JPWO2017159771A1 - 肝細胞増殖因子(hgf)のpdマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 肝細胞増殖因子(HGF)の薬力学的作用を評価する方法であって、
HGFが投与された被験体から採取した生体試料中のApoA4のレベルを測定するステップを含む、
ことを特徴とする、
評価方法。
HGFが投与された被験体から採取した生体試料中のApoA4のレベルを、HGFが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体から採取した前記生体試料中のApoA4のレベルと比較するステップをさらに含む、
ことを特徴とする、
評価方法。
HGFが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体のApoA4のレベルと比較して、HGFが投与された被験体のApoA4のレベルが上昇している場合に、当該投与されたHGFが薬力学的作用をもたらす量で投与されていると判定するステップをさらに含む、
ことを特徴とする、
評価方法。
前記「ApoA4のレベル」は、ApoA4タンパク質の発現レベルである、
ことを特徴とする、
評価方法。
生体由来試料中のApoA4タンパク質の発現レベルが、イムノアッセイによって測定される、
ことを特徴とする、
評価方法。
前記生体由来試料は、血清または血漿に由来する試料である、
ことを特徴とする、
評価方法。
前記「ApoA4のレベル」は、ApoA4遺伝子の発現レベルである、
ことを特徴とする、
評価方法。
生体由来試料中のApoA4遺伝子の発現レベルが、リアルタイムPCRによって測定される、
ことを特徴とする、
評価方法。
前記生体試料は、肝細胞または肝組織である、
ことを特徴とする、
評価方法。
前記被験体は、健常人である、
ことを特徴とする、
評価方法。
前記被験体は、肝臓疾患を有する被験体である
ことを特徴とする、
評価方法。
抗ApoA4抗体を含む、
ことを特徴とする、
キット。
目的:
rh−HGFが生物活性をもたらす標的臓器、肝臓を材料として、rh−HGFによって影響を受ける分子を同定し、その中からPDマーカーの同定を試みた。分子同定には、マイクロアレイならびにリアルタイムPCR法を用いた。
rh−HGFの投与と採材
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で組み換え発現させた肝細胞増殖因子アクチベーターを用いて、CHO細胞で組み換え発現させたヒトHGFを活性化して、rh−HGFを得た。BALB/cAnNCrlCrlj雄性6週齢マウス(日本チャールスリバー)に、ダルベツコリン酸緩衝生理食塩水(Dulbecco‘s Phosphate buffered saline:PBS)(Wako,♯045−29795)またはrh−HGF(1.5mg/kg)を静脈内投与した。PBS投与直後、rh−HGFの投与後8および24時間に、3%イソフルラン吸入麻酔下にて腹部下大静脈より採血を行い、頚椎脱臼法によりマウスを安楽死させた。安楽死後、肝臓組織を採取し、RNA later(Ambion, #AM7021)に浸漬させた。下記表は、本実験に用いた試験群を示す。
採材した肝臓からTRIZOL Reagent(Invitrogen, #15596−018)、RNeasy Mini Kit(QIAGEN, #74104)、およびRNase−Free DNase set(QIAGEN, #79254)を用いてtotal RNAを精製した。RNA濃度を吸光度により測定した後、RNA 6000 Nano Assay Kit(Agilent Technologies, #5067−1511)を用いて、2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)にてクオリティチェックを実施した。
DNAマイクロアレイは、SurePrint G3 mouse GE 8×60K(Agilent Technologies, #G4852A)を使用した。得られたデータのうち、3群全てでシグナル値が100以上となっている遺伝子を対象とし、群1に対して群2または群3で2倍以上のシグナル値が増加したものを一時抽出した。その中から、可溶性タンパク質として存在しうると思われうる分子として、Gene Ontology annotationで「Extracellular」あるいは「Plasma membrane」の情報を有するものを抽出した。このようにして、rh−HGF投与によって発現が強く誘導される分子をPDマーカー候補として選んだ。
上記の分子選出法によって、ApoA4分子を抽出した(表2)。ApoA4分子は、アポリポタンパク質を構成するアポタンパク質として血中に存在する分子である。ApoA4分子は、PBSのみを投与されたマウス(群1)では発現が低く、rh−HGFを投与すると発現増強が見られた。
