ES2297953B1 - Metodos in vitro para la deteccion de un carcinoma, determinacion de su estadio o severidad y para la determinacion de su desarrollo. - Google Patents
Metodos in vitro para la deteccion de un carcinoma, determinacion de su estadio o severidad y para la determinacion de su desarrollo. Download PDFInfo
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Abstract
Métodos in vitro para la detección de un
carcinoma, determinación de su estadio o severidad y para la
determinación de su desarrollo.
La presente invención se refiere a un método
in vitro para detectar la presencia de carcinomas en un
individuo, para determinar el estadio, la malignidad, o la
severidad de dicho carcinoma en el individuo, o para monitorizar el
efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho
carcinoma; a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación
de la eficacia de compuestos para terapia de dicho carcinoma con el
fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como a agentes que
inducen la expresión y/o la actividad de la proteína
Plexina-B1, o a agentes que inhiben los efectos de
la represión de la expresión y/o actividad de la proteína
Plexina-B1.
Description
Métodos in vitro para la detección de un
carcinoma, determinación de su estadio o severidad y para la
determinación de su desarrollo.
La presente invención se refiere a un método
in vitro para detectar la presencia de carcinomas en un
individuo, para determinar el estadio, la malignidad, o la
severidad de dicho carcinoma en el individuo, o para monitorizar el
efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho
carcinoma; a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación
de la eficacia de compuestos para terapia de dicho carcinoma con el
fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como a agentes que
inducen la expresión y/o la actividad de la proteína
Plexina-B1, o a agentes que inhiben los efectos de
la represión de la expresión y/o actividad de la proteína
Plexina-B1.
A pesar de todos los avances que se han
producido en los últimos años, el cáncer es todavía una de las
principales causas de muerte en todo el mundo. Más de 5 millones de
nuevos casos de cáncer se diagnostican cada año en el mundo y más
de 3.5 millones de muertes están causadas por los distintos tipos de
cáncer, según datos de la Agencia Internacional para la
Investigación del Cáncer, GLOBOCAN, del año 2000.
Las neoplasias renales son tumores frecuentes en
las sociedades occidentales; representan el 2% de todos los casos
de cáncer. Según datos de la Agencia Internacional para la
Investigación del Cáncer, GLOBOCAN, del año 2000, cada año se
diagnostican más de 90.000 nuevos casos en Europa, 9.000 en Japón y
30.000 en América del Norte; más de 39.000, 4.000 y 12.000 muertes
son causadas por el carcinoma renal cada año en Europa, Japón y
América del Norte, respectivamente; y la mortalidad a escala mundial
causada por el carcinoma renal supera los 100.000 casos
anuales.
Avances en el conocimiento de la Genética del
cáncer han permitido la clasificación de distintos tipos de tumores
renales. El subtipo más común es el carcinoma convencional de
células renales, que es diferente de los subtipos papilar,
cromófobo o ductal colector. El oncocitoma renal es una neoplasia
benigna, indistinguible en ocasiones del carcinoma renal, que es
una neoplasia maligna. Estudios previos han demostrado que todos
estos subtipos histológicos son distintos genética y
biológicamente, y que tanto su morfología como comportamiento están
determinados por factor moleculares distintivos (Kovacs G., et
al., J. Pathol., 1997, 183:131-133).
En la actualidad, los sistemas de diagnóstico
del cáncer renal están basados en la identificación de síntomas
clínicos y en técnicas radiológicas. Los síntomas más comunes son
hematuria (en el 50-60% de los pacientes), dolor
abdominal (en el 40% de los pacientes) y una masa palpable en el
flanco del abdomen (en el 30-40% de los pacientes)
(Ritchie A.W.S. and Chisholm G.D., Semin. Oncol., 1983,
10:390-400). La combinación simultánea de estos
síntomas ("triada clásica") se produce en menos del 10% de los
pacientes. Tumores pequeños, localizados, raramente producen
síntomas, retrasando el diagnóstico a estadios avanzados. El 25% de
los tumores se diagnostican por tomografía computerizada y
ultrasonografía (Porena M., et al., J. Clin.
Ultrasound,1992, 20:395-400; Konnack J.W. and
Grossman H.B., J. Urol., 1985, 134:1094-1096;
Thompson I.M. and Peek M., J. Urol., 1988,
140:487-490); los tumores diagnosticados con estas
técnicas son normalmente más pequeños que los que producen síntomas
y son más fácilmente resecables para conseguir la curación (Konnack
J.W. and Grossman H.B., J. Urol., 1985,
134:1094-1096; Thompson I.M. and Peek M., J. Urol.,
1988, 140:487-490; Smith S.J., et al.,
Radiology, 1989, 170:699-703).
La alteración de los niveles de expresión génica
está estrechamente relacionada con el crecimiento celular
descontrolado y con procesos de des-diferenciación,
hechos comunes a todos los tipos de cáncer. Los niveles de
expresión de los denominados "genes supresores de tumores", que
actúan para evitar el crecimiento celular maligno, están reprimidos
en las células tumorales; y los niveles de expresión de los
denominados "oncogenes", que actúan para inducir el
crecimiento maligno, están aumentados en las células tumorales.
Se han asociado muchos genes al desarrollado al
desarrollo del cáncer renal, como el gen de von
Hippel-Lindau (Seizinger B.R., et al.,
Nature, 1988, 332:268-269), el gen del receptor del
factor de crecimiento epidérmico (Ishikawa J., et al., Int.
J. Cancer, 1990, 45:1018-1021), el gen de
transformación del factor de crecimiento alfa (Lager D.J., et
al., Mod. Pathol., 1994, 7:544), el oncogen
c-myc (Yao M., et al., Cancer Res., 1988,
48:6753-6757), genes del metabolismo retinoide (Guo
X., et al., Cancer Res., 2001, 61:2774-2781),
o genes de factores de adhesión celular (Kuroiwa, K., et
al., J. Surg. Oncol., 2001, 77:123-131). Sin
embargo, muchos de los genes implicados en el inicio y la
progresión de los tumores renales son todavía desconocidos.
Actualmente no existe ningún método no invasivo
in vitro que detecte, con niveles aceptables de sensibilidad
y especificidad, los tumores renales; un método no invasivo con
alta sensibilidad y especificidad permitiría la realización
rutinaria de análisis clínicos para la detección de estos tumores.
