ES2714700T3 - Señalización de SLIT-ROBO para el diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad de riñón - Google Patents

Señalización de SLIT-ROBO para el diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad de riñón Download PDF

Info

Publication number
ES2714700T3
ES2714700T3 ES13733786T ES13733786T ES2714700T3 ES 2714700 T3 ES2714700 T3 ES 2714700T3 ES 13733786 T ES13733786 T ES 13733786T ES 13733786 T ES13733786 T ES 13733786T ES 2714700 T3 ES2714700 T3 ES 2714700T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
robo2
protein
subject
nephrine
kidney disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13733786T
Other languages
English (en)
Inventor
Weining Lu
Xueping Fan
David Salant
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boston Medical Center Corp
Original Assignee
Boston Medical Center Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boston Medical Center Corp filed Critical Boston Medical Center Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2714700T3 publication Critical patent/ES2714700T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
    • G16H20/10—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance relating to drugs or medications, e.g. for ensuring correct administration to patients
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de ROBO2 que inhibe la actividad biológica de ROBO2, en la que el inhibidor de ROBO2 es una proteína ROBO2 soluble que comprende un polipéptido de fusión que comprende los dominios de unión a SLIT de Ig1 e Ig2 de ROBO2 sin dominio de ROBO2 intracelular.

Description

DESCRIPCION
Senalizacion de SLIT-ROBO para el diagnostico y el tratamiento de una enfermedad de rinon
Campo de la invencion
El campo de la invencion se refiere a metodos para el tratamiento de enfermedad renal cronica y proteinuria y para el diagnostico de la enfermedad renal cronica y al control de los efectos del tratamiento sobre la progresion de la enfermedad renal cronica y la proteinuria.
Lu, W. y otros (Am. J. Hum. Genet. Vol. 80, no.4, abril de 2007) informan que la interrupcion de ROBO2 esta asociada con anomalias del tracto urinario y confiere riesgo de reflujo vesicoureteral. Se observo a un paciente con una translocacion cromosomica que interrumpe el gen ROBO2 y da como resultado las proteinas de fusion Fu-129 (129aas) y Fu-153 (153aas) que comprenden el primer dominio de inmunoglobulina (Ig) extracelular de ROBO2. Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de ROBO2 que inhibe la actividad biologica de ROBO2, en la que el inhibidor de ROBO2 es una proteina ROBO2 soluble que comprende un polipeptido de fusion que comprende los dominios de union a SLIT de Ig1 e Ig2 de ROBO2 sin un dominio de ROBO2 intracelular.
La presente invencion tambien proporciona dicha composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o esta en riesgo de una enfermedad renal cronica o proteinuria.
En el presente documento se proporcionan metodos novedosos para el tratamiento de la enfermedad renal cronica y la proteinuria y para el diagnostico de la enfermedad renal cronica, y para controlar los efectos del tratamiento sobre la progresion de la enfermedad renal cronica y la proteinuria basados, en parte, en el descubrimiento de los inventores de un nuevo e inesperado papel para la ruta de senalizacion de SLIT-ROBO en la regulacion del citoesqueleto de podocitos de F-actina y la estructura del proceso del pie en el rinon.
Por consiguiente, en algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan metodos para el tratamiento de la enfermedad renal cronica en un sujeto que lo necesite, comprendiendo los metodos administrar a un sujeto que tiene o estan en riesgo de una enfermedad renal cronica una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende un inhibidor de ROBO2.
Tambien se proporcionan en este documento, en algunos aspectos, un metodo para la reduccion de la proteinuria en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a un sujeto que tiene o esta en riesgo de proteinuria una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende un inhibidor de ROBO2.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es un anticuerpo de bloqueo o un fragmento de union a antigeno del mismo especifico para ROBO2, una molecula antisentido especifica para ROBO2, un ARN de interferencia corto (ARNic) especifico para ROBO2, un inhibidor de molecula pequena de ROBO2, un polipeptido inhibidor de ROBO2, o un analogo estructural de ROBO2. En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 bloquea o reduce la union de ROBO2 a SLIT, a Nck, o a ambos.
En algunas formas de realización de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es especifico para el dominio de union a SLIT de Ig 1, los dominios de union de SLIT de Ig1 e Ig2, el dominio de union intracelular de Nck, o cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el polipeptido inhibidor de ROBO2 es una proteina de fusion ROBO2 dominante negativa, un polipeptido que comprende un dominio extracelular de ROBO2 sin el dominio intracelular, o un polipeptido que comprende un dominio intracelular de ROBO2 sin el dominio extracelular.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el sujeto que tiene o esta en riesgo de padecer una enfermedad renal cronica tiene nefropatia diabetica o presion arterial alta. En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el metodo comprende ademas administrar al sujeto un agente terapeutico adicional.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el agente terapeutico adicional es un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) o un bloqueador del receptor de la angiotensina II (ARB).
Tambien se proporcionan en el presente documento, en algunos aspectos, metodos que comprenden:
a. ensayar una muestra de prueba biologica de un sujeto para determinar un nivel de expresion de polipeptido ROBO2 o un a Rn que codifica un polipeptido ROBO2;
b. determinar si el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 en la muestra biologica de prueba esta por encima de un nivel de umbral de referencia; y
c. diagnosticar al sujeto como necesitado de tratamiento o terapia para la enfermedad renal cronica.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el ensayo del nivel de expresion del polipeptido ROBO2 se realiza utilizando un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo especifico para el polipeptido ROBO2.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el ensayo del nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 se realiza mediante PCR o un ensayo de hibridacion. En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, la muestra biologica de prueba es una biopsia de rinon, orina, sangre, muestra de suero o celulas sedimentadas de una muestra de orina.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 esta al menos un 20% por encima del nivel de umbral de referencia.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 es al menos dos desviaciones estandar por encima del nivel de umbral de referencia.
Tambien se proporcionan en el presente documento, en algunos aspectos, ensayos que comprenden:
a. poner en contacto una muestra de prueba biologica aislada de un sujeto con un reactivo que detecta el polipeptido r Ob O2 o un ARN que codifica un polipeptido ROBO2; y
b. medir el nivel de polipeptido ROBO2 o un ARN que codifica un polipeptido ROBO2,
en los que un nivel aumentado de dicho polipeptido ROBO2 o dicho ARN que codifica un polipeptido ROBO2, en relacion con una muestra biologica normal, identifica a un sujeto que tiene enfermedad renal cronica y/o progresion de enfermedad renal cronica o proteinuria.
En algunas realizaciones de estos ensayos y todos los ensayos descritos en el presente documento, la deteccion del nivel de expresion del polipeptido ROBO2 se realiza utilizando un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo especifico para el polipeptido ROBO2.
En algunas realizaciones de estos ensayos y todos los ensayos descritos en el presente documento, la deteccion del nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 se realiza mediante PCR o un ensayo de hibridacion. En algunas realizaciones de estos ensayos y todos los ensayos descritos en el presente documento, la muestra biologica de prueba es una biopsia de rinon, orina, sangre, muestra de suero o celulas sedimentadas de una muestra de orina.
En algunas realizaciones de estos ensayos y todos los ensayos descritos en el presente documento, el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARn que codifica un polipeptido ROBO2 esta al menos un 20% por encima del nivel de umbral de referencia.
En algunas realizaciones de estos ensayos y todos los ensayos descritos en el presente documento, el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 es al menos dos desviaciones estandar por encima del nivel de umbral de referencia.
En algunas realizaciones de estos ensayos y todos los ensayos descritos en el presente documento, el sujeto ha sido diagnosticado con diabetes o presion arterial alta.
En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan sistemas para determinar si un sujeto esta en riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, o tiene enfermedad renal cronica que comprende:
a. un modulo de medicion configurado para determinar el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 en una muestra biologica obtenida de un sujeto;
b. un modulo de comparacion configurado para recibir dicho nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 determinado por el modulo de medicion y realizar al menos un analisis para determinar si el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 es mayor que un nivel o proporcion de referenda predeterminado, y para proporcionar un contenido recuperado; y
c. un modulo de visualizacion para mostrar un contenido basado en la salida de datos de dicho modulo de comparacion, en el que el contenido comprende una senal indicativa de que el nivel de expresion o proporcion de polipeptido o ARN de ROBO2 es mayor que el nivel o relacion de referencia predeterminado, o una senal indicativa que el nivel o la relacion de expresion de ROBO2 no sea mayor que el nivel de referencia o relacion predeterminada.
En algunas realizaciones de estos sistemas y todos los sistemas descritos en el presente documento, el contenido mostrado en el modulo de visualizacion comprende ademas una senal indicativa de que se recomienda al sujeto que reciba un regimen de tratamiento particular.
En algunos aspectos, se proporcionan en este documento sistemas para determinar si un sujeto esta en riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, o tiene enfermedad renal cronica que comprende:
a. un modulo de determinacion configurado para recibir al menos una muestra de prueba obtenida de un sujeto y realizar al menos un analisis en dicha al menos una muestra de prueba para determinar la presencia o ausencia de cualquiera de las siguientes condiciones:
i. una relacion de expresion de ROBO2 mayor que una relacion predeterminada, o
ii. un nivel de expresion de ROBO2 mayor que un nivel predeterminado
b. un dispositivo de almacenamiento configurado para almacenar la salida de datos de dicho modulo de determinacion; y
c. un modulo de visualizacion para mostrar un contenido basado en la salida de datos de dicho modulo de determinacion, en el que el contenido comprende una senal indicativa de que la relacion de expresion de ROBO2 es mayor que la relacion predeterminada o el nivel de ROBO2 mayor que un nivel predeterminado, o una senal indicativa de que la relacion de expresion de ROBO2 no es mayor que la relacion predeterminada o no mayor que un nivel predeterminado.
En algunas realizaciones de estos sistemas y todos los sistemas descritos en el presente documento, el contenido mostrado en el modulo de visualizacion comprende ademas una senal indicativa de que se recomienda al sujeto que reciba un regimen de tratamiento particular.
Tambien se proporcionan en este documento, en algunos aspectos, metodos para tratar a un sujeto humano con riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, que comprenden administrar un tratamiento o terapia para prevenir la aparicion de enfermedad renal cronica o proteinuria a un sujeto humano que esta determinado a tener un nivel de proteina ROBO2 por encima de un nivel de umbral de referencia.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el nivel de proteina ROBO2 esta al menos un 20% por encima del nivel de referencia.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el nivel de proteina ROBO2 es al menos dos desviaciones estandar por encima del nivel de referencia.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el tratamiento o terapia para prevenir la aparicion de enfermedad renal cronica o proteinuria comprende un inhibidor de ROBO2.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es un anticuerpo bloqueante o un fragmento de union a antigeno del mismo especifico para ROBO2, una molecula antisentido especifica para ROBO2, un ARN interferente corto (ARNic) especifico para ROBO2, un inhibidor de molecula pequeno de ROBO2, un polipeptido inhibidor de ROBO2, o un analogo estructural de ROBO2.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 bloquea o reduce la union de ROBO2 a SLIT, a Nck, o a ambos.
En algunas formas de realización de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es especifico para el dominio de union a SLIT de Ig 1, los dominios de union a SLIT de Ig1 e Ig2, el dominio de union intracelular a Nck, o cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el polipeptido inhibidor de ROBO2 es una proteina de fusion ROBO2 negativa dominante, un polipeptido que comprende un dominio extracelular de ROBO2 sin el dominio intracelular, o un polipeptido que comprende un dominio intracelular de ROBO2 sin el dominio extracelular.
Tambien se proporcionan en este documento, en algunos aspectos, inhibidores de ROBO2 para uso en el tratamiento de una enfermedad renal cronica, e inhibidor de ROBO2 para uso en el tratamiento de proteinuria.
En algunas realizaciones de estos usos y todos los usos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es un anticuerpo bloqueante o un fragmento de union a antigeno del mismo especifico para ROBO2, una molecula antisentido especifica para ROBO2, un ARN interferente corto (ARNic) especifico para ROBO2, un inhibidor de molecula pequena de ROBO2, un polipeptido inhibidor de ROBO2, o un analogo estructural de ROBO2.
En algunas realizaciones de estos usos y todos los usos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 bloquea o reduce la union de ROBO2 a SLIT, a Nck, o a ambos.
En algunas realizaciones de estos usos y todos los usos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es especifico para el dominio de union a SLI de Ig1, los dominios de union a SLIT de Ig 1 e Ig2, el dominio de union intracelular a Nck, o cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones de estos usos y todos los usos descritos en el presente documento, el polipeptido inhibidor de ROBO2 es una proteina de fusion ROBO2 negativa dominante, un polipeptido que comprende un dominio extracelular de ROBO2 sin el dominio intracelular, o un polipeptido que comprende un dominio intracelular de ROBO2 sin el dominio extracelular.
En algunas realizaciones de estos usos y todos los usos descritos en el presente documento, la enfermedad renal cronica o proteinuria es causada por nefropatia diabetica o presion arterial alta.
En algunas realizaciones de cualquiera de estos aspectos y todos los aspectos descritos en el presente documento, ROBO2 se refiere a ROBO2 humano que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 codificada por la secuencia del ARNm de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones de cualquiera de estos aspectos y todos los aspectos descritos en el presente documento, ROBO2 se refiere a ROBO2 humano que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3 codificada por la secuencia de ARNm de la SEQ ID NO: 4.
Definiciones
En aras de la conveniencia, ciertos terminos empleados en el presente documento, en la memoria descriptiva, ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se reunen en el presente documento. A menos que se indique lo contrario, o este implicito a partir del contexto, los siguientes terminos y frases incluyen los significados que se proporcionan a continuacion. A menos que se indique explicitamente lo contrario, o que se desprenda del contexto, los terminos y frases a continuacion no excluyen el significado que el termino o la frase ha adquirido en la tecnica a la que pertenece. Las definiciones se proporcionan para ayudar a describir realizaciones particulares, y no pretenden limitar la invencion reivindicada, porque el alcance de la invencion esta limitado solo por las reivindicaciones. A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion.
Como se usa en el presente documento, el termino "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a las composiciones, metodos y sus respectivos componentes, que son esenciales para la invencion, pero abiertos a la inclusion de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.
Como se usa en el presente documento, el termino "que consiste esencialmente en" se refiere a los elementos requeridos para una realización dada. El termino permite la presencia de elementos adicionales que no afectan materialmente las caracteristicas basicas y novedosas o funcionales de esa realización de la invencion.
El termino "que consiste en" se refiere a composiciones, metodos y componentes respectivos de los mismos como se describe en el presente documento, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realizacion.
Segun se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asi, por ejemplo, las referencias a "el metodo" incluyen uno o mas metodos, y/o etapas del tipo descrito aqui y/o que seran evidentes para los expertos en la materia al leer esta descripción y asi sucesivamente.
Aparte de en los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reaccion utilizadas en este documento deben entenderse como modificados en todos los casos por el termino "aproximadamente". El termino "aproximadamente" cuando se usa en relacion con porcentajes puede significar ± 10%, ± 5% o ± 1%.
A menos que se defina lo contrario en este documento, los terminos cientificos y tecnicos utilizados en relacion con la presente solicitud deberan tener los significados que comunmente entienden los expertos en la tecnica a los que pertenece esta descripción. Debe entenderse que esta invencion no esta limitada a la metodologia, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en este documento y como tales pueden variar. La terminologia utilizada en este documento tiene el proposito de describir solo realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invencion, que se define unicamente por las reivindicaciones. Las definiciones de terminos comunes en inmunologia y biologia molecular se pueden encontrar en The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Decimoctava Edicion, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2 ); Robert S. Porter y colaboradores, (editores), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9 ); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicada por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8 ); Immunology by Werner Luttmann, publicada por Elsevier, 2006. Las definiciones de terminos comunes en biologia molecular se encuentran en Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634 ); Kendrew y colaboradores, (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9 ); y Robert A. Meyers (ed.), Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EE.UU (1982 ); Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EE.UU (1989); Davis y colaboradores, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986 ); o Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger y A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, y colaboradores ed., John Wiley and Sons, Inc. ), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) y Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.).
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-1R demuestran que Robo2 se expresa y localiza en la superficie celular basal de los podocitos. Todas las inmunotinciones en (Figuras 1A-1Q) se llevan a cabo en ratones los dias E16.5 con un aumento de 600X (vease las Figuras 5A-5M para inmunotinciones en glomerulos de ratones adultos). (Figuras 1A-1C) Robo2 se localiza conjuntamente con la proteina nefrina del diafragma de hendidura del podocito. (Figuras 1D-1F) Robo2 se localiza conjuntamente con la proteina podocina del diafragma de hendidura del podocito. (Figuras 1G-11) Robo2 se localiza conjuntamente con la proteina adaptadora Nck en los glomerulos. (Figuras 1J-1L) Robo2 se expresa en la superficie de los podocitos basales adyacentes a la proteina nidogeno de la membrana basal glomerular. (Figuras 1M-1O) Robo2 no se localiza conjuntamente con el marcador de proteina de celulas endoteliales glomerulares Pecam1. (Figura IP) La region ampliada encuadrada en (Figura. 1L) muestra que Robo2 se expresa predominantemente en la superficie de las celulas basales (flecha) de los podocitos (p) adyacentes al marcador de membrana basal glomerular nidogeno. Robo2 se expresa debilmente en las superficies de las celulas apicales y laterales (puntas de flecha) de los podocitos. (Figura 1Q) Robo2 se expresa predominantemente en la superficie de las celulas basales (flechas) de los podocitos (p) y se expresa debilmente en las superficies de las celulas apicales o laterales (puntas de flecha). (Figuras 1R) La microscopia electronica de Immuno-oro muestra la localizacion de particulas de oro (flechas) conjugadas con el anticuerpo Robo2 en el proceso del pie (fp) de un podocito de un raton de 3 semanas de edad. GBM, membrana basal glomerular. Ampliacion: 50.000X. Vease tambien las Figuras 5A-5M.
Las Figuras 2A-2J demuestran que Robo2 interactua con la proteina adaptadora Nck y forma un complejo con nefrina. (Figura 2A) Los ensayos de doble hibrido en levadura muestran una interaccion positiva entre el dominio intracelular de Robo2 (Robo2-ICD) y Nckl. El informador LacZ (X-gal): ++, la levadura se torno oscura; +, clara; -, blanco en 24 horas. El informador de leucina (-Leu): , la levadura crecio; -, la levadura no crecio. CC, region conservada citoplasmatica. Los numeros indican las posiciones de los residuos en la proteina de longitud completa. (Figura 2B) Los ensayos de doble hibrido en levadura muestran que los dos primeros dominios SH3 de Nckl son necesarios para su interaccion con Robo2-ICD. (Figura 2C) Los ensayos de doble hibrido en levadura muestran dominios de union potenciales que median la interaccion de Robo2 y Nckl. La secuencia es la region de union potencial en Robo2 para Nckl. Se destacan las regiones ricas en prolina. (Figura 2D) Precipitacion conjunta de Robo2 y Nck. Los lisados celulares en el carril 5 se recogen de celulas transfectadas con His-myc-Robo2 (usadas en los carriles 1 y 2); los lisados celulares en el carril 6 se recogen de celulas transfectadas con His-myc-Robo2-ANBD (usadas en los carriles 3 y 4). (Figura 2E) Precipitacion conjunta de Robo2, Nck y nefrina. (Figura 2F) una precipitacion conjunta similar a la de la (Figura 2E), excepto que His-myc-nefrina se extrae en lugar de His-myc-Robo2. (Figura 2G) Inmunoprecipitacion conjunta Robo2, Nck y nefrina endogeno de rinon. (Figura 2H) Un ensayo similar al de la Figura 2G, excepto que los precipitados se preparan utilizando un anticuerpo anti-nefrina de raton. (I) Slit2 mejora la formacion del complejo Robo2-Nck-nefrina. His-myc-Robo2, nefrina y Fyn se expresan en celulas HEK que se estimulan con medio acondicionado con Slit2 (carriles 1, 3) o medio acondicionado de control (carril 2, 4). (Figura 2J) Cuantificacion de la intensidad de (Figura 2I). Los datos se representan como la media ± SEM; n = 7, *p 0,05, **p 0,01 comparado con el control, prueba t de Student pareada. Vease tambien las Figuras 6A-6F'.
Las Figuras 3A-3G demuestran que la senalizacion de Slit2-Robo2 inhibe la polimerizacion de actina mediada por nefrina. (Figura 3A) CD16/7-NCD se expresa conjunta con Robo2 en celulas HEK, que se tratan con anticuerpo anti-CD16 y anticuerpo anti-IgG conjugado con rodamina en presencia de medio acondicionado con Slit2 (Slit) o medio acondicionado de control (CTL). Las celulas luego se fijan y se tinen con faloidina conjugada con FITC para revelar F-actina. Barra de escala, 5 pm. NCD: dominio citoplasmatico de nefrina. (Figura 3B) Un ensayo similar al de la (Figura 3A), excepto que CD16/7-NCD se reemplaza por CD16/7-HA y se usa como un ensayo de control. (Figura 3C) Se cuantifica el porcentaje de celulas con colas de F-actina sobre celulas totales con agrupaciones de CD16/7 en cada grupo. Los datos se representan como la media ± SEM, *p 0,01, n = 5. (Figura 3D) CD16/7-NCD en (Figura 3A) se inmunoprecipita por el anticuerpo anti-CD16 despues de la estimulacion del medio acondicionado con Slit2 (carriles 1 y 3) o del medio acondicionado de control (carriles 2 y 4). Notese la F-actina reducida en el carril 1. CD16/7-HA se usa como control negativo. (Figura 3E) Cuantificacion de la intensidad de (Figura 3D). Los datos se representan como la media ± SEM; n = 4, *p 0,05 en comparacion con el control, prueba t de Student pareada. (Figura 3F) Inmunoprecipitacion de nefrina de rinones de raton con desactivacion de Robo2 homocigotos (Robo2-/-), heterocigotos (Robo2 /-), y de tipo silvestre (Robo2+/+) utilizando el anticuerpo anti-nefrina. Observese el aumento de F-actina en el carril 3. (Figura 3G) Cuantificacion de la intensidad de (Figura 3F). Los datos se representan como la media ± SEM; n = 4, *p 0,05 en comparacion con el tipo silvestre y heterocigoto, analisis ANOVA. Vease tambien las Figuras 7A-7C.
Las Figuras 4A-4W demuestran los fenotipos estructurales de podocitos en ratones nulos homocigotos para Robo2, desactivados especificos para podocitos de Robo2 y desactivacion doble de Robo2 y N phsl. (Figuras 4A y 4B) Las imágenes representativas de rinones de recien nacidos muestran cuerpos de podocitos (puntas de flecha) y la capsula de Bowman (flechas) en ratones de tipo silvestre (Figura 4A) y nulos homocigotos para Robo2 (Figura 4B). (Figuras 4C y 4D) Las imágenes de gran aumento de (Figuras 4A y 4B) muestran procesos base de podocitos (flechas) en el rinon del recien nacido. Barra de escala, 1 pm. (Figuras 4E y 4F) Las imágenes representativas de rinones de 3 semanas con bajo aumento muestran el cuerpo celular de podocitos (puntas de flecha) en un raton nulo homocigotico para Robo2 (Figura 4F) en comparacion con un control de igual edad (Figura 4E). (Figuras 4G y 4H) Las imágenes de mayor aumento de (Figuras 4E y 4F) muestran procesos base serpenteantes mas cortos y desorganizados (flecha) en un raton nulo homocigoto para Robo2 de 3 semanas (Figura 4H) en comparacion con procesos base con forma de cremallera bien organizados en el control de la misma edad (Figura 4G). Barras de escala: 2 pm. (Figuras 4I y 4J) Las imágenes representativas de microscopia electronica de transmision (ampliacion a 5.000x) representan el desplazamiento del proceso del pie del podocito segmentario focal (flecha en la Figura 4J) en un raton de un mes de edad con desactivacion especifica de podocito de Robo2 y el fenotipo normal en el control (Figura 4I). Abreviaturas: gc: capilar glomerular; us: espacio urinario. (Figuras 4K y 4L) Las imágenes de microscopia electronica de transmision de mayor aumento (40.000x) muestran procesos base de podocitos mas amplios (flecha en la Figura 4L) en un raton mutante de dos meses de edad especifico de podocitos de Robo2 en comparacion con el control (Figura 4K). Abreviaturas: fp, proceso del pie de podocitos; GBM, membrana basal glomerular. (Figura 4M) Cuantificacion del ancho del proceso del pie de podocito en ratones de un mes de edad con desactivacion especifica de podocitos de Robo2del5/flox;TgNphs2-cre+ (KO de Robo2) y los controles de la camada de tipo silvestre (WT). Los datos se representan como la media ± SEM, n = 333, * p 0,01. (Figura 4N) Ensayo ELISA de orina puntual muestra una elevada proporcion de albumina/creatinina en ratones adultos Robo2del5/flox;Nphs2-Cre+ (KO) en comparacion con el control de tipo silvestre (WT). Los datos se representan como la media ± SEM, n = 20, *p 0,01. (Figura 4O) El analisis de transferencia Western muestra la presencia de albumina en la orina; se cargo 1 pL de orina en cada pozo, se usaron 0,2 pg de albumina como control positivo. WT, tres companeros de camada de tipo silvestre; Robo2 KO, tres ratones individuales Robo2del5/flox;Nphs2-Cre+. (Figuras 4P y 4Q) Las imágenes representativas del microscopio electronico de barrido muestran procesos base de podocitos interdigitales interrumpidos que se asemejan a protuberancias celulares desorganizadas (flechas) en el rinon de raton recien nacido homocigoto sencillo para Nphs1-/-. Barras de escala: 1 pm. (Figuras 4R y 4S) Los glomerulos de ratones recien nacidos homocigotos dobles para Nphs1-/- Robo2-/- exhiben procesos base interdigitales restaurados (flechas), lo que indica un alivio del fenotipo nulo de nefrina por desactivacion de Robo2. (Figuras 4T y 4U), los glomerulos de ratones recien nacidos homocigotos sencillos para Robo2-/- presentan procesos base irregulares y mas amplios, pero una extensa formacion de patrones interdigitales (flechas). (Figuras 4V y 4W), glomerulos de ratones de tipo silvestre recien nacidos con un patron de interdigitacion regular normal del proceso del pie (flechas). Vease tambien las Figuras. 8A-8Z y Tablas 1-4.
Las Figuras 5A-5M demuestran que Robo2 se expresa en glomerulos en desarrollo y en adultos. (Figuras 5A y 5B) El analisis de hibridacion in situ muestra que los transcriptos de Robo2 se expresan en glomerulos en desarrollo (flechas) en E16.5. Ampliacion: 60X (Figura 5A) y 200X (Figura 5B). (Figuras 5C-5F) Los estudios de inmunohistoquimica (IHC) revelan que Robo2 se expresa durante el desarrollo de glomerulos desde E14.5 hasta E17.5. Ampliacion: 600X. (Figura 5G) IHC muestra que Robo2 se expresa especificamente en glomerulos de ratones adultos a las 5 semanas de edad (Figura 5G). DAPI marca los nucleos celulares en el rinon. Ampliacion: 400X. (Figura 5H) Las tinciones de localizacion conjunta de IHC de rinon de 5 semanas muestran que Robo2 se expresa conjuntamente en el glomerulo con el marcador de podocitos Wt1. Ampliacion: 600X. (Figuras 5I-5K) Robo2 y WT1 se expresan conjuntamente en el glomerulo del raton en E16.5. Ampliacion: 600X. (Figuras 5L y 5M) Las tinciones de localizacion conjunta de IHC de rinon de 5 semanas muestran que Robo2 se expresa conjuntamente en el glomerulo con el marcador de celulas mesangiales Pdgfrb (Figura 5L) y el marcador de celulas endoteliales Pecam1 (Figura 5M). Ampliacion: 600X.
Las Figuras 6A-6F' demuestran que Robo2 interactua con Nck y forma un complejo con nefrina, que se ve reforzado por la estimulacion con Slit2. (Figura 6A) Co-IP de Robo2 y nefrina con Nck endogeno. Robo2, nefrina y Fyn se expresan en celulas HEK y se estimulan con Slit2. El Nck endogeno esta inmunoprecipitado por un anticuerpo anti-Nck. El raton IgG se utiliza como control. La formacion de complejos con nefrina se ve reforzada por la expresion Slit2 y d Fyn. (Figuras 6B y 6C) Slit2 se expresa en los glomerulos de ratones recien nacidos mediante tincion con inmunoperoxidasa (Figura 6B) y se expresa conjuntamente en el glomerulo con el marcador de podocitos Sinaptopodina (Figura 6C). Ampliacion: 600X. (Figuras 6D y 6D') CD16/7-NCD se expresa conjuntamente con Robo2 en celulas HEK en presencia de Slit2, se trata con anticuerpo anti-CD16 y anticuerpo anti-IgG conjugado con rodamina, luego se fija y se tine con anticuerpos anti-Robo2. Las agrupaciones de CD16/7-NCD se localizan conjuntamente con Robo2 (Figura 6D) pero no se observa localizacion conjunta en las agrupaciones CD16/7-HA de control (Figura 6D'). Barra de escala: 5 pm. NCD: dominio citoplasmatico de nefrina. (Figuras 6E y 6E') La eliminacion del dominio de union a Nck (NBD) de Robo2 afecta su localizacion conjunta con CD16/7-NCD en presencia de Slit2. Las agrupaciones de CD16/7-NCD se localizan conjuntamente con Robo2 (Figura 6E), pero no se observa localizacion conjunta en agrupaciones de Robo2- DNBD (Figura 6E'). Barra de escala: 5 pm. (Figuras 6F y 6F') La estimulacion con Slit2 mejora la localizacion conjunta de CD16/7-NCD y Robo2 en celulas HEK. Las agrupaciones CD16/7-NCD se localizan conjuntamente con Robo2 en presencia de Slit2 (Figura 6F) pero no con medio acondicionado de control (Figura 6F'). Barra de escala: 5 pm.
Las Figuras 7A-7C demuestran que la eliminacion del dominio de union a Nck de Robo2 compromete la inhibicion de Slit2-Robo2 en la polimerizacion de actina inducida por nefrina. (Figura 7A) CD16/7-NCD y Robo2 se expresan conjuntamente en celulas HEK, agrupadas con anticuerpo anti-CD16 y anticuerpo anti-IgG conjugado con rodamina en presencia de medio acondicionado con Slit2 (Slit2) o medio condicionado de control (CTL) ). Las celulas se fijaron y se tineron con faloidina conjugada con FITC para revelar las fibras de F-actina. Se examinaron agrupaciones de CD16/7-NCD y fibras de F-actina usando microscopia confocal. Barra de escala, 5pm. NCD, dominio citoplasmatico de nefrina. (Figura 7B) CD16/7-NCD y Robo2-ANBD se expresaron conjuntamente en celulas HEK. Barra de escala, 5pm. NBD, dominio de union a Nck. (Figura 7C) Se cuantifico el porcentaje de celulas con colas de F-actina sobre celulas totales con agrupaciones de CD16/7-NCD en cada grupo. Los datos se representan como la media ± SEM, *p = 1,436x 10-5, ** p = 6,32x 10-5, n = 5, ANOVA.