DNAマイクロアレイで用いたサンプルと同じRNAについて、High−Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor(Applied Biosystems, #4374966)を使用して逆転写し、cDNAを作製した。得られたcDNAを鋳型として、ApoA4 mRNA発現量をリアルタイムPCR法で検討した。検討にあたっては、Hprt mRNAを内部コントロールとした。PCR反応は、TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems, #4444557)とTaqMan Assay(ApoA4: Mm00431814_m1, Hprt: Mm03024075_m1, Applied Biosystems)を用いて、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を使用して、PCRの増幅反応を実施した。増幅反応は、95℃で20秒インキュベートした後、95℃で1秒、60℃で20秒の反応を40サイクル繰り返した。ApoA4 mRNAの発現値をサンプルごとにHprt mRNA発現値で標準化することで、サンプル間の補正を実施した。
ApoA4 mRNA定量の結果について、コントロールとrh−HGF投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した(図1)。
DNAマイクロアレイの結果得られたApoA4について、そのmRNAをリアルタイムPCR法で定量し確定した。ハウスキーピング遺伝子のHprt mRNAを内部コントロールとしたApoA4 mRNA定量の結果、その挙動はDNAマイクロアレイで見られたシグナル値の変動と相関しており、rh−HGF投与によって強く発現が増強されていることが確認された(図1)。
目的:
rh−HGFの生物活性は、その受容体c−Metを介してもたらされる。即ち、ApoA4がrh−HGFのPDマーカーであることの妥当性は、その発現誘導がc−Metに依存していることを明らかにすることによって担保できる。そこで、c−Metの特異的阻害剤を投与した健常マウスを用いて、rh−HGF投与によるApoA4発現誘導のキャンセル効果を検討した。検討は肝臓由来mRNAおよび血清中タンパク質を対象とした。
c−Met阻害剤の投与と実験群
BALB/cAnNCrlCrlj雄性6週齢マウス(日本チャールスリバー)にc−Met阻害剤PF−04217903(50 mg/kg)(Selleck Chemicals #S1094, lot. 05)または媒体(5% DMSO,10% Tween80,6.7mmol/L塩酸水)を10mL/kgの用量で経口投与し、1時間後にrh−HGF(0.5, 1.5, 5.0, 15mg/kg)またはPBSを静脈内投与した。rh−HGFまたはPBSの投与後24時間、3%イソフルラン吸入麻酔下にて腹部下大静脈より採血を行い、頚椎脱臼法によりマウスを安楽死させた。安楽死後、肝臓組織を採取し、RNA later(Ambion,#AM7021)に浸漬させた。採取した血液から血清を回収した。下記表は、本実験で用いた試験群を示す。
採材した肝臓からTRIZOL Reagent(Invitrogen, #15596−018)、RNeasy Mini Kit(QIAGEN, #74104)、およびRNase−Free DNase set(QIAGEN, #79254)を用いてtotal RNAを精製し、RNA濃度を吸光度により測定した。
リアルタイムPCR法によるApoA4 mRNAの定量は、実施例1に準じて行った。
ApoA4 mRNA定量の結果について、コントロールとrh−HGF投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した。さらに、ApoA4 mRNAが統計的に有意に増加したrh−HGF処置群について、ビヒクルとc−Met阻害剤処置群との間で対応のないt検定を実施した(図2)。
ApoA4 mRNAはrh−HGF投与により肝臓で顕著に発現が誘導・亢進することが再度確認された。更に、その誘導は、c−Met阻害剤を投与することで顕著に阻害されたことから、rh−HGF投与に伴うApoA4 mRNAの発現増強は、c−Met依存性であることが確認できた(図2)。
