白质组的丰度水平。每种蛋白质被独特的寡核苷酸标记的抗体对靶向。紧密接近时，寡核苷酸经历接近依赖性DNA聚合事件以形成PCR靶序列。使用标准实时PCR检测和定量所得DNA序列。PEA在log2标度上给出归一化蛋白质表达(NPX)的蛋白质丰度水平。
在一个实施方案中，上述测量VEGFA、TGFB1或CSF1的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合蛋白质的配体(如特异性结合VEGFA、TGFB1或CSF1的抗体或其抗原结合片段)接触，并测量VEGFA、TGFB1或CSF1与配体(例如抗体或其抗原结合片段)之间的复合物的量。如本文所用的术语“抗体或其抗原结合片段”是指任何类型的抗体/抗体片段，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体、人源化抗体、CDR移植抗体、嵌合抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原特异性/结合活性即可。抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双体抗体(diabody)、线性抗体、单链抗体分子、单结构域抗体(例如来自骆驼科动物)、鲨鱼NAR单结构域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段还可以指包含CDR或抗原结合结构域的结合部分，包括但不限于VH区(VH、VH-VH)、anticalin、PepBodies、抗体-T细胞表位融合物(Troybody)或Peptibody。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段被标记。抗体或其抗原结合片段可以用一种或多种标记来标记，如生物素标记、荧光标记、酶标记、辅酶标记、化学发光标记或放射性同位素标记。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段用可检测标记/部分，例如荧光部分(荧光团)来标记。有用的可检测标记包括荧光化合物(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、荧光素、Alexa染料等)、放射性标记、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和蛋白质检测测定中常用的其他酶)、链霉亲和素/生物素，和比色标记，如胶体金、有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)。也可以使用化学发光化合物。在另一个实施方案中，如上所述，将抗体或其抗原结合片段与寡核苷酸缀合，例如以进行邻近延伸测定。
在一个实施方案中，特异性结合蛋白质的配体(例如，特异性结合VEGFA、TGFB1或CSF1的抗体或其抗原结合片段)附接或固定在固体支持物上。固体支持物可以是允许配体结合(例如，固定化)并且可以用于所需应用的任何固体支持物。包括例如玻璃或塑料板/载玻片。在一个实施方案中，上述固体支持物是塑料板/载玻片。在实施方案中，可以在固定配体之前对上述板/载玻片进行修饰(例如，包被、化学修饰、衍生化)。在一个实施方案中，使用本领域已知的任何方法修饰固体支持物以允许或促进配体的共价或非共价固定。固体支持物可以是氨基官能化或羧基官能化的，这取决于是否需要通过配体的C-或N-末端来固定配体。可以使用能够结合与配体缀合的相应部分(亲和标签)的任何常规部分修饰/包被固体支持物，例如使用典型的基于亲和标签的系统，如NTA-“His-标签”系统、生物素-亲和素/链霉亲和素系统、谷胱甘肽S-转移酶(GST)-谷胱甘肽系统、麦芽糖结合蛋白(MBP)-直链淀粉系统，以及抗原-抗体系统。
在一个实施方案中，上述方法包括将蛋白质水平归一化的步骤，即将上述蛋白质的测量水平相对于稳定表达的对照蛋白质(或管家蛋白质)归一化，以促进不同样品之间的比较。如本文所用的“归一化(normializing)”或“归一化(normalization)”是指针对样品间变化校正不同样品之间的原始蛋白质水平值/数据，以考虑“外在”参数，如蛋白质质量、纯化效率等的差异，即不是由于样品中蛋白质的实际“内在”变化引起的差异。通过基于针对一种或多种“管家”或“对照”蛋白质测量的蛋白质水平值/数据校正测试蛋白质(或目的蛋白质，即VEGFA、TGFB1和/或CSF1)的原始蛋白质水平值/数据来进行这种归一化，即已知所述“管家”或“对照”蛋白质水平在不同实验条件下在生物样品中是恒定的(即，显示相对低的变异性)。因此，在一个实施方案中，上述方法还包括测量生物样品中管家蛋白的表达水平。
在分析之前，可以对样品中测量的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的原始水平进行数学变换，如对数变换。在一个实施方案中，本文所述的方法包括在分析之前对样品中测量的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的原始水平进行Log2转换。
根据本公开，生物样品(例如，医学/临床样品)包括从怀疑含有本文所述的一种或多种靶蛋白(VEGFA、TGFB1和CSF1)的受试者/患者获得的任何样品(粗制的或加工的)。这样的物质可以源自多种来源。在一个实施方案中，怀疑含有一种或多种靶蛋白的样品可以从任何组织/器官和/或从身体排泄物或流体获得。如果需要，样品可以使用本领域技术人员已知的技术制备，包括但不限于机械裂解、去垢剂提取、超声处理、电穿孔、变性剂等，并且如果需要也可以纯化。在进一步的实施方案中，可以处理样品以获得其富含蛋白质的提取物，其范围从相对粗制到相对纯的蛋白质制剂。
