ES2303390B1 - Metodos para el diagnostico in vitro y pronostico in vitro del adenocarcinoma ductal de pancreas y/o de una pancreatitis; y para el desarrollo de farmacos contra el adenocarcinoma ductal de pancreas y/o contra una pancreatitis. - Google Patents
Metodos para el diagnostico in vitro y pronostico in vitro del adenocarcinoma ductal de pancreas y/o de una pancreatitis; y para el desarrollo de farmacos contra el adenocarcinoma ductal de pancreas y/o contra una pancreatitis. Download PDFInfo
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Abstract
Métodos para el diagnóstico in vitro y
pronóstico in vitro del adenocarcinoma ductal de páncreas y/o
de una pancreatitis; y para el desarrollo de fármacos contra el
adenocarcinoma ductal de páncreas y/o contra una pancreatitis.
La presente invención se refiere a un método
in vitro para detectar un adenocarcinoma ductal de páncreas
y/o una pancreatitis, para determinar el estadio o la severidad de
dichas enfermedades en el individuo, o para monitorizar el efecto de
la terapia administrada a un individuo que presente dichas
enfermedades. Asimismo, la presente invención se refiere a la
búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de
compuestos para terapia de dichas enfermedades del páncreas, con el
fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como a agentes que
inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína DRM y/o de la
proteína NBL1, y/o los efectos de esta expresión.
Description
Métodos para el diagnóstico in vitro y
pronóstico in vitro del adenocarcinoma ductal de páncreas y/o
de una pancreatitis; y para el desarrollo de fármacos contra el
adenocarcinoma ductal de páncreas y/o de una pancreatitis.
La presente invención se refiere a un método
in vitro para detectar la presencia de un adenocarcinoma
ductal de páncreas en un individuo y/o de una pancreatitis, para
determinar el estadio o la severidad de dichas enfermedades del
páncreas en el individuo, o para monitorizar el efecto de la
terapia administrada a un individuo que presente dichas
enfermedades; a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación
de la eficacia de compuestos para terapia de dichas enfermedades,
con el fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como a agentes
que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína DRM y/o de
la proteína NBL1, y/o los efectos de esta expresión.
El adenocarcinoma ductal de páncreas fue la
causa de más de 220.000 muertes en el mundo, y de más de 3.600 en
España, durante el año 2.000 (GLOBOCAN). El comportamiento clínico
del cáncer de páncreas es homogéneo y siempre infausto, sin
diferencias notables en la supervivencia según el estadio. El número
de pacientes con cáncer de páncreas de buen pronóstico es
insignificante. Una posible explicación es que incluso en pacientes
con tumores pequeños, encuadrados en el estadio I, la enfermedad
está diseminada. Su diagnóstico en una fase inicial, salvo en casos
fortuitos, es difícil; un 75% de los pacientes diagnosticados
presentan enfermedad avanzada (Estadios III y IV). Se trata de una
neoplasia muy agresiva, resistente a los tratamientos citostáticos
y sólo entre un 1 y un 4% de los casos permanecen vivos a los cinco
años del diagnóstico, siempre que el tumor esté localizado y haya
podido ser extirpado en su totalidad (Warshaw A.L., y Fernándes del
Castillo C., N. Eng. J. Med., 1992, 326:455-465;
Ahlgren J.D., Semin. Oncol., 1996, 23:241-250). Es
por todo ello que en el caso del cáncer de páncreas, tanto el
desarrollo de sistemas de diagnóstico precoz como el de terapias
eficaces, resultan cruciales para el control de la enfermedad
(Byungwoo R., y col., Cancer Res., 2002,
62:819-826).
Muchos de los genes y proteínas implicados en la
progresión de estos carcinomas son todavía desconocidos; la
identificación de genes y proteínas expresados diferencialmente en
asociación con el proceso de invasividad tumoral, podría conducir a
la identificación de marcadores biológicos y dianas terapéuticas,
que podrían tener un gran valor para el diagnóstico, el pronóstico
y el tratamiento de esta enfermedad.
El Factor \beta de Crecimiento Transformante
(Transformig Growth Factor \beta, o TGF \beta) es una citoquina
que inhibe el crecimiento de la mayoría de las células epiteliales
normales, bloqueando la transición G1-S en el ciclo
celular o promoviendo apoptosis (Massague, J., y col., 2000, Cell,
103:295-309). TGF\beta se ha asociado previamente
al adenocarcinoma de páncreas, pero su función en esta enfermedad no
está bien definida y se han publicado trabajos de investigación con
resultados y conclusiones contradictorias, debidas posiblemente a
la heterogeneidad de los modelos de cultivo celular in vitro
utilizados y a las condiciones no fisiológicas que existen in
vitro (Bardeesy N. y DePinho R.A., 2002, Nature Rev. Cancer,
2:897-909). Giehl y sus colaboradores demostraron
que TGF\beta1 reprimía la proliferación de células de carcinoma
de páncreas (Giehl K. y col., 2000, Oncogene,
19:4531-4541), mientras que por el contrario,
Rowland-Goldsmith y sus colaboradores demostraron
que TGF\beta inducía mitogénesis en cultivos de células de
carcinoma de páncreas (Rowland-Goldsmith M.A., y
col., 2001, Clin. Cancer Res., 7:2931-2940).
Inesperadamente, los autores de la presente
invención han descubierto, tras laboriosa investigación y empleando
diferentes técnicas (DNA-chips y
RT-PCR cuantitativa para medir los niveles de
expresión génica y Western-blot para medir los
niveles de expresión proteica), que la expresión de dos genes y de
las proteínas que codifican, dos miembros de la familia DAN de
antagonistas de TGF\beta, está incrementada en adenocarcinomas
ductales de páncreas, al compararla con la expresión en tejido
pancreático no tumoral procedente de los mismos individuos o de
individuos afectados de pancreatitis. Estos genes son el gen drm,
que codifica la proteína Gremlin, también llamada antagonista 1 de
la proteína morfogénica del hueso (DRM) y el gen nbl1, que codifica
el supresor tumorigénico 1 de neuroblastoma (Neuroblastoma
supression of tumorigenicity 1, o NBL1). Adicionalmente, los autores
de la invención también han descubierto que la expresión del gen
drm y de la proteína DRM está también incrementada, aunque en menor
medida que en tejido tumoral, en tejido pancreático no tumoral,
pero inflamado (pancreatitis), al compararla con la expresión en
tejido pancreático no tumoral, no inflamado.
La función de estas proteínas es controvertida,
al igual que la función del factor que antagonizan. DRM es una
proteína que actúa durante las primeras fases del desarrollo
embrionario, controlando el crecimiento a través de su actividad
antiapoptótica (Merino R., y col., 1999, Development,
126:5515-5522), lo que concuerda con la actividad
apoptótica de la proteína morfogénica del hueso (Borne Morphogenic
protein o BMP) que antagoniza (Zou H., y Niswander L., 1996,
Science, 272:738-741); pero también se ha propuesto
que podría actuar como un supresor de tumores (Hsu D.R., y col.,
1998, Mol. Cell, 1:673-683; Chen B., y col., 2002,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 295:1135-1141).
NBL1 es un factor de transcripción que se ha postulado que podría
funcionar como un inhibidor del crecimiento celular y del ciclo
celular, y que al sobreexpresarse podría tener actividad como
supresor de tumores en neuroblastomas (Enomoto H., y col., 1994,
Oncogene, 9:2785-2791); el gen nbl1 ha aparecido en
una lista de 123 genes que resultaban sobreexpresados en
adenocarcinomas ductales de páncreas en experimentos realizados con
DNA-chips (Iacobuzio-Donahue C.A.,
y col., 2003, Am. J. Pathol.,
162(4):1151-62).
Las evidencias experimentales de la presente
invención convierten a DRM y NBL1 en útiles dianas para el
desa-
rrollo de nuevos métodos in vitro de diagnóstico y pronóstico, y para la identificación y desarrollo de compuestos para terapia de adenocarcinomas ductales de páncreas.
rrollo de nuevos métodos in vitro de diagnóstico y pronóstico, y para la identificación y desarrollo de compuestos para terapia de adenocarcinomas ductales de páncreas.