上記血清をもちいて、ウェスタンブロット法によってApoA4タンパク質を定量した。PBS(−)(Wako)で200倍希釈した血清に1/4容の泳動バッファー液(313mM Tris−HCl(pH6.8),10% SDS,30% Glycerol,0.2mg/mL Bromo−phenol blue,25% 2−Mercaptoethnol)を添加し(血清の最終希釈度は250倍となる)、95℃、3分加熱処理した。その内12.5μLをSDS−PAGEに供し、ニトロセルロースフィルター(Schleicher&Schuell, BA85)にブロッティングした。フィルターをブロッキング液(50mM Tris−HCl(pH7.5),150mM NaCl,5% skim−milk,0.01% Tween20,0.1% NaN3)に浸し、室温で1時間振とうしてからブロッキング液を廃棄し、goat anti−mouse Apolipoprotein A−IV抗体(GeneTex, #GTX88533)を0.42μg/mL濃度で添加した反応溶液(50mM Tris−HCl(pH7.5),150mM NaCl,5% skim−milk,4% PEG6000,0.2% EDTA/3Na,0.01% Tween20,0.2% Proclin150)に浸し、室温下で2時間振とうした。洗浄液(50mM Tris−HCl(pH7.5),150mM NaCl,0.01% Tween20)で3回洗浄した後、二次抗体のHRP標識rabbit anti−goat IgG(H+L)(Invitrogen)を1/2000濃度で添加した上記反応溶液に浸し、室温で1時間振とうした。上記洗浄液で3回洗浄した後、化学発光溶液SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Thermo Scientific)を加えて発光させ、LAS−4000(FUJIFILM)でApoA4タンパク質を検出した。
血清ApoA4 タンパク質定量の結果について、コントロールとrh−HGF投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した。さらに、ApoA4 タンパク質が統計的に有意に増加したrh−HGF処置群について、ビヒクル処置群とc−Met阻害剤処置群との間で対応のないt検定を実施した(図3)。
rh−HGF投与によるApoA4タンパク質の発現誘導は、血清中のタンパク質として検出することが可能だった。更に、その誘導は、c−Met阻害剤を投与することで阻害されたことから、rh−HGF投与に伴うApoA4 タンパク質の発現増強は、c−Met依存性であることが確認できた(図3)。
目的:
これまでの結果から、マウスApoA4タンパク質は血中で測定可能なHGFのPDマーカーと考えられた。健常マウスの肝mRNAならびに血中において、ApoA4タンパク質はHGFのPDマーカーとしての挙動をしめしたが、肝障害時においてもHGFのPDマーカーとしての挙動を示すか否かについて、実験的肝障害マウス(Jo2肝不全モデル)を用いて検証した。Jo2肝不全モデルは、抗Fasモノクローナル抗体(Anti−Fas MAb)投与によって直接に肝細胞のアポトーシスを惹起することに起因した重症度の高い肝障害モデルである。
Jo2肝不全モデルの作製
BALB/cAnNCrlCrlj雄性6週齢マウス(日本チャールスリバー)に、抗Fasモノクローナル抗体(クローン名:Jo2、BD Pharmingen, #554254, lot#3269634)0.23mg/kgを単回尾静脈内投与し、急性肝不全モデルを作製した。このモデルに対し、PBSに溶解したrh−HGFを0.15, 1.5, 15 mg/kgで、抗Fasモノクローナル抗体投与の1時間前に尾静脈内投与した。コントロール群(Control)には、PBSを尾静脈内投与した。
抗Fasモノクローナル抗体投与5時間後に3%イソフルラン吸入麻酔下にてマウスを保定し、顎骨後ろに位置する静脈より血液を採取し、コアグチェックXS(Roche−diagnostics, #ES350009)およびPTテストストリップ(Roche−diagnostics, #ES350054)を用いてプロトロンビン時間(Prothrombin time:PT)を測定した。プロトロンビン時間測定後、腹部下大静脈より採血を行った後、頚椎脱臼法により安楽死させた。血清中のAspartate Aminotransferase(AST)、Alanine transaminase(ALT)の測定は、それぞれLタイプワコー AST・J2(Wako)のキットおよびLタイプワコー ALT・J2(Wako)のキットおよび自動分析装置(Hitachi 7180 Automatic Analyzer, Hitachi High−Technologies)を用いて行った。
血清ApoA4タンパク質の定量は、実施例2に準じて行った。
PT、AST、ALTおよび血清ApoA4タンパク質の測定の結果について、コントロールとrh−HGF投与群との間でダネットの多重比較検定を実施した(図4)。
Jo2肝不全マウスにおいて、コントロールでは顕著な血中AST、ALTの上昇とPTの延長を認める一方、それらはrh−HGF投与によって強く阻害された。その時、血中ApoA4タンパク質の値は、rh−HGFの投与によって上昇し、1.5,5,15 mg/kgでは統計学的に有意な上昇を示した。以上から、HGFによる肝障害阻止効果を反映してApoA4タンパク質の上昇がみられることが判明した(図4)。
