KR102103323B1 - 신장 질환의 진단 및 치료를 위한 ｓｌｉｔ­ｒｏｂｏ 신호전달 - Google Patents

신장 질환의 진단 및 치료를 위한 ｓｌｉｔ­ｒｏｂｏ 신호전달 Download PDF

Info

Publication number
KR102103323B1
KR102103323B1 KR1020147021856A KR20147021856A KR102103323B1 KR 102103323 B1 KR102103323 B1 KR 102103323B1 KR 1020147021856 A KR1020147021856 A KR 1020147021856A KR 20147021856 A KR20147021856 A KR 20147021856A KR 102103323 B1 KR102103323 B1 KR 102103323B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
robo2
protein
delete delete
kidney disease
nephrin
Prior art date
Application number
KR1020147021856A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140123516A (ko
Inventor
웨이닝 루
슈에핑 판
데이비드 제이. 살란트
Original Assignee
보스턴 메디칼 센터 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 보스턴 메디칼 센터 코포레이션 filed Critical 보스턴 메디칼 센터 코포레이션
Publication of KR20140123516A publication Critical patent/KR20140123516A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102103323B1 publication Critical patent/KR102103323B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
    • G16H20/10—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance relating to drugs or medications, e.g. for ensuring correct administration to patients
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Abstract

본원에서는 신장에서의 족세포 F-액틴 세포골격 및 족 돌기 구조의 조절에 있어서 SLIT-ROBO 신호전달 경로에 대한 예상치 못한 역할에 기초하여 만성 신장 질환 및 단백뇨의 치료를 위한 방법, 만성 신장 질환의 진단을 위한 방법, 및, 만성 신장 질환 및 단백뇨의 진행에 대한 치료의 효과를 모니터링하기 위한 방법을 제공한다.