La detección in vitro de niveles altos de
expresión del gen drm, el gen nbl1, la proteína DRM, o la proteína
NBL1, o cualquier combinación de ellos, en muestras de tejido de
páncreas o en muestras de suero de individuos, permitirá la
detección precoz del cáncer de páncreas.
El desarrollo de nuevos fármacos dirigidos
específicamente contra el gen drm, el gen nbl1, la proteína DRM, o
la proteína NBL1, o cualquier combinación de ellos, es una nueva
aproximación para tratar estos adenocarcinomas ductales de páncreas,
de tan negativo pronóstico.
La presente invención proporciona por tanto un
método in vitro de alta sensibilidad para detectar la
presencia de un adenocarcinoma ductal de páncreas y/o de una
pancreatitis en un individuo, para determinar el estadio o la
severidad de dichas enfermedades en el individuo, o para
monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que
presente dichas enfermedades, basado en la detección y/o
cuantificación de la proteína DRM, del mRNA del gen drm, del
correspondiente cDNA, de la proteína NBL1, del mRNA del gen nbl1,
del correspondiente cDNA, o de cualquier combinación de ellos, en
una muestra de dicho individuo. Asimismo, la presente invención
proporciona dianas o herramientas para la búsqueda, identificación,
desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia de
adenocarcinomas ductales de páncreas y/o de una pancreatitis.
Finalmente, la invención proporciona agentes caracterizados porque
inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína DRM y/o de la
proteína NBL1, para el tratamiento de adenocarcinomas ductales de
páncreas y/o de una pancreatitis.
La presente invención tiene como objeto
principal el desarrollo de un método in vitro para detectar
la presencia de un adenocarcinoma ductal de páncreas y/o de une
pancreatitis, para determinar el estadio o la severidad de dichas
enfermedades en el individuo, o para monitorizar el efecto de la
terapia administrada a un individuo que presente dichas
enfermedades.
Un segundo objeto de la presente invención es un
método in vitro para buscar, identificar, desarrollar y
evaluar la eficacia de compuestos para la terapia de
adenocarcinomas ductales de páncreas y/o de una pancreatitis.
Un objeto adicional de la invención reside en el
uso de secuencias derivadas del gen drm y/o del gen nbl1, para el
diagnóstico y pronóstico in vitro de un adenocarcinoma ductal
de páncreas y/o de una pancreatitis, así como para la búsqueda,
identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos
para la terapia de dichas enfermedades.
Otro objeto de la presente invención consiste en
proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o
la actividad de la proteína DRM, y/o de la proteína NBL1, para el
tratamiento de adenocarcinomas ductales de páncreas y/o de una
pancreatitis.
Por último, es también objeto de la invención
una composición farmacéutica que comprenda uno o varios agentes
terapéuticos junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable,
para el tratamiento de los adenocarcinomas ductales de páncreas y/o
de una pancreatitis.
Figura 1: Curva de desnaturalización del
producto de la PCR del gen diana, drm (Tm = 80ºC) y del gen de
referencia, ribl10 (Tm=84ºC), en experimentos de medida de la
expresión génica por RT-PCR cuantitativa en tiempo
real, en muestras de páncreas.
Figura 2: Cálculo de la eficiencia de
amplificación de las reacciones de PCR de drm, en experimentos de
medida de la expresión génica por RT-PCR
cuantitativa en tiempo real, en muestras de páncreas.
Figura 3: Cálculo de la eficiencia de
amplificación del las reacciones de PCR de ribl10, en experimentos
de medida de la expresión génica por RT-PCR
cuantitativa en tiempo real, en muestras de páncreas.
Figura 4: Curva de desnaturalización del
producto de la PCR del gen diana, nbl1 (Tm = 85ºC) y del gen de
referencia, ribl10 (Tm=84ºC), en experimentos de medida de la
expresión génica por RT-PCR cuantitativa en tiempo
real, en muestras de páncreas.
Figura 5: Cálculo de la eficiencia de
amplificación de las reacciones de PCR de nbl1, en experimentos de
medida de la expresión génica por RT-PCR
cuantitativa en tiempo real, en muestras de páncreas.
Figura 6: Cálculo de la eficiencia de
amplificación del las reacciones de PCR de: ribl10, en experimentos
de medida de la expresión génica por RT-PCR
cuantitativa en: tiempo real, en muestras de páncreas.
\newpage
Figura 7: Resultados del análisis de la
expresión de la proteína DRM en muestras de páncreas humano por
transferencia de Western. Se analizaron dos muestras de tejido
pancreático no tumoral ("sano") (muestras número 15 y 42),
cuatro muestras de tejido pancreático no tumoral procedentes de
pacientes con tumor (34, 35, 36 y 37), tres muestras de tejido
pancreático no tumoral, pero inflamado (pancreatitis), procedentes
de pacientes con tumor y pancreatitis (28, 29 y 30), dos muestras de
tejido pancreático procedentes de individuos afectados de
adenocarcinoma ductal de páncreas de estadío I (27 y 33), una
muestra de tejido pancreático procedente de un individuo afectado
de adenocarcinoma ductal de páncreas de estadío III (24) y una
muestra de tejido pancreático procedente de un individuo afectado de
adenocarcinoma ductal de páncreas de estadío IV (23). Se analizó
también una muestra de tejido no tumoral de pulmón (38) y una
metástasis pulmonar de adenocarcinoma pancreático (39). Finalmente,
se analizaron también extractos de cultivos de células pancreáticas
ductales inmortalizadas (líneas celulares Capan-1,
BxPC3 y PANC-1). La cantidad de extracto de
proteína total cargada fue 40 \mug en todos los casos. Las
membranas se revelaron con anticuerpo anti-DRM. Los
films se expusieron durante 1 min. DRM aparecía en forma de una
banda inmunorreactiva de unos 18 kDa, correspondientes a la forma
madura de la proteína; se observaban también unas bandas
inespecíficas de mayor peso molecular.
Para facilitar la comprensión de la presente
solicitud de patente, exponemos a continuación el significado de
algunos términos y expresiones en el contexto de la invención:
Los términos "sujeto" o "individuo" se
refieren a miembros de especies de animales mamíferos, e incluye,
pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el
sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de
cualquier edad o raza.
Los términos "cáncer" o "carcinoma" se
refieren a la enfermedad que se caracteriza por una proliferación
descontrolada de células anormales capaces de invadir tejidos
adyacentes y diseminarse a órganos lejanos.
El término "cáncer de páncreas" o
"adenocarcinoma ductal de páncreas" se refiere a cualquier
desorden proliferativo maligno de células ductales del páncreas.
El término "pancreatitis" se refiere a
cualquier desorden inflamatorio del páncreas.
El término "tumor" se refiere a cualquier
masa anormal de tejido producto de un proceso neoplásico, benigno
(no canceroso) o maligno (canceroso).
El término "gen" se refiere a una cadena
molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína.
El término "DNA" se refiere al ácido
desoxirribonucleico. Una secuencia de DNA es una secuencia de
desoxirribonucleótidos.
El término "cDNA" se refiere a una
secuencia de nucleótidos, complementaria de una secuencia de
mRNA.
El término "RNA" se refiere al ácido
ribonucleico. Una secuencia de RNA es una secuencia de
ribonucleótidos.
El término "mRNA" se refiere al ácido
ribonucleico mensajero, que es la fracción del RNA total que se
traduce a proteínas.
La frase "mRNA transcrito de" se refiere a
la transcripción del gen (DNA) en mRNA, como primer paso para que
el gen se exprese y traduzca a proteína.
El término "secuencia de nucleótidos" o
"secuencia nucleotídica" se refiere indistintamente a una
secuencia de ribonucleótidos (RNA) o de desoxirribonucleótidos
(DNA).
El término "proteína" se refiere a una
cadena molecular de aminoácidos, con una actividad biológica.
Los términos "péptido" y "polipéptido"
se refieren a un fragmento proteico. Los términos "proteína" y
"péptido", se usan indistintamente.