目的:
マウスを用いた実施例を通じて、血中ApoA4タンパク質がHGFのPDマーカーであることを確認した。実際に、ヒトにおいてもApoA4タンパク質が、HGFのPDマーカーとなりうるのか否かについて、ヒト初代培養肝細胞を用いて検証した。
ヒト初代培養肝細胞とrh−HGFによる処理
24ウェルプレートに播種したヒト初代培養肝細胞(3.8×105細胞/ウェル, Biopredic International, #HEP220−MW24)をIncubation Medium(製品名:Biopredic International, #MIL214)で3日培養したのち、c−Met阻害剤PF−04217903(終濃度100 nmol/L)(Selleck Chemicals, #S1094, lot. 05)または媒体(ビヒクル:DMSO)を添加し、1時間後にrh−HGF(終濃度100, 300, 1000 ng/mL)またはコントロール群(Control)には、(Incubation Medium)を添加した。
rh−HGF添加24時間後の肝細胞からRNeasy Mini Kit(QIAGEN, #74104)およびRNase−Free DNase set(QIAGEN, #79254)を用いてtotal RNAを精製し、RNA濃度を吸光度により測定した。精製したtotal RNAをHigh−Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor(Applied Biosystems, #4374966)を使用して逆転写しcDNAを作製した。得られたcDNAを鋳型として、ApoA4 mRNA発現量をリアルタイムPCR法で検討した。検討にあたっては、18S rRNAを内部コントロールとした。PCR反応は、TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems, #4444557)とTaqMan Assay(ApoA4: Hs00166636_m1, 18S rRNA: Hs99999901_s1, Applied Biosystems)を用いて、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を使用して、PCRの増幅反応を実施した。増幅反応は、95℃で20秒インキュベートした後、95℃で1秒、60℃で20秒の反応を40サイクル繰り返した。ApoA4 mRNAの発現値をサンプルごとに18S rRNA発現値で標準化することで、サンプル間の補正を実施した。
ApoA4 mRNA定量の結果について、コントロールとrh−HGF投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した。ApoA4 mRNAが統計的に有意に増加したrh−HGF処置群について、ビヒクル処置群とc−Met阻害剤処置群との間で対応のないt検定を実施した(図5)。
ヒト初代培養肝細胞をrh−HGFに暴露することによって、ヒトApoA4 mRNAの発現が強力に増強された。また、その増強効果は、特異的c−Met阻害剤によって阻害されたことから、ApoA4はヒト肝細胞においてもc−Met介在性にrh−HGF生物活性を反映したPDマーカーであることが強く示唆された。従って、ApoA4はヒトにおいてもrh−HGFのPDマーカーとなることが示唆された(図5)。
rh−HGF添加24時間後の肝細胞培養上清(mRNA調製用の細胞と同一物の培養上清)をもちいて、ウェスタンブロット法によってApoA4タンパク質を定量した。PBS(Wako)で4倍希釈した培養上清に1/4容の泳動バッファー液(313 mM Tris−HCl(pH6.8),10% SDS,30% Glycerol,0.2 mg/mL Bromo−phenol blue,25% 2−Mercuptoethnol)を添加し(培養上清の最終希釈度は20倍となる)、95℃、3分加熱処理した。その内 10μLをSDS−PAGEに供し、ニトロセルロースフィルター(Schleicher&Schuell, BA85)にブロッティングした。フィルターをブロッキング液(50 mM Tris−HCl(pH7.5),150 mM NaCl,5% skim−milk,0.01% Tween20,0.1% NaN3)に浸し、室温で1時間振とうしてからブロッキング液を廃棄し、rabbit anti−human Apolipoprotein A4抗体(Proteintech, 17996−1−AP)を0.067 μg/mL濃度で添加した反応溶液(50 mM Tris−HCl(pH7.5),150 mM NaCl,5% skim−milk,4% PEG6000,0.2% EDTA/3Na,0.01% Tween20,0.2% Proclin150)に浸し、室温下で2時間振とうした。