在一个实施方案中，上述生物样品是生物流体，例如尿液、唾液、淋巴或血液来源的样品。如本文所用的术语“血液来源的样品”是指血液(例如，新鲜血液、储存的血液)或其级分，如血清、血浆等。它还指使用血液(例如通过静脉穿刺获得)作为起始材料在一次或多次纯化、富集，和/或处理步骤后获得的任何样品。在一个实施方案中，生物样品是血液来源的样品，在进一步的实施方案中是血浆。
样品可以从怀疑患有NAFLD的受试者获得，例如具有脂肪肝和/或肝纤维化的一种或多种症状的受试者。基于实验室测试的结果，如升高的肝酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST)，通过成像技术检测到的肝脂肪的证据，和/或肝活检，受试者可能被怀疑患有NAFLD，或已被诊断为NAFLD。术语NAFLD是指慢性肝病，其定义为在没有任何肝脏脂肪积累的次要原因(如酒精使用、脂肪发生药物和遗传性疾病)的情况下，存在肝脏脂肪变性的病理(>5％的肝脏横截面积被脂肪泡占据)。NAFLD包括可以简化为两类的一系列疾病：(1)单纯性脂肪变性(SS)或非酒精性脂肪肝(NAFL)，70％-75％的病例，定义为没有炎症或细胞损伤的过量肝脏脂肪；和(2)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，25％-30％的病例，定义为存在过量的肝脏脂肪，伴有炎症和细胞损伤，伴有或不伴有窦周纤维化。在一个实施方案中，生物样品来自患有或被怀疑患有NAFL的受试者。在另一个实施方案中，生物样品来自患有或被怀疑患有NASH的受试者。在另一个实施方案中，受试者是HIV感染的受试者，即受试者患有HIV相关的NAFLD。
在一个实施方案中，本文所述的方法还包括进行一种或多种另外的测定以评估/诊断受试者中的NAFLD/NASH。此类测定包括例如确定来自受试者的生物样品中的肝酶(如丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST))的水平，使用成像技术(如超声、计算机断层扫描(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、超声弹性成像(USE)、基于定量超声的技术、磁共振弹性成像(MRE)和基于磁共振的脂肪定量技术)进行肝成像，或肝样品的组织学分析(例如，肝活检)。如本文所述，可以基于其生物样品中VEGFA、TGFB1和/或CSF1的更高/增加的水平(相对于参照水平)对怀疑患有NAFLD的患者进行这样的另外的测定。
在另一个方面中，本公开提供了一种测定混合物，其用于(a)评估患者中NAFLD随时间推移的严重程度，和/或(b)评估受试者患有NAFLD的可能性，所述测定混合物包含：(i)来自患有或被怀疑患有NAFLD的受试者的生物样品；和(ii)用于测定/测量样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平的一种或多种试剂。在一个实施方案中，生物样品是血液来源的样品，在进一步的实施方案中是血浆。在一个实施方案中，生物样品来自患有NAFLD的受试者。在另一个实施方案中，生物样品来自HIV感染的受试者。
在另一个方面中，本公开提供了一种系统，其用于(a)评估患者中NAFLD随时间推移的严重程度，和/或(b)评估受试者患有NAFLD的可能性，所述系统包括：(i)来自患有或怀疑患有NAFLD的受试者的生物样品；和(ii)用于测定/测量样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平的一种或多种测定。在一个实施方案中，生物样品是血液来源的样品，在进一步的实施方案中是血浆。在一个实施方案中，生物样品来自患有NAFLD的受试者。在另一个实施方案中，生物样品来自HIV感染的受试者。
在另一个方面中，本公开提供了一种系统，其用于(a)评估患者中NAFLD随时间推移的严重程度，和/或(b)评估受试者患有NAFLD的可能性，所述系统包括：样品分析仪，其配置成产生对应于受试者生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平的信号；和计算机子系统，其经编程以基于一个或多个蛋白质水平来计算所述信号是高于还是低于参照值。在各种实施方案中，所述系统还包括生物样品。在一个实施方案中，生物样品是血液来源的样品，在进一步的实施方案中是血浆。在一个实施方案中，生物样品来自患有NAFLD的受试者。在另一个实施方案中，生物样品来自HIV感染的受试者。
在另一个方面中，本公开涉及一种试剂盒，用于(a)评估患者中NAFLD随时间推移的严重程度，和/或(b)评估受试者患有NAFLD的可能性，所述试剂盒包含用于测量生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平的试剂；以及用于将VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平与NAFLD的严重程度和/或患有NAFLD的可能性相关联的说明书。
在一个实施方案中，测定混合物、系统和/或试剂盒中的试剂包含例如VEGFA、TGFB1和/或CSF1的配体(例如抗体或其片段)、溶液、缓冲液、核酸扩增试剂(例如DNA聚合酶、DNA聚合酶辅因子、dNTP)、核酸杂交/检测试剂，和/或用于检测抗原-抗体复合物的试剂等。在一个实施方案中，试剂包含针对VEGFA、TGFB1和/或CSF1中的至少两种的配体(例如，抗体或其片段)。在一个实施方案中，试剂包含针对以下的配体(例如，抗体或其片段)：(i)VEGFA和TGFB1；(ii)VEGFA和CSF1；(iii)TGFB1和CSF1；或(iv)VEGFA、TGFB1和CSF1。在一个实施方案中，测定混合物、系统和/或试剂盒包含阵列，所述阵列包含针对以下的配体(例如，抗体或其片段)：(i)VEGFA和TGFB1；(ii)VEGFA和CSF1；(iii)TGFB1和CSF1；或(iv)VEGFA、TGFB1和CSF1。
在一个实施方案中，根据本公开的试剂盒可以分成含有上述相应试剂组分的单独包装或隔室。
此外，这样的试剂盒可以任选地包含以下中的一种或多种：(1)使用试剂进行本文所述方法和/或用于解释所获得的结果的说明书；(2)一个或多个容器；和/或(3)适当的对照/标准。此类试剂盒可以包括用于从患者收集生物样品的试剂和用于处理生物样品的试剂。
试剂盒中包括的信息材料可以是与本文所述的方法和/或用于本文所述方法的试剂的用途相关的描述性、说明性、营销性或其他材料。例如，试剂盒的信息材料可以包含联系信息，例如物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码，试剂盒的用户可以从中获得关于进行本文所述的方法和解释结果的实质性信息。
本文描述的试剂盒还可以提供从蛋白质水平数据推断患者中NAFLD的严重程度和/或受试者患有NAFLD的可能性所需的软件。
在另一个方面中，提供了本文所述的试剂盒或测定混合物用于(a)评估患者中NAFLD随时间推移的严重程度，和/或(b)评估受试者患有NAFLD的可能性的用途。
实施本发明的方式
通过以下非限制性实施例进一步详细说明本公开。
实施例1：材料和方法
研究设计
一项随机、双盲试验，其中患有HIV相关NAFLD的个体被分配接受每天2mg的生长激素释放激素(GHRH)类似物替莫瑞林或相同的安慰剂，持续12个月(7)。利用来自该试验的血浆样本，当前研究显著建立在先前的纯转录组学分析(8)上以检查特定的蛋白质。研究了治疗组之间对应于响应替莫瑞林的途径中的顶端领头基因的蛋白质的循环水平的变化，并评估了这些蛋白质与组织学、放射成像学和转录组学指数的关系，以鉴定NAFLD/NASH的血浆标志物并阐明替莫瑞林响应的潜在机制。
登记了61名18-70岁的男性和女性，其已记录HIV感染和肝脏脂肪变性，如在1H-磁共振谱(1H-MRS)上肝脏脂肪分数≥5％所定义。参与者需要接受稳定的抗逆转录病毒疗法(ART)≥3个月，和CD4+T细胞计数>100个细胞/mm3且HIV病毒载量<400拷贝/mL。排除标准包括过量酒精使用(女性>20g每日或男性>30g每日)、活动性乙型肝炎或丙型肝炎、其他已知的肝病、肝硬化和控制不足的糖尿病(HbA1c≥7％)。参与者在2015年8月20日至2019年1月16日期间在马萨诸塞州总医院(MGH，Boston，MA)和国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD)登记。从每个参与者获得书面知情同意书。所有方法均根据指南和规定进行。
研究程序
母体临床试验的研究程序已在别处详细描述(7，9)。所有研究程序均在禁食状态下进行。简言之，进行肝脏1H-MRS以测量基线和12个月时的肝脏脂肪分数。在每个时间点也完成超声引导的经皮肝活检取样两个芯。将第一个芯固定在福尔马林中，并随后由对治疗不知情的单个病理学专家进行组织病理学审查(D.E.K.，National Institutes ofHealth)。根据非酒精性脂肪性肝炎临床研究网络评分系统(10)进行组织学评分，包括NAFLD活动度评分(NAS)和纤维化分期。将第二个芯置于RNA稳定试剂(Qiagen)中并储存在-80℃用于基因表达分析。在基线和12个月时收集血液样本并储存在-80℃。使用标准技术(Quest Laboratories)测量血清IGF-1。
肝转录组学评估
使用先前描述的方法(9)对肝组织进行RNA提取、cDNA文库构建和Illumina测序。为了鉴定在替莫瑞林和安慰剂治疗的参与者之间从治疗前时间点到治疗后时间点差异调节的通路，使用来自Broad Institute的桌面模块进行GSEA(www.broadinstitute.org/gsea/)。使用的基因集包括分子签名数据库(MsigDB)标志基因集集合(11)和与HCC预后有关的定制基因集(9)。GSEA领头基因是显著富集的基因集中的基因子集，其解释富集信号并用于随后定量通路基因表达。假发现率(FDR)<0.05的基因集被认为是富集的。
利用这种方法，先前发现了由替莫瑞林对比安慰剂差异调节的14种标志基因通路。在这方面，与氧化磷酸化有关的基因集随治疗而上调。此外，在替莫瑞林治疗的个体中，参与炎症、组织修复和细胞分裂的13个基因集下调(图1)。将RNA-seq数据提交给国家生物技术信息中心的基因表达综合库(登录号GSE150026)。
血浆蛋白质组学评估
对于该分析，使用多重邻近延伸测定(PEA)平台评估12个月内靶向的蛋白质的变化。PEA是一种基于亲和力的测定，其表征预定蛋白质组的丰度水平。每种蛋白质被独特的寡核苷酸标记的抗体对靶向。紧密接近时，寡核苷酸经历接近依赖性DNA聚合事件以形成PCR靶序列。所得的DNA序列在Fluidigm BioMarkTMHD实时PCR平台上使用标准实时PCR检测和定量。PEA给出log2标度上的归一化蛋白质表达(Normalized Protein eXpression,NPX)的蛋白质丰度水平。包括检测限和测定性能测量的测定特征可从制造商(Olink，Uppsala，Sweden)获得。由于方法学的精确度，特异性很高，这使得对随时间推移的变化的评估成为可能。在所利用的高多重组(下文)内的所有蛋白质中，平均测定内和测定间变化分别报告为8.3％和11.5％。
靶向的蛋白质组学分析
本研究的目的是描绘NAFLD中替莫瑞林效应的潜在响应通路，并确定可用于检测NAFLD患者中对替莫瑞林的治疗反应的蛋白质特征。为此，将发现与来自替莫瑞林应答基因集的顶端领头基因重叠的近100种蛋白质(Olink Immuno-Oncology；完整蛋白质列表参见www.olink.com)的高多重组内的所有血浆蛋白标记(8)。在该靶向的蛋白质组中，比较了治疗状态的血浆水平变化。然后相对于基线和纵向NAFLD严重程度的放射成像学、组织学和转录组学指数，检查被发现相对于安慰剂由替莫瑞林差异调节的蛋白质。作为纤维化分期的替代，利用源自显示与纤维化相关的18个基因的肝表达的基因水平纤维化评分(11)，其在当前样品中被验证为先前描述的组织学变化(8)。这些蛋白质水平的变化也与其相应的肝转录物水平的变化和血清IGF-1的变化相关。
连续变量表示为平均值±标准偏差，而分类变量表示为频率(％)。使用用于连续变量的双尾独立样本t检验和用于分类变量的卡方检验来比较组之间的差异。相关性用皮尔逊相关系数评估。P≤0.05的值是统计学显著性的预定阈值。使用JMP Pro 14(SASInstitute Inc.，Cary，North Carolina，USA)进行统计分析。
表1：研究的蛋白质与差异调节的基因集中的顶端领头基因的重叠
缩写：CASP8，半胱天冬酶8；CCL20，C-C基序趋化因子配体20；CRTAM，细胞毒性和调节性T细胞分子；CSF1，巨噬细胞集落刺激因子1；CXCL12，C-X-C基序趋化因子配体12；NCR1，天然细胞毒性触发受体1；TGFB1，转化生长因子β1；TNFRSF21，肿瘤坏死因子受体超家族成员21；VEGFA，血管内皮生长因子A。
实施例2：研究参与者的特征
在随机对照试验中的61名患有HIV相关NAFLD的参与者中，58名个体具有在基线处获得的可用于分析的血浆蛋白组。此外，这些个体中的44名(20名分配给替莫瑞林，24名分配给安慰剂)在12个月时重复血浆蛋白组。全部样品中每个治疗组的特征总结在表2中，并且先前已经描述(7)。就关键临床变量而言，替莫瑞林和安慰剂组是良好平衡的。简言之，参与者(53±7岁，79％男性)具有良好控制的17±9年的HIV感染。所有受试者接受稳定的ART，其中64％基于整合酶抑制剂的方案。通过肝脏1H-MRS测量，基线肝脏脂肪含量为14±8％。在初始肝活检中，总共33％和43％分别具有NASH和纤维化的组织学证据。
表2：基线人口统计学和临床特征
/>
对于上文所示的任何变量，在基线处，组之间没有统计学上显著的差异。
连续变量表示为平均值±标准偏差。
缩写：NASH，非酒精性脂肪性肝炎；NNRTI，非核苷逆转录酶抑制剂；NRTI，核苷逆转录酶抑制剂；PI，蛋白酶抑制剂。
实施例3：由替莫瑞林差异调节的血浆蛋白
九种血浆蛋白被鉴定为对应于由替莫瑞林调节的顶端领头基因(图1)。这些领头基因包含在与炎症、组织修复和细胞分裂有关的基因集中(表1)，相比于安慰剂，其通过用替莫瑞林治疗而下调。在这些蛋白质中，与安慰剂相比，用替莫瑞林治疗导致血浆VEGFA(log2-倍数变化-0.20±0.35vs.0.05±0.34，P＝0.02)、TGFB1(log2-倍数变化-0.35±0.56vs.-0.05±0.43，P＝0.05)和CSF1(log2-倍数变化-0.17±0.21vs.0.02±0.20，P＝0.004)的的减少(图2A-2C)。此外，用替莫瑞林血浆CCL20倾向于降低，尽管组间差异没有达到统计学显著性(log2-倍数变化-0.28±0.88vs.0.20±0.79，P＝0.06)。对比安慰剂，治疗对所有9种血浆蛋白的影响总结在表3中。
表3：替莫瑞林对比安慰剂对选择的血浆蛋白的影响
粗体文本表示P<0.05。数据表示为平均值(95％置信区间)或平均值±SD。
缩写：CASP8，半胱天冬酶8；CCL20，C-C基序趋化因子配体20；CRTAM，细胞毒性和调节性T细胞分子；CSF1，巨噬细胞集落刺激因子1；CXCL12，C-X-C基序趋化因子配体12；NCR1，天然细胞毒性触发受体1；TGFB1，转化生长因子β1；TNFRSF21，肿瘤坏死因子受体超家族成员21；VEGFA，血管内皮生长因子A。
实施例4：关键血浆蛋白与NAFLD表型的关联
鉴于它们通过替莫瑞林的差异调节，接下来研究了VEGFA、TGFB1和CSF1与NAFLD表型的关系(表4)。在基线处，在所有样品中，血浆CSF1水平与NAS评分(r＝0.38，P＝0.004)和基因水平纤维化评分(r＝0.37，P＝0.03)直接相关。相反，未发现VEGFA和TGFB1与这些参数中的任一个相关。此外，VEGFA、TGFB1或CSF1与肝脂肪分数没有基线关联。
表4：通过替莫瑞林下调的血浆蛋白与NAFLD严重程度的关系A)基线
B)纵向
在替莫瑞林治疗的分支内，血浆VEGFA(r＝0.62，P＝0.006)和CSF1(r＝0.50，P＝0.04)的减少与NAS评分的下降强烈相关(图3A、3B和表4)。此外，在替莫瑞林治疗的参与者中，TGFB1(r＝0.61，P＝0.009)和CSF1(r＝0.64，P＝0.006)的减少与基因水平纤维化评分的下降相关(图4A、4B)。未发现这3种血浆蛋白的变化与安慰剂治疗的参与者中NAS评分或基因水平纤维化评分的变化相关，或者与任一治疗组内肝脂肪分数的变化相关。
实施例5：关键血浆蛋白的变化与肝转录物水平和血清IGF-1的变化的关联
为了阐明血浆VEGFA、TGFB1和CSF1的调节，接下来研究了所有样品内它们与相应的肝转录物水平和血清IGF-1水平的关系。CSF1表现出血浆蛋白和肝转录物水平的变化之间的相关性(r＝0.50，P＝0.002)。另外，血清IGF-1的增加与CSF1的线性下降相关(r＝0.38，P＝0.01)。
尽管上文已经通过其具体实施例描述了本发明，但是在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的精神和性质的情况下，可以对其进行修改。在权利要求中，词语“包括”用作开放式术语，基本上等同于短语“包括但不限于”。单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括相应的复数指代，除非上下文另有明确规定。
参考文献
1.Maurice JB,Patel A,Scott AJ,Patel K,Thursz M,Lemoine M.Prevalenceand risk factors of nonalcoholic fatty liver disease in HIV-monoinfection.AIDS 2017；31:1621-1632.
2.Koethe JR,Jenkins CA,Lau B,Shepherd BE,Justice AC,Tate JP,BuchaczK,等Rising Obesity Prevalence and Weight Gain Among Adults StartingAntiretroviral Therapy in the United States and Canada.AIDS Res HumRetroviruses 2016；32:50-58.
3.Grant PM,Kitch D,McComsey GA,Collier AC,Bartali B,Koletar SL,Erlandson KM,等Long-term body composition changes in antiretroviral-treatedHIV-infected individuals.AIDS 2016；30:2805-2813.
4.Vodkin I,Valasek M,Bettencourt R,Cachay E,Loomba R.Clinical,biochemical and histological differences between HIV-associated NAFLD andprimary NAFLD:a case–control study.Alimentary pharmacology&therapeutics 2015；41:368-378.
5.Fourman LT,Stanley TL,Zheng I,Pan CS,Feldpausch MN,Purdy J,Aepfelbacher J,等Clinical Predictors of Liver Fibrosis Presence andProgression in HIV-Associated NAFLD.Clin Infect Dis 2020.
6.Wong VW,Singal AK.Emerging medical therapies for non-alcoholicfatty liver disease and for alcoholic hepatitis.Transl Gastroenterol Hepatol2019；4:53.
7.Stanley TL,Fourman LT,Feldpausch MN,Purdy J,Zheng I,Pan CS,Aepfelbacher J,等Effects of tesamorelin on non-alcoholic fatty liver diseasein HIV:a randomised,double-blind,multicentre trial.Lancet HIV 2019；6:e821-e830.
8.Fourman LT,Billingsley JM,Agyapong G,Ho Sui SJ,Feldpausch MN,PurdyJ,Zheng I,等Effects of tesamorelin on hepatic transcriptomic signatures inHIV-associated NAFLD.JCI Insight2020；5.
9.Kleiner DE,Brunt EM,Van Natta M,Behling C,Contos MJ,Cummings OW,Ferrell LD,等Design and validation of a histological scoring system fornonalcoholic fatty liver disease.Hepatology 2005；41:1313-1321.
10.Liberzon A,Birger C,Thorvaldsdottir H,Ghandi M,Mesirov JP,TamayoP.The Molecular Signatures Database(MSigDB)hallmark gene set collection.CellSyst 2015；1:417-425.
11.Hoang SA,Oseini A,Feaver RE,Cole BK,Asgharpour A,Vincent R,Siddiqui M,等Gene Expression Predicts Histological Severity and RevealsDistinct Molecular Profiles of Nonalcoholic Fatty Liver Disease.Sci Rep 2019；9:12541.
12.Kitade M,Yoshiji H,Kojima H,Ikenaka Y,Noguchi R,Kaji K,Yoshii J,等Neovascularization and oxidative stress in the progression of non-alcoholicsteatohepatitis.Mol Med Rep 2008；1:543-548.
13.Coulon S,Francque S,Colle I,Verrijken A,Blomme B,Heindryckx F,DeMunter S,等Evaluation of inflammatory and angiogenic factors in patients withnon-alcoholic fatty liver disease.Cytokine 2012；59:442-449.
14.Cayón A,Crespo J,Guerra AR,Pons-Romero F.[Gene expression in obesepatients with non-alcoholic steatohepatitis].Rev Esp Enferm Dig 2008；100:212-218.
15.Coulon S,Legry V,Heindryckx F,Van Steenkiste C,Casteleyn C,Olievier K,Libbrecht L,等Role of vascular endothelial growth factor in thepathophysiology of nonalcoholic steatohepatitis in two rodentmodels.Hepatology 2013；57:1793-1805.
16.Fabregat I,Moreno-Càceres J,Sánchez A,Dooley S,Dewidar B,GiannelliG,Ten Dijke P.TGF-βsignalling and liver disease.FEBS J 2016；283:2219-2232.
17.Yang L,Roh YS,Song J,Zhang B,Liu C,Loomba R,Seki E.Transforminggrowth factor beta signaling in hepatocytes participates in steatohepatitisthrough regulation of cell death and lipid metabolism in mice.Hepatology2014；59:483-495.
18.Cayón A,Crespo J,Mayorga M,Guerra A,Pons-Romero F.Increasedexpression of Ob-Rb and its relationship with the overexpression of TGF-beta1and the stage of fibrosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis.LiverInt 2006；26:1065-1071.
19.Hamilton,J.A.,Cook,A.D.&Tak,P.P.Anti-colony-stimulating factortherapies for inflammatory and autoimmune diseases.Nat.Rev.Drug Discov.16,53–70
20.Stutchfield BM,Antoine DJ,Mackinnon AC,Gow DJ,Bain CC,Hawley CA,Hughes MJ,等CSF1 Restores Innate Immunity After Liver Injury in Mice andSerum Levels Indicate Outcomes of Patients With Acute LiverFailure.Gastroenterology 2015；149:1896-1909e1814.21.Naito M,Hayashi S,YoshidaH,Nishikawa S,Shultz LD,Takahashi K.Abnormal differentiation of tissuemacrophage populations in'osteopetrosis'(op)mice defective in the productionof macrophage colony-stimulating factor.Am J Pathol 1991；139:657-667.
22.Radi ZA,Koza-Taylor PH,Bell RR,Obert LA,Runnels HA,Beebe JS,LawtonMP,等Increased serum enzyme levels associated with kupffer cell reductionwith no signs of hepatic or skeletal muscle injury.Am J Pathol 2011；179:240-247.
23.Tosello-Trampont AC,Landes SG,Nguyen V,Novobrantseva TI,HahnYS.Kuppfer cells trigger nonalcoholic steatohepatitis development in diet-induced mouse model through tumor necrosis factor-αproduction.J Biol Chem2012；287:40161-40172.
24.Li H,Zhou Y,Wang H,Zhang M,Qiu P,Zhang M,Zhang R,等CrosstalkBetween Liver Macrophages and Surrounding Cells in NonalcoholicSteatohepatitis.Front Immunol 2020；11:1169.25.Rosenfeld ME,-Herttuala S,Lipton BA,Ord VA,Witztum JL,Steinberg D.Macrophage colony-stimulating factormRNA and protein in atherosclerotic lesions of rabbits and humans.Am JPathol1992；140:291-300.
26.Sjaarda J,Gerstein H,Chong M,Yusuf S,Meyre D,Anand SS,Hess S,等Blood CSF1 and CXCL12 as Causal Mediators of Coronary Artery Disease.J AmColl Cardiol 2018；72:300-310.
序列表
<110> 综合医院公司
<120> 用于评估肝脏疾病的试剂盒、试剂和方法
<130> G11718-00419-SSS
<150> US 63/107,730
<151> 2020-10-30
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的GRF肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Tyr残基连接己烯酰基-反式-3部分
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> 酰胺化
<400> 1
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
35 40
<210> 2
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GRF肽
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Tyr或His
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Val或Ala
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> 变体
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Val或Ile
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Ala或Gly
<220>
<221> 变体
<222> (18)..(18)
<223> Xaa = Ser或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> (24)..(24)
<223> Xaa = Gln或His
<220>
<221> 变体
<222> (25)..(25)
<223> Xaa = Asp或Glu
<220>
<221> 变体
<222> (27)..(27)
<223> Xaa = Met或Ile或Nle
<220>
<221> 变体
<222> (28)..(28)
<223> Xaa = Ser或Asn
<220>
<221> 变体
<222> (30)..(30)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (31)..(31)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (33)..(33)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (34)..(34)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (35)..(35)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (36)..(36)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (37)..(37)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (38)..(38)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (39)..(39)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (40)..(40)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (41)..(41)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (43)..(43)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = 任何氨基酸或不存在
<400> 2
Xaa Xaa Asp Ala Ile Phe Tyr Xaa Ser Tyr Arg Lys Xaa Leu Xaa Gln
1 5 10 15
Leu Xaa Ala Arg Lys Leu Leu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对应于人GRF的位置30至44的氨基酸序列
<400> 3
Gln Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
1 5 10 15
<210> 4
<211> 44
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
35 40
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp
165 170 175
Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys
180 185 190
His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr
210 215 220
Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
225 230
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala
20 25
<210> 7
<211> 206
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gln Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys
115 120 125
Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg
130 135 140
Cys Cys Leu Met Pro Trp Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro
145 150 155 160
Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys
165 170 175
Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu
180 185 190
Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
195 200 205
<210> 8
<211> 390
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr
20 25 30
Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
35 40 45
Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser
50 55 60
Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu
85 90 95
Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu
100 105 110
Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr
115 120 125
His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val
130 135 140
Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu
145 150 155 160
Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn
165 170 175
Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser
180 185 190
Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu
195 200 205
Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr
225 230 235 240
Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro
245 250 255
Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser
275 280 285
Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys
290 295 300
Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn
305 310 315 320
Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr
325 330 335
Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala
340 345 350
Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr
355 360 365
Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val
370 375 380
Arg Ser Cys Lys Cys Ser
385 390
<210> 9
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly
20 25
<210> 10
<211> 249
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser
20 25 30
Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val
35 40 45
Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala
50 55 60
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr
65 70 75 80
Arg Val Leu Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys
85 90 95
Gln Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg
100 105 110
Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu
115 120 125
Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys
130 135 140
Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg
165 170 175
Gln Trp Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala
180 185 190
His Cys Ser Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn
195 200 205
Gly Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met
210 215 220
Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln
225 230 235 240
His Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg
245
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu
50 55 60
Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 12
<211> 554
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr
20 25 30
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu
35 40 45
Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln
50 55 60
Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr
85 90 95
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu
100 105 110
Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu
115 120 125
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln
130 135 140
Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu
145 150 155 160
Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala
165 170 175
Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu
180 185 190
Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His
195 200 205
Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu
210 215 220
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro
225 230 235 240
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser
245 250 255
Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser
260 265 270
Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn
275 280 285
Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val
290 295 300
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly
305 310 315 320
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu
325 330 335
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala
340 345 350
Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro
355 360 365
Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro
370 375 380
Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro
385 390 395 400
Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro
405 410 415
Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly
420 425 430
Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp
435 440 445
Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala
450 455 460
Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly
465 470 475 480
His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Phe Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser
485 490 495
Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val
500 505 510
Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro
515 520 525
Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr
530 535 540
Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val
545 550
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr
20 25 30
<210> 14
<211> 522
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu
1 5 10 15
Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln
20 25 30
Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys
35 40 45
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr
50 55 60
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu
65 70 75 80
Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu
85 90 95
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln
100 105 110
Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu
115 120 125
Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala
130 135 140
Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu
145 150 155 160
Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His
165 170 175
Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu
180 185 190
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro
195 200 205
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser
210 215 220
Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser
225 230 235 240
Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn
245 250 255
Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val
260 265 270
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly
275 280 285
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu
290 295 300
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala
305 310 315 320
Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro
325 330 335
Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro
340 345 350
Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro
355 360 365
Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro
370 375 380
Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly
385 390 395 400
Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp
405 410 415
Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala
420 425 430
Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly
435 440 445
His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Phe Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser
450 455 460
Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val
465 470 475 480
Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro
485 490 495
Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr
500 505 510
Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val
515 520

Claims (45)

1.一种用于评估患者非酒精性脂肪肝病(NAFLD)随时间推移的严重程度的方法，该方法包括
在第一时间点测量来自患者的生物样品中的血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和/或集落刺激因子1(CSF1)的第一蛋白质水平；
在第二较晚时间点测量来自患者的相应生物样品中的VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第二蛋白质水平；
其中在所述第一和第二时间点之间VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第二蛋白质水平相对于第一蛋白质水平的降低指示患者中NAFLD严重程度已随时间消退；
其中在所述第一和第二时间点之间VEGFA、TGFB1和/或CSF1的第二蛋白质水平相对于第一蛋白质水平的增加指示患者中NAFLD严重程度已随时间进展；和
其中在所述第一和第二时间点之间VEGFA、TGFB1和CSF1的第二蛋白质水平相对于第一蛋白质水平没有变化指示患者中NAFLD严重程度随时间推移是稳定的。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括测量VEGFA的蛋白质水平。
3.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括测量TGFB1的蛋白质水平。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述方法包括测量CSF1的蛋白质水平。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中NAFLD严重程度包括纤维化评分和/或NAFLD活动度评分(NAS)。
6.权利要求5的方法，其中NAFLD严重程度包括纤维化评分。
7.权利要求5或6的方法，其中NAFLD严重程度包括NAS。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中患者在所述第一时间点和所述第二时间点之间接受了针对NAFLD的治疗。
9.权利要求8的方法，其中治疗包括施用生长激素释放激素(GHRH)分子或其类似物。
10.权利要求9的方法，其中治疗包括施用反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)-NH2或其药学上可接受的盐。
11.权利要求1至10任一项的方法，其中生物样品是血液来源的样品。
12.权利要求11的方法，其中血液来源的样品是血浆。
13.权利要求1至12任一项的方法，其中测量VEGFA的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合VEGFA的抗体或其抗原结合片段接触，并测量VEGFA与抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
14.权利要求1至13任一项的方法，其中测量TGFB1的蛋白水平包括使生物样品与特异性结合TGFB1的抗体或其抗原结合片段接触，并测量TGFB1与抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
15.权利要求1至14任一项的方法，其中测量CSF1的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合CSF1的抗体或其抗原结合片段接触，并测量CSF1和抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
16.权利要求13至15任一项的方法，其中抗体或其抗原结合片段与可检测部分缀合。
17.权利要求1至16任一项的方法，其中所述患者患有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
18.一种用于评估受试者患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的可能性的方法，所述方法包括测量来自受试者的生物样品中的血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和/或集落刺激因子1(CSF1)的蛋白质水平，其中相对于相应的对照水平，样品中VEGFA、TGFB1和/或CSF1的水平较高指示受试者患有NAFLD的可能性增加。
19.权利要求18的方法，其中所述方法包括测量VEGFA的蛋白质水平。
20.权利要求18或19的方法，其中所述方法包括测量TGFB1的蛋白质水平。
21.权利要求18至20任一项的方法，其中所述方法包括测量CSF1的蛋白质水平。
22.权利要求18至21任一项的方法，其中NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
23.权利要求18至22任一项的方法，其中NAFLD包括肝纤维化。
24.权利要求18至23任一项的方法，其中生物样品是血液来源的样品。
25.权利要求23的方法，其中血液来源的样品是血浆。
26.权利要求18至25任一项的方法，其中测量VEGFA的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合VEGFA的抗体或其抗原结合片段接触，并测量VEGFA与抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
27.权利要求18至26任一项的方法，其中测量TGFB1的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合TGFB1的抗体或其抗原结合片段接触，并测量TGFB1与抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
28.权利要求18至27任一项的方法，其中测量CSF1的蛋白质水平包括使生物样品与特异性结合CSF1的抗体或其抗原结合片段接触，并测量CSF1和抗体或其抗原结合片段之间的复合物的量。
29.权利要求26至28任一项的方法，其中抗体或其抗原结合片段与可检测部分缀合。
30.权利要求18至29任一项的方法，其中所述方法在来自被怀疑患有NAFLD的受试者的生物样品上进行。
31.权利要求30的方法，其中受试者具有升高水平的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST)。
32.权利要求18至31任一项的方法，其中所述受试者患有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
33.一种用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的方法，所述方法包括使用权利要求18至32任一项的方法鉴定患有NAFLD的可能性增加的受试者，并向受试者施用针对NAFLD的治疗。
34.权利要求33的方法，其中治疗包括施用生长激素释放激素(GHRH)或其类似物。
35.权利要求34的方法，其中治疗包括施用反式-3-己烯酰基-GHRH(1-44)-NH2或其药学上可接受的盐。
36.一种试剂盒，其用于(a)评估患者中非酒精性脂肪肝病(NAFLD)随时间推移的严重程度，和/或(b)评估受试者患有NAFLD的可能性，所述试剂盒包含用于测量生物样品中血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和/或集落刺激因子1(CSF1)的蛋白质水平的试剂；以及用于将VEGFA、TGFB1和/或CSF1的蛋白质水平与NAFLD的严重程度和/或患有NAFLD的可能性相关联的说明书。
37.权利要求36的试剂盒，其中所述试剂盒包含(i)特异性结合VEGFA的抗体或其抗原结合片段，(ii)特异性结合TGFB1的抗体或其抗原结合片段；(iii)特异性结合CSF1的抗体或其抗原结合片段；或(iv)(i)至(iii)的任何组合。
38.权利要求37的试剂盒，其中抗体或其抗原结合片段与可检测部分缀合。
39.一种测定混合物，其包含(a)用于测量生物样品中血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)和/或集落刺激因子1(CSF1)的蛋白质水平的试剂；和(b)来自患有或怀疑患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的受试者的生物样品。
40.权利要求39的测定混合物，其中测定混合物包含(i)特异性结合VEGFA的抗体或其抗原结合片段，(ii)特异性结合TGFB1的抗体或其抗原结合片段；(iii)特异性结合CSF1的抗体或其抗原结合片段；或(iv)(i)至(iii)的任何组合。
41.权利要求40的测定混合物，其中测定混合物包含(i)至(iii)的任何组合。
42.权利要求40或41的测定混合物，其中抗体或其抗原结合片段与可检测部分缀合。
43.权利要求39至42任一项的测定混合物，其中生物样品是血液来源的样品。
44.权利要求43的测定混合物，其中血液来源的样品是血浆。
45.权利要求39至44任一项的测定混合物，其中生物样品来自患有NAFLD的受试者。
CN202180088535.7A 2020-10-30 2021-10-26 用于评估肝脏疾病的试剂盒、试剂和方法 Pending CN116801788A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063107730P 2020-10-30 2020-10-30
US63/107,730 2020-10-30
PCT/US2021/056568 WO2022093757A1 (en) 2020-10-30 2021-10-26 Kits, reagents and methods for the assessment of liver diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116801788A true CN116801788A (zh) 2023-09-22

Family

ID=81383186

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180088535.7A Pending CN116801788A (zh) 2020-10-30 2021-10-26 用于评估肝脏疾病的试剂盒、试剂和方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230393148A1 (zh)
EP (1) EP4236768A1 (zh)
JP (1) JP2023548156A (zh)
KR (1) KR20230097095A (zh)
CN (1) CN116801788A (zh)
CA (1) CA3196736A1 (zh)
WO (1) WO2022093757A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3133319A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 The General Hospital Corporation Ghrh or analogues thereof for use in treatment of hepatic disease
GB202216449D0 (en) * 2022-11-04 2022-12-21 Io Biotech Aps TGF-BETA1 vaccine

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012315784A1 (en) * 2011-09-28 2013-05-16 Wellstat Diagnostics, Llc Assay panel for non-alcoholic steatohepatitis
BR122019026188B1 (pt) * 2013-03-15 2024-01-02 Somalogic Operating Co., Inc Métodos para determinar se um indivíduo com esteatose não alcoólica tem esteato-hepatite não alcoólica e para monitorar um indivíduo com esteatose não alcoólica para o desenvolvimento de nash
WO2017040407A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-09 Nusirt Sciences, Inc. Compositions and methods for the reduction or prevention of non-alcoholic steatohepatitis (nash)
US11371098B2 (en) * 2015-09-14 2022-06-28 Genfit Methods for diagnosing and evaluating non-alcoholic steatohepatitis

Also Published As

Publication number Publication date
US20230393148A1 (en) 2023-12-07
KR20230097095A (ko) 2023-06-30
CA3196736A1 (en) 2022-05-05
JP2023548156A (ja) 2023-11-15
WO2022093757A1 (en) 2022-05-05
EP4236768A1 (en) 2023-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7981627B2 (en) Methods for diagnosing and monitoring liver diseases
AU2007248483A1 (en) Methods for diagnosing and predicting non-alcoholic steatohepatitis (NASH)
JP6717428B2 (ja) カリウムチャネル蛋白質を用いた癌診断用組成物
US20230393148A1 (en) Kits, reagents and methods for the assessment of liver diseases
US20130017206A1 (en) Mcam modulation and uses thereof
JP5773315B2 (ja) 膵癌のバイオマーカーとしてのｃｘｃｌ４ｌ１
JP6847972B2 (ja) 大腸がん診断用組成物と診断マーカー検出方法
US20050074805A1 (en) Specific markers for diabetes
CN110678757B (zh) 诊断或监测肾功能或诊断肾功能障碍的方法
KR20090053222A (ko) 체액 내 대장암 마커로서의 ｃｘｃｌ－１６유전자 및 이를이용한 대장암의 진단 및 치료에의 용도
WO2022022541A1 (zh) Rbm10基因的用途
EP1701166B1 (en) Phosphorylated SP1 as a marker in diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis (nash) and target in drug screening for nash
ES2297953B1 (es) Metodos in vitro para la deteccion de un carcinoma, determinacion de su estadio o severidad y para la determinacion de su desarrollo.
ES2339125T3 (es) Sp1 fosforilado como marcador en el diagnostico de esteatohepatitis no alcoholica (ehna) y diana en el cribado de farmacos para ehna.
KR101516716B1 (ko) 간 섬유화 진단용 바이오마커 rorc
KR101515210B1 (ko) 간 섬유화 진단용 바이오마커 elk3
KR20200083371A (ko) 뇌수막염 진단을 위한 정보제공방법
ES2299281B1 (es) Metodos para el diagnostico in vitro y pronostico in vitro del cancer de pancreas, y para el desarrollo de farmacos contra el cancer de pancreas.
US20230288399A1 (en) Method for screening colorectal cancer metastasis inhibitor
US7674578B2 (en) Methods of using sIP-10 to assess HCV clearance and/or response to interferon therapy
KR101906657B1 (ko) 위암 예후 예측용 바이오 마커 조성물
EP1526381A1 (en) Methods for in vitro diagnosis and in vitro prognosis of cancer of the pancreas and for the development of drugs against cancer of the pancreas
Yamasaki et al. Agglutinin-Positive Human Mac-2 Binding Protein Predict the Development of Hepatocellular Carcinoma in Hepatitis C Patients
US20140256735A1 (en) Method for assessing a liver of a patient having a chronic hepatitis b virus infection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination