BR112014016493A2 - sinalização slit-robo para diagnóstico e tratamendo de doença renal - Google Patents

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Abstract

composição farmacêutica compreendendo um inibidor de robo2 e seu uso no tratamento de doença renal crônica ou proteinúria. são aqui fornecidos métodos para o tratamento da doença renal crônica e proteinúria, e para o diagnóstico da doença renal crônica, e monitoração dos efeitos do tratamento sobre a progressão da doença renal crônica e proteinúria, baseados em funções inesperadas para a via de sinalização slit-robo na regulação de estrutura de processo de citoesqueleto e pé de f-actina de podócitosnos rins.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO UM INIBIDOR DE ROBO2
E SEU USO NO TRATAMENTO DE DOENÇA RENAL CRÔNICA OU PROTEINÚRIA”. REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício sob U.S.C. 35 §119(e) do Pedido de Patente Provisório Norte- Americano N° de Série 61/583,379 depositado em 5 de janeiro de 2012, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] O campo da invenção refere-se a métodos para o tratamento da doença renal crônica e proteinúria, e para o diagnóstico de doença renal crônica e monitoramento dos efeitos do tratamento na progressão da doença renal crônica e proteinúria.
APOIO GOVERNAMENTAL
[0003] Esta invenção foi realizada com Apoio do Governo sob o Contrato Nº DK078226 concedido pelo National Institutes of Health. O Governo tem certos direitos sobre a invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0004] São aqui fornecidos novos métodos para o tratamento da doença renal crônica e proteinúria, e para o diagnóstico de doença renal crônica, e monitoramento dos efeitos do tratamento sobre a progressão da doença renal crônica e proteinúria com base, em parte, na descoberta dos inventores de um novo e inesperado papel para a via de sinalização SLIT-ROBO na regulação de actina-F do citoesqueleto de podócitos e estrutura do processo podálico no rim.
[0005] Desta maneira, em alguns aspectos, os métodos são aqui fornecidos para o tratamento da doença renal crônica em um indivíduo em necessidade do mesmo, os métodos que compreendem a administração a um indivíduo tendo, ou em risco de ter, uma doença renal crônica de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um inibidor de ROBO2.
[0006] Também são fornecidos aqui, em alguns aspectos, métodos para a redução da proteinúria em um indivíduo com necessidade do mesmo, que compreende administrar a um indivíduo tendo ou em risco de ter uma proteinúria, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um inibidor de ROBO2.
[0007] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é um anticorpo bloqueador ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo específico para ROBO2, uma molécula anti-senso específica para ROBO2, um RNA de interferência curto (siRNA) específico para ROBO2, uma molécula pequena inibidora de ROBO2, um polipeptídeo inibitório de ROBO2, ou um análogo estrutural de ROBO2.
[0008] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 bloqueia ou reduz a ligação de ROBO2 à SLIT, à Nck, ou a ambas.
[0009] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é específico para o domínio de ligação Ig1 SLIT, os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT, o domínio de ligação intracelular Nck, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00010] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o polipeptídeo inibitório de ROBO2 é uma proteína de fusão dominante negativa de ROBO2, um polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular de ROBO2 sem o domínio intracelular, ou um polipeptídeo compreendendo um domínio intracelular de ROBO2 sem o domínio extracelular.
[00011] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o indivíduo tendo ou em risco de uma doença renal crônica tem nefropatia diabética ou a pressão sanguínea elevada.
[00012] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de um agente terapêutico adicional.
[00013] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o agente terapêutico adicional é um inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA) ou um bloqueador do receptor de angiotensina II (BRA).
[00014] Também são aqui fornecidos, em alguns aspectos, métodos compreendendo: a. Analisar uma amostra biológica de teste a partir de um indivíduo para determinar um nível de expressão de polipeptídeo ROBO2 ou um RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2; b. Determinar se o nível de expressão de polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão de RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 na amostra biológica de teste está acima de um nível limite de referência; e c. Diagnosticar o indivíduo como em necessidade de tratamento ou terapia para a doença renal crônica.
[00015] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o ensaio do nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 é realizado utilizando um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno específico para o polipeptídeo ROBO2.
[00016] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o ensaio do nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, é realizado utilizando PCR ou um ensaio de hibridização.
[00017] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, a amostra biológica de teste é uma biópsia renal, urina, sangue, amostra de soro, ou células peletizadas a partir de uma amostra de urina.
[00018] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 é, pelo menos, 20% acima do nível limite de referência.
[00019] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 é, pelo menos, dois desvios padrão acima do nível limite de referência.
[00020] Também aqui fornecidos, em alguns aspectos, são os ensaios que compreendem: a. Contactar uma amostra biológica de teste isolada a partir de um indivíduo com um reagente que detecta o polipeptídeo ROBO2 ou um RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2; e b. Medir o nível do polipeptídeo ROBO2 ou um RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, em que um nível aumentado do referido polipeptídeo
ROBO2 ou do referido RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, em relação a uma amostra biológica normal, identifica um indivíduo com doença renal crônica e/ou progressão da doença renal crônica ou proteinúria.
[00021] Em algumas modalidades destes ensaios, e todos esses ensaios aqui descritos, a detecção do nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 é realizada utilizando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo específico para o polipeptídeo ROBO2.
[00022] Em algumas modalidades destes ensaios, e todos esses ensaios aqui descritos, a detecção do nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 é realizada utilizando PCR ou um ensaio de hibridização.
[00023] Em algumas modalidades destes ensaios, e todos esses ensaios aqui descritos, a amostra biológica de teste é uma biópsia renal, urina, sangue, amostra de soro, ou células peletizadas a partir de uma amostra de urina.
[00024] Em algumas modalidades destes ensaios, e todos esses ensaios aqui descritos, o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 é, pelo menos, 20% acima do nível limite de referência.
[00025] Em algumas modalidades destes ensaios, e todos esses ensaios aqui descritos, o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 é, pelo menos, dois desvios padrão acima do nível limite de referência.
[00026] Em algumas modalidades destes ensaios, e todos esses ensaios aqui descritos, o indivíduo foi diagnosticado com diabetes ou pressão arterial elevada.
[00027] Em alguns aspectos, são fornecidos aqui os sistemas para determinar se um indivíduo está em risco para a doença renal crônica ou proteinúria, ou tem doença renal crônica que compreende: a. Medir um módulo configurado para determinar o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 em uma amostra biológica obtida de um indivíduo; b. Comparar um módulo configurado para receber o referido nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 determinado pelo módulo de medição e realizar, pelo menos, uma análise para determinar se o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 é maior do que um nível de referência predeterminado ou a razão, e para fornecer um conteúdo recuperado; e c. Exibição do módulo de exibição para exibir um conteúdo baseado na saída de dados a partir do referido módulo de comparação, em que o conteúdo compreende um sinal indicativo de que o nível de expressão ou a razão do polipeptídeo ROBO2 ou RNA é maior do que o nível de referência predeterminado ou a razão, ou um sinal indicativo que o nível ou a razão de expressão de ROBO2 não é maior do que o nível de referência ou razão predeterminada.
[00028] Em algumas modalidades de tais sistemas e todos os sistemas aqui descritos, o conteúdo apresentado no módulo de visualização compreende ainda um sinal indicativo do indivíduo a ser recomendado para receber um regime de tratamento particular.
[00029] Em alguns aspectos, são aqui fornecidos os sistemas para determinar se um indivíduo está em risco para a doença renal crônica ou proteinúria, ou tem doença renal crônica que compreende: a. um módulo de determinação configurado para receber, pelo menos, uma amostra de teste obtida de um indivíduo e realizar, pelo menos, uma análise sobre a referida, pelo menos, uma amostra de teste para determinar a presença ou a ausência de qualquer uma das seguintes condições: i. uma razão de expressão de ROBO2 maior do que uma razão predeterminada, ou ii. um nível de expressão de ROBO2 maior do que um nível predeterminado,
b. um dispositivo de armazenamento configurado para armazenar os dados de saída a partir do referido módulo de determinação; e c. um módulo de exibição para a exibição de um conteúdo baseado sobre os dados da saída a partir do referido módulo de determinação, em que o conteúdo compreende um sinal indicativo de que a razão de expressão de ROBO2 é maior do que a razão predeterminada ou o nível de ROBO2 maior do que um nível predeterminado, ou um sinal indicativo de que a razão de expressão de ROBO2 não é maior do que a razão predeterminada ou não maior do que um nível predeterminado.
[00030] Em algumas modalidades de tais sistemas e todos os sistemas aqui descritos, o conteúdo apresentado no módulo de visualização compreende ainda um sinal indicativo do indivíduo a ser recomendado para receber um regime de tratamento particular.
[00031] Também são aqui fornecidos, em alguns aspectos, os métodos para o tratamento de um indivíduo humano com um risco de doença renal crônica ou proteinúria, que compreende a administração de um tratamento ou terapia para prevenir a ocorrência de doença renal crônica ou proteinúria a um indivíduo humano, cujo é determinado ter um nível de proteína ROBO2 acima de um nível limite de referência.
[00032] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o nível de proteína ROBO2 é, pelo menos, 20% acima do nível de referência.
[00033] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o nível de proteína ROBO2 é, pelo menos, dois desvios padrão acima do nível de referência.
[00034] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o tratamento ou a terapia para evitar a ocorrência da doença renal crônica ou proteinúria compreende um inibidor de ROBO2.
[00035] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é um anticorpo bloqueador ou seu fragmento de ligação ao antígeno específico para ROBO2, uma molécula anti-senso específica para ROBO2, um RNA de interferência curto (siRNA) específico para ROBO2, uma molécula pequena inibidora de ROBO2, um polipeptídeo inibitório de ROBO2, ou um análogo estrutural de ROBO2.
[00036] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 bloqueia ou reduz a ligação de ROBO2 para SLIT, para Nck, ou para ambas.
[00037] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é específico para o domínio de ligação Ig1 SLIT, os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT, o domínio de ligação intracelular Nck, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00038] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o polipeptídeo inibitório de ROBO2 é uma proteína de fusão dominante negativa de ROBO2, um polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular de ROBO2 sem o domínio intracelular, ou um polipeptídeo compreendendo um domínio intracelular de ROBO2 sem o domínio extracelular.
[00039] Também são aqui fornecidos, em alguns aspectos, os inibidores de ROBO2 para uso no tratamento de uma doença renal crônica, e inibidor de ROBO2 para uso no tratamento de proteinúria.
[00040] Em algumas modalidades destes usos e todos esses usos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é um anticorpo bloqueador ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo específico para ROBO2, uma molécula de anti-senso específica para ROBO2, um RNA de interferência curto (siRNA) específico para ROBO2, um inibidor de molécula pequena de ROBO2, um polipeptídeo inibidor de ROBO2, ou um análogo estrutural ROBO2.
[00041] Em algumas modalidades destes usos e todos esses usos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 bloqueia ou reduz a ligação de ROBO2 para SLIT, para Nck, ou para ambos.
[00042] Em algumas modalidades destes usos e todos esses usos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é específico para o domínio de ligação Ig1 SLIT, os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT, o domínio de ligação intracelular Nck, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00043] Em algumas modalidades destes usos e todos esses usos aqui descritos, o polipeptídeo inibidor de ROBO2 é uma proteína de fusão negativa dominante ROBO2, um polipeptídeo que compreende um domínio extracelular ROBO2 sem o domínio intracelular, ou um polipeptídeo que compreende um domínio intracelular ROBO2 sem o domínio extracelular.
[00044] Em algumas modalidades destes usos e todos esses usos aqui descritos, a doença renal crônica ou proteinúria é causada por nefropatia diabética ou a pressão sanguínea elevada.
[00045] Em algumas modalidades de qualquer um destes aspectos e todos esses aspectos aqui descritos, ROBO2 refere-se a ROBO2 humano possuindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 codificada pela sequência de mRNA da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades de qualquer um destes aspectos e todos esses aspectos aqui descritos, ROBO2 refere-se a ROBO2 humano possuindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 codificada pela sequência de mRNA da SEQ ID NO: 4.
Definições
[00046] Por conveniência, certos termos empregados aqui no relatório descritivo, exemplos e reivindicações estão aqui reunidos. A menos que indicado de outra forma, ou implicitamente a partir do contexto, os seguintes termos e frases incluem os significados indicados abaixo. A menos que especificado ao contrário, ou aparente a partir do contexto, os termos e expressões abaixo não excluem o sentido que o termo ou frase adquiriu na técnica a que se refere. As definições são fornecidas para ajudar a descrever as modalidades particulares, e não se destinam a limitar a invenção reivindicada, por que o escopo da invenção é limitado apenas pelas reivindicações. A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um técnico especialista no assunto ao qual esta invenção pertence.
[00047] Tal como aqui usado, o termo "compreendendo" ou "que compreende" é utilizado em referência às composições, métodos, e os respectivos componentes dos mesmos, que são essenciais para a invenção, ainda aberto a inclusão de elementos não-especificados, quer essenciais ou não.
[00048] Tal como aqui usado, o termo "consistindo essencialmente em" refere-se aos elementos necessários para uma determinada modalidade. O termo permite a presença de elementos adicionais que não afetam materialmente as características básicas e novas ou funcionais da modalidade da invenção.
[00049] O termo "consistindo em" refere-se a composições, métodos, e respectivos componentes dos mesmos, como aqui descritos, que são exclusivos de qualquer elemento não recitado naquela descrição da modalidade.
[00050] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem as referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, as referências ao "método" incluem um ou mais métodos, e/ou as etapas do tipo aqui descrito e/ou que se tornarão evidentes para os técnicos especialistas no assunto após a leitura desta descrição e, assim por diante.
[00051] Exceto nos exemplos de funcionamento, ou onde indicado ao contrário, todos os números que expressam as quantidades de ingredientes ou condições de reação aqui usados, devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". O termo "cerca de", quando utilizado em conexão com porcentagens podem significar ± 10%, ± 5%, ou ± 1%.
[00052] A menos que definidos de outro modo, os termos científicos e técnicos utilizados em conexão com o presente pedido devem ter os significados que são comumente entendidos por aqueles técnicos especialistas no assunto, à qual pertence esta descrição. Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos, e reagentes, etc., aqui descritos e, como tal, podem variar. A terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas as modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida somente pelas reivindicações. Definições de termos comuns em imunologia, e biologia molecular podem ser encontradas em The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al.(eds.).
The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotecnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology de Werner Luttmann, publicado por Elsevier, 2006.Definições de termos comuns em biologia molecular são encontradas em Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers
(ed.), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., N.Y., EUA (1986); ou Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S.L. Berger e A.R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, EUA (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E.
Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) e Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et al., ed.
John Wiley and Sons, Inc.), os quais são todos aqui incorporados por referência na sua totalidade.
[00053] Entende-se que a seguinte descrição detalhada e os seguintes exemplos são apenas ilustrativos e não devem ser tomados como limitações ao escopo da invenção. Várias alterações e modificações às modalidades descritas, as quais serão evidentes para aqueles técnicos especialistas no assunto, podem ser feitas sem sair do espírito e do escopo da presente invenção. Além disso, todas as patentes, pedidos de patentes, e publicações identificadas estão aqui expressamente incorporados por referência com o objetivo de descrever e revelar, por exemplo, os métodos descritos nestas publicações que podem ser utilizados em ligação com a presente invenção. Estas publicações são fornecidas somente para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada a este respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito a antecipar tal descrição em virtude da invenção anterior ou por qualquer outro motivo.
Todas as declarações quanto à data ou representação quanto aos conteúdos destes documentos são baseadas na informação disponível aos requerentes e não constituem qualquer admissão quanto à exatidão das datas ou conteúdos desses documentos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00054] As FIGURAS 1A-1R demonstram que ROBO2 é expresso e localizado na superfície de células basais de podócitos. Todas as imunomarcações em (FIGURAS 1A-1Q) são realizadas em camundongos dia E16,5 em ampliação 600X (ver FIGURAS 5A-5M para imunomarcações em glomérulos de camundongos adulto). (FIGURAS 1A-1C) ROBO2 co-localiza com proteína nefrina de diafragma slit de podócito. (FIGURAS1D- 1F) ROBO2 co-localiza com proteína de diafragma slit de podócito. (FIGURAS 1G-1I) ROBO2 co-localiza com a proteína adaptadora Nck em glomérulos. (FIGURAS 1J-1D) ROBO2 é expresso na superfície do podócito basal adjacente ao nidogênio de proteína da membrana basal glomerular.
(FIGURAS 1M-1O) ROBO2 não co-localiza com o marcador de proteína de célula endotelial glomerular Pecam1. (FIG. 1P) A região ampliada encaixotada em (FIG. 1L) mostra que ROBO2 é predominantemente expresso na superfície de células basais (seta) de podócitos (p) adjacente ao nidogênio de marcador de membrana basal glomerular. ROBO2 é fracamente expresso nas superfícies das células apicais e laterais (pontas de seta) de podócitos. (FIG. 1Q) ROBO2 é predominantemente expresso na superfície de células basais (setas) de podócitos (p) e é fracamente expresso nas superfícies das células apicais ou laterais (pontas de seta). (FIG. 1R) Microscopia eletrônica com imunomarcação com ouro mostra a localização de parciais de ouro (setas) conjugadas para o anticorpo ROBO2 no processo podálico (fp) de um podócito de um camundongo de 3 semanas de idade. GBM, membrana basal glomerular. Ampliação: 50.000 X. Ver também as FIGURAS 5A-5M.
[00055] As FIGURAS 2A-2J demonstram que ROBO2 interage com a proteína adaptadora Nck e forma um complexo com nefrina. (FIG. 2A) Os ensaios de dois híbridos de levedura mostram uma interação positiva entre o domínio intracelular ROBO2 (ROBO2-ICD) e Nck1. LacZ repórter (X- gal): +++, a levedura ficou escura; ++, clara; -, branco em 24 horas. Leucina repórter (-Leu): +, levedura cresceu; -,
a levedura não cresceu. CC, região conservada citoplasmática. Os números indicam as posições dos resíduos na proteína de comprimento completo. (FIG. 2B) Os ensaios de dois híbridos de levedura mostram que os dois primeiros domínios SH3 de Nck1 são necessários para a sua interação com ROBO2-ICD. (FIG. 2C) Os ensaios de dois híbridos de levedura mostram que os domínios de ligação potenciais que medeiam a interação ROBO2 e Nck1. A sequência é a região de ligação potencial em ROBO2 para Nck1. As regiões ricas em prolina são realçadas. (FIG.2D) A co-precipitação de ROBO2 e Nck. Os lisados celulares na linha 5 são coletados a partir de células transfectadas com His-myc-ROBO2 (utilizados nas linhas 1 e 2); Os lisados celulares na linha 6 são coletados a partir de células transfectadas His-myc-ROBO2-ΔNBD (utilizados nas linhas 3 e 4). (FIG. 2E) A co-precipitação de ROBO2, Nck, e nefrina. (FIG. 2F) Uma co-precipitação similar como (FIG. 2E), exceto que His-myc- nefrina é extraído (pulled down) em vez de His-myc-ROBO2.
(FIG. 2G) A co-imunoprecipitação ROBO2 de endógeno renal, Nck, e nefrina. (FIG. 2H) Um ensaio similar como (FIG. 2G), exceto que os precipitados são preparados usando o anticorpo de antinefrina de camundongo. (I) Slit2 aumenta a formação do complexo ROBO2-Nck-nefrina. His-myc-ROBO2, nefrina, e Fyn são expressos em células HEK que são estimuladas com meio condicionado Slit2 (linhas 1, 3), ou meio condicionado de controle (linhas 2, 4). (FIG. 2J) A quantificação da intensidade da (FIG. 2I). Os dados estão representados como a média ± DP; n= 7, *p<0,05, **p <0,01 em comparação com o controle, o teste t de Student pareado.
Ver também as FIGURAS 6A-6F’.
[00056] As FIGURAS 3A-3G demonstram que a sinalização Slit2-ROBO2 inibe a polimerização da actina mediada por nefrina. (FIG. 3A) CD16/7-NCD é co-expresso com ROBO2 em células HEK, as quais são tratadas com o anticorpo anti-CD16 e anticorpo anti-IgG conjugado com rodamina na presença de meio condicionado Slit2 (Slit) ou meio condicionado de controle (CTL). As células são, em seguida, fixadas e coradas com faloidina conjugada com FITC para revelar actina-F. Barra de escala, 5µm. NCD: domínio citoplasmático de nefrina. (FIG. 3B) Um ensaio similar como (FIG. 3A), exceto que CD16/7-NCD é substituído por CD16/7- HA e é utilizado como um ensaio de controle. (FIG. 3C) A porcentagem de células com caudas de actina-F sobre as células totais com agrupamentos CD16/7 em cada grupo é quantificado. Os dados são representados como a média ± DP, *p <0,01, n= 5. (FIG. 3D) CD16/7-NCD em (FIG. 3A) é imunoprecipitado pelo anticorpo anti-CD16, após estimulação com meio condicionado Slit2 (linhas 1 e 3) ou meio condicionado de controle (linhas 2 e 4). Nota reduzida de actina-F na linha 1. CD16/7-HA é usado como um controle negativo. (FIG. 3E) A quantificação da intensidade da (FIG.
3D). Os dados estão representados como a média ± DP; n= 4, *p <0,05 comparados com o controle, o teste t de Student pareado. (FIG. 3F) A imunoprecipitação de nefrina a partir dos rins de camundongos knockout homozigóticos ROBO2 (ROBO2-/-), heterozigóticos (ROBO2+/-), e de tipo selvagem (ROBO2+/+) utilizando o anticorpo antinefrina. Nota aumentada de actina-F na linha3. (FIG. 3G) A quantificação da intensidade da (FIG. 3F). Os dados estão representados como a média ± DP; n= 4, *p <0,05 em comparação com o tipo selvagem e heterozigótico, análise de ANOVA. Ver também as FIGURAS 7A-7C.
[00057] As FIGURAS 4A-4W demonstram que os fenótipos estruturais de podócito no homozigoto nulo ROBO2, knockout específico de podócito ROBO2, e camundongos knockout duplos ROBO2 e Nphs1. (FIGURAS 4A e 4B) As imagens representativas de rins de recém-nascidos mostram os corpos de podócito (pontas de seta) e a cápsula de Bowman (setas) no tipo selvagem (FIG. 4A) e camundongos nulos homozigóticos ROBO2 (FIG. 4B). (FIGURAS 4C e 4D) As imagens de alta ampliação das (FIGURAS 4A e4B) mostram os processos podálicos de podócito (setas) no rim de recém-nascido. Barra de escala, 1µm. (FIGURAS 4E e 4F) As imagens representativas de rins de 3 semanas em baixa ampliação mostram o corpo de célula de podócito (pontas de seta) em um camundongo nulo homozigótico ROBO2 (FIG. 4F), em comparação com um controle pareado por idade (FIG. 4E). (FIGURAS 4G e 4H) As imagens de maior ampliação das (FIGURAS 4E e 4F) mostram os processos podálicos sinuosos mais curtos desorganizados (seta) em um camundongo homozigoto ROBO2 nulo de 3 semanas (FIG. 4H) comparado aos processos podálicos do tipo zíper bem organizados no controle pareado por idade (FIG. 4G).
Barras de escala: 2µm. (FIGURAS 4I e 4J) As imagens de microscopia de elétron de transmissão representativa (ampliação de 5000x) retratam a supressão do processo podálico de podócito segmental focal (seta na FIG. 4J) em um camundongo knockout específico de podócito ROBO2 de um mês de idade e o fenótipo normal no controle (FIG. 4I).
Abreviações: gc: capilar glomerular; us: espaço urinário.
(FIGURAS 4K e 4L) As imagens de microscopia de elétron de transmissão de maior ampliação (40000x) mostram os processos podálicos de podócito mais amplos (seta na FIG.
4L) em um camundongo mutante específico de podócito ROBO2 de dois meses de idade em comparação com o controle (FIG.
4K). Abreviações: fp, processo podálico de podócito; GBM, membrana basal glomerular. (FIG. 4M) A quantificação da largura do processo podálico de podócito em um ROBO2del5/flox de um mês de idade; camundongos knockout específicos de podócito TgNphs2-Cre+ (ROBO2 KO) e os controles de ninhada do tipo selvagem (WT). Os dados estão representados como a média ± DP, n= 333, *p <0,01. (FIG. 4N) Ensaio ELISA de manchas de urina mostra uma relação de albumina/creatinina elevada em ROBO2del5/flox; camundongos adultos Nphs2-Cre+ (KO) em comparação com o controle do tipo selvagem (WT). Os dados estão representados como a média ± DP, n= 20, *p <0,01. (FIG. 4O) As análises de Western blot mostram a presença de albumina na urina; 1µl de urina foi aplicado em cada poço, 0,2µg de albumina foi utilizado como um controle positivo. WT, três irmãos da ninhada do tipo selvagem; ROBO2 KO, três indivíduos ROBO2del5/flox; camundongos Nphs2- Cre+. (FIGURAS 4P e 4T) As imagens de microscopia eletrônica de varredura representativa mostram os processos podálicos de podócito de interdigitação interrompidos que assemelham as saliências celulares desorganizadas (setas) no rim do camundongo recém-nascido de homozigoto único Nphs1-/-. Barras de escala: 1µm. (FIGURAS 4R e 4S) Os glomérulos a partir do camundongo recém-nascido de homozigoto duplo Nphs1-/-ROBO2-/- apresentam os processos podálicos de interdigitação restaurados (setas), indicando redução de fenótipo nulo de nefrina pelo ROBO2 inativado.
(FIGURAS 4T e 4U) Os glomérulos a partir do camundongo recém-nascido de homozigoto único ROBO2-/- exibem os processos podálicos irregulares e mais amplos, mas formação padrão de interdigitação extensa (setas). (FIGURAS 4V e 4W) Os glomérulos a partir dos camundongos do tipo selvagem dos recém-nascidos com padrão de interdigitação regular normal do processo podálico (setas). Ver também as FIGURAS 8A-8Z e Tabelas 1-4.
[00058] As FIGURAS 5A-5M demonstram que ROBO2 é expresso no desenvolvimento e nos glomérulos adultos.
(FIGURAS 5A e 5B) Nas análises de hibridização in situ mostram que as transcrições ROBO2 são expressas no desenvolvimento de glomérulos (setas) em E16,5. Ampliação: 60x (FIG. 5A) e 200X (FIG. 5B). (FIGURAS 5C-5F) Estudos imuno-histoquímicos (IHQ) revelam que ROBO2 é expresso durante o desenvolvimento de glomérulos de E14,5 a E17,5.
Ampliação: 600X. (FIG. 5G) IHC mostra que ROBO2 é especificamente expresso nos glomérulos de camundongo adulto com 5 semanas de idade (FIG. 5G). DAPI marca os núcleos de células no rim. Ampliação: 400X. (FIG. 5H) As marcações de co-localização de IHC do rim de 5 semanas mostram que ROBO2 é co-expresso no glomérulo com marcador de podócito WT1. Ampliação: 600X. (FIGURAS 5I-5K) ROBO2 e WT1 são co-expressos no glomérulo de camundongo em E16,5.
Ampliação: 600X. (FIGURAS 5L e 5M) As marcações de co- localização de IHC de rim de 5 semanas mostram que o ROBO2 é co-expresso no glomérulo com marcador de células mesangial Pdgfrb (FIG. 5L), e marcador de célula endotelial Pecam1 (FIG. 5M). Ampliação: 600X.
[00059] As FIGURAS 6A-6F' demonstram que ROBO2 interage com Nck e forma um complexo com nefrina, que é reforçado por estimulação Slit2. (FIG. 6A) Co-IP de ROBO2 e nefrina com Nck endógeno. ROBO2, nefrina, e Fyn são expressos em células HEK e estimulados por Slit2. O Nck endógeno é imunoprecipitado por um anticorpo anti-Nck. O camundongo IgG é utilizado como um controle. A formação do complexo com nefrina é reforçada por expressão de Slit2 e Fyn. (FIGURAS 6B e 6C) Slit2 é expresso nos glomérulos de camundongo recém-nascido por marcação com imunoperoxidase (FIG. 6B) e é co-expresso nos glomérulos com o marcador de podócito sinaptopodina (FIG. 6C). Ampliação: 600X. (FIGURAS 6D e 6D') CD16/7-NCD é co-expresso com ROBO2 em células HEK na presença de Slit2, tratado com anticorpo anti-CD16 e anticorpo anti-IgG conjugado com rodamina, em seguida, fixo e corado com anticorpo anti-ROBO2. Agrupamentos CD16/7-NCD co-localizam com ROBO2 (FIG.6D), mas nenhuma co-localização é observada em agrupamentos de controle CD16/7-HA (FIG.
6D’). Barra de escala: 5µm. NCD: domínio citoplasmático de nefrina. (FIGURAS 6E e 6E') Deleção de domínio de ligação Nck (NBD) em ROBO2 prejudica a sua co-localização com CD16/7-NCD na presença de Slit2. Agrupamentos CD16/7-NCD co-localizam com ROBO2 (FIG. 6E), mas nenhuma co- localização é observada em agrupamentos de ROBO2-ΔNBD (FIG.
6E'). Barra de escala: 5µm. (FIGURAS 6F e 6F') A estimulação de Slit2 melhora CD16/7-NCD e co-localização
ROBO2 em células HEK. Agrupamentos CD16/7-NCD co-localizam com ROBO2 na presença de Slit2 (FIG. 6F), mas nenhum com meio condicionado de controle (FIG. 6F'). Barra de escala: 5µm.
[00060] As FIGURAS 7A-7C demonstram que a deleção de domínio de ligação Nck em ROBO2 compromete a inibição Slit2-ROBO2 sobre a polimerização de actina induzida por nefrina. (FIG. 7A) CD16/7-NCD e ROBO2 foram co-expressos em células HEK, agrupados com anticorpo anti-CD16 e anticorpo anti-IgG conjugado com rodamina na presença do meio condicionado Slit2 (Slit2) ou meio condicionado de controle (CTL). As células foram, em seguida, fixas e coradas com faloidina conjugada com FITC para revelar as fibras de actina-F. Os agrupamentos de CD16/7-NCD e fibras de actina- F foram examinados utilizando microscopia confocal. Barra de escala, 5 µm. NCD, domínio citoplasmático de nefrina.
(FIG. 7B) CD16/7-NCD e ROBO2-ΔNBD foram co-expressos em células HEK. Barra de escala, 5 µm. NBD, domínio de ligação Nck. (FIG. 7C) A percentagem de células com caudas actina-F sobre as células totais com agrupamentos CD16/7-NCD em cada grupo foi quantificada. Os dados estão representados como a média ± DP, *p = 1,436x10-5, **p = 6,32x10-5, n= 5, ANOVA.
[00061] As FIGURAS 8A-8Z demonstram o fenótipo glomerular no homozigoto nulo ROBO2, knockout específico de podócito ROBO2, camundongos knockout duplos ROBO2 e Nphs1,
e um modelo proposto de sinalização ROBO2-nefrina. (FIGURAS 8A-8F) As análises de microscopia de elétron de transmissão de ultra-estrutura glomerular em rins de camundongos mutantes recém-nascidos (RN) ROBO2del5/del5. (FIGURAS 8A, 8C, 8E) A ultra-estrutura glomerular a partir de um camundongo de controle ROBO2 heterozigoto recém-nascido em ampliações baixas (FIG. 8A, 2200x), médias (FIG. 8C, 15500X) e altas (FIG. 8E, 52000X). (FIGURAS 8B, 8D, 8F) A ultra-estrutura glomerular a partir de um camundongo mutante homozigoto recém-nascido ROBO2(-/-) (isto é, ROBO2del5/del5) em ampliações baixas (FIG. 8B), médias (FIG. 8D) e altas (FIG.