El término "anticuerpo" se refiere a una
glucoproteína que exhibe una actividad de unión específica por una
proteína particular, a la que se denomina "antígeno". El
término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o
anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos; e
incluye anticuerpos humanos, humanizados y de origen no humano. Los
"anticuerpos monoclonales" son poblaciones homogéneas de
anticuerpos, altamente específicos, que están dirigidos contra un
único sitio o "determinante" antigénico. Los "anticuerpos
policlonales" incluyen poblaciones heterogéneas de anticuerpos,
que están dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos.
El término "epítopo", tal como se utiliza
en la presente invención, se refiere a un determinante antigénico
de una proteína, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína
que un anticuerpo específico reconoce.
El término "fase sólida", tal como se
utiliza en la presente invención, se refiere a una matriz no acuosa
a la que se puede unir el anticuerpo. Ejemplos de materiales para
fase sólida incluyen vidrio, polisacáridos, por ejemplo agarosa,
poliacrilamida, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas.
Ejemplos de formas de fase sólida son el pocillo de una placa de
ensayo o una columna de purificación.
El término "oligonucleótido cebador", tal
como se utiliza en la presente invención, se refiere a una
secuencia nucleotídica, que es complementaria de una secuencia
nucleotídica del gen drm o del gen nbl1. Cada cebador hibrida con su
secuencia nucleotídica diana y actúa como un sitio de inicio para
la polimerización del DNA.
El término "sonda", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a una secuencia nucleotídica
complementaria de una secuencia nucleotídica derivada del gen drm o
del gen nbl1, que se puede utilizar para detectar esa secuencia
nucleotídica derivada del gen drm o del gen nbl1,
respectivamente.
El término "diana terapéutica" se refiere a
secuencias nucleotídicas o peptídicas, contra las que se puede
diseñar y aplicar clínicamente un fármaco o compuesto
terapéutico.
El término "antagonista" se refiere a
cualquier molécula que inhiba la actividad biológica de la molécula
antagonizada. Ejemplos de moléculas antagonistas incluyen, entre
otros, proteínas, péptidos, variaciones de secuencia de péptidos
naturales y pequeñas moléculas orgánicas (de peso molecular
inferior a 500 daltons).
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que tanto la expresión génica de drm y nbl1, como
la concentración de la proteína DRM se ven incrementadas en el
adenocarcinoma ductal de páncreas. Así mismo, la invención también
se basa en que la expresión del gen drm y de la proteína DRM está
también incrementada, aunque en menor medida que en tejido tumoral,
en tejido pancreático no tumoral, pero inflamado (pancreatitis), al
compararla con la expresión en tejido pancreático no. tumoral, no
inflamado.
En este sentido, la presente invención
proporciona, en primer lugar, un método in vitro para
detectar la presencia de un adenocarcinoma ductal de páncreas en un
individuo, para determinar el estadio o la severidad de dicha
enfermedad en si individuo, o para monitorizar el efecto de la
terapia administrada a un individuo que presente dicha enfermedad,
que comprende:
a) la detección y/o cuantificación bien de la
proteína DRM, del mRNA del gen drm, o del correspondiente cDNA,
bien de la proteína NBL1, del mRNA del gen nbl1, del
correspondiente cDNA, o de cualquier combinación de ellos, en una
muestra de dicho individuo, y
b) la comparación bien de la cantidad de
proteína DRM, de mRNA del gen drm o del correspondiente cDNA, bien
de la cantidad de proteína NBL1, de mRNA del gen nbl1 o del
correspondiente cDNA, o de cualquier combinación de ellos detectada
en una muestra de un individuo, con la cantidad respectiva de
proteína DRM, del mRNA del gen drm o del correspondiente cDNA, bien
con la cantidad de proteína NBL1, del mRNA del gen nbl1 o del
correspondiente cDNA, o con cualquier combinación de ellos,
detectada en las muestras de individuos control o en muestras
anteriores del mismo individuo o con los valores normales de
referencia.
La presente invención también proporciona un
método in vitro para detectar la presencia de pancreatitis
en un individuo, para determinar el estadio o la severidad de dicha
enfermedad en el individuo, o para monitorizar el efecto de la
terapia administrada a un individuo que presente dicha enfermedad,
que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la
proteína DRM, del mRNA del gen drm, o del correspondiente cDNA, en
una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la cantidad de proteína
DRM, de la cantidad de mRNA del gen drm o de la cantidad del
correspondiente cDNA detectada en una muestra de un individuo, con
la cantidad respectiva de proteína DRM, con la cantidad del mRNA del
gen drm o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en las
muestras de individuos control o en muestras anteriores del mismo
individuo o con los valores normales de referencia.
El método proporcionado por la presente
invención es de alta sensibilidad y especificidad, y se basa en que
sujetos o individuos diagnosticados de adenocarcinoma ductal de
páncreas presentan niveles elevados de mRNA transcrito del gen drm
(niveles elevados de expresión del gen drm), o
concentraciones elevadas de la proteína codificada por el gen drm
(proteína DRM), o niveles elevados de mRNA transcrito del gen
nbl1 (niveles elevados de expresión del gen nb11), o
concentraciones elevadas de la proteína codificada por el gen nbl1
(proteína NBL1), en comparación con los correspondientes
niveles en muestras procedentes de sujetos sin historial clínico de
estos carcinomas.
El presente método comprende una etapa de
obtención de la muestra del individuo. Se puede trabajar con
distintas muestras fluidas como, por ejemplo: orina, sangre,
plasma, suero, líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial,
bilis, semen, exudado de flujo gástrico o líquido cefalorraquídeo.
La muestra también puede ser tejido de páncreas, que se puede
obtener por cualquier método convencional, preferiblemente
resección quirúrgica.
\newpage
Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos
previamente diagnosticados, o no diagnosticados, de un determinado
tipo de carcinoma; o también de un sujeto en tratamiento, o que ha
sido tratado previamente contra un carcinoma, en particular contra
el adenocarcinoma ductal de páncreas y/o contra la pancreatitis.
El presente método comprende además una etapa de
extracción de la muestra, ya sea para obtener el extracto de
proteínas de ésta, o bien para obtener el extracto de RNA total.
Uno de estos dos extractos representa el material de trabajo para la
siguiente fase. Los protocolos de extracción de la proteína total o
del RNA total son bien conocidos por el experto en la materia
(Chomczynski P. y col., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski
P., Biotechniques, 1993, 15: 532).
Cualquier ensayo convencional se puede utilizar
en el marco de la invención para detectar un carcinoma, siempre que
mida in vitro los niveles de mRNA transcrito del gen drm o
su cDNA complementario, la concentración de proteína DRM, o los
niveles de mRNA transcrito del gen nbl1 o su cDNA complementario, o
la concentración de proteína NBL1, en muestras recogidas de los
individuos a analizar y de individuos control.
Así pues, esta invención proporciona un método
para detectar la presencia de una pancreatitis y/o de un
adenocarcinoma ductal de páncreas en un individuo, para determinar
el estadio o la severidad de dichas enfermedades del páncreas en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a
un individuo que presente dichas enfermedades, basado bien en la
medida de la concentración de la proteína DRM, o bien en la medida
del nivel de expresión del gen drm, o bien en la medida de la
concentración de la proteína NBL1, o bien en la medida del nivel de
expresión del gen nbl1, o bien en cualquier combinación de dichas
medidas.
En el caso de que lo que se pretenda detectar
sea la proteína DRM o la proteína NBL1, el método de la invención
comprende una primera etapa de puesta en contacto del extracto de
proteínas de la muestra con una composición de uno o más anticuerpos
específicos contra uno o más epítopos de la proteína DRM o de la
proteína NBL1, y una segunda etapa de cuantificación de los
complejos formados por anticuerpos y la proteína DRM o la proteína
NBL1.
Existe una amplia variedad de ensayos
inmunológicos disponibles para detectar y cuantificar la formación
de complejos específicos antígeno-anticuerpo;
numerosos ensayos de unión de proteínas, competitivos y no
competitivos, han sido previamente descritos, y un gran número de
estos ensayos está disponible comercialmente.
Así, la proteína DRM o la proteína NBL1 se
pueden cuantificar con anticuerpos como, por ejemplo: anticuerpos
monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos recombinantes de
ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos,
específicos contra la proteína DRM; siendo estos anticuerpos
humanos, humanizados o de origen no humano. Los anticuerpos que se
emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no; los
anticuerpos no marcados se pueden utilizar en ensayos de
aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una
amplia variedad de ensayos. Las moléculas marcadoras que se pueden
utilizar para marcar los anticuerpos incluyen radionucleótidos,
enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos
enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas,
colorantes y derivados.