Description

신장 질환의 진단 및 치료를 위한 ＳＬＩＴ­ＲＯＢＯ 신호전달 {ＳＬＩＴ­ＲＯＢＯ SIGNALING FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF KIDNEY DISEASE}
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2012년 1월 5일에 출원된 미국 가출원 제61/583,379호의 35 U.S.C.§ 119(e) 하의 이익을 주장하며, 이의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명의 분야는 만성 신장 질환 및 단백뇨의 치료 및 만성 신장 질환의 진단 및 만성 신장 질환 및 단백뇨의 진행에 대한 치료 효과의 모니터링을 위한 방법에 관한 것이다.
정부 지원
본 발명은 미국국립보건원에 의해 수여된 계약 번호 DK078226 하의 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.
발명의 요약
본원에서는 신장에서의 족세포 F-액틴 세포골격(podocyte F-actin cytoskeleton) 및 족 돌기 구조(foot process structure)의 제어에 있어서의 SLIT-ROBO 신호전달 경로를 위한 신규하고 예상외의 역할에 대한 발명자들의 발견에 부분적으로 기초한, 만성 신장 질환 및 단백뇨의 치료 및 만성 신장 질환의 진단, 및 만성 신장 질환 및 단백뇨의 진행에 대한 치료 효과의 모니터링을 위한 신규한 방법을 제공한다.
따라서, 일부 양태에 있어서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에 있어서의 만성 신장 질환의 치료를 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 ROBO2 억제제를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 만성 신장 질환을 갖거나 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 일부 양태에 있어서, 본원에서는 ROBO2 억제제를 포함하는 조성물의 치료적 유효량의 조성물을 단백뇨를 갖거나 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에 있어서의 단백뇨의 감소 방법을 제공한다.
이 방법 및 본원에 기술된 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 ROBO2에 대해 특이적인 차단 항체 또는 이의 항원-결합 절편, ROBO2에 대해 특이적인 안티센스 분자, ROBO2에 대해 특이적인 짧은 간섭 RNA (siRNA), ROBO2의 소분자 억제제, ROBO2 억제 폴리펩티드, 또는 ROBO2 구조 유사체이다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 SLIT, Nck, 또는 이 둘 모두에의 ROBO2의 결합을 차단하거나 감소시킨다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 Ig1 SLIT 결합 도메인, Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인, Nck 세포내 결합 도메인, 또는 이의 임의의 조합에 대해 특이적이다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제 폴리펩티드는 우성 음성 ROBO2 융합 단백질, 세포내 도메인이 없는 ROBO2 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 또는 세포외 도메인이 없는 ROBO2 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, 만성 신장 질환을 갖거나 위험이 있는 대상체는 당뇨병성 신장증 또는 고혈압을 가진다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 또한 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, 상기 추가 치료제는 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 또는 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB)이다.
또한 본원에서, 일부 양태에 있어서, 하기를 포함하는 방법을 제공한다:
a. ROBO2 폴리펩티드 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 결정하기 위해 대상체로부터의 생물학적 시험 샘플을 분석하는 단계;
b. 상기 생물학적 시험 샘플에서의 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준이 참조 한계 수준(reference threshold level)을 초과하는지를 결정하는 단계;
c. 만성 신장 질환을 위한 치료 또는 요법(therapy)을 필요로 하는 환자를 진단하는 단계.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준을 분석하는 단계는 ROBO2 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 사용하여 수행된다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 분석하는 단계는 PCR 또는 혼성화 분석(hybridization assay)을 사용하여 수행된다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, 생물학적 시험 샘플은 신장 생검, 소변, 혈액, 혈청 샘플, 또는 소변 샘플로부터 펠렛화된 세포이다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준은 참조 한계 수준보다 적어도 20% 초과이다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준은 참조 한계 수준보다 적어도 2 표준 편차 초과이다.
또한 본원에서, 일부 양태에 있어서, 하기를 포함하는 분석법이 제공된다:
a. 환자로부터 분리된 생물학적 시험 샘플을 ROBO2 폴리펩티드 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA를 검출하는 시약과 접촉시키는 단계; 및
b. ROBO2 폴리펩티드 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 수준을 측정하는 단계,
상기에서, 정상 생물학적 샘플에 대해, 상기 ROBO2 폴리펩티드 또는 상기 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 증가된 수준은, 만성 신장 질환 및/또는 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 진행을 갖는 대상체를 확인한다.
본원에 기술된 이러한 분석법 및 모든 이러한 분석법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준을 검출하는 단계는 ROBO2 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 사용하여 수행된다.
본원에 기술된 이러한 분석법 및 모든 이러한 분석법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 검출하는 단계는 PCR 또는 혼성화 분석을 사용하여 수행된다.
본원에 기술된 이러한 분석법 및 모든 이러한 분석법의 일부 실시형태에 있어서, 생물학적 시험 샘플은 신장 생검, 소변, 혈액, 혈청 샘플, 또는 소변 샘플로부터 펠렛화된 세포이다.
본원에 기술된 이러한 분석법 및 모든 이러한 분석법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준은 참조 한계 수준보다 적어도 20% 초과이다.
본원에 기술된 이러한 분석법 및 모든 이러한 분석법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준은 참조 한계 수준보다 적어도 2 표준 편차 초과이다.
본원에 기술된 이러한 분석법 및 모든 이러한 분석법의 일부 실시형태에 있어서, 대상체는 당뇨병 또는 고혈압으로 진단된 적이 있다.
일부 양태에 있어서, 본원에서는 하기를 포함하는, 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨 위험이 있는지, 또는 만성 신장 질환을 가지는지를 결정하기 위한 시스템을 제공한다:
a. 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 결정하도록 구성된 측정 모듈;
b. 상기 측정 모듈에 의해 결정된 상기 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 받고 그 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준이 미리-정해진 참조 수준 또는 비율을 초과하는지 여부를 결정하기 위해 하나 이상의 분석을 수행하고, 검색된 컨텐츠(retrieved content)를 제공하도록 구성된 비교 모듈; 및
c. 상기 비교 모듈로부터의 데이터 출력에 기초한 컨텐츠를 디스플레이하기 위한 디스플레이 모듈 - 상기 컨텐츠는 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준이 미리-정해진 참조 수준 또는 비율 초과임을 나타내는 신호; 또는 ROBO2의 발현 비율이 참조 수준 또는 미리-정해진 비율 이하임을 나타내는 신호를 포함함 -.
본원에 기술된 이러한 시스템 및 모든 이러한 시스템의 일부 실시형태에 있어서, 디스플레이 모듈에 표시되는 컨텐츠는 특정 치료 요법을 받도록 권장되는 대상체를 나타내는 신호를 추가로 포함한다.
일부 양태에 있어서, 본원에서는 하기를 포함하는, 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨 위험이 있는지, 또는 만성 신장 질환을 가지는지를 결정하기 위한 시스템을 제공한다:
a. 대상체로부터 얻은 하나 이상의 시험 샘플을 받고 하기 조건 중 하나의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 상기 하나 이상의 시험 샘플에 대해 하나 이상의 분석을 수행하도록 구성되는 결정 모듈:
i. 미리-정해진 비율을 초과하는 ROBO2의 발현 비율, 또는
ii. 미리-정해진 수준을 초과하는 ROBO2의 발현 수준
b. 상기 결정 모듈로부터의 데이터 출력을 저장하도록 구성된 저장 장치; 및
c. 상기 결정 모듈로부터의 데이터 출력에 기초한 컨텐츠를 표시하기 위한 디스플레이 모듈 - 상기 컨텐츠는 ROBO2의 발현 비율이 미리-정해진 비율을 초과하거나 ROBO2의 수준이 미리-정해진 수준을 초과함을 나타내는 신호, 또는 ROBO2의 발현 비율이 미리-정해진 비율 이하이거나 또는 미리-정해진 수준 이하임을 나타내는 신호를 포함함 -.
본원에 기술된 이러한 시스템 및 모든 이러한 시스템의 일부 실시형태에 있어서, 디스플레이 모듈에 디스플레이되는 컨텐츠는 특정 치료 요법을 받도록 권장되는 대상체를 나타내는 신호를 포함한다.
또한, 본원에서, 일부 양태에 있어서, 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 발생을 예방하기 위한 치료 또는 요법을 참조 한계 수준 초과의 ROBO2 단백질의 수준을 갖는 것으로 결정된 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 만성 신장 질환 또는 단백뇨 위험을 가진 인간 대상체의 치료 방법을 제공한다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이러한 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질의 수준은 참조 수준보다 적어도 20% 초과이다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질의 수준은 참조 수준보다 적어도 2 표준 편차 초과이다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 발생을 예방하기 위한 치료 또는 요법은 ROBO2 억제제를 포함한다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 ROBO2에 대해 특이적인 차단 항체 또는 이의 항원-결합 절편, ROBO2에 대해 특이적인 안티센스 분자, ROBO2에 대해 특이적인 짧은 간섭 RNA (siRNA), ROBO2의 소분자 억제제, ROBO2 억제 폴리펩티드, 또는 ROBO2 구조 유사체이다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 SLIT, Nck, 또는 이 둘에의 ROBO2의 결합을 차단하거나 감소시킨다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 Ig1 SLIT 결합 도메인, Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인, Nck 세포내 결합 도메인, 또는 이의 임의의 조합에 대해 특이적이다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제 폴리펩티드는 우성 음성 ROBO2 융합 단백질, 세포내 도메인이 없는 ROBO2 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 또는 세포외 도메인이 없는 ROBO2 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다.
또한 본원에서는, 일부 양태에 있어서, 만성 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 ROBO2 억제제, 및 단백뇨의 치료에 사용하기 위한 ROBO2 억제제를 제공한다.
본원에 기술된 이러한 용도 및 모든 이러한 용도의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 ROBO2에 대해 특이적인 차단 항체 또는 이의 항원-결합 절편, ROBO2에 대해 특이적인 안티센스 분자, ROBO2에 대해 특이적인 짧은 간섭 RNA (siRNA), ROBO2의 소분자 억제제, ROBO2 억제 폴리펩티드, 또는 ROBO2 구조 유사체이다.
본원에 기술된 이러한 용도 및 모든 이러한 용도의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 SLIT, Nck, 또는 이 둘에의 ROBO2의 결합을 차단하거나 감소시킨다.
본원에 기술된 이러한 용도 및 모든 이러한 용도의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 Ig1 SLIT 결합 도메인, Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인, Nck 세포내 결합 도메인, 또는 이의 임의의 조합에 대해 특이적이다.
본원에 기술된 이러한 용도 및 모든 이러한 용도의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제 폴리펩티드는 우성 음성 ROBO2 융합 단백질, 세포내 도메인이 없는 ROBO2 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 또는 세포외 도메인이 없는 ROBO2 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다.
본원에 기술된 이러한 용도 및 모든 이러한 용도의 일부 실시형태에 있어서, 만성 신장 질환 또는 단백뇨는 당뇨병성 신장증 또는 고혈압에 의해 야기된다.
본원에 기술된 이러한 용도 및 모든 이러한 용도의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2는 서열번호 2의 mRNA 서열에 의해 암호화된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 ROBO2를 지칭한다. 본원에 기술된 이러한 임의의 이러한 양태 및 모든 이러한 양태의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2는 서열번호 4의 mRNA 서열에 의해 암호화된 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 인간 ROBO2를 지칭한다.
정의
편의상, 상세한 설명, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 특정 용어를 여기에 정리하였다. 다르게 언급되거나 문맥으로부터 암시되지 않는 한, 하기 용어 및 문구는 하기에 제공되는 의미를 포함한다. 다르게 명백하게 언급되거나, 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 하기 용어 및 문구는 그 용어 또는 문구가 본 기술과 관련된 기술분야에서 획득한 의미를 제외하지 않는다. 정의는 특정 실시형태를 기술하는 것을 보조하고자 제공되고, 본 발명의 범위는 단지 특허청구범위에 의해 제한되기 때문에, 청구된 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해될 수 있는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "포함함" 또는 "포함하다"는 본 발명에 필수적이지만, 필수적이든 그렇지 않든 불특정 요소의 포함의 여지가 있는 조성물, 방법, 및 이의 각각의 구성요소(들)과 관련하여 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "필수적으로 이루어진"은 주어진 실시형태에 대해 요구되는 요소들을 지칭한다. 상기 용어는 본 발명의 이러한 실시형태의 기본적이고 신규하거나 기능적인 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 추가적인 요소의 존재를 허용한다.
용어 "이루어진"은 실시형태의 상세한 설명에 열거되지 않은 임의의 요소를 배제하고, 본원에 기술된 바와 같은 조성물, 방법, 및 이의 각각의 구성요소를 지칭한다.
이러한 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 분명하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 어구를 포함한다. 따라서 예를 들어, "방법"에 대한 참조는 본원에 기술된 및/또는 본 개시물 등을 읽는 당업자에게 자명한 유형의 하나 이상의 방법들, 및/또는 단계들을 포함한다.
작동 실시예에서나 달리 지시된 곳 이외에서, 본 발명에 사용되는 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 수치는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 백분율과 함께 사용될 때 ±10%, ±5%, 또는 ±1%를 의미할 수 있다.
본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련되어 사용되는 과학 및 기술 용어는 본 개시물이 속하는 기술분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명은 본원에 기술된 특별 방법론, 프로토콜, 및 시약 등에 제한되지 않고 변화될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어들은 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 것으로 의도되지 않고, 이는 오로지 특허청구범위에 의해 한정된다. 면역학, 및 분자 생물학에서 일반 용어의 정의는 문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al . (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006]에서 찾을 수 있다. 분자 생물학에서의 일반 용어의 정의는 문헌 [Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al . (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Maniatis et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al ., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); or Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al . ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) and Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.)]에서 발견되고, 이는 본원에서 그 전문이 참조로 모두 포함된다.
하기 상세한 설명 및 하기 실시예는 단지 예시적인 것이고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 선택된 것이 아닌 것으로 이해된다. 당업자에게 자명할 것인, 개시된 실시형태에 대한 다양한 변화 및 수정은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남 없이 이루어질 수 있다. 또한, 확인된 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물은 예를 들어 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기술된 방법론을 기술하고 개시하기 위해 본원에 참조로 분명하게 통합된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시 내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떤 것도 발명자가 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시 내용보다 선행할 자격이 없음에 대한 인정으로 해석되어서는 안된다. 날짜에 대한 모든 언급 또는 본 문헌의 내용에 대한 표현은 본 출원인에게 이용가능한 정보에 기초하고, 그 날짜의 정확성 또는 이러한 문헌의 내용에 대한 어떤 승인도 구성하지 않는다.
도 1A-1R은 Robo2가 발현되어 족세포의 기저 세포 표면에 국재화되는 것을 나타낸다. (도 1A-1Q)에서의 모든 면역염색법은 마우스 E16.5일차에 600X 배율로 수행되었다 (성체 마우스 사구체에서의 면역염색법에 대한 도 5A-5M 참조). (도 1A-1C) Robo2는 족세포 세극막(slit-diaphragm) 단백질 네프린과 공동-국재화된다. (도 1D-1F) Robo2는 족세포 세극막 단백질 포도신과 공동-국재화된다. (도 1G-1I) Robo2는 사구체에서 어댑터 단백질 Nck와 공동-국재화된다. (도 1J-1L) Robo2는 사구체 기저막 단백질 니도겐과 인접한 기저 족세포 표면에서 발현된다. (도 1M-1O) Robo2는 사구체 내피 세포 단백질 마커 Pecam1과 공동-국재화되지 않는다. (도 1P) (도 1L)에서 박스처리된 확대된 영역은 Robo2가 사구체 기저막 마커 니도겐과 인접한 족세포들 (p)의 기저 세포 표면 (화살표)에서 주로 발현됨을 나타낸다. Robo2는 족세포의 꼭대기 및 측부 세포 표면 (화살촉)에서 약하게 발현된다. (도 1Q) Robo2는 족세포들 (p)의 기저 세포 표면 (화살표)에서 주로 발현되고 꼭대기 또는 측부 세포 표면 (화살촉)에서 약하게 발현된다. (도 1R) 면역금 전자 현미경은 3-주령 마우스로부터의 족세포의 족 돌기 (fp)에서 Robo2 항체와 컨쥬게이션된 금 부분(gold partials (화살표)의 국재화를 나타낸다. GBM, 사구체 기저막. 배율: 50,000X. 또한 도 5A-5M 참조.
도 2A-2J는 Robo2가 어댑터 단백질 Nck와 상호작용하고 네프린과의 복합체를 형성함을 나타낸다. (도 2A) 효모 투-하이브리드 분석(yeast two-hybrid assay)은 Robo2 세포내 도메인 (Robo2-ICD)과 Nck1 사이의 양성 상호작용을 나타낸다. LacZ 리포터 (X-gal): +++, 효모가 어둡게 변함; ++, 밝음; -, 24 시간 내 백색. 류신 리포터 (-Leu): +, 효모가 생장하였음; -, 효모가 생장하지 않았음. CC, 세포질 보존 영역. 숫자는 전장 단백질에서의 잔기 위치를 나타낸다. (도 2B) 효모 투-하이브리드 분석은 Robo2-ICD와의 상호작용을 위해 Nck1의 최초의 2 개의 SH3 도메인이 필요함을 나타낸다. (도 2C) 효모 투-하이브리드 분석은 Robo2와 Nck1의 상호작용을 매개하는 잠재적 결합 도메인을 나타낸다. 서열은 Nck1에 대한 Robo2 내의 잠재적 결합 영역이다. 프롤린-풍부 영역을 강조하였다. (도 2D) Robo2 및 Nck의 공침전. 5 레인(lane)에서의 세포 용해액은 His-myc-Robo2 형질도입된 세포로부터 수집되며 (레인 1 및 2에서 사용됨); 레인 6에서의 세포 용해액은 His-myc-Robo2-△NBD 형질도입된 세포로부터 수집된다 (레인 3 및 4에서 사용됨). (도 2E) Robo2, Nck, 및 네프린의 공-침전. (도 2F) His-myc-네프린이 His-myc-Robo2 대신 풀다운된(pulled-down) 것을 제외하고 (도 2E)와 유사한 공-침전. (도 2G) 신장 내인성 Robo2, Nck, 및 네프린의 공동-면역침전. (도 2H) 침전물이 마우스 안티-네프린 항체를 사용하여 제조된 것을 제외하고 (도 2G)와 유사한 분석. (I) Slit2는 Robo2-Nck-네프린 복합체 형성을 증강시킨다. His-myc-Robo2, 네프린, 및 Fyn이 Slit2 조정 배지 (레인 1, 3) 또는 대조군 조정 배지 (레인 2, 4)로 자극된 HEK 세포에서 발현된다. (도 2J) (도 2I)의 강도 정량화(Intensity quantification). 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타내고; n=7, *p < 0.05, **p < 0.01 대조군과 비교됨, 대응표본 스튜던트 t-시험(paired student's t-test), 또한 도 6A-6F' 참조.
도 3A-3G는 Slit2-Robo2 신호전달이 네프린-매개 액틴 중합을 억제함을 나타낸다. (도 3A) CD16/7-NCD는 Slit2 조정 배지 (Slit) 또는 대조군 조정 배지 (CTL)의 존재 하에 안티-CD16 항체 및 로다민-컨쥬게이션된 안티-IgG 항체로 처리된, HEK 세포에서 Robo2와 공동-발현된다. 세포는 이후 고정되고 F-액틴을 나타내도록 FITC-컨쥬게이션된 팔로이딘으로 착색된다. 스케일 바(scale bar), 5 ㎛, NCD: 네프린 세포질 도메인. (도 3B) CD16/7-NCD가 CD16/7-HA로 대체되고 대조군 분석으로서 사용되는 것을 제외하고 (도 3A)와 유사한 분석. (도 3C) 각 그룹에서 CD16/7 응집체(CD16/7 cluster)를 가진 총 세포에 대한 F-액틴 테일을 가진 세포의 백분율이 정량화된다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타내고; *p < 0.01, n=5. (도 3D) (도 3A)에서의 CD16/7-NCD는 Slit 조정 배지 자극 (레인 1 및 3) 또는 대조군 조정 배지 (레인 2 및 4) 이후 안티-CD16 항체에 의해 면역침전된다. 레인 1에서의 감소된 F-액틴을 주목한다. CD16/7-HA는 음성 대조군으로서 사용된다. (도 3E) (도 3D)의 강도 정량화. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타내고; n=4, *p < 0.05 대조군과 비교됨, 대응표본 스튜던트 t-시험. (도 3F) 안티-네프린 항체를 사용하는 Robo2 녹아웃(knockout) 동형접합 (Robo2-/-), 이형접합 (Robo2+/-), 및 야생형 (Robo2+/+) 마우스 신장으로부터의 네프린의 면역침전. 레인 2에서의 증가된 F-액틴을 주목한다. (도 3G) (도 3F)의 강도 정량화. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타내고; n=4, *p < 0.05 야생형 및 이형접합과 비교됨, ANOVA 분석, 또한 도 7A-7C 참조.
도 4A-4W는 Robo2 동형접합 널(null), Robo2 족세포 특이적 녹아웃, 및 Robo2 및 Nphs1 이중 녹아웃 마우스에서의 족세포 구조 표현형을 나타낸다. (도 4A 및 4B) 신생 신장의 대표 이미지는 야생형 (도 4A) 및 Robo2 동형접합 널 마우스 (도 4B) 에서의 족세포 본체 (화살촉) 및 보우만 캡슐 (화살표)을 나타낸다. (도 4C 및 4D) (도 4A 및 4B)의 고배율 이미지는 신생 신장에서의 족세포 족 돌기 (화살표)를 나타낸다. 스케일 바, 1 ㎛. (도 4E 및 4F) 저배율에서의 3주 신장의 대표 이미지는 연령-일치된 대조군 (도 4E)과 비교되는 Robo2 동형접합 널 마우스 (도 4F)에서의 족세포 세포 본체 (화살표)를 나타낸다. (도 4G 및 4H) (도 4E 및 4F)의 보다 높은 고배율 이미지는 연령-일치된 대조군 (도 4G)에서의 잘-정렬된 지퍼-유사 족 돌기(well-organized zip-like foot processes)와 비교되는 3주 Robo2 동형접합 널 마우스 (도 4H)에서의 흐트러지고 더 짧은 구불구불한 족 돌기 (화살표)를 나타낸다. 스케일 바: 2 ㎛. (도 4I 및 4J) 대표적인 투과 전자 현미경 이미지 (5000x에서의 배율)는 1개월된 Robo2 족세포-특이적 녹아웃 마우스에서의 국소 분절성 족세포 족 돌기 소멸(도 4J에서의 화살표) 및 대조군에서의 정상 표현형 (도 4I)을 묘사하고 있다. 약어: gc: 사구체 모세관; us: 비뇨 공간(urinary space). (도 4k 및 4L) 더 고배율의 투과 전자 현미경 이미지 (40000x)는 대조군 (도 4K)과 비교되는 2개월된 Robo2 족세포-특이적 돌연변이 마우스에서의 더 넓은 족세포 족 돌기 (도 4L에서의 화살표)를 나타낸다. 약어: fp, 족세포 족 돌기; GBM, 사구체 기저막. (도 4M) 1개월된 Robo2del5/flox;TgNphs2-Cre+ 족세포 특이적 녹아웃 마우스 (Robo2 KO) 및 야생형 한배새끼 대조군(littermate control) (WT)에서의 족세포 족 돌기 너비의 정량화. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타내고, n=333, *p < 0.01. (도 4N) 단회뇨(spot urine)의 ELISA 분석은 대조군 야생형 (WT)와 비교되는 Robo2del5/flox; Nphs2-Cre+ (KO) 성체 마우스에서의 증가된 알부민/크레아티닌 비율을 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타내고, n=20, *p < 0.01. (도 4O) 웨스턴 블롯 분석은 소변에서의 알부민의 존재를 나타내고; 1 ㎕ 소변은 각 웰에 장입되었고, 0.2 ㎍ 알부민은 양성 대조군으로서 사용되었다. WT, 3 마리의 야생형 한배새끼; Robo2 KO, 3 개체의 Robo2del5/flox;Nphs2-Cre+ 마우스. (도 4P 및 4Q) 대표적인 주사 전자 현미경 이미지는 Nphs1-/- 단일 동형접합 신생 마우스 신장에서의 흐트러진 세포 돌출부(cellular protrusion) (화살표)와 닮은 분열된(disrupted) 깍지낌형(interdigitating) 족세포 족 돌기를 나타낸다. 스케일 바: 1 ㎛. (도 4R 및 4S) Nphs1-/-Robo2-/- 이중 동형접합 신생 마우스로부터의 사구체는 Robo2를 녹아웃시킴으로써 네프린 널 표현형의 완화를 나타내는, 복원된 깍지낌형 족 돌기 (화살표)를 나타낸다. (도 4T 및 4U), Robo2-/- 단일 동형접합 신생 마우스로부터의 사구체는 불규칙하고 더 넓은 족 돌기, 한편 대규모의 깍지낌형 패턴 형성 (화살표)을 나타낸다. (도 4V 및 4W), 족 돌기의 일반적인 규칙적인 깍지낌형 패턴 (화살표)을 가진 신생 야생형 마우스로부터의 사구체. 또한 도 8A-8Z 및 표 1-4 참조.
도 5A-5M은 Robo2가 발달중 및 성체 사구체에서 발현되는 것을 나타낸다. (도 5A 및 5B) 인시츄 혼성화 분석은 Robo2 전사물이 E16.5 발달중인 사구체 (화살표)에서 발현되는 것을 나타낸다. 배율: 60X (도 5A) 및 200X (도 5B). (도 5C-5F) 면역조직화학 (IHC) 연구는 Robo2가 E14.5로부터 E17.5까지의 발달중인 사구체 과정에서 발현됨을 나타낸다. 배율: 600X. (도 5G) IHC는 Robo2가 5주 연령 (도 5G)의 성체 마우스 사구체에서 특이적으로 발현됨을 나타낸다. DAPI는 신장에서의 세포핵을 표식한다. 배율: 400X. (도 5H) 5w 신장의 IHC 공동-국재화 착색은 Robo2가 족세포 마커 Wt1을 가진 사구체에서 공동-발현됨을 나타낸다. 배율: 600X. (도 5I-5K) Robo2 및 WT1은 E16.5의 마우스 사구체에서 공동-발현된다. 배율: 600X. (도 5L 및 5M) 5w 신장의 IHC 공동-국재화 착색은 Robo2가 혈관간 세포 마커 Pdgfrb (도 5L) 및, 내피 세포 마커 Pecam1 (도 5M)와 사구체에서 공동-발현됨을 나타낸다. 배율: 600X.
도 6A-6F'는 Robo2가 Nck와 상호작용하고, 네프린과의 복합체를 형성하며, 그것이 Slit2 자극에 의해 증감됨을 나타낸다. (도 6A) 내인성 Nck에 의한 Robo2 및 네프린의 공동-IP. Robo2, 네프린, 및 Fyn는 HEK 세포에서 발현되고 Slit2에 의해 자극된다. 내인성 Nck는 안티-Nck 항체에 의해 면역침전된다. 마우스 IgG는 대조군으로서 사용된다. 네프린과의 복합체 형성은 Slit2 및 Fyn 발현에 의해 증강된다. (도 6B 및 6C) Slit2는 면역과산화효소 착색에 의한 신생 마우스 사구체 (도 6B)에서 발현되고, 족세포 마커 시냅토포딘(Synaptopodin)과 사구체 (도 6C)에서 공동-발현된다. 배율: 600X. (도 6D 및 6D') CD16/7-NCD는 Slit2의 존재 하에 HEK 세포에서 Robo2와 공동-발현되고, 안티-CD16 항체 및 로다민-컨쥬게이션된 안티-IgG 항체로 처리되고, 이후 고정되고 안티-Robo2 항체로 착색된다. CD16/7-NCD 응집체는 Robo2와 공동-국재화되나 (도 6D) 대조군 CD16/7-HA 응집체에서는 어떠한 공동국재화(colocalization)도 관찰되지 않는다 (도 6D'). 스케일 바: 5 ㎛. NCD: 네프린 세포질 도메인. (도 6E 및 6E') Robo2에서의 Nck 결합 도메인 (NBD)의 결실은 Slit2의 존재 하에 CD16/7-NCD와의 이의 공동-국재화를 손상한다. CD16/7-NCD 응집체는 Robo2와 공동-국재화되나 (도 6E) Robo2-△NBD 응집체에서 어떠한 공동국재화도 관찰되지 않는다 (도 6E'). 스케일 바: 5 ㎛. (도 6F 및 6F') Slit2 자극은 HEK 세포에서 CD16/7-NCD와 Robo2의 공동-국재화를 증강시킨다. CD16/7-NCD 응집체는 Slit2의 존재 하에 Robo2와 공동-국재화하나 (도 6F) 대조군 조정 배지에서는 그렇지 않다 (도 6F'). 스케일 바 5 ㎛.
도 7A-7C는 Robo2에서의 Nck 결합 도메인의 결실은 네프린-유도 액틴 중합에 대해 Slit2-Robo2 억제를 위태롭게 하는 것을 나타낸다. (도 7A) CD16/7-NCD와 Robo2는 HEK 세포에서 공동-발현되고, Slit2 조정 배지 (Slit2) 또는 대조군 조정 배지 (CLT)의 존재 하에 안티-CD16 항체 및 로다민-컨쥬게이션된 안티-IgG 항체와 응집되었다. 세포는 이후 고정되고 F-액틴 섬유를 나타내기 위해 FITC-컨쥬게이션된 팔로이딘으로 착색되었다. CD16/7-NCD 및 F-액틴 섬유의 응집체는 공초점 현미경을 사용하여 조사되었다. 스케일 바, 5 ㎛. NCD, 네프린 세포질 도메인. (도 7B) CD16/7-NCD 및 Robo2-△NBD는 HEK 세포에서 공동-발현되었다. 스케일 바, 5 ㎛. NBD, Nck 결합 도메인. (도 7C) 각 그룹에서 CD16/7-NCD 응집체를 가진 총 세포에 대한 F-액틴 테일(F-actin tail)을 가진 세포의 백분율을 정량화하였다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타낸다, *p = 1.436x10-5, **p = 6.32x10-5, n=5, ANOVA.
도 8A-8Z는 Robo2 동형접합 널, Robo2 족세포 특이적 녹아웃, Robo2 및 Nphs1 이중 녹아웃 마우스, 및 Robo2-네프린 신호전달의 제안된 모델에서의 사구체 표현형을 나타낸다. (도 8A-8F) 신생 (NB) Robo2 del5/del5 돌연변이 마우스 신장에서의 사구체 초미세구조의 투과 전자 현미경 분석. (도 8A, 8C, 8E) 낮은 (도 8A, 2200X), 중간 (도 8C, 15500X) 및 높은 (도 8E, 52000X) 배율에서의 신생 이형접합 Robo2 대조군 마우스로부터의 사구체 초미세구조. (도 8B, 8D, 8F) 낮은 (도 8B), 중간 (도 8D) 및 높은 (도 8F) 배율에서의 신생 동형접합 Robo2(-/-) (즉, Robo2 del5/del5) 돌연변이 마우스로부터의 사구체 초미세구조. 화살표는 국소 족 돌기 소멸을 나타낸다. 약어: gc: 사구체 모세관; us: 비뇨 공간; GBM; 사구체 기저막. (도 8G-8N) Robo2 족세포-특이적 녹아웃 마우스에서의 비정상적인 족세포 족 돌기 패턴. (도 8G-8J) 1개월된 Robo2 del5/flox;Nphs2-Cre + 족세포-특이적 녹아웃 마우스 및 연령 일치된 Robo2 flox/+ 대조군 마우스로부터의 사구체의 대표적인 주사 전자 현미경 이미지. 깍지낌형 족세포 족 돌기의 약한 불규칙성이 1개월된 Robo2 족세포-특이적 녹아웃 마우스에서 발견되었다 (도 8K 및 8N). 7개월생에서, Robo2 족세포-특이적 녹아웃 마우스는 주목할만한 불규칙한 족 돌기가 발달되었다 (도 8L 및 8N). 스케일 바: 10 ㎛ (2000x 배율에서의 도 8G, 8H, 8K, 8L) 및 2 ㎛ (13000x 배율에서의 도 8I, 8J, 8M, 8N). (도 8O-8T) Robo2 족세포-특이적 녹아웃 마우스에서의 사구체 형태. (도 8O-8R) 주기적 산-쉬프 (PAS) 착색은 연령-일치된 대조군 (도 8O, 8Q)과 비교되는 2개월 및 6-개월된 Robo2 족세포-특이적 녹아웃 마우스 (도 8P, 8R)로부터의 사구체에서의 혈관간 매트릭스 팽창(mesangial matrix expansion)을 나타내었다. (도 8S) 사구체의 정량적 분석은 연령 일치된 야생형 (WT) 대조군과 비교되는 12-개월된 Robo2 족세포-특이적 녹아웃 마우스 (MU)에서의 혈관간 매트릭스 팽창을 나타내었다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타내었고, n=5, *p < 0.01. (T) Robo2 족세포-특이적 녹아웃은 족세포 수에 영향을 주지 않는다. 족세포 세포들은 WT-1 착색을 사용하여 확인되었다. 사구체 단면 당 족세포의 수는 4 마리의 연령-일치된 야생형 마우스 (MT)에 비교되는 4 마리의 1년생 Robo2 del5/flox;Tg Nphs2-Cre+ 족세포 특이적 녹아웃 마우스 (MU)에서 계수되었다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타내었고, p = 0.645, t-시험; 돌연변이: n=165 사구체; 대조군: n=166 사구체. (도 8U-8Y) Robo2 및 Nphs1 이중 녹아웃 마우스에서의 사구체 표현형. (도 8U) H&E 착색은 400x에서, Nphs1 -/- 단일 동형접합 신생 마우스에서의 보우만 공간 (별표)의 특징적 팽창을 가진 사구체를 나타낸다. (도 8V) Robo2 -/- 단일 동형접합 신생 마우스로부터의 사구체는 보우만 공간 팽창의 부재를 나타낸다; 400x. (도 8W) 유의미한 보우만 공간 팽창이 없는 정상인 것으로 보여지는 사구체 (화살표)는 Nphs1 -/- 사구체 표현형의 완화를 나타내는 Robo2 -/-;Nphs1 -/- 이중 동형접합 신생 마우스에서 나타난다; 400x. (도 8X) 연령-일치된 야생형 신생 마우스 대조군으로부터의 정상 신장 및 사구체의 H&E 착색; 400x. (도 8Y) 신생 마우스에서 팽창된 보우만 공간을 갖는 사구체의 정량화는 Nphs1 -/- 단일 동형접합 (Robo2 +/-;Nphs1 -/-)과 비교되는 Robo2 -/-;Nphs1 -/- 이중 동형접합에서의 보우만 공간의 특징적 팽창 표현형을 가진 사구체의 유의미한 감소를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타냄, *p < 0.01. (도 8Z) 족세포 족 돌기 구조에 영향을 주기 위한 Slit2-Robo2 신호전달의 억제 효과의 모델: 생리학적 조건 (예를 들어, 족 돌기 발달 동안의) 하에, 네프린 세포내 인산화 티로신 도메인 (YDxV-p)은 SH2 도메인과의 이의 상호작용을 통해 Nck를 리쿠루트하였다. Nck는 순차적으로 액틴 중합을 촉진하기 위해 이의 SH3 도메인을 통해 세포골격 조절자를 리쿠루트(recruit)한다. Slit2는 Robo2에 결합되어 Nck의 SH3 도메인과의 ROBO2 세포내 도메인 상호작용을 증가시키고, 이는 세포골격 조절자에의 Nck의 결합을 방지하고 네프린-유도 액틴 중합의 억제를 초래할 것이다. 균형잡힌(balanced) 액틴 중합은 정상적인 족 돌기 구조를 위한 족세포 발달 과정에서 유지된다. Slit2-Robo2 신호전달의 부재의 경우 (예를 들어, Robo2가 녹아웃되는 경우), 네프린 유도 중합에 대한 Robo2의 억제 효과가 상실된다. Nck의 SH3 도메인은 다운스트림 세포골격 조절자(downstream cytoskeletal regulator)와 상호작용하여 액틴 중합을 증가시킬 수 있고, 이는 Robo2 돌연변이 마우스에서의 변경된 족세포 족 돌기 구조를 설명할 수 있다. 약어: Ig: 면역글로불린 도메인; FN3: 피브로넥틴 유형 3 도메인; SH2: Src 상동 2 도메인; SH3: Src 상동 3 도메인; CC0, CC1, CC2, CC3: 세포질 보존 영역 0, 1, 2, 3.
Robo2는 반발성 유도 신호 Slit(repulsive guidance cue Slit)에 대한 세포 표면 수용체이고 신경계에서 축색돌기 유도 및 뉴런 이동과 관련되는 것으로 이전에 밝혀졌다. 네프린은 신장 사구체 여과 장벽에서 기능을 하는 족세포 세극막 단백질(podocyte slit-diaphragm protein)이다. 본원에서 본 발명자는 Robo2는 족세포, 예컨대 마우스 족세포의 기저면에서 발현되고, 네프린과 공동-국재화되는 것을 나타낸다. 생화학 연구는 Robo2가 어댑터 단백질 Nck을 통해 신장에서 네프린과 복합체를 형성하는 것을 나타낸다. 액틴 중합을 촉진하는 네프린의 역할과 대조하여, 본 발명자는 본원에서 Slit2-Robo2 신호전달이 네프린-유도 액틴 중합을 억제한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 네프린과 연관된(associated) F-액틴의 양은 변경된 족세포 족 돌기 구조(podocyte foot process structure) 및 미세단백뇨(microalbuminuria)를 발달시키는 Robo2 녹아웃 마우스(Robo2 knockout mice)에서 증가된다. 유전적 상호작용 연구는 또한 Robo2의 손실은 네프린 널 마우스(nephrin null mice)에서의 비정상적인 족세포 표현형을 완화시키는 것을 나타낸다. 본원에서 제공된 결과는 Robo2 신호전달이 네프린에 대해 음성 조절자로서 역할을 하여 족세포 족세포 족 돌기 구조에 영향을 주는 것을 보여준다.
게다가, 방광 요관 역류 (VUR)를 가지는 환자는 ROBO2 유전자를 저해하고 SLIT2-ROBO2 신호전달 경로를 폐기시키는 우성 음성 ROBO2 융합 단백질을 생성하는 염색체 전좌를 가지는 것으로 나타났다. 일반적으로, VUR은 방광으로부터 요관 및 신장으로의 소변의 역행하는 흐름에 의해 특정되는 질환이고 VUR 환자는 역류성 신증, 심한 단백뇨를 나타내는 질병을 겪을 수 있다. VUR 환자에 의해 생성된 우성 음성 ROBO2 융합 단백질은 SLIT2-ROBO2 신호전달 경로를 차단하고 역류성 신증 및 단백뇨로부터 환자를 보호하는 것을 나타내었고, 이에 따라 만성 신장 질환의 치료를 위한 SLIT2-ROBO2 신호전달 경로의 타겟팅의 치료 가치의 동물 모델에서의 발명자 결과를 확인하고 지지하였다.
정상 신장에서, 유창 내피 세포, 기저막 및 족세포로 구성된 3층 사구체 모세관벽은 혈장 단백질에 대한 투과성을 제한한다. 족세포는 사구체 기저막의 외부 표면을 덮도록 1차 및 2차 돌기를 연장시키는 특화된 내피 세포이다. 이웃하는 족세포로부터의 액틴-풍부 깍지낌형 2차 돌기, 또는 족 돌기는 단백질 투과에 대한 최종 장벽을 형성하는 반-다공성 세극막에 의해 가교된 여과 세극을 생성한다. 족세포 세극막 단백질 예컨대 네프린 및 다른 것들의 유전적 돌연변이가 단백뇨 신장 질환의 유전적 형태와 관련되는 반면 (Tryggvason et al., 2006), 세극막을 이루고 이와 연관되는 단백질은 단순한 구조적 장벽 이상임이 분명해졌다. 이러한 단백질은 족세포 족 돌기 구조에 영향을 주고 F-액틴 세포골격과의 상호작용을 통해 작용할 수 있는 안정된 신호전달 네트워크를 형성한다 (Faul et al., 2007; Jones et al., 2006; Verma et al., 2006).
라운드어바웃(roundabout) (Robo) 패밀리 단백질, Robo1, Robo2, Robo3 및 Robo4는 분비된 리간드 Slit에 대한 세포 표면 수용체이다 (Dickson and Gilestro, 2006). Slit1, Slit2 및 Slit3은 본래 축색 궤적(axon pathfinding) 및 신경계 발생 동안의 뉴런의 이동을 위한 반발성 유도 신호(repulsive guidance cue)로서 발견되었다 (Guan and Rao, 2003). 막투과 단백질 Robo는 이의 세포외 도메인에 5 개의 Ig 모티프 및 3 개의 피브로넥틴 유형 III (FNIII) 반복단위를 함유한다 (Dickson and Gilestro, 2006). 면역글로불린 (Ig) 모티프 1 및 2 모두 Slit과 상호작용하는 한편, Robo의 제 1 Ig1 모티프는 Slit에 대한 주요 결합 부위이다 (Dickson and Gilestro, 2006). Robo의 세포내 도메인은 CC0, CC1, CC2, 및 CC3로 명명되는 4 개의 세포질 보존 (CC) 서열을 가진다 (Bashaw et al., 2000; Kidd et al., 1998; Morlot et al., 2007; Zallen et al., 1998). CC0 및 CC1은 티로신을 함유하고, 한편 CC2 및 CC3는 프롤린-풍부 스트레치(proline-rich stretch)이다. Slit-Robo 신호전달의 반발 활성은 액틴 중합을 억제하거나 (Guan and Rao, 2003) F-액틴 해중합을 유도한다 (Piper et al., 2006).
Slit-Robo 신호전달은 또한 초기 신장 유도 및 요관싹 성장(ureteric bud outgrowth) 동안 결정적 역할을 한다. Slit2 또는 Robo2가 결핍된 마우스 돌연변이는 과잉 요로싹(supernumerary ureteric bud)을 발생시키며, 이는 중복 신장을 포함하는 요로 표현형의 광범위-스펙트럼, 비정상적인 요관방광 연결(ureterovesical junction) 및 수신증을 초래한다 (Grieshammer et al., 2004; Lu et al. 2007). 인간에서 ROBO2의 파괴는 신장 및 요로의 선천성 기형 (CAKUT)을 야기하고, ROBO2의 점 돌연변이들은 방광 요관 역류 (VUR)를 가진 환자에게서 확인되었다 (Lu et al., 2007). 본 발명자의 최근 연구는 Robo2가 정상 요관구(ureteral orifice)의 형성 및 효과적인 항-역류 메커니즘의 유지를 위해 중요하다는 것을 증명한다 (Wang et al., 2011).
본원에서 본 발명자는 Robo2가 신장에서의 사구체 족세포의 기저면에서 발현되는 신규한 족세포 단백질이고 네프린 및 포도신과 공동-국재화된다는 것을 나타낸다. Robo2는 어댑터 단백질 Nck SH3 도메인과 직접적으로 상호작용하고 네프린과 복합체를 형성한다. Robo2 녹아웃 마우스가 변경된 족세포 족 돌기를 발달시키는 반면, Robo2의 손실은 네프린 널 마우스에서 보여지는 족 돌기 구조적 기형을 완화시킨다. 본원에 기술된 이러한 결과는 Robo2 신호전달이 족세포 족 돌기 구조에 영향을 주는 네프린 신호전달에 대해 음성 조절자로서 역할을 하는 것을 나타낸다. 게다가, 본원에서 입증된 바와 같이, 환자에게서 생성된 우성 음성 ROBO2 융합 단백질은 SLIT2-ROBO2 신호전달 경로를 차단하고 역류성 신증 및 단백뇨로부터 환자를 보호하는 것으로 발견되었고, 이에 따라 만성 신장 질환의 치료를 위한 SLIT2-ROBO2 신호전달 경로의 타겟팅의 치료 가치의 동물 모델에서의 본원에 기술된 결과를 확인하고 추가로 지지하였다.
따라서, 일부 양태에 있어서, 본원에서는 이를 필요로 하는 대상체에게 만성 신장 질환의 치료를 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 만성 신장 질환을 갖거나 위험이 있는 대상체에게 SLIT2-ROBO2 신호전달 경로 억제제를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 본원에서는, 일부 양태에 있어서, 단백뇨를 갖거나 위험이 있는 대상체에게 SLIT2-ROBO2 신호전달 경로 억제제를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에게 단백뇨의 감소를 위한 방법을 제공한다.
다른 양태에 있어서, 본원에서는 대상체에게서 신장 질환을 방지하거나 예방을 촉진하도록 대상체에게 SLIT2-ROBO2 신호전달 경로 억제제를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에 있어서 신장 질환을 방지하거나 신장 질환의 예방을 촉진하기 위한 방법을 제공한다.
또한 본원에서는, 일부 양태에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체에게서 신장 질환의 영향을 완화시키고, 신장 질환의 심각성을 감소시키고, 신장 질환의 발달 가능성을 감소시키고, 및/또는 신장 질환의 진행을 늦추기 위한 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ROBO2"는 하기의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서 지칭된다:
Figure 112014073912652-pct00001
(Homo sapiens roundabout homolog 2 isoform ROBO2a; 서열번호 1), 예를 들어, NP_001122401.1에 의해 기술되고 NM_001128929.2(서열번호 2)에 의해 암호화된 바와 같음; 또는
Figure 112014073912652-pct00002
(Homo sapiens roundabout homolog 2 isoform ROBO2b; 서열번호 3), 예를 들어, NP_002933.1에 의해 기술되고 NM_002942.4(서열번호 4)에 의해 암호화된 바와 같음, 또한 임의의 자연 발생된 대립형질, 스플라이스 변이체, 및 이의 프로세싱된 형태를 가짐. 전형적으로, ROBO2는 인간 ROBO2를 지칭한다. ROBO2 유전자는 침팬지, 붉은털 원숭이, 개, 소, 마우스, 쥐, 닭, 제브라피쉬, 초파리, 모기, 및 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 보존되어 있다. ROBO2의 특이적 잔기는, 예를 들어, "ROBO2(30)"으로서 지칭될 수 있다.
ROBO2의 특이적 도메인은 또한 이러한 명명법에 의해 지칭될 수 있다. 5 개의 면역글로불린 모티프 및 3 개의 피브로넥틴 유형 III(FNIII) 반복단위를 포함하는, N-말단 또는 "ROBO2의 세포외 도메인"은 예를 들어 서열번호 1의 ROBO2(46-848) 또는 서열번호 3의 ROBO2(30-832)로서 지칭될 수 있다. Slit2와 상호작용하는, 면역글로불린 (Ig) 모티브 1 및 2, 또는 "Ig SLIT 결합 도메인"은 서열번호 1의 각각 ROBO2(46-145) 및 ROBO2(151-237), 및 서열번호 3의 각각 ROBO2(30-129) 및 ROBO2(135-221)로서 지칭될 수 있다. 유사하게는, 본원에 기술된, 4 개의 세포내 프롤린 풍부 모티프를 포함하는, "Nck 세포내 결합 도메인"을 포함하는, "세포내 도메인"은 서열번호 3의 ROBO2(881-1378)로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ROBO2 억제제", "ROBO2 길항제", "ROBO2 억제 작용제", 및 "ROBO2 길항 작용제"는 ROBO2 신호전달에 의해 매개되는 다운스트림 경로의 활성, 예컨대, 어댑터 단백질 Nck와의 ROBO2 상호작용 및/또는 네프린과의 복합체 형성, 네프린-매개 액틴 중합의 SLIT2-ROBO-2 매개 억제, 및/또는 ROBO2에 대한 세포 반응의 유도를 포함하는, 생체외, 인시츄, 및/또는 생체내 ROBO2 (포유동물, 예컨대 인간, ROBO2) 생물학적 활성을 유의하게 차단, 억제, 감소, 또는 방해하는 분자 또는 작용제를 지칭한다. ROBO2 억제제와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "작용제(agent)"는 임의의 화합물 또는 물질 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 펩티드, 약물, 이온 등을 의미한다. "작용제"는, 제한 없이, 합성 및 자연-발생적 단백질성 또는 비-단백질성 독립체를 포함하는, 임의의 화학적, 독립체(entity) 또는 모이어티(moiety)일 수 있다. 본원에 기술된 양태의 일부 실시형태에 있어서, 작용제는 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 항체, 펩티드, 압타머, 핵산의 올리고머, 아미노산, 또는 탄수화물이고, 제한 없이, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNA효소, 당단백질, 안티센스 RNA, siRNA, 리포단백질, 압타머, 및 이의 변형체 및 조합 등을 포함한다. 본원에 기술된 치료적 조성물 및 방법에 사용되는 화합물은 바람직한 활성 및/또는 특성을 가지는 것으로 알려져 있을 수 있고, 또는 당업자 중 일인에게 알려진 스크리닝 방법을 사용하여, 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
본원에 기술된 다양한 양태 및 실시형태에서 사용하기 위해 고려될 수 있는 예시적인 ROBO2 억제제는, 이에 제한되지 않지만, 안티-ROBO2 항체 또는 ROBO2에 특이적으로 결합하는 이의 항원-결합 절편; ROBO2 (예를 들어, ROBO2a 또는 ROBO2b 또는 둘 모두)를 암호화하는 핵산을 겨냥한 안티-센스 분자; ROBO2 (예를 들어, ROBO2a 또는 ROBO2b 또는 둘 모두)를 암호화하는 핵산을 겨냥한 짧은 간섭 RNA ("siRNA") 분자; ROBO2와 결합되고, ROBO2 매개 신호전달을 억제/감소/차단하는 RNA 또는 DNA 압타머; ROBO2 구조 유사체; 및 가용성 ROBO2 단백질, 억제 폴리펩티드, 예를 들어, 우성 음성 폴리펩티드, 또는 이의 융합 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 기술된 이러한 양태 및 모든 이러한 양태의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 절편)은 ROBO2와 결합하고 (이와 물리적으로 상호작용함), 다운스트림 ROBO2 신호전달을 타겟팅하고, 및/또는 ROBO2 합성, 생성 또는 방출을 억제한다 (감소시킨다). 본원에 기술된 이러한 양태 및 모든 이러한 양태의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 결합하고 SLIT 단백질 리간드, 예컨대 SLIT2와의 이의 결합을 방지한다. 본원에 기술된 이러한 양태 및 모든 이러한 양태의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 하나 이상의 ROBO2 동형단백질(isoform)의 발현 (즉, 전사 또는 번역)을 특이적으로 감소시키거나 제거한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, ROBO2 억제제 또는 길항제는 ROBO2 억제제의 부재시 활성 또는 발현 수준에 대하여 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 그 이상으로 세포 (예를 들어, 족세포)에서의 ROBO2의 활성 및/또는 발현을 감소시키는 능력을 가진다.
따라서, 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 ROBO2 매개 신호 전달을 억제한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 어댑터 단백질 Nck와의 ROBO2 상호작용 및/또는 네프린과의 복합체 형성, 네프린-매개 액틴 중합의 SLIT2-ROBO-2 매개 억제, 및/또는 ROBO2에 대한 세포 반응의 유도를 타겟팅한다.
본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 결합 부위는, ROBO2 리간드 상호작용 부위, 예컨대 SLIT2 리간드 상호작용 부위를 겨냥한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 결합 부위는, ROBO2 어댑터 상호작용 부위 예컨대 Nck 상호작용 부위 또는 Nck 세포내 결합 도메인 (ROBO2의 4 개의 세포내 프롤린 풍부 모티프를 포함함)을 겨냥한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제의 결합 부위는, 수용체 (예를 들어, ROBO2)와 이의 리간드 (예를 들어, SLIT2)의 상호작용에 대한 입체 장애를 제공하기 위해, 리간드 상호작용 부위의 근접한 타겟 상의 부위를 겨냥한다. ROBO2 리간드 상호작용 부위에 결합함으로써, 본원에 기술된 ROBO2 억제제는 ROBO2의 활성 또는 발현, 및 다운스트림 ROBO2 신호전달 결과 (예를 들어, 어댑터 단백질 Nck와의 ROBO2 상호작용 및/또는 네프린과의 복합체 형성, 네프린-매개 액틴 중합의 SLIT2-ROBO-2 매개 억제, 및/또는 ROBO2에 대한 세포 반응의 유도)를 감소시키거나 억제할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제의 결합 부위는 ROBO2, 즉 예를 들어 서열번호 1의 각각의 ROBO2(46-145) 및 ROBO2(151-237), 및 서열번호 3의 각각의 ROBO2(30-129) 및 ROBO2(135-221)의, 적어도 Ig1, 및 바람직하게는 Ig1 및 Ig2 부위 둘다를 차단하거나 타겟팅한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제의 결합 부위는 Nck 세포내 결합 도메인을 포함하는 ROBO2 세포내 도메인, 즉 서열번호 3의 ROBO2(881-1378)을 차단하거나 타겟팅한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제의 결합 부위는 ROBO2의 4 개의 세포내 프롤린 풍부 모티프를 포함하는 ROBO2 Nck 세포내 결합 도메인을 차단하거나 타겟팅한다. 이는 본 기술분야에 주지된 다양한 수단, 예컨대 항체 및 이의 항원-결합 절편, 억제제 RNA 등에 의해 그리고 본원에 기술된 바와 같이 달성될 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 ROBO2와 선택적으로 결합되거나 물리적으로 상호작용하는 항체 또는 이의 항원-결합 절편이다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 ROBO2와 결합되는 항체 또는 항원-결합 절편이고 Nck와의 상호작용 및/또는 네프린과의 복합체 형성을 억제하고 및/또는 차단하고 및/또는 방지한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 ROBO2의 Ig SLIT 결합 도메인에 결합된다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 ROBO2의 Ig1SLIT 결합 도메인 또는 ROBO2의 Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인 둘다, 즉, 서열번호 1의 각각의 ROBO2(46-145) 및 ROBO2(151-237), 및 서열번호 3의 각각의 ROBO2(30-129) 및 ROBO2(135-221)에 결합된다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 ROBO2 세포내 도메인, 즉, 서열번호 3의 ROBO2(881-1378)에 결합하거나 차단한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 ROBO2의 4 개의 세포내 프롤린 풍부 모티프를 포함하는 Nck 세포내 결합 도메인에 결합하거나 차단한다.
ROBO2에 대해 특이적이거나 선택적으로 결합되고, 본원에 기술된 조성물에서의 사용 및 방법을 실행하는데 적합한 항체는 바람직하게는 단일클론이고, 이에 제한되지 않지만, 단일 사슬 항체, Fab 절편, F(ab') 절편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성되는 절편 및/또는 상기 중 임의의 것의 결합 절편을 포함하는, 인간, 인간화된 또는 키메라 항체를 포함할 수 있다. 항체는 또한 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역적 활성부분, 즉 항원 또는 타겟 결합 부위 또는 "항원-결합 절편"을 함유하는 분자를 지칭한다. 본원에 기술된 면역글로불린 분자는 당업자에게 이해되는 바와 같은, 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 ROBO2 억제제는 단일클론 안티-ROBO2 항체 또는 항원-결합 절편이다.
본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 ROBO2 억제제는 ROBO2 항체 절편 또는 항원-결합 절편이다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체 절편", "항원 결합 절편", 및 "항체 유도체"는 일반적으로 완전 항체의 항원 결합 부위를 포함하고 이에 따라 항원을 결합하는 능력을 보유하는 완전 항체의 일부만을 포함하는 단백질 절편을 지칭한다. 용어 항체 절편 또는 항원-결합 절편으로 포함되는 항체 절편의 예는 하기를 포함한다: (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 가지는 Fab 절편; (ii) CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 절편인 Fab' 절편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 절편; (iv) VH 및 CH1 도메인 및 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 절편; (v) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 절편; (vi) VH 도메인 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 절편 (Ward et al ., Nature 341, 544-546 (1989)); (vii) 분리된 CDR 영역; (viii) F(ab')2 절편, 경첩 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2 개의 Fab' 절편을 포함하는 2가의 절편; (ix) 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어, 단일 사슬 Fv; scFv) (Bird et al ., Science 242:423-426 (1988); 및 Huston et al ., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) 동일한 폴리펩티드 사슬에서 경사슬 가변 도메인 (VL)에 연결되는 중사슬 가변 도메인 (VH)를 포함하는 2 개의 항원 결합 부위를 가지는 "디아바디(diabody)" (예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); (xi) 상보적인 경사슬 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는, 한 쌍의 탠덤 Fd 세그먼트(tandem Fd segment) (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체" (Zapata et al . Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); 및 미국특허번호 5,641,870); 및 상기 중 임의의 것의 변형된 형태 (예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜) 또는 다른 적합한 중합체의 공유 결합에 의해 변형됨).
본 발명에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제 또는 길항제는 ROBO2 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 키메라 항체 유도체이다.
본원에 기술된 ROBO2 억제제 또는 길항제 항체 및 이의 항원-결합 절편은 또한, 일부 실시형태에 있어서, 인간화 항체 유도체일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 ROBO2 억제제 또는 길항제 항체 및 이의 항원-결합 절편은, 즉, 항체에의 임의의 유형의 분자의 공유 결합에 의해 변형된 유도체를 포함하고, 단 그 공유 결합은 항체가 타겟 항원, 예를 들어 ROBO2에 결합하는 것을 방해하지 않는 것을 전제로 한다.
본 발명에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 인간 환자의 치료법에 특히 바람직한 전 인간 항체가 사용된다.
본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 예를 들어 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 이들 둘다, 또는 이의 관련 도메인과 같은 ROBO2를 암호화하는 핵산을 타겟팅함으로써 특별한 기능적 ROBO2의 발현을 차단하거나 감소시킬 수 있는 하나 이상의 안티센스 분자를 포함한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 안티센스 분자는 ROBO2의 Ig SLIT 결합 도메인을 암호화하는 핵산을 타겟팅한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 안티센스 분자는 ROBO2의 Ig1 SLIT 결합 도메인 또는 ROBO2의 Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인 둘다를 암호화하는 핵산을 타겟팅한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 안티센스 분자는 ROBO2 세포내 도메인을 암호화하는 핵산을 타겟팅한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 안티센스 분자는 ROBO2의 4 개의 세포내 프롤린 풍부 모티프를 포함하는 Nck 세포내 결합 도메인을 암호화하는 핵산을 타겟팅한다. 다른 폴리뉴클레오티드와 교차-반응 없이 ROBO2 mRNA와 특이적으로 결합할 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자의 제조를 위한 방법은 당업자에게 알려져 있다. 타겟팅의 예시적인 부위는, 이에 제한되지 않지만, 개시 코돈, 5' 조절 영역, 프로모터(promoter) 또는 인핸서(enhance)를 포함함, 암호화 서열, 임의의 보존된 공통 영역(conserved consensus region)을 포함함, 및 3' 비번역 영역을 포함한다. 본원에 기술된 이러한 양태 및 모든 이러한 양태의 일부 실시형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이에 있어 약 10 내지 약 100 개의 뉴클레오티드, 길이에 있어 약 15 내지 약 50 개의 뉴클레오티드, 길이에 있어 약 18 내지 약 25 개의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다. 특정 실시형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레아제 저항성 등을 증가시키는 화학적 변형, 예컨대 당업자에게 알려진 포스포로티오에이트 연결 및 2'-O-당 변형을 추가로 포함한다.
본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 ROBO2의 두 동형단백질, 예를 들어 서열번호 2 또는 서열번호 4, 또는 이의 관련 도메인을 암호화하는 핵산을 타겟팅함으로써 기능적 ROBO2의 발현을 차단하거나 감소시킬 수 있는 하나 이상의 짧은 간섭 RNA (siRNA) 분자를 포함한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 siRNA 분자는 ROBO2의 Ig SLIT 결합 도메인을 암호화하는 핵산을 타겟팅한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 siRNA 분자는 ROBO2의 Ig1 SLIT 결합 도메인 또는 ROBO2의 Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인 둘다를 암호화하는 핵산을 타겟팅한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 siRNA 분자는 ROBO2 세포내 도메인을 암호화하는 핵산을 타겟팅한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 siRNA 분자는 ROBO2의 4 개의 세포내 프롤린 풍부 모티프를 포함하는 Nck 세포내 결합 도메인을 암호화하는 핵산을 타겟팅한다. 다른 폴리뉴클레오티드와 교차-반응 없이 ROBO2 mRNA를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA 분자를 제조하는 것은 일상적인 것이다. 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용되기 위한 siRNA 분자는 본 기술분야에 알려진 방법에 의해, 예컨대 통상적인 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 만들어질 수 있고, 종종 siRNA 작용제의 반감기 및/또는 효능을 증가시키기 위한, 및/또는 보다 강한 전달 제형을 가능하게 하는 화학적 변형을 포함할 것이다. 대안적으로, siRNA 분자는 siRNA의 세포내 전사를 위한 발현 카세트를 암호화하는 벡터를 사용하여 전달된다.
본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 ROBO2의 하나 이상의 동형단백질에 결합하는 RNA 또는 DNA 압타머이다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제 또는 길항제는 ROBO2에 결합하거나 물리적으로 상호작용하고, ROBO2와 리간드 또는 어댑터 분자, 예를 들어 SLIT2 또는 Nck 각각과의 사이에서의 상호작용을 차단하는 RNA 또는 DNA 압타머이다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO-2 억제제 또는 길항제는 ROBO2에 결합하거나 물리적으로 상호작용하고, 다운스트림 ROBO2 신호, 예컨대 네프린-매개 액틴 중합의 SLIT2-ROBO-2 매개 억제, 및/또는 ROBO2에 대한 세포 반응의 유도를 감소, 지연, 또는 차단하는 RNA 또는 DNA 압타머이다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, RNA 또는 DNA 압타머는 ROBO2의 Ig SLIT 결합 도메인과 결합하거나 물리적으로 상호작용한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, RNA 또는 DNA 압타머는 ROBO2의 Ig1 SLIT 결합 도메인 또는 ROBO2의 Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인 둘다, 즉 서열번호 1의 각각의 ROBO2(46-145) 및 ROBO2(151-237), 및 서열번호 3의 각각의 ROBO2(30-129) 및 ROBO2(135-221)와 결합되거나 물리적으로 상호작용한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, RNA 또는 DNA 압타머는 ROBO2 세포내 도메인, 즉 서열번호 3의 ROBO2(881-1378) 에 결합하거나 물리적으로 상호작용한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, RNA 또는 DNA 압타머는 ROBO2의 4 개의 세포내 프롤린 풍부 모티프를 포함하는 Nck 세포내 결합 도메인과 결합하거나 물리적으로 상호작용하거나 차단한다.
본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 이에 제한되지 않지만, 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 가용성 펩티드, 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물을 포함하는, ROBO2를 타겟팅하거나 결합하는 소분자 화합물 또는 작용제이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "소분자"는 이에 제한되지 않지만, 펩티드, 펩티도미메틱, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 압타머, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 약 10,000 g/mole 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물 (예를 들어, 잡종유기(heterorganic) 및 유기금속 화합물을 포함함), 약 5,000 g/mole 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 1,000 g/mole 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 500 g/mole 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 약학적으로 허용가능한 다른 형태를 포함할 수 있는 화학작용제를 지칭한다. 소분자 결합의 예시적인 부위는, 이에 제한되지 않지만, SLIT2 또는 어댑터 Nck, 즉 ROBO2의 Ig1 SLIT 결합 도메인 또는 ROBO2의 Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인 둘다, ROBO2 세포내 도메인 또는 ROBO2의 4 개의 세포내 프롤린 풍부 모티프를 포함하는 Nck 세포내 결합 도메인에 결합하는 ROBO2의 부분을 포함한다.