Las Figuras 8A-8Z demuestran fenotipo glomerular en ratones nulos homocigotos de Robo2, con desactivacion especifica de podocitos de Robo2, desactivados dobles de Robo2 y Nphsl, y un modelo propuesto de senalizacion de Robo2-Nefrina. (Figuras 8A-8F) Analisis por microscopia electronica de transmision de la ultraestructura glomerular en rinones de ratones mutantes Robo2del5/del5 recien nacidos (NB). (Figuras 8A, 8C, 8E) Ultraestructura glomerular de un raton control heterocigotico Robo2 recien nacido con aumentos bajos (Figura 8A, 2.200X), medios (Figura 8C, 15.500X) y altos (Figura 8E, 52.000X). (Figuras 8B, 8D, 8F) Ultraestructura glomerular de un raton mutante recien nacido homocigoto Robo2 (-/-) (es decir, Robo2del5/del5) con amplificaciones baja (Figura 8B), media (Figura 8D) y alta (Figura 8F). Las flechas indican el desplazamiento focal del proceso del pie. Abreviaturas: gc: capilar glomerular; us: espacio urinario; GBM: membrana basal glomerular. (Figuras 8G-8N) Patrones anormales del proceso del pie de podocitos en ratones con desactivacion especifica de podocitos de Robo2. (Figuras 8G-8J) Imagenes representativas de microscopia electronica de barrido de glomerulos de ratones de un mes de edad con desactivacion especifica de podocitos de Robo2del5/flox;Nphs2-Cre+ y ratones de control Robo2del5/floxl+ de la misma edad. Se encontraron irregularidades leves de los procesos base de podocitos de interdigitacion en un raton de un mes de edad con desactivacion especifica de podocito de Robo2 (Figuras 8K y 8N). A los siete meses de edad, los ratones con desactivacion especifica para podocitos de Robo2 desarrollaron procesos base marcadamente irregulares (Figuras 8L y 8N). Barras de escala: 10 pm (Figuras 8G, 8H, 8K, 8L con una amplificacion de 2.000x) y 2 pm (Figuras 8I, 8J, 8M, 8N con una amplificacion de 13.000x). (Figuras 8O-8T) Morfologia glomerular en ratones con desactivacion especifica de podocito de Robo2. (Figuras 8O-8R) La tincion periodica con acido de Schiff (PAS) mostro una expansion de la matriz mesangial en los glomerulos de ratones de 2 meses y 6 meses con desactivacion especifica de podocitos de Robo2 (Figuras 8P, 8R) en comparacion con los controles de la misma edad (Figuras 8O, 8Q). (Figura 8S) El analisis cuantitativo de los glomerulos muestra la expansion de la matriz mesangial en ratones de 12 meses de edad con desactivacion especifica de podocitos de Robo2 en comparacion con controles de tipo silvestre (WT) de la misma edad. Los datos se representan como la media ± SEM, n = 5, *p < 0,01. (T) La desactivacion especifica de podocitos de Robo2 no afecta el numero de podocitos. Se identificaron celulas de podocitos usando tincion con WT-1. El numero de podocitos por seccion transversal glomerular se conto en 4 ratones de 1 ano de edad con desactivacion especifica de podocitos de Robo2del5/flox;TgNphs2-Cre+ (MU) en comparacion con cuatro ratones de tipo silvestre (WT) de la misma edad. Los datos se representan como la media ± SEM, p = 0,645, prueba t; mutante: n = 165 glomerulos; control: n = 166 glomerulos. (Figuras 8U-8Y) Fenotipo glomerular en ratones con desactivacion doble de Robo2y Nphsl. (Figura 8U) La tincion con H&E muestra glomerulos con dilataciones caracteristicas del espacio de Bowman (asteriscos) en un raton recien nacido homocigoto unico Nphs1-/-, 400x. (Figura 8V) Los glomerulos de un raton recien nacido homocigoto unico Robo2-/- muestran ausencia de dilataciones espaciales de Bowman; 400x. (Figura 8W) Los glomerulos de aspecto normal sin dilataciones espaciales de Bowman significativas (flechas) se muestran en un raton recien nacido homocigotico doble Robo2-/-;Nphs1-/- que indica alivio del fenotipo glomerular Nphs1-/-; 400x. (Figura 8X) Tincion con H&E de rinon normal y glomerulos de un control de raton recien nacido de tipo silvestre de edades similares; 400x. (Figura 8Y) La cuantificacion de glomerulos con espacio de Bowman dilatado en ratones recien nacidos muestra una reduccion significativa de los glomerulos con el fenotipo de dilatacion caracteristica del espacio de Bowman en homocigotos dobles para Robo2-/-;Nphs1-/- comparado con homocigotos sencillos para Nphs1-/-(Robo2-/-;Nphs1-/-). Los datos se representan como la media ± SEM, *p< 0,01. (Figura 8Z) Un modelo de efectos inhibidores de senalizacion de Slit2-Robo2 en nefrina para influir en la estructura del proceso del pie de podocitos: Bajo condiciones fisiologicas (por ejemplo, durante el desarrollo del proceso del pie), los dominios de tirosina intracelular fosforilada de nefrina (YDxV-p) reclutan a Nck a traves de su interaccion con el dominio SH2. Nck a su vez recluta reguladores del citoesqueleto a traves de sus dominios SH3 para promover la polimerizacion de la actina. Slit2 se une a Robo2 para aumentar la interaccion del dominio intracelular de Robo2 con los dominios SH3 de Nck, lo que evitaria la union de Nck a los reguladores del citoesqueleto y daria como resultado una inhibicion de la polimerizacion de actina inducida por nefrina. La polimerizacion de actina equilibrada se mantiene durante el desarrollo del podocito para una estructura normal del proceso del pie. En ausencia de senalizacion de Slit2-Robo2 (por ejemplo, cuando se inactiva Robo2), se pierden los efectos inhibidores de Robo2 sobre la polimerizacion inducida por nefrina. Los dominios SH3 de Nck son capaces de interactuar con los reguladores del citoesqueleto secuencia abajo para aumentar la polimerizacion de la actina, lo que puede explicar la estructura alterada del proceso del pie del podocito en ratones mutantes Robo2. Abreviaturas: Ig: dominio de inmunoglobulina; FN3: dominio de fibronectina tipo 3; SH2: dominio del homologo 2 de Src; SH3: dominio del homologo 3 de Src; CC0, CC1, CC2, CC3: Region conservada citoplasmatica 0, 1, 2, 3.
Descripcion detallada
Se ha demostrado previamente que Robo2 es el receptor de la superficie celular para la SLIT senal de guia de repulsion y esta involucrado en la guia de axones y la migracion neuronal en el sistema nervioso. La nefrina es una proteina del diafragma de hendidura del podocito que funciona en la barrera de filtracion glomerular del rinon. En el presente documento se ha demostrado que Robo2 se expresa en la superficie basal de los podocitos, tal como los podocitos de raton, y se localiza conjuntamente con nefrina. Los estudios bioquimicos indican que Robo2 forma un complejo con nefrina en el rinon a traves de la proteina adaptadora Nck. En contraste con el papel de la nefrina que promueve la polimerizacion de actina, en el presente documento se demuestra que la senalizacion de Slit2-Robo2 inhibe la polimerizacion de actina inducida por nefrina. Por ejemplo, la cantidad de F-actina asociada con la nefrina aumenta en los ratones con desactivacion de Robo2 que desarrollan una estructura alterada del proceso del pie del podocito y microalbuminuria. Los estudios de interaccion genetica revelan ademas que la perdida de Robo2 alivia el fenotipo anormal de podocitos en ratones con nefrina nula. Los resultados proporcionados en este documento muestran que la senalizacion de Robo2 actua como un regulador negativo sobre la nefrina para influir en la arquitectura del proceso del pie del podocito.
Ademas, se ha demostrado que un paciente con reflujo vesicoureteral (VUR) tiene una translocacion cromosomica que interrumpe el gen ROBO2 y produce proteinas de fusion ROBO2 negativas dominantes que anulan la ruta de senalizacion de SLIT2-ROBO2. Normalmente, VUR es una enfermedad caracterizada por el flujo retrogrado de orina desde la vejiga hacia los ureteres y el rinon, y los pacientes con VUR pueden presentar nefropatia por reflujo, una afeccion que se manifiesta con proteinuria severa. Se ha demostrado que las proteinas de fusion ROBO2 dominantes negativas producidas por un paciente con VUR bloquean la ruta de senalizacion de SLIT2-ROBO2 y protegen al paciente de la nefropatia por reflujo y la proteinuria, lo que confirma y apoya aun mas los resultados de los inventores en modelos animales del valor terapeutico del direccionamiento de la ruta de senalizacion SLIT2-ROBO2 para el tratamiento de la enfermedad renal cronica.
En el rinon normal, la pared capilar glomerular trilaminar, compuesta por celulas endoteliales fenestradas, membrana basal y podocitos, restringe la permeabilidad a las proteinas plasmaticas. Los podocitos son celulas epiteliales especializadas que extienden los procesos primarios y secundarios para cubrir la superficie externa de la membrana basal glomerular. Los procesos secundarios de interdigitacion ricos en actina, o procesos base, de podocitos vecinos crean hendiduras de filtracion unidas por un diafragma de hendidura semiporoso que forma la barrera final a la permeacion de proteinas. Mientras que las mutaciones geneticas de las proteinas de diafragma de hendidura de los podocitos, como la nefrina y otras, estan asociadas con formas hereditarias de enfermedad renal proteinurica (Tryggvason y colaboradores, 2006), se ha hecho evidente que las proteinas que forman y se asocian con el diafragma de hendidura son mas que una simple barrera estructural. Estas proteinas forman una red de senalizacion equilibrada que puede influir en la estructura del proceso del pie de los podocitos y funcionar a traves de la interaccion con el citoesqueleto de F-actina (Faul y colaboradores, 2007; Jones y colaboradores, 2006; Verma y colaboradores, 2006).
Las proteinas de la familia Roundabout (Robo), Robol, Robo2, Robo3 y Robo4 son receptores de la superficie celular para el ligando secretado Slit (Dickson y Gilestro, 2006). S litl, Slit2 y Slit3 se encontraron originalmente como senales de guia repulsivas para la busqueda de axones y las neuronas migratorias durante el desarrollo del sistema nervioso (Guan y Rao, 2003). La proteina transmembrana Robo contiene cinco motivos de Ig y tres repeticiones de fibronectina tipo III (FNIII) en su dominio extracelular (Dickson y Gilestro, 2006). Si bien ambos motivos de inmunoglobulina (Ig) 1 y 2 interactuan con Slit, el primer motivo de Ig 1 de Robo es el sitio de union principal para Slit (Dickson y Gilestro, 2006) . El dominio intracelular de Robo tiene cuatro secuencias conservadas citoplasmaticas (CC) denominadas CC0, CC1, CC2 y CC3 (Bashaw y colaboradores, 2000; Kidd y colaboradores, 1998; Morlot y colaboradores, 2007; Zallen y colaboradores, 1998). CC0 y CC1 contienen tirosina, mientras que CC2 y CC3 son estiramientos ricos en prolina. La actividad repulsiva de la senalizacion de Slit-Robo inhibe la polimerizacion de la actina (Guan y Rao, 2003) o induce la despolimerizacion de la F-actina (Piper y colaboradores, 2006).
La senalizacion Slit-Robo tambien desempena funciones cruciales durante la induccion renal temprana y el crecimiento de las yemas uretrales. Los mutantes de raton que carecen de Slit2 o Robo2 desarrollan brotes uretrales supernumerarios, lo que conduce a un amplio espectro de fenotipo del tracto urinario, que incluye rinones duplex, uniones ureterovesicales anormales e hidronefrosis (Grieshammer y colaboradores, 2004; Lu y colaboradores, 2007). La interrupcion de ROBO2 en humanos causa anomalias congenitas de los rinones y vias urinarias (CAKUT), y se han identificado mutaciones puntuales de ROBO2 en pacientes con reflujo vesicoureteral (VUR) (Lu y colaboradores, 2007) . Nuestro estudio reciente demuestra que Robo2 es crucial para la formacion de un orificio ureteral normal y para el mantenimiento de un mecanismo efectivo contra el reflujo (Wang y colaboradores, 2011).
En este documento se demuestra que Robo2 es una nueva proteina de podocitos expresada en la superficie basal de los podocitos glomerulares en el rinon y se localiza conjuntamente con nefrina y podocina. Robo2 interactua directamente con los dominios SH3 de la proteina adaptadora Nck y forma un complejo con nefrina. Mientras que los ratones con desactivacion de Robo2 desarrollaron procesos de base alterados de podocitos, la perdida de Robo2 alivia las anomalias estructurales del proceso del pie que se observan en ratones nulos para nefrina. Estos resultados descritos en el presente documento indican que la senalizacion de Robo2 actua como un regulador negativo en la senalizacion de nefrina para influir en la arquitectura del proceso del pie de podocitos. Ademas, como se demuestra en este documento, se ha descubierto que las proteinas de fusion ROBO2 negativas dominantes producidas por un paciente bloquean la ruta de senalizacion SLIT2-ROBO2 y protegen al paciente de la nefropatia por reflujo y proteinuria, lo que confirma y respalda los resultados descritos en este documento en modelos animales del valor terapeutico del direccionamiento de la ruta de senalizacion SLIT2-ROBO2 para el tratamiento de la enfermedad renal cronica.
Por consiguiente, en algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan metodos para el tratamiento de la enfermedad renal cronica en un sujeto que lo necesite, comprendiendo dicho metodo administrar a un sujeto que tiene o esta en riesgo de una enfermedad renal cronica una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende un inhibidor de la ruta de senalizacion SLIT2-ROBO2.
Tambien se proporcionan en este documento, en algunos aspectos, metodos para la reduccion de la proteinuria en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a un sujeto que tiene o esta en riesgo de proteinuria una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende un inhibidor de la ruta de senalizacion SLIT2-ROBO2
En otros aspectos, en el presente documento se proporcionan metodos para prevenir enfermedades renales o promover la profilaxis de enfermedades renales en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende un inhibidor de la ruta de senalizacion SLIT2-ROBO2 para prevenir o promover la profilaxis de la enfermedad renal en el sujeto.
Tambien se proporcionan en este documento, en algunos aspectos, metodos para mitigar los efectos de la enfermedad renal, reducir la gravedad de la enfermedad renal, reducir la probabilidad de desarrollar enfermedad renal y/o ralentizar la progresion de la enfermedad renal en un sujeto que la necesite.
Como se usa en este documento, "ROBO2" se refiere al polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de:
MARRHERVTRRMWTWAPGLLMMTVVFWGHQGNGQGQGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSK GEPTTLNCKAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGS YVCVARNYLGEAVSRNASLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYWKK DKVRIDDKEERISIRGGKLMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPI NQVVLEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYM CIAENRVGKMEASATLTVRAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQ NLLFPNQPQQPNSRCSVSPTGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVTDVLTDRPP PIILQGPANQTLAVDGTALLKCKATGDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGTLQIKNLRIS DTGTYTCVATSSSGETSWSAVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQ PGTPGTLPASAYIIEAFSQSVSNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPS PMSDPVRTQDISPPAQGVDHRQVQKELGDVLVRLHNPVVLTPTTVQVTWTVDRQPQFIQGY RVMYRQTSGLQATSSWQNLDAKVPTERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTV RTTEEAPSAPPQSVTVLTVGSYNSTSISVSWDPPPPDHQNGIIQEYKIWCLGNETRFHINKTVD AAIRSVIIGGLFPGIQYRVEVAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQP AFIAGIGGACWVILMGFSIWLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPS YPWLADSWPATSLPVNNSNSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKT SYNSSSQITQATPYATTQILHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNG GKGGKKKKNKNSSKPQKNNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCPP LPVQTYLHQGLEDELEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPMLQAHLD ELTRAYQFDIAKQTWHIQSNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALEIPRP LRALDQTPGSSMDNLDSSVTGKAFTSSQRPRPTSPFSTDSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRM DQQPALPHRREGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTEVLRAGHQRNAS DLLDIGYMGSNSQGQFTGEL(isoforma ROBO2a del homologo 2 Roundaboud de Homo sapiens; SEQ ID NO: 1), como se describe por ejemplo, por NP_001122401.1 y se codifica por NM_001128929.2 (SEQ ID NO: 2); o MSLLMFTQLLLCGFLYVRVDGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSKGEPTTLNCKAEGRPTPTIE WYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNA SLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYWKKDKVRIDDKEERISIRGGK LMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPINQVVLEEEAVEFRCQVQ GDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYMCIAENRVGKMEASATLTV RAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQNLLFPNQPQQPNSRCSVSP TGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVTDVLTDRPPPIILQGPANQTLAVDGTAL LKCKATGDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGTLQIKNLRISDTGTYTCVATSSSGETSWS AVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQPGTPGTLPASAYIIEAFSQSV SNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPSPMSDPVRTQDISPPAQGVD HRQVQKELGDVLVRLHNPVVLTPTTVQVTWTVDRQPQFIQGYRVMYRQTSGLQATSSWQN LDAKVPTERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTVRTTEEAPSAPPQSVTVLTV GSYNSTSISVSWDPPPPDHQNGIIQEYKIWCLGNETRFHINKTVDAAIRSVIIGGLFPGIQYRVE VAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQPAFIAGIGGACWVILMGFSI WLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPSYPWLADSWPATSLPVNNS NSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKTSYNSSSQITQATPYATTQI LHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNGGKGGKKKKNKNSSKPQK NNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCPPLPVQTYLHQGLEDELEED DDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPMLQAHLDELTRAYQFDIAKQTWHIQ SNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALEIPRPLRALDQTPGSSMDNLDSS VTGKAFTSSQRPRPTSPFSTDSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRMDQQPALPHRREGMTDEE ALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTEVLRAGHQRNASDLLDIGYMGSNSQGQFTG EL (isoforma ROBO2b del homologo 2 de Roundabout de Homo sapiens; SEQ ID NO: 3), como se describe en, por ejemplo, NP_002933.1 y codificado por NM_002942.4 (SEQ ID NO: 4), junto con cualquiera de las variantes de empalme alelicas de origen natural y formas procesadas de las mismas. Tipicamente, ROBO2 se refiere a ROBO2 humano. El gen ROBO2 se conserva en chimpance, mono Rhesus, perro, vaca, raton, rata, pollo, pez cebra, mosca de la fruta, mosquito y C. elegans. Los residuos especificos de ROBO2 se pueden denominar, por ejemplo, "ROBO2(30)".
Los dominios especificos de ROBO2 tambien pueden ser denominados por dicha nomenclatura. El dominio N-terminal o "extracelular de ROBO2", que comprende los cinco motivos de inmunoglobulina y las tres repeticiones de fibronectina tipo III (FNIII), puede denominarse ROBO2 (46-848) de la SEQ ID NO: 1 o ROBO2 (30-832) de la SEQ ID NO: 3, por ejemplo. Los motivos de inmunoglobulina (Ig) 1 y 2 que interactuan con Slit2, o el "dominio de union a SLIT de Ig" pueden denominarse ROBO2 (46-145) y ROBO2 (151-237) respectivamente de la SEQ ID NO: 1, y ROBO2 (30-129) y ROBO2 (135-221) respectivamente de la SEQ ID NO: 3. De manera similar, el "dominio intracelular" que comprende el "dominio de union intracelular a Nck", que comprende los cuatro motivos intracelulares ricos en prolina , descritos en este documento, pueden denominarse como ROBO2 (881-1378) de la SEQ ID NO: 3.
Como se usa en el presente documento, los terminos "inhibidor de ROBO2", "antagonista de ROBO2", "agente inhibidor de ROBO2" y "agente antagonista de ROBO2" se refieren a una molecula o agente que bloquea, inhibe, reduce o interfiere significativamente con la actividad biologica de ROBO2 (mamifero, tal como humano, ROBO2) in vitro, in situ y/o in vivo, incluida la actividad de rutas posteriores mediadas por la senalizacion de ROBO2, tales como, por ejemplo, la interaccion de ROBO2 con la proteina adaptadora Nck y/o la formacion de complejo con nefrina, inhibicion mediada por SLIT2-ROBO-2 de polimerizacion de actina mediada por nefrina y/o provocacion de una respuesta celular a ROBO2. El termino "agente" como se usa en el presente documento en referencia a un inhibidor de ROBO2 significa cualquier compuesto o sustancia tal como, pero sin limitarse a, una molecula pequena, acido nucleico, polipeptido, peptido, farmaco, ion, etc. Un "agente" puede ser cualquier sustancia quimica, entidad o fraccion, incluyendo, sin limitacion, entidades proteicas y no proteicas sinteticas y naturales. En algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, un agente es un acido nucleico, un analogo de acido nucleico, una proteina, un anticuerpo, un peptido, un aptamero, un oligomero de acidos nucleicos, un aminoacido o un carbohidrato, e incluye, sin limitacion, proteinas, oligonucleotidos, ribozimas, ADNzimas, glicoproteinas, ARN antisentido, ARNic, lipoproteinas, aptameros y modificaciones y combinaciones de los mismos, etc. Se puede saber que los compuestos para uso en las composiciones terapeuticas y los metodos descritos en este documento tienen una actividad deseada y o propiedad, o puede seleccionarse de una biblioteca de diversos compuestos, utilizando metodos de cribado conocidos por un experto en la tecnica.
Los ejemplos de inhibidores de ROBO2 contemplados para uso en los diversos aspectos y realizaciones descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-ROBO2 o fragmentos de union a antigeno de los mismos que se unen especificamente a ROBO2; moleculas antisentido dirigidas a un acido nucleico que codifica ROBO2 (por ejemplo, ROBO2a o ROBO2b o ambos); moleculas ARN de interferencia corta ("ARNic") dirigidas a un acido nucleico que codifica ROBO2 (por ejemplo, ROBO2a o ROBO2b o ambos); aptameros de ARN o ADN que se unen a ROBO2, e inhiben/reducen/bloquean la senalizacion mediada por ROBO2; analogos estructurales de ROBO2; y proteinas ROBO2 solubles, polipeptidos inhibidores, por ejemplo, polipeptidos negativos dominantes, o polipeptidos de fusion de los mismos. En algunas realizaciones de estos aspectos y todos los aspectos descritos en el presente documento, un inhibidor de ROBO2 (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo) se une (interactua fisicamente con) ROBO2, se dirige secuencia abajo de la senalizacion de ROBO2 y/o inhibe (reduce) la sintesis produccion o liberacion de ROBO2. En algunas realizaciones de estos aspectos y todos los aspectos descritos en el presente documento, un inhibidor de ROBO2 se une y evita su union a un ligando de proteina SLIT, tal como SLIT2. En algunas realizaciones de estos aspectos y todos los aspectos descritos en el presente documento, un inhibidor de ROBO2 reduce o elimina especificamente la expresion (es decir, la transcripcion o traduccion) de una o mas isoformas de ROBO2.
Como se usa en el presente documento, un inhibidor o antagonista de ROBO2 tiene la capacidad de reducir la actividad y/o expresion de ROBO2 en una celula (por ejemplo, podocitos) en al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, en al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, o mas, en relacion con la actividad o nivel de expresion en ausencia del inhibidor de ROBO2.
Por consiguiente, en algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 inhibe la transduccion de senales mediada por ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 se dirige a la interaccion de ROBO2 con la proteina adaptadora Nck y/o la formacion de complejos con nefrina, la inhibicion mediada por SLIT2-ROBO-2 de la polimerizacion de actina mediada por nefrina y/o la provocacion de una respuesta celular a ROBO2.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, los sitios de union de los inhibidores de ROBO2, tales como un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, se dirigen contra un sitio de interaccion de ligando de ROBO2, tal como un sitio de interaccion de ligando de SLIT2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, los sitios de union del inhibidor de ROBO2, tales como un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, se dirigen contra un sitio de interaccion del adaptador de ROBO2 tal como un sitio de interaccion Nck o el dominio de union intracelular a NCK que comprende los cuatro motivos intracelulares ricos en prolina de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, los sitios de union de los inhibidores de ROBO2 se dirigen contra un sitio en un objetivo en la proximidad del sitio de interaccion del ligando, con el fin de proporcionar un impedimento esterico para la interaccion del receptor (por ejemplo, ROBO2) con su ligando (por ejemplo, SLIT2). Al unirse a un sitio de interaccion del ligando de ROBO2, un inhibidor de ROBO2 descrito en este documento puede reducir o inhibir la actividad o expresion de ROBO2, y las consecuencias de senalizacion de ROBO2 secuencia abajo (por ejemplo, la interaccion de ROBO2 con la protefna adaptadora Nck y/o la formacion de complejos con nefrina, inhibicion mediada por SLIT2-ROBO-2 de la polimerizacion de la actina mediada por nefrina, y/o provocacion de una respuesta celular a ROBO2). Por ejemplo, en algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, los sitios de union de los inhibidores de ROBO2 bloquean o se dirigen al menos a la Ig 1, y preferiblemente a los sitios de Ig1 e Ig2, en ROBO2, es decir, ROBO2 (46-145) y ROBO2 (151-237) respectivamente de la SEQ ID NO: 1, y ROBO2 (30-129) y ROBO2 (135-221) respectivamente de la SEQ ID NO: 3, por ejemplo. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, los sitios de union de los inhibidores de ROBO2 bloquean o se dirigen al dominio intracelular de ROBO2 que comprende el dominio de union intracelular a Nck, es decir, ROBO2 (881-1378) de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, los sitios de union de los inhibidores de ROBO2 bloquean o se dirigen al dominio de union intracelular a Nck de ROBO2 que comprende los cuatro motivos intracelulares ricos en prolina de ROBO2. Esto se puede lograr mediante una variedad de medios bien conocidos en la tecnica, tales como anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos, ARN inhibidores, etc., y como se describe en el presente documento.
Por consiguiente, en algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que se une selectivamente o interactua ffsicamente con ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que se une a ROBO2 e inhibe y/o bloquea y/o evita la interaccion con Nck y/o la formacion de complejos con nefrina. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se une al dominio de union a SLIT de Ig de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se une al dominio de union a SLIT de Ig1 de ROBO2 o ambos dominios de union a SLIT de Ig 1 e Ig2 de ROBO2, es decir, ROBO2 (46-145) y ROBO2 (151-237) respectivamente de la SEQ ID NO: 1, y ROBO2 (30-129) y ROBO2 (135-221) respectivamente de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el anticuerpo o antfgeno fragmento de union del mismo se une o bloquea el dominio intracelular de ROBO2, es decir, ROBO2 (881-1378) de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno de la misma se une o bloquea el dominio de union intracelular a Nck que comprende los cuatro motivos intracelulares ricos en prolina de ROBO2.
Los anticuerpos especfficos para o que se unen selectivamente a ROBO2, adecuados para uso en las composiciones y para practicar los metodos descritos en el presente documento son preferiblemente monoclonales, y pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos humanos, humanizados o quimericos, que comprenden anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresion de Fab y/o fragmentos de union de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos tambien se refieren a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen antfgeno o sitios de union al objetivo o "fragmentos de union a antfgenos". Las moleculas de inmunoglobulina descritas en este documento pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclases de moleculas de inmunoglobulina, como es entendido por un experto en la tecnica.
Por consiguiente, en algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, un inhibidor de ROBO2 como se describe en este documento es un anticuerpo monoclonal anti-ROBO2 o un fragmento de union a antfgeno.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en este documento, un inhibidor de ROBO2 como se describe en este documento es un fragmento de anticuerpo de ROBO2 o un fragmento de union a antfgeno. Los terminos "fragmento de anticuerpo", "fragmento de union a antfgeno" y "derivado de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refieren a un fragmento de protefna que comprende solo una porcion de un anticuerpo intacto, que generalmente incluye un sitio de union a antfgeno del anticuerpo intacto y, por lo tanto, retiene la capacidad de unirse al antfgeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluidos en los terminos fragmento de anticuerpo o fragmento de union a antfgeno incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene dominios Vl, Cl, Vh y Ch1 ; (ii) el fragmento Fab', que es un fragmento Fab que tiene uno o mas residuos de cistefna en el extremo terminal C del dominio Ch1 ; (iii) el fragmento Fd que tiene dominios Vh y Ch1 ; (iv) el fragmento Fd' que tiene dominios Vh y Ch1 y uno o mas residuos de cisteina en el extremo terminal C del dominio Ch1 ; (v) el fragmento Fv que tiene los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) un fragmento de dAb (Ward y colaboradores, Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio Vh o un dominio Vl; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la region de la bisagra; (ix) moleculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, Fv de cadena sencilla; scFv) (Bird y colaboradores, Science 242: 423-426 (1988); y Huston y colaboradores, PNAS (EE.UU) 85: 5879-5883 (1988)); (x) "diacuerpos" con dos sitios de union a antigeno, que comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptidica (vease, por ejemplo, los documento EP 404.097; WO 93/11161; Hollinger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 90: 6444-6448 (1993)); (xi) "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fd en tandem (Vh-Ch1-Vh-Ch1) que, junto con polipeptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de union a antigeno (Zapata y colaboradores, Protein Eng. 8 (10) ): 1057-1062 (1995) y la patente de Estados Unidos N° 5.641.870); y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, modificadas por la union covalente de polialquilenglicol (por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polibutilenglicol) u otro polimero adecuado).
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, un inhibidor o antagonista de ROBO2 es un derivado de anticuerpo quimerico de un anticuerpo antagonista de ROBO2 o un fragmento de union a antigeno del mismo.
El inhibidor o anticuerpos antagonistas de ROBO2 y los fragmentos de union a antigeno de los mismos descritos en el presente documento tambien pueden ser, en algunas realizaciones, un derivado de anticuerpo humanizado.
En algunas realizaciones, el inhibidor o anticuerpos antagonistas de ROBO2 y sus fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documentos incluyen derivados que se modifican, es decir, por la union covalente de cualquier tipo de molecula al anticuerpo, siempre que la union covalente no impida que el anticuerpo se una al antigeno objetivo, por ejemplo, ROBO2.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, se usan anticuerpos completamente humanos, que son particularmente deseables para el tratamiento terapeutico de pacientes humanos.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 comprende al menos una molecula antisentido capaz de bloquear o disminuir la expresion de un ROBO2 funcional particular dirigiendose a los acidos nucleicos que codifican ROBO2, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o ambos, o dominios relevantes de los mismos. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, al menos una molecula antisentido se dirige a los acidos nucleicos que codifican el dominio de union a SLIT de Ig de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, al menos una molecula antisentido se dirige a los acidos nucleicos que codifican el dominio de union a SLIT de Ig1 de ROBO2 o ambos dominios de union a SLIT de Ig 1 e Ig2 de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, al menos una molecula antisentido se dirige a los acidos nucleicos que codifican el dominio intracelular de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, al menos una molecula antisentido se dirige a acidos nucleicos que codifican el dominio de union intracelular a Nck que comprende los cuatro motivos intracelulares ricos en prolina de ROBO2. Los expertos en la tecnica conocen metodos para la preparacion de moleculas de oligonucleotidos antisentido que se uniran especificamente al ARNm de ROBO2 sin reaccionar de forma cruzada con otros polinucleotidos. Los ejemplos de sitios de direccionamiento incluyen, pero no se limitan a, el codon de iniciacion, las regiones reguladoras 5', incluidos los promotores o potenciadores, la secuencia codificadora, incluidas las regiones de consenso conservadas, y la region no traducida 3'. En alguna realización de estos aspectos y todos los aspectos descritos en el presente documento, los oligonucleotidos antisentido tienen una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleotidos, una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleotidos, una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleotidos, o mas. En ciertas realizaciones, los oligonucleotidos antisentido comprenden ademas modificaciones quimicas para aumentar la resistencia a la nucleasa y similares, tales como, por ejemplo, enlaces fosforotioato y modificaciones de 2'-O-azucar conocidas por los expertos en la tecnica.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 comprende al menos una molecula ARN de interferencia corto (ARNic) capaz de bloquear o disminuir la expresion de ROBO2 funcional dirigiendose a los acidos nucleicos que codifican a ambas isoformas de ROBO2, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o dominios relevantes de las mismas. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, al menos una molecula de ARNic se dirige a los acidos nucleicos que codifican el dominio de union a SLIT de Ig de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, la al menos una molecula de ARNic se dirige a los acidos nucleicos que codifican el dominio de union a SLIT de Ig de ROBO2 o ambos dominios de union a SLIT de Ig1 e Ig2 de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, al menos una molecula de ARNic se dirige a los acidos nucleicos que codifican el dominio intracelular de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, al menos una molecula de ARNic se dirige a acidos nucleicos que codifican el dominio de union intracelular a Nck que comprende los cuatro motivos intracelulares ricos en prolina de ROBO2. Es rutina preparar moleculas de ARNic que se dirijan especificamente al ARNm de ROBO2 sin reaccionar de forma cruzada con otros polinucleotidos. Las moleculas de ARNic para uso en las composiciones y metodos descritos en el presente documento pueden generarse por metodos conocidos en la tecnica, tales como por ejemplo la sfntesis tfpica de oligonucleotidos en fase solida, y con frecuencia incorporaran modificaciones qufmicas para aumentar la vida media y/o la eficacia del agente de ARNic, y/o para permitir una formulacion de suministro mas robusta. Alternativamente, las moleculas de ARNic se administran utilizando un vector que codifica un casete de expresion para la transcripcion intracelular de ARNic.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es un aptamero de ARN o ADN que se une a una o mas isoformas de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, un inhibidor o antagonista de ROBO2 es un aptamero de ARN o ADN que se une o interactua ffsicamente con ROBO2 y bloquea las interacciones entre ROBO2 y un ligando o molecula adaptadora, por ejemplo, SLIT2 o Nck, respectivamente. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, un inhibidor o antagonista de ROBO2 es un aptamero de ARN o ADN que se une o interactua ffsicamente con ROBO2, y reduce, impide o bloquea la senalizacion secuencia abajo de ROBO2, tal como la inhibicion SLIT2-ROBO2 mediada por la polimerizacion de actina mediada por nefrina y/o provocacion de una respuesta celular a ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el aptamero de ARN o ADN se une o interactua ffsicamente con el dominio de union a SLIT de Ig de ROBO2. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el aptamero de ARN o ADN se une a o interactua ffsicamente con el dominio de union a SLIT de Ig1 de ROBO2 o ambos dominios de union a SLIT de Ig 1 e Ig2 de ROBO2, es decir, ROBO2 (46-145) y ROBO2 (151-237) respectivamente de la SEQ ID NO: 1, y ROBO2 (30-129) y ROBO2 (135-221) respectivamente de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el aptamero de ARN o ADN se une o interactua ffsicamente con el dominio intracelular de ROBO2, es decir, ROBO2 (881-1378) de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en este documento, el aptamero de ARN o ADN se une o interactua ffsicamente con o bloquea el dominio de union intracelular a Nck que comprende los cuatro motivos intracelulares ricos en prolina de ROBO2.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ROBO2 es un compuesto o agente de molecula pequena que se dirige o se une a ROBO2, que incluye, entre otros, peptidos pequenos o moleculas similares a peptidos, peptidos solubles, y compuestos organicos o inorganicos no peptidflicos sinteticos. Como se usa en el presente documento, el termino "molecula pequena" se refiere a un agente qufmico que puede incluir, entre otros, un peptido, un peptidomimetico, un aminoacido, un analogo de aminoacido, un polinucleotido, un analogo de polinucleotido, un aptamero, un nucleotido, un analogo de nucleotido, un compuesto organico o inorganico (por ejemplo, incluyendo compuestos heterorganicos y organometalicos) que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 5.000 gramos por mol, organico o compuestos inorganicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, esteres y otras formas farmaceuticamente aceptables de tales compuestos. Los ejemplos de sitios de union de moleculas pequenas incluyen, pero no se limitan a, la porcion de ROBO2 que se une a SLIT2 o al adaptador Nck, es decir, el dominio de union a SLIT de Ig1 de ROBO2 o ambos dominios de union a SLIT de Ig1 e Ig2 de ROBO2, el dominio intracelular de ROBO2 o el dominio de union intracelular de Nck que comprende los cuatro motivos intracelulares ricos en prolina de ROBO2.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, un inhibidor o antagonista de ROBO2 comprende una pequena molecula que se une a ROBO2 e inhibe la actividad biologica de ROBO2.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el inhibidor o antagonista de ROBO2 comprende al menos un analogo estructural de ROBO2, tal como un polipeptido de ROBO2 negativo dominante. El termino analogos estructurales de ROBO2, como se usa en este documento, se refiere a compuestos que tienen una estructura tridimensional similar a la de ROBO2 y que se unen a SLIT2 y/o a Nck en condiciones fisiologicas in vitro o in vivo, en donde la union inhibe al menos parcialmente la actividad biologica de ROBO2, tal como la inhibicion mediada por SLIT2-ROBO2 de la polimerizacion de actina mediada por nefrina, y/o la provocacion de una respuesta celular a ROBO2. Los analogos estructurales adecuados de ROBO2 se pueden disenar y sintetizar a traves del modelado molecular de la union de ROBO2-SLIT2, por ejemplo. Los analogos estructurales de ROBO2 pueden ser monomeros, dfmeros o multfmeros de orden superior en cualquier combinacion deseada de estructuras iguales o diferentes para obtener afinidades y efectos biologicos mejorados.