Existe una amplia variedad de ensayos bien
conocidos, que se pueden utilizar en la presente invención, que
utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y
anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas
se incluyen el Western-blot o transferencia Western,
ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o ensayo
inmunoabsorvente ligado a enzima), RIA (Radioinmunoassay o
Radioinmunoensayo), EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay
o Inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA
(Double antibody sándwich-ELISA o ensayo ELISA
sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e
inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o
microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o
ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como
dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar la
Proteína DRM o la proteína NBL1, incluyen técnicas de cromatografía
de afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a
lectina.
El inmunoensayo preferido en el método de la
invención es un ensayo ELISA sándwich con doble anticuerpo
(DAS-ELISA). En este inmunoensayo se puede
utilizar cualquier anticuerpo o combinación de anticuerpos,
específicos contra uno o más epítopos de la proteína DRM o de la
proteína NBL1. Como ejemplo de uno de los muchos posibles formatos
de este ensayo, un anticuerpo, monoclonal o policlonal, o un
fragmento de este anticuerpo, o una combinación de anticuerpos, que
recubren una fase sólida, se ponen en contacto con la muestra a
analizar, y se incuban durante un tiempo y en condiciones
apropiados para formar los complejos
antígeno-anticuerpo. Después de un lavado en
condiciones apropiadas para eliminar los complejos no específicos,
se incuba con los complejos antígeno-anticuerpo, en
condiciones y tiempo apropiados, un reactivo indicador, que
comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento de
este anticuerpo, o una combinación de estos anticuerpos, unidos a
un compuesto generador de una señal. La presencia de la proteína DRM
o de la proteína NBL1 en la muestra a analizar, se detecta y
cuantifica, en caso de que exista, midiendo la señal generada. La
cantidad de proteína DRM o de la proteína NBL1 presente en la
muestra analizar es proporcional a esa señal.
En el caso de que se pretenda detectar el mRNA o
el cDNA correspondiente al gen drm o el mRNA o el cDNA
correspondiente al gen nbl1, y no las proteínas que codifican, el
método de la invención para detectar in vitro el carcinoma
posee etapas diferentes. Así, una vez obtenida la muestra y
extraído el RNA total, el método de la invención, la detección del
mRNA o del correspondiente cDNA del gen drm, o del mRNA o del
correspondiente cDNA del gen nbl1, comprende una primera etapa de
amplificación del extracto de RNA total o del correspondiente cDNA
sintetizado por retrotranscripción a partir del mRNA, y una segunda
etapa de cuantificación del producto de la amplificación del mRNA o
del cDNA del gen drm, o del mRNA o del cDNA del gen nbl1.
Un ejemplo de amplificación del mRNA, consiste
en retrotranscribir el mRNA en cDNA (RT), seguido de la Reacción en
Cadena de la polimerasa (PCR), usando oligonucleótidos cebadores,
siendo las secuencias de los cebadores utilizados
5'-CAGTCTTGCACATAAGTGCAG-3' (SEQ ID
NO 1) y 5'- GGCATTTTCAATGAAAGTT: GG-3' (SEQ ID NO
2) para drm y 5'- GGGATGGGCTCGCTGAA-3' (SEQ ID NO 3)
y 5'-GCCCAAGTGAACCCTGACTGT-3' (SEQ
ID NO 4) para nbl1; la PCR es una técnica de amplificación de una
determinada secuencia nucleotídica (diana) contenida en una mezcla
de secuencias nucleotídicas. En la PCR, se utiliza un exceso de una
pareja de oligonucleótidos cebadores, que hibridan con las hebras
complementarias de la secuencia nucleotídica diana. A continuación,
una enzima con actividad polimerasa (DNA Taq Polimerasa) extiende
cada cebador, utilizando como molde la secuencia nucleotídica
diana. Los productos de la extensión se convierten entonces en
secuencias dianas, tras la disociación de la hebra diana original.
Nuevas moléculas de cebador hibridan y la polimerasa las extiende;
el ciclo se repite para aumentar exponencialmente el número de
secuencias diana. Esta técnica está descrita en las patentes US
4683195 y US 4683202. Se han descrito previamente muchos métodos
para detectar y cuantificar los productos de la amplificación por
PCR, de los que cualquiera puede ser usado en esta invención. En un
método preferido de la invención, el producto amplificado se
detecta por electroforesis en gel de agarosa, de la manera
siguiente: cinco microlitros del producto de la amplificación se
someten a una separación por electroforesis en un gel de agarosa a
una concentración del 2%, en un tampón TBE 0,5x a 100 vdc, durante
una hora. Tras la electroforesis, el gel se tiñe con bromuro de
etidio y el producto de la amplificación se visualiza al iluminar el
gel con luz ultravioleta (uv); como alternativa a la tinción, y
realización preferida, se puede transferir el producto amplificado
a una membrana de nailon por técnicas de Southern blotting o
transferencia Southern, para ser detectado con una sonda
específica del cDNA del gen drm, convenientemente marcada.
En otro ejemplo la detección del mRNA se realiza
transfiriendo el mRNA a una membrana de nailon, mediante técnicas
de transferencia como por ejemplo Northern-blot o
transferencia Northern, y detectándolo con sondas específicas del
mRNA o del correspondiente cDNA del gen drm, o del mRNA o del
correspondiente cDNA del gen nbl1.
En una realización particular la amplificación y
cuantificación del mRNA correspondiente al gen drm y/o la
amplificación y cuantificación del mRNA correspondiente al gen
nbl1, se realiza a la vez mediante RT-PCR
cuantitativa a tiempo real (Q-PCR).
El paso final del método de la invención para
detectar in vitro un adenocarcinoma ductal de páncreas, en
una muestra procedente de un individuo comprende comparar la
cantidad de proteína DRM, la cantidad de mRNA del gen drm o la
cantidad del correspondiente cDNA, o la cantidad de Proteína NBL1,
la cantidad de mRNA del gen nbl1 o la cantidad del correspondiente
cDNA, detectada en una muestra de un individuo, con la cantidad de
proteína DRM, la cantidad de mRNA del gen drm, o la cantidad del
correspondiente cDNA, o con la cantidad de Proteína NBL1, la
cantidad de mRNA del gen nbl1, o la cantidad del correspondiente
cDNA, detectada en las muestras de individuos control o en muestras
no tumorales del mismo individuo, o con los valores normales de
referencia.
De modo semejante, si bien trabajando sólo con
el gen o la proteína DMR, se realizará el paso final del método de
la invención para detectar in vitro una pancreatitis.
En su segundo objeto, la invención también
proporciona un método in vitro para identificar y evaluar la
eficacia de agentes para terapia de un adenocarcinoma ductal de
páncreas, que comprende:
a) poner en contacto un cultivo de células
inmortalizadas de páncreas, con el compuesto candidato, en las
condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que
interaccionen,
b) detectar y cuantificar los niveles de
expresión del gen drm, la Proteína DRM, el gen nbl1, la proteína
NBL1, o cualquier combinación de ellos y
c) comparar dichos niveles de expresión con los
de cultivos control de células tumorales sin tratar con el
compuesto candidato.
De modo semejante, si bien trabajando sólo con
el gen o la proteína DMR, la invención proporciona un método in
vitro para identificar y evaluar la eficacia de agentes para
terapia de una pancreatitis.
La cuantificación de los niveles de expresión
del gen drm, la proteína DRM, el gen nbl1 o la proteína NBL1 se
realizan de modo semejante a como se indica en el método de la
invención para detectar in vitro la presencia de un
adenocarcinoma ductal de páncreas o una pancreatitis en un
individuo.
Cuando un agente disminuye los niveles de
expresión del gen drm y/o del gen nbl1 o revierte los efectos de la
expresión elevada de dicho gen, preferiblemente disminuyendo los
niveles de proliferación celular, este agente se convierte en
candidato para la terapia de un adenocarcinoma ductal de páncreas.
Similarmente, cuando un agente disminuye los niveles de expresión
del gen drm o revierte los efectos de la expresión elevada de dicho
gen, este agente se convierte en candidato para la terapia de una
pancreatitis.