본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제 또는 길항제는 ROBO2에 결합하고 ROBO2 생물학적 활성을 억제하는 소분자를 포함한다.
본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제 또는 길항제는 하나 이상의 ROBO2 구조 유사체, 예컨대 우성 음성 ROBO2 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 ROBO2 구조 유사체는 생리학적 조건 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 하에 SLIT2 및/또는 Nck에 결합하고, ROBO2의 그것의 부분과 유사한 삼차원 구조를 가지는 화합물을 지칭하고, 상기 결합은 ROBO2 생물학적 활성, 예컨대 네프린-매개 액틴 중합의 SLIT2-ROBO2 매개 억제, 및/또는 ROBO2에 대한 세포 반응의 유도를 적어도 부분적으로 억제한다. 적합한 ROBO2 구조 유사체는 예를 들어, ROBO2-SLIT2 결합의 분자 모델링을 통해 설계되고 합성될 수 있다. ROBO2 구조 유사체는 개선된 친화도 및 생물학적 효과를 얻기 위해 동일하거나 상이한 구조의 임의의 바람직한 조합의 모노머, 다이머, 또는 고차 멀티머일 수 있다.
본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제 또는 길항제는 하나 이상의 가용성 ROBO2 수용체 또는 이의 융합 폴리펩티드, 예컨대 ROBO2 억제 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제 폴리펩티드는 우성 음성 ROBO2 융합 단백질이다. 본원에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제 폴리펩티드는 ROBO2 세포외 도메인, 예를 들어, 세포내 ROBO2 도메인을 갖지 않는, ROBO2의 Ig1 SLIT 결합 도메인 또는 ROBO2의 Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인 둘다를 포함한다.
본원에 기술된 조성물 및 방법에 사용되기 위한 ROBO2 억제제 또는 길항제는 본 기술분야에 알려진 방법, 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 실시예에서 본원에 기술된 것을 포함하여 본 기술분야에 익히 알려진, 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석법, 및 세포-기반 분석을 사용하여 확인되거나 특징규명될 수 있다.
예를 들어, ROBO2와 이의 리간드, 예를 들어 SLIT2 간의 상호작용을 억제하는 분자를 확인하기 위해, 결합 분석법이 사용될 수 있다. 예를 들어, ROBO2 또는 SLIT은 공유 또는 비-공유 결합에 의해 마이크로타이터 플레이트에 고정된다. 상기 분석법은 시험 작용제의 존재 또는 부재 하에, 고정된 성분에, 검출가능한 라벨에 의해 라벨링될 수 있는 비-고정된 성분 (리간드 또는 수용체)를 첨가함으로써 수행된다. 반응의 완료시, 미-반응된 성분을 제거하고 결합 복합체가 검출된다. 결합 복합체의 형성이 시험 작용제의 존재에 의해 억제되는 경우, 그 시험 작용제는 예를 들어 ROBO2와 SLIT2 사이의 결합을 억제하는 후보 길항제로 여겨질 수 있다. 세포-기반 또는 멤브레인-기반 분석법도 ROBO2 억제제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, ROBO2 유전자 발현의 수준을 검출하고/하거나 측정함으로써, ROBO2 유전자 발현을 억제하는 ROBO2 억제제 분자가 시험될 수 있다. ROBO2 유전자 발현은 다양한 방법, 예컨대 실시간 RT-PCR, 효소-결합 면역흡수 분석법 ("ELISA"), 노던 블러팅법, 또는 유세포분석에 의해 그리고 당업자에게 알려져 있는 바에 따라 검출되고/되거나 측정될 수 있다.
이와 같이 확인된 ROBO2 억제제는 만성 신장 질환의 생체내 동물 모델, 예컨대 사구체 및 간질성 손상 모델 (예를 들어, NZB, (NZB x NZW) F1 하이브리드 (NZB/W로 명명됨), 및 이의 유사유전자형 유도체, MRL/lpr 및 BXSB 유형의 마우스를 포함하는, 루프스 신염의 동물 모델), 노화의 동물 모델 (예를 들어, 노화된 Sprague Dawley 래트 및 노화된 C57BL/6 마우스); 자연발생 고혈압 래트 (SHR); Buffalo/mna 래트, 이는 인간 특발성 신증후군의 모델임; Munich Wistar Froemter (MWF) 래트, 이는 성인의 고혈압 및 소금 민감성으로 발전하는 성향이 있는 네프론 수에 있어서의 선천적 장애에 관련되는 유전자 모델임; 1차 족세포-특이적 유전자 FSGS 모델; HIV-연관 신병증 (HIVAN) 유전자 이식 마우스 모델; 알포트 증후군(Alport syndrome)의 동물 모델, 이는 유형 IV 콜라겐의 α3, α4, 또는 α5 사슬(COL4A3, COL4A4, 및 COL4A5)의 돌연변이를 포함함; 면역-유도 모델, 예컨대 Thy-1 신장염 모델, 이는 메산지움증식성 사구체신염 (MsPGN)의 실험쥐 모델임, 항-사구체 기저막 (GBM) 모델; 및 비-면역 유도 모델을 사용하여 추가로 시험될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, ROBO2 억제제와 관련하여, "선택적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "에 대해 특이적인"은 예를 들어, 타겟에, 즉 ROBO2에 KD 10-5 M (10000 nM) 이하, 예를 들어 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 또는 10-12 M 이하로 결합하는 본원에서 사용되는 ROBO2 억제제, 예컨대 ROBO2 길항제 항체 또는 이의 ROBO2 항원-결합 절편의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기술된 ROBO2 억제제/길항제가 관련된 분자, 예컨대 다른 ROBO 패밀리 멤버가 아닌 ROBO2에 10-5 M 이하의 KD로 결합되는 경우, 상기 작용제가 ROBO2에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다. 예를 들어, 특이적 결합은 예를 들어, ROBO2 억제제/길항제 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 친화도 및 결합능(avidity) 및 폴리펩티드 작용제의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 당업자는 본원에 기술된 폴리펩티드 작용제가 임의의 적합한 방법, 예컨대 적합한 세포 결합 분석법에서의 폴리펩티드 작용제의 적정을 사용하여 타겟을 선택적으로 결합하는 적절한 조건을 결정할 수 있다.
ROBO2 활성의 억제에 의한 만성 신장 질환의 치료 방법과 관련하여, 용어 "만성 신장 질환" 또는 CKD는, 네프론의 점진적 손상 및 신기능의 그로 인한 손상에 기인하여 시간에 따라 서서히 그리고 점진적으로 악화되는 신장병을 지칭한다. 초기 단계에서, 증상이 없을 수 있다. 기능의 손상은 일반적으로 발생되는데 수개월 또는 수년이 걸린다. 이는 매우 느려 증상은 신장 기능이 정상의 십분의 일 미만일 때까지 나타나지 않을 수 있다. 만성 신장 질환의 최종 단계는 말기 신장질환 (ESRD)으로 일컬어진다. 이 단계에서, 신장은 더 이상 신체로부터의 충분한 노폐물 및 과량의 유체를 제거할 수 없다. 환자는 투석 또는 신장 이식이 요구된다. 당뇨병성 신장질환을 초래하는 당뇨병, 및 고혈압은 만성 신장 질환의 2 개의 가장 일반적인 원인이고 대부분의 경우를 차지한다. 신장을 손상시키고 만성 신장 질환을 초래할 수 있는 다른 질환 및 질병은 하기를 포함한다: 자가면역 장애 (예컨대 전신성 홍반성 루푸스 및 경피증); 신장의 선천성 결함 (예컨대 다낭성 신장 질환); 특정 독성 화학물질; 사구체신염; 상처 또는 외상; 신장 결석 및 감염; 신장에 또는 신장 내부로 유도하는 동맥의 문제; 몇몇 진통제 및 다른 약물 (예컨대 항암 약물); 역류성 신증 (이에서 신장은 신장으로의 소변의 역류에 의해 손상됨); 등. 본원에서 사용되는 "단백뇨"는 소변에서의 과량의 혈청 단백질의 존재를 지칭한다. 단백뇨는, 일부 실시형태에 있어서, 신장 질환을 나타내지만 그 자체로 결정적인 것은 아니다.
따라서, 본원에 기술된 이러한 양태 및 모든 이러한 양태의 일부 실시형태에 있어서, 만성 신장 질환을 갖거나 위험이 있는 대상체는 당뇨병성 신장질환을 가진다.
본원에 기술된 만성 신장 질환 및 단백뇨 치료 방법과 관련하여 "감소" 또는 "억제"는 만성 신장 질환의 주어진 파라미터 또는 증상에 대해, 바람직하게는 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 전체적 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 예를 들어, 감소 및 억제는 치료되는 장애, 예를 들어 고혈압, 소변에서의 단백질 등의 증상과 관련될 수 있다.
고혈압은 거의 항상 만성 신장 질환의 모든 단계 동안 존재한다. 신경계 시험은 신경 손상의 징후를 나타낼 수 있다. 의료인은 청진기로 듣는 경우 비정상 심장 또는 폐 소리를 들을 수 있다. 만성 신장 질환의 초기 증상은 또한 다른 병의 증상이다. 이러한 증상은 상기 질병이 보다 진전될 때까지 신장 질환의 유일한 징후일 수 있다. 만성 신장 질환의 증상은 하기를 포함할 수 있다: 식욕 부진; 일반적인 병감 및 피로; 두통; 가려움 (소양증) 및 건조한 피부; 메스꺼움; 체중 감소의 시도 없는 체중 감소; 등. 특히 신장 기능이 악화되는 경우 발전될 수 있는 다른 증상은 하기를 포함한다: 비정상적인 어둡거나 밝은 피부; 골통; 뇌 및 신경계 증상; 나른함 및 혼란; 집중하거나 생각하는 문제; 손, 발, 또는 다른 부분의 무감각; 근육 긴축 또는 경련; 입 냄새; 간단한 타박상, 출혈, 또는 대변에서의 피; 과도한 갈증; 빈번한 딸국질; 낮은 수준의 성적 흥미 및 발기부전; 월경 기간의 정지 (무월경); 숨가쁨; 수면 문제, 예컨대 불면증, 하지 불안 증후군, 및 폐쇄성 수면무호흡증; 발과 손의 종창 (부종); 전형적으로 아침에서의 구토.
따라서, 본원에 기술된 방법의 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 ROBO2 억제제를 포함하는 유효량의 조성물은 만성 신장 질환의 증상을 완화시키기 위해 대상체에게 투여된다. 본원에서 사용되는 "만성 신장 질환 증상을 완화시킴"은 만성 신장 질환과 관련되는 임의의 질병 또는 증상을 개선하는 것이다. 대안적으로, 만성 신장 질환의 증상을 완화시키는 것은 만성 신장 질환을 앓고 있는 비치료된 대조군과 관련하여, 또는 치료하기 이전의 대상체와 관련하여 대상체에서 만성 신장 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것과 관련될 수 있다. 동등한 비치료된 대조군, 또는 ROBO2 억제제로 치료하기 이전의 대상체와 비교되는 바와 같이, 이러한 감소 또는 예방의 정도는, 임의의 표준 기술에 의해 측정된 바와 같이, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 그 이상이다. 바람직하게는, 만성 신장 질환은 본 기술분야에 알려진 임의의 표준 기술에 의해 검출됨에 따라 상당하게 감소되거나 검출되지 않을 수 있고, 이러한 경우 만성 신장 질환은 치료된 것으로 간주된다. 만성 신장 질환을 치료받는 환자는 의사가 이러한 질병을 갖는 것으로 진단한 사람이다. 진단은 당업자 중 일인에 대해 알려진 임의의 적합한 수단에 의할 수 있다. 진단 및 모니터링은, 예를 들어, 소변, 혈액, 또는 혈청 샘플에서의 특정 단백질 또는 분자, 예컨대, 알부민, 칼슘, 콜레스테롤, 전혈구 검사 (CBC), 전해질, 마그네슘, 인, 칼륨, 나트륨, 또는 이의 임의의 조합의 수준을 검출하는 것; 특정 기술 또는 절차, 예컨대 복부 CT 스캔, 복부 MRI, 복부 초음파, 신장 생검, 신장 스캔, 신장 초음파의 사용을 통한; 에리스로포이에틴, PTH에 대한 분석 또는 시험; 골밀도 시험, 또는 비타민 D; 또는 이러한 검출 방법 및 분석의 임의의 조합의 결과에서의 변화의 검출에 의한, 예를 들어, 크레아티닌 클리어런스; 크레아티닌 수준; BUN (혈중 요소 질소)을 검출하기 위한 분석법과 관련될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법과 관련되어 사용되는 용어 "대상체" 및 "개체"는은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 동물, 예를 들어 인간, 본원에 기술된 ROBO2 억제제의 수령체를 지칭한다. 용어 "비-인간 동물" 및 "비-인간 포유동물"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 포유동물 예컨대 쥐, 마우스, 토끼, 양, 고양이, 개, 소, 돼지, 및 비-인간 영장류를 포함한다. 용어 "대상체"는 또한 이에 제한되지 않지만, 포유동물, 파충류, 양서류 및 어류를 포함하는 임의의 척추동물을 포함한다. 그러나, 유리하게는, 대상체는 포유동물 예컨대 인간, 또는 다른 포유동물 예컨대 길들여진 포유동물, 예를 들어, 개, 고양이, 말 등이다.
본원에서 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ROBO2 억제제에 더하여 추가 치료제를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 추가 치료제는 ROBO2 억제제와 공동-투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "공동-투여함" 또는 "공동-투여하다"는 본원에 기술된 ROBO2 억제제 및 다른 화합물, 예를 들어 치료제를 자격증이 있는 의료인에 의해 결정된 기간 동안 별도로, 동시에, 및/또는 순차적인 투여를 의미한다.
몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 추가 치료제는 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB), 또는 무기질코르티코이드 수용체 (MR) 길항제이다.
본원에 기술된 ROBO2 억제제와 같이 사용하기 위한 ACE 억제제는, 이에 제한되지 않지만, 베나제프릴(benazepril) (LOTENSIN™으로서 미국에서 시판됨), 캅토프릴(captopril) (CAPOTEN™으로서 미국에서 시판됨), 에날라프릴/에날라프릴라트(enalapril/enalaprilat) (VASOTEC™으로서 미국에서 시판됨, 경구 및 주사용), 포시노프릴(fosinopril) (MONOPRIL™으로서 미국에서 시판됨), 리시노프릴(lisinopril) (ZESTRIL™ 및 PRINIVIL™으로서 미국에서 시판됨), 모엑시프릴(moexipril) (UNIVASC™으로서 미국에서 시판됨), 페린도프릴(perindopril) (ACEON™으로서 미국에서 시판됨), 퀴나프릴(quinapril) (ACCUPRIL™으로서 미국에서 시판됨), 라미프릴(ramipril) (ALTACE™으로서 미국에서 시판됨), 및 트란도라프릴(trandolapril) (MAVIK™으로서 미국에서 시판됨)를 포함한다. 본원에 기술된 ROBO2 억제제와 같이 사용하기 위한 ARB는 칸데사르탄(candesartan) (ATACAND™으로서 미국에서 시판됨), 이르베사르탄(irbesartan) (AVAPRO™으로서 미국에서 시판됨), 올메사르탄(olmesartan) (BENICAR™으로서 미국에서 시판됨), 로사르탄(losartan) (COZAAR™으로서 미국에서 시판됨), 발사르탄(valsartan) (DIOVAN™으로서 미국에서 시판됨), 텔미사르탄(telmisartan) (MICARDIS™으로서 미국에서 시판됨), 및 에프로사르탄(eprosartan) (TEVETEN™으로서 미국에서 시판됨)을 포함한다.
본원에 기술된 이 방법 및 모든 이 방법의 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ROBO2 억제제에 더하여 유효량의 이뇨제를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 이뇨제는, 이에 제한되지 않지만, 토르세미드 (DEMADEX™으로서 미국에서 시판됨), 푸로세미드 (LASIX™으로서 미국에서 시판됨), 부메타니드(bumetanide) (BUMEX™으로서 미국에서 시판됨), 에타크린산 (EDECRIN™으로서 미국에서 시판됨), 토르세미드 (torsemide) (DEMADEX™으로서 미국에서 시판됨), 아밀로라이드(amiloride) (MIDAMOR™으로서 미국에서 시판됨), 아세타졸아미드(acetazolamide) (DIAMOX™으로서 미국에서 시판됨), 파마브롬(pamabrom) (AQUA-BAN™으로서 미국에서 시판됨), 만니톨(mannitol) (ARIDOL™ 또는 OSMITROL™으로서 미국에서 시판됨), 트라임테렌(traimterene) (DYRENIUM™으로서 미국에서 시판됨), 스피로놀락톤(spironolactone) (ALDACTONE™으로서 미국에서 시판됨), 아밀로라이드(amiloride) (MIDAMOR™으로서 미국에서 시판됨), 인다파미드(indapamide) (LOZOL™으로서 미국에서 시판됨), 히드로클로로티아자이드(hydrochlorothiazide) (HYDRODIURIL™으로서 미국에서 시판됨), 메톨라존(metolazone) (ZAROXOLYN™ 또는 MYKROX™으로서 미국에서 시판됨), 메틸클로티아자이드(methylclothiazide) (AQUATENSEN™ 또는 ENDURON™으로서 미국에서 시판됨), 히드로클로로티아자이드(hydrocholorthiazide) (AQUAZIDE H™ 또는 ESIDRIX™ 또는 MICROZIDE™으로서 미국에서 시판됨), 클로로티아자이드(chlorothiazide) (DIURIL™으로서 미국에서 시판됨), 벤드로플루메티아자이드(bendroflumethiazide) (NATURETIN™으로서 미국에서 시판됨), 폴리티아자이드(polythiazide) (RENESE™으로서 미국에서 시판됨), 히드로플루메티아자이드(hydroflumethiazide) (SALURON™으로서 미국에서 시판됨), 및 클로르탈리돈(chlorthalidone) (THALITONE™으로서 미국에서 시판됨)을 포함한다. 전체 목록에 대해서는, 또한, 예를 들어, 문헌 [Physician's Desk Reference, 2012 Edition, PDR Network (2011)]도 참조할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, ROBO-2 억제제 또는 본원에 기술된 이의 복합 치료를 포함하는 임의의 조성물 및 방법과 관련하여, 용어 "치료하다", "치료", "치료함" 또는 "개선"은 치료법을 지칭하고, 이에서 목적은 질환 또는 장애와 관련된 질병의 발전 또는 심각성을 전환, 완화, 개선, 억제, 지연 또는 중지하는 것이다. 용어 "치료함"은 만성 신장 질환, 예컨대 이에 제한되지 않지만, 당뇨병성 신장질환과 관련된 질병, 질환 또는 장애의 하나 이상의 역효과 또는 증상을 감소시키거나 완화시키는 것을 포함한다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상 또는 임상적 마커가 감소되는 경우 일반적으로 "효과적이다". 대안적으로, 치료는 질환의 발전이 감소되거나 중지되는 "효과적이다". 즉, "치료"는 단지 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라 치료의 부재에서 예상될 것인 증상의 발전 또는 악화의 멈춤, 적어도 늦춤을 포함한다. 유익한 또는 바람직한 임상 결과는, 이에 제한되지 않지만, 하나 이상의 증상(들)의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 발전의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화(palliation), 및 (부분적 또는 전체적이던), 검출가능하던 검출불가능하던 차도를 포함한다. 질환의 용어 "치료"는 또한 질환의 증상 또는 부작용으로부터 경감 (완화 요법(palliative treatment)을 포함함)을 제공하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 치료되는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 완화하기 위해 요구되는, 본원에 기술된 ROBO-2 억제제의 양을 지칭하고, 바람직한 효과를 제공하기 위한 약학적 조성물의 충분한 양을 지칭한다. 용어 "치료적으로 유효한 양"은 따라서 본원에 기술된 방법을 사용하여, 통상적인 대상체에게 투여하는 경우 특정 효과를 제공하기에 충분한, 본원에 기술된 ROBO-2 억제제의 양을 지칭한다. 본원에 사용되는 유효량은 질환의 증상의 발달을 지연시키고, 질환의 증상의 발달을 변경하고 (예를 들어 이에 제한되지 않지만, 질환의 증상의 진척을 늦추고), 또는 질환의 증상을 반전시키기에 충분한 양을 포함할 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 명시하는 것이 불가능하다. 그러나, 임의의 특정 경우에 대해, 적절한 "유효량"은 단지 일상 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
유효량, 독성, 및 치료적 효능은, 예를 들어 LD50 (구성원의 50%에 대한 치사량) 및 ED50 (구성원의 50%에서 치료적으로 유효한 투여량)을 결정하기 위한, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 이용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 변화할 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 투여 비율은 치료적 지표이고 비율 LD50/ED50로서 표현될 수 있다. 큰 치료적 지수(therapeutic indice)를 나타내는 조성물 및 방법이 바람직하다. 치료적으로 유효한 투여량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 산정될 수 있다. 또한, 투여량은 세포 배양, 또는 적절한 동물 모델에서 결정된 IC50 (즉, 측정된 기능 또는 활성의 1/2-최대 억제를 달성하는, 본원에 기술된 ROBO-2 억제제의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 임의의 특정 투여량의 효과는 적합한 생물학적 검정에 의해 모니터링될 수 있다. 투여량은 의사에 의해 결정되고, 필요에 따라 치료의 관찰된 효과를 맞추기 위해 조정될 수 있다. 만성 신장 질환의 유형 및 심각성에 따라, 본원에 기술된 ROBO2 억제제 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg (예를 들어, 0.1-20 mg/kg)이 예를 들어 하나 이상의 별도의 투여에 의한 것이든, 또는 연속 주입에 의한 것이든 대상체에 대한 투여를 위한 초기 후보 투여량 범위이다.
투여의 방식
본원에 기술된 ROBO2 억제제 또는 이의 병행 치료는 대상체에게 효과적인 치료를 야기하는 임의의 적합한 루트로 이의 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여함", 및 "도입함"은 상호교환적으로 사용되고 바람직한 효과(들)이 일어나도록, 바람직한 부위에 이러한 작용제의 적어도 부분적 국재화(partial localization)를 야기하는 방법 또는 경로에 의한 ROBO-2 억제제의 대상체에게로의 배치를 지칭한다.
일부 실시형태에 있어서, ROBO2 억제제는 작용제를 전신적으로 또는 원하는 표면 또는 타겟으로 전달하고, 이에 제한되지 않지만, 주사, 주입, 점적주사, 및 흡입 투여를 포함할 수 있는 임의의 투여 방식에 의해 만성 신장 질환을 가지는 대상체에게 투여된다. 폴리펩티드 작용제가 소화기관에서의 불활성화로부터 보호될 수 있는 경우, 경구 투여 형태가 또한 고려된다. "주사"는, 이에 제한되지 않지만, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추관, 심실내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 피하내, 관절내, 피막하, 지주막, 척수강, 뇌척수내(intracerebro spinal), 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 ROBO-2 억제제는 정맥내 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
본원에서 사용되는 문구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여됨"은 통상적으로 주사에 의한 장관 및 국소 투여 이외 투여 방식을 지칭한다. 본원에서 사용되는 문구 "전신 투여", "전신적으로 투여됨", "말초정맥 투여" 및 "말초정맥으로 투여됨"은 대상체의 순환계로 들어가 신진대사 및 기타 다른 과정에 제공되도록, 타겟 부위, 조직, 또는 기관, 예컨대 종양 부위로의 직접적이지 않은 ROBO-2 억제제의 투여를 지칭한다.
본원에 기술된 방법의 임상적 사용을 위해, 본원에 기술된 ROBO-2 억제제의 투여는 비경구 투여, 예를 들어 정맥내; 점막, 예를 들어, 비강내; 안구, 또는 다른 투여 방식을 위한 약학적 조성물로 또는 약학적 제형으로의 제형화를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 ROBO-2 억제제는 대상체에게 효과적인 치료를 초래하는 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 화합물, 물질, 또는 조성물로 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 약학적 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 성분과 조합하여 본원에 기술된 ROBO-2 억제제를 함유할 수 있다.
문구 "약학적으로 허용가능한"은 적정한 이익/위험 비율에 순응하는, 과량의 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 이러한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 제형을 지칭한다. 본원에서 사용되는 문구 "약학적으로 허용가능한 담체"는 ROBO-2 억제제의 안정성, 가용성, 또는 활성을 유지하는 것과 관련되는, 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 매질, 캡슐화 물질, 제조 보조제 (예를 들어, 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용될 수 있고 환자에게 해롭지 않다는 의미에 있어서 "허용가능"해야 한다. 약학적으로-허용가능한 담체로서 역할을 할 수 있는 물질의 몇몇 예는 하기를 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스, 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트래거캔스; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스(suppository wax); (8) 오일, 예컨대 피넛 오일, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두유; (9) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (10) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG); (11) 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; (12) 한천; (13) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (14) 알긴산; (15) 파이로젠-무함유 물; (16) 등장액(isotonic saline); (17) 링거액; (19) pH 완충 용액; (20) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; (21) 증량제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산; (22) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (23) C2-C12 알코올, 예컨대 에탄올; 및 (24) 약학적 제형에 사용되는 기타 비-독성 상용 물질. 방출제, 코팅제, 보존제, 및 항산화제가 또한 제형에 존재할 수 있다. 용어 예컨대 "부형제", "담체", "약학적으로 허용가능한 담체" 등이 본원에 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용되는 ROBO-2 억제제는 대상체에게 고체, 액체 또는 젤 형태로의 화합물의 투여를 위해 특별하게 제형화될 수 있고, 하기를 위해 적용되는 것을 포함한다: (1) 예를 들어, 무균 용액 또는 현탁액, 또는 서방형 제형과 같은, 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여; (2) 예를 들어, 크림, 연고, 또는 피부에 적용되는 조절 방출형 패치 또는 스프레이와 같은 국소 적용; (3) 예를 들어, 페서리, 크림 또는 폼과 같은 질내 또는 직장내; (4) 안구; (5) 경피; (6) 점막관; 또는 (79) 비강. 추가적으로, ROBO-2 억제제는 환자에게 주입되거나 약물 전달 시스템을 이용하여 주사될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Urquhart, et al ., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981); 미국특허 번호 3,773,919; 및 미국특허 번호 35 3,270,960]을 참조한다.
본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는, 본원에 기술된 ROBO-2 억제제를 포함하는 조성물 및 제형의 추가의 실시형태 및 투여 방식은 하기에 기술된다.
비경구 제형. ROBO-2 억제제의 비경구 제형은 또한, 이에 제한되지 않지만, 피하, 정맥내 (볼루스 주사를 포함함), 근육내, 및 동맥내를 포함하는 다양한 경로에 의해 만성 신장 장애를 가진 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 제형의 투여는 오염물에 대한 환자의 선천적 방어(natural defense)를 우회하여야 하기 때문에, 비경구 제형은 바람직하게는 무균성이거나 환자에게의 투여에 앞서 살균될 수 있다. 비경구 제형의 예는, 이에 제한되지 않지만, 주사용 용액, 주사를 위한 약학적으로 허용가능한 비히클에 용해되거나 현탁될 수 있는 건조 제품, 주사용 현탁액, 조절-방출 비경구 제형, 및 에멀젼을 포함한다.
개시물의 비경구 제형을 제공하는데 사용될 수 있는 적합한 비히클은 당업자에게 익히 알려져 있다. 예는, 제한 없이, 하기를 포함한다: 멸균수; 주사 USP용 물; 식염수; 글루코스 용액; 수성 비히클 예컨대 이에 제한되지 않지만, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사액, 및 락트산 링거 주사액; 물-혼화성 비히클 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜; 및 비-수성 비히클 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 옥수수 오일, 면실유, 피넛 오일, 참기름, 에틸 올리에이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 ROBO2 억제제를 포함하는 조성물은, 예를 들어 별개의 제형, 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 정제 (제한 없이 분할 또는 코팅 정제를 포함함), 알약, 당의정, 캡슐, 저작성 정제, 분말 패킷, 약포, 트로키, 웨이퍼, 에어로졸 스프레이, 또는 액체, 예컨대 이에 제한되지 않지만, 시럽, 엘릭시르제, 수성 액체 중 용액 또는 현탁액, 비-수성 액체, 수중유 에멀젼, 또는 유중수 에멀젼으로서 경구 투여에 적합하도록 제형화된다. 이러한 조성물은 개시된 조성물의 약학적으로 허용가능한 염의 미리-정해진 양을 함유하고, 당업자에게 익히 알려진 약학 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton, Pa. (1990)]을 참조한다.
이들의 투여의 용이성에 기인하여, 정제 및 캡슐은 가장 유리한 고체 경구 투여 단위 형태를 대표하고, 이 경우 고체의 약학적 부형제가 사용된다. 바람직한 경우, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 코팅될 수 있다. 이러한 제형은 임의의 약학 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 약학적 조성물 및 제형은 균일하고 긴밀하게 활성 성분(들)과 액체 담체, 미세하게 분열된 고체 담체, 또는 이 둘 모두와 혼화하고, 이후 필요한 경우 원하는 외형으로 제품을 형성함으로써 제조된다. 일부 실시형태에 있어서, 경구 제형은 항생제에 대해 사용되지 않는다.
ROBO2 억제제의 유효량을 포함하는 조성물의 전형적인 경구 제형은 ROBO2 억제제의 약학적으로 허용가능한 염과 종래의 약학 조제 기술에 따른 하나 이상의 부형제와 긴밀하게 혼화하여 조합함으로써 제조된다. 부형제는 투여를 위해 바람직한 조성물의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 경구 액체 또는 에어로졸 제형에 사용하기에 적합한 부형제는, 이에 제한되지 않지만, 물, 글리콜, 오일, 알코올, 착향료, 보존제, 및 착색제를 포함한다. 고체 경구 제형에 사용하기에 적합한 부형제 (예를 들어, 분말, 정제, 캡슐, 및 당의정)는, 이에 제한되지 않지만, 전분, 당, 미세결정 셀룰로오스, 카올린, 희석제, 과립화제, 윤활제, 바인더, 및 붕해제를 포함한다.
본원에 기술된 약학적 제형에 사용되기에 적합한 바인더는, 이에 제한되지 않지만, 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 다른 전분, 젤라틴, 천연 및 합성 검 예컨대 아카시아, 나트륨 알지네이트, 알긴산, 다른 알지네이트, 분말화된 트래거캔스, 구아 검, 셀룰로오스 및 이의 유도체 (예를 들어, 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스), 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로오스, 호화 전분, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, (예를 들어, Nos. 2208, 2906, 2910), 미세결정 셀룰로오스, 및 이의 혼합물을 포함한다.
본원에 기술된 약학적 제형에 사용되기에 적합한 충전제의 예는, 이에 제한되지 않지만, 탈크, 탄산칼슘 (예를 들어, 과립 또는 분말), 미세결정 셀룰로오스, 분말화된 셀룰로오스, 덱스트레이트, 카올린, 만니톨, 규산, 소르비톨, 전분, 호화 전분, 및 이의 혼합물을 포함한다. 본원에 기술된 약학적 조성물에서의 바인더 또는 충전제는 통상적으로 약학적 조성물의 약 50 내지 약 99 중량%를 나타낸다.
붕해제는 수성 환경에 노출되는 경우 붕해되는 정제를 제공하기 위해 본원에 기술된 경구 약학적 제형에서 사용된다. 활성 성분(들)의 방출을 유해하게 변화화도록 너무 적거나 너무 많지 않은 붕해제의 충분한 양이 본원에 기술된 ROBO2 억제제의 고체 경구 제형을 형성하는데 사용되어야 한다. 사용되는 붕해제의 양은 제형의 유형에 기초하여 변화되고, 당업자에게 용이하게 구별될 수 있다. 경구 약학적 제형을 형성하기 위해 사용될 수 있는 붕해제는, 이에 제한되지 않지만, 한천, 알긴산, 탄산칼슘, 미세결정 셀룰로오스, 크로스카르멜로오스 나트륨, 크로스포비돈, 폴라크릴린 칼륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 다른 전분, 호화 전분, 클레이, 다른 알진, 다른 셀룰로오스, 검, 및 이의 혼합물을 포함한다.
본원에 기술된 ROBO2 억제제의 경구 약학적 제형을 형성하는데 사용될 수 있는 윤활제는, 이에 제한되지 않지만, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일, 경 미네랄 오일, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 글리콜, 스테아르산, 나트륨 라우릴 설페이트, 탈크, 수소첨가된 식물성 오일(hydrogenated vegetable oil) (예를 들어, 피넛 오일, 면실유, 해바라이유, 참기름, 올리브유, 옥수수 오일, 및 대두유), 아연 스테아레이트, 에틸 올리에이트, 에틸 라우레이트, 한천, 및 이의 혼합물을 포함한다. 추가적인 윤활제는, 예를 들어, 사일로이드 실리카 겔(syloid silica gel) (AEROSIL
Figure 112014073912652-pct00003
200, W. R. Grace Co. of Baltimore, Md.에 의해 제조됨) , 합성 실리카의 응고된 에어로졸 (Degussa Co. of Piano, Tex.에 의해 시판됨), CAB-O-SIL
Figure 112014073912652-pct00004
(Cabot Co. of Boston, Mass.에 의해 판매되는 발열성 이산화규소), 및 이의 혼합물을 포함한다. 전혀 사용되지 않는 경우, 윤활제는 통상적으로 이들이 포함되는 약학적 조성물 또는 제형의 약 1 중량% 미만의 양으로 사용된다.
다른 실시형태에 있어서, 락토오스-무함유 약학적 제형 및 제형이 제공되고, 이에서 이러한 조성물은 바람직하게는 임의의 경우 소량의 락토오스 또는 다른 단- 또는 이-당류를 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "락토오스-무함유"는, 설사 있다손 치더라도, 존재하는 락토오스의 양이 활성 성분의 분해 속도를 실질적으로 증가시키기에 불충한 것을 의미한다. 본 개시물의 락토오스-무함유 조성물은 본 기술분야에서 익히 알려진 부형제를 포함할 수 있고, 본원에 참조로서 포함된, USP (XXI)/NF (XVI)에서 열거되어 있다.
ROBO2 억제제의 경구 제형은, 일부 실시형태에 있어서, 물이 이 화합물의 분해를 촉진할 수 있기 때문에, 활성 성분으로서 본원에 기술된 ROBO2 억제제를 포함하는 무수 약학적 조성물 및 제형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 물 (예를 들어, 5%)의 추가는 특징 예컨대 경시적인 제형의 품질 수명 또는 안정성을 결정하기 위해 장기 저장을 시물레이션하는 수단으로서 약학적 기술분야에서 널리 받아들여지고 있다. 예를 들어, 문헌 [Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2nd ed., Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995)]을 참조한다. 본원에 기술된 무수 약학적 조성물 및 제형은 무수 또는 저수분 함유 성분 및 저수분 또는 저습도 조건을 사용하여 제조될 수 있다. 락토오스 및 1차 또는 2차 아민을 포함하는 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물 및 제형은 제조, 포장, 및/또는 저장 과정에서 수분 및/또는 습기와 실질적 접촉이 예상되는 경우 바람직하게는 무수성이다. 무수 조성물은 바람직하게는 적합한 처방 키트(formulary kit)에 포함될 수 있도록 물에 대한 노출을 방지하는 것으로 알려진 물질을 사용하여 포장된다. 적합한 포장의 예는, 이에 제한되지 않지만, 건조제, 블리스터 팩, 및 스트립 팩을 사용하거나 사용하지 않는 용봉한 포일(hermetically sealed foil), 플라스틱, 단위 투여 용기 (예를 들어, 유리병)을 포함한다.
에어로졸 제형. ROBO-2 억제제는 적합한 추진제(propellant), 예를 들어 통상의 보조제를 갖는 프로판, 부탄, 또는 이소부탄과 같은 탄화수소 추진제와 함께 가압된 에어로졸 용기에 포장될 수 있다. ROBO-2 억제제는 또한 연무기 또는 분무기와 같은 비-가압된 형태로 투여될 수 있다. ROBO-2 억제제는 또한 건조 분말의 형태로, 예를 들어, 흡입기의 사용에 의해, 기도로 직접적으로 투여될 수 있다.
적합한 분말 조성물은 실례로서 락토오스, 또는 기관지내 투여에 허용될 수 있는 다른 비활성 분말과 완전하게 혼합되는, ROBO-2 억제제의 분말화된 작용제를 포함한다. 분말 조성물은 에어로졸 용기를 통해 투여되거나, 캡슐을 타공하여 흡입에 적합한 연속적 흐름으로 분말을 불어넣는 장치로 대상체에 의해 삽입될 수 있는 파쇄성 캡슐에 감싸질 수 있다. 조성물은 추진체, 계면활성제, 및 보조-용매를 포함할 수 있고, 적합한 계측 밸브에 의해 폐쇄되는 종래의 에어로졸 용기에 충전될 수 있다.
기도에 전달하기 위한 에어로졸은 본 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Adjei, A. and Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. and Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995); Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract," in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990); Anderson et al ., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)) and have potential for the systemic delivery of peptides and proteins as well (Patton and Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:179-196 (1992)); Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); and Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4:26-29 (1994); French, D. L., Edwards, D. A. and Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996); Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)); Rudt, S. and R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y, and Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988); Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 10 1-20 1995); Patton, J. and Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8: 179-196 (1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990); Patton, J. S., et al ., Controlled Release, 28: 15 79-85 (1994); Damms, B. and Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al ., Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995); and Kobayashi, S., et al ., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996)]을 참조하고, 이의 모든 내용은 본원에 그 전문이 참조로 포함되어 있다.
본원에 기술된 ROBO-2 억제제의 제형은, 물이 일부 화합물의 분해를 촉진할 수 있기 때문에, 활성 성분으로서 개시된 화합물을 포함하는 무수 약학적 조성물 및 제형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 물 (예를 들어, 5%)의 첨가는 특징 예컨대 경시적인 제형의 품질 수명 또는 안정성을 결정하기 위해 장기 저장을 시뮬레이션하는 수단으로서 약학적 기술분야에서 널리 받아들여지고 있다. 예를 들어, 문헌 [Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2nd ed., Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995)]을 참조한다. 본 개시물의 무수 약학적 조성물 및 제형은 무수 또는 저수분 함유 성분 및 저수분 또는 저습기 조건을 사용하여 제조될 수 있다. 락토오스 및 1차 또는 2차 아민을 포함하는 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물 및 제형은 제조, 포장, 및/또는 저장 과정에서 수분 및/또는 습기와 실질적 접촉이 예상되는 경우 바람직하게는 무수성이다. 무수 조성물은 바람직하게는 적합한 처방 키트에 포함될 수 있도록 물에 대한 노출을 방지하는 것으로 알려진 물질을 사용하여 포장된다. 적합한 포장의 예는, 이에 제한되지 않지만, 건조제, 블리스터 팩, 및 스트립 팩을 사용하거나 사용하지 않는 용봉한 포일, 플라스틱, 단위 투여 용기 (예를 들어, 유리병)을 포함한다.
조절 및 지연 방출 제형. 본원에 기술된 양태의 일부 실시형태에 있어서, ROBO-2 억제제는 조절- 또는 지연-방출 수단에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 이상적으로는, 의학적 치료에서 최적으로 설계된 조절-방출 제제의 용도는 최소의 시간 내에 질병을 치유하거나 제어하는데 이용되는 최소의 약물 물질에 의해 특징지워진다. 조절-방출 제형의 장점은 하기를 포함한다: 1) 약물의 연장된 활성; 2) 감소된 투여 빈도; 3) 증가된 환자의 순응성; 4) 적은 총 약물의 사용량; 5) 국소적 또는 전신적 부작용에 있어서의 감소; 6) 약물 축적의 최소화; 7) 혈액 수준 변동에 있어서의 감소; 8) 치료의 효능에 있어서의 개선; 9) 약물 활성의 강화 작용 또는 손실의 감소; 및 10) 질환 또는 질병의 제어의 속도에 있어서의 개선. 문헌 [(Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000))]. 조절-방출 제형은 화학식(I)의 화합물의 작용의 시작, 작용의 기간, 치료 가능시기에서의 혈장 수준, 및 최고 혈액 수준을 조절하는데 사용될 수 있다. 특히, 조절(controlled)- 또는 연장(extended)-방출 제형 또는 제제는 화학식 (I)의 화합물의 최대 효과가 달성되는 한편 약물을 과소투여하는 것(즉, 최소 치료 수준 미만으로) 뿐만 아니라 약물에 대한 독성 수준을 초과하는 것 모두로부터 발생될 수 있는 잠재적 부작용 및 안전 우려의 최소화를 보장하는데 사용될 수 있다.
다양한 조절- 또는 연장-방출 제형, 제제, 및 장치는 본원에 기술된 ROBO-2 억제제와 함께 사용하기 위해 적용될 수 있다. 예는, 이에 제한되지 않지만, 미국특허 번호: 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5674,533; 5,059,595; 5,591 ,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; 5,733,566; 및 6,365,185 B1에 기술된 것을 포함하고, 이의 각각은 본원에 그 전문이 참조로 포함되어 있다. 이러한 제형은, 변화하는 비율로 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해, 예를 들어, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 다른 중합체 매트릭스, 젤, 투과성 멤브레인, 삼투성 시스템 (예컨대 OROS
Figure 112014073912652-pct00005
(Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA)), 다층 코팅, 마이크로입자, 리포좀, 또는 미립구 또는 이들의 조합을 사용하여, 하나 이상의 활성 성분의 느리거나 또는 조절된-방출을 제공하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 이온 교환 물질이 개시된 화합물의 고정화되고, 흡착된 염 형태를 제조하고 이에 따라 약물의 조절된 전달에 영향을 주는데 사용될 수 있다. 특정 음이온 교환체의 예는, 이에 제한되지 않지만, DUOLITE
Figure 112014073912652-pct00006
A568 및 DUOLITE
Figure 112014073912652-pct00007
AP143 (Rohm&Haas, Spring House, Pa. USA)를 포함한다.
본원에 기술된 방법의 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 ROBO-2 억제제는 지속 방출에 의해 또는 펄스(pluse)로 대상체에게 투여된다. 펄스 요법(pulse therapy)은 시간에 따라 동일한 양의 조성물의 비연속적 투여의 형태가 아니나, 감소된 빈도 또는 감소된 투여량의 투여로 조성물의 동일한 투여량의 투여를 포함한다. 지속 방축 또는 펄스 투여(pulse administration)는, 예를 들어 만성 신장 질환을 가지는 대상체에게 장애가 계속적으로 발생하는 경우, 특히 바람직하다. 각각의 펄스 투여(pulse dose)는 감소될 수 있고 대상체 또는 환자에 대한 치료의 경과에 따라 투여되는 본원에 기술된 ROBO-2 억제제의 총량은 최소화된다.
필요한 경우, 펄스간 간격은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 종종, 펄스간 간격은 조성물 또는 조성물의 활성 성분이 다음 펄스의 전달 이전에 대상체에서 더 이상 검출될 수 없을 때 조성물의 다른 투여량을 투여함으로써 계산될 수 있다. 간격은 또한 조성물의 생체내 반감기로부터 계산될 수 있다. 간격은 생체내 반감기보다 더 큰 것으로, 또는 조성물의 반감기보다 2, 3, 4, 5 및 심지어 10 배 더 큰 것으로 계산될 수 있다. 주입 또는 환자에게의 전달의 다른 형태에 의해 조성물을 펄싱(pulsing)하기 위한 다양한 방법 및 장치가 미국특허 번호 4,747,825; 4,723,958; 4,948,592; 4,965,251 및 5,403,590에 개시되어 있다.
일부 실시형태에 있어서, ROBO-2 억제제를 포함하는 지속 방출 작용제가 제조될 수 있다. 지속 방출 작용제의 적합한 예는 상기 억제제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로젤 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국특허번호 3,773,919), L-글루탐산 및 y 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사형 미립구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여를 위해 사용되는 ROBO-2 억제제를 포함하는 제형은 바람직하게는 무균성이다. 이는 예를 들어, 무균성 여과 멤브레인을 통한 여과, 및 당업자에게 알려진 다른 방법에 의해 용이하게 달성된다.
또한, 본원에서는, 일부 양태에 있어서, 만성 신장 질환 또는 만성 신장 질환의 성향 또는 단백뇨를 나타내는 바이오마커로서의 ROBO2의 발현 프로파일 또는 서열 정보에 기초하여, 개체가 만성 신장 질환 또는 만성 신장 질환의 성향 또는 단백뇨에 대한 성향을 가지는지를 결정하기 위한 분석법, 방법, 및 시스템을 제공한다. 본원에서 입증된 바와 같이, ROBO2는 만성 신장 질환을 가지는 또는 만성 신장 질환 또는 단백뇨에 대한 높은 위험이 있는 대상체를 확인하거나 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 진행에 대한 치료의 효과를 모니터링하기 위한 바이오마커로서 유용하다.
본원에서 사용되는, "바이오마커"는 다른 표현형 상태 (예를 들어, 질환을 가지지 않음)와 비교되는 하나의 표현형 상태 (예를 들어, 질환을 가짐)의 대상체로부터 취해진 샘플에 상이하게 존재하는 유기 생체분자를 지칭한다. 바이오마커는, 상이한 군에서 바이오마커의 평균 또는 중간 발현 수준이 통계적으로 유의미한 것으로 산출되는 경우, 상이한 표현형 상태들 사이에 상이하게 존재한다. 통계적 유의성에 대한 일반적 시험은, 특히, t-테스트, ANOVA, 크러스칼-왈리스 검정(Kruskal-Wallis), 윌콕슨 검정(Wilcoxon), 맨-휘트니 검정(Mann-Whitney) 및 오즈비(odds ratio)를 포함한다. 단독 또는 조합되는 바이오마커는 a-대상체가 하나의 표현형 상태 또는 다른 것에 속할 상대적 위험의 측정을 제공한다. 이와 같이, 이는 질환 (진단), 약물의 치료 유효성 (치료진단) 및 약물 독성에 대한 마커로서 유용하다.
본원에 기술된 분석법에 사용되기 위한 ROBO2 발현은 임의의 적합한 방법에 의해 검출될 수 있고, 단백질 수준의 검출 또는 mRNA 발현 수준의 검출을 포함한다. ROBO2 폴리펩티드는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 발견될 수 있는 임의의 형태, 또는 생물학적 샘플의 조각으로부터 (예를 들어, 샘플 처리 결과로서) 생성될 수 있는 임의의 형태로 검출될 수 있다. ROBO2의 변형된 형태는 대립유전자 변이, 스플라이싱 변이, 번역후 변형 (예를 들어, 글리코실화, 단백질 분해분열 (예를 들어, 모 단백질의 절편), 글리코실화, 인산화, 지질화, 산화, 메틸화, 시스테인화, 설폰화, 아세틸화 등), 올리고머화, 탈-올리고머화 (단백질의 멀티머형으로부터 단량체를 분리하기 위한 것임), 변성 등의 생성물인 변형된 단백질을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 분석법은 ROBO2의 모든 형태 또는 특정 형태를 검출하기 위해 설계될 수 있다. 필요한 경우, ROBO2의 상이한 형태, 예를 들어 상이한 동형단백질 사이의 구별은 상기 형태들 간에 차별화하는 물리적 특징, 예를 들어 상이한 분자량, 상이한 분자 크기, 상이한 항원결정부위의 존재/부재 등에 따른 검출 방법의 사용에 의해 달성될 수 있다.
따라서, 본원에서는, 일부 양태에 있어서, 만성 신장 질환을 가지는 또는 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험이 있는 대상체의 진단을 위한 분석법을 제공하고, 분석법은 하기를 포함한다: 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 ROBO2 단백질 또는 핵산의 수준을 측정하는 단계, - 대상체로부터의 생물학적 샘플에서의 ROBO2의 수준이 ROBO2에 대한 한계 참조 수준과 동일한 수준이거나 이보다 큰 (예를 들어, 통계학적으로 유의미한 양보다 큰) 경우, 그 대상체는 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험이 있거나 만성 신장 질환을 가질 가능성이 높음 -. 예를 들어, ROBO2의 참조 한계 수준과 비교하여 약 10% 초과, 또는 약 20% 초과, 또는 약 30% 초과, 또는 약 40% 초과, 또는 약 50% 초과, 또는 약 60% 초과, 또는 그 이상으로 ROBO2의 수준에서의 증가. 일부 실시형태에 있어서, ROBO2의 수준에 있어서의 증가는 중간 또는 평균 ROBO2 참조 한계 수준보다 적어도 1 표준 편차 초과이거나, 적어도 2 표준 편차 초과, 또는 그 이상이다. 이러한 중간 또는 평균 ROBO2 참조 수준은, 예를 들어, 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 갖지 않는 대상체로부터 수득된 5 개 이상의 샘플로부터, 또는 상이한 시점에서 동일한 대상체로부터 수득되는 5 개 이상의 샘플로부터 얻을 수 있다.
이러한 분석법의 일부 실시형태에 있어서, 생물학적 샘플로부터 측정된 ROBO2의 양은 참조 한계 수준, 또는 참조 생물학적 샘플, 예컨대 연령-일치된 정상 대조군 (예를 들어, 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 갖지 않는 연령-일치된 대상체), 또는 건강한 대상체, 예를 들어, 건강한 개체로부터 수득된 생물학적 샘플과 비교된다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 개시된 분석법, 시스템 및 키트는 또한 대상체에게 투여되는 치료의 과정을 모니터링하기 위해 유용하다. 예를 들어, 제 1 시점 (예를 들어, t1)의 대상체에서 생물학적 샘플에서의 ROBO2의 수준을 측정하고 ROBO2 바이오마커 참조 한계 수준과 비교할 수 있고, ROBO2의 측정된 수준이 참조 한계 수준 이상인 경우, 대상체는 적절한 치료법 또는 요법을 투여하여 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 발생을 지연시키거나 감소시킬 수 있고, 예를 들어, 본원에 방법에서 개시된 바와 같이 운동을 증가시키고, 심장 압박(heart pressure)을 감소시키고, 식사 등을 조절할 수 있고, 이후 ROBO2 바이오마커 단백질의 패널의 수준은 제 2 (예를 들어, t2) 및 후속 시점 (예를 들어, t3, t4, t5, t5 ... 등)에서 측정되고, 만성 신장 질환 또는 단백뇨 위험을 감소시키고, 이의 발생을 지연시키거나 감소시키기 위한 치료에 대한 치료법 또는 의료적 치료 또는 요법이 효과적인지를 결정하기 위해 하나 이상의 시점 (예를 들어 t1 또는 임의의 후속 시점)의 tROBO2의 수준 또는 ROBO2의 참조 한계 수준과 비교할 수 있다. 이러한 일부 실시형태에 있어서, 본원에 개시된 분석법, 시스템 및 키트는 증상을 보이는 대상체 (예를 들어, 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가지는 것으로 알려진 대상체)에게서 치료법을 모니터링하는데 사용될 수 있고, 이에서 효과적인 치료는 대상체에서 ROBO2에 있어서의 감소일 수 있고, 또는 대안적으로 본원에 개시된 분석법, 시스템 및 키트는 (예를 들어, 대상체에 발생되는 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 방지하기 위해) 증상이 없는 대상체에게서의 예방적 치료의 효과를 모니터링하는데 사용될 수 있고, 예를 들어, 상기 대상체는 본원에 개시된 방법, 또는 본 기술분야에 알려진 다른 것에 따라, 또는 유전적 이유에 기인하여, 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험이 있는 것으로 확인된 적이 있다.
본원에서 일반적으로 사용되는 용어 "샘플"은 핵산, DNA 또는 RNA, 또는 아미노산을 함유하는 임의의 물질을 지칭한다. 일반적으로, 이러한 물질은 혈액 샘플, 대변 샘플, 조직 샘플, 세포, 박테리아, 미세조직 절편, 또는 구강내 표본(buccal swab)의 형태일 수 있다. 샘플은 준비될 수 있고, 예를 들어 샘플은 신선, 고정, 냉동, 또는 파라핀에 포매될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터의 세포 또는 세포의 집단 또는 일정량의 조직 또는 체액을 지칭한다. 대부분, 샘플은 대상체로부터 분리되고, 그러나 용어 "생물학적 샘플"은 또한 생체내에서 분석되는, 즉 대상체로부터 분리됨 없는 세포 또는 조직을 지칭할 수 있다. 종종 "생물학적 샘플"은 동물로부터 분리된 세포를 함유할 수 있고, 그러나 상기 용어는 또는 비-세포 생물학적 물질, 예컨대 유전자 발현 수준을 측정하는데 사용될 수 있는, 혈액, 타액, 또는 소변의 비-세포 분획을 지칭할 수 있다. 생물학적 샘플은, 이에 제한되지 않지만, 조직 생검, 긁어냄(scrapes), 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 세포 배양액, 또는 뇌척수액을 포함한다. 생물학적 샘플은 또한 조직 생검, 세포 배양액을 포함한다. 생물학적 샘플 또는 조직 샘플은 이에 제한되지 않지만, 예를 들어 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 신장 생검, 대변, 객담, 척수액, 흉수, 유관액, 림프액, 피부, 호흡기, 장 및 생식기 관의 외부 절편, 눈물, 타액, 젖, 세포 (이에 제한되지 않지만 혈세포를 포함함), 종양, 장기, 및 또는 생체외 세포 배양 성분의 샘플을 포함하는, 개체로부터 분리된 조직 또는 체액의 샘플을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 소변 샘플이 수득되는 경우, 소변 샘플은 원심분리되어 임의의 신장 세포를 펠렛화하고, 그것에 대해 본원에 개시된 분석법 및 방법이 수행될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 샘플은 신장 생검, 예컨대 신장 또는 이의 부분의 침생검, 예컨대 족세포 샘플로부터의 것이다. 추가적으로, 세침 흡인 샘플(fine needle aspirate sample)이 사용된다. 일부 실시형태에 있어서, 생물학적 샘플이 준비될 수 있고, 예를 들어 생물학적 샘플은 신선, 고정, 냉동, 또는 파라핀에 포매될 수 있다. 상기 샘플은 대상체로부터의 세포의 샘플을 분리하여 수득될 수 있으나, 또한 앞서 분리된 세포 (예를 들어, 다른 사람에 의해 분리된 것)을 사용함으로써, 또는 생체내에서 본원에 개시된 방법을 수행함으로서 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 폴리펩티드 또는 단백질의 발현 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 유전자의 발현으로 상호교환적으로 지칭될 수 있다. 발현은 또한 번역전 변형된 그리고 번역후 변형된 단백질의 발현, 및 전구체-mRNA(pre-mRNA) 분자, 선택적으로 스플라이싱된 성숙 mRNA 분자의 발현도 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 발현은, 예를 들어, RNA 전사 분자의 생성, 예를 들어 전령 RNA (mRNA) 전사 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 단백질 또는 폴리펩티드의 발현은, 예를 들어, 폴리펩티드와 결합되는 항체(들)을 사용하는 면역분석법에 의해 결정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 적용되는 용어 "암호화하다(encode)"는, 천연 상태 또는 당업자에게 익히 알려진 방법에 의해 조작시, 전사되어 폴리펩티드 및/또는 이의 절편을 생성하는 아미노산 서열로 번역될 수 있는 RNA를 생성할 수 있는 경우에서의 폴리펩티드 또는 단백질을 "암호화"한다고 하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 안티센스 가닥(antisense strand)은 이러한 핵산의 상보적인 것이고, 암호화 서열은 이들로부터 추론될 수 있다. 용어 "내인성으로 발현된" 또는 "내인성 발현"은 정상 수준에서 그리고 이 세포 유형에 대한 정상 조절 하에의 유전자 생성물의 발현을 지칭한다.
샘플 또는 생물학적 샘플에서 ROBO2 단백질 또는 핵산의 수준을 측정하기 위한 본원에 개시된 분석법, 방법, 및 시스템과 함께 사용될 수 있는 검출법은 광학적 방법, 전기화학적 방법 (전류전압법 및 전류법 기술), 원자력 현미경, 및 무선주파수 방법, 예를 들어, 다극성 공명 분광법(multipolar resonance spectroscopy)을 포함한다. 광학적 방법은 현미경, 공초점 및 비-공초점 모두, 형광, 발광, 화학발광, 흡광도, 반사율, 투과율, 및 복굴절 또는 굴절률의 검출 (예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 타원편광 반사법(ellipsometry), 공명 거울 방법(resonant mirror method), 그레이팅 커플러 웨이브가이드 방법(grating coupler waveguide method) 또는 간섭측정법)을 포함한다.
ROBO2 단백질의 수준, 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 3의 단백질의 수준을 결정하는 본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 실시형태에 있어서, 당업자에게 일반적으로 알려진 임의의 단백질 접근법(proteomic approach)을 사용하여 생물학적 샘플에서 바이오마커 단백질의 수준을 측정할 수 있다. 측정이 생물학적 샘플에서의 ROBO2 단백질의 수준이 ROBO2 단백질에 대한 참조 한계값 수치와 동일, 또는 초과 또는 미만인지를 결정하거나 나타낼 수 있는 한, 측정은 정량적 또는 정성적일 수 있다.
ROBO2 단백질의 측정된 수준은, 일부 실시형태에 있어서, 예컨대 샘플에서의 ROBO2 단백질 분자의 수를 검출함으로써) ROBO2 단백질 자체의 양을 측정하는 ROBO2 단백질의 수준의 일차적 측정일 수 있고, 또는 이는, 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질의 이차적 측정 (그로부터 ROBO2 단백질의 양이 추론될 수 있으나 필연적으로 추론되는 것은 아닌 측정으로, 예컨대 기능 활성의 측정 또는 핵산, 예컨대 ROBO2 단백질을 암호화하는 mRNA의 측정)일 수 있다. 정성적 데이터는 또한 일차적 측정으로부터 유도되거나 얻을 수 있다.
본원에 기술된 분석법 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 친화도-기반 측정 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 항체와 관련되는 "친화도(affinity)"는 본 기술분야에서 익히 이해되는 용어이고, 결합 상대, 예컨대 본원에 기술된 바이오마커 (또는 이의 항원결정부위)에의 항체의 결합의 정도, 또는 강도를 의미한다. 친화도는, 이에 제한되지 않지만, 평형 해리 상수 (KD 또는 Kd), 외견상의 평형 해리 상수 (KD' 또는 Kd'), 및 IC50 (경쟁 분석법에서 50% 억제 실현에 필요한 양; 본원에서 "I50"과 상호교환적으로 사용됨)을 포함하는, 본 기술분야에 알려진 다수의 방법으로 측정되고/되거나 표현될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 친화도는 항원결정부위에 결합되는 주어진 군집의 항체에 대한 평균 친화도이다.
친화도-기반 측정 기술은 측정되는 바이오마커 단백질과 특이적으로 결합되는 분자 ("친화성 시약", 예컨대 항체 또는 압타머)를 이용하고, 물론 다른 기술, 예컨대 분광법-기반 기술 (예를 들어, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비행시간형(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight), MALDI-TOF 분광법) 또는 생물활성을 측정하는 분석법 (예를 들어, 성장 인자의 미토겐활성(mitogenicity)을 측정하는 분석법)이 또한 사용될 수 있다. 본원에 기술된 분석법 및 방법과 함께 사용하기 위한 친화도-기반 기술은 항체-기반 분석법 (면역분석법) 및 압타머 (다른 분자와 특이적으로 결합하는 핵산 분자)를 이용하는 분석법, 예컨대 ELONA를 포함할 수 있다. 추가적으로, 항체 및 압타머 모두를 이용하는 분석법이 또한 고려될 수 있다 (예를 들어, 포획을 위한 항체 및 검출을 위한 압타머를 이용하는 샌드위치 포맷 분석법(sandwich format assay)). 매우 다양한 친화도-기반 분석법이 또한 본 기술분야에 알려져 있다.
친화도-기반 분석법은 통상적으로 바이오마커 단백질, 즉 ROBO2로부터 유도되는 하나 이상의 항원결정부위를 이용하고, 많은 친화도-기반 분석법 방식은 하나 초과의 항원결정부위를 이용한다 (예를 들어, 2 개 이상의 항원결정부위는 "샌드위치" 방식 분석법과 관련되고; 하나 이상의 항원결정부위는 바이오마커 단백질을 포획하기 위해 사용되고, 하나 이상의 상이한 항원결정부위는 마커를 검출하기 위해 사용됨).
친화도-기반 분석법은 경쟁적 또는 직접 반응 방식이고, 샌드위치-유형 방식을 이용할 수 있고, 추가로 이질이거나 (예를 들어, 고체 기질을 이용함) 균질일 수 있고 (예를 들어, 단일 상에서 일어남) 및/또는 면역침강법을 이용할 수 있다. 많은 분석법은 라벨링된 친화성 시약 (예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 또는 압타머)의 사용과 관련되고, 라벨은, 예를 들어, 효소적, 형광성, 화학발광성, 방사성 또는 염료 분자일 수 있다. 프로브로부터의 신호를 증폭하는 분석법이 또한 알려져 있고; 이의 예는 비오틴 및 아비딘을 이용하는 분석법, 및 효소-라벨링 및 매개의 면역분석법, 예컨대 ELISA 및 ELONA 분석법이다. 예를 들어, 생물학적 유체 샘플로부터의 바이오마커 농도는 LUMINEX
Figure 112014073912652-pct00008
분석법 또는 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 바이오마커 또는 바이오마커에 대해 특이적인 시약은 표면에 결합될 수 있고, 수준은 직접적이거나 간접적으로 측정될 수 있다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 면역분석 친화도-기반 측정 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
면역분석 기술은 생물학적 샘플에서의 ROBO2 단백질의 수준을 정량적 또는 정성적으로 측정할 수 있는 임의의 면역분석 기술을 포함할 수 있다. 적합한 면역분석 기술은, 이에 제한되지 않지만, 방사성면역측정법, ELISA (효소-결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역방사측정 분석법, 면역확산 분석법, 인시츄 면역분석법 (예를 들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성동위원소 라벨을 사용함), 웨스턴 블롯 분석(western blot analysis), 면역침강법, 면역형광 분석법, 면역전기영동 분석법, 형광면역분석법 (FiA), 면역방사측정 분석법 (IRMA), 면역효소측정 분석법 (IEMA), 발광면역 분석법 및 형광면역 분석법 (Madersbacher S, Berger P. Antibodies and immunoassays. Methods 2000;21:41-50), 화학발광 분석법, 면역-PCR, 및 웨스턴 블롯 분석법을 포함한다. 유사하게, 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 정량적 또는 정성적으로 측정할 수 있는 압타머-기반 분석법이 본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 압타머는 추가적인 분석 방식 (예컨대 핵산 증폭 기술 예컨대 PCR을 사용하는 결합된 압타머의 증폭 (미국특허 번호 4,683,202) 또는 복합 프라이머와의 등온 증폭 (미국특허 번호 6,251,639 및 6,692,918)을 가능하게 함에도 불구하고, 압타머는 거의 모든 방식의 면역분석법에서 항체를 대신할 수 있다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준이 면역분석 친화도-기반 측정 기술을 사용하여 측정되는 경우, 면역분석법은 바이오마커/항체 상호작용의 단백질/항체 상호작용의 정도를 측정함으로써 수행된다. 면역분석의 임의의 알려진 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 결합 상대, 예를 들어 결합 분석법(binding assay)에서의 ROBO2 단백질에 결합되는 항체 또는 리간드는, 필수적으로 항체는 아닌, 바람직하게는 라벨링된 특이적 결합 상대이다. 결합 상대는 대개 그 자체가 라벨링되고, 그러나 대안적으로 이는 신호가, 예를 들어 다른 라벨링된 물질로부터 발생되는 2차 반응에 의해 검출될 수 있다.
따라서, ROBO2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템에서 사용되어 생물학적 샘플에서의 ROBO2 단백질의 존재 및/또는 양을 결정할 수 있고, 이는 진단 샘플에 존재하는 ROBO2 단백질의 증가되거나 감소된 농도를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 면역진단 분야에 익히 알려진 임의의 방법에 의해 발생될 수 있다. 항체는 임의의 생물학적으로 관련 있는 상태의 단백질에 대한 안티-ROBO2 단백질 항체일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 이는 글리코실화된 형태로 신체에 존재하는, ROBO2 단백질의 비글리코실화된 형태에 대해, 또는 ROBO2 단백질의 관련 항원결정부위를 지닌 펩티드에 대해 발생될 수 있다.
이러한 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, 증폭된 분석 형태가 사용될 수 있고, 이에서 증대된 "신호"는 검출되는 상대적으로 낮은 수준의 단백질로부터 생성된다. 증폭된 면역분석법 중 하나의 특별한 형태는 증대된 화학발광 분석법이다. 예를 들어, 항체는 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 라벨링되고, 이는 루미놀, 과산화물 기질 및 방출되는 빛의 강도 및 지속 시간을 증대시키는 화합물, 통상적으로 4-아이도페놀 또는 4-히드록시신남산과의 화학발광 반응에 참여한다.
이러한 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, 면역-PCR를 포함하는 증폭된 면역분석법이 사용될 수 있다. 이 기술에서, 항체는 PCR 프라이머를 포함하는 임의의 DNA의 분자와 공유 결합하고, 그럼으로써 항체가 부착된 DNA는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 의해 증폭된다. 문헌 [E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23: 522-529 (1995)]을 참조한다.