En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, un inhibidor o antagonista de ROBO2 comprende al menos un receptor soluble de ROBO2 o un polipeptido de fusion del mismo, tal como, por ejemplo, un polipeptido inhibidor de ROBO2. En algunas de tales realizaciones, el polipeptido inhibidor de ROBO2 es una protefna de fusion ROBO2 negativa dominante. En algunas realizaciones de las composiciones y metodos descritos en el presente documento, el polipeptido inhibidor de ROBO2 comprende el dominio extracelular de ROBO2, por ejemplo, el dominio de union a SLIT de Ig 1 de ROBO2 o ambos dominios de union a SLIT de Ig 1 e Ig2 de ROBO2, sin dominios de ROBO2 intracelulares.
Los inhibidores o antagonistas de ROBO2 para uso en las composiciones y metodos descritos en el presente documento pueden identificarse o caracterizarse usando metodos conocidos en la tecnica, tales como ensayos de union protefna-protefna, ensayos de seleccion bioquimicos, inmunoensayos y ensayos basados en celulas, que son bien conocido en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en el presente documento en los Ejemplos.
Por ejemplo, para identificar una molecula que inhibe la interaccion entre ROBO2 y su ligando, por ejemplo, SLIT2, se pueden usar los ensayos de union. Por ejemplo, ROBO2 o SLIT se inmovilizan en una placa de microtitulacion por union covalente o no covalente. El ensayo se realiza agregando el componente no inmovilizado (ligando o receptor), que puede marcarse con una etiqueta detectable, al componente inmovilizado, en presencia o ausencia de un agente de prueba. Cuando se completa la reaccion, los componentes que no reaccionan se eliminan y se detectan los complejos de union. Si la formacion de complejos de union es inhibida por la presencia del agente de prueba, el agente de prueba puede considerarse un antagonista candidato que inhibe la union entre ROBO2 y SLIT2, por ejemplo. Los ensayos basados en celulas o en membranas tambien se pueden usar para identificar los inhibidores de ROBO2. En otras realizaciones, al detectar y/o medir los niveles de expresion del gen ROBO2, se pueden probar las moleculas inhibidoras de ROBO2 que inhiben la expresion del gen ROBO2. La expresion del gen ROBO2 puede detectarse y/o medirse mediante una variedad de metodos, como RT-PCR en tiempo real, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ("ELISA"), transferencia Northern o citometria de flujo, y como sabe un experto habitual en el arte.
Dichos inhibidores de ROBO2 identificados pueden probarse adicionalmente utilizando modelos animales in vivo de la enfermedad renal cronica, como los modelos de lesion intersticial y glomerular (por ejemplo, modelos animales de nefritis lupica, incluidos los ratones del hibrido NZB, (NZB x NZW) F1 (denominado NZB/W), y derivados congenicos de los mismos, cepas MRL/lpr y BXSB), modelos animales de envejecimiento (por ejemplo, ratas Sprague Dawley viejas y ratones C57BL/6 viejos); ratas espontaneamente hipertensas (SHR); ratas bufalo/mna, que son un modelo del sindrome nefrotico idiopatico humano; ratas Munich Wistar Fromter (MWF), que son un modelo genetico relacionado con un deficit congenito en el numero de nefronas que esta predispuesto al desarrollo de hipertension y sensibilidad a la sal en la edad adulta; modelos geneticos especificos de podocitos primarios FSGS; modelos de ratones transgenicos de nefropatia asociada al VIH (HIVAN); modelos animales del sindrome de Alport, que comprenden mutaciones de las cadenas a3, a4 o a5 del colageno de tipo IV (COL4A3, COL4A4 y COL4A5); modelos inducidos por el sistema inmunitario, tal como el modelo de nefritis Thy-1, que es un modelo experimental de rata de los modelos de glomerulonefritis mesangioproliferativa (MsPGN), modelos de membrana basal anti-glomerular (GBM); y modelos inducidos no inmunes.
Como se usa en este documento, con respecto a un inhibidor de ROBO2, "se une selectivamente" o "se une especificamente" o "especifico para" se refiere a la capacidad de un inhibidor de ROBO2 como se describe en este documento, tal como, por ejemplo, un anticuerpo antagonista de ROBO2 o su fragmento de union al antigeno ROBO2, para unirse a un objetivo, es decir, ROBO2, con un Kd10-5 M (10.000 nM) o menos, por ejemplo, 10-6 M o menos, 10­ 7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, o 10-12 M o menos. Por ejemplo, si un inhibidor/antagonista de ROBO2 descrito en el presente documento se une a ROBO2 con un Kd de 10-5 M o inferior, pero no a una molecula relacionada, tal como, por ejemplo, otros miembros de la familia ROBO, se dice que el agente se une especificamente a ROBO2. La union especifica puede estar influida, por ejemplo, por la afinidad y avidez de, por ejemplo, el inhibidor/anticuerpo antagonista de ROBO2 o su fragmento de union a antigeno de los mismos y la concentracion de agente polipeptidico. El experto en la materia puede determinar las condiciones apropiadas bajo las cuales los agentes polipeptidicos descritos en el presente documento se unen selectivamente a los objetivos utilizando cualquier metodo adecuado, como la titulacion de un agente polipeptidico en un ensayo de union celular adecuado.
Con respecto a los metodos para tratar la enfermedad renal cronica mediante la inhibicion de la actividad de ROBO2, el termino "enfermedad renal cronica" o CKD se refiere a enfermedades renales que empeoran lenta y progresivamente con el tiempo debido a la perdida progresiva de nefronas y la consiguiente perdida de la funcion renal. En las primeras etapas, puede no haber sintomas. La perdida de la funcion suele tardar meses o anos en ocurrir. Puede ser tan lento que los sintomas no aparecen hasta que la funcion renal es menos de una decima parte de lo normal. La etapa final de la enfermedad renal cronica se llama enfermedad renal en etapa terminal (ESRD). En esta etapa, los rinones ya no pueden eliminar suficientes desechos y exceso de liquidos del cuerpo. El paciente necesita dialisis o un trasplante de rinon. La diabetes, que conduce a la nefropatia diabetica, y la presion arterial alta son las dos causas mas comunes de la enfermedad renal cronica y representan la mayoria de los casos. Otras enfermedades y afecciones que pueden danar los rinones y llevar a una enfermedad renal cronica, incluyen: trastornos autoinmunes (como lupus eritematoso sistemico y escleroderma); defectos de nacimiento de los rinones (tal como la enfermedad poliquistica del rinon); ciertos quimicos toxicos; glomerulonefritis; lesion o trauma; calculos renales e infeccion; problemas con las arterias que conducen hacia o dentro de los rinones; algunos medicamentos para el dolor y otros medicamentos (como los medicamentos contra el cancer); nefropatia por reflujo (en la cual los rinones son danados por el flujo de orina hacia los rinones) etc. Como se usa en este documento, "proteinuria" se refiere a la presencia de un exceso de proteinas sericas en la orina. La proteinuria puede, en algunas realizaciones, ser indicativa de enfermedad renal, pero, por si misma, no es concluyente.
Por consiguiente, en algunas realizaciones de estos aspectos y todos los aspectos descritos en el presente documento, el sujeto que tiene o tiene riesgo de padecer una enfermedad renal cronica tiene nefropatia diabetica.
Por "reducir" o "inhibir" en terminos de la enfermedad renal cronica y los metodos de tratamiento de proteinuria descritos en el presente documento se entiende la capacidad de causar una disminucion general de 20% o mas, 30% o mas, 40% o mas, 45% o mas, mas preferiblemente de 50% o mas, de 55% o mas, de 60% o mas, de 65% o mas, de 70% o mas, y lo mas preferiblemente de 75% o mas, 80% o mas , 85% o mas, 90% o mas, o 95% o mas, para un parametro o smtoma dado de una enfermedad renal cronica. Reducir o inhibir puede referirse, por ejemplo, a los smtomas del trastorno que se esta tratando, por ejemplo, presion arterial alta, protemas en la orina, etc.
La presion arterial alta casi siempre esta presente en todas las etapas de la enfermedad renal cronica. Un examen del sistema nervioso puede mostrar signos de dano a los nervios. El medico puede escuchar ruidos cardfacos o pulmonares anormales cuando escucha con un estetoscopio. Los primeros smtomas de la enfermedad renal cronica tambien son smtomas de otras enfermedades. Estos smtomas pueden ser los unicos signos de enfermedad renal hasta que la afeccion este mas avanzada. Los smtomas de la enfermedad renal cronica pueden incluir: perdida de apetito; malestar general y fatiga; dolores de cabeza, picazon (prurito) y piel seca; nausea; perdida de peso sin intentar perder peso, etc. Otros smtomas que pueden desarrollarse, especialmente cuando la funcion renal ha empeorado, incluyen: piel anormalmente oscura o clara; dolor de huesos; smtomas del cerebro y del sistema nervioso; somnolencia y confusion; problemas para concentrarse o pensar; entumecimiento en las manos, pies u otras areas; contracciones musculares o calambres; olor en el aliento, moretones faciles, sangrado o sangre en las heces; sed excesiva; hipo frecuente, bajo nivel de interes sexual e impotencia; perdida de los periodos menstruales (amenorrea); falta de aliento, problemas para dormir, tales como insomnio, smdrome de piernas inquietas y apnea obstructiva del sueno; hinchazon de los pies y manos (edema); vomitos, tfpicamente por la manana.
Por consiguiente, en algunas realizaciones de los metodos descritos en el presente documento, una cantidad eficaz de una composicion que comprende un inhibidor de ROBO2 descrito en este documento se administra a un sujeto con el fin de aliviar un smtoma de enfermedad renal cronica. Como se usa en este documento, "aliviar un smtoma de una enfermedad renal cronica" esta mejorando cualquier afeccion o smtoma asociado con la enfermedad renal cronica. Alternativamente, el alivio de un smtoma de una enfermedad renal cronica puede implicar la reduccion de uno o mas smtomas de la enfermedad renal cronica en el sujeto en relacion con un control no tratado que sufre de enfermedad renal cronica o en relacion con el sujeto antes del tratamiento. En comparacion con un control equivalente no tratado, o el sujeto antes del tratamiento con el inhibidor de ROBO2, dicha reduccion o grado de prevencion es de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%. %, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75 %, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o mas, según lo medido por cualquier tecnica estandar. De manera deseable, la enfermedad renal cronica se reduce significativamente o es indetectable, como se detecta por cualquier metodo estandar conocido en la tecnica, en cuyo caso se considera que se ha tratado la enfermedad renal cronica. Un paciente que esta siendo tratado por una enfermedad renal cronica es aquel a quien un medico ha diagnosticado como tal. El diagnostico puede ser por cualquier medio adecuado conocido por un experto en la tecnica. El diagnostico y la monitorizacion pueden incluir, por ejemplo, la deteccion del nivel de protemas o moleculas especfficas en una muestra de orina, sangre o suero, tal como, por ejemplo, albumina, calcio, colesterol, hemograma completo (CBC), electrolitos, magnesio, fosforo, potasio, sodio, o cualquier combinacion de los mismos; ensayos para detectar, por ejemplo, aclaramiento de creatinina; niveles de creatinina; BUN (nitrogeno ureico en sangre); mediante el uso de tecnicas o procedimientos especfficos, como tomograffa computarizada abdominal, resonancia magnetica abdominal, ecograffa abdominal, biopsia renal, gammagraffa renal, ecograffa renal; a traves de la deteccion de cambios en los resultados de ensayos o pruebas para eritropoyetina, PTH; prueba de densidad osea, o vitamina D; o cualquier combinacion de tales metodos y ensayos de deteccion.
Los terminos "sujeto" e "individuo" tal como se usan con respecto a cualquiera de los metodos descritos en este documento se usan de manera intercambiable en este documento, y se refieren a un animal, por ejemplo, un humano, receptor de los inhibidores de ROBO2 descritos en este documento. Para el tratamiento de estados de enfermedad que son especfficos para un animal especffico como un sujeto humano, el termino "sujeto" se refiere a ese animal especffico. Los terminos "animales no humanos" y "mamfferos no humanos" se usan indistintamente en el presente documento, e incluyen mamfferos como ratas, ratones, conejos, ovejas, gatos, perros, vacas, cerdos y primates no humanos. El termino "sujeto" tambien abarca cualquier vertebrado, incluidos, entre otros, mamfferos, reptiles, anfibios y peces. Sin embargo, ventajosamente, el sujeto es un mamffero tal como un ser humano, u otros mamfferos tales como un mamffero domesticado, por ejemplo, perro, gato, caballo, y similares.
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el metodo comprende ademas administrar al sujeto un agente terapeutico adicional, ademas del inhibidor de ROBO2. Dicho agente terapeutico adicional puede administrarse junto con el inhibidor de ROBO2. Como se usa en el presente documento, la frase "administrar conjuntamente" o "coadministrar" significa la administracion de un inhibidor de ROBO2 descrito en el presente documento y otro compuesto, por ejemplo, un agente terapeutico, por separado, simultaneamente y/o secuencialmente durante un perfodo de tiempo según lo determinado por un cuidador calificado.
En algunas de tales realizaciones, el agente terapeutico adicional es un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), un bloqueador del receptor de angiotensina II (ARB), o un antagonista del receptor de mineralocorticoides (MR).
Los inhibidores de la ACE para uso con los inhibidores de ROBO2 descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, benazepril (comercializado en los Estados Unidos como LOTENSIN™), captopril (comercializado en los Estados Unidos Como CAPOTEN™), enalapril/enalaprilato (comercializado en los Estados Unidos como VASOTEC™ oral e inyectable), fosinopril (comercializado en los Estados Unidos como MONOPRIL™), lisinopril (comercializado en los Estados Unidos como ZESTRIL™ y PRINIVIL™), moexipril (comercializado en los Estados Unidos como UNIVASC™), perindopril (comercializado en los Estados Unidos como ACEON™), quinapril (comercializado en los Estados Unidos como ACCUPRIL™), ramipril (comercializado en los Estados Unidos Como ALTACE™) y trandolapril (comercializado en los Estados Unidos como MAVIK™). Los ARB para uso con los inhibidores de ROBO2 descritos en el presente documento incluyen candesartan (comercializado en los Estados Unidos como ATACAND™), irbesartan (comercializado en los Estados Unidos como AVAPRO™), olmesartan (comercializado en los Estados Unidos como BENICAR™), losartan (comercializado en los Estados Unidos como COZAAR™), valsartan (comercializado en los Estados Unidos como DIOVAN™), telmisartan (comercializado en los Estados Unidos como MICARDIS™) y eprosartan (comercializado en los Estados Unidos como TEVETEN™).
En algunas realizaciones de estos metodos y todos los metodos descritos en el presente documento, el metodo comprende ademas administrar al sujeto una cantidad eficaz de un diuretico, ademas del inhibidor de ROBO2. Los diureticos incluyen, pero no se limitan a, torsemida (comercializada en los Estados Unidos como DEMADEX™), furosemida (comercializada en los Estados Unidos como LASIX™), bumetanida (comercializada en los Estados Unidos como BUMEX™), acido etacrinico (comercializado en los Estados Unidos como EDECRIN™), torsemida (comercializada en los Estados Unidos como DEMADEX™), amilorida (comercializada en los Estados Unidos como MIDAMOR™), acetazolamida (comercializada en los Estados Unidos como DIAMOX™), pamabrom (comercializada en los Estados Unidos como AQUA-BAN™) , manitol (comercializado en los Estados Unidos como ARIDOL™ u OSMITROL™), traimtereno (comercializado en los Estados Unidos como DYRENIUM™), espironolactona (comercializado en Estados Unidos como ALDACTONE™), amilorida (comercializada en Estados Unidos como MIDAMOR™), indapamida (comercializada en los Estados Unidos como LOZOL™), hidroclorotiazida (comercializada en los Estados Unidos como HYDRODIURIL™), metolazona (comercializada en los Estados Unidos como ZAROXOLYN™ o MYKROX™), metilclotiazida (comercializada en los Estados Unidos como AQUATENSEN™ o ENDURON™), hidrocloroazida (comercializada en los Estados Unidos como AQUAZIDE H™ o ESIDRIX™ o MICROZIDE™), clorotiazida (comercializada en los Estados Unidos como DIURIL™), bendroflumetiazida (comercializada en los Estados Unidos como NATURETIN™), politiazida (comercializada en los Estados Unidos como RENESE™), hidroflumetiazida (comercializada en los Estados Unidos como SALURON™) y clorhidralidona (comercializada en los Estados Unidos como THALITONE™). Para obtener una lista completa, vease tambien, por ejemplo, Physician's Desk Reference, Edicion 2012, PDR Network (2011).
Como se usa en el presente documento, con respecto a cualquiera de las composiciones y metodos que comprenden inhibidores de ROBO-2 o tratamientos combinados de los mismos descritos en el presente documento, los terminos "tratar", "tratamiento", "que trata" o "mejoria" se refieren a tratamientos terapeuticos, en el que el objeto es revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o detener la progresion o gravedad de una afeccion asociada con una enfermedad o trastorno. El termino "tratar" incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o sintoma de una afeccion, enfermedad o trastorno asociado con una enfermedad renal cronica, tal como, entre otras, la nefropatia diabetica. El tratamiento generalmente es "efectivo" si se reducen uno o mas sintomas o marcadores clinicos. Alternativamente, el tratamiento es "efectivo" si la progresion de una enfermedad se reduce o se detiene. Es decir, el "tratamiento" incluye no solo la mejoria de los sintomas o marcadores, sino tambien un cese de al menos una disminucion del progreso o un empeoramiento de los sintomas que se esperaria en ausencia de un tratamiento. Los resultados clinicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, el alivio de uno o mas sintomas, disminucion de la extension de la enfermedad, estado de la enfermedad estabilizado (es decir, sin empeoramiento), retraso o ralentizacion de la progresion de la enfermedad, mejoria o paliacion del estado de la enfermedad y la remision (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. El termino "tratamiento" de una enfermedad tambien incluye proporcionar alivio de los sintomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluido el tratamiento paliativo).
El termino "cantidad efectiva", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un inhibidor de ROBO-2 descrito en el presente documento, necesario para aliviar al menos uno o mas sintomas de la enfermedad o trastorno que se esta tratando, y se relaciona con una cantidad suficiente de una composicion farmacologica para proporcionar el efecto deseado. El termino "cantidad terapeuticamente eficaz", por lo tanto, se refiere a una cantidad del inhibidor de ROBO-2 descrito en el presente documento, utilizando los metodos descritos en este documento, que es suficiente para proporcionar un efecto particular cuando se administra a un sujeto tipico. Una cantidad efectiva como se usa en este documento tambien incluiria una cantidad suficiente para retrasar el desarrollo de un sintoma de la enfermedad, alterar el curso de una enfermedad sintomatica (por ejemplo, pero sin limitarse a, retardar la progresion de un sintoma de la enfermedad), o revertir un sintoma de la enfermedad. Por lo tanto, no es posible especificar la "cantidad efectiva" exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, un experto en la tecnica puede determinar una "cantidad efectiva" apropiada utilizando solo la experimentacion rutinaria.
Las cantidades efectivas, la toxicidad y la eficacia terapeutica pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y la ED50 (la dosis terapeuticamente efectiva) en el 50% de la poblacion). La dosificacion puede va sreiagrún la forma de dosificacion empleada y la ruta de administracion utilizada. La relacion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el indice terapeutico y puede expresarse como la relacion LD50/ED50. Se prefieren las composiciones y metodos que exhiben grandes indices terapeuticos. Una dosis terapeuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Ademas, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentracion en plasma circulante que incluya la IC50 (es decir, la concentracion del inhibidor de ROBO-2 que se describe en este documento, que logra una inhibicion media maxima de la funcion o actividad medida) se determine. s Eegnú cnultivo celular, o en un modelo animal apropiado. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento. Los efectos de cualquier dosis particular pueden controlarse mediante un bioensayo adecuado. La dosis puede ser determinada por un medico y ajustada, según sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad renal cronica, aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de un inhibidor de ROBO2 descrito en este documento es un intervalo de dosificacion candidato inicial para la administracion al sujeto, ya sea, por ejemplo, mediante una o mas administraciones separadas, o por infusion continua.
Modos de Administracion
Los inhibidores de ROBO2 o los tratamientos combinados de los mismos descritos en este documento pueden administrarse a un sujeto que lo necesite por cualquier vfa apropiada que de como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto. Como se usa en este documento, los terminos "administrar" e "introducir" se usan de manera intercambiable y se refieren a la colocacion de un inhibidor de ROBO-2 en un sujeto mediante un metodo o ruta que resulta en una localizacion al menos parcial de dichos agentes en un sitio deseado, de tal manera que se produzca un efecto o efectos deseados.
En algunas realizaciones, el inhibidor de ROBO2 se administra a un sujeto que tiene una enfermedad renal cronica mediante cualquier modo de administracion que administre el agente sistemicamente o a una superficie o objetivo deseado, y puede incluir, pero no se limita a, administracion por inyeccion, infusion, instilacion e inhalacion. En la medida en que los agentes polipeptfdicos puedan protegerse de la inactivacion en el intestino, tambien se contemplan formas de administracion oral. "Inyeccion" incluye, sin limitacion, inyeccion e infusion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardfaca, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcutanea, subcutanea, subcuticular, intracapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal, e intraesternal. En algunas realizaciones, los inhibidores de ROBO-2 para uso en los metodos descritos en el presente documento se administran mediante infusion o inyeccion intravenosa.
Las frases "administracion parenteral" y "administrada parenteralmente" como se usan en este documento, se refieren a modos de administracion distintos a la administracion enteral y topica, usualmente por inyeccion. Las frases "administracion sistemica", "administrada sistemicamente", "administracion periferica" y "administrada perifericamente" como se usan en este documento se refieren a la administracion del inhibidor de ROBO-2, que no sea directamente en un sitio objetivo, tejido u organo, como un sitio tumoral, de modo que ingrese al sistema circulatorio del sujeto y, por lo tanto, este sujeto al metabolismo y otros procesos similares.
Para el uso clfnico de los metodos descritos en el presente documento, la administracion de los inhibidores de ROBO-2 descritos en el presente documento puede incluir una formulacion en composiciones farmaceuticas o formulaciones farmaceuticas para administracion parenteral, por ejemplo, por vfa intravenosa; mucosa, por ejemplo, intranasal; ocular, u otro modo de administracion. En algunas realizaciones, los inhibidores de ROBO-2 descritos en el presente documento pueden administrarse junto con cualquier compuesto portador, material o composicion farmaceuticamente aceptable que de como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto. Por lo tanto, una formulacion farmaceutica para uso en los metodos descritos en este documento puede contener un inhibidor de ROBO-2, como se describe en este documento, en combinacion con uno o mas ingredientes farmaceuticamente aceptables.
La frase "farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificacion que son, dentro del alcance del buen juicio medico, adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica u otro problema o complicacion, proporcional a una relacion razonable de riesgo/beneficio. La frase "portador farmaceuticamente aceptable" como se usa en este documento significa un material, composicion o vehfculo farmaceuticamente aceptable, tal como un relleno lfquido o solido, diluyente, excipiente, solvente, medio, material de encapsulacion, auxiliar de fabricacion (por ejemplo, lubricante, talco, estearato de magnesio, calcio o zinc, o acido esterico), o material de encapsulacion de disolvente, involucrado en el mantenimiento de la estabilidad, solubilidad o actividad de un inhibidor de ROBO-2. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehfculos farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidon de mafz y almidon de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (8) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de mafz y aceite de soja; (9) glicoles, tales como propilenglicol; (10) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol (PEG); (11) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (12) agar; (13) agentes reguladores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (14) acido algfnico; (15) agua libre de pirogenos; (16) solucion salina isotonica; (17) solucion de Ringer; (19) soluciones reguladas de pH; (20) poliesteres, policarbonatos y/o polianhfdridos; (21) agentes de relleno, como polipeptidos y aminoacidos (22) componentes sericos, como albumina serica, HDL y LDL; (23) alcoholes C2-C12, tales como etanol; y (24) otras sustancias compatibles no toxicas empleadas en formulaciones farmaceuticas. Los agentes liberadores, agentes de recubrimiento, conservantes y antioxidantes tambien pueden estar presentes en la formulacion. Los terminos tales como "excipiente", "portador", "portador farmaceuticamente aceptable" o similares se usan indistintamente en este documento.
Los inhibidores de ROBO-2 descritos en el presente documento pueden formularse especialmente para la administracion del compuesto a un sujeto en forma solida, liquida o de gel, incluidos los adaptados para lo siguiente: (1) administracion parenteral, por ejemplo, por via subcutanea, intramuscular, inyeccion intravenosa o epidural como, por ejemplo, una solucion o suspension esteril, o formulacion de liberacion sostenida; (2) aplicacion topica, por ejemplo, como una crema, unguento o un parche o aerosol de liberacion controlada que se aplica sobre la piel; (3) por via intravaginal o intrarrectal, por ejemplo, como pesario, crema o espuma; (4) ocularmente; (5) transdermicamente; (6) transmucosa; o (79) por via nasal. Ademas, un inhibidor de ROBO-2 puede implantarse en un paciente o inyectarse utilizando un sistema de administracion de medicamentos. Vease, por ejemplo, Urquhart, y colaboradores, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, Nueva York, 1981); Patente de Estados Unidos N° 3.773.919; y la patente de Estados Unidos N° 353.270.960.
A continuacion se describen realizaciones adicionales de las formulaciones y modos de administracion de las composiciones que comprenden los inhibidores de ROBO-2 descritos en el presente documento, que pueden usarse en los metodos descritos en el presente documento.
Formas de dosificacion parenteral. Las formas de dosificacion parenteral de los inhibidores de ROBO-2 tambien pueden administrarse a un sujeto con una afeccion renal cronica por varias vias, que incluyen, entre otras, subcutanea, intravenosa (incluida la inyeccion de bolos), intramuscular e intraarterial. Dado que la administracion de formas de dosificacion parenteral por lo general evita las defensas naturales del paciente contra los contaminantes, las formas de dosificacion parenteral son preferiblemente esteriles o pueden esterilizarse antes de la administracion a un paciente. Los ejemplos de formas de dosificacion parenteral incluyen, pero no se limitan a, soluciones listas para inyeccion, productos secos listos para disolverse o suspendidos en un vehiculo farmaceuticamente aceptable para inyeccion, suspensiones listas para inyeccion, formas de dosificacion parenteral de liberacion controlada y emulsiones.
Los expertos en la tecnica conocen bien los vehiculos adecuados que pueden usarse para proporcionar formas de dosificacion parenteral de la divulgacion. Los ejemplos incluyen, sin limitacion: agua esteril; agua para inyeccion USP; solucion salina; solucion de glucosa; vehiculos acuosos tales como, entre otros, inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer, inyeccion de dextrosa, inyeccion de dextrosa y cloruro de sodio e inyeccion de Ringer lactato; vehiculos miscibles con agua tales como, pero sin limitacion, alcohol etilico, polietilenglicol y propilenglicol; y vehiculos no acuosos tales como, pero no limitados a, aceite de maiz, aceite de semilla de algodon, aceite de cacahuete, aceite de sesamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.
En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un inhibidor de ROBO2 se formulan para ser adecuadas para la administracion oral, por ejemplo, como formas de dosificacion discretas, tales como, entre otras, comprimidos (incluidos, sin limitacion, comprimidos marcados o recubiertos), pildoras, capsulas para chupar, capsulas, comprimidos masticables, paquetes de polvo, capsulas lisas, trociscos, obleas, aerosoles o liquidos, tales como, entre otros, jarabes, elixires, soluciones o suspensiones en un liquido acuoso, un liquido no acuoso, una emulsion de aceite en agua o una emulsion de agua en aceite. Dichas composiciones contienen una cantidad predeterminada de la sal farmaceuticamente aceptable de los compuestos descritos, y pueden prepararse por metodos farmaceuticos bien conocidos por los expertos en la tecnica. Vease en general, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18s edicion, Mack Publishing, Easton, Pa. (1990).
Debido a su facilidad de administracion, los comprimidos y las capsulas representan las formas unitarias de dosis orales solidas mas ventajosas, en cuyo caso se utilizan excipientes farmaceuticos solidos. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con tecnicas estandar acuosas o no acuosas. Estas formas de dosificacion se pueden preparar por cualquiera de los metodos de la farmacia. En general, las composiciones farmaceuticas y las formas de dosificacion se preparan mezclando de manera uniforme e intima el ingrediente o ingredientes activos con vehiculos liquidos, vehiculos solidos finamente divididos, o ambos, y luego moldeando el producto en la presentacion deseada si es necesario. En algunas realizaciones, las formas de dosificacion oral no se usan para el agente antibiotico.
Las formas de dosificacion oral tipicas de las composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un inhibidor de ROBO2 se preparan combinando la sal farmaceuticamente aceptable del inhibidor de ROBO2 en una mezcla intima con al menos un excipiente de acuerdo con tecnicas de composicion farmaceutica convencionales. Los excipientes pueden tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de la composicion deseada para la administracion. Por ejemplo, los excipientes adecuados para uso en formas de dosis orales liquidas o en aerosol incluyen, pero no se limitan a, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes y agentes colorantes. Los ejemplos de excipientes adecuados para uso en formas de dosificacion oral solidas (por ejemplo, polvos, comprimidos, capsulas y comprimidos) incluyen, entre otros, almidones, azucares, celulosa microcristalina, caolin, diluyentes, agentes de granulacion, lubricantes, ligantes y agentes desintegrantes.
Los aglutinantes adecuados para uso en las formulaciones farmaceuticas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, almidon de maiz, almidon de patata u otros almidones, gelatina, gomas naturales y sinteticas tales como acacia, alginato de sodio, acido alginico, otros alginatos, tragacanto en polvo, goma guar, celulosa y sus derivados (por ejemplo, etilcelulosa, acetato de celulosa, carboximetilcelulosa calcica, carboximetilcelulosa sodica), polivinilpirrolidona, metilcelulosa, almidon pregelatinizado, hidroxipropil metil celulosa, (por ejemplo, Nos. 2208, 2906, 2910), celulosa microcristalina y mezclas de los mismos.
Los ejemplos de cargas adecuadas para uso en las formulaciones farmaceuticas descritas en el presente documento incluyen, pero no estan limitados a, talco, carbonato de calcio (por ejemplo, granulos o polvo), celulosa microcristalina, celulosa en polvo, dextranos, caolin, manitol, acido silicico, sorbitol, almidon, almidon pregelatinizado y mezclas de los mismos. El aglutinante o la carga en composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento esta presente tipicamente en aproximadamente 50 a aproximadamente 99 por ciento en peso de la composicion farmaceutica.
Los desintegrantes se usan en las formulaciones farmaceuticas orales descritas en el presente documento para proporcionar comprimidos que se desintegran cuando se exponen a un ambiente acuoso. Se debe usar una cantidad suficiente de desintegrante que no sea ni muy escasa ni demasiado para alterar perjudicialmente la liberacion del ingrediente o ingredientes activos para formar formas de dosificacion oral solidas de los inhibidores de ROBO2 descritos en este documento. La cantidad de desintegrante utilizada varia en funcion del tipo de formulacion, y es facilmente discernible para los expertos en la tecnica. Los desintegrantes que se pueden usar para formar formulaciones farmaceuticas orales incluyen, entre otros, agar, acido alginico, carbonato de calcio, celulosa microcristalina, croscarmelosa sodica, crospovidona, polacrilina potasica, almidon glicolato sodico, almidon de patata o tapioca, otros almidones, almidon pregelatinizado, arcillas, otras alginas, otras celulosas, gomas y sus mezclas.
Los lubricantes que pueden usarse para formar formulaciones farmaceuticas orales de los inhibidores de ROBO2 descritos en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a, estearato de calcio, estearato de magnesio, aceite mineral, aceite mineral ligero, glicerina, sorbitol, manitol, polietilenglicol, otros glicoles, acido estearico, laurilsulfato de sodio, talco, aceite vegetal hidrogenado (por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de girasol, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de maiz y aceite de soja), estearato de zinc, oleato de etilo, laurato de etilo, agar, y mezclas de los mismos. Los lubricantes adicionales incluyen, por ejemplo, un gel de silice siloide (AEROSIL® 200, fabricado por WR Grace Co. de Baltimore, Md.), un aerosol coagulado de silice sintetica (comercializado por Degussa Co. de Piano, Tex.), CAB O-SIL® (un producto de dióxido de silicio pirogeno vendido por Cabot Co. de Boston, Mass.), y mezclas de los mismos. Si se usan, los lubricantes se usan tipicamente en una cantidad de menos de aproximadamente 1 por ciento en peso de las composiciones farmaceuticas o formas de dosificacion en las que se incorporan.
En otras realizaciones, se proporcionan formulaciones farmaceuticas y formas de dosificacion sin lactosa, en las que dichas composiciones contienen preferiblemente poca o ninguna lactosa u otros mono o disacaridos. Como se usa en este documento, el termino "sin lactosa" significa que la cantidad de lactosa presente, si existe, es insuficiente para aumentar sustancialmente la velocidad de degradacion de un ingrediente activo. Las composiciones sin lactosa de la divulgacion pueden comprender excipientes que son bien conocidos en la tecnica y se enumeran en la USP (XXI)/NF (XVI).