Por tanto, otro objeto de la invención se
refiere al uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas
del gen drm y/o del gen nbl1, en métodos de búsqueda,
identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos
para terapia de un adenocarcinoma ductal de páncreas y/o de una
pancreatitis. Dentro de los métodos de búsqueda, resalta la
importancia adquirida últimamente por los métodos de screening de
fármacos basados en el binding, competitivo o no, de la molécula
potencial fármaco a la diana terapéutica.
Otro objeto adicional de la invención se refiere
al uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen
drm y/o del gen nbl1 para detectar la presencia de un
adenocarcinoma ductal de páncreas y/o de una pancreatitis, para
determinar el estadio o la severidad de dicho carcinoma en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada
a un individuo que presente dicho carcinoma.
Otro objeto de la invención consiste en
proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o
la actividad de la proteína DRM y/o de la proteína NBL1. Estos
agentes, que se pueden identificar y evaluar según la presente
invención, pueden ser seleccionados del grupo formado por:
a) un anticuerpo, o combinación de anticuerpos,
específicos contra uno o más epítopos presentes en la Proteína DRM
o en la proteína NBL1, preferiblemente un anticuerpo monoclonal
humano o humanizado; pudiendo ser también un fragmento del
anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo
anti-idiotipo,
b) agentes citotóxicos, tales como toxinas,
moléculas con átomos radiactivos, o agentes
quimio-terapéuticos, entre los que se incluyen, sin
limitación, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos,
fosfopéptidos, moléculas antisentido ribozimas, siRNAs, moléculas de
triple hélice, etc., que inhiben la expresión y/o la actividad de la
Proteína DRM y/o de la proteína NBL1, y
c) compuestos antagonistas de la Proteína DRM
y/o de la proteína NBL1, que inhiben una o más de las funciones de
la Proteína DRM y/o de la proteína NBL1.
Por último, constituye también un objeto de la
presente invención una composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de uno o varios agentes de los
mencionados anteriormente junto con uno o más excipientes y/o
sustancias transportadoras. Además dicha composición puede contener
cualquier otro ingrediente activo que inhiba la función de la
proteína DRM y/o de la proteína NBL1.
Los excipientes, sustancias transportadoras y
sustancias auxiliares tienen que ser farmacéuticamente y
farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados con
otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan
efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones
farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas
para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea,
intradérmica, intramuscular e intravenosa), aunque la mejor vía de
administración depende del estado del paciente. Las formulaciones
pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se
preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la
farmacología. Las cantidades de sustancias activas para
administrarse pueden variar en función de las particularidades de la
terapia.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Microarrays. Se utilizaron los
microarrays GeneChip Test 3 (Affymetrix, Santa Clara), que permiten
analizar la calidad del RNA, previamente al análisis de expresión
con el array GeneChip Human Genome U133A (Affymetrix, Santa Clara),
que representa 13.220 secuencias completas de genes anotados; el
gen drm está representado en el microarray por el set de sondas
218468_s_at de Affymetrix, que son oligonucleótidos sentido de 25
nucleótidos de longitud, diseñados en base a la secuencia Hs.40098
de Unigene, o AF0154054 de GeneBank (Tabla 1); el gen nbl1 está
representado en el microarray por el set de sondas 201621_at de
Affymetrix, que son oligonucleótidos sentido de 25 nucleótidos de
longitud, diseñados en base a la secuencia Hs.76307 de Unigene, o
NM_005380 de GeneBank (Tabla 2).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras. Las muestras estudiadas
procedían de biopsias obtenidas por resección quirúrgica: Biopsias
control de tejido pancreático descrito como no tumoral ("sano")
en el análisis anatomopatológico, procedentes de individuos que
presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 1); biopsias de
tejido pancreático no tumoral pero inflamado ("Pancreatitis"),
procedentes de individuos que presentaban adenocarcinoma ductal de
páncreas (n = 1); biopsias de tejido pancreático no tumoral pero
inflamado ("Pancreatitis crónica"), procedentes de individuos
control sin adenocarcinoma ductal de páncreas, pero con pancreatitis
crónica (n = 1); biopsias de tejido pancreático tumoral,
procedentes de pacientes que presentaban adenocarcinoma ductal de
páncreas (n = 10) en uno de los siguientes estadios: Estadio I,
tumor limitado al páncreas; estadio III, tumor extendido a ganglios
linfáticos regionales; estadio IVB, existe metástasis en tejidos u
órganos distantes. Todas las muestras fueron clasificadas clínica e
histológicamente (grado y estadio) en el Hospital Central de
Asturias, el mismo hospital donde las muestras habían sido recogidas
siguiendo los preceptos de la declaración de Helsinki. Las muestras
se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente tras su extracción
y se mantuvieron a -80ºC hasta el momento de su análisis.
De cada tipo de tumor se recibieron los
siguientes casos:
- - Tumor estadio I:
- 7 muestras
- - Tumor estadio III:
- 1 muestra
- - Tumor estadio IV:
- 2 muestras
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis se llevó a cabo con RNA total
procedente de sujetos individuales. Las 13 muestras que fueron
analizadas se describen en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
El RNA total de cada una de las biopsias se
obtuvo homogenizando el tejido en TRIzol® Reagent (Life
Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA
total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski
P. y col., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P.,
Biotechniques, 1993, 15: 532). De cada preparación de RNA total se
usaron 10 \mug como material de partida para la síntesis de la
primera hebra de cDNA con la enzima transcriptasa inversa
SuperScript^{TM} II RNase (Life Technologies), usando como
cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la
secuencia del promotor de la RNA polimerasa del fago T7. La segunda
hebra de cDNA se sintetizó utilizando los enzimas DNA polimerasa I
de E. coli (Invitrogen Life Technologies), DNA ligasa de
E. coli (Invitrogen Life Technologies), Rnasa H de E.
coli (Invitrogen Life Technologies), y DNA polimerasa del fago
T4 (Invitrogen Life Technologies). El cRNA marcado con biotina se
sintetizó usando el kit ENZO BioArray^{TM} HighYield^{TM}
Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics Inc). Después de la
transcripción in vitro, se eliminaron los nucleótidos no
incorporados usando las columnas Rneasy (QIAGEN).
\vskip1.000000\baselineskip
Se fragmentaron 15 \mug de cada cRNA
biotinilado a 94ºC durante 35 minutos en una solución tampón que
contenía 40 mM Tris-Acetato (pH 8.1), 100 mM KOAc y
30 mM MgOAc. El cRNA fragmentado se mezcló con buffer de
hibridación (100 mM MES, 1M NaCl, 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20) y se
calentó a 99º durante 5 minutos y posteriormente a 45º durante 5
minutos, para a continuación ser cargado en el array de Affymetrix.
El primer array en el que se realizó la hibridación fue el Test 3 de
Affymetrix. Este array permite testar la calidad del RNA previo al
análisis de expresión en el Affymetrix® GeneChip® Human
Genome 133 A (HG-U133A).
Para la hibridación, los arrays se incubaron en
un horno rotatorio a 45º durante 16 horas y con una rotación
constante de 60 rpm.