따라서, 본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 모든 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질의 수준은 본원에서 "단백질-결합 엔티티(protein-binding entity)" 또는 "친화성 시약"이 라고도 하는 단백질-결합 작용제, 특히 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 예로써, 친화성 시약, 특히 항체 예컨대 안티-바이오마커 항체는 면역분석법, 특히 ELISA (효소-결합 면역흡착 분석법)에서 사용될 수 있다. 실시형태에 있어서, 바이오마커 단백질의 수준은 예를 들어 이에 제한되지 않지만 동형단백질 단백질의 동형단백질-특이적 화학적 또는 효소적 분해, 면역블로팅(immunobloting), 면역조직화학적 분석법(immunohistochemical analysis), ELISA, 및 질량 분석법을 포함하는 본 기술분야에 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 측정될 수 있다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 "효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)"을 사용하여 측정된다. ELISA는 라벨링된 (예를 들어, 효소 결합된) 형태의 항체를 사용하여 항원의 농도를 검출하고 측정하기 위한 기술이다. 당업자에게 익히 알려진 상이한 형태의 ELISA가 있다. ELISA에 대한 기술분야에서 알려진 표준 기술은 문헌 ["Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al., "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964; and Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22:895-904]에 기술되어 있다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 샌드위치 분석법 ELISA를 사용하여 측정된다. "샌드위치 ELISA"에서, 항체 (예를 들어, 안티-효소)는 고체상 (즉, 마이크로타이터 플레이트)에 결합되고 항원 (예를 들어, 효소)를 함유하는 생물학적 샘플에 노출된다. 고체상은 이후 세척되어 미결합된 항원이 제거된다. 라벨링된 항체 (예를 들어, 효소 결합된 것)는 이후 (존재하는 경우) 항체-항원-항체 샌드위치를 형성하는 결합된-항원에 결합된다. 따라서, 이 방법을 사용하여, ROBO2 단백질에 대한 1차 항체가 고체상 예컨대 플라스틱 마이크로타이터 플레이트의 웰(well)에 결합되고, 샘플 및 분석되는 ROBO2 단백질에 특이적인 라벨링된 2차 항체와 함께 배양된다. 항체에 결합될 수 있는 효소의 예는 알칼리성 인산가수분해효소, 고추냉이 과산화효소, 루시페라아제, 우레아제, 및 B-갈락토시다아제이다. 효소 결합 항체는 기질과 반응하여 측정될 수 있는 착색된 반응 생성물을 발생시킨다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 항체 포획 분석법(antibody capture assay) 또는 경쟁적 ELISA를 사용하여 측정된다. "경쟁적 ELISA"에 있어서, 항체는 항원 (즉, 효소)을 함유하는 샘플과 함께 배양된다. 항원-항체 혼합물은 이후 항원 (즉, 효소)으로 코팅된 고체상 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트)과 접촉된다. 샘플에 존재하는 항원이 많을수록 고체상에 결합될 수 있는 자유 항체는 더 적어질 것이다. 고체상에 결합된 1차 항체의 양을 결정하기 위해 라벨링된 (예를 들어, 효소 결합된) 2차 항체는 이후 고체상에 추가된다. 따라서, 이러한 일부 실시형태에 있어서, 생물학적 시험 샘플은 고체상에 결합시켜지고, 안티-ROBO2 단백질 항체 (예를 들어, ROBO2 단백질에 특이적으로 결합되는 항체)가 추가되어 결합되도록 할 수 있다. 미결합된 물질을 제거한 후, 고체상에 결합되는 항체의 양은 1차의 것에 안티인 라벨링된 2차 항체를 사용하여 결정된다.
이러한 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, 라벨은 바람직하게는 효소이다. 효소에 대한 기질은, 예를 들어, 발색되고(color forming), 형광성 또는 화학발광성일 수 있다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 면역조직화학법을 사용하여 측정된다. "면역조직화학 분석법"에 있어서, 조직의 절편(section)은 조직을 분석되는 단백질에 대해 특이적인 항체에 노출시킴으로써 특이적 단백질에 대해 시험된다. 항체는 이후 존재하는 단백질의 존재 및 양을 결정하기 위해 임의의 다수의 방법에 의해 가시화된다. 항체를 가시화하기 위해 사용되는 방법의 예는, 예를 들어, 항체에 결합되는 효소 (예를 들어, 루시페라아제, 알칼리성 인산가수분해효소, 고추냉이 과산화효소, 또는 베타-갈락토시다아제), 또는 화학적 방법 (예를 들어, DAB/기질 크로마젠(DAB/Substrate chromagen))에 의한 것이다. 샘플은 이후, 가장 바람직하게는 당업자에게 알려진 임의의 다양한 착색법 및 시약을 사용하는, 가시광 스펙트럼에서 검출되는 착색제로 착색된 샘플의 광현미경에 의해, 현미경으로 분석된다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 방사성면역분석법을 사용하여 측정된다. 방사성면역분석법은 라벨링된 (예를 들어, 방사성으로 또는 형광적으로 라벨링된) 형태의 항원을 사용하여, 항원, 즉 ROBO2의 농도를 검출하고 측정하기 위한 기술이다. 항원에 대한 방사성 라벨의 예는 3H, 14C, 및 125I를 포함한다. 생물학적 샘플에서의 ROBO2의 농도는, ROBO2에 대한 항체에 결합함에 있어, 그 생물학적 샘플 내의 ROBO2를 (예를 들어, 방사성으로) 라벨링된 ROBO2와 경쟁시킴으로써 측정된다. 라벨링된 ROBO2와 미라벨링된 ROBO2 사이에서의 경쟁적 결합을 보장하기 위해, 라벨링된 ROBO2는 항체의 결합 부위를 포화시키기에 충분한 농도로 존재한다. 샘플에서의 ROBO2 농도가 높을수록, 항체에 결합될 라벨링된 ROBO2의 농도는 낮아진다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 면역방사측정 분석법 (IRMA)을 사용하여 측정된다. IRMA는 항체 시약이 방사성으로 라벨링된 면역분석법이다. IRMA는 단백질, 예를 들어 토끼 혈청 알부민 (RSA)과의 컨쥬게이션과 같은 기술에 의한 다가 항원 컨쥬게이트의 생성을 요구한다. 다가 항원 컨쥬게이트는 분자당 2 개 이상의 항원을 가져야 하고 항원 잔기는 항원에 대해 2 개 이상의 항체에 의해 결합될 수 있도록 충분한 거리로 떨어져 있어야 한다. 예를 들어, IRMA에서 다가 항원 컨쥬게이트는 고체 표면 예컨대 플라스틱 구체에 부착될 수 있다. 미라벨링된 "샘플" 항원 및 방사성으로 라벨링된 항원에 대한 항체는 다가 항원 컨쥬게이트 코팅된 구체를 함유하는 시험관에 첨가된다. 샘플에서의 항원은 항원 항체 결합 부위에 대해 다가 항원 컨쥬게이트와 경쟁한다. 적절한 배양 기간 이후, 미결합된 반응물은 세척에 의해 제거되고 고체상에서의 방사능의 양이 결정된다. 결합된 방사성 항체의 양은 샘플에서의 항원의 농도에 반비례한다.
생물학적 샘플에서 ROBO2 단백질의 수준을 검출하는데 사용될 수 있는 다른 기술이 본 개시물 및 생물학적 샘플의 유형 (즉, 혈장, 소변, 조직 샘플 등)에 기초하여 수행자의 선호도에 따라 수행될 수 있다. 하나의 이러한 기술은 웨스턴 블로팅 (Towbin et at., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979))이고, 이에서 적합하게 처리된 샘플은 고체 지지체, 예컨대 니트로셀룰로오스 필터로 이송되기 전에 SDS-PAGE 젤에서 수행된다. 검출가능하게 라벨링된 안티-ROBO2 항체 또는 단백질 결합 분자는 이후 ROBO2 단백질의 수준을 평가하기 위해 사용되고, 이에서 검출가능한 라벨로부터의 신호의 강도는 ROBO2 단백질의 양에 상응한다. 존재하는 ROBO2 단백질의 양의 수준은 또한 예를 들어 농도계에 의해 정량화될 수 있다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 질량 분석법 예컨대 MALDI/TOF (비행시간형), SELDI/TOF, 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS), 가스 크로마토그래피-질량 분석법 (GC-MS), 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (HPLC-MS), 모세관 전기영동-질량 분석법, 핵 자기 공명 분광법, 또는 이중 질량 분석법 (예를 들어, MS/MS, MS/MS/MS, ESI-MS/MS 등)을 사용하여 측정된다. 예를 들어, 미국특허출원 번호: 20030199001, 20030134304, 20030077616를 참조하고, 이는 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
이러한 일부 실시형태에 있어서, 이 방법론들은 기계, 컴퓨터 시스템 및 매체와 조합되어, 생물학적 샘플에서 ROBO2 단백질의 수준의 결정과, 예를 들어 생물학적 샘플에서 ROBO2 단백질의 수준을 확인하는 인쇄가능한 보고서를 만들기 위한 분석을 위한 자동화된 시스템을 제조할 수 있다. 몇몇 예시에서, ROBO2의 수준의 측정은 결정 및 비교 모듈로부터 원격적으로 이루어진다.
질량 분석 방법은 본 기술분야에 익히 알려져 있고 생체분자, 예컨대 단백질을 정량화하고/하거나 확인하기 위해 사용되고 있다 (예를 들어, 문헌 [Li et al. (2000) Tibtech 18:151-160; Rowley et al. (2000) Methods 20: 383-397; and Kuster and Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400]을 참조한다). 또한, 분리된 단백질의 적어도 부분적인 드 노보 시퀀싱(de novo sequencing)을 가능하게 하는 질량 분석 기술이 개발되었다. 문헌 [Chait et al., Science 262:89-92 (1993); Keough et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999); reviewed in Bergman, EXS 88:133-44 (2000)].
특정 실시형태에 있어서, 기체상 이온 분광광도계가 사용된다. 다른 실시형태에 있어서, 샘플을 분석하기 위해 레이저-탈착/이온화 질량 분석법이 사용된다. 최신 레이저 탈착/이온화 질량 분석법 ("LDI-MS")은 2 개의 주요 변형예에서 실시될 수 있다: 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 ("MALDI") 질량 분석법 및 표면-증강 레이저 탈착/이온화 ("SELDI"). MALDI에서, 분석물은 매트릭스를 함유하는 용액과 혼합되고, 액체의 액적이 기판의 표면에 배치된다. 매트릭스 용액은 이후 생체 분자와 공동-결정화된다. 기판은 질량 분석기에 삽입된다. 레이저 에너지가 기판 표면에 가해지고 이는 생체 분자를 상당하게 분해시키지 않으면서 이들을 흡수제로부터 제거하고(desorb) 이온화한다. 예를 들어, 문헌 [미국특허 번호 5,118,937 (Hillenkamp et al.) 및 미국특허 번호 5,045,694 (Beavis & Chait)]을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
SELDI에서, 기판 표면은 탈착 과정에서의 능동적 참여 인자가 되도록 개질된다. 하나의 변형예에 있어서, 상기 표면은 관심 대상의 단백질을 선택적으로 결합하는 흡착제 및/또는 포획제로 유도된다. 다른 변형예에 있어서, 표면은 레이저가 쏘여지는 경우에 제거되지 않는 에너지 흡수 분자로 유도된다. 다른 변형예에 있어서, 상기 표면은 관심 대상의 단백질을 결합하고 레이저를 가할 때 파괴되는 광분해성 결합을 함유하는 분자로 유도된다. 각각의 이 방법에 있어서, 유도체화제는 일반적으로 샘플이 적용된 기판 표면에서의 특정 위치에 국한시킨다. 예를 들어, 문헌 [미국특허 번호 5,719,060 및 WO 98/59361]을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 이들 두 개의 방법은 예를 들어, 분석물을 포획하는 SELDI 친화성 표면을 사용하고 에너지 흡수 물질을 제공하기 위해 포획된 분석물에 매트릭스-함유 액체를 첨가함으로써 조합될 수 있다.
질량 분석과 관련된 추가적인 정보에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Principles of Instrumental Analysis, 3rd edition., Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985; 및 Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed. Vol. 15 (John Wiley & Sons, New York 1995), pp. 1071-1094]을 참조한다.
ROBO2 단백질의 수준의 검출은 통상적으로 신호 강도의 검출에 좌우될 것이다. 이는, 결국, 기판에 결합되는 폴리펩티드의 양 및 특징을 반영할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에 있어서, 제 1 및 제 2 샘플의 스펙트럼으로부터 피크값의 신호 강도는 특정 생체분자의 상대적인 양을 결정하기 위해 (예를 들어, 시각적으로, 컴퓨터 분석 등에 의해) 비교될 수 있다. 소프트웨어 프로그램 예컨대 Biomarker Wizard program (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.)이 질량 스펙트럼을 분석에 있어서 보조하기 위해 사용될 수 있다. 질량 분석기 및 이의 기술은 당업자에게 익히 알려져 있다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 겔 전기영동 기술, 특히 SDS-PAGE (Sodium Dodecylsulfate Polyacrylamide Gel Elektrophoresis), 특별하게는 이차원 PAGE (2D-PAGE), 바람직하게는 이차원 SDS-PAGE (2D-SDS-PAGE)를 사용하여 측정된다. 특정 샘플에 따라, 분석법은, 특히 바람직하게는 pH 4-9 걸친 pH 범위를 갖는 고정화 pH 구배법 (IPG)을 사용하는, 2D-PAGE에 기초한다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 겔 전기영동 기술, 특히 다른 단백질 분리 방법, 특별하게는 당업자에게 알려진 방법, 특히, 크로마토그래피 및/또는 크기 배제와 조합되는 상술한 기술을 사용하여 측정된다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 공명 기술, 특히, 표면 플라즈마 공명(plasma surface resonance)을 사용하여 측정된다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준은 단백질 바이오칩을 사용하여 측정된다. 바이오칩은 일반적으로 포획제 (예를 들어, 흡착제 또는 친화성 시약)이 결합되는, 실질적인 평면 표면을 갖는 고체 기판을 포함한다. 빈번하게, 바이오칩의 표면은 결합된 포획제를 갖는 다수의 주소를 가진 위치를 포함할 수 있다. 바이오칩은 또한 대조군으로서 역할을 하는 결합된 포획제를 포함할 수 있다. 단백질 바이오칩은 폴리펩티드의 포획을 위해 적용된 바이오칩이다. 많은 단백질 바이오칩이 본 기술분야에 기술되어 있다. 이는 예를 들어, Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, Calif.), Zyomyx (Hayward, Calif.), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), Biacore (Uppsala, Sweden) 및 Procognia (Berkshire, UK)에 의해 제조되는 단백질 바이오칩을 포함한다. 이러한 단백질 바이오칩의 예는 하기 특허 또는 공개된 특허출원에 기술되어 있다: 미국특허 번호 6,225,047 (Hutchens & Yip); 미국특허 번호 6,537,749 (Kuimelis and Wagner); 미국특허 번호 6,329,209 (Wagner et al.); PCT 국제공개번호 WO 00156934 (Englert et al.); PCT 국제공개번호 WO 031048768 (Boutell et al.) 및 미국특허 번호 5,242,828 (Bergstrom et al.).
대상체로부터의 ROBO2 단백질의 수준과 비교하기 위해 사용되는 ROBO2 단백질 수준의 참조 한계 수준 또는 수치는 본 상세한 설명, 및 하기를 통해 이해될 수 있는 바와 같이, 실시되는 본원에 기술된 양태 또는 실시형태에 따라 변화할 수 있다. 참조 한계값 수치는 개개의 샘플 수치, 예컨대 시험되는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 그러나 더 이른 시점에서 (예를 들어 제 1 시점 (t1)에서, 예를 들어 측정된 제 1 바이오마커 수준, 또는 예를 들어 제 2 시점 (t2)에서) 얻어진 수치에 기초할 수 있다. 참조 한계값은 또한 샘플의 집단, 예를 들어 시험되는 대상체의 집단으로부터의 샘플로부터 얻은 수치(들)에 기초할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질에 대한 참조 한계값은 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 갖는 것으로 알려진 대상체에서 측정된 ROBO2 단백질의 측정된 50% 수치 (예를 들어, 중간값)에 기초한다. 예를 들어, ROBO2 단백질에 대한 상위 50% (중간 수준이나 그 초과)에서의 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가지는 위험이 있는 것으로 선택될 수 있다. 참조 수치(들)은 또한 시험되는 샘플(들)을 포함하거나 배제하는 샘플의 집단에 기초할 수 있다. 참조 수치는, 예컨대 역연령-일치된 그룹의 건강한 대상체의 집단으로부터, 또는 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가지지 않거나 이의 위험을 가지지 않는 대상체로부터의 많은 수의 샘플에 기초할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 참조 수치는 임의의 이 분석법의 평균 또는 중간값 또는 미리 정해진 평균 또는 중간값의, 적어도 1, 보다 통상적으로 적어도 2 표준 편차 초과일 수 있다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템에 의해 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 앓거나 가질 가능성이 있는 대상체의 위험을 평가하기 위해, "참조 한계값"은 통상적으로 미리 정해진 참조 한계 수준, 예컨대 시험되는 대상체의 역연령과 일치된 역연령 그룹에 있는 건강한 대상체의 집단으로부터 얻은 중간의 소변, 혈청 또는 혈액 ROBO2 단백질이다. 앞서 나타낸 바와 같이, 일부 경우에서, 참조 샘플은 또한 성별 일치되고/되거나 인종에 기초하여 일치될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질에 대한 참조 한계값은 생물학적 샘플의 유형, 예를 들어, 동일한 인종, 예를 들어, 백인, 흑인, 히스패닉계, 아시아, 및 아시아-인디언, 파키스탄, 중동 및/또는 태평양 제도민에 대한 패널 대상체에서 소변, 혈액, 혈청에서의 이 바이오마커에 대한 중간 수준이다.
본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템에 의해 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 앓거나 가질 가능성이 있는 대상체의 위험을 평가하기 위해, ROBO2 단백질에 대한 참조 한계 수준은 시험되는 대상체의 역연령과 일치되는 역연령 그룹에 있는 건강한 대상체의 집단으로부터 얻은 평균 또는 중간 수준과 같은 미리 정해진 수준일 수 있다. 대안적으로, ROBO2 단백질에 대한 참조 한계 수준은, 더 이른 시점에서, 및/또는 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험을 가지지 않았을 때, 동일한 대상체로부터 유도된 샘플로부터 얻은 특정 대상체에 대한 역사적 참조 수준일 수 있다. 일부 경우에서, ROBO2 단백질에 대한 참조 한계 수준은 예를 들어, 당뇨병에 기인하여 모두 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가진 대상체들의 특정 그룹에 대한 ROBO2 단백질의 역사적 참조 수준일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 건강한 대상체는 대조군 대상체로써 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, 대조군은 연령-일치된 대조군이다. 건강한 대상체는 예를 들어 소변 또는 혈청 샘플에서의 ROBO2 단백질 참조 한계 수준을 얻기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "건강한" 대상체 또는 "건강한" 대상체 또는 개체로부터의 샘플은 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법을 위해 건강한 대상체로서 대조군 대상체를 선택하기 위해, 본원에 기술된 신장 기능을 평가하는 것으로 일반적으로 알려진 방법을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 만성 신장 질환을 시사하는 신호 또는 징후가 없는 양호하게 건강한 대상체는 건강한 대조군 대상체로서 모집될 수 있다. 대상체는 병력, 가족력, 임상의에 의한 육체적 및 신장 검사, 실험실 시험으로 이루어지는 광범위한 조사에 기초하여 평가된다. 만성 신장 질환 및/또는 단백뇨의 분석의 예는, 이에 제한되지 않지만, 소변, 혈액, 또는 혈청 샘플에서의 특정 단백질 또는 분자, 예컨대 알부민, 칼슘, 콜레스테롤, 전혈구 검사 (CBC), 전해질, 마그네슘, 인, 칼륨, 나트륨, 또는 이의 조합의 수준을 검출하는 것; 특정 기술 또는 과정, 예컨대 복부 CT 스캔, 복부 MRI, 복부 초음파, 신장 생검, 신장 스캔, 신장 초음파의 사용을 통해; 에리스로포이에틴, PTH에 대한 분석 또는 시험; 골밀도 시험, 또는 비타민 D; 또는 이러한 검출 방법 및 분석의 임의의 조합의 결과에서의 변화의 검출에 의한, 예를 들어, 크레아티닌 클리어런스, 크레아티닌 수준; BUN (혈액 요소 질소)을 검출하기 위한 분석법을 포함한다.
연령-일치된 집단 (참조값은 이로부터 수득될 수 있음)은 이상적으로는 시험되는 대상체 또는 개체와 동일한 역연령이고, 그러나 근사하게 연령-일치된 집단이 또한 허용될 수 있다. 근사하게 연령-일치된 집단은 시험되는 개체의 1, 2, 3, 4, 또는 5 년의 역연령 이내일 수 있거나, 시험되는 개체의 역연령을 포함하는 상이한 역연령의 그룹일 수 있다.
"역연령 일치된 그룹"과 비교되는 대상체는 일반적으로 그 대상체를 5 내지 20 년 범위 내로 일치된 역연령과 비교하는 것을 지칭한다. 근사하게 연령-일치된 집단은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15, 또는 20 년 증가분 내에 있을 수 있다 (예를 들어, 62세 대상체에 대한 참조값의 공급원이 될 수 있는 "5년 증가분" 그룹은 58-62세 개체, 59-63세 개체, 60-64세 개체, 61-65세 개체, 또는 62-66세 개체를 포함할 수 있음). 광의의 정의에 있어서, 상이한 역연령 그룹들 사이에 더 큰 갭이 있는 경우, 예를 들어 참조값으로 이용가능한 상이한 역연령 그룹이 소수가 있고, 상이한 역연령 그룹 사이의 갭이 본원에 기술된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15, 또는 20 년 증가분을 초과하는 경우, "역연령 일치된 그룹"은 대상체의 역연령과 더 근접하게 일치된 연령 그룹을 지칭할 수 있다 (예를 들어, 고령 그룹 (예를 들어 80-90세) 및 청년 그룹 (예를 들어, 20-30세)에 대해 참조값이 이용가능한 경우, 51세에 대한 역연령 일치된 그룹은 참조 수준으로서 시험되는 대상체의 역연령과 근접한 청년 그룹 (예를 들어, 20-30세)을 사용할 수 있다).
대조군 대상체의 선택시 고려되는 다른 인자는, 이에 제한되지 않지만, 종, 성별, 인종 등을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 참조 수준은 미리 정해진 참조 수준, 예컨대 시험되는 대상체의 성별과 일치된 성별인 건강한 대조군 대상체의 집단으로부터 얻은 평균 또는 중간 수준일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 참조 수준은 미리 정해진 참조 수준, 예컨대 시험되는 대상체의 인종 (예를 들어, 백인, 흑인, 히스패닉계, 아시아, 및 아시아-인디안, 파키스탄, 중동 및 태평양 제도민)과 일치된 인종인 건강한 대조군 대상체의 집단으로부터 얻은 평균 또는 중간 수준일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 건강한 대상체의 집단의 역연령 및 성별 모두 각각 시험되는 대상체의 역연령 및 성별과 일치된다. 다른 실시형태에 있어서, 건강한 대조군 대상체의 집단의 역연령, 성별, 및 인종은 각각 시험되는 대상체의 역연령, 성별, 및 인종과 일치된다.
대상체로부터의 생물학적 샘플에서 ROBO2 단백질의 수준과 ROBO2 단백질에 대한 참조 한계 수준을 비교하는 과정은 적절하고 당업자에게 알려진 임의의 종래의 방법으로 수행될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템을 사용하여 결정되는 ROBO2 단백질 수준의 수치는 정량적 수치 (예를 들어, 농도의 정량적 수치, 예컨대 샘플의 리터당 ROBO2 단백질의 밀리그램 (예를 들어, mg/L), 또는 절대 양) 일 수 있다. 대안적으로, ROBO2 단백질 수준의 수치는 측정 기술에 따라 정성적일 수 있고, 이에 따라 대상체로부터의 수치와 참조 수치를 비교하는 방식은 이용되는 측정 기술에 따라 변화할 수 있다. 예를 들어, 수치 데이터를 조사함으로써, 데이터의 표현을 조사함으로써 (예를 들어, 도식적 표현 예컨대 바 또는 선형 그래프를 조사함으로써), 그리고 예를 들어, 적어도 1, 또는 적어도 2 표준 편차의 표준 편차를 사용함으로써 비교가 이루어질 수 있다. 하나의 예에서, 정성적 분석법이 ROBO2 단백질 수준을 측정하기 위해 사용되는 경우, 그 수준은 착색된 반응 생성물의 강도를 시각적으로 비교함으로써, 또는 착색된 반응 생성물의 농도계 또는 분광계 측정으로부터의 데이터를 비교함으로써 (예를 들어, 측정 장치로부터 유도된 수치 데이터 또는 그래프 데이터, 예컨대 바 차트를 비교함으로써) 비교될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, ROBO2 단백질 수준은 정량적으로 (절대값) 또는 정성적으로 (상대값) 측정될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 생물학적 샘플에서의 ROBO2 단백질 수준의 정량적 수치는 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험의 주어진 수준 (또는 등급)을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, (예를 들어, 대상체로부터 얻어진 측정된 ROBO2 단백질 수준과 참조 한계값 ROBO2 단백질 수치 사이의 "배수(fold)" 또는 백분율 차이를 비교하여) 대상체로부터의 수치와 참조 수치 사이의 차이의 크기를 결정하기 위해 비교가 실시될 수 있다. 배수 차이(fold difference)는 ROBO2 단백질 수준의 절대 농도를 측정하고, 이를 참조 한계값 ROBO2 단백질 수준과 비교함으로써 결정될 수 있고, 또는 배수 차이는 참조 수치와 샘플 수치 사이의 상대적 차이에 의해 측정될 수 있고, 이에서 두 수치는 절대 농도의 양이 아니고, 및/또는 두 수치는 동시에 측정된다. 예를 들어, ELISA는 참조에서의 동일한 단백질의 절대 농도와 비교하여 그로부터 배수 변화가 결정되어지는 단백질의 절대 함량 또는 농도를 측정한다. 다른 예로서, 항체 어레이 분석법은 그로부터 배수 변화가 결정되어지는 상대적 농도를 측정한다. 따라서, 특정 진단을 제시하거나 나타내는 측정된 수치와 참조 수치 사이의 차이의 크기는 실시되는 방법에 따를 것이다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 모사 측정(replicate measurement)이 ROBO2 단백질 수준의 측정을 위해 선택되는 경우, 대상체로부터의 측정된 수치는 참조 한계값 ROBO2 단백질 수준과 비교되고, 모사 측정에 참작될 수 있다. 모사 측정은 평균 또는 중간의 측정된 수치를 사용하여 참작될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 비교 과정은 수동일 수 있고, 바람직하게는 이는 자동적일 수 있다. 예를 들어, 분석 장치 (예컨대 화학발광 신호를 측정하기 위한 발광측정기)는 대상체로부터의 수치와 ROBO2 단백질에 대한 참조 수치를 비교할 수 있게 하는 회로 및 소프트웨어를 포함할 수 있다. 대안적으로, 별개의 장치 (예를 들어, 디지털 컴퓨터)가 대상체(들)로부터의 측정된 ROBO2 단백질 수준과 ROBO2 단백질의 참조 한계 수준을 비교하기 위해 사용될 수 있다. 비교를 위한 자동화 장치는 ROBO2 단백질에 대한 저장된 참조 수치를 포함할 수 있고, 또는 대상체(들)로부터의 측정된 ROBO2 단백질 수준과 동시 측정된 참조 샘플로부터 유도된 ROBO2 단백질에 대한 참조 한계 수준을 비교할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, ROBO2 단백질 수준에 대해 시험한 대상체는 본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 결과에 기초하여 2 개 이상의 그룹 (상태) 중 하나로 배정된다. 본원에 기술된 진단 분석법, 방법, 및 시스템은 다수의 상이한 상태들을 분류하는데 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에 있어서, 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 높은 위험을 가지는지 (상태: 저-위험 대 고 위험)를 결정하는 것은 본원에 기술된 진단 분석법, 방법, 및 시스템을 사용하여 수행된다. 다양한 위험 상태, 예를 들어 높음, 중간 또는 낮음의 특징으로 결정되는 ROBO2 단백질의 바이오마커 양 또는 패턴이 확인된다. 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 발전 위험은 ROBO2 단백질 단독 또는 다른 알려진 바이오마커와 조합하여 측정하고, 이후 이들을 분류 알고리즘에 제공하거나 이들을 특정 위험 수준과 관련되는 참조 양 (예를 들어, 본원에 개시된 컷 오프 참조 양(cut off reference amount)과 비교함으로써 결정된다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에서는 대상체에 있어서의 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 갖는 것의 심각성 또는 단계 또는 위험을 결정하기 위한 진단 분석법, 방법, 및 시스템이 제공된다. 만성 신장 질환의 각각의 단계는, 예를 들어, ROBO2 단백질의 특징적 양 또는 ROBO2 단백질의 상대적 양을 가진다. 질환의 단계는 ROBO2 단백질을 단독 또는 다른 바이오마커와 조합하여 측정하고, 이후 이들을 분류 알고리즘에 제공하거나 이들을 특정 상태, 예를 들어 대상체에서 얼마나 빨리 만성 신장 질환 또는 단백뇨가 발전될지와 관련된 바이오마커의 참조 양 및/또는 패턴과 비교함으로써 결정된다. 예를 들어, 일년 이내 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가질 가능성이 있는 것 (예를 들어, 나쁜 예후) 또는 차후 5 년 이내 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가질 가능성이 있는 대상체로 분류할 수 있다.
진단 분석법, 방법, 및 시스템의 추가적인 실시형태는 예를 들어 기술자, 의사 또는 환자에게의 결과 또는 진단 또는 이 둘의 통신(communication)과 관련된다. 특정 실시형태에 있어서, 컴퓨터는 관심 대상의 당사자, 예를 들어, 의사 및 이의 환자에게 분석 결과 또는 진단 또는 이 둘을 통신하는데 사용된다. 일부 실시형태에 있어서, 분석법은, 예를 들어, 결과 또는 진단이 통신되는 국가 또는 관할권과 상이한 국가 또는 관할권에서 분석된 분석 결과에 대해 수행된다. 일부 실시형태에 있어서, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서의 ROBO2 단백질의 수준에 기초한 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가질 위험은 수준 또는 예후를 얻은 후 대상체에게 통신된다. 예후 또는 진단은 환자를 치료하는 의사에 의해 대상체에게 통신될 수 있다. 대안적으로, 예후 또는 진단은 이메일에 의해 대상체에게 보내지거나 전화에 의해 대상체에게 통신될 수 있다. 컴퓨터는 이메일 또는 전화에 의해, 또는 보안 게이트웨이 환자-로그-인 서비스를 사용하여 인터넷을 통해 예후 또는 진단을 통신할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 예후 또는 진단 시험의 결과를 포함하는 메시지는 생성되어 통신분야의 당업자에게 익숙한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 조합을 사용하여 대상체에게 자동적으로 전달될 수 있다. 본원에 기술된 분석법, 방법, 및 시스템의 특정 실시형태에 있어서, 샘플을 분석하는 단계, 질환을 진단하는 단계, 및 분석된 결과 또는 진단을 통신하는 단계를 포함하는 방법 단계의 모두 또는 일부는 다양한 (예를 들어, 외국) 관할권에서 수행될 수 있다.
본원에 기술된 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험을 한정하거나 평가하는 진단 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, 분석법, 방법, 또는 시스템은 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가질 위험의 결정에 기초하여 대상체 치료를 관리하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 관리는 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가질 대상체 위험을 결정한 이후 의사 또는 임상가의 조치를 포함한다. 예를 들어, 의사가 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험이 있는 대상체를 진단하는 경우, 이후 치료의 특정 요법이 후속될 수 있다. 치료의 적절한 요법은, 제한 없이, 지도식 운동 프로그램; 혈압, 당 섭취, 및/또는 지질 수준의 조절; 및 약물 요법을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가질 위험의 진단은 환자가 만성 신장 질환으로 고통받는지 여부, 또는 환자가 관련 질환으로 고통받는지 여부를 결정하기 위해 추가로 시험하는 것이 후속될 수 있다. 또한, 진단 시험이 주요 부작용 상태의 위험에 대해 결론에 도달하지 못하는 경우, 추가의 시험이 요구될 수 있다. 본원에 기술된 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험을 한정하거나 평가하는 진단 분석법, 방법, 및 시스템의 일부 실시형태에 있어서, 의사가 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험이 없는 것으로 진단하는 경우, 이후 어떠한 치료도 제공되지 않는다.
본원에 기술된 분석법 및 ROBO2 검출 방법은 로봇공학 및 시스템이 연결된 컴퓨터를 사용하여 자동화될 수 있다. 생물학적 샘플, 예컨대 소변, 혈장, 또는 혈액 샘플은 시스템, 예컨대 샘플 입력에서 결과의 출력까지 로봇 스테이션에 의해 전적으로 실행되는 미세유체 소자로 주입될 수 있다.
따라서, 또한 일부 양태에 있어서, 본원에서는 발현 프로파일 또는 서열 정보에 기초하여 개체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨 또는 만성 신장 질환 또는 단백뇨에 대한 성향을 가지는지를 결정하기 위한 방법을 수행하기 위한 시스템 (및 컴퓨터 시스템을 구동하기 위한 컴퓨터 판독가능 매체)를 제공한다.
일부 양태에 있어서, 본원에서는 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 갖거나 증가된 위험이 있는지를 평가하기 위한 시스템을 제공하고, 그 시스템은 하기를 포함한다: (a) 하나 이상의 생물학적 샘플을 받고 그 생물학적 샘플에서 ROBO2의 수준을 측정하기 위해 상기 생물학적 샘플에 대한 하나 이상의 분석을 수행하거나 미리-정해진 또는 한계 참조 수준에 대한 ROBO2의 발현 비율을 결정하고 그리고 상기 측정된 수준 또는 발현 비율을 출력하도록 구성되는 결정 모듈; (b) 상기 결정 모듈로부터 데이터 출력 정보를 저장하도록 구성되는 저장 장치; (c) 상기 저장 장치로부터 입력을 수신하고 저장 장치에 저장된 데이터와 하나 이상의 참조 한계값 ROBO2 수준을 비교하도록 적용된 비교 모듈, 측정된 ROBO2 단백질 수준이 참조 한계 수준보다 적어도 동일하거나 더 큰 경우, 상기 비교 모듈은 생물학적 샘플이 참조 한계값 바이오마커 수준으로부터 벗어난 대상체와 연관이 있다는 정보를 출력 모듈로 제공함; 및 (d) 사용자에게 상기 정보를 디스플레이하기 위한 출력 모듈.
본 발명의 모든 양태에 있어서, ROBO2 단백질의 수준을 결정하기 위한 방법은 자동화 기계 또는 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 기계 및 시스템은 보고서를 생성하고, 예컨대 가시적 화면에의 보고서 또는 ROBO2 단백질의 수준을 나타내고/내거나 ROBO2 단백질에 대한 참조 한계 수준 대비 증가하거나 동일한지 여부, 및/또는 샘플을 얻은 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 위험이 있는지를 보고하는 인쇄가능한 보고서를 디스플레이한다.
따라서, 본원에 기술된 일부 양태는 또한 (i) ROBO2 단백질의 수준을 결정하는 단계, 및 (ii) 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 가질 위험이 있는지를 나타내거나 보고하는 단계를 수행하기 위한 기계, 컴퓨터 시스템 및 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다.
이러한 양태의 실시형태는 컴퓨터 판독가능 매체에 기록된 컴퓨터 실행가능 명령에 의해 한정되고 실행시 방법 단계를 수행하도록 컴퓨터를 구동하는, 기능 모듈을 통해 기술된다. 상기 모듈은 명확하게 하기 위해 기능에 의해 분리된다. 그러나, 상기 모듈은 코드의 이격된 블록과 일치될 필요는 없고 기술된 기능은 다양한 매체에 저장된 다양한 코드 부분의 실행에 의해 수행되고 다양한 시간에 실행될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 상기 모듈은 다른 기능을 수행할 수 있고, 이에 따라 상기 모듈은 임의의 특정 기능 또는 일련의 기능을 갖는 것으로 제한되지 않음이 인정되어야 한다.
컴퓨터 판독가능 매체는 컴퓨터에 의해 접근할 수 있는 임의의 이용가능한 텐저블 매체(tangible media)일 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 정보 예컨대 컴퓨터 판독가능 지시, 데이터 구조, 프로그램 모듈 또는 다른 데이터의 저장을 위한 임의의 방법 또는 기술에서 실행되는 휘발성 및 비-휘발성, 제거가능 및 비-제거가능 텐저블 매체를 포함한다. 컴퓨터 판독가능 매체는, 이에 제한되지 않지만, RAM (random access memory), ROM (read only memory), EPROM (eraseable programmable read only memory), EEPROM (electrically eraseable programmable read only memory), 플래쉬 메모리 또는 다른 메모리 기술, CD-ROM (compact disc read only memory), DVD (digital versatile disks) 또는 다른 광학 저장 매체, 자기 카세트, 자기 테이프, 자기 디스크 저장 또는 다른 자기 저장 매체, 다른 유형의 휘발성 및 비-휘발성 메모리, 및 원하는 정보를 저장하는데 사용할 수 있고 상기 중 임의의 적합한 조합을 포함하는 컴퓨터에 의해 접근할 수 있는 임의의 다른 텐저블 매체를 포함한다.
컴퓨터-판독가능 매체들, 또는 컴퓨터 판독가능 매체에서 구현되는 컴퓨터-판독가능 데이터는 예를 들어 결과적으로 컴퓨터에 의해 실행되는 결과로서 본원에 기술된 하나 이상의 기능 (예를 들어, 시스템, 또는 컴퓨터 판독가능 매체와 관련된 것), 및/또는 다양한 실시형태, 변형예 및 이의 조합을 수행하도록 컴퓨터를 지시하는, 하나 이상의 프로그램의 일부로서 지시를 정의할 수 있다. 이러한 지시는 다수의 프로그래밍 언어, 예를 들어 자바, J#, 비주얼 베이직, C, C#, C++, 포트란, 파스칼, 에펠, 베이직, 코볼 어셈블리 언어 등, 또는 이의 임의의 다양한 조합 중 임의의 것으로 작성될 수 있다. 이러한 지시가 포함된 컴퓨터-판독가능 매체는 본원에 기술된 시스템, 또는 컴퓨터 판독가능 매체 중 하나 이상의 부품에 속할 수 있고, 하나 이상의 이러한 부품에 분산되어 있을 수 있고, 이들 사이에 있을 수 있다.
컴퓨터-판독가능 매체는 이에 저장된 지시가 본원에 논의된 본 발명의 양태를 실행하기 위한 임의의 컴퓨터 자원에 탑재될 수 있도록 운반가능할 수 있다. 추가적으로, 상기 기술된 컴퓨터 판독가능 매체들, 또는 컴퓨터-판독가능 매체에 저장된 지시는 호스트 컴퓨터에서 수행되는 응용 프로그램의 일부로서 구현된 지시로 제한되지 않는다. 오히려, 지시는 본 발명의 양태를 실시하기 위해 컴퓨터를 프로그래밍하는데 이용될 수 있는 임의의 유형의 컴퓨터 코드 (예를 들어, 소프트웨어 또는 마이크로코드)로서 구현될 수 있다. 컴퓨터 실행가능 지시는 적합한 컴퓨터 언어 또는 다양한 언어의 조합으로 작성될 수 있다. 베이직 계산 생물학 방법 (basic computational biology method)은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Setubal and Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics : Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000) and Ouelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001)]에 기술되어 있다.
본원에 기술된 양태의 특정 실시형태의 기능 모듈은 결정 모듈, 저장 장치, 비교 모듈 및 디스플레이 모듈을 포함한다. 기능 모듈은 하나, 또는 다중 컴퓨터에서, 또는 하나, 또는 다중 컴퓨터 네트워크 또는 컴퓨터 시스템을 사용하여 실행될 수 있다.
일부 양태에 있어서, 본원에서는 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 갖거나 위험이 있는지를 결정하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 컴퓨터 시스템은 결정 모듈과 접속되고 생물학적 샘플과 관련된 결정 모듈로부터 출력 데이터를 얻도록 구성되고, - 상기 결정 모듈은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서의 ROBO2 단백질의 수준을 검출하도록 구성됨 -; 컴퓨터 시스템은 (a) 결정 모듈로부터의 데이터 출력 및 참조 데이터를 저장하도록 구성되는 저장 장치를 포함하고; 상기 저장 장치는 일부 실시형태에 있어서 저장 장치에 저장되는 출력 데이터와 저장된 참조 데이터를 비교하도록 적용되고, 대안적인 실시형태에 있어서, 출력 데이터와 그 자체를 비교하도록 적용된 (b) 비교 모듈에 접속되고, 상기 비교 모듈은 보고 데이터를 생성하고 클라이언트 컴퓨터 상에 사용자를 위한 검색된 컨텐츠 (즉, 비교 모듈로부터의 보고 데이터)의 페이지를 디스플레이하기 위한 (c) 디스플레이 모듈에 접속되고, 상기 검색된 컨텐츠는 ROBO2의 수준, 및/또는 장차 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 겪을 가능성을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 결정 모듈은 발현 데이터, 서열 정보, 서열 정보와 관련된 정보를 컴퓨터 판독가능 형태로 제공하는 컴퓨터 실행가능 지시를 가진다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "서열 정보"는 이에 제한되지 않지만 전장 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열, 부분적 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열, 또는 돌연변이 서열을 포함하는, 임의의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 지칭한다. 또한, 서열 정보와 "관련되는" 정보는 서열의 존재 또는 부재의 검출 (예를 들어, 돌연변이 또는 결실의 검출), 샘플에서의 서열의 농도의 결정 (예를 들어, 아미노산 서열 발현 수준, 또는 뉴클레오티드 (RNA 또는 DNA) 발현 수준) 등을 포함한다. 용어 "서열 정보"는 변역후 변형 (예를 들어, 인산화, 글리코실화, 수밀화(summylation), 파르네실화 등)의 존재 또는 부재를 포함하는 것으로 의도된다.
예로서, ROBO2 서열 또는 핵산 발현 정보를 결정하기 위한 결정 모듈은 Hitachi FMBIO
Figure 112014073912652-pct00009
및 Hitachi FMBIO
Figure 112014073912652-pct00010
II Fluorescent Scanners (Hitachi Genetic Systems 사제, Alameda, California); SPECTRUMEDIX
Figure 112014073912652-pct00011
SCE 9610 Fully Automated 96-Capillary Electrophoresis Genetic Analysis Systems (SpectruMedix LLC 사제, State College, Pennsylvania); ABI PRISM
Figure 112014073912652-pct00012
377 DNA Sequencer, ABI
Figure 112014073912652-pct00013
373 DNA Sequencer, ABI PRISM
Figure 112014073912652-pct00014
310 Genetic Analyzer, ABI PRISM
Figure 112014073912652-pct00015
3100 Genetic Analyzer, 및 ABI PRISM
Figure 112014073912652-pct00016
3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems 사제, Foster City, California); Molecular Dynamics FLUORIMAGER™575, SI Fluorescent Scanners, 및 Molecular Dynamics FLUORIMAGER™595 Fluorescent Scanners (Amersham Biosciences UK Limited 사제, Little Chalfont, Buckinghamshire, England); GENOMYXSC™DNA Sequencing System (Genomyx Corporation 사제, (Foster City, California); 및 PHARMACIA ALF™DNA Sequencer 및 Pharmacia ALFEXPRESS™ (Amersham Biosciences UK Limited 사제, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)를 포함하는 자동 서열 분석을 위한 알려진 시스템을 포함할 수 있다.
서열 또는 단백질 정보를 결정하기 위한 일부 실시형태에 있어서, 결정 모듈은 단백질 및 DNA 분석을 위한 시스템을 포함한다. 예를 들어, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비행시간 (MALDI-TOF) 시스템을 포함하는 질량 분석기 시스템; SELDI-TOF-MS 단백질칩 어레이 프로파일링 시스템, 예를 들어 Machines with CIPHERGEN PROTEIN BIOLOGY SYSTEM II™ 소프트웨어; 유전자 발현 데이터를 분석하기 위한 시스템 (예를 들어 U.S. 2003/0194711 참조); 발현 분석에 기초한 어레이용 시스템, 예를 들어 HT array systems 및 cartridge array systems, Affymetrix 사제 (Santa Clara, CA 95051) AutoLoader, COMPLETE GENECHIP
Figure 112014073912652-pct00017
Instrument System, Fluidics Station 450, Hybridization Oven 645, QC Toolbox Software Kit, Scanner 3000 7G, Scanner 3000 7G plus Targeted Genotyping System, Scanner 3000 7G Whole-Genome Association System, GENETITAN™ Instrument, GeneChip
Figure 112014073912652-pct00018
Array Station, HT Array; 자동화된 ELISA 시스템 (예를 들어, DSX
Figure 112014073912652-pct00019
or DS2
Figure 112014073912652-pct00020
form Dynax, Chantilly, VA or the ENEASYSTEM III
Figure 112014073912652-pct00021
, TRITURUS
Figure 112014073912652-pct00022
, THE MAGO
Figure 112014073912652-pct00023
Plus); 농도계 (예를 들어, X-Rite-508-Spectro Densitometer
Figure 112014073912652-pct00024
, The HYRYS™ 2 densitometer); 자동화된 형광 인시츄 혼성화 시스템(automated Fluorescence in situ hybridization system) (예를 들어, 미국특허 제6,136,540호 참조); 2-D 이미징 소프트웨어가 결합된 2D 겔 이미징 시스템; 마이크로플레이트 리더; 형광 활성화 세포 분류기 (FACS) (예를 들어, Flow Cytometer FACSVantage SE, Becton Dickinson); 방사성 동위원서 분석기 (예를 들어, 신틸레이션 계수기), 또는 이의 조합.
본 발명의 이러한 양태 및 모든 다른 양태의 일부 실시형태에 있어서 다양한 소프트웨어 프로그램 및 양식이 저장 장치에 바이오마커 단백질 수준 정보를 저장하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 수의 데이터 프로세서 구조화 양식 (예를 들어, 텍스트 파일 또는 데이터베이스)이 이에 기록된 서열 정보 또는 발현 수준 정보를 갖는 매체를 얻거나 만들기 위해 사용될 수 있다.
결정 모듈에서 결정된 ROBO2 발현 정보 또는 ROBO2 발현 정보와 관련된 정보는 저장 장치에 의해 판독될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "저장 장치"는 임의의 적합한 컴퓨팅 또는 처리 장치 또는 데이터 또는 정보를 저장하기 위해 구성되거나 적용되는 다른 장치를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 전자 장치의 예는 독립형 컴퓨팅 장치(stand-alone computing apparatus), 근거리 통신망 (LAN), 광역 통신망 (WAN), 클라우드 저장 시스템, 인터넷, 인트라넷, 및 엑스트라넷을 포함하는 데이터 통신 네트워크, 및 로컬 및 분산 컴퓨터 프로세싱 시스템(local and distributed computer processing system)을 포함한다. 저장 장치는 또한, 이에 제한되지 않지만 하기를 포함한다: 자기 저장 메체, 예컨대 플로피 디스크, 하드 디스크, 저장 매체, 자기 테이프, 광학 저장 매체 예컨대 CD-ROM, DVD, 전자 저장 매체 예컨대 RAM, ROM, EPROM, EEPROM 등, 클라우드 저장 시스템, 일반적인 하드 디스크 및 이러한 부류의 혼성체 예컨대 자기/광학 저장 매체. 저장 장치는 이에 기록된 서열 정보 또는 발현 수준 정보를 갖기 위해 적용되거나 구성된다. 이러한 정보는 전자적으로, 예를 들어 인터넷을 통해, 클라우드 시스템을 통해, 디스켓 상에, USB (universal serial bus)를 통해, 또는 임의의 다른 적합한 통신 방식을 통해 전송되고 판독될 수 있는 디지털 형태로 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "발현 수준 정보"는 이에 제한되지 않지만 전장 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열, 부분 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열, 또는 돌연변이 서열을 포함하는 임의의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 발현 수준 정보를 지칭한다. 또한, 발현 수준 정보와 "관련된" 정보는 서열의 존재 또는 부재 (예를 들어, 아미노산 서열, 뉴클레오티드 서열, 또는 전사후 변형의 존재 또는 부재)의 검출, 샘플에서의 서열의 농도 (예를 들어, 아미노산 서열 수준, 또는 뉴클레오티드 (RNA 또는 DNA) 발현 수준, 또는 번역후 변형의 수준)의 결정 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "저장된"은 저장 장치에 정보를 암호화하기 위한 과정을 지칭한다. 당업자는 알려진 매체에 정보를 기록하기 위해 현재 알려진 임의의 방법을 용이하게 적용하여 서열 정보 또는 발현 수준 정보를 포함하는 제품을 생성할 수 있다.
다양한 소프트웨어 프로그램 및 양식은 저장 장치에 서열 정보 또는 발현 수준 정보를 저장하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 수의 데이터 프로세서 구조화 양식 (예를 들어, 텍스트 파일 또는 데이터베이스)는 이에 기록된 서열 정보 또는 발현 수준 정보를 가지는 매체를 얻거나 만들기 위해 사용될 수 있다.
컴퓨터-판독가능 형태로 서열 정보 또는 발현 수준 정보를 제공함으로써, 특정 서열 또는 발현 프로파일을 저장 장치 내의 참조 데이터와 비교하기 위해 비교 모듈에서의 판독가능한 형태의 서열 정보 또는 발현 수준 정보를 사용할 수 있다. 예를 들어, 서치 프로그램은 특정 서열 (참조 데이터, 예를 들어, 대조군 샘플로부터 얻어진 서열 정보)과 일치하는 서열의 절편 또는 부위를 확인하기 위해 사용될 수 있고 또는 결정된 발현 수준의 직접 비교는 참조 데이터 발현 수준 (예를 들어, 대조군 샘플로부터 얻어진 발현 수준 정보)에 대해 비교될 수 있다. 컴퓨터-판독가능 형태로 이루어진 비교는 다양한 수단에 의해 처리될 수 있는 컴퓨터 판독가능 비교 결과를 제공한다. 비교 결과에 기초한 컨텐츠는 특정 질환 또는 장애, 예컨대 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 나타내기 위해 비교 모듈로부터 검색될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 비교 모듈에 의해 판독되는 저장 장치에 저장된 참조 데이터는 시험되는 생물학적 샘플과 동일한 유형의 대조군 생물학적 샘플로부터 얻어진 ROBO2 서열 또는 발현 정보 데이터이다. 대안적으로, 참조 데이터는 데이터베이스, 예를 들어, 유기체의 전체 게놈 서열의 일부, 또는 서열의 단백질 패밀리, 또는 발현 수준 프로파일 (RNA, 단백질 또는 펩티드)이다. 일부 실시형태에 있어서, 참조 데이터는 특정 질환 또는 장애, 예컨대 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 나타내는 서열 정보 또는 발현 수준 프로파일이다.
일부 실시형태에 있어서, 참조 데이터는 이에 제한되지 않지만 GenBank (NCBI) 단백질 및 DNA 데이터베이스 예컨대 게놈, ESTs, SNPS, Traces, Celara, Ventor Reads, Watson reads, HGTS 등; 생물정보학 스위스 연구기관 데이터베이스, 예컨대 ENZYME, PROSITE, SWISS-2DPAGE, Swiss-Prot 및 TrEMBL 데이터베이스, Melanie software package 또는 ExPASy WWW 서버 등; SWISS-MODEL, Swiss-Shop 및 다른 네트워크-기반 컴퓨터 장치; Comprehensive Microbial Resource database (게놈 연구 기관으로부터 이용가능함)를 포함하는 데이터베이스로부터 전자적으로 또는 디지털 방식으로 기록되고 주석이 기록된다. 생성된 정보는 참조 데이터 또는 게놈 내 및 그 중의 유전자 또는 단백질 사이에서의 상동성을 결정하기 위해 이용될 수 있는 관련 데이터 베이스에 저장될 수 있다.
비교 모듈에서 판독가능한 형태로 ROBO2의 수준을 제공함으로써, 이는 저장 장치 내의 ROBO2의 참조 한계 수준과 비교하기 위해 사용될 수 있다. 컴퓨터-판독가능 형태로 이루어진 비교는 다양한 수단에 의해 처리될 수 있는 컴퓨터 판독가능 컨텐츠를 제공한다.
"비교 모듈"은 참조 ROBO2 서열 또는 발현 수준 데이터에 대해 결정 모듈에서 결정되는 ROBO2 서열 또는 발현 수준 정보를 비교하기 위해 이용되는 비교를 위한 다양한 이용가능한 소프트웨어 프로그램 및 양식을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 비교 모듈은 하나 이상의 참조 데이터 패턴에 대해 하나 이상의 대상으로부터의 ROBO2 서열 또는 발현 수준 데이터와 비교하기 위해 패턴 인식 기술을 사용하도록 구성된다. 비교 모듈은 패턴을 비교하기 위한 현재 시판되거나 자유롭게 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 구성될 수 있고, 수행되는 특정 데이터 비교를 위해 최적화될 수 있다. 비교 모듈은, 예를 들어, 서열의 존재 또는 부재의 검출 (예를 들어, 돌연변이 또는 결실 (단백질 또는 DNA)의 검출, 별개의 대립 형질에 관한 정보, 번역후 변형, 또는 서열의 생략 또는 반복의 검출); 샘플에서의 서열의 농도의 결정 (예를 들어, 아미노산 서열/단백질 발현 수준, 또는 뉴클레오티드 (RNA 또는 DNA) 발현 수준, 또는 번역후 변형의 수준), 또는 발현 프로파일의 결정을 포함할 수 있는 서열 정보에 관한 컴퓨터 판독가능 정보를 제공한다.
일부 실시형태에 있어서, 비교 모듈은 결정 모듈의 출력 데이터로부터의 ROBO2의 수준과 각 ROBO2에 대한 참조 한계 수준 데이터와의 비교를 가능하게 한다.
일부 실시형태에 있어서, 비교 모듈은 질량-분석 스펙트럼을 사용한 비교를 수행하고, 예를 들어 펩티드 절편 서열 정보의 비교는 "Qcealign" (예를 들어 참조로 본원에 포함되는 WO2007/022248 참조), 및 "Qpeaks" (Spectrum Square Associates, Ithaca, NY)로 지칭되는 스크립트를 가진 MATLB, 또는 Ciphergen Peaks 2.1™ 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 처리되는 스펙트럼은 이후 기준치 정정 데이터를 선택함으로써 최소 엔트로피 알고리즘을 사용하여 샘플 데이터를 대조군 데이터에 맞추어 조정하는 정렬 알고리즘(alignment algorithm)을 사용하여 정렬될 수 있다 (예를 들어, 참조로 본원에 포함되는 WIPO 공개 WO2007/022248 참조). 비교 결과는 비율 계산에 의해 추가로 처리될 수 있다. 단백질 발현 프로파일은 식별될 수 있다.
이에 제한되지 않지만, Ciphergen Express (CE) 및 Biomarker Patterns Software (BPS) 패키지, Ciphergen Biosystems, Inc. 사제, CA, USA를 포함하는 임의의 이용가능한 비교 소프트웨어가 사용될 수 있다. 비교 분석은 단백질 칩 시스템 소프트웨어로 실시될 수 있다 (예를 들어, Bio-Rad Laboratories에 대한 the Proteinchip suite).
본원에 기술된 비교 모듈, 또는 임의의 다른 모듈은 관련 데이터베이스 관리 시스템, 웹 애플리케이션, 및 웹 서버가 실행되는 작동 시스템 (예를 들어, UNIX)을 포함할 수 있다. 웹 애플리케이션은 데이터베이스 언어 문장 (예를 들어, 구조화 질의어 (SQL) 문장)을 생성하기 위해 필요한 실행 코드를 포함한다. 일반적으로, 실행가능한 것은 내장 SQL 문장을 포함할 것이다. 추가적으로, 웹 애플리케이션은 포인터(pointer)를 포함하고 서버 및 서비스 사용자 요청에 접근하여야 하는 다양한 외부 및 내부 데이터베이스를 포함하는 다양한 소프트웨어 독립체에 어드레스하는 구성 파일을 포함할 수 있다. 구성 파일은 또한 서버 리소스(server resource)에 대한 요청을 서버가 2 개 이상의 별개의 컴퓨터에 분산된 경우 필요할 수 있는 적절한 하드웨어에 지시한다. 일부 실시형태에 있어서, 웹 서버는 TCP/IP 프로토콜을 지지한다. 이와 같은 근거리 통신망은 때대로 "인트라넷"으로서 지칭된다. 이 인트라넷의 장점은 이들 웹에 속해 있는 공용 도메인 데이터베이스(예를 들어, GenBank or Swiss Pro World Wide Web site)와 용이하게 통신할 수 있게 한다는 점이다. 따라서, 일부 바람직한 실시형태에 있어서, 사용자는 웹 브라우저 및 웹 서버에서 제공하는 HTML 인터페이스를 사용하여 인터넷 데이터베이스에 속해있는 데이터에 (예를 들어 하이퍼 링크를 통해) 직접 접근할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 비교 모듈은 유전자 발현 프로파일을 비교한다. 예를 들어, 유전자 발현 프로파일의 검출은 Affymetrix Microarray Suite software version 5.0 (MAS 5.0) (Affymetrix 사제, Santa Clara, California)를 사용하여 결정하여 프로브 세트로부터의 신호의 강도에 기초하여 유전자 또는 유전자들의 상대적 존재비를 분석할 수 있고, MAS 5.0 데이터 파일은 데이터베이스로 이송되어 Microsoft Excel 및 GeneSpring 6.0 소프트웨어 (Agilent Technologies 사제, Santa Clara, California)로 분석될 수 있다. MAS 5.0 소프트웨어의 검출 알고리즘은 얼마나 많은 전사물이 주어진 샘플에서 검출되는지의 종합적인 검토를 얻기 위해 사용될 수 있고 2 개 이상의 마이크로어레이 데이터 세트의 비교 분석을 가능하게 한다.
일부 실시형태에 있어서, 비교 모듈은 단백질 발현 프로파일을 비교한다. 이에 제한되지 않지만, Ciphergen Express (CE) 및 Biomarker Patterns Software (BPS) 패키지 (Ciphergen Biosystems, Inc. 사제, Freemont, California)를 포함하는 임의의 이용가능한 비교 소프트웨어가 사용될 수 있다. 비교 분석은 단백질 칩 시스템 소프트웨어 (예를 들어, The Proteinchip suite (Bio-Rad Laboratories 사제, Hercules, California)로 실시될 수 있다. 발현 프로파일을 확인하기 위한 알고리즘은 최적 알고리즘 예컨대 평균 분산 알고리즘 (예를 들어, JMP Genomics 알고리즘, JMP Software Cary 사제, North Carolina)의 사용을 포함할 수 있다.
비교 모듈은 디스플레이 모듈을 사용하는 사용자의 요청에 의해 저장되고 출력될 수 있는 비교 결과에 부분적으로 기초한 컨텐츠를 제공하기 위해, 미리 정의된 기준, 또는 사용자에 의해 정의된 기준에 의해 컴퓨터 판독가능 형태로 처리될 수 있는 컴퓨터 판독가능 비교 결과를 제공한다. 디스플레이 모듈은 사용자에 대하여 비교 결과에 부분적으로 기초한 컨텐츠의 디스플레이를 가능하게 하고, 이에서 컨텐츠는 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 나타내는 신호이다. 이러한 신호는, 예를 들어, 컴퓨터 모니터에 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 존재 또는 부재를 나타내는 컨텐츠, 프린터로부터의 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 존재 또는 부재를 나타내는 컨텐츠의 인쇄된 페이지, 또는 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 존재 또는 부재를 나타내는 빛 또는 소리의 디스플레이일 수 있다.
비교 결과에 기초한 컨텐츠는 하나 이상의 단백질의 발현 프로파일, 또는 하나 이상의 유전자의 발현 프로파일을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 비교 결과에 기초한 컨텐츠는 ROBO2 단백질 수준에 기초하여 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 존재 또는 부재를 나타내는 단지 신호이다.
일부 실시형태에 있어서, 비교 결과에 기초한 컨텐츠는 컴퓨터 모니터에 디스플레이된다. 본 발명의 한 실시형태에 있어서, 비교 결과에 기초한 컨텐츠는 인쇄가능한 매체를 통해 디스플레이된다. 본 발명의 한 실시형태에 있어서, 비교 결과에 기초한 컨텐츠는 빛 또는 소리 지표로서 디스플레이된다. 디스플레이 모듈은 컴퓨터로부터 수신하도록 구성되는 임의의 적합한 장치일 수 있고 사용자에게 컴퓨터 판독가능 정보를 디스플레이한다. 비-제한적인 예는, 예를 들어, 예컨대 인텔 펜티엄-유형 프로세서에 기한 범용 컴퓨터, 애플 컴퓨터 및 태블릿 장치, 모토로라 PowerPC, Sun UltraSPARC, 휴렛-패커드(Hewlett-Packard) PA-RISC 프로세서, 임의의 다양한 프로세서 (Advanced Micro Devices (AMD) of Sunnyvale 사제, California), 또는 다른 유형의 프로세서, 태블릿 장치와 같은 시각 디스플레이 장치, 스마트폰 모바일 장치, 평면 디스플레이, 음극선관 등, 및 다양한 유형의 컴퓨터 프린터를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 웹 브라우저는 비교 결과에 기초한 컨텐츠의 디스플레이를 위한 사용자 인터페이스를 제공하기 위해 사용된다. 본 발명의 다른 모듈은 웹 브라우저 인터페이스를 갖도록 적용될 수 있음을 이해하여야 한다. 웹 브라우저를 통해, 사용자가 비교 모듈로부터의 데이터를 처리하기 위한 요청을 구성할 수 있다. 따라서, 사용자는 통상적으로 사용자 인터페이스 요소 예컨대 그래픽 사용자 인터페이스에서 통상 이용되는 버튼, 풀 다운 메뉴(pull down menu), 스크롤 바 등을 포인팅하고 클릭할 수 있다. 사용자 웹 브라우저로 만들어진 요청은 서열 정보, 예를 들어 돌연변이 또는 결실 (DNA 또는 단백질)의 존재 또는 부재의 표시의 디스플레이; 아미노산 서열 (단백질)의 발현 수준의 디스플레이; 뉴클레오티드 (RNA 또는 DNA) 발현 수준의 디스플레이; 발현, SNP, 또는 돌연변이 프로파일, 또는 반수체형(haplotype)의 디스플레이, 또는 이에 기초한 정보의 디스플레이와 관련된 적절한 정보를 추출하기 위해 이용될 수 있는 질의를 생성하기 위해 이를 정형화하는 웹 애플리케이션으로 전송된다. 한 실시형태에 있어서, 참조 샘플 데이터의 서열 정보가 또한 디스플레이된다.
일부 실시형태에 있어서, 디스플레이 모듈은 비교 결과 및 비교 결과가 질환을 나타내는지, 예를 들어 ROBO2의 발현 프로파일이 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 나타내는지를 디스플레이한다.
일부 실시형태에 있어서, 디스플레이되는 비교 결과에 기초한 컨텐츠는 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 존재 또는 부재를 나타내는 신호 (예를 들어, 양성 또는 음성 신호)이고, 양성 또는 음성 지표만이 디스플레이될 수 있다.
따라서, 본원에서는 개체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨 또는 발현 프로파일 또는 서열 정보에 기초하는 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 성향을 가지는지를 결정하기 위한 분석법 및 방법을 수행하기 위한 시스템 (및 컴퓨터 시스템을 구동하는 컴퓨터 판독가능 매체)를 제공한다.
시스템 및 컴퓨터 판독가능 매체는 단지 개체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨 또는 발현 프로파일 또는 서열 정보에 기초하는 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 성향을 가지는지를 결정하는 분석법 및 방법을 수행하기 위한 본 발명의 예시적인 실시형태이고, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것으로 의도되지 않는다. 시스템, 및 컴퓨터 판독가능 매체의 변형예가 가능하고 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
시스템의 또는 컴퓨터 판독가능 매체에 사용되는 모듈은 수많은 구성이 가정될 수 있다. 예를 들어, 기능이 단일 기계에 제공되거나 복수의 기계에 걸쳐 분산될 수 있다.
Robo2 는 마우스 족세포의 기저 세포 표면에 국재화되는 족세포 단백질이다
신장 발달 과정에서, Robo2 mRNA는 나뭇가지 모양의 요관싹(arborizing ureteric bud)에 둘러싸인 뒤콩팥 중간엽(metanephric mesenchyme) 및 이후 S-형태 바디(S-shaped body)의 근위 말단 (Piper et al., 2000), 원시 족세포의 위치에서 발현된다. 초기 신장 유도(kidney induction)에서 이의 역할에 더하여, Robo2가 또한 족세포 성숙에 관련되는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 인시츄 혼성화를 수행하여 ROBO2 mRNA가 배아기 16.5일 (E16.5)에서의 마우스 배아의 발달중인 사구체의 모세혈관 고리 단계에서 발현되었음을 발견하였다 (도 5A 및 5B). Robo2 단백질은 E14.5 즈음의 발달중인 사구체에서 면역형광착색법에 의해 검출가능하게 되었고 E16.5에서 최대 발현에 도달되었다 (도 5C-5E). 발달 과정에서 E17.5 이후 발현이 감소됨에도 불구하고 (도 5F), 특정 Robo2 발현은 출생 후 사구체에서 유지되었고 5 주 연령에서의 성체 마우스에서 검출가능하였다 (도 5G, 5H, 5L-5M).
발달중인 사구체에서 Robo2의 세포내 국재화를 결정하기 위해, 사구체 세포 유형 특이적 마커로 이중-라벨 면역조직화학법(dual-label immunohistochemistry)을 수행하였다. 본 발명자들은 Robo2 단백질이 네프린 (도 1A- AC) 및 포도신 (도 1D-1F), 2개의 족세포 세극막과 관련 단백질과 공동-국재화된 것을 발견하였다. Robo2는 또한 네프린-상호작용 어댑터 단백질 Nck (도 1G, 1I) 및 족세포 핵의 구성성분, WT1 (도 5H-5K)와 사구체에서 공동-발현되었다. 니도겐, 기저막 마커 (도 1J-IL 및 1P) 및 Pecam1, 내피 세포 마커 (도 1M-1O, 5M)에 대한 항체에 의한 이중-라벨링은, Robo2가 사구체 기저막의 외부 표면에 인접하여 국재화되고 내피 세포에 없음을 나타내었다. 고해상도 공초점 현미경은 추가로 세포 이하의 Robo2가 족세포의 기저 표면에 가장 풍부하다는 것을 나타내었다 (도 1Q). 세포질 도메인에 대한 항체를 사용한 출생 후 마우스 신장의 면역금 전자 현미경(immunogold electron microscopy)은 Robo2가 세극막의 세포질면에 근접한 족세포 족 돌기에 국재화된다는 것을 확인하였다 (도 1R). 이러한 결과는 Robo2가 족세포 단백질이고 족 돌기에서의 이의 기저 세포내 국재화는 이것이 족세포 족 돌기 구조를 조절하는 역할을 한다는 것을 나타내는 것을 나타낸다.
Robo2 세포내 도메인은 어댑터 단백질 Nck 의 SH3 도메인과 직접적으로 상호작용한다
네프린 세포외 도메인 참여(engagement)는 Src 키나아제에 의한 이의 세포내 도메인의 티로신 인산화 및 순차적으로 액틴 중합을 유도하는 어댑터 단백질 Nck의 SH2 도메인의 리쿠루트를 초래한다 (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Nck는 C-말단에서 하나의 SH2 도메인 및 N-말단 근처의 3 개의 SH3 도메인을 함유한다. 액틴 중합은 Nck의 SH3 도메인에 의해 매개되고 (Rivera et al., 2004), 이는 N-WASP 및 Pak를 포함하는 다양한 세포골격 조절자(cytoskeleton regulator)를 리쿠르트할 수 있다 (Jones et al., 2006). 앞선 연구들은 초파리 Nck 상동 드레드락(Drosophila Nck homolog Dreadlock) (Dock)의 SH3 도메인이 또한 Robo의 세포내 도메인과 직접적으로 상호작용하여 액틴 중합을 억제한다는 것을 나타내었다 (Fan et al., 2003; Yang and Bashaw, 2006).