La identificación de genes expresados diferencialmente en
carcinomas renales, podría permitir la identificación de marcadores
biológicos, que podrían tener un alto valor para el diagnóstico
in vitro, el pronóstico in vitro y el tratamiento de
esta enfermedad (Boer J.M., et al., Genome Res., 2001,
11:1861-1870). La detección de cambios en el nivel
de expresión génica o en la concentración de las proteínas
codificadas, en fluidos corporales, podría ser la base de métodos
no invasivos de diagnóstico in vitro del cáncer renal.
Una vez que al paciente se le ha diagnosticado
un cáncer renal, la resección quirúrgica es el tratamiento de
elección. La nefrectomía radical, que incluye resección del riñón,
grasa perirenal y la glándula adrenal ipsilateral, ha sido
generalmente realizada desde los años 60 (Robson C.J., et
al., J. Urol, 1969, 101:297-301). La cirugía
"nephron-sparing" se ha utilizado para tratar
tumores pequeños localizados (Herr H.W., Cancer, 1994,
73:160-162). El parámetro más importante para
predecir la supervivencia es la extensión anatómica del tumor. Los
pacientes con tumores pequeños, localizados, que son resecados
completamente, tienen unos índices de supervivencia mayores que
aquellos con afectación nodal o con metástasis distal. El
20-30% de los pacientes con tumores localizados se
curan tras la nefrectomía radical; menos de un 5% sufren recidivas
locales y un 50-60% de los pacientes desarrollan
metástasis a distancia (Rabinovitch R.A., et al., J. Clin.
Oncol., 1994, 12:206-212; Sandock, D.S., et
al., J. Urol, 1995, 154:28-31). Una vez que la
metástasis se desarrolla, el pronóstico de supervivencia a largo
plazo empeora significativamente; actualmente el 30% de los
pacientes que se diagnostican ya se encuentran en un estadio IV, es
decir, han desarrollado metástasis a distancia.
El tratamiento del carcinoma renal es
extremadamente difícil por su capacidad de extenderse sin producir
síntomas, por su inherente resistencia a la quimioterapia sistémica
convencional y por la incapacidad de la radioterapia para reducir
los niveles de recaída tras la nefrectomía, incluso en pacientes con
afectación nodal o tumores no resecados completamente (Kjaer M.,
et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1987,
13:665-672). Casi el 50% de los pacientes, y el
90-95% de los pacientes con metástasis a distancia,
mueren durante los 5 años posteriores al diagnóstico. Frente a esta
realidad, estudios de Genética Molecular están facilitando el
conocimiento de la patogénesis de esta enfermedad y pueden
proporcionar nuevas dianas contra las que desarrollar nuevos agentes
terapéuticos que sean más eficaces que los disponibles en la
actualidad.
La familia de proteínas denominadas Plexinas
esta compuesta por varios proteínas con dominios transmembrana
citoplasmática celular; las Plexinas actúan como receptores de las
proteínas de la familia de las Semaforinas, aunque también se han
encontrado expresadas en tejidos extraneuronales con otras funciones
moleculares. La Plexina-B1 actúa como receptor de
la Semaforina III, que es una proteína que causa el colapso del
crecimiento conal de las neuronas y la repulsión química de los
axones (Driessens M.H., Olivo C., Nagata K., Inagaki, M., Collard
J.G., FEBS lett., 2002, 529:168-172). A día de hoy,
no se ha demostrado que las Plexinas jueguen un papel en el proceso
de carcinogénesis; sin embargo se ha demostrado que existe un
patrón complejo y dinámico de interacción entre Plexinas y pequeñas
proteínas rho guanosin trifosfatasas (Castellani V., et al.,
Curr. Opin. Neurobiol., 2002, 12:532). Estas
Rho-GTPasas tienen una función en el reordenamiento
del citoesqueleto y están implicadas en procesos de adhesión y
migración celular; de hecho, la activación de la proteína Rac, uno
de los miembros de esta familia, se ha asociado con procesos de
inducción de la migración celular y el desarrollo de un fenotipo de
invasión tumoral (Keely, et al.,1997. Nature 390,
632-637; Sander, et al., J. Cell Biol., 1998,
143:1385-1398). Por otro lado la quinasa activada
por la proteína p21 (PAK) es el factor activador de Rac y compite
con la Plexina-B1 por unirse a Rac; esta interacción
es bidireccional, ya que la interacción Plexina-B1
- Rac inhibe la activación de PAK (Vikis H.G., Li W., and Guan K.L.
Genes Dev., 2002, 16:836-845; Vikis H.G., Li W., and
Guan K.L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002,
99:12085-12090). Se ha descrito también, utilizando
DNA-chips, que el gen
plexina-B1 era uno de los 213 genes que
presentaban una expresión reducida en muestras de carcinomas de
células renales, al compararlas con muestras de riñón sano (Gieseg
M.A., Cody T., Man M.Z., Madore S.J., Rubin M.A., and Kalfjian
E.P., BMC Bioinformatics, 2002, 3:26); pero no demostraban los
autores de este trabajo, que los niveles diferenciales de expresión
génica de la Plexina-B1 se mantuviesen al analizar
las muestras por métodos más sensibles, específicos y fiables que
los DNA-chips, como por ejemplo
RT-PCR cuantitativa; ni demostraban que los niveles
diferenciales de expresión génica se tradujesen en niveles
diferenciales de expresión proteica.
En concordancia con esta hipotética función de
la Plexina-B1, los autores de la presente invención
han descubierto, tras laboriosa investigación y empleando
diferentes técnicas (DNA-chips y PCR cuantitativa
para medir los niveles de expresión génica y
Western-blot para medir los niveles de expresión
proteica), que sorprendentemente la expresión del gen
plexina-B1 se ve reducida en carcinomas de
riñón, siendo la reducción proporcional a la malignidad y a la
invasividad. Más sorprendentemente, los autores de la presente
invención han descubierto que también la concentración de la
proteína Plexina-B1 se ve disminuida en carcinomas
de riñón.
La presente invención proporciona por tanto un
método in vitro para detectar la presencia de un carcinoma
en un individuo, para determinar el estadio o la severidad de dicho
carcinoma en el individuo, o para monitorizar el efecto de la
terapia administrada a un individuo que presente dicho carcinoma,
basado en la detección y/o cuantificación de la proteína
Plexina-B1, del mRNA del gen
plexina-B1 o el correspondiente cDNA en una
muestra de dicho individuo.
La presente invención tiene como objeto
principal proporcionar un método para detectar la presencia de un
carcinoma en un individuo, para determinar el estadio o la
severidad de dicho carcinoma en el individuo, o para monitorizar el
efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho
carcinoma, basado en la detección y/o cuantificación de la proteína
Plexina-B1, del inRNA del gen
plexina-B1 o el correspondiente cDNA en una
muestra de dicho individuo. El carcinoma a detectar es
preferiblemente un carcinoma de riñón.