Las formulaciones orales de los inhibidores de ROBO2 tambien abarcan, en algunas realizaciones, composiciones farmaceuticas anhidras y formas de dosificacion que comprenden los inhibidores de ROBO2 descritos en el presente documento como ingredientes activos, ya que el agua puede facilitar la degradacion de algunos compuestos. Por ejemplo, la adicion de agua (por ejemplo, 5%) es ampliamente aceptada en las tecnicas farmaceuticas como un medio para simular el almacenamiento a largo plazo con el fin de determinar caracteristicas como la vida util o la estabilidad de las formulaciones a lo largo del tiempo. Vease, por ejemplo, Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2a ed., Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995). Las composiciones farmaceuticas anhidras y las formas de dosificacion descritas en el presente documento pueden prepararse utilizando ingredientes anhidros o que contienen poca humedad y condiciones de baja humedad o baja humedad. Las composiciones farmaceuticas y formas de dosificacion que comprenden lactosa y al menos un ingrediente activo que comprende una amina primaria o secundaria son preferiblemente anhidras si se espera un contacto sustancial con la humedad y/o la humedad durante la fabricacion, envasado y/o almacenamiento. Las composiciones anhidras se envasan preferiblemente utilizando materiales que se sabe que evitan la exposicion al agua, de manera que pueden incluirse en kits de formulaciones adecuadas. Los ejemplos de envases adecuados incluyen, entre otros, laminas hermeticamente selladas, plasticos, recipientes de dosis unitaria (por ejemplo, viales) con o sin desecantes, envases blister y envases de tiras.
Formulaciones en aerosol. Un inhibidor de ROBO-2 puede envasarse en un contenedor de aerosol presurizado junto con propelentes adecuados, por ejemplo, propelentes de hidrocarburos tales como propano, butano o isobutano con adyuvantes convencionales. Un inhibidor de ROBO-2 tambien se puede administrar en una forma no presurizada, tal como en un nebulizador o atomizador. Un inhibidor de ROBO-2 tambien se puede administrar directamente a las vias respiratorias en forma de polvo seco, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador.
Las composiciones en polvo adecuadas incluyen, a modo de ilustracion, preparaciones en polvo de un inhibidor de ROBO-2, completamente entremezcladas con lactosa, u otros polvos inertes aceptables para la administracion intrabronquial. Las composiciones en polvo pueden administrarse a traves de un dispensador de aerosol o encerradas en una capsula rompible que puede ser insertada por el sujeto en un dispositivo que pincha la capsula y expulsa el polvo en una corriente constante adecuada para inhalacion. Las composiciones pueden incluir propelentes, surfactantes y codisolventes y pueden llenarse en recipientes de aerosol convencionales que estan cerrados por una valvula dosificadora adecuada.
Los aerosoles para el suministro al tracto respiratorio son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Adjei, A. y Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. y Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995); Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract," en Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990); Anderson y colaboradores, Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)) y tienen potencial para el suministro sistemico de peptidos y proteina igualmente (Patton y Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8: 179-196 (1992)); Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); y Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4: 26-29 (1994); French, D. L., Edwards, D. A. y Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996); Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)); Rudt, S. y R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y, y Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988); Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 101-201995); Patton, J. y Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8: 179-196 (1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990); Patton, J. S., y colaboradores, Controlled Release, 28: 15 79-85 (1994); Damms, B. y Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., y colaboradores, Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995); y Kobayashi, S., y colaboradores, Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996).
Las formulaciones de los inhibidores de ROBO-2 descritos en el presente documento abarcan ademas composiciones farmaceuticas anhidras y formas de dosificacion que comprenden los compuestos descritos como ingredientes activos, ya que el agua puede facilitar la degradacion de algunos compuestos. Por ejemplo, la adicion de agua (por ejemplo, 5%) es ampliamente aceptada en las tecnicas farmaceuticas como un medio para simular el almacenamiento a largo plazo con el fin de determinar caracteristicas como la vida util o la estabilidad de las formulaciones a lo largo del tiempo. Vease, por ejemplo, Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2a ed., Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995). Las composiciones farmaceuticas anhidras y las formas de dosificacion de la divulgacion se pueden preparar usando ingredientes anhidros o que contienen poca humedad y condiciones de humedad baja o bajo contenido de agua. Las composiciones farmaceuticas y formas de dosificacion que comprenden lactosa y al menos un ingrediente activo que comprende una amina primaria o secundaria son preferiblemente anhidras si se espera un contacto sustancial con la humedad y/o el agua durante la fabricacion, envasado y/o almacenamiento. Las composiciones anhidras se envasan preferiblemente utilizando materiales que se sabe que evitan la exposicion al agua, de manera que pueden incluirse en kits de formularios adecuados. Los ejemplos de envases adecuados incluyen, entre otros, laminas hermeticamente selladas, plasticos, recipientes de dosis unitaria (por ejemplo, viales) con o sin desecantes, envases de blister y envases de tiras.
Formas de dosificacion de liberacion controlada y retardada. En algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, se puede administrar un inhibidor de ROBO-2 a un sujeto por medios de liberacion controlada o retardada. Idealmente, el uso de una preparacion de liberacion controlada de diseno optimo en el tratamiento medico se caracteriza porque se emplea un minimo de sustancia farmaceutica para curar o controlar la afeccion en un periodo minimo de tiempo. Las ventajas de las formulaciones de liberacion controlada incluyen: 1) actividad extendida del farmaco; 2) frecuencia de dosificacion reducida; 3) mayor cumplimiento del paciente; 4) uso de menos farmaco total; 5) reduccion de los efectos secundarios locales o sistemicos; 6) minimizacion de la acumulacion de farmacos; 7) reduccion en las fluctuaciones del nivel sanguineo; 8) mejora en la eficacia del tratamiento; 9) reduccion de la potenciacion o perdida de actividad farmacologica; y 10) mejora en la velocidad de control de enfermedades o condiciones. (Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)). Las formulaciones de liberacion controlada se pueden usar para controlar el inicio de accion, la duracion de la accion, los niveles plasmaticos dentro de la ventana terapeutica y los niveles maximos en sangre de un compuesto de formula (I). En particular, se pueden usar formas o formulaciones de dosificacion de liberacion controlada o prolongada para garantizar que se logre la maxima eficacia de un compuesto de formula (I) al mismo tiempo que se minimizan los posibles efectos adversos y problemas de seguridad, que pueden ocurrir tanto a partir de una dosis insuficiente a medicamento (es decir, ir por debajo de los niveles terapeuticos minimos), asi como sobrepasar el nivel de toxicidad para el medicamento.
Se puede adaptar una variedad de formas de dosificacion, formulaciones y dispositivos conocidos de liberacion controlada o extendida para su uso con los inhibidores de ROBO-2 descritos en el presente documento. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las patentes de Estados Unidos N°: 3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3.598.123; 4.008.719; 5.674.533; 5.059.595; 5.591.767; 5.120.548; 5.073.543; 5.639.476; 5.354.556; 5.733.566; y 6.365.185 B1. Estas formas de dosificacion se pueden usar para proporcionar una liberacion lenta o controlada de uno o mas ingredientes activos usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices de polimeros, geles, membranas permeables, sistemas osmoticos (tales como OROS® (Alza Corporation, Mountain View, Calif., Estados Unidos), recubrimientos multicapa, microparticulas, liposomas o microesferas o una combinacion de los mismos para proporcionar el perfil de liberacion deseado en proporciones variables. Ademas, los materiales de intercambio ionico se pueden usar para preparar formas de sales adsorbidas inmovilizadas de los compuestos descritos y, por lo tanto, efectuar la administracion controlada del farmaco. Los ejemplos de intercambiadores de aniones especificos incluyen, entre otros, DUOLITE® A568 y DUOLITE® AP143 (Rohm & Haas, Spring House, Pa., Estados Unidos).
En algunas realizaciones de los metodos descritos en el presente documento, un inhibidor de ROBO-2 para uso en los metodos descritos en este documento se administra a un sujeto mediante liberacion sostenida o en pulsos. La terapia de pulso no es una forma de administracion discontinua de la misma cantidad de una composicion a lo largo del tiempo, sino que comprende la administracion de la misma dosis de la composicion a una frecuencia reducida o la administracion de dosis reducidas. Las administraciones de liberacion sostenida o de pulso son particularmente preferidas cuando el trastorno ocurre continuamente en el sujeto, por ejemplo, cuando el sujeto tiene enfermedad renal cronica. Cada dosis de pulso puede reducirse y la cantidad total de un inhibidor de ROBO-2 descrito en este documento administrada en el transcurso del tratamiento al sujeto o paciente se minimiza.
El intervalo entre pulsos, cuando sea necesario, puede ser determinado por un experto en la tecnica. A menudo, el intervalo entre pulsos puede calcularse administrando otra dosis de la composicion cuando la composicion o el componente activo de la composicion ya no es detectable en el sujeto antes de la administracion del siguiente pulso. Los intervalos tambien pueden calcularse a partir de la vida media in vivo de la composicion. Los intervalos pueden calcularse como mayores que la vida media in vivo, o 2, 3, 4, 5 e incluso 10 veces mayores que la vida media de la composicion. Diversos metodos y aparatos para composiciones pulsantes por infusion u otras formas de administracion al paciente se describen en las patentes de Estados Unidos N° 4.747.825; 4.723.958; 4.948.592; 4.965.251 y 5.403.590.
En algunas realizaciones, pueden prepararse preparaciones de liberacion sostenida que comprenden el inhibidor de ROBO-2. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrofobos solidos que contienen el inhibidor, en las cuales las matrices estan en forma de articulos conformados, por ejemplo, peliculas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinilico)), polilactidos (patente de Estados Unidos N° 3.773.919), copolimeros de acido L-glutamico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolimeros de acido lactico-acido glicolico degradables tales como el LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas de copolimero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida) y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico.
Las formulaciones que comprenden los inhibidores de ROBO-2 a usar para la administracion in vivo son preferiblemente esteriles. Esto se logra facilmente mediante filtracion a traves, por ejemplo, de membranas de filtracion esteriles y otros metodos conocidos por los expertos en la tecnica.
Tambien se proporcionan en este documento, en algunos aspectos, ensayos, metodos y sistemas para determinar si un individuo tiene una enfermedad renal cronica o una predisposicion para una enfermedad renal cronica o proteinuria con base en los perfiles de expresion o información de secuencia de ROBO2 como un biomarcador indicativo de enfermedad renal cronica o una predisposicion por una enfermedad renal cronica o proteinuria. Como se demuestra en el presente documento, ROBO2 es util como biomarcador para identificar a un sujeto con enfermedad renal cronica o con alto riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria o para monitorear los efectos del tratamiento sobre la progresion de la enfermedad renal cronica o proteinuria.
Como se usa en el presente documento, un "biomarcador" se refiere a una biomolecula organica que esta presente diferencialmente en una muestra tomada de un sujeto de un estado fenotipico (por ejemplo, que tiene una enfermedad) en comparacion con otro estado fenotipico (por ejemplo, que no tiene la enfermedad). Un biomarcador esta presente diferencialmente entre diferentes estados fenotipicos si se calcula que la media o mediana del nivel de expresion del biomarcador en los diferentes grupos es estadisticamente significativo. Las pruebas comunes de significancia estadistica incluyen, entre otras, la prueba t, ANOVA, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney y la razon de probabilidades. Los biomarcadores, solos o en combinacion, proporcionan medidas de riesgo relativo de que el sujeto a pertenece a un estado fenotipico u otro. Como tales, son utiles como marcadores para la enfermedad (diagnostico), la eficacia terapeutica de un farmaco (teranosticos) y la toxicidad del farmaco.
La expresion de ROBO2 para uso en los ensayos descritos en el presente documento puede detectarse mediante cualquier metodo adecuado, incluida la deteccion de los niveles de proteina o la deteccion de los niveles de expresion de ARNm. El polipeptido ROBO2 se puede detectar en cualquier forma que se pueda encontrar en una muestra biologica obtenida de un sujeto, o en cualquier forma que pueda resultar de la manipulacion de la muestra biologica (por ejemplo, como resultado del procesamiento de la muestra). Las formas modificadas de ROBO2 pueden incluir proteinas modificadas que son un producto de variantes alelicas, variantes de empalme, modificacion postraduccional (por ejemplo, glicosilacion, escision proteolitica (por ejemplo, fragmentos de una proteina original), glicosilacion, fosforilacion, lipidacion, oxidacion, metilacion, cisteinilacion, sulfonacion, acetilacion y similares), oligomerizacion, desoligomerizacion (para separar monomeros de una forma multimerica de la proteina), desnaturalizacion y similares.
Los ensayos descritos en el presente documento pueden disenarse para detectar todas las formas o formas particulares de ROBO2. Cuando se desee, la diferenciacion entre diferentes formas de ROBO2, por ejemplo, diferentes isoformas, se puede lograr mediante el uso de metodos de deteccion que dependen de las caracteristicas fisicas que difieren entre las formas, por ejemplo, diferente peso molecular, diferente tamano molecular, presencia/ausencia de diferentes epitopos, y similares.
Por consiguiente, se proporcionan en este documento, en algunos aspectos, ensayos para el diagnostico de un sujeto que tiene enfermedad renal cronica o riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, comprendiendo el ensayo: medir el nivel de proteina o acido nucleico de ROBO2 en una muestra biologica obtenida del sujeto, en donde si el nivel de ROBO2 en la muestra biologica del sujeto esta en el mismo nivel o mayor que (por ejemplo, mayor que por una cantidad estadisticamente significativa) un nivel de referencia de umbral para ROBO2, el sujeto probablemente esta en riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria o tiene enfermedad renal cronica. Por ejemplo, un aumento en el nivel de ROBO2 en mas de aproximadamente el 10%, o mas de aproximadamente el 20%, o mas de aproximadamente el 30%, o mas de aproximadamente el 40%, o mas de aproximadamente el 50%, o mas de aproximadamente el 60%, o mas, en comparacion con un nivel de umbral de referencia de ROBO2. En algunas realizaciones, el aumento en el nivel de ROBO2 es al menos una desviacion estandar mayor que, o al menos dos desviaciones estandar, o mas, mayor que una mediana o nivel de umbral de referencia promedio de ROBO2. Dichos niveles de referencia de la mediana o la media de ROBO2 pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de cinco o mas muestras obtenidas de sujetos que no tienen enfermedad renal cronica o proteinuria, o de cinco o mas muestras obtenidas del mismo sujeto en diferentes puntos de tiempo.
En algunas realizaciones de estos ensayos, la cantidad de ROBO2 medida en una muestra biologica se compara con un nivel de umbral de referencia, o una muestra biologica de referencia, tal como una muestra biologica obtenida de un control normal de la misma edad (por ejemplo, un sujeto de la misma edad que no tiene riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, o un sujeto sano, por ejemplo, un individuo sano.
En algunas realizaciones, los ensayos, sistemas y kits como se describe en el presente documento tambien son utiles para controlar un curso de tratamiento que se administra a un sujeto. Por ejemplo, uno puede medir el nivel de ROBO2 en una muestra biologica en el sujeto en un primer punto de tiempo (por ejemplo, t1) y comparar con el nivel de umbral de referencia del biomarcador ROBO2, y si el nivel medido para ROBO2 es el mismo o mayor que el nivel de referencia, al sujeto se le puede administrar un tratamiento o regimen terapeutico apropiado para retrasar o reducir la aparicion de enfermedad renal cronica o proteinuria, por ejemplo, aumentar el ejercicio, reducir la presion cardiaca, ajustar la dieta, etc. como se describe en los metodos de este documento, y luego el nivel del panel de la proteina biomarcadora ROBO2 se puede medir en un segundo (por ejemplo, t2) y puntos de tiempo subsiguientes (por ejemplo, t3, t4, t5, t5...etc.), y se puede comparar con los niveles de tROBO2 en uno o mas puntos de tiempo (por ejemplo, en t1 o cualquier otro punto de tiempo posterior) o los umbrales de referencia de ROBO2 para determinar si el tratamiento terapeutico o tratamiento o regimen medico para el tratamiento para reducir el riesgo, retrasar o reducir la aparicion de enfermedad renal cronica o proteinuria es efectiva. En algunas de tales realizaciones, los ensayos, sistemas y kits que se describen en el presente documento se pueden usar para monitorear un tratamiento terapeutico en un sujeto sintomatico (por ejemplo, un sujeto que se sabe que tiene enfermedad renal cronica o proteinuria), donde un tratamiento eficaz puede ser una disminucion de ROBO2 en el sujeto, o alternativamente los ensayos, sistemas y kits como se describe en el presente documento se pueden usar para monitorear el efecto del tratamiento profilactico en un sujeto asintomatico (por ejemplo, para prevenir la enfermedad renal cronica o proteinuria que ocurre en un sujeto), por ejemplo, donde se ha identificado que el sujeto tiene riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria de acuerdo con los metodos descritos en este documento, u otros conocidos en la tecnica, o debido a razones hereditarias, por ejemplo.
El termino "muestra" como se usa en el presente documento generalmente se refiere a cualquier material que contenga acido nucleico, ya sea ADN o ARN, o aminoacidos. En general, dicho material estara en forma de muestra de sangre, muestra de heces, muestra de tejido, celulas, bacterias, seccion de histologia o frotis bucal. Las muestras pueden prepararse, por ejemplo, pueden ser frescas, fijas, congeladas o incrustadas en parafina. El termino "muestra biologica" como se usa en el presente documento se refiere a una celula o poblacion de celulas o una cantidad de tejido o fluido de un sujeto. La mayoria de las veces, la muestra se ha extraido de un sujeto, pero el termino "muestra biologica" tambien puede referirse a las celulas o tejidos analizados in vivo, es decir, sin eliminacion del sujeto. A menudo, una "muestra biologica" contendra celulas del animal, pero el termino tambien puede referirse a material biologico no celular, como las fracciones no celulares de sangre, saliva u orina, que pueden usarse para medir los niveles de expresion genica. Las muestras biologicas incluyen, pero no se limitan a, biopsias de tejidos, raspados, sangre total, plasma, suero, orina, saliva, cultivo celular o liquido cefalorraquideo. Las muestras biologicas tambien incluyen biopsias de tejidos, cultivos celulares. Una muestra biologica o muestra de tejido puede referirse a una muestra de tejido o liquido aislado de un individuo, que incluye, entre otros, orina, sangre, plasma, suero, biopsia de rinon, heces, esputo, liquido cefalorraquideo, liquido pleural, aspiracion del pezon, liquido linfatico, las secciones externas de la piel, tracto respiratorio, intestinal y genitourinario, lagrimas, saliva, leche, celulas (incluidas, entre otras, celulas sanguineas), tumores, organos y tambien muestras de un constituyente de cultivo celular in vitro. Constituyente de la cultura. En algunas realizaciones, cuando se obtiene una muestra de orina, la muestra de orina se centrifuga para sedimentar las celulas renales, en las que se pueden realizar los ensayos y metodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la muestra es de una biopsia de rinon, tal como una biopsia con aguja gruesa de un rinon o una porcion del mismo, tal como una muestra de podocitos. Ademas, se utilizan muestras de aspirado con aguja fina. En algunas realizaciones, las muestras biologicas pueden prepararse, por ejemplo, las muestras biologicas pueden ser frescas, fijadas, congeladas o embebidas en parafina. La muestra se puede obtener retirando una muestra de celulas de un sujeto, pero tambien se puede lograr usando celulas previamente aisladas (por ejemplo, aisladas por otra persona), o realizando los metodos descritos en el presente documento in vivo.
El termino "expresion", como se usa en el presente documento, se refiere de manera intercambiable a la expresion de un polipeptido o proteina o la expresion de un polinucleotido o la expresion de un gen. La expresion tambien se refiere a la expresion de proteinas modificadas previamente a la traduccion y modificadas posteriormente a la traduccion, asi como a la expresion alternativamente de moleculas pre-ARNm, moleculas de ARNm empalmadas y maduras. La expresion de un polinucleotido se puede determinar, por ejemplo, midiendo la produccion de moleculas de transcripcion de ARN, por ejemplo, niveles de transcripcion de a Rn mensajero (ARNm). La expresion de una proteina o polipeptido se puede determinar, por ejemplo, mediante inmunoensayo utilizando un anticuerpo o anticuerpos que se unen con el polipeptido. El termino "codificar" tal como se aplica a los polinucleotidos se refiere a un polinucleotido que se dice que "codifica" un polipeptido o proteina si, en su estado nativo o cuando se manipula mediante metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica, puede transcribirse para producir el ARN que se puede traducir en una secuencia de aminoacidos para generar el polipeptido y/o un fragmento del mismo. La cadena antisentido es el complemento de dicho acido nucleico, y la secuencia codificante se puede deducir de el. El termino "expresado de forma endogena" o "expresion endogena" se refiere a la expresion de un producto genico a niveles normales y bajo regulacion normal para ese tipo de celula.
Los metodos de deteccion que se pueden usar con los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento para medir los niveles de proteina o acido nucleico de ROBO2 en una muestra o muestra biologica incluyen metodos opticos, metodos electroquimicos (tecnicas de voltametria y amperometria), microscopia de fuerza atomica, y metodos de radiofrecuencia, por ejemplo, espectroscopia de resonancia multipolar. Los metodos opticos incluyen microscopia, tanto confocal como no confocal, deteccion de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia y birrefringencia o indice de refraccion (por ejemplo, resonancia de plasmon de superficie, elipsometria, un metodo de espejo resonante, un metodo de guia de onda de acoplamiento de rejilla o interferometria).
En aquellas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento en los que se determina el nivel de proteina ROBO2, tal como, por ejemplo, el nivel de una proteina de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, se puede usar cualquier enfoque proteomico comunmente conocido por personas con experiencia ordinaria en la tecnica para medir el nivel de proteinas biomarcadoras en una muestra biologica. La medicion puede ser cuantitativa o cualitativa, siempre que la medicion sea capaz de determinar o indicar si el nivel de proteina ROBO2 en la muestra biologica es igual, superior o inferior a un valor umbral de referencia para la proteina ROBO2.
El nivel medido de proteina ROBO2 puede, en algunas realizaciones, ser una medida primaria del nivel de proteina ROBO2 que mide la cantidad de proteina ROBO2 en si, tal como mediante la deteccion del numero de moleculas de proteina ROBO2 en la muestra) o puede ser, en algunas realizaciones, una medida secundaria de la proteina ROBO2 (una medida a partir de la cual la cantidad de proteina ROBO2 se puede deducir, pero no necesariamente, como una medida de la actividad funcional o una medida de acido nucleico, tal como el ARNm, que codifica la proteina ROBO2). Los datos cualitativos tambien pueden derivarse u obtenerse de mediciones primarias.
En algunas realizaciones de los ensayos y metodos descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 pueden medirse utilizando una tecnologia de medicion basada en afinidad. "Afinidad" como se refiere a un anticuerpo es un termino bien entendido en la tecnica y significa el grado, o fuerza, de union del anticuerpo al companero de union, tal como un biomarcador como se describe en el presente documento (o epitopo del mismo). La afinidad se puede medir y/o expresar de varias formas conocidas en la tecnica, que incluyen, entre otras, la constante de disociacion en equilibrio (Kd o Kd), la constante de disociacion en equilibrio aparente (Kd. o Kd) y la IC50 (cantidad necesaria para efectuar una inhibicion del 50% en un ensayo de competicion; se usan de manera intercambiable en este documento con "150"). Se entiende que, para los fines de esta invencion, una afinidad es una afinidad promedio para una poblacion dada de anticuerpos que se unen a un epitopo.
La tecnologia de medicion basada en afinidad utiliza una molecula que se une especificamente a la proteina biomarcadora que se esta midiendo (un "reactivo de afinidad", como un anticuerpo o aptamero), aunque tambien pueden utilizarse otras tecnologias, como las tecnologias basadas en espectroscopia (por ejemplo, desorcion/ionizacion laser asistida por matriz-tiempo de vuelo, espectroscopia MALDI-TOF) o ensayos que miden la bioactividad (por ejemplo, ensayos que miden la mitogenicidad de los factores de crecimiento). Las tecnologias basadas en afinidad para el uso con los ensayos y metodos descritos en el presente documento pueden incluir ensayos basados en anticuerpos (inmunoensayos) y ensayos que utilizan aptameros (moleculas de acido nucleico que se unen especificamente a otras moleculas), tales como ELONa . Ademas, tambien se contemplan ensayos que utilizan tanto anticuerpos como aptameros (por ejemplo, un ensayo en formato en sandwich que utiliza un anticuerpo para la captura y un aptamero para la deteccion). Una amplia variedad de ensayos basados en afinidad tambien se conoce en la tecnica.
Los ensayos basados en afinidad tipicamente utilizan al menos un epitopo derivado de la proteina biomarcadora, es decir, ROBO2, y muchos formatos de ensayo basados en afinidad utilizan mas de un epitopo (por ejemplo, dos o mas epitopos estan involucrados en los ensayos de formato en "sandwich"; al menos un epitopo se usa para capturar la proteina biomarcadora, y al menos un epitopo diferente se usa para detectar el marcador).
Los ensayos basados en afinidad pueden estar en formatos de reaccion directa o de competicion, utilizar formatos de tipo sandwich y ademas pueden ser heterogeneos (por ejemplo, utilizar soportes solidos) u homogeneos (por ejemplo, tienen lugar en una sola fase) y/o utilizar inmunoprecipitacion. Muchos ensayos implican el uso de reactivo de afinidad marcado (por ejemplo, anticuerpo, polipeptido o aptamero); Las etiquetas pueden ser, por ejemplo, moleculas enzimaticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o colorantes. Tambien se conocen los ensayos que amplifican las senales de la sonda; ejemplos de los cuales son ensayos que utilizan biotina y avidina, e inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, como los ensayos ELISA y ELONA. Por ejemplo, las concentraciones de biomarcadores de muestras de fluidos biologicos se pueden medir mediante el ensayo LUMINEX® o ELISA. Cualquiera de los biomarcadores o reactivos especificos para el biomarcador se puede unir a una superficie y los niveles se pueden medir directa o indirectamente.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 pueden medirse utilizando una tecnologia de medicion basada en afinidad de inmunoensayo.
Las tecnologias de inmunoensayo pueden incluir cualquier tecnologia de inmunoensayo que pueda medir cuantitativa o cualitativamente el nivel de proteina ROBO2 en una muestra biologica. Las tecnologias de inmunoensayo adecuadas incluyen, pero no se limitan a radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos en "sandwich", ensayos inmunoradiometricos, ensayos de inmunodifusion, inmunoensayos in situ (utilizando etiquetas coloidales de oro, enzimas o radioisotopos, por ejemplo), analisis de transferencia Western, inmunoprecipitaciones, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de inmunoelectroforesis, ensayos de fluoroinmunoensayo (FiA), ensayos de inmunorradiometria (IRMA), ensayos de inmunoenzimometria (IEMA), ensayos de inmunoluminiscencia y ensayos de inmunofluorescencia (Madersbacher S, Berger P. Antibodies and immunoassays. Methods 2000;21:41-50), ensayo quimioluminiscente, inmuno-PCR y ensayo de transferencia Western. Del mismo modo, los ensayos basados en aptameros que pueden medir cuantitativa o cualitativamente el nivel de un biomarcador en una muestra biologica se pueden usar en los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento. En general, los aptameros pueden sustituirse por anticuerpos en casi todos los formatos de inmunoensayo, aunque los aptameros permiten formatos de ensayo adicionales (como la amplificacion de aptameros unidos utilizando tecnologia de amplificacion de acido nucleico tal como la PCR (patente de Estados Unidos N° 4.683.202) o la amplificacion isotermica con cebadores compuestos (patentes de Estados Unidos N° 6.251.639 y 6.692.918).
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, en los que los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando una tecnologia de medicion basada en afinidad de inmunoensayo, el inmunoensayo se realiza midiendo el grado de interaccion proteina/anticuerpo de la interaccion biomarcador/ anticuerpo. Se puede usar cualquier metodo conocido de inmunoensayo.
En algunas realizaciones, un companero de union, por ejemplo, un anticuerpo o un ligando que se une a la proteina ROBO2 en el ensayo de union, es preferiblemente un companero de union especifico marcado, pero no necesariamente un anticuerpo. El companero de enlace generalmente se marca a si mismo, pero alternativamente puede detectarse por una reaccion secundaria en la que se genera una senal, por ejemplo, de otra sustancia marcada.
Por lo tanto, el anticuerpo que se une especificamente a la proteina ROBO2 se puede usar en los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento para determinar la presencia y/o cantidad de la proteina ROBO2 en una muestra biologica, que se puede usar para detectar el aumento o disminucion de la concentracion de proteina ROBO2 presente en una muestra diagnostica. Dichos anticuerpos pueden generarse por cualquiera de los metodos bien conocidos en el campo de los inmunodiagnosticos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos anti-proteina ROBO2 para cualquier estado biologicamente relevante de la proteina. Asi, por ejemplo, podrian elevarse contra la forma no glicosilada de la proteina ROBO2, que existe en el cuerpo en forma glicosilada, o contra un peptido que porta un epitopo relevante de la proteina ROBO2.
En algunas realizaciones de estos ensayos, metodo y sistemas, se puede usar una forma de ensayo amplificada, por lo que se produce una "senal" mejorada a partir de un nivel relativamente bajo de proteina a detectar. Una forma particular de un inmunoensayo amplificado es un ensayo quimioluminiscente mejorado. Por ejemplo, el anticuerpo esta marcado con peroxidasa de rabano picante, que participa en una reaccion quimioluminiscente con luminol, un sustrato de peróxido y un compuesto que potencia la intensidad y la duracion de la luz emitida, tipicamente el 4-yodofenol o el acido 4-hidroxicinamico.
En algunas realizaciones de estos ensayos, metodo y sistemas, se puede usar un inmunoensayo amplificado que comprende inmuno-PCR. En esta tecnica, el anticuerpo esta unido covalentemente a una molecula de ADN arbitrario que comprende cebadores de PCR, por lo que el ADN con el anticuerpo unido a el se amplifica por la reaccion en cadena de la polimerasa. Vease E. R. Hendrickson y colaboradores, Nucleic Acids Research 23: 522-529 (1995).
Por consiguiente, en todas las realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, el nivel de proteina ROBO2 se puede determinar utilizando un agente de union a proteinas, tambien denominado en el presente documento "entidad de union a proteinas" o se puede utilizar un "reactivo de afinidad", en particular, anticuerpos. Por ejemplo, los reactivos de afinidad, en particular, los anticuerpos tales como los anticuerpos antibiomarcadores se pueden usar en un inmunoensayo, particularmente en un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). En realizaciones en las que el nivel de una proteina biomarcadora se puede medir en una muestra biologica usando metodos comunmente conocidos en la tecnica, y que incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse a, escision quimica o enzimatica de isoformas, proteinas, isoformas, inmunotransferencias, analisis inmunohistoquimico, ELISA, y espectrometria de masas.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando el "ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)". ELISA es una tecnica para detectar y medir la concentracion de un antigeno utilizando una forma marcada (por ejemplo, ligada a enzimas) del anticuerpo. Existen diferentes formas de ELISA, que son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Las tecnicas estandar conocidas en la tecnica para ELISA se describen en "Methods in Immunodiagnosis", 2a Edicion, Rose y Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell y colaboradores, "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964; y Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22: 895-904.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando un ensayo ELISA de tipo sandwich. En un "ELISA tipo sandwich", un anticuerpo (por ejemplo, un anti-enzima) se enlaza a una fase solida (es decir, una placa de microtitulacion) y se expone a una muestra biologica que contiene antigeno (por ejemplo, una enzima). La fase solida se lava luego para eliminar el antigeno no unido. Un anticuerpo marcado (por ejemplo, ligado a una enzima) se une al antigeno unido (si esta presente) formando un sandwich anticuerpo-antigeno-anticuerpo. Por consiguiente, utilizando este metodo, un primer anticuerpo para la proteina ROBO2 se une a la fase solida, tal como un pozo de una placa de microtitulacion de plastico, y se incuba con la muestra y con un segundo anticuerpo marcado especifico para la proteina ROBO2 que se va a analizar. Ejemplos de enzimas que pueden unirse al anticuerpo son la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rabano picante, la luciferasa, la ureasa y la B-galactosidasa. El anticuerpo unido a la enzima reacciona con un sustrato para generar un producto de reaccion coloreado que se puede medir.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando un ensayo de captura de anticuerpos o un ELISA competitivo. En un "ELISA competitivo", el anticuerpo se incuba con una muestra que contiene antigeno (es decir, enzima). La mezcla antigenoanticuerpo luego se pone en contacto con una fase solida (por ejemplo, una placa de microtitulacion) que esta recubierta con antigeno (es decir, enzima). Cuanto mas antigeno este presente en la muestra, menor sera el anticuerpo libre que estara disponible para unirse a la fase solida. Luego se agrega un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, unido a una enzima) a la fase solida para determinar la cantidad de anticuerpo primario unido a la fase solida. Por consiguiente, en algunas de tales realizaciones, se permite que una muestra de prueba biologica se una a una fase solida, y se puede agregar el anticuerpo anti-proteina ROBO2 (por ejemplo, anticuerpos que se unen especificamente a la proteina ROBO2) y dejar que se una. Despues de lavar el material no unido, la cantidad de anticuerpo unido a la fase solida se determina utilizando un segundo anticuerpo marcado, anti- respecto al primero.