El lavado y tinción de cada array se llevó a
cabo en la Estación de Fluidos de Affymetrix®. Se usó un programa
de lavado y tinción que incluía:
- 10x2 ciclos de lavado con
SSPE-T 6x (0.9 m NaCl, 60 mM NaH_{2}PO_{4}Ç, 6
mM EDTA, 0.01% Tween 20) a 25º,
- 4x15 ciclos con 0.1 mM MES, 0.1M NaCl, 0.01%
Tween 20 a 50º,
- Tinción del cRNA biotinilado con un conjugado
estreptavidina-ficoeritrina (10 \mug/ml,
Molecular Probes)
- 10x4 ciclos de lavado con
SSPE-T a 25º
- Tinción con un anticuerpo
anti-estreptavidina durante 10 minutos
- Tinción un conjugado
estreptavidina-ficoeritrina (1 mg/ml, Molecular
Probes) durante 10 minutos
- 15x4 ciclos de lavado con
SSPE-T a 30º
Los arrays se escanearon a 560 nm usando un
microscopio confocal que utiliza emisión láser (Agilent GeneArray
Scanner). El análisis de las lecturas de intensidad se realizó con
el software Microarray Suite 5.0. Para la comparación de arrays,
éstos fueron escalados a una intensidad total de 100.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis diferencial de la expresión de los
genes drm y nbl1 en los estadios tumorales, con respecto a los
controles no tumorales, se realizó a partir de los datos de
comparación de arrays obtenidos utilizando el software de
Affymetrix. Los parámetros que se tuvieron en cuenta (en el orden
en el que aparecen en la lista) fueron: i) Detección. Indica
si el transcrito está Presente (P), Ausente (A) o Marginal (M), ii)
Cambio: Indica si la expresión de un determinado transcrito
Aumenta (I), Decrece (D), No Cambia (NC), Aumenta Marginalmente
(MI), o Decrece Marginalmente (MD), iii) Signal Log Ratio
(SLR): Indica el nivel de cambio de expresión entre la línea
base (control) y una muestra problema. Este cambio se expresa como
el log2 del ratio (fold change o número de veces que la
expresión del gen está elevada o reprimida en la muestra
problema-tumoral frente a la muestra
control-sana). Se considera significativo un valor
de SLR de 1 (equivalente a un fold change de 2), para
transcritos cuya expresión aumenta frente al control y de -1, para
transcritos cuya expresión disminuye frente al control.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
El análisis diferencial de la expresión del gen
drm en los estadios tumorales con respecto al control no tumoral
("sano") (PA36), demostró que los niveles de expresión del gen
drm estaban incrementados, entre 5 (SLR=2,3) y 80 veces (SLR=6,4),
en todas las biopsias de tumores de páncreas de estadio I, de
estadio III y de estadio IV; la expresión del gen drm estaba
también incrementada, entre 6 y 8 veces (SLR=2,4 y SLR=3), en las
biopsias de pancreatitis (Tabla 4). Por otro lado, el análisis de
expresión diferencial del gen drm en los estadios tumorales, frente
al control con pancreatitis crónica (PA46), demostró que los
niveles de expresión del gen drm estaban incrementados, entre 4
(SLR=2) y 12 veces (SLR=3,6), en 4 de las 7 biopsias de tumores de
páncreas de estadio I, en la biopsia de estadio III y en las 2
biopsias de estadio IV (Tabla 5).
El análisis diferencial de la expresión del gen
nbl1 en los estadios tumorales con respecto al control no tumoral
("sano") (PA36), demostró que los niveles de expresión del gen
nbl1 estaban incrementados, entre 1,5 (SLR=0,6) y 7,5 veces
(SLR=2,9), en todas las biopsias de tumores de páncreas de estadio
I, estadio III y estadio IV (Tabla 6). Por otro lado, el análisis
de expresión diferencial del gen nbl1 en los estadios tumorales,
frente al control con pancreatitis crónica (PA46), demostró que los
niveles de expresión del gen nbl1 estaban incrementados entre 6 y 9
veces (SLR=2,4 y SLR=3,3) en 4 de las 7 biopsias de estadio I y en
1 de las 2 biopsias de estadio IV (Tabla 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demostraron que la expresión
del gen drm estaba incrementada en la mayoría de los tumores de
tipo I y en todos los tumores de tipo III y IV, tanto frente a
biopsias de tejido no tumoral ("sano") como frente a biopsias
de pancreatitis crónica; por otro lado, los resultados demostraron
que la expresión del gen drm estaba también incrementada, aunque en
menor medida, en las biopsias de pancreatitis, frente a las
biopsias de tejido no tumoral ("sano").
Respecto al gen nbl1, los resultados demostraron
que sus niveles de expresión estaban incrementados en todos los
tumores de tipo I, III y IV, frente a las biopsias de tejido no
tumoral ("sano"), y también estaban incrementados en la mayoría
de los tumores frente a las biopsias de pancreatitis crónica. Sin
embargo, al contrario que drm, los niveles de expresión de nbl1 en
biopsias de pancreatitis, no estaban incrementados frente a
biopsias de tejido no tumoral ("sano"), incluso su expresión en
biopsias de pancreatitis era indetectable utilizando
DNA-chips.
El método empleado consiste en la transcripción
inversa del mRNA a cDNA y su. posterior amplificación en un equipo
LightCycler (Roche), utilizando SYBR Green para la detección
del producto amplificado. La cuantificación se realiza en tiempo
real y permite calcular la expresión relativa de la secuencia en
diferentes muestras, en la fase de amplificación lineal de la
reacción.
Muestras. Las muestras estudiadas
procedían de biopsias obtenidas por resección quirúgica: Biopsias de
tejido pancreático descrito como no tumoral ("sano") en el
análisis anatomopatológico, procedentes de individuos que
presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 1); biopsias de
tejido pancreático no tumoral pero inflamado ("pancreatitis
crónica"), procedentes de individuos control sin adenocarcinoma
ductal de páncreas, pero con pancreatitis crónica (n = 1); biopsias
de tejido pancreático tumoral procedentes de individuos que
presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 5) en uno de los
siguientes estadios: Estadio I, tumor limitado al páncreas; estadio
III, tumor extendido a ganglios linfáticos regionales; estadio IVB,
existe metástasis en tejidos u órganos distantes. Todas las muestras
fueron clasificadas clínica e histológicamente (grado y estadio) en
el Hospital Central de Asturias, el mismo hospital donde las
muestras habían sido recogidas siguiendo los preceptos de la
declaración de Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno
líquido inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a -80ºC
hasta el momento de su análisis.
RT-PCR Cuantitativa en Tiempo
Real. El análisis se llevó a cabo con RNA total procedente de
sujetos individuales. Las 7 muestras que fueron analizadas se
describen en la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El RNA total de cada una de las biopsias se
obtuvo homogenizando el tejido en TRIzol® Reagent (Life
Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA
total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski
P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P.,
Biotechniques, 1993, 15: 532). El RNA se cuantificó
espectrofotométricamente y se digirieron 5 \mug de RNA total con
DNasal. Se utilizó 1 \mug de RNA tratado con DNAsa como material
de partida para la síntesis de la primera hebra de cDNA con la
enzima transcriptasa inversa SuperScript^{TM} II RNase (Life
Technologies), usando como cebador un oligonucleótido
oligo-dT que contenía la secuencia del promotor de
la RNA polimerasa del fago T7. Se prepararon alícuotas del cDNA
diluido a la concentración de trabajo.
\vskip1.000000\baselineskip
El cDNA sintetizado se amplificó utilizando
cebadores específicos del gen humano drm
(5'-CAGTCTTGCACA
TAAGTGCAG-3' -SEQ ID NO1- y 5'-GGCATTTTCAATGAAAGTTGG-3' -SEQ ID NO2-), del gen humano nbl1 (5'- GGGATGGGCTCGCTGAA-3' -SEQ ID NO3- y 5'-GCCCAAGTGAACCCTGACTGT-3' -SEQ ID NO4-), y del gen que codifica la proteína ribosomal L10 humana (5'-TGCGATGGCTGCACACA-3' -SEQ ID NO27- y 5'- TCCCTTAGAGCAACCCATACAAC-3' -SEQ ID NO28-). Las reacciones de PCR en tiempo real se prepararon utilizando el kit LightCycler-FastStart DNA master SYBR Green 1 kit (Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. El programa de amplificación consistía en 1 ciclo de 95ºC durante 10 min ("hot start") seguido de 45 ciclos de 95ºC (desnaturalización) durante 10 seg, 60ºC (anillamiento) durante 5 seg, 72ºC (amplificación y adquisición de fluorescencia) durante 10 seg. El programa de análisis de curvas de desnaturalización consistía en un ciclo de un pulso de 95ºC, 65ºC durante 15 seg, y un pulso de 95ºC durante el paso de amplificación y adquisición.