8F). As setas indicam a supressão do processo podálico focal. Abreviações: gc: capilar glomerular; us: espaço urinário; GBM: membrana basal glomerular. (FIGURAS 8G-8N) Os padrões do processo podálico de podócito anormais no camundongo knockout específico de podócito ROBO2. (FIGURAS 8G-8J) As imagens de microscopia de elétron de varredura representativas de glomérulos a partir de ROBO2del5/flox de um mês de idade; camundongo knockout específico de podócito Nphs2-Cre+ e camundongo de controle ROBO2flox+ com a mesma idade. Irregularidades leves dos processos podálicos de podócito de interdigitação foram encontradas em um camundongo knockout específico de podócito ROBO2 de um mês de idade (FIGURAS 8K e 8N). Aos sete meses de idade, camundongo knockout específico de podócito ROBO2 desenvolveu marcadamente os processos podálicos irregulares
(FIGURAS 8L e 8N). Barras de escala: 10 µm (FIGURAS 8G, 8H,
8K, 8L em 2000x de ampliação) e 2µm (FIGURAS 8I, 8J, 8M, 8N em 13000x de ampliação). (FIGURAS 8O-8T) A morfologia glomerular em camundongo knockout específico de podócito
ROBO2. (FIGURAS 8O-8R) A marcação de ácido periódico-Schiff
(PAS) mostrou a expansão de matriz mesangial nos glomérulos a partir do camundongo knockout específico de podócito
ROBO2 de 2 meses e 6 meses de idade (FIGURAS 8P, 8R) em comparação com os controles da mesma idade (FIGURAS 8O,
8Q). (FIG. 8S) As análises quantitativas de glomérulos mostram a expansão da matriz mesangial em camundongos knockout específicos de podócito ROBO2 de 12 meses de idade
(MU), em comparação com os controles do tipo selvagem da mesma idade (WT). Os dados estão representados como a média
± DP, n= 5, *p <0,01. (T) Knockout específico de podócito
ROBO2 não afeta os números de podócito.
As células de podócito foram identificadas utilizando marcação WT-1. O número de podócitos por seção transversal glomerular foi contado em quatro em um ROBO2del5/flox de um ano de idade;
camundongo knockout específico de podócito TgNphs2-Cre+ (MU)
em comparação com quatro camundongos do tipo selvagem da mesma idade (WT). Os dados estão representados como a média
± DP, p= 0,645, teste t; mutante: n= 165 glomérulos;
controle: n= 166 glomérulos. (FIGURAS 8U-8Y) O fenótipo glomerular em camundongos knockout duplos ROBO2 e Nphs1.
(FIG. 8U) A marcação H&E mostra os glomérulos com dilatações características da cápsula de Bowman (asteriscos) em um camundongo recém-nascido homozigoto único Nphs1-/-, 400x. (FIG.8V) Os glomérulos a partir de um camundongo recém-nascido homozigoto único ROBO2-/- mostram ausência de dilatações na cápsula de Bowman; 400x. (FIG.8W) Os glomérulos de aparência normais sem dilatações da cápsula de Bowman significativas (setas) são mostrados em um camundongo recém-nascido homozigoto duplo ROBO2-/-; Nphs1-/-indicando a redução do fenótipo glomerular Nphs1-/-; 400x. (FIG. 8X) A marcação H&E do rim normal e glomérulos de controle de camundongo recém-nascido do tipo selvagem da mesma idade; 400x. (FIG. 8A) Quantificação de glomérulos com cápsula de Bowman dilatada em camundongos recém- nascidos mostra redução significativa de glomérulos com o fenótipo de dilatação característico da cápsula de Bowman em homozigotos duplos ROBO2-/-; Nphs1-/-em comparação aos homozigotos únicos Nphs1-/- (ROBO2+/-; Nphs1-/-). Os dados estão representados como a média ± DP, *p <0,01. (FIG. 8Z) Um modelo de efeitos inibitórios da sinalização Slit2-ROBO2 em nefrina para influenciar a estrutura do processo podálico de podócito: Em condições fisiológicas (por exemplo, durante o desenvolvimento do processo podálico), os domínios de tirosina fosforilados de nefrina intracelular (YDxV-p) recrutam Nck por meio de sua interação com o domínio SH2. NCK, por sua vez, recruta os reguladores de citoesqueleto através dos seus domínios SH3 para promover a polimerização de actina. Slit2 liga ROBO2 para aumentar a interação do domínio intracelular ROBO2 com domínios SH3 de Nck, que impediriam a ligação de Nck aos reguladores de citoesqueleto e resultam em uma inibição da polimerização de actina induzida por nefrina. Polimerização de actina equilibrada é mantida durante o desenvolvimento do podócito para uma estrutura do processo podálico normal.
Na ausência de sinalização Slit2-ROBO2 (por exemplo, quando ROBO2 é eliminado), os efeitos inibidores de ROBO2 sobre a polimerização induzida por nefrina são perdidos. Os domínios SH3 de Nck são capazes de interagir com os reguladores do citoesqueleto a jusante para aumentar a polimerização da actina, o que pode explicar a estrutura do processo podálico de podócito alterada em camundongos mutantes ROBO2. Abreviações: Ig: domínio de imunoglobulina; FN3: Fibronectina de domínio do tipo 3; SH2: Src domínio homólogo 2; SH3: Src domínio homólogo 3; CC0, CC1, CC2, CC3: região conservada citoplasmática 0, 1, 2, 3.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00062] ROBO2 foi mostrado anteriormente ser o receptor da superfície da célula para a indicação de orientação repulsiva Slit, e para ser envolvido na orientação do axônio e migração neuronal no sistema nervoso. Nefrina é uma proteína de diafragma slit de podócito que funciona na barreira de filtração glomerular do rim. Foi aqui demonstrado que ROBO2 é expresso na superfície basal de podócitos, tais como podócitos de camundongo, e co-localiza com a nefrina. Os estudos bioquímicos indicaram que ROBO2 forma um complexo com nefrina no rim através da proteína adaptadora Nck. Em contraste com o papel de nefrina que promove a polimerização da actina, demonstrou-se aqui que a sinalização Slit2-ROBO2 inibe a polimerização de actina induzida por nefrina. Por exemplo, a quantidade de actina-F associada com nefrina é aumentada em camundongos knockout ROBO2 que desenvolvem uma estrutura do processo podálico de podócito alterada e microalbuminúria. Estudos de interação genéticos descreveram ainda que a perda de ROBO2 alivia o fenótipo de podócito anormal em camundongo nulo de nefrina.
Os resultados aqui fornecidos mostram que a sinalização de ROBO2 atua como um regulador negativo sobre nefrina para influenciar a arquitetura do processo podálico de podócito.
[00063] Além disso, demonstrou-se que um paciente que tem o refluxo vesico-ureteral (VUR) tem uma translocação do cromossomo que interrompe o gene ROBO2 e produz as proteínas de fusão ROBO2 negativas dominantes que anulam a via de sinalização SLIT2-ROBO2. Normalmente, VUR é uma doença caracterizada pelo fluxo retrógrado de urina da bexiga para os ureteres e rins e pacientes de VUR podem apresentar-se com nefropatia de refluxo, uma condição que se manifesta com proteinúria grave. Tem sido demonstrado que as proteínas de fusão ROBO2 negativas dominantes produzidas por um paciente de VUR bloqueiam a via de sinalização SLIT2-ROBO2 e protegem o paciente de nefropatia de refluxo e proteinúria, confirmando assim, e apoiando ainda mais os resultados da invenção em modelos animais de valor terapêutico de direcionar a via de sinalização SLIT2- ROBO2 para o tratamento da doença renal crônica.
[00064] No rim normal, a parede capilar glomerular trilaminar, composta por células endoteliais fenestradas, membrana basal e podócitos, limita a permeabilidade às proteínas do plasma. Podócitos são células epiteliais especializadas que se estendem aos processos primários e secundários para cobrir a superfície externa da membrana basal glomerular. Os processos secundários de interdigitação ricos em actina ou processos podálicos, de podócitos vizinhos que criam slits de filtração em ponte por um diafragma slit semiporoso que forma a barreira final para a permeação de proteína. Considerando as mutações genéticas de proteínas de diafragma slit de podócito, tais como nefrina e outras estão associadas com formas hereditárias da doença renal proteinúrica (Tryggvason et al., 2006), tornou-se evidente que as proteínas que compõem e se associam com o diafragma slit são mais do que uma barreira estrutural simples. Estas proteínas formam uma rede de sinalização equilibrada que pode influenciar a estrutura e função de processo podálico de podócito através da interação com o citoesqueleto de actina-F (Faul et al., 2007; Jones et al., 2006; Verma et al., 2006).
[00065] As proteínas da família roundabout (Robo), Robo1, Robo2, Robo3 e Robo4 são receptores de superfície celular para o slit de ligante secretado (Dickson e Gilestro, 2006). Slit1, Slit2, e Slit3 foram originalmente encontrados como pistas de orientação repulsivas para encontro do caminho do axônio e neurônios que migram durante o desenvolvimento do sistema nervoso (Guan e Rao, 2003). A proteína de transmembrana Robo contém cinco motivos Ig e três fibronectinas do tipo III (FNIII) que se repetem no seu domínio extracelular (Dickson e Gilestro, 2006). Embora ambos os motivos 1 e 2 de imunoglobulina (Ig) interagem com Slit, o primeiro motivo Ig1 de Robo é o local de ligação primário para Slit (Dickson e Gilestro, 2006). O domínio intracelular de Robo tem quatro sequências conservadas citoplasmáticas (CC) nomeadas CC0, CC1, CC2, e CC3 (Bashaw et al., 2000;Kidd et al., 1998; Morlot et al., 2007; Zallen et al., 1998). CC0 e CC1 contêm tirosina, enquanto CC2 e CC3 são trechos ricos em prolina. A atividade repulsiva de sinalização de Slit-Robo inibe a polimerização de actina (Guan e Rao, 2003) ou induz a despolimerização de Actina-F (Piper et al., 2006).
[00066] A sinalização Slit-Robo também desempenha um papel crucial durante a indução renal precoce e consequência de broto uretérico. Camundongos mutantes que não possuem Slit2 ou ROBO2 desenvolveram os brotos uretéricos supranumerários, que levam a um amplo espectro de fenótipo do trato urinário, incluindo os rins duplex, junções intravesicais anormais e hidronefrose (Grieshammer et al., 2004; Lu et al. 2007). Rompimento de ROBO2 nos seres humanos provoca anomalias congênitas dos rins e tratos urinários (CAKUT), e mutações pontuais de ROBO2 foram identificadas em pacientes com refluxo vesico ureteral (VUR) (Lu et al., 2007). Os estudos recentes demonstram que ROBO2 é crucial para a formação de um orifício ureteral normal e para a manutenção de um mecanismo anti-refluxo eficaz (Wang et al., 2011).
[00067] Foi demonstrado aqui que ROBO2 é uma nova proteína de podócito expressa na superfície basal de podócitos glomerulares no rim e é co-localizada com nefrina e podocin. ROBO2 interage diretamente com os domínios de proteína adaptadora Nck SH3 e forma um complexo com nefrina. Enquanto que os camundongos knockout ROBO2 desenvolveram os processos podálicos de podócito alterados,
a perda de ROBO2 alivia as anormalidades estruturais do processo podálico que são vistas em camundongos nulos de nefrina. Estes resultados aqui descritos indicam que a sinalização de ROBO2 atua como um regulador negativo na sinalização de nefrina para influenciar a arquitetura do processo podálico do podócito. Além disso, tal como aqui demonstrado, foi descoberto que as proteínas de fusão ROBO2 negativas dominantes produzidas por um paciente bloqueiam a via de sinalização SLIT2-ROBO2 e protegem o paciente a partir de nefropatia de refluxo e proteinúria, confirmando assim, e suportando ainda mais os resultados aqui descritos em modelos de animais de valor terapêutico através do direcionamento da via de sinalização SLIT2-ROBO2 para o tratamento da doença renal crônica.
[00068] Desta maneira, em alguns aspectos, são aqui fornecidos os métodos para o tratamento da doença renal crônica em um indivíduo em necessidade do mesmo, tal método que compreende a administração a um indivíduo com ou em risco para uma doença renal crônica de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um inibidor da via de sinalização SLIT2-ROBO2.
[00069] Também aqui fornecido, em alguns aspectos, os métodos para a redução de proteinúria, em um indivíduo com necessidade do mesmo, que compreende a administração a um indivíduo com ou em risco para proteinúria de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um inibidor da via de sinalização SLIT2-ROBO2.
[00070] Em outros aspectos, aqui são fornecidos os métodos para a prevenção de doenças renais ou promover a profilaxia de doenças renais em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um inibidor da via de sinalização SLIT2- ROBO2, de modo a prevenir ou promover a profilaxia de doença renal no indivíduo.
[00071] Também são aqui fornecidos, em alguns aspectos, métodos para atenuar os efeitos da doença renal, reduzindo a gravidade da doença renal, reduzindo a probabilidade de desenvolvimento de doença renal e/ou retardar a progressão da doença renal em um indivíduo em necessidade do mesmo.
[00072] Tal como aqui usado, "ROBO2" refere-se ao polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido de:
MARRHERVTRRMWTWAPGLLMMTVVFWGHQGNGQGQGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVS KGEPTTLNCKAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSK PDEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHP EPTIYWKKDKVRIDDKEERISIRGGKLMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELT VFERPTFLRRPINQVVLEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLR IKKTMSTDEGTYMCIAENRVGKMEASATLTVRAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETK GNPQPAVFWQKEGSQNLLFPNQPQQPNSRCSVSPTGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVA GSILAKAQLEVTDVLTDRPPPIILQGPANQTLAVDGTALLKCKATGDPLPVISWLKEGF TFPGRDPRATIQEQGTLQIKNLRISDTGTYTCVATSSSGETSWSAVLDVTESGATISKN YDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQPGTPGTLPASAYIIEAFSQSVSNSWQTVANH VKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPSPMSDPVRTQDISPPAQGVDHRQVQKE LGDVLVRLHNPVVLTPTTVQVTWTVDRQPQFIQGYRVMYRQTSGLQATSSWQNLDAKVP TERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTVRTTEEAPSAPPQSVTVLTVGSY NSTSISVSWDPPPPDHQNGIIQEYKIWCLGNETRFHINKTVDAAIRSVIIGGLFPGIQY RVEVAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQPAFIAGIGGAC WVILMGFSIWLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPSYPWLADSW PATSLPVNNSNSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKTSYNS SSQITQATPYATTQILHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNG GKGGKKKKNKNSSKPQKNNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWC PPLPVQTYLHQGLEDELEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPM LQAHLDELTRAYQFDIAKQTWHIQSNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADD EEEALEIPRPLRALDQTPGSSMDNLDSSVTGKAFTSSQRPRPTSPFSTDSNTSAALSQS
QRPRPTKKHKGGRMDQQPALPHRREGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGST GPRKTEVLRAGHQRNASDLLDIGYMGSNSQGQFTGEL (Homo sapiens roundbout homólogo 2 isoforma ROBO2a; SEQ ID NO: 1), tal como descrito, por exemplo, NP_001122401.1 e codificado por NM_001128929.2 (SEQ ID NO: 2); ou
MSLLMFTQLLLCGFLYVRVDGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSKGEPTTLNCKAEGRPT PTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGE AVSRNASLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYWKKDKVRIDDK EERISIRGGKLMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPINQVV LEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYMCIA ENRVGKMEASATLTVRAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQN LLFPNQPQQPNSRCSVSPTGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVTDVLT DRPPPIILQGPANQTLAVDGTALLKCKATGDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGT LQIKNLRISDTGTYTCVATSSSGETSWSAVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVT DVTKNSVTLSWQPGTPGTLPASAYIIEAFSQSVSNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTI YLFMVRAINPQGLSDPSPMSDPVRTQDISPPAQGVDHRQVQKELGDVLVRLHNPVVLTP TTVQVTWTVDRQPQFIQGYRVMYRQTSGLQATSSWQNLDAKVPTERSAVLVNLKKGVTY EIKVRPYFNEFQGMDSESKTVRTTEEAPSAPPQSVTVLTVGSYNSTSISVSWDPPPPDH QNGIIQEYKIWCLGNETRFHINKTVDAAIRSVIIGGLFPGIQYRVEVAASTSAGVGVKS EPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQPAFIAGIGGACWVILMGFSIWLYWRRK KRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPSYPWLADSWPATSLPVNNSNSGPNE IGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKTSYNSSSQITQATPYATTQIL HSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNGGKGGKKKKNKNSSKPQ KNNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCPPLPVQTYLHQGLEDE LEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPMLQAHLDELTRAYQFDI AKQTWHIQSNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALEIPRPLRALDQ TPGSSMDNLDSSVTGKAFTSSQRPRPTSPFSTDSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRMDQ
QPALPHRREGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTEVLRAGHQRNA SDLLDIGYMGSNSQGQFTGEL (Homo sapiens roundabout homólogo 2 isoforma ROBO2b; SEQ ID NO: 3), conforme descrito, por exemplo, NP_002933.1 e codificado por NM_002942.4 (SEQ ID NO: 4), junto com qualquer alelo de ocorrência natural, variantes de processamento, e as formas processadas do mesmo. Geralmente, ROBO2 refere-se a ROBO2 humano. O gene ROBO2 é conservado no chimpanzé, macaco Rhesus, cão, vaca,
camundongo, rato, galinha, peixe-zebra, mosca da fruta, mosquito, e C. elegans. Resíduos específicos de ROBO2 podem ser referidos como, por exemplo, "ROBO2(30)".
[00073] Os domínios específicos de ROBO2 podem ser referidos por essa nomenclatura também. O N-terminal ou "domínio extracelular de ROBO2", que compreende os cinco motivos de imunoglobulina e três repetições de fibronectina do tipo III (FNIII) podem ser referidos como ROBO2 (46-848) da SEQ ID NO: 1 ou ROBO2 (30-832) da SEQ ID NO: 3, por exemplo. Os motivos de imunoglobulina 1 e 2 (Ig) que interagem com Slit2, ou o "domínio de ligação Ig SLIT" pode ser referido como ROBO2 (46-145) e ROBO2 (151-237), respectivamente, da SEQ ID NO: 1, e ROBO2 (30-129) e ROBO2 (135-221), respectivamente, da SEQ ID NO: 3. Do mesmo modo, o "domínio intracelular" que compreende o "domínio de ligação Nck intracelular", o qual compreende os quatro motivos ricos de prolina intracelulares, aqui descritos, podem ser referidos como ROBO2 (881-1378) de SEQ ID NO: 3.
[00074] Tal como aqui usados, os termos "inibidor de ROBO2", "antagonista ROBO2", "agente inibidor de ROBO2", e "agente antagonista ROBO2" referem-se a uma molécula ou agente que bloqueia significativamente, inibe, reduz, ou interfere com a atividade biológica in vitro, in situ, e/ou in vivo de ROBO2 (mamíferos, tais como seres humanos, ROBO2), incluindo a atividade das vias a jusante mediadas por sinalização ROBO2, tais como, por exemplo, a interação ROBO2 com a proteína adaptadora Nck e/ou formação de complexo com nefrina, inibição mediada por SLIT2-ROBO-2 de polimerização de actina mediada por nefrina, e/ou desencadeamento de uma resposta celular para ROBO2. O termo "agente", tal como aqui usado em referência a um inibidor de ROBO2 significa qualquer composto ou substância, tal como, mas não limitado a, uma molécula pequena, ácido nucléico, polipeptídeo, peptídeo, fármaco, íon, etc. Um "agente" pode ser qualquer produto químico, entidade, ou porção, incluindo, sem limitação, as entidades não- protéicas e protéicas de ocorrência natural e sintéticas.
Em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, um agente é um ácido nucléico, um análogo de ácido nucléico, uma proteína, um anticorpo, um peptídeo, um aptâmero, um oligômero de ácidos nucléicos, um aminoácido, ou um carboidrato, e inclui, sem limitação, proteínas, oligonucleotídeos, ribozimas, DNAzimas, glicoproteínas, RNA de anti-senso, siRNAs, lipoproteínas, aptâmeros, e modificações e combinações dos mesmos, etc. Os compostos para uso nas composições terapêuticas e métodos descritos aqui podem ser conhecidos por terem uma atividade desejada e/ou propriedade, ou podem ser selecionados a partir de uma biblioteca de compostos diferentes, usando os métodos de rastreio conhecidos por um versado na técnica.
[00075] Inibidores de ROBO2 exemplares contemplados para uso nos vários aspectos e modalidades aqui descritos incluem, mas não são limitados a, anticorpos de anti-ROBO2 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a ROBO2; moléculas de anti-senso direcionadas a um ácido nucléico que codifica ROBO2 (por exemplo, ROBO2a ou ROBO2b ou ambos); moléculas de RNA de interferência curtas ("siRNA") direcionadas a um ROBO2 que codifica ácido nucléico (por exemplo, ROBO2a ou ROBO2b ou ambos); RNA ou aptâmeros de DNA que se ligam a ROBO2, e inibem/reduzem/bloqueiam a sinalização mediada por ROBO2; análogos estruturais de ROBO2; e proteínas ROBO2 solúveis, polipeptídeos inibitórios, por exemplo, polipeptídeos negativos dominantes, ou polipeptídeos de fusão dos mesmos.
Em algumas modalidades destes aspectos e todos esses aspectos aqui descritos, um inibidor de ROBO2 (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) liga-se (interage fisicamente com) ROBO2, sinalização alvo ROBO2 a jusante, e/ou inibe (reduz) as sínteses, produção ou liberação de ROBO2. Em algumas modalidades destes aspectos e todos esses aspectos aqui descritos, um inibidor de ROBO2 se liga e impede a sua ligação de um ligante de proteína SLIT, tal como SLIT2. Em algumas modalidades destes aspectos e todos esses aspectos aqui descritos, um inibidor de ROBO2 especificamente reduz ou elimina a expressão (isto é, transcrição ou tradução) de uma ou mais isoformas ROBO2.
[00076] Tal como aqui usado, um inibidor ou antagonista ROBO2 tem a capacidade de reduzir a atividade e/ou a expressão de ROBO2 em uma célula (por exemplo, podócitos) em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, em menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, em relação ao nível de expressão ou atividade na ausência do inibidor de ROBO2.
[00077] Desta maneira, em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 inibe a transdução de sinal mediada por ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 direciona a interação ROBO2 com a proteína adaptadora Nck e/ou a formação de complexo com nefrina, inibição mediada por SLIT2-ROBO-2 de polimerização de actina mediada por nefrina, e/ou desencadeamento de uma resposta celular para ROBO2.
[00078] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, os locais de ligação dos inibidores de ROBO2, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, são direcionados contra um local de interação do ligante ROBO2, tal como um local de interação do ligante SLIT2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, os locais de ligação do inibidor de
ROBO2, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, são direcionados contra um local de interação do adaptador ROBO2, tal como um local de interação Nck ou o domínio de ligação intracelular NCK que compreende os quatro motivos ricos de prolina intracelular de ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, os locais de ligação dos inibidores de
ROBO2 são direcionados contra um local sobre um alvo na proximidade do local de interação do ligante, a fim de proporcionar o impedimento estérico para a interação do receptor (por exemplo, ROBO2) com o seu ligante (por exemplo, SLIT2). Ao ligar-se a um local de interação do ligante ROBO2, um inibidor de ROBO2 aqui descrito pode reduzir ou inibir a atividade ou a expressão de ROBO2, e consequentemente a via de sinalização ROBO2 a jusante (por exemplo, a interação ROBO2 com a proteína adaptadora Nck e/ou a formação de complexo com nefrina, inibição mediada por SLIT2-ROBO-2 de polimerização de actina mediada por nefrina, e/ou desencadeamento de uma resposta celular ao
ROBO2). Por exemplo, em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, os locais de ligação dos inibidores de ROBO2 bloqueiam ou direcionam, pelo menos, o Ig1, e de preferência, ambos os locais Ig1 e Ig2, em ROBO2, isto é, ROBO2 (46-145) e ROBO2 (151-237), respectivamente da SEQ ID NO: 1, e ROBO2 (30-129) e ROBO2 (135-221) respectivamente da SEQ ID NO: 3, por exemplo. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, os locais de ligação dos inibidores de ROBO2 bloqueiam ou direcionam o domínio intracelular ROBO2 que compreende o domínio de ligação intracelular Nck, isto é, ROBO2 (881- 1378) da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, os locais de ligação dos inibidores de ROBO2 bloqueiam ou direcionam o domínio de ligação intracelular ROBO2 Nck que compreende os quatro motivos ricos de prolina intracelular de ROBO2. Isto pode ser alcançado por uma variedade de meios bem conhecidos na técnica, tais como anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, RNA inibidor, etc., e tal como aqui descrito.
[00079] Desta maneira, em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga seletivamente ou interage fisicamente com ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao
ROBO2 e inibe e/ou bloqueia e/ou impede a interação com Nck e/ou a formação complexa com nefrina. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga ao domínio de ligação Ig SLIT de ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga ao domínio de ligação de Ig1 SLIT de ROBO2 ou ambos os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT de ROBO2, isto é, ROBO2 (46-145) e ROBO2 (151-237) respectivamente da SEQ ID NO: 1, e ROBO2 (30-129) e ROBO2 (135-221), respectivamente da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga a ou bloqueia o domínio intracelular ROBO2, isto é, ROBO2(881-1378) da SEQ ID NO:
3. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga a ou bloqueia o domínio de ligação intracelular Nck que compreende os quatro motivos ricos de prolina intracelular de ROBO2.
[00080] Os anticorpos específicos para ou que se ligam seletivamente ao ROBO2, adequados para uso nas composições e para a prática dos métodos aqui descritos são, de preferência, os anticorpos monoclonais, e podem incluir, mas não são limitados a, anticorpos humanos,
humanizados ou quiméricos, compreendendo os anticorpos de cadeia simples, os fragmentos Fab, os fragmentos F(ab'), os fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e/ou fragmentos de ligação de qualquer um dos acima.
Os anticorpos também se referem a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, as moléculas que contêm o antígeno ou locais de ligação alvo ou "fragmentos de ligação ao antígeno". As moléculas de imunoglobulina aqui descritas podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina, tal como é entendido por um versado na técnica.
[00081] Desta maneira, em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, um inibidor de ROBO2 como aqui descrito é um anticorpo anti-ROBO2 monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno.
[00082] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, um inibidor de ROBO2 como descrito aqui é um fragmento de anticorpo ROBO2 ou fragmento de ligação ao antígeno. Os termos "fragmento de anticorpo", "fragmento de ligação ao antígeno", e "derivado de anticorpo" como aqui usado, referem-se a um fragmento de proteína que compreende apenas uma porção de um anticorpo intacto, geralmente incluindo um local de ligação ao antígeno do anticorpo intacto e, retendo assim, a capacidade de se ligar ao antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpos abrangidos pelos termos, fragmento de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno incluem: (i) o fragmento Fab, tendo os domínios VL, CL, VH e CH1; (ii) o fragmento Fab', o qual é um fragmento Fab tendo um ou mais resíduos de cisteína no C-terminal do domínio CH1; (iii) o fragmento Fd tendo os domínios VH e CH1; (iv) o fragmento Fd' tendo os domínios VH e CH1 e um ou mais resíduos de cisteína no C-terminal do domínio CH1; (v) o fragmento Fv tendo os domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (vi) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544- 546(1989)) que consiste em um domínio VH ou um domínio VL; (vii) regiões CDR isoladas; (viii) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos Fab' ligados por uma ponte de dissulfureto na região de dobradiça; (ix) as moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, cadeia simples Fv; scFv) (Bird et al., Science 242:423- 426(1988); e Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacorpos" com dois locais de ligação ao antígeno, que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (ver, por exemplo, EP
404.097, WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci.USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticorpos lineares" que compreendem um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH- CH1) que, junto com os polipeptídeos de cadeia leve complementares formam um par de regiões de ligação ao antígeno (Zapata et al. Protein Eng. 8 (10):1057- 1062(1995); e Patente U.S. No. 5,641,870); e versões modificadas de qualquer uma das anteriores (por exemplo, modificadas pela ligação covalente de polialquileno glicol (por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polibutileno glicol) ou outro polímero adequado).
[00083] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, um inibidor de ROBO2 ou antagonista é um derivado de anticorpo quimérico de um anticorpo antagonista ROBO2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00084] O inibidor de ROBO2 ou anticorpos antagonistas e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos também podem ser, em algumas modalidades, um derivado de anticorpo humanizado.
[00085] Em algumas modalidades, o inibidor de ROBO2 ou anticorpos antagonistas e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos incluem os derivados que são modificados, isto é, por meio da ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, desde que a ligação covalente não impede o anticorpo da ligação ao antígeno alvo, por exemplo, ROBO2.
[00086] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, os anticorpos totalmente humanos são utilizados, os quais são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos.
[00087] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 compreende, pelo menos, uma molécula de anti-senso capaz de bloquear ou reduzir a expressão de um ROBO2 funcional particular, através do direcionamento dos ácidos nucléicos que codificam ROBO2, por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou ambas, ou domínios relevantes dos mesmos. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, pelo menos, uma molécula de anti-senso direciona os ácidos nucléicos que codificam o domínio de ligação Ig SLIT de ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, pelo menos, uma molécula de anti-senso direciona os ácidos nucléicos que codificam o domínio de ligação Ig1 SLIT de ROBO2 ou ambos os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT de ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, pelo menos, uma molécula de anti-senso direciona os ácidos nucléicos que codificam o domínio intracelular ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, pelo menos, uma molécula de anti-senso direciona os ácidos nucléicos que codificam o domínio de ligação intracelular Nck que compreende os quatro motivos ricos de prolina intracelular de ROBO2. Os métodos são conhecidos por aqueles técnicos especialistas no assunto para a preparação de moléculas de oligonucleotídeo de anti-senso que irão especificamente se ligar ao ROBO2 mRNA sem reação cruzada com outros polinucleotídeos. Locais exemplares de direcionamento incluem, mas não são limitados a, códon de iniciação, regiões reguladoras 5’, incluindo os promotores ou intensificadores, a sequência de codificação, incluindo quaisquer regiões de consenso conservadas, e a região não- traduzida 3'. Em algumas modalidades destes aspectos e todos esses aspectos aqui descritos, os oligonucleotídeos de anti-senso são, cerca de 10 a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, cerca de 18 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, ou mais. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos de anti-senso compreendem ainda as modificações químicas para aumentar a resistência à nuclease e semelhantes, tais como, por exemplo, as ligações de fosforotioato e modificações de 2'-O-açúcar conhecidas por aqueles técnicos especialistas no assunto.
[00088] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 compreende, pelo menos, uma molécula de RNA de interferência curto
(siRNA) capaz de bloquear ou reduzir a expressão de ROBO2 funcional, através do direcionamento da codificação de ácidos nucléicos ou ambas as isoformas de ROBO2, por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou domínios relevantes dos mesmos.
Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, pelo menos, uma molécula de siRNA direciona os ácidos nucléicos que codificam o domínio de ligação Ig SLIT de ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, pelo menos, uma molécula de siRNA direciona os ácidos nucléicos que codificam o domínio de ligação Ig1 SLIT de ROBO2 ou ambos os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT de ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, pelo menos, uma molécula de siRNA direciona os ácidos nucléicos que codificam o domínio intracelular
ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, pelo menos, uma molécula de siRNA direciona os ácidos nucléicos que codificam o domínio de ligação intracelular Nck que compreende os quatro motivos ricos de prolina intracelular de ROBO2. É rotineiro preparar as moléculas de siRNA, que visam especificamente ROBO2 mRNA sem reação cruzada com outros polinucleotídeos.
As moléculas de siRNA para o uso nas composições e métodos aqui descritos podem ser geradas por métodos conhecidos na técnica, tais como através de sínteses de oligonucleotídeo em fase sólida típica, e muitas vezes, irão incorporar as modificações químicas para aumentar a meia-vida e/ou a eficácia do agente de siRNA, e/ou para permitir uma formulação de distribuição mais robusta. Alternativamente, as moléculas de siRNA são distribuídas utilizando um vetor que codifica um cassete de expressão para a transcrição intracelular de siRNA.
[00089] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é um aptâmero de RNA ou DNA que se liga a uma ou mais isoformas de ROBO2.
Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, um inibidor de ROBO2 ou antagonista é um aptâmero de RNA ou DNA que se liga ou interage fisicamente com ROBO2, e bloqueia as interações entre ROBO2 e um ligante ou molécula adaptadora, por exemplo, SLIT2 ou Nck, respectivamente. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, um inibidor de ROBO-2 ou antagonista é um aptâmero de RNA ou DNA que se liga ou interage fisicamente com ROBO2, e reduz, impede, ou bloqueia a sinalização ROBO2 a jusante, tais como inibição mediada por SLIT2-ROBO-2 de polimerização de actina mediada por nefrina, e/ou desencadeamento de uma resposta celular ao ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o aptâmero de RNA ou DNA que se liga a ou interage fisicamente com o domínio de ligação Ig SLIT de
ROBO2. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o aptâmero de RNA ou DNA que se liga a ou interage fisicamente com o domínio de ligação Ig1 SLIT de ROBO2 ou ambos os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT de ROBO2, isto é, ROBO2(46-145) e ROBO2(151-237), respectivamente, da SEQ ID NO: 1, e ROBO2(30-129) e ROBO2 (135-221), respectivamente, da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o aptâmero de RNA ou DNA que se liga a ou interage fisicamente com o domínio intracelular ROBO2, isto é, ROBO2(881-1378) de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o aptâmero de RNA ou DNA que se liga a ou interage fisicamente com ou bloqueia o domínio de ligação intracelular Nck que compreende os quatro motivos ricos de prolina intracelular de ROBO2.
[00090] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o inibidor de ROBO2 é um pequeno composto de molécula ou agente que direciona ou se liga a ROBO2, incluindo, mas não limitado a, pequenos peptídeos ou moléculas semelhantes a peptídeos, peptídeos solúveis, e compostos orgânicos ou inorgânicos de não-peptidila sintéticos. Tal como aqui usado, o termo "pequena molécula" refere-se a um agente químico que pode incluir, mas não está limitado a, um peptídeo, um peptidomimético, um aminoácido, um análogo de aminoácido, um polinucleotídeo,
um análogo de polinucleotídeo, um aptâmero, um nucleotídeo, um análogo de nucleotídeo, um composto orgânico ou inorgânico (por exemplo, incluindo os compostos organometálicos e heterorgânicos) tendo um peso molecular inferior a cerca de 10.000 gramas por mol, os compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol, os compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular inferior a cerca de 1.000 gramas por mol, os compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular inferior a cerca de 500 gramas por mol, e os sais, ésteres, e outras formas farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos. Locais exemplares de ligação de pequenas moléculas incluem, mas não são limitados, à porção de ROBO2 que se liga a SLIT2 ou ao adaptador Nck, isto é, o domínio de ligação Ig1 SLIT de ROBO2 ou ambos os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT de ROBO2, o domínio intracelular ROBO2 ou o domínio de ligação intracelular Nck que compreende os quatro motivos ricos de prolina intracelular de ROBO2.
[00091] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, um inibidor ou antagonista ROBO2 compreende uma pequena molécula que se liga a ROBO2 e inibe a atividade biológica ROBO2.
[00092] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o inibidor ou antagonista ROBO2 compreende, pelo menos, um análogo estrutural ROBO2, tal como um polipeptídeo ROBO2 negativo dominante. O termo análogos estruturais de ROBO2, tal como aqui usado, refere- se a compostos que têm uma estrutura tridimensional similar, como parte daquela de ROBO2 e que se ligam a SLIT2 e/ou para Nck sob condições fisiológicas in vitro ou in vivo, em que a ligação, pelo menos, inibe parcialmente uma atividade biológica ROBO2, tais como a inibição mediada por SLIT2-ROBO2 de polimerização de actina mediada por nefrina, e/ou desencadeamento de uma resposta celular ao ROBO2.
Análogos estruturais de ROBO2 adequados podem ser nomeados e sintetizados através da modelagem molecular de ligação ROBO2-SLIT2, por exemplo. Os análogos estruturais de ROBO2 podem ser monômeros, dímeros, ou multímeros de ordem superior, em qualquer combinação desejada das mesmas ou de diferentes estruturas para obter as afinidades melhoradas e os efeitos biológicos.
[00093] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, um inibidor ou antagonista ROBO2 compreende, pelo menos, um receptor ROBO2 solúvel ou polipeptídeo de fusão do mesmo, tal como, por exemplo, um polipeptídeo inibidor ROBO2. Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo inibidor ROBO2 é uma proteína de fusão ROBO2 negativa dominante. Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos, o polipeptídeo inibidor ROBO2 compreende o domínio extracelular ROBO2, por exemplo, o domínio de ligação Ig1 SLIT de ROBO2 ou ambos os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT de ROBO2, com nenhum domínio intracelular ROBO2.
[00094] Os inibidores de ROBO2 ou antagonistas para o uso nas composições e métodos aqui descritos podem ser identificados ou caracterizados utilizando os métodos conhecidos na técnica, tais como ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de rastreio bioquímicos, imunoensaios, e ensaios baseados em células, que estão bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados aos descritos aqui nos Exemplos.
[00095] Por exemplo, para identificar uma molécula que inibe a interação entre ROBO2 e o seu ligante, por exemplo, SLIT2, os ensaios de ligação podem ser utilizados.
Por exemplo, ROBO2 ou SLIT é imobilizado em uma placa de microtítulo de ligação covalente ou não-covalente. O ensaio é realizado por adição do componente não-imobilizado (ligante ou receptor), que pode ser marcado por um marcador detectável, ao componente imobilizado, na presença ou ausência de um agente de teste. Quando a reação está completa, os componentes não-reagidos são removidos e complexos de ligação são detectados. Se a formação de complexos de ligação é inibida pela presença do agente de teste, o agente de teste pode ser considerado um antagonista candidato que inibe a ligação entre ROBO2 e SLIT2, por exemplo. Os ensaios baseados em membranas ou baseados em células também podem ser utilizados para identificar os inibidores de ROBO2. Em outras modalidades, por meio da detecção e/ou medição dos níveis de expressão de genes ROBO2, as moléculas de inibidor ROBO2 que inibem a expressão de gene ROBO2 podem ser testadas. A expressão do gene ROBO2 pode ser detectada e/ou medida por uma variedade de métodos, tais como o RT-PCR em tempo real, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima ("ELISA"), Northern blotting, ou citometria de fluxo, e como é do conhecimento dos técnicos especialistas no assunto.
[00096] Tais inibidores de ROBO2 identificados podem ainda ser testados usando modelos animais in vivo da doença renal crônica, tais como os modelos de lesões intersticiais e glomerulares (por exemplo, os modelos animais de nefrite lúpica, incluindo os camundongos de NZB, (NZB x NZW) F1 híbridos (denominados de NZB/W), e derivados congênitos dos mesmos, MRL/lpr e cepas BXSB), os modelos animais de envelhecimento (por exemplo, camundongos Sprague Dawley envelhecidos e camundongos C57BL/6 envelhecidos); camundongos espontaneamente hipertensos (SHR); camundongos de Búfalo/mma, que são um modelo de síndrome nefrótica idiopática humana; camundongos de Munique Wistar Frömter (MWF), que são um modelo genético relacionado a um déficit congênito em número de néfrons predisposto para o desenvolvimento da hipertensão e sensibilidade ao sal na vida adulta; modelos FSGS genéticos específicos de podócito primário; modelos de camundongos transgênicos de nefropatia associada ao HIV (HIVAN); modelos animais de síndrome de Alport, que compreendem as mutações das cadeias α3, α4, α5 do colágeno tipo IV (COL4A3, COL4A4, e COL4A5); modelos induzidos imunes, tais como o modelo de nefrite Thy-1, que é um modelo de camundongo experimental de glomerulonefrite mesangioproliferativa (MsPGN), modelos da membrana de base antiglomerular (GBM); e modelos induzidos não-imunes.
[00097] Tal como aqui usado, em relação a um inibidor de ROBO2, "liga-se seletivamente" ou "liga-se especificamente" ou "específico para" refere-se à capacidade de um inibidor de ROBO2 como aqui descrito, tais como, por exemplo, um anticorpo antagonista ROBO2 ou fragmento de ligação ao antígeno ROBO2 do mesmo, para se ligar a um alvo, isto é, ROBO2, com um KD 10-5 M (10000 nM) ou inferior, por exemplo, 10-6 M ou inferior, 10-7 M ou inferior, 10-8 M ou inferior, 10-9 M ou inferior, 10-10 M ou inferior, 10-11 M ou inferior, ou 10-12 M ou inferior. Por exemplo, se um inibidor/antagonista ROBO2 aqui descrito liga-se ao ROBO2 com um KD de 10-5 M ou inferior, mas não a uma molécula relacionada, tais como, por exemplo, outros membros da família ROBO, em seguida, o agente é referido para ligar-se especificamente ao ROBO2. A ligação específica pode ser influenciada por, por exemplo, a afinidade e avidez de, por exemplo, o anticorpo de inibidor/antagonista ROBO2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e a concentração do agente de polipeptídeo. A pessoa versada na técnica pode determinar as condições adequadas sob as quais os agentes de polipeptídeo aqui descritos, se ligam seletivamente os alvos utilizando quaisquer métodos adequados, tal como a titulação de um agente de polipeptídeo em um ensaio de ligação de célula adequado.
[00098] No que diz respeito aos métodos de tratamento da doença renal crônica através da atividade de inibição ROBO2, o termo "doença renal crônica" ou CKD refere-se a doenças renais que lenta e progressivamente pioraram ao longo do tempo devido à perda progressiva de néfrons e consequente perda da função renal. Nos estágios iniciais, pode haver nenhum sintoma. A perda da função normalmente leva meses ou anos para ocorrer. Pode ser tão lenta que os sintomas não aparecem até que a função renal é inferior a um décimo do normal. O estágio final da doença renal crônica é chamado de doença renal terminal (ESRD).
Neste estágio, os rins já não são capazes de remover os resíduos suficientes e líquidos em excesso do corpo. O paciente necessita de diálise ou um transplante renal.
Diabetes, o que leva a nefropatia diabética, e pressão arterial elevada são as duas causas mais comuns de doença renal crônica e conta para a maioria dos casos. Outras doenças e condições que podem danificar os rins e levam à doença renal crônica, incluem: doenças autoimunes (tais como, o lúpus eritematoso sistêmico e esclerodermia); defeitos congênitos dos rins (tais como, doença renal policística); certas substâncias químicas tóxicas; glomerulonefrite; lesão ou trauma; pedras nos rins e infecção; problemas com as artérias que levam a ou para dentro dos rins; alguns medicamentos para a dor e outros fármacos (tais como,fármacos contra o câncer); nefropatia de refluxo (em que os rins estão danificados pelo fluxo retrógrado de urina para os rins); etc. Como aqui usado, "proteinúria" refere-se à presença de um excesso de proteínas séricas na urina. Proteinúria pode, em algumas modalidades, ser indicativa de doença renal, mas, por si só, não é conclusiva.
[00099] Desta maneira, em algumas modalidades destes aspectos e todos esses aspectos aqui descritos, o indivíduo tem ou está em risco para uma doença renal crônica que tem nefropatia diabética.
[000100] Por "reduzir" ou "inibir" em termos da doença renal crônica e métodos de tratamento de proteinúria aqui descritos significa que a capacidade para causar uma diminuição global, de preferência, de 20% ou maior, 30% ou maior, 40% ou maior, 45% ou maior, mais de preferência, de 50% ou maior, de 55% ou maior, de 60% ou maior, de 65% ou maior, de 70% ou maior, e mais de preferência, de 75% ou maior, 80% ou maior, 85% ou maior, 90% ou maior, ou 95% ou maior, para um determinado parâmetro ou sintoma de uma doença renal crônica. Reduzir ou inibir pode referir-se, por exemplo, aos sintomas da doença a ser tratada, por exemplo, pressão sanguínea elevada, proteína na urina, etc.
[000101] A pressão arterial elevada é quase sempre presente durante todos os estágios da doença renal crônica.
Um exame do sistema nervoso pode mostrar sinais de danos nos nervos. O médico pode ouvir os sons do coração ou pulmão anormais quando se ouve com um estetoscópio. Os primeiros sintomas da doença renal crônica também são sintomas de outras doenças. Estes sintomas podem ser os únicos sinais de doença renal até que a condição seja mais avançada. Os sintomas da doença renal crônica podem incluir: perda de apetite; mal-estar geral e fadiga; dores de cabeça; comichão (prurido) e pele seca; náuseas; perda de peso sem tentar perder peso; etc. Outros sintomas que podem se desenvolver, especialmente quando a função renal piorou, incluem: pele anormalmente escura ou clara; dor óssea; cérebro e sintomas do sistema nervoso; sonolência e confusão; problemas de concentração ou pensamento;
dormência nas mãos, pés, ou outras áreas; espasmos musculares ou cólicas; mau hálito; fácil nódoas negras, hemorragias, ou sangue nas fezes; sede excessiva; soluços frequentes; baixo nível de interesse sexual e impotência; paragem dos períodos menstruais (amenorréia); falta de ar; problemas do sono, tais como insônia, síndrome das pernas inquietas, e apnéia do sono obstrutiva; inchaço das mãos e pés (edema); vômitos, geralmente na parte da manhã.
[000102] Desta maneira, em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um inibidor de ROBO2 aqui descrito é administrada a um indivíduo, de modo a aliviar um sintoma de doença renal crônica. Tal como aqui usado, "aliviar um sintoma de uma doença renal crônica" é melhorar qualquer condição ou sintoma associado com a doença renal crônica. Alternativamente, aliviar um sintoma de uma doença renal crônica pode envolver a redução de um ou mais sintomas da doença renal crônica no indivíduo em relação a um controle não-tratado que sofre de doença renal crônica ou em relação ao indivíduo antes do tratamento. Em comparação com um controle sem tratamento equivalente, ou o indivíduo antes do tratamento com o inibidor de ROBO2, tal redução ou grau de prevenção é, pelo menos de 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos
45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, tal como medido por qualquer técnica padrão.
Desejavelmente, a doença renal crônica é significativamente reduzida ou não-detectável, tal como detectada por qualquer método padrão conhecido na técnica, no caso em que a doença renal crônica é considerada ter sido tratada. Um paciente que está sendo tratado para uma doença renal crônica é um que um médico tem diagnosticado como tendo tal condição. O diagnóstico pode ser feito por quaisquer meios adequados conhecidos por um versado na técnica. Diagnóstico e monitoramento podem envolver, por exemplo, a detecção do nível de proteínas ou moléculas específicas em uma amostra de urina, sangue, ou soro, tal como, por exemplo, albumina, cálcio, colesterol, contagem de sangue completo (CBC), eletrólitos, magnésio, fósforo, potássio, sódio, ou qualquer combinação dos mesmos; os ensaios para detectar, por exemplo, depuração da creatinina; níveis de creatinina; BUN (nitrogênio de uréia no sangue); através do uso de técnicas ou procedimentos específicos, tal como uma tomografia computadorizada abdominal CT, ressonância magnética abdominal MRI, ultra-som abdominal, biópsia renal, varredura renal, ultra-som renal; através da detecção de alterações nos resultados de ensaios ou testes de eritropoietina, PTH; teste de densidade óssea, ou vitamina D; ou qualquer combinação de tais métodos de detecção e ensaios.
[000103] Os termos "indivíduo" e "individual", como usados em relação a qualquer um dos métodos aqui descritos são aqui usados indiferentemente, e referem-se a um animal, por exemplo, um ser humano, receptor dos inibidores de ROBO2 aqui descritos. Para o tratamento de estados de doença que são específicos para um animal específico, tal como um indivíduo humano, o termo "indivíduo" refere-se a esse animal específico. Os termos "animais não-humanos" e "mamíferos não-humanos" são aqui usados indiscriminadamente, e incluem mamíferos, tais como camundongos, camundongos, coelhos, ovelhas, gatos, cães, vacas, porcos, e primatas não-humanos. O termo "indivíduo" também engloba qualquer vertebrado, incluindo, mas não limitado a mamíferos, répteis, anfíbios e peixes. No entanto, vantajosamente, o indivíduo é um mamífero, tal como um ser humano, ou outros mamíferos, tais como um mamífero domesticado, por exemplo, cão, gato, cavalo, e semelhantes.
[000104] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o método ainda compreende a administração ao indivíduo de um agente terapêutico adicional, para além do inibidor de ROBO2. Um tal agente terapêutico adicional pode ser co-administrado com o inibidor de ROBO2. Tal como aqui usado, a frase "co- administrar" ou "para co-administrar" significa que a administração de um inibidor de ROBO2 aqui descrita e um outro composto, por exemplo, um agente terapêutico, em separado, em simultâneo, e/ou sequencialmente ao longo de um período de tempo conforme determinado por um cuidador qualificado.
[000105] Em algumas de tais modalidades, o agente terapêutico adicional é uma enzima conversora de angiotensina (ECA), um bloqueador do receptor da angiotensina II (BRA), ou um antagonista de receptor de mineralocorticóide (MR).
[000106] Os inibidores de ECA para o uso com os inibidores de ROBO2 aqui descritos incluem, mas não são limitados a, benazepril (comercializado nos EUA como LOTENSINTM), captopril (comercializado nos EUA como CAPOTENTM), enalapril/enalaprilato (comercializado nos EUA como VASOTECTM oral e injetável), fosinopril (comercializado nos EUA como MONOPRILTM), lisinopril (comercializado nos EUA como ZESTRILTM e PRINIVILTM), moexipril (comercializado nos EUA como UNIVASCTM), perindopril (comercializado nos EUA como ACEONTM), quinapril (comercializado nos EUA como ACCUPRILTM), ramipril (comercializado nos EUA como ALTACETM) e treolapril (comercializado nos EUA como MAVIKTM). BRAs para uso com os inibidores de ROBO2 aqui descritos incluem ceesartan (comercializado nos EUA como ATACETM), irbesartan (comercializado nos EUA como AVAPROTM), olmesartan (comercializado nos EUA como BENICARTM), losartan (comercializado nos EUA como COZAARTM), valsartan (comercializado nos EUA como DIOVANTM), telmisartan (comercializado nos EUA como MICARDISTM), e eprosartan (comercializado nos EUA como TEVETENTM).
[000107] Em algumas modalidades de tais métodos e todos esses métodos aqui descritos, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um diurético, para além do inibidor de ROBO2. Diuréticos incluem, mas não são limitados a, torsemida (comercializado nos EUA como DEMADEXTM), furosemida (comercializado nos EUA como LASIXTM), bumetanida (comercializado nos EUA como BUMEXTM), ácido etacrínico (comercializado nos EUA como EDECRINTM), torsemida (comercializado nos EUA como DEMADEXTM), amilorida (comercializado nos EUA como MIDAMORTM), acetazolamida (comercializado nos EUA como DIAMOXTM), pamabrom (comercializado nos EUA como AQUA- BANTM), manitol (comercializado nos EUA como ARIDOLTM ou OSMITROLTM), traimtereno (comercializado nos EUA como DYRENIUMTM), espironolactona (comercializado nos EUA como ALDACTONETM), amilorida (comercializado nos EUA como
MIDAMORTM), indapamida (comercializado nos EUA como LOZOLTM), hidroclorotiazida (comercializado no EUA como HYDRODIURILTM), metolazona (comercializado nos EUA como ZAROXOLYNTM ou MYKROXTM), metilclotiazida (comercializado nos EUA como AQUATENSENTM ou ENDURONTM), hidroclorotiazida (comercializado nos EUA como AQUAZIDE HTM ou ESIDRIXTM ou MICROZIDETM), clorotiazida (comercializado nos EUA como DIURILTM), bendroflumetiazida (comercializado nos EUA como NATURETINTM), politiazida (comercializado nos EUA como RENESETM), hidroflumetiazida (comercializado nos EUA como SALURONTM) e clortalidona (comercializado nos EUA como THALITONETM). Para uma lista completa também ver, por exemplo, Physician’s Desk Reference, 2012 Edition, PDR Network (2011).
[000108] Conforme aqui usado, no que diz respeito a qualquer uma das composições e métodos que compreendem os inibidores de ROBO-2 ou tratamentos de combinação dos mesmos aqui descritos, os termos "tratar", "tratamento", "para tratar", ou "melhoramento" referem-se a tratamentos terapêuticos, em que o objetivo é reverter, aliviar, melhorar, inibir, retardar ou parar a progressão ou a gravidade de uma condição associada a uma doença ou distúrbio. O termo "tratamento" inclui reduzir ou aliviar, pelo menos, um efeito adverso ou sintoma de uma condição, doença ou distúrbio associada com uma doença renal crônica,
tal como, mas não limitado à nefropatia diabética.
Tratamento é geralmente "eficaz", se um ou mais sintomas ou marcadores clínicos forem reduzidos. Alternativamente, o tratamento é "eficaz", se a progressão de uma doença é reduzida ou interrompida. Isto é, "tratamento" inclui não apenas a melhoria dos sintomas ou marcadores, mas também uma cessação de, pelo menos, retardar o progresso ou agravamento de sintomas que seria esperado na ausência de tratamento. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados ao alívio de um ou mais sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, não piora) da doença, atraso ou retardamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão (quer parcial ou total), quer detectável ou indetectável. O termo "tratamento" de uma doença também inclui o fornecimento de alívio dos sintomas ou efeitos colaterais da doença (incluindo tratamento paliativo).
[000109] O termo "quantidade eficaz", tal como aqui usado, refere-se à quantidade de um inibidor de ROBO-2 aqui descrito, necessária para aliviar, pelo menos, um ou mais dos sintomas da doença ou distúrbio a ser tratada, e refere-se a uma quantidade suficiente de composição farmacológica para proporcionar o efeito desejado. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", portanto, refere-se a uma quantidade do inibidor de ROBO-2 aqui descrito, utilizando os métodos como aqui descritos, que é suficiente para proporcionar um efeito especial, quando administrado a um indivíduo normal. Uma quantidade eficaz como é aqui utilizada também inclui uma quantidade suficiente para retardar o desenvolvimento de um sintoma da doença, alterar o curso de um sintoma da doença (por exemplo, mas não limitado a, retardar a progressão de um sintoma da doença), ou inverter um sintoma da doença. Assim, não é possível especificar a "quantidade eficaz" exata. No entanto, para qualquer caso, uma "quantidade eficaz" adequada pode ser determinada por um versado na técnica utilizando apenas a experimentação de rotina.
[000110] As quantidades, toxicidade e eficácia terapêutica eficazes podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para a determinação de LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada. A relação da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a relação LD50/ED50. As composições e os métodos que exibem os graves índices terapêuticos são preferidos. Uma dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Além disso, uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma circulação da faixa de concentração no plasma que inclui IC50 (isto é, a concentração do inibidor de ROBO-2 aqui descrito, que atinge uma inibição semimáxima da função ou atividade medida), conforme determinado em cultura de célula, ou em um modelo animal apropriado. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência. Os efeitos de qualquer dosagem particular podem ser monitorados por um bio-ensaio adequado. A dosagem pode ser determinada por um médico e ajustada, se necessário, para adequar os efeitos observados do tratamento.
Dependendo do tipo e da gravidade da doença renal crônica, a cerca de 1µg/kg a 100 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de um inibidor de ROBO2 aqui descrito é uma faixa de dosagem de candidato inicial para a administração ao indivíduo se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua.
Modos de Administração
[000111] Os inibidores de ROBO2 ou tratamentos de combinação dos mesmos aqui descritos podem ser administrados a um indivíduo em necessidade do mesmo por qualquer via apropriada que resulta em um tratamento eficaz no indivíduo. Tal como aqui usados, os termos "administrar"
e "introduzir" são utilizados de forma intercambiável e referem-se à colocação de um inibidor de ROBO-2 em um indivíduo por um método ou via que resulta na localização, pelo menos, parcial destes agentes em um local desejado, de tal modo que um efeito desejado é produzido.
[000112] Em algumas modalidades, o inibidor de ROBO2 é administrado a um indivíduo com uma doença renal crônica por qualquer modo de administração que proporciona o agente sistemicamente ou a uma superfície desejada ou alvo, e pode incluir, mas não é limitado à injeção, infusão, instilação, e administração por inalação. Na medida em que os agentes de polipeptídeo podem ser protegidos a partir da inativação no intestino, formas de administração oral também são contempladas. "Injeção" inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, sub-capsular, sub-aracnóide, intra-espinal, intracérebro espinal, e intra-esternal e infusão. Em algumas modalidades, os inibidores de ROBO-2 para uso nos métodos aqui descritos são administrados por infusão intravenosa ou por injeção.
[000113] As frases "administração parentérica" e "administrado parentericamente", tal como aqui utilizadas,
referem-se a modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, geralmente por injeção. As frases "administração sistêmica", "administrado sistemicamente", "administração periférica" e "administrado perifericamente" como usadas aqui se referem à administração do inibidor de ROBO-2, com exceção diretamente em um local alvo, tecido, ou órgão, tal como um local do tumor, de tal modo que o mesmo entra no sistema circulatório do indivíduo e, assim, é submetido ao metabolismo e outros processos semelhantes.
[000114] Para o uso clínico dos métodos aqui descritos, a administração dos inibidores de ROBO-2 aqui descritos, pode incluir a formulação em composições farmacêuticas ou formulações farmacêuticas para administração por via parentérica, por exemplo, por via intravenosa; mucosal, por exemplo, intranasal; ocular, ou outro modo de administração. Em algumas modalidades, os inibidores de ROBO-2 aqui descritos podem ser administrados juntamente com qualquer veículo, composto, material, ou composição farmaceuticamente aceitável que resulta em um tratamento eficaz no indivíduo. Assim, uma formulação farmacêutica para uso nos métodos aqui descritos pode conter um inibidor de ROBO-2, como aqui descrito, em combinação com um ou mais ingredientes farmaceuticamente aceitáveis.
[000115] A frase "farmaceuticamente aceitável"
refere-se aqueles compostos, materiais, composições,e/ou formas de dosagem que estão, dentro do escopo do bom julgamento médico, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma relação de benefício/risco razoável.
A frase "veículo farmaceuticamente aceitável" tal como aqui utilizada significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente, meios, material de encapsulamento, ajuda de fabricação (por exemplo,
lubrificante, talco, magnésio, cálcio ou estearato de zinco, ou ácido estérico), ou material de encapsulamento solvente, envolvido na manutenção da estabilidade,
solubilidade, ou atividade de, um inibidor de ROBO-2. Cada veículo deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o paciente.
Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem:(1) açúcares, tais como, lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como, amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, tais como,
carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, etilcelulose,
celulose microcristalina e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) excipientes, tais como,manteiga de cacau e ceras para supositório; (8) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (9) glicóis, tais como, propileno glicol; (10) polióis, tais como, glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol (PEG); (11) ésteres, tais como, oleato de etila e laurato de etila; (12) ágar; (13) agentes tampão, tais como, hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (14) ácido algínico; (15) água apirogênica; (16) solução salina isotônica; (17) solução de Ringer; (19) soluções tamponadas de pH; (20) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (21) agentes de volume, tais como, polipeptídeos e aminoácidos (22) os componentes do soro, tais como, albumina do soro, HDL e LDL; (23) C2- C12 álcoois, tais como etanol; e (24) outras substâncias compatíveis não-tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas. Os agentes de liberação, agentes de revestimento, conservantes, e antioxidantes também podem estar presentes na formulação. Os termos, tais como "excipiente", "veículo", "veículo farmaceuticamente aceitável" ou outros semelhantes são aqui usados alternadamente.
[000116] Os inibidores de ROBO-2 aqui descritos podem ser especialmente formulados para administração do composto a um indivíduo na forma sólida, líquida ou em gel, incluindo as adaptadas para o seguinte: (1) administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo, uma solução estéril ou suspensão, ou a formulação de liberação prolongada; (2) aplicação tópica, por exemplo, como um creme, pomada, ou um adesivo de liberação controlada ou pulverização aplicado à pele; (3) por via intravaginal ou intra-retal, por exemplo, como um pessário, creme ou espuma; (4) por via ocular; (5) por via transdérmica; (6) por via transmucosal; ou (79) por via nasal. Além disso, um inibidor de ROBO-2 pode ser implantado em um paciente ou injetado usando um sistema de distribuição de fármaco. Ver, por exemplo, Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides e Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981); Patente U.S. No. 3,773,919; e Patente U.S. No. 35 3,270,960.
[000117] Outras modalidades das formulações e modos de administração das composições que compreendem os inibidores de ROBO-2 aqui descritos, que podem ser utilizados nos métodos aqui descritos são descritos abaixo.
[000118] Formas de Dosagem Parenteral. Formas de dosagem parenteral de inibidores de ROBO-2 também podem ser administradas a um indivíduo com uma condição renal crônica através de várias vias, incluindo, mas não limitadas à, subcutânea, intravenosa (incluindo injeção de bolus), intramuscular e intra-arterial. Uma vez que a administração das formas de dosagem parenteral tipicamente ultrapassa as defesas naturais do paciente contra os contaminantes, as formas de dosagem parenterais são, de preferência, estéreis ou capazes de serem esterilizadas antes da administração a um paciente. Exemplos de formas de dosagem parenterais incluem, mas não estão limitadas a, soluções prontas para injeção, produtos secos prontos para serem dissolvidos ou suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável para injeção, suspensões prontas para injeção, as formas de dosagem parenterais de liberação controlada, e emulsões.
[000119] Os veículos adequados que podem ser utilizados para proporcionar as formas de dosagem parenterais da descrição são bem conhecidas por aqueles técnicos especialistas no assunto. Exemplos incluem, sem limitação: água estéril; água para injeção USP; solução salina; solução de glicose; veículos aquosos, tais como, mas não limitados à injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de dextrose, dextrose e injeção de cloreto de sódio, e injeção de Ringer com lactato; veículos miscíveis com água, tais como, mas não limitados a, álcool etílico, polietileno glicol, e propileno glicol; e veículos não-aquosos, tais como, mas não limitados a, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de sésamo, oleato de etila, miristato de isopropila, e benzoato de benzila.
[000120] Em algumas modalidades, as composições que compreendem uma quantidade eficaz de um inibidor de ROBO2 são formuladas para serem adequadas para administração oral, por exemplo, como formas de dosagem discretas, tais como, mas não limitadas a, comprimidos (incluindo, sem limitação comprimidos marcados ou revestidos), pílulas, cápsulas, cápsulas, comprimidos para mastigar, saquetas de pó, hóstias, trociscos, pastilhas, sprays de aerossóis, ou líquidos, tais como, mas não limitados a, xaropes, elixires, soluções ou suspensões em um líquido aquoso, um líquido não-aquoso, uma emulsão de óleo-em-água, ou uma emulsão de água-em-óleo. Tais composições contêm uma quantidade predeterminada do sal farmaceuticamente aceitável dos compostos descritos, e podem ser preparadas por métodos de farmácia bem conhecidos por aqueles técnicos especialistas no assunto. Ver, em geral, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton, Pa. (1990).
[000121] Devido a sua facilidade de administração, os comprimidos e as cápsulas representam as formas de unidade de dosagem oral sólida mais vantajosas, caso em que os excipientes farmacêuticos sólidos são utilizados. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos por técnicas aquosas ou não-aquosas padrão. Estas formas de dosagem podem ser preparadas por qualquer um dos métodos de farmácia. Em geral, as composições farmacêuticas e formas de dosagem são preparadas misture o uniformemente e intimamente os ingredientes ativos com veículos líquidos, veículos sólidos finamente divididos, ou ambos, e em seguida, dando forma ao produto na apresentação desejada, se necessário. Em algumas modalidades, formas de dosagem oral não são usadas para o agente antibiótico.
[000122] As formas de dosagem oral típicas das composições que compreendem uma quantidade eficaz de um inibidor de ROBO2 são preparadas por combinação do sal farmaceuticamente aceitável do inibidor de ROBO2 em uma mistura íntima com, pelo menos, um excipiente de acordo com as técnicas de composição farmacêutica convencionais. Os excipientes podem tomar uma ampla variedade de formas dependendo da forma da composição desejada para administração. Por exemplo, os excipientes adequados para uso em formas de dosagem de aerossol ou líquida oral incluem, mas não são limitados a, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, e agentes corantes. Exemplos de excipientes adequados para uso em formas de dosagem oral sólidas (por exemplo, pós,
comprimidos, cápsulas, e cápsulas) incluem, mas não são limitados a, amidos, açúcares, celulose microcristalina, caulim, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, e agentes de desintegração.
[000123] Os aglutinantes adequados para uso nas formulações farmacêuticas aqui descritas incluem, mas não são limitados a, amido de milho, amido de batata, ou outros amidos, gelatina, gomas naturais e sintéticas, tais como acácia, alginato de sódio, ácido algínico, outros alginatos, tragacanto em pó, goma de guar, celulose e seus derivados (por exemplo, etilcelulose, acetato de celulose, carboximetilcelulose de cálcio, carboximetil celulose de sódio), polivinilpirrolidona, metilcelulose, amido pré- gelatinizado, hidroxipropilmetilcelulose, (por exemplo, Números 2208, 2906, 2910), celulose microcristalina, e misturas dos mesmos.