En algunas realizaciones de estos ensayos, metodo y sistemas, una etiqueta es preferiblemente una enzima. El sustrato para la enzima puede ser, por ejemplo, formador de color, fluorescente o quimioluminiscente.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando inmunohistoquimica. En un "ensayo de inmunohistoquimica", se analiza una seccion de tejido en busca de proteinas especificas exponiendo el tejido a anticuerpos que son especificos para la proteina que se esta analizando. Luego, los anticuerpos se visualizan mediante cualquiera de varios metodos para determinar la presencia y cantidad de la proteina presente. Ejemplos de metodos utilizados para visualizar anticuerpos son, por ejemplo, a traves de enzimas enlazadas a los anticuerpos (por ejemplo, luciferasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante o beta-galactosidasa), o metodos quimicos (por ejemplo, DAB/sustrato-cromogeno). La muestra luego se analiza microscopicamente, lo mas preferiblemente por microscopia de luz de una muestra tenida con una tincion que se detecta en el espectro visible, utilizando cualquiera de una variedad de tales metodos de tincion y reactivos conocidos por los expertos en la tecnica.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando radioinmunoensayos. Un radioinmunoensayo es una tecnica para detectar y medir la concentracion de un antigeno, es decir, ROBO2, usando una forma del antigeno marcada (por ejemplo, marcada de forma radiactiva o fluorescente). Los ejemplos de marcadores radiactivos para antigenos incluyen 3H, 14C y 125I. La concentracion de ROBO2 en una muestra biologica se mide haciendo que la ROBO2 en la muestra biologica compita con la ROBO2 marcada (por ejemplo, en forma radiactiva) para unirse al anticuerpo para ROBO2. Para asegurar la union competitiva entre el ROBO2 marcada y la ROBO2 no marcada, la ROBO2 marcada esta presente en una concentracion suficiente para saturar los sitios de union del anticuerpo. Cuanto mayor sea la concentracion de ROBO2 en la muestra, menor sera la concentracion de ROBO2 marcada que se unira al anticuerpo.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden usando un ensayo inmunoradiometrico (IRMA). IRMA es un inmunoensayo en el que el reactivo del anticuerpo esta marcado radiactivamente. Un IRMA requiere la produccion de un conjugado de antigeno multivalente, mediante tecnicas como la conjugacion a una proteina, por ejemplo, albumina de suero de conejo (RSA). El conjugado de antigeno multivalente debe tener al menos 2 residuos de antigeno por molecula y los residuos de antigeno deben estar a una distancia suficiente para permitir la union de al menos dos anticuerpos al antigeno. Por ejemplo, en un IRMA, el conjugado de antigeno multivalente se puede unir a una superficie solida tal como una esfera de plastico. El antigeno de "muestra" sin marcar y el anticuerpo con el antigeno que esta marcado radiactivamente se agregan a un tubo de ensayo que contiene la esfera recubierta con conjugado de antigeno multivalente. El antigeno en la muestra compite con el conjugado de antigeno multivalente por los sitios de union del anticuerpo con el antigeno. Despues de un periodo de incubacion apropiado, los reactivos no unidos se eliminan mediante lavado y se determina la cantidad de radioactividad en la fase solida. La cantidad de anticuerpo radiactivo unido es inversamente proporcional a la concentracion de antigeno en la muestra.
Se pueden usar otras tecnicas para detectar el nivel de proteina ROBO2 en una muestra biologica segun la preferencia del medico, y en base a la presente divulgacion y el tipo de muestra biologica (es decir, plasma, orina, muestra de tejido, etc.). Una de tales tecnicas es la transferencia Western (Towbin y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. 76: 4350 (1979)), en la que una muestra tratada adecuadamente se procesa en un gel de SDS-PAGE antes de transferirla a un soporte solido, tal como un filtro de nitrocelulosa. Los anticuerpos anti-ROBO2 marcados de forma detectable o las moleculas de union a proteinas pueden utilizarse para evaluar el nivel de proteina ROBO2, donde la intensidad de la senal de la etiqueta detectable corresponde a la cantidad de proteina ROBO2. Los niveles de la cantidad de proteina ROBO2 presente tambien se pueden cuantificar, por ejemplo, por densitometria.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden usando espectrometria de masas como MALDI/TOF (tiempo de vuelo), SELDI/TOF, cromatografia lfquida-espectrometrfa de masas (LC-MS), cromatografia de gases-espectrometria de masas (GC-MS), cromatografia liquida de alto rendimiento-espectrometria de masas (HPLC-MS), electroforesis capilar-espectrometria de masas, espectrometria de resonancia magnetica nuclear, o espectrometria de masas en tandem (por ejemplo, MS/MS, Ms /Ms /MS, ESI-MS/MS, etc.). Veanse, por ejemplo, las solicitudes de patente de Estados Unidos N°.
20030199001,20030134304,20030077616.
En algunas de tales realizaciones, estas metodologias se pueden combinar con las maquinas, los sistemas informaticos y los medios para producir un sistema automatizado para determinar el nivel de proteina ROBO2 en una muestra biologica y el analisis para producir un informe imprimible que identifique, por ejemplo, el nivel de proteina ROBO2 en una muestra biologica. En algunos casos, la medicion del nivel de ROBO2 se realiza de forma remota desde los modulos de determinacion y comparacion.
Los metodos de espectrometria de masas son bien conocidos en la tecnica y se han utilizado para cuantificar y/o identificar biomoleculas, tales como proteinas (vease, por ejemplo, Li y colaboradores (2000) Tibtech 18: 151-160; Rowley y colaboradores (2000) Methods 20: 383-397; y Kuster y Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400). Ademas, se han desarrollado tecnicas de espectrometria de masas que permiten al menos una nueva secuenciacion parcial de proteinas aisladas. Chait y colaboradores, Science 262: 89-92 (1993); Keough y colaboradores, Proc. Natl Acad Sci. Estados Unidos. 96: 7131-6 (1999); revisado en Bergman, EXS 88: 133-44 (2000).
En ciertas realizaciones, se usa un espectrofotometro de iones en fase gaseosa. En otras realizaciones, se usa para analizar la muestra espectrometria de masas de desorcion con laser/ionizacion. La espectrometria de masas moderna de desorcion con laser /ionizacion ("LDI-MS") se puede practicar en dos variaciones principales: espectrometria de masas de desorcion con laser/ionizacion asistida por matriz ("MALDI"), y desorcion con laser/ionizacion mejorada en la superficie ("SELDI"). En MALDI, el analito se mezcla con una solucion que contiene una matriz, y se coloca una gota del liquido en la superficie de un sustrato. La solucion de la matriz cristaliza conjuntamente entonces con las moleculas biologicas. El sustrato se inserta en el espectrometro de masas. La energía del laser se dirige a la superficie del sustrato donde desorbe y ioniza las moleculas biologicas sin fragmentarlas significativamente. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.118.937 (Hillenkamp y colaboradores), y la patente de Estados Unidos N° 5.045.694 (Beavis & Chait).
En SELDI, la superficie del sustrato se modifica para que sea un participante activo en el proceso de desorcion. En una variante, la superficie se deriva con adsorbentes y/o reactivos de captura que se unen selectivamente a la proteina de interes. En otra variante, la superficie forma derivados con moleculas absorbentes de energía que no se desorben cuando se golpean con el laser. En otra variante, la superficie forma derivados con moleculas que se unen a la proteina de interes y que contienen un enlace fotolitico que se rompe tras la aplicacion del laser. En cada uno de estos metodos, el agente de formacion de derivados generalmente se localiza en una ubicacion especifica en la superficie del sustrato donde se aplica la muestra. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.719.060 y el documento WO 98/59361. Los dos metodos pueden combinarse, por ejemplo, utilizando una superficie de afinidad SELDI para capturar un analito y agregar un liquido que contenga matriz al analito capturado para proporcionar el material absorbente de energía.
Para obtener información adicional con respecto a los espectrometros de masas, consultar, por ejemplo, Principles of Instrumental Analysis, tercera edicion, Skoog, Saunders College Publishing, Filadelfia, 1985; y Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4a ed. Vol. 15 (John Wiley & Sons, Nueva York, 1995), pags. 1071-1094.
La deteccion del nivel de proteina ROBO2 dependera tipicamente de la deteccion de la intensidad de la senal. Esto, a su vez, puede reflejar la cantidad y el caracter de un polipeptido unido al sustrato. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la intensidad de la senal de los valores maximos de los espectros de una primera muestra y una segunda muestra se puede comparar (por ejemplo, visualmente, mediante analisis computarizado, etc.) para determinar las cantidades relativas de biomoleculas particulares. Los programas de software como el programa Biomarker Wizard (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, California) se pueden usar para ayudar a analizar los espectros de masas. Los espectrometros de masas y sus tecnicas son bien conocidos por los expertos en la tecnica.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando tecnicas de electroforesis en gel, en particular SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio), especialmente PAGE bidimensional (2D-PAGE), preferiblemente SDS-PAGE bidimensional (2D-SDS-PAGE). De acuerdo con un ejemplo particular, el ensayo se basa en 2D-PAGE, en particular, utilizando gradientes de pH inmovilizados (IPG) con un intervalo de pH preferiblemente de mas de pH 4-9.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando tecnicas de electroforesis en gel, en particular, las tecnicas mencionadas anteriormente combinadas con otros metodos de separacion de proteinas, particularmente los metodos conocidos por los expertos en la tecnica, en particular, cromatografia y/o exclusion por tamano.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando tecnicas de resonancia, en particular, resonancia de plasmon de superficie.
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, los niveles de proteina ROBO2 se miden utilizando un biochip de proteina. Un biochip generalmente comprende un sustrato solido que tiene una superficie sustancialmente plana, a la que se une un reactivo de captura (por ejemplo, un adsorbente o reactivo de afinidad). Con frecuencia, la superficie de un biochip comprende una pluralidad de ubicaciones direccionables que tienen unido un reactivo de captura. El biochip tambien puede incluir un reactivo de captura unido que sirve como control. Los biochips de proteinas son biochips adaptados para la captura de polipeptidos. Muchos biochips de proteinas se describen en la tecnica. Estos incluyen, por ejemplo, los biochips de proteinas producidos por Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, California), Zyomyx (Hayward, California), Invitrogen (Carlsbad, California), Biacore (Uppsala, Suecia) y Procognia (Berkshire, Reino Unido). Los ejemplos de dichos biochips de proteinas se describen en las siguientes patentes o solicitudes de patente publicadas: patente de Estados Unidos N° 6.225.047 (Hutchens & Yip); patente de Estados Unidos N° 6.537.749 (Kuimelis y Wagner); patente de Estados Unidos N° 6.329.209 (Wagner y colaboradores); publicacion internacional PCT No. WO 00156934 (Englert y colaboradores); la publicacion internacional PCT N° WO 031048768 (Boutell y colaboradores) y la patente de Estados Unidos N° 5.242.828 (Bergstrom y colaboradores).
Los niveles de umbral de referencia o los valores de los niveles de proteina ROBO2 utilizados para la comparacion con el nivel de proteina ROBO2 de un sujeto pueden variar, dependiendo del aspecto o la realizacion descrita en el presente documento, como se entendera a lo largo de esta memoria descriptiva, y mas adelante. Un valor de umbral de referencia puede basarse en un valor de muestra individual, como por ejemplo, un valor obtenido de una muestra biologica del sujeto que se esta analizando, pero en un momento anterior (por ejemplo, en un primer punto de tiempo (t1), por ejemplo, un primer nivel de biomarcador medido, o en un segundo punto de tiempo (t2), por ejemplo). Un valor de umbral de referencia tambien puede basarse en un conjunto de muestras, por ejemplo, valores obtenidos de muestras de un conjunto de sujetos que se estan evaluando. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los valores de umbral de referencia para la proteina ROBO2 se basan en medir el valor del 50% (por ejemplo, la mediana) de la proteina ROBO2 medida en sujetos que se sabe que tienen enfermedad renal cronica o proteinuria. Por ejemplo, los sujetos en el 50% superior (por ejemplo, en o por encima del nivel medio) para la proteina ROBO2 pueden seleccionarse por estar en riesgo de tener enfermedad renal cronica o proteinuria. Los valores de referencia tambien pueden basarse en un conjunto de muestras que incluyen o excluyen las muestras a ser analizadas. El valor de referencia se puede basar en un gran numero de muestras, tal como en la poblacion de sujetos sanos del grupo de la misma edad cronologica, o en sujetos que no tienen o no tienen riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria. En algunas realizaciones, el valor de referencia puede ser al menos una, mas tipicamente al menos dos, desviaciones estandar por encima de la media o la mediana de cualquiera de estos ensayos o una media o mediana predeterminada.
Para evaluar el riesgo de que un sujeto experimente o tenga enfermedad renal cronica o proteinuria mediante los ensayos, metodos y sistemas como se describe en el presente documento, un "valor de umbral de referencia" es tipicamente un nivel de umbral de referencia predeterminado, como la mediana de la proteina ROBO2 en orina, suero o sangre obtenida de una poblacion de sujetos sanos que se encuentran en el grupo de edad cronologica que se corresponde con la edad cronologica del sujeto examinado. Como se indico anteriormente, en algunas situaciones, las muestras de referencia tambien pueden ser del mismo genero y/o emparejadas segun el origen etnico. En algunas realizaciones, el valor umbral de referencia para la proteina ROBO2 es el nivel de la media para ese biomarcador en un tipo de muestra biologica, por ejemplo, orina, sangre, suero, en un panel de sujetos de la misma etnia, por ejemplo, caucasico, negro, hispano, asiatico y asiatico-indio, pakistani, Oriente Medio y/o isleno del Pacifico.
Para evaluar el riesgo de que un sujeto experimente o tenga enfermedad renal cronica o proteinuria mediante los ensayos, metodos y sistemas que se describen en este documento, el nivel de umbral de referencia para la proteina ROBO2 puede ser un nivel predeterminado, tal como un promedio o mediana de los niveles obtenidos de una poblacion de sujetos sanos que se encuentran en el grupo de edad cronologica de la misma edad cronologica del sujeto evaluado. Alternativamente, el nivel de umbral de referencia para la proteina ROBO2 puede ser un nivel de referencia historico para el sujeto en particular que se obtuvo de una muestra derivada del mismo sujeto, pero en un momento anterior, y/o cuando el sujeto no tenia un riesgo de la enfermedad renal cronica o proteinuria. En algunos casos, el nivel de umbral de referencia para la proteina ROBO2 puede ser un nivel de referencia historico de la proteina ROBO2 para un grupo particular de sujetos que han tenido todos enfermedad renal cronica o proteinuria, debido, por ejemplo, a la diabetes.
En algunas realizaciones, los sujetos sanos se seleccionan como los sujetos de control. En algunas realizaciones, los controles son controles de la misma edad. Se puede utilizar un sujeto sano para obtener una proteina ROBO2 de nivel umbral de referencia, por ejemplo, en una muestra de orina o suero. Un sujeto "sano" o muestra de un sujeto o individuo "sano" tal como se usa en el presente documento es el mismo que entiende comunmente un experto en la tecnica. Por ejemplo, se pueden usar metodos comunmente conocidos para evaluar la funcion renal, como se describe en este documento, para seleccionar sujetos de control como sujetos sanos para el diagnostico y los metodos de tratamiento descritos en este documento. En algunas realizaciones, los sujetos con buena salud sin signos o sfntomas que sugieran enfermedad renal cronica pueden ser reclutados como sujetos de control sanos. Los sujetos son evaluados con base en evaluaciones extensas consistentes en historia clfnica, historia familiar, examenes ffsicos y renales realizados por expertos clfnicos, pruebas de laboratorio. Los ejemplos de analisis de enfermedad renal cronica y/o proteinuria incluyen, entre otros, la deteccion del nivel de protefnas o moleculas especfficas en una muestra de orina, sangre o suero, como, por ejemplo, albumina, calcio, colesterol, recuento de sangre completa (CBC), electrolitos, magnesio, fosforo, potasio, sodio o cualquier combinacion de los mismos; ensayos para detectar, por ejemplo, eliminacion de creatinina; niveles de creatinina; BUN (nitrogeno ureico en sangre); mediante el uso de tecnicas o procedimientos especfficos, tales como tomograffa computarizada abdominal, resonancia magnetica abdominal, ecograffa abdominal, biopsia renal, gammagraffa renal, ecograffa renal; a traves de la deteccion de cambios en los resultados de ensayos o pruebas para eritropoyetina, PTH; prueba de densidad osea, o vitamina D; o cualquier combinacion de tales metodos de deteccion y ensayos.
Las poblaciones de la misma edad (a partir de las cuales se pueden obtener valores de referencia) son idealmente de la misma edad cronologica que el sujeto o el individuo sometido a prueba, pero tambien son aceptables las poblaciones emparejadas aproximadamente por edad. Las poblaciones aproximadas por edad pueden estar dentro de 1,2, 3, 4 o 5 anos de la edad cronologica del individuo evaluado, o pueden ser grupos de diferentes edades cronologicas que abarcan la edad cronologica del individuo sometido a prueba.
Un sujeto que se compara con su "grupo de la misma edad cronologica" generalmente se refiere a comparar al sujeto con la misma edad cronologica dentro de un intervalo de 5 a 20 anos. Las poblaciones aproximadas por edad pueden estar en incrementos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15, o 20 anos (por ejemplo, un grupo de "incremento de 5 anos" puede servir como fuente de valores de referencia para un sujeto de 62 anos puede incluir individuos de 58-62 anos, individuos de 59-63 anos, individuos de 60-64 anos, individuos de 61-65 anos o individuos de 62-66 anos). En una definicion mas amplia, donde hay mayores brechas entre los diferentes grupos de edades cronologicas, por ejemplo, cuando hay pocos grupos de edades cronologicas diferentes disponibles para los valores de referencia, y las brechas entre los diferentes grupos de edades cronologicas superan los 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15, o los incrementos de 20 anos descritos en este documento, entonces el "grupo de la misma edad cronologica" puede referirse al grupo de edad que esta mas cerca de la edad cronologica del sujeto (por ejemplo, cuando los valores de referencia disponible para un grupo de mayor edad (por ejemplo, 80-90 anos) y un grupo de menor edad (por ejemplo, 20-30 anos), un grupo de la misma edad cronologica para un sujeto de 51 anos puede usar el grupo de menor edad (20-30 anos), que esta mas cerca de la edad cronologica del sujeto de prueba, como el nivel de referencia.
Otros factores que deben considerarse al seleccionar sujetos de control incluyen, pero no se limitan a, especie, genero, origen etnico, etc. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un nivel de referencia puede ser un nivel de referencia predeterminado, tal como un promedio o mediana de niveles obtenidos de una poblacion de sujetos de control sanos que estan emparejados por genero con el genero del sujeto evaluado. En algunas realizaciones, un nivel de referencia puede ser un nivel de referencia predeterminado, tal como un promedio o la mediana de los niveles obtenidos de una poblacion de sujetos de control sanos que coinciden con la etnia del sujeto evaluado (por ejemplo, caucasico, negro, hispano, asiatico y asiatico-indio, pakistanf, medio oriente e isleno del Pacffico). En otras realizaciones, tanto la edad cronologica como el genero de la poblacion de sujetos sanos se comparan con la edad cronologica y el genero del sujeto sometido a prueba, respectivamente. En otras realizaciones, tanto la edad cronologica como la etnia de la poblacion de sujetos sanos se comparan con la edad cronologica y la etnia del sujeto sometido a prueba, respectivamente. En otras realizaciones, la edad cronologica, el genero y la etnia de la poblacion de sujetos de control sanos se combinan con la edad cronologica, el genero y la etnia del sujeto evaluado, respectivamente.
El proceso de comparar un nivel de protefna ROBO2 en una muestra biologica de un sujeto y un nivel de umbral de referencia para la protefna ROBO2 se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente, apropiada y conocida por un experto en la materia. En general, los valores de los niveles de protefna ROBO2 determinados mediante los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento pueden ser valores cuantitativos (por ejemplo, valores cuantitativos de concentracion, como los miligramos de protefna ROBO2 por litro (por ejemplo, mg/L) de muestra, o una cantidad absoluta). Alternativamente, los valores de los niveles de protefna ROBO2 pueden ser cualitativos dependiendo de las tecnicas de medicion y, por lo tanto, el modo de comparar un valor de un sujeto y un valor de referencia puede variar la tecnologf saeg dúen medicion empleada. Por ejemplo, la comparacion se puede realizar inspeccionando los datos numericos, inspeccionando representaciones de los datos (por ejemplo, inspeccionando representaciones graficas como graficos de barras o de lfneas), y utilizando desviaciones estandar de, por ejemplo, al menos uno, o al menos dos desviaciones estandar. En un ejemplo, cuando se usa un ensayo cualitativo para medir los niveles de protefna ROBO2, los niveles pueden compararse visualmente comparando la intensidad del producto de reaccion coloreado, o comparando datos de mediciones densitometricas o espectrometricas del producto de reaccion coloreada (por ejemplo, comparando datos numericos o datos graficos, tal como los graficos de barras, derivados del dispositivo de medicion).
Como se describe en el presente documento, los niveles de protefna ROBO2 pueden medirse cuantitativamente (valores absolutos) o cualitativamente (valores relativos). En algunas realizaciones, los valores cuantitativos de los niveles de protefna ROBO2 en las muestras biologicas pueden indicar un nivel dado (o grado) de riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria.
En algunas realizaciones, la comparacion se realiza para determinar la magnitud de la diferencia entre los valores de un sujeto y los valores de referencia (por ejemplo, comparando las ''veces'' o la diferencia porcentual entre los niveles de proteina ROBO2 medidos obtenidos de un sujeto y el valor umbral de referencia de la proteina ROBO2). Un numero de veces de diferencia se puede determinar midiendo la concentracion absoluta de los niveles de proteina ROBO2, y comparando eso con el valor absoluto con el umbral de referencia del nivel de proteina ROBO2, o el numero de veces que se diferencia puede medirse por la diferencia relativa entre un valor de referencia y un valor de muestra, en donde ninguno de los valores es una medida de la concentracion absoluta, y/o cuando ambos valores se miden simultaneamente. Por ejemplo, un ELISA mide el contenido absoluto o la concentracion de una proteina a partir de la cual se determina el numero de veces que cambia en comparacion con la concentracion absoluta de la misma proteina en la referencia. Como otro ejemplo, una matriz de anticuerpos mide la concentracion relativa a partir de la cual se determina el numero de veces que cambia. En consecuencia, la magnitud de la diferencia entre el valor medido y el valor de referencia que sugiere o indica un diagnostico particular dependera del metodo que se este practicando.
Como sera evidente para los expertos en la tecnica, cuando se toman mediciones repetidas para medir los niveles de proteina ROBO2, los valores medidos de los sujetos pueden compararse con los niveles del umbral de referencia de la proteina ROBO2, y se tienen en cuenta las mediciones repetidas. Las mediciones repetidas se pueden tener en cuenta utilizando la media o la mediana de los valores medidos.
En algunas realizaciones, el proceso de comparacion puede ser manual o puede, preferiblemente, automatizarse. Por ejemplo, un dispositivo de ensayo (como un luminometro para medir senales de quimioluminiscencia) puede incluir circuitos y software que le permitan comparar un valor de un sujeto con un valor de referencia para la proteina ROBO2. Alternativamente, se puede usar un dispositivo separado (por ejemplo, un ordenador digital) para comparar los niveles de proteina ROBO2 medidos de los sujetos y los niveles de umbral de referencia para la proteina ROBO2. Los dispositivos automatizados para comparacion pueden incluir valores de referencia almacenados para la proteina ROBO2, o pueden comparar los niveles de proteina ROBO2 medidos de los sujetos con niveles de umbral de referencia para la proteina ROBO2 que se derivan de muestras de referencia medidas simultaneamente.
En algunas realizaciones, un sujeto sometido a prueba para determinar los niveles de proteina ROBO2 se asigna en uno de dos o mas grupos (estatus) basandose en los resultados de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento. Los ensayos, metodos y sistemas de diagnostico que se describen en este documento pueden utilizarse para clasificar entre varios estados diferentes.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, la determinacion de si un sujeto tiene un alto riesgo de tener enfermedad renal cronica o proteinuria (estado: bajo riesgo frente a alto riesgo) se realiza usando los ensayos, metodos y sistemas de diagnostico descritos en el presente documento. Se identifican las cantidades o patrones de biomarcadores de la proteina ROBO2 determinados como caracteristicos de varios estados de riesgo, por ejemplo, alto, medio o bajo. El riesgo de desarrollar enfermedad renal cronica o proteinuria se determina midiendo la proteina ROBO2 sola o en combinacion con otros biomarcadores conocidos, y luego presentandolos a un algoritmo de clasificacion o comparandolos con una cantidad de referencia (por ejemplo, una cantidad de referencia de corte como se divulga en el presente documento) que se asocia con el nivel de riesgo particular.
En algunas realizaciones, en el presente documento se proporcionan ensayos, metodos y sistemas de diagnostico para determinar la gravedad o el estado o el riesgo de tener una enfermedad renal cronica o proteinuria en un sujeto. Cada etapa de la enfermedad renal cronica, por ejemplo, tiene una cantidad caracteristica de proteina ROBO2 o cantidades relativas de proteina ROBO2. La etapa de una enfermedad se determina midiendo la proteina ROBO2, sola o en combinacion con otros biomarcadores, y luego sometiendolas a un algoritmo de clasificacion o comparandolas con una cantidad de referencia y/o patron de biomarcadores que se asocia con la etapa particular, por ejemplo, que tan pronto el sujeto desarrollara probablemente enfermedad renal cronica o proteinuria. Por ejemplo, se puede clasificar entre la probabilidad de tener enfermedad renal cronica o proteinuria dentro de un ano (por ejemplo, un pronostico desfavorable) o un sujeto con probabilidad de tener enfermedad renal cronica o proteinuria en los proximos 5 anos.
Las realizaciones adicionales de los ensayos, metodos y sistemas de diagnostico se refieren a la comunicacion de resultados o diagnosticos, o ambos a los tecnicos, medicos o pacientes, por ejemplo. En ciertas realizaciones, se usan ordenadores para comunicar los resultados de los analisis o los diagnosticos o ambos a las partes interesadas, por ejemplo, los medicos y sus pacientes. En algunas realizaciones, los ensayos se realizan o los resultados de los ensayos se analizan en un pais o jurisdiccion que difiere del pais o la jurisdiccion a la que se comunican los resultados o diagnosticos, por ejemplo. En algunas realizaciones, el riesgo de tener enfermedad renal cronica o proteinuria basada en los niveles de proteina ROBO2 en una muestra biologica del sujeto se comunica al sujeto despues de que se obtienen los niveles o el pronostico. El medico tratante del sujeto puede comunicar el pronostico o el diagnostico al sujeto. Alternativamente, el pronostico o diagnostico puede enviarse al sujeto por correo electronico o comunicarse al sujeto por telefono. Se puede usar un ordenador para comunicar el pronostico o el diagnostico por correo electronico o por telefono, o a traves de Internet, mediante un servicio de acceso seguro para el ingreso de pacientes. En ciertas realizaciones, el mensaje que contiene los resultados del pronostico o prueba de diagnostico se puede generar y entregar automaticamente al sujeto utilizando una combinacion de hardware y software de ordenador que sera familiar para los expertos en telecomunicaciones. En ciertas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas descritos en el presente documento, todos o algunos de las etapas del metodo, que incluyen el analisis de muestras, el diagnostico de enfermedades y la comunicacion de los resultados de los analisis o diagnosticos, se pueden llevar a cabo de jurisdicciones diversas (por ejemplo el extranjero).
En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas de diagnostico de calificacion o evaluacion del riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria descritos en el presente documento, los ensayos, metodos o sistemas comprenden ademas el manejo del tratamiento del sujeto en funcion de la determinacion del riesgo de tener una enfermedad renal cronica o proteinuria. Dicho manejo incluye las acciones del medico o del clinico luego de determinar el riesgo de los sujetos de tener enfermedad renal cronica o proteinuria. Por ejemplo, si un medico hace un diagnostico del sujeto con riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, entonces puede seguir un cierto regimen de tratamiento. Un regimen de tratamiento adecuado puede incluir, sin limitacion, un programa de ejercicio supervisado; control de la presion arterial, ingesta de azucar y/o niveles de lipidos; y terapias farmacologicas. En algunas realizaciones, un diagnostico de un riesgo de tener enfermedad renal cronica o proteinuria puede ser seguido por pruebas adicionales para determinar si un paciente padece una enfermedad renal cronica, o si el paciente padece una enfermedad relacionada. Ademas, si la prueba de diagnostico da un resultado no concluyente sobre el riesgo de un estado de evento adverso importante, es posible que se requieran pruebas adicionales. En algunas realizaciones de los ensayos, metodos y sistemas de diagnostico de calificacion o evaluacion del riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria descritos en el presente documento, si un medico hace un diagnostico de que el sujeto no tiene riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, entonces no se proporciona tratamiento.
El ensayo y los metodos de deteccion de ROBO2 descritos en el presente documento pueden automatizarse usando robotica y sistemas dirigidos por ordenador. Se puede inyectar una muestra biologica, tal como una muestra de orina, plasma o sangre, en un sistema, tal como un dispositivo de microfluidos completamente operado por una estacion robotica desde la entrada de la muestra hasta la salida del resultado.
Por consiguiente, tambien se proporciona en el presente documento, en algunos aspectos, sistemas (y medio legible por ordenador para hacer que los sistemas informaticos) realicen un metodo para determinar si un individuo tiene una enfermedad renal cronica o proteinuria o una predisposicion para una enfermedad renal cronica o proteinuria basada en perfiles de expresion o información de secuencia.
En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan sistemas para evaluar si un sujeto tiene o esta en riesgo mayor de enfermedad renal cronica o proteinuria, comprendiendo los sistemas: (a) un modulo de determinacion configurado para recibir al menos una muestra biologica y realizar al menos un analisis en dicha muestra biologica para medir el nivel de ROBO2 en la muestra biologica o determinar la relacion de expresion de ROBO2 con respecto a un nivel predeterminado o de referencia de umbral y para dar salida a dicho nivel medido o relacion de expresion; (b) un dispositivo de almacenamiento configurado para almacenar informacion de salida de datos del modulo de determinacion; (c) un modulo de comparacion adaptado para recibir informacion del dispositivo de almacenamiento y comparar los datos almacenados en el dispositivo de almacenamiento con al menos un umbral de referencia de nivel de ROBO2, en donde si el nivel medido de proteina ROBO2 es al menos igual o superior que el nivel de umbral de referencia, el modulo de comparacion proporciona información a un modulo de salida de que la muestra biologica esta asociada con un sujeto que se desvia del umbral de referencia del biomarcador, y (d) un modulo de salida para mostrar la información al usuario.
En todos los aspectos de la invencion, los metodos para determinar los niveles de proteina ROBO2 se pueden realizar utilizando una maquina o sistema automatizado. Dichas maquinas y sistemas generan un informe, tal como mostrar un informe en una pantalla visible o un informe imprimible que indica los niveles de proteina ROBO2 y/o informar un aumento o el mismo como un nivel de umbral de referencia para la proteina ROBO2, y/o si el sujeto del cual se obtuvo la muestra esta en riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria.
Por consiguiente, algunas realizaciones descritas en el presente documento tambien proporcionan una maquina, sistemas informaticos y medios legibles por ordenador para realizar las etapas de (i) determinar los niveles de proteina ROBO2, y (ii) indicar o informar si un sujeto esta en riesgo de tener enfermedad renal cronica o proteinuria.
Las realizaciones de estos aspectos se describen a traves de modulos funcionales, que se definen mediante instrucciones ejecutables por ordenador grabadas en medios legibles por ordenador y que hacen que un ordenador realice etapas de metodo cuando se ejecuta. Los modulos se han segregado por funcion para mayor claridad. Sin embargo, debe entenderse que los modulos no necesitan corresponder a bloques de código discretos y que las funciones descritas pueden llevarse a cabo mediante la ejecucion de varias porciones de código almacenadas en diversos medios y ejecutadas en diversos momentos. Ademas, debe apreciarse que los modulos pueden realizar otras funciones, por lo tanto, los modulos no se limitan a tener ninguna funcion particular o conjunto de funciones.
El medio legible por ordenador puede ser cualquier medio tangible disponible al que se pueda acceder mediante un ordenador. Los medios legibles por ordenador incluyen medios tangibles volatiles y no volatiles, extraibles y no removibles implementados en cualquier metodo o tecnologia para el almacenamiento de informacion, tales como instrucciones legibles por ordenador, estructuras de datos, modulos de programas u otros datos. Los medios legibles por ordenador incluyen, pero no estan limitados a, RAM (memoria de acceso aleatorio), ROM (memoria de solo lectura), EPROM (memoria de solo lectura programable y borrable), EEPROM (memoria de solo lectura programable y borrable electricamente), memoria flash u otra tecnologia de memoria, CD-ROM (memoria solo de lectura de disco compacto), DVD (discos versatiles digitales) u otros medios de almacenamiento optico, casetes magneticos, cinta magnetica, almacenamiento en disco magnetico u otros medios de almacenamiento magnetico, otros tipos de memoria volatil y no volatil, y cualquier otro medio tangible que se pueda utilizar para almacenar la informacion deseada y al que se pueda acceder mediante un ordenador, incluida cualquier combinacion adecuada de los anteriores.
Los datos legibles por ordenador incorporados en uno o mas medios legibles por ordenador, o medio legible por ordenador, pueden definir instrucciones, por ejemplo, como parte de uno o mas programas, que, como resultado de ser ejecutados por un ordenador, instruyen al ordenador para realizar una o mas de las funciones descritas en el presente documento (por ejemplo, en relacion con un sistema o medio legible por ordenador), y/o varias realizaciones, variaciones y combinaciones de las mismas. Dichas instrucciones se pueden escribir en cualquiera de una pluralidad de lenguajes de programacion, por ejemplo, Java, J#, Visual Basic, C, C#, C++, Fortran, Pascal, Eiffel, Basic, lenguaje de ensamblaje COBOL y similares, o cualquiera de una variedad de combinaciones de los mismos. Los medios legibles por ordenador en los que se incorporan dichas instrucciones pueden residir en uno o mas de los componentes de cualquiera de los sistemas, o el medio legible por ordenador descrito en el presente documento, puede distribuirse a traves de uno o mas de dichos componentes, y pueden estar en transicion entre ellos.