Otro objeto de la presente invención es un
método in vitro para buscar, identificar, desarrollar y
evaluar la eficacia de compuestos para la terapia del cáncer;
preferiblemente del cáncer de riñón.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Un objeto adicional de la invención reside en el
uso de secuencias derivadas del gen
plexina-B1 en métodos de búsqueda,
identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de
compuestos para terapia del cáncer; en particular para terapia del
cáncer de riñón.
Otro objeto de la presente invención consiste en
proporcionar agentes caracterizados porque inducen la expresión y/o
la actividad de la proteína Plexina-B1, o porque
inhiben los efectos carcinogénicos de la represión de la expresión
de la proteína Plexina-B1, para el tratamiento del
cáncer; en particular del cáncer de riñón.
Por último, es también objeto de la invención
una composición farmacéutica que comprenda uno o varios agentes
terapéuticos junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable,
para el tratamiento del cáncer; en particular del cáncer de
riñón.
Figura 1: Niveles diferenciales de expresión
del gen plexina-B1, por RT-PCR
cuantitativa en tiempo real, en muestras procedentes de biopsias de
riñón de individuos afectados por distintos tipos de carcinomas
renales. Las barras representan el nivel de expresión del gen
plexina-B1 frente al nivel de expresión del
gen gadph (gen de referencia) en cada una de las muestras tumorales
y no tumorales.
Para facilitar la comprensión de la presente
solicitud de patente, exponemos a continuación el significado de
algunos términos y expresiones en el contexto de la invención:
Los términos "sujeto" o "individuo" se
refieren a miembros de especies de animales mamíferos, e incluye,
pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el
sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de
cualquier edad o raza.
El término "cáncer o carcinoma" se refiere
a la enfermedad que se caracteriza por una proliferación
descontrolada de células anormales capaces de invadir tejidos
adyacentes y diseminarse a órganos lejanos.
El término "cáncer de riñón" refiere a
cualquier desorden proliferativo maligno de células del riñón.
El término "tumor" se refiere a cualquier
masa anormal de tejido producto de un proceso neoplásico, benigno
(no canceroso) o maligno (canceroso).
El término "gen" se refiere a una cadena
molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína.
El término "DNA" se refiere al ácido
desoxirribonucleico. Una secuencia de DNA es una secuencia de
desoxirribonucleótidos.
El término "cDNA" se refiere a una
secuencia de nucleótidos, complementaria de una secuencia de
mRNA.
El término "RNA" se refiere al ácido
ribonucleico. Una secuencia de RNA es una secuencia de
ribonucleótidos.
El término "mRNA" se refiere al ácido
ribonucleico mensajero, que es la fracción del RNA total que se
traduce a proteínas.
La frase "mRNA transcrito de" se refiere a
la transcripción del gen (DNA) en mRNA, como primer paso para que
el gen se exprese y traduzca a proteína.
El término "secuencia de nucleótidos" o
"secuencia nucleotídica" se refiere indistintamente a una
secuencia de ribonucleótidos (RNA) o de desoxirribonucleótidos
(DNA).
El término "proteína" se refiere a una
cadena molecular de aminoácidos, con una actividad biológica.
El gen "plexina-B1"
corresponde al gen denominado "plexina-B1" en
inglés y presenta el número de código de GeneBank ACCB007867.
Los términos "péptido" y "polipéptido"
se refieren a un fragmento proteico. Los términos "proteína" y
"péptido", se usan indistintamente.
La frase "expresión reducida" significa que
los niveles medidos del gen o de la proteína en pacientes de
cáncer, son inferiores a los niveles medidos en una población
control de sujetos sin historial de cáncer.
El término "sensibilidad" se refiere a la
detección de falsos negativos (diagnóstico negativo de cáncer,
cuando el paciente está afectado de cáncer); una sensibilidad del
100% significa que no hay falsos negativos.
El término "especificidad" se refiere a la
detección de falsos positivos (diagnóstico positivo de cáncer,
cuando el paciente no está afectado de cáncer); una especificidad
del 100% significa que no hay falsos positivos.
\global\parskip0.870000\baselineskip
El término "anticuerpo" se refiere a una
glucoproteína que exhibe una actividad de unión específica por una
proteína particular, a la que se denomina "antígeno". El
término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o
anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos; e incluye
anticuerpos humanos, humanizados y de origen no humano. Los
"anticuerpos monoclonales" son poblaciones homogéneas de
anticuerpos, altamente específicos, que están dirigidas contra un
único sitio o "determinante" antigénico. Los "anticuerpos
policlonales" incluyen poblaciones heterogéneas de anticuerpos,
que están dirigidos contra diferentes determinantes
antigénicos.
El término "epítopo", tal como se utiliza
en la presente invención, se refiere a un determinante antigénico
de una proteína, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína
que un anticuerpo específico reconoce.
El término "fase sólida", tal como se
utiliza en la presente invención, se refiere a una matriz no acuosa
a la que se puede unir el anticuerpo. Ejemplos de materiales para
fase sólida incluyen vidrio, polisacáridos, por ejemplo agarosa,
poliacrilamida, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas.
Ejemplos de formas de fase sólida son el pocillo de una placa de
ensayo o una columna de purificación.
El término "oligonucleótido cebador", tal
como se utiliza en la presente invención, se refiere a una
secuencia nucleotidica, que es complementaria de una secuencia
nucleotidica del gen plexina-B1. Cada cebador
hibrida con su secuencia nucleotidica diana y actúa como un sitio
de inicio para la polimerización del DNA.
El término "sonda", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a una secuencia nucleotídica
complementaria de una secuencia nucleotidica derivada del gen
plexina-B1, que se puede utilizar para
detectar esa secuencia nucleotídica derivada del gen
plexina-B1.
El término "diana terapéutica" se refiere a
secuencias nucleotídicas o peptidicas, contra las que se puede
diseñar y aplicar clínicamente un fármaco o compuesto
terapéutico.
El término "agonista" se refiere a
cualquier molécula que mimetice la actividad biológica de la
molécula agonizada. Ejemplos de moléculas agonistas incluyen, entre
otros, proteínas, péptidos, variaciones de secuencia de péptidos
naturales y pequeñas moléculas orgánicas (de peso molecular inferior
a 500 daltons).