[000124] Os exemplos de enchedores adequados para uso nas formulações farmacêuticas aqui descritas incluem, mas não são limitados a, talco, carbonato de cálcio (por exemplo, grânulos ou pó), celulose microcristalina, celulose em pó, dextranos, caulim, manitol, ácido silícico, sorbitol, amido, amido pré-gelatinizado, e misturas dos mesmos. O aglutinante ou enchedor nas composições farmacêuticas aqui descritas está geralmente presente em cerca de 50 a cerca de 99 por cento em peso da composição farmacêutica.
[000125] Os desintegrantes são utilizados nas formulações farmacêuticas orais aqui descritas para proporcionar os comprimidos que se desintegram quando expostos a um ambiente aquoso. Uma quantidade suficiente de desintegrante que não seja tão demasiadamente tão pequena para alterar prejudicialmente muito mais, a liberação dos ingredientes ativos deve ser utilizada para formar as formas de dosagem oral sólidas dos inibidores de ROBO2 aqui descritos. A quantidade de desintegrante utilizada varia com base no tipo de formulação, e é facilmente discernível para os técnicos especialistas no assunto. Os desintegrantes que podem ser utilizados para formar as formulações farmacêuticas orais incluem, mas não são limitados a, ágar, ácido algínico, carbonato de cálcio, celulose microcristalina, croscarmelose de sódio, crospovidona, polacrilina de potássio, glicolato de amido de sódio, amido de batata ou de tapioca, outros amidos, amido pré-gelatinizado, argilas, outras alginas, outras celuloses, gomas, e misturas dos mesmos.
[000126] Os lubrificantes que podem ser usados para formar as formulações farmacêuticas orais dos inibidores de ROBO2 aqui descritos incluem, mas não são limitados a, estearato de cálcio, estearato de magnésio, óleo mineral, óleo mineral leve, glicerina, sorbitol, manitol,
polietileno glicol, outros glicóis, ácido esteárico, lauril sulfato de sódio, talco, óleo vegetal hidrogenado (por exemplo, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girassol, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho, e óleo de soja), estearato de zinco, oleato de etila, laureato de etila, ágar, e misturas dos mesmos.
Lubrificantes adicionais incluem, por exemplo, um gel de sílica de silóide (AEROSIL® 200, fabricado por W.R. Grace Co. of Baltimore, Md.), um aerossol coagulado de sílica sintética (comercializado por Degussa Co. of Piano, Texas), CAB-O-SIL® (um produto de dióxido de silício pirogênico vendido por Cabot Co. of Boston, Mass.), e misturas dos mesmos. Se usado em todos, os lubrificantes são tipicamente utilizados em uma quantidade de menos do que cerca de 1 por cento em peso das composições farmacêuticas ou formas de dosagem em que as mesmas estão incorporadas.
[000127] Em outras modalidades, as formulações farmacêuticas livres de lactose e as formas de dosagem são fornecidas, em que tais composições contêm, de preferência, pouca, ou nenhuma, lactose ou outros mono ou dissacarídeos.
Tal como aqui usado, o termo "sem lactose" significa que a quantidade de lactose presente, se alguma, é insuficiente para aumentar substancialmente a taxa de degradação de um ingrediente ativo. As composições livres de lactose da descrição podem compreender os excipientes que são bem conhecidos na técnica e estão listados em USP (XXI)/NF (XVI), que é aqui incorporado por referência.
[000128] As formulações orais dos inibidores de ROBO2 abrangem ainda, em algumas modalidades, as composições farmacêuticas anidras e formas de dosagem que compreendem os inibidores de ROBO2 aqui descritos como ingredientes ativos, uma vez que a água pode facilitar a degradação de alguns compostos. Por exemplo, a adição de água (por exemplo, 5%) é amplamente aceita nas técnicas farmacêuticas como um meio de simular o armazenamento a longo prazo, de modo a determinar as características, tais como a vida de prateleira ou a estabilidade de formulações ao longo do tempo. Ver, por exemplo, Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2nd ed., Marcel Dekker, N.Y., N.Y.:1995). As composições farmacêuticas anidras e formas de dosagem aqui descritas podem ser preparadas utilizando anidro ou baixa umidade contendo os ingredientes e baixa umidade ou baixas condições de umidade. As composições farmacêuticas e formas de dosagem que compreendem lactose e, pelo menos, um ingrediente ativo que compreende uma amina primária ou secundária são, de preferência, anidras, se um contato substancial com umidade e/ou umidade durante a fabricação, embalagem, e/ou armazenamento é esperado. As composições anidras são, de preferência, embaladas utilizando os materiais conhecidos para prevenir a exposição à água, tais que as mesmas possam ser incluídas em kits de formulários adequados. Exemplos de embalagens adequadas incluem, mas não são limitados a, folhas hermeticamente seladas, plásticos, recipientes de doses unitárias (por exemplo, frascos) com ou sem dessecantes, embalagens blister, e embalagens de tiras.
[000129] As formulações em aerossol. Um inibidor de ROBO-2 pode ser embalado em um recipiente de aerossol pressurizado junto com propulsores adequados, por exemplo, propulsores de hidrocarboneto como propano, butano, ou isobutano com adjuvantes convencionais. Um inibidor de ROBO-2 também pode ser administrado em uma forma não- pressurizada, tal como em um nebulizador ou atomizador. Um inibidor de ROBO-2 também pode ser administrado diretamente às vias aéreas na forma de um pó seco, por exemplo, pelo uso de um inalador.
[000130] As composições em pó adequadas incluem, a título de ilustração, as preparações em pó de um inibidor de ROBO-2, completamente misturadas com lactose, ou outros pós inertes aceitáveis para a administração intrabronquial.
As composições em pó podem ser administradas através de um dispensador de aerossol ou encerradas em uma cápsula quebrável que possa ser inserida pelo indivíduo em um dispositivo que perfura a cápsula e expele o pó para fora em uma corrente estável adequada para inalação. As composições podem incluir os propulsores, tensoativos, e co-solventes e podem ser colocadas em recipientes de aerossol convencionais que são fechados por uma válvula de medição adequada.
[000131] Os aerossóis para a administração ao trato respiratório são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Adjei, A. e Garren, J. Pharm. Res., 1:565-569(1990); Zanen, P. e Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114:111-115(1995); Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic e diagnostic agents to the respiratory tract", in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273- 313(1990); Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140:1317-1324(1989)) e possuem potencial para a administração sistêmica de peptídeos eproteínas, bem como (Patton e Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:179- 196(1992)); Timsina et. al., Int. J. Pharm, 101:1-13(1995); e Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4:26-29(1994); French, D.L., Edwards, D.A. e Niven, R.W., Aerosol Sci., 27:769-783(1996); Visser, J., Powder Technology 58:1- 10(1989)); Rudt, S. e R.H. Muller, J. Controlled Release, 22:263-272(1992); Tabata, Y, e Y. Ikada, Biomed. Mater.
Res., 22:837-858(1988); Wall, D. A., Drug Delivery, 2:101- 20 1995); Patton, J. e Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8:179-196(1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5:107-132 (1990); Patton, J. S., et al., Controlled Release, 28:15,
79-85 (1994); Damms, B. e Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al., Pharm.Res., 12(9); 1343- 1349(1995); e Kobayashi, S., et al. Pharm. Res., 13(1):80- 83(1996), os conteúdos de todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
[000132] As formulações dos inibidores de ROBO-2 aqui descritas abrangem ainda as composições farmacêuticas anidras e formas de dosagem que compreendem os compostos descritos como ingredientes ativos, uma vez que a água pode facilitar a degradação de alguns compostos. Por exemplo, a adição de água (por exemplo, 5%) é amplamente aceita nas técnicas farmacêuticas como um meio de simular o armazenamento a longo prazo, de modo a determinar as características, tais como a vida de prateleira ou a estabilidade de formulações ao longo do tempo. Ver, por exemplo, Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2nd ed., Marcel Dekker, N.Y., N.Y.:1995).
As composições farmacêuticas anidras e formas de dosagem da descrição podem ser preparadas utilizando anidro ou baixa umidade contendo os ingredientes e baixa umidade ou baixas condições de umidade. As composições farmacêuticas e formas de dosagem que compreendem lactose e, pelo menos, um ingrediente ativo que compreende uma amina primária ou secundária são, de preferência anidras, se um contato substancial com umidade e/ou umidade durante a fabricação,
embalagem, e/ou armazenamento é esperado. As composições anidras são, de preferência, embaladas utilizando os materiais conhecidos para prevenir a exposição à água, tais que as mesmas possam ser incluídas em kits de formulários adequados. Exemplos de embalagens adequadas incluem, mas não são limitados a, folhas hermeticamente seladas, plásticos, recipientes de doses unitárias (por exemplo, frascos) com ou sem dessecantes, embalagens blister, e embalagens de tiras.
[000133] Formas de Dosagem de Liberação Controlada e Retardada. Em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, um inibidor de ROBO-2 pode ser administrado a um indivíduo por meios de liberação controlada ou retardada.
Idealmente, o uso de uma preparação de liberação controlada otimamente concebido no tratamento médico é caracterizado por um mínimo de substância de fármaco sendo empregado para curar ou controlar a condição em um período mínimo de tempo. As vantagens das formulações de liberação controlada incluem: 1) atividade prolongada do fármaco; 2) frequência de dosagem reduzida; 3) adesão do paciente aumentada; 4) o uso de menos fármacos no total; 5) redução nos efeitos colaterais locais ou sistêmicos; 6) minimização de acumulação de fármaco; 7) redução nas flutuações do nível do sangue; 8) melhoria na eficácia do tratamento; 9) redução de potenciação ou perda da atividade de fármaco; e
10) melhoria na velocidade de controle de doenças ou condições. (Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)). As formulações de liberação controlada podem ser utilizadas para controlar um composto de fórmula (I) é o início da ação, duração da ação, os níveis de plasma dentro da janela terapêutica, e os níveis sanguíneos de pico. Em particular, formas de dosagem de liberação controlada ou estendida ou formulações podem ser utilizadas para assegurar que a eficácia máxima de um composto de fórmula (I) é alcançada enquanto minimiza os efeitos adversos potenciais e as preocupações de segurança, que podem ocorrer tanto a partir de subdosagem de um fármaco (isto é, indo abaixo dos níveis terapêuticos mínimos), assim como excedendo o nível de toxicidade para o fármaco.
[000134] Uma variedade de formas de dosagem de liberação controlada ou estendida conhecidas, formulações, e dispositivos podem ser adaptados para uso com os inibidores de ROBO-2 aqui descritos. Exemplos incluem, mas não são limitados, aos descritos nas Patentes U.S. Números: 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5,674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; 5,733,566; e 6,365,185 B1, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Estas formas de dosagem podem ser utilizadas para fornecer uma liberação controlada ou lenta, de um ou mais ingredientes ativos utilizando, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose, outras matrizes poliméricas, geles, membranas permeáveis, sistemas osmóticos (tais como, (OROS® (Alza Corporation, Mountain View, California, USA)), revestimentos de multicamada, micropartículas, lipossomos, ou microesferas ou uma combinação dos mesmos para proporcionar o perfil de liberação desejado em proporções variadas. Além disso, os materiais de troca de íons podem ser usados para preparar as formas de sal imobilizadas, adsorvidas dos compostos descritos e, assim, efetuar a liberação controlada do fármaco. Exemplos de permutadores de ânions específicos incluem, mas não são limitados a, DUOLITE® A568 e DUOLITE® AP143 (Rohm & Haas, Spring House, Pa. USA).
[000135] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, um inibidor de ROBO-2 para uso nos métodos aqui descritos é administrado a um indivíduo por liberação sustentada ou por impulsos. Terapia de impulso não é uma forma de administração descontínua da mesma quantidade de uma composição ao longo do tempo, mas compreende a administração da mesma dose da composição a uma frequência reduzida ou administração de doses reduzidas.
Administrações de liberação ou de pulso sustentadas são particularmente preferidas quando a distúrbio ocorre continuamente no indivíduo, por exemplo, quando o indivíduo tem doença renal crônica. Cada dose do pulso pode ser reduzida e a quantidade total de um inibidor de ROBO-2 aqui descrito administrada ao longo do curso do tratamento para o indivíduo ou paciente é minimizada.
[000136] O intervalo entre os pulsos, quando necessário, pode ser determinado por um dos técnicos especialistas no assunto. Muitas vezes, o intervalo entre impulsos pode ser calculado através da administração de outra dose da composição, quando a composição ou o componente ativo da composição não é detectável no indivíduo antes da administração do impulso seguinte. Os intervalos podem também ser calculados a partir da meia- vida da composição in vivo. Os intervalos podem ser calculados como maiores do que a meia-vida in vivo, ou 2, 3, 4, 5 e mesmo 10 vezes maiores do que composição de meia- vida. Vários métodos e aparelhos para as composições de pulsação por infusão ou outras formas de administração ao paciente, estão descritos nas Patentes U.S. Números 4,747,825; 4,723,958; 4,948,592; 4,965,251 e 5,403,590.
[000137] Em algumas modalidades, as preparações de liberação sustentada que compreendem o inibidor de ROBO-2 podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o inibidor, em que as matrizes estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Patente U.S. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não-degradável, copolímeros de ácido glicólico - ácido láctico degradáveis, tais como LUPRON DEPOT (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido glicólico -ácido láctico e acetato de leuprolide), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[000138] As formulações que compreendem os inibidores de ROBO-2 a serem usados para administração in vivo são, de preferência, estéreis. Isto é facilmente alcançado por filtração através de, por exemplo, membranas de filtração estéreis, e outros métodos conhecidos por um versado na técnica.
[000139] Também são aqui fornecidos, em alguns aspectos, os ensaios, métodos, e sistemas para determinar se uma pessoa tem uma doença renal crônica ou uma pré- disposição para uma doença renal crônica ou proteinúria com base em perfis de expressão ou informação da sequência de ROBO2 como um biomarcador indicativo de doença renal crônica ou uma pré-disposição para uma doença renal crônica ou proteinúria. Como aqui demonstrado, ROBO2 é útil como um biomarcador para identificar um indivíduo com doença renal crônica ou de alto risco para doença renal crônica ou proteinúria ou para monitorar os efeitos do tratamento sobre a progressão da doença renal crônica ou proteinúria.
[000140] Conforme aqui usado, um "biomarcador" refere-se a uma biomolécula orgânica que está diferencialmente presente em uma amostra tomada a partir de um indivíduo de um estado fenotípico (por exemplo, tendo uma doença), em comparação com um outro estado fenotípico (por exemplo, não tendo o doença). Um biomarcador está diferencialmente presente entre diferentes estados fenotípicos se a média ou o nível de expressão mediana do biomarcador nos diferentes grupos for calculado para ser estatisticamente significativo. Testes mais comuns para significância estatística incluem, entre outros, teste t, ANOVA, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney e relações de probabilidade. Biomarcadores, isoladamente ou em combinação, proporcionam medidas de risco relativo, em que um indivíduo pertence a um estado fenotípico ou outro. Como tal, os mesmos são úteis como marcadores para a doença (diagnóstico), eficácia terapêutica de um fármaco (teranóstica) e da toxicidade do fármaco.
[000141] A expressão de ROBO2 para uso nos ensaios aqui descritos, pode ser detectada por qualquer método adequado, incluindo a detecção ou os níveis de proteína ou a detecção dos níveis de expressão de mRNA. O polipeptídeo de ROBO2 pode ser detectado em qualquer forma que pode ser encontrada em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, ou em qualquer forma que pode resultar a partir da manipulação de amostra biológica (por exemplo, como um resultado do processamento da amostra). As formas modificadas de ROBO2 podem incluir as proteínas modificadas que são um produto de variantes alélicas, variantes de splice, modificação pós-translacional (por exemplo, glicosilação, clivagem proteolítica (por exemplo, fragmentos de uma proteína de origem), glicosilação, fosforilação, lipidação, oxidação, metilação, cisteinilação, sulfonação, acetilação, e semelhantes), oligomerização, de-oligomerização (para monômeros separados de uma forma multimérica da proteína), desnaturação, e semelhantes.
[000142] Os ensaios aqui descritos podem ser concebidos para detectar todas as formas ou formas particulares de ROBO2. Quando desejado, a diferenciação entre as diferentes formas de ROBO2, por exemplo, diferentes isoformas, podem ser alcançadas pelo uso de métodos de detecção dependentes mediante as características físicas que diferem entre as formas, por exemplo, peso molecular diferente, tamanho molecular diferente, presença/ausência de epítopos diferentes, e semelhantes.
[000143] Desta maneira, como fornecidos aqui, em alguns aspectos, são os ensaios para o diagnóstico de um indivíduo com doença renal crônica ou em situação de risco para a doença renal crônica ou proteinúria, o ensaio que compreende: medir o nível de proteína ROBO2 ou ácido nucléico em um amostra biológica obtida a partir do indivíduo, em que, se o nível do ROBO2 na amostra biológica a partir do indivíduo para o mesmo nível ou superior do que
(por exemplo, superior do que por uma quantidade estatisticamente significativa) um nível de referência limite para ROBO2, o indivíduo provavelmente está em risco para doença renal crônica ou proteinúria ou tem doença renal crônica.
Por exemplo, um aumento no nível de ROBO2 por mais do que cerca de 10%, ou mais do que cerca de 20%,
ou mais do que cerca de 30%, ou mais do que cerca de 40%,
ou mais do que cerca de 50%, ou mais do que cerca de 60%,
ou mais, em comparação com um nível limite de referência de
ROBO2. Em algumas modalidades, o aumento no nível de ROBO2 é, pelo menos, um desvio padrão maior do que, ou pelo menos, dois desvios padrão, ou mais, maiores do que um nível limite de referência ROBO2 mediana ou média.
Tais níveis de referência ROBO2 de mediana ou média podem ser obtidos, por exemplo, de cinco ou mais amostras obtidas a partir dos indivíduos que não têm a doença renal crônica ou proteinúria, ou a partir de cinco ou mais amostras obtidas a partir do mesmo indivíduo em diferentes pontos temporais.
[000144] Em algumas modalidades destes ensaios, a quantidade de ROBO2 medida em uma amostra biológica é comparada com um nível limite de referência, ou uma amostra biológica de referência, tal como amostra biológica obtida a partir de um controle normal da mesma idade (por exemplo, um indivíduo da mesma idade não tem um risco de doença renal crônica ou proteinúria), ou um indivíduo saudável, por exemplo, um indivíduo saudável.
[000145] Em algumas modalidades, os ensaios, sistemas e kits como aqui descritos também são úteis para monitorar um curso do tratamento sendo administrado a um indivíduo.
Por exemplo, um pode medir o nível de ROBO2 em uma amostra biológica no indivíduo em um primeiro momento(por exemplo, t1) e comparar com o nível limite de referenciado biomarcador ROBO2, e se o nível medido para ROBO2 para o mesmo ou maior do que o nível limite de referência, o indivíduo pode ser administrado com um tratamento terapêutico adequado ou regime para retardar ou reduzir a ocorrência da doença renal crônica ou proteinúria, por exemplo, aumentar o exercício, reduzir a pressão cardíaca, ajustar a dieta, etc., como descrito nos métodos aqui, e em seguida, o nível do painel da proteína biomarcadora ROBO2 pode ser medido em um segundo (por exemplo, t2) e momentos subsequentes (por exemplo, t3, t4, t5, t5, etc.), e em comparação com os níveis de tROBO2 em um ou mais momentos (por exemplo, em t1 ou qualquer momento subsequente) ou os níveis limite de referência de ROBO2 para determinar se o tratamento terapêutico ou tratamento médico ou regime para o tratamento para reduzir o risco de, retardar, ou reduzir a ocorrência da doença renal crônica ou proteinúria é eficaz. Em algumas de tais modalidades, os ensaios, sistemas e kits como aqui descritos podem ser utilizados para monitorar um tratamento terapêutico em um indivíduo sintomático (por exemplo, um indivíduo conhecido para uma doença renal crônica ou proteinúria), em que um tratamento eficaz pode ser uma redução em ROBO2 no indivíduo ou, alternativamente, os ensaios, sistemas e kits como aqui descritos podem ser utilizados para monitorar o efeito do tratamento profilático em um indivíduo assintomático (por exemplo, para prevenir a doença renal crônica ou proteinúria que ocorre em um indivíduo), por exemplo, onde o indivíduo foi identificado como estando em risco de doença renal crônica ou proteinúria, de acordo com os métodos como aqui descritos, ou outros conhecidos na técnica, ou devido a razões hereditárias, por exemplo.
[000146] O termo "amostra", tal como aqui usado, geralmente refere-se a qualquer material que contém ácido nucléico, quer DNA ou RNA, ou aminoácidos. Geralmente, estes materiais estarão sob a forma de uma amostra de sangue, amostra de fezes, amostra de tecido, células, bactérias, seção histológica, ou cotonete bucal. As amostras podem ser preparadas, por exemplo, as amostras podem ser frescas, fixas, congeladas, ou embebidas em parafina. O termo "amostra biológica", tal como aqui usado refere-se a uma célula ou população de células, ou uma quantidade de tecido ou de fluido a partir de um indivíduo.
Na maioria das vezes, a amostra foi retirada a partir de um indivíduo, mas o termo "amostra biológica" também pode se referir a células ou tecidos analisados in vivo, isto é, sem a remoção a partir do indivíduo. Na maioria das vezes, uma "amostra biológica" conterá as células do animal, mas o termo pode também referir-se ao material biológico não- celular, tais como as frações não-celulares do sangue, saliva, ou urina, que podem ser utilizadas para medir os níveis de expressão do gene. As amostras biológicas incluem, mas não são limitadas a, biópsias de tecidos, arranhões, sangue total, plasma, soro, urina, saliva, cultura de células, ou fluido cérebro-espinhal. As amostras biológicas também incluem as biópsias de tecidos, cultura de células. Uma amostra biológica ou amostra de tecido pode referir-se a uma amostra de tecido ou fluido isolado a partir de um indivíduo, incluindo, mas não limitado a, por exemplo, urina, sangue, plasma, soro, biopsia renal, fezes, expectoração, fluido espinhal, fluido pleural, mamilo aspirado, fluido linfático, as seções externas da pele, tratos respiratório, intestinal e genito-urinário, lágrimas, saliva, leite, células (incluindo, mas não limitadas a, células do sangue), tumores, órgãos, e também amostras de um constituinte de cultura de célula in vitro.
Em algumas modalidades, em que uma amostra de urina é obtida, a amostra de urina é centrifugada para sedimentar quaisquer células do rim, na qual os ensaios e métodos aqui descritos podem ser realizados. Em algumas modalidades, a amostra é de uma biópsia renal, tal como uma biópsia da agulha do núcleo de um rim ou porção da mesma, tal como uma amostra de podócito. Além disso, são utilizadas as amostras de aspirado de agulha fina. Em algumas modalidades, as amostras biológicas podem ser preparadas, por exemplo, as amostras biológicas podem ser frescas, fixas, congeladas, ou embebidas em parafina. A amostra pode ser obtida através da remoção de uma amostra de células a partir de um indivíduo, mas também pode ser realizada usando células isoladas anteriormente (por exemplo, isoladas por outra pessoa), ou através da realização dos métodos aqui descritos, in vivo.
[000147] O termo "expressão", tal como aqui usado refere-se alternadamente à expressão de um polipeptídeo ou proteína, ou expressão de um polinucleotídeo ou expressão de um gene. A expressão também se refere à expressão de proteínas modificadas pré-translacionais e modificadas pós- transducionalmente, bem como a expressão de moléculas de pré-mRNA, as moléculas de mRNA maduras e alternativamente unidas.A expressão de um polinucleotídeo pode ser determinada, por exemplo, através da medição da produção de moléculas de RNA transcrito, por exemplo, níveis transcritos de RNA mensageiro (mRNA). A expressão de uma proteína ou um polipeptídeo pode ser determinada, por exemplo, por meio de imunoensaio usando um anticorpo que se liga com o polipeptídeo. O termo "codificação", como é aplicado aos polinucleotídeos refere-se a um polinucleotídeo que é referido para "codificar" um polipeptídeo ou proteína se, no seu estado nativo ou quando manipulado através de métodos bem conhecidos por aqueles técnicos especialistas no assunto, o mesmo pode ser transcrito para produzir o RNA que pode ser traduzido para uma sequência de aminoácido para gerar o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. O filamento de anti-senso é o complemento de tal ácido nucléico tal, e a sequência de codificação pode ser daí reduzida. O termo "expresso endogenamente" ou "expressão endógena" refere-se à expressão de um produto do gene em níveis normais e sob regulação normal para esse tipo de célula.
[000148] Os métodos de detecção que podem ser utilizados com os ensaios, métodos e sistemas aqui descritos para medir os níveis de proteína ROBO2 ou ácido nucléico em uma amostra ou amostras biológicas incluem os métodos ópticos, métodos eletroquímicos (técnicas de voltametria e amperometria), microscopia de força atômica e os métodos de rádio frequência, por exemplo, espectroscopia de ressonância multipolar. Métodos ópticos incluem microscopia, ambas confocal e não-confocal, detecção de fluorescência, luminescência, quimioluminescência, absorvência, refletância, transmitância, e birrefringência ou índice de refração (por exemplo, ressonância de plasma de superfície, elipsometria, um método do espelho ressonante, um método de guia de onda de acoplamento de grade ou interferometria).
[000149] Em modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, em que o nível de proteína ROBO2 é determinado, tal como, por exemplo, o nível de uma proteína de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, um pode usar qualquer abordagem proteômica vulgarmente conhecida por aqueles técnicos especialistas no assunto para medir o nível das proteínas biomarcadoras em uma amostra biológica. A medição pode ser quantitativa ou qualitativa, desde que a medição seja capaz de determinar, ou indicar se o nível de proteína ROBO2 na amostra biológica é o mesmo que, ou acima ou abaixo de um valor limite de referência para a proteína ROBO2.
[000150] O nível medido de proteína ROBO2 pode, em algumas modalidades, ser uma medida preliminar do nível de proteína ROBO2 medindo a quantidade da própria proteína ROBO2, tal como por meio da detecção do número de moléculas de proteína ROBO2 na amostra ou pode ser, em algumas modalidades, uma medição secundária da proteína ROBO2 (uma medição a partir da qual a quantidade de proteína ROBO2 pode ser, mas não necessariamente deduzida, tal como uma medida da atividade funcional ou uma medida de ácido nucléico, tal como mRNA, que codifica a proteína ROBO2). Os dados qualitativos podem também ser derivados ou obtidos a partir de medições preliminares.
[000151] Em algumas modalidades dos ensaios e os métodos aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 podem ser medidos utilizando uma tecnologia de medição com base na afinidade. "Afinidade", como se refere a um anticorpo é um termo bem compreendido na técnica e designa a extensão, ou a força, de uma ligação do anticorpo para o parceiro de ligação, tal como um biomarcador, tal como aqui descrito (ou epítopo do mesmo). Afinidade pode ser uma medida e/ou expressa em um número de maneiras conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, constante de dissociação de equilíbrio (KD ou Kd), constante de dissociação de equilíbrio aparente (KD’ ou Kd’), e IC50 (quantidade necessária para efetuar 50% de inibição em um ensaio de competição, aqui usada alternadamente com "I50"). Entende- se que, para os fins desta invenção, uma afinidade é uma afinidade média para uma determinada população de anticorpos que se ligam a um epítopo.
[000152] A tecnologia de medição baseada na afinidade utiliza uma molécula que se liga especificamente à proteína biomarcadora sendo medida (um "reagente de afinidade", tal como um anticorpo ou um aptâmero), apesar de outras tecnologias, tais como as tecnologias baseadas na espectroscopia (por exemplo, matriz- ionização de dessorção de laser assistida -tempo de voo, espectrometria de MALDI- TOF) ou ensaios que medem a bioatividade (por exemplo, ensaios que medem a mitogenicidade de fatores de crescimento) podem também ser utilizadas. Tecnologias baseadas em afinidade para uso com os ensaios e métodos aqui descritos podem incluir os ensaios baseados em anticorpos (imunoensaios) e ensaios utilizando aptâmeros (moléculas de ácidos nucléicos que se ligam especificamente a outras moléculas), tal como ELONA. Além disso, ensaios utilizando ambos os anticorpos e aptâmeros são também contemplados (por exemplo, um ensaio em formato de sanduíche, utilizando um anticorpo para a captura e um aptâmero para a detecção). Uma grande variedade de ensaios baseados em afinidade também é conhecida na técnica.
[000153] Os ensaios baseados em afinidade tipicamente utilizam, pelo menos, um epítopo derivado a partir da proteína biomarcadora, isto é, ROBO2, e muitos formatos de ensaios baseados em afinidade utilizam mais do que um epítopo (por exemplo, dois ou mais epítopos estão envolvidos em ensaios de formato "sanduíche"; pelo menos, um epítopo é usado para capturar a proteína biomarcadora e, pelo menos, um epítopo diferente é utilizado para detectar o marcador).
[000154] Os ensaios baseados em afinidade podem estar em concorrência ou em formatos de reação direta, utilizar formatos do tipo sanduíche, e podem ainda ser heterogêneos (por exemplo, utilizar os suportes sólidos) ou homogêneos (por exemplo, ocorrem em uma única fase) e/ou utilizar imunoprecipitação. Muitos ensaios envolvem o uso de reagente por afinidade marcados(por exemplo, anticorpo, polipeptídeo, ou aptâmero); os marcadores podem ser, por exemplo, enzimáticos, fluorescentes, quimioluminescentes, radioativos, ou moléculas de corante. Os ensaios que amplificam os sinais a partir da sonda são também conhecidos; exemplos dos quais são ensaios que utilizam biotina e avidina, e imunoensaios mediados e marcados com enzima, tais como os ensaios de ELISA e ELONA. Por exemplo, as concentrações de biomarcadores a partir de amostras de fluidos biológicos podem ser medidas pelo ensaio de LUMINEX® ou ELISA. Qualquer um dos biomarcadores ou reagente específico para o biomarcador pode ser ligado a uma superfície e os níveis podem ser medidos diretamente ou indiretamente.
[000155] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 podem ser medidos utilizando uma tecnologia de medição baseada em afinidade de imunoensaio.
[000156] As tecnologias de imunoensaio podem incluir qualquer tecnologia de imunoensaio que pode quantitativamente ou qualitativamente medir o nível de proteína ROBO2 em uma amostra biológica. Tecnologias de imunoensaio adequadas incluem, mas não são limitadas a, radio-imunoensaio, ELISA (ensaio imuno-absorvente ligado à enzima), imunoensaios de "sanduíche", ensaios imuno- radiométricos, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (usando ouro coloidal, enzima ou marcadores de radioisótopos, por exemplo), análises Western blot, imunoprecipitações, ensaios de imunofluorescência, ensaios de imunoeletroforese, fluoroimunoensaio (FiA), ensaio imuno-radiométrico (IRMA), ensaio imunoenzimométrico (IEMA), ensaio de imunoluminescência e ensaio de imunofluorescência (Madersbacher S, Berger P. Antibodies and Immunoassays. Methods 2000;21:41-50), ensaio quimioluminescente, imuno-PCR, e ensaio Western blot. Da mesma forma, os ensaios baseados em aptâmero que podem quantitativamente ou qualitativamente medir o nível de um biomarcador em uma amostra biológica podem ser utilizados nos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos.
Geralmente, os aptâmeros podem ser substituídos por anticorpos em quase todos os formatos de imunoensaio, embora os aptâmeros permitam os formatos de ensaios adicionais (tal como, amplificação de aptâmeros ligados utilizando a tecnologia de amplificação de ácido nucléico, tais como PCR (Patente U.S. No. 4.683.202) ou amplificação isotérmica com iniciadores compostos (Patentes U.S. Números
6.251.639 e 6.692.918).
[000157] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos e sistemas aqui descritos, em que os níveis de proteína ROBO2 são medidos usando uma tecnologia de medição baseada na afinidade de imunoensaio, o imunoensaio é realizado através da medição do grau de interação de proteína/anticorpo da interação de biomarcador/anticorpo.
Qualquer método conhecido de imunoensaio pode ser utilizado.
[000158] Em algumas modalidades, um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo ou uma ligação de ligante para a proteína ROBO2 no ensaio de ligação, é de preferência, um agente de ligação específico marcado, mas não necessariamente, um anticorpo. O parceiro de ligação geralmente é ele próprio marcado, mas alternativamente pode ser detectado por uma reação secundária, na qual é gerado um sinal, por exemplo, a partir de outra substância rotulada.