Los medios legibles por ordenador pueden ser transportables de manera tal que las instrucciones almacenadas en ellos pueden cargarse en cualquier recurso de ordenador para implementar los aspectos de la presente invencion discutidos en este documento. Ademas, debe apreciarse que las instrucciones almacenadas en los medios legibles por ordenador, o el medio legible por ordenador, descrito anteriormente, no se limitan a las instrucciones incorporadas como parte de un programa de aplicacion que se ejecuta en un ordenador huesped. En vez de eso, las instrucciones pueden incorporarse como cualquier tipo de código de ordenador (por ejemplo, software o microcódigo) que puede emplearse para programar un ordenador para implementar aspectos de la presente invencion. Las instrucciones ejecutables por ordenador se pueden escribir en un lenguaje de ordenador adecuado o en una combinacion de varios lenguajes. Los expertos en la tecnica conocen los metodos basicos de biologia computacional y se describen, por ejemplo, en Setubal y Meidanis y colaboradores, Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi y Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, Londres, 2000) y Ouelette y Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2a ed., 2001).
Los modulos funcionales de ciertas realizaciones de los aspectos descritos en este documento incluyen un modulo de determinacion, un dispositivo de almacenamiento, un modulo de comparacion y un modulo de visualizacion. Los modulos funcionales se pueden ejecutar en uno o varios ordenadores o mediante el uso de una o varias redes o sistemas informaticos.
En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan sistemas informaticos que pueden usarse para determinar si es probable que un sujeto tenga o este en riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria. En algunas realizaciones, un sistema informatico esta conectado a un modulo de determinacion y esta configurado para obtener datos de salida de un modulo de determinacion con respecto a una muestra biologica, donde el modulo de determinacion esta configurado para detectar los niveles de proteina ROBO2 en una muestra biologica obtenida del sujeto; y donde el sistema informatico comprende (a) un dispositivo de almacenamiento configurado para almacenar la salida de datos del modulo de determinacion, asi como los datos de referencia; donde el dispositivo de almacenamiento esta conectado a (b) un modulo de comparacion que, en algunas realizaciones, esta adaptado para comparar los datos de salida almacenados en el dispositivo de almacenamiento con los datos de referencia almacenados, y en realizaciones alternativas, adaptado para comparar los datos de salida consigo mismo, donde el modulo de comparacion produce datos de informe y esta conectado a (c) un modulo de visualizacion para mostrar una pagina de contenido recuperado (es decir, datos de informe del modulo de comparacion) para el usuario en un ordenador cliente, en donde el contenido recuperado puede indicar los niveles de ROBO2 y/o la probabilidad de que el sujeto experimente enfermedad renal cronica o proteinuria en el futuro.
En algunas realizaciones, el modulo de determinacion tiene instrucciones ejecutables por ordenador para proporcionar datos de expresion, información de secuencia, información relacionada con informacion de secuencia en forma legible por ordenador. Como se usa en este documento, "información de secuencia" se refiere a cualquier secuencia de nucleotidos y/o aminoacidos, que incluye, entre otros, secuencias de nucleotidos y/o aminoacidos de longitud completa, secuencias parciales de nucleotidos y/o aminoacidos, o secuencias mutadas. Ademas, la informacion "relacionada con" la información de la secuencia incluye la deteccion de la presencia o ausencia de una secuencia (por ejemplo, deteccion de una mutacion o eliminacion), determinacion de la concentracion de una secuencia en la muestra (por ejemplo, los niveles de expresion de la secuencia de aminoacidos, o niveles de expresion de nucleotidos (ARN o ADN)), y similares. El termino "información de secuencia" pretende incluir la presencia o ausencia de modificaciones postraduccionales (por ejemplo, fosforilacion, glicosilacion, sumilacion, farnesilacion y similares).
Como ejemplo, los modulos de determinacion para determinar la secuencia de ROBO2 o la informacion de expresion de acido nucleico pueden incluir sistemas conocidos para el analisis de secuencia automatizado, incluidos, entre otros, los escaneres fluorescentes Hitachi FMBIO® y Hitachi FMBIO® II (disponibles a traves de Hitachi Genetic Systems, Alameda, California); Sistemas de analisis geneticos de electroforesis totalmente automatizados de 96 capilares SPECTRUMEDIX® SCE 9610 (disponibles a traves de SpectruMedix LLC, State College, Pensilvania); secuenciador de ADN ABI PRISM® 377, secuenciador de ADN ABI® 373, Analizador genetico ABI PRISM® 310, Analizador genetico ABI PRISM® 3100 y Analizador de ADN ABI PRISM® 3700 (disponibles a traves de Applied Biosystems, Foster City, California);, escaneres de fluorescencia SI Molecular Dynamics FLUORIMAGER™ 575, y escaneres fluorescencia Molecular Dynamics FLUORIMAGER™ 595 (disponibles a traves de Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra); Sistema de secuenciacion de ADN GENOMYXSC™ (disponible a traves de Genomyx Corporation (Foster City, California); y secuenciador de ADN PHARMACIA a Lf™ y Pharmacia ALFEXPRESS™ (disponible a traves de Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).
En algunas realizaciones para determinar la información de la secuencia o de la proteina, los modulos de determinacion incluyen sistemas para analisis de proteinas y ADN. Por ejemplo, sistemas de espectrometria de masas que incluyen sistemas de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF); sistemas de perfilado de matrices SELDI-TOF-MS ProteinChip, por ejemplo, maquinas con el software CIPHERGEN PROTEIN BIOLOGY SYSTEM II™; sistemas para analizar datos de expresion de genes (vease, por ejemplo, el documento US.
2003/0194711); sistemas para el analisis de expresion basado en matrices, por ejemplo, sistemas de matrices HT y sistemas de matrices de cartucho disponibles a traves de Affymetrix (Santa Clara, CA 95051) AutoLoader, COMPLETE GENECHIP® Instrument System, Fluidics Station 450, Hybridization Oven 645, QC Toolbox Software Kit, Scanner 30007G, Scanner 30007G plus Targeted Genotyping System, Scanner 30007G Whole-Genome Association System, GENETITAN™ Instrument, GeneChip® Array Station, HT Array; un sistema automatizado de ELISA (por ejemplo, DSX® o DS2® de Dynax, Chantilly, VA o el ENEASYSTEM III®, TRITURUS®, THE MAGO® Plus); densitometros (por ejemplo, X-Rite-508-Spectro Densitometer®, el densitometro HYRYS™ 2); sistemas automatizados de hibridacion de fluorescencia in situ (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.136.540); sistemas deformacion de imágenes en gel 2D acoplados con el software de formacion de imágenes 2-D; lectores de microplacas; clasificadores de celulas activadas por fluorescencia (FACS) (por ejemplo, Citometro de flujo FACSVantage SE, Becton Dickinson); analizadores de radioisotopos (por ejemplo, contadores de centelleo), o una combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones de este aspecto y en todos los otros aspectos de la presente invencion, se puede usar una variedad de programas y formatos de software para almacenar la información del nivel de proteina del biomarcador en el dispositivo de almacenamiento. Se puede emplear cualquier numero de formatos de estructuracion de procesadores de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) para obtener o crear un medio que haya grabado en el la información de secuencia o información de nivel de expresion.
La información de la expresion de ROBO2 o la información relacionada con la información de la expresion de ROBO2 determinada en el modulo de determinacion puede ser leida por el dispositivo de almacenamiento. Tal como se usa en el presente documento, el "dispositivo de almacenamiento" esta destinado a incluir cualquier aparato informatico o de procesamiento adecuado u otro dispositivo configurado o adaptado para almacenar datos o informacion. Los ejemplos de aparatos electronicos adecuados para su uso con la presente invencion incluyen aparatos informaticos autonomos, redes de telecomunicaciones de datos, incluidas redes de area local (LAN), redes de area amplia (WAN), sistemas de almacenamiento en la nube, Internet, Intranet y Extranet, y sistemas locales y de procesamiento por ordenador distribuidos. Los dispositivos de almacenamiento tambien incluyen, pero no se limitan a: medios de almacenamiento magneticos, tales como disquetes, medios de almacenamiento en discos duros, cintas magneticas, medios de almacenamiento optico como CD-ROM, DVD, medios de almacenamiento electronico como RAM, ROM, EPROM, EEPROM y similares, sistemas de almacenamiento en la nube, discos duros generales e hibridos de estas categorias, tales como los medios de almacenamiento magnetico/optico. El dispositivo de almacenamiento esta adaptado o configurado para haber grabado en el información de secuencia o información de nivel de expresion. Dicha información se puede proporcionar en forma digital que se puede transmitir y leer electronicamente, por ejemplo, a traves de Internet, a traves de un sistema en la nube, en un disquete, a traves de USB (bus serial universal), o a traves de cualquier otro modo de comunicacion adecuado.
Como se usa en el presente documento, "información de nivel de expresion" se refiere a cualquier información de nivel de expresion de nucleotidos y/o aminoacidos, que incluye pero no se limita a secuencias de nucleotidos y/o aminoacidos de longitud completa, secuencias parciales de nucleotidos y/o aminoacidos, o secuencias mutadas. Ademas, la información "relacionada con" la información del nivel de expresion incluye la deteccion de la presencia o ausencia de una secuencia (por ejemplo, presencia o ausencia de una secuencia de aminoacidos, secuencia de nucleotidos o modificacion postraduccional), determinacion de la concentracion de una secuencia en la muestra (por ejemplo, niveles de secuencia de aminoacidos, o niveles de expresion de nucleotidos (ARN o ADN), o nivel de modificacion postraduccional), y similares.
Como se usa en este documento, "almacenado" se refiere a un proceso para codificar información en el dispositivo de almacenamiento. Los expertos en la tecnica pueden adoptar facilmente cualquiera de los metodos actualmente conocidos para grabar información en medios conocidos para generar fabricantes que comprenden la información de secuencia o información de nivel de expresion.
Se puede usar una variedad de programas y formatos de software para almacenar la información de secuencia o información de nivel de expresion en el dispositivo de almacenamiento. Se puede emplear cualquier numero de formatos de estructuracion de procesadores de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) para obtener o crear un medio que haya grabado en el la información de secuencia o información de nivel de expresion.
Al proporcionar información de secuencia o información de nivel de expresion en forma legible por ordenador, se puede usar la información de secuencia o información de nivel de expresion en forma legible en el modulo de comparacion para comparar una secuencia especifica o perfil de expresion con los datos de referencia dentro del dispositivo de almacenamiento. Por ejemplo, los programas de busqueda se pueden usar para identificar fragmentos o regiones de las secuencias que coinciden con una secuencia particular (datos de referencia, por ejemplo, información de secuencia obtenida de una muestra de control) o la comparacion directa del nivel de expresion determinado puede compararse con el nivel de expresion de los datos de referencia (por ejemplo, información de nivel de expresion obtenida de una muestra de control). La comparacion realizada en forma legible por ordenador proporciona un resultado de comparacion legible por ordenador que puede ser procesado por una variedad de medios. El contenido basado en el resultado de la comparacion se puede recuperar del modulo de comparacion para indicar una enfermedad o trastorno especifico, tal como enfermedad renal cronica o proteinuria.
En algunas realizaciones, los datos de referencia almacenados en el dispositivo de almacenamiento a leer por el modulo de comparacion son datos de secuencia o información de expresion de ROBO2 obtenidos de una muestra biologica de control del mismo tipo que la muestra biologica a analizar. Alternativamente, los datos de referencia son una base de datos, por ejemplo, una parte de la secuencia completa del genoma de un organismo, o una familia de secuencias de proteinas, o un perfil de nivel de expresion (ARN, proteina o peptido). En algunas realizaciones, los datos de referencia son información de secuencia o perfiles de nivel de expresion que son indicativos de una enfermedad o trastorno especifico, como enfermedad renal cronica o proteinuria.
En algunas realizaciones, los datos de referencia se registran y anotan electronica o digitalmente desde bases de datos que incluyen, pero no se limitan a, bases de datos de ADN y proteinas del GenBank (NCBI) tales como genoma, EST, SNPS, Traces, Celara, Ventor Reads, lecturas de Watson, HGTS, y similares; bases de datos del Instituto Suizo de Bioinformatica, como las bases de datos ENZYME, PROSITE, SWlSS-2DPAGE, Swiss-Prot y TrEMBL; el paquete de software Melanie o el servidor ExPASy WWW, y similares; el SWISS-MODEL, Swiss-Shop y otras herramientas computacionales basadas en red; la base de datos de Comprehensive Microbial Resource (disponible a traves del Instituto de Investigacion Genomica). La información resultante puede almacenarse en una base de datos relacional que puede emplearse para determinar homologias entre los datos de referencia o genes o proteinas dentro y entre los genomas.
Al proporcionar los niveles de ROBO2 en forma legible en el modulo de comparacion, se puede usar para comparar con los niveles de umbral de referencia de ROBO2 dentro del dispositivo de almacenamiento. La comparacion realizada en forma legible por ordenador proporciona contenido legible por ordenador que puede ser procesado por una variedad de medios.
El "modulo de comparacion" puede usar una variedad de programas y formatos de software disponibles para el operativo de comparacion para comparar la secuencia de ROBO2 o la información de nivel de expresion determinada en el modulo de determinacion para hacer referencia a la secuencia de ROBO2 o los datos de nivel de expresion. En algunas realizaciones, el modulo de comparacion esta configurado para usar tecnicas de reconocimiento de patrones para comparar la secuencia de ROBO2 o los datos de nivel de expresion de una o mas entradas a uno o mas patrones de datos de referencia. El modulo de comparacion puede configurarse utilizando el software existente comercialmente disponible o disponible libremente para comparar patrones, y puede optimizarse para comparaciones de datos particulares que se realicen. El modulo de comparacion proporciona información legible por ordenador relacionada con la información de secuencia que puede incluir, por ejemplo, deteccion de la presencia o ausencia de una secuencia (por ejemplo, deteccion de una mutacion o eliminacion (proteina o ADN), información sobre distintos alelos, deteccion de modificacion postraduccional, u omision o repeticion de secuencias); determinacion de la concentracion de una secuencia en la muestra (por ejemplo, secuencia de aminoacidos/niveles de expresion de proteinas, o niveles de expresion de nucleotidos (ARN o ADN), o niveles de modificacion postraduccional), o determinacion de un perfil de expresion.
En algunas realizaciones, el modulo de comparacion permite la comparacion de niveles de ROBO2 a partir de los datos de salida del modulo de determinacion con datos de nivel de umbral de referencia para cada ROBO2.
En algunas realizaciones, el modulo de comparacion realiza comparaciones con espectros de espectrometria de masas, por ejemplo, las comparaciones de la información de la secuencia del fragmento peptidico pueden llevarse a cabo utilizando espectros procesados en MATLB con un texto llamado "Qcealign" (vease por ejemplo el documento WO2007/022248) y "Qpeaks" (Spectrum Square Associates, Ithaca, NY), o el software Ciphergen Peaks 2.1™. Luego, los espectros procesados se pueden alinear utilizando algoritmos de alineacion que alinean los datos de la muestra con los datos de control utilizando el algoritmo de entropia minima tomando datos corregidos de linea base (vease, por ejemplo, la publicacion WIPO WO2007/022248). El resultado de la comparacion puede procesarse adicionalmente calculando las proporciones. Los perfiles de expresion de proteinas pueden ser discernidos.
Se puede usar cualquier software de comparacion disponible, incluido, entre otros, el paquete Ciphergen Express (CE) y el Biomarker Patterns Software (BPS), Ciphergen Biosystems, Inc., CA, EE.UU. El analisis comparativo se puede realizar con el software del sistema de chip de proteinas (por ejemplo, la suite The Proteinchip para los laboratorios Bio-Rad).
El modulo de comparacion, o cualquier otro modulo descrito en este documento, puede incluir un sistema operativo (por ejemplo, UNIX) en el que se ejecuta un sistema de administracion de base de datos relacional, una aplicacion de la World Wide Web y un servidor de World Wide Web. La aplicacion de la World Wide Web incluye el código ejecutable necesario para generar comandos de lenguaje de base de datos (por ejemplo, comandos del Structured Query Language (SQL)).
En general, los ejecutables incluiran comandos de SQL incorporados. Ademas, la aplicacion World Wide Web puede incluir un archivo de configuracion que contiene punteros y direcciones a las diversas entidades de software que conforman el servidor, asi como a las diversas bases de datos externas e internas a las que se debe acceder para atender las solicitudes de los usuarios. El archivo de configuracion tambien dirige las solicitudes de recursos del servidor al hardware apropiado, como puede ser necesario si el servidor se distribuye en dos o mas ordenadores separados. En algunas realizaciones, el servidor World Wide Web admite un protocolo TCP/IP. Las redes locales como esta a veces se denominan "Intranets". Una ventaja de tales Intranets es que permiten una facil comunicacion con las bases de datos de dominio publico que residen en la World Wide Web (por ejemplo, el sitio World Wide Web del GenBank o Swiss Pro). Por lo tanto, en algunas realizaciones preferidas, los usuarios pueden acceder directamente a los datos (a traves de enlaces de hipertexto, por ejemplo) que residen en bases de datos de Internet mediante una interfaz HTML proporcionada por navegadores web y servidores web.
En algunas realizaciones, el modulo de comparacion compara los perfiles de expresion genica. Por ejemplo, la deteccion de los perfiles de expresion genica se puede determinar utilizando el software Affymetrix Microarray Suite version 5.0 (MAS 5.0) (disponible en Affymetrix, Santa Clara, California) para analizar la abundancia relativa de un gen o genes en funcion de la intensidad de la senal de los conjuntos de sondas, y los archivos de datos MAS 5.0 pueden transferirse a una base de datos y analizarse con el software Microsoft Excel y GeneSpring 6.0 (disponible a traves de Agilent Technologies, Santa Clara, California). El algoritmo de deteccion del software MAS 5.0 se puede usar para obtener una vision general completa de cuantas transcripciones se detectan en muestras dadas y permite un analisis comparativo de 2 o mas conjuntos de datos de microarreglos.
En algunas realizaciones, el modulo de comparacion compara los perfiles de expresion de proteinas. Se puede usar cualquier software de comparacion disponible, incluido, entre otros, el paquete Ciphergen Express (CE) y Biomarker Patterns Software (BPS) (disponible a traves de Ciphergen Biosystems, Inc., Freemont, California). El analisis comparativo se puede realizar con el software del sistema de chip de proteinas (por ejemplo, The Proteinchip Suite (disponible a traves de Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). Los algoritmos para identificar perfiles de expresion pueden incluir el uso de algoritmos de optimizacion tal como el algoritmo de varianza de la media (por ejemplo, el algoritmo de JMP Genomics disponible a traves de JMP Software Cary, Carolina del Norte).
El modulo de comparacion proporciona un resultado de comparacion legible por ordenador que se puede procesar en forma legible por ordena sdeogrún criterios predefinidos, o criterios definidos por un usuario, para proporcionar un contenido basado en parte en el resultado de comparacion que se puede almacenar y generar según lo solicite un usuario utilizando un modulo de visualizacion. El modulo de visualizacion permite visualizar un contenido basado en parte en el resultado de comparacion para el usuario, en el que el contenido es una senal indicativa de una enfermedad renal cronica o proteinuria. Dicha senal puede ser, por ejemplo, una visualizacion del contenido indicativo de la presencia o ausencia de una enfermedad renal cronica o proteinuria en un monitor de ordenador, una pagina impresa del contenido que indica la presencia o ausencia de una enfermedad renal cronica o proteinuria de una impresora, o un indicador luminoso o sonoro de la presencia o ausencia de una enfermedad renal cronica o proteinuria.
El contenido basado en el resultado de la comparacion puede incluir un perfil de expresion de una o mas proteinas, o un perfil de expresion de uno o mas genes. En algunas realizaciones, el contenido basado en el resultado de comparacion es simplemente una senal indicativa de la presencia o ausencia de una enfermedad renal cronica o proteinuria basada en los niveles de proteina ROBO2.
En algunas realizaciones, el contenido basado en el resultado de comparacion se muestra en un monitor de ordenador. En una realización de la invencion, el contenido basado en el resultado de comparacion se muestra a traves de medios imprimibles. En una realización de la invencion, el contenido basado en el resultado de comparacion se muestra como un indicador luminoso o sonoro. El modulo de visualizacion puede ser cualquier dispositivo adecuado configurado para recibir desde un ordenador y mostrar información legible por ordenador a un usuario. Entre los ejemplos no limitativos se incluyen, por ejemplo, ordenadores de proposito general como los que se basan en procesadores tipo Intel PENTIUM, ordenadores Apple y tabletas, Motorola PowerPC, Sun UltraSPARC, procesadores PA-RISC de Hewlett-Packard, cualquiera de una variedad de procesadores disponible a traves de Advanced Micro Devices (AMD) de Sunnyvale, California, o cualquier otro tipo de procesador, dispositivos de despliegue visual tales como tabletas, telefonos inteligentes moviles, pantallas planas, tubos de rayos catodicos y similares, asi como impresoras de ordenador de varios tipos
En algunas realizaciones, se usa un navegador de World Wide Web para proporcionar una interfaz de usuario para mostrar el contenido basandose en el resultado de la comparacion. Debe entenderse que otros modulos de la invencion pueden adaptarse para tener una interfaz de navegador web. A traves del navegador web, un usuario puede construir solicitudes para recuperar datos del modulo de comparacion. Por lo tanto, el usuario generalmente apunta y hace clic en los elementos de la interfaz de usuario, como los botones, los menus desplegables, las barras de desplazamiento y elementos similares empleados convencionalmente en las interfaces graficas de usuario. Las solicitudes asf formuladas con el navegador web del usuario se transmiten a una aplicacion web que las formatea para producir una consulta que se puede emplear para extraer la información pertinente relacionada con la informacion de la secuencia, por ejemplo, visualizacion de una indicacion de la presencia o ausencia de mutacion o supresion (ADN o protefna); visualizacion de los niveles de expresion de una secuencia de aminoacidos (protefna); visualizacion de los niveles de expresion de nucleotidos (ARN o ADN); visualizacion de la expresion, SNP, o perfiles de mutacion, o haplotipos, o visualizacion de información basada en ellos. En una realizacion, tambien se muestra la informacion de secuencia de los datos de la muestra de referencia.
En algunas realizaciones, el modulo de visualizacion muestra el resultado de la comparacion y si el resultado de la comparacion es indicativo de una enfermedad, por ejemplo, si el perfil de expresion de ROBO2 es indicativo de enfermedad renal cronica o proteinuria.
En algunas realizaciones, el contenido basado en el resultado de comparacion que se muestra es una senal (por ejemplo, senal positiva o negativa) indicativa de la presencia o ausencia de una enfermedad renal cronica o proteinuria, por lo tanto, solo una indicacion positiva o negativa puede ser mostrada.
Por lo tanto, en este documento se proporcionan sistemas (y un medio legible por ordenador para hacer que los sistemas informaticos) realicen ensayos y metodos para determinar si un individuo tiene una enfermedad renal cronica o proteinuria o una predisposicion, para una enfermedad renal cronica o una proteinuria con base en perfiles de expresion o información de secuencia.
Los sistemas y el medio legible por ordenador, son meramente una realización ilustrativa de la invencion para realizar ensayos y metodos para determinar si un individuo tiene una enfermedad o trastorno especffico o una predisposicion, para una enfermedad o trastorno especffico con base en perfiles de expresion o informacion de secuencia, y no pretende limitar el alcance de la invencion. Las variaciones de los sistemas, y el medio legible por ordenador, son posibles y se pretende que esten dentro del alcance de la invencion.
Los modulos del sistema o usados en el medio legible por ordenador, pueden asumir numerosas configuraciones. Por ejemplo, la funcion puede proporcionarse en una sola maquina o distribuirse en varias maquinas.
Robo2 es una protefna de podocitos localizada en la superficie de celulas basales de podocitos de raton
Durante el desarrollo del rinon, el ARNm de Robo2 se expresa en el mesenquima metanefrico que rodea el brote ureterico arborizante y luego en el extremo proximal del cuerpo en forma de S (Piper y colaboradores, 2000), la ubicacion de los podocitos primordiales. Para investigar si Robo2 tambien esta involucrado en la maduracion de los podocitos, ademas de su papel en la induccion renal temprana, se realizo una hibridacion in situ y se encontro que el ARNm de ROBO2 se expreso en la etapa de bucle capilar de glomerulos en desarrollo de embriones de raton en el dfa embrionario 16.5 (E16.5) (Figuras 5A y 5B). La protefna Robo2 se hizo detectable por tincion de inmunofluorescencia en el glomerulo en desarrollo alrededor de E14.5 y alcanzo la expresion maxima en E16.5 (Figuras 5C-5E). Aunque la expresion disminuyo despues de E17.5 durante el desarrollo (Figura 5F), la expresion especffica de Robo2 se mantuvo en glomerulos despues del nacimiento y fue detectable en ratones adultos a las 5 semanas de edad (Figuras 5G, 5H, 5L-5M).
Para determinar la localizacion celular de Robo2 en el glomerulo en desarrollo, se realizo una inmunohistoqufmica de doble etiqueta con marcadores especfficos del tipo de celula glomerular. Se encontro que la protefna Robo2 se localizaba conjuntamente con nefrina (FIGS. 1A-1C) y podocina (Figuras 1D-1F), dos protefnas asociadas al diafragma de hendidura de podocitos. Robo2 tambien se expreso conjuntamente en los glomerulos con la protefna adaptadora de interaccion con nefrina Nck (Figuras 1G, 1I) y con WT1, un constituyente de los nucleos de los podocitos (Figuras 5H-5K). El etiquetado doble con anticuerpos contra nidogeno, un marcador de membrana basal (Figuras 1J-1L y 1P) y Pecam1, un marcador de celulas endoteliales (Figuras 1M-1O, 5M) mostro que Robo2 estaba localizado adyacente a la superficie externa de la membrana basal glomerular y ausente en las celulas endoteliales. La microscopfa confocal de alta resolucion demostro ademas que Robo2 subcelular era mas abundante en la superficie basal de los podocitos (Figura 1Q). La microscopfa electronica de inmuno-oro de rinones de raton postnatales con un anticuerpo contra el dominio citoplasmatico establecio que Robo2 estaba localizado en procesos base de podocitos cerca de la cara citoplasmatica de los diafragmas de hendidura (Figura 1R). Estos resultados demuestran que Robo2 es una protefna de los podocitos y su localizacion subcelular basal en los procesos base indica que desempena un papel en la regulacion de la estructura del proceso del pie del podocito.
El dominio intracelular Robo2 interactua directamente con los dominios SH3 de la protefna adaptadora Nck
La union del dominio extracelular de nefrina conduce a la fosforilacion de tirosina de su dominio intracelular por Src quinasas y el reclutamiento del dominio SH2 de la protefna adaptadora Nck, que a su vez induce la polimerizacion de la actina (Jones y colaboradores, 2006; Verma y colaboradores, 2006). Nck tiene un dominio SH2 en el extremo terminal C y tres dominios SH3 cerca del extremo terminal N. La polimerizacion de la actina esta mediada por los dominios SH3 de Nck (Rivera y colaboradores, 2004), que pueden reclutar varios reguladores del citoesqueleto que incluyen N-WASP y Pak (Jones y colaboradores, 2006). Estudios previos han demostrado que los dominios SH3 del Dreadlock (Dock) homologo de Nck de Drosophila tambien interactua directamente con el dominio intracelular de Robo para inhibir la polimerizacion de actina (Fan y colaboradores, 2003; Yang y Bashaw, 2006).
Se probo si Nck de mamifero tambien puede interactuar directamente con Robo2 en el podocito para regular el citoesqueleto de F-actina. Para responder a esta pregunta, se utilizo un ensayo doble hibrido de levadura para examinar si Robo2 interactuo con Nck. Dado que dos Nck de mamifero (es decir, Nckl, Nck2) comparten una estructura y funcion similares en el desarrollo del rinon (Jones y colaboradores, 2006), se uso Nckl en este estudio y se observo que el dominio intracelular de Robo2 interactuaba directamente con Nckl (Figuras 2A-2C). El mapeo del sitio de union en Robo2 para Nckl mostro que la secuencia del aminoacido 1085 a 1301, que contiene 4 motivos ricos en prolina, fue crucial para la interaccion (Figuras 2A y 2C). La ausencia de esta region rica en prolina impidio su interaccion con Nckl (Figura 2A). El mapeo del sitio de union en Nckl para Robo2 mostro que los dos primeros dominios SH3 eran necesarios para su interaccion con Robo2 porque la eliminacion de uno de los dos o ambos anulaba la interaccion (Figura 2B). Por lo tanto, la interaccion de Robo2 y Nckl estaba mediada por dos dominios de proteinas bien caracterizados, los dominios SH3 y los motivos ricos en prolina (Figura 2C). CD2AP, otra proteina adaptadora de podocitos, tambien tiene tres dominios SH3 en su extremo terminal N (Shih y colaboradores, 2001), pero no se detecto ninguna interaccion entre CD2AP y Robo2 ni en los ensayos de doble hibrido de levadura o de precipitacion conjunta. Estas observaciones indican que la union entre Robo2 y Nckl en el podocito es una interaccion especifica.
Robo2 de longitud completa forma un complejo con nefrina a traves de Nck
Se confirmo la interaccion entre Robo2 y Nck mediante ensayos de extraccion y precipitacion conjunta. Robo2 humano de longitud completa etiquetado con His y myc (His-myc-Robo2) o Robo2 humano etiquetado con His y myc con una eliminacion del dominio de union a Nckl (His-myc-Robo2-ANBD) se expresaron en celulas HEK. Las celulas HEK transfectadas se estimularon con medio condicionado con Slit2 (preparado a partir de celulas transfectadas de manera estable con Slit2) para activar Robo2 y aumentar la union de Nck (Fan y colaboradores, 2003). Nck fue extraido con His-myc-Robo2 de los lisados de celulas HEK usando perlas de Ni-NTA pero no con His-myc-Robo2-ANBD (Figura 2D). Dado que el dominio SH2 de Nck interactua con las fosfotirosinas en el dominio citoplasmatico de nefrina (NCD) (Jones y colaboradores, 2006; Verma y colaboradores, 2006), se examino si Robo2 formaba un complejo con nefrina a traves de Nck utilizando un ensayo de precipitacion conjunta. Para establecer una prueba de principio, se expresaron conjuntamente Robo2 y nefrina en celulas HEK con Fyn quinasa para aumentar la fosforilacion de nefrina (Verma y colaboradores, 2006). La extraccion de His-myc-Robo2 de los lisados de celulas HEK con perlas de Ni-NTA precipito conjuntamente Nck y nefrina cuando se expreso Fyn (Figura 2E). En el orden inverso, la extraccion de His-myc-nefrina precipito conjuntamente Nck y Robo2 cuando se expreso Fyn quinasa (Figura 2F). Ademas, los precipitados preparados con el anticuerpo anti-Nck contenian tanto Robo2 como nefrina cuando se sobreexpreso Fyn (Figura 6A). Estos datos indican que nefrina, Nck y Robo2 forman un complejo in vitro. Para validar estos hallazgos in vivo, se inmunoprecipito Robo2 de lisados de rinon de ratones recien nacidos y se encontro que Nck y nefrina se precipitaron conjuntamente (Figura 2G). Por el contrario, los precipitados preparados con el anticuerpo anti-nefrina tambien contenian Nck y Robo2 (Figura 2H). Dado que la nefrina se expresa de forma unica en los podocitos, y que Nck y Robo2 tambien se localizan en estas celulas en el rinon, estos resultados indican que la nefrina, Nck y Robo2 son capaces de formar un complejo en los podocitos.
Para determinar el papel de Slit2 en la formacion del complejo de proteinas Robo2-Nck-nefrina, His-myc-Robo2, nefrina y Fyn se expresaron conjuntamente en celulas HEK que se estimularon con medio condicionado con Slit2 o medio condicionado de control sin Slit2 antes de la precipitacion conjunta (Figura 2I). Se observo que la estimulacion con Slit2 aumentaba la union de Robo2 a Nck y la formacion de complejos con nefrina. Ambas relaciones de Nckl frente a Robo2 y nefrina frente a Robo2 aumentaron despues de la estimulacion con Slit2 (Figura 2J). De acuerdo con este hallazgo, se observo que Slit2 se expreso fuertemente en glomerulos de ratones recien nacidos (Figuras 6B, 6C).
La senalizacion de Slit2-Robo2 inhibe la polimerizacion de actina inducida por nefrina
Dado que Slit une a Robo para reclutar Dock y srGAP para inhibir la polimerizacion de actina (Fan y colaboradores, 2003), se quiso probar si Robo2 tambien recluta a Nck para inhibir la polimerizacion de actina en celulas de mamiferos, un papel opuesto a la nefrina que promueve la polimerizacion de actina. Para abordar esta cuestion, se estudio la polimerizacion de la actina mediante el analisis de colas de F-actina en celulas que expresan la proteina quimerica CD16/7-NCD como se describio anteriormente (Jones y colaboradores, 2006; Verma y colaboradores, 2006). Este modelo utiliza los dominios extracelular y transmembrana de los receptores Fc de inmunoglobulina humana CD16 y CD7 fusionados al dominio citoplasmatico de nefrina (NCD). CD16/7-HA, en el que NCD se reemplazo por una etiqueta HA, se uso como control negativo. Estas proteinas quimericas se expresaron conjuntamente con Robo2 en celulas HEK y se agruparon mediante tratamiento con anticuerpo anti-CD16 y un anticuerpo secundario conjugado con rodamina. Primero se examino si la agrupacion del dominio citoplasmatico de nefrina podria reclutar a Robo2. Se observo que la union de CD16/7-NCD llevo a Robo2 a las agrupaciones, ya que la mayoria de Robo2 se localizo conjuntamente con las agrupaciones de CD16/7-NCD (Figuras 6D-6F). Sin embargo, no se observo localizacion conjunta de Robo2 con el control CD16/7-HA (Figura 6D') ni con el constructo Robo2-ANBD (Figura 6E'), en el que se elimino el dominio de union a Nck de Robo2 (NBD). Curiosamente, en ausencia de Slit2, la localizacion conjunta de CD16/7-NCD y Robo2 se redujo significativamente (Figura 6F'). Estos datos proporcionan evidencia adicional de que el dominio citoplasmatico de nefrina es capaz de formar complejos con el dominio intracelular de Robo2 en presencia de Slit2 y valida el modelo para determinar si la formacion de un complejo Robo2-Nck-nefrina afecta la polimerizacion de la actina.