El término "vector de expresión
recombinante" se refiere a un replicón al que está ligada otra
secuencia de nucleótidos, para que esta otra secuencia pueda ser
transportada, introducida y expresada en el interior de las
células.
El término "replicón" se refiere a una
secuencia de nucleótidos que es capaz de autoreplicarse en el
interior de las células.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que tanto la expresión génica del gen
plexina-B1, como la concentración de la
proteína Plexina-B1 se ven reprimidas con el
desarrollo de un cáncer; especialmente en los cánceres de riñón.
En este sentido, la presente invención
proporciona, en primer lugar, un método in vitro para
detectar la presencia de un carcinoma en un individuo, para
determinar el estadio o la severidad de dicho carcinoma en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada
a un individuo que presente dicho carcinoma, que comprende:
- a)
- la detección y/o cuantificación de la proteína Plexina-B1, del mRNA del gen plexina-B1 o el correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
- b)
- la comparación de la cantidad de proteína Plexina-B1, de la cantidad de mRNA del gen plexina-B1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra de un individuo; con la cantidad de proteína Plexina-B1, con la cantidad del mRNA del gen plexina B1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en las muestras de individuos control o en muestras anteriores del mismo individuo o con los valores normales de referencia.
El método proporcionado por la presente
invención es de alta sensibilidad y especificidad, y se basa en que
sujetos o individuos diagnosticados de cáncer, en particular de
cáncer de riñón, presentan niveles bajos de mRNA transcrito del gen
plexina-B1, niveles reducidos de expresión del gen
plexina-B1, o concentraciones disminuidas de
la proteína codificada por el gen plexina-B1
(proteína Plexina-B1), en comparación con los
correspondientes niveles en muestras procedentes de sujetos sin
historial clínico de cáncer, como por ejemplo cáncer de riñón.
El presente método comprende una etapa de
obtención de la muestra del individuo. Se puede trabajar con
distintas muestras fluidas como, por ejemplo: orina, sangre,
plasma, suero, líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial,
bilis, semen o líquido cefalorraquídeo. La muestra también puede
ser un tejido, como por ejemplo tejido de riñón, que se puede
obtener por cualquier método convencional.
Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos
previamente diagnosticados, o no diagnosticados, de cáncer, como
por ejemplo cáncer de riñón; o también de un sujeto en tratamiento,
o que ha sido tratado previamente contra el cáncer, especialmente
contra el cáncer de riñón.
El presente método comprende además una etapa de
extracción de la muestra, ya sea para obtener el extracto de
proteínas de ésta, o bien para obtener el extracto de RNA total.
Uno de estos dos extractos representa el material de trabajo para
la siguiente fase. Los protocolos de extracción de la proteína total
o del RNA total son bien conocidos por el experto en la materia
(Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156;
Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532).
Cualquier ensayo convencional se puede utilizar
en el marco de la invención para detectar cáncer, especialmente el
cáncer de riñón, siempre que midan in vitro los niveles de
mRNA transcrito del gen plexina-B1 o su cDNA
complementario, o la concentración de proteína
Plexina-B1, en muestras recogidas de los individuos
a analizar y de individuos control.
En el caso de que lo que se pretenda detectar
sea la proteína, concretamente la proteína
Plexina-B1, el método de la invención comprende una
primera etapa de puesta en contacto del extracto de proteínas de la
muestra con una composición de uno o más anticuerpos específicos
contra uno o más epítopos de la proteína Plexina- B1, y una segunda
etapa de cuantificación de los complejos formados por anticuerpos y
la proteína Plexina-B1.
Existe una amplia variedad de ensayos
inmunológicos disponibles para detectar y cuantificar la formación
de complejos específicos antígeno-anticuerpo;
numerosos ensayos de unión de proteínas, competitivos y no
competitivos, han sido previamente descritos, y un gran número de
estos ensayos está disponible comercialmente.
Así, la proteína Plexina-B1 se
puede cuantificar con anticuerpos como, por ejemplo: anticuerpos
monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos recombinantes de
ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos,
específicos contra la proteína Plexina-B1; siendo
estos anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano.
Existen anticuerpos que se unen específicamente a la proteína
Plexina-B1, que están disponibles comercialmente.
Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar
marcados o no; los anticuerpos no marcados se pueden utilizar en
ensayos de aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden
utilizar en una amplia variedad de ensayos. Las moléculas
marcadoras que se pueden utilizar para marcar los anticuerpos
incluyen radionucleótidos, enzimas, fluoróforos, reactivos
quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores,
inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes y derivados.
Existe una amplia variedad de ensayos bien
conocidos, que se pueden utilizar en la presente invención, que
utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y
anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas
se incluyen el Western-blot o transferencia
Western, ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o
ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima), RIA (Radioimnunoassay o
Radioinmunoensayo), EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay
o Inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA
(Double antibody sándwich-ELISA o ensayo ELISA
sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e
inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o
microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o
ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como
dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar la proteína
Plexina-B1, incluyen técnicas de cromatografía de
afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a
lectina.
El inmunoensayo preferido en el método de la
invención es un ensayo ELISA sándwich con doble anticuerpo. En este
inmunoensayo se puede utilizar cualquier anticuerpo o combinación
de anticuerpos, específicos contra uno o más epítopos de la
proteína Plexina-B1. Como ejemplo de uno de los
muchos posibles formatos de este ensayo, un anticuerpo, monoclonal
o policlonal, o un fragmento de este anticuerpo, o una combinación
de anticuerpos, que recubren una fase sólida, se ponen en contacto
con la muestra a analizar, y se incuban durante un tiempo y en
condiciones apropiados para formar los complejos
antígeno-anticuerpo. Después de un lavado en
condiciones apropiadas para eliminar los complejos no específicos,
se incuba con los complejos antígeno-anticuerpo, en
condiciones y tiempo apropiados, un reactivo indicador, que
comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento de
este anticuerpo, o una combinación de estos anticuerpos, unidos a un
compuesto generador de una señal. La presencia de la proteína
Plexina-B1 en la muestra a analizar, se detecta y
cuantifica, en caso de que exista, midiendo la señal generada. La
cantidad de proteína Plexina-B1 presente en la
muestra analizar es proporcional a esa señal.