[000159] Deste modo, o anticorpo que se liga especificamente à proteína ROBO2 pode ser utilizado nos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos para determinar a presença e/ou quantidade da proteína ROBO2 na amostra biológica, que pode ser usada para detectar o aumento ou diminuição da concentração de proteína ROBO2 presente em uma amostra de diagnóstico. Tais anticorpos podem ser feitos por qualquer um dos métodos bem conhecidos no campo de imunodiagnóstico. Os anticorpos podem ser anticorpos de proteína anti-ROBO2 para qualquer estado biologicamente relevante da proteína. Assim, por exemplo, os mesmos podem ser criados contra a forma não-glicosilada de proteína ROBO2, que existe no corpo em uma forma glicosilada, ou contra um peptídeo que carrega um epítopo relevante de proteína ROBO2.
[000160] Em algumas modalidades destes ensaios, método, e sistemas, uma forma de ensaio amplificado pode ser usada, na qual um "sinal" reforçado é produzido a partir de um nível relativamente baixo de proteína a ser detectado. Uma forma particular de um imunoensaio amplificado é reforçada no ensaio quimioluminescente. Por exemplo, o anticorpo é marcado com peroxidase de rábano silvestre, que participa em uma reação quimioluminescente com luminol, um substrato de peróxido e um composto que aumenta a intensidade e a duração da luz emitida, tipicamente 4-iodofenol ou ácido 4-hidroxicinâmico.
[000161] Em algumas modalidades destes ensaios, método, e sistemas, um imunoensaio amplificado pode ser utilizado compreendendo imuno-PCR. Nesta técnica, o anticorpo está covalentemente ligado a uma molécula de DNA arbitrária que compreende os iniciadores de PCR, em que o DNA com o anticorpo ligado ao mesmo é amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Ver, E.R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23:522-529 (1995).
[000162] Desta maneira, em todas as modalidades dos ensaios, método, e sistemas aqui descritos, o nível de proteína ROBO2 pode ser determinado utilizando um agente de ligação de proteína, também aqui referido como "entidade de ligação de proteína" ou um "reagente de afinidade" pode ser utilizado, em particular, os anticorpos. Por exemplo, os reagentes de afinidade, em particular, anticorpos, tais como anticorpos antibiomarcadores podem ser utilizados em um imunoensaio, particularmente em um ensaio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Em modalidades, em que o nível de uma proteína biomarcadora pode ser medido em uma amostra biológica usando métodos geralmente conhecidos na técnica, e incluindo, por exemplo, mas não limitado a,clivagem enzimática ou química específica de isoforma de proteínas de isoforma, imunoblotting, análises imuno-histoquímicas, ELISA, e espectrometria de massa.
[000163] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos utilizando "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)". ELISA é uma técnica para detectar e medir a concentração de um antígeno usando uma forma rotulada (por exemplo, ligado à enzima) do anticorpo. Existem diferentes formas de ELISA, as quais são bem conhecidas para os técnicos especialistas no assunto. As técnicas padrão conhecidas na área para ELISA são descritas em "Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose e Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al., "Methods and Immunology", W.A. Benjamin, Inc., 1964; e Oellerich, M.
1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22:895-904.
[000164] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos utilizando um ensaio em sanduíche ELISA. Em um "ELISA de sanduíche", um anticorpo (por exemplo, anti- enzima) está ligado a uma fase sólida (isto é, uma placa de microtítulo), e exposto a uma amostra biológica que contém o antígeno (por exemplo, enzima). A fase sólida é, em seguida, lavada para remover o antígenonão-ligado. Um anticorpo marcado (por exemplo, ligado à enzima) é, em seguida, ligado ao antígeno ligado (se presente), formando um sanduíche de anticorpo-antígeno-anticorpo. Desta maneira, usando este método, um primeiro anticorpo para a proteína ROBO2 está ligado à fase sólida, tal como uma placa de microtítulo de plástico, e incubado com a amostra e com um segundo anticorpo marcado específico para a proteína ROBO2 a ser ensaiada. Exemplos de enzimas que podem ser ligados ao anticorpo são fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, luciferase, urease, e B- galactosidase. O anticorpo ligado à enzima reage com um substrato para gerar um produto de reação de cor que pode ser medido.
[000165] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos usando um ensaio de captura de anticorpo ou ELISA competitivo. Em um "ELISA competitivo", o anticorpo é incubado com uma amostra contendo o antígeno (isto é, enzima). A mistura de antígeno-anticorpo é, em seguida, colocada em contato com uma fase sólida (por exemplo, uma placa de microtítulo), que é revestida com um antígeno (isto é, enzima). O antígeno mais presente na amostra, o anticorpo menos livre, que estará disponível para se ligar à fase sólida. Um anticorpo secundário marcado(por exemplo, ligado à enzima) é, em seguida, adicionado à fase sólida para determinar a quantidade de anticorpo primário ligada à fase sólida. Desta maneira, em algumas de tais modalidades, uma amostra biológica de teste é deixada ligar-se a uma fase sólida, e o anticorpo de proteína anti-ROBO2 (por exemplo, anticorpos que se ligam especificamente à proteína ROBO2) pode ser adicionado e deixado ligar. Após a lavagem para retirar o material não-ligado, a quantidade de anticorpo ligada à fase sólida é determinada usando um segundo anticorpo marcado, anti- para o primeiro.
[000166] Em algumas modalidades destes ensaios, método, e sistemas, um marcador é, de preferência, uma enzima. O substrato para a enzima pode ser, por exemplo, de formação de cor, fluorescente ou quimioluminescente.
[000167] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos através de imuno-histoquímica. Em um "ensaio de imuno-histoquímica" uma seção de tecido é testada para as proteínas específicas, expondo o tecido a anticorpos que são específicos para a proteína que está sendo ensaiada. Os anticorpos são, em seguida, visualizados por qualquer um de uma série de métodos para determinar a presença e quantidade de proteína presente. Exemplos de métodos utilizados para visualizar os anticorpos são, por exemplo, por meio de enzimas ligadas a anticorpos (por exemplo, luciferase, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, ou beta-galactosidase), ou métodos químicos (por exemplo, DAB/Substrate Chromagen). A amostra é, em seguida, analisada microscopicamente, mais de preferência, por meio de microscopia de luz de uma amostra manchada com um corante que é detectado no espectro visível, utilizando qualquer de uma variedade de tais métodos de marcação e reagentes conhecidos dos técnicos especialistas no assunto.
[000168] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos utilizando radio-imunoensaios. Um radio-imunoensaio é uma técnica para detectar e medir a concentração de um antígeno, isto é, ROBO2, utilizando uma forma rotulada (por exemplo, radioativamente ou fluorescentemente rotulada) do antígeno. Exemplos de marcadores radioativos para antígenos incluem 3H, 14C, e 125I. A concentração de ROBO2 em uma amostra biológica é medida com o ROBO2 na amostra biológica que compete com o ROBO2 marcado(por exemplo, radioativamente) para a ligação a um anticorpo para ROBO2.
Para assegurar a ligação competitiva entre o ROBO2 marcado e o ROBO2não-marcado, o ROBO2marcadoestá presente em uma concentração suficiente para saturar os locais de ligação do anticorpo. Quanto maior a concentração de ROBO2 na amostra, menor a concentração de ROBO2 marcado que irá ligar-se ao anticorpo.
[000169] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos usando um ensaio imuno-radiométrico (IRMA). IRMA é um imunoensaio em que o reagente de anticorpo é marcado radioativamente. Um IRMA requer a produção de um conjugado de antígeno multivalente, por meio de técnicas, tais como por exemplo, conjugação com uma proteína, albumina de soro de coelho (RSA). O conjugado de antígeno multivalente deve ter pelo menos 2 resíduos de antígeno por molécula e os resíduos de antígeno devem ser de uma distância suficiente para além de permitir a ligação por, pelo menos, dois anticorpos para o antígeno. Por exemplo, em um IRMA o conjugado de antígeno multivalente pode ser ligado a uma superfície sólida, tal como uma esfera de plástico. Um antígeno de "amostra" não-marcado e o anticorpo para o antígeno, que é marcado radioativamente são adicionados a um tubo de ensaio contendo a esfera revestida de conjugado de antígeno multivalente. O antígeno na amostra compete com o conjugado de antígeno multivalente para os locais de ligação antígeno-anticorpo. Após um período de incubação apropriado, os reagentes não-ligados são removidos por lavagem e a quantidade de radioatividade na fase sólida é determinada. A quantidade de anticorpo radioativo ligado é inversamente proporcional à concentração de antígeno na amostra.
[000170] Outras técnicas podem ser usadas para detectar o nível de proteína ROBO2em uma amostra biológica que pode ser realizada de acordo com a preferência do praticante, e com base na presente descrição e o tipo de amostra biológica (isto é, plasma, urina, amostras de tecido, etc.). Uma dessas técnicas é Western blotting (Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350(1979)), em que uma amostra convenientemente tratada é executada sobre um gel de SDS-PAGE antes de ser transferida para um suporte sólido, tal como um filtro de nitrocelulose. Os anticorpos anti-ROBO2marcadosde forma detectável ou moléculas de ligação de proteína podem, em seguida, serem usados para avaliar o nível de proteína ROBO2, onde a intensidade do sinal do marcador detectável corresponde à quantidade de proteína ROBO2. Níveis de quantidade de proteína ROBO2 presente também podem ser quantificados, por exemplo, por densitometria.
[000171] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos usando a espectrometria de massa, tal como MALDI/TOF (tempo-de-vôo), SELDI/TOF, espectrometria de massa-cromatografia líquida (LC-MS), espectrometria de massa-cromatografia gasosa (GC-MS), espectrometria de massa- cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-MS), espectrometria de massa-eletroforese capilar, espectrometria de ressonância magnética nuclear, ou espectrometria de massa em tandem (por exemplo, MS/MS,
MS/MS/MS, ESI-MS/MS, etc.). Ver, por exemplo, Pedidos de Patente U.S. Números: 20030199001, 20030134304, 20030077616, que são aqui incorporados na sua totalidade por referência.
[000172] Em algumas de tais modalidades, estas metodologias podem ser combinadas com as máquinas, os sistemas computacionais e meios para produzir um sistema automatizado para determinação do nível de proteína ROBO2 em uma amostra biológica e análises para a produção de um relatório impresso que identifica, por exemplo, o nível de proteína ROBO2, em uma amostra biológica. Em alguns casos, a medição do nível de ROBO2 é feita remotamente a partir da determinação e módulos de comparação.
[000173] Métodos de espectrometria de massa são bem conhecidos na técnica e têm sido utilizados para quantificar e/ou identificação de biomoléculas, tais como proteínas (ver, por exemplo, Li et al. (2000) Tibtech 18:151-160;Rowley et al. (2000) Methods 20: 383-397, e Kuster and Mann (1998) Curr.Opin.Structural Biol. 8: 393- 400). Além disso, as técnicas de espectrometria de massa foram desenvolvidas, as quais permitem, pelo menos,novo sequenciamento parcial de proteínas isoladas. Chait et al., Science 262:89-92(1993); Keough et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. EUA. 96:7131-6(1999); reviewed in Bergman, EXS 88:133- 44(2000).
[000174] Em certas modalidades, um espectrofotômetro de íon em fase gasosa é usado. Em outras modalidades, a espectrometria de massa de dessorção/ionização de laser é utilizada para analisar a amostra. A espectrometria de massa de dessorção/ionização a laser moderna ("LDI-MS") pode ser praticada em duas variações principais: matriz assistida de espectrometria de massa de dessorção/ionização a laser ("MALDI") e dessorção/ionização a laser intensificada pela superfície("SELDI"). Em MALDI, o analito é misturado com uma solução contendo uma matriz, e uma gota do líquido é colocada sobre a superfície de um substrato. A solução de matriz, em seguida, co-cristaliza com as moléculas biológicas. O substrato é inserido no espectrômetro de massa. A energia a laser é direcionada para a superfície do substrato onde a mesma dissolve e ioniza as moléculas biológicas sem fragmentá-las significativamente. Ver, por exemplo, Patente U.S. No.
5,118,937 (Hillenkamp et al.), e Patente U.S. No. 5,045,694 (Beavis & Chait), as quais são aqui incorporadas por referência.
[000175] Em SELDI, a superfície do substrato é modificada, de modo que a mesma é um participante ativo no processo de dessorção. Em uma variante, a superfície é derivatizada com reagentes adsorventes e/ou de captura que se ligam seletivamente à proteína de interesse. Em outra variante, a superfície é derivatizada com as moléculas absorventes de energia que não são dissolvidas quando atingidas com o laser. Em outra variante, a superfície é derivatizada com as moléculas que se ligam à proteína de interesse e que contêm uma ligação fotolítica que é quebrada quando da aplicação do laser. Em cada um destes métodos, o agente de derivatização é geralmente localizado a um local específico sobre a superfície do substrato em que a amostra é aplicada. Ver, por exemplo, Patente U.S.
No. 5,719,060 e WO 98/59361, que são aqui incorporados por referência. Os dois métodos podem ser combinados, por exemplo, usando uma superfície de afinidade SELDI para capturar um analito e adicionar o líquido que contém a matriz com o analito capturado para fornecer o material de absorção de energia.
[000176] Para informações adicionais sobre espectrômetros de massa, ver, por exemplo, Principles of Instrumental Analysis, 3rd edition, Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985; e Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed. Vol. 15 (John Wiley & Sons, New York, 1995), pp. 1071-1094.
[000177] A detecção do nível de proteína ROBO2 dependerá tipicamente da detecção da intensidade de sinal.
Este, por sua vez, pode refletir a quantidade e caráter de um polipeptídeo ligado ao substrato. Por exemplo, em certas modalidades, a intensidade do sinal dos valores de pico de espectros de uma primeira amostra e uma segunda amostra pode ser comparada (por exemplo, visualmente, pelas análises de computador, etc.), para determinar as quantidades relativas de biomoléculas específicas. Os programas de software, tais como o programa Biomarker Wizard (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Califórnia) podem ser usados para auxiliar na análise de espectro de massa. Os espectrômetros de massa e as suas técnicas são bem conhecidos por aqueles técnicos especialistas no assunto.
[000178] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos usando técnicas de eletroforese em gel, em particular, SDS-PAGE (Eletroforese em Gel de Poliacrilamida de Dodecilsulfato de Sódio), especialmente dois PAGE dimensionais (2D-PAGE), de preferência, dois SDS-PAGE dimensionais (2D-SDS-PAGE). De acordo com um exemplo particular, o teste baseia-se em 2D-PAGE, em particular, utilizando os gradientes de pH imobilizados (IPGs), com um intervalo de pH, de preferência, ao longo de pH de 4 a 9.
[000179] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos usando técnicas de eletroforese em gel, em particular, as técnicas acima mencionadas combinadas com outros métodos de separação de proteína, em particular, os métodos conhecidos pelos técnicos especialistas no assunto, em particular, cromatografia e/ou por exclusão de tamanho.
[000180] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos usando as técnicas de ressonância, em particular, por ressonância de superfície de plasma.
[000181] Em algumas modalidades dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos, os níveis de proteína ROBO2 são medidos usando um biochip de proteína. Um biochip compreende geralmente um substrato sólido, tendo uma superfície substancialmente plana, para que um reagente de captura (por exemplo, um adsorvente ou reagente de afinidade) seja anexado. Frequentemente, a superfície de um biochip compreende uma pluralidade de localizações endereçáveis com reagente de captura ligado. O biochip pode também incluir o reagente de captura ligado que serve como um controle. Biochips de proteína são biochips adaptados para a captura de polipeptídeos. Muitos biochips de proteína estão descritos na técnica. Estes incluem, por exemplo, biochips de proteína produzidos por Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, CA), Zyomyx (Hayward, CA), Invitrogen (Carlsbad, CA), Biacore (Uppsala, Suécia) e Procognia (Berkshire, Reino Unido). Exemplos de tais biochips de proteína estão descritos nas seguintes patentes ou pedidos de patentes publicados: Patente U.S. No.
6.225.047 (Hutchens & Yip); Patente U.S. No. 6.537.749 (Kuimelis e Wagner); Patente U.S. No. 6.329.209 (Wagner et al.); Publicação Internacional PCT No. WO 00156934 (Englert et al.); Publicação Internacional PCT No. WO 031048768 (Boutell et al.) e Patente U.S. No. 5.242.828 (Bergstrom et al.).
[000182] Os níveis limites de referência ou valores de níveis de proteína ROBO2 usados para comparação com o nível de proteína ROBO2 de um indivíduo podem variar, dependendo do aspecto ou modalidade aqui descrita a ser praticado, como será entendido ao longo deste relatório descritivo, e abaixo. Um valor limite de referência pode ser baseado em um valor de amostra individual, tal como por exemplo, um valor obtido a partir de uma amostra biológica a partir do indivíduo a ser testado, mas em um ponto mais cedo no tempo (por exemplo, em um primeiro momento (t1), por exemplo, um primeiro nível biomarcador medido, ou em um segundo momento (t2), por exemplo). Um valor limite de referência também pode ser baseado em um conjunto de amostras, por exemplo, os valores obtidos a partir de amostras provenientes de um conjunto de indivíduos em teste. Por exemplo, em algumas modalidades, os valores limites de referência para a proteína ROBO2 são baseados como o valor medido de 50% (por exemplo, média) de proteína
ROBO2 medida em indivíduos conhecidos tendo a doença renal crônica ou proteinúria. Por exemplo, os indivíduos superiores a 50% (por exemplo, igual ou superior ao nível média) para a proteína ROBO2 podem ser selecionados para ter o risco de ter doença renal crônica ou proteinúria.
Valores de referência também podem ser baseados em um conjunto de amostras, incluindo ou excluindo as amostras a serem testadas. O valor de referência pode ser baseado em um grande número de amostras, tal como a partir da população de indivíduos saudáveis do grupo da mesma idade cronológico, ou a partir de indivíduos que não têm ou não têm um risco de doença renal crônica ou proteinúria. Em algumas modalidades, o valor de referência pode ser, pelo menos, um, mais tipicamente, pelo menos, dois, desvios padrão acima da média ou mediana de qualquer um destes ensaios ou uma média ou mediana predeterminada.
[000183] Para avaliar o risco de um indivíduo suscetível de experimentar ou sofrer de doença renal crônica ou proteinúria pelos ensaios, métodos, e sistemas, tal como aqui descritos, um "valor limite de referência" é tipicamente um nível limite de referência predeterminado, tal como a urina mediana, soro ou proteína ROBO2de sangue obtida a partir de uma população de indivíduos saudáveis que se encontram no mesmo grupo com a mesma idade cronológico combinado com a idade cronológica do indivíduo testado. Como indicado anteriormente, em algumas situações, as amostras de referência também podem ser do mesmo gênero e/ou da mesma idade com base na raça. Em algumas modalidades, o valor limite de referência para a proteína ROBO2 é o nível mediana para que o biomarcador em um tipo de amostra biológica, por exemplo, urina, sangue, soro, em um painel de indivíduos da mesma raça, por exemplo, Caucásios,Negros, Hispânicos, Asiáticos, e Asiáticos- Indianos, Paquistaneses, do Oriente Médio e/ou Ilhas do Pacífico.
[000184] Para avaliar o risco de um indivíduo suscetível de experimentar ou sofrer de doença renal crônica ou proteinúria pelos ensaios, métodos, e sistemas, tais como aqui descritos, o nível limite de referência para a proteína ROBO2 pode ser um nível predeterminado, tal como uma média ou mediana dos níveis obtidos a partir de uma população de indivíduos saudáveis que se encontram no grupo de idade cronológico combinado com a idade cronológica do indivíduo testado. Como alternativa, o nível limite de referência para a proteína ROBO2 pode ser um nível de referência histórico para o determinado indivíduo que foi obtido a partir de uma amostra derivada do mesmo indivíduo, mas em um momento anterior, e/ou quando o indivíduo não tem um risco de doença renal crônica ou proteinúria. Em alguns casos, o nível limite de referência para a proteína ROBO2 pode ser um nível de referência histórico de proteína ROBO2 para um determinado grupo de indivíduos a quem todos tinham doença renal crônica ou proteinúria, devido a, por exemplo, diabetes.
[000185] Em algumas modalidades, indivíduos saudáveis são selecionados como os indivíduos de controle. Em algumas modalidades, os controles são controles da mesma idade.
Indivíduo saudável pode ser utilizado para obter uma proteína ROBO2 de nível limite de referência em, por exemplo, uma amostra de urina ou soro. Um indivíduo "saudável" ou a amostra a partir de uma de indivíduo "saudável" ou individual, como é aqui usado é o mesmo que os vulgarmente entendidos para um versado na técnica. Por exemplo, podem-se utilizar métodos vulgarmente conhecidos para avaliar a função renal, tal como aqui descrito, para selecionar os indivíduos de controle como indivíduos saudáveis para os métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos. Em algumas modalidades, os indivíduos saudáveis, sem sinais ou sintomas que sugerem a doença renal crônica podem ser recrutados como indivíduos de controle saudáveis. Os indivíduos são avaliados com base em avaliações abrangentes consistidas em histórico médico, histórico familiar, exames físicos e renais por clínicos, exames laboratoriais. Exemplos de análises de doença renal crônica e/ou proteinúria incluem, mas não são limitados a detectar o nível de proteínas ou moléculas específicas em uma amostra de urina, sangue, ou amostra de soro, tal como, por exemplo, albumina, cálcio, colesterol, contagem de sangue completo (CBC), eletrólitos, magnésio, fósforo, potássio, sódio, ou qualquer combinação dos mesmos; ensaios para detectar, por exemplo, depuração da creatinina; níveis de creatinina; BUN (nitrogênio de uréia de sangue); através do uso de técnicas ou procedimentos específicos, tais como uma tomografia computadorizada abdominal, ressonância magnética abdominal, ultra-som abdominal, biópsia renal, varredura renal, ultra-som renal; através da detecção de alterações nos resultados de ensaios ou testes para eritropoietina, PTH; teste de densidade óssea, ou vitamina D; ou qualquer combinação de tais métodos de detecção e ensaios.
[000186] As populações pareadas por idade (a partir dais quais os valores de referência podem ser obtidos) são idealmente da mesma idade cronológica do indivíduo ou indivíduo que está sendo testado, mas as populações aproximadamente da mesma idade também são aceitáveis.
Aproximadamente, as populações pareadas por idade podem estar dentro de 1, 2, 3, 4 ou 5 anos da idade cronológica do indivíduo testado, ou podem ser grupos de idades cronológicas diferentes que abrangem a idade cronológica do indivíduo que está sendo testado.
[000187] Um indivíduo que é comparado com o seu
"grupo pareado de idade cronológica" é geralmente referido para a comparação do indivíduo de idade pareada cronológica dentro de um intervalo de 5 a 20 anos.
Aproximadamente, as populações pareadas por idade podem estar em incrementos de
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 15, ou 20 anos (por exemplo,
um grupo de "incremento de 5 anos" pode servir como fonte para valores de referência para um indivíduo de 62 anos pode incluir indivíduos de 58 a 62 anos de idade,
indivíduos de 59 a 63 anos de idade, indivíduos de 60 a 64 anos de idade, indivíduos de 61 a 65 anos de idade, ou indivíduos de 62 a 66 anos de idade).Em uma definição mais ampla, onde há lacunas maiores entre as diferentes faixas etárias cronológicas, por exemplo, quando há poucas faixas etárias cronológicas diferentes disponíveis para valores de referência, e as lacunas entre as faixas etárias cronológicas diferentes excedemos incrementos de 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 15, ou 20 anos aqui descritos, então o
"grupo pareado de idade cronológica" pode se referir a faixa etária que está mais compatível à idade cronológica do indivíduo (por exemplo, quando os valores de referências disponíveis para uma faixa etária mais idosa(por exemplo,
80 a 90 anos) e uma faixa etária mais jovem (por exemplo,
20 a 30 anos), um grupo pareado de idade cronológica para
51 anos de idade pode usar a faixa etária mais jovem (20 a
30 anos), que está mais próxima da idade cronológica do indivíduo teste, tal como o nível de referência.
[000188] Outros fatores a serem considerados ao selecionar indivíduos de controle incluem, mas não estão limitando a, espécie, gênero, etnia, e assim por diante.
Assim, em algumas modalidades, um nível de referência pode ser um nível de referência predeterminado, como uma média ou mediana dos níveis obtidos a partir de uma população de indivíduos de controle saudáveis, que estão pareados por gênero com o gênero do indivíduo testado. Em algumas modalidades, um nível de referência pode ser um nível de referência predeterminado, como uma média ou mediana dos níveis obtidos a partir de uma população de indivíduos de controle saudáveis que são pareados por etnia com a etnia do indivíduo testado (por exemplo, caucasianos, negros, hispânicos, asiáticos e asiático-indianos, paquistaneses, do Oriente Médio e das Ilhas do Oceano Pacífico). Em outras modalidades, tanto a idade cronológica e o gênero da população de indivíduos saudáveis são pareados com a idade cronológica e gênero do indivíduo testado, respectivamente.
Em outras modalidades, a idade cronológica, gênero, e etnia da população de indivíduos de controle saudáveis são todos pareados com a idade cronológica e etnia do indivíduo testado, respectivamente. Em outras modalidades, a idade cronológica, gênero e etnia da população de indivíduos de controle saudáveis são todas pareadas com a idade cronológica, sexo e etnia do indivíduo testado, respectivamente.
[000189] O processo de comparação de um nível de proteína ROBO2em uma amostra biológica de um indivíduo e de um nível de limiar de referência para proteína ROBO2 pode ser realizado de qualquer modo conveniente e adequado,e conhecido por um técnico especialista no assunto.
Geralmente, os valores de níveis de proteína ROBO2 determinados utilizando os ensaios, métodos e sistemas aqui descritos podem ser valores quantitativos (por exemplo, os valores quantitativos de concentração, tal como miligramas de proteína ROBO2 por litro (por exemplo, mg/L) da amostra, ou um valor absoluto). Em alternativa, os valores de níveis de proteína ROBO2 podem ser qualitativos, dependendo das técnicas de medição e, portanto, o modo de comparar um valor de um indivíduo e um valor de referência pode variar dependendo da tecnologia de medição empregada. Por exemplo, a comparação pode ser feita através do controle dos dados numéricos, através da verificação das representações dos dados (por exemplo, verificar representações gráficas tais como barras ou gráficos de linha), e utilizar os desvios- padrão de, por exemplo, pelo menos um ou pelo menos dois desvios-padrão. Em um exemplo, quando um ensaio qualitativo é utilizado para medir os níveis de proteína ROBO2, os níveis podem ser comparados pela comparação visual da intensidade do produto reacional colorido, ou através da comparação de dados a partir de medições densitométricas ou espectrométricas do produto reacional colorido (por exemplo, comparar dados numéricos ou dados gráficos, tais como gráficos de barras derivados do dispositivo de medição).
[000190] Conforme aqui descrito, os níveis da proteína ROBO2 podem ser medidos quantitativamente (valores absolutos) ou qualitativamente (valores relativos). Em algumas modalidades, os valores quantitativos dos níveis da proteínaROBO2 em amostras biológicas podem indicar um determinado nível (ou grau) do risco de doença renal crônica ou proteinúria.
[000191] Em algumas modalidades, a comparação é realizada para determinar a magnitude da diferença entre os valores a partir de um indivíduo e valores de referência (por exemplo, comparando a "dobra" ou a diferença percentual entre os níveis de proteína de ROBO2 medidos, obtidas a partir de um indivíduo, e o valor do limiar de referência de proteína ROBO2). Uma diferença de dobra pode ser determinada através da medição da concentração absoluta dos níveis de proteína ROBO2, e comparação com o valor absoluto do nível limite de referência da proteína ROBO2, ou uma diferença de dobra pode ser medida através da diferença relativa entre um valor de referência e um valor de amostra, em que nem o valor é uma medida da concentração absoluta, e/ou onde ambos os valores são medidos simultaneamente. Por exemplo, um ELISA mede o teor absoluto ou concentração de uma proteína a partir dos quais uma mudança de dobra é determinada em comparação com a concentração absoluta da mesma proteína na referência. Como outro exemplo, uma matriz de anticorpo mede a concentração relativa a partir da qual uma mudança de dobra é determinada. Portanto, a magnitude da diferença entre o valor medido e o valor de referência que sugere ou indica um diagnóstico específico, irá depender do método sendo praticado.
[000192] Como será evidente para os técnicos especialistas no assunto, quando as medições em replicata são tomadas para a medição dos níveis de proteína ROBO2, os valores medidos a partir de indivíduos podem ser comparado com os níveis limite de referência da proteína ROBO2, e levar em consideração as medições em replicata. As medições em replicata podem ser levadas em consideração através da utilização ou da média ou mediana dos valores medidos.
[000193] Em algumas modalidades, o processo de comparação pode ser manual ou pode, preferencialmente, ser automatizado. Por exemplo, um dispositivo de análise (tal como um luminômetro para medir sinais quimioluminescentes)
pode incluir circuitos e softwares possibilitando a comparação de um valor de um indivíduo com um valor de referência para a proteína ROBO2.Alternativamente, um dispositivo separado (por exemplo, um computador digital) pode ser utilizado para comparar os níveis de proteína ROBO2 medidos de um indivíduo, e os níveis limite de referência para a proteína ROBO2. Os dispositivos automatizados para a comparação podem incluir valores de referência armazenados para a proteína ROBO2, ou podem comparar os níveis de proteína ROBO2 medidos de um indivíduo(s) com os níveis limite de referência para a proteína ROBO2 que são derivados a partir de amostras de referência medidas simultaneamente.
[000194] Em algumas modalidades, um indivíduo testado para os níveis de proteína ROBO2 é atribuído em um dos dois ou mais grupos (estados) com base nos resultados dos ensaios, métodos, e sistemas aqui descritos. Os ensaios de diagnóstico, métodos e sistemas aqui descritos podem ser usados para classificar entre um número de diferentes estados.
[000195] Portanto, em algumas modalidades, determinar se um indivíduo tem um risco elevado de ter a doença renal crônica ou proteinúria (estado: risco baixo. risco elevado) é realizado utilizando os ensaios de diagnóstico, métodos e sistemas aqui descritos. As quantidades de biomarcadores ou padrões de proteína ROBO2determinados como sendo característica de vários estados de risco, por exemplo, elevado, médio ou baixo, são identificados. O risco de desenvolvimento de doença renal crônica ou proteinúria é determinado através da medição da proteínaROBO2isolada ou em combinação com outros biomarcadores conhecidos, e em seguida, ou submetendo-as a um algoritmo de classificação, ou comparando-as com uma quantidade de referência (por exemplo, um valor de referência interrompida conforme aqui divulgado) que está associado com o nível de risco específico.
[000196] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui ensaios de diagnóstico, métodos e sistemas para determinar a severidade ou estágio ou o risco de ter uma doença renal crônica ou proteinúria em um indivíduo. Cada estágio da doença renal crônica, por exemplo, tem um valor característico de proteína ROBO2 ou quantidades relativas de proteína ROBO2. O estágio de uma doença é determinado através da medição da proteína ROBO2, isolada ou em combinação com outros biomarcadores e, depois, submetendo- os a um algoritmo de classificação ou comparando-os com uma quantidade e/ou padrão de biomarcadores, que está associado com o estágio específico, por exemplo, em quanto tempo o indivíduo provavelmente irá desenvolver doença renal crônica ou proteinúria. Por exemplo, pode-se classificar entre propenso a ter doença renal crônica ou proteinúria dentro de um ano (por exemplo, um prognóstico ruim), ou um indivíduo propenso a ter doença renal crônica ou proteinúria nos próximos 5 anos.
[000197] Modalidades adicionais dos testes de diagnóstico, métodos e sistemas se relacionam com a comunicação de resultados ou diagnósticos ou ambos aos técnicos, médicos ou pacientes, por exemplo. Em certas modalidades, os computadores são usados para comunicar os resultados do ensaio ou diagnóstico ou ambas às partes interessadas, por exemplo, médicos e seus pacientes. Em algumas modalidades, os ensaios são realizados ou os resultados do ensaio analisados em um país ou jurisdição que difere do país ou jurisdição em que os resultados ou diagnósticos são comunicados, por exemplo. Em algumas modalidades, o risco de ter a doença renal crônica ou proteinúria com base nos níveis de proteína de ROBO2 em uma amostra biológica do indivíduo é comunicado ao indivíduo depois que os níveis ou prognóstico são obtidos. O prognóstico ou diagnóstico pode ser comunicado ao indivíduo pelo médico responsável pelo tratamento do indivíduo.