본 발명자들은 포유동물 Nck가 또한 족세포에서의 Robo2와 직접적으로 상호작용하여 F-액틴 세포골격을 조절할 수 있는지를 시험하였다. 이 질문에 대답하기 위해, 본 발명자들은 Robo2가 Nck와 상호작용하는지를 조사하기 위해 효모 투-하이브리드 분석법(yeast two-hybrid assay)을 사용하였다. 2 개의 포유동물 Nck (즉, Nck1, Nck2)가 신장 발달에서 유사한 구조 및 기능을 공유하기 때문에 (Jones et al., 2006), 본 발명자들은 본 연구에서 Nck1을 사용하였고 Robo2의 세포내 도메인이 Nck1과 직접적으로 상호작용함을 관찰하였다 (도 2A-2C). Nck1에 대한 Robo2에서 결합 부위 맵핑은, 4 개의 프롤린-풍부 모티브를 함유하는 아미노산 1085 내지 1301의 서열이 상호작용에 결정적임을 나타내었다 (도 2A 및 2C). 이 프롤린-풍부 영역의 부재는 이의 Nck1과의 상호작용을 방해하였다 (도 2A). Robo2에 대한 Nck1에서 결합 부위 맵핑은 최초 두 개의 SH3 도메인이, 이 중 하나 또는 둘 모두의 결실이 상호작용을 일으키지 않기 때문에, 이의 Robo2와의 상호작용을 위해 요구됨을 나타내었다 (도 2B). 따라서 Robo2 및 Nck1 상호작용은 2 개의 익히-특성화된 단백질 도메인, SH3 도메인 및 프롤린-풍부 모티프에 의해 매개되었다 (도 2C). CD2AP, 다른 족세포 어댑터 단백질은 또한 이의 N-말단에 3 개의 SH3 도메인을 함유하나 (Shih et al., 2001), 본 발명자들은 효모 투-하이브리드 또는 공-침전 분석법 중 하나에서 CD2AP 및 Robo2 사이에서의 어떤 상호작용도 검출하지 못하였다. 이러한 관찰은 족세포에서의 Robo2 및 Nck1 사이의 결합이 특이적 상호작용임을 나타낸다.
전장 Robo2 는 Nck 를 통해 네프린과의 복합체를 형성한다
본 발명자들은 풀 다운 및 공-침전 분석법(pull down and co-precipitation assay)에 의해 Robo2와 Nck 사이의 상호작용을 확인하였다. Nck1 결합 도메인 (His-myc-Robo2-△NBD)의 결실이 있는 His- 및 myc-태그가 붙은 인간 전장 Robo2 (His-myc-Robo2) 또는 his- 및 myc-태그가 붙은 인간 Robo2가 HEK 세포에서 발현되었다. 형질도입된 HEK 세포는 Slit2 조정 배지 (Slit2 안정화 형질도입 세포로부터 제조됨)로 자극시켜 Robo2를 활성화시키고 Nck 결합을 증가시켰다 (Fan et al., 2003). Nck는 Ni-NTA 비드를 사용하여 HEK 세포 용해액으로부터 His-myc-Robo2로 풀다운(pull down)되었으나 His-myc-Robo2-△NBD로는 그렇지 않았다 (도 2D). Nck의 SH2 도메인이 네프린 세포질 도메인 (NCD)에서 포스포티로신과 상호작용하기 때문에 (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006), 본 발명자들은 공-침전 분석법을 사용하여 Robo2가 Nck를 통해 네프린과의 복합체를 형성하였는지를 조사하였다. 원리의 증거를 확립하기 위해서, 본 발명자들은 Fyn 키나아제를 가진 HEK 세포에서 Robo2 및 네프린을 공동-발현시켜 네프린 인산화를 증가시켰다 (Verma et al., 2006). Ni-NTA 비드에 의한 HEK 세포 용해액으로부터의 His-myc-Robo2의 풀다운은, Fyn이 발현되었을 때 Nck 및 네프린을 공동-침전시켰다 (도 2E). 역 순서로, Fyn 키나아제가 발현되었을 때 His-myc-네프린의 풀다운은 Nck 및 Robo2를 공동-침전시켰다 (도 2F). 또한, 안티-Nck 항체로 제조된 침전물은 Fyn이 과발현되었을 때 Robo2 및 네프린 모두를 함유하였다 (도 6A). 이러한 데이터는 네프린, Nck, 및 Robo2가 생체외에서 복합체를 형성하는 것을 나타낸다. 이러한 발견을 생체내에서 입증하기 위해서, 본 발명자들은 신생 마우스 신장 용해액으로부터 Robo2를 면역침전시켰고 Nck 및 네프린이 공동-침전된 것을 발견하였다 (도 2G). 역으로, 안티-네프린 항체로 제조된 침전물은 또한 Nck 및 Robo2를 함유하였다 (도 2H). 네프린은 족세포에서 유일하게 발현되고, Nck 및 Robo2는 또한 신장의 이 세포에 국재화되기 때문에, 이러한 결과는 네프린, Nck, 및 Robo2가 족세포에서 복합체를 형성할 수 있음을 나타낸다.
Robo2-Nck-네프린 단백질 복합체의 형성에 있어서 Slit2의 역할을 결정하기 위해서, His-myc-Robo2, 네프린, 및 Fyn은 공동-침전 이전에 Slit2 조정 배지 또는 Slit2 없는 대조군 조정 배지로 자극된 HEK 세포에서 공동-발현되었다 (도 2I). 본 발명자들은 Slit2 자극이 Nck에 결합되는 Robo2 및 네프린과의 복합체 형성을 증가시키는 것을 관찰하였다. Nck1 대 Robo2 및 네프린 대 Robo2의 비율 모두가 Slit2 자극 이후 증가되었다 (도 2J). 이러한 발견과 같은 맥락으로, 본 발명자들은 Slit2가 신생 마우스 사구체에서 강하게 발현된 것을 관찰하였다 (도 6B, 6C).
Slit2 - Robo2 신호는 네프린 -유도 액틴 중합을 억제한다
Slit은 액틴 중합을 억제하는 Dock 및 srGAP를 리쿠르트하기 위해 Robo에 결합하기 때문에 (Fan et al., 2003), 본 발명자는 Robo2가 또한 액틴 중합을 촉진하는 네프린과 반대 역할로서 포유동물 세포에서 액틴 중합을 억제하기 위해 Nck를 리쿠르트하는지를 시험하고자 하였다. 이러한 질문을 다루기 위해, 본 발명자들은 앞서 기술된 CD16/7-NCD 키메라 단백질을 발현하는 세포에서의 F-액틴 테일(F-actin tail)을 분석함으로써 액틴 중합을 연구하였다 (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). 이 모델은 네프린 세포질 도메인 (NCD)에 융합된 인간 면역글로불린 Fc 수용체 CD16 및 CD7의 세포외 및 막관통 도메인을 이용한다. NCD가 HA 태그로 대체된 CD16/7-HA를 음성 대조군으로 사용하였다. 이 키메라 단백질은 HEK 세포에서 Robo2와 공동-발현되었고 안티-CD16 항체 및 로다민과 컨쥬게이션된 2차 항체로 처리함으로써 응집되었다. 본 발명자들은 우선 네프린 세포질 도메인의 응집이 Robo2를 리쿠르트할 수 있는지를 조사하였다. 본 발명자들은 대부분의 Robo2가 CD16/7-NCD 응집체 (CD16/7-NCD cluster)와 함께 공동-국재화되기 때문에 CD16/7-NCD의 참여가 Robo2를 응집체로 보내는 것을 관찰하였다 (도 6D-6F). 그러나, Robo2의 공동국재화는 CD16/7-HA 대조군 (도 6D')이나 Robo2 Nck 결합 도메인 (NBD)가 결실된 Robo2-△NBD 구조 (도 6E')으로 관찰되지 않았다. 흥미롭게도, Slit2의 부재의 경우, CD16/7-NCD 및 Robo2의 공동국재화는 상당하게 감소되었다 (도 6F'). 이러한 데이터는 네프린 세포질 도메인이 Slit2의 존재 하에서 Robo2 세포내 도메인과 복합될 수 있고 Robo2-Nck-네프린 복합체의 형성이 액틴 중합에 영향을 미치는지를 결정하기 위한 상기 모델을 입증하는 추가의 증거를 제공한다.
CD16/7-NCD 및 Robo2를 발현하는 HEK 세포는 안티-CD16 항체에 의해 응집되는 동안 Slit2 또는 Slit2 없는 대조군 조정 배지로 자극되었다. 액틴 중합은 가시적인 액틴 테일을 가지는 HEK 세포의 수를 정량화함으로써 평가되었다 (Rivera et al., 2004). 본 발명자들은 ~80%의 CD16/7-NCD 응집 세포는 앞서 보고된 팔로이딘 착색에 의해 나타날 수 있는 F-액틴 테일을 형성하는 것을 관찰하였다 (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). 그러나, Slit2 자극시, F-액틴 테일을 가진 세포의 수는 대략 40%로 상당하게 감소되었다 (도 3A 및 3C). 단지 소수의 세포가 대조군 CD16/7-HA 단백질이 응집되는 경우에 더 짧은 F-액틴 테일을 함유하는 것으로 관찰되었다 (도 3B 및 3C). 액틴 중합의 이러한 억제가 Nck를 요구하는지를 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 Robo2에 대한 Nck 결합의 차단이 네프린-유도 액틴 중합에 대한 Slit2-Robo2 억제를 방지할 것인지를 결정하기 위해 Nck 결합 도메인이 없는 Robo2 (Robo2-△NBD)를 사용하여 이 분석법을 반복하였다. CD16/7-NCD는 HEK 세포에서 전장 Robo2 (도 7A) 또는 Robo2-△NBD (도 7B)와 공동-발현되었다. 본 발명자들은 Robo2에서의 Nck 결합 도메인의 결실이 네프린-유도 액틴 중합에 대한 Slit2-Robo2 억제를 상당히 위태롭게 함을 관찰하였다 (도 7C).
앞선 연구는 네프린이 F-액틴 세포구조에 연결되는 것을 나타내었다 (Yuan et al., 2002). Slit2-Robo2 신호전달이 네프린과 연관된 F-액틴을 억제할 수 있는지를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 안티-CD16 항체로 CD16/7-NCD 및 CD16/7-HA를 면역침전시키고 웨스턴 블롯에 의해 침전물에서의 F-액틴의 양을 조사하였다. 본 발명자들은 네프린과 연관된 F-액틴의 양이 Slit2 자극시 상당하게 감소되는 것을 관찰하였다 (도 3D 및 3E). 역으로, 생체내 면역침전 분석법은 Robo2 널 신생 마우스 신장으로부터의 안티-네프린 항체에 의해 면역침전된 네프린과 연관된 F-액틴이 야생형 또는 Robo2 이형접합 마우스 신장으로부터의 그것과 비교하여 상당하게 증가한 것을 나타내었다 (도 3F 및 3G). 취합하여 생각해보면, 이 결과는 Slit2-Robo2 신호전달이 네프린-유도 액틴 중합을 억제한다는 것을 나타낸다.
족세포에서의 Robo2 의 손실은 마우스 에서 변경된 족세포 족 돌기 구조를 야기한다
본 발명자 및 이외 다른 사람들은 혼합된 유전전 배경에서의 거의 모든 ROBO2 동형접합 널 마우스는 심한 CAKUT 표현형으로 인해 출생 후 바로 죽는 것을 앞서 나타내었다 (Grieshammer et al., 2004; Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). C57BL/6 유전적 배경에 대해 5 세대 동안 Robo2 del5 돌연변이 대립유전자를 갖는 마우스를 번식시킨 후, Robo2 del5 /+ 이형접합 부모와의 교배는 (이유(weaning) 시에 분석한 총 160 마리의 마우스 중) 3 주까지 생존한 3 마리의 Robo2 del5 / del5 동형접합 널 마우스를 나타내었다. Robo2가 발달 동안 족세포 족 돌기 형성을 위해 필요로 되는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 출생 및 3주 연령 시에 Robo2 널 마우스에서의 사구체의 초미세구조를 조사하였다. 족세포 본체, 족 돌기 및 세극막이 출생시 형성되었음에도 불구하고, 투과 전자 현미경은 신생의 Robo2 del5 / del5 동형접합 널 마우스에서 국소성 족 돌기 소멸을 나타내었다 (도 8A-8F). 주사 전자 현미경에 의해, 본 발명자들은 출생 및 3주 연령 시에 Robo2 del5 / del5 동형접합 널 마우스에서 불규칙한 깍지낌형 족 돌기(interdigitating foot processes)를 관찰하였다 (도 4A-4H). 이러한 발견은 Robo2가 신장 발달 동안 정상적인 족세포 족 돌기 패턴화를 필요로 한다는 것을 나타낸다.
성숙한 사구체에서 족 돌기 구조의 유지에서의 Robo2의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 조건부 Robo2 flox/flox 마우스를 포도신-Cre 전이유전자를 지닌 Robo2 del5/+; Tg Nphs2-Cre/+ 이형접합 마우스와 이종교배시킴으로써 족세포 특이적 Robo2 녹아웃 마우스를 발생시켰다. Robo2 del5/flox; Tg Nphs2-Cre/+ 유전자형을 갖는 20 마리의 족세포 특이적 ROBO2 돌연변이 마우스 및 20 마리의 한배새끼(littermate) 대조군 마우스를 1년 연령까지 분석하였다. 족세포 특이적 Robo2 녹아웃 마우스가 생존가능하였고 번식하였다. 그러나, 이들은 1 개월 차에 특이하게 넓은 족세포 족 돌기 및 국소 분절성 족 세포 소멸을 나타내었다 (도 4I-4M). 6 주 연령 차에 돌연변이 마우스는 유의미한 미세알부민뇨가 발달되었고, 이는 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되었다 (도 4N 및 4O). 추가적으로, 주사 전자 현미경은 Robo2 족세포 특이적 녹아웃 마우스에서 족 돌기 패턴화 결함(foot process patterning defect)을 나타내었다. 야생형에서의 정돈된 지퍼-유사 깍지낌형 2차 족 돌기 대신, Robo2 족세포 특이적 녹아웃 마우스는 1 개월 차에 불규칙하고 흐트러진 족 돌기 깍지가지 패턴화를 나타내었다 (도 8G-8J). 이러한 결함은 시간에 따라 더욱 분명해졌다. 7 개월 연령 차에, 분명하게 흐트러지고, 더 짧고, 구불구불한 족 돌기가 Robo2 족세포 특이적 녹아웃 마우스에서 관찰되었고 (도 8K-8N), 이는 3주 연령의 Robo2 널 마우스의 유전형과 유사하였다. Robo2 족세포 특이적 녹아웃 마우스는 정상 족세포 수를 나타내었고, 매트릭스 침착(matrix deposition)이 사구체에서 상당하게 증가하였다 (도 8O-8T, 표 1 및 2). 이러한 형태적 변화는 Robo2가 사구체 족세포 족 돌기 구조를 유지하고 조절하는 역할을 한다는 것을 나타낸다.
Robo2 의 손실은 네프린 널 마우스 에서 족세포 구조 결함을 완화한다
네프린 동형접합 마우스는 보우만 공간(Bowman's space)의 팽창, 비정상적으로 넓은 족 돌기, 사구체 세극막의 부재, 및 유의미한 단백뇨를 가진 특징적 표현형이 발달된다 (Done et al., 2008; Hamano et al., 2002). Robo2는 네프린과의 복합체를 형성하고, Slit2-Robo2 신호전달이 네프린-유도 액틴 중합을 억제하기 때문에, 본 발명자들은 Robo2의 손실이 네프린 널 마우스에서 족세포 표현형을 변형하는지에 대해 의문을 가졌다. Robo2와 네프린 사이에서의 가능한 유전적 상호작용의 이러한 추정을 시험하기 위해, 본 발명자들은 생식 계열 Robo2 -/-;Nphs1 -/- 및 족세포-특이적 Robo2 flox / flox;Tg Nphs2 - Cre /+;Nphs1 -/- 이중 Robo2-네프린 녹아웃 마우스 모두를 발생시켰다. Nphs1 -/- 단일 동형접합체와 같이, 두 Robo2 -/-;Nphs1 -/- (4/4, 100%) 및 Robo2 flox/flox;Tg Nphs2-Cre/+;Nphs1 -/- (3/3, 100%) 이중 녹아웃 마우스는 출생 후 10 시간 이내에 죽었다. 그러나, 조직학적 분석은 Robo2 -/-;Nphs1 -/- 이중 동형접합 마우스에서의 사구체의 형태는 팽창된 보우만 공간을 갖는, Nphs1 -/- 단일 네프린 동형접합 마우스의 유전자형과 비교하여 상대적으로 정상인 것으로 보여지는 것을 나타내었다. (도 8U-8X). 팽창된 보우만 공간을 갖는 사구체의 수는 네프린 단일 널 마우스 (31/122, 25.4%)와 비교하여 Robo2 -/-;Nphs1 -/- 이중 동형접합 마우스 (2/55, 3.6%)에서 상당하게 감소되었다 (도 8Y 및 표 3). 추가적으로, 주사 전자 현미경에 의한 사구체 초미세구조의 분석은 깍지낌형 족세포 족 돌기 구조가 Robo2 -/- 단일 동형접합체 (도 4T 및 4U) 및 야생형 대조군 (도 4V 및 4W)에서의 100%와 비교하여 네프린 단일 동형접합 마우스 (도 4P 및 4Q)로부터의 15 개의 사구체 중 단지 1 개 (6.67%)에서 관찰된 것을 나타내었다. 현저하게는, 족세포 족 돌기의 깍지낌형 패턴화는 Robo2 -/-;Nphs1 -/- 이중 동형접합 신생 마우스 신장 (도 4R 및 4S, 표 4)으로부터의 16 개의 사구체 중 12 개 (75%)에서 복원되었고, Robo2 및 네프린의 동시 손실은 이 마우스에서 족세포 족 돌기 구조 표현형을 완화시키는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 상기 기술된 Robo2-Nck-네프린 물리적 상호작용이 Robo2 및 네프린 발현 수준이 유전적으로 변경되는 경우에 생체내에서 족세포 족 돌기 형태에 실질적인 영향을 주는 것을 나타낸다.
족세포는 현저한 정도의 가소성(plasticity)을 나타낸다. 발달 과정에서 이는 단층입방 상피 세포로부터 본 발명자들이 성숙한 족세포로 인식하는 정교한 돌기-함유 세포(elaborate process-bearing cell)로 분화된다 (Reeves et al., 1978). 이러한 가소성은 성숙 후 보유된다. 이는 최소 변화 질환을 가진 아이들에게서의 단백뇨의 재발 및 소멸 과정에서 프로타민 설페이트로의 실험적 표면 전하 중성화 및 헤파린으로의 복원 (Seiler et al., 1975)에 후속되는 가역적 족 돌기 소멸로써 매우 상세하게 나타난다 (Nachman et al., 2008). 족 돌기에서의 보다 미묘한 변화는 가능하게는 혈류역학적, 호르몬에 의한 또는 주변분비율 자극의 형태에 있어서 양성 및 음성 신호에 대응하여 생리학적 조건 하에서 일어난다. 족 돌기에서의 풍부한 F-액틴을 고려할 때, 이론에 구속되거나 제한됨 없이, 이러한 자극은 F-액틴 세포골격으로 형질도입된 양성 및 음성 신호에 대응하여 이러한 미묘한 변화를 일으키는 것 같다. 너무 크고 불균형적인 양성 신호는 질환 표현형을 초래할 수 있다. 사실상, 생리학적 리간드가 확인되지 않았음에도 불구하고, 네프린의 응집 및 인산화는, Nck를 리쿠르트함에 의한 액틴 중합, 네프린의 세포외 도메인에 대해 신장염 단일클론 항체에 의해 래트에서 유도된 단백뇨 (Topham et al., 1999) 및 신장 이식 후 안티-네프린 동종항체를 발달시키는 선천성 신증후군의 경우 (Patrakka et al., 2002)와 관련되는 메커니즘을 유도한다는 것은 명확한 것이다.
본원에 기술된 본 연구는, Slit에 의해 구속되는(bound) 경우, Robo2가 네프린-유도 액틴 중합을 억제하는 족세포 액틴 중합의 다른 수준의 음성 조절을 나타낸다. 본 발명자들은, 이론에 구속되거나 제한됨 없이, Slit-Robo2 신호전달이 하기와 같이 정상 족세포 족 돌기 구조를 유지하는 네프린-유도 액틴 중합을 억제할 수 있음을 제안한다: 생리학적 조건 하에서 (예를 들어, 족 돌기 발달 과정에서), 네프린 참여는 Nck SH2 도메인이 결합되는 세포내 Y1191/1208/1232의 인산화를 초래한다 (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Nck는 순차적으로 이의 SH3 도메인을 통해 세포골격 조절자 예컨대 N-WASP를 리쿠르트하여 족세포 족-돌기 신장 또는 확장을 위한 액틴 중합을 촉진한다 (도 8Z). Slit의 국소 분비(local secretion) 및 결합은 이의 프롤린 풍부 영역 및 Nck의 최초 2 개의 SH3 도메인을 통해 Nck와의 Robo2의 상호작용을 증가시킨다. Robo2에 의해 Nck의 최초 2 개의 SH3 도메인을 격리(Sequester)시키는 것은 네프린-Nck 매개 액틴 중합을 억제하고 네프린과 연관된 F-액틴을 감소시켜 역동적이고 균형잡힌 F-액틴 세포골격 및 정상 족세포 족 돌기 구조를 유지할 것이다 (도 8Z). Nck를 통한 네프린-유도 액틴 중합의 직접적 억제에 더하여, Slit-Robo2 신호전달은 다른 경로, 예컨대 앞서 보고된 바와 같이 F-액틴 세포골격을 음성적으로 조절하는 Ena, Abl, srGAPs의 리쿠르트를 통해 액틴 중합을 불활성화시킬 수 있다 (Bashaw et al., 2000; Wong et al., 2001). Slit-Robo2 신호전달의 부재의 경우 (예를 들어, Robo2가 녹아웃된 경우), 네프린 유도 중합에 대한 Robo2의 억제 효과가 상실된다. Nck의 SH3 도메인은 액틴 중합을 증가시키는 다운스트림 세포골격 조절자와 상호작용할 수 있고 (도 8Z), 이는 Robo2 돌연변이 마우스에서 확인된 변경된 족세포 족 돌기 구조를 설명할 수 있다. 본원에 기술된 본 발명자들의 결과는 Slit-Robo 신호전달이 액손 성장 콘 경로탐색 (axon growth cone pathfinding) (Guan and Rao, 2003)에서의 Slit-Robo 신호전달의 역할과 유사한, F-액틴 세포골격을 음성적으로 조절함으로써 족세포 가소성(podocyte plasticity)을 조절할 수 있는 메카니즘을 지지한다. Robo2 돌연변이 마우스 사구체에서의 증가된 매트릭스 침착의 경로 탐색은 2차 반응을 나타낼 것 같다.
Robo2가 족세포의 기저면에 국재화되고 이의 세포내 도메인을 통해 다른 자리잡은(established) 족 돌기 세극막 단백질과 복합체를 형성함이, 상기에서 기술된 본 발명자의 연구로부터 명확함에도 불구하고, 이것이 세극막 그 자체의 일부를 실제로 형성하는지는 불확실한 것으로 남아있다. 흥미롭게도, Robo2의 세포외 도메인은 8 개의 면역글로불린 (Ig)-유사 모티프 및 하나의 피브로넥틴 도메인을 가지는 네프린의 것과 유사하고, 반면 Robo2는 5 개의 Ig-유사 모티프 및 3 개의 피브로넥틴 도메인을 가진다 (도 8Z) (Tryggvason et al., 2006). 본 발명자들은 효모 투-하이브리드 분석에서 Robo2의 세포내 도메인과 네프린의 세포질 도메인의 사이에서의 상호작용을 시험하였다. 본 발명자들의 생화학 데이터 (도 2E 및 2F)는 또한 생체외에서 이러한 2개의 수용체 사이에서의 직접적 상호작용을 지지하지 않았다. 그러나, Robo2의 세포외 도메인은 세극막에서의 트랜스-상호작용을 통해 인접한 족 돌기의 세포막에서 생체내 네프린의 세포외 도메인과 연관될 수 있다.
본 발명자들은 Robo2 동형접합 널 및 족세포 특이적 녹아웃 마우스(Robo2 homozygous null and podocyte specific knockout mice)는 변경된 족 돌기 깍지낌형 패턴, 네프린 널 마우스의 것과 상이한 표현형이 발달되는 것을 발견하였다 (Hamano et al., 2002; Done, 2008). 네프린 및 Robo2는 족세포 F-액틴 세포골격을 조절함에 있어 반대 역할을 하기 때문에 이는 놀라운 것은 아니다. 네프린 신호전달이 국소 액틴 중합(localized actin polymerization)을 유도하는 한면, Slit2-Robo2 신호전달은 족세포 족 돌기 가소성 및 다이나믹스(dynamics)를 유지하기 위해 액틴 중합에서 음성 조절자로서 역할을 한다. 유사한 족 돌기 조직 결함이 액틴-해중합 인자 Cofilin-1, 족세포에서의 F-액틴 세포골격의 다른 음성 조절자가 녹아웃된 마우스에서 관찰된 것은 주목할 만하다 (Garg et al., 2010). 이는 액틴 중합 촉진 인자 예컨대 네프린 신호전달 또는 억제 인자 예컨대 Robo2 신호전달의 부재는 족세포의 정상 구조에 영향을 미칠 것을 나타낸다. 따라서 족세포에서의 양성 및 음성 F-액틴 세포골격 조절자 사이의 균형은 정상 족 돌기 구조를 유지하는데 중요하다. 양성 (네프린) 및 음성 (Robo2) 신호 모두를 녹아웃시키는 것에 의해 이러한 균형을 회복하는 것은 Robo2-네프린 이중 녹아웃 마우스에서의 족세포 족 돌기 깍지낌형 및 온화한 사구체 표현형의 복원을 설명할 수 있다. 본원에서 기술된 본 발명자들의 연구는 한편으로는 사구체 투과선택성을 조절하는 세극막의 필수 성분으로서 (Tryggvason et al., 2006), 다른 한편으로는 액틴 세포골격과의 이의 상호작용을 통한 족 돌기 형태의 조절자로서의 (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006) 네프린의 이중 역할을 나타낸다. Robo2 신호전달은 분명하게 족 돌기에 대한 네프린의 양성 신호 효과에 반작용하지만, 이것이 또한 세극막 무결성(integrity)에도 영향을 주는지는 결정해야 할 것이다.
따라서, 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자는 신장에서의 족세포 세포내 연접의 신규한 성분으로서 Robo2를 확인하였다. 본 발명자들은 생화학, 기능적, 및 유전적 기술을 사용하여 Robo2 및 네프린 사이에서의 상호작용을 입증하였고 Slit2-Robo2 신호전달이 네프린-유도 액틴 다이내믹스를 억제한다는 것을 나타내었다. 본 발명자들의 결과는 Robo2 신호전달이 네프린에 대한 음성 조절자로서 역할을 하여 족세포 족 돌기 구조를 조절한다는 것을 나타낸다. 이러한 연구는 Slit-Robo 신호전달의 역할의 이해를 넓혀 주고 유도 신호 수용체 Robo가 F-액틴 세포골격 다이내믹스에 영향을 주는 신규한 상호소통 메커니즘을 확인하였다.
본원에서 다르게 정의하지 않는 한, 본 출원과 연관되어 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 본 개시물이 속하는 기술분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명은 본원에 기술된 특별한 방법론, 프로토콜, 및 시약 등으로 제한되지 않고 변화될 수 있음을 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것으로 의도되지 않고, 이는 청구범위에 의해 유일하게 한정된다. 면역학, 및 분자 생물학에서의 일반 용어의 정의는 문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006. Definitions of common terms in molecular biology are found in Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); or Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) 및 Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.)]에서 찾을 수 있고, 이는 모두 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함함"은 존재하는 정의된 성분 이외 다른 성분이 또한 존재할 수 있음을 의미한다. "포함함"의 사용은 제한이라기보다는 포함을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "로 필수적으로 이루어지는"은 주어진 실시형태에 대해 요구되는 이러한 성분과 관련된다. 상기 용어는 본 발명의 실시형태의 기본적이고 신규한 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 추가의 성분의 존재를 허용한다.
용어 "로 이루어지는"은 실시형태의 이 세부설명에서 인용되지 않은 임의의 성분이 배제되는, 본원에 기술된 조성물, 방법, 및 이의 각각의 구성요소와 관련된다.
또한, 문맥에 의해 요구되지 않는 경우, 단수형 용어는 복수형을 포함하고 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 본 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an", 및 "the")은 문맥이 명확하게 다르게 기재하지 않는 한 복수형 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "방법"에 관한 참조는 본원에 기술된 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함하고/하거나 본 개시물 등을 읽는 당업자에게 자명할 것이다.
작동 실시예에서나 달리 지시된 곳 이외에서,, 본원에서 사용되는 구성요소 또는 반응의 양을 나타내는 모든 수는 용어 "약"에 의한 모든 경우에서 수정될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 백분율과 연관되어 사용되는 경우 ±1%를 의미할 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약 등에 제한되지 않고 변화될 수 있음을 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것으로 의도되지 않고, 이는 단지 청구범위에 의해 한정된다.
확인된 모든 특허 및 다른 공개물은, 예를 들어 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 이러한 공개물에 기술된 방법론을 기술하고 개시하기 위해 본원에 참조로 분명하게 통합된다. 이와 관련하여 어떤 것도 발명자가 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시 내용보다 선행할 자격이 없음에 대한 인정으로 해석되어서는 안된다. 날짜에 대한 모든 언급 또는 본 문헌의 내용에 대한 표현은 본 출원인에게 이용가능한 정보에 기초하고, 그 날짜의 정확성 또는 이러한 문헌의 내용에 대한 어떤 승인도 구성하지 않는다.
본원에 기술된 다양한 양태의 실시형태는 하기 번호가 붙은 문단에 의해 설명될 수 있다:
1. 만성 신장 질환을 갖거나 위험이 있는 대상체에게 ROBO2 억제제를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에 있어서의 만성 신장 질환의 치료 방법.
2. 단백뇨를 갖거나 위험이 있는 대상체에게 ROBO2 억제제를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에 있어서의 단백뇨의 감소 방법.
3. 문단 1 또는 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 억제제는 ROBO2에 대해 특이적인 차단 항체 또는 이의 항원-결합 절편, ROBO2에 대해 특이적인 안티센스 분자, ROBO2에 대해 특이적인 짧은 간섭 RNA (siRNA), ROBO2의 소분자 억제제, ROBO2 억제 폴리펩티드, 또는 ROBO2 구조 유사체인 방법.
4. 문단 1-3 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 억제제가 SLIT, Nck, 또는 이 둘에 대한 ROBO2의 결합을 차단하거나 감소시키는 방법.
5. 문단 1-4 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 억제제가 Ig1 SLIT 결합 도메인, Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인, Nck 세포내 결합 도메인, 또는 이의 임의의 조합에 대해 특이적인 방법.
6. 문단 3에 있어서, 상기 ROBO2 억제 폴리펩티드는 우성 음성 ROBO2 융합 단백질, 세포내 도메인 없이 ROBO2 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 또는 세포외 도메인 없이 ROBO2 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
7. 문단 1-6 중 어느 하나에 있어서, 만성 신장 질환을 갖거나 위험이 있는 대상체가 당뇨병성 신장증 또는 고혈압을 갖는 방법.
8. 문단 1-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에게 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
9. 문단 8에 있어서, 상기 추가 치료제는 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 또는 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB)인 방법.
10. a. ROBO2 폴리펩티드 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 결정하기 위해 대상체로부터의 생물학적 시험 샘플을 분석하는 단계;
b. 상기 생물학적 시험 샘플에서의 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준이 참조 한계 수준을 초과하는지를 결정하는 단계; 및
c. 상기 만성 신장 질환의 치료 또는 요법을 필요로 하는 대상체를 진단하는 단계를 포함하는 방법.
11. 문단 10에 있어서, 상기 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준을 분석하는 단계는 ROBO2 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 사용하여 수행되는 방법.
12. 문단 10에 있어서, 상기 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 분석하는 단계는 PCR 또는 혼성화 분석을 사용하여 수행되는 방법.
13. 문단 10-12 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 시험 샘플은 신장 생검, 소변, 혈액, 혈청 샘플, 또는 소변 샘플로부터 펠렛화한 세포인 방법.
14. 문단 10-13 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준은 상기 참조 한계 수준보다 적어도 20% 초과인 방법.
15. 문단 10-13 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준은 상기 참조 한계 수준보다 적어도 2 표준 편차 초과인 방법.
16. a. 대상체로부터 분리한 생물학적 샘플을 ROBO2 폴리펩티드 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA를 검출하는 시약과 접촉시키는 단계; 및
b. ROBO2 폴리펩티드 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하고;
c. 정상 생물학적 샘플에 대해 상기 ROBO2 폴리펩티드 또는 상기 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 증가된 수준이, 만성 신장 질환 및/또는 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 진행을 가지는 대상체를 확인하는 분석법.
17. 문단 16에 있어서, 상기 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준을 검출하는 단계는 ROBO2 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 사용하여 수행되는 분석법.
18. 문단 16에 있어서, 상기 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 검출하는 단계는 PCR 또는 혼성화 분석을 사용하여 수행되는 분석법.
19. 문단 16-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 시험 샘플은 신장 생검, 소변, 혈액, 혈청 샘플, 또는 소변 샘플을 펠렛화한 세포인 분석법.
20. 문단 16-19 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준은 참조 한계 수준보다 적어도 20% 초과인 분석법.
21. 문단 16-19 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준은 참조 한계 수준보다 2 표준 편차 초과인 분석법.
22. 문단 16-21 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 당뇨병 또는 고혈압으로 진단된 적이 있는 분석법.
23. 하기를 포함하는, 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨 위험이 있거나, 만성 신장 질환을 가지는지를 결정하기 위한 시스템:
a. 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서의 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 결정하도록 구성된 측정 모듈;
b. 상기 측정 모듈에 의해 측정한 상기 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준을 받고 그 ROBO2 폴리펩티드의 발현 수준 또는 ROBO2 폴리펩티드 암호화 RNA의 발현 수준이 미리-정해진 참조 수준 또는 비율 초과인지를 결정하기 위해 하나 이상의 분석을 수행하고, 검색된 컨텐츠를 제공하도록 구성된 비교 모듈; 및
c. 상기 비교 모듈로부터의 데이터 출력에 기초한 컨텐츠를 디스플레이하기 위한 디스플레이 모듈 - 컨텐츠는 ROBO2 폴리펩티드 또는 RNA의 발현 수준 또는 비율이 미리-정해진 참조 수준 또는 비율 초과임을 나타내는 신호, 또는 ROBO2의 수준 또는 발현 비율이 참조 수준 또는 미리-정해진 비율 이하임을 나타내는 신호를 포함함 -.
24 문단 23에 있어서, 상기 디스플레이 모듈에서 디스플레이되는 컨텐츠는 특정 치료 요법을 받도록 권장되는 대상체를 나타내는 신호를 추가로 포함하는 시스템.
25. 하기를 포함하는, 대상체가 만성 신장 질환 또는 단백뇨 위험이 있거나, 만성 신장 질환을 가지는지를 결정하기 위한 시스템:
a. 대상체로부터 얻은 하나 이상의 시험 샘플을 받고 하기 조건 중 하나의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 상기 하나 이상의 시험 샘플에 대해 하나 이상의 분석을 수행하도록 구성된 결정 모듈:
i. 미리-정해진 비율 초과의 ROBO2의 발현 비율, 또는
ii. 미리-정해진 수준 초과의 ROBO2의 발현 수준
b. 상기 결정 모듈로부터의 데이터 출력을 저장하도록 구성된 저장 장치; 및
c. 상기 결정 모듈로부터의 데이터 산출에 기초한 컨텐츠를 디스플레이하도록 구성된 디스플레이 모듈 - 컨텐츠는 ROBO2의 발현 비율이 미리-정해진 비율 초과이거나 ROBO2의 수준이 미리-정해진 수준 초과임을 나타내는 신호, 또는 ROBO2의 발현 비율이 미리-정해진 비율 이하이거나 미리-정해진 수준 이하임을 나타내는 신호를 포함함 -.
26. 문단 25에 있어서, 상기 디스플레이 모듈에서 디스플레이되는 컨텐츠는 특정 치료 요법을 받도록 권장되는 대상체를 나타내는 신호를 추가로 포함하는 시스템.
27. 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 발생을 방지하기 위한 치료 또는 요법을 참조 한계 수준 초과의 ROBO2 단백질의 수준을 가지는 것으로 결정되는 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 만성 신장 질환 또는 단백뇨 위험을 가지는 인간 대상체의 치료 방법.
28. 문단 27에 있어서, 상기 ROBO2 단백질의 수준이 참조 수준보다 적어도 20% 초과인 방법.
29. 문단 27에 있어서, 상기 ROBO2 단백질의 수준이 참조 수준보다 적어도 2 표준 편차 초과인 방법.
30. 문단 27-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 만성 신장 질환 또는 단백뇨의 발생을 예방하는 치료 또는 요법은 ROBO2 억제제를 포함하는 방법.
31. 문단 30에 있어서, 상기 ROBO2 억제제는 ROBO2에 대해 특이적인 차단 항체 또는 이의 항원-결합 절편, ROBO2에 대해 특이적인 안티센스 분자, ROBO2에 대해 특이적인 짧은 간섭 RNA (siRNA), ROBO2의 소분자 억제제, ROBO2 억제 폴리펩티드, 또는 ROBO2 구조 유사체인 방법.
32. 문단 30-31 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 억제제가 SLIT, Nck, 또는 이 둘에 대한 ROBO2의 결합을 차단하거나 감소시키는 방법.
33. 문단 30-32 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 억제제는 Ig1 SLIT 결합 도메인, Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인, Nck 세포내 결합 도메인, 또는 이의 임의의 조합에 대해 특이적인 방법.
34. 문단 31에 있어서, 상기 ROBO2 억제 폴리펩티드는 우성 음성 ROBO2 융합 단백질, 세포내 도메인이 없는 ROBO2 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 또는 세포외 도메인이 없는 ROBO2 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
35. 만성 신장 질환을 치료하기 위해 사용되는 ROBO2 억제제.
36. 단백뇨를 치료하기 위해 사용되는 ROBO2 억제제.
37. 문단 35 또는 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 억제제는 ROBO2에 대해 특이적인 차단 항체 또는 이의 항원-결합 절편, ROBO2에 대해 특이적인 안티센스 분자, ROBO2에 대해 특이적인 짧은 간섭 RNA (siRNA), ROBO2의 소분자 억제제, ROBO2 억제 폴리펩티드, 또는 ROBO2 구조 유사체인 용도.
38. 문단 35-37 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 억제제는 SLIT, Nck, 또는 이 둘에 대한 ROBO2의 결합을 차단하거나 감소시키는 용도.
39. 문단 35-38 중 어느 하나에 있어서, 상기 ROBO2 억제제는 Ig1 SLIT 결합 도메인, Ig1 및 Ig2 SLIT 결합 도메인, Nck 세포내 결합 도메인, 또는 이의 임의의 조합에 대해 특이적인 용도.
40. 문단 37에 있어서, 상기 ROBO2 억제 폴리펩티드는 우성 음성 ROBO2 융합 단백질, 세포내 도메인이 없는 ROBO2 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 또는 세포외 도메인이 없는 ROBO2 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드인 용도.
41. 문단 35-40 중 어느 하나에 있어서, 상기 만성 신장 질환 또는 단백뇨는 당뇨병성 신장증 또는 고혈압에 의해 야기되는 용도.
본 발명은 또한 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는 하기 실시예에 의해 설명된다.
실시예
조직 인시츄 혼성화( Tissue in Situ Hybridization ), 면역조직화학, 및 면역 금 전자 현미경
인시츄 혼성화 분석을 앞서 기술된 디곡시제닌-라벨링된 Robo2 리보프로브(digoxigenin-labeled Robo2 riboprobe)로 수행하였다 (Grieshammer et al., 2004). 면역조직화학법을 4% 파라포름알데히드로 고정한 마우스 배아 신장 조직 및 메탄올로 고정한 성체 마우스 신장 조직에 대해 수행하였다. 면역금 전자 현미경을 위해, 야생형 마우스 신장을 해부하고 파라포름알데히드-리신-과옥소산염 (PLP)에서 고정하였다. 마우스 신장의 초박 절편을 제조하였고 염소 안티-Robo2 항체 (DAKO Corporation) 및 10 nm 금 콜로이드 (Ted Pella)와 결합된 2차 항체와 함께 배양하였다.
효모 투- 하이브리드 , 공-침전, 및 액틴 중합 분석
DUPLEX-A™ 효모 투-하이브리드 시스템 (OriGene Tech)을 제조자의 교시에 따라 Robo2 및 Nck1 상호작용을 특성화하기 위해 사용하였다. 세포 배양, His-태그가 붙은 단백질 공-침전, 및 면역침전을 앞서 보고한 바와 같이 수행하였다 (Fan et al., 2003). 내인성 면역침전(endogenous immunoprecipitation)을 위해, 신생 마우스 신장을 이용하였다. CD16/7 융합 단백질의 CD16 항체-매개 가교 및 액틴 중합 분석법을 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다 (Jones et al., 2006; Rivera et al., 2004; Verma et al., 2006).
녹아웃 마우스 연구, 투과 및 주사 전자 현미경, 및 신장 사구체 분석
마우스 프로토콜을 보스턴 대학 의료 센터(#14388)에 있는 제도적 동물 케어 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인받았다. Robo2 flox 조건 대립유전자, Robo2 del5 (또한 본원에서 상호교환적으로 Robo2 - 로 지칭됨) 배선 돌연변이, 및 Robo2 + 야생형 대립유전자의 생성 및 유전자형이 앞서 기술되었다 (Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). Robo2-네프린 이중 녹아웃 마우스를 생성하기 위해, Robo2 +/- 마우스를 앞서 생성한 Nphs1 +/- 마우스와 교배시켰다 (Hamano et al., 2002). 투과 전자 현미경을 위해, 신장을 고정하고, 0.15 M 나트륨 카코딜레이트 중 2% 글루타르알데히드에서 배양하였고, 분별 에탄올 중에서 탈수시키고, 에폰(Epon)에 포매시키고, 절개하고, 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 착색시켰다. 신장 초박 절편을 JEM-1011 전자 현미경을 사용하여 조사하였다. 주사 전자 현미경을 위해, 신장을 하기 표준 프로토콜에 따라 제조하였다. 신장 병리학적 연구를 위해, 신장을 4% 파라포름알데히드 중에서 고정하고, 파라핀을 포매시키고, 절개하고, 표준 주기적 산-쉬프(standard Periodic acid-Schiff) (PAS) 또는 에오신 헤마톡실린 (H&E) 방법을 사용하여 착색시켰다. 족세포 수의 정량화를 위해, WT1을 족세포 핵 마커로써 사용하고 면역과산화효소 착색을 표준 프로토콜에 따라 신장 절편에 대해 수행하였다. 각 사구체 단면에서의 WT1 양성 족세포 핵을 계수하였다. 단백뇨 분석을 위해, 6주 연령 마우스의 "단회"뇨 ("spot" urine)를 제조자의 교시에 따라 쥐 알부민뇨 ELISA 정량 키트 (Exocell) 및 스크리닝 방법으로서 소변 시험지봉(urine dipstick) (Multistix, Bayer, IN)을 사용하여 조사하였다.
조직 인시츄 혼성화 및 면역조직화학법
인시츄 혼성화 분석을 앞서 기술한 디곡시제닌-라벨링된 Robo2 리보프로브로 수행하였다 (Grieshammer et al., 2004). ROBO2 cDNA를 NotI으로 선형화하였고 프로브를 DIG DNA 라벨링 및 검출 키트 (Roche Applied Science)를 사용하여 제조하였다. 혼성화를 4% 파라포름알데히드 고정된 OCT 포매시킨 마우스 배아 신장 냉동 절편에 대해 수행하였다. 면역조직화학법을 4% 파라포름알데히드 이후 30% 수크로오스 냉해보호제(cryoprotection) (Mugford et al., 2008)에 고정한 마우스 배아 신장 조직 및 메탄올에 고정한 성체 마우스 신장 조직에 대해 수행하였다. OCT 화합물에 포매시킨 마우스 신장을 냉동시키고 8-10 ㎛로 크라이오스탯을 사용하여 절개하였다. 절편을 1차 항체로, 이후 적절한 FITC 또는 Cy3 컨쥬게이션된 2차 항체로 착색시켰다. 본 연구에서 사용되는 1차 항체는 ROBO2 (R&D System, Abnova, Santa Cruz Biotechnology), 네프린 (custom synthesized) (Topham et al., 1999), Nck (Upstate/Millipore), 포독신 (Sigma), 니도겐 (Santa Cruz Biotechnology), Pecam1 (BD Biosciences), WT1 (Santa Cruz Biotechnology), SLIT2 (Santa Cruz Biotechnology), PDGFR 베타 (Cell Signaling), 시냅토포딘(Synaptopodin) (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 것을 포함한다. Perkin Elmer UltraView LCI 다중-포인트 스피닝 디스크 레이저-주사 공초점 현미경 및 60x 유침용대물렌즈를 갖는 Zeiss LSM 510 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다.
면역금 전자 현미경
야생형 마우스 신장을 해부하고 4℃에서 밤새 파라포름알데히드-리신-과옥소산염 (PLP)로 고정하였다. 조직을 1x PBS에서 세척하고 분별 에탄올에서 탈수시키고 LR 백색 수지 (Electron Microscopy Sciences)에 포매시켰다. 마우스 신장의 초박 절편을 제조하고 포름바르(Formvar)-코팅된 금 그리드(gold grid)로 이송하고, 1x PBS 중 1% 소혈청 알부민 및 5% 일반 염소 혈청으로 차단하였다. 절편을 이후 4℃에서 밤새 DAKO (DAKO Corporation) 중 1:50 희석액으로 염소 안티-Robo2 항체와 함께 배양시켰다. 비-면역성 혈청을 대조군으로 사용하였다. 1x PBS로의 3회 세척 후, 절편을 실온에서 2 시간 동안 10 nm 콜로이드성 금 (Ted Pella)과 결합된 IgG 2차 항체와 함께 배양시켰다. 절편을 최종적으로 1% 글루타르알데히드로 후-고정하였고 우라닐 아세테이트와 대조하였다. 절편을 80kV에서 JEM-1011 투과 전자 현미경 (JEOL, Tokyo, Japan)으로 조사하였고, AMT 디지탈 화상 시스템 (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA.)을 사용하여 이미지를 얻었고, 어도브 포토샵으로 불러왔다. 사구체에서 금 입자로 착색된 Robo2의 세포 이하의 국재화(subcellular localization)는 비-면역성 혈청으로 착색된 대조군 현미경사진과 비교하여 디지털 전자 현미경사진에서 인식되었다.
효모 투- 하이브리드 분석
DUPLEX-A™ 효모 투-하이브리드 시스템 (OriGene Tech, Rockville, MD)을 Robo2 및 Nck1 상호작용을 특성화하기 위해 사용하였다. 인간 Robo2의 세포내 도메인 암호화 cDNA 및 이의 축약형(truncated form)을 EcoRI/XhoI 부위에서 pJG4-5 벡터로 클로닝시켰고, 이들을 B42의 전사 활성화 도메인에 융합시켰다. 인간 Nck1의 cDNA 및 이의 축약형을 EcoRI/XhoI에서 pEG202 벡터로 클로닝시키고 이들을 LexA의 DNA 결합 도메인에 융합시켰다. 구조체 pSH18-34에서의 lacZ 유전자 및 EGY48 균주 효모 게놈에서의 LEU2 유전자를 리포터 유전자로서 사용하였다. pEG202, pSH18-34, 및 pJG4-5 구조체를 효모 EGY48 세포로 공동-형질전환시켰다. 효모 세포가 X-gal의 존재 하에 청색으로 변하고 류신의 부재 하에 성장되는 경우 상호작용은 양성인 것으로 고려하였다.
세포 배양, DNA 구조체, 형질도입, 공-침전, 및 웨스턴 블롯 분석
HEK (293T) 세포를 인산칼슘 형질도입을 사용하여 60% 융합도(confluency)에서 형질도입하였다. C-말단 his- 및 myc-태그가 붙은 융합 단백질을 제조하기 위해, 전장 인간 네프린 및 Robo2를 Hind III/EcoR1 및 EcoR1/Xho1 제한 부위에서 각각 pSecTag B 백터 (Invitrogen)로 클로닝시켰다. Robo2-△NBD를 제조자의 교시에 따라 QUIKCHANGE 부위-지정 돌연변이유발 키트(site-directed mutagenesis kit) (Strategene)를 사용하여 Nck 결합 도메인 (도 2C)을 결실시킴으로써 얻었다. 태그 붙지 않은 Robo2 및 Nck1을 EcoR1/Xho1 부위에서 pCS2 벡터 (Addgene)로, HindIII/EcoR1 부위에서 네프린을 클로닝시켰다. 인간 Fyn 및 myc-태그가 붙은 Slit2 구조체가 앞서 보고된 바 있다 (Li et al., 2008; Wong et al., 2001). CD16/7-NCD 및 CD16/7-HA 구조체가 또한 앞서 보고되었다 (Verma et al., 2006). Robo2 및 Nck1 상호작용을 검출하기 위해, C-말단 His- 및 myc-태그가 붙은 인간 Robo2 또는 Robo2-△NBD를 HEK 세포에서 발현시켰다. 48 시간 후-형질도입, 세포를 세포용해 버퍼(lysis buffer) (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 0.5% TX100, 1x 프로테아제 억제제 [pH 8.0])에서 세포 용해시켰다. 세포 용해액을 4℃에서 10분 동안 원심분리시키고, 상청액을 4℃에서 2 시간 동안 Ni-NTA 수지 (Qiagen)와 함께 배양하여 His-Robo2를 침전시키고, Ni 없는 NTA 수지를 대조군으로서 사용하였다. 수지를 세척 버퍼 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 0.5% TX100 [pH 8.0])로 3 회 세척하였고 95℃에서 10분 동안 가열하였다. 침전물을 SDS-PAGE 겔에 용해시키고 1:1000 희석으로 토끼 안티-myc, 토끼 단일클론 안티-Nck1 (Cell Signaling) 항체로 블롯팅하였다. Robo2, Nck1, 및 네프린 간의 삼중 상호작용을 조사하기 위하여, His-myc-Robo2 또는 His-myc-Robo2-△NBD를 인간 네프린 및 인간 Fyn을 가진 HEK 세포에서 공동-발현시켰다. His-myc-Robo2를 상기에서 기술한 Ni-NTA 비드로 침전시켰다. 삼중 상호작용을 확인하기 위해서, His-myc-네프린을 Robo2와 공동-발현시켰고, HEK 세포에서의 Fyn 및 His-myc-네프린을 Ni-NTA 비드로 풀다운시켰다. 침전물을 1:1000 희석으로 토끼 다중클론 안티-myc, 토끼 단일클론 안티-Nck1, 토끼 다중클론 안티-네프린, 마우스 단일클론 안티-Robo2 (R&D systems), 및 토끼 다중클론 안티-Fyn (Santa Cruz Biotechnology) 항체로 블롯팅시켰다. 내인성 단백질의 공동-면역침전을 위해, 신생 마우스로부터의 신장을 얼음 중의 RIPA 버퍼 (50 mM Tris [pH 7.4], 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% 디옥시콜산나트륨, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1x 프로테아제 억제제)에서 균질화시켰다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심분리시키고 상청액을 4℃에서 1 시간 동안 1 ㎍ 마우스 단일클론 안티-Robo2 항체 (R&D Systems)와 함께 배양시켰다. 대조군 염소 IgG (Santa Cruz Biotechnology)를 대조군으로서 사용하였다. 샘플을 이후 30 ㎕의 단백질 A/G 플러스 아가로스 비드 슬러리(protein A/G Plus agarose bead slurry) (Santa Cruz Biotechnology)와 혼합하였고 추가로 4℃에서 12 시간 동안 배양시켰다. 비드를 이후 RIPA 버퍼에서 3 회 세척하였고 단백질을 95℃에서 10 분 동안 가열함으로써 1x 단백질 로딩 버퍼(protein loading buffer)에서 용리시켰다. 침전물을 SDS-PAGE 겔에서 용해시키고 상기에서 기술된 마우스 안티-Robo2, 토끼 안티-네프린, 및 토끼 안티-Nck1 항체로 블롯팅시켰다. 액틴을 Sigma로부터의 안티-베타-액틴 마우스 항체로 블롯팅시켰다. 밴드의 강도를 ImageJ를 사용하여 측정하였다. 단백뇨 검출을 위해, 마우스 단회뇨를 수집하고 1:000 희석으로 1x 단백질 로딩 버퍼로 희석시켰다. 소변 단백질을 이후 SDS-PAGE 겔에 용해시키고 정제된 알부민을 대조군으로서 사용하였다 (MP Biomedicals). 겔을 토끼 안티-알부민 다중클론 항체 (MP Biomedicals)로 블롯팅시켰다.
CD16 /7- NCD 가교 및 액틴 중합 분석
CD16/7 융합 단백질의 CD16 항체-매개 가교는 앞서 기술하였다 (Jones et al., 2006; Rivera et al., 2004; Verma et al., 2006). 간단하게는, CD16/7-NCD 또는 CD16/7-HA를 HEK 세포에서 Robo2와 공동-발현시켰다. 24 시간 후, 세포를 형질도입시키고 추가 24 시간 동안 폴리리신으로 코팅된 유리 커버슬립에 착상(seeding)시켰다. 세포를 이후 37℃에서 30분 동안 1 ㎍/㎖ 마우스 단일클론 안티-CD16 (Beckman Coulter)로 배양시켰고, DMEM로 일회 세척하고, 30 분 동안 Slit2 조정 배지 (Wong et al., 2001) 또는 대조군 조정 배지로 희석한 로다민-컨쥬게이션된 2차 항체 (Thermo Scientific)와 함께 배양하였고, 1x PBS 중의 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. F-액틴을 제조자의 교시에 따라 FITC-컨쥬게이션된 팔로이딘 (Invitrogen)을 사용하여 착색시켰다. 신규하게 형성된 F-액틴 다발은 응집된 네프린 (CD16/7-NCD)에 붙어 있고 형광 현미경 하에서 혜성 꼬리 (즉, 본문에서 액틴 테일)처럼 보인다. 이 실험에서, 본 발명자들은 CD16/7-NCD의 응집에 의해 형성되고 응집체에 부착된 F-액틴 다발만을 분석하였다. F-액틴 테일을 가진 세포를 계수하고 총 CD16/7-NCD 형질도입된 세포와 비교하였다. 정량화 식은 하기와 같다: 백분율(%)=(F-액틴 테일의 가진 형질도입된 세포의 수 / 형질도입된 세포의 총 수)×100. 60x 유침용대물렌즈를 갖는 LSM510 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다.
Robo2 족세포 특이적 녹아웃 마우스 및 Robo2 - 네프린 이중 녹아웃 마우스의 발생 및 특징
Robo2 flox 조건 대립유전자, Robo2 del5 (또한 본원에서 상호교환적으로 Robo2 - 로 지칭됨) 배선 돌연변이 대립유전자, 및 Robo2 + 야생형 대립유전자의 발생 및 유전자형이 앞서 기술되어 있다 (Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). Robo2 족세포 특이적 Robo2 del5 / flox;TgNphs2 - Cre /+ 녹아웃 마우스를 발생시키기 위해 표준 육종 계획을 따랐고, 이는 하나의 Robo2 del5 대립유전자 및 하나의 Robo2 flox 대립유전자를 지닌다. 이러한 합성 돌연변이에 있어서, 포도신 프로모터에 의해 유도된 족세포 특이적 Cre 재조합효소는 ROBO2 flox 대립유전자만을 결실시켜 표현형의 침투를 촉진하였는데, 이는 다른 대립유전자 Robo2 del5가 생식세포 발현에서 어디에서나 결실되었기 때문이다. Robo2 del5 / flox;TgNphs2 - Cre /+ 마우스의 진정성(authenticity)은 Robo2 del5 및 Robo2 flox 대립유전자 및 TgNphs2 - Cre 전이유전자의 존재에 대한 테일 DNA 유전자형 검사에 의해 결정되었다. Robo2 del5 대립유전자 및 TgNphs2 - Cre 전이유전자가 없는 F2 한배새끼 Robo2 flox /+ 마우스를 대조군으로써 사용하였다. Robo2-네프린 이중 녹아웃 마우스를 발생시키기 위해, Robo2 +/- 이형접합 마우스를 앞서 발생된 Nphs1 +/- 이형접합 마우스와 교배시켰다 (Hamano et al., 2002). Robo2 +/-;Nphs1 +/- 이중 이형접합 마우스의 발생 후, 이중 이형접합 마우스의 교배를 Robo2 -/-;Nphs1 -/- 이중 동형접합 마우스 및 Nphs1 -/- 단일 동형접합, Robo2 -/- 단일 동형접합, 및 Robo2 +/+;Nphs1 +/+ 야생형 대조군을 발생시키기 위해 수행하였다. 마우스 프로토콜을 보스턴 대학 의료 센터 (#14388)에 있는 제도적 동물 케어 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인받았다.
투과 및 주사 전자 현미경
투과 전자 현미경을 위해, Robo2 동형접합 널 마우스 및 족세포 특이적 녹아웃 마우스로부터 신장을 해부하고, 4℃에서 밤새 PLP에 고정시켰고, 이후 6 시간 동안 0.15 M 나트륨 카코딜레이트 중 2% 글루타르알데히드에서 배양시켰다. 1x PBS에서 세척 후, 고정된 신장을 분별 에탄올에서 탈수시키고, 에폰에 포매시키고, 절개하고, 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 착색시켰다. 초박 신장 절편을 제조하고 JEM-1011 전자 현미경을 사용하여 조사하였다. 야생형 한배새끼를 대조군으로써 사용하였다. 주사 전자 현미경을 위해, Robo2 동형접합 널 마우스, 족세포 특이적 녹아웃 마우스, 네프린 동형접합 널 마우스, 및 Robo2-네프린 이중 동형접합 마우스로부터의 신장 샘플을 앞서 기술한 프로토콜 (Friedman and Ellisman, 1981)에 따라 미미하게 변형하여 제조하였다. 간단하게는, 신장을 0.1M 카코딜레이트 버퍼 중 2.5% 글루타르알데히드 및 2% 파라포름알데히드 용액으로 관류시켰고 (Karnovsky's fixative, Electron Microscopy Sciences), 카르노브스키 정착액(Karnovsky's fixative)에서 24 시간 동안 고정시키고, 후속하여 2% 오스뮴 테트라옥사이드 용액 (Electron Microscopy Sciences)에서 후고정하였다. 신장 샘플을 동결할단시키고(cryo-fractured), 탈수시키고, 헥사메틸디실라잔 (Electron Microscopy Sciences)으로 건조시켰다. 신장 샘플을 Amray 1000A 및 Jeol 6340F 주사 전자 현미경을 사용하여 이미지화하였다. 각 동물로부터의 3 개의 사구체를 조사하여 대표 이미지를 제공하였다.
마우스 신장 병리학 연구, 족세포 수의 정량화, 및 단백뇨 분석
신장 병리학 연구를 위해, 신장을 해부하고 4% 파라포름알데히드에서 밤새 고정시켰고, 이후 파라핀 포매(paraffin embedding)를 위해 분별 에탄올 시리즈로 처리하였다. 신장 파라핀 블록을 MT-920 마이크로톰 (MICROM)을 사용하여 4 ㎛로 절개하고, 표준 주기적 산-쉬프 (PAS) 또는 에오신 헤마톡실린 (H&E) 방법을 사용하여 착색시켰다. 사구체를 SPOT 디지탈 카메라 시스템이 장착된 Olympus BHT 광학 현미경을 사용하여 매트릭스 침착, 분절가수체경화증(segmental glomerulosclerosis), 및 보우만 공간의 팽창에 대해 조사하고 평가하였다. 족세포 수의 정량화를 위해, WT1을 족세포 핵 마커로서 사용하고 면역과산화효소 착색을 앞서 기술한 프로토콜에 따라 신장 절편에 대해 수행하였다 (Sanden et al., 2003). 간단하게는, 4 마리의 일년생 Robo2 del5 / flox;Tg Nphs2 - Cre + 족세포-특이적 녹아웃 마우스 및 4 마리의 연령-일치된 야생형 대조군 마우스로부터의 파라핀 포매된 신장 절편을 4 ㎛로 절개하고, 마이크로파 항원 복원 이후 WT1 항체 (Santa Cruz Biotechnology)로 착색시켰다. 비오티닐화 2차 항체 및 Vectastain ABC 키트 (Vector Laboratories)를 WT1 신호를 검출하기 위해 사용하였다. 각 사구체 단면에서의 WT1 양성 족세포 핵은 4 마리의 돌연변이 마우스로부터의 총 165개의 사구체에서, 4 마리의 대조군 마우스로부터의 166 개의 사구체에서 계수되었다. 단백뇨 분석을 위해, 6주생 마우스로부터의 "단회"뇨 견본을 제조자의 교시에 따라 민감성 마우스 알부민뇨 ELISA 정량 키트 (Exocell) 및 스크리닝 방법으로써 소변 시험지봉(urine dipstick) (Multistix, Bayer, IN)을 사용하여 조사하였다. 소변을 알부민/크레아티닌 비율을 제공하기 위해 크레아티닌으로 정규화시켰다. 소변에서의 크레아티닌을 제조자의 교시에 따라 크레아티닌 검출 키트 (Sigma)를 사용하여 결정하였다. 소변 알부민을 또한 12% SDS-PAGE에 의해 조사하였고 안티-알부민 항체 (MP Biomedicals)로 블롯팅시켰다. 돌연변이 및 대조군으로부터의 데이터를 원-웨이 ANOVA, 스튜던트 t-시험 (Student t-test), 및 카이-스퀘어 시험(Chi-square test)을 사용하여 분석하였다.
[표 1]. 대조군 (야생형)과 비교되는 2 내지 9개월된 Robo2 족세포 특이적 녹아웃 마우스 (돌연변이)에서의 증가된 매트릭스 팽창을 가진 사구체의 정량적 분석
Figure 112014073912652-pct00025
[표 2]. 대조군 (야생형)과 비교되는 12개월된 Robo2 족세포-특이적 녹아웃 마우스 (돌연변이)에서의 증가된 매트릭스 팽창을 가진 사구체의 정량적 분석
Figure 112014073912652-pct00026
[표 3]. 조직학에 의한 Robo2 -/-;Nphs1 -/- 이중-동형접합 신생 마우스와 비교되는 Nphs1 -/- 단일-동형접합 (Robo2 +/-;Nphs1 -/-)에서의 팽창된 보우만 공간을 갖는 사구체의 형태 분석
Figure 112014073912652-pct00027
주석: 도 S4U에 나타난 것과 유사한 표현형을 디스플레이하는 사구체가 관찰되는 경우 사구체는 팽창된 보우만 공간을 갖는 양성인 것으로 기록되었고, 도 8V-8X에서 나타난 것과 유사한 사구체가 관찰되는 경우 음성인 것으로 기록되었다. 각각의 유전자형으로부터의 3 개의 마우스를 분석하였다. Robo2 -/- 단일 동형접합 (Robo2 +/-;Nphs1 -/-) 및 야생형 (Robo2 +/+;Nphs1 +/+)를 대조군으로서 사용하였다.
[표 4]. 주사 전자 현미경에 의한 ROBO2 -/-;Nphs1 -/- 이중-동형접합 신생 마우스와 비교되는 Nphs1 -/- 단일-동형접합 (ROBO2 +/-;Nphs1 -/-)에서의 사구체 족세포 깍지낌형 족 돌기 (FP) 표현형의 형태 분석
Figure 112014073912652-pct00028
참조문헌
Bashaw, G. J., Kidd, T., Murray, D., Pawson, T., and Goodman, C. S. (2000). Repulsive axon guidance: Abelson and Enabled play opposing roles downstream of the roundabout receptor. Cell 101, 703-715.
Dickson, B. J., and Gilestro, G. F. (2006). Regulation of commissural axon pathfinding by slit and its Robo receptors. Annu Rev Cell Dev Biol 22, 651-675.
Done, S. C., Takemoto, M., He, L., Sun, Y., Hultenby, K., Betsholtz, C., and Tryggvason, K. (2008). Nephrin is involved in podocyte maturation but not survival during glomerular development. Kidney Int 73, 697-704.
Fan, X., Labrador, J. P., Hing, H., and Bashaw, G. J. (2003). Slit stimulation recruits Dock and Pak to the roundabout receptor and increases Rac activity to regulate axon repulsion at the CNS midline. Neuron 40, 113-127.
Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., and Mundel, P. (2007). Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends Cell Biol 17, 428-437.
Furness, P. N., Hall, L. L., Shaw, J. A., and Pringle, J. H. (1999). Glomerular expression of nephrin is decreased in acquired human nephrotic syndrome. Nephrol Dial Transplant 14, 1234-1237.
Garg, P., Verma, R., Cook, L., Soofi, A., Venkatareddy, M., George, B., Mizuno, K., Gurniak, C., Witke, W., and Holzman, L. B. (2010). Actin-depolymerizing factor cofilin-1 is necessary in maintaining mature podocyte architecture. J Biol Chem 285, 22676-22688.
Grieshammer, U., Le, M., Plump, A. S., Wang, F., Tessier-Lavigne, M., and Martin, G. R. (2004). SLIT2-mediated ROBO2 signaling restricts kidney induction to a single site. Dev Cell 6, 709-717.
Guan, K. L., and Rao, Y. (2003). Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci 4, 941-956.
Hamano, Y., Grunkemeyer, J. A., Sudhakar, A., Zeisberg, M., Cosgrove, D., Morello, R., Lee, B., Sugimoto, H., and Kalluri, R. (2002). Determinants of vascular permeability in the kidney glomerulus. J Biol Chem 277, 31154-31162.
Jones, N., Blasutig, I. M., Eremina, V., Ruston, J. M., Bladt, F., Li, H., Huang, H., Larose, L., Li, S. S., Takano, T., et al . (2006). Nck adaptor proteins link nephrin to the actin cytoskeleton of kidney podocytes. Nature 440, 818-823.
Lu, W., van Eerde, A. M., Fan, X., Quintero-Rivera, F., Kulkarni, S., Ferguson, H. L., Kim, H., Fan, Y., Xi, Q., Li, Q. G., et al . (2007). Disruption of ROBO2 is associated with urinary tract anomalies and confers risk of vesicoureteral reflux. Am J Hum Genet 80, 616-632.
Nachman, P. H., Jennette, J. C., and Falk, R. J. (2008). Primary glomerular disease. In Brenner & Rector's The Kidney, B. M. Brenner, ed. (Pheladelphia, Saunders), pp. 987-1066.
Patrakka, J., Ruotsalainen, V., Reponen, P., Qvist, E., Laine, J., Holmberg, C., Tryggvason, K., and Jalanko, H. (2002). Recurrence of nephrotic syndrome in kidney grafts of patients with congenital nephrotic syndrome of the Finnish type: role of nephrin. Transplantation 73, 394-403.
Piper, M., Anderson, R., Dwivedy, A., Weinl, C., van Horck, F., Leung, K. M., Cogill, E., and Holt, C. (2006). Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron 49, 215-228.
Piper, M., Georgas, K., Yamada, T., and Little, M. (2000). Expression of the vertebrate Slit gene family and their putative receptors, the Robo genes, in the developing murine kidney. Mech Dev 94, 213-217.
Reeves, W., Caulfield, J. P., and Farquhar, M. G. (1978). Differentiation of epithelial foot processes and filtration slits: sequential appearance of occluding junctions, epithelial polyanion, and slit membranes in developing glomeruli. Lab Invest 39, 90-100.
Rivera, G. M., Briceno, C. A., Takeshima, F., Snapper, S. B., and Mayer, B. J. (2004). Inducible clustering of membrane-targeted SH3 domains of the adaptor protein Nck triggers localized actin polymerization. Curr Biol 14, 11-22.
Seiler, M. W., Venkatachalam, M. A., and Cotran, R. S. (1975). Glomerular epithelium: structural alterations induced by polycations. Science 189, 390-393.
Shih, N. Y., Li, J., Cotran, R., Mundel, P., Miner, J. H., and Shaw, A. S. (2001). CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. Am J Pathol 159, 2303-2308.
Topham, P. S., Kawachi, H., Haydar, S. A., Chugh, S., Addona, T. A., Charron, K. B., Holzman, L. B., Shia, M., Shimizu, F., and Salant, D. J. (1999). Nephritogenic mAb 5-1-6 is directed at the extracellular domain of rat nephrin. J Clin Invest 104, 1559-1566.
Tryggvason, K., Patrakka, J., and Wartiovaara, J. (2006). Hereditary proteinuria syndromes and mechanisms of proteinuria. N Engl J Med 354, 1387-1401.
Verma, R., Kovari, I., Soofi, A., Nihalani, D., Patrie, K., and Holzman, L. B. (2006). Nephrin ectodomain engagement results in Src kinase activation, nephrin phosphorylation, Nck recruitment, and actin polymerization. J Clin Invest 116, 1346-1359.
Wang, H., Li, Q., Liu, J., Mendelsohn, C., Salant, D. J., and Lu, W. (2011). Noninvasive assessment of antenatal hydronephrosis in mice reveals a critical role for Robo2 in maintaining anti-reflux mechanism. PLoS One 6, e24763.