En el caso de que se pretenda detectar el mRNA o
el cDNA correspondiente al gen plexina-B1, y
no la proteína, el método de la invención presenta etapas
diferentes. Así, una vez obtenida la muestra y extraído el RNA
total, el método de la invención, la detección del mRNA o del
correspondiente cDNA del gen plexina-B1,
comprende una primera etapa de amplificación del extracto de RNA
total o del correspondiente cDNA sintetizado por retrotranscripción
a partir del mRNA, y una segunda etapa de cuantificación del
producto de la amplificación del mRNA o del eDNA del gen
plexina-B1.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de amplificación del mRNA, consiste
en retrotranscribir el mRNA en cDNA (RT), seguido de la Reacción en
Cadena de la polimerasa (PCR), usando oligonucleótidos cebadores,
siendo las secuencias de los cebadores utilizados
5'ACAGTGTGACAGGCAAGGCC-3' (SEQ ID NO 1) y
5'-CACAGCCAATAGTGCATTCAAGG-3' (SEQ
ID NO 2); la PCR es una técnica de amplificación de una determinada
secuencia nucleotídica (diana) contenida en una mezcla de
secuencias nucleotídicas. En la PCR, se utiliza un exceso de una
pareja de oligonucleótidos cebadores, que hibridan con las hebras
complementarias de la secuencia nucleotídica diana. A continuación,
una enzima con actividad polimerasa (DNA Taq Polimerasa) extiende
cada cebador, utilizando como molde la secuencia nucleotídica
diana. Los productos de la extensión se convierten entonces en
secuencias dianas, tras la disociación de la hebra diana original.
Nuevas moléculas de cebador hibridan y la polimerasa las extiende;
el ciclo se repite para aumentar exponencialmente el número de
secuencias diana. Esta técnica está descrita en las patentes US
4683195 y US 4683202. Se han descrito previamente muchos métodos
para detectar y cuantificar los productos de la amplificación por
PCR, de los que cualquiera puede ser usado en esta invención. En un
método preferido de la invención, el producto amplificado se
detecta por electroforesis en gel de agarosa, de la manera
siguiente: cinco microlitros del producto de la amplificación se
someten a una separación por electroforesis en un gel de agarosa a
una concentración del 2%, en un tampón TBE 0,5x a 100 vdc, durante
una hora. Tras la electroforesis, el gel se tiñe con bromuro de
etidio y el producto de la amplificación se visualiza al iluminar
el gel con luz ultravioleta (uv); como alternativa a la tinción, y
realización preferida, se puede transferir el producto amplificado a
una membrana de nailon por técnicas de Southern blotting o
transferencia Southern, para ser detectado con una sonda específica
del cDNA del gen plexina-B1,
convenientemente marcada.
En otro ejemplo la detección del mRNA se realiza
transfiriendo el rnRNA a una membrana de nailon, mediante técnicas
de transferencia como por ejemplo Northern-blot o
transferencia Northern, y detectándolo con sondas específicas del
mRNA o del correspondiente cDNA del gen
plexina-B1.
En una realización particular la amplificación y
cuantificación del mRNA correspondiente al gen
plexina-B1 se realiza a la vez mediante
RT-PCR cuantitativa a tiempo real
(Q-PCR).
El paso final del método de la invención
consiste en comparar la cantidad de proteína
Plexina-B1, la del mRNA del gen
plexina-B1 o la del correspondiente cDNA
detectada en una muestra de un individuo; con la cantidad de
proteína Plexina-B1, la del mRNA del gen
plexina-B1 o la del correspondiente cDNA
detectada en las muestras de sujetos control o en muestras
anteriores del mismo individuo, o con los valores normales de
referencia.
La invención también proporciona un método in
vitro para identificar y evaluar la eficacia de agentes para
terapia del cáncer, preferiblemente para el cáncer de riñón, que
comprende:
- a)
- poner en contacto un cultivo de células tumorales, preferiblemente de riñón, con el agente candidato, en las condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que interaccionen,
- b)
- detectar y cuantificar los niveles de expresión del gen plexina-B1 o la proteína Plexina-B1, y
- c)
- comparar dichos niveles de expresión con los de cultivos control de células tumorales sin tratar con el compuesto candidato.
La cuantificación de los niveles de expresión
del gen plexina-B1 o la proteína
Plexina-B1 se realizan de modo semejante a como se
indica en el método de la invención para detectar in vitro
la presencia del cáncer de de riñón en un individuo.
Cuando un agente aumenta los niveles de
expresión del gen plexina-B1 o revierte los
efectos de la expresión reducida de dicho gen, preferiblemente
disminuyendo los niveles de proliferación celular, este agente se
convierte en candidato para la terapia del cáncer y, especialmente
del carcinoma de riñón.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen
plexina-B1 para detectar la presencia de un
cáncer, especialmente de un cáncer de riñón en un individuo, para
determinar el estadio o la severidad de dicho carcinoma en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada
a un individuo que presente dicho carcinoma.
En otro aspecto de la invención se hace
referencia a agentes caracterizados porque inducen la expresión y/o
la actividad de la proteína Plexina-B1. Estos
agentes, que se pueden identificar y evaluar según la presente
invención, pueden ser seleccionados del grupo formado por:
a) vectores de expresión recombinantes que
expresan la proteína Plexina-B1. El vector puede
ser introducido in vivo en las células del individuo
diagnosticado de cáncer; el vector de expresión también puede ser
introducido en las células ex vivo, rindiendo células
transformadas que son posteriormente introducidas en el individuo.
Ejemplos de vectores de expresión recombinantes son virus
quiméricos; ejemplos de vectores virales útiles para terapia génica
incluyen aquello vectores derivados de adenovirus, virus herpes,
vaccinia, o cualquier virus cuyo material genético sea RNA, como
los retrovirus de aves o de murinidos. En estos vectores, el gen
plexina-B1 puede estar unido a un promotor de
expresión génica específico del tejido afectado por el cáncer, por
ejemplo riñón, de manera que se evite la expresión del vector en
otros tejidos donde no es necesaria. Otros ejemplos de sistemas de
vehiculización del gen plexina-B1 al interior
de las células tumorales son los sistemas de dispersión coloidal;
ejemplos de sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos
macromoleculares, nanocápsulas, microsferas, perlas y sistemas
lipídicos como emulsiones
aceite-en-agua, micelios, micelios
mixtos y liposomas.
b) agentes citotóxicos, tales como toxinas,
moléculas con átomos radiactivos, o agentes
quimio-terapéuticos, entre los que se incluyen, sin
limitación, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos,
fosfopéptidos, moléculas antisentido, ribozimas, moléculas de
triple hélice, etc., que inhiben los efectos carcinogénicos de la
represión de la expresión y/o de la actividad de de la proteína
Plexina-B1, y
c) compuestos agonistas de la proteína
Plexina-B1, que inducen, mimetizan o reemplazan una
o más de las funciones de la proteína
Plexina-B1.