Alternativamente, o prognóstico ou diagnóstico pode ser enviado para o indivíduo por e-mail ou comunicado ao indivíduo por telefone. Um computador pode ser usado para comunicar o prognóstico ou diagnóstico por e-mail ou telefone, ou através da internet usando um serviço seguro de login do acesso do paciente. Em certas modalidades, a mensagem contendo os resultados do teste de diagnóstico ou prognóstico pode ser gerada e enviada automaticamente para o indivíduo utilizando uma combinação de hardware e software computacionais, que serão familiares aos técnicos especialistas em telecomunicações. Em certas modalidades,os ensaios, métodos e sistemas aqui descritos, todas ou algumas das etapas do processo, incluindo a análise das amostras, diagnóstico de doenças, e comunicação de resultados de ensaio ou diagnósticos, podem ser realizados em diversas jurisdições (por exemplo, estrangeiras).
[000198] Em algumas modalidades, os ensaios de diagnóstico, métodos e sistemas de qualificação ou avaliação do risco de insuficiência renal crônica ou de proteinúria aqui descritos, os ensaios, métodos ou sistemas compreendem ainda o gerenciamento do tratamento do indivíduo com base na determinação do risco de ter uma doença renal crônica ou proteinúria. Tal gestão inclui as ações do médico ou clínico posterior à determinação do risco do indivíduo de ter a doença renal crônica ou proteinúria. Por exemplo, se um médico faz um diagnóstico do indivíduo em risco de doença renal crônica ou proteinúria, então certo regime de tratamento pode ser seguido. Um regime de tratamento adequado pode incluir, sem limitação, um programa de exercícios supervisionado; controle da pressão arterial, ingestão de açúcar, e/ou os níveis de lípidos; e terapias medicamentosas. Em algumas modalidades, um diagnóstico de um risco de ter a doença renal crônica ou proteinúria pode ser seguido ainda por testes para determinar se um paciente está sofrendo de uma doença renal crônica, ou se o paciente está sofrendo de uma doença relacionada. Além disso, se o teste de diagnóstico der um resultado inconclusivo sobre o risco de um estado dos eventos adversos principais, outros testes podem ser recomendados. Em algumas modalidades dos ensaios de diagnóstico, métodos e sistemas de qualificação ou avaliação do risco de insuficiência renal crônica ou de proteinúria aqui descritos, se o médico faz um diagnóstico do indivíduo não estando em risco de insuficiência renal crônica ou proteinúria, então nenhum tratamento é fornecido.
[000199] Os métodos de ensaio e detecção de ROBO2 aqui descritos podem ser automatizados utilizando sistemas direcionados computacionais e robóticos. Uma amostra biológica, tal como urina, plasma, ou uma amostra de sangue, pode ser injetado em um sistema, tal como um dispositivo de microfluídos inteiramente executado por uma estação robótica de entrada da amostra, para a saída do resultado.
[000200] Portanto, em algumas modalidades também fornecidas aqui,estão sistemas (e meio computacional legível para originar sistemas computacionais) para realizar um método para determinar se uma pessoa tem uma doença renal crônica ou proteinúria, ou uma pré-disposição para a doença renal crônica ou proteinúria com base em perfis de expressão ou informação de sequências.
[000201] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui sistemas para avaliar se um indivíduo tem ou está em risco elevado de doença renal crônica ou proteinúria, os sistemas compreendendo: (a) um módulo de determinação configurado para receber pelo menos uma amostra de teste e realizar pelo menos uma análise sobre a referida amostra biológica para medir um nível de ROBO2 na amostra biológica, ou determinar a razão de expressão de ROBO2 em relação a um nível limite de referência ou predeterminado, a saída do nível medido ou razão e expressão; (b)um dispositivo de armazenamento configurado para armazenar a informação da saída de dados a partir do referido módulo de determinação; (c) um módulo de comparação adaptado para receber a entrada a partir do dispositivo de armazenamento, e comparar os dados armazenados no dispositivo de armazenamento com pelo menos um nível limite de referência de ROBO2, em que o nível de proteína ROBO2 medido é pelo menos igual ou maior do que o nível limite de referência, o modúlo de comparação fornece a informação para um módulo de saída de que a amostra biológica está associada com um indivíduo que desvia do nível do biomarcador limite de referência; e (d) um módulo de saída para exibir a informação ao usuário.
[000202] Em todos os aspectos da invenção, os métodos para determinar os níveis da proteína ROBO2 podem ser realizados utilizando um sistema ou máquina automatizados.
Tais máquinas e sistemas geram um relatório, tal como a exibição de um relatório em uma tela visível ou um relatório impresso que indica os níveis da proteína ROBO2e/ou reportam um aumento ou o mesmo que um nível limite de referência para a proteína ROBO2, e/ou se o indivíduo a partir do qual a amostra foi obtida está em risco de doença renal crônica ou proteinúria.
[000203] Portanto, algumas modalidades aqui descritas também fornecem uma máquina, sistemas computacionais e mídia computacional legível para realizar as etapas de (i) determinar os níveis de proteína ROBO2, e (ii) indicar ou relatar se um indivíduo está em risco de ter doença renal crônica ou proteinúria.
[000204] Modalidades desses aspectos são descritos através de módulos funcionais, que são definidas pelas instruções executáveis computacionais gravadas em mídias computacionais legíveis e que conduzem um computador a realizar as etapas do método quando executado. Os módulos foram segregados por função por motivos de clareza. No entanto, deve ser entendido que os módulos não precisam corresponder a blocos discretos de código e as funções descritas podem ser realizadas através da execução de várias porções de código armazenadas em várias mídias e executadas em várias vezes. Além disso, deve ser notado que os módulos podem executar outras funções, assim os módulos não estão limitadas a ter qualquer função ou conjunto de funções específicos.
[000205] A mídia computacional legível pode ser qualquer mídia tangível disponível que possa ser acessada por um computador. A mídia computacional legível inclui mídias voláteis e não voláteis removíveis e não removíveis implementadas em qualquer método ou tecnologia para o armazenamento de informações, tais como instruções computacionais legíveis, estruturas de dados, módulos de programas ou outros dados. A mídia computacional legível inclui, mas não está limitada a, RAM (memória de acesso aleatória), ROM (memória somente para leitura), EPROM (memória somente para leitura programável apagável eletricamente), EEPROM (memória somente para leitura programável apagável), memória flash ou outra tecnologia de memória, CD-ROM (disco compacto com memória somente para leitura), DVDs (discos versáteis digitais) ou outras mídias de armazenamento ótico, cassetes magnéticas, fita magnética, armazenamento em disco magnético ou outra mídia de armazenamento magnético, outros tipos de memória volátil e não volátil, e qualquer outro meio tangível que possa ser utilizado para armazenar a informação desejada, e que possa ser acessado por um computador incluindo qualquer combinação adequada dos anteriores.
[000206] Os dados computacionais legíveis incorporados em uma ou mais mídias computacionais legíveis ou meio computacional legível, podem definir instruções, por exemplo, como parte de um ou mais programas, que, como resultado de serem executadas por um computador, instruem o computador para executar uma ou mais das funções aqui descritas (por exemplo, em relação a um sistema de computador ou meio de leitura), e/ou várias modalidades, variações e combinações dos mesmos. Tais instruções podem ser escritas em qualquer uma de uma pluralidade de linguagens de programação, por exemplo, Java, J#, Visual Basic, C, C#, C++, Fortran, Pascal, Eiffel, Basic, linguagem de montagem COBOL, e semelhantes, ou qualquer uma de uma variedade de combinações das mesmas. As mídias computacionais legíveis em que tais instruções são incorporadas podem residir em um ou mais dos componentes ou do sistema computacional, ou meio computacional legível aqui descritos, podem ser distribuídas através de um ou mais destes componentes, e podem estar na transição entre eles.
[000207] A mídia computacional legível pode ser transportável de modo a que as suas instruções armazenadas possam ser carregadas em qualquer recurso computacional para implementar os aspectos da presente invenção aqui discutidos. Além disso, deve ser notado que as instruções armazenadas na mídia computacional legível ou o meio computacional legível descritos acima, não estão limitadas às instruções incorporadas como parte de um programa de aplicação executado em um computador hospedeiro. Em vez disso, as instruções podem ser realizadas como qualquer tipo de código de computador (por exemplo, software ou micro código) que pode ser utilizado para programar um computador para implementar os aspectos da presente invenção. As instruções executáveis computacionais podem ser escritas em uma linguagem de computador adequada ou combinação de várias linguagens. Os métodos básicos computacionais biológicos são conhecidos pelos técnicos especialistas no assunto e são descritos em, por exemplo, Setubal e Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi e Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science e Medicine (CRC Press, London, 2000) e Ouelette e
Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene e Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001).
[000208] Os módulos funcionais de certas modalidades dos aspectos aqui descritos incluem um módulo de determinação, um dispositivo de armazenamento, um módulo de comparação e um módulo de exibição. Os módulos funcionais podem ser executados em um, ou vários computadores, ou usando uma ou vários, redes computacionais ou sistemas computacionais.
[000209] Em alguns aspectos, são aqui incorporados sistemas computacionais que podem ser usados para determinar se um indivíduo é suscetível de ter ou estar em risco de insuficiência renal crônica ou proteinúria. Em algumas modalidades, um sistema de computador é conectado a um módulo de determinação e é configurado para obter os dados de saída a partir de um módulo de determinação relacionado a uma amostra biológica, onde o módulo de determinação é configurado para detectar os níveis da proteína ROBO2 em uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo; e onde o sistema de computador compreende (a) um dispositivo de armazenamento configurado para armazenar os dados de saída do módulo de determinação, bem como os dados de referência; em que o dispositivo de armazenamento está conectado a (b) um módulo de comparação, em algumas modalidades, está adaptado para comparar os dados de saída armazenados no dispositivo de armazenamento com os dados de referência armazenados, e em modalidades alternativas, adaptado para comparar os dados de saída com ele mesmo, onde o módulo de comparação produz dados de relatório e está conectado a (c) um módulo de exibição para a exibição de uma página de conteúdo recuperado (ou seja, dados de relatório do módulo de comparação) para o usuário em um computador cliente, em que o conteúdo recuperado pode indicar os níveis de ROBO2, e/ou a probabilidade do indivíduo ter a doença renal crônica ou proteinúria no futuro.
[000210] Em algumas modalidades, o módulo de determinação tem instruções computacionais executáveis para fornecer dados de expressão, informação de sequências, informação relacionada com a sequência de informação em modelo computacional legível. Tal como aqui utilizado, "a informação de sequências" refere-se a quaisquer nucleotídeos e/ou sequência de aminoácidos, incluindo, mas não limitada às sequências de nucleotídeos de comprimento completo e/ou de aminoácidos, sequências de nucleotídeos parciais e/ou de aminoácidos, ou sequências mutantes. Além disso, a informação "relacionada com" a informação de sequências inclui a detecção da presença ou ausência de uma sequência (por exemplo, a detecção de uma mutação ou deleção), a determinação da concentração de uma sequência na amostra (por exemplo, os níveis de expressão de sequências de aminoácidos, ou os níveis de expressão de nucleotídeos (DNA ou RNA)), e semelhantes. O termo "informação de sequências” é destinado a incluir a presença ou ausência de modificações pós-translacionais (por exemplo, fosforilação, glicosilação, sumoilação, farnesilação, e semelhantes).
[000211] Como um exemplo, os módulos de determinação para determinar a sequência de ROBO2 ou informações da expressão de ácido nucleico podem incluir sistemas conhecidos para a análise de sequência automatizada, incluindo, mas não limitados a Hitachi FMBIO® e Hitachi FMBIO®II Fluorescent Scanners (disponível em Hitachi Genetic Systems, Alameda, California); Spectrumedix® SCE 9610 Fully Automated 96-Capillary Electrophoresis Genetic Analysis Systems (disponível em SpectruMedix LLC, State College, Pennsylvania); ABI PRISM® 377 DNA Sequencer, ABI® 373 DNA Sequencer, ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer, ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, e ABI PRISM® 3700 DNA Analyzer (disponível em Applied Biosystems, Foster City, California); Molecular Dynamics FluorImager™ 575, SI Fluorescent Scanners, e Molecular Dynamics FluorImager™ 595 Fluorescent Scanners (disponível em Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, England); GenomyxSC™ DNA Sequencing System (disponível em Genomyx
Corporation (Foster City, California); e Pharmacia ALF™ DNA Sequencer and Pharmacia ALFexpress™ (disponível em Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, England).
[000212] Em algumas modalidades para a determinação da informação de sequência ou proteína, os módulos de determinação incluem sistemas de análise de proteína e DNA.
Por exemplo, os sistemas de espectrometria de massa, incluindo sistemas Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight (MALDI-TOF); sistemas de perfil de ensaio SELDI-TOF-MS ProteinChip, por exemplo, máquinas com CIPHERGEN PROTEIN BIOLOGY SYSTEM II™ software; sistemas para análise dos dados de expressão gênica (ver, por exemplo, U.S. 2003/0194711); sistemas de matriz baseados em análise de expressão, por exemplo, sistemas de matriz HT e sistema de matriz cartucho disponível por Affymetrix (Santa Clara, CA 95051) AutoLoader, COMPLETE GENECHIP® Instrument System, Fluidics Station 450, Hybridization Oven 645, QC Toolbox Software Kit , Scanner 3000 7G, Scanner 3000 7G plus Targeted Genotyping System, Scanner 3000 7G Whole- Genome Association System, GENETITAN™ Instrument, GeneChip® Array Station, HT Array; um sistema de ELISA automatizado (por exemplo, DSX® ou DS2® da Dynax, Chantilly, VA ou o ENEASYSTEM III®, TRITURUS®, THE MAGO® Plus); Densitômetros (por exemplo, X-Rite-508-Spectro Densitometer®, o densitômetro HYRYS™ 2); sistemas automatizados de hibridização in situ com fluorescência (ver, por exemplo, a Patente Norte-Americana 6,136,540); sistemas de imagem 2D em gel acoplados com software de imagem 2-D; leitores de microplacas; classificadores de células ativadas por fluorescência (FACS) (por exemplo, Flow Cytometer FACSVantage SE, Becton Dickinson); analisadores de radioisótopos (por exemplo,contadores de cintilação), ou uma combinação dos mesmos.
[000213] Em algumas modalidades deste aspecto e de todos os outros aspectos da presente invenção, uma variedade de programas de software e formatos pode ser utilizada para armazenar a informação do nível de proteína biomarcadora no dispositivo de armazenamento.Qualquer número de formatos de estruturação do processador de dados (por exemplo, arquivo de texto ou base de dados) pode ser utilizado para se obter ou criar um meio com a informação de sequência ou nível de expressão de informação gravado no mesmo.
[000214] A informação de expressão de ROBO2 ou informação relacionada com a informação da expressão de ROBO2 determinada no módulo de determinação podem ser lidas pelo dispositivo de armazenamento. Como aqui utilizado, o "dispositivo de armazenamento" pretende incluir qualquer aparelho de computação adequado ou de processamento, ou outro dispositivo configurado ou adaptado para armazenar dados ou informações. Exemplos de aparelhos eletrônicos adequados para uso com a presente invenção incluem aparelhos de computação de suporte autônomos, rede de telecomunicações de dados, incluindo redes de área local (LAN), redes de área ampla (WAN), sistemas de armazenamento em nuvem, Internet, Intranet, Extranet, e sistemas local e de processamento computacional distribuído. Os dispositivos de armazenamento também incluem, mas não estão limitados a: mídias de armazenamento magnético, tais como disquetes, mídias de armazenamento do disco rígido, fita magnética, mídia de armazenamento ótico, tais como CD-ROM, DVD, mídia de armazenamento eletrônico, tais como RAM, ROM, EPROM, EEPROM e semelhantes, sistemas de armazenamento em nuvem, discos rígidos gerais e híbridos dessas categorias, tais como mídias de armazenamento magnético/ótico. O dispositivo de armazenamento é adaptado ou configurado por ter gravado nele as informações de sequências ou informações sobre o nível de expressão. Essas informações podem ser fornecidas em formato digital que podem ser transmitidas e lidas eletronicamente, por exemplo, através da Internet, através de um sistema em nuvem, um disquete, via USB (universal serial bus), ou via qualquer outro meio adequado de comunicação.
[000215] Conforme aqui utilizado, "a informação do nível de expressão" refere-se à informação do nível de expressão de qualquer nucleotídeo/ou aminoácido, incluindo,mas não limitado às sequências de nucleotídeos de comprimento completo e/ou de aminoácidos, sequências de nucleotídeos parciais e/ou de aminoácidos, ou seqüências mutadas. Além disso, a informação "relacionada com" a informação do nível de expressão inclui a detecção da presença ou ausência de uma sequência (por exemplo, presença ou ausência de uma sequência de aminoácidos, sequência de nucleotídeos, ou modificação pós- translacional), determinação da concentração de uma sequência na amostra (por exemplo, os níveis de sequência de aminoácidos, ou os níveis de expressão de nucleotídeos (RNA ou DNA), ou o nível de modificação pós-translacional), e semelhantes.
[000216] Conforme aqui utilizado, "armazenado" refere-se a um processo para a codificação de informação no dispositivo de armazenamento.Os técnicos especialistas no assunto podem facilmente adotar qualquer um dos métodos atualmente conhecidos para a gravação de informação em mídias conhecidas, para gerar produtos manufaturados compreendendo a informação da sequência ou informação do nível de expressão.
[000217] Uma variedade de programas de software e formatos pode ser utilizada para armazenar a informação da sequência ou informação do nível de expressão no dispositivo de armazenamento. Qualquer número de formatos de estruturação do processador de dados (por exemplo, arquivo de texto ou base de dados) pode ser utilizado para se obter ou criar um meio com a informação de sequência ou informação do nível de expressão gravados no mesmo.
[000218] Ao fornecer informação de seqüência ou informação do nível de expressão em modelo computacional legível, pode-se usar a informação de seqüência ou informação do nível de expressão no suporte legível no módulo de comparação para comparar uma seqüência ou perfil de expressão específicos, com os dados de referência dentro do dispositivo de armazenamento. Por exemplo, programas de pesquisa podem ser utilizados para identificar fragmentos ou regiões das sequências que correspondem a uma sequência particular (dados de referência, por exemplo, a informação sobre a sequência obtida a partir de uma amostra controle), ou a comparação direta do nível de expressão determinado pode ser comparada com os dados de referência do nível de expressão (por exemplo, informações sobre o nível de expressão obtido a partir de uma amostra de controle). A comparação feita em modelo computacional legível fornece um resultado de comparação computacional legível que pode ser processado por uma variedade de meios. O conteúdo baseado no resultado da comparação pode ser recuperado a partir do módulo de comparação para indicar uma doença ou distúrbio específica, tais como a doença renal crônica ou proteinúria.
[000219] Em algumas modalidades, os dados de referência armazenados no dispositivo de armazenamento para serem lidos pelo módulo de comparação é a sequência de ROBO2 ou dados de informação de expressão obtidos a partir de uma amostra biológica de controle do mesmo tipo que a amostra biológica a ser testada. Alternativamente, os dados de referência são uma base de dados, por exemplo, uma parte da sequência genômica inteira de um organismo, ou uma família de proteínas de sequências, ou um perfil do nível de expressão (RNA, proteína ou peptídeo). Em algumas modalidades, os dados de referência são informação de sequência ou perfil do nível de expressão que são indicativos de uma doença ou distúrbio específica, tais como a doença renal crônica ou proteinúria.
[000220] Em algumas modalidades, os dados de referência são eletronicamente ou digitalmente gravados e anotada a partir de bancos de dados, incluindo mas não limitado ao GenBank (NCBI)bancos de dados de proteínas e DNA, tais como genoma, ESTs, SNPS, Traces, Celara, Ventor Reads, Watson reads, HGTS, e semelhantes; banco de dados do Instituto Suíço de Bioinformática, tais como os banco de dados ENZYME, PROSITE, SWISS-2DPAGE, Swiss-Prot e TrEMBL; o pacote de software Melanie ou o servidor ExPASy WWW, e semelhantes; a SWISS-MODEL, Swiss-Shop e outras ferramentas computacionais baseadas em rede; o banco de dados Comprehensive Microbial Resource (disponível no Instituto de Pesquisa Genômica). A informação resultante pode ser armazenada em uma base de dados relacionada, que pode ser empregada para determinar a homologia entre os dados de referência ou os genes ou proteínas dentro e dentre os genomas.
[000221] O fornecimento dos níveis de ROBO2 no modelo legível no módulo de comparação pode ser utilizado para comparação com os níveis limite de referência de ROBO2 dentro do dispositivo de armazenamento. A comparação feita no modelo computacional legível fornece conteúdo computacional legível que pode ser processado através de uma variedade de meios.
[000222] O "módulo de comparação" pode usar uma variedade de programas de software disponíveis e formatos para a operação de comparação para comparar sequência de ROBO2 ou informação do nível de expressão determinado no módulo de determinação para fazer referência a seqüência de ROBO2,ou dados do nível de expressão. Em algumas modalidades, o módulo de comparação é configurado para usar técnicas padrões de reconhecimento para comparar a sequência de ROBO2 ou de dados do nível de expressão,a partir de uma ou mais entradas para uma ou mais padrões de dados de referência. O módulo de comparação pode ser configurado usando o software disponível comercialmente ou disponível livremente existente para a comparação de padrões, e pode ser otimizado para comparações de dados específicos que são conduzidos. O módulo de comparação fornece informações computacionais legíveis relacionadas com a informação de sequência que pode incluir, por exemplo, a detecção da presença ou ausência de uma sequência (por exemplo, a detecção de uma mutação ou deleção (proteína ou DNA), informação relativa a alelos distintos, detecção de modificações pós-translacionais, omissão ou repetição de sequências); determinação da concentração de uma sequência na amostra (por exemplo, os níveis de expressão de sequência de aminoácidos/proteínas, ou os níveis de expressão de nucleotídeos (RNA ou DNA), ou os ou níveis de modificação pós-translacional), ou a determinação de um perfil de expressão.
[000223] Em algumas modalidades, o módulo de comparação permite a comparação dos níveis de ROBO2 a partir dos dados de saída do módulo de determinação com os dados do nível limite de referência para cada ROBO2.
[000224] Em algumas modalidades, o módulo de comparação realiza comparações com os espectros de espectrometria de massa, por exemplo, comparações da informação da sequência de fragmento do peptídeo podem ser realizadas utilizando espectros processados em MATLB com script chamado "Qcealign" (ver, por exemplo, WO2007/022248, aqui incorporado por referência) e "Qpeaks" (Spectrum Square Associates, Ithaca, NY), ou software Ciphergen Peaks
2.1TM. Os espectros processados podem então ser alinhados utilizando algoritmos de alinhamento que alinham os dados da amostra com os dados de controle utilizando o algoritmo de entropia mínimo, pegando os dados corrigidos da linha de base (ver, por exemplo, Publicação da WIPO WO2007/022248, incorporada aqui por referência). O resultado da comparação pode ser ainda processado pelo cálculo das razões. Os perfis de expressão de proteínas podem ser discernidos.
[000225] Qualquer software de comparação disponível pode ser utilizado, incluindo, mas não limitado ao pacote Ciphergen Express (CE) e Biomarker Patterns Software (BPS), Ciphergen Biosystems, Inc., CA, EUA. A análise comparativa pode ser feita com o software de sistema de chip de proteínas (por exemplo, OProteinChip Suite para Bio-Rad Laboratories).
[000226] O módulo de comparação, ou qualquer outro módulo aqui descrito, podem incluir um sistema operacional (por exemplo, UNIX) onde corre um sistema de gestão de banco de dados relacional, uma aplicação World Wide Web, e um servidor World Wide Web. A aplicação World Wide Web inclui o código executável necessário para a geração de declarações de linguagem de banco de dados (por exemplo, declarações Structured Query Language (SQL)). Geralmente, os executáveis irão incluir declarações SQL incorporadas.
Além disso, a aplicação World Wide Web pode incluir um arquivo de configuração que contém indicadores e endereços para as várias entidades de software que compõem o servidor, bem como as diversas bases de dados externas e internas que devem ser acessados para atender as solicitações do usuário. O arquivo de configuração também direciona as solicitações de recursos do servidor para o apropriado hardware –caso seja necessário, o servidor deve ser distribuído ao longo de dois ou mais computadores separados. Em algumas modalidades, o servidor da World Wide Web suporta um protocolo TCP/IP. Redes locais tais como essa, são muitas vezes referidas como "Intranets". Uma vantagem dessas Intranets é que elas permitem uma fácil comunicação com bancos de dados de domínio público que residem na World Wide Web (por exemplo, o GenBank ou site Swiss Pro World Wide Web). Assim, em algumas modalidades preferidas, os usuários podem acessar diretamente os dados (através de Hypertext links, por exemplo) que residem em bancos de dados da Internet, usando uma interface HTML fornecida pelos navegadores Web e servidores Web.
[000227] Em algumas modalidades, o módulo de comparação compara os perfis de expressão de gene. Por exemplo, a detecção dos perfis de expressão de gene podem ser determinados utilizando o software Affymetrix Microarray Suite versão 5.0 (MAS 5.0) (disponível pela Affymetrix, Santa Clara, Califórnia), para analisar a abundância relativa de um gene ou genes com base na intensidade do sinal a partir de conjuntos de sondas, e os arquivos de dados MAS 5,0 podem ser transferidos para uma base de dados e analisados com o Microsoft Excel e o software GeneSpring 6.0 (disponível pela Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia).O algoritmo de detecção de software MAS 5.0 pode ser utilizado para se obter uma visão global compreensiva de como muitos transcritos são detectados em determinadas amostras, e permite uma análise comparativa de dois ou mais conjuntos de dados de microarranjos.
[000228] Em algumas modalidades, o módulo de comparação compara os perfis de expressão de proteínas.
Qualquer software de comparação disponível pode ser utilizado, incluindo, mas não limitado ao pacote Ciphergen Express (CE) e Biomarker Patterns Software (BPS) (disponível pela Ciphergen Biosystems, Inc., Freemont, Califórnia). A análise comparativa pode ser feita com software de sistema de chip de proteína (por exemplo, O ProteinChip Suite (disponível por Bio-Rad Laboratories,
Hercules, Califórnia). Algoritmos para identificar perfis de expressão podem incluir o uso de algoritmos de otimização, tais como o algoritmo da variância médio (por exemplo, algoritmo JMP Genomics disponível por JMP Software Cary, North Carolina).
[000229] O módulo de comparação fornece um resultado de comparação computacional legível que pode ser processado em modelo computacional legível através de critérios predefinidos, ou critérios definidos por um usuário, para fornecer um conteúdo baseado em parte no resultado da comparação, que pode ser armazenado e liberado tal como solicitado por um usuário usando um módulo de exibição. O módulo de exibição permite a exibição de um conteúdo baseado em parte no resultado de comparação para o usuário, em que o conteúdo é um sinal indicativo de uma doença renal crônica ou proteinúria. Tal sinal pode ser, por exemplo, uma visualização do conteúdo indicativo da presença ou ausência de uma doença renal crônica ou proteinúria em um monitor de computador, uma página impressa do conteúdo indicando a presença ou ausência de uma doença renal crônica ou proteinúria a partir de uma impressora, ou uma luz ou som indicativo da presença ou ausência de uma doença renal crônica ou proteinúria.
[000230] O conteúdo baseado no resultado da comparação pode incluir um perfil de expressão de uma ou mais proteínas, ou um perfil de um ou mais genes de expressão. Em algumas modalidades, o conteúdo baseado no resultado de comparação é meramente um sinal indicativo da presença ou ausência de uma doença renal crônica ou proteinúria baseado nos níveis da níveis de proteína ROBO2.
[000231] Em algumas modalidades, o conteúdo com base no resultado desta comparação é exibido em um monitor de um computador. Em uma modalidade da invenção, o conteúdo baseado no resultado de comparação é exibido através dos meios de impressão. Em uma modalidade da invenção, o conteúdo baseado no resultado de comparação é apresentado como uma luz indicadora ou som. O módulo de exibição pode ser qualquer dispositivo adequado configurado para receber a partir de um computador e visor de computador, informação legível para um usuário. Exemplos não limitativos incluem, por exemplo, computadores de uso geral, tais como aqueles baseados em processador Intel tipo Pentium, dispositivos de computador e tablet da Apple, Motorola PowerPC, Sun UltraSPARC, processadores Hewlett-Packard PA-RISC, qualquer um de uma variedade de processadores disponível a partir da Advanced Micro Devices (AMD) de Sunnyvale, Califórnia, ou qualquer outro tipo de processador, dispositivos de exibição visual, tais como dispositivos tablet, dispositivos móveis smartphones, monitor de tela plana, os tubos de raios catódicos e semelhantes, assim como impressoras de computador de vários tipos.
[000232] Em algumas modalidades, um navegador World Wide Web é usado para fornecer uma interface de usuário para visualização do conteúdo baseado no resultado da comparação. Deve ser entendido que outros módulos da invenção podem ser adaptados para ter uma interface de navegador web. Através do navegador Web, o usuário pode gerar pedidos de recuperação de dados do módulo de comparação.Assim, o usuário irá normalmente apontar e clicar nos elementos da interface do usuário, como botões, menus suspensos, barras de rolagem e semelhantes, convencionalmente utilizados em interfaces gráficas de usuário. Os pedidos assim formulados com o navegador Web do usuário são transmitidos para uma aplicação Web que os formata para produzir uma consulta, que pode ser utilizada para extrair a informação pertinente relacionada com a informação de sequência, por exemplo, a exibição de uma indicação da presença ou ausência de mutação ou deleção (DNA ou proteína); exibição de níveis de expressão de uma sequência de aminoácidos (proteína); exibição dos níveis de expressão de nucleotídeos (DNA ou RNA); exibição da expressão, SNP, ou perfis de mutação, ou haplótipos, ou exibição de informações baseadas nos mesmos.Em uma modalidade, a informação da sequência de dados da amostra de referência é também exibida.
[000233] Em algumas modalidades, o módulo de visualização apresenta o resultado de comparação, e se o resultado de comparação é indicativo de uma doença, por exemplo, se o perfil de expressão de ROBO2 é indicativo de doença renal crônica ou proteinúria.
[000234] Em algumas modalidades, o conteúdo baseado no resultado de comparação que é apresentado, é um sinal (por exemplo, sinal positivo ou negativo) indicativo da presença ou ausência de uma doença renal crônica ou proteinúria, assim apenas uma indicação positiva ou negativa pode ser exibida.
[000235] Portanto, são fornecidos aqui sistemas (e meio computacional legível para gerar sistemas computacionais) para realizar ensaios e métodos para determinar se uma pessoa tem uma doença crônica renal ou proteinúria, ou uma pré-disposição para uma doença renal crônica ou proteinúria, com base em perfis de expressão ou informação de seqüência.
[000236] Os sistemas e os meios computacionais legíveis são meramente modalidades ilustrativas da invenção para a realização de ensaios e métodos de determinação se uma pessoa tem uma doença específica ou distúrbio ou uma pré-disposição, para uma doença ou distúrbio específico, com base em perfis de expressão ou informação de sequência, e não se destinam a limitar o escopo da invenção. As variações de sistemas e meios computacionais legíveis são possíveis, e são destinadas a cair dentro do escopo da invenção.
[000237] Os módulos do sistema ou utilizados no meio computacional legível podem assumir numerosas configurações. Por exemplo, a função pode ser fornecida em uma única máquina, ou distribuída por várias máquinas.
Robo2 é uma proteína dos podócitos localizada na superfície celular basal dos podócitos dos camundongos
[000238] Durante o desenvolvimento do rim, o mRNA de Robo2 é expresso no mesênquima metanéfrico circundando o broto uretérico e depois na extremidade proximal do corpo em forma de S (Piper et al., 2000), à localização de podócitos primordiais. Para investigar se aRobo2 também está envolvida na maturação dos podócitos além do seu papel na indução renal precoce, foi realizada a hibridização in situ, e o mRNA de Robo2 encontrado estava expresso na fase do ciclo capilar de glomérulos em desenvolvimento de embriões de camundongos no dia embrionário 16,5 (E16, 5) (FIGS. 5A e 5B).A proteína Robo2 se tornou detectável através da coloração por imunofluorescência no desenvolvimento de glomérulos em torno de E14,5 e atingiu pico de expressão em E16,5 (FIGS.5C-5E). Embora a expressão diminua após E17,5 durante o desenvolvimento (FIG.5F), a expressão deRobo2 específica foi mantida nos glomérulos após o nascimento, e foi detectável em camundongos adultos com 5 semanas de idade (FIG. 5G, 5H, 5L-5M).