TAAGTGCAG-3' -SEQ ID NO1- y 5'-GGCATTTTCAATGAAAGTTGG-3' -SEQ ID NO2-), del gen humano nbl1 (5'- GGGATGGGCTCGCTGAA-3' -SEQ ID NO3- y 5'-GCCCAAGTGAACCCTGACTGT-3' -SEQ ID NO4-), y del gen que codifica la proteína ribosomal L10 humana (5'-TGCGATGGCTGCACACA-3' -SEQ ID NO27- y 5'- TCCCTTAGAGCAACCCATACAAC-3' -SEQ ID NO28-). Las reacciones de PCR en tiempo real se prepararon utilizando el kit LightCycler-FastStart DNA master SYBR Green 1 kit (Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. El programa de amplificación consistía en 1 ciclo de 95ºC durante 10 min ("hot start") seguido de 45 ciclos de 95ºC (desnaturalización) durante 10 seg, 60ºC (anillamiento) durante 5 seg, 72ºC (amplificación y adquisición de fluorescencia) durante 10 seg. El programa de análisis de curvas de desnaturalización consistía en un ciclo de un pulso de 95ºC, 65ºC durante 15 seg, y un pulso de 95ºC durante el paso de amplificación y adquisición.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar se determinó la especificidad de
los productos de PCR analizando las curvas de desnaturalización.
Posteriormente, como medida relativa de la expresión génica, se
calculó la relación entre la abundancia de mRNAs transcritos de drm
y la abundancia de transcritos de ribl10 y se normalizó el dato de
la relación en cada una de las muestras tumorales en base a los
valores de la muestra control. Para calcular la eficiencia de las
reacciones de PCR (drm y ribl10) se construyó, para cada secuencia
génica, una curva patrón realizada con diluciones seriadas de cDNA.
A las concentraciones de cDNA molde para las reacciones en la curva
patrón se les dieron valores arbitrarios 10, 5, 2.5, 1.25 y 0.625.
La eficiencia se calculó utilizando la ecuación:
E=
10^{-1/p}
donde E es la eficiencia de
amplificación y p es la pendiente de la recta
patrón.
\vskip1.000000\baselineskip
La relación de los valores de expresión génica
se determinó utilizando la siguiente ecuación, que relaciona los
datos experimentales de la amplificación y corrige el error
originado por la diferencia de eficiencia de las reacciones de
PCR:
\vskip1.000000\baselineskip
donde E es la eficiencia de
amplificación, Cp es el punto de corte (Crossing
point), diana es drm, referencia es ribl10,
control es la muestra control (sano o pancreatitis) y
muestra es la muestra
tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
El mismo protocolo se realizó para cuantificar
nbl1, en comparación con ribl10
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de los productos de PCR demostró la
amplificación específica de dos productos con temperaturas de
desnaturalización similares a las esperadas según el software
empleado para el diseño de los cebadores, PrimerExpress (Applied
Biosystems) (Figura 1, para drm; figura 4, para nbl1).
\vskip1.000000\baselineskip
De cada una de las 5 diluciones de cDNA se
amplificaron dos réplicas y los puntos de corte (Cp) de cada una de
ellas se representaron en una gráfica respecto al logaritmo de la
concentración de cDNA para construir la recta patrón (Tablas 9 y 10,
figuras 2 y 3 para drm; tablas 13 y 14, figuras 5 y 6 para
nbl1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Dos réplicas de cada muestra se amplificaron con
los cebadores específicos de drm y ribl10. A partir de los puntos de
corte generados en estas amplificaciones se calcularon los cambios
de expresión del gen drm en las muestras tumorales respecto al
control no tumoral ("sano") y al control de pancreatitis
aplicando la ecuación anteriormente descrita (Tablas 11 y 12).
El mismo protocolo se realizó para cuantificar
nbl1, en comparación con ribl10 (Tablas 15 y 16).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados confirmaron los datos obtenidos
midiendo la diferencia de expresión génica con
DNA-chips (ejemplo 1), esto es, la expresión del gen
drm estaba fuertemente incrementada en todas las muestras tumorales
respecto a las muestras no tumorales ("sanas"), con un
incremento medio de 90 veces, mientras que el incremento de la
expresión en las muestras tumorales frente a las muestras con
pancreatitis crónica era menor, con un incremento medio de 2,2
veces, y en 4 de las 5 muestras tumorales analizadas; la expresión
de drm en la muestra PA33, al igual que ocurría al medirla con
DNA-chips, no estaba incrementada frente a la
muestra con pancreatitis crónica. Por otro lado, la expresión del
gen nbl1 estaba incrementada en todas las muestras tumorales
respecto a las muestras sanas, con un incremento medio de 4,2
veces, y respecto a las muestras con pancreatitis crónica, con un
incremento medio de 2,3 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados confirmaron que el incremento
de la expresión génica de drm y de nbl1 estaba asociado al
adenocarcinoma ductal de páncreas, y que el incremento de la
expresión génica de drm también estaba asociado a pancreatitis.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras: Las muestras estudiadas
procedían de biopsias de páncreas obtenidas por resección
quirúgica: Biopsias de tejido pancreático no tumoral ("sano"),
procedentes de individuos control sin adenocarcinoma ductal de
páncreas (n = 2); biopsias de tejido pancreático no tumoral,
procedentes de individuos que presentaban adenocarcinoma ductal de
páncreas (n = 4); biopsias de tejido pancreático no tumoral, pero
inflamado (pancreatitis), procedentes de individuos que presentaban
pancreatitis y adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 3); biopsias
de tejido pancreático tumoral, procedentes de pacientes que
presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 4); biopsias de
tejido pulmonar tumoral, procedente de un individuo con metástasis
en pulmón (n = 1) y de tejido pulmonar no tumoral procedente del
mismo paciente (n = 1); y finalmente extractos de cultivos de
células pancreáticas ductales inmortalizadas. Todas las muestras
fueron clasificadas histológicamente (grado y estadio) en el
Hospital Central de Asturias, el mismo hospital donde las muestras
habían sido recogidas siguiendo los preceptos de la declaración de
Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido
inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a -80ºC hasta el
momento de su análisis.
Obtención de extractos proteicos: Las
muestras congeladas se homogeneizaron con politrón en tampón RIPA B
[fosfato sódico 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, Tritón
X-100 1%, EDTA 5 mM y un cóctel de inhibidores de
proteasas (Roche Diagnostics Inc., Mannheim, RFA)]. Las muestras se
centrifugaron entonces a 15000 xg durante 10 min a 4ºC, para
eliminar los restos celulares; a continuación se recuperó el
sobrenadante y se estimó la concentración de proteínas mediante el
ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA,
EE.UU.)
Ensayos de transferencia de Western: Se
tomaron muestras de los extractos proteicos con 40 \mug de
proteína total, se les añadió tampón de carga de
SDS-PAGE con un 5% de
\beta-mercaptoetanol, se incubaron a 100ºC durante
5 min y a continuación se cargaron en un gel de poliacrilamida al
8%. Las proteínas se transfirieron luego a membranas de
nitrocelulosa para revelarlas con anticuerpos específicos contra la
proteína DRM. Finalmente, las membranas se hibridaron con un
anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Amersham, Little
Chalfont, RU) y se detectó la señal quimoluminiscente con el
sistema ECL (Amersham). Los films empleados fueron también de
Amersham.
\vskip1.000000\baselineskip
Expresión de DRM en adenocarcinomas
pancreáticos humanos: Los resultados obtenidos se recogen en la
Figura 7 y en la Tabla 17. Como se puede observar, los niveles de
expresión de la proteína DRM son casi indetectables, o
indetectables, en los tejidos pancreáticos no tumorales, procedentes
de individuos sanos (PA15, PA42), así como en los tejidos
pancreáticos no tumorales, procedentes de individuos con
adenocarcinoma ductal de páncreas (PA34, PA35, PA36, PA37) ; estas 4
muestras procedían del mismo páncreas que la muestra tumoral PA33.
En cambio, DRM se encontraba sobreexpresada en los cuatro
adenocarcinomas ductales pancreáticos analizados (PA23, PA24, PA27
Y PA33). En el caso de los tejidos pancreáticos no tumorales, pero
inflamados, procedentes de individuos con tumor y pancreatitis, DRM
se detectaba en 1 (PA29) de las 3 muestras analizadas (PA28, PA29,
PA30); las 3 muestras procedían del mismo páncreas que la muestra
tumoral PA27; PA29 y PA30 procedían de la parte posterior de la
cabeza del páncreas, PA28 procedía de la parte anterior de la cabeza
del páncreas; PA29, la muestra positiva, presentaba un alto grado de
inflamación. La banda inmunorreactiva específica se situaba a unos
18 kDa, lo que corresponde a la forma madura de la proteína DRM; se
observaban también unas bandas inespecíficas de mayor peso
molecular
(Figura 7).