Otro objeto de la invención está constituido por
el empleo de los agentes caracterizados porque inducen la expresión
y/o la actividad de la proteína Plexina-B1, así
como de la misma proteína Plexina-B1, en el
tratamiento del cáncer, especialmente en el tratamiento del cáncer
de riñón.
Constituye también un objeto de la presente
invención una composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de uno o varios agentes de los mencionados
anteriormente, o de la misma proteína Plexina-B1,
junto con uno o más excipientes y/o sustancias transportadoras.
Además dicha composición puede contener cualquier otro ingrediente
activo que induzca, mimetice o reemplace una o más de las funciones
de la proteína Plexina-B1.
Los excipientes, sustancias transportadoras y
sustancias auxiliares tienen que ser farmacéuticamente y
farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados
con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan
efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones
farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas
para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea,
intradérmica, intramuscular e intravenosa), aunque la mejor vía de
administración depende del estado del paciente. Las formulaciones
pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se
preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la
farmacolo-
gía. Las cantidades de sustancias activas para administrarse pueden variar en función de las particularidades de la terapia.
gía. Las cantidades de sustancias activas para administrarse pueden variar en función de las particularidades de la terapia.
Por último, constituye también un objeto de esta
invención el uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas
del gen plexina-B1, como dianas o
herramientas para el desarrollo de fármacos para tratar el cáncer en
un individuo, especialmente el cáncer de riñón.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Microarrays. Se utilizaron los
microarrays GeneChip Test 3 (Affymetrix, Santa Clara), que
permiten testar la calidad del RNA, previamente al análisis de
expresión con el array GeneChip Human Genome U95A
(Affymetrix, Santa Clara), que representa 12.000 secuencias
completas de genes anotados; el gen plexina-B1
(plexin B1) está representado en el microarray por el set de
sondas 33783_at de Affymetrix, que son oligonucleótidos
sentido de 25 nu-
cleótidos de longitud, diseñados en base a la secuencia Hs.200480 de Unigene, o AB007867 de GeneBank (Tabla 1).
cleótidos de longitud, diseñados en base a la secuencia Hs.200480 de Unigene, o AB007867 de GeneBank (Tabla 1).
Muestras. Las muestras de riñón
estudiadas procedían de biopsias, obtenidas por resección
quirúrgica, de 12 individuos afectados de oncocitoma renal (n=1),
carcinoma renal convencional (n=8), carcinoma renal cromófobo (n=1)
o carcinoma renal de células papilares (n=2). De cada individuo, se
recolectó tejido neoplásico y, como control negativo, tejido no
neoplásico. Todas las muestras fueron clasificadas histológicamente,
en el servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario
Marqués de Valdecilla, el mismo hospital donde las muestras habían
sido recogidas, siguiendo los preceptos de la Declaración de
Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido
inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a -80ºC hasta el
momento de su análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
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El análisis se llevó a cabo con RNA total
procedente de 1 muestra de tejido neoplásico de riñón de 1
individuos afectado de oncocitoma renal (Muestra #12), con mezclas
equimolares (pools) de RNAs totales procedentes de un conjunto de 8
muestras de tejido neoplásico de riñón de 8 individuos afectados de
carcinoma renal convencional (Pool 1), RNA total procedente de 1
muestra de tejido neoplásico de riñón de 1 individuo afectado de
carcinoma renal cromófobo (Muestra #9), y, como control negativo,
con mezclas equimolares de RNAs totales procedentes de un conjunto
de muestras de tejido no neoplásico de riñón de individuos
afectados de oncocitoma renal, carcinoma renal convencional y
carcinoma renal cromófobo (Pool 2) (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
El RNA total de cada una de las biopsias se
obtuvo homogenizando el tejido en TRIzol® Reagent (Life
Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA
total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski
P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P.,
Biotechniques, 1993, 15: 532). De cada preparación de RNA total se
usaron 10 \mug como material de partida para la síntesis de la
primera hebra de cDNA con la enzima transcriptasa inversa
SuperScript^{TM} II RNase (Life Technologies), usando como
cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la
secuencia del promotor de la RNA polimerasa del fago T7. La segunda
hebra de cDNA se sintetizó utilizando los enzimas DNA polimerasa I
de E. coli (Invitrogen Life Technologies), DNA ligara de
E. coli (Invitrogen Life Technologies), Rnasa H de E.
coli (Invitrogen Life Technologies), y DNA polimerasa del fago
T4 (Invitrogen Life Technologies). El cRNA marcado con biotina se
sintetizó usando el kit ENZO BioArray^{TM} HighYield^{TM}
Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics Inc). Después de la
transcripción in vitro, se eliminaron los nucleótidos no
incorporados usando las columnas Rneasy (QIAGEN).
\vskip1.000000\baselineskip
Se fragmentaron 15 \mug de cada cRNA
biotinilado a 94ºC durante 35 minutos en una solución tampón que
contenía 40 mM Tris-Acetato (pH 8.1), 100 mM KOAc y
30 mM MgOAc. El cRNA fragmentado se mezcló con buffer de hibridación
(100 mM MES, 1M NaCl, 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20) y se calentó a
99º durante 5 minutos y posteriormente a 45º durante 5 minutos,
para a continuación ser cargado en el array de Affymetrix. El primer
array en el que se realizó la hibridación fue el Test 3 de
Affymetrix. Este array permite testar la calidad del RNA previo al
análisis de expresión en el Affymetrix® GeneChip® Human
Genome 95 A (HG-U95A).
Para la hibridación, los arrays se incubaron en
un horno rotatorio a 45º durante 16 horas y con una rotación
constante de 60 rpm.
El lavado y tinción de cada array se llevó a
cabo en la Estación de Fluidos de Affymetrix®. Se usó un programa
de lavado y tinción que incluía:
- 10x2 ciclos de lavado con
SSPE-T 6x (0.9 m NaCl, 60 mM NaH_{2}PO4, 6 mM
EDTA, 0.01% Tween 20) a 25º,
- 4x15 ciclos con 0.1 mM MES, 0.1M NaCl, 0.01%
Tween 20 a 50º,
- Tinción del cRNA biotinilado con un conjugado
estreptavidina-ficoeritrina (10 \mug/mlMolecular
Probes)
- 10x4 ciclos de lavado con
SSPE-T a 25º
- Tinción con un anticuerpo
anti-estreptavidina durante 10 minutos
- Tinción un conjugado
estreptavidina-ficoeritrina (1 mg/ml, Molecular
Probes) durante 10 minutos
- 15x4 ciclos de lavado con
SSPE-T a 30º
Los arrays se escanearon a 560 nm usando un
microscopio confocal que utiliza emisión láser (Agilent GeneArray
Scanner). El análisis de las lecturas de intensidad se realizó con
el software Microarray Suite 5.0. Para la comparación de arrays,
éstos fueron escalados a una intensidad total de 100.