洗浄液(50 mM Tris−HCl(pH7.5),150 mM NaCl,0.01% Tween20)で3回洗浄した後、二次抗体のHRP標識goat anti−rabbit IgG(H+L)(Jackson)を1/2000濃度で添加した上記反応溶液に浸し、室温で1時間振とうした。上記洗浄液で3回洗浄した後、化学発光溶液SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Thermo Scientific)を加えて発光させ、LAS−4000(FUJIFILM)でApoA4タンパク質を検出した。
ApoA4タンパク質の定量結果について、コントロールとrh-HGF投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した。で、ApoA4タンパク質が統計的に有意に増加したrh−HGF処置群について、ビヒクル処置群とc−Met阻害剤処置群との間で対応のないt検定を実施した(図6)。
ヒト初代培養肝細胞をrh−HGFに暴露することによって、ヒトApoA4タンパク質の細胞外への放出が強力に増強された。また、その増強効果は、特異的c−Met阻害剤によって阻害されたことから、ApoA4タンパク質はヒト肝細胞においてもc−Met介在性にrh−HGF生物活性を反映したPDマーカーであることが強く示唆された。従って、ApoA4タンパク質はヒトにおいてもrh−HGFのPDマーカーとなることが示唆された(図6)。
Claims (12)
- 肝細胞増殖因子(HGF)の薬力学的作用を評価する方法であって、
HGFが投与された被験体から採取した生体試料中のApoA4のレベルを測定するステップを含む、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項1に記載の評価方法であって、
HGFが投与された被験体から採取した生体試料中のApoA4のレベルを、HGFが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体から採取した前記生体試料中のApoA4のレベルと比較するステップをさらに含む、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項2に記載の評価方法であって、
HGFが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体のApoA4のレベルと比較して、HGFが投与された被験体のApoA4のレベルが上昇している場合に、当該投与されたHGFが薬力学的作用をもたらす量で投与されていると判定するステップをさらに含む、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の評価方法であって、
前記「ApoA4のレベル」は、ApoA4タンパク質の発現レベルである、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項4に記載の評価方法であって、
生体由来試料中のApoA4タンパク質の発現レベルが、イムノアッセイによって測定される、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の評価方法であって、
前記生体由来試料は、血清または血漿に由来する試料である、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の評価方法であって、
前記「ApoA4のレベル」は、ApoA4遺伝子の発現レベルである、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項7に記載の評価方法であって、
生体由来試料中のApoA4遺伝子の発現レベルが、リアルタイムPCRによって測定される、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項1〜3、7または8のいずれか1項に記載の評価方法であって、
前記生体由来試料は、肝細胞または肝組織である、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項1〜9のいずれか1項に記載の評価方法であって、
前記被験体は、健常人である、
ことを特徴とする、
評価方法。 - 請求項1〜9のいずれか1項に記載の評価方法であって、
前記被験体は、肝臓疾患を有する被験体である
ことを特徴とする、
評価方法。 - HGFの薬力学的作用を評価するためのキットであって、
抗ApoA4抗体を含む、
ことを特徴とする、
キット。
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