Las celulas HEK que expresan CD16/7-NCD y Robo2 se estimularon con Slit2 o medio condicionado de control sin Slit2 mientras se agrupaban por el anticuerpo anti-CD16. La polimerizacion de actina se evaluo cuantificando el numero de celulas HEK con colas de F-actina visibles (Rivera y colaboradores, 2004). Se observo que aproximadamente el 80% de las celulas agrupadas CD16/7-NCD formaban colas de F-actina que podrian revelarse mediante la tincion con faloidina como se informo anteriormente (Jones y colaboradores, 2006; Verma y colaboradores, 2006). Sin embargo, tras la estimulacion con Slit2, el numero de celulas con colas de F-actina se redujo significativamente a aproximadamente el 40% (Figuras 3A y 3C). Solo se observo que unas pocas celulas contenian colas de F-actina mas cortas cuando las proteinas CD16/7-HA de control estaban agrupadas (Figuras 3B y 3C). Para investigar mas a fondo si esta inhibicion de la polimerizacion de actina requeria Nck, se repitio este ensayo utilizando Robo2 sin dominio de union a Nck (Robo2-ANBD) para determinar si el bloqueo de la union de Nck a Robo2 evitaria la inhibicion de Slit2-Robo2 en la polimerizacion de actina inducida por nefrina. CD16/7-NCD se expreso conjuntamente con Robo2 de longitud completa (Figura 7A) o Robo2-ANBD (Figura 7B) en celulas HEK. Se observo que la eliminacion del dominio de union de Nck en Robo2 comprometio significativamente la inhibicion de Slit2-Robo2 en la polimerizacion de actina inducida por nefrina (Figura 7C).
El estudio anterior ha demostrado que la nefrina esta relacionada con el citoesqueleto de F-actina (Yuan y colaboradores, 2002). Para determinar si la senalizacion de Slit2-Robo2 podria inhibir la F-actina asociada a la nefrina, se inmunoprecipitaron CD16/7-NCD y CD16/7-HA con anticuerpo anti-CD16 y se examino la cantidad de F-actina en los precipitados por transferencia Western. Se observo que la abundancia de F-actina asociada con nefrina se redujo significativamente con la estimulacion con Slit2 (Figuras 3D y 3E). Al contrario, el ensayo de inmunoprecipitacion in vivo mostro que la F-actina asociada con nefrina inmunoprecipitada por un anticuerpo anti-nefrina de rinones de ratones nulos recien nacidos de Robo2 aumento significativamente en comparacion con la de los rinones de raton heterocigotos de tipo silvestre o Robo2 (Figuras 3F y 3G). En conjunto, estos resultados indican que la senalizacion de Slit2-Robo2 inhibe la polimerizacion de actina inducida por nefrina.
La perdida de Robo2 en podocitos causa alteracion en la estructura del proceso del pie en ratones
Nosotros y otros hemos demostrado previamente que casi todos los ratones nulos homocigotos para Robo2 con antecedentes geneticos mixtos mueren poco despues del nacimiento debido a un fenotipo CAKUT severo (Grieshammer y colaboradores, 2004; Lu y colaboradores, 2007; Wang y colaboradores, 2011). Despues de criar ratones con un alelo mutante Robo2del5 durante cinco generaciones en un antecedente genetico C57BL/6, el apareamiento de padres heterocigotos Robo2del5/+ revelo tres ratones nulos homocigotos para Robo2del5/del5 que sobrevivieron hasta 3 semanas (entre un total de 160 ratones analizados al destete). Para determinar si se requirio Robo2 para la formacion del proceso del pie de podocitos durante el desarrollo, se examino la ultra estructura de los glomerulos en ratones nulos Robo2 al nacimiento y 3 semanas de edad. Aunque el cuerpo del podocito, los procesos base y el diafragma de hendidura se formaron al nacer, la microscopia electronica de transmision mostro un desplazamiento del proceso del pie focal en ratones nulos homocigotos para Robo2del5/del5 recien nacidos (Figuras 8A-8F). Mediante microscopia electronica de barrido, se observaron procesos base interdigitales irregulares en ratones nulos homocigotos para Robo2 del5/del5 al nacer y 3 semanas de edad (Figuras 4A-4H). Estos hallazgos indican que se requiere Robo2 para el modelado normal del proceso del pie de podocitos durante el desarrollo del rinon.
Para examinar el papel de Robo2 en el mantenimiento de la estructura del proceso del pie en glomerulos maduros, se generaron ratones con desactivacion de Robo2 especificos de podocitos mediante el cruce condicional de ratones Robo2flox/flox con ratones heterocigoticos Robo2del5/+;TgNphs2-Cre/+ que portan un transgen podocina-cre. Se analizaron 20 ratones mutantes Robo2 especificos de podocitos con el genotipo Robo2del5/flox; TgNphs2-Cre/+ y 20 ratones de la camada hasta de un ano de edad. Los ratones con desactivacion de Robo2 especificos de podocitos fueron viables y fertiles. Sin embargo, mostraron procesos base de podocitos inusualmente amplios y un desplazamiento del proceso del pie segmentario focal en un mes (Figuras 4I-4M). A las 6 semanas de edad, los ratones mutantes desarrollaron una microalbuminuria significativa, que se detecto mediante analisis ELISA y transferencia Western (Figuras 4N y 4O). Ademas, la microscopia electronica de barrido revelo defectos en el modelado del proceso del pie en ratones con desactivacion de Robo2 especifica de podocitos. En lugar de procesos base secundarios interdigitantes tipo cremallera ordenada en ratones de tipo silvestre con desactivacion de Robo2 especifica de podocitos mostraron un modelado de interdigitacion del proceso base irregular y desorganizado al mes (Figuras 8G-8J). Estos defectos se hicieron mas evidentes con el tiempo. A los siete meses de edad, se observaron procesos base abiertamente desorganizados, mas cortos y serpenteantes en ratones con desactivacion de Robo2 especifica de podocitos (Figuras 8K-8N), que eran similares al fenotipo de ratones nulos para Robo2 de tres semanas de edad. Aunque los ratones con desactivacion de Robo2 especifica de podocitos mostraron un numero normal de podocitos, la deposicion de la matriz aumento significativamente en los glomerulos (Figuras 8O-8T, Tablas 1 y 2). Estos cambios morfologicos indican que Robo2 desempena un papel en la regulacion y el mantenimiento de la estructura del proceso del pie del podocito glomerular.
La perdida de Robo2 alivia el defecto estructural de los podocitos en ratones nulos para nefrina
Los ratones homocigotos con nefrina desarrollan un fenotipo caracteristico con dilatacion del espacio de Bowman, procesos base anormalmente amplios, ausencia de diafragmas de hendidura glomerular y proteinuria significativa (Done y colaboradores, 2008; Hamano y colaboradores, 2002). Dado que Robo2 formo un complejo con nefrina, y la senalizacion de Slit2-Robo2 inhibio la polimerizacion de actina inducida por nefrina, nos preguntamos si la perdida de Robo2 modificaria el fenotipo de podocitos en ratones con nefrina nula. Para probar esta hipotesis de una posible interaccion genetica entre Robo2 y nefrina, se generaron tanto ratones con desactivacion de Robo2~l~;Nphs1~l~ de linea germinal como con desactivacion de Robo2-nefrina doble Robo2floxlflox;TgNphs2-Crel+;Nphs1'/' especifica de podocitos. Al igual que los ratones homocigotos sencillos Nphs1-/-, ambos ratones con desactivacion doble Robo2/-;Nphs1'/- (414, 100%) y Robo2flox/flox;TgNphs2'Cre/+;Nphs1'/' (313, 100%) murieron dentro de las 10 horas posteriores al nacimiento. El analisis histologico, sin embargo, revelo que la morfologia de los glomerulos en los ratones homocigotos dobles para Robo2l~;Nphs1~l~ aparecia relativamente normal en comparacion con el fenotipo en ratones homocigotos para nefrina simple Nphs1~l~, que tenian un espacio de Bowman dilatado (Figuras 8U-8X). El numero de glomerulos con el espacio de Bowman dilatado se redujo significativamente en ratones homocigotos dobles para Robo2l~;Nphs1~l~ (2l55, 3,6%) comparados con ratones nulos solo para nefrina (311122, 25,4%) (Figuras 8Y y Tabla 3). Ademas, el analisis de la ultraestructura glomerular mediante microscopia electronica de barrido mostro que la estructura del proceso del pie de podocitos interdigitante se observo en solo 1 (6,67%) de los 15 glomerulos de ratones homocigotos solo para nefrina (Figuras 4P y 4Q) en comparacion con 100% en homocigotos sencillos Robo2l~ (Figuras 4T y 4U) y controles de tipo silvestre (Figura 4V y 4W). Sorprendentemente, el patron interdigitacion de los procesos base de podocitos se restauro en 12 (75%) de los 16 glomerulos de rinones de ratones recien nacidos homocigotos dobles para Robo2l-;Nphs1~l- (Figuras 4R y 4S, Tabla 4) lo que indica que una perdida concomitante de Robo2 y nefrina alivio el fenotipo estructural del proceso del pie de podocitos en estos ratones. Estos hallazgos indican que las interacciones fisicas Robo2-Nck-nefrina descritas anteriormente tienen un efecto sustancial en la morfologia del proceso del pie del podocito in vivo cuando los niveles de expresion de Robo2 y nefrina estan alterados geneticamente.
Los podocitos exhiben un grado notable de plasticidad. Durante el desarrollo, se diferencian de simples celulas epiteliales cuboidales en celulas elaboradas que contienen procesos que reconocemos como podocitos maduros (Reeves y colaboradores, 1978). Esta plasticidad se conserva despues de la maduracion. Se ve mas graficamente como el desplazamiento reversible del proceso del pie despues de la neutralizacion de la carga superficial experimental con sulfato de protamina y la restauracion con heparina (Seiler y colaboradores, 1975) y durante la recaida y remision de proteinuria en ninos con enfermedad de cambio minimo (Nachman y colaboradores, 2008). Los cambios mas sutiles en los procesos del pie probablemente se producen en condiciones fisiologicas en respuesta a senales positivas y negativas en forma de estimulos hemodinamicos, hormonales o paracrinos. Dada la abundancia de F-actina en los procesos del pie, es probable que, sin desear estar ligados o limitados por la teoria, tales estimulos provoquen esos cambios sutiles en respuesta a senales positivas y negativas transducidas al citoesqueleto de F-actina. Unas senales positivas demasiado desequilibradas pueden conducir a un fenotipo de enfermedad. De hecho, aunque todavia no se ha identificado un ligando fisiologico, esta claro que la agrupacion y la fosforilacion de la nefrina inducen la polimerizacion de la actina mediante el reclutamiento de Nck, un mecanismo que puede estar involucrado en la proteinuria inducida en ratas por un anticuerpo monoclonal nefritogenico al dominio extracelular de nefrina (Topham y colaboradores, 1999) y en casos de sindrome nefrotico congenito que desarrollan aloanticuerpos anti-nefrina despues del trasplante renal (Patrakka y colaboradores, 2002).
Nuestros estudios descritos en este documento revelan otro nivel de regulacion negativa de la polimerizacion de la actina de podocitos en la que Robo2, cuando esta unido por Slit, inhibe la polimerizacion de la actina inducida por nefrina. Se propone, sin desear estar ligados o limitados por la teoria, que la senalizacion Slit-Robo2 puede inhibir la polimerizacion de actina inducida por nefrina para mantener la estructura normal del proceso del pie de podocitos de la siguiente manera: en condiciones fisiologicas (por ejemplo, durante el desarrollo del proceso del pie), la union de la nefrina conduce a fosforilacion de la Y1191l1208l1232 intracelular a la que se une el dominio SH2 de Nck (Jones y colaboradores, 2006; Verma y colaboradores, 2006). Nck, a su vez, recluta reguladores del citoesqueleto tales como N-WASP a traves de sus dominios SH3 para promover la polimerizacion de actina para la extension o propagacion del proceso del pie del podocito (Figura 8Z). La secrecion local y la union de Slit aumentan la interaccion de Robo2 con Nck a traves de su region rica en prolina y los dos primeros dominios SH3 de Nck. El secuestro de los dos primeros dominios SH3 de Nck por Robo2 inhibiria la polimerizacion de la actina mediada por nefrina-Nck y disminuiria la F-actina asociada con la nefrina para mantener un citoesqueleto de F-actina dinamico y equilibrado y la estructura normal del proceso del pie de podocitos (Figura 8Z). Ademas de la inhibicion directa de la polimerizacion de actina inducida por nefrina a traves de Nck, la senalizacion Slit-Robo2 puede inactivar la polimerizacion de actina a traves de otras vias, como el reclutamiento de Ena, Abl, srGAP para regular negativamente el citoesqueleto de F-actina como se informo anteriormente (Bashaw y colaboradores, 2000 ; Wong y colaboradores, 2001). En ausencia de senalizacion Slit2-Robo2 (por ejemplo, cuando Robo2 se elimina), se pierden los efectos inhibidores de Robo2 sobre la polimerizacion inducida por nefrina. Los dominios SH3 de Nck son capaces de interactuar con los reguladores del citoesqueleto secuencia abajo para aumentar la polimerizacion de la actina (Figura 8Z), lo que puede explicar la estructura alterada del proceso del pie del podocito identificada en los ratones mutantes Robo2. Nuestros resultados descritos en el presente documento apoyan por lo tanto un mecanismo por el cual la senalizacion Slit-Robo puede regular la plasticidad de los podocitos regulando negativamente el citoesqueleto de F-actina, que es similar al papel de la senalizacion Slit-Robo en el rastreo de conos de crecimiento de axones (Guan y Rao, 2003). El hallazgo patologico de una mayor deposicion de matriz en los glomerulos del raton mutante Robo2 probablemente representa una respuesta secundaria.
Aunque esta claro a partir de nuestros estudios descritos en este documento que Robo2 se localiza en la superficie basal de los podocitos y forma un complejo con otras protemas de diafragma de hendidura en el proceso del pie establecido a traves de su dominio intracelular, sigue siendo incierto si realmente forma parte del diafragma mismo de hendidura. Curiosamente, el dominio extracelular de Robo2 se parece al de la nefrina, que tiene ocho motivos de tipo inmunoglobulina (Ig) y un dominio de fibronectina, mientras que Robo2 tiene cinco motivos de tipo Ig y tres dominios de fibronectina (Figura 8Z) (Tryggvason y colaboradores, 2006). Se ha probado la interaccion entre el dominio intracelular de Robo2 y el dominio citoplasmatico de la nefrina en el ensayo doble hfbrido de levadura. Los datos bioqufmicos (Figuras 2E y 2F) tampoco apoyaron una interaccion directa entre estos dos receptores in vitro. Sin embargo, es posible que el dominio extracelular de Robo2 pueda asociarse con el dominio extracelular de nefrina in vivo en las membranas celulares de procesos de pie adyacentes a traves de una interaccion trans en el diafragma de hendidura.
Se encontro que los ratones con desactivacion especffica del podocito y nulos homocigotos Robo2 desarrollaron un patron de interdigitacion del proceso del pie alterado, un fenotipo que es diferente de aquel de los ratones nulos para nefrina (Hamano y colaboradores, 2002; Done, 2008). Esto no es sorprendente ya que la nefrina y Robo2 desempenan papeles opuestos en la regulacion del citoesqueleto de F-actina de podocitos. Mientras que la senalizacion de nefrina induce la polimerizacion localizada de actina, la senalizacion Slit2-Robo2 actua como un regulador negativo en la polimerizacion de actina para mantener la plasticidad y dinamica del proceso del pie del podocito. Cabe destacar que se observa un defecto similar en la organizacion del proceso del pie en ratones en los que se elimina el factor de despolimerizacion de la actina Cofilin-1, otro regulador negativo del citoesqueleto de F-actina en los podocitos (Garg y colaboradores, 2010). Esto indica que la ausencia de un factor promotor de la polimerizacion de la actina, como la senalizacion de nefrina o un factor inhibidor, como la senalizacion de Robo2, afectara la estructura normal de los podocitos. Por lo tanto, el equilibrio entre los reguladores del citoesqueleto de F-actina positivos y negativos en los podocitos es importante para mantener la estructura normal del proceso del pie. Recuperar este equilibrio al eliminar tanto las senales positivas (nefrina) como las senales negativas (Robo2) puede explicar la restauracion de la interdigitacion del proceso del pie de podocitos y el fenotipo glomerular mas leve en los ratones con desactivacion doble de Robo2-nefrina. Nuestros estudios descritos en el presente documento demuestran las funciones duales de la nefrina como un componente esencial del diafragma de hendidura para controlar la permoselectividad glomerular por un lado (T ryggvason y colaboradores, 2006) y como regulador de la morfologfa del proceso del pie a traves de su interaccion con el citoesqueleto de actina (Jones y colaboradores, 2006; Verma y colaboradores, 2006) por el otro lado. Mientras que la senalizacion de Robo2 contrarresta claramente los efectos de senalizacion positivos de la nefrina en los procesos del pie, queda por determinar si tambien influye en la integridad del diafragma de hendidura.
Por consiguiente, como se describe en este documento, se ha identificado Robo2 como un nuevo componente de la union intercelular de podocitos en el rinon. Se han demostrado interacciones entre Robo2 y nefrina mediante tecnicas bioqufmicas, funcionales y geneticas, y se ha demostrado que la senalizacion Slit2-Robo2 inhibe la dinamica de actina inducida por nefrina. Estos resultados indican que la senalizacion de Robo2 actua como un regulador negativo en la nefrina para modular la arquitectura del proceso del pie de podocitos. Este estudio amplfa nuestra comprension del papel de la senalizacion Slit-Robo e identifica un nuevo mecanismo de interferencia mediante el cual el receptor de senal de gufa Robo podrfa influir en la dinamica del citoesqueleto de F-actina.
A menos que se defina de otra manera en el presente documento, los terminos cientfficos y tecnicos utilizados en relacion con la presente solicitud tendran los significados que comunmente entienden los expertos en la tecnica a los que pertenece esta divulgacion. Debe entenderse que esta invencion no esta limitada a la metodologfa, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en este documento y como tales pueden variar. La terminologfa utilizada en este documento tiene el proposito de describir solo realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invencion, que se define unicamente por las reivindicaciones. Las definiciones de terminos comunes en inmunologfa y biologfa molecular se pueden encontrar en The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18a Edicion, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicada por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology por Werner Luttmann, publicada por Elsevier, 2006. Las definiciones de terminos comunes en biologfa molecular se encuentran en Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (Is Bn 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EE.UU. (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EE.UU. (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, EE.UU. (1986); o Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger y A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, EE.UU. (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al., ed., John Wiley y Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) y Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.).
Como se usa en el presente documento, el termino "que comprende" significa que otros elementos tambien pueden estar presentes ademas de los elementos definidos presentados. El uso de "que comprende" indica inclusion en lugar de limitacion.
Como se usa en el presente documento, el termino "que consiste esencialmente en" se refiere a los elementos requeridos para una realización dada. El termino permite la presencia de elementos adicionales que no afectan materialmente las caracteristicas basicas y novedosas o funcionales de esa realización de la invencion.
El termino "que consiste en" se refiere a composiciones, metodos y componentes respectivos de los mismos como se describe en el presente documento, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realizacion.
Ademas, a menos que el contexto lo requiera, los terminos en singular incluiran los plurales y los terminos en plural incluiran el singular. Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, las referencias a "el metodo" incluyen uno o mas metodos, y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o que seran evidentes para los expertos en la materia al leer esta descripción y asi sucesivamente.
Aparte de en los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reaccion utilizadas en este documento deben entenderse como modificados en todos los casos por el termino "aproximadamente". El termino "aproximadamente" cuando se usa en relacion con porcentajes puede significar ± 1%.
Debe entenderse que esta invencion no se limita a la metodologia, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en este documento y como tales pueden variar. La terminologia utilizada en este documento tiene el proposito de describir solo realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invencion, que se define unicamente por las reivindicaciones.
Las realizaciones de los diversos aspectos descritos en el presente documento pueden ilustrarse mediante los siguientes parrafos numerados:
2. Un metodo para el tratamiento de la enfermedad renal cronica en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a un sujeto que tiene o esta en riesgo de padecer una enfermedad renal cronica una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende un inhibidor de ROBO2.
3. Un metodo para la reduccion de la proteinuria en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a un sujeto que tiene o tiene riesgo de proteinuria una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende un inhibidor de ROBO2.
4. El metodo de cualquiera de los parrafos 1 o 2, en el que el inhibidor de ROBO2 es un anticuerpo bloqueante o un fragmento de union a antigeno del mismo especifico para ROBO2, una molecula antisentido especifica para ROBO2, un ARN de interferencia corto (ARNic) especifico para ROBO2, un inhibidor de molecula pequena de ROBO2, un polipeptido inhibidor de ROBO2 o un analogo estructural de ROBO2.
5. El metodo de cualquiera de los parrafos 1 -3, en el que el inhibidor de ROBO2 bloquea o reduce la union de ROBO2 a SLIT, a Nck, o a ambos.
6. El metodo de cualquiera de los parrafos 1-4, en el que el inhibidor de ROBO2 es especifico para el dominio de union a SLIT de Ig 1, los dominios de union a SLIT de Ig 1 e Ig2, el dominio de union intracelular a Nck, o cualquier combinacion de los mismos.
7. El metodo del parrafo 3, en el que el polipeptido inhibidor de ROBO2 es una proteina de fusion ROBO2 negativa dominante, un polipeptido que comprende un dominio extracelular de ROBO2 sin el dominio intracelular, o un polipeptido que comprende un dominio intracelular de ROBO2 sin el dominio extracelular.
8. El metodo de cualquiera de los parrafos 1-6, en el que el sujeto que tiene o esta en riesgo de padecer una enfermedad renal cronica tiene nefropatia diabetica o presion arterial alta.
9. El metodo de cualquiera de los parrafos 1-7, que ademas comprende administrar al sujeto un agente terapeutico adicional.
10. El metodo del parrafo 8, en el que el agente terapeutico adicional es un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) o un bloqueador del receptor de angiotensina II (ARB).
11. Un metodo que comprende:
a. ensayar una muestra de prueba biologica de un sujeto para determinar un nivel de expresion de polipeptido ROBO2 o un a Rn que codifica un polipeptido ROBO2;
b. determinar si el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 en la muestra biologica de prueba esta por encima de un nivel de umbral de referencia; y
c. diagnosticar al sujeto como necesitado de tratamiento o terapia para la enfermedad renal cronica.
12. El metodo del parrafo 10, en el que el ensayo del nivel de expresion del polipeptido ROBO2 se realiza utilizando un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo especifico para el polipeptido ROBO2.
13. El metodo del parrafo 10, en el que el ensayo del nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 se realiza mediante PCR o un ensayo de hibridacion.
14. El metodo de cualquiera de los parrafos 10-12, en donde la muestra biologica de prueba es una biopsia de rinon, orina, sangre, muestra de suero o celulas sedimentadas de una muestra de orina.
15. El metodo de cualquiera de los parrafos 10-13, en el que el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 es al menos 20% superior al nivel de umbral de referencia.
16. El metodo de cualquiera de los parrafos 10-13, en el que el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 es al menos dos desviaciones estandar por encima del nivel de umbral de referencia.
17. Un ensayo que comprende:
a. poner en contacto una muestra de prueba biologica aislada de un sujeto con un reactivo que detecta el polipeptido r Ob O2 o un ARN que codifica un polipeptido ROBO2; y
b. medir el nivel de polipeptido ROBO2 o un ARN que codifica un polipeptido ROBO2,
c. en el que un mayor nivel de dicho polipeptido ROBO2 o dicho ARN que codifica un polipeptido ROBO2, en relacion con una muestra biologica normal, identifica a un sujeto que tiene enfermedad renal cronica y/o progresion de enfermedad renal cronica o proteinuria.
18. El ensayo del parrafo 16, en el que la deteccion del nivel de expresion del polipeptido ROBO2 se realiza utilizando un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo especifico para el polipeptido ROBO2.
19. El ensayo del parrafo 16, en el que la deteccion del nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 se realiza mediante PCR o un ensayo de hibridacion.
20. El ensayo de uno cualquiera de los parrafos 16-18, en el que la muestra biologica de prueba es una biopsia de rinon, orina, sangre, muestra de suero o celulas sedimentadas de una muestra de orina.
21. El ensayo de uno cualquiera de los parrafos 16-19, en el que el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 esta al menos un 20% por encima del nivel de umbral de referencia.
22. El ensayo de uno cualquiera de los parrafos 16-19, en el que el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 es al menos dos desviaciones estandar por encima del nivel de umbral de referencia.
23. El ensayo de cualquiera de los parrafos 16-21, en el que el sujeto ha sido diagnosticado con diabetes o presion arterial alta.
24. Un sistema para determinar si un sujeto esta en riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, o tiene enfermedad renal cronica que comprende:
a. un modulo de medicion configurado para determinar el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 en una muestra biologica obtenida de un sujeto;
b. un modulo de comparacion configurado para recibir dicho nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 determinado por el modulo de medicion y realizar al menos un analisis para determinar si el nivel de expresion del polipeptido ROBO2 o el nivel de expresion del ARN que codifica un polipeptido ROBO2 es mayor que un nivel o proporcion de referencia predeterminado, y para proporcionar un contenido recuperado; y
c. un modulo de visualizacion para mostrar un contenido basado en la salida de datos de dicho modulo de comparacion, en el que el contenido comprende una senal indicativa de que el nivel de expresion o proporcion de polipeptido ROBO2 o ARN es mayor que el nivel o proporcion de referencia predeterminado, o una senal indicativa que el nivel o la relacion de expresion de ROBO2 no sea mayor que el nivel de referencia o la relacion predeterminada.
25. El sistema del parrafo 23, en el que el contenido que se muestra en dicho modulo de visualizacion comprende ademas una senal indicativa del sujeto recomendado para recibir un regimen de tratamiento particular.
26. Un sistema para determinar si un sujeto tiene riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, o tiene enfermedad renal cronica que comprende:
a. un modulo de determinacion configurado para recibir al menos una muestra de prueba obtenida de un sujeto y realizar al menos un analisis en dicha al menos una muestra de prueba para determinar la presencia o ausencia de cualquiera de las siguientes condiciones:
i. una relacion de expresion de ROBO2 mayor que una relacion predeterminada, o
ii. un nivel de expresion de ROBO2 mayor que un nivel predeterminado
b. un dispositivo de almacenamiento configurado para almacenar la salida de datos de dicho modulo de determinacion; y
c. un modulo de visualizacion para mostrar un contenido basado en la salida de datos de dicho modulo de determinacion, en el que el contenido comprende una senal indicativa de que la relacion de expresion de ROBO2 es mayor que la relacion predeterminada o el nivel de ROBO2 mayor que un nivel predeterminado, o una senal indicativa de que la relacion de expresion de ROBO2 no es mayor que la relacion predeterminada o no mayor que un nivel predeterminado.
27. El sistema del parrafo 25, en el que el contenido que se muestra en dicho modulo de pantalla comprende ademas una senal indicativa del sujeto recomendado para recibir un regimen de tratamiento particular.
28. Un metodo para tratar a un sujeto humano con riesgo de enfermedad renal cronica o proteinuria, que comprende administrar un tratamiento o terapia para prevenir la aparicion de enfermedad renal cronica o proteinuria en un sujeto humano que se determina que tiene un nivel de proteina ROBO2 superior al nivel de umbral de referencia.
29. El metodo del parrafo 27, en el que el nivel de proteina ROBO2 esta al menos un 20% por encima del nivel de referencia.
30. El metodo del parrafo 27, en el que el nivel de proteina ROBO2 es al menos dos desviaciones estandar por encima del nivel de referencia.
31. El metodo de cualquiera de los parrafos 27-29, en el que el tratamiento o terapia para prevenir la aparicion de enfermedad renal cronica o proteinuria comprende un inhibidor de ROBO2.
32. El metodo del parrafo 30, en el que el inhibidor de ROBO2 es un anticuerpo bloqueante o un fragmento de union a antigeno del mismo especifico para ROBO2, una molecula antisentido especifica para ROBO2, un ARN interferente corto (ARNic) especifico para ROBO2, una pequena molecula inhibidora de ROBO2, un polipeptido inhibidor de ROBO2, o un analogo estructural de ROBO2.
33. El metodo de cualquiera de los parrafos 30-31, en el que el inhibidor de ROBO2 bloquea o reduce la union de ROBO2 a SLIT, a Nck, o a ambos.
34. El metodo de uno cualquiera de los parrafos 30-32, en el que el inhibidor de ROBO2 es especifico para el dominio de union a SLIT de Ig 1, los dominios de union a SLIT de Ig 1 e Ig2, el dominio de union intracelular a Nck, o cualquier combinacion de los mismos.
35. El metodo del parrafo 31, en el que el polipeptido inhibidor de ROBO2 es una proteina de fusion ROBO2 negativa dominante, un polipeptido que comprende un dominio extracelular de ROBO2 sin el dominio intracelular, o un polipeptido que comprende un dominio intracelular de ROBO2 sin el dominio extracelular.
36. Un inhibidor de ROBO2 para uso en el tratamiento de una enfermedad renal cronica.
37. Un inhibidor de ROBO2 para uso en el tratamiento de la proteinuria.
38. El uso de uno cualquiera de los parrafos 35 o 36, en el que el inhibidor de ROBO2 es un anticuerpo bloqueante o un fragmento de union a antigeno del mismo especifico para ROBO2, una molecula antisentido especifica para ROBO2, un ARN interferente corto (ARNic) especifico para ROBO2, un inhibidor de molecula pequena de ROBO2, un polipeptido inhibidor de ROBO2 o un analogo estructural de ROBO2.
39. El uso de cualquiera de los parrafos 35 a 37, en el que el inhibidor de ROBO2 bloquea o reduce la union de ROBO2 a SLIT, a Nck, o a ambos.
40. El uso de uno cualquiera de los parrafos 35-38, en el que el inhibidor de ROBO2 es especifico para el dominio de union a SLIT de Ig 1, los dominios de union a SLIT de Ig 1 e Ig2, el dominio de union intracelular a Nck, o cualquier combinacion de los mismos.
41. El uso del parrafo 37, en el que el polipeptido inhibidor de ROBO2 es una proteina de fusion ROBO2 negativa dominante, un polipeptido que comprende un dominio extracelular de ROBO2 sin el dominio intracelular, o un polipeptido que comprende un dominio intracelular de ROBO2 sin el dominio extracelular.
42. El uso de uno cualquiera de los parrafos 35 a 40, en el que la enfermedad renal cronica o la proteinuria es causada por nefropatia diabetica o presion arterial alta.
Esta invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplos
Hibridacion in situ de tejidos, inmunohistoquimica y microscopia electronica de inmuno-oro
El analisis de hibridacion in situ se realizo con ribosondas Robo2 marcadas con digoxigenina como se describio previamente (Grieshammer y colaboradores, 2004). La inmunohistoquimica se realizo en tejidos de rinon embrionario de raton fijados en paraformaldehido al 4% y en tejidos de rinon de raton adulto fijados en metanol. Para la microscopia electronica de inmuno-oro, los rinones de raton de tipo silvestre se diseccionaron y se fijaron en paraformaldehidolisina-peryodato (PLP). Se prepararon secciones ultrafinas del rinon de raton y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-Robo2 (DAKO Corporation) y un anticuerpo secundario acoplado a oro coloidal de 10 nm (Ted Pella).
Ensayos de doble hibrido de levadura, precipitacion conjunta y polimerizacion de actina
Se utilizo el sistema de doble hibrido de levadura DUPLEX-A™ (OriGene Tech) para caracterizar la interaccion de Robo2 y Nckl de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cultivo celular, la precipitacion conjunta de proteinas etiquetadas con His y la inmunoprecipitacion se llevaron a cabo como se informo anteriormente (Fan y colaboradores, 2003). Para la inmunoprecipitacion endogena, se utilizaron rinones de ratones recien nacidos. El entrecruzamiento mediado por el anticuerpo CD16 de las proteinas de fusion CD16/7 y el ensayo de polimerizacion de actina se realizaron como se describio anteriormente (Jones y colaboradores, 2006; Rivera y colaboradores, 2004; Verma y colaboradores, 2006).
Estudio de raton con desactivacion, microscopia electronica de barrido y transmision y analisis glomerular de rinon
Los protocolos de raton fueron aprobados por el Comite Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro Medico de la Universidad de Boston (# 14388). La generacion y el genotipado del alelo condicional Robo2flox, alelo mutante de linea germinal Robo2del5 (tambien llamado Robo2 indistintamente en este articulo), y el alelo de tipo silvestre Robo2+ se describieron anteriormente (Lu y colaboradores, 2007; Wang y colaboradores, 2011). Para generar ratones con desactivacion doble de Robo2-nefrina, se cruzaron ratones Robo2+/- con ratones Nphs1+/~ que se generaron previamente (Hamano y colaboradores, 2002). Para la microscopia electronica de transmision, los rinones se fijaron, se incubaron en glutaraldehido al 2% en cacodilato de sodio 0,15 M, se deshidrataron en etanol graduado, se embebieron en Epon, se seccionaron y se tineron con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las secciones del rinon ultrafino se examinaron utilizando un microscopio electronico JEM-1011. Para la microscopia electronica de barrido, los rinones se prepararon siguiendo el protocolo estandar. Para los estudios patologicos del rinon, los rinones se fijaron en paraformaldehido al 4%, se embebieron en parafina, se seccionaron y se tineron usando los metodos estandar de acido peryodico-Schiff (PAS) o hematoxilina eosina (H&E). Para la cuantificacion del numero de podocitos, se uso WT1 como marcador nuclear de podocitos y se realizo una tincion con inmunoperoxidasa en secciones de rinon siguiendo el protocolo estandar. Se contaron los nucleos de podocitos positivos para WT1 en cada seccion transversal glomerular. Para el analisis de proteinuria, se examinaron muestras de orina "puntuales" de ratones de 6 semanas de edad utilizando un kit de cuantificacion de ELISA de albuminuria murina (Exocell) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la varilla de graduada para orina (Multistix, Bayer, IN) como metodo de cribado.
Hibridacion de tejidos in situ e inmunohistoquimica
El analisis de hibridacion in situ se realizo con ribosondas de Robo2 marcadas con digoxigenina como se describio previamente (Grieshammer y colaboradores, 2004). El ADNc de Robo2 se linealizo con NotI y las sondas se generaron utilizando el kit de deteccion y marcacion de ADN DIG (Roche Applied Science). La hibridacion se realizo en secciones congeladas de rinon embrionario de raton embebidas en OCT y fijadas en paraformaldehido al 4%. La inmunohistoquimica se realizo en tejidos de rinon embrionario de raton fijados en paraformaldehido al 4% seguido de crioproteccion con sacarosa al 30% (Mugford y colaboradores, 2008) y en tejidos de rinon de ratones adultos fijados en metanol. Los rinones de raton embebidos en el compuesto OCT se congelaron y se seccionaron usando un criostato a 8-10 pm. Las secciones se tineron con anticuerpos primarios y seguido por un anticuerpo secundario apropiado conjugado con FITC o Cy3. Los principales anticuerpos utilizados en este estudio incluyen aquellos contra ROBO2 (R&D System, Abnova, Santa Cruz Biotechnology), nefrina (sintetizada a la medida) (Topham y colaboradores, 1999), Nck (Upstate/Millipore), podocina (Sigma), nidogeno (Santa Cruz Biotechnology), Pecam1 (BD Biosciences), WT1 (Santa Cruz Biotechnology), SLIT2 (Santa Cruz Biotechnology), PDGFR beta (Cell Signaling), Sinaptopodina (Santa Cruz Biotechnology). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal de barrido laser de disco rotatorio multipunto Perkin Elmer UltraView LCI y un microscopio de barrido laser confocal Zeiss LSM 510 con un objetivo de inmersion en aceite 60x.
Microscopia Electronica Inmuno-oro
Los rinones de raton de tipo silvestre se diseccionaron y se fijaron en paraformaldehido-lisina-peryodato (PLP) a 4°C durante la noche. El tejido se lavo en 1x PBS y se deshidrato en etanol graduado y se embebio en resina LR White (Electron Microscopy Sciences). Se prepararon secciones ultrafinas del rinon de raton y se transfirieron a rejillas de oro recubiertas con Formvar y se bloquearon con albumina de suero bovino al 1% y suero normal de cabra al 5% en 1 x PBS. Las secciones luego se incubaron con anticuerpo anti-Robo2 de cabra con una dilucion 1:50 en DAKO (DAKO Corporation) a 4°C durante la noche. Se uso suero no inmune como control. Despues de tres lavados con 1 x PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario IgG acoplado a oro coloidal de 10 nm (Ted Pella) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las secciones finalmente se fijaron posteriormente con glutaraldehido al 1% y se contrastaron con acetato de uranilo. Las secciones se examinaron con un microscopio electronico de transmision JEM-1011 (JEOL, Tokio, Japon) a 80 kV, y las imágenes se adquirieron con un sistema de imágenes digitales AMT (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA.) y se importaron a Adobe Photoshop. La localizacion subcelular de Robo2 tenida con particulas de oro en glomerulos se reconocio en micrografias electronicas digitales en comparacion con las micrografias de control tenidas con suero no inmune.
Ensayo doble hibrido de levadura
Se uso el sistema de doble hibrido de levadura DUPLEX-A™ (OriGene Tech, Rockville, MD) para caracterizar la interaccion de Robo2 y Nckl. Los ADNc que codifican el dominio intracelular de Robo2 humana y sus formas truncadas se clonaron en el vector pJG4-5 en los sitios EcoRI/XhoI del vector, fusionandolos en el dominio de activacion de transcripcion de B42. Los ADNc de Nckl humano y sus formas truncadas se clonaron en el vector pEG202 en EcoRI/XhoI para fusionarlos al dominio de union a ADN de LexA. El gen lacZ en el constructo pSH18-34 y el gen LEU2 en el genoma de levadura de la cepa EGY48 se utilizaron como genes informadores. Los constructos pEG202, pSH18-34 y pJG4-5 se transformaron conjuntamente en celulas EGY48 de levadura. La interaccion se considero positiva si las celulas de levadura se volvieron azules en presencia de X-gal y crecieron en ausencia de leucina.
Cultivo celular, constructos de ADN, transfeccion, precipitacion conjunta y analisis de transferencia Western
Las celulas HEK (293T) se transfectaron a una confluencia del 60% usando transfeccion con fosfato de calcio. Para hacer proteinas de fusion marcadas con his y myc en el extremo terminal C, se clonaron nefrina humana de longitud completa y Robo2 en el vector pSecTag B (Invitrogen) en los sitios de restriccion HindIII/EcoRI y EcoRI/XhoI respectivamente. Se obtuvo Robo2-ANBD al eliminar el dominio de union a Nck (Figura 2C) usando el kit de mutagenesis dirigida al sitio QUIKCHANGE (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Robo2 y Nckl no etiquetados se clonaron en el vector pCS2 (Addgene) en los sitios EcoRI/XhoI, la nefrina en los sitios HindIII/EcoRI. Los constructos Slit2 humanos etiquetados con Fyn y myc se han informado previamente (Li y colaboradores, 2008; Wong y colaboradores, 2001). Los constructos CD16/7-NCD y CD16/7-HA tambien se informaron previamente (Verma y colaboradores, 2006). Para detectar la interaccion de Robo2 y Nckl, se expreso Robo2 o Robo2-ANBD humano marcado con His y myc en el extremo terminal C en celulas HEK. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, las celulas se lisaron en el regulador de lisis (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, TX100 al 0,5%, inhibidor de proteasa 1x [pH 8,0]). Los lisados celulares se centrifugaron durante 10 minutos a 4°C; los sobrenadantes se incubaron con resina Ni-NTA (Qiagen) a 4°C durante 2 horas para precipitar His-Robo2, se uso resina NTA sin Ni como control. La resina se lavo tres veces con regulador de lavado (NaH2PO450 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, TX100 al 0,5% [pH 8,0]) y se calento a 95°C durante 10 min. Los precipitados se resolvieron en geles de SDS-PAGE y se transfirieron con anticuerpos anti-myc de conejo, anticuerpos monoclonales de conejo anti-Nckl (Cell Signaling) a una dilucion de 1: 1000. Para examinar la triple interaccion entre Robo2, Nckl y nefrina, se expresaron conjuntamente His-myc-Robo2 o His-myc-Robo2-ANBD en celulas HEK con nefrina humana y Fyn humana. His-myc-Robo2 se precipito con perlas de Ni-NTA como se describio anteriormente. Para confirmar la interaccion triple, His-myc-nefrina se expreso conjuntamente con Robo2, y Fyn en las celulas HEK y His-myc-nefrina se redujo con perlas de Ni-NTA. Los precipitados se transfirieron con anticuerpos anti-myc policlonal de conejo, anti-Nckl monoclonal de conejo, anti-nefrina policlonal de conejo, anti-Robo2 monoclonal de raton (R&D Systems) y anti-Fyn policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology) a una dilucion de 1:1000. Para la inmunoprecipitacion conjunta de proteinas endogenas, se homogeneizaron los rinones de ratones recien nacidos en el regulador RIPA (Tris 50 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, Sd S al 0,1%, NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, Na3VO41 mM, NaF 1 mM, inhibidor de proteasa 1x) en hielo. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante se incubo con 1 gg de anticuerpo anti-Robo2 monoclonal de raton (R&D Systems) durante 1 hora a 4°C. Se utilizo como control IgG de cabra de control (Santa Cruz Biotechnology). Las muestras se mezclaron luego con 30 gL de la suspension de perlas de agarosa de proteina A/G Plus (Santa Cruz Biotechnology) y se incubaron adicionalmente durante 12 horas a 4°C. Las perlas se lavaron luego tres veces en el regulador RIPA y las proteinas se eluyeron en regulador de carga de proteinas 1x calentando a 95°C durante 10 min. Los precipitados se resolvieron en geles de SDS-PAGE y se transfirieron con anticuerpos anti-Robo2 de raton, anti-nefrina de conejo y anti-Nckl de conejo como se describio anteriormente. La actina se transfirio con un anticuerpo de raton anti-beta-actina de Sigma. La intensidad de las bandas se midio usando ImageJ. Para la deteccion de la proteinuria, las muestras de orina puntuales de ratones se recogieron y se diluyeron con un regulador de carga de proteinas 1x a una dilucion de 1:100. Las proteinas de la orina se resolvieron luego en geles de SDS-PAGE y se uso albumina purificada como control (MP Biomedicals). Los geles se transfirieron con anticuerpo policlonal anti-albumina de conejo (MP Biomedicals).
Entrecruzamiento de CD16/7-NCD y ensayo de polimerizacion de actina
El entrecruzamiento mediado por el anticuerpo CD16 de las protefnas de fusion CD16/7 se ha descrito previamente (Jones y colaboradores, 2006; Rivera y colaboradores, 2004; Verma y colaboradores, 2006). Brevemente, CD16/7-NCD o CD16/7-HA se expresaron conjuntamente en celulas HEK con Robo2. Despues de 24 horas, las celulas se transfirieron y se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con polilisina durante otras 24 horas. Las celulas se incubaron luego con 1 pg/mL con anticuerpo monoclonal de raton anti-CD16 (Beckman Coulter) durante 30 min a 37°C, se lavaron una vez con DMEM, se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con rodamina (Thermo Scientific) diluido en medio acondicionado con Slit2 (Wong y colaboradores, 2001) o medio de control acondicionado durante 30 min y fijado en paraformaldehfdo al 4% en 1x PBS. La F-actina se tino usando faloidina conjugada con FITC (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los haces de F-actina recientemente formados se adhieren a la nefrina agrupada (CD16/7-NCD) y parecen colas de cometa (es decir, colas de actina en el texto principal) bajo el microscopio de fluorescencia. En este experimento, solo se analizaron los haces de F-actina formados por la agrupacion de CD16/7-NCD y unidos a las agrupaciones. Las celulas con colas de F-actina se contaron y se compararon con el total de celulas transfectadas con CD16/7-NCD. La formula de cuantificacion es: Porcentaje% = (numero de celulas transfectadas con colas de F-actina/numero total de celulas transfectadas) x 100. Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio confocal LSM510 con un objetivo de inmersion en aceite 60x.
Generacion y caracterizacion de ratones con desactivacion especffica para podocitos de Robo2 y ratones con desactivacion doble de Robo2-Nefrina
La generacion y el genotipado del alelo condicional Robof x , alelo mutante de lfnea germinal Robo2del5 (tambien llamado Robo2 indistintamente en este artfculo), y el alelo de tipo silvestre Robo2+ se describieron anteriormente (Lu y colaboradores, 2007; Wang y colaboradores, 2011). Se siguio el esquema de reproduccion estandar para generar ratones con desactivacion de Robo2del5/flox;TgNphs2-Cre/+, especfficos para podocitos de Robo2, que portan un alelo Robo2del5 y un alelo Robo2flox. En este mutante compuesto, la recombinasa Cre especffica de podocitos dirigida por el promotor de podocina elimina solo el alelo Robo2*lox para facilitar la penetracion de un fenotipo porque el otro alelo, Robo2del5, se ha eliminado de forma ubicua de la expresion de la lfnea germinal. La autenticidad de los ratones Robo2del5/flox;TgNphs2-Cre/+ se determino mediante el genotipado del ADN de la cola para la presencia de los alelos Robo2del5 y Robo2flox asf como el transgen TgNphs2-Cre. Los ratones Robo2flox/+ de las camadas F2 sin el alelo Robo2del5 y el transgen TgNphs2-Cre se utilizaron como controles. Para generar ratones con desactivacion doble de Robo2-nefrina, se cruzaron ratones heterocigotos Robo2+/- con ratones heterocigotos Nphs1+/- que se generaron previamente (Hamano y colaboradores, 2002). Despues de la generacion de ratones heterocigotos dobles Robo2+/-;Nphs1+/-, se realizo el cruce de ratones heterocigotos dobles para generar ratones homocigotos dobles para Robo2"/-;Nphs1-/- asf como homocigotos sencillos Robo1-/-, homocigotos sencillos, Robo2/-, y controles de tipo silvestre Robo2+/+;Nphs1+/+. Los protocolos de raton fueron aprobados por el Comite Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro Medico de la Universidad de Boston (# 14388).
Microscopfa electronica de transmision y barrido
Para la microscopfa electronica de transmision, se diseccionaron los rinones de ratones nulos homocigotos para robo2 y ratones con desactivacion especfficos para podocitos, se fijaron en PLP a 4°C durante la noche, y luego se incubaron en glutaraldehfdo al 2% en cacodilato de sodio 0,15 M durante 6 horas. Despues de lavar en 1x PBS, los rinones fijados se deshidrataron en etanol graduado, se embebieron en Epon, se seccionaron y se tineron con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las secciones de rinon ultrafino se prepararon y examinaron utilizando un microscopio electronico JEM-1011. Las camadas de tipo silvestre se utilizaron como controles. Para la microscopfa electronica de barrido, se prepararon muestras de rinon de ratones nulos homocigotos para Robo2, ratones con desactivacion especffica para podocitos, ratones nulos homocigotos para nefrina y ratones homocigotos dobles para Robo2-nefrina, de acuerdo con el protocolo descrito previamente (Friedman y Ellisman, 1981) con modificaciones menores. Brevemente, el rinon se perfundio con glutaraldehfdo al 2,5% y solucion de paraformaldehfdo al 2% en regulador de cacodilato 0,1 M (fijador de Karnovsky, Electron Microscopy Sciences), y posteriormente se fijo en el fijador de Karnovsky durante 24 horas seguido de una fijacion posterior en solucion de tetraóxido de osmio al 2% (Electron Microscopy Sciences). Las muestras de rinon se criofracturaron, se deshidrataron y se secaron con hexametildisilazano (Electron Microscopy Sciences). Se tomaron imágenes de las muestras de rinon utilizando un microscopio electronico de barrido Amray 1000A y Jeol 6340F. Se examinaron tres glomerulos de cada animal para proporcionar imágenes representativas.
Estudios patologicos de rinon de ratones, cuantificacion del numero de podocitos y analisis de proteinuria
Para estudios patologicos de rinon, los rinones se diseccionaron y se fijaron en paraformaldehfdo al 4% durante la noche, y luego se trataron con una serie de etanol graduada para inclusion en parafina. Los bloques de parafina del rinon se seccionaron a 4 pm usando un microtomo MT-920 (MICROM) y se tineron con los metodos estandar con acido peryodico-Schiff (PAS) o hematoxilina eosina (H&E). Los glomerulos se examinaron y evaluaron para determinar la deposicion de la matriz, la glomeruloesclerosis segmentaria y las dilataciones del espacio de Bowman utilizando un microscopio de luz Olympus BHT equipado con un sistema de camara digital SPOT. Para la cuantificacion del numero de podocitos, se uso WT1 como marcador nuclear de podocitos y se realizo una tincion con inmunoperoxidasa en secciones de rinon siguiendo el protocolo descrito anteriormente (Sanden y colaboradores, 2003). Brevemente, se cortaron secciones de 4 pm de rinon embebidas en parafina de 4 ratones de un ano de edad con desactivacion especifica para podocitos de Robo2del5/flox;TgNphs2-Cre+ y 4 ratones de control de tipo silvestre de la misma edad y se tineron con anticuerpo WT1 (Santa Cruz Biotechnology) despues de la recuperació dnel antigeno con microondas. Se utilizaron el anticuerpo secundario biotinilado y el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) para detectar la senal de WT1. Los nucleos de podocitos positivos para WT1 en cada seccion transversal glomerular se contaron en un total de 165 glomerulos de cuatro ratones mutantes y 166 glomerulos de cuatro ratones de control. Para el analisis de proteinuria, se examinaron muestras de orina "puntuales" de ratones de 6 semanas de edad utilizando un kit de cuantificacion ELISA de albuminuria murina sensible (Exocell) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la varilla graduada de orina (Multistix de Bayer, IN) como metodo de cribado. La albumina en orina se normalizo con creatinina para proporcionar una proporcion de albumina/creatinina. La creatinina en la orina se determino utilizando el kit de deteccion de creatinina (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La albumina en orina tambien se examino con SDS-PAGE al 12% y se transfirio con anticuerpo anti-albumina (MP Biomedicals). Los datos de los mutantes y los controles se analizaron utilizando ANOVA de una via, prueba de t de Student y prueba de Chi cuadrado.
Tabla 1. Analisis cuantitativo de glomerulos con aumento de la expansion de matriz en ratones de 2 a 9 meses de edad con desactivacion especifica para podocitos de Robo2 (mutantes) en comparacion con los controles (tipo silvestre)
Figure imgf000047_0001
Tabla 2. Analisis cuantitativo de glomerulos con mayor expansion de matriz en ratones de 12 meses de edad con desactivacion especifica para podocitos de Robo2 (mutantes) en comparacion con los controles (tipo silvestre)
Figure imgf000047_0002
Figure imgf000048_0001
Tabla 3. Analisis de la morfologia de glomerulos con espacio de Bowman dilatado en ratones recien nacidos homocigotos sencillos para Nphs1-/- (Robo2+/-;Nphs1'/') comparado con homocigotos dobles para Robo2/-;Nphs1'/' por histologia
Figure imgf000048_0002
Tabla 4. Analisis de la morfologia del fenotipo del proceso del pie (FP) interdigitante del podocito glomerular en ratones recien nacidos homocigotos sencillos para Nphs1-/- (Robo2+/-;Nphs1'/') comparado con homocigotos dobles para
Robo2/~;Nphs1'/' por microscopia electronica de barrido
Figure imgf000048_0003
Referencias
Bashaw, G. J., Kidd, T., Murray, D., Pawson, T., y Goodman, C. S. (2000). Repulsive axon guidance: Abelson and Enabled play opposing roles downstream of the roundabout receptor. Cell 101,703-715.
Dickson, B. J., y Gilestro, G. F. (2006). Regulation of commissural axon pathfinding by slit and its Robo receptors. Annu Rev Cell Dev Biol 22, 651-675.
Done, S. C., Takemoto, M., He, L., Sun, Y., Hultenby, K., Betsholtz, C., y Tryggvason, K. (2008). Nephrin is involved in podocyte maturation but not survival during glomerular development. Kidney Int 73, 697-704.
Fan, X., Labrador, J. P., Hing, H., y Bashaw, G. J. (2003). Slit stimulation recruits Dock and Pak to the roundabout receptor and increases Rac activity to regulate axon repulsion at the CNS midline. Neuron 40, 113-127.
Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., y Mundel, P. (2007). Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends Cell Biol 17, 428-437.
Furness, P. N., Hall, L. L., Shaw, J. A., y Pringle, J. H. (1999). Glomerular expression of nephrin is decreased in acquired human nephrotic syndrome. Nephrol Dial Transplant 14, 1234-1237.
Garg, P., Verma, R., Cook, L., Soofi, A., Venkatareddy, M., George, B., Mizuno, K., Gurniak, C., Witke, W., y Holzman, L. B. (2010). Actin-depolymerizing factor cofilin-1 is necessary in maintaining mature podocyte architecture. J Biol Chem 285, 22676-22688.
Grieshammer, U., Le, M., Plump, A. S., Wang, F., Tessier-Lavigne, M., y Martin, G. R. (2004). SLIT2-mediated ROBO2 signaling restricts kidney induction to a single site. Dev Cell 6, 709-717.
Guan, K. L., y Rao, Y. (2003). Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci 4, 941-956.
Hamano, Y., Grunkemeyer, J. A., Sudhakar, A., Zeisberg, M., Cosgrove, D., Morello, R., Lee, B., Sugimoto, H., y Kalluri, R. (2002). Determinants of vascular permeability in the kidney glomerulus. J Biol Chem 277, 31154-31162. Jones, N., Blasutig, I. M., Eremina, V., Ruston, J. M., Bladt, F., Li, H., Huang, H., Larose, L., Li, S. S., Takano, T., y colaboradores (2006). Nck adaptor proteins link nephrin to the actin cytoskeleton of kidney podocytes. Nature 440, 818-823.
Lu, W., van Eerde, A. M., Fan, X., Quintero-Rivera, F., Kulkarni, S., Ferguson, H. L., Kim, H., Fan, Y., Xi, Q., Li, Q. G., y colaboradores (2007). Disruption of ROBO2 is associated with urinary tract anomalies and confers risk of vesicoureteral reflux. Am J Hum Genet 80, 616-632.
Nachman, P. H., Jennette, J. C., y Falk, R. J. (2008). Primary glomerular disease. En Brenner & Rector's The Kidney, B. M. Brenner, ed. (Pheladelphia, Saunders), paginas 987-1066.
Patrakka, J., Ruotsalainen, V., Reponen, P., Qvist, E., Laine, J., Holmberg, C., Tryggvason, K., y Jalanko, H. (2002). Recurrence of nephrotic syndrome in kidney grafts of patients with congenital nephrotic syndrome of the Finnish type: role of nephrin. Transplantation 73, 394-403.
Piper, M., Anderson, R., Dwivedy, A., Weinl, C., van Horck, F., Leung, K. M., Cogill, E., y Holt, C. (2006). Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron 49, 215-228.
Piper, M., Georgas, K., Yamada, T., y Little, M. (2000). Expression of the vertebrate Slit gene family and their putative receptors, the Robo genes, in the developing murine kidney. Mech Dev 94, 213-217.
Reeves, W., Caulfield, J. P., y Farquhar, M. G. (1978). Differentiation of epithelial foot processes and filtration slits: sequential appearance of occluding junctions, epithelial polyanion, and slit membranes in developing glomeruli. Lab Invest 39, 90-100.
Rivera, G. M., Briceno, C. A., Takeshima, F., Snapper, S. B., y Mayer, B. J. (2004). Inducible clustering of membranetargeted SH3 domains of the adaptor protein Nck triggers localized actin polymerization. Curr Biol 14, 11-22.
Seiler, M. W., Venkatachalam, M. A., y Cotran, R. S. (1975). Glomerular epithelium: structural alterations induced by polycations. Science 189, 390-393.
Shih, N. Y., Li, J., Cotran, R., Mundel, P., Miner, J. H., y Shaw, A. S. (2001). CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. Am J Pathol 159, 2303-2308.
Topham, P. S., Kawachi, H., Haydar, S. A., Chugh, S., Addona, T. A., Charron, K. B., Holzman, L. B., Shia, M., Shimizu, F., y Salant, D. J. (1999). Nephritogenic mAb 5-1-6 is directed at the extracellular domain of rat nephrin. J Clin Invest 104, 1559-1566.
Tryggvason, K., Patrakka, J., y Wartiovaara, J. (2006). Hereditary proteinuria syndromes and mechanisms of proteinuria. N Engl J Med 354, 1387-1401.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de ROBO2 que inhibe la actividad biologica de ROBO2, en la que el inhibidor de ROBO2 es una protefna ROBO2 soluble que comprende un polipeptido de fusion que comprende los dominios de union a SLIT de Ig1 e Ig2 de ROBO2 sin dominio de ROBO2 intracelular.
2. La composicion farmaceutica de la 1, en la qu ree eivli inndhiibciadocrió dne ROBO2 previene o reduce la union del polipeptido ROBO2 a SLIT2, a Nck, o a ambos.
3. La composicion farmaceutica de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el dominio de union a SLIT de IgS1 comprende los residuos de aminoacidos 46-145 de la SEQ ID NO: 1 o los residuos de aminoacidos 30-129 de la SEQ ID NO: 3.
4. La composicion farmaceutica de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el dominio de union a SLIT de Ig2 comprende los residuos de aminoacidos 151-237 de la SEQ ID NO: 1 o los residuos de aminoacidos 135-221 de la SEQ ID NO: 3.
5. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la protefna ROBO2 soluble comprende los residuos de aminoacidos 30-129 y los residuos de aminoacidos 135-221 de la SEQ ID NO: 3.
6. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o esta en riesgo de una enfermedad renal cronica o proteinuria.
7. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que la enfermedad renal cronica o proteinuria es causada por nefropatfa diabetica o presion arterial alta.
ES13733786T 2012-01-05 2013-01-04 Señalización de SLIT-ROBO para el diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad de riñón Active ES2714700T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261583379P 2012-01-05 2012-01-05
PCT/US2013/020280 WO2013103811A2 (en) 2012-01-05 2013-01-04 Slit-robo signaling for diagnosis and treatment of kidney disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2714700T3 true ES2714700T3 (es) 2019-05-29

Family

ID=48745540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13733786T Active ES2714700T3 (es) 2012-01-05 2013-01-04 Señalización de SLIT-ROBO para el diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad de riñón

Country Status (29)

Country Link
US (2) US9572879B2 (es)
EP (1) EP2800578B1 (es)
JP (2) JP6153946B2 (es)
KR (1) KR102103323B1 (es)
CN (2) CN106390118B (es)
AU (2) AU2013207484B2 (es)
BR (1) BR112014016493A2 (es)
CA (1) CA2860558C (es)
CO (1) CO7020918A2 (es)
CY (1) CY1121529T1 (es)
DK (1) DK2800578T3 (es)
ES (1) ES2714700T3 (es)
HK (1) HK1202085A1 (es)
HR (1) HRP20190116T1 (es)
HU (1) HUE041779T2 (es)
IL (1) IL233462B (es)
LT (1) LT2800578T (es)
MX (1) MX351313B (es)
MY (1) MY170143A (es)
PE (1) PE20141473A1 (es)
PH (2) PH12018502577A1 (es)
PL (1) PL2800578T3 (es)
PT (1) PT2800578T (es)
RS (1) RS58517B1 (es)
RU (1) RU2674153C2 (es)
SG (2) SG10201605361RA (es)
SI (1) SI2800578T1 (es)
TR (1) TR201821294T4 (es)
WO (1) WO2013103811A2 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9700593B2 (en) * 2013-06-04 2017-07-11 The Hospital For Sick Children Methods and uses of slit for treating fibrosis
US11101021B2 (en) * 2014-08-08 2021-08-24 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Electronic phenotyping technique for diagnosing chronic kidney disease
KR102011957B1 (ko) 2016-06-08 2019-08-19 재단법인 아산사회복지재단 Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
WO2017213435A1 (ko) * 2016-06-08 2017-12-14 재단법인 아산사회복지재단 Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
EP3527655A4 (en) 2016-10-11 2020-05-06 Tokushima University METHOD FOR PRODUCING RENAL-LIKE BIOLOGICAL TISSUE
JP2020515832A (ja) * 2017-03-25 2020-05-28 シャリテ−ウニベルジテーツメディツィン ベルリン 腎疾患のバイオマーカーとしての尿のフローサイトメトリー
CN108929383B (zh) 2017-05-26 2021-10-15 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 重组Slit2D2(C386S)-HSA融合蛋白及其在预防和/或治疗肺部炎症中的应用
WO2018222850A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Pfizer Inc. Recombinant robo2 proteins, compositions, methods and uses thereof
AU2018279705A1 (en) * 2017-06-09 2019-11-14 Boston Medical Center Corporation Anti-ROBO2 antibodies, compositions, methods and uses thereof
US11406682B2 (en) 2017-08-24 2022-08-09 Bar-Ilan University Roundabout (Robo) receptor inhibitors and uses thereof
CN108753818B (zh) * 2018-04-24 2022-01-28 深圳市第二人民医院 RNA信号连接器、靶mRNA翻译调控方法、逻辑门及应用
WO2019237158A1 (en) * 2018-06-15 2019-12-19 Microba Life Sciences Limited Methods for sample preparation and microbiome characterisation
US20200339676A1 (en) * 2019-04-23 2020-10-29 The Regents Of The University Of California Compositions and methods useful in promoting milk production
BR112022024233A2 (pt) 2020-05-29 2022-12-27 Rokit Healthcare Inc Composição de tratamento renal usando omento, kit médico de tratamento renal que compreende a mesma e filme de tratamento renal que compreende produto curado da mesma
CN115068480B (zh) * 2022-08-09 2023-10-20 郑州大学第一附属医院 细胞分裂周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用
WO2024061158A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Everest Medicines (China) Co., Ltd. Slit2 related compositions and methods

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
GB2236186B (en) 1989-08-22 1994-01-05 Finnigan Mat Gmbh Process and device for laser desorption of analyte molecular ions, especially of biomolecules
US5045694A (en) 1989-09-27 1991-09-03 The Rockefeller University Instrument and method for the laser desorption of ions in mass spectrometry
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
AU676582B2 (en) 1993-05-28 1997-03-13 Baylor College Of Medicine Method and apparatus for desorption and ionization of analytes
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
ATE245190T1 (de) * 1997-10-20 2003-08-15 Univ California Robo: eine familie polypeptiden und nukleinesäuren wirksam in nervenzellleitung
US6365185B1 (en) 1998-03-26 2002-04-02 University Of Cincinnati Self-destructing, controlled release peroral drug delivery system
US20030077616A1 (en) 2001-04-19 2003-04-24 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomolecule characterization using mass spectrometry and affinity tags
US8068987B2 (en) 2001-08-13 2011-11-29 Bg Medicine, Inc. Method and system for profiling biological systems
EP2316853A3 (en) * 2002-03-08 2011-10-05 Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS Detection and modulation of slit and roundabout (robo) mediated angiogenesis and uses thereof
US20030199001A1 (en) 2002-04-23 2003-10-23 Pitt Aldo M. Sample preparation of biological fluids for proteomic applications
WO2007022248A2 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Methods of detection of cancer using peptide profiles
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
JP2014507395A (ja) 2010-12-23 2014-03-27 サノフイ 肝癌の治療における使用のためのＲｏｂｏ１−Ｆｃ融合タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
EP2800578A4 (en) 2015-07-15
WO2013103811A2 (en) 2013-07-11
CN106390118A (zh) 2017-02-15
JP2015510500A (ja) 2015-04-09
US20150037325A1 (en) 2015-02-05
MY170143A (en) 2019-07-08
PH12014501538B1 (en) 2014-10-08
US10358677B2 (en) 2019-07-23
US9572879B2 (en) 2017-02-21
HUE041779T2 (hu) 2019-05-28
EP2800578A2 (en) 2014-11-12
AU2013207484B2 (en) 2017-10-12
TR201821294T4 (tr) 2019-01-21
US20170114412A1 (en) 2017-04-27
MX2014008088A (es) 2014-09-25
IL233462B (en) 2020-05-31
CN104271197A (zh) 2015-01-07
PT2800578T (pt) 2019-03-18
PH12018502577B1 (en) 2020-03-02
CA2860558C (en) 2021-03-02
IL233462A0 (en) 2014-08-31
HK1202085A1 (en) 2015-09-18
AU2018200105A1 (en) 2018-01-25
BR112014016493A2 (pt) 2021-08-10
AU2013207484A1 (en) 2014-07-24
SG11201403746SA (en) 2014-07-30
RS58517B1 (sr) 2019-04-30
SI2800578T1 (sl) 2019-03-29
BR112014016493A8 (pt) 2017-07-04
JP6153946B2 (ja) 2017-06-28
HRP20190116T1 (hr) 2019-03-08
CY1121529T1 (el) 2020-05-29
JP2017193559A (ja) 2017-10-26
RU2674153C2 (ru) 2018-12-05
KR102103323B1 (ko) 2020-05-29
WO2013103811A3 (en) 2014-08-28
CA2860558A1 (en) 2013-07-11
CN106390118B (zh) 2021-05-11
EP2800578B1 (en) 2018-12-05
PH12014501538A1 (en) 2014-10-08
LT2800578T (lt) 2019-02-11
PE20141473A1 (es) 2014-11-05
KR20140123516A (ko) 2014-10-22
PL2800578T3 (pl) 2019-05-31
CO7020918A2 (es) 2014-08-11
PH12018502577A1 (en) 2020-03-02
MX351313B (es) 2017-10-10
SG10201605361RA (en) 2016-08-30
DK2800578T3 (en) 2019-03-25
RU2014132108A (ru) 2016-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2714700T3 (es) Señalización de SLIT-ROBO para el diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad de riñón
US20210371535A1 (en) Modulators of ror1-ror2 binding
Löwik et al. Molecular genetic analysis of podocyte genes in focal segmental glomerulosclerosis—a review
Alka et al. Bicarbonate transport in health and disease
Shirata et al. Glomerulosclerosis induced by deficiency of membrane-associated guanylate kinase inverted 2 in kidney podocytes
ES2731609T3 (es) Polipéptidos ERFE y eritroferrona y métodos de regulación del metabolismo del hierro
Hu et al. Cisplatin-mediated upregulation of APE2 binding to MYH9 provokes mitochondrial fragmentation and acute kidney injury
ES2830849T3 (es) Ensayo y método para tratar sujetos con enfermedades inmunomediadas
Liu et al. Mitofusin2 Ameliorated Endoplasmic Reticulum Stress and Mitochondrial Reactive Oxygen Species Through Maintaining Mitochondria-Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Integrity in Cisplatin-Induced Acute Kidney Injury
US8449864B2 (en) Neurotensin as a marker and therapeutic target for sepsis
US20230016187A1 (en) Trem-1 inhibitors for the treatment of vaso-occlusions and tissue injuries in patients suffering from sickle cell disease
US20220307034A1 (en) Inhibiting ape2 expression in a subject treated with a drug agent that causes increased ape2 expression
US8980861B2 (en) Method for determining activators of excitatory synapse formation
ES2304818B1 (es) Metodos para el diagnostico y pronostico de las enfermedades desmielinizantes y para el desarrollo de medicamentos contra las enfermedades desmielinizantes.
Rizvi Investigating the pathophysiological mechanisms linked to 2 membrane proteins: the choline transporter 1 and the kidney anion exchanger 1