(Figura 7).
Los resultados confirmaron a nivel de expresión
proteica, los datos obtenidos midiendo la diferencia de expresión
génica, esto es, la expresión de la proteína DRM estaba
incrementada en todas las muestras tumorales respecto a las muestras
sanas; por otro lado, mientras que en las muestras no tumorales
procedente de un paciente afectado de adenocarcinoma ductal de
páncreas, no se detectaba la proteína DRM, una de las muestras no
tumorales, pero inflamadas, procedente de un paciente afectado de
adenocarcinoma ductal de páncreas y de pancreatitis, presentaba un
elevado nivel de expresión de la proteína DRM, lo que confirma la
asociación de esta proteína no sólo al adenocarcinoma ductal de
páncreas, sino también a pancreatitis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Medplant genetics, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos para el diagnóstico in
vitro y pronóstico in vitro del adenocarcinoma ductal de
páncreas y/o de una pancreatitis; y para el desarrollo de fármacos
contra el adenocarcinoma ductal de páncreas y/o contra una
pancreatitis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 200302213
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> ES 200302213
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-09-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la amplificación por
PCR del gen DRM
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtcttgca cataagtgca g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<223> Cebador para la amplificación por
PCR del gen DRM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipggcattttca atgaaagttg g
\hfill21
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<210> 3
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<223> Cebador para la amplificación por
PCR del gen NBL1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatgggct cgctgaa
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador para la amplificación por
PCR del gen NBL1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccaagtga accctgactg t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda correspondiente al set de
sondas 218468_s_at
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\hskip-.1em\dddseqskipggacgaggag gacatgggac ttgcg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
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sondas 201621_at
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskipaggacatggg acttgcgtgg acagt
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda correspondiente al set de
sondas 201621_at
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<400> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtggacag tcagggttca cttgg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda correspondiente al set de
sondas 201621_at
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagctgcac tttaacccta gaagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda correspondiente al set de
sondas 201621_at
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccattggac agtctccctg atgga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> cebador para la amplificación del
gen L10 humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcgatggct gcacaca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> cebador para la amplificación del
gen L10 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccttagag caacccatac aac
\hfill23
Claims (18)
1. Método in vitro para detectar la
presencia de un adenocarcinoma ductal de páncreas en un individuo,
para determinar el estadio o la severidad de dicha enfermedad en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a
un individuo que presente dicha enfermedad, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la
proteína DRM, del mRNA del gen drm, o del correspondiente cDNA, o
de cualquier combinación de ellos, en una muestra de dicho
individuo, y
b) la comparación de la cantidad de proteína
DRM, de la cantidad de mRNA del gen drm o del correspondiente cDNA
o de cualquier combinación de ellos detectada en una muestra de un
individuo, con la cantidad respectiva de proteína DRM, del mRNA del
gen drm, o del correspondiente cDNA, o con cualquier combinación de
ellos, detectada en las muestras de individuos control o en
muestras anteriores del mismo individuo o con los valores normales
de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según las reivindicaciones anteriores
en el que dicha muestra es una muestra de tejido de páncreas.
3. Método según la reivindicación 2 en el que
dicha muestra de tejido de páncreas a analizar se obtiene por
cualquier método convencional, preferiblemente resección
quirúrgica.
4. Método según la reivindicación 1 en el que
dicha muestra es una muestra de orina, sangre, plasma, suero,
aspirado de jugo gástrico, bilis o semen.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que no se le
ha diagnosticado previamente un carcinoma.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que se le ha
diagnosticado previamente un carcinoma, preferentemente un
adenocarcinoma ductal de páncreas.
7. Método según las reivindicación 1, en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo en tratamiento,
o que ha sido tratado previamente, contra un carcinoma,
preferentemente un adenocarcinoma ductal de páncreas.
8. Método según la reivindicación 1
caracterizado porque comprende la realización de una
extracción de la muestra, bien para obtener un extracto de proteínas
o bien para obtener un extracto que consiste en el RNA total.
9. Método según la reivindicación 8
caracterizado porque la detección de la proteína DRM,
comprende una primera etapa de puesta en contacto del extracto de
proteínas de la muestra con una composición de uno o más anticuerpos
específicos contra uno o más epítopos de la proteína DRM, y una
segunda etapa de cuantificación de los complejos formados por los
anticuerpos y la proteína DRM.
10. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque dichos anticuerpos comprenden
anticuerpos monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos
recombinantes de ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de
anticuerpos, específicos contra la proteína DRM; siendo estos
anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano.
11. Método según las reivindicaciones 9 ó 10
caracterizado porque para la cuantificación de los complejos
formados por los anticuerpos y la proteína DRM, se utilizan
técnicas seleccionadas del grupo formado por:
Western-blot, ELISA (Enzyme-Linked
Inmunosorbent Assay o ensayo de inmunosorbente ligado a enzima), RIA
(Radioinmunoassay o Radioinmunoensayo), EIA Competitivo
(Competitive Enzyme Immunoassay o Inmunoensayo Enzimático
Competitivo), DAS-ELISA (Double antibody
Sandwich-ELISA o ensayo ELISA Sándwich con Doble
Anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas,
técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de
proteínas que incluyan anticuerpos específicos, ensayos basados en
precipitación con oro coloidal en formatos tales como
dipsticks; o mediante técnicas de cromatografía de afinidad,
ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a lectina.
12. Método según la reivindicación 8
caracterizado porque la detección del mRNA o del
correspondiente cDNA del gen drm, comprende una primera etapa de
amplificación del mRNA, incluido en el extracto de RNA total, o del
correspondiente cDNA sintetizado por retrotranscripción del mRNA,
incluido en el extracto de RNA total, y una segunda etapa de
cuantificación del producto de la amplificación del mRNA o del cDNA
del gen drm.
13. Método según la reivindicación 12
caracterizado porque la amplificación se realiza de manera
cualitativa o cuantitativa, mediante RT-PCR usando
oligonucleotidos cebadores, siendo las secuencias de los cebadores
utilizados para amplificar la secuencia del gen drm 5'-
CAGTCTTGCACATAAGTGCAG -3' (SEQ ID NO 1) y 5'- GGCATTTT
CAATGAAAGTTGG -3' (SEQ ID NO 2).
CAATGAAAGTTGG -3' (SEQ ID NO 2).
14. Método según la reivindicación 8
caracterizado porque la detección se realiza con sondas
específicas bien del mRNA o del correspondiente cDNA del gen drm,
mediante técnicas como por ejemplo Northern-blot o
transferencia Northern.
15. Método según la reivindicación 8
caracterizado porque la detección del mRNA se efectúa
mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real
(Q-PCR).
16. Uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas
derivadas del gen drm para detectar in vitro la presencia de
un adenocarcinoma ductal de páncreas, para determinar in
vitro el estadio o la severidad de dicho carcinoma en el
individuo, o para monitorizar in vitro el efecto de la
terapia administrada a un individuo que presente dicho
carcinoma.
17. Método in vitro para identificar y
evaluar la eficacia de compuestos para terapia de un adenocarcinoma
ductal de páncreas, que comprende:
a) poner en contacto un cultivo de células
inmortalizadas de páncreas, con el compuesto candidato, en las
condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que
interaccionen,
b) detectar y cuantificar los niveles de
expresión del gen drm, la Proteína DRM, o cualquier combinación de
ellos y
c) comparar dichos niveles de expresión con los
de cultivos control de células inmortalizadas sin tratar con el
compuesto candidato.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Uso de secuencias nucleotidicas o peptídicas
derivadas del gen drm, en métodos de búsqueda, identificación,
desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia
de un adenocarcinoma ductal de páncreas.
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| IACOBUZIO-DONAHUE C.A. et al. Exploration of global gene expression patterns in pancreatic adenocarcinoma using cDNA microarrays. American Journal of Pathology. Abril 2003, Vol. 162, N$^{o}$ 4, todo el documento. * |
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