[000239] Para determinar a localização celular da Robo2 nos glomérulos em desenvolvimento, foi realizada a imuno-histoquímica de dupla marcação com marcadores específicos do tipo de célula glomerular. Foi verificado que a proteína Robo2 estava também co-localizada com nefrina (FIGS. 1A-1C) e podocina (FIGS.1D-1F), duas proteínas associadas com o diafragma slit dos podócitos.
Robo2 foi também co-expressa nos glomérulos com a proteína adaptadora de interação com a nefrina Nck (FIGS.1G,1I) e com WT1, um componente do núcleo dos podócitos (FIGS. 5H- 5K). A dupla marcação com anticorpos contra o nidogênio, um marcador da membrana basal (FIGS. 1J-1L e 1P) e Pecaml um marcador celular endotelial (FIGS.1M-lO,5M), mostrou que o Robo2 estava localizado adjacente à superfície externa da membrana basal glomerular, e ausente das células endoteliais. A microscopia confocal de alta resolução demonstrou ainda que a Robo2 subcelular era mais abundante na superfície basal dos podócitos (FIG. 1Q). A microscopia eletrônica immunogold dos rins de camundongos pós- nascimento com um anticorpo contra o domínio citoplasmático, estabeleceu que a Robo2 estava localizada para processos podálicos perto da face citoplasmática dos diafragmas slit (FIG.1R). Estes resultados demonstram que a
Robo2 é uma proteína dos podócitos, e a sua localização sub-celular basal nos processos podálicos indica que ela desempenha um papel na regulação da estrutura dos processos podálicos.
Domínio Intracelular da Robo2 Interage Diretamente com Domínios da Proteína Adaptadora Nck
[000240] O acoplamento do domínio extracelular da nefrina leva à fosforilação da tirosina do seu domínio intracelular por quinases Src, e o recrutamento do domínio SH2 da proteína adaptadora Nck, que por sua vez, induz a polimerização da actina (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006 ). Nck tem um domínio SH2 em C-terminal e três domínios SH3 próximos ao N-terminal. A polimerização da actina é mediada através dos domínios SH3 da Nck (Rivera et al., 2004), que podem recrutar vários reguladores do citoesqueleto, incluindo N-WASP e Pak (Jones et al., 2006).
Estudos anteriores demonstraram que os domínios SH3 da Dreadlock (Dock) homóloga da Nck da Drosophilla também interagem diretamente com o domínio intracelular de Robo para inibir a polimerização da actina (Fan et al., 2003;.
Yang e Bashaw, 2006).
[000241] Foi testado se os mamíferos Nck também podem interagir diretamente com Robo2 no podócito, para regular o citoesqueleto de actina-F. Para responder a esta questão, foi utilizado um ensaio de dois híbridos de levedura para examinar se a Robo2 interagiu com a Nck. Já que as duas Ncks dos mamíferos {isto é, Nck1, Nck2) compartilham estrutura e função semelhantes no desenvolvimento do rim (Jones et al., 2006), foi utilizado neste estudo a Nck1, e foi observado que o domínio intracelular de Robo2 interagiu diretamente com a Nck1 (FIGS.2A a 2C). O mapeamento do sítio de ligação na Robo2 para Nck1 mostrou que a sequência de aminoácidos de 1085 a 1301, que contém 4 motivos ricos em prolina, foi fundamental para a interação (FIGS.2A a 2C). A ausência desta região rica em prolina evitou sua interação com Nck1 (FIG.2A). O mapeamento do sítio de ligação naNck1 para Robo2 mostrou que os dois primeiros domínios SH3 foram necessários para a sua interação com Robo2, porque a exclusão de um ou ambos anula sua interação (FIG.2B). Logo, a interação de Robo2 com Nck1 foi mediada por dois domínios de proteínas bem caracterizados, os domínios SH3 e motivos ricos em prolina (FIG.2C). CD2AP, outra proteína adaptadora dos podócitos, também tem três domínios SH3 em seu N-terminal (Shih et al., 2001), mas não foram detectados qualquer interação entre CD2AP e Robo2 tanto na levedura de dois híbridos ou ensaios de co- precitação. Estas observações indicam que a ligação entre Robo2 e Nck1nos podócitos é uma interação específica.
A Robo2 de Comprimento Total Forma um Complexo com Nefrina através da Nck
[000242] Foi confirmada a interação entre Robo2 e Nck por pull down e ensaios de co-precipitação.
Robo2 humana de comprimento total his-e myc- marcados ou Robo2 humana his-
e myc- marcados com uma deleção do domínio de ligação
Nck1(His-myc-Robo2-∆NBD) foram expressas em células HEK.
As células HEK transfectadas foram estimuladas com o meio condicionado Slit2 (preparado a partir de células transfectadas estáveis Slit2) para ativar a Robo2 e aumentar a ligação à Nck (Fan et al., 2003). Nck foi puxado para baixo com His-mycRobo2 a partir dos lisados de células
HEK usando esferas de Ni-NTA, mas não com His-myc-Robo2-
∆NBD (FIG. 2D). Uma vez que o domínio SH2 da Nck interage com fosfotirosinas no domínio citoplasmático de nefrina
(NCD) (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006), foi examinado se o Robo2 formou um complexo com a nefrina através da Nck, usando um ensaio de co-precipitação.
Para estabelecer a prova de princípio, Robo2 e nefrina foram co-
expressos em células HEK com quinase Fyn para aumentar a fosforilação da nefrina (Verma et al., 2006). O pull-down da His-myc-Robo2 dos lisados das células HEK com esferas de
Ni-NTA co-precipitou Nck e nefrina quando a quinase Fyn foi expressa (FIG. 2E). Na ordem inversa, o pull down da His-
myc-nefrina co-precipitou Nck e Robo2 quando a quinase Fyn foi expressa (FIG.2F). Além disso, os precipitados preparados com o anticorpo anti-Nck continha tanto Robo2 e nefrina quando Fyn foi super-expressa (FIG. 6A). Estes dados indicam que nefrina, Nek, e Robo2 formam um complexo in vitro. Para validar estes resultados in vivo, foi imunoprecipitado a Robo2 dos lisados dos rins recém- nascidos, e foi verificado que Nck e nefrina foram co- precipitadas (FIG.2G).Por outro lado, os precipitados preparados com o anticorpo anti-nefrina também continham Nck e Robo2 (FIG. 2H). Uma vez que a nefrina é expressa exclusivamente em podócitos, e Nck e Robo2 também estão localizadas nessas células no rim, estes resultados indicam que nefrina, Nck, e Robo2 são capazes de formar um complexo nos podócitos.
[000243] Para determinar o papel de Slit2 na formação do complexo de proteína Robo2-Nck-nefrina, His-myc-Robo2, nefrina, e Fyn foram co-expressos em células HEK que foram estimuladas com o meio condicionado Slit2 ou meio condicionado de controle sem Slit2 antes da co-precipitação (FIG.21). Foi observado que a estimulação de Slit2 aumentou a ligação da Robo2 à Nck, e a formação do complexo com nefrina. Ambos as razões de Nck1 versus Robo2, e nefrina versusRobo2 aumentaram após estimulação de Slit2 (FIG.2J).
Em consistência com esta verificação, foi observado que Slit2 foi fortemente expresso nos glomérulos dos camundongos recém-nascido (FIG. 6B, 6C).
Sinalização de Slit2-Robo2 Inibe a Polimerização da
Actina Induzida pela Nefrina
[000244] Uma vez que a Slit se liga a Robo para recrutar Dock e srGAPs para inibir a polimerização de actina (Fan et al., 2003), foi desejado testar se Robo2 também recruta a Nck para inibir a polimerização de actina em células de mamíferos, um papel oposto à nefrina, que promove a polimerização de actina. Para endereçar esta questão, foi estudada a polimerização da actina, analisando as caudas de actina-F em células expressando a proteína quimérica CD16/7-NCD como previamente descrito (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Este modelo utiliza os domínios extracelulares e transmembranares dos receptores CD16 e CD7 de da imunoglobulina humana Fc fundidos com o domínio citoplasmático da nefrina (NCD). CD16/7-HA, em que a NCD foi substituída por um marcador de HA, foi usada como um controle negativo. Estas proteínas quiméricas foram co- expressas com Robo2 em células HEK, e agrupadas através do tratamento com anticorpo anti-CD16 e um anticorpo secundário conjugado com rodamina. Foi examinado primeiro se o agrupamento do domínio citoplasmático de nefrina poderia recrutar Robo2. Observou-se que o envolvimento de CD16/7-NCD trouxe a Robo2 em agrupamentos, já que a maioria da Robo2 co-localizou com os agrupamentos CD16/7-NCD (FIGS.6D-6F). No entanto, nenhuma co-localização da Robo2 foi observada ou com o controle CD16/7-HA (FIG. 6D’) ou com o constructo de Robo2-a-∆NBD (FIG.6E’), em que o domínio de ligação Robo2 Nck (NBD) foi excluído. Curiosamente, na ausência de Slit2, uma co-localização de CD16/7-NCD e Robo2 foi reduzida significativamente (FIG. 6F'). Estes dados fornecem provas adicionais de que o domínio citoplasmático da nefrina é capaz de complexar com o domínio intracelular de Robo2 na presença de Slit2, e validam o modelo para determinar se a formação de um complexo Robo2-Nck-nefrina afeta a polimerização de actina.
[000245] As células HEK expressando CD16/7-NCD e Robo2 foram estimuladas com Slit2 ou meio condicionado de controle sem Slit2, enquanto agrupadas pelo anticorpo anti- CD16. A polimerização da actina foi avaliada através da quantificação do número de células HEK com caudas visíveis de actina-F (Rivera et al., 2004). Foi observado que ~80% das células CD16/7-NCD agrupadas formaram caudas de actina- F, que poderiam ser revelada por coloração com faloidina como relatado previamente (Jones et al., 2006; Verma et al, 2006).Após a estimulação de Slit2, no entanto, o número de células com caudas de actina-F foi significativamente reduzido para cerca de 40% (FIGS. 3A e 3C). Apenas algumas células foram observadas contendo caudas de actina-F mais curtas, quando as proteínas CD16/7-HA de controle foram agrupadas (FIGS. 3B e 3C). Para investigar ainda se esta inibição da polimerização da actina requisitou Nck, este foi repetido ensaio utilizando Robo2 sem domínio de ligação para Nck (Robo2-∆NBD) para determinar se o bloqueio da ligação da Nck para Robo2 impediria a inibição de Slit2- Robo2 sobre a polimerização da actina induzida por nefrina.
CD16/7-NCD foi co-expressa ou com Robo2 de comprimento completo (FIG.7A) ou Robo2-∆NBD (FIG.7B) em células HEK.
Foi observado que a exclusão do domínio de ligação da Nck na Robo2 comprometia significativamente a inibição da Slit2-Robo2 na polimerização da actina induzida por nefrina (FIG.7C).
[000246] O estudo anterior demonstrou que a nefrina está ligada ao citoesqueleto de actina-F (Yuan et al., 2002). Para determinar se a sinalização da Slit2-Robo2 poderia inibir a actina-F associada à nefrina, foram imunoprecipitadas CD16/7-NCD e CD16/7-HA com anticorpo anti-CD 16, e examinada a quantidade de actina-F nos precipitados por Western Blot. Foi observado que a abundância de actina-F associada com nefrina foi significativamente reduzida após a estimulação da Slit2 (FIGS. 3D e 3E). Por outro lado, o ensaio de imunoprecipitação in vivo demonstrou que a actina-F associada com nefrina imunoprecipitada por um anticorpo anti-nefrina do Robo2 dos rins de camundongos nulos recém- nascidos, foi significativamente aumentada em comparação com a de tipo selvagem ou Robo2 de rins de camundongo heterozigóticos (FIG.3F e 3G). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a sinalização Slit2-robo2 inibe a polimerização de actina induzida pela nefrina.
Perda de Robo2 em Podócitos Causa Estrutura do Processo Podálico Alterada em Camundongos
[000247] Os inventores e outros mostraram previamente que quase todas as Robo2 de camundongos homozigotos nulos com antecedente genético misturado morrem logo após o nascimento, devido a um fenótipo grave CAKUT (Grieshammer et al., 2004;. Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). Depois da reprodução de camundongos com um alelo mutante de Robo2del5por cinco gerações com antecedente genético C57BL/6, o acasalamento de pares homozigotos de Robodel5/+ revelou três camundongos homozigotos nulos de Robodel5/del5 que sobreviveram por3 semanas (dentre um total de 160 camundongos analisados no desmame). Para determinar se Robo2 foi necessária para a formação do processo podálico durante o desenvolvimento, foi examinada a ultra-estrutura de glomérulos em Robo2 de camundongos nulos no nascimento e com 3 semanas de idade. Embora corpo podocítico, processos podálicos, e diafragma slit foram formados no nascimento, a microscopia eletrônica de transmissão mostrou a supressão do processo podálico focal em camundongos homozigotos nulos recém-nascidos Robo2del5/del5 (FIGS. 8A a 8F). Através da microscopia eletrônica de varredura, foi observado processos podálicos interdigitantes irregulares em camundongos homozigotos nulos Robo2del5/del5 no nascimento e com 3 semanas de idade (FIGS. 4A a 4H). Estas descobertas indicam que é Robo2 é necessário para a padronização do processo podálico normal durante o desenvolvimento renal.
[000248] Para examinar o papel do Robo2 na manutenção da estrutura do processo podálico nos glomérulos maduros, foram gerados camundongos knockout Robo2 específico parapodócitos cruzando camundongos Robo2flox/flox condicionais com camundongos com Robo2del5/+; camundongos heterozigotos TgNphs2-Cre/+ carregando um transgene de podocina-Cre. Vinte camundongos mutantes Robo2 podócito específico com Robo2del5/+; camundongos heterozigotos TgNphs2-Cre/+ carregando um transgene de podocina-Cre. Vinte camundongos mutantes Robo2 podócito específico com Robo2del5/+; genótipo TgNphs2- Cre/+ e 20 camundongos da ninhada de controle foram analisados até um ano de idade. Os camundongos knockout Robo2 podócito específico eram viáveis e férteis. No entanto, eles exibiram do processo podálicos amplamente incomuns e supressão focal processo podálico segmentar focal em um mês (FIGS. 4I-4M). Com 6 semanas de idade, os camundongos mutantes desenvolveram microalbuminúria significativa, que foi detectada tanto por análise de ELISA e quanto de Western blot (Figs. 4N e 4O). Além disso, a microscopia eletrônica de varredura revelou defeitos na padronização do processo podálico em camundongos knockout podócito específico Robo2. Em vez dos processos podálicos secundários interdigitantes semelhante a zíper ordenados no tipo selvagem, os camundongos knockout podócito específico Robo2 exibiram padronização da interdigitação do processo podálico irregular e desorganizada com um mês (FIG. 8G a 8J). Estes defeitos se tornaram mais evidentes ao longo do tempo. Aos sete meses de idade, os processos podálicos notoriamente abertamente desorganizados, mais curtos, e sinuosos, foram observados nos camundongos knockout de podócitos específicos Robo2 (FIGS.8K-8N), que eram semelhantes ao fenótipo dos camundongos nulos Robo2 com três semanas de idade. Apesar dos camundongos knockout de podócitos específicos Robo2 exibirem número normal de podócitos, a deposição de matriz foi significativamente aumentada nos glomérulos (FIGS 8O-T8, Tabelas 1 e 2). Estas alterações morfológicas indicam que Robo2 desempenha um papel na regulação e manutenção da estrutura dos processos podálicos glomerulares.
A Perda de Robo2 Suaviza os Defeitos Estruturais dos Podócitos Estrutural em Camundongos Nulos com Nefrina
[000249] Os camundongos homozigotos com nefrina desenvolvem um fenótipo característico, com dilatação da cápsula de Bowman, processos podálicos amplamente anormais, ausência do diafragma slit glomerular, e proteinúria significativa (Done et al., 2008; Hamano et al., 2002). Uma vez que o Robo2 formou um complexo com nefrina e a sinalização Slit2-robo2 inibiu a polimerização da actina induzida por nefrina, foi questionado se a perda de Robo2 iria modificar o fenótipo dos podócitos em camundongos nulos com nefrina. Para testar esta hipótese de uma possível interação genética entre Robo2 e nefrina, foram gerado as ambas as linhagens germinativas Robo2-/-; Nphs1-/- e podócitos específicas Robo2flox/flox; TgNphs2-Cre/+; Nphs1-/- camundongos knockout com nefrina-Robo2 duplicados. Como o homozigoto único Nphs1-/-, ambos Robo2-/-; Nphs1-/- (4/4, 100%) e Robo2flox/flox; TgNphs2-Cre/+; Nphs1-/- (3/3, 100%) camundongos knockout duplicados morreram dentro de 10 horas após o nascimento. A análise histológica revelou, contudo, que a morfologia dos glomérulos no Robo2-/-; Nphs1-/- de camundongos homozigotos duplicados apareceu relativamente normal em comparação com o fenótipo deNphs1-/- em um camundongo único homozigoto com nefrina, o qual tinha um cápsula de Bowman dilatada (Figs.8U-8X). O número de glomérulos com cápsula de Bowman dilatada foi significativamente reduzido em camundongos homozigotos duplicados Robo2-/-; Nphs1-/- (2/55, 3,6%), em comparação com camundongos nulos com nefrina única (31/122, 25,4%) (FIGS.
8Y e Tabela 3). Além disso, a análise da ultraestrutura glomerular por microscopia eletrônica de varredura mostrou que a estrutura do processo podálicos interdigitante foi observada em apenas 1 (6,67%) de 15 glomérulos de camundongos homozigotos nulos com única nefrina (FIGS. 4T e 4U) comparado com 100% em homozigotos com única Robo2-/- (FIGS.4T e 4U) e controles do tipo selvagem (FIGS. 4V e 4W). Notavelmente, o padrão interdigitante dos processos podálicos foi restaurado em 12 (75%) dos 16 glomérulos dos rins de camundongos recém-nascidos homozigotos duplos Robo2-/-; Nphs1-/- (FIGS. 4R e 4S, Tabela 4), indicando que uma perda concomitante de Robo2 e nefrina aliviou o fenótipo estrutural dos processos podálicos nestes camundongos. Estes resultados indicam que as interações físicas Robo2-Nck-nefrina descritas acima têm um efeito substancial sobre a morfologia do processo podálico in vivo, quando os níveis de expressão de Robo2 e nefrina são geneticamente alterados.
[000250] Os podócitos apresentam um grau notável de plasticidade. Durante o desenvolvimento, eles se diferenciam a partir de células epiteliais cubóides simples para as células de rolamento do processo elaboradas, que foram reconhecidas como podócitos maduros (Reeves et al., 1978). Esta plasticidade é retida após a maturação. Ela é vista mais graficamente como uma supressão do processo podólico reversível seguindo neutralização de cargas de superfície experimental com sulfato de protamina e restauração com heparina (Seiler et al., 1975), e durante a recaída e remissão da proteinúria em crianças com doença com alterações mínimas (Nachman et al., 2008 ). Mudanças mais sutis nos processos podálicos pé provavelmente ocorrem em condições fisiológicas em resposta a sinais positivos e negativos na forma de estímulos hemodinâmicos, hormonais ou parácrinos. Dada a abundância de actina-F em processos podálicos, é provável que, sem querer estar ligado ou limitado pela teoria, que estes estímulos provocam essas alterações sútis em resposta a sinais positivos e negativos transduzidos ao citoesqueleto de actina-F. Sinais positivos em excesso e desequilibrados podem levar ao fenótipo da doença. De fato, apesar de um ligante fisiológico tem ainda que ser identificado, é claro que o agrupamento e a fosforilação da nefrina induz a polimerização da actina através do recrutamento da Nck, um mecanismo que pode estar envolvido na proteinúria induzida em camundongos, por um anticorpo monoclonal nefritogênico para o domínio extracelular de nefrina (Topham et al., 1999), e em casos de síndrome nefrótica congênita que se desenvolvem anticorpos anti-nefrina após o transplante renal (Patrakka et al., 2002).
[000251] Os estudos aqui descritos revelam outro nível de regulação negativa da polimerização da actina nos podócitos em que Robo2, quando ligado através de Slit,
inibe a polimerização de actina induzida por nefrina. É proposto, sem querer estar ligado ou limitado pela teoria, que a sinalização de Slit-Robo2 pode inibir a polimerização da actina induzida por nefrina para manter a estrutura normal do processo podálico, como se segue: Sob condições fisiológicas (por exemplo, durante o desenvolvimento do processo podálico), acoplamento da nefrina leva à fosforilação do Yl191/1208/1232 intracelular ao qual o domínio SH2 Nck se liga (Jones et al, 2006; Verma et al, 2006). A Nck por sua vez, recruta os reguladores do citoesqueleto, tal como N-WASP, através de seus domínios SH3 para promover a polimerização de actina para extensão de processos podálicos de podócitos ou espalhamento (FIG.
8Z). A secreção local e ligação da Slit aumenta a interação da Robo2 com a Nck através de sua região rica em e os dois primeiros domínios SH3 da Nck. Sequestrar os dois primeiros domínios SH3 da Nck através da Robo2 inibiria a polimerização de actina mediada por nefrina-Nck e diminuiria a actina-F associada com uma nefrina para manter um citoesqueleto de actina-F dinâmico e equilibrado, e a estrutura normal do processo podálico em podócitos(FIG.8Z).
Em adição à inibição direta da polimerização da actina induzida pela nefrina através da Nck, a sinalização de Slit-Robo2 pode inativar a polimerização da actina através de outras vias, tais como o recrutamento de Ena, Abl,
srGAPs para regular negativamente o citoesqueleto de actina-F tal como anteriormente relatado (Bashaw et al., 2000; Wong et al., 2001). Na ausência da sinalização de Slit2-Robo2 (por exemplo, quando Robo2 é eliminado), os efeitos inibidores da Robo2sob a polimerização induzida pela nefrina são perdidos. Os domínios SH3 da Nck são capazes de interagir com os reguladores do citoesqueleto a jusante, para aumentar a polimerização de actina (FIG.8Z), o que pode explicar a estrutura do processo podálico dos podócitos alterada, identificada em camundongos mutantes Robo2. Os resultados aqui descritos apoiam então um mecanismo onde a sinalização Slit-Robo pode regular a plasticidade dos podócitos regulando negativamente o citoesqueleto de actina-F, que é semelhante à função da sinalização Slit-Robo em vias de encontro de cone de crescimento de axônios (Guan e Rao, 2003). A descoberta patológica do aumento da deposição de matriz no glomérulo de camundongo mutante Robo2, provavelmente representa uma resposta secundária.
[000252] Embora seja evidente a partir dos estudos aqui descritos que Robo2 localiza a superfície basal dos podócitos, e forma um complexo com outras proteínas de diafragma slit do processo podálico estabelecidas por meio de seu domínio intracelular, permanece incerto se ela realmente faz parte do diafragma slit. Interessantemente, o domínio extracelular de Robo2 se assemelha ao de nefrina, que tem oito motivos semelhantes à imunoglobulina (Ig) e um domínio de fibronectina, enquanto Robo2 tem cinco motivos semelhantes à Ig e três domínios de fibronectina (FIG.8Z) (Tryggvason et al., 2006 ). Foi testada a interação entre o domínio intracelular da Robo2 e o domínio citoplasmático da nefrina no ensaio de dois híbridos de levedura. Os dados bioquímicos (FIGS. 2E e 2F) também não apoiaram uma interação direta entre estes dois receptores in vitro. No entanto, é possível que o domínio extracelular de Robo2 possa se associa com o domínio extracelular da nefrina in vivo nas membranas celulares dos processos podálicos adjacentes, através de uma interação-trans no diafragma slit.
[000253] Foi verificado que homozigotos nulos Robo2 e camundongos knockout podócitos específicos desenvolveram um padrão interdigitante do processo podálico alterado, um fenótipo que é diferente daquele dos camundongos nulos com nefrina (Hamano et al., 2002; Done, 2008). Isto não é surpreendente, pois nefrina e Robo2 desempenham papéis opostos na regulação citoesqueleto de F-actina dos podócitos. Enquanto a sinalização da nefrina induz a polimerização da actina localizada, a sinalização Slit2- Robo2 atua como um regulador negativo sobre a polimerização da actina para manter a plasticidade do processo podálico dos podócitos e dinâmica. É notável que um defeito semelhante de organização do processo podálico é observado em camundongos em que o fator de despolimerização da actina Cofilina-1, outro regulador negativo do citoesqueleto de actina-F nos podócitos, é inativado (Garg et al.,2010).
Isso indica que a ausência ou de um fator promotor da polimerização de actina tal como a sinalização da nefrina ou um fator inibitório, tal como a como sinalização da Robo2 afetará a estrutura normal dos podócitos. Assim, o equilíbrio entre os reguladores positivos e negativos do citoesqueleto de actina-F nos podócitos é importante para manter a estrutura normal do processo podálico. Recuperar esse equilíbrio através da inativação de ambos os sinais negativo (Robo2) e positivo (nefrina), pode explicar a restauração da interdigitação do processo podálico dos podócitos e fenótipo glomerular mais suave nos camundongos knockout duplos Robo2-nefrina. Os estudos aqui descritos demonstram o duplo papel da nefrina como um componente essencial do diafragma slit para controlar a permeabilidade seletiva glomerular por um lado (Tryggvason et al., 2006), e como um regulador da morfologia do processo podálico, através da sua interação com o citoesqueleto de actina (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006) por outro lado.
Enquanto a sinalização de Robo2 claramente combate os efeitos positivos da sinalização da nefrina sobre os processos podálicos, ainda não foi determinado se ela também influencia a integridade do diafragma slit.
[000254] Deste modo, tal como aqui descrito, foi identificado a Robo2 como um novo componente de junção intercelular dos podócitos no rim. Foram demonstradas interações entre Robo2 e nefrina utilizando técnicas bioquímicas, funcionais e genéticas, e foi demonstrado que a sinalização Slit2-Robo2 inibe a dinâmica da actina induzida pela nefrina. Os resultados indicam que a sinalização Robo2 atua como um regulador negativo na nefrina para modular a arquitetura do processo podálico dos podócitos. Este estudo amplia a compreensão do papel da sinalização Slit-Robo, e identifica um novo mecanismo de crosstalk, pelo qual o receptor Robo de sinal de entrada de orientação pode influenciar a dinâmica do citoesqueleto de actina-F.
[000255] A menos que definidos de outro modo, os termos científicos e técnicos utilizados em conexão com o presente pedido devem ter os significados que são comumente entendidos pelos técnicos especialistas no assunto a qual pertence esta divulgação. Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos e reagentes, etc., aqui descritos e, como tal, pode variar. A terminologia aqui utilizada é para a finalidade de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definido somente pelas reivindicações. As definições de termos comuns em imunologia e biologia molecular podem ser encontradas no The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, publicado por Elsevier, 2006. Definições de termos comuns em biologia molecular são encontrados em Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al.
(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); ou Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning
Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley e Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley e Sons, Inc.) e Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley e Sons, Inc.), que são todos aqui incorporados por referência, em suas totalidades.
[000256] Conforme aqui utilizado, o termo "compreendendo" significa que outros elementos podem também estar presentes, além dos elementos definidos apresentados.
O uso do termo "compreendendo" significa a inclusão em vez de limitação.
[000257] Conforme aqui utilizado, o termo "consistindo essencialmente de" refere-se aos elementos necessários para uma dada modalidade. O termo permite a presença de elementos adicionais que não afetam materialmente a característica (s) básica e nova ou funcional da modalidade da invenção.
[000258] O termo "consistindo de" refere-se a composições, métodos, e respectivos componentes da mesma, como aqui descritos, que são exclusivos de qualquer elemento não recitado na descrição da modalidade.
[000259] Além disso, a menos que indicado de outra maneira pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular.Tal como é usado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um," "uma," e "o" incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, referências a "o método" incluem um ou mais métodos, e/ou as etapas do método aqui descrito e/ou que se tornarão evidentes para os técnicos especialistas no assunto após a leitura desta descrição, e assim por diante.
[000260] Exceto nos exemplos operativos ou onde indicado de outro modo todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação aqui utilizadas, devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". O termo "cerca de", quando utilizados em conexão com porcentagens podem significar ± 1%.
[000261] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos e reagentes, etc., aqui descritos e, como tal, podem variar.
A terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definido somente pelas reivindicações.
[000262] Todas as patentes e outras publicações identificadas estão aqui expressamente incorporadas por referência, com o objetivo de descrever e revelar, por exemplo, os métodos descritos nestas publicações que poderiam ser utilizados em conexão com a presente invenção.
Estas publicações são fornecidas somente para sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada a este respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito a antecipar a divulgação em virtude da invenção anterior, ou por qualquer outro motivo. Todas as declarações quanto à data ou representação quanto ao conteúdo desses documentos é baseado em informações disponíveis para os depositantes, e não constitui qualquer admissão quanto à exatidão das datas ou conteúdo desses documentos.
[000263] As modalidades dos vários aspectos aqui descritos podem ser ilustradas pelos seguintes parágrafos numerados:
2. Método para o tratamento da doença renal crônica em um indivíduo com necessidade do mesmo compreendendo administrar a um indivíduo tendo ou em risco de uma doença renal crônica, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um inibidor de ROBO2.
3. Método para a redução da proteinúria em um indivíduo com necessidade do mesmo, compreendendo administrar a um indivíduo tendo ou em risco de proteinúria, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um inibidor de ROBO2.
4. O método de qualquer um dos parágrafos l ou2 em que o inibidor de ROBO2 é um anticorpo bloqueador ou seu fragmento de ligação ao antígeno específico para ROBO2, uma molécula anti-senso específica para ROBO2, um RNA de interferência curto (siRNA) específico para ROBO2, uma molécula pequena inibidora de ROBO2, um polipeptídeo inibitório de ROBO2, ou um análogo estrutural de ROBO2.
5. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 4 em que o inibidor de ROBO2 bloqueia ou reduz a ligação de ROBO2 à SLIT, à Nck, ou a ambas.
6. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 4 em que o inibidor de ROBO2 é específico para o domínio de ligação Ig1 SLIT, os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT, o domínio de ligação intracelular Nck, ou qualquer combinação dos mesmos.
7. O método do parágrafo 3 em que o polipeptídeo inibitório de ROBO2 é uma proteína de fusão dominante negativa de ROBO2, um polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular de ROBO2 sem o domínio intracelular, ou um polipeptídeo compreendendo um domínio intracelular de ROBO2 sem o domínio extracelular.
8. O método de qualquer um dos parágrafos
1 a 4 em que o indivíduo tendo ou em risco de uma doença renal crônica, tem nefropatia diabética ou pressão arterial elevada.
9. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 4 compreendendo ainda administrar ao indivíduo um agente terapêutico adicional.
10. O método do parágrafo 8, em que o agente terapêutico adicional é um inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA), ou um bloqueador do receptor da angiotensina II (BRA).
11. Método compreendendo: a. analisar uma amostra biológica de teste de um indivíduo para determinar um nível de expressão do polipeptídeo ROBO2, ou um RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2; b. determinar se o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 na amostra biológica de teste está acima de um nível limite de referência;e c. diagnosticar o indivíduo como em necessidade de tratamento ou terapia para doença renal crônica.
12. O método do parágrafo 10, em que o ensaio do nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 é realizado utilizando um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno específico para o polipeptídeo ROBO2.
13. O método do parágrafo 10, em que o ensaio do nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, é realizado utilizando PCR ou um ensaio de hibridização.
14. O método de qualquer um dos parágrafos 10 a 12, em que a amostra biológica de teste é uma biópsia renal, urina, sangue, amostra de soro, ou células peletizadas de uma amostra de urina.
15. O método de qualquer um dos parágrafos 10 a 13 em que o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, é pelo menos 20% acima do nível limite de referência.
16. O método de qualquer um dos parágrafos 10 a 13 em que o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, é pelo menos dois desvios padrão acima do nível limite de referência.
17. Um ensaio compreendendo: a. contatar uma amostra de teste biológica isolada de um indivíduo com um reagente que detecta o polipeptídeo ROBO2, ou um RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2;e b. medir o nível do polipeptídeo ROBO2 ou um RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, c. em que um nível aumentado do referido polipeptídeo ROBO2 ou o referido RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, relativos a uma amostra biológica normal, identifica um indivíduo tendo doença renal crônica, e/ou a progressão da doença renal crônica ou proteinúria.
O ensaio do parágrafo 16, em que a detecção do nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 é realizada utilizando um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno específico para o polipeptídeo ROBO2.
18. O ensaio do parágrafo 16 que a detecção do nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, é realizada utilizando PCR ou um ensaio de hibridização.
19. O ensaio de qualquer um dos parágrafos 16 a 18 em que a amostra biológica de teste é uma biópsia renal, urina, sangue, amostra de soro, ou células peletizadas de uma amostra de urina.
20. O ensaio de qualquer um dos parágrafos 16 a 19 em que o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, é pelo menos 20% acima do nível limite de referência.
21. O ensaio de qualquer um dos parágrafos 16 a 19 em que o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, é pelo menos dois desvios padrão acima do nível limite de referência.
22. O ensaio de qualquer um dos parágrafos 16 a 21 em que o indivíduo foi diagnosticado com diabetes ou pressão arterial elevada.
23. Um sistema para determinar se um indivíduo está em risco de doença renal crônica ou proteinúria, ou tem doença renal crônica compreendendo: a. um módulo de medição configurado para determinar o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo; b. um módulo de comparação configurado para receber o referido nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2 determinado pelo módulo de medição de expressão, e realizar pelo menos uma análise para determinar se o nível de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou o nível de expressão do RNA que codifica um polipeptídeo ROBO2, é maior que um nível de referência pré-determinado ou razão, e para fornecer um conteúdo recuperado;e c. um módulo de exibição para exibir um conteúdo baseado na saída de dados a partir do referido módulo de comparação, em que o conteúdo compreende um sinal indicativo de que o nível ou razão de expressão do polipeptídeo ROBO2 ou RNA é maior do que o nível de referência pré-determinado ou razão, ou um sinal indicativo de que o nível ou razão de expressão de ROBO2 não é maior do que o nível de referência ou razão pré-determinada.
24. O sistema do parágrafo 23 em que o conteúdo exibido no referido módulo de exibição, compreende ainda um sinal indicativo do indivíduo sendo recomendado para receber um regime de tratamento particular.
25. Um sistema para determinar se um indivíduo está em risco de doença renal crônica ou proteinúria, ou possui doença renal crônica compreendendo: a. um módulo de determinação configurado para receber pelo menos uma amostra de teste obtida de um indivíduo e realizar pelo menos uma análise sobre a referida pelo menos uma amostra de teste, para determinar a presença ou a ausência de qualquer uma das seguintes condições: i. uma razão de expressão de ROBO2 maior que uma razão pré-determinada, ou ii. um nível de expressão de ROBO2 maior do que um nível pré-determinado b. um dispositivo de armazenamento configurado para armazenar a saída de dados a partir do referido módulo de determinação;e c. um módulo de exibição para exibir um conteúdo baseado na saída de dados a partir do referido módulo de determinação, em que o conteúdo compreende um sinal indicativo de que a razão de expressão de ROBO2 é maior do que a razão pré-determinada, ou nível de ROBO2 maior que um nível pré-determinado, ou um sinal indicativo de que a razão de expressão do ROBO2 não é maior do que a razão pré-determinada, ou não maior do que um nível pré- determinado.
26. O sistema do parágrafo 25 em que o conteúdo exibido no referido módulo de exibição compreende ainda um sinal indicativo do indivíduo sendo recomendado para receber um regime de tratamento particular.
27. Um método para tratar um indivíduo humano com um risco de doença renal crônica ou proteinúria compreendendo administrar um tratamento ou terapia para prevenir a ocorrência de doença renal crônica ou proteinúria, em um indivíduo humano que está determinado a ter um nível de proteína ROBO2 acima do nível limite de referência.
28. O método do parágrafo 27 em que o nível da proteína ROBO2 é pelo menos 20% acima do nível de referência.
29. O método do parágrafo 27 em que o nível da proteína ROBO2 é pelo menos dois desvios padrão acima do nível de referência.
30. O método de qualquer um dos parágrafos 27 a 29 em que o tratamento ou terapia para evitar a ocorrência da doença renal crônica ou proteinúria, compreende um inibidor de ROBO2.
31. O método do parágrafo 30 em que o inibidor de ROBO2 é um anticorpo bloqueador ou seu fragmento de ligação ao antígeno específico para ROBO2, uma molécula anti-senso específica para ROBO2, um RNA de interferência curto (siRNA) específico para ROBO2, uma molécula pequena inibidora de ROBO2, um polipeptídeo inibitório de ROBO2, ou um análogo estrutural de ROBO2.
32. O método de qualquer um dos parágrafos 30 a 31 em que o inibidor de ROBO2 bloqueia ou reduz a ligação de ROBO2 à SLIT, à Nck, ou a ambas.
33. O método de qualquer um dos parágrafos 30 a 32 em que o inibidor de ROBO2 é específico para o domínio de ligação Igl SLIT, os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT, o domínio de ligação intracelular Nck, ou qualquer combinação dos mesmos.
34. O método do parágrafo 31 que o polipeptídeo inibitório de ROBO2 é uma proteína de fusão dominante negativa de ROBO2, um polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular de ROBO2 sem o domínio intracelular, ou um polipeptídeo compreendendo um domínio intracelular de ROBO2 sem o domínio extracelular.
35. Inibidor de ROBO2para uso no tratamento de uma doença renal crônica.
36. Inibidor de ROBO2 para uso no tratamento de proteinúria.
37. Uso de qualquer um dos parágrafos 35 ou 36 em que o inibidor de ROBO2 é um anticorpo bloqueador ou seu fragmento de ligação ao antígeno específico para ROBO2, uma molécula anti-senso específica para ROBO2, um RNA de interferência curto (siRNA) específico para ROBO2, um molécula pequena inibidora de ROBO2, um polipeptídeo inibitório de ROBO2, ou um análogo estrutural de ROBO2.
38. Uso de qualquer um dos parágrafos 35 a 37 em que o inibidor de ROBO2 bloqueia ou reduz a ligação do ROBO2 à SLIT, à Nck, ou a ambas.
39. Uso de qualquer um dos parágrafos 35 a 38 em que o inibidor de ROBO2 é específico para o domínio de ligação Igl SLIT, os domínios de ligação Ig1 e Ig2 SLIT, o domínio de ligação intracelular Nck, ou qualquer combinação dos mesmos.
40. Uso do parágrafo 37 em que o polipeptídeo é uma proteína de fusão dominante negativa de ROBO2, um polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular de ROBO2 sem o domínio intracelular, ou um polipeptídeo compreendendo um domínio intracelular de ROBO2 sem o domínio extracelular.
41. Uso de qualquer um dos parágrafos 35 a 40 em que a doença renal crônica ou proteinúria é causada por nefropatia diabética ou pressão arterial elevada.
[00264] Essa invenção é ainda ilustrada através dos exemplos seguintes, que não devem ser interpretados como limitativos.
EXEMPLOS Hibridização do tecido in situ, Imunohistoquímica e Microscopia Eletrônica Immunogold
[000265] Uma análise de hibridização in situ foi realizada com ribossondas de Robo2 marcadas com digoxigenina como descrito anteriormente (Grieshammer et al., 2004). A imuno-histoquímica foi realizada em tecidos do rim embrionário de camundongo, fixada em 4% de paraformaldeído, e em tecidos de rim de camundongo adulto fixada em metanol. Para a microscopia de elétron immunogold, rins de camundongo do tipo selvagem foram dissecados e fixados em paraformaldeído-lisina-periodato (PLP). Seções ultrafinas do rim do camundongo foram preparadas e incubadas com o anticorpo de cabra anti-Robo2 (DAKO Corporation), e um anticorpo secundário acoplado a ouro coloidal de 10 nm (Ted Pella).
Dois híbridos de levedura, Co-precipitação, e Ensaios da Polimerização de Actina
[000266] O sistema de dois híbridos de levedura DUPLEX-A™ (OriGene Tech) foi usado para caracterizar a interação de Robo2 e Nck1, de acordo com as instruções do fabricante. A cultura de células, co-precipitação de proteínas marcada com His, e immunoprecipitação foram realizadas como previamente descrito (Fan et al., 2003).
Para a imunoprecipitação endógena, foram utilizados camundongos rins de recém-nascidos. O anticorpo CD16 mediou a ligação cruzada de proteínas de fusão CD16/17, e os ensaios de polimerização da actina foram realizados como previamente descrito (Jones et al., 2006;. Rivera et al., 2004;. Verma et al., 2006.).
Estudo do Camundongo Knockout, Transmissão e Microscopia Eletrônica de Varredura, e Análise Glomerular do Rim
[000267] Os protocolos de camundongo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) no Boston University Medical Center (#14388). A geração e genotipagem do alelo condicional Robo2flox, alelo mutante da linha germinativa Robo2del5(também chamado Robo2indiferentemente no presente documento), e alelo tipo selvagem Robo2+foram descrito anteriormente (Lu et al, 2007; Wang et al.,2011). Para gerar camundongos knockout duplo Robo2-nefrina, camundongos Robo2+foram cruzados com camundongos Nphs1+/-que foram gerados previamente (Hamano et al., 2002). Para a microscopia eletrônica de transmissão, os rins foram fixados, incubado em 2% de glutaraldeído em cacodilato de sódio 0,15M, desidratados em etanol graduado, embebidos em Epon, seccionados e corados com acetato de uranilo e citrato de chumbo. Seções renais ultrafinas foram examinadas utilizando um microscópio de elétrons JEM-1011.
Para a microscopia eletrônica de varredura, os rins foram preparados seguindo o protocolo padrão. Para os estudos patológicos renais, os rins foram fixados em paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina, seccionados e corados usando os métodos padrões ácido periódico de Schiff (PAS) ou hematoxilina eosina (H&E). Para a quantificação do número de podócitos, WT1 foi usado como um marcador nuclear de podócitos, e a coloração com imunoperoxidase foi realizada em seções do rim de acordo com o protocolo padrão. Os núcleos de podócitos positivos WT1 em cada seção transversal glomerular foram contados. Para a análise de proteinúria, amostras de urina "spot" de camundongos a partir de seis semanas de idade foram examinadas usando um kit de quantificação de ELISA albuminúria murino (Exocell), de acordo com as instruções do fabricante e vareta de urina (Multistix, Bayer, IN) como método de triagem.
Hibridização do Tecido In situ e Imunohistoquímica
[000268] A análise de hibridização in situ foi realizada com ribossondas de Robo2 marcadas com digoxigenina como anteriormente descrito (Grieshammer et al., 2004).O cDNA de Robo2 foi linearizado com NotI e sondas foram gerados usando a rotulagem DIG DNA e kit de detecção (Roche Applied Science). A hibridização foi efetuada em 4% de paraformaldeído fixado embebido em OCT de seções congeladas embrionárias de rins dos camundongos. A imunohistoquímica foi realizada em tecidos embrionário de rim de camundongo fixadas em paraformaldeído a 4%, seguido de 30% crioproteção de sacarose (Mugford et al., 2008), e em tecidos de rim de camundongo adulto fixados em metanol.
Os rins de camundongo embebidos em composto OTC foram congelados e seccionados usando Cryostat de 8 a 10 µm. As seções foram coradas com anticorpos primários, e seguidas por anticorpos secundários conjugados com FITC ou Cy3 apropriadas. Os anticorpos primários utilizados neste estudo incluem aqueles contra ROBO2 (R & D System, Abnova, Santa Cruz Biotechnology), nefrina (sintetizado personalizada) (Topham et al., 1999), Nck (Upstate/Millipore), podocina (Sigma), nidogênio (Santa Cruz Biotechnology), Pecaml (BD Biosciences), WT1 (Santa Cruz Biotechnology), SLIT2 (Santa Cruz Biotechnology), PDGFR beta (Cell Signaling), Sinaptopodina (Santa Cruz Biotechnology). As imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal de varredura a laser com disco giratório e multi-ponto Perkin Elmer UltraView LCI, e um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM com um objetivo 60x de imersão em óleo.
Microscopia eletrônica immunogold
[000269] Rins de camundongo de tipo selvagem foram dissecados e fixados em paraformaldeído-lisina-periodato (PLP) a 4°C durante a noite. O tecido foi lavado em lx PBS, e desidratado em etanol graduado, e embebido em resina LR White (Electron Microscopy Sciences). Seções ultrafinas do rim do camundongo foram preparadas, e transferidas para grelhas de ouro revestidas com Formvar, e bloqueadas com 1% de albumina de soro bovino e 5% de soro normal de cabra em PBS lx. As Seções foram então incubadas com anticorpo de cabra anti-Robo2 com uma diluição 1:50 em DAKO (DAKO Corporation), a 4°C durante a noite. Soro não-imune foi usado como controle. Após três lavagens com lx PBS, as Seções foram incubadas com um anticorpo secundário IgG acoplado a ouro coloidal de 10 nm (Ted Pella) durante 2 horas à temperatura ambiente. As Seções foram, finalmente, pós-fixadas com 1% glutaraldeído, e contrastados com acetato de uranila. As seções foram examinados com um microscópio eletrônico de transmissão JEM-1011 (JEOL, Tóquio, Japão) a 80kV, e as imagens foram adquiridas através de um sistema de imagem digital AMT (Técnicas Avançadas de Microscopia, Danvers, MA.) e importadas para o
Adobe Photoshop. A localização subcelular da Robo2 corada com partículas de ouro nos glomérulos foi reconhecida em micrografias eletrônicas digitais em comparação com micrografias de controle coradas com soro não-imune.
Ensaio de Dois Híbridos de Levedura
[000270] Um sistema de dois híbridos de levedura DUPLEX-ATM(OriGene Tech, Rockville, MD) foi usado para caracterizar a interação Robo2 e Nck1. Os cDNA codificando o domínio intracelular de Robo2 humano e suas formas truncadas, foram clonados no vetor pJG4-5 nos sítios EcoRI/XhoI, fundindo-os com o domínio de ativação de transcrição de B42. Os cDNAs de Nck1 humano e suas formas truncadas, foram clonados no vetor pEG202 em EcoRI/XhoI para fundi-los para o domínio de ligação ao DNA de LexA. O gene lacZ no constructo pSH18-34 e o gene LEU2 no genoma da cepa de levedura EGY48, foram usados como genes repórter.
Os constructos de pEG202, pSH18-34, e pJG4-5 foram co- transformados em células de levedura EGY48. A interação foi considerada positiva quando as células de levedura se tornaram azul na presença de X-gal, e cresceram na ausência de leucina.
Cultura de células, Constructos de DNA, Transfecção, Co-precipitação e Análises de Western Blot
[000271] As células HEK (293T) foram transfectadas a 60% de confluência utilizando transfecção com fosfato de cálcio. Para fazer as proteínas de fusão marcadas com C- terminal his e myc, nefrina humana de comprimento total, e Robo2 foram clonados no vetor de pSecTagB (Invitrogen) em sítios de restrição Hind III/EcoR1 e EcoR1/Xho1, respectivamente. Robo2-ΔNBD foi obtida por deleção do domínio de ligação Nck (Figura 2C) usando um kit QUIKCHANGE de mutagênese direcionada para o local (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Robo2 e Nck1 não marcados foram clonados no vetor pCS2 (Addgene) em sítios EcoR1/Xho1, nefrina em sítios HindIII/EcoR1. Constructos Slit2 marcados com Fyn humano e myc foram relatados anteriormente (Li et al, 2008; Wong et al, 2001).
Constructos CD16/7-NCD CD16/7-HA também foram relatados previamente (Verma et al., 2006). Para detectar interação de Robo2 e Nck1, Robo2 humano marcado com C-terminal His e myc e Robo2-ΔNBD foram expressos em células HEK. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lisadas em tampão de lise (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM de Imidazol, 0,5% TX100, 1x inibidor de protease [pH 8.0])).
Os lisados celulares foram centrifugados durante 10 min a 4°C; os sobrenadantes foram incubados com resina Ni-NTA (Qiagen) a 4°C durante 2 horas para precipitar His-Robo2, resina NTA sem Ni foi utilizada como um controle. A resina foi lavada três vezes com tampão de lavagem (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 0,5% TX100 [pH 8,0]), e aquecidas a 95°C durante 10 min. Os precipitados foram resolvidos em géis de SDS-PAGE, e colocados para hibridar com anticorpos anti-myc de coelho, anti-Nck1 monoclonal de coelho (Sinalização celular), a uma diluição 1:1000 de diluição. Para examinar a interação tripla entre Robo2, Nck1 e nefrina, His-myc-Robo2 ou His-myc-Robo2-ΔNBD foram co-expressadas em células HEK com nefrina humana e Fyn humano. His-myc-Robo2 foi precipitada com esferas de Ni- NTA, tal como descrito acima. Para confirmar a interação tripla, His-myc-nefrina foi co-expressa com Robo2, e Fyn em células HEK e His-myc-nefrina foi puxado para baixo por esferas de Ni-NTA. Os precipitados foram apagados com anticorpos policlonal de coelho anti-myc, monoclonal de coelho anti-Nck1, policlonal de coelho anti-nefrina, monoclonal anti-Robo2 (sistemas R&D) e policlonal de coelho anti-Fyn (Santa Cruz Biotechnology) em uma diluição 1:1000.
Para a co-imunoprecipitação de proteínas endógenas, rins de camundongos recém-nascidos foram homogeneizados em tampão RIPA (50 mM Tris [pH 7.4], 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40,
0.5% sódio deoxicolato, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, inibidor de protease de lx) em gelo. As amostras foram centrifugadas durante 10 min a 4°C, e o sobrenadante foi incubado com 1 µg de anticorpo monoclonal de camundongo anti-Robo2 (Sistemas R&D) durante 1 hora a 4°C. A IgG de cabra de controle (Santa Cruz Biotechnology) foi utilizada como um controle. As amostras foram então misturadas com 30 µl de proteína A/G Plus lama de esfera de agarose (Santa Cruz Biotechnology), e depois incubadas durante 12 horas a 4°C.
As pérolas foram então lavadas três vezes em tampão RIPA, e as proteínas foram eluídas em tampão de carga de proteína lx por aquecimento a 95°C durante 10 min. Os precipitados foram resolvidos em géis de SDS-PAGE e colocados para hibridar com anticorpo anti-Robo2, de coelho anti-nefrina, e anticorpos de coelho anti-Nck1 como descritos acima.
Actina foi colocada para hibridizar com o anticorpo anti- mouse-beta actina da Sigma. A intensidade das bandas foi medida utilizando o ImageJ. Para a detecção de proteinúria, urinas de camundongos pontuais foram recolhidas e diluídas com tampão de carga de proteína lx a 1:100 de diluição. As proteínas da urina foram então resolvidas em géis de SDS- PAGE, e a albumina purificada foi utilizada como um controle (MP Biomedicals). Os géis foram colocados para hibridizar com anticorpo policlonal de coelho anti-albumina (MP Biomedicals).
Ligação Cruzada CD16/7-NCD e Ensaio da Polimerização de Actina
[000264] A ligação cruzada mediada por anticorpos CD16 de proteínas de fusão CD16/7foi descrita previamente (Jones et al., 2006; Rivera et al., 2004;. Verma et al.,
2006.) Resumidamente, CD16/7-NCD ou CD16/7-HA foram co-
expressados em células HEK com Robo2. Após 24 horas, as células foram transferidas e semeadas em lamelas de vidro revestidas com polilisina por mais 24 horas. As células foram então incubadas com 1 µg/ml de anticorpo monoclonal anti-CD16 (Beckman Coulter) durante 30 min a 37°C, lavadas uma vez com DMEM, incubadas com anticorpo secundário conjugado com rodamina (Thermo Scientific), diluídas em meio condicionado Slit2 (Wong et al., 2001), ou meio condicionado de controle, durante 30 minutos e fixadas em 4% de paraformaldeído em lx PBS. Actina-F foi corada com faloidina conjugada com FITC (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os grupos de actina-F recém- formados são colocados em nefrina agrupada (CD16/7-NCD) e se parecem com as caudas dos cometas (ou seja, caudas de actina no texto principal), sob microscópio de fluorescência. Neste experimento, foram analisados apenas os grupos de actina-F formadas por agrupamento deCD16/7-NCD e ligado aos agrupamentos. As células com caudas de actina- F foram contadas e comparadas com o número total de células CD16/7-NCD transfectadas. A fórmula de quantificação é: Porcentagem% = (número de células transfectadas com caudas de actina-F/número total de células transfectadas) x 100.
As imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal LSM510 com um objetivo de imersão 60x em óleo.
Geração e Caracterização de Camundongos Knockout com
Podócitos Específicos Robo2 e Camundongos Knockout Duplo Robo2-Nefrina
[000265] A geração e genotipagem do alelo condicionalRobo2flox,alelo mutante da linha germinativa Robo2del5(também chamado de Robo2- intercambiamente neste documento), e alelo de tipo selvagem Robo2+foram descritos anteriormente (Lu et al., 2007;.Wang et al., 2011). O esquema de reprodução padrão foi seguido para gerar camundongos knockout Robo2 podócito específico Robo2del5/flox; TgNphs2-Cre/+, que carregam um aleloRobo2del5 e um alelo Robo2flox. Neste composto mutante, a recombinase Cre podócito específica conduzido por promotor de podocina exclui apenas o alelo Robo2floxpara facilitar a penetrância de um fenótipo porque o outro alelo, Robo2del5, foi suprimido de maneira ubíqua da expressão da linha germinativa. A autenticidade de dos camundongos Robo2del5/flox; TgNphs2-Cre/+foi determinada por genotipagem da cauda de DNA quanto à presença de alelos Robo2del5e Robo2flox, bem como transgene TgNphs2-Cre. Camundongos Robo2flox/+ ninhada F2 sem Robo2del5 foram utilizados como controles. Para gerar camundongos knockout duplo Robo2- nephrin, camundongos heterozigóticos Robo2+/- foram cruzados com camundongos heterozigóticos Nphs1+/-que foram gerados previamente (Hamano et al., 2002). Após a geração de camundongos heterozigotos duplosRobo2+/-;Nphs1+/-, a cruz de camundongos heterozigotos dupla foi realizada para gerar camundongos heterozigotos duplos Robo2+/-;Nphs1+/-, bem como homozigoto único Nphs1-/-, homozigoto único Robo2-/- e controles do tipo selvagem Robo2+/+;Nphs1+/+. Protocolos de camundongo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Boston University Medical Center (#14388).
[000272] Transmissão e Microscopia Eletrônica de Varredura
[000266] Para a microscopia eletrônica de transmissão, os rins foram dissecados a partir de camundongos homozogóticos nulos Robo2 e camundongos knockout podócitos específicos, fixadas em PLP a 4°C durante a noite, e, em seguida, incubados em 2% de glutaraldeído em cacodilato de sódio 0,15 M durante 6 horas. Após lavagem em PBS lx, os rins fixados foram desidratados em etanol graduado, embebidos em Epon, seccionados e corados com acetato de uranila e citrato de chumbo. Seções renais ultrafinas foram preparadas e analisadas usando um microscópio eletrônico de JEM-1011.
Ninhadas de tipo selvagem foram utilizadas como controles.
Para a microscopia eletrônica de varredura, as amostras de rim de camundongos homozigotos nulos Robo2, camundongos knockout podócitos específicos, camundongos homozigotos nulos, e camundongos homozigotos duplos Robo2-nefrina foram preparados seguindo o protocolo descrito anteriormente (Friedman e Ellisman, 1981) com pequenas modificações.
Resumidamente, o rim foi submetido à perfusão com 2,5% de glutaraldeído e solução de paraformaldeído a 2% em tampão cacodilato 0,1 M(Fixador de Karnovsky, Electron Microscopy Sciences), e, posteriormente, fixados em fixador de Karnovsky por 24 horas, seguidos por solução pós-fixação em tetróxido de ósmio 2% (Electron Microscopy Sciences). As amostras de rim foram crio-fraturadas, desidratados e secadas usando hexametildissilazano (Electron Microscopy Sciences). As amostras de rim foram fotografadas usando microscópios eletrônicos de varredura Amray 1000A e Jeol 6340F. Três glomérulos de cada animal foram analisados para fornecer imagens representativas.
Estudos de Patologia nos Rins dos camundongos, Quantificação do Número dos Podócitos, Análise de Proteinúria
[000267] Para estudos patológicos renais, os rins foram dissecados e fixados em paraformaldeído 4% durante a noite, e depois tratados com uma série de etanol graduada para serem embebidos em parafina. Os blocos de parafina nos rins foram seccionados em 4µm usando um MT-920 micrótomo (MICROM), e corados usando os métodos padrão ácido periódico de Schiff (PAS) ou hematoxilina eosina (H&E) métodos. Os glomérulos foram examinados e avaliados para deposição de matriz, glomeruloesclerose segmentar, e dilatações da cápsula de Bowman, usando um microscópio de luz Olympus BHT equipado com um sistema de câmera digital SPOT. Para a quantificação do número de podócitos, WT1 foi usado como um marcador nuclear de podócitos e a coloração com imunoperoxidase foi realizada em seções de rim, seguindo o protocolo descrito anteriormente (Sanden et al., 2003).Resumidamente, seções renais embebidas em parafina, de 4 camundongos knockout podócitos específicos Robo2del5/flox;TgNphs2-Cre+ de um ano de idade e 4 camundongos do controle do tipo selvagem da mesma idade foram seccionados em 4 µm e corados com anticorpo WT1 (Biotecnologia Santa Cruz) após recuperação antigênica por microondas. Anticorpo secundário biotinilado e kit Vectastain ABC (Vetor Laboratories) foram usados para detectar o sinal WT1.
Núcleos de podócitos positivos WT1 em cada seção transversal glomerular foram contados no total de 165 glomérulos a partir dos quatro camundongos mutantes, e 166 glomérulos a partir de quatro camundongos controle. Para a análise de proteinúria, amostras de urina de camundongos "spot" a partir de camundongos de seis semanas de idade foram examinadas usando um kit de ELISA para quantificação albuminúria murino sensível (Exocell), de acordo com as instruções do fabricante e vareta para urina (Multistix da Bayer, IN) como método de triagem. A albumina da urina foi normalizada com creatinina para fornecer uma relação albumina/creatinina. A creatinina na urina foi determinada utilizando o kit de detecção de creatinina (Sigma), de acordo com as instruções do fabricante. A albumina da urina também foi examinada por 12% SDS-PAGE, e colocada para hibridizar com anticorpo anti-albumina (MP Biomedicals). Os dados dos mutantes e controles foram analisados por meio de ANOVA, teste de Student-t, e teste de Chi-quadrado.
Tabela 1. Análise quantitativa de glomérulos com expansão de matriz em camundongos knockout podócitos específicos Robo2 de 2 a 9 Meses (Mutantes) comparado aos controles (tipo selvagem) Genótipo Camund Idade(mes Total de Glomérulos com % de ongo es) glomérulo expansão de Glomérulos ID# s matrix com contatado mesangial expansão de s matrix mesangial Mutante 4048 2 96 13 12,35% Mutante 1721 3 107 18 16,82% Mutante 4005 6 103 17 16,51% Mutante 1190 7 102 20 19,61% Mutante 2396 9 80 14 17,50% Mutante 488 82 16,80% total Tipo 4058 2 90 4 4,44% selvagem
Tipo 4052 3 105 6 5,71% selvagem Tipo 3919 6 107 4 3,74% selvagem Tipo 1191 7 103 5 4,85% selvagem Tipo 2385 9 106 5 4,72% selvagem Tipo 511 24 4,70% selvagem total * P <0,01, n=5, t-teste.
Tabela 2. Análise quantitativa de glomérulos com expansão de matriz aumentada em camundongos knockout podócitos específicos Robo2 de 12 meses de idade (Mutantes) comparado aos controles (tipo selvagem) Genótipo Camund Idade(me Total de Glomérulos % de Glomérulos ongo ses) glomérul com expansão com expansão de ID# os de matrix matrix contatad mesangial mesangial os Mutante 1844 12 136 17 12,50% Mutante 1847 12 125 18 14,40% Mutante 1877 12 127 11 8,66% Mutante 1878 12 132 20 15,15% Mutante 1948 12 142 28 19,72% Mutante 662 94 14,20% total
Tipo 1901 12 125 5 4,00% selvagem Tipo 2429 12 179 8 4,47% selvagem Tipo 2834 12 154 9 5,84% selvagem Tipo 2836 12 159 7 4,40% selvagem Tipo 2837 12 124 5 4,03% selvagem Tipo 741 34 4,59% selvagem total *P<0,01, n=5, t-teste.
Tabela 3. Análise morfológica de glomérulos com o cápsula de Bowman dilatada em homozigotos único Nphs1-/- (Robo2+/-;Nphs1-/-)comparado com camundongos recém-nascidos homozigotos duplo Robo2-/-;Nphs1-/- por histologia Genótipo Glomérulos Glomérulos com % de Glomérulos totais contados Cápsula de com Cápsula de Bowman dilatada Bowman dilatada Robo2+/-;Nphs1-/- 122 31 25,4% Robo2-/-;Nphs1-/- 55 2 3,6% Robo2-/-;Nphs1+/- 158 3 1,9% Robo2+/+;Nphs1+/+ 271 1 0,4% Nota: Os glomérulos foram classificados como positivos com a cápsula de Bowman dilatada, se foi observado que o glomérulo exibiu fenótipo semelhante como mostrado na FIG. S4U, e foi classificado como negativo se foi observado que glomérulo era semelhante como mostrado na FIG.8V-8X.Foram analisados três camundongos de cada um dos genótipos. Homozigotos únicoRobo2-/- (Robo2-/-;Nphs1+/-) e tipo selvagem (Robo2+/+;Nphs1+/+) foram usados como controles.
Tabela 4. Análise morfológica do processo podálico interdigitante dos podócitos glomerulares(FP), fenótipo em Nphs1-/- homozigoto único (Robo2+/-;Nphs1-/-) em comparação aos camundongos recém-nascido duplo homozigotoRobo2-/- ;Nphs1-/- por Microscopia Eletrônica de Varredura Genótipo Glomérulos Glomérulos com % de Glomérulos totais contados estrutura com estrutura interdigitante FP interdigitante
FP Robo2+/-;Nphs1-/- 15 1 6,67% Robo2-/-;Nphs1-/- 16 12 75% Robo2-/-;Nphs1+/- 13 13 100% Robo2+/+;Nphs1+/+ 13 13 100%
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Claims (9)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição farmacêutica caracterizada pelo de que compreende um inibidor de ROBO2, que inibe a atividade biológica do ROBO2, em que o inibidor de ROBO2 é uma proteína solúvel de ROBO2 compreendendo um polipeptídeo de fusão compreendendo ambos os domínios de ligação Igl e Ig2 SLIT de ROBO2 sem domínio intracelular de ROBO2.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo de que o inibidor de ROBO2 previne ou reduz a ligação do polipeptídeo de ROBO2 a SLIT2, a Nick, ou a ambas.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo de que o domínio de ligação Ig1 SLIT compreende resíduos de aminoácidos 46- 145 da SEQ ID No: 1 ou resíduos de aminoácidos 30-129 da SEQ ID No: 3.
4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo de que o domínio de ligação Ig2 SLIT compreende resíduos de aminoácidos 151- 237 da SEQ ID No: 1 ou resíduos de aminoácidos 135-221 da SEQ ID No: 3.
5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo de que a proteína ROBO2 solúvel compreende resíduos de aminoácidos 30-129 da SEQ ID No: 3 e resíduos de aminoácidos 135-221 da
SEQ ID No: 3.
6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo de que é para uso no tratamento de um indivíduo tendo, ou em risco de ter, uma doença renal crônica ou proteinúria.
7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo de que a doença renal crônica ou proteinúria é causada por nefropatia diabética ou pressão alta.
8. Uso de uma composição tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar um indivíduo tendo, ou em risco de ter, uma doença renal crônica ou proteinúria.
9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo de que a doença renal crônica ou proteinúria é causada por nefropatia diabética ou pressão alta.
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