Wong, K., Ren, X. R., Huang, Y. Z., Xie, Y., Liu, G., Saito, H., Tang, H., Wen, L., Brady-Kalnay, S. M., Mei, L., et al . (2001). Signal transduction in neuronal migration: roles of GTPase activating proteins and the small GTPase Cdc42 in the Slit-Robo pathway. Cell 107, 209-221.
Yuan, H., Takeuchi, E., and Salant, D. J. (2002). Podocyte slit-diaphragm protein nephrin is linked to the actin cytoskeleton. Am J Physiol Renal Physiol 282, F585-591.
Friedman, P. L., and Ellisman, M. H. (1981). Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. J Neurocytol 10, 111-131.
Li, X., Gao, X., Liu, G., Xiong, W., Wu, J., and Rao, Y. (2008). Netrin signal transduction and the guanine nucleotide exchange factor DOCK180 in attractive signaling. Nat Neurosci 11, 28-35.
Mugford, J. W., Sipila, P., Kobayashi, A., Behringer, R. R., and McMahon, A. P. (2008). Hoxd11 specifies a program of metanephric kidney development within the intermediate mesoderm of the mouse embryo. Dev Biol 319, 396-405.
Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., and Wiggins, R. C. (2003). Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. J Am Soc Nephrol 14, 2484-2493.
SEQUENCE LISTING <110> BOSTON MEDICAL CENTER CORPORATION <120> SLIT-ROBO SIGNALING FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF KIDNEY DISEASE <130> 701586-072811-PCT <140> PCT/US2013/020280 <141> 2013-01-04 <150> 61/583,379 <151> 2012-01-05 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1394 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Arg His Glu Arg Val Thr Arg Arg Met Trp Thr Trp Ala 1 5 10 15 Pro Gly Leu Leu Met Met Thr Val Val Phe Trp Gly His Gln Gly Asn 20 25 30 Gly Gln Gly Gln Gly Ser Arg Leu Arg Gln Glu Asp Phe Pro Pro Arg 35 40 45 Ile Val Glu His Pro Ser Asp Val Ile Val Ser Lys Gly Glu Pro Thr 50 55 60 Thr Leu Asn Cys Lys Ala Glu Gly Arg Pro Thr Pro Thr Ile Glu Trp 65 70 75 80 Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Val Glu Thr Asp Lys Asp Asp Pro Arg Ser 85 90 95 His Arg Met Leu Leu Pro Ser Gly Ser Leu Phe Phe Leu Arg Ile Val 100 105 110 His Gly Arg Arg Ser Lys Pro Asp Glu Gly Ser Tyr Val Cys Val Ala 115 120 125 Arg Asn Tyr Leu Gly Glu Ala Val Ser Arg Asn Ala Ser Leu Glu Val 130 135 140 Ala Leu Leu Arg Asp Asp Phe Arg Gln Asn Pro Thr Asp Val Val Val 145 150 155 160 Ala Ala Gly Glu Pro Ala Ile Leu Glu Cys Gln Pro Pro Arg Gly His 165 170 175 Pro Glu Pro Thr Ile Tyr Trp Lys Lys Asp Lys Val Arg Ile Asp Asp 180 185 190 Lys Glu Glu Arg Ile Ser Ile Arg Gly Gly Lys Leu Met Ile Ser Asn 195 200 205 Thr Arg Lys Ser Asp Ala Gly Met Tyr Thr Cys Val Gly Thr Asn Met 210 215 220 Val Gly Glu Arg Asp Ser Asp Pro Ala Glu Leu Thr Val Phe Glu Arg 225 230 235 240 Pro Thr Phe Leu Arg Arg Pro Ile Asn Gln Val Val Leu Glu Glu Glu 245 250 255 Ala Val Glu Phe Arg Cys Gln Val Gln Gly Asp Pro Gln Pro Thr Val 260 265 270 Arg Trp Lys Lys Asp Asp Ala Asp Leu Pro Arg Gly Arg Tyr Asp Ile 275 280 285 Lys Asp Asp Tyr Thr Leu Arg Ile Lys Lys Thr Met Ser Thr Asp Glu 290 295 300 Gly Thr Tyr Met Cys Ile Ala Glu Asn Arg Val Gly Lys Met Glu Ala 305 310 315 320 Ser Ala Thr Leu Thr Val Arg Ala Pro Pro Gln Phe Val Val Arg Pro 325 330 335 Arg Asp Gln Ile Val Ala Gln Gly Arg Thr Val Thr Phe Pro Cys Glu 340 345 350 Thr Lys Gly Asn Pro Gln Pro Ala Val Phe Trp Gln Lys Glu Gly Ser 355 360 365 Gln Asn Leu Leu Phe Pro Asn Gln Pro Gln Gln Pro Asn Ser Arg Cys 370 375 380 Ser Val Ser Pro Thr Gly Asp Leu Thr Ile Thr Asn Ile Gln Arg Ser 385 390 395 400 Asp Ala Gly Tyr Tyr Ile Cys Gln Ala Leu Thr Val Ala Gly Ser Ile 405 410 415 Leu Ala Lys Ala Gln Leu Glu Val Thr Asp Val Leu Thr Asp Arg Pro 420 425 430 Pro Pro Ile Ile Leu Gln Gly Pro Ala Asn Gln Thr Leu Ala Val Asp 435 440 445 Gly Thr Ala Leu Leu Lys Cys Lys Ala Thr Gly Asp Pro Leu Pro Val 450 455 460 Ile Ser Trp Leu Lys Glu Gly Phe Thr Phe Pro Gly Arg Asp Pro Arg 465 470 475 480 Ala Thr Ile Gln Glu Gln Gly Thr Leu Gln Ile Lys Asn Leu Arg Ile 485 490 495 Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Val Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu 500 505 510 Thr Ser Trp Ser Ala Val Leu Asp Val Thr Glu Ser Gly Ala Thr Ile 515 520 525 Ser Lys Asn Tyr Asp Leu Ser Asp Leu Pro Gly Pro Pro Ser Lys Pro 530 535 540 Gln Val Thr Asp Val Thr Lys Asn Ser Val Thr Leu Ser Trp Gln Pro 545 550 555 560 Gly Thr Pro Gly Thr Leu Pro Ala Ser Ala Tyr Ile Ile Glu Ala Phe 565 570 575 Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser Trp Gln Thr Val Ala Asn His Val Lys 580 585 590 Thr Thr Leu Tyr Thr Val Arg Gly Leu Arg Pro Asn Thr Ile Tyr Leu 595 600 605 Phe Met Val Arg Ala Ile Asn Pro Gln Gly Leu Ser Asp Pro Ser Pro 610 615 620 Met Ser Asp Pro Val Arg Thr Gln Asp Ile Ser Pro Pro Ala Gln Gly 625 630 635 640 Val Asp His Arg Gln Val Gln Lys Glu Leu Gly Asp Val Leu Val Arg 645 650 655 Leu His Asn Pro Val Val Leu Thr Pro Thr Thr Val Gln Val Thr Trp 660 665 670 Thr Val Asp Arg Gln Pro Gln Phe Ile Gln Gly Tyr Arg Val Met Tyr 675 680 685 Arg Gln Thr Ser Gly Leu Gln Ala Thr Ser Ser Trp Gln Asn Leu Asp 690 695 700 Ala Lys Val Pro Thr Glu Arg Ser Ala Val Leu Val Asn Leu Lys Lys 705 710 715 720 Gly Val Thr Tyr Glu Ile Lys Val Arg Pro Tyr Phe Asn Glu Phe Gln 725 730 735 Gly Met Asp Ser Glu Ser Lys Thr Val Arg Thr Thr Glu Glu Ala Pro 740 745 750 Ser Ala Pro Pro Gln Ser Val Thr Val Leu Thr Val Gly Ser Tyr Asn 755 760 765 Ser Thr Ser Ile Ser Val Ser Trp Asp Pro Pro Pro Pro Asp His Gln 770 775 780 Asn Gly Ile Ile Gln Glu Tyr Lys Ile Trp Cys Leu Gly Asn Glu Thr 785 790 795 800 Arg Phe His Ile Asn Lys Thr Val Asp Ala Ala Ile Arg Ser Val Ile 805 810 815 Ile Gly Gly Leu Phe Pro Gly Ile Gln Tyr Arg Val Glu Val Ala Ala 820 825 830 Ser Thr Ser Ala Gly Val Gly Val Lys Ser Glu Pro Gln Pro Ile Ile 835 840 845 Ile Gly Arg Arg Asn Glu Val Val Ile Thr Glu Asn Asn Asn Ser Ile 850 855 860 Thr Glu Gln Ile Thr Asp Val Val Lys Gln Pro Ala Phe Ile Ala Gly 865 870 875 880 Ile Gly Gly Ala Cys Trp Val Ile Leu Met Gly Phe Ser Ile Trp Leu 885 890 895 Tyr Trp Arg Arg Lys Lys Arg Lys Gly Leu Ser Asn Tyr Ala Val Thr 900 905 910 Phe Gln Arg Gly Asp Gly Gly Leu Met Ser Asn Gly Ser Arg Pro Gly 915 920 925 Leu Leu Asn Ala Gly Asp Pro Ser Tyr Pro Trp Leu Ala Asp Ser Trp 930 935 940 Pro Ala Thr Ser Leu Pro Val Asn Asn Ser Asn Ser Gly Pro Asn Glu 945 950 955 960 Ile Gly Asn Phe Gly Arg Gly Asp Val Leu Pro Pro Val Pro Gly Gln 965 970 975 Gly Asp Lys Thr Ala Thr Met Leu Ser Asp Gly Ala Ile Tyr Ser Ser 980 985 990 Ile Asp Phe Thr Thr Lys Thr Ser Tyr Asn Ser Ser Ser Gln Ile Thr 995 1000 1005 Gln Ala Thr Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Ile Leu His Ser Asn Ser 1010 1015 1020 Ile His Glu Leu Ala Val Asp Leu Pro Asp Pro Gln Trp Lys Ser 1025 1030 1035 Ser Ile Gln Gln Lys Thr Asp Leu Met Gly Phe Gly Tyr Ser Leu 1040 1045 1050 Pro Asp Gln Asn Lys Gly Asn Asn Gly Gly Lys Gly Gly Lys Lys 1055 1060 1065 Lys Lys Asn Lys Asn Ser Ser Lys Pro Gln Lys Asn Asn Gly Ser 1070 1075 1080 Thr Trp Ala Asn Val Pro Leu Pro Pro Pro Pro Val Gln Pro Leu 1085 1090 1095 Pro Gly Thr Glu Leu Glu His Tyr Ala Val Glu Gln Gln Glu Asn 1100 1105 1110 Gly Tyr Asp Ser Asp Ser Trp Cys Pro Pro Leu Pro Val Gln Thr 1115 1120 1125 Tyr Leu His Gln Gly Leu Glu Asp Glu Leu Glu Glu Asp Asp Asp 1130 1135 1140 Arg Val Pro Thr Pro Pro Val Arg Gly Val Ala Ser Ser Pro Ala 1145 1150 1155 Ile Ser Phe Gly Gln Gln Ser Thr Ala Thr Leu Thr Pro Ser Pro 1160 1165 1170 Arg Glu Glu Met Gln Pro Met Leu Gln Ala His Leu Asp Glu Leu 1175 1180 1185 Thr Arg Ala Tyr Gln Phe Asp Ile Ala Lys Gln Thr Trp His Ile 1190 1195 1200 Gln Ser Asn Asn Gln Pro Pro Gln Pro Pro Val Pro Pro Leu Gly 1205 1210 1215 Tyr Val Ser Gly Ala Leu Ile Ser Asp Leu Glu Thr Asp Val Ala 1220 1225 1230 Asp Asp Asp Ala Asp Asp Glu Glu Glu Ala Leu Glu Ile Pro Arg 1235 1240 1245 Pro Leu Arg Ala Leu Asp Gln Thr Pro Gly Ser Ser Met Asp Asn 1250 1255 1260 Leu Asp Ser Ser Val Thr Gly Lys Ala Phe Thr Ser Ser Gln Arg 1265 1270 1275 Pro Arg Pro Thr Ser Pro Phe Ser Thr Asp Ser Asn Thr Ser Ala 1280 1285 1290 Ala Leu Ser Gln Ser Gln Arg Pro Arg Pro Thr Lys Lys His Lys 1295 1300 1305 Gly Gly Arg Met Asp Gln Gln Pro Ala Leu Pro His Arg Arg Glu 1310 1315 1320 Gly Met Thr Asp Glu Glu Ala Leu Val Pro Tyr Ser Lys Pro Ser 1325 1330 1335 Phe Pro Ser Pro Gly Gly His Ser Ser Ser Gly Thr Ala Ser Ser 1340 1345 1350 Lys Gly Ser Thr Gly Pro Arg Lys Thr Glu Val Leu Arg Ala Gly 1355 1360 1365 His Gln Arg Asn Ala Ser Asp Leu Leu Asp Ile Gly Tyr Met Gly 1370 1375 1380 Ser Asn Ser Gln Gly Gln Phe Thr Gly Glu Leu 1385 1390 <210> 2 <211> 8374 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcgctggagg agggaggcgg aaggacagcg ctgcgccacc acccggagga gggagcgcgg 60 tagctgcagg caggggaggg agaggaaaga aaaggaagga cggctcccag acagagagtg 120 ggagaaaccg gggagcagcg ggagcagcag gtccgggggg agctgttccg ctgcgctgcc 180 ctcgttattc acacggacgc tgcggagctt cccagggctg cttccctgtc cccctgggtg 240 gaggctgccg tctaaacctg actccagagt ttaagatgca atggccagaa gacatgaacg 300 tgtcactaga aggatgtgga catgggctcc gggactgttg atgatgactg tggtgttttg 360 gggtcatcag gggaatggac aaggccaagg atcgcgtctt cgccaggagg actttccccc 420 gcggattgtg gagcatcctt ccgatgtcat cgtctctaag ggcgagccca cgactctgaa 480 ctgcaaggcg gagggccggc caacgcccac cattgagtgg tacaaagatg gggagcgagt 540 ggagactgac aaggacgatc cccggtccca caggatgctt ctgcccagcg gatccttatt 600 cttcttgcgc atcgtgcacg ggcgcaggag taaacctgat gaaggaagct acgtttgtgt 660 tgcgaggaac tatcttggtg aagcagtgag tcgaaatgcg tctctggaag tggcattgtt 720 acgagatgac ttccgacaaa accccacaga tgttgtagtg gcagctggag agcctgcaat 780 cctggagtgc cagcctcccc ggggacaccc agaacccacc atctactgga aaaaagacaa 840 agttcgaatt gatgacaagg aagaaagaat aagtatccgt ggtggaaaac tgatgatctc 900 caataccagg aaaagtgatg cagggatgta tacttgtgtt ggtaccaata tggtgggaga 960 aagggacagt gacccagcag agctgactgt ctttgaacga cccacatttc tcaggaggcc 1020 aattaaccag gtggtactgg aggaagaagc tgtagaattt cgttgtcaag tccaaggaga 1080 tcctcaacca actgtgaggt ggaaaaagga tgatgcagac ttgccaagag gaaggtatga 1140 catcaaagac gattacacac taagaattaa aaagaccatg agtacagatg aaggcaccta 1200 tatgtgtatt gctgagaatc gggttggaaa aatggaagcc tctgctacac tcaccgtccg 1260 agctccccca cagtttgtgg ttcggccaag agatcagatt gttgctcaag gtcgaacagt 1320 gacatttccc tgtgaaacta aaggaaaccc acagccagct gttttttggc agaaagaagg 1380 cagccagaac ctacttttcc caaaccaacc ccagcagccc aacagtagat gctcagtgtc 1440 accaactgga gacctcacaa tcaccaacat tcaacgttcc gacgcgggtt actacatctg 1500 ccaggcttta actgtggcag gaagcatttt agcaaaagct caactggagg ttactgatgt 1560 tttgacagat agacctccac ctataattct acaaggccca gccaaccaaa cgctggcagt 1620 ggatggtaca gcgttactga aatgtaaagc cactggtgat cctcttcctg taattagctg 1680 gttaaaggag ggatttactt ttccgggtag agatccaaga gcaacaattc aagagcaagg 1740 cacactgcag attaagaatt tacggatttc tgatactggc acttatactt gtgtggctac 1800 aagttcaagt ggagagactt cctggagtgc agtgctggat gtgacagagt ctggagcaac 1860 aatcagtaaa aactatgatt taagtgacct gccagggcca ccatccaaac cgcaggtcac 1920 tgatgttact aagaacagtg tcaccttgtc ctggcagcca ggtacccctg gaacccttcc 1980 agcaagtgca tatatcattg aggctttcag ccaatcagtg agcaacagct ggcagaccgt 2040 ggcaaaccat gtaaagacca ccctctatac tgtaagagga ctgcggccca atacaatcta 2100 cttattcatg gtcagagcga tcaaccccca aggtctcagt gacccaagtc ccatgtcaga 2160 tcctgtgcgc acacaagata tcagcccacc agcacaagga gtggaccaca ggcaagtgca 2220 gaaagagcta ggagatgtcc ttgtccgtct tcataatcca gttgtgctga ctcccaccac 2280 ggttcaggtc acatggacgg ttgatcgcca accccagttt atccaaggct accgagtgat 2340 gtatcgtcag acttcaggtc tgcaggcgac atcttcgtgg cagaatttag atgccaaagt 2400 cccgactgaa cgaagtgctg tcttagtcaa cctgaaaaag ggggtgactt atgaaattaa 2460 agtacggcca tattttaatg agttccaagg aatggatagt gaatctaaaa cggttcgtac 2520 tactgaagaa gccccaagtg ccccaccaca gtctgtcact gtactgacag ttggaagcta 2580 caatagcaca agtattagtg tttcctggga tcctcctcct ccagatcacc agaatggaat 2640 tatccaagaa tacaagatct ggtgtctagg aaatgaaacg cgattccata tcaacaaaac 2700 tgtggatgca gccattcggt ccgtaataat tggtggatta ttcccaggta ttcaataccg 2760 ggtagaggtt gcagctagta ccagtgcagg ggttggagta aagagtgagc cacagccaat 2820 aataatcggg agacgcaatg aagttgtcat tactgaaaac aataacagca taactgagca 2880 aatcactgat gtggtgaagc aaccagcctt tatagctggt attggtggtg cctgctgggt 2940 aattctgatg ggttttagca tatggttgta ttggcgaaga aagaagagga agggactcag 3000 taattatgct gttacgtttc aaagaggaga tggaggacta atgagcaatg gaagccgtcc 3060 aggtcttctc aatgctggtg atcccagcta tccatggctt gctgattctt ggccagccac 3120 gagcttgcca gtaaataata gcaacagtgg cccaaatgag attggaaatt ttggccgtgg 3180 agatgtgctg ccaccagttc caggccaagg ggataaaaca gcaacgatgc tctcagatgg 3240 agccatttat agtagcattg acttcactac caaaaccagt tacaacagtt ccagccaaat 3300 aacacaggct accccatatg ccacgacaca gatcttgcat tccaacagca tacatgaatt 3360 ggctgtcgat ctgcctgatc cacaatggaa aagctcaatt cagcaaaaaa cagatctgat 3420 gggatttggt tattctctac ctgatcagaa caaaggtaac aatggtggga aaggtggaaa 3480 aaagaagaaa aataaaaact cttctaaacc acagaaaaac aatggatcca cttgggccaa 3540 tgtccctcta cctccccccc cagtccagcc ccttcctggc acggagctgg aacactatgc 3600 agtggaacaa caagaaaatg gctatgacag tgatagctgg tgcccaccat tgccagtaca 3660 aacttactta caccaaggtc tggaagatga actggaagaa gatgatgata gggtcccaac 3720 acctcctgtt cgaggcgtgg cttcttctcc tgctatctcc tttggacagc agtccactgc 3780 aactcttact ccatccccac gggaagagat gcaacccatg ctgcaggctc acctggatga 3840 gttgacaaga gcctatcagt ttgatatagc aaaacaaaca tggcacattc aaagcaataa 3900 tcaacctcca cagcctccag ttccaccgtt aggttatgtg tctggagcct tgatttctga 3960 tttggaaacg gatgttgcag atgatgatgc cgacgacgaa gaggaagctt tagaaatccc 4020 caggcccctg agagcactgg accagactcc tggatccagc atggacaatc tagacagctc 4080 tgtgacagga aaagccttta cctcctctca aagacctcga cctaccagcc cattttctac 4140 tgacagtaac accagtgcag ccctgagtca aagtcagagg cctcggccca ctaaaaaaca 4200 caagggaggg cggatggacc aacaaccagc attgcctcat cgaagggaag gaatgacaga 4260 tgaggaggcc ttggtgccct atagcaagcc cagtttccca tctccaggtg gccacagctc 4320 atcaggaaca gcttcttcta agggatccac tggacctagg aaaaccgagg tgttgagagc 4380 aggccaccag cgcaatgcca gcgaccttct tgacatagga tatatgggct ccaacagtca 4440 aggacagttt acaggtgaat tatagtaaat gagaggagac atacaaagct gctctgaagg 4500 accatcaggt ccggactcat ggaagtgatg actctaaaca gtgcaatgaa caatttattt 4560 atgtactatt aaaagaactg taaatgcaat gtaaagacac acagccacac atatcccaca 4620 gatattttca ttgtgttctt ctcttaagta caccacccac cttaactctt tcttgtcagg 4680 agtatataaa aaagaaagaa aacaaaactc gccctacagg aagaaaagga ttctcctctg 4740 tatataattt cttttgtgca ttgctatgca agctcactct ttttagctct gctcatatta 4800 ttgtctgttc ttattggtct gttgtactat atgtgaatta ataggctgtg gtgccatata 4860 ttaactttta attgtgtaac ttttatgttt aaattttgca ctgcaatttt atttggtgat 4920 aagcacaaat ctctactcct catgacatga agaaaaagac tgaatgtgaa gggagtttct 4980 gtactgtaag ctagattgga taatgatggc tgtaacaaat catgttagat ggttttcagt 5040 tggggtgtag aaataggaag atgcaaagga acaatggtgt tggcaaagtc ttctttgaat 5100 atcagggact gagtcaataa aaaaaatagt agaaaggtgg cttttactat tgacaaaagc 5160 cggggtcaaa aaaagtagtt taagtcttaa gactgaatat gcattaaagt atgcaggtag 5220 caaagatgta ataaatttgc ttaaaaaaag aaattaaagt tttatttaga atcaatttta 5280 cctgtcattg taattgaccc atctgagaat tacaataagc aagaggaaat taaggtgttt 5340 tgcaagagct gtatttatat tacagttttt taaaaacatt ttctgaatta tcgtaattaa 5400 gctctccaac tcgttaagtc agaatataat atgaagttcc ccaaggaaac gaacaaaatg 5460 aactctagaa tatctagcaa atagttaaag aagcaattta ttattagggc atactcgggc 5520 tgtttccaaa tataaactct attgcaatat cttatttcat ctttctaata catgtacagt 5580 gcacactaga ggatagagct gcatcactta aattcatgac ttaaaaaata atacagttta 5640 tatacaactt gttttttatt tgattaagaa gtgaagttta cgccacccaa tgtatagcca 5700 aattgtacgt gcttaaaaaa cagtgccgag agtatgttca gttcgcagta agtagattta 5760 ttggaataaa tattctatgg tacattctca gaaattggct tccaactaaa atacgtttga 5820 cccattttga ataaggaaat tgaaaagaaa aatttaaaag gagaaaaaaa tgcatgttta 5880 taaacttttt aaataaaacc agaccttgta agtggacatt aataattgtc ctgcctcatt 5940 tgttttcacg actttgacaa caagaagttc ctgaacatta gtcatgtatg ctcagaataa 6000 atgtgacttt gaaatatatg ttagctactg tacatgtata gtcagtcaag tagaagagga 6060 ccttcctgaa attcccactt gtgacatttt cccatgggtt tcctacacaa tcttaaattt 6120 tatttctgtc tatactttct caaatttttc ctatgataag ttcagttgtt ggtactcttc 6180 taaaaatatt caacgtgatt aggatcagtt ctaaaatacg ggaccccttt gagtgacaat 6240 tcgcactcca tgcattattg gctcagtagc caatttttgt cacgtcgtta taacaaggag 6300 atgacataat taaacatttc catcctttct attccctgag actgcatcag cacaggcaag 6360 tatagaatgt aatgttcttc atgggcccca ccagcttttt ggtgccatgt aatttatttc 6420 ttcgctgaag agaaaaagaa ttctgagaca cagttattaa accctttatc aactttctac 6480 catcagtgcc tgaattctaa tgcagtgtga tttctctggg acaaagagac tgaggaagat 6540 gaaaagtttc ttcaaagagt gaatacatac ttattcacaa ctctaggatg tgaggacttt 6600 aaatatctct ttatgaagtt ccctgcctaa cctctttcta tttaaaggca aacaaatttc 6660 gaagaggttt tgtgttccct ctttatgttt ctctatgacc cagtttagtc taaaacctta 6720 gttcattaca tatacaacac atagcctttg atccctggta actggcaggt gttggtgatt 6780 aataaaccaa ggcttcaaag tgaagtatgt gtgtgcagat gacttttgga ataacgtggg 6840 catagcatca taccttcctg attgtcttca gcatataaaa attaactgtt gtagttaaaa 6900 ttatgtcagt gcagagcttg tggttacttg gaatgttctt tcagaatagt ccatgttgcc 6960 tattaaacct agttttaaac acattgggca gtcaatttat gcacccaaaa tatcaccctc 7020 aggtagattg agggcaagat aaaatgctgt atgtagctat acaaaggaat tcagaaacat 7080 tactggaaag caaagccttt gtcagcttgc tactgacaaa gtagtaaaaa gctactaatc 7140 agtgttgagt cagatgtcaa cagaaaaata caaataccta tgagagccac agcagtttct 7200 cgtttcatag ccgattcaat gaatatgatt agaaattcac tgagctcact cttgcaggtt 7260 taaatggagg cctgcataag gactgcaaga ggaaatctgg gtgggagaga atgtaatctg 7320 atcttgcact cataggcaat gctgcaatgc aatcatgtcc aatacaagca cagcttcatt 7380 cataacagga aacgtcttct ttgggaaaat agctctattg gtgcccaaac tcaggtatgc 7440 cagtgtatgc aggtggagtc gccctacccc tcttccaaac atgtcctgtg agatttttaa 7500 aataagatgg gatagtacag gggcatgaaa agaattgatt ccttcacagg atttgaatcc 7560 agttcaaggg agaatgtaga aaattcaaaa ccaacatata aggtatcaca caaccaagaa 7620 aagtaaaacc attgcaagtt tacttgcgtt gagtacaaaa cagatttaat ggtgttctat 7680 gtcatagttt aatgctctgg gtatttaaat atgttttcaa caggatttga gttgaaagtt 7740 tgtaatgtgc tttgatggaa cacctctcaa tttctattca ataaacttat gtaattgtcc 7800 attgacaata taatgataac agtaccattg aactctaaac tgtggtttat cttcactact 7860 gggaagcaac tgtgcatcag tattaaagat atgcagaaac ataatattca ctaatttgtt 7920 catctgcttc tgtatattgt ttatggaatt acatggcaag aactgttcta aagcaacatg 7980 tctttccaca ttattttaga ggtgaaatta cttttgtttt gcttctctat aatgtgtact 8040 tcaaatgaaa caccatactt ttttctaaaa aaagatgttc aatttactaa tttttttaaa 8100 tctcataatt taaaaagcat ttgttgtgat tttaaagtgt tgcaagaaaa gggattttgt 8160 ggccgtgggt agacttttta tactttgttt tatagatgga ttttttttaa ctgtagtttg 8220 tttaagtcac caagcagcat ccaaaatctt aatgtgtttc atttgatgtt gttagatcag 8280 agaagaaatt ggcataaaat cggttaatag tattgtcaaa gaattgtgta ttgtgtactc 8340 actgggaaaa aataaaatat attcacattt caaa 8374 <210> 3 <211> 1378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ser Leu Leu Met Phe Thr Gln Leu Leu Leu Cys Gly Phe Leu Tyr 1 5 10 15 Val Arg Val Asp Gly Ser Arg Leu Arg Gln Glu Asp Phe Pro Pro Arg 20 25 30 Ile Val Glu His Pro Ser Asp Val Ile Val Ser Lys Gly Glu Pro Thr 35 40 45 Thr Leu Asn Cys Lys Ala Glu Gly Arg Pro Thr Pro Thr Ile Glu Trp 50 55 60 Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Val Glu Thr Asp Lys Asp Asp Pro Arg Ser 65 70 75 80 His Arg Met Leu Leu Pro Ser Gly Ser Leu Phe Phe Leu Arg Ile Val 85 90 95 His Gly Arg Arg Ser Lys Pro Asp Glu Gly Ser Tyr Val Cys Val Ala 100 105 110 Arg Asn Tyr Leu Gly Glu Ala Val Ser Arg Asn Ala Ser Leu Glu Val 115 120 125 Ala Leu Leu Arg Asp Asp Phe Arg Gln Asn Pro Thr Asp Val Val Val 130 135 140 Ala Ala Gly Glu Pro Ala Ile Leu Glu Cys Gln Pro Pro Arg Gly His 145 150 155 160 Pro Glu Pro Thr Ile Tyr Trp Lys Lys Asp Lys Val Arg Ile Asp Asp 165 170 175 Lys Glu Glu Arg Ile Ser Ile Arg Gly Gly Lys Leu Met Ile Ser Asn 180 185 190 Thr Arg Lys Ser Asp Ala Gly Met Tyr Thr Cys Val Gly Thr Asn Met 195 200 205 Val Gly Glu Arg Asp Ser Asp Pro Ala Glu Leu Thr Val Phe Glu Arg 210 215 220 Pro Thr Phe Leu Arg Arg Pro Ile Asn Gln Val Val Leu Glu Glu Glu 225 230 235 240 Ala Val Glu Phe Arg Cys Gln Val Gln Gly Asp Pro Gln Pro Thr Val 245 250 255 Arg Trp Lys Lys Asp Asp Ala Asp Leu Pro Arg Gly Arg Tyr Asp Ile 260 265 270 Lys Asp Asp Tyr Thr Leu Arg Ile Lys Lys Thr Met Ser Thr Asp Glu 275 280 285 Gly Thr Tyr Met Cys Ile Ala Glu Asn Arg Val Gly Lys Met Glu Ala 290 295 300 Ser Ala Thr Leu Thr Val Arg Ala Pro Pro Gln Phe Val Val Arg Pro 305 310 315 320 Arg Asp Gln Ile Val Ala Gln Gly Arg Thr Val Thr Phe Pro Cys Glu 325 330 335 Thr Lys Gly Asn Pro Gln Pro Ala Val Phe Trp Gln Lys Glu Gly Ser 340 345 350 Gln Asn Leu Leu Phe Pro Asn Gln Pro Gln Gln Pro Asn Ser Arg Cys 355 360 365 Ser Val Ser Pro Thr Gly Asp Leu Thr Ile Thr Asn Ile Gln Arg Ser 370 375 380 Asp Ala Gly Tyr Tyr Ile Cys Gln Ala Leu Thr Val Ala Gly Ser Ile 385 390 395 400 Leu Ala Lys Ala Gln Leu Glu Val Thr Asp Val Leu Thr Asp Arg Pro 405 410 415 Pro Pro Ile Ile Leu Gln Gly Pro Ala Asn Gln Thr Leu Ala Val Asp 420 425 430 Gly Thr Ala Leu Leu Lys Cys Lys Ala Thr Gly Asp Pro Leu Pro Val 435 440 445 Ile Ser Trp Leu Lys Glu Gly Phe Thr Phe Pro Gly Arg Asp Pro Arg 450 455 460 Ala Thr Ile Gln Glu Gln Gly Thr Leu Gln Ile Lys Asn Leu Arg Ile 465 470 475 480 Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Val Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu 485 490 495 Thr Ser Trp Ser Ala Val Leu Asp Val Thr Glu Ser Gly Ala Thr Ile 500 505 510 Ser Lys Asn Tyr Asp Leu Ser Asp Leu Pro Gly Pro Pro Ser Lys Pro 515 520 525 Gln Val Thr Asp Val Thr Lys Asn Ser Val Thr Leu Ser Trp Gln Pro 530 535 540 Gly Thr Pro Gly Thr Leu Pro Ala Ser Ala Tyr Ile Ile Glu Ala Phe 545 550 555 560 Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser Trp Gln Thr Val Ala Asn His Val Lys 565 570 575 Thr Thr Leu Tyr Thr Val Arg Gly Leu Arg Pro Asn Thr Ile Tyr Leu 580 585 590 Phe Met Val Arg Ala Ile Asn Pro Gln Gly Leu Ser Asp Pro Ser Pro 595 600 605 Met Ser Asp Pro Val Arg Thr Gln Asp Ile Ser Pro Pro Ala Gln Gly 610 615 620 Val Asp His Arg Gln Val Gln Lys Glu Leu Gly Asp Val Leu Val Arg 625 630 635 640 Leu His Asn Pro Val Val Leu Thr Pro Thr Thr Val Gln Val Thr Trp 645 650 655 Thr Val Asp Arg Gln Pro Gln Phe Ile Gln Gly Tyr Arg Val Met Tyr 660 665 670 Arg Gln Thr Ser Gly Leu Gln Ala Thr Ser Ser Trp Gln Asn Leu Asp 675 680 685 Ala Lys Val Pro Thr Glu Arg Ser Ala Val Leu Val Asn Leu Lys Lys 690 695 700 Gly Val Thr Tyr Glu Ile Lys Val Arg Pro Tyr Phe Asn Glu Phe Gln 705 710 715 720 Gly Met Asp Ser Glu Ser Lys Thr Val Arg Thr Thr Glu Glu Ala Pro 725 730 735 Ser Ala Pro Pro Gln Ser Val Thr Val Leu Thr Val Gly Ser Tyr Asn 740 745 750 Ser Thr Ser Ile Ser Val Ser Trp Asp Pro Pro Pro Pro Asp His Gln 755 760 765 Asn Gly Ile Ile Gln Glu Tyr Lys Ile Trp Cys Leu Gly Asn Glu Thr 770 775 780 Arg Phe His Ile Asn Lys Thr Val Asp Ala Ala Ile Arg Ser Val Ile 785 790 795 800 Ile Gly Gly Leu Phe Pro Gly Ile Gln Tyr Arg Val Glu Val Ala Ala 805 810 815 Ser Thr Ser Ala Gly Val Gly Val Lys Ser Glu Pro Gln Pro Ile Ile 820 825 830 Ile Gly Arg Arg Asn Glu Val Val Ile Thr Glu Asn Asn Asn Ser Ile 835 840 845 Thr Glu Gln Ile Thr Asp Val Val Lys Gln Pro Ala Phe Ile Ala Gly 850 855 860 Ile Gly Gly Ala Cys Trp Val Ile Leu Met Gly Phe Ser Ile Trp Leu 865 870 875 880 Tyr Trp Arg Arg Lys Lys Arg Lys Gly Leu Ser Asn Tyr Ala Val Thr 885 890 895 Phe Gln Arg Gly Asp Gly Gly Leu Met Ser Asn Gly Ser Arg Pro Gly 900 905 910 Leu Leu Asn Ala Gly Asp Pro Ser Tyr Pro Trp Leu Ala Asp Ser Trp 915 920 925 Pro Ala Thr Ser Leu Pro Val Asn Asn Ser Asn Ser Gly Pro Asn Glu 930 935 940 Ile Gly Asn Phe Gly Arg Gly Asp Val Leu Pro Pro Val Pro Gly Gln 945 950 955 960 Gly Asp Lys Thr Ala Thr Met Leu Ser Asp Gly Ala Ile Tyr Ser Ser 965 970 975 Ile Asp Phe Thr Thr Lys Thr Ser Tyr Asn Ser Ser Ser Gln Ile Thr 980 985 990 Gln Ala Thr Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Ile Leu His Ser Asn Ser Ile 995 1000 1005 His Glu Leu Ala Val Asp Leu Pro Asp Pro Gln Trp Lys Ser Ser 1010 1015 1020 Ile Gln Gln Lys Thr Asp Leu Met Gly Phe Gly Tyr Ser Leu Pro 1025 1030 1035 Asp Gln Asn Lys Gly Asn Asn Gly Gly Lys Gly Gly Lys Lys Lys 1040 1045 1050 Lys Asn Lys Asn Ser Ser Lys Pro Gln Lys Asn Asn Gly Ser Thr 1055 1060 1065 Trp Ala Asn Val Pro Leu Pro Pro Pro Pro Val Gln Pro Leu Pro 1070 1075 1080 Gly Thr Glu Leu Glu His Tyr Ala Val Glu Gln Gln Glu Asn Gly 1085 1090 1095 Tyr Asp Ser Asp Ser Trp Cys Pro Pro Leu Pro Val Gln Thr Tyr 1100 1105 1110 Leu His Gln Gly Leu Glu Asp Glu Leu Glu Glu Asp Asp Asp Arg 1115 1120 1125 Val Pro Thr Pro Pro Val Arg Gly Val Ala Ser Ser Pro Ala Ile 1130 1135 1140 Ser Phe Gly Gln Gln Ser Thr Ala Thr Leu Thr Pro Ser Pro Arg 1145 1150 1155 Glu Glu Met Gln Pro Met Leu Gln Ala His Leu Asp Glu Leu Thr 1160 1165 1170 Arg Ala Tyr Gln Phe Asp Ile Ala Lys Gln Thr Trp His Ile Gln 1175 1180 1185 Ser Asn Asn Gln Pro Pro Gln Pro Pro Val Pro Pro Leu Gly Tyr 1190 1195 1200 Val Ser Gly Ala Leu Ile Ser Asp Leu Glu Thr Asp Val Ala Asp 1205 1210 1215 Asp Asp Ala Asp Asp Glu Glu Glu Ala Leu Glu Ile Pro Arg Pro 1220 1225 1230 Leu Arg Ala Leu Asp Gln Thr Pro Gly Ser Ser Met Asp Asn Leu 1235 1240 1245 Asp Ser Ser Val Thr Gly Lys Ala Phe Thr Ser Ser Gln Arg Pro 1250 1255 1260 Arg Pro Thr Ser Pro Phe Ser Thr Asp Ser Asn Thr Ser Ala Ala 1265 1270 1275 Leu Ser Gln Ser Gln Arg Pro Arg Pro Thr Lys Lys His Lys Gly 1280 1285 1290 Gly Arg Met Asp Gln Gln Pro Ala Leu Pro His Arg Arg Glu Gly 1295 1300 1305 Met Thr Asp Glu Glu Ala Leu Val Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Phe 1310 1315 1320 Pro Ser Pro Gly Gly His Ser Ser Ser Gly Thr Ala Ser Ser Lys 1325 1330 1335 Gly Ser Thr Gly Pro Arg Lys Thr Glu Val Leu Arg Ala Gly His 1340 1345 1350 Gln Arg Asn Ala Ser Asp Leu Leu Asp Ile Gly Tyr Met Gly Ser 1355 1360 1365 Asn Ser Gln Gly Gln Phe Thr Gly Glu Leu 1370 1375 <210> 4 <211> 8689 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctcctctctt ttggaaaccg gagaggtgga gggagggcaa caccgctgca aaggagaggc 60 ccgccaagtc tgcccgcctg caaagtgttg ctttgacaca ttcttattat ggaagttaag 120 taaaaatata gacatattaa aaaataactc cggacgtgga gctgctacgg agaaggaaac 180 cgggggaaag aaaaccagta ggcaggccaa tggtttttcg gcagcgcgct ggcaagtttg 240 tggaacactt tctaggaatt aggtcttttc ctcccccttc atcatcttga cttctgaagg 300 aagaacttgg ctttggattg cagtggagcc taaggagaga gggttagaca cactcgaata 360 atccctctgg ctgggctgaa tttgtgggaa tttaggaagc cagagtgctg gaaatacagc 420 agcctttgaa gtaccctctg ttaatttgga tggatctcag tgtgccccgt tcgagacctc 480 tccaccaacc ccttctgatc ttgcgatttg ctcttcttga ctttaattag tatctaggaa 540 agtctaaact ttggacctac ctcttttttt gatactcatt tttgtacttt tgctctctgg 600 gattggtttc ttaaagaatc tggatccttt ttaatatgtc aaaatgagtc tgctgatgtt 660 tacacaacta ctgctctgtg gatttttata tgttcgggtt gatggatcgc gtcttcgcca 720 ggaggacttt cccccgcgga ttgtggagca tccttccgat gtcatcgtct ctaagggcga 780 gcccacgact ctgaactgca aggcggaggg ccggccaacg cccaccattg agtggtacaa 840 agatggggag cgagtggaga ctgacaagga cgatccccgg tcccacagga tgcttctgcc 900 cagcggatcc ttattcttct tgcgcatcgt gcacgggcgc aggagtaaac ctgatgaagg 960 aagctacgtt tgtgttgcga ggaactatct tggtgaagca gtgagtcgaa atgcgtctct 1020 ggaagtggca ttgttacgag atgacttccg acaaaacccc acagatgttg tagtggcagc 1080 tggagagcct gcaatcctgg agtgccagcc tccccgggga cacccagaac ccaccatcta 1140 ctggaaaaaa gacaaagttc gaattgatga caaggaagaa agaataagta tccgtggtgg 1200 aaaactgatg atctccaata ccaggaaaag tgatgcaggg atgtatactt gtgttggtac 1260 caatatggtg ggagaaaggg acagtgaccc agcagagctg actgtctttg aacgacccac 1320 atttctcagg aggccaatta accaggtggt actggaggaa gaagctgtag aatttcgttg 1380 tcaagtccaa ggagatcctc aaccaactgt gaggtggaaa aaggatgatg cagacttgcc 1440 aagaggaagg tatgacatca aagacgatta cacactaaga attaaaaaga ccatgagtac 1500 agatgaaggc acctatatgt gtattgctga gaatcgggtt ggaaaaatgg aagcctctgc 1560 tacactcacc gtccgagctc ccccacagtt tgtggttcgg ccaagagatc agattgttgc 1620 tcaaggtcga acagtgacat ttccctgtga aactaaagga aacccacagc cagctgtttt 1680 ttggcagaaa gaaggcagcc agaacctact tttcccaaac caaccccagc agcccaacag 1740 tagatgctca gtgtcaccaa ctggagacct cacaatcacc aacattcaac gttccgacgc 1800 gggttactac atctgccagg ctttaactgt ggcaggaagc attttagcaa aagctcaact 1860 ggaggttact gatgttttga cagatagacc tccacctata attctacaag gcccagccaa 1920 ccaaacgctg gcagtggatg gtacagcgtt actgaaatgt aaagccactg gtgatcctct 1980 tcctgtaatt agctggttaa aggagggatt tacttttccg ggtagagatc caagagcaac 2040 aattcaagag caaggcacac tgcagattaa gaatttacgg atttctgata ctggcactta 2100 tacttgtgtg gctacaagtt caagtggaga gacttcctgg agtgcagtgc tggatgtgac 2160 agagtctgga gcaacaatca gtaaaaacta tgatttaagt gacctgccag ggccaccatc 2220 caaaccgcag gtcactgatg ttactaagaa cagtgtcacc ttgtcctggc agccaggtac 2280 ccctggaacc cttccagcaa gtgcatatat cattgaggct ttcagccaat cagtgagcaa 2340 cagctggcag accgtggcaa accatgtaaa gaccaccctc tatactgtaa gaggactgcg 2400 gcccaataca atctacttat tcatggtcag agcgatcaac ccccaaggtc tcagtgaccc 2460 aagtcccatg tcagatcctg tgcgcacaca agatatcagc ccaccagcac aaggagtgga 2520 ccacaggcaa gtgcagaaag agctaggaga tgtccttgtc cgtcttcata atccagttgt 2580 gctgactccc accacggttc aggtcacatg gacggttgat cgccaacccc agtttatcca 2640 aggctaccga gtgatgtatc gtcagacttc aggtctgcag gcgacatctt cgtggcagaa 2700 tttagatgcc aaagtcccga ctgaacgaag tgctgtctta gtcaacctga aaaagggggt 2760 gacttatgaa attaaagtac ggccatattt taatgagttc caaggaatgg atagtgaatc 2820 taaaacggtt cgtactactg aagaagcccc aagtgcccca ccacagtctg tcactgtact 2880 gacagttgga agctacaata gcacaagtat tagtgtttcc tgggatcctc ctcctccaga 2940 tcaccagaat ggaattatcc aagaatacaa gatctggtgt ctaggaaatg aaacgcgatt 3000 ccatatcaac aaaactgtgg atgcagccat tcggtccgta ataattggtg gattattccc 3060 aggtattcaa taccgggtag aggttgcagc tagtaccagt gcaggggttg gagtaaagag 3120 tgagccacag ccaataataa tcgggagacg caatgaagtt gtcattactg aaaacaataa 3180 cagcataact gagcaaatca ctgatgtggt gaagcaacca gcctttatag ctggtattgg 3240 tggtgcctgc tgggtaattc tgatgggttt tagcatatgg ttgtattggc gaagaaagaa 3300 gaggaaggga ctcagtaatt atgctgttac gtttcaaaga ggagatggag gactaatgag 3360 caatggaagc cgtccaggtc ttctcaatgc tggtgatccc agctatccat ggcttgctga 3420 ttcttggcca gccacgagct tgccagtaaa taatagcaac agtggcccaa atgagattgg 3480 aaattttggc cgtggagatg tgctgccacc agttccaggc caaggggata aaacagcaac 3540 gatgctctca gatggagcca tttatagtag cattgacttc actaccaaaa ccagttacaa 3600 cagttccagc caaataacac aggctacccc atatgccacg acacagatct tgcattccaa 3660 cagcatacat gaattggctg tcgatctgcc tgatccacaa tggaaaagct caattcagca 3720 aaaaacagat ctgatgggat ttggttattc tctacctgat cagaacaaag gtaacaatgg 3780 tgggaaaggt ggaaaaaaga agaaaaataa aaactcttct aaaccacaga aaaacaatgg 3840 atccacttgg gccaatgtcc ctctacctcc ccccccagtc cagccccttc ctggcacgga 3900 gctggaacac tatgcagtgg aacaacaaga aaatggctat gacagtgata gctggtgccc 3960 accattgcca gtacaaactt acttacacca aggtctggaa gatgaactgg aagaagatga 4020 tgatagggtc ccaacacctc ctgttcgagg cgtggcttct tctcctgcta tctcctttgg 4080 acagcagtcc actgcaactc ttactccatc cccacgggaa gagatgcaac ccatgctgca 4140 ggctcacctg gatgagttga caagagccta tcagtttgat atagcaaaac aaacatggca 4200 cattcaaagc aataatcaac ctccacagcc tccagttcca ccgttaggtt atgtgtctgg 4260 agccttgatt tctgatttgg aaacggatgt tgcagatgat gatgccgacg acgaagagga 4320 agctttagaa atccccaggc ccctgagagc actggaccag actcctggat ccagcatgga 4380 caatctagac agctctgtga caggaaaagc ctttacctcc tctcaaagac ctcgacctac 4440 cagcccattt tctactgaca gtaacaccag tgcagccctg agtcaaagtc agaggcctcg 4500 gcccactaaa aaacacaagg gagggcggat ggaccaacaa ccagcattgc ctcatcgaag 4560 ggaaggaatg acagatgagg aggccttggt gccctatagc aagcccagtt tcccatctcc 4620 aggtggccac agctcatcag gaacagcttc ttctaaggga tccactggac ctaggaaaac 4680 cgaggtgttg agagcaggcc accagcgcaa tgccagcgac cttcttgaca taggatatat 4740 gggctccaac agtcaaggac agtttacagg tgaattatag taaatgagag gagacataca 4800 aagctgctct gaaggaccat caggtccgga ctcatggaag tgatgactct aaacagtgca 4860 atgaacaatt tatttatgta ctattaaaag aactgtaaat gcaatgtaaa gacacacagc 4920 cacacatatc ccacagatat tttcattgtg ttcttctctt aagtacacca cccaccttaa 4980 ctctttcttg tcaggagtat ataaaaaaga aagaaaacaa aactcgccct acaggaagaa 5040 aaggattctc ctctgtatat aatttctttt gtgcattgct atgcaagctc actcttttta 5100 gctctgctca tattattgtc tgttcttatt ggtctgttgt actatatgtg aattaatagg 5160 ctgtggtgcc atatattaac ttttaattgt gtaactttta tgtttaaatt ttgcactgca 5220 attttatttg gtgataagca caaatctcta ctcctcatga catgaagaaa aagactgaat 5280 gtgaagggag tttctgtact gtaagctaga ttggataatg atggctgtaa caaatcatgt 5340 tagatggttt tcagttgggg tgtagaaata ggaagatgca aaggaacaat ggtgttggca 5400 aagtcttctt tgaatatcag ggactgagtc aataaaaaaa atagtagaaa ggtggctttt 5460 actattgaca aaagccgggg tcaaaaaaag tagtttaagt cttaagactg aatatgcatt 5520 aaagtatgca ggtagcaaag atgtaataaa tttgcttaaa aaaagaaatt aaagttttat 5580 ttagaatcaa ttttacctgt cattgtaatt gacccatctg agaattacaa taagcaagag 5640 gaaattaagg tgttttgcaa gagctgtatt tatattacag ttttttaaaa acattttctg 5700 aattatcgta attaagctct ccaactcgtt aagtcagaat ataatatgaa gttccccaag 5760 gaaacgaaca aaatgaactc tagaatatct agcaaatagt taaagaagca atttattatt 5820 agggcatact cgggctgttt ccaaatataa actctattgc aatatcttat ttcatctttc 5880 taatacatgt acagtgcaca ctagaggata gagctgcatc acttaaattc atgacttaaa 5940 aaataataca gtttatatac aacttgtttt ttatttgatt aagaagtgaa gtttacgcca 6000 cccaatgtat agccaaattg tacgtgctta aaaaacagtg ccgagagtat gttcagttcg 6060 cagtaagtag atttattgga ataaatattc tatggtacat tctcagaaat tggcttccaa 6120 ctaaaatacg tttgacccat tttgaataag gaaattgaaa agaaaaattt aaaaggagaa 6180 aaaaatgcat gtttataaac tttttaaata aaaccagacc ttgtaagtgg acattaataa 6240 ttgtcctgcc tcatttgttt tcacgacttt gacaacaaga agttcctgaa cattagtcat 6300 gtatgctcag aataaatgtg actttgaaat atatgttagc tactgtacat gtatagtcag 6360 tcaagtagaa gaggaccttc ctgaaattcc cacttgtgac attttcccat gggtttccta 6420 cacaatctta aattttattt ctgtctatac tttctcaaat ttttcctatg ataagttcag 6480 ttgttggtac tcttctaaaa atattcaacg tgattaggat cagttctaaa atacgggacc 6540 cctttgagtg acaattcgca ctccatgcat tattggctca gtagccaatt tttgtcacgt 6600 cgttataaca aggagatgac ataattaaac atttccatcc tttctattcc ctgagactgc 6660 atcagcacag gcaagtatag aatgtaatgt tcttcatggg ccccaccagc tttttggtgc 6720 catgtaattt atttcttcgc tgaagagaaa aagaattctg agacacagtt attaaaccct 6780 ttatcaactt tctaccatca gtgcctgaat tctaatgcag tgtgatttct ctgggacaaa 6840 gagactgagg aagatgaaaa gtttcttcaa agagtgaata catacttatt cacaactcta 6900 ggatgtgagg actttaaata tctctttatg aagttccctg cctaacctct ttctatttaa 6960 aggcaaacaa atttcgaaga ggttttgtgt tccctcttta tgtttctcta tgacccagtt 7020 tagtctaaaa ccttagttca ttacatatac aacacatagc ctttgatccc tggtaactgg 7080 caggtgttgg tgattaataa accaaggctt caaagtgaag tatgtgtgtg cagatgactt 7140 ttggaataac gtgggcatag catcatacct tcctgattgt cttcagcata taaaaattaa 7200 ctgttgtagt taaaattatg tcagtgcaga gcttgtggtt acttggaatg ttctttcaga 7260 atagtccatg ttgcctatta aacctagttt taaacacatt gggcagtcaa tttatgcacc 7320 caaaatatca ccctcaggta gattgagggc aagataaaat gctgtatgta gctatacaaa 7380 ggaattcaga aacattactg gaaagcaaag cctttgtcag cttgctactg acaaagtagt 7440 aaaaagctac taatcagtgt tgagtcagat gtcaacagaa aaatacaaat acctatgaga 7500 gccacagcag tttctcgttt catagccgat tcaatgaata tgattagaaa ttcactgagc 7560 tcactcttgc aggtttaaat ggaggcctgc ataaggactg caagaggaaa tctgggtggg 7620 agagaatgta atctgatctt gcactcatag gcaatgctgc aatgcaatca tgtccaatac 7680 aagcacagct tcattcataa caggaaacgt cttctttggg aaaatagctc tattggtgcc 7740 caaactcagg tatgccagtg tatgcaggtg gagtcgccct acccctcttc caaacatgtc 7800 ctgtgagatt tttaaaataa gatgggatag tacaggggca tgaaaagaat tgattccttc 7860 acaggatttg aatccagttc aagggagaat gtagaaaatt caaaaccaac atataaggta 7920 tcacacaacc aagaaaagta aaaccattgc aagtttactt gcgttgagta caaaacagat 7980 ttaatggtgt tctatgtcat agtttaatgc tctgggtatt taaatatgtt ttcaacagga 8040 tttgagttga aagtttgtaa tgtgctttga tggaacacct ctcaatttct attcaataaa 8100 cttatgtaat tgtccattga caatataatg ataacagtac cattgaactc taaactgtgg 8160 tttatcttca ctactgggaa gcaactgtgc atcagtatta aagatatgca gaaacataat 8220 attcactaat ttgttcatct gcttctgtat attgtttatg gaattacatg gcaagaactg 8280 ttctaaagca acatgtcttt ccacattatt ttagaggtga aattactttt gttttgcttc 8340 tctataatgt gtacttcaaa tgaaacacca tacttttttc taaaaaaaga tgttcaattt 8400 actaattttt ttaaatctca taatttaaaa agcatttgtt gtgattttaa agtgttgcaa 8460 gaaaagggat tttgtggccg tgggtagact ttttatactt tgttttatag atggattttt 8520 tttaactgta gtttgtttaa gtcaccaagc agcatccaaa atcttaatgt gtttcatttg 8580 atgttgttag atcagagaag aaattggcat aaaatcggtt aatagtattg tcaaagaatt 8640 gtgtattgtg tactcactgg gaaaaaataa aatatattca catttcaaa 8689 <210> 5 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Thr Glu Leu Glu His Tyr Ala Val Glu Gln Gln Glu Asn Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Ser Asp Ser Trp Cys Pro Pro Leu Pro Val Gln Thr Tyr Leu His Gln 20 25 30 Gly Leu Glu Asp Glu Leu Glu Glu Asp Asp Asp Arg Val Pro Thr Pro 35 40 45 Pro Val Arg Gly Val Ala Ser Ser Pro Ala Ile Ser Phe Gly Gln Gln 50 55 60 Ser Thr Ala Thr Leu Thr Pro Ser Pro Arg Glu Glu Met Gln Pro Met 65 70 75 80 Leu Gln Ala His Leu Asp Glu Leu Thr Arg Ala Tyr Gln Phe Asp Ile 85 90 95 Ala Lys Gln Thr Trp His Ile Gln Ser Asn Asn Gln Pro Pro Gln Pro 100 105 110 Pro Val Pro Pro Leu Gly Tyr Val Ser Gly Ala Leu Ile Ser Asp Leu 115 120 125 Glu Thr Asp Val Ala Asp Asp Asp Ala Asp Asp Glu Glu Glu Ala Leu 130 135 140 Glu Ile Pro Arg Pro Leu Arg Ala Leu Asp Gln Thr Pro Gly Ser Ser 145 150 155 160 Met Asp Asn Leu Asp Ser Ser Val Thr Gly Lys Ala Phe Thr Ser Ser 165 170 175 Gln Arg Pro Arg Pro Thr Ser Pro Phe Ser Thr Asp Ser Asn Thr Ser 180 185 190 Ala Ala Leu Ser Gln Ser Gln Arg Pro Arg Pro Thr Lys His Lys Gly 195 200 205 Gly Arg Met Asp Gln Gln Pro Ala 210 215 <210> 6 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Glu Leu Glu His Tyr Ala Val Glu Gln Gln Glu Asn Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Ser Asp Ser Trp Cys Pro Pro Leu Pro Val Gln Thr Tyr Leu His Gln 20 25 30 Gly Leu Glu Asp Glu Leu Glu Glu Asp Asp Asp Arg Val Pro Thr Pro 35 40 45 Pro Val Arg Gly Val Ala Ser Ser Pro Ala Ile Ser Phe Gly Gln Gln 50 55 60 Ser Thr Ala Thr Leu Thr Pro Ser Pro Arg Glu Glu Met Gln Pro Met 65 70 75 80 Leu Gln Ala His Leu Asp Glu Leu Thr Arg Ala Tyr Gln Phe Asp Ile 85 90 95 Ala Lys Gln Thr Trp His Ile Gln Ser Asn Asn Gln Pro Pro Gln Pro 100 105 110 Pro Val Pro Pro Leu Gly Tyr Val Ser Gly Ala Leu Ile Ser Asp Leu 115 120 125 Glu Thr Asp Val Ala Asp Asp Asp Ala Asp Asp Glu Glu Glu Ala Leu 130 135 140 Glu Ile Pro Arg Pro Leu Arg Ala Leu Asp Gln Thr Pro Gly Ser Ser 145 150 155 160 Met Asp Asn Leu Asp Ser Ser Val Thr Gly Lys Ala Phe Thr Ser Ser 165 170 175 Gln Arg Pro Arg Pro Thr Ser Pro Phe Ser Thr Asp Ser Asn Thr Ser 180 185 190 Ala Ala Leu Ser Gln Ser Gln Arg Pro Arg Pro Thr Lys Lys His Lys 195 200 205 Gly Gly Arg Met Asp Gln Gln Pro Ala 210 215