El análisis diferencial de la expresión del gen
plexina-B1 en los tejidos neoplásicos frente
a los tejidos control, no neoplásicos, se realizó a partir de los
datos de comparación de arrays obtenidos utilizando el software de
Affymetrix. Los parámetros que se tuvieron en cuenta (en el orden
en el que aparecen en la lista) fueron: i) Detección. Indica
si el transcrito está Presente (P), Ausente (A) o Marginal (M), ii)
Cambio: Indica si la expresión de un determinado transcrito
Aumenta (I), Decrece (D), No Cambia (NC), Aumenta Marginalmente
(MI), o Decrece Marginalmente (MD), iii) Signal Log Ratio
(SLR): Indica el nivel de cambio de expresión entre la línea
base (control) y una muestra problema. Este cambio se expresa como
el log2 del ratio (fold change o número de veces que la
expresión del gen está elevada o reprimida en la muestra
problema-tumoral frente a la muestra
control-sana). Se considera significativo un valor
de SLR de 1 (equivalente a un fold change de 2), para
transcritos cuya expresión aumenta frente al control) y de -1, para
transcritos cuya expresión disminuye frente al control.
El análisis diferencial de la expresión del gen
plexina-B1 en los estadios tumorales con
respecto al control, demostró que los niveles de expresión del gen
plexina-B1 estaban reprimidos en el tejido
neoplásico de riñón, respecto al tejido no neoplásico, y que esa
represión era mayor, cuanto mayor era la malignidad del tumor
analizado: el, nivel de represión era mayor de 2 veces (SLR<-1)
en biopsias de oncocitomas renales, (benignos), mayor de 4 veces
(SLR<-2) en biopsias de carcinomas renales convencionales
(malignos) y mayor de 8 veces (SLR<-3) en biopsias de carcinoma
renales cromófobos (mayor grado de malignidad) (Tabla 3).
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\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar los niveles de expresión del gen
plexina-B1, se realizó una
RT-PCR cuantitativa a tiempo real en un 7000
Sequence Detection System utilizando una mezcla SYBR
green PCR master mix (Applied-Biosystems, Foster
City, EE.UU.). El RNA total RNA se extrajo de biopsias
individuales usando el reactivo Trizol^{TM} Reagent (Life
Technologies, EE.UU.), siguiendo las instrucciones recomendadas por
el fabricante; este RNA total se purificó a continuación con el kit
Qiagen Mini Kit spin columns (Qiagen, EE.UU.). La integridad
del RNA se confirmó por electroforesis en un gel de agarosa 1% y el
RNA se cuantificó espectrofotométricamente. A continuación, se
digirieron 5 \mug de RNA total con DNasa I (1.2 uu/\mug RNA) y
se procedió a la síntesis del cDNA siguiendo el siguiente
protocolo: Un \mug de RNA tratado con DNAsa se mezcló, en un
volumen total de 20 \mul, con la transcriptassa reversa
SuperScript^{TM} Rnase H-Reverse
Transcriptase (Invitrogen, EE.UU.) (400 units/\mug RNA) y con
100 pmoles de oligodT. El cDNA sintetizado se amplificó utilizando
cebadores específicos del gen humano
plexina-B1
(5'-ACAGTGTGACAGGCAAGGCC-3' -SEQ ID
NO 1-, y
5'-CACAGCCAATAGTGCATTCAAGG-3'-SEQ
ID NO 2-), y cebadores específicos del gen humano
gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa
(gapdh). A continuación, se calculó, como medida relativa de la
expresión génica, la relación entre la abundancia de mRNAs
transcritos de plexina-B1 y la abundancia de
transcritos de gapdh: 2^{n}, donde n es el valor. C_{t}
(threshold cycle) de gapdh menos el valor C_{t} de
plexina-B1, y se normalizó el dato dé la
relación, en base al valor de la muestra con el nivel más bajo de
expresión de plexina-B1. La especificidad de
los productos de PCR se determinó por análisis de curvas de
desnaturalización. Para cada secuencia génica, se construyó una
curva patrón realizada con diluciones seriadas de cDNA; a las
concentraciones de cDNA molde para las: reacciones en la curva
patrón se les dieron valores arbitrarios 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625;
0.3125 and 0.15625. Las reacciones de PCR en tiempo real se
prepararon utilizando el kit
LightCycler-FastStart DNA master SYBR Green I
kit (Roche, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del
fabricante. El programa de amplificación consistía en 1 ciclo de
95ºC durante 1 min ("hot start") seguido de 45 ciclos de 95ºC
(desnaturalización) durante 10 seg, 60ºC (anillamiento) durante 5
seg, 72ºC (amplificación y adquisición) durante 10 seg. El programa
de análisis de curvas de desnaturalización consistía en un ciclo de
un pulso de 95ºC, 65ºC durante 15 seg, y un pulso de 95ºC durante
el paso de amplificación y adquisición.
La eficiencia de amplificación se calculó para
cada reacción de PCR a partir de los datos de la curva patrón,
utilizando la ecuación:
[1]E=
10^{-1/slope}
donde E es la eficiencia de
amplificación.
La relación de los valores de expresión génica
se determinó por la ecuación:
Ratio =
\frac{E_{target}{}^{-(Cp \ target \ control-Cp \
target \ sample)}}{E_{reference}{}^{-(Cp \ reference \ control \ - \
Cp \ reference \
sample)}}
donde E es la eficiencia de
amplificación, Cp es el punto de cruce, target es
plexina-B1, reference es GAPDH,
control es la muestra sana y sample es la muestra
tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron las curvas de amplificación y
desnaturalización de los genes diana (target,
plexina-B1) y de referencia (reference,
gadph); en la curva de desnaturalización se veía un único pico
definido a la temperatura correspondiente a la temperatura de
desnaturalización de cada producto, lo que indicaba que las
reacciones eran específicas (datos no mostrados). Cada muestra se
analizó por triplicado para calcular el cambio relativo en los
niveles de expresión génica utilizando las ecuaciones 1 y 2
descritas en el apartado anterior. Los cambios en los niveles de
expresión del gen plexina-B1 están descritos
en la tabla 4. De las muestras neoplásicas analizadas, sólo una
mostró niveles de expresión génica superiores a los niveles en las
muestras no neoplásicas; en los demás casos, que incluían muestras
de carcinoma renal convencional, papilar y cromófobo, los niveles de
expresión estaban claramente reprimidos respecto a las muestras
procedentes de tejido no neoplásico (Figura 1).
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Progenika Biopharma, S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos in vitro para la
detección de un carcinoma, determinación de su estadio o severidad
y para la determinación de su desarrollo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 200301518
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> ES 200301518
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-06-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador para la amplificación PCR
del gen Plexina-B1
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\hskip-.1em\dddseqskipacagtgtgac aggcaaggcc
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<223> Cebador para la amplificación PCR
del gen plexina-B1
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\hskip-.1em\dddseqskipcacagccaat agtgcattca agg
\hfill23
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<212> DNA
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<223> Sonda correspondiente al set de
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<223> sonda correspondiente al set de
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<223> sonda correspondiente al set de
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<223> sonda correspondiente al set de
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\newpage
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<223> Sonda correspondiente al set de
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<223> sonda correspondiente al set de
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<223> Sonda correspondiente al set de
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Claims (22)
1. Método in vitro para detectar la
presencia de un carcinoma en un individuo, para determinar el
estadio o la severidad de dicho carcinoma en el individuo, o para
monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que
presente dicho carcinoma, que comprende:
- a)
- la detección y/o cuantificación de la proteína Plexina-B1, del mRNA del gen plexina-B1 o el correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
- b)
- la comparación de la cantidad de proteína Plexina-B1, de la cantidad de mRNA del gen plexina-B1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra de un individuo; con la cantidad de proteína plexina-B1, con la cantidad del mRNA del gen plexina-B1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en las muestras de individuos control o en muestras anteriores del mismo individuo o con los valores normales de referencia.
2. Método según la reivindicación 1 en el que
dicho carcinoma es un cáncer de riñón.
3. Método según la reivindicación 1 en el que
dicha muestra es una muestra de tejido de riñón.
4. Método según la reivindicación 3 en el que
dicha muestra de tejido de riñón a analizar se obtiene por
cualquier método convencional, preferiblemente nefrectomía.
5. Método según la reivindicación 1 en el que
dicha muestra es una muestra de orina, sangre, plasma, suero,
líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial, bilis, semen,
jugo gástrico o líquido cefalorraquideo.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que no se le
ha diagnosticado previamente carcinoma.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que se le ha
diagnosticado previamente carcinoma.
8. Método según las reivindicación 1, en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo en tratamiento,
o que ha sido tratado previamente, contra cáncer.
9. Método según la reivindicación 1
caracterizado porque comprende la realización de una
extracción de la muestra, bien para obtener un extracto de
proteínas o bien para obtener un extracto que consiste en el RNA
total.
10. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la detección de la proteína
Plexina-B1 comprende una primera etapa de puesta en
contacto del extracto de proteínas de la muestra con una
composición de uno o más anticuerpos específicos contra uno o más
epítopos de la proteína Plexina-B1, y una segunda
etapa de cuantificación de los complejos formados por los
anticuerpos y la proteína Plexina-B1.
11. Método según la reivindicación 10
caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden
anticuerpos monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos
recombinantes de ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de
anticuerpos, específicos contra la proteína
Plexina-B1; siendo estos anticuerpos humanos,
humanizados o de origen no humano.
12. Método según las reivindicaciones 10 ó 11
caracterizado porque para la cuantificación de los complejos
formados por los anticuerpos y la proteína
Plexina-B1 se utilizan técnicas seleccionadas del
grupo formado por: Western-blot, ELISA
(Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay o ensayo de
inmunosorbente ligado a enzima), RIA (Radioinmunoassay o
Radioinmunoensayo), EIA Competitivo (Competitive Enzyme Immunoassay
o Inmunoensayo Enzimático Competitivo), DAS-ELISA
(Double antibody Sandwich-ELISA o ensayo ELISA
Sándwich con Doble Anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e
inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o
microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos,
ensayos basados en precipitación con oro coloidal en formatos tales
como dipsticks; o mediante técnicas de cromatografía de afinidad,
ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a
lectina.
lectina.
13. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la detección del mRNA o del
correspondiente cDNA del gen plexina-B1
comprende una primera etapa de amplificación del mRNA, incluido en
el extracto de RNA total, o del correspondiente cDNA sintetizado
por retrotranscripción del mRNA, incluido en el extracto de RNA
total, y una segunda etapa de cuantificación del producto de la
amplificación del mRNA o del cDNA del gen
plexina-B1.
14. Método según la reivindicación 13
caracterizado porque la amplificación se realiza de manera
cualitativa o cuantitativa, mediante RT-PCR usando
oligonucleotidos cebadores, siendo las secuencias de los cebadores
utilizados SEC ID NO 1 y SEC ID NO 2.
\newpage
15. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la detección se realiza con sondas
específicas del mRNA o del correspondiente cDNA del gen
plexina-B1, mediante técnicas como por
ejemplo Northern-blot o transferencia Northern.
16. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la detección del mRNA se efectúa
mediante RT- PCR cuantitativa a tiempo real
(Q-PCR).
17. Uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas
derivadas del gen plexina-B1 para detectar
in vitro la presencia de un carcinoma en un individuo, para
determinar in vitro el estadio o la severidad de dicho
carcinoma en el individuo, o para monitorizar in vitro el
efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho
carcinoma.
18. Método in vitro para identificar y
evaluar la eficacia de compuestos para terapia del cáncer;
preferiblemente para el cáncer de riñón, que comprende:
- a)
- poner en contacto un cultivo de células tumorales; preferiblemente de riñón, con el compuesto candidato, en las condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que interaccionen,
- b)
- detectar y cuantificar los niveles de expresión del gen plexina-B1 o la proteína Plexina-B1, y
- c)
- comparar dichos niveles de expresión con los de cultivos control de células tumorales sin tratar con el compuesto candidato.
19. Uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas
derivadas del gen plexina-B1, en métodos de
búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de
compuestos para terapia del cáncer, preferiblemente del cáncer de
riñón.
20. Proteína Plexina-B1 para el
tratamiento del cáncer; preferiblemente para el cáncer de
riñón.
21. Uso de la proteína
Plexina-B1 en la elaboración de un medicamento para
el tratamiento de cáncer; preferiblemente para el cáncer de
riñón.
22. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína
Plexina-B1 junto con al menos un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
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