Claims (41)

  1. ROBO2(Roundabout 2)의 생물학적 활성을 억제하는 ROBO2 억제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하고,
    상기 ROBO2 억제제가
    (i) 상기 ROBO2의 면역글로불린 (Ig) 모티브 1 및 2를 포함하고, (ii) 상기 ROBO2의 면역글로불린 (Ig) 모티브 3, 4, 및 5를 포함하지 않고, (iii) 상기 ROBO2의 피브로넥틴 유형 III (FNIII) 반복단위를 포함하지 않는 가용성 ROBO2 단백질인, 네프린의 불활성화로 인한 만성 신장 질환 또는 단백뇨를 갖거나 또는 이의 위험이 있는 대상체의 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 ROBO2 억제제가 SLIT2, Nck, 또는 이 둘에 대한 ROBO2의 결합을 방지하거나 감소시키는 약학적 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 가용성 ROBO2 단백질이 10-8M 이하의 결합 친화도 KD(해리 상수) 값으로 SLIT에 결합하는 약학적 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 ROBO2 억제제는 상기 가용성 ROBO2 단백질의 부재에서 SLIT에 대한 ROBO2의 결합에 대하여, SLIT에 대한 ROBO2의 결합을 적어도 30%까지 감소시키는 우성 음성(dominant negative) 가용성 ROBO2 단백질인 약학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 ROBO2 억제제가 상기 우성 음성 가용성 ROBO2 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드인 약학적 조성물.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 가용성 ROBO2 단백질은 서열번호 3의 30-129 및 135-221 아미노산 잔기를 포함하는 약학적 조성물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 가용성 ROBO2 단백질은 상기 ROBO2의 세포내 도메인을 포함하지 않는 약학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 세포내 도메인은 서열번호 3의 881-1378 아미노산 잔기를 포함하는 약학적 조성물.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 Ig 모티브 1은 서열번호 3의 30-129 아미노산 잔기를 포함하는 약학적 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 Ig 모티브 2는 서열번호 3의 135-221 아미노산 잔기를 포함하는 약학적 조성물.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 Ig 모티브 1은 서열번호 3의 30-129 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 Ig 모티브 2는 서열번호 3의 135-221 아미노산 잔기를 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 만성 신장 질환 또는 단백뇨는 당뇨병성 신장증 또는　고혈압에 의해 야기되는 약학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
KR1020147021856A 2012-01-05 2013-01-04 신장 질환의 진단 및 치료를 위한 ｓｌｉｔ­ｒｏｂｏ 신호전달 KR102103323B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261583379P 2012-01-05 2012-01-05
US61/583,379 2012-01-05
PCT/US2013/020280 WO2013103811A2 (en) 2012-01-05 2013-01-04 Slit-robo signaling for diagnosis and treatment of kidney disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140123516A KR20140123516A (ko) 2014-10-22
KR102103323B1 true KR102103323B1 (ko) 2020-05-29

Family

ID=48745540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147021856A KR102103323B1 (ko) 2012-01-05 2013-01-04 신장 질환의 진단 및 치료를 위한 ｓｌｉｔ­ｒｏｂｏ 신호전달

Country Status (29)

Country Link
US (2) US9572879B2 (ko)
EP (1) EP2800578B1 (ko)
JP (2) JP6153946B2 (ko)
KR (1) KR102103323B1 (ko)
CN (2) CN106390118B (ko)
AU (2) AU2013207484B2 (ko)
BR (1) BR112014016493A2 (ko)
CA (1) CA2860558C (ko)
CO (1) CO7020918A2 (ko)
CY (1) CY1121529T1 (ko)
DK (1) DK2800578T3 (ko)
ES (1) ES2714700T3 (ko)
HK (1) HK1202085A1 (ko)
HR (1) HRP20190116T1 (ko)
HU (1) HUE041779T2 (ko)
IL (1) IL233462B (ko)
LT (1) LT2800578T (ko)
MX (1) MX351313B (ko)
MY (1) MY170143A (ko)
PE (1) PE20141473A1 (ko)
PH (2) PH12018502577A1 (ko)
PL (1) PL2800578T3 (ko)
PT (1) PT2800578T (ko)
RS (1) RS58517B1 (ko)
RU (1) RU2674153C2 (ko)
SG (2) SG10201605361RA (ko)
SI (1) SI2800578T1 (ko)
TR (1) TR201821294T4 (ko)
WO (1) WO2013103811A2 (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9700593B2 (en) * 2013-06-04 2017-07-11 The Hospital For Sick Children Methods and uses of slit for treating fibrosis
US11101021B2 (en) * 2014-08-08 2021-08-24 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Electronic phenotyping technique for diagnosing chronic kidney disease
KR102011957B1 (ko) 2016-06-08 2019-08-19 재단법인 아산사회복지재단 Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
WO2017213435A1 (ko) * 2016-06-08 2017-12-14 재단법인 아산사회복지재단 Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
EP3527655A4 (en) 2016-10-11 2020-05-06 Tokushima University METHOD FOR PRODUCING RENAL-LIKE BIOLOGICAL TISSUE
JP2020515832A (ja) * 2017-03-25 2020-05-28 シャリテ−ウニベルジテーツメディツィン ベルリン 腎疾患のバイオマーカーとしての尿のフローサイトメトリー
CN108929383B (zh) 2017-05-26 2021-10-15 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 重组Slit2D2(C386S)-HSA融合蛋白及其在预防和/或治疗肺部炎症中的应用
WO2018222850A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Pfizer Inc. Recombinant robo2 proteins, compositions, methods and uses thereof
AU2018279705A1 (en) * 2017-06-09 2019-11-14 Boston Medical Center Corporation Anti-ROBO2 antibodies, compositions, methods and uses thereof
US11406682B2 (en) 2017-08-24 2022-08-09 Bar-Ilan University Roundabout (Robo) receptor inhibitors and uses thereof
CN108753818B (zh) * 2018-04-24 2022-01-28 深圳市第二人民医院 RNA信号连接器、靶mRNA翻译调控方法、逻辑门及应用
WO2019237158A1 (en) * 2018-06-15 2019-12-19 Microba Life Sciences Limited Methods for sample preparation and microbiome characterisation
US20200339676A1 (en) * 2019-04-23 2020-10-29 The Regents Of The University Of California Compositions and methods useful in promoting milk production
BR112022024233A2 (pt) 2020-05-29 2022-12-27 Rokit Healthcare Inc Composição de tratamento renal usando omento, kit médico de tratamento renal que compreende a mesma e filme de tratamento renal que compreende produto curado da mesma
CN115068480B (zh) * 2022-08-09 2023-10-20 郑州大学第一附属医院 细胞分裂周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用
WO2024061158A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Everest Medicines (China) Co., Ltd. Slit2 related compositions and methods

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
GB2236186B (en) 1989-08-22 1994-01-05 Finnigan Mat Gmbh Process and device for laser desorption of analyte molecular ions, especially of biomolecules
US5045694A (en) 1989-09-27 1991-09-03 The Rockefeller University Instrument and method for the laser desorption of ions in mass spectrometry
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
AU676582B2 (en) 1993-05-28 1997-03-13 Baylor College Of Medicine Method and apparatus for desorption and ionization of analytes
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
ATE245190T1 (de) * 1997-10-20 2003-08-15 Univ California Robo: eine familie polypeptiden und nukleinesäuren wirksam in nervenzellleitung
US6365185B1 (en) 1998-03-26 2002-04-02 University Of Cincinnati Self-destructing, controlled release peroral drug delivery system
US20030077616A1 (en) 2001-04-19 2003-04-24 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomolecule characterization using mass spectrometry and affinity tags
US8068987B2 (en) 2001-08-13 2011-11-29 Bg Medicine, Inc. Method and system for profiling biological systems
EP2316853A3 (en) * 2002-03-08 2011-10-05 Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS Detection and modulation of slit and roundabout (robo) mediated angiogenesis and uses thereof
US20030199001A1 (en) 2002-04-23 2003-10-23 Pitt Aldo M. Sample preparation of biological fluids for proteomic applications
WO2007022248A2 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Methods of detection of cancer using peptide profiles
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
JP2014507395A (ja) 2010-12-23 2014-03-27 サノフイ 肝癌の治療における使用のためのＲｏｂｏ１−Ｆｃ融合タンパク質

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Circulation research, Vol, 107, pages 1336-1344 (2010)
Nature neuroscience, Vol. 11, pages 269-276 (2008)
The American Journal of Human Genetics, vol.80, pages.616-632 (2007)

Also Published As

Publication number Publication date
EP2800578A4 (en) 2015-07-15
WO2013103811A2 (en) 2013-07-11
CN106390118A (zh) 2017-02-15
JP2015510500A (ja) 2015-04-09
US20150037325A1 (en) 2015-02-05
MY170143A (en) 2019-07-08
PH12014501538B1 (en) 2014-10-08
US10358677B2 (en) 2019-07-23
US9572879B2 (en) 2017-02-21
HUE041779T2 (hu) 2019-05-28
EP2800578A2 (en) 2014-11-12
AU2013207484B2 (en) 2017-10-12
TR201821294T4 (tr) 2019-01-21
US20170114412A1 (en) 2017-04-27
MX2014008088A (es) 2014-09-25
IL233462B (en) 2020-05-31
CN104271197A (zh) 2015-01-07
PT2800578T (pt) 2019-03-18
PH12018502577B1 (en) 2020-03-02
CA2860558C (en) 2021-03-02
IL233462A0 (en) 2014-08-31
HK1202085A1 (en) 2015-09-18
AU2018200105A1 (en) 2018-01-25
BR112014016493A2 (pt) 2021-08-10
AU2013207484A1 (en) 2014-07-24
SG11201403746SA (en) 2014-07-30
ES2714700T3 (es) 2019-05-29
RS58517B1 (sr) 2019-04-30
SI2800578T1 (sl) 2019-03-29
BR112014016493A8 (pt) 2017-07-04
JP6153946B2 (ja) 2017-06-28
HRP20190116T1 (hr) 2019-03-08
CY1121529T1 (el) 2020-05-29
JP2017193559A (ja) 2017-10-26
RU2674153C2 (ru) 2018-12-05
WO2013103811A3 (en) 2014-08-28
CA2860558A1 (en) 2013-07-11
CN106390118B (zh) 2021-05-11
EP2800578B1 (en) 2018-12-05
PH12014501538A1 (en) 2014-10-08
LT2800578T (lt) 2019-02-11
PE20141473A1 (es) 2014-11-05
KR20140123516A (ko) 2014-10-22
PL2800578T3 (pl) 2019-05-31
CO7020918A2 (es) 2014-08-11
PH12018502577A1 (en) 2020-03-02
MX351313B (es) 2017-10-10
SG10201605361RA (en) 2016-08-30
DK2800578T3 (en) 2019-03-25
RU2014132108A (ru) 2016-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102103323B1 (ko) 신장 질환의 진단 및 치료를 위한 ｓｌｉｔ­ｒｏｂｏ 신호전달
Welsh et al. Insulin signaling to the glomerular podocyte is critical for normal kidney function
Shirata et al. Glomerulosclerosis induced by deficiency of membrane-associated guanylate kinase inverted 2 in kidney podocytes
US20100168016A1 (en) Diagnosis and treatment of diseases caused by misfolded proteins
Loftus et al. A novel interaction between Pyk2 and MAP4K4 is integrated with glioma cell migration
US8492106B2 (en) Identification methods for ergothioneine transporter modulators and therapeutic uses thereof
US20030176651A1 (en) Multiprotein-complex comprising a nmda receptor and uses thereof
US9541546B2 (en) Method of promoting excitatory synapse formation with an anti-Ephexin5 phospho-Y361 antibody
US20220307034A1 (en) Inhibiting ape2 expression in a subject treated with a drug agent that causes increased ape2 expression
US20230357430A1 (en) Rnf167 and castor1 as novel mtor targets
US20230181672A1 (en) Aberrant post-translational modifications (ptms) in methyl- and propionic acidemia and a mutant sirtuin (sirt) to metabolize ptms
JP2022500382A (ja) 膵炎を処置するための方法
Englert A pathophysiologic evaluation of the receptor for advanced glycation end products (RAGE) in the lung
WO2008089435A1 (en) Methods of identifying pain modulators

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant