BR112019013388A2

BR112019013388A2 - Compostos de 1h-pirrol-2,5-diona e métodos de uso dos mesmos para induzir a autorrenovação de células de suporte tronco/progenitoras

Info

Publication number: BR112019013388A2
Application number: BR112019013388-7A
Authority: BR
Inventors: Loose Christopher; Tait Bradley; Manchanda Rajesh; Mclean Will
Original assignee: Frequency Therapeutics, Inc.
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2020-03-03
Also published as: US20210300948A1; JP7109446B2; US11066419B2; MX2019007890A; KR20190104359A; AU2017386417B2; CN110392686A; AU2017386417A1; EP3562827A1; CA3048220A1; WO2018125746A1; US20190352313A1; SG10201910821XA; IL267601A; JP2020503340A

Abstract

a presente invenção refere-se a compostos de 1h-pirrol-2,5-diona e métodos de usá-los para induzir a autorrenovação de células de supor-te tronco/progenitoras, incluindo a indução das células-tronco/progenitoras para proliferarem enquanto mantendo, nas células-filha, a capacidade de se diferenciar em células de tecido.

Description

[001] Este aplicativo reivindica prioridade ao Pedido U.S. Nos. 62/484.282, depositado em 11 de Abril de 2017, e 62/441.060, depositado em 30 de Dezembro de 2016, os conteúdos completos dos quais estão aqui incorporados por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se a compostos de 1 H-pirrol2,5-diona e métodos de uso destes para induzir a autorrenovação das células de suporte tronco/progenitoras, incluindo a indução das células-tronco/progenitoras para proliferar enquanto mantendo, nas células-filha, a capacidade de se diferenciar em células do tecido.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO [003] As células-tronco exibem uma extraordinária capacidade de gerar vários tipos de células no corpo. Além das células-tronco embrionárias, as células-tronco específicas de tecido desempenham um papel crítico durante o desenvolvimento, bem como na homeostasia e reparação de lesões em adultos. As células-tronco se renovam por meio da proliferação bem como geram tipos de células específicas de tecido por meio da diferenciação. As características das diferentes células-tronco variam de tecido para tecido, e são determinadas pelo seu estado genético e epigenético intrínseco. No entanto, o equilíbrio entre a autorrenovação e diferenciação de diferentes células-tronco é estritamente controlado. A autorrenovação descontrolada pode levar ao crescimento excessivo de células-tronco e possivelmente a formação de tumor, enquanto a diferenciação descontrolada pode esgotar o pool de células-tronco, levando a uma capacidade perjudicada para manter

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2/196 a homeostasia do tecido. Assim, as células-tronco continuamente sentem seu ambiente e respondem apropriadamente com proliferação, diferenciação ou apoptose. Seria desejável conduzir a regeneração controlando o tempo e a extensão da proliferação e diferenciação das células-tronco. O controle da proliferação com moléculas pequenas que são eliminadas ao longo do tempo permitiría controlar o tempo e a extensão da proliferação e diferenciação das células-tronco. Notavelmente, as células-tronco de tecidos a partir de diferentes tecidos partilham um número limitado de vias de sinalização para a regulação da sua autorrenovação e diferenciação, embora de uma maneira muito dependente do contexto. Algumas dessas vias são as vias Wnt e GSK3.

[004] Lgr5 é expressa através de uma faixa diversa de tecidos e tem sido identificada como um biomarcador de células-tronco adultas em uma variedade de tecidos tais como o epitélio intestinal (Barker et al., 2007), rim, folículo piloso, e estômago (Barker et al., 2010; Haegebarth & Clevers, 2009). Por exemplo, foi publicado pela primeira vez em 2011, que as células ciliadas do ouvido interno de mamífero, são derivados a partir de células LGR5⁺ (Chai et al, 2011, Shi et al. 2012). Lgr5 é um componente conhecido da via de Wnt/beta-catenina, que tem sido demonstrado que desempenham papéis importantes na diferenciação, proliferação, e indução das características de células-tronco (Barker et al., 2007).

[005] Danos permanentes às células ciliadas do ouvido interno resultam na perda auditiva neurossensorial, levando a dificuldades de comunicação em uma grande porcentagem da população. As células ciliadas são as células receptoras que transduzem o estímulo acústico. A regeneração de células ciliadas danificadas fornecería uma via para o tratamento de uma condição que atualmente não tem terapias além de dispositivos protéticos. Embora as células ciliadas não se regenePetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 22/245

3/196 ram na cóclea dos mamíferos, novas células ciliadas em vertebrados inferiores são geradas de células epiteliais, as chamadas células de suporte, que envolvem as células ciliadas.

[006] O trabalho anterior tem incidido sobre a transdiferenciação de células de suporte em células ciliadas, através da ativação ou expressão forçada de genes que levam à formação de células ciliadas, com um foco particular em mecanismos para realçar a expressão de Atohl (Bermingham et al, 1999;. Zheng e Gao, 2000; Izumikawa et al., 2005; Mizutari et al., 2013). Curiosamente, as células transduzidas com vetores Atohl foram mostradas para adquirir fenótipos vestibulares (Kawamoto et al, 2003;. Huang et al, 2009; Yang et al, 2012, 2013), e carecem de desenvolvimento completo. Como mencionado, a subregulação de Atohl por meio da inserção de gene tem sido demonstrada para criar os tipos de células não cocleares que se comportam de um modo que não é encontrado no interior da cóclea nativa. Além disso, esses métodos aumentam o número de células ciliadas, porém, diminuem o número de células de suporte. Visto que as células de suporte são conhecidas por ter papéis especializados (RamirezCamancho 2006, Dale e Jagger 2010), a perda dessas células poderia criar problemas na função coclear adequada.

[007] Assim, há uma necessidade há muito sentida de novos compostos que possam preservar/promover a função das células existentes após a lesão.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [008] A presente descrição fornece compostos de Fórmula (I),

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4/196

[009] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos, em que:

[0010] Q¹ é CH ou N;

[0011] Q²éCouN;

[0012] Q³éCouN;

[0013] em que pelo menos um dentre Q¹, Q², e Q³ é N;

[0014] R¹ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^1a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^1a é Ci-C4alquila;

[0015] R² é selecionado a partir do grupo consistindo em halo, C1C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -O-Ci-C4alquila, NH2, -NH(Ci-C4alquil), -N(Ci-C4alquil)2, -NHC(O)R^2a, e -S(O)2NH₂; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^2a é Ci-C4alquila;

[0016] R³ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^3a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^3a é Ci-C4alquila;

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5/196 [0017] Ar é selecionado a partir do grupo consistindo em

[0018] -Z-W-X-Y- é -C(R^Z)2-C(R^W)2-N(R^X)-C(R^Y)2-, -C(R^z)2-C(R^w)2CH(R^x)-C(R^y)2-, ou -C(R^w)2-CH(R^x)-C(R^y)2-;

[0019] cada R^z é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^z juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo;

[0020] cada R^w é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^w juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo;

[0021] ou R^z e R^w juntamente com os carbonos aos quais eles são ligados formam uma Cs-Cecicloalquila;

[0022] R^x é selecionado a partir do grupo consistindo em -COR^X1, SO₂R^X1, heteroarila, e -(Ci-C4alquileno)-(C3-C8cicloalquil), e em que o (Ci-C4alquileno)-(C3-C8cicloalquil) é opcionalmente substitutído com um a quatro halo no Ci-C4alquileno;

[0023] em que R^X1 é heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com um a doze substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em deutério, halo, [C(R^x1a)2]p-CN, -CF3, Ci-C4alquila, -(CH2)P-OH, -[C(R^x1a)2]_p-OH, [C(R^x1a)2]p-O-Ci-C4alquila, -NHCOCi-C4alquila, -CONHCi-C4alquila, COH, -CO2H, -[C(R^x1a)2]_p-COO-Ci-C₄alquila, -(CH₂)_P-NH₂, -[C(R^x1a)2]pNH2, -[C(R^x1a)2]_p-NH-Ci-C₄alquila, -[C(R^x1a)₂]_p-N-(Ci-C₄alquil)₂; em que p é 0, 1, 2, ou 3; em que cada R^x1a é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, -CF3, e C1Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 25/245

6/196

C4alquila, ou ambos grupos R^x1ajuntamente formam Cs-Cecicloalquila; [0024] ou R^X1 é N(R^X2)₂ em que R^X2é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, alquila, alquila substituída, em que a substituição de alquila pode ser halo, heterociclos e heterociclos substituídos; cada R^Y é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^Y juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo; e [0025] m é 0, 1, ou 2.

[0026] Em algumas modalidades, os compostos de Fórmula (I) têm um ou mais dos seguintes aspectos:

[0027] a) contanto que o composto não seja

[0029] A presente descrição fornece compostos de Fórmula (Ia):

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7/196

[0030] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos, em que:

[0031] Q¹ é CH ou N;

[0032] Q²éCouN;

[0033] Q³éCouN;

[0034] em que pelo menos um dentre Q¹, Q², e Q³ é N;

[0035] R¹ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^3a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^1a é Ci-C4alquila;

[0036] R² é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C₄alquila, -NH₂, -NH(Ci-C₄alquil), -N(Ci-C₄alquil)₂, -NHC(O)R^2a, e S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^2a é C1 -C4alquiIa;

[0037] R³ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^3a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^3a é Ci-C4alquila;

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8/196 [0038] Ar é selecionado a partir do grupo consistindo em

mente substitutído com deutério, halo, alquila, alcóxi, e CN;

[0039] Q⁷ é selecionado a partir de S, O, CH2, e NR^Q7; em que R^Q7 é hidrogênio ou Ci-C4alquila opcionalmente substituída;

[0040] -Z-W-X-Y- é -C(R^z)2-C(R^w)2-N(R^x)-C(R^y)2-, -C(R^z)₂-C(R^w)2CH(R^x)-C(R^y)2-, ou -C(R^w)2-CH(R^x)-C(R^y)2-;

[0041] cada R^z é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^z juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo;

[0042] cada R^w é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^w juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo;

[0043] ou R^z e R^w juntamente com os carbonos aos quais eles são ligados formam uma Cs-Cecicloalquila;

[0044] R^x é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, R^X1, -COR^X1, -SO₂R^X1, -(Ci-C4alquileno)-R^x1, e em que 0 -(C1C4alquileno)-R^x1 é opcionalmente substitutído com um a quatro halo no Ci-C4alquileno;

[0045] em que R^X1 é Cs-Cscicloalquila, heteroarila, ou heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com um a doze substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em deutério, halo, -[C(R^x1a)₂]_P-CN, -CF3, Ci-C4alquila, -(CH₂)_PPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 28/245

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OH, -[C(R^x1a)2]P-OH, -[C(R^x1a)2]_P-O-Ci-C₄alquila, -NHCOCi-C₄alquila, CONHCi-C₄alquila, COH, -CO₂H, -[C(R^x1a)2]p-COO-Ci-C4alquila, (CH2)p-NH2, -[C(R^x1a)2]_p-NH₂, -[C(R^x1a)2]p-NH-Ci-C4alquila, -[C(R^x1a)2]_pN-(Ci-C₄alquil)₂; em que p é 0, 1, 2, ou 3; em que cada R^x1a é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, -CF3, e Ci-C₄alquila, ou ambos grupos R^x1a juntamente formam Cs-Cecicloalquila;

[0046] ou R^X1 é N(R^X2)₂ em que R^X2 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, alquila, alquila substituída, em que a substituição de alquila pode ser halo, heterociclos e heterociclos substituídos;

[0047] cada R^Y é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C₄alquila, ou ambos grupos R^Y juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo; e [0048] m é 0, 1, ou 2.

[0049] A presente descrição fornece compostos de Fórmula (lb):

[0050] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos, em que:

[0051] Q¹ é CH ou N;

[0052] Q²éCouN;

[0053] Q³éCouN;

[0054] em que pelo menos um dentre Q¹, Q², e Q³ é N; e contanto que quando Q¹ for CH e Q³ for C, Q² não seja N;

[0055] R¹ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogêPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 29/245

10/196 nio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^3a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^1a é Ci-C4alquila;

[0056] R² é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C₄alquila, -NH₂, -NH(Ci-C₄alquil), -N(Ci-C₄alquil)₂, -NHC(O)R^2a, e S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^2a é C1 -C4alquiIa;

[0057] R³ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^3a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^3a é Ci-C4alquila;

[0058] Ar é selecionado a partir do grupo consistindo em

; em que Ar é opcionalmente substitutído com deutério, halo, alquila, alcóxi, e CN;

[0059] cada Q⁶ é independentemente selecionado a partir de CR^Q6

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11/196 e N; em que R^Q6 é hidrogênio, halo, -CN, alquila inferior, ou alquila substituída;

[0060] Q⁷ é selecionado a partir de S, O, CH2, e NR^Q7; em que R^Q7é hidrogênio ou Ci-C4alquila opcionalmente substituída;

[0061] -Z-W-X-Y- é -C(R^z)2-C(R^w)2-N(R^x)-C(R^y)2-, -C(R^z)₂-C(R^w)2CH(R^x)-C(R^y)2-, ou -C(R^w)2-CH(R^x)-C(R^y)2-;

[0062] cada R^z é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^z juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo;

[0063] cada R^w é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^w juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo;

[0064] ou R^z e R^w juntamente com os carbonos aos quais eles são ligados formam uma Cs-Cecicloalquila;

[0065] R^x é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, R^X1, -COR^X1, -SO₂R^X1, -(Ci-C4alquileno)-R^x1, e em que 0 -(C1C4alquileno)-R^x1 é opcionalmente substitutído com um a quatro halo no Ci-C4alquileno;

[0066] em que R^X1 é Cs-Cscicloalquila, heteroarila, ou heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com um a doze substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em deutério, halo, -[C(R^x1a)₂]_P-CN, -CF3, Ci-C4alquila, -(CH₂)_POH, -[C(R^x1a)2]P-OH, -[C(R^x1a)2]_P-O-Ci-C₄alquila, -NHCOCi-C₄alquila, CONHCi-C₄alquila, COH, -CO₂H, -[C(R^x1a)₂]_P-COO-Ci-C₄alquila, (CH₂)_p-NH₂, -[C(R^x1a)2]P-NH2, -[C(R^x1a)2]_P-NH-Ci-C₄alquila, -[C(R^x1a)₂]_PN-(Ci-C4alquil)₂; em que p é 0, 1, 2, ou 3; em que cada R^x1a é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, -CF3, e Ci-C4alquila, ou ambos R^x1a grupos juntamente formam Cs-Cecicloalquila;

[0067] ou R^X1 é N(R^X2)₂ em que R^X2 é independentemente selecioPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 31/245

12/196 nado a partir de hidrogênio, alquila, alquila substituída, em que a substituição de alquila pode ser halo, heterociclos e heterociclos substituídos;

[0068] cada R^Y é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^Y juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo; e [0069] m é 0, 1, ou 2.

[0070] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para a proliferação de células-tronco compreendendo a administração a uma população de células de uma quantidade eficaz de uma composição aqui fornecida. Em algumas modalidades, a proliferação ocorre na ausência de um ativador de incisura ou um inibidor de HDAC.

[0071] Entre os vários aspectos da presente descrição, portanto, pode notar-se um método para a ativação da via de Wnt em uma população de células para aumentar a capacidade da população de autorrenovação, isto é, a capacidade de geração repetida de células-filha com proliferação equivalente e potencial da 'especificação do destino celular', e diferenciação, isto é, a capacidade de geração de célulasfilha especificadas para a diferenciação. Em uma modalidade, a população celular é uma população de células de suporte cocleares. Preferivelmente, a via de Wnt é ativada a montante do gene c-myc em membros da população e sem qualquer modificação genética da população. Em vez disso, a via de Wnt é preferivelmente ativada por moléculas pequenas que induzem transitoriamente tal atividade. Adicionalmente, a população de células de suporte inclui preferivelmente, as células de suporte que são LGR5⁺ e endógenas para o Órgão de Corti. [0072] Um outro aspecto da presente revelação é um método para induzir a autorrenovação das células de suporte tronco/progenitoras compreendidas por uma população de célula coclear. Isto é, as células de suporte tronco/progenitoras são induzidas a proliferar (isto é, diviPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 32/245

13/196 dem e formam células-filha) mantendo ao mesmo tempo, nas célulasfilha, a capacidade de se diferenciar em células ciliadas. Em contraste, se as células de suporte tronco/progenitoras foram apenas induzidas a proliferar (sem manter a multi-potência), as células-filha que não têm a capacidade de se dividir em células ciliadas. Além disso, apenas aplicando a diferenciação de uma população de célulastronco/progenitoras pré-existente tem o potencial de esgotar o pool de células-tronco. A proliferação é preferivelmente ativada por moléculas pequenas que induzem transitoriamente tal atividade. Além disso, em certas modalidades, a população de células de suporte inclui preferivelmente, as células de suporte que são LGR5+ e endógenas para o Órgão de Corti.

[0073] Em um primeiro aspecto, métodos de utilização de compostos de 1 H-pirrol-2,5-diona para induzir a autorrenovação das células de suporte tronco/progenitoras são fornecidos. Em algumas modalidades, os compostos de 1 H-pirrol-2,5-diona são compostos de Fórmula (I).

[0074] Em certas modalidades, portanto, a presente descrição fornece métodos para induzir a autorrenovação de uma população de células de suporte por ativação de vias e mecanismos que conhecidos por estarem envolvidos na indução de propriedades de células-tronco, tais como os utilizados para criar células-tronco pluripotentes induzidas. Preferivelmente, as vias são ativadas com moléculas pequenas. Por exemplo, um composto quando aplicado in vitro a uma população de células de suporte induz a população a proliferar a um alto grau e com alta pureza em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco, e também permite que a população se diferenciar em uma população de alta pureza de uma célula de tecido em um Ensaio de Diferenciação de Células Tronco. Em uma tal modalidade, o composto induz e mantém as propriedades das células-tronco proliferando-se para produzir as células-tronco, as quais podem se dividir para muitas gerações e

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14/196 manter a capacidade de ter uma alta proporção das células resultantes ao diferenciar-se nas células de tecido. Além disso, a proliferação das células-tronco expressa os marcadores de células-tronco que podem incluir um ou mais dentre Lgr5, Sox2, Opeml, Phex, Iin28, Lgr6, ciyclina D1, Msx1, Myb, Kit, Gdnf3, Zic3, Dppa3, Dppa4, Dppaõ, Nanog, Esrrb, Rex1, Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3l, Utf1, Tcl1, Oct4, Klf4, Pax6, Six2, Zic1, Zic2, Otx2, Bmi1, CDX2, STAT3, Smadl, Smad2, smad2/3, smad4, smadõ, e smad7.

[0075] Em certas modalidades, a invenção fornece um método para expandir uma população de células cocleares em um tecido coclear compreendendo uma população origem de células. Nesta modalidade, o método compreende o contato do tecido coclear com um proliferador de células-tronco para formar uma população expandida de células no tecido coclear, em que [0076] o proliferador de células-tronco é capaz de (i) formar uma população de célula final do ensaio de proliferação de uma população de célula inicial do ensaio de proliferação durante um período de tempo do ensaio de proliferação em um ensaio de proliferação de célulastronco e (ii) formar uma população de célula final de ensaio de diferenciação de uma população de célula inicial de diferenciação em um período de tempo de ensaio de diferenciação em um ensaio de diferenciação de células-tronco em que:

[0077] (a) a população de célula inicial do ensaio de proliferação tem (i) um número inicial do ensaio de proliferação de células totais, (ii) um número inicial do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺, (iii) um número inicial do ensaio de proliferação de células ciliadas, (iv) uma fração de célula Lgr5⁺ inicial do ensaio de proliferação que se iguala à relação do número inicial do ensaio de proliferação de células de Lgr5⁺para o número inicial do ensaio de proliferação de células totais, e (v) uma fração de célula ciliada inical do ensaio de proliferação que se

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15/196 iguala à relação do número inicial do ensaio de proliferação de células pilosas para o ensaio de proliferação;

[0078] (b) a população de célula final do ensaio de proliferação tem (i) um número final do ensaio de proliferação de células totais, (ii) um número final do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺, (iii) um número final do ensaio de proliferação de células ciliadas, (iv) uma fração de célula Lgr5⁺ final do ensaio de proliferação que se iguala à relação do número final do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺ para o número final do ensaio de proliferação de células totais e (v) uma fração de célula ciliada final do ensaio de proliferação que se iguala à relação do número final do ensaio de proliferação de células ciliadas para o número final do ensaio de proliferação de células;

[0079] (c) a população de célula inicial do ensaio de diferenciação tem (i) um número inicial do ensaio de diferenciação de células totais, (ii) um número inicial do ensaio de diferenciação de células Lgr5⁺, (iii) um número inicial do ensaio de diferenciação de células ciliadas, (iv) uma fração de célula Lgr5⁺ inical do ensaio de diferenciação que s iguala à relação do número inicial do ensaio de diferenciação de células Lgr5⁺ para o número inicial do ensaio de diferenciação de células totais, e (v) uma fração de célula ciliada inicial do ensaio de diferenciação que se iguala à relação do número inicial do ensaio de diferenciação de células ciliadas para o número inicial do ensaio de diferenciação de células totais;

[0080] (d) a população de célula final do ensaio de diferenciação tem (i) um número final do ensaio de diferenciação de células totais, (ii) um número final do ensaio de diferenciação de células Lgr5⁺, (iii) um número final do ensaio de diferenciação de células ciliadas, (iv) uma fração de célula Lgr5⁺ final do ensaio de diferenciação que se iguala à relação do número final do ensaio de diferenciação de células Lgr5⁺ para o número final do ensaio de diferenciação de células totais,

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16/196 e (v) uma fração de célula ciliada final do ensaio de diferenciação que se iguala à relação do número final do ensaio de diferenciação das células ciliadas para o número final do ensaio de diferenciação das células totais;

[0081] (e) o número final do ensaio de proliferação de células

Lgr5⁺ excede o número inicial do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺ por um fator de pelo menos 10; e [0082] (f) o número final do ensaio de diferenciação das células ciliadas é um número diferente de zero.

[0083] O ensaio descrito acima não inclui a aplicação de um ativador de incisura ou um inibidor de HDAC.

[0084] Em certas modalidades, a descrição fornece um método para aumentar a densidade celular das células de suporte em uma população de célula coclear. O método compreende ativar a vias e mecanismos que induzem propriedades de células-tronco nas células de suporte, proliferar as células de suporte ativadas (mantendo ao mesmo tempo o caráter multipotente das células de suporte nas células-filha recém-formadas) e depois disso permitir (ou mesmo induzir) a população expandida a diferenciar-se em células ciliadas para formar uma população de célula coclear expandida em que a densidade celular das células ciliadas na população de célula coclear expandida excede a densidade celular das células ciliadas na população da célula coclear original (não expandida). Em algumas modalidades, tal proliferação ocorre na ausência de um ativador de incisura ou de um inibidor de HDAC. Em algumas modalidades, a população de células de suporte é uma população de célula de suporte in vitro. Em outras modalidades, a população da célula de suporte é uma população da célula de suporte in vivo. Adicionalmente, o estágio de proliferação é preferivelmente controlado para manter substancialmente a organização nativa da estrutura coclear. A proliferação é induzida pelo composto aqui descrito

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17/196 que induz transitoriamente tal atividade em vez da indução de c-myc e sem qualquer modificação genética da população. Em algumas modalidades, tal proliferação ocorre na ausência de um ativador de incisura ou de um inibidor de HDAC. Adicionalmente, em certas modalidades, a população de célula de suporte inclui preferivelmente as células de suporte que são LGR5⁺ e endógenas para o Órgão de Corti.

[0085] Em certas modalidades, a descrição fornece um método para aumentar a densidade celular de células de suporte Lgr5⁺ em uma população de célula coclear. O método compreende ativar as de vias e de mecanismos que induzem ou mantêm as propriedades de células-tronco nas células de suporte Lgr5⁺, proliferar as células de suporte Lgr5⁺ activadas (mantendo ao mesmo tempo tais propriedades das células-tronco) e depois disso permitir (ou mesmo induzir) a população expandida para se diferenciarem em células ciliadas para formar uma população de célula coclear expandida em que a densidade celular de células ciliadas na população de célula coclear expandida excede a densidade celular das células ciliadas na população de célula coclear origem (não expandido). Em algumas modalidades para aumentar a densidade celular de células de suporte Lgr5⁺ em uma população de células cocleares, tal aumento da densidade celular ocorre na ausência de um ativador de incisura ou de um inibidor de HDAC. Em algumas modalidades, a população de célula de suporte Lgr5⁺ é uma população de células-tronco Lgr5⁺ in vitro. Em outras modalidades, a população de células de suporte Lgr5⁺ é uma população de célula de suporte in vivo. Adicionalmente, em certas modalidades, o estágio de proliferação é preferivelmente controlado para manter substancialmente a organização nativa da estrutura coclear.

[0086] Em certas modalidades, a descrição fornece um método para aumentar a densidade celular de células ciliadas em uma população de célula cloclear inicial, a população inicial (que pode ser uma

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18/196 população in vivo ou in vitro) compreende células ciliadas, células de suporte Lgr5' e células de suporte Lgr5⁺. Em algumas modalidades para aumentar a densidade celular das células ciliadas em uma população inicial das células cocleares, tal aumento da densidade celular ocorre na ausência de um ativador de incisura ou de um inibidor de HDAC. O método compreende administrar à população inicial um composto aqui descrito.

[0087] Em certas modalidades, o método produz células-tronco em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco que expressa os marcadores de células-tronco Lgr5⁺. Em certas modalidades, se uma população mista de troncos Lgr5⁺ e não Lgr5⁺ é colocada em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco, o método aumenta a fração de células na população que são Lgr5⁺. Em algumas modalidades, tal produção de células-tronco em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco ocorre na ausência de um ativador de incisura ou de um inibidor de HDAC.

[0088] A expansão das populações de células de suporte a um grau que destroi a organização nativa da estrutura coclear podería inibir a função coclear. O direcionamento da proliferação de células de suporte existente com um sinal de molécula pequena pode permitir uma regeneração mais controlada de células ciliadas do que o uso da liberação do gene, que é incapaz de direcionar um tipo de célula específico e permanente altera a informação genética de uma célula. Uma estrutura coclear aproximadamente normal é desejada com fileiras de células ciliadas que têm células de suporte entre elas, e as células ciliadas não entram em contato com outras células ciliadas. Além disso, seria desejável evitar o uso da modificação genética para direcionar a proliferação para criar grandes agregações celulares na cóclea que rompem a anatomia do órgão.

[0089] Em certas modalidades, a descrição fornece um método

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19/196 para aumentar a densidade celular de células ciliadas em uma população de célula cloclear inicial compreendendo células ciliadas e células de suporte. O método compreende expandir seletivamente o número de células de suporte na população inicial para formar uma população de célula coclear intermediária em que a relação do número de células de suporte para células ciliadas na população de célula coclear intermediária excede a relação do número de células de suporte para células ciliares na população de célula cloclear inicial. O método compreende ainda gerar as células ciliadas na população de célula coclear intermediária para formar uma população de célula coclear expandida em que a relação do número de células ciliadas para células de suporte na população de célula coclear expandida excede a relação do número de células ciliadas para células de suporte na população de célula coclear intermediária. Em algumas modalidades, o método não envolve o uso de um ativador de incisura ou um inibidor de HDAC.

[0090] Em certas modalidades, a descrição fornece um método para aumentar o número de células de suporte Lgr5⁺ ou aumentar a atividade de Lgr5⁺ em uma população de célula inicial cocleares, em que a população inicial compreende células de suporte e células ciliadas. Por exemplo, em um tal método, uma população intermediária é formada em que o número de células de suporte Lgr5⁺ é expandida em relação à população inicial. Alternativamente, em um tal método, uma população intermediária é formada em que a atividade de Lgr5⁺das células de suporte em relação à população inicial é aumentada. Alternativamente, um método onde o número de células Lgr5⁺ é aumentado em relação à população de célula inicial ativando a expressão de Lgr5⁺ em tipos de células que normalmente não têm ou têm níveis muito baixos de Lgr5⁺. Em algumas modalidades, estes métodos alternativos não comprendem o uso de um ativador de incisura ou um inibidor de HDAC. A título de exemplo adicional, uma população

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20/196 intermediária é formada em que o número de células de suporte Lgr5⁺é expandido e a atividade de Lgr5 é aumentada em relação à população de célula cloclear inicial. Em seguida, as células ciliadas na população de célula coclear intermediária podem ser geradas para formar uma população de célula coclear expandido em que a relação de células ciliadas para células de suporte na população de célula coclear expandida excede a relação do número de células ciliadas para células de suporte na população de célula coclear intermediária.

[0091] Em cada uma das modalidades acima mencionadas da presente descrição, sternness é induzido ativando Wnt ou inibindo a atividade de GSK3. Em algumas modalidades, a indução de sternness não compreende o uso de um ativador de incisura ou de um inibidor de HDAC.

[0092] Em certas modalidades, a descrição fornece métodos para prevenir e tratar a disfunção auditiva. Por exemplo, em certas modalidades, a descrição fornece métodos para prevenir ou tratar deficiências auditivas em um indivíduo compreendendo administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um composto aqui fornecido.

[0093] Em certas modalidades, a presente descrição também se refere aos usos ex vivo das células aqui descritas. Por exemplo, as abordagens descritas aqui podem ser usadas rastreamentos de alto rendimento e para fins de descoberta. Por exemplo, certas modalidades da presente descrição são úteis para identificar os agentes que proliferam os progenitores das células ciliadas e/ou aumentam os números de células ciliadas, e também agentes que protegem as células de suporte e/ou células ciliadas (por exemplo, para suportar sua sobrevivência), e também para identificar agentes que são tóxicos ou não tóxicos para células de suporte ou progênie diferenciado, incluindo células ciliadas.

[0094] Em certas modalidades, a descrição fornece métodos para

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21/196 inibir a perda ou a morte das células do sistema auditivo em um indivíduo compreendendo administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz do composto aqui descrito aqui ou derivado do mesmo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo ou excipiente aceitável, inibindo desse modo a perda ou morte das células do sistema auditivo no indivíduo. Em algumas modalidades, o método não compreende o uso de um ativador de incisura ou de um inibidor de HDAC.

[0095] Em certas modalidades, a descrição fornece métodos para manter ou promover o crescimento de células do sistema auditivo em um indivíduo compreendendo administrar ao referido indivíduo o composto aqui descrito ou um derivado do mesmo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em uma quantidade eficaz de modo a aumentar ou iniciar o reparo endógeno, desse modo mantendo ou promovendo o crescimento de células no sistema auditivo no indivíduo.

[0096] É também aqui descrito um método para expandir uma população de células cocleares em um tecido coclear compreendendo uma população origem de células, a população origem incluindo células de suporte e um número de células Lgr5⁺, o método compreendendo contatar o tecido coclear com uma proliferador de células-tronco para formar uma população expandida de células no tecido coclear, em que o proliferador de células-tronco é capaz (i) em um ensaio de proliferação de células-tronco de aumentar o número de células Lgr5⁺em uma população de células do ensaio de proliferação de célulastronco por um fator de pelo menos 10 e (ii) em um ensaio de diferenciação de células-tronco de formar células ciliadas de uma população celular compreendendo células Lgr5⁺. Em algumas modalidades para expandir uma população de células cocleares, o método não compreende o uso de um ativador de incisura ou de um inibidor de HDAC.

[0097] É também aqui descrito um método para expandir uma poPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 41/245

22/196 pulação de células cocleares em um tecido coclear compreendendo uma população origem de células, a população origem incluindo células de suporte, o método compreendendo contatar o tecido coclear com um proliferador de células-tronco para formar uma população expandida de células no tecido coclear. O proliferador de células-tronco pode ser capaz de (i) formar uma população de célula final do ensaio de proliferação de uma população de célula inicial do ensaio de proliferação durante um período de tempo do ensaio de proliferação em um ensaio de proliferação de células-tronco e (ii) formar uma população de célula final do ensaio de diferenciação de uma população de célula inicial do ensaio de diferenciação durante um período de tempo do ensaio de diferenciação em um ensaio de diferenciação de células-tronco em que: (a) a população de célula inicial do ensaio de proliferação tem (i) um número inicial do ensaio de proliferação de células totais, (ii) um número inicial do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺, (iii) um número inicial do ensaio de proliferação de células ciliadas, (iv) uma fração de célula Lgr5⁺ inicial do ensaio de proliferação que se iguala à relação do número inicial do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺para o número inicial do ensaio de proliferação de células totais, e (v) uma fração de célula ciliada inicial do ensaio de proliferação que se iguala à relação do número inicial do ensaio de proliferação de células ciliadas para o número inicial do ensaio de proliferação de células totais; (b) a população de célula final do ensaio de proliferação tem (i) um número final do ensaio de proliferação de células totais, (ii) um número final do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺, (iii) um número final do ensaio de proliferação de células ciliadas, (iv) uma fração de célula Lgr5⁺ final do ensaio de proliferação que se iguala à relação do número final do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺ para o número final do ensaio de proliferação de células totais e (v) uma fração de célula ciliada final do ensaio de proliferação que se iguala à relação do

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23/196 número final do ensaio de proliferação de células ciliadas para o número final do ensaio de proliferação de células totais; (c) a população de célula inicial do ensaio de diferenciação tem (i) o número inicial do ensaio de diferenciação de células totais, (ii) o número inicial do ensaio de diferenciação de células Lgr5⁺, (iii) um número inicial do ensaio de diferenciação de células ciliadas, (iv) uma fração de célula Lgr5⁺ inicial do ensaio de diferenciação que se iguala à relação do número inicial do ensaio de diferenciação de células Lgr5⁺ para a número inicial do ensaio de diferenciação de células totais e (v) uma fração de célula ciliada inicial do ensaio de diferenciação que se iguala à relação do número inicial do ensaio de diferenciação de células totais; (d) a população de célula final do ensaio de diferenciação tem (i) um número final do ensaio de diferenciação de células totais, (ii) um número final do ensaio de diferenciação de células Lgr5⁺, (iii) um número final do ensaio de diferenciação de células ciliadas, (iv) uma fração de célula Lgr5⁺ final do ensaio de diferenciação que se iguala à relação do número final do ensaio de diferenciação de células Lgr5⁺ para o número final do ensaio de diferenciação de células totais, e (v) uma fração de célula ciliada final do ensaio de diferenciação que se iguala à relação do número final do ensaio de diferenciação das células ciliadas para o número final do ensaio de diferenciação das células totais; (e) o número final do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺ excede o número inicial do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺ por um fator de pelo menos 10; e (f) o número final do ensaio de diferenciação de células ciliadas é um número diferente de zero. Em algumas modalidades do ensaio descrito acima, o ensaio não compreende o uso de um ativador de incisura ou de um inibidor de HDAC.

[0098] O número final do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺ pode ser maior do que o número inicial do ensaio de proliferação de células Lgr5⁺ por um fator de pelo menos 50, ou por um fator de pelo

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24/196 menos 100. A população expandida de células no tecido coclear pode inclui um maior número de células ciliadas do que a população origem. A fração de célula Lgr5+ final do ensaio de proliferação pode ser maior do que a fração de célula Lgr5⁺ inicial do ensaio de diferenciação por, pelo menos, um fator de 2. A fração de célula ciliada final do ensaio de diferenciação pode ser maior do que a fração de célula ciliada inicial do ensaio de proliferação por, pelo menos, um fator de 2. A fração de célula ciliada final do ensaio de diferenciação pode ser pelo menos 25% menor do que a fração de célula ciliada inicial do ensaio de proliferação. A fração de célula Lgr5⁺ final do ensaio de proliferação pode ser pelo menos 10% maior do que a fração de célula Lgr5⁺ inicial do ensaio de proliferação. Uma das características mais morfológicas do tecido coclear pode ser mantida. A morfologia nativa pode ser mantida. O proliferador de células-tronco pode ser disperso em uma matriz biocompatível, que pode ser um gel ou espuma biocompatível. O tecido coclear pode ser um tecido coclear in vivo ou um tecido coclear ex vivo. O método pode produzir uma população de células Lgr5⁺ que estão em fase s. O tecido coclear pode estar em um indivíduo e o contato do tecido coclear com o composto pode ser obtido administrando o composto transtimpanicamente ao indivíduo. Entrar em contato com o tecido coclear com o composto pode resultar no funcionamento auditivo melhorado do indivíduo.

[0099] Também é descrito aqui um método para tratar um indivíduo que tem, ou está em risco de desenvolver, a perda auditiva. O método pode incluir administrar transtimpanicamente a um tecido coclear do composto indivíduo aqui fornecido.

[00100] Também é descrito aqui um método para gerar células cocleares Myo7a+. O método pode incluir o contato de células cocleares

Lgr5⁺ com um composto aqui fornecido, desse modo gerando as células cocleares Lgr5⁺ de população expandida, desse modo gerando as

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25/196 células cocleares Myo7a⁺.

[00101] Outros objetivos e aspectos serão em parte evidentes e em parte apontados aqui.

Definições [00102] Neste pedido, o uso de ou significa e/ ou, a menos que de outra maneira indicado. Quando aqui usado neste pedido, o termo compreender e variações do termo, tais como compreendendo e compreende, não se destinam a excluir outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas. Quando aqui usado neste pedido, os termos cerca de e aproximadamente são usados como equivalentes. Quaisquer números usados neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente são pretendidos abranger quaisquer flutuações normais apreciadas por alguém de experiência ordinária na técnica relevante. Em certas modalidades, o termo aproximadamente ou cerca de refere-se a uma faixa de valores que estão dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos, em ambas as direções (maior do que ou menor que) do valor de referência declarado a menos que declarado de outra maneira ou de outra maneira evidente no contexto (exceto onde tal número excedería 100% de um valor possível).

[00103] Administração refere-se à introdução de uma substância em um indivíduo. Em algumas modalidades, a administração é auricular, intra-auricular, intracoclear, intravestibular ou transtimpanicamente, por exemplo, por injeção. Em algumas modalidades, a administração é diretamente ao ouvido interno, por exemplo, injeção através da redonda ou oval, cápsula ótica ou canais vestibulares. Em algumas modalidades, a administração é diretamente no ouvido interno através de um sistema de liberação do implante coclear. Em algumas modalidades, a substância é injetada transtimpanicamente ao no ouvido médio. Em

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26/196 algumas modalidades, fazer com que seja administrado refere-se à administração de um segundo componente após o primeiro componente já ter sido administrado (por exemplo, em um tempo diferente e/ou por um fator diferente).

[00104] Um anticorpo refere-se a um polipeptídeo de imunoglobulina, ou fragmento do mesmo, tendo capacidade de ligação ao imunógeno.

[00105] Quando aqui usado, um agonista é um agente que causa um aumento na expressão ou atividade de um gene alvo, proteína ou uma via, respectivamente. Portanto, um agonista pode ligar-se e ativar seu receptor cognato de alguma forma, o que direta ou indiretamente provoca esse efeito fisiológico no gene ou proteína alvo. Um agonista também pode aumentar a atividade de uma via através da modulação da atividade de componentes da via, por exemplo, através da inibição da atividade de reguladores negativos de uma via. Por conseguinte, um agonista de Wnt pode ser definido como um agente que aumenta a atividade da via de Wnt, que pode ser medida por transcrição mediada por TCF/LEF aumentada em uma célula. Por conseguinte, um agonista de Wnt pode ser um verdadeiro agonista de Wnt que se liga e ativa um membro da família do receptor Frizzled, incluindo qualquer e todas as proteínas da família Wnt, um inibidor da degradação de beta-catenina intracelular, e ativadores de TCF/LEF.

[00106] Um antagonista refere-se a um agente que se liga a um receptor, o que por sua vez diminui ou elimina a ligação por outras moléculas.

[00107] Antissenso refere-se a uma sequência de ácido nucleico, independente do comprimento, que é complementar ao filamento de codificação ou mRNA de uma sequência de ácido nucleico. O RNA antissenso pode ser introduzido em uma célula individual, tecido ou organoide. Um ácido nucleico antissenso pode conter uma cadeia

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27/196 principal modificada, por exemplo, fosforotioato, fosforoditioato, ou outras cadeias principais modificadas conhecidas na técnica, ou pode conter ligações de internucleosídeo não naturais.

[00108] Como aqui referido, uma sequência de ácido nucleico complementar é uma sequência de ácido nucleico capaz de hibridizar com outra sequência de ácido nucleico compreendida por pares de base de nucleotídeo complementares. Por hibridar significa-se o par para formar uma molécula de fita dupla entre as bases de nucleotídeo complementares (por exemplo, adenina (A) forma um par de base com timina (T), assim como a guanina (G) com citosina (C) em DNA) sob condições apropriadas de estringência. (Veja, por exemplo, Wahl, G. M. e S. L. Berger (1987) Methods Enzymol 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507).

[00109] Administração auricular refere-se a um método de uso de um dispositivo de cateter ou pavio para administrar uma composição através da membrana timpânica ao ouvido interno do indivíduo. Para facilitar a inserção do pavio ou cateter, a membrana timpânica pode ser perfurada usando uma seringa ou pipeta de tamanho adequado. Os dispositivos podem também ser inseridos usando quaisquer outros métodos conhecidos por aqueles de experiência na técnica, por exemplo, implantação cirúrgica do dispositivo. Em modalidades particulares, o dispositivo de pavio ou cateter pode ser um dispositivo isolado, o que significa que é inserido no ouvido do indivíduo e depois a composição é libertaa de modo controlado para o ouvido interno. Em outras modalidades particulares, o dispositivo de pavio ou cateter pode ser ligado ou acoplado a uma bomba ou outro dispositivo que permita a administração de composições adicionais. A bomba pode ser programada automaticamente para liberar as unidades de dosagem ou pode ser controlada pelo indivíduo ou profissional médico.

[00110] Matriz Biocompatível quando aqui usado é um veículo poPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 47/245

28/196 limérico que é aceitável para administração a humanos para a liberação de agentes terapêuticos. Uma Matriz Biocompatível pode ser um gel ou espuma biocompatível.

[00111] Agregado de Célula, quando aqui usado significará células do corpo do Órgão de Corti que proliferaram, para formar um cluster de um determinado tipo de célula que é maior do que 40 microns no diâmetro e/ou produziu uma morfologia em que mais do que 3 camadas celulares residem perpendicularmente à membrana basilar. Um Agregado de Célula também pode se referir a um processo em que a divisão celular cria um corpo de células que causam um ou mais tipos de células para quebrar a lâmina reticular, ou a fronteira entre a endolinfa e perilinfa.

[00112] Densidade Celular quando aqui usado em relação a um tipo de célula específico é o número médio desse tipo de célula por área em uma Amostra de Microscopia Representativa. Os tipos de células podem incluir, porém, não estão limitados a, células Lgr5⁺, células ciliadas ou células de suporte. A Densidade Celular pode ser avaliada com um determinado tipo de célula em um determinado órgão ou tecido, incluindo, porém, não limitado à cóclea ou Órgão de Corti. Por exemplo, a Densidade Celular de Lgr5⁺ no Órgão de Corti é a Densidade Celular de células Lgr5⁺ visto que medida pelo Órgão de Corti. Tipicamente, as células de suporte e as células Lgr5⁺ serão enumeradas empregando cortes transversais do Órgão de Corti. Tipicamente, as células ciliadas serão enumeradas observando a superfície do Órgão de Corti, embora as cortes transversais possam ser usadas em alguns casos, como descrito em uma Amostra de Microscopia Representativa. Tipicamente, a Densidade Celular das células Lgr5⁺ será medida por análise de preparações de montagem completas do Organ de Corti e contando o número de Células Lgr5 por uma determinada distância ao longo da superfície dos epitélios, como descrito em uma

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Amostra de Microscopia Representativa. As células ciliares podem ser identificadas por suas características morfológicas, tais como feixes ou corantes específicos de células ciliadas (por exemplo, Miosina Vila, Prestina, vGlut3, Pou4f3, Espina, Faloidina conjugada, PMCA2, Ribeye, Atohl, etc). As células Lgr5⁺ podem ser identificadas por corantes específicos ou anticorpos (por exemplo, repórter transgênico Lgr5GFP, anticorpo anti-Lgrõ, etc.) [00113] Concentração Coclear, quando aqui usado, será a concentração de um determinado agente visto que medida por amostragem de fluido coclear. A menos que de outra maneira notado, a amostra deve conter uma porção substancialmente suficiente do fluido coclear, de modo que seja aproximadamente representativo da concentração média do agente na cóclea. Por exemplo, as amostras podem ser retiradas de um canal vestibular, e uma série de amostras de fluido retiradas em série de tal forma que as amostras individuais são compostas de fluido coclear em porções específicas da cóclea.

[00114] Sequência de ácido nucleico complementar refere-se a uma sequência de ácido nucleico capaz de hibridizar com outra sequência de ácido nucleico compreendida de pares de base de nucleotídeo complementares.

[00115] A Densidade Celular Corte Transversal, quando aqui usado em conjunto com um tipo de célula específico, é o número médio desse tipo de célula por área de corte transversal através de um tecido em uma Amostra de Microscopia Representativa. Os cortes transversais do Corpo de Corti também podem ser usados para determinar o número de células em um determinado plano. Tipicamente, a Densidade Celular de corte Transversal de células ciliadas será medida analisando as preparações de montagem inteira do Órgão de Corti e contando o número de células ciliadas em uma determinada distância em cortes transversais tomados ao longo de uma porção dos epitélios, tal

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30/196 como descrito em uma Amostra de Microscopia Representativa. Tipicamente, a Densidade Celular Transversal das células Lgr5⁺ será medida analisando as preparações de montagem inteira do Órgão de Corti e contando o número de células Lgr5⁺ através em uma determinada distância em cortes transversais tomadas ao longo de uma parte dos epitélios, como descrito em uma Amostra de Microscopia Representativa. As células ciliadas podem ser identificadas pelas suas características morfológicas, tais como feixes ou corantes específicos de célula ciliada (corantes adequados incluem, por exemplo, Miosina Vila, Prestina, vGltu3, Pou4f3, Faloidina Conjugada, PMCA2, Atohl, etc). Células Lgr5⁺ podem ser identificadas por corantes ou anticorpos específicos (corantes e anticorpos adequados incluem hibridização in situ de fluorescência de mRNA de Lgr5, sistema repórter transgênico de Lgr5-GFP, anticorpos anti-l_gr5, etc.).

[00116] Diminuição refere-se à diminuição em pelo menos 5%, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100%, por exemplo, em comparação com o nível de referência.

[00117] Diminuições significa também diminuições por, pelo menos, 1 vez, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 vezes ou mais, por exemplo, em comparação com o nível de uma referência.

[00118] Período de Diferenciação quando aqui usado é a duração do tempo em que existe uma Concentração do Direcionador de Sternness Eficaz sem uma Concentração de Inibição de Diferenciação Eficaz.

[00119] Concentração Eficaz pode ser a Concentração do Direcionador de Sternness Eficaz ou a Concentração de Inibição de Difusão

Eficaz para um Inibidor de Difusão.

[00120] Concentração de Inibição de Diferenciação Eficaz é a

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31/196 concentração mínima de um Inibidor de Diferenciação que não permite mais do que um aumento de 50% na fração da população total de células que são células ciliadas no final do Ensaio de Proliferação de Células Tronco em comparação ao início do Ensaio de Proliferação de Células Tronco. Ao medir a Concentração de Inibição de Diferenciação Eficaz, um corante de Célula Ciliada para as células pode ser utilizado com citometria de fluxo para quantificar as células ciliadas para uma cepa de camundongos que não é um camundongo Atoh1-GFP. Alternativamente, a cepa de camundongo Atoh1-GFP pode ser usada.

[00121] A Taxa de Liberação Eficaz (massa/tempo) quando aqui usada é a Concentração Eficaz (massa/volume) * 30 uL/1 hora.

[00122] Concentração do Direcionador de Sternness Eficaz é a concentração mínima de um Direcionador de Sternness que induz um aumento de pelo menos 1,5 vezes no número de células LGR5⁺ em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco em comparação com o número de células Lgr5⁺ em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco realizado sem o Direcionador de Sternness e com todos os outros componentes presentes nas mesmas concentrações.

[00123] Eliminar significa diminuir para um nível que é indetectável.

[00124] Enxertar ou enxerto refere-se ao processo de incorporação de células-tronco ou progenitoras em um tecido de interesse in vivo através do contato com células existentes do tecido. Célula progenitora epitelial refere-se a uma célula multipotente que tem o potencial de se tornar restringida para linhagens celulares que resultam em células epiteliais.

[00125] Células tronco epiteliais refere-se a uma célula multipotente que tem o potencial de se tornar comprometida com múltiplas linhagens celulares, incluindo linhagens celulares que resultam em células epiteliais.

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32/196 [00126] Fragmento refere-se a uma porção de um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico. Esta porção contém, preferivelmente, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de todo o comprimento da molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo de referência. Um fragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1.000 nucleotídeos ou aminoácidos.

[00127] Inibidor de GSK3 é uma composição que inibe a atividade de GSK3, GSK-3alfa e/ou GSK-3beta.

[00128] GSK3beta, GSK3p, e GSK3B quando aqui usados alternadamente são acrônimos para glicogênio sintase cinase 3 beta, [00129] Inibidor de GSK3beta é uma composição que inibe a atividade de GSK3beta.

[00130] Hibridizar refere-se ao pareamento para formar uma molécula de de fita dupla entre as bases de nucleotídeo complementares (por exemplo, adenina (A) forma um par de base com timina (T), assim como a guanina (G) com citosina (C) no DNA) sob condições adequadas de estrigência. (Veja, por exemplo, Wahl, G. M. e S. L. Berger (1987) Methods Enzymol 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507).

[00131] Um inibidor refere-se a um agente que causa uma diminuição na expressão ou atividade de um gene ou proteína alvo, respectivamente. Um antagonista pode ser um inibidor, porém, é, mais especificamente, um agente que se liga a um receptor, e que por sua vez diminui ou elimina a ligação em outras moléculas.

[00132] Quando aqui usado, um ácido nucleico inibidor é um RNA de fita dupla, interferência de RNA, miRNA, siRNA, shRNA, ou RNA antissenso, ou uma porção dos mesmos, ou um mimético do mesmo, que quando administrado a uma célula de mamífero resulta em uma diminuição na expressão de um gene alvo. Tipicamente, um inibidor de

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33/196 ácido nucleico compreende pelo menos uma porção de uma molécula de ácido nucleico alvo, ou um ortólogo da mesma, ou compreende pelo menos uma porção do filamento complementar de uma molécula de ácido nucleico alvo. Tipicamente, a expressão de um gene alvo é reduzida em 10%, 25%, 50%, 75% ou até mesmo 90-100%.

[00133] Atividade Lgr5 In Vitro refere-se ao nível de expressão ou atividade de Lgr5 em uma população in vitro de células. Pode ser medida, por exemplo, em células derivadas de um camundongo de expressão de Lgr5-GFP tal como um camundongo B6.129P2Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J (também conhecido como camundongo Lgr5EGFP-IRES-creERT2 ou Lgr5-GFP, Jackson Lab Stock No: 008875) dissociando as células em células únicas, corando com iodeto de propídio (PI), e analisando as células utilizando um citómetro de fluxo para a expressão de Lgr5-GFP. Células epiteliais do ouvido interno de camundongos do tipo selvagem (não-Lgr5-GFP) que passam pelos mesmos procedimentos de cultura e análise podem ser usadas como um controle negativo. Tipicamente, duas populações de células são mostradas na plotagem bivariada com GFP/FITC como uma variável, que inclui igualmente populações GFP positivas e GFP negativas. As células positivas para Lgr5 são identificadas controlando a população de célula positiva para GFP. A porcentagem de células positivas para Lgr5 é medida controlando a população de células positivas para GFP igualmente contra a população negativa para GFP e o controle negativo. O número de células positivas para Lgr5 é calculado multiplicando o número total de células pela percentagem de células positivas para Lgr5. Para células derivadas de camundongos não Lgr5-GFP, a atividade de Lgr5 pode ser medida utilizando um anticorpo anti-Lgr5 ou PCR quantitativa no gene Lgr5.

[00134] Atividade de Lgr5 In Vivo quando aqui usado é o nível de expressão ou atividade de Lgr5 em um indivíduo. Pode ser medido,

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34/196 por exemplo, removendo o ouvido interno de um animal e medindo a proteína de Lgr5 ou o mRNA de Lgr5. A produção de proteína de Lgr5 pode ser medida utilizando um anticorpo anti-Lgr5 para medir a intensidade de fluorescência como determinado por imageamento de amostras cocleares, onde a intensidade de fluorescência é usada como uma medida da presença de Lgr5. Western blots podem ser usados com um anticorpo anti-Lgrõ, onde as células podem ser colhidas do órgão tratado para determinar aumentos na proteína de Lgr5. PCR quantitativa ou hibridização in situ de RNA pode ser usada para medir as alterações relativas na produção de mRNA de Lgr5, onde as células podem ser colhidas do ouvido interno para determinar as mudanças no mRNA de Lgr5. Alternativamente, a expressão de Lgr5 pode ser medida usando um sistema transgênico repórter de GFP direcionado ao promotor de Lgr5, onde a presença ou intensidade da fluorescência de GFP pode ser detectada diretamente utilizando a citometria de fluxo, imagem, ou indiretamente utilizando um anticorpo anti-GFP.

[00135] Aumentar significa também aumentar em pelo menos 1 vez, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 vezes ou mais, por exemplo, em comparação com o nível de um padrão de referência.

[00136] Aumentar refere-se a aumentar em pelo menos 5 %, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100 % ou mais, por exemplo, comparado com o nível de uma referência.

[00137] Administração intra-auricular refere-se à administração de uma composição ao meio ou inerte de um indivíduo injetando diretamente a composição.

[00138] A administração intracoclear refere-se à injeção direta de uma composição através da membrana timpânica e através da membrana redonda ou oval na cóclea.

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35/196 [00139] A administração intravestibular refere-se à injeção direta de uma composição através da membrana timpânica e através da membrana redonda ou oval para os órgãos vestibulares.

[00140] Isolado refere-se a um material que é livre em graus variados dos componentes que normalmente o acompanham como encontrado em seu estado nativo. Isolar significa um grau de separação da fonte original ou arredores.

[00141] Lgr5 é um acrônimo para o receptor acoplado da proteína G contendo repetições ricas em leucina 5, também conhecido como o receptor acoplado à proteína G 49 (GPR49) ou receptor acoplado à proteína G 67 (GPR67). É uma proteína que é codificada pelo gene Lgr5 em humanos.

[00142] Atividade de Lgr5 é definida como o nível de atividade de Lgr5 em uma população de células. Em uma população celular in vitro, a atividade de Lgr5 pode ser medida em um ensaio de atividade de Lgr5 in vitro. Em uma população celular in vivo, a atividade de Lgr5 pode ser medida em um ensaio de atividade de Lgr5 in vivo.

[00143] Célula Lgr5⁺ ou célula Lgr5 positiva, quando aqui utilizada, é uma célula que expressa Lgr5. Célula Lgr5, quando aqui usada, é uma célula que não é Lgr5⁺.

[00144] Traço de Linhagem, quando aqui usado, está usando uma linhagem de camundongo que permite o rastreamento de qualquer célula que expresse um gene alvo no momento da indução de repórter. Isso pode incluir células ciliadas ou genes celulares de suporte (Sox2, Lgr5, MyosinVIla, Pou4f3, etc). Por exemplo, a traço de linhagem pode utilizar um camundongo Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 cruzado com um camundongo repórter, que após a indução, permite uma para traçar o destino das células que expressavam Lgr5 no momento da indução. Por exemplo adicional, as células Lgr5 podem ser isoladas em células isoladas e cultivadas em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco

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36/196 para gerar colônias, em seguida, subsequentemente diferenciadas em um Ensaio de Diferenciação e analisadas quanto ao destino celular por coloração para a célula ciliada e / ou de suporte de proteínas de célula e a determinação da colocalização do repórter com células ciliadas ou células de suporte para determinar o destino das células Lgr5. Além disso, o traço de linhagem pode ser realizado em explantes cocleares para rastrear células de suporte ou células ciliadas dentro do órgão intacto após o tratamento. Por exemplo, o destino da célula Lgr5 pode ser determinada através do isolamento da cóclea de um camundongo Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 cruzado com um camundongo repórter, e induzindo o repórter em células Lgr5 antes ou durante o tratamento. O órgão pode então ser analisado quanto ao destino da célula por coloração para células ciliadas e / ou proteínas de células de suporte e determinação da colocalização de repórter com células ciliadas ou coloração de células de suporte para determinar o destino das células Lgr5. Além disso, o traço da linhagem pode ser realizado in vivo rastreando o destino de células de suporte ou células ciliadas dentro do órgão intacto após o tratamento. Por exemplo, o destino da célula Lgr5 pode ser determinado induzindo um repórter em um camundongo Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 cruzado com um camundongo repórter, o tratamento do animal, em seguida isolando a cóclea. O órgão pode então ser analisado quanto ao destino da célula por coloração para células ciliadas e / ou proteínas de células de suporte e determinação da colocalização de repórter com células ciliadas ou coloração de células de suporte para determinar o destino das células Lgr5. O traço da linhagem pode ser feito usando repórteres alternativos de interesse como é padrão na técnica.

[00145] Mamífero refere-se a qualquer mamífero, incluindo porém, não limitado a humano, camundongo, rato, ovelha, macaco, cabra, coelho, hamster, cavalo, vaca ou porco.

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37/196 [00146] Tempo de Liberação Médio quando aqui utilizado, é o tempo em que metade de um agente é liberado em solução salina tamponada com fosfato a partir de um veículo em um Ensaio de Liberação.

[00147] Morfologia Nativa, quando aqui usado, significa que a organização do tecido reflete largamente a organização em um tecido saudável.

[00148] Mamífero não humano, quando aqui utilizado, refere-se a qualquer mamífero que não seja humano.

[00149] Quando utilizado no contexto relevante aqui, o termo número de células pode ser 0, 1 ou mais células.

[00150] Órgão de Corti, quando aqui usado, refere-se às células sensoriais do órgão auditivo localizadas na cóclea.

[00151] Organoide ou organoide epitelial refere-se a um cluster ou agregado de células que se assemelha a um órgão, ou parte de um órgão, e possui tipos de células relevantes para esse órgão em particular.

[00152] População de células refere-se a qualquer número de células maior do que 1, porém, é de um modo preferido, pelo menos, 1x10³ células, pelo menos 1x10⁴ células, pelo menos, pelo menos, 1x10⁵ células, pelo menos 1x10⁶ células, pelo menos 1x10⁷ células, pelo menos 1x10⁸ células, pelo menos 1x10⁹ células, ou pelo menos 1x10¹° células.

[00153] Células progenitoras, quando aqui utilizado refere-se a uma célula que, como uma célula-tronco, tem a tendência de se diferenciar em um tipo específico de célula, porém, é já mais específico do que uma célula-tronco e é empurrado para se diferenciarem em sua célula alvo.

[00154] Referência significa um estado padrão ou controle (por exemplo, não tratado com um agente teste ou combinação de agentes

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38/196 teste.

[00155] Ensaio de Liberação quando aqui usado, é um teste no qual a taxa de liberação de um agente a partir de uma matriz biocompativel através da membrana de diálise para um ambiente salino. Um ensaio de liberação exemplar pode ser realizado colocando 30 microlitros de uma composição em 1 ml de fosfato salino tamponado dentro do saco de diálise de solução salina com um corte apropriado, e a colocação do saco de diálise dentro de 10 ml de salina tamponada com fosfato a 37Ό. O tamanho da membrana de diálise pode ser escolhido com base no tamanho do agente para permitir que o agente seja avaliado ao sair da membrana. Para a liberação de pequenas moléculas, pode-se usar um corte de 3,5-5 kDa. A taxa de liberação de uma composição pode mudar com o tempo e pode ser medida em incrementos de 1 hora.

[00156] Amostra de Microscopia Representativa, quando aqui utilizada, descreve um número suficiente de campos de visão no interior de um sistema de cultura celular, uma porção de tecido extraído, ou todo um órgão extraído cujo tamanho médio de característica ou número que está sendo medido pode razoavelmente ser referido representa o tamanho ou número médio do aspecto se todos os campos relevantes foram medidos. Por exemplo, a fim de avaliar as contagens de células ciliadas em uma faixa de frequência sobre o órgão de Corti, o software Imaged (NIH) pode ser usado para medir o comprimento total de montagens inteiras cocleares e o comprimento dos segmentos individuais contados. O número total de células ciliadas internas, células ciliadas externas e células de suporte podem ser contadas na totalidade ou fração de qualquer um dos quatro segmentos cocleares de 1200-1400 microns (apical, mesoapical, mesobasal e basal) em pelo menos 3 campos de visão a 100 pm de tamanho de campo seriam razoavelmente considerados uma Amostra de Microscopia RepresentatiPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 58/245

39/196 va. Uma Amostra de Microscopia Representativa pode incluir medições dentro de um campo de visão, que podem ser medidas como células por determinada distância. Uma amostra representativa de microscopia pode ser utilizada para avaliar a morfologia, tais como contatos célula-célula, a arquitectura coclear, e componentes celulares (por exemplo, feixes, sinapses).

[00157] Padronização de Roseta é um arranjo celular característico na cóclea em que <5 % das células ciliadas são adjacentes a outras células ciliadas.

[00158] O termo amostra refere-se a um volume ou massa obtido, fornecido e / ou submetido à análise. Em algumas modalidades, uma amostra é uma amostra de tecido, uma célula de amostra, uma amostra de fluido e similares. Em algumas modalidades, uma amostra é retirada de (ou é) um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano ou animal). Em algumas modalidades, uma amostra de tecido é ou compreende cérebro, pêlo (incluindo raízes), compressas bucais, sangue, saliva, sêmen, músculo, ou a partir de quaisquer órgãos internos, ou câncer, células pré-cancerosas ou tumorais associadas com qualquer um destes. Um fluido pode ser, porém, não limitado a, urina, sangue, ascite, fluido pleural, fluido espinal e similares. Um tecido corporal pode incluir, porém, não está limitado a, cérebro, pele, músculo, tecido do endométrio, uterino e cervical ou câncer, células pré-cancerosas ou tumorais associadas com qualquer um destes. Em uma modalidade, um tecido corporal é um tecido cerebral ou um tumor cerebral ou câncer. Aqueles de experiência ordinária na técnica irão apreciar que, em algumas modalidades, uma amostra é uma amostra primária na medida em que é obtido a partir de uma fonte (por exemplo, um indivíduo); em algumas modalidades, uma amostra é o resultado do processamento de uma amostra de partida, por exemplo, para remover certos componentes potencialmente contaminantes e / ou para isolar

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40/196 ou purificar certos componentes de interesse.

[00159] Autorrenovação refere-se ao processo pelo qual uma célula-tronco se divide para gerar uma (divisão assimétrica) ou duas (divisão simétrica) células filhas com potenciais de desenvolvimento que são indistinguíveis daqueles da célula mãe. A autorrenovação envolve a proliferação e a manutenção de um estado indiferenciado.

[00160] SiRNA refere-se a um RNA de cadeia dupla. Em condições ideais, um siRNA é 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotideos de comprimento e tem uma projeção de base 2 na sua extremidade 3'. Estes dsRNAs podem ser introduzidos em uma célula individual ou em um sistema de cultura. Tais siRNAs são usados para subregular os níveis de mRNA ou atividade promotora.

[00161] Célula-tronco refere-se a uma célula multipotente que tem a capacidade de se autorrenovar e de se diferenciar em múltiplas linhagens celulares.

[00162] Ensaio de Diferenciação de Células Tronco quando aqui utilizado é um ensaio para determinar a capacidade de diferenciação de células-tronco. Em um Ensaio de Diferenciação de Células Tronco exemplar, o número de células para uma população inicial de células é colhido a partir de um camundongo Atoh1-GFP entre a idade de 3 a 7 dias, por se isolar o epitélio sensorial do órgão de Corti, dissociando o epitélio em células únicas, e passando as células através de um filtro de células de 40 um. Aproximadamente 5000 células são aprisionadas em 40 μΙ do substrato de cultura (por exemplo: Matrigel (Corning, Factor de Crescimento Reduzido)) e colocada no centro de cavidades em uma placa de 24 cavidades com 500 μΙ de um meio de cultura apropriado, fatores de crescimento e agente sendo testado. Meios de cultura apropriados e fatores de crescimento incluem DMEM/F12 avançado com Suplementos de meios (1X N2, 1X B27, Glutamax 2 mM, HEPES 10 mM, N-acetilcisteína 1 mM e 100 U/ml de penicilina /100 pg/mL de

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Estreptomicina) e fatores de crescimento (50 ng I ml_ de EGF, 50 ng/ml de bFGF e 50 ng/ml de IGF-1), bem como o(s) agente (s) a ser avaliado(s) são adicionados a cada cavidade. As células são cultivadas por 10 dias em uma incubadora de cultura de células padrão a 37Ό e 5 % de CO 2, com a mudança de meios a cada 2 dias. Estas células são então cultivadas através da remoção de Agentes de Ensaio de Proliferação de Células Tronco e substituindo meios de cultura Basal e moléculas para conduzir a diferenciação. Um meio de cultura basal apropriado é DMEM / F12 avançado suplementado com 1X N2, 1X B27, Glutamax 2 mM, HEPES 10 mM, N-acetilcisteína 1 mM e 100 U / ml de Penicilina / 100 pg / ml de estreptomicina e as moléculas adequadas para direcionar a diferenciação têm 3 μΜ de CHIR99021 e 5 μΜ de DAPT por 10 dias, com mudança de meios a cada 2 dias. O número de células ciliadas em uma população pode ser medido usando citometria de fluxo para GFP. O nível de diferenciação de células ciliadas pode ainda ser avaliado utilizando qPCR para medir 0 nível de expressão de marcador de célula ciliada (por exemplo, MYO7A) normalizado utilizando referências ou genes de manutenção adequados e não reguladas (por exemplo, Hprt). O nível de diferenciação de células ciliadas pode também ser avaliado por imunocoloração para marcadores de células ciliadas (por exemplo, Myosin7a, vGlut3, Espina, PMCAs, Ribeye, faloidina conjugada, Atohl, Pou4f3, etc). O nível de diferenciação de células ciliadas pode também ser avaliado por Western Blot para Myosin7a, vGlut3, Espina, PMCAs, Prestina, Ribeye, Atohl, Pou4f3.

[00163] Ensaio de Células Tronco, quando aqui utilizado, é um ensaio em que uma célula ou uma população de células são testadas para uma série de critérios para determinar se a célula ou população de células são células-tronco ou enriquecida em células-tronco ou marcadores de células-tronco. Em um ensaio de células-tronco, a céluPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 61/245

42/196 la I população de células são testadas quanto às características de células-tronco tal como a expressão de marcadores de células-tronco, e ainda, opcionalmente, são testadas quanto à função de célulastronco, incluindo a capacidade de autorrenovação e diferenciação.

[00164] Proliferador de Células Tronco, quando aqui utilizado é um composto que induz um aumento na população de células que possuem a capacidade de autorrenovação e diferenciação.

[00165] Ensaio de Proliferação de Células Tronco, quando aqui utilizado é um ensaio para determinar a capacidade para agente (s) para induzir a criação de células-tronco a partir de uma população de células de partida. Em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco exemplar, o número de células para uma população inicial de células é colhido a partir de um camundongo Lgr5-GFP, tal como um camundongo B6.129P2-Lgr5tm1 (cre/ERT2)Cle/J (também conhecido como camundongo Lgr5-EGFP- IRES-creERT2 ou Lgr5-GFP, Jackson Lab Stock No: 008875) entre a idade de 3 a 7 dias, por se isolar o epitélio sensorial do órgão de Corti e dissociando o epitélio em células únicas. Aproximadamente 5000 células são aprisionadas em 40 μΙ do substrato de cultura (por exemplo: Matrigel (Corning, Fator de Crescimento Reduzido)) e colocadas no centro de cavidades em uma placa de 24 cavidades com 500 μΙ de um meio de cultura apropriado, fatores de crescimento e agente sendo testado. Meios de cultura apropriados e fatores de crescimento incluem DMEM / F12 avançado com suplementos de meios (1X N2, 1X B27, Glutamax 2 mM, HEPES 10 mM, Nacetilcisteína 1 mM e 100 U / mL de penicilina /100 pg / mL de Estreptomicina) e fatores de crescimento (50 ng / mL de EGF, 50 ng/ml de bFGF e 50 ng/ml de IGF-1), bem como o(s) agente (s) a ser avaliados são adicionados em cada cavidade. As células são cultivadas por 10 dias em uma incubadora de cultura de células padrão a 37Ό e 5 % de CO2, com a mudança de meios a cada 2 dias. O número de células

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Lgr5+ é quantificado através da contagem do número de células identificadas como Lgr5+ em um ensaio de atividade in vitro Lgr5. A fração de células que são Lgr5+ é quantificada através da divisão do número de células identificadas como Lgr5+ em uma população de células pelo número total de células presentes na população de células. A atividade de Lgr5⁺ média de uma população é quantificada através da medição do nível médio de expressão de mRNA de Lgr5 da população normalizado utilizando referências ou genes de manutenção (por exemplo, Hprt) adequados e não regulados. O número de células ciliadas em uma população pode ser medida por coloração com marcador de célula ciliada (por exemplo, Myosin Vila), ou utilizando um repórter endógeno de genes de células ciliadas (por exemplo, Pou4f3-GFP, Atoh1-nGFP) e análise por citometria de fluxo. A fração de células que são células ciliadas é quantificada através da divisão do número de células identificadas como células ciliadas em uma população de células pelo número total de células presentes na população de células. A atividade de Lgr5 pode ser medida por qPCR.

[00166] Marcadores de Células Tronco, quando aqui utilizados pode ser definido como produtos de genes (por exemplo, proteína, RNA, etc) que especificamente expressaram em células-tronco. Um tipo de marcador de células-tronco é um produto genético que suporta direta e especificamente a manutenção da identidade das célulastronco. Exemplos incluem Lgr5 e Sox2. Marcadores adicionais de células-tronco podem ser identificados utilizando ensaios descritos na literatura. Para determinar se um gene é necessário para a manutenção da identidade das células-tronco, os estudos de ganho de função e perda de função podem ser usados. Nos estudos de ganho de função, a superexpressão do produto gênico específico (marcador de célulastronco) ajudaria a manter a identidade das células-tronco. Enquanto em estudos de perda de função, a remoção do marcador de célulasPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 63/245

44/196 tronco causaria perda de identidade de células-tronco ou diferenciação induzida de células-tronco. Outro tipo de marcador de células-tronco é um gene que é expresso apenas em células-tronco, porém, não tem uma função específica para manter a identidade das células-tronco. Este tipo de marcador pode ser identificado comparando a expressão genética de células-tronco separadas e não-tronco por ensaios, tais como microarranjo e qPCR. Este tipo de marcador de células-tronco pode ser encontrado na literatura, (por exemplo, Liu P. et al, Int J Biochem Cell Biol. 2015 Mar; 60: 99-111 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25582750). Marcadores potenciais de células-tronco incluem Ccdc121, Gdf10, Opcml, Phex, etc. A expressão dos marcadores de células-tronco tal como Lgr5 ou Sox2 em uma dada população celular ou célula pode ser medida utilizando ensaios tais como qPCR, imuno-histoquímica, western blot e de hibridação de RNA. A expressão dos marcadores de células-tronco também pode ser medida utilizando repórteres de expressão de células transgênicas que podem indicar a expressão dos marcadores de células-tronco dadas, por exemplo, Lgr5-GFP ou Sox2-GFP. A análise por citometria de fluxo pode então ser usada para medir a atividade da expressão de repórter. A microscopia de fluorescência também pode ser usada para visualizar diretamente a expressão de repórteres. A expressão de marcadores de células-tronco pode ser ainda determinada utilizando análise de microarranjo para análise global do perfil de expressão gênica. O perfil de expressão gênica de uma determinada população de células ou população de células purificadas pode ser comparado com o perfil de expressão gênica da célula-tronco para determinar a similaridade entre as populações de duas células. A função das células-tronco pode ser medida por ensaio de formação de colônias ou ensaio de formação de esferas, ensaio de autorrenovação e ensaio de diferenciação. Em ensaio de formação de colônia (ou esfePetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 64/245

45/196 ra), quando cultivada em meios de cultura adequados, a célula-tronco deve ser capaz de formar colônias, sobre a superfície de cultura de células (por exemplo, placa de cultura de células) ou incorporadas no substrato de cultura de células (por exemplo, Matrigel) ou ser capaz de formar esferas quando cultivadas em suspensão. No ensaio de formação de colônias / esferas, as células-tronco isoladas são semeadas em baixa densidade celular em meios de cultura apropriados e deixadas proliferar durante um determinado período de tempo (7-10 dias). A colônia formada é então contada e marcada para a expressão do marcador de células-tronco como um indicador da célula-tronco da célula original. Opcionalmente, as colônias formadas são então colhidas e passadas para testar seu potencial de autorrenovação e diferenciação. No ensaio de autorrenovação, quando cultivadas em meios de cultura adequado, as células devem manter a expressão do marcador de células-tronco (por exemplo Lgr5) ao longo de pelo menos uma (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, etc) divisões celulares. Em uma Ensaio de Diferenciação de Células Tronco, quando cultivadas em meio de diferenciação adequado, as células devem ser capazes de gerar células ciliadas que podem ser identificadas pela expressão do marcador de células ciliadas medido por qPCR, imunocoloração, western blot, hibridação de RNA ou citometria de fluxo.

[00167] Direcionador Sternness quando aqui usado é uma composição que induz a proliferação de células LGR5⁺, super-regula Lgr5 em células, ou mantém a expressão Lgr5 nas células, enquanto se mantém o potencial de autorrenovação e o potencial para se diferenciarem em células ciliadas. Geralmente, os direcionadores sternness regulam pelo menos um biomarcador de células-tronco pós-natais. Os direcionadores sternness incluem, porém, não estão limitados a, agonistas de Wnt e inibidores de GSK3.

[00168] Indivíduo inclui humanos e mamíferos (por exemplo, caPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 65/245

46/196 mundongos, ratos, porcos, gatos, cães e cavalos). Em muitas modalidades, os indivíduos são mamíferos, especialmente primatas, especialmente humanos. Em algumas modalidades, os indivíduos são animais de criação tais como gado bovino, ovelhas, cabras, vacas, suínos e similares; tais como galinhas, patos, gansos, perus e similares; e animais domesticados, como cães e gatos. Em algumas modalidades (por exemplo, particularmente em contextos de investigação) os mamíferos objeto serão, por exemplo, roedores (por exemplo, camundongos, ratos, hamsters), coelhos, primatas, porcos ou tais como porcos consanguíneos e similares.

[00169] Célula de Suporte, quando aqui usada em conjunção com um epitélio coclear, compreende células epiteliais dentro do órgão de Corti que não são células ciliadas. Isto inclui células pilares internas, células falângicas internas, células de Deiter, células de Hensen, células de Boettcher e / ou células de Claudius.

[00170] Sinergia ou efeito sinérgico é um efeito que é maior do que a soma de cada um dos efeitos tomados separadamente; e maior que o efeito aditivo.

[00171] Inibidor de TGF beta, quando aqui utilizado, é uma composição que reduz a atividade do TGF Beta.

[00172] O tecido é um conjunto de células semelhantes da mesma origem que, em conjunto, desempenham uma função específica, incluindo, por exemplo, um tecido coclear, como o órgão de Corti.

[00173] A administração transtimpânica refere-se injeção direta de uma composição através da membrana timpânica no ouvido médio.

[00174] Tratar quando aqui utilizado em conjunção com população significa liberar uma substância à população para efetuar um resultado. No caso de populações in vitro, a substância pode ser diretamente (ou mesmo indiretamente) liberada à população. No caso de populações in vivo, a substância pode ser administrada por adminisPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 66/245

47/196 tração ao indivíduo hospedeiro.

[00175] Ativação de Wnt, quando aqui utilizada, é uma ativação da via de sinalização de Wnt.

[00176] O termo alquila, quando aqui utilizado, refere-se a um hidrocarboneto saturado linear ou ramificado. Por exemplo, um grupo alquila pode ter de 1 a 8 átomos de carbono (isto é, (Ci-Ce) alquila) ou 1 a 6 átomos de carbono (isto é, (O-Ce alquila) ou 1 a 4 átomos de carbono.

[00177] O termo alquenila quando aqui utilizado refere-se a um radical linear ou ramificada de hidrocarboneto que inclui uma ou mais ligações duplas e podem incluir radicais divalentes, tendo de 2 a cerca de 15 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquenila incluem, porém, não estão limitados a, etenila, propenila, butenila e homólogos e isômeros superiores.

[00178] O termo alquinila quando aqui utilizado refere-se a um radical linear ou ramificada de hidrocarboneto que inclui uma ou mais ligações triplas e pode incluir radicais divalentes, tendo de 2 a cerca de 15 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquinila incluem, porém, não estão limitados a, etinila, propinila, butinila e homólogos e isômeros superiores.

[00179] O termo halo ou halogênio, quando aqui utilizado, referese a flúor, cloro, bromo e iodo.

[00180] O termo arila, quando aqui utilizado, refere-se a um sistema de anel aromático exclusivamente carbono único ou um de anel exclusivamente carbono condensado múltiplo, em que pelo menos um dos anéis é aromático. Por exemplo, um grupo arila pode ter 6 a 20 átomos de carbono, 6 a 14 átomos de carbono ou 6 a 12 átomos de carbono. Arila inclui um radical fenila. Arila inclui também vários sistemas em anel condensado (por exemplo, sistemas de anéis que compreendem 2, 3 ou 4 anéis) possuindo cerca de 9 a 20 átomos de carPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 67/245

48/196 bono, em que pelo menos um anel é aromático e em que os outros anéis podem ser aromáticos ou não aromáticos (isto é, carbociclo). Tais sistemas de anéis condensados múltiplos podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais (por exemplo, 1, 2 ou 3) grupos oxo em qualquer porção carbociclo do sistema de anéis condensados múltiplos. Os anéis do sistema de anéis condensados múltiplos podem ser conectados uns aos outros através de ligações fundidas, espiro e pontes, quando permitido pelos requisitos de valência. É para ser entendido que o ponto de ligação de um sistema de anel condensado múltiplo como definido acima pode estar em qualquer posição no sistema de anel incluindo uma porção aromática ou carbociclo do anel.

[00181] O termo heteroarila quando aqui utilizado refere-se a um anel aromático único que tem pelo menos um átomo diferente do carbono no anel, em que o átomo é selecionado a partir do grupo que consiste em oxigênio, nitrogênio e enxofre; o termo também inclui sistemas de anéis condensados múltiplos que possuem pelo menos um desses anéis aromáticos, que são descritos abaixo. Assim, o termo inclui anéis aromáticos simples de cerca de 1 a 6 átomos de carbono e cerca de 1-4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste em oxigênio, nitrogênio e enxofre nos anéis. Os átomos de enxofre e nitrogênio também podem estar presentes em uma forma oxidada desde que o anel seja aromático. O termo heteroarila como definido acima pode ser condensado com um ou mais anéis selecionados de heteroarilas (para formar, por exemplo, uma naftilidinila tal como 1,8naftiridinila), heterociclos, (para formar por exemplo, uma 1, 2, 3, 4tetra-hidronaftiridinila tal como 1, 2,3,4-tetra-hidro-1,8-naftiridinila), carbociclos (para formar por exemplo, 5, 6,7,8-tetra-hidroquinolila) e arilas (para formar, por exemplo, indazolila) para formar o sistema de anel condensado múltiplo. Assim, uma heteroarila (um sistema de anel aromático único ou anel condensado múltiplo) tem cerca de 1-20 átoPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 68/245

49/196 mos de carbono e cerca de 1-6 heteroomos dentro do anel heteroarila. Tais sistemas de anéis condensados múltiplos podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais (por exemplo, 1,2, 3 ou 4) grupos oxo nas porções carbociclo ou heterociclo de anel condensado. Os anéis do sistema de anéis condensados múltiplos podem ser conectados uns aos outros através de ligações fundidas, espiro e pontes, quando permitido pelos requisitos de valência. Deve ser entendido que os anéis individuais do sistema de anéis condensados múltiplos podem ser conectados em qualquer ordem em relação um ao outro. É também para ser entendido que o ponto de ligação de um sistema de anéis condensados múltiplos (tal como definido acima para um heteroarila) pode estar em qualquer posição do sistema de anéis condensados múltiplos, incluindo uma porção heteroarila, heterociclo, arila ou carbociclo do condensado múltiplo é sistema de anel e em qualquer átomo adequado do sistema de anel condensado múltiplo incluindo um átomo de carbono e um heteroátomo (por exemplo, nitrogênio).

[00182] O termo cicloalquila quando aqui utilizado refere-se a uma estrutura em anel saturado ou parcialmente saturado, tendo de cerca de 3 a cerca de 8 membros no anel que tem apenas átomos de carbono como átomos do anel e podem incluir radicais divalentes. Exemplos de cicloalcanos grupos cicloalquila incluem, porém, não estão limitados a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-hexeno, ciclopentenila, ciclo-hexenila.

[00183] Os termos heterociclila ou heterocíclica referem-se a anéis de 3 a 24 membros monocíclicos ou policíclicos contendo carbono e heteroátomos selecionados a partir de oxigênio, fósforo, nitrogênio, ou enxofre e em que não há π elétrons deslocalizados (aromaticidade) partilhada entre o carbono ou heteroátomos no anel. Exemplos de heterociclila incluem, porém, não estão limitados a, oxetanila, azetadinila, tetra-hidrofuranila, pirrolidinila, oxazolinila, oxazolidinila, tiazoPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 69/245

50/196 linila, tiazolidinila, piranila, tiopiranila, tetra-hidropiranila, dioxalinila, piperidinila, morfolinila, tiomorfolinila, S-óxido de tiomorfolinila, S-dióxido, piperazinila, azepinila, oxepinila, diazepinila, tropanila e homotropanila. Exemplos de heterociclila incluem, porém, não estão limitados a, anéis fundidos, em anéis em ponte (por exemplo, 2,5diazabiciclo[2,2,1]heptano), e os anéis espirocíclicos, (por exemplo, 2,8-diazaespiro[4, 5]decano).

[00184] A utilização de ou significa e / ou, salvo indicação em contrário. Quando utilizado neste pedido, o termo compreender e variações do termo, tais como compreendendo e compreende, não se destinam a excluir outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas. Conforme usado neste pedido, os termos cerca de e aproximadamente são usados como equivalentes. Quaisquer números utilizados neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente pretendem abranger quaisquer flutuações normais apreciadas por alguém de experiência ordinária na técnica. Em certas modalidades, o termo cerca de ou aproximadamente refere-se a uma faixa de valores que estão dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos, em ambas as direções (maior que ou menor que) do valor de referência declarado, a menos que de outra maneira declarado ou de outra forma evidente no contexto (exceto onde tal número excedería 100% de um valor possível).

[00185] A frase farmaceuticamente aceitável é aqui empregado para referir-se àqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do diagnóstico médico seguro, adequados para utilização em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação benefício/risco razoável.

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51/196 [00186] Quando aqui usado veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável inclui, sem limitação, qualquer adjuvante, veículo, excipiente, deslizante, agente edulcorante, diluente, conservante, corante/colorante, realçador de sabor, tensoativo, agente de umectação, agente dispersante, agente de suspensão, estabilizador, agente isotônico, solvente, tensoativo, ou emulsificante que foi aprovado pela United States Food and Drug Administration como sendo aceitável para uso em seres humanos ou animais domésticos. Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares incluem, porém, não estão limitados a, açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose sódica, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto; malte; gelatina; talco; manteiga de cacau, ceras, gorduras animais e vegetais, parafinas, silicones, bentonitas, ácido silícico, oxido de zinco; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de caroço de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propileno glicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções de tampão de fosfato; e quaisquer outras substâncias compatíveis empregadas em formulações farmacêuticas.

[00187] Sal farmaceuticamente aceitável inclui igualmente sais de adição de ácido e base.

[00188] Sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável refere-se aos sais que mantêm a eficácia biológica e as propriedades das bases livres, que não são biologicamente ou de outro maneira indesejáveis, e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, porém, não estão limitados a, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúriPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 71/245

52/196 co, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares, e ácidos orgânicos, tais como, porém, não limitados a, ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido benzenossulfônico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido canfórico, ácido canfor-10-sulfônico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido carbônico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido ciclâmico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-dissulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glico-heptônico, ácido glicônico, ácido glicurônico, ácido glutâmico, ácido glutárico, ácido 2-oxo-glutárico, ácido glicerofosfôrico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido isobutírico, ácido lático, ácido lactobiônico, ácido láurico, ácido maleico, ácido málico, ácido malônico, ácido mandélico, ácido metanossulônico, ácido múcico, ácido naftaleno-1,5-dissulfônico, ácido naftaleno-2-sulfônico, ácido 1-hidróxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido propiônico, ácido piroglutâmico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido 4-aminossalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tiociânico, ácido toluenossulfônico, ácido trifluoroacético, ácido undecilênico e similares.

[00189] Sal de adição de base farmaceuticamente aceitável refere-se aos sais que mantêm a eficácia biológica e as propriedades dos ácidos livres, que não são biologicamente ou de outra maneira indesejáveis. Estes sais são preparados a partir da adição de uma base inorgânica ou de uma base orgânica ao ácido livre. Os sais derivados de bases inorgânicas incluem, porém, não estão limitados aos sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e similares. Por exemplo, sais inorgânicos incluem, porém, não estão limitados a, sais de amônio, sódio, potássio, cálcio e magnésio. Os sais derivados de bases orgânicas incluem, porém, não

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53/196 estão limitados a, sais de aminas primárias, secundárias, e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas de permuta iônica básicas, tais como amônia, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2-dimetilaminoetanol, 2dietilaminoetanol, diciclo-hexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etilenodiamina, glicosamina, metilglicamina, teobromina, trietanolamina, trometamina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina e similares. Exemplo bases orgânicas utilizados em certas modalidades incluem isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclo-hexilamina, colina e cafeína.

[00190] Agentes de umectação, emulsificantes e lubrificantes, tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes nas composições.

[00191] Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.

[00192] Os compostos ou composições aqui descritos podem ser formulados em qualquer forma adequada para uma rotina de liberação desejada, por exemplo, injeção transtimpânica, pavios transtimpânicos e cateteres, e depósitos injetáveis. Tipicamente, as formulações incluPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 73/245

54/196 em todas as composições fisiologicamente aceitáveis incuding derivados ou profármacos, solvatos, estereoisômeros, racematos, ou tautômeros dos mesmos com quaisquer veículos, diluentes, e/ou excipientes fisiologicamente aceitáveis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00193] Uma descrição das modalidades do exemplo da invenção segue.

Compostos [00194] A presente descrição fornece compostos de Fórmula (I),

[00195] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos, em que Q¹, Q², Q³, R¹, R², R³, Ar, -Z-W-X-Y- e m são como definidos acima para Fórmula (I).

[00196] Em algumas modalidades, os compostos de Fórmula (I) têm um ou mais dos seguintes aspectos:

[00197] a) contanto que o composto não seja

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[00198]

b) contanto que quando Ar for

[00199] Em certas modalidades, a presente descrição fornece um composto de Fórmula (I) que não é descrito em WO 2003/076442 (PCT/US03/05050), que está incorporado aqui por referência.

[00200] Em certas modalidades de Fórmula (I), R^x é -COR^X1 ou SO₂R^X1.

[00201] Em certas modalidades de Fórmula (I), R^x é selecionado a

[00202] Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila opcionalmente substituída com um a doze substituintes que é halo. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila que é deuterada. Em certas modalidades, a

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56/196 heterociclila é um anel monocíclico ou bicíclico. Em algumas modalidades, a heterociclila é um anel fundido, em ponte ou espirocíclico. Em certas modalidades, a heterociclila contém um a três nitrogênios (isto é, 1,2, ou 3 nitrogênios) e/ou um a três oxigênios (isto é, 1,2, ou 3 oxigênios). Em certas modalidades, a heterociclila contém um nitrogênio e/ou um oxigênio. Em certas modalidades, a heterociclila contém um nitrogênio. Em certas modalidades, a heterociclila contém dois nitrogênios. Em certas modalidades, a heterociclila contém um nitrogênio e um oxigênio.

[00203] Em algumas modalidades, R^X1 é piperidina, 2,8diazaespiro[4,5]decano, 2,5-diazabiciclo[2,2,1]heptano, ou 8-oxa-3azabiciclo[3.2.1]octano, cada dos quais é opcionalmente substitutído com um a doze substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em deutério, halo, Ci-C4alquila, -[C(RX^1a)2]P-OH, (CH2)P-NMe2, -(CH2)P-NHMe, -(CH2)P-NH2; em que p é 0, 1, 2, ou 3. Em algumas modalidades, R^X1 é piperidina, opcionalmente substituída com um a seis substituintes de halo. Em algumas modalidades, R^X1 é piperidina opcionalmente substituída com -[C(R^x1a)2]P-OH, -(CH2)_PNMe₂.

[00204] Em certas modalidades de Fórmula (I), a heterociclila é opcionalmente substitutída com Ci-C4alquila, -(CH2)_P-OH, ou -(CH2)_PΝΗ₂; em que p é 1,2, ou 3. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com Ci-C4alquila. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com -(CH2)P-OH; em que p é 1, 2, ou 3. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com -CH2-OH. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com -(CH2)P-NH2; em que p é 1, 2, ou 3. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com -CH2-NH2.

[00205] Em certas modalidades de Fórmula (I), R^X1 é heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substituída com -[C(R^x1a)2]_PPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 76/245

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CN. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com [C(R^x1a)2]P-OH, -[C(R^x1a)2]_P-O-Ci-C₄alquila, -NHCOCi-C₄alquila, CONHCi-C₄alquila, COH, -CO₂H, -[C(R^x1a)2]p-COO-Ci-C4alquila, [C(R^x1a)2]_p-NH₂, -[C(R^x1a)2]p-NH-Ci-C4alquila, ou -[C(R^x1a)2]_p-N-(CiC₄alquil)₂. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutida com -CONHCi-C4alquila, -COH, CO2H, ou -[C(R^x1a)2]p-COO-Ci-C₄alquila.

[00206] Em certas modalidades de Fórmula (I), cada R^x1a é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e halo. Em certas modalidades, ambos grupos R^x1a juntamente formam Cs-Cecicloalquila, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclo-hexila.

[00207] Em certas modalidades de Fórmula (I), R^x é heteroarila. Em certas modalidades, a heteroarila é monocíclica ou bibicíclica. Em certas modalidades, a heteroarila contém um a três nitrogênios (isto é, 1, 2, ou 3 nitrogênios) e/ou um a três oxigênios (isto é, 1, 2, ou 3 oxigênios). Em certas modalidades, a heteroarila contém um nitrogênio e/ou um oxigênio. Em certas modalidades, a heteroarila contém um nitrogênio. Em certas modalidades, a heteroarila contém dois nitrogênios. Em certas modalidades, a heteroarila contém um nitrogênio e um oxigênio. Em certas modalidades, R^x é .

[00208] Em certas modalidades de Fórmula (I), R^x é -(CiC4alquileno)-(C3-C8cicloalquila). Em certas modalidades, o -(CiC4alquileno)-(C3-C8cicloalquil) é substituído com um a dois halo no CiC4alquileno. Em certas modalidades, a Cs-Cscicloalquila é ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclo-hexila. Em certas modalidades, R^x é (Ci-C4alquileno)-(C3-C8cicloalquil), em que o -(Ci-C₄alquileno)-(C3Cscicloalquil) é opcionalmente substitutído com um ou dois halo no CiC₄alquileno e em que Cs-Cscicloalquila é ciclopropila, ciclobutila, cicloPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 77/245

58/196 pentila, ou ciclo-hexila. Em certas modalidades, R^x é ^F f [00209] A presente descrição fornece um composto tendo a Fórmula (la),

[00210] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos, em que Q¹, Q², Q³, R¹, R², R³, Ar, -Z-W-X-Y- e m são como definidos acima para Fórmula (Ia).

[00211] A presente descrição fornece um composto tendo a Fórmula (Ib),

[00212] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos, em que Q¹, Q², Q³, R¹, R², R³, Ar, -Z-W-X-Y- e m são como definidos acima para Fórmula (Ib).

[00213] Em certas modalidades, Q¹ é CH; Q² é N; e Q³ é C. Em certas modalidades, Q¹ é N; Q² é C; e Q³ é N. Em certas modalidades, Q¹ é CH; Q² é C; e Q³ é N. Em certas modalidades,¹ é N; Q² é N; e Q³ é C.

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 78/245

59/196 [00214]

Em certas modalidades, a

partir do grupo consistindo em é selecionada a

[00215] Em certas modalidades, R¹ é hidrogênio ou halo. Em certas modalidades, R¹ é Ci-C4alquila, em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH. Em certas modalidades, R¹ é Ci-C4alquinila, -CN, -OH, ou -S(O)2NH2. Em certas modalidades, R¹ é -NH2 ou -NHC(O)R^1a, em que R^1a é Ci-C4alquila. Em certas modalidades, R¹ é Ci-C4alquenila. Em certas modalidades, R¹ é -O-C1C4alquila.

[00216] Em certas modalidades, R² é hidrogênio ou halo. Em certas modalidades, R² é Ci-C4alquila, em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH. Em certas modalidades, R² é Ci-C4alquinila, -CN, -OH, ou -S(O)2NH2. Em certas modalidades, R² é -NH2 ou -NHC(O)R^2a, em que R^2a é Ci-C4alquila. Em certas modalidades, R² é -S(O)₂NH₂.

[00217] Em certas modalidades, R² é Ci-C4alquenila. Em certas modalidades, R² é -O-Ci-C4alquila. Em certas modalidades, R² é -NH2,

-NH(Ci-C4alquil), ou -N(Ci-C4alquil)2.

[00218] Em certas modalidades, R² é selecionado a partir do grupo

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 79/245

60/196 consistindo em halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C₄alquinila, -CN, -OH, -O-Ci-C4alquila, -NH2, -NH(Ci-C4alquil), -N(Ci-C₄alquil)₂, NHC(O)R^2a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^2a é Ci-C4alquila. Em certas modalidades, R² é selecionado a partir do grupo consistindo em halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -NH2, -NHC(O)R^2a, e 8(Ο)2ΝΗ2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^2a é Ci-C₄alquila. Em certas modalidades, R² não é hidrogênio.

[00219] Em certas modalidades, R³ é hidrogênio ou halo. Em certas modalidades, R³ é Ci-C4alquila, em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH. Em certas modalidades, R³ é Ci-C4alquinila, -CN, -OH, ou -S(O)2NH2. Em certas modalidades, R³ é -NH2 ou -NHC(O)R^3a, em que R^3a é Ci-C4alquila. Em certas modalidades, R³ é Ci-C4alquenila. Em certas modalidades, R³ é -O-C1C₄alquila.

Q4 [00220] Em certas modalidades, Ar e n . Em certas modali°' Á J < J J dades, Ar é . Em certas modalidades, Ar é . Em ww

Q J certas modalidades, Ar é Em certas modalidades, Ar «/VW L, / é Em certas modalidades, Ar é n .Em certas modalidades, Ar é ' n Em certas modalidades, Ar

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 80/245

61/196

HO é oh

HO T N | |_| . Em certas modalidades, Ar é oh

Em certas modalidades, Ar é

. Em certas modalidades, Ar

N

. Em certas modalidades, Ar é

. Em certas modalidades, Ar é

N

I . Em certas modalidades, Ar é

[00221] Em certas modalidades de Fórmula (Ia), Ar é ,^NA V-A- ,N Em certas modalidades de Fórmula (Ia), Ar é n \\ ,N N

Em certas

Q⁷ modalidades de Fórmula (Ia), Ar é Q⁷ ou Q⁷ , em que Q⁷ é selecionado a partir de S, O, CH2, e NR^Q7; em que R^Q7 é hidrogênio ou Ci-C4alquila opcionalmente substituída.

[00222] Em certas modalidades de Fórmula (lb), Ar é ,^NA V-A- ,n

Em certas modalidades de Fórmula (lb), Ar é n . Em certas

modalidades de Fórmula (lb), Ar é Q⁷ ou Q⁷ , em que Q⁷ é selecionado a partir de S, O, CH2, e NR^Q7; em que R^Q7 é hidrogênio ou

Ci-C4alquila opcionalmente substituída. Em certas modalidades de

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 81/245

62/196

Fórmula (lb), Aré ^Q , ^Q , _em q_ue Q7 θ selecionado a partir de S, O, CH2, e NR^Q7; em que R^Q7 é hidrogênio ou Ci-C4alquila opcionalmente substituída. Em certas modalidades de Fórmula (Ib), Ar é

Q⁶-^Q\ Y /„ N—/ q⁶ , em que cada Q^b e independentemente selecionado a partir de CR^Q6 e N; em que R^Q6 é hidrogênio, halo, -CN, alquila inferior, ou substituted alquila.

[00223] Em certas modalidades, -Z-W-X-Y- é -C(R^Z)2-C(R^W)2-N(R^X)C(R^y)₂. Em certas modalidades, -Z-W-X-Y- é -C(R^Z)2-C(R^W)2-CH(R^X)C(R^y)₂-, Em certas modalidades, -Z-W-X-Y- é -C(R^W)2-CH(R^X)-C(R^Y)2-, [00224] Em certas modalidades, cada R^z é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e halo. Em certas modalidades, ambos grupos R^z juntamente formam C3Cecicloalquila, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclohexila. Em certas modalidades, ambos grupos R^z juntamente formam oxo. Em certas modalidades, R^z e R^w juntamente com os carbonos aos quais eles são ligados formam uma Cs-Cecicloalquila, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclo-hexila.

[00225] Em certas modalidades, cada R^w é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e halo. Em certas modalidades, ambos grupos R^w juntamente formam C3Cecicloalquila, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclohexila. Em certas modalidades, ambos grupos R^w juntamente formam oxo. Em certas modalidades, R^z e R^w juntamente com os carbonos aos quais eles são ligados formam uma Cs-Cecicloalquila, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclo-hexila.

[00226] Em certas modalidades, cada R^Y é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e halo. Em certas modalidades, ambos grupos R^Y juntamente formam C3Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 82/245

63/196

Cecicloalquila, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclohexila. Em certas modalidades, ambos grupos R^Y juntamente formam oxo.

[00227] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (Ib), R^x é H. Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (Ib), R^x é R^X1, que é C3Cscicloalquila, heteroarila, ou heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com um a doze substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em deutério, halo, Ci-C₄alquila, -(CH₂)_P-OH, -[C(R^x1a)2]P-OH, -[C(R^x1a)2]_p-O-Ci-C₄alquila, NHCOCi-C₄alquila, -CONHCi-C₄alquila, -(CH₂)_P-NH₂, -[C(R^x1a)₂]_p-NH₂, -[C(R^x1a)2]p-NH-Ci-C4alquila, -[C(R^x1a)2]_p-N-(Ci-C₄alquil)₂; em que p é 0, 1,2, ou 3; em que cada R^x1a é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e C1C4alquila, ou ambos grupos R^x1ajuntamente formam Cs-Cecicloalquila. [00228] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (Ib), R^x é -COR^X1ou -SO2R^X1.

[00229] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (lb),R^x é selecio-

[00230] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (Ib), R^x é -(C1C4alquileno)-R^x1, em que 0 -(Ci-C4alquileno)-R^x1 é opcionalmente

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 83/245

64/196 substitutído com um a quatro halo no Ci-C4alquileno. Em certas modalidades, a -(Ci-C4alquileno)-R^x1 é substituído com um a quatro halo no Ci-C4alquileno. Em certas modalidades, o -(Ci-C4alquileno)-R^x1 é substituído com um ou dois halo no Ci-C4alquileno. Em certas modalidades, R^x é -(Ci-C4alquileno)-R^x1, em que o -(Ci-C4alquileno)-R^x1 é opcionalmente substitutído com um ou dois halo no Ci-C4alquileno e em que R^X1 é ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclo-hexila. Em certas modalidades, R^x é [00231] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (Ib), R^X1 é C3Cscicloalquila. Em certas modalidades, R^X1 é ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclo-hexila.

[00232] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (Ib), R^X1 é heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com um a doze substituintes que é halo. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila que é deuterada. Em certas modalidades, a heterociclila é monocíclica ou bibicíclica. Em certas modalidades, a heterociclila contém um a três nitrogênios (isto é, 1,2, ou 3 nitrogênios) e/ou um a três oxigênios (isto é, 1,2, ou 3 oxigênios). Em certas modalidades, a heterociclila contém um nitrogênio e/ou um oxigênio. Em certas modalidades, a heterociclila contém um nitrogênio. Em certas modalidades, a heterociclila contém dois nitrogênios. Em certas modalidades, a heterociclila contém um nitrogênio e um oxigênio.

[00233] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (Ib), R^X1 é heterociclila opcionalmente substituída com Ci-C4alquila, -(CH2)P-OH, ou (CFDp-NFE; em que p é 1, 2, ou 3. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com Ci-C4alquila. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com -(CH2)P-OH; em que p é 1, 2, ou 3. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com -(CH2)-OH. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com -(CH2)_PPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 84/245

65/196

NH₂; em que p é 1,2, ou 3. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com -(CH₂)-NH₂.

[00234] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (lb), R^X1 é heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substituída com [C(R^x1a)2]p-CN. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila substituída com -[C(R^x1a)2]_p-OH, -[C(R^x1a)2]p-O-Ci-C4alquila, -NHCOCi-C4alquila, [C(R^x1a)2]_p-NH₂, -[C(R^x1a)2]p-NH-Ci-C4alquila, ou -[C(R^x1a)2]_p-N-(CiC₄alquil)₂. Em certas modalidades, R^X1 é heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com -CONHCi-C4alquila, -COH, CO2H, ou -[C(R^x1a)2]_p-COO-Ci-C₄alquila.

[00235] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (lb), cada R^x1a é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e halo. Em certas modalidades, ambos grupos R^x1a juntamente formam Cs-Cecicloalquila, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclo-hexila.

[00236] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (lb), R^X1 é heteroarila. Em certas modalidades, a heteroarila é monocíclica ou bibicíclica. Em certas modalidades, a heteroarila contém um a três nitrogênios (isto é, 1, 2, ou 3 nitrogênios) e/ou um a três oxigênios (isto é, 1, 2, ou 3 oxigênios). Em certas modalidades, a heteroarila contém um nitrogênio e/ou um oxigênio. Em certas modalidades, a heteroarila contém um nitrogênio. Em certas modalidades, a heteroarila contém dois nitrogênios. Em certas modalidades, a heteroarila contém um nitrogênio e um oxigênio. Em certas modalidades, R^X1 é .

[00237] Em certas modalidades de Fórmula (Ia) e (lb), R^x é CON(R^X2)2. Em certas modalidades, R^x é -CON(R^X2)2, em que R^X2 é hidrogênio ou metila. Em certas modalidades, R^x é -CONH2. Em certas modalidades, R^x é -CON(R^X2)2, em que R^X2 é Ci-C4alquila. Em certas modalidades, R^x é -CON(R^X2)2, em que R^X2 é metila.

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 85/245

66/196 [00238] Em certas modalidades, m é 0. Em certas modalidades, m é 1. Em certas modalidades, m é 2.

[00239] Em uma variação dos compostos aqui, Ar é n θ Q¹é CH; Q² é N; Q³ é C; Q⁴ é C; e Q⁵ é C.

[00240] Em uma variação dos compostos aqui, Ar é n é CH; Q² é N; Q³ é C; Q⁴ é C; e Q⁵ é C.

[00241] A presente descrição fornece compostos aqui de Fórmula (I):

W-_X^^YA [00242] tendo um, dois, três, ou mais dos seguintes aspectos:

Qf [00243] a) Ar é n [00244] b)Q¹ é CH; Q² é N; e Q³ é C;

[00245] c) R² é hidrogênio ou halo;

[00246] d) -Z-W-X-Y- é -C(R^Z)2-C(R^W)2-N(R^X)-C(R^Y)₂-;

[00247] e)R^xé-COR^x1.

[00248] A presente descrição fornece compostos aqui de Fórmula (I):

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 86/245

67/196

[00249] tendo um, dois, três, ou mais dos seguintes aspectos:

Qf [00250] a) Ar é n [00251] b)Q¹ é CH; Q² é N; e Q³ é C;

[00252] c) R² é Ci-C4alquila, em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH;

[00253] d) -Z-W-X-Y- é -C(R^Z)2-C(R^W)2-N(R^X)-C(R^Y)2-;

[00254] e)R^xé-COR^x1.

[00255] A presente descrição fornece compostos aqui de Fórmula (I):

[00256] tendo um, dois, três, ou mais dos seguintes aspectos:

Of [00257] a) Ar é n [00258] b)Q¹ é CH; Q² é N; e Q³ é C;

[00259] c) R² é Ci-C₄alquinila, -CN, -OH, -S(O)₂NH₂, -NH₂ ou NHC(O)R^2a;

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 87/245

68/196 [00260] d) -Z-W-X-Y- é -C(R^Z)2-C(R^W)2-N(R^X)-C(R^Y)2-;

[00261] e)R^xé-COR^x1.

[00262] Exemplos não limitantes dos compostos da invenção são apresentados abaixo.

Composto 1-1	H °*γ^Ν^ο /=\ An ,cf₃ ^N N / \ >-ⁿv_/ o
Composto I-2	H O^V⁰\—í ,CN N ^N ) \ y-^NU o
Composto I-3	H °vy° x N ^N ) \ o
Composto I-4	H Ο^ζ^Νχ^Ο Ά—Γ _/^NH₂ OtTc0 N 1 ) o
Composto I-5	n ^H ^ϋ<^Ν Q?t_r. ^N \ J J N o o
Composto I-6	n ^HqA/y ^N \ J J N Λ~ν ° OH

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 88/245

69/196

Composto 1-7	H O^^N^O Λ—Γ y N n''_> ^yCk 0
Composto 1-8	H °Ύ^ΝΧ° /=\ Pk w Π/)
Composto 1-9	H °Ύ^ΝΧ° /=\ y=/ + V/r '-Λ _ZN // \\ /> ° y»o
Composto 1-10	H O^^Nx^O h O Λ/ ΟΛΟΙ? N N \ ^vO 0
Composto 1-11	H Λ—Λ /CHF2 N ^N ) 0
Composto 1-12	⁰ ;Ó^nh0==( 0 ^fA <ⁿxi Or 0
Composto 1-13	Nr ⁰ ;i^NH /^=( 0 k Γ ri 0 H

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 89/245

70/196

Composto 1-14	N-n O r-Ã Λ l! /ⁿ\í ^NH /=) 0 0
Composto 1-15	N-n ° /=) o < Γχΐ \_/1-^ V o
Composto 1-16	n-, ° [T^J T-?^H/=( o ^Fvv ocx^ ^F V-_x^N~Y o
Composto 1-17	N-n ° ;Ó^NH /=) o o
Composto 1-18	N-n O r-Ã Jk Ã v ^NH /=) O /—^N Ϊ. (z'^NY'^r^F0
Composto 1-19	/V ° ;Ô^NH/=) o ( Π S--/ \ N _F h₂n Y-W o

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 90/245

71/196

Composto 1-20	n-, ° P=y o HO \__[T^F O
Composto 1-21	N-η. ° P=y o 7^ ( Γ1 /—/ \ HO \__/^N^( O
Composto I-22	N-n O JLÃ k /^nx\í ^nh O ¢7 CG Ά 'o
Composto I-23	N-n O K Â fj ^N \[ ΝΗ /=) O ^F/ ⁰
Composto I-24	N-n O π JLi Γ nh F=\ O F Λ^ΝνΚ < kl F °
Composto I-25	N-n O r-k kA 1/ ^NH ΛΠ o fX ^c ki ^Fk^NY 0

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 91/245

72/196

Composto 1-26	N-n O
N yNH
/=\ O

F.
F-4—/ \ N _F
HO^Z \__
O
Composto 1-27	N-n O Γ ^NH /=( O X CÒi / \ O_/^NX 0
Composto 1-28	H Λ—Γ _ZF CO? N N \ x-O o
Composto 1-29	N-n ° /=( o r, x ο. Ρ ρ _n X Vii ^DÍTo °
Composto 1-30	N O (^^N JL/^NH xl / \ n^^^f \ N~Z O
Composto 1-31	H °^^Νν^° Ά_Λ v Q5c0 ^{N CF3} Xx-N y-N_x__/ OH O
Composto I-32	H o^^Nv^° Λ—Λ Q^cQ N —K f y-\ VN. J N- 1 ^H

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 92/245

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Composto 1-33	H A—( ,F N n \ --\ VN J Ν’ O ¹
Composto 1-34	0° /-zVÍ o Q z 6J
Composto 1-35	H O_<=(z^Ns^O \—F / N-/ ζ \ N N \ L / r—. H / VN V^N d ^X O
Composto 1-36	H θΑ'Αθ }—F F O“O~0 N N^z \ / \^N / An O
Composto 1-37	H \—Γ /F Oqc0 N^{X N}^) Η _r __/ NH O
Composto 1-38	H }—Γ /F Oqc0 / r---s Υ^Ν_χ_J NH o —J
Composto 1-39	H Os₌₍/^Nx^O \—Γ /F OAr~0 N^X N^Z \ A-n / __Γ o' —¹

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 93/245

74/196

Composto 1-40	\ O jAR o
Composto 1-41	H O^^Nx^O Λ —/ / N N \ / l / r--- /~^N X^N / X \ o
Composto I-42	H O^^NXsO OrfoZ? N I ) X^N / λ O
Composto I-43	H 2=Ά z-V^CF3Q3H7 ^N i^) X---N Λ'Q VN. / H N—f-F ⁰ F
Composto I-44	H O<~z^Nx^O >=< z^^CF3/^ N-/ Y—ζ \ vx % < Ly N N ^Fy^F o
Composto I-45	H O^^NXssO /CN OTc0 ^{n n} ) / \^^N f \ O
Composto I-46	H O^z^NVsO Λ—Γ _zcn Ο.3θ5 N ^N ) ^^N, / o

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 94/245

75/196

Composto 1-47	H oVVo Λ—Λ .ON N N 'ç ¹ \ O
Composto 1-48	J/ntf ° O ° tf

[00263] A presente descrição fornece um composto tendo a Fórmula (Ha):

[00264] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos.

[00265] Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do grupo consistindo em:

[00266] A presente descrição fornece um composto tendo a Fórmu la (llb):

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 95/245

76/196 [00267] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos.

[00268] Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do grupo consistindo em:

[00269] Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do

[00270]

Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do grupo consistindo em:

[00271] A presente descrição fornece um composto tendo a Fórmu la (llc):

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 96/245

77/196

[00272] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos.

[00273]

Em algumas modalidades,

R^X1 é selecionado a partir do grupo consistindo em:

[00274]

Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do

[00275]

Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do grupo consistindo em:

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78/196 [00276] A presente descrição fornece um composto tendo a Fórmula (lld):

[00277] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos.

[00278] Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do grupo consistindo em:

[00280] Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do

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79/196 grupo consistindo em:

[00281] A presente descrição fornece um composto tendo a Fórmula (He):

⁰ (He), [00282] e sais farmaceuticamente aceitáveis e tautômeros dos mesmos.

[00283] Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do grupo consistindo em:

[00284] Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do

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grupo consistindo em: /

[00285] Em algumas modalidades, R^X1 é selecionado a partir do grupo consistindo em:

[00286] A menos que de outra maneira declarado, as estruturas aqui descritas também pretendem incluir compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos. Por exemplo, a substituição de um átomo de hidrogênio por deutério ou trício, ou a substituição de um átomo de carbono por ¹³C ou ¹⁴C, ou a substituição de um átomo de nitrogênio por ¹⁵N, ou a substituição de um átomo de oxigênio com ¹⁷O ou ¹⁸O estão dentro do escopo da presente descrição. Tais compostos isotopicamente marcados são úteis como ferramentas de pesquisa ou de diagnóstico. Em certas modalidades, a deuteração pode ser utilizada para retardar o metabolismo e, assim, potencialmente melhorar a meia-vida do composto. Qualquer um ou todos os hidrogênios no composto podem ser substituídos por deutério.

Métodos de Sintetização dos Compostos Descritos [00287] Os compostos da presente invenção podem ser feitos por uma variedade de métodos, incluindo química padrão. Rotinas sintéticas adequadas são descritas nos esquemas abaixo indicados.

[00288] Os compostos de quaisquer das fórmulas aqui descritas

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81/196 podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica da síntese orgânica como menciondos na parte pelos seguintes esquemas sintéticos e exemplos. Nos esquemas descritos abaixo, é bem entendido que os grupos protetores para grupos sensíveis ou reativos são utilizados sempre que necessário de acordo com os princípios gerais ou química. Os grupos protetores são manipulados de acordo com os métodos padrão de síntese orgânica (T. W. Greene e P.G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Terceira Edição, Wiley, New York 1999). Estes grupos são removidos em um estágio conveniente da síntese do composto utilizando métodos que ficarão facilmente evidentes àqueles versados na técnica. Os procedimentos de selecção, bem como as condições de reação e a ordem da sua execução, devem ser consistentes com a preparação dos compostos da presente descrição.

[00289] Aqueles versados na técnica reconhecerão se existe um estereocentro em quaisquer dos compostos da presente descrição. Consequentemente, a presente invenção inclui ambos os estereoisômeros possíveis (a menos que especificado na síntese) e inclui não apenas compostos racêmicos, porém, também enantiômeros individuais e/ou diastereômeros também. Quando um composto é desejado como um enantiômero ou diastereômero único, pode ser obtido por síntese estereoespecífica ou por resolução do produto final ou qualquer intermediário conveniente. A resolução do produto final, um intermediário ou material de partida pode ser afetada por qualquer método adequado conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Stereochemistry of Organic Compounds por E. L. Eliel, S. H. Wile,n e L. N. Mander (Wiley-lnterscience, 1994).

Métodos de Preparar os Compostos [00290] Os compostos aqui descritos podem ser feitos de materiais de partida comercialmente disponíveis ou sintetizados utilizando proPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 101/245

82/196 cessos orgânicos, inorgânicos e/ou enzimáticos conhecidos.

[00291] Os compostos da presente invenção podem ser preparados de várias formas bem conhecidas por aqueles versados na técnica da síntese orgânica. A título de exemplo, os compostos da descrição podem ser sintetizados utilizando os métodos descritos abaixo, em conjunto com os métodos sintéticos conhecidos na técnica da química orgânica sintética, ou variações dos mesmos, como é apreciado por aqueles versados na técnica. Estes métodos incluem, porém, não estão limitados aos métodos descritos abaixo.

[00292] Uma síntese representativa para os compostos em questão é mostrada no Esquema 1.

Esquema 1. Síntese geral de um composto ilustrativo de Fórmula (I)

[00293] No Esquema 1, Núcleo 2 é uma modalidade em que Q¹ é

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Qi

CH; Q² é N; e Q³ é C; R² é bromo; Ar é θ -Z-W-X-YN [00294] O Composto 1 e o aldeído alílico são materiais de partida comercialmente disponíveis. Alternativamente, o composto 1 e o aldeído alílico podem ser sintetizados por uma variedade de diferentes rotinas de síntese utilizando materiais de partida comercialmente disponíveis e/ou materiais de partida preparados por métodos sintéticos convencionais.

[00295] Com referência continuada ao Esquema 1, o composto 1 e um aldeído alílico são reagidos para formar o composto 2 em uma reação de condensação em um solvente adequado tal como acetonitrila em uma temperatura, por exemplo, de cerca de 400°C a 1000°C. O Composto 2 é reagido com amônia para formar o composto 3 em um solvente adequado, tal como metanol a uma temperatura, por exemplo, na faixa de 0°C até à temperatura ambiente. O composto 3 pode ser utilizado em uma reação de acoplamento a ser discutida abaixo.

[00296] Com referência continuada ao Esquema 1, o composto 5 pode ser preparado a partir de um composto de alquilação de 4 com um haleto de alquila na presença de uma base, tal como um hidreto de metal alcalino, tal como hidreto de sódio. A reação pode ser conduzida em um solvente adequado, tal como dimetilformamida (DMF) a uma temperatura, por exemplo, na faixa de 0°C até à temperatura ambiente.

[00297] O composto 6 pode ser preparado a partir da redução do composto 5. Reagentes de redução apropriados incluem complexo de borano piridina. A reação pode ser conduzida em um solvente adequado, tal como ácido acético a uma temperatura, por exemplo, na faiPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 103/245

84/196 xa de 0°C até à temperatura ambiente.

[00298] O composto 7 pode ser preparado a partir da reação do composto 6. A reação é realizada com formaldeído na presença de ácido, tal como ácido sulfúrico e ácido acético.

[00299] O composto 8 pode ser preparado a partir da proteção do grupo amino do composto 7. Os reagentes adequados incluem BOC anidrido. A reação pode ser conduzida em um solvente adequado, tal como tetra-hidrofurano (THF) a uma temperatura, por exemplo, na faixa de 0°C até à temperatura ambiente.

[00300] Núcleo 1 pode ser preparado a partir da desidrogenação do Composto 8. Os reagentes adequados incluem DDQ (2,3-dicloro-5,6diciano-1,4-benzoquinona). A reação pode ser conduzida em um solvente adequado, tal como tetra-hidrofurano (THF) a uma temperatura, por exemplo, na faixa de 0°C até à temperatura ambiente.

[00301] O composto 10 pode ser preparado do núcleo 1 por desprotecção do grupo amino e em seguida a reação subsequente com o haleto de acila. A desprotecção do grupo amino pode ser realizada sob condições ácidas, se o grupo de protecção for BOC. Em seguida, a reação com um haleto de acila pode resultar no composto 10. A reação pode ser conduzida em um solvente adequado, tal como dimetilformamida (DMF), a uma temperatura, por exemplo, na faixa de 0°C até à temperatura ambiente.

[00302] O composto 11 pode ser preparado a partir do composto 10 por uma reação de acilação, tal como uma reação de acilação de Friedel Crafts. Nesta reação, um haleto de acila é reagido com o composto 10 em um solvente adequado, tal como cloreto de metileno a uma temperatura, por exemplo, na faixa de 30°C a 100°C. O produto é, então, reagido com um álcool e uma base para formar um éster, como no composto 11.

[00303] Composto 11 e Composto 3 são reagidos para formar o

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85/196 composto 1 H-pirrol-2,5-diona. A reação é realizada em um solvente orgânico inerte, tal como dimetilformamida, tetra-hidrofurano, e similares e na presença de uma base tal como terc-butóxido de potássio.

Métodos de Uso dos Compostos [00304] A presente descrição refere-se a métodos para ativar a via de Wnt ou inibir a atividade de GSK3-beta. Apesar de existirem centenas de inibidores de GSK3 supostos na literatura de patente e de não patente, nem todos os inibidores de GSK3, quando administrados na ausência de outros agentes terapêuticos seria suficiente nem potente o suficiente para promover a ativação da proliferação de célulastronco.

[00305] Em outro aspecto, a presente descrição refere-se a métodos para prevenir, reduzir ou tratar a incidência e/ou gravidade de distúrbios ou doenças associados com a ausência ou falta de certas células de tecido. Em um aspecto, a presente descrição refere-se a métodos para prevenir, reduzir ou tratar a incidência e/ou gravidade de distúrbios do ouvido interno e incapacidades auditivas que envolvem o tecido do ouvido interno, particularmente células ciliadas do ouvido interno, os seus progenitores, e opcionalmente, a estria vascular, e nervos auditivos associados. De particular interesse estão aquelas condições que levam à perda permanente da audição onde o número reduzido de células ciliadas pode ser responsável e/ou diminuição da função das células ciliadas. Também de interesse são aqueles que surgem como um efeito colateral indesejado de fármacos terapêuticos ototóxicos, incluindo a cisplatina e seus análogos, antibióticos aminoglicosídicos, salicilato e seus análogos, ou diuréticos de alça. Em certas modalidades, a presente descrição refere-se à indução, promoção ou realque do crescimento, proliferação ou regeneração do tecido do ouvido interno, particularmente as células de suporte do ouvido interno e células ciliadas.

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86/196 [00306] Entre outras coisas, os métodos aqui apresentados são úteis para a preparação de formulações farmacêuticas para a profilaxia e/ou tratamento de doença do ouvido aguda e crônica e perda auditiva, problemas de tontura e equilíbrio, especialmente perda auditiva súbita, trauma acústico, perda auditiva devido à exposição ao ruído crônica, presbiacusia, trauma durante a implantação da prótese no ouvido interno (trauma de inserção), tontura devido a doenças do ouvido interno, tontura relacionada e/ou como um sintoma da doença de Meniere, vertigem relacionada e/ou como um sintoma da doença de Meniere, zumbido e perda auditiva devido a antibióticos e citostáticos e outros fármacos.

[00307] Quando as populações de célula de suporte na cóclea são tratadas com o composto, se a população é, in vivo ou in vitro, as células de suporte tratadas exibem comportamento semelhante às célulastronco pelo fato de que as células de suporte tratadas têm a capacidade de proliferar e diferenciar e, mais especificamente, diferenciar em células ciliadas na cóclea. Preferivelmente, o composto induz e mantém as células de suporte para a produção de células-tronco filha que podem se dividir por muitas gerações e manter a capacidade de ter uma alta proporção das células resultantes que se diferenciam em células ciliadas. Em certas modalidades, as células-tronco de proliferação expressam marcadores de células-tronco que podem incluir Lgr5, Sox2, Opeml, Phex, Iin28, Lgr6, ciclina D1, Msx1, Myb, Kit, Gdnf3, Zic3, Dppa3, Dppa4, Dppa5, Nanog, Esrrb, Rex1, Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3l, Utf1, Tcl1, Oct4, Klf4, Pax6, Six2, Zic1, Zic2, Otx2, Bmi1, CDX2, STAT3, Smadl, Smad2, Smad2/3, Smad4, smadõ, e/ou Smad7.

[00308] Em algumas modalidades, o método da presente descrição pode ser utilizado para manter, ou mesmo aumentar transitoriamente sternness (isto é, autorrenovação) de uma população de células de

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87/196 suporte pré-existente antes da formação de células ciliadas significativa. Em algumas modalidades, a população de células de suporte préexistente compreende células pilar internas, células pilares externas, células falangeais internas, células de Deiter, células de Hensen, células de Boettcher, e/ou células de Claudius. A análise morfológica com imunocoloração (incluindo contagens de células) e o rastreamento de linhagem através de Amostras de Microscopia Representativas podem ser usados para confirmar a expansão de um ou mais destes tipos de células. Em algumas modalidades, as células de suporte préexistentes compreendem células Lgr5⁺. Análises morfológicas com imunocoloração (incluindo contagens de células) e qPCR e de hibridização de RNA podem ser usadas para confirmar a superregulação de Lgr5 entre a população de células.

[00309] Vantajosamente, os métodos da presente descrição atingem estes objetivos sem o uso de manipulação genética. A manipulação da linha germinativa utilizada nos diversos estudos acadêmicos não é uma abordagem terapêutica desejável para o tratamento da perda auditiva. Em geral, a terapia envolve preferivelmente a administração de uma molécula pequena, peptídeo, anticorpo, ou outra molécula de não ácido nucleico ou vetor de liberação de ácido nucléico não acompanhado por terapia genética. Em certas modalidades, a terapia envolve a administração de uma molécula orgânica pequena. Preferivelmente, a proteção ou restauração auditiva é conseguida através do uso de um agente terapêutico (não genético) que é injetado no ouvido médio e difunde-se na cóclea.

[00310] A cóclea depende fortemente de todos os tipos de células presentes, e a organização destas células é importante para a sua função. As células de suporte desempenham um papel importante no ciclismo neurotransmissor e mecânica coclear. Assim, manter um padrão de roseta dentro do Órgão de Corti pode ser importante para a

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88/196 função. Mecânica coclear da membrana basilar ativa a transdução de células ciliadas. Devido à elevada sensibilidade da mecânica coclear, é também é desejável evitar massas de células. Em todos, manter a distribuição adequada e relação das células ciliadas e células de suporte ao longo da membrana basilar, mesmo depois da proliferação, é provavelmente uma característica desejada para audição quando a função das células de suporte e mecânica adequada são necessárias para a audição normal.

[00311] Em uma modalidade da presente descrição, a densidade celular das células ciliadas em uma população de célula coclear é expandida de uma maneira que mantém, ou até mesmo estabelece, o padrão de roseta característico dos epitélios cocleares.

[00312] De acordo com um aspecto da presente descrição, a densidade celular das células ciliadas pode ser aumentada em uma população de células cocleares compreendendo ambas as células ciliadas e células de suporte. A população de célula coclear pode ser uma população in vivo (isto é, compreendida pelo epitélio coclear de um indivíduo) ou a população da célula coclear pode ser uma população ex vitro (ex vivo). Se a população é uma população in vitro, o aumento na densidade celular pode ser determinado por referência a uma Amostra de Microscopia Representativa da população tirada antes e depois de qualquer tratamento. Se a população é uma população in vivo, o aumento na densidade celular pode ser determinado indiretamente por determinação de um efeito na audição do indivíduo com um aumento na densidade da célula ciliada correlacionando a uma melhoria da audiência.

[00313] Em uma modalidade, as células de suporte colocadas em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco na ausência de neuronal formam as sinapses em fita.

[00314] Em uma cóclea nativa, a padronização das células ciliadas

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89/196 e das células de suporte ocorre de maneira paralela à membrana basilar. Em uma modalidade da presente descrição, a proliferação de células de suporte em uma população de célula coclear é expandida de uma maneira como a membrana basilar característica dos epitélios cocleares.

[00315] Em uma modalidade, o número de células de suporte em uma população de célula cloclear inicial é seletivamente expandida por tratamento da população de célula cloclear inicial com uma composição aqui fornecida para formar uma população de célula coclear intermediária e em que a relação de células de suporte para as células ciliadas na população de célula coclear intermediária excede a relação de células de suporte para células ciliadas na população de célula cloclear inicial. A população de célula coclear expandida pode ser, por exemplo, uma população in vivo, uma população in vitro ou até mesmo um explante in vitro. Em uma tal modalidade, a relação de células de suporte para as células ciliadas na população de célula coclear intermediária excede a relação de células de suporte para células ciliadas na população de célula cloclear inicial. Por exemplo, em uma tal modalidade, a relação de células de suporte para células ciliadas na população de célula coclear intermediária excede a relação de células de suporte para células ciliadas na população de célula cloclear inicial em um fator de 1,1. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, a relação de células de suporte para células ciliadas na população de célula coclear intermediária excede a relação de células de suporte para células ciliadas na população de célula cloclear inicial por um fator de 1,5. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, a relação de células de suporte para células ciliadas na população de célula coclear intermediária excede a relação de células de suporte para células ciliadas na população de célula cloclear inicial por um fator de 2. A título de exempo adicional, em uma tal modalidade, a relação de

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90/196 células de suporte para células ciliadas na população de célula coclear intermediária excede a relação de células de suporte para células ciliadas na população de célula cloclear inicial por um fator de 3. Em cada uma das modalidades anteriores, a capacidade de uma composição da presente descrição de expandir uma população de célula coclear como descrito neste parágrafo, pode ser determinada por meio de um Ensaio de Proliferação de Células Tronco.

[00316] Em uma modalidade, o número de células-tronco em uma população de célula coclear é expandido para formar uma população de célula coclear intermediária por tratamento de uma população de célula coclear com uma composição fornecida aqui em que a densidade celular de células-tronco na população de célula coclear intermediária excede a densidade celular das células-tronco na população de célula cloclear inicial. A população de célula coclear tratada pode ser, por exemplo, uma população in vivo, uma população in vitro ou até mesmo um explante in vitro. Em uma tal modalidade, a densidade celular das células-tronco na população de célula coclear tratada excede a densidade celular das células-tronco na população de célula cloclear inicial por um fator de pelo menos 1,1. Por exemplo, em uma tal modalidade, a densidade celular das células-tronco na população de célula coclear tratada excede a densidade celular das células-tronco na população de célula cloclear inicial por um fator de pelo menos 1,25. Por exemplo, em uma tal modalidade, a densidade celular das células-tronco na população de célula coclear tratada excede a densidade celular das células-tronco na população de célula cloclear inicial por um fator de pelo menos 1,5. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, a densidade celular de células-tronco na população de célula coclear tratada excede a densidade celular de células-tronco na população de célula cloclear inicial por um fator de pelo menos 2. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, a densidade celular de célulasPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 110/245

91/196 tronco na população de célula coclear tratada excede a densidade celular de células-tronco na população de célula cloclear inicial por um fator de pelo menos 3. Populações de célula coclear in vitro podem expandir-se significativamente mais do que as populações in vivo; por exemplo, em certas modalidades, a densidade celular de célulastronco em uma população in vitro expandida de células-tronco pode ser, pelo menos, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2.000 ou até 3.000 vezes mais do que a densidade celular das células-tronco na população de célula cloclear inicial. Em cada uma das modalidades anteriores, a capacidade de uma composição da presente descrição expandir uma população celular coclear como descrita neste parágrafo, pode ser determinada por meio de um Ensaio de Proliferação de Células Tronco.

[00317] De acordo com um aspecto da presente descrição, uma população de célula de suporte na cóclea é tratada com uma composição aqui fornecida para aumentar a atividade de Lgr5 da população. Por exemplo, em uma modalidade, a composição aqui fornecida tem a capacidade de aumentar e manter a atividade de Lgr5 de uma população in vitro das células de suporte na cóclea por fator de pelo menos 1,2. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a atividade de Lgr5 de uma população in vitro de células de suporte na cóclea por um fator de 1,5. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a atividade de Lgr5 de uma população in vitro de células de suporte na cóclea por um fator de 2, 3, 5, 10, 100, 500, 1.000, 2.000 ou até mesmo 3.000. Aumentos na atividade de Lgr5 também podem ser observados para populações in vivo, porém, o aumento observado pode ser um pouco mais modesto. Por exemplo, em uma modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a ativiPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 111/245

92/196 dade de Lgr5 de uma população in vivo de células de suporte na cóclea por pelo menos 5%. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a atividade de Lgr5 de uma população in vivo de células de suporte na cóclea por pelo menos 10%. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a atividade de Lgr5 de uma população in vivo de células de suporte na cóclea por pelo menos 20%. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a atividade de Lgr5 de uma população in vivo de células de suporte na cóclea por pelo menos 30%. Em cada uma das modalidades anteriores, a capacidade do composto para um tal aumento na atividade de Lgr5 pode ser demonstrada, por exemplo, em um Ensaio de Atividade de Lgr5⁺ In Vitro e em uma população in vivo pode ser demonstrada, por exemplo, em um Ensaio de Atividade de Lgr5⁺ In Vivo, como medido por isolamento do órgão e realizando análises morfológicas usando a imunocoloração, a expressão da proteína fluorescente endógena de Lgr5 (por exemplo, Lgr5, Sox2), e qPCR para Lgr5.

[00318] Além de aumentar a atividade de Lgr5 da população, o número de células de suporte Lgr5⁺ em uma população de célula da cóclea pode ser aumentado por tratamento de uma população de célula da cóclea contendo células de suporte Lgr5⁺ (quer in vivo ou in vitro) com uma composição fornecida aqui Geralmente, a densidade celular das células de suporte tronco/progenitoras pode expandir em relação à população celular inicial através de um ou mais de vários mecanismos. Por exemplo, em uma tal modalidade, células de suporte Lgr5⁺ recentemente geradas podem ser geradas as quais têm a propensão de célula-tronco aumentada (isto é, maior capacidade de se diferenciar em células ciliadas). A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, nenhuma célula Lgr5⁺ filha é gerada por divisão celular, porém, as

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93/196 células de suporte Lgr5⁺ preexistentes são induzidas a diferenciaremse em células ciliadas. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade nenhuma célula filha é gerada por divisão celular, porém, as células de suporte Lgr5' são ativadas até um nível mais elevado de atividade de Lgr5 e as células de suporte ativadas são, então, capazes de se diferenciar em células ciliadas. Independentemente do mecanismo, em uma modalidade do composto da presente descrição tem a capacidade de aumentar a densidade celular das células de suporte Lgr5⁺ em uma população de célula isolada in vitro de células de suporte na cóclea por um fator de pelo menos 5. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a densidade celular de células de suporte Lgr5⁺ em uma população in vitro de células de suporte na cóclea por um fator de pelo menos 10. Por meio de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a densidade celular das células de suporte Lgr5+ em uma população in vitro das células de suporte na cóclea por um fator de pelo menos 100, pelo menos 500, pelo menos 1.000 ou ainda pelo menos 2.000. Aumentos na densidade celular de células de suporte Lgr5⁺ também podem ser observados para populações in vivo, porém, o aumento observado pode ser um pouco mais modesto. Por exemplo, em uma modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a densidade celular de células de suporte Lgr5⁺em uma população in vivo de células de suporte na cóclea por pelo menos 5%. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a densidade celular de células de suporte Lgr5⁺ em uma população in vivo de células de suporte na cóclea por pelo menos 10%. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a densidade celular das células de suporte Lgr5⁺ em uma população in vivo de células de suporte na cóclea por pelo menos 20%. A título de exemplo

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94/196 adicional, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a densidade celular de células de suporte Lgr5⁺ em uma população in vivo de células de suporte na cóclea por pelo menos 30%. A capacidade do composto para um tal aumento em células de suporte Lgr5+ em uma população in vitro pode ser demonstrada, por exemplo, em um Ensaio de Proliferação de Células Tronco em um ensaio in vivo apropriado. Em uma modalidade, um composto da presente descrição tem a capacidade de aumentar o número de células Lgr5⁺ na cóclea induzindo a expressão de Lgr5 em células com níveis de deteção baixos ou ausentes da proteína, enquanto mantendo a Morfologia Nativa. Em uma modalidade, um composto da presente descrição tem a capacidade de aumentar o número de células Lgr5⁺ na cóclea induzindo a expressão de Lgr5 em células com níveis de detecção baixos ou ausentes da proteína, enquanto mantendo a Morfologia Nativa e sem a produção de Agregados de Células.

[00319] Além de aumentar a densidade celular de células de suporte Lgr5⁺, em uma modalidade, o método da presente descrição tem a capacidade de aumentar a relação de células Lgr5⁺ para células ciliadas em uma população de célula coclear. Em uma modalidade, o número de células de suporte Lgr5⁺ em uma população de célula cloclear inicial é seletivamente expandida por tratamento da população de célula cloclear inicial com um composto da presente descrição para formar uma população de célula expandida e em que o número de células de suporte Lgr5⁺ na população de célula coclear expandida pelo menos iguala-se ao número de células ciliadas. A população de célula coclear expandida pode ser, por exemplo, uma população in vivo, uma população in vitro ou até mesmo um explante in vitro. Em uma tal modalidade, a relação de células de suporte Lgr5⁺ para células ciliadas na população de célula coclear expandida é de pelo menos 1:1. Por exemplo, em uma tal modalidade, a relação de células de suporte

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Lgr5⁺ para células ciliadas na população de célula coclear expandida é de pelo menos 1,5:1. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, a relação de células de suporte Lgr5⁺ para células ciliadas na população de célula coclear expandida é de pelo menos 2:1. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, a relação de células de suporte Lgr5⁺ para células ciliadas na população de célula coclear expandida é de pelo menos 3:1. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, a relação de células de suporte Lgr5⁺ para células ciliadas na população de célula coclear expandida é de pelo menos 4:1. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, a relação de células de suporte Lgr5⁺ para células ciliadas na população de célula coclear expandida é de pelo menos 5: 1. Em cada uma das modalidades anteriores, a capacidade do composto da presente descrição de expandir uma população de célula coclear como descrito neste parágrafo pode ser determinada por meio de um Ensaio de Proliferação de Célula Tronco.

[00320] Em certas modalidades, o método aumenta a fração das células Lgr5⁺ para células totais no epitélio sensorial por, pelo menos, 10%, 20%, 50%, 100%, 250%, 500%, 1000% ou 5000%.

[00321] Em certas modalidades, o método aumenta as células Lgr5⁺ até se tornarem pelo menos 10, 20, 30, 50, 70 ou 85% das células no epitélio sensorial, por exemplo, o Órgão de Corti.

[00322] Em geral, a proliferação excessiva de células de suporte na cóclea é preferivelmente evitada. Em uma modalidade, o método da presente descrição tem a capacidade de expandir uma população de célula coclear sem criar uma protrusão de novas células além da superfície nativa da cóclea, por exemplo, um Agregado Celular. Em algumas modalidades, 30 dias após a colocação de uma composição fornecida aqui na membrana redonda ou oval, o tecido coclear tem Morfologia Nativa. Em algumas modalidades, 30 dias após a colocaPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 115/245

96/196 ção do composto na membrana redonda ou oval, o tecido coclear tem Morfologia Nativa e não possui Agregados Celulares. Em algumas modalidades, 30 dias após a colocação do composto na membrana redonda ou oval, o tecido coclear tem Morfologia Nativa e pelo menos 10, 20, 30, 50, 75, 90, 95, 98, ou até mesmo pelo menos 99% das células Lgr5⁺ no Órgão de Corti não fazem parte dos Agregados Celulares.

[00323] Além de expandir populações de células de suporte, geralmente, e células de suporte Lgr5⁺, especificamente, como descrito acima, o método da presente descrição tem a capacidade de manter, nas células-filha, a capacidade de se diferenciar em células ciliadas. Em populações in vivo, a manutenção dessa capacidade pode ser indiretamente observada por uma melhora na audição de um indivíduo. Em populações in vitro, a manutenção desta capacidade pode ser diretamente observada por um aumento no número de células ciliadas em relação a uma população de partida ou indiretamente medindo a atividade de LGR5, atividade de SOX2 ou um ou mais dos outros marcadores de células-tronco identificadas em outras partes aqui.

[00324] Em uma modalidade, a capacidade do método de aumentar o sternness de uma população de células de suporte cocleares, em geral, ou uma população de células de suporte Lgr5⁺, em particular, pode estar correlacionada com um aumento da atividade de Lgr5 de uma população in vitro de células Lgr5⁺ isoladas, conforme determinado por um Ensaio de Atividade de Lgr5. Como observado anteriormente, em uma tal modalidade, o composto tem a capacidade de aumentar a atividade de Lgr5 de células-tronco na população de célula intermediária por um fator de 5, em média, em relação à atividade de Lgr5 das células na população de célula inicial. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o método tem a capacidade de aumentar a atividade de Lgr5 dos genes de células-tronco na população de célula

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97/196 intermediária por um fator de 10 em relação à atividade de Lgr5 das células na população de célula inicial. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade do método tem a capacidade de aumentar a atividade de Lgr5 das células-tronco na população de célula intermediária por um fator de 100 em relação à atividade de Lgr5 das células na população de célula inicial. A título de exemplo adicional, em uma tal modalidade, o método tem a capacidade de aumentar a atividade de Lgr5 das células-tronco na população de célula intermediária por um fator de 1000 em relação à atividade de Lgr5 das células na população de célula inicial. Em cada uma das modalidades anteriores, o aumento na atividade de células-tronco na população de célula pode ser determinado in vitro por imunocoloração ou expressão da proteína fluorescente endógena para genes alvo e análise de suas intensidades relativas por meio de análise por imageamento ou citometria de fluxo, ou usando qPCR para genes de células-tronco alvo. A identidade da população de células-tronco resultante pode opcionalmente ser também determinada por ensaios de células-tronco, incluindo ensaio de expressão de marcador de células-tronco, ensaio de formação de colônia, ensaio de autorrenovação e ensaio de diferenciação como definido no ensaio de células Tronco.

[00325] Em algumas modalidades, o método aplicado a um mamífero adulto produz uma população de células Lgr5⁺ de mamíferos adultas que estão na fase S.

[00326] Em uma modalidade, após a aplicação da composição fornecida à redonda e oval de um camundongo, a Atividade de Lgr5⁺ in vivo de uma população celular no Órgão de Corti aumenta 1,3x, 1,5x, até 20x sobre a linha de base para uma população que não foi exposta ao composto. Em algumas modalidades, a aplicação do composto à redonda ou oval de um camundongo aumenta a média. Atividade de Lgr5⁺ In vivo para células no Órgão de Corti é aumentada 1,3x, 1,5x,

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98/196 até 20x sobre a linha de base para uma população que não foi exposta ao composto.

[00327] Em certas modalidades, o método aumenta as células Lgr5⁺ até se tornarem pelo menos 10%, 7,5%, 10%, até 100% da população de célula de suporte em número.

[00328] Em certas modalidades, o composto tem a capacidade de aumentar a percentagem de células Lgr5⁺ em uma cóclea por 5%, 10%, 25%, 50%, ou 80%.

[00329] Em certas modalidades, a população de células-tronco é de um indivíduo in vivo, e o método é um tratamento para a perda auditiva e/ou disfunção vestibular (por exemplo, em que a geração de células ciliadas do ouvido interno da população expandida de células-tronco resulta na recuperação parcial ou total da perda auditiva e/ou função vestibular melhorada). Em certas modalidades, a população de células-tronco é de um indivíduo in vivo, e o método compreende ainda liberar um fármaco ao indivíduo (por exemplo, para o tratamento de uma doença e/ou distúrbio não relacionado à perda auditiva e/ou disfunção vestibular) em uma concentração mais alta do que uma dosagem máxima segura conhecida do fármaco para o indivíduo (por exemplo, a dosagem máxima segura conhecida se liberada na ausência da geração de células ciliadas do ouvido interno resultante do método) (por exemplo, devido a uma redução ou eliminação de uma ototoxicidade limitante de dose do fármaco).

[00330] Em certas modalidades, o método compreende ainda a realização oe rastreio de alto rendimento utilizando as células ciliadas do ouvido interno geradas. Em certas modalidades, o método compreende utilizar as células ciliadas do ouvido interno para rastrear moléculas quanto à toxicidade contra as células ciliadas do ouvido interno. Em certas modalidades, o método compreende a utilização de células ciliadas do ouvido interno geradas para rastrear moléculas quanto a caPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 118/245

99/196 pacidade de melhorar a sobrevivência de células ciliadas do ouvido interno (por exemplo, as células ciliadas do ouvido interno expostas às referidas moléculas).

[00331] Em outro aspecto, a descrição é direcionada a um método de produção de uma população expandida de células-tronco, o método compreendendo: administrar ou fazer com que seja administrado a uma população de células-tronco (por exemplo, amostra/indivíduo in vitro, ex vivo, ou in vivo) uma composição aqui fornecida.

[00332] Em certas modalidades, a etapa de administração é realizado através da realização de uma ou mais injeções no ouvido (por exemplo, transtimpanicamente no ouvido médio e/ou no ouvido interno).

[00333] Em certas modalidades, a etapa de administração compreende a administração do inibidor de GSK3-beta e/ou o agonista de Wnt de uma forma prolongada.

[00334] Em certas modalidades, as células-tronco são célulastronco do ouvido interno e/ou células de suporte.

[00335] Em certas modalidades, o método compreende ainda a realização de um rastreio de alto rendimento utilizando a população expandida gerada de células-tronco. Em certas modalidades, o método compreende ainda a utilização das células-tronco geradas para rastrear moléculas quanto à toxicidade contra células-tronco e/ou seu progênie. Em certas modalidades, o método compreende a utilização de células-tronco geradas para rastrear moléculas quanto à capacidade de melhorar a sobrevivência de células-tronco e/ou seu progênie.

[00336] Em outro aspecto, a descrição é direcionada a um método de tratamento de um indivíduo que tem, ou está em risco de desenvolver, perda auditiva e/ou disfunção vestibular, o método compreendendo: identificar um indivíduo que tenha experimentado, ou está em risco de desenvolver, perda auditiva e/ou disfunção vestibular, administrar

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100/196 ou fazer com que seja administrada uma composição aqui fornecida.

[00337] Em algumas modalidades, a população de células-tronco compreende células Lgr5⁺. Em algumas modalidades, a população de células-tronco compreende células pós-natais. Em algumas modalidades, a população de células-tronco compreende células-tronco epiteliais. Em certas modalidades, as células-tronco incluem células progenitoras.

[00338] Em certas modalidades, a etapa de administração é realizada através da realização de uma ou mais injeções no ouvido (por exemplo, transtimpanicamente no ouvido médio e/ou no ouvido interno).

[00339] Em outro aspecto, a descrição é direcionada a um método de geração de células ciliadas do ouvido interno, o método compreendendo: proliferar as células-tronco em uma população de célulastronco inicial (por exemplo, de uma amostra/indivíduo in vitro, ex vivo ou in vivo), resultando em uma população expandida de células-tronco (por exemplo, de tal forma que a população expandida seja um fator de pelo menos 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 5, 10, ou 20 maior do que a população de células-tronco inicial); e facilitar a geração de células ciliadas do ouvido interno da população expandida de células-tronco.

[00340] Em outro aspecto, a descrição é direcionada a um método de gerar células ciliadas do ouvido interno, o método compreendendo a administração de uma composição aqui fornecida (por exemplo, em uma forma farmaceuticamente aceitável (por exemplo, sal)) a uma população de células em um ouvido interno de um indivíduo, facilitando assim a geração de células ciliadas do ouvido interno.

[00341] Em outro aspecto, a descrição é direcionada a um método de gerar células ciliadas do ouvido interno, o método compreendendo:

proliferar células LGR5+ pós-natais de uma população inicial (por exemplo, de uma amostra/indivíduo in vitro, ex vivo ou in vivo), resulPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 120/245

101/196 tando em uma população expandida de células LGR5+ (por exemplo, de tal forma que a população expandida seja um fator de pelo menos 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 5, 10, ou 20 maior do que a população de célulastronco inicial), a referida população expandida de células LGR5+, resultando na geração de células ciliadas do ouvido interno. Em certas modalidades, as células-tronco incluem células progenitoras.

[00342] Em outro aspecto, a descrição refere-se a um método de tratamento de uma doença ou distúrbio, o método compreendendo: proliferar células epiteliais Lgr5⁺ pós-natais em uma população inicial de um indivíduo (/7? vivo), resultando em uma população expandida de células epiteliais Lgr5+ (por exemplo, de tal forma que a população expandida seja um fator de pelo menos 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 5, 10, 20 ou maior do que a população de células epiteliais Lgr5⁺ pós-natais inicial).

[00343] Em algumas modalidades, as células Lgr5⁺ são diferenciadas em células ciliadas.

Recrescimento da Célula Ciliada [00344] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de facilitar a geração de células ciliadas do ouvido interno, o método compreendendo: administrar um composto da presente descrição para expandir a população de células-tronco do tecido coclear.

[00345] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de facilitar a geração de células ciliadas do ouvido interno, o método compreendendo: administrar uma composição compreendendo um composto da presente descrição e o inibidor de HDAC para expandir a população de células-tronco do tecido coclear.

[00346] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método para regenerar audição em mamíferos.

[00347] Em certas modalidades, a população de células-tronco é de

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102/196 um indivíduo in vivo, e o método é um tratamento para a perda auditiva e/ou disfunção vestibular.

[00348] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de geração de células ciliadas do ouvido interno, utilizando de um composto da presente descrição para proliferar as células LGR5+ em uma população inicial in vivo, resultando em uma população expandida de células LGR5+ (por exemplo, de tal forma que a população expandida seja pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, ou 20 vezes maior do que a população de células-tronco inicial), resultando na geração das células ciliadas do ouvido interno.

[00349] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de geração de células ciliadas do ouvido interno, utilizando de uma composição compreendendo um composto da presente descrição e o inibidor de HDAC para proliferar as células LGR5+ em uma população inicial in vivo, resultando em uma população expandida de células LGR5+ (por exemplo, de tal forma que a população expandida seja pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, ou 20 vezes maior do que a população de células-tronco inicial), resultando na geração de células ciliadas do ouvido interno.

Regeneração Intestinal [00350] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de facilitar a geração de células intestinais, o método compreendendo: administrar um composto da presente descrição para expandir a população de células-tronco do epitélio intestinal.

[00351] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de facilitar a geração de células intestinais, o método compreendendo: administrar uma composição compreendendo um composto da presente descrição e o inibidor de HDAC para expandir a população de células-tronco dos epitélios intestinais.

[00352] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada

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103/196 a um método de regeneração do epitélio intestinal em mamíferos.

[00353] Em certas modalidades, a população de células-tronco é de um indivíduo in vivo. Em certas modalidades, o método é um tratamento para promover o reparo da mucosa danificada relacionada com doenças tais como a mucosite gastrointestinal induzida por quimioterapia, Doença do Enxerto Versus Hospedeiro, úlcera gástrica, de Crohn ou colite ulcerativa.

Proliferação de Lgr5+ Intestinal [00354] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de facilitar a geração de células intestinais, o método compreendendo: administrar um composto da presente descrição para expandir a população de células Lgr5+ dos epitélios intestinais.

[00355] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de facilitar a geração de células intestinais, o método compreendendo: administrar uma composição compreendendo um composto da presente descrição e o inibidor de HDAC para expandir a população de células Lgr5+ dos epitélios intestinais.

[00356] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de regenerar as células intestinais da população de células Lgr5+ em mamíferos.

[00357] Em certas modalidades, a população de células Lgr5+ é um indivíduo in vivo. Em certas modalidades, o método é um tratamento para promover o reparo da mucosa danificada relacionada com doenças tais como a mucosite gastrointestinal induzida por quimioterapia, Doença do Enxerto Versus Hospedeiro, úlcera gástrica, de Crohn ou colite ulcerativa.

[00358] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de tratamento de uma doença ou distúrbio, o método compreendendo proliferar células epiteliais Lgr5+ in vivo, resultando em uma população expandida de células epiteliais Lgr5+ (por exemplo,

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104/196 de tai forma que a população expandida seja a pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, ou 20 vezes maior que a população de células epiteliais Lgr5+ pós-natais).

Expansão de uma população de células vestibulares [00359] Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas podem expandir uma população de células vestibulares em um tecido vestibular compreendendo o contato do tecido vestibular. Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas são capazes, em um ensaio de proliferação de células-tronco, de aumentar o número de células de suporte em uma população de células do ensaio de proliferação de células-tronco por um fator de pelo menos 10 ou pelo menos 50. Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas são capazes de um ensaio de diferenciação de células-tronco de formar células ciliadas de uma população celular compreendendo células de suporte vestibulares.

[00360] Em certas modalidades, o tecido vestibular mantém a Morfologia Nativa. Em certas modalidades, o tecido vestibular está em um indivíduo. Em certas modalidades, o contato do tecido vestibular com a composição é conseguido administrando a composição transtimpanicamente ao indivíduo. Em certas modalidades, o contato do tecido vestibular com a composição resulta em um funcionamento vestibular melhorado do indivíduo.

[00361] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de tratamento de um indivíduo que tem, ou está em risco de desenvolver, uma doença associada com a ausência ou falta de certas células do tecido, o método compreendendo administrar ou fazer com que seja administrado ao referido indivíduo um composto da presente descrição.

[00362] Em certas modalidades, o composto é disperso em uma matriz biocompatível. Em certas modalidades, a matriz biocompatível é

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105/196 um gel ou espuma biocompatível. Em certas modalidades, o composto é administrado transtimpanicamente a um tecido vestibular do indivíduo.

[00363] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método para expandir uma população de células vestibulares em um tecido vestibular compreendendo o contato do tecido vestibular com (i) um composto da presente descrição, e (ii) um Inibidor de TGF-β para formar uma população expandida de células no tecido vestibular. Geração de Células da Papila Dérmica [00364] Em certas modalidades, a presente descrição é direcionada a um método de facilitar a geração de Células da Papila Dérmicas, o método compreendendo: administrar um composto da presente descrição, sozinho ou em combinação com um inibidor da BMP, para expandir a população das Células da Papila Dérmicas. Em certas modalidades, os compostos podem regenerar o pêlo em um mamífero. Em certas modalidades, a população de Células da Papila Dérmicas é de um indivíduo In vivo. Em certas modalidades, a população de Células da Papila Dérmicas é de um indivíduo in vivo para o tratamento de alopecia. Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de gerar Células da Papila Dérmicas utilizando um composto da presente descrição, sozinho ou em combinação com inibidor de BMP para proliferar as Células da Papila Dérmicas em uma população inicial in vivo, resultando em uma população expandida de Células da Papila Dérmicas.

Administração [00365] A membrana do redondo ou oval é a barreira biológica ao espaço do ouvido interno e representa o maior obstáculo ao tratamento local da deficiência auditiva. O fármaco administrado deve superar essa membrana para alcançar o espaço do ouvido interno. O fármaco pode funcionalmente (por exemplo, injeção através da membrana timPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 125/245

106/196 pânica) ser colocado localmente à membrana redonda ou oval e, em seguida, pode penetrar através da membrana redonda ou oval. Substâncias que penetram a redonda ou oval tipicamente distribuem na perilinfa e, assim, atingem as células ciliadas e células de suporte.

[00366] Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas estão adaptadas para administrar o fármaco localmente à membrana redonda ou oval. As formulações farmacêuticas também podem conter um realçador de penetração de membrana, o que suporta a passagem dos agentes aqui mencionados através da membrana redonda ou oval. Por conseguinte, formulações líquidas, em gel ou espuma podem ser utilizadas. Também é possível aplicar o ingrediente ativo oralmente ou empregar uma combinação de abordagens de liberação.

[00367] A liberação intratimpânica (IT) de fármacos ao ouvido é cada vez mais usada tanto para fins clínicos e de pesquisa. Alguns grupos têm aplicado fármaco de uma forma sustentada usando microcateteres e micropavios, enquanto a maioria tem aplicado como únicas ou como repetidas injeções IT (até 8 injeções durante períodos de até 2 semanas).

[00368] Fármacos intratimpanicamente aplicados são pensados para entrar nos fluidos do ouvido interno principalmente através do cruzamento da redonda ou oval (RW). Os cálculos mostram que um fator importante no controle da quantidade de fármaco que entra no ouvido e a distribuição de fármaco ao longo do comprimento do ouvido, é a duração que o fármaco permanece no espaço do ouvido médio. Aplicações, 'one-shof, individuais ou aplicações de soluções aquosas para duração de algumas horas resulta em gradientes de fármacos macerados para a substância aplicada ao longo do comprimento da cóclea e concentração de rápido declínio na volta basal da cóclea visto que o fármaco subsequentemente torna-se distribuído em todo o ouvido.

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107/196 [00369] Outras abordagens de injeção incluem por bomba osmótica, ou, por combinação com biomaterial implantável, e mais preferivelmente, por injeção ou infusão. Biomateriais que podem auxiliar no controle de cinéticas de liberação e distribuição de fármaco incluem materiais de hidrogel, materiais degradáveis. Uma classe de materiais que é mais preferivelmente usada inclui materiais gelificantes in situ. Outros materiais incluem o colágeno, ou outros materiais naturais, incluindo fibrina, gelatina, e os tecidos descelularizados. A espuma de gel também pode ser adequada.

[00370] A liberação pode também ser realçada através de meios alternativos, incluindo, porém, não limitados a agentes adicionados à composição liberada tais como realçadores de penetração, ou pode ser através de dispositivos através de ultra-som, eletroporação, ou jato de alta velocidade.

[00371] Os métodos aqui descritos podem também ser utilizados para os tipos de células do ouvido interno que podem ser produzidas utilizando uma variedade de métodos conhecidos por aqueles versados ma técnica, incluindo aqueles tipos de células descritos no Pedido PCT No. WO2012103012 A1.

[00372] No que diz respeito ao tratamento humano e veterinário, a quantidade de um agente(s) particular(es) que é(são) administrado(s) pode ser dependente de uma variedade de fatores, incluindo o distúrbio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; atividade do(s) agente(s) específico(s) empregado(s); a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, rotina de administração, e taxa de excreção do(s) agente(s) específico(s) empregado(s); a duração do tratamento; fármacos utilizados em combinação ou coincidentes com o(s) agente(s) específico(s) empregado(s); o julgamento do médico prescritor ou veterinário; e fatores similares conhecidos nas técnicas médicas e veterinárias.

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108/196 [00373] Os agentes aqui descritos podem ser administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um indivíduo em necessidade de tratamento. A administração de compostos aqui descritos pode ser por meio de qualquer rotina de administração adequada, em particular intratimpanicamente. Outras rotinas incluem ingestão, ou, alternativamente parentericamente, por exemplo por via intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraniana, intramuscular, intranasal, subcutânea, sublingual, transdérmica, ou por inalação ou insuflação, ou tópica por instilação do ouvido para absorção através da pele do canal auditivo e membranas do tímpano. Tal administração pode ser em dose oral única ou múltipla, número definido de gotas para os ouvidos, ou uma injeção de bolo, injeções múltiplas, ou como uma infusão de curta ou de longa duração. Os dispositivos implantáveis (por exemplo, bombas de infusão implantáveis) também podem ser empregados para a liberação parentérica periódica ao longo do tempo de dosagens equivalentes ou variáveis da formulação particular. Para uma tal administração parentérica, os compostos são preferivelmente formulados na forma de uma solução estéril em água ou outro solvente adequado ou mistura de solventes. A solução pode conter outras substâncias, tais como sais, açúcares (especialmente glicose ou manitol), para preparar a solução isotônica com o sangue, agentes de tamponamento tais como ácidos acético, cítrico e/ou fosfórico e seus sais de sódio, e conservantes.

[00374] Os compostos aqui descritos podem ser administrados por um número de métodos suficientes para liberar o composto no ouvido interno. A liberação de um composto ao ouvido interno inclui a administração do composto ao ouvido médio, de tal modo que o composto possa difundir-se através da redonda ou oval ao ouvido interno e a administração de um composto ao ouvido interno por injeção direta através da membrana redonda ou oval. Tais métodos incluem, porém,

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109/196 não estão limitados à administração auricular, por pavios transtimpânicos ou cateteres, ou a administração parentérica, por exemplo, por injeção intra-auricular, transtimpânica, ou intracoclear.

[00375] Em modalidades particulares, os compostos, composições e formulações da descrição são administrados localmente, significando que não são administrados sistemicamente.

[00376] Em uma modalidade, um aparelho de seringa e agulha é utilizado para administrar os compostos ou composições a um indivíduo utilizando a administração auricular. Uma agulha de tamanho adequado é utilizada para perfurar a membrana timpânica e um pavio ou cateter que compreende a composição é inserido através da membrana timpânica perfurada e no ouvido médio do indivíduo. O dispositivo pode ser inserido de modo que fique em contato com o redondo ou oval ou imediatamente adjacente ao redondo ou oval. Dispositivos exemplares usados para administração auricular incluem, porém, não estão limitados a, pavios transtimpânicos, cateteres transtimpânicos, microcateteres redondos ou ovais (pequenos cateteres que liberam medicamento ao redondo ou oval), e Silverstein Microwicks ™ (tubo pequeno com um pavio através do tubo ao redondo ou oval, permitindo a regulamentação por indivíduo ou profissional médico).

[00377] Em outra modalidade, um aparelho de seringa e agulha é utilizado para administrar os compostos ou composições a um indivíduo utilizando injeção transtimpânica, injeção por detrás da membrana timpânica no ouvido médio e/ou interno. A formulação pode ser administrada diretamente sobre a membrana redonda ou oval através da injeção transtimpânica ou pode ser administrada diretamente à cóclea por meio de injeção intracoclear ou diretamente aos órgãos vestibulares por meio de injeção intravestibular.

[00378] Em algumas modalidades, o dispositivo de liberação é um aparelho projetado para administração dos compostos ou composiPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 129/245

110/196 ções ao ouvido médio e/ou interno. Apenas a título de exemplo: GYRUS Medical GmbH oferece micro-otoscópios para visualização e liberação de fármaco ao nicho redondo ou oval; Arenberg descreveu um dispositivo de tratamento médico para liberar fluidos às estruturas do ouvido internas na Pat U.S. Nos. 5.421.818; 5.474.529; e 5.476.446, cada um dos quais é aqui incorporado por referência para tal descrição. Pedido de patente U.S. No. Serial 08/874208, que está aqui incorporado por referência para tal descrição, descreve um método cirúrgico para implantar um canal de transferência de fluidos para liberar composições ao ouvido interno. Publicação do Pedido de Patente U.S. 2007/0167918, que está aqui incorporado por referência para tal descrição, descreve ainda um distribuidor de aspirador e de medicamento ótico combinado para amostragem de fluido trans-timpânico e aplicação de medicamento.

[00379] Em algumas modalidades, a composição aqui fornecida é administrada a um indivíduo que dela necessite uma vez. Em algumas modalidades, a composição aqui fornecida é administrada a um indivíduo em necessidade desta mais do que uma vez. Em algumas modalidades, a primeira administração da composição aqui fornecida é seguida por uma segunda, terceira, quarta ou quinta administração da composição aqui fornecida.

[00380] O número de vezes que um composto é administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo depende do critério de um profissional de saúde, do distúrbio, da gravidade do distúrbio, e da resposta do indivíduo à formulação. Em algumas modalidades, o composto aqui descrito é administrado uma vez a um indivíduo em necessidade deste com uma condição aguda leve. Em algumas modalidades, o composto aqui descrito é administrado mais de uma vez a um indivíduo em necessidade do mesmo com uma condição aguda moderada ou grave. No caso em que a condição do indivíduo não melhora, a criPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 130/245

111/196 tério do médico, o composto pode ser administrado cronicamente, isto é, por um período de tempo prolongado, incluindo ao longo da duração de vida do indivíduo, a fim de melhorar ou de outro modo controlar ou limitar os sintomas da doença ou condição do indivíduo.

[00381] No caso em que o estado do indivíduo melhore, a critério do médico, o composto pode ser administrado continuamente; alternativamente, a dose do fármaco a ser administrado pode ser temporariamente reduzida ou temporariamente suspensa durante um certo período de tempo (isto é, umas férias do fármaco). A duração das férias do fármaco varia entre 2 dias e 1 ano, incluindo, a título de exemplo apenas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 12 dias, 15 dias, 20 dias , 28 dias, 35 dias, 50 dias, 70 dias, 100 dias, 120 dias, 150 dias, 180 dias, 200 dias, 250 dias, 280 dias, 300 dias, 320 dias, 350 dias e 365 dias. A redução da dose durante as férias do fármaco pode ser de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100%.

[00382] Uma vez que a audição e/ou o equilíbrio do indivíduo meIhorara(m), uma dose de manutenção pode ser administrada, se necessário. Subsequentemente, a dosagem ou a frequência de administração, ou ambas, é opcionalmente reduzida, como uma função dos sintomas, a um nível em que a doença, distúrbio ou condição melhorado é mantido. Em certas modalidades, os indivíduos requerem tratamento intermitente a longo prazo sob qualquer recorrência dos sintomas.

[00383] Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas podem também conter um agente adicional selecionado a partir de um ativador de Notch, inibidor de HDAC, um antagonista de BMP4, Noggin (Inibe BMP4), Sox2, Vitamina D (calquitriol), Vitamina B (nicotinomida), Vitamina A Vitamina C (pVc). Lgr4, inibição de p38/MAPK, inibição de ROCK e/ou inibição de Alk4/7. Em certas modalidades, as forPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 131/245

112/196 mulações farmacêuticas podem também conter o fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), ou uma combinação dos mesmos.

Composições com HDAC [00384] Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas podem também conter HDAC. Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas contendo HDAC pode realçar a formação de células Lgr5+, diferenciação de controle, sternness de controle e replicação ou restauração da audição e regeneração intestinal.

[00385] Em certas modalidades, o inibidor de HDAC é ácido Valproico ou um profármaco, éster, forma de sal ou amida dos mesmos.

[00386] Em certas modalidades, o inibidor de HDAC é um composto contendo ácido carboxílico. Em certas modalidades, o composto contendo ácido carboxílico é ácido carboxílico de C6-C20, em que 0 ácido carboxílico compreende alquila, alquenila, ou alquinila.

[00387] Em certas modalidades, 0 composto contendo ácido carboxílico é um alquil-COzH de cadeia linear, ramificada, ou cíclica de C5C20 substituído ou não substituído, alquenil-COzH de cadeia linear, ramificada, ou cíclica de C5-C20 substituído ou não substituído e alquinilCO2H de cadeia linear, ramificada, ou cíclica de C5-C20 substituído ou não substituído. Em certas modalidades, 0 composto contendo ácido carboxílico é um alquil-COzH de cadeia linear ou ramificada de C5-C20 substituído.

[00388] Em certas modalidades, 0 composto contendo ácido carboxílico é um alquil-COzH de cadeia linear ou ramificada de C5-C20 substituído, em que 0 substituinte é -NH2. Em certas modalidades, 0 composto contendo ácido carboxílico é um ácido 2-propilpentanoico substituído por amino. Em certas modalidades, 0 ácido 2-propilpentanoico substituído por amino é selecionado a partir do grupo consistindo em

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113/196 ácido 5-amino-2-propilpentanoico, ácido 4-amino-2-propilpentanoico, ácido 3-amino-2-propilpentanoico, e ácido 2-amino-2-propilpentanoico. [00389] Em certas modalidades, o composto contendo ácido carboxílico é um alquil-COzH de cadeia linear ou ramificada de C5-C20 não substituído. Em certas modalidades, 0 composto contendo ácido carboxílico é um alquil-COzH de cadeia ramificada linear de C6-C9 não substituído. Em certas modalidades, 0 composto contendo ácido carboxílico é um alquil-COzH de cadeia ramificada linear de Cs-Cg não substituído. Em certas modalidades, 0 composto contendo ácido carboxílico é um alquil-COgH de cadeia linear ramificada de Cs não substituído.

[00390] Em certas modalidades, 0 composto contendo ácido carboxílico é ácido Valproico.

[00391] Em certas modalidades, 0 ácido carboxílico contendo 0 composto está na forma de um profármaco de um alquil-COgH de cadeia linear ramificada de Cs não substituído, em que 0 profármaco se encontra na forma de uma amida ou éster. Em certas modalidades, a amida de alquil-COgH de cadeia linear ramificada de Cs não substituído é 0 produto de condensação com um aminoácido. Em certas modalidades, a amida do ácido Valproico é selecionada a partir do grupo que consiste em

(2-propilpentanoil)-L-prolina ácido (P-propilpentanoiO-L-glutâmico ácido (P-propilpentanoiO-L-aspártico [00392] Em algumas modalidades, 0 inibidor de HDAC é qualquer um dos inibidores listados na Tabela 1.

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Tabela 1 - Inibidores de HDAC

Coluna A	Coluna B	Número de CAS
Classe	Agente
Ácido Alifático	Ácido Valproico	99-66-1
Ácido Alifático	Fenil butirato	1821-12-1
Ácido Alifático	Butirato	107-92-6
Ácido Alifático	ácido 2-(prop-2-in-1 -il)octanoico	96017-59-3
Ácido Alifático	ácido (S)-2-(prop-2-in-1 -il)octanoico	185463-37-0
Ácido Alifático	ácido (R)-2-(prop-2-in-1 -il)octanoico	185463-38-1
Ácido Alifático	ácido 2-(prop-2-in-1 -il)heptanoico	176638-49-6
Ácido Alifático	ácido (S)-2-(prop-2-in-1-il) heptanoico	185463-37-0
Ácido Alifático	ácido (R)-2-(prop-2-in-1-il) heptanoico	185463-38-1
Ácido Alifático	Ácido 2-fluoro-2-propil Pentanoico	197779-85-4
Ácido Alifático Ester	AN-9	122110-53-6
Amino	932718-22-4	932718-22-4

Benzamida	Entinostate (EM-275)	209783-80-2
Benzamida	Mocetinostate (MGCD0103)	726169-73-9
Benzamida	Tacedinalina	112522-64-2
Benzamida	BML-210	537034-17-6
Benzamida	NKL 22	537034-15-4
Benzamida	RGFP109	1215493-56-3
Benzamida	RGFP136	1215493-97-2
Benzamida	RGFP966	1357389-11-7
Benzamida	4SC-202	1186222-89-8
Benzamida	Inibidor IV de HDAC	537034-15-4
Benzamida	Chidamida	743438-44-0
Benzamida	TC-H 106, Inibidor VII de HDAC	937039-45-7

Peptídeo cíclico	Romidepsina	128517-07-7
Peptídeo cíclico	Trapoxina A	133155-89-2
Peptídeo cíclico	Toxina HC	83209-65-8
Peptídeo cíclico	Apicidina	183506-66-3
Peptídeo Cíclico	Tailandepsina A	1269219-30-8
Peptídeo cíclico	Di-hidroclamidocina	52574-64-8

Epóxido	(-)-Depudecina	139508-73-9
Epóxido	Partenolide	20554-84-1

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Coluna A	Coluna B	Número de CAS
Classe	Agente

Hidroxamato	Tricostatina A (TSA)
Hidroxamato	Tricostatina A (TSA)	58880-19-6
Hidroxamato	SAHA (Zolinza, vorinostate)	149647-78-9
Hidroxamato	4-iodo-SAHA	1219807-87-0
Hidroxamato	SBHA	38937-66-5
Hidroxamato	CBHA	174664-65-4
Hidroxamato	LAQ-824	591207-53-3
Hidroxamato	PDX-101 (belinostate)	866323-14-0
Hidroxamato	LBH-589 (panobinostate)	404950-80-7
Hidroxamato	ITF2357 (Givinostate)	497833-27-9
Hidroxamato	PCI-34051	950762-95-5
Hidroxamato	PCI-24781 (Abexinostate)	783355-60-2
Hidroxamato	Tubastatina A	1252003-15-8
Hidroxamato	CUDC-101	1012054-59-9
Hidroxamato	Oxanflatina	151720-43-3
Hidroxamato	ITF2357	497833-27-9
Hidroxamato	Bufexamaco	2438-72-4
Hidroxamato	Composto 8 de APHA	676599-90-9
Hidroxamato	Inibidor XXIV de HDAC	854779-95-6
Hidroxamato	Tubacina	537049-40-4
Hidroxamato	Ácido butiril-hidroxâmico	4312-91-8
Hidroxamato	MC 1568	852475-26-4
Hidroxamato	SB939 (Pracinostate)	929016-96-6
Hidroxamato	4SC-201 (Resminostate)	864814-88-0
Hidroxamato	Tefinostate (CHR-2845)	914382-60-8
Hidroxamato	CHR-3996	1256448-47-1
Hidroxamato	NSC 57457	6953-61-3
Hidroxamato	CG200745	936221-33-9
Hidroxamato	ACY1215	1316214-52-4
Hidroxamato	Nexturastate A	1403783-31-2
Hidroxamato	Droxinostate	99873-43-5
Hidroxamato	Scriptaid	287383-59-9
Hidroxamato	BRD9757	1423058-85-8
Hidroxamato	HPOB	1429651-50-2
Hidroxamato	CAY10603	1045792-66-2

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 135/245

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Coluna A	Coluna B	Número de CAS
Classe	Agente
Hidroxamato	Inibidor III de HDAC6	1450618-49-1
Hidroxamato	M344	251456-60-7
Hidroxamato	4-(dimetilamino)-N-[6-(hidroxiamino)-6oxo-hexil]-benzamida	193551-00-7
Hidroxamato	(S)-HDAC-42	935881-37-1
Hidroxamato	HNHA	926908-04-5
Hidroxamato	Piroxamida	382180-17-8
Hidroxamato	Inhibitor VI de HDAC	926908-04-5
Hidroxamato	Inibidor II de HDAC	174664-65-4
Hidroxamato	LMK235	1418033-25-6
Hidroxamato	HDAC-IN-1	1239610-44-6
Hidroxamato	VAHA	106132-78-9

Cetona - CF3	Composto 6e	946500-31-8
Cetona - CF3	Composto 6H	946500-39-6
Cetona - CF3	Composto 27	946499-86-1
Cetona	Composto 43	891259-76-0
Cetona - acetoamidas	436150-82-2	436150-82-2

Policetídeo	Ratjadone A	163564-92-9

Álcool silílico	1587636-32-5	1587636-32-5

Sulfonil Ureia	960130-17-0	960130-17-0

Sulfonamida	1587636-33-6	1587636-33-6
Sulfonamida	329967-25-1	329967-25-1

Tiol	1428536-05-3	1428536-05-3
Tiol	908860-21-9	908860-21-9
Tiol	828920-13-4	828920-13-4
Tiol	1368806-68-1	1368806-68-1
Tiol	827036-76-0	827036-76-0

Tioéster	TCS HDAC6 20b	956154-63-5
Tioéster	PTACH	848354-66-5

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 136/245

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Coluna A	Coluna B	Número de CAS
Classe	Agente
Tioéster	KD 5170	940943-37-3
Tioéster	Inibidor XXII de HDAC	848354-66-5

Thioketone	Inibitor VII de SIRT1/2	143034-06-4
Tropones	46189-88-2	46189-88-2
Tropones	1411673-95-4	1411673-95-4

Não clássico	TMP269	1314890-29-3
Não clássico	Tasquinimode	254964-60-8

[00393] As classes de inibidores de HDAC para uso em várias modalidades das composições e métodos aqui descritos incluem, porém, não estão limitados aos listados na Coluna A da Tabela 1. Os inibidores de HDAC específicos para a utilização em várias modalidades das composições e métodos aqui descritos incluem, porém, não estão limitados aos listados na Coluna B da Tabela 1. Todos os agentes listados na Tabela 1, coluna B, entendem-se incluir derivados ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Todas as classes listadas na Tabela 1 coluna A entendem-se incluir ambos agentes compreendendo esta classe e derivados ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[00394] Em certas modalidades, a quantidade do composto contendo ácido carboxílico está entre cerca de 2% em peso (peso do composto contendo ácido carboxílico/peso da composição farmacêutica) e 20% em peso. Em certas modalidades, a composição compreende pelo menos 4% em peso do ácido carboxílico. Em certas modalidades, a composição compreende pelo menos 8% em peso do ácido carboxílico. Em certas modalidades, a composição compreende pelo menos 12% em peso do ácido carboxílico. Em certas modalidades, a composição compreende pelo menos 16% em peso do ácido carboxílico. Em certas modalidades, a composição compreende pelo menos 20% em peso do ácido carboxílico.

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Composições com inibidor de BMP [00395] Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas podem também conter um inibidor de BMP. Exemplos de inibidores de BMP são mostrados aqui. Outros exemplos são descritos em WO2014138088A1 e W02016054406A1, que estão aqui incorporados por referência em suas totalidades.

Inibidor II de BMP	1206711-16-1
dorsomorfina	866405-64-3
ML347	1062368-49-3
LDN-193189	1062368-24-4

Composições com inibidor de TGF-beta [00396] Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas podem também conter um inibidor de TGF-beta. Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas contendo inibidor de FTC-beta podem expandir uma população de células vestibulares em um tecido vestibular compreendendo o contato do tecido vestibular. Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas contendo inibidor de TGF-beta são capazes em um ensaio de proliferação de células-tronco de aumentar o número de células de suporte em uma população de células do ensaio de proliferação de células-tronco por um fator de pelo menos 10 ou pelo menos 50. Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas contendo o inibidor de TGF-beta são capazes em um ensaio de diferenciação de células-tronco de formar células ciliadas de uma população celular compreendendo células de suporte vestibulares.

[00397] Em uma modalidade, o inibidor de TGF-beta é selecionado a partir de 616452 (Repsox), Galunisertibe (LY2157299), EW-719, EM1130, EW-7203, EW-7195, SM16, R 268712, GW788388, e PF 03671148.

[00398] Inibidores de TGF-β exemplares aparecem na Tabela 2.

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Inibidores do receptor tipo I de TGF-beta incluem, porém, não estão limitados a 2-(3-(6-Metilpiridin-2-il)-1 H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, [3(pi ridi n-2-i l)-4-(4-qui noi I)]-1 H-pirazol, e 3-(6-Meti Ipi ridi n-2-il)-4-(4quinolil)-1-feniltiocarbamoil-1 H-pirazol, que podem ser adquiridos de Calbiochem (San Diego, Calif.). Outros inibidores de moléculas pequenas incluem, porém, não estão limitados a, SB-431542 (veja, por exemplo, Halder et al, 2005; Neoplasia 7(5):509-521), SM16 (veja, por exemplo, Fu, K et al., 2008; Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 28 (4): 665), e SB-505124 (ver, por exemplo, Dacosta Byfield, S., etal, 2004; Molecular Pharmacology 65:. 744-52), entre outros.

Tabela 2. Inibidores de TGF-β

Classe	Agente	Número de CAS	Nome Alternativo
inibidor de Tgfbeta-R1	LY-364947	396129-53-6	616451, Inibidor Ide TGF-β RI Cinase, [3-(Piridin-2-il)-4(4-quinonil)]-1 H-pirazol, Inibidor I de ALK5, LY-364947, HTS-466284
inibidor de Tgfbeta-R1	Repsox	446859-33-2	616452, Inibidor II de TGF-β RI Cinase, 2-(3-(6-Metilpiridin2-il)-1 H-pirazol-4-il)-1,5naftiridina
inibidor de Tgfbeta-R1	SB-505124	356559-13-2	616453, Inibidor III de TGF-β RI Cinase, CAS 356559-13-2 2-(5-Benzo[1,3]dioxol-4-il-2terc-butil-1 H-imidazol-4-il)-6metilpiridina, HCI, Inibidor III de ALK5,
inibidor de Tgfbeta-R1	A-83-01	909910-43-6	616454, Inibidor IV de TGF-β RI Cinase - 3-(6-Metilpiridin-2il)-4-(4-quinolil)-1 feniltiocarbamoil-1 H-pirazol, A-83-01, Inibidor IV de ALK5
inibidor de Tgfbeta-R1	SD-208	627536-09-8	616456, Inibidor V de TGF-β RI Cinase, 2-(5-Cloro-2fluorofenil)pteridin-4-il)piridin4-il amina, SD-208, Inibidor V de ALK5

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Classe	Agente	Número de CAS	Nome Alternativo
inibidor de Tgfbeta-R1	SB-431542	301836-41-9	616461, Inibidor VI de TGF-β RI Cinase, 4-[4-(3,4- Metilenodioxifenil)-5-(2-piridil)1 H-imidazol-2-il]benzamida, Di-hidrato, 4-(4-(1,3Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridil)1 H-imidazol-2-il]benzamida, Di-hidrato
inibidor de Tgfbeta-R1	TGF-β RI Cinase Inibidor VII	666729-57-3	616458, TGF-β RI Cinase Inibidor VII, 1-(2-((6,7Dimetóxi-4-quinolil)óxi)-(4,5dimetilfenil)-1-etanona, Inibidor VII de ALK5
inibidor de Tgfbeta-R1	SB-525334	356559-20-1	616459, Inibidor VIII de TGFβ RI Cinase - SB-525334, 6(2-terc-Butil-5-(6-metil-piridin2-il)-1 H-imidazol-4-il)quinoxalina, ALK5 Inibidor VIII
inibidor de Tgfbeta-R1	Inibidor I de TGFβ RI CinaseX	1117684-36-2	616463, Inibidor IX de TGF-β RI Cinase, 4-((4-((2,6- Dimetilpiridin-3-il)óxi)piridin-2il)amino)benzenossulfonamid a, Inibidor IX de ALK5
inibidor de Tgfbeta-R1	GW788388	452342-67-5	4-(4-(3-(piridin-2-il)-1 Hpirazol-4-il)piridin-2-il)-N(tetra-hidro-2 H-piran-4il)benzamida
inibidor de Tgfbeta-R1	LY2109761	700874-71-1	7-(2-morfolinoetóxi)-4-(2(piridin-2-il)-5,6-di-hidro-4 Hpirrolo[1,2-b]pirazol-3il)quinolina
inibidor de Tgfbeta-R1	Galunisertibe (LY2157299)	700874-72-2	4-(2-(6-metilpiridin-2-il)-5,6-dihidro-4 H-pirrolo[1,2-b]pirazol3-il)quinolina-6-carboxamida
inibidor de Tgfbeta-R1	EW-7197	1352608-82-2	N-(2-fluorofenil)-5-(6-metil-2piridinil)-4-[1,2,4]triazolo[1,5a]piridin-6-il-1 H-imidazol-2metanamina
inibidor de produção de Tgfb	Pirfenidona	53179-13-8	5-metil-1 -fenil-2(1 H)Piridinona,
inibidor de Tgfbeta-R1	K02288	1431985-92-0	3-[(6-Amino-5-(3,4,5trimetoxifenil)-3-piridinil]fenol

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Classe	Agente	Número de CAS	Nome Alternativo
inibidor de Tgfbeta-R1	D 4476	301836-43-1	4-[4-(2,3-Di-hidro-1,4benzodioxin-6-il)-5-(2piridinil)-1 H-imidazol-2il]benzamida
inibidor de Tgfbeta-R1	R 268712	879487-87-3	4-[2-Fluoro-5-[3-(6-metil-2piridinil)-1 H-pirazol-4-il]fenil]1 H-pirazol-1-etanol
Outros	ITD 1	1099644-42-4	Etil éster de ácido 4-[1,1 bifenil]-4-il-1,4,5,6,7,8-hexahidro-2,7,7-trimetil-5-oxo-3quinolinacarboxílico
Inibidor de Smad3	SIS3	1009104-85-1	Cloridrato de 1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dimetóxi-2-[(2E)-3(1 -fenil-1 H-pirrolo[2,3b]piridin-3-il)-1-oxo-2propenil]-isoquinolina
inibidor de Tgfbeta-R1	A77-01	909910-42-5	4-[5-(6-metilpiridin-2-il)-1 Hpirazol-4-il]quinolina
inibidor de Tgfbeta-R1	SM16	614749-78-9	4-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)4-(6-metilpiridin-2-il)-1 Himidazol-2il)biciclo[2.2.2]octano-1 carboxamida
inibidor de Tgfbeta-R1	LY-550410	737791-20-7	5,6-di-hidro-2-(2-piridinil)-4 Hpirrolo[1,2-b]pirazol-3-il]- Quinolina
inibidor de Tgfbeta-R1	LY-580276	476475-07-7	3-(4-fluorofenil)-5,6-di-hidro-2- (6-metil-2-piridinil)-4H- Pirrolo[1,2-b]pirazol
inibidor de Tgfbeta-R1	EW-7203	1383123-98-5	3-[[[4-(6-metil-2-piridinil)-5- [1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-6il-2-tiazolil]amino]metil]Benzonitrila,
inibidor de Tgfbeta-R1	EW-7195	1352609-28-9	3-[[[5-(6-metil-2-piridinil)-4- [1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-6il-1 H-imidazol-2il]metil]amino]-Benzonitrila
inibidor de Tgfbeta-R1	GW6604	452342-37-9	Piridina, 2-fenil-4-[3-(2- piridinil)-1 H-pirazol-4-il]-
inibidor de Tgfbeta-R1	Cmp 3d	733806-89-8	4-Quinazolinamina, 2-(6-metil- 2-piridinil)-N-4-piridinil-

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 141/245

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Classe	Agente	Número de CAS	Nome Alternativo
inibidor de Tgfbeta-R1	LY-566578	607738-00-1	Piridina, 2-[4-(4-fluorofenil)- 1 H-pirazol-3-il]-6-metil-
inibidor de Tgfbeta-R1	Cmp 5	607738-02-3	Fenol, 4-[3-(6-metil-2-piridinil)- 1 H-pirazol-4-il]
inibidor de Tgfbeta-R1	Cmp 3	676331-30-9	Quinolina, 7-etóxi-4-[3-(2piridinil)-1 H-pirazol-4-il]-
inibidor de Tgfbeta-R1	Cmp 8b	705263-50-9	1 H-Benzimidazol, 6-[5,6-dihidro-2-(2-piridinil)-4Hpirrolo[1,2-b]pirazol-3-il]-
inibidor de Tgfbeta-R1	Cmp 4b	1308760-90-8	N-(3-cianofenil)-3-(6-metil-2piridinil)-4-(6-qu inolin il)-1HPirazol-1-acetamida
inibidor de Tgfbeta-R1	Cmp 21b	1607465-38-2?	1 H-Pirazol-1-acetamida, N-(3cianofenil)-3-(6-metil-2piridinil)-4-[1,2,4]triazolo[1,5a]piridin-6-ila
inibidor de Tgfbeta-R1	PF-03671148	1378524-25-4	3-metil-6-[1 -(6-metil-2piridinil)-1H-pirazol-5-il]-4(3H)Quinazolinona,
inibidor de Tgfbeta-R1	SB-203580	152121-47-6	Piridina, 4-[4-(4-fluorofenil)-2[4-(metilsu If in il)fen il]-1Himidazol-5-il]-
inibidor de Tgfbeta-R1	SB-202190	152121-30-7	4-[4-(4-Fluorofenil)-5-(4- piridinil)-1 H-imidazol-2-il]fenol
inibidor de Tgfbeta-R1	IN-1130	868612-83-3	3-[[5-(6-metil-2-piridinil)-4-(6quinoxalin il)-1 H-imidazol-2il]metil]-Benzamida,
inibidor de Tgfbeta-R1	IN-1233	1093952-95-4	3-[[5-(6-metil-2-piridinil)-4-(6quinolin il)-1 H-imidazol-2il]metil]-Benzamida,
inibidor de Tgfbeta-R1	Cmp 16i	864375-44-0	Ácido carbâmico de [[4-(6benzotiazolil)-5-(4-metil-2tiazolil)-1 H-imidazol-2-il]metil]2-metilpropil éster
inibidor de Tgfbeta-R1	LDN-214117	1627503-67-6	1-[4-[6-metil-5-(3,4,5trimetoxifenil)-3-piridinil]fenil]Piperazina
inibidor de Tgfbeta-R1	LDN-193189	1627503-67-6	CAS 1062368-24-4, 4-[6-[4(1piperazinil)fenil]pirazolo[1,5a]pirimidin-3-il]-Quinolina

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 142/245

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Classe	Agente	Número de CAS	Nome Alternativo
inibidor de Tgfbeta-R1	Cmp 12b	1415663-82-9	Tiazolamina de 2-N-[(3fluorofenil)metil]-4-(6-metil-2piridinil)-5-[1,2,4]triazolo[1,5a]piridin-6-ila
inibidor de Tgfbeta-R1	Cmp 6d	1630024-29-1	Ácido 5-[[2-ciclopropil-6-(4fluorofenil)imidazo[2,1 -b]1,3,4-tiadiazol-5-il]metileno]-4oxo-2-tioxo-3-Tiazolidinaacético
inibidor de Tgfbeta-R1	SD-093		Estrutura desconhecida
inibidor de Tgfbeta-R1	Ki-26894		Estrutura desconhecida
inibidor de Tgfbeta-R1	NPC-30345		Estrutura desconhecida
inibidor de Tgfbeta-R1	SX-007		Estrutura desconhecida
inibidor de Tgfbeta-R1	SKI-2162		Estrutura desconhecida
Outro	Asiaticoside	16830-15-2
anticorpo de Tgfbeta	ID11
anticorpo de Tgfbeta	2G7
anticorpo de Tgfbeta	GC-1008		Fresolimumabe
anticorpo de Tgfbeta	CAT-152		Lerdelimimabe
anticorpo de Tgfbeta	CAT-192		Metelimumabe
Anticorpo de receptor de TGfbeta	PF-03446962
anticorpo de Tgfbeta	SR-2F
anticorpo de Tgfbeta	2G7
anticorpo de Tgfbeta	LY2382770
anticorpo de Tgfbeta	IMC-TR1

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 143/245

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Classe	Agente	Número de CAS	Nome Alternativo
anticorpo de Tgfbeta	STX-100
TGF-beta antagonista	TGF-PRII:Fc
proteína recombinante	betaglican/TGF- PRIII
Inibidor de oligonucleotídeo	AP12009		Trabedersen, molécula antissenso
Inibidor de oligonucleotídeo	AP11014
Inibidor de oligonucleotídeo	AP15012
É este inibidor de TGF b/SIM	LY-573636	519055-62-0	N-[(5-bromo-2-tienil)sulfonil]- 2,4-dicloro-Benzamida
	pirrol-imidazol poliamida		Silenciamento de gene

	Patente U.S. No. 7.087.626		Derivados de pirrol como agentes farmacêuticos
	Patente U.S. No. 6.476.031		Derivados de quinazolina como medicamentos
	Patente U.S. No. 7.723.486, e EP 0945464		Anticorpos para TGF-β

Peptídeo	Triptopeptina A	1644153-72-9
Peptídeo	Trx-xFoxHlb		aptâmeros de peptídeo de interação de Smad
Peptídeo	Trx-Lefl
Peptídeo	Distertide (pl44)
Peptídeo	pl7
Peptídeo	LSKL

estrutura com base em dihidropirrlipirazol	Veja a Patente US US 8298825 B1
estrutura com base em imidazol	Veja a Patente US US 8298825 B1

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 144/245

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Classe	Agente	Número de CAS	Nome Alternativo
estrutura com base em pirazolopiridina	Veja a Patente US US 8298825 B1
estrutura com base em pirazol			Veja a Patente US US 8298825 B1
estrutura com base em imidazopiridina	Veja a Patente US US 8298825 B1
estrutura com base em triazol			Veja a Patente US US 8298825 B1
estrutura com base em piridopirimidina	Veja a Patente US US 8298825 B1
estrutura com base em pirrolopirazol	Veja a Patente US US 8298825 B1
estrutura com base em isotiazol	Veja a Patente US US 8298825 B1
estrutura com base em oxazol	Veja a Patente US US 8298825 B1

Composições com Poloxâmeros [00399] Em certas modalidades, a presente descrição proporciona uma composição farmacêutica compreendendo: a) um composto da presente descrição e b) um poloxâmero.

[00400] Em certas modalidades, o pH da composição farmacêutica se situa entre cerca de 5 e cerca de 9. Em certas modalidades, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5, 6, 7, 8, ou 9.

[00401] Em certas modalidades, a solubilidade do composto na presença do poloxâmero é cerca de 3 vezes mais elevada do que a solubilidade do composto ao mesmo pH na ausência de poloxâmero. Em certas modalidades, a solubilidade do composto na presença do poloxâmero é de cerca de 2-, 3-, 4- ou 5 vezes mais elevada do que a solubilidade do composto ao mesmo pH na ausência de poloxâmero.

[00402] Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas poPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 145/245

126/196 dem também conter um poloxâmero. Os poloxâmeros são os copolimeros de tribloco não iônicos constituídos por uma cadeia hidrofóbica central da polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)). Os poloxâmeros são muitas vezes considerados excipientes funcionais, porque são componentes essenciais e desempenham um papel importante em uma formulação.

[00403] Em algumas modalidades, o poloxâmero compreende, pelo menos, um dentre Poloxâmero124, Poloxâmero 188, Poloxâmero 237, Poloxâmero 338 ou Poloxâmero 407. Em algumas modalidades, o poloxâmero compreende misturas de dois ou mais dentre Poloxâmero124, Poloxâmero 188, Poloxâmero 237, Poloxâmero 338 ou Poloxâmero 407. Em algumas modalidades, a mistura de dois ou mais poloxâmeros incluem Poloxâmero 407 e Poloxâmero 124. Em uma outra modalidade, o Poloxâmero compreende, pelo menos, um dentre Poloxâmero 188 e Poloxâmero 407 ou suas misturas. Em algumas modalidades, o poloxâmero é Poloxâmero 407.

[00404] Em algumas modalidades, o poloxâmero está presente em uma concentração entre cerca de 5 % em peso e cerca de 25 % em peso em relação à composição. Em algumas modalidades, o poloxâmero está presente em uma concentração entre cerca de 10 % em peso e cerca de 23 % em peso, em relação à composição. Em algumas modalidades, o poloxâmero está presente em uma concentração entre cerca de 15 % em peso e cerca de 20 % em peso em relação à composição. Em algumas modalidades, o poloxâmero está em uma concentração de aproximadamente 17 % em peso em relação à composição. Em algumas modalidades, o poloxâmero está em uma concentração de aproximadamente 21 % em peso em relação à composição.

[00405] Em algumas modalidades, o poloxâmero pode estar em uma concentração entre 21 % em peso e 40 % em peso em relação à

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127/196 composição. Em outra modalidade, o poloxâmero está presente em uma concentração entre 21 % em peso e 30 % em peso em relação à composição. Em outra modalidade, o poloxâmero está presente em uma concentração entre 23 % em peso e 29 % em peso em relação à composição. Em outra modalidade, o poloxâmero está presente em uma concentração entre 23 % em peso e 27 % em peso em relação à composição. Em outra modalidade, o poloxâmero está em uma concentração de 25 % em peso em relação à composição.

[00406] Em algumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica é superior a cerca de 10Ό. Em algumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica se situa entre cerca de 11Ό e cerca de 32Ό. Em algumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica se situa entre cerca 15Ό e cerca de 30Ό. Em algumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica se situa entre cerca 20Ό e cerca de 28Ό. Em algumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica se situa entre cerca 24Ό e cerca de 26Ό.

[00407] Em algumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica é de cerca de 15Ό. Em algu mas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica é de cerca de 20Ό. Em algumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica é de cerca de 24Ό. Em a Igumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica é de cerca de 26Ό. Em algumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica é de cerca de 28Ό. Em a Igumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica é de cerca de 30Ό. Em algumas modalidades, a temperatura de gelificação da composição farmacêutica é de cerca de 32Ό.

[00408] Em certas modalidades, a presente descrição proporciona

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128/196 uma composição farmacêutica que tem uma temperatura de gelificação maior do que 10Ό, a composição compreendendo: a) um composto farmaceuticamente ativo da presente descrição; b) e poloxâmero superior ou igual a 21 % em peso da composição farmacêutica; e c) e um inibidor de HDAC; em que a composição farmacêutica tem uma temperatura de gelificação superior a 10Ό.

[00409] Em certas modalidades, a presente descrição proporciona uma composição farmacêutica que tem uma temperatura de gelificação maior do que 10Ό, a composição compreendendo: a) um composto farmaceuticamente ativo da presente descrição; b) e poloxâmero superior ou igual a 21 % em peso da composição farmacêutica; e c) e um composto contendo ácido carboxílico; em que a composição farmacêutica tem uma temperatura de gelificação superior a 10Ό. EXEMPLOS

Métodos experimentais gerais [00410] Os espectros de ¹H RMN foram registados em Bruker Avance III 400 MHz e Bruker Fourier 300 MHz e TMS foi utilizado como um padrão interno.

[00411] A LCMS foi realizada em um Espectrômetro de Massa quadrupolo em Agilent LC/MSD Série 1200 (Coluna: C18 (50 x 4,6 mm, 5 pm) operando no modo de ionização ES (+) ou (-); T = 30Ό

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Esquemas Sintéticos

Esquema Sintético 1

Esquema Sintético 2

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Esquema Sintético 3

Esquema Sintético 4

2) NaOMe, HOMe

1)CH₂CI_o

Esquema Sintético 5

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131/196

Esquema Sintético 6

22

Boc₂O

K₂CO₃, THF

Esquema Sintético 7

Trifosgênio

Et₃N, DCM

núcleo 3

Et₃N, DMF

31 32

NaBH₄

THF

Composto I-6

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132/196

Esquema Sintético 8

35

Trifosqênio

Et₃N, DOM

37

HCI/MeOH

núcleo 3

Et₃N, DMF

Composto l“8

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133/196

Esquema Sintético 9

Esquema Sintético 10

Composto I-20

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134/196

Esquema Sintético 11

Trifosgênio

Et₃N, DCM

núcleo 3

Et₃N, DMF

Esquema Sintético 12

Composto I-28

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135/196

Esquema Sintético 13

66 67 68 69

Esquema Sintético 14

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136/196

Esquema Sintético 15

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Procedimentos Experimentais:

Síntese de intermediário 2.

2 [00412] Uma solução de intermediário (20 g, 213 mmol) em MeCN (540 ml_) foi (E)-4-oxo-butenoato de etila (28,6 g, 223 mmol). A mistura de reação foi aquecida a 800 e agitada durante 6 h oras. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluído com Diclorometano / MeOH de 1 :0a 200 : 1) para produzir o intermediário 2 cru (25 g) como um sólido castanho.

Síntese de intermediário 3.

[00413] A uma solução do intermediário cru 2 (25 g) em MeOH (100 ml_) adicionou-se NH3 / MeOH (6 M, 100 ml_). A mistura de reação foi

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137/196 agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi vertida em EtOAc (500 mL) e depois filtrada. A massa filtrante foi secada em vácuo para produzir o intermediário 3 (13 g, 35 % para duas etapas) como um sólido castanho.

[00414] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 8,30 (d, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,60 (s br, 1 H), 7,54 (d, J = 5, 2 Hz, 1 H), 7,41 (s, 1 H), 7,19-7,23 (m, 1 H), 7,06 (s br, 1 H), 6,89-6,93 (m, 1 H), 3,80 (s, 2 H).

Síntese de intermediário 5.

[00415] A uma solução do intermediário 4 (100 g, 0,51 mol) em DMF (1000 mL) foi adicionado NaH (60 %, 61 g, 1,53 mol) a 0Ό. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 20 minutos. Cloridrato de 2-cloroetilamina (89,2 g, 0,77 mol) foi adicionado à mistura em porções a 0Ό. A mistura foi agitada em temperai ura ambiente durante 2 horas. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 5/1) indicou que a reação estava completa. A mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (600 mL x 3). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na2SO4 e concentradas em vácuo para produzir o intermediário 5 (110 g, 90 %) como um óleo amarelo.

[00416] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 7,74-7,75 (d, 1 H, J = 1, 2 Hz), 7,21-7,29 (m, 2 H), 7,13-7,14 (d, 1 H, J = 3, 2 Hz), 6,44-6,45 (d, 1 H, J = 2,8 Hz), 4,14-4,17 (t, 2 H, J = 6 Hz), 3,08-3,11 (t, 2 H, J = 6 Hz).

Síntese de intermediário 6.

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[00417] A uma solução do intermediário 5 (150 g, 0,63 mol) em AcOH (720 ml_) foi adicionado complexo de borano-piridina (9,3 M, 135,5 ml_, 1,26 mol) em temperatura ambiente sob N₂. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Depois a mistura foi ajustada em pH = 9-10 com NaOH aquoso e extraída com EtOAc (800 ml x 3). As fases orgânicas combinadas foram concentradas em vácuo para produzir um composto cru. Adicionou-se água (720 ml_) ao composto cru seguido da adição lenta de HCI concentrado (240 ml_). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 min, ajustada em pH = 10-11 com NaOH aquoso, extraída com EtOAc (800 ml_ x 3) e concentrada para produzir um composto cru. A uma solução do composto cru em metil butil éter terciário (500 ml_) foi adicionado AcOH (28 ml_) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos, em seguida filtrada, a massa filtrante foi lavada com metil butil éter terciário e secada para produzir o intermediário 6 (120 g, 63,5 %) como um sólido branco. ¹H RMN (DMSO-d₆, 400 MHz): δ (ppm) 7,14 (s, 1 H), 7,09-7,12 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 6,43-6,45 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 3,33-3,37 (t, 2 H, J = 8,4 Hz), 3,06-3,09 (t, 2 H, J = 6,6 Hz), 2,87-2,92 (t, 2 H, J = 8,4 Hz), 2,76-2,79 (t, 2 H, J = 6,6 Hz).

Síntese de intermediário 7.

[00418] A uma solução de H₂SO₄ (12,6 ml_) em AcOH (80 ml_) e

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HCHO (37 % aquoso, 660 ml_) foi adicionado o intermediário 6 (100 g, 0,33 mol) em porções em temperatura ambiente. A mistura foi agitada a 500 durante 20 min. Em seguida, a mistura foi aj ustada em pH 9-10 com NaOH aquoso, extraída com EtOAc (800 ml_ x 3) e concentrada para produzir o intermediário cru 7 (100 g) como um sólido amarelo que foi utilizado diretamente na etapa seguinte sem purificação.

Síntese de intermediário 8.

[00419] Uma mistura de intermediário 7 (100 g, cru) e K2CO3 aquoso (300 ml_, 1 M) em THF (700 ml_) foi adicionado (Boc)₂O (94,4 g) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, adicionou-se H₂O e extraiu-se com EtOAc (500 ml_ x 3). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas sobre Na₂SO4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc a partir de 50 : 1 a 5 : 1) para produzir 0 intermediário 8 (75 g, 64,6 % para duas etapas) como um sólido amarelo.

[00420] ¹H RMN (CDCI3, 400 MHz): δ (ppm) 7,11 (bs, 1 H), 6,99 (bs, 1 H), 4,30-4,37 (m, 2 H), 3,68 (m, 2 H), 3,36-3,40 (m, 2 H), 2,96-3,01 (m, 4 H), 1,41 (s, 9H).

Síntese de núcleo 1.

Boc Boc core 1

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140/196 [00421] A uma solução do intermediário 8 (49 g, 0,14 mol) em THF (490 ml_) foi adicionada uma solução de DDQ (37,9 g, 0,17 mol) em THF (490 ml_) a 0Ό sob N2. A mistura foi agitada a 0Ό durante 15 minutos. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 5/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em NazCCb e extraída com EtOAc (400 ml_ x 2). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas sobre Na2SÜ4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluído com éter de petróleo / EtOAc a partir de 50 : 1 a 10 : 1) para produzir 0 núcleo 1 (24 g, 49 %) como um sólido amarelo.

[00422] ¹H RMN (CDCI3, 400 MHz): δ (ppm) 7,63 (bs, 1 H), 7,047,15 (m, 2 H), 6,46-6,47 (d, 1 H, J = 3, 2 Hz), 4,76-4,83 (m, 2 H), 4,25 (m, 2 H), 3,92 (m, 2 H), 1,42-1,45 (m, 9H).

Síntese de Intermediário 10

[00423] A uma solução do núcleo 1 (10 g, 28,5 mmol) em diclorometano (100 ml_) adicionou-se HCI / dioxano (7 M, 50 ml_) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 5/1) indicou que a reação estava completa. O solvente foi concentrado em vácuo para produzir um sólido branco.

[00424] A uma solução do sólido branco e cloreto de 1piperidinacarbonila (4,6 g, 31,3 mmol) em DMF (100 ml) adicionou-se

EtaN (8,6 g, 85,5 mmol) abaixo de 5Ό. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertiPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 160/245

141/196 da em água gelada e extraída com EA (200 ml x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas sobre Na2SÜ4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc de 20 : 1 a 1 : 1) para produzir o intermediário 10 (7,5 g, 72,8 %) como um sólido amarelo.

[00425] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 7,86 (d, J = 1,6 Hz,1 H), 7,26 (s, 1 H), 7,02(t, J = 1,6 Hz,1 H), 6,47(d, J = 3, 2 Hz, 1 H), 4,63 (s, 2 H),4,22-4,20 (t, J = 4,8 Hz, 2 H), 3,98-4,00 (t, J = 4,8 Hz, 2 H), 3,18-3,19 (m, 4 H), 1,58-1,40 (m, 6 H).

Síntese de intermediário 11.

11 [00426] A uma solução do intermediário 10 (10 g, 27,6 mmol) em diclorometano (100 mL) foi adicionado (COCI)2 (8,8 g, 69 mmol) a 0Ό sob N2. A mistura foi agitada a 40Ό durante 1 h. TLC (éter de petróleo / EtOAc =1/1) indicou que a reação estava completa. Depois adicionou-se uma solução de NaOMe (3,7 g, 69 mmol) em MeOH (10 mL) a -600 sob N 2. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. Adicionou-se água e extraiu-se com diclorometano (100 ml x 3). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas sobre Na2SÜ4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc de 5 : 1 a 1 : 2) para produzir 0 intermediário 11 (6g, 48,5 %) como um sólido amarelo.

[00427] ¹H RMN (CDCI3, 400 MHz): δ (ppm) 8,70 (d, J = 1,6 Hz, 1

H), 8,29 (s, 1 H), 7,41 (s, 1 H), 4,67 (s, 2 H), 4,41-4,39 (m, 2 H), 4,01 Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 161/245

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3,98 (m, 2 Η), 3,95 (s, 3 Η), 3,15-3,01 (m, 4 Η), 1,60-1,40 (m, 6 Η).

Síntese de núcleo 2.

[00428] A uma solução do intermediário 11 (10 g, 22,3 mmol) e intermediário 3 (3,9 g, 22,3 mmol) em DMF foi adicionada uma solução de t-BuOK (6,4 g, 19,0 mmol) em THF (100 ml_) a 0-10Ό. A mistura foi agitada a 0-10Ό durante 15 minutos. TLC (diclorometano / MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 ml_ x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas sobre NazSCri e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / AcOEt / THF de 10 : 5 : 1 a 1 : 1 : 1) para produzir o núcleo 2 (6,5 g, 50,7 %) como um sólido laranja.

[00429] ¹H RMN (DMSO-d₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,25 (s, 1 H), 8,02 (s, 1 H), 7,91 (s, 1 H), 7,65-7,68 (d, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,59-7,61 (d, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,19-7,23 (t, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,04 (s, 1 H), 6,55-6,58 (t, J = 6,4 Hz, 1 H), 6,08 (s, 1 H), 4,63 (s, 2 H), 4,50-4,62 (m, 2 H), 3,823,86 (m, 2 H), 2,94-3,06 (m, 4 H), 1,40-1,60 (m, 6 H).

[00430] LC/EM M+1 = 573,1

Síntese de intermediário 12.

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 162/245

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núcleo 1 12 [00431] A uma solução do núcleo 1 (10 g, 28,5 mmol) em DMF (200 ml_) adicionou-se Cul (5,4 g, 28,5 mmol) e 2,2-difluoro-2(fluorossulfonil)acetato de metila 100 mmol) em temperatura ambiente sob N2. A mistura é agitada a 80Ό durante 2,5 horas. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 5/1) indicou que a reação estava completa. A mistura foi resfriada em temperatura ambiente e filtrada. O filtrado foi adicionado com água e extraída com EtOAc (100 ml x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na2SÜ4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc de 20 : 1 a 5 : 1) para produzir 0 intermediário 12 (5,5 g, 56,7 %) como um sólido amarelo.

[00432] ¹H RMN (CDCI3, 400 MHz): δ (ppm) 7,81 (s, 1 H), 7,13-7,28 (m, 2 H), 6,62 (s, 1 H), 4,92-4,84 (m, 2 H), 4,22(s, 2 H), 3,98-3,97 (m, 2 H), 1,40 (s, 9H).

Síntese de intermediário 13.

13 [00433] A uma solução do intermediário 12 (5,0 g, 14,7 mmol) em diclorometano (75 ml_) foi adicionado (COCI)2 (4,6 g, 36,7 mmol) sob

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 163/245

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Νς. A mistura foi agitada a 400 durante 1 h. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 1/1) indicou que a reação estava completa. Depois adicionouse uma solução de NaOMe (1,98 g, 36,7 mmol) em MeOH (10 ml) a 600 sob N 2. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. Adicionou-se água e extraiu-se com diclorometano (100 ml x 3). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas em Na2SO4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc de 10:1 a 5 : 1) para produzir o intermediário 13 (3,8g, 60,7 %) como um sólido amarelo.

[00434] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 8,64 (s, 1 H), 8,44 (s, 1 H), 7,40-7,31 (m, 1 H), 4,98-4,88 (m, 2 H), 4,51-4,50 (m, 2 H), 4,044,01 (m, 2 H), 3,96 (s, 3 H), 1,40 (s, 9H).

Síntese de intermediário 14.

[00435] A uma solução do intermediário 13 (5,5 g, 12,9 mmol) e intermediário 3 (2,25 g, 12,9 mmol) em DMF (110 ml_) foi adicionada uma solução de tBuOK (3,6 g, 32,2 mmol) a 0-100. A mistura foi agitada a 0-100 durante 15 min. TLC (éter de petróleo / EtOAc =1/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 mL x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na2SO4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com diclorometano / MeOH de 100 : 1 a 30 : 1) para produzir 0 intermediário 14 (3,5 g, 58,3 %) como um sóPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 164/245

145/196 lido laranja.

[00436] ¹H RMN (CDCI3, 400 MHz): δ (ppm) 8,16 (s, 1 H), 8,02 (s, 1 H), 7,96 (s, 1 H), 7,35 (s, 1 H), 7,27 (s, 1 H), 7,12-7,08 (m, 2 H)), 6,406,38 (m, 2 H, 4,89-4,77 (m, 2 H), 4,50 (s, 2 H), 4,04 (s, 2 H), 1,48-1,37 (m, 9H).

Síntese de composto 1-1.

[00437] A uma solução do intermediário 14 (5 g, 9,1 mmol) em diclorometano (50 ml_) foi adicionado HCI I dioxano (50 ml_, 7 M) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. TLC (diclorometano / MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. O solvente foi concentrado em vácuo para produzir um sólido branco.

[00438] A uma solução do sólido branco e cloreto de 1piperidinacarbonila (1,8 g, 12,3 mmol) em DMF (40 ml_) adicionou-se EtaN (2,49 g, 24,6 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 mL x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na₂SO4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com diclorometano / THF de 20 : 1 a 10 : 1) para produzir o composto 1-1 (3,0 g, 70 %) como um sólido vermelho.

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 165/245

146/196 [00439] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,30 (s, 1 H), 8,17 (s, 1 H), 7,93 (s, 1 H), 7,64-7,60 (m, 2 H), 7,19 (s, 1 H), 6,56 (m, 1 H), 6,31 (s, 1 H), 4,77-4,69 (m, 2 H), 4,68-4,60 (m, 2 H), 3,95-3,85 (m, 2 H), 3,10-2,90 (m, 4 H), 1,55-1,35 (m, 6 H).

[00440] LC/EM M+1 563,1

Síntese de composto 1-2.

CuCN

NMP

Composto 1-2 [00441] A uma solução de núcleo 2 (5 g, 8,7 mmol) em N-metil-2pirrolidona (50 ml_) foi adicionado CuCN (2,5 g, 28 mol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada a 150Ό durante 6 horas sob N2. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 ml_ x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas em NazSCXi e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com diclorometano / MeOH de 1 : 0 a 50 : 1) para produzir 0 composto I-2 (2,2 g, 49 %) como um sólido laranja.

[00442] ¹H RMN (DMSO-c/₆): δ (ppm) 11,30 (s, 1 H), 8,07 (s, 1 H), 7,97 (s, 1 H), 7,66-7,68 (d, 1H, J = 9, 2 Hz), 7,54-7,56 (d, 1 H, J = 6,8

Hz), 7,29 (s, 1 H), 7,19-7,23 (t, J = 8 Hz, 1 H), 6,53-6,57 (t, 1 H, J = 6,8 Hz), 6,44 (s, 1 H), 4,68 (S, 4 H), 4,60-4,63 (m, 4 H), 3,84-3,88 (m, 2 H), 2,96-3,05 (m, 4 H), 1,43-1,47 (m, 6 H).

[00443] LC/EM M+1 520,1

Síntese de intermediário 15.

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 166/245

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núcleo 1 15 [00444] A uma solução do núcleo 1 (50 g, 0,14 mol) em 1,4dioxano (500 mL) foram adicionados Nal (42,7 g, 0,28 mol) e Cul (2,7 g) e 2-Dimetilaminoetilamina. A mistura foi agitada a 140Ό durante a noite sob N₂. A massa filtrante foi lavada com diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram concentradas em vácuo. O resíduo foi lavado com metil butil éter terciário para produzir o intermediário 15 (50 g, 88,0 %) como um sólido amarelo.

Síntese de intermediário 16.

16 [00445] A uma solução do intermediário 15 (10g, 25,1 mmol) em EtaN (120 ml) e THF (60 ml) em temperatura ambiente, então Pd(PPh3)₂CI₂ (1,2 g, 2,4 mmol) e Cul (1,2 g, 2,4 mmol) foram adicionados sob N₂. Em seguida, adicionou-se gota a gota etiniltrimetilsilano (4,75 g, 48,4 mmol). A mistura foi agitada a 60Ό d urante a noite. A mistura foi concentrada em vácuo para remover EtsN. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com CH₂CI₂ (300 mL x 2). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na₂SO₄ e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc a partir de 100 : 1 a 50 : 1) para produzir o intermediário 16 (6g,

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 167/245

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64,8 %) como um sólido amarelo.

[00446] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 7,63-7,67 (m, 1 H), 7,04-7,41 (m, 2 H), 6,46-6,49 (m, 1 H), 4,77-4,84 (m, 2 H), 4,23-4,29 (m, 2 H), 3,90-3,97 (m, 2 H), 1,43 (s, 9 H), 0,26 (s, 9H).

Síntese de intermediário 17.

17 [00447] A uma solução do intermediário 16 (10 g, 27 mmol) em diclorometano (110 ml_) foi adicionado (COCI)2 (8,5 g, 67,4 mmol) a 0Ό sob N2. A mistura foi agitada a 40Ό durante 1 h. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 5/1) indicou que a reação estava completa. Depois adicionou-se uma solução de NaOMe (3,64 g, 67,4 mmol) em MeOH (10 ml_) a -60Ό sob N 2. Agitou-se a mistura em temperatura ambiente durante 1 h. Adicionou-se água e extraiu-se com diclorometano (100 ml x 3). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na2SÜ4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc de 100 : 1 a 5 : 1) para produzir 0 intermediário 17 (7 g, 56,7 %) como um sólido amarelo.

Síntese de intermediário 18.

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 168/245

149/196 [00448] A uma solução do intermediário 17 (8 g, 17,6 mmol) e intermediário 3 (3,1 g, 17,6 mmol) em DMF (80 ml) foi adicionada uma solução de tBuOK (4,9g, 44 mmol) a 0-100. A mistura foi agitada a 0100 durante 15 min. TLC (éter de petróleo / EtOAc =1/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 mL x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na2SÜ4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com diclorometano / MeOH de 100 : 1 a 50 : 1) para produzir o intermediário 18 (5 g, 49 %) como um sólido laranja.

Síntese de intermediário 19.

[00449] A uma solução do intermediário 18 (5 g, 8,6 mmol) em diclorometano (50 mL) foi adicionado HCI / dioxano (50 mL, 7 M) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. TLC (diclorometano / MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. O solvente foi concentrado em vácuo para produzir um sólido branco.

[00450] A uma solução do sólido branco e cloreto de 1piperidinacarbonila (1,4 g, 9,5 mmol) em DMF (50 mL) adicionou-se EtaN (2,6 g, 25,8 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 mL x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secaPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 169/245

150/196 das em Na₂SO₄ e concentradas em vácuo para produzir o intermediário 19 cru (5,2 g), que foi utilizado diretamente na etapa seguinte sem purificação.

Síntese de composto I-3.

Composto I-3 [00451] A uma solução do intermediário cru 19 (5,2 g) em DMF (100 ml) adicionou-se K₂CO₂ (2 g). A mistura foi aquecida a 500 e agitada durante 1 h. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 ml_ x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na₂SO₄ e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com diclorometano / MeOH de 100 : 1 a 30 : 1) para produzir o composto I-3 (3 g, 18,6 % para duas etapas) como um sólido vermelho.

[00452] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,26 (s, 1 H), 8,02 (s, 1 H), 7,92 (s, 1 H), 7,65-7,59 (m, 2 H), 7,20 (t, 1 H, J = 8 Hz), 6,97 (s, 1 H), 6,58-6,55 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 6,18 (s, 1 H), 4,63 (s, 2 H), 4,504,60 (m, 2 H), 3,80-3,90 (m, 2 H), 3,75 (s, 1 H), 2,95-3,05 (m, 4 H), 1,46-1,35 (m, 6 H).

[00453] LC/EM M+1 519,2

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Síntese de composto 1-10

[00454] A uma solução do núcleo 2 (5 g, 8,8 mmol) em dioxano (50 mL) foram adicionados acetamida (3,1 g, 53,3 mmol), Cul (1,1 g, 5,8 mmol) e K3PO3 em RT sob N₂. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 20 minutos. Adicionou-se N¹,N²-dimetiletano-1,2diamina (1,56 g, 17,8 mmol) e depois agitou-se a mistura a 115Ό durante 5 horas sob N₂. TLC (diclorometano / MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc / THF (3/1, 100 mL x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na₂SO₄ e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com diclorometano / MeOH de 200 : 1 a 50 : 1) para produzir 0 composto 1-10 (3 g, 62 %) como um sólido vermelho.

[00455] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,21 (s, 1 H), 9,43 (s, 1 H), 7,86 (s, 1 H), 7,78 (s, 1 H), 7,58-7,64 (m, 2 H), 7,17-7,21 (t, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,00 (s, 1 H), 6,77 (s, 1 H), 6,56-6,58 (t, 1 H, J = 7, 2 Hz), 4,60 (s, 2 H), 4,40-4,50 (m, 2 H), 3,80-3,88 (m, 2 H) , 2,88-3,12 (m, 4 H), 1,85 (s, 3 H) , 1,15-1,20 (m, 6 H).

[00456] LC/EM M+1 552,2

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 171/245

152/196

Síntese de composto 1-4.

[00457] A uma solução do composto 1-10 (3 g, 5,4 mmol) em EtOH (10 mL) foi adicionado HCI (28 mL, 6 N) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada a 80Ό durante 3 horas. TLC (di clorometano / MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. A mistura foi então vertida em água gelada e extraída com diclorometano (100 ml x 2), depois a fase aquosa foi ajustada em pH 9-10 com NazCCA aq., extraída com diclorometano (100 ml x 6) e concentrada em vácuo. O resíduo foi lavado com metil butil éter terciário e filtrado. A massa filtrante foi secada em vácuo para produzir o composto 1-4 (2,1 g, 75 %) como um sólido vermelho.

[00458] ¹H RMN (DMSO-c/6, 400 MHz): δ (ppm) 11,19 (s, 1 H), 7,86 (s, 1 H), 7,84 (s, 1 H), 7,62 (bs, 2 H), 7,18-7,22 (t, 1 H, J = 7, 2 Hz), 6,57-6,61 (t, 1 H, J = 6,8 Hz), 6,24 (s, 1 H), 5,27 (s, 1 H), 4,50 (s, 2 H), 4,36-4,39 (m, 2 H), 4,14-4,17 (m, 2 H), 3,75-3,78 (m, 2 H), 2,88-3,05 (m, 4 H), 1,44-1,48 (m, 6 H).

[00459] EM/LC M+1 511,1

Síntese de intermediário 22.

22 [00460] A uma solução do intermediário 21 (100 g, 0,59 mol) em tolueno seco (890 ml) foram adicionados n-BuOH (131,6 g, 1,78 mol) e

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TsOH (10 g) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada a 1200 durante a noite e a água foi removida utilizando um aparelho de Deanstark. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 5/1) indicou que a reação estava completa. A mistura foi concentrada em vácuo para produzir o intermediário cru 22. O intermediário cru 22 foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc a partir de 100 : 1 a 20 : 1) para produzir o intermediário 22 (120 g, 67,8 %) como e óleo amarelo.

[00461] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 7,89-7,92 (dd, 1 H, J = 4,8 Hz, 8,8 Hz), 7,51-7,54 (dd, 1 H, J =2,8 Hz, 9,6 Hz), 7,09-7,14 (m, 1 H), 6,04 (s, 1 H), 3,50-3,56 (m, 4 H), 1,55-1,62 (m, 4 H), 1,33-1,42 (m, 4 H), 0,83-0,93 (m, 6 H).

Síntese de intermediário 23.

23 [00462] A uma solução do intermediário 22 (50 g, 0,17 mol) em THF seco (1500 ml_) adicionou-se gota a gota solução de brometo de vinilmagnésio (1 M, 668,8 ml_, 668,8 mmol) a -40Ό. A mistura foi agitada a -40Ό durante 1 h. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 5/1) mostrou que a reação estava completa, depois a mistura foi vertida em NH4CI aq., extraída com EtOAc (300 ml x 3), as fases orgânicas foram concentradas para produzir um composto cru. O composto cru foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc a partir de 100 : 1 a 20 : 1) para produzir 0 composto (24 g) como um óleo amarelo. A uma solução do composto (24 g) em THF (100 ml) foi adicionado HCI (0,5 N, 80 ml) gota a gota em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 5/1) indicou que a reação estava completa. A mistuPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 173/245

154/196 ra foi ajustada em pH 10 com NaOH aq., extraída com EtOAc (300 ml_ x 3) e concentrada em vácuo para proporcionar o intermediário 23 (16 g, 58,8 %) como um sólido amarelo.

[00463] ¹H RMN (CDCI₃,400 MHz): δ (ppm) 10,06 (s, 1 H), 7,62 (dd, 1 H, J = 2 Hz, 9, 2 Hz), 7,38-7,41 (m, 2 H), 6,60 (t, 1 H, J = 2,4 Hz).

Síntese de intermediário 24.

[00464] A uma solução do intermediário 23 (140 g, 0,86 mol) em MeOH (2100 ml_) foi adicionado 2-aminoetanol (78 g, 1,3 mol) e Pd/C (14 g) em temperatura ambiente sob N2. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas sob N2. Em seguida, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite sob H2. A mistura foi filtrada e concentrada para produzir 0 intermediário 24 (200 g, cru) como um óleo amarelo, que foi utilizado diretamente na etapa seguinte sem purificação.

Síntese de intermediário 25.

[00465] Uma mistura de intermediário 24 (90 g, cru) e K2CO3 (467 ml_, 1 M) em THF (1300 ml_) foi adicionada a BOC2O (141 g) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) mostrou que a reação

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155/196 estava completa, depois adicionou-se H2O e extraiu-se com EtOAc (500 ml x 3). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas em Na2SO₄ e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluído com éter de petróleo / EtOAc de 10 : 1 a 1 : 1) para produzir 0 intermediário 25 (66,6 g, 56 % para duas etapas) como um óleo amarelo.

[00466] ¹H RMN (CDCI₃,400 MHz): δ (ppm) 10,17(s, 1 H), 7,23-7,26 (m, 2 H), 6,78-6,82 (dd, 1 H, J = 9, 2 Hz, J = 2 Hz), 6,48-6,50 (t, 1 H, J = 2,4 Hz), 4,67 (s, 2 H), 3,66-3,71 (m, 2 H), 3,25-35 (m, 2 H), 1,40 (s, 9H).

Síntese de intermediário 26.

26 [00467] A uma solução do intermediário 25 (50 g, 0,26 mol) em THF (1000 ml) adicionou-se Et₃N (79 g, 0,79 mol) e MS2O (55 g, 0,32 mol) a 0Ό sob N 2. A mistura foi agitada a 0Ό durante 2 h. TLC (éte r de petróleo / EtOAc = 3/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (400 ml x 2). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas em Na2SO₄ e concentradas em vácuo para proporcionar 0 intermediário 26 (50 g, 79 %) como um óleo amarelo.

[00468] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 10,08 (bs, 1 H), 7,247,29 (m, 2 H), 6,81-6,84 (m, 1 H), 6,49-6,50 (d, 1 H, J = 2,4 Hz), 4,67 (s, 2 H), 4,28-4,31 (m, 2 H), 3,48-3,52 (m, 2 H), 2,79 (s, 3 H), 1,51 (s, 9H).

Síntese de intermediário 27.

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[00469] A uma solução do intermediário 26 (65 g, 0,19 mol) em DMF (722 ml_) foi adicionada NaH (60 %, 11,5 g, 0,29 mol) a 00. A mistura foi agitada a 00 durante 1 hora sob N 2. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 3/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (500 ml_ x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na2SÜ4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc a partir de 50 : 1 a 10 : 1) para produzir 0 intermediário 27 (26 g, 53,2 %) como um sólido amarelo.

[00470] ¹H RMN (CDCI3, 400 MHz): δ (ppm) 7,14-7,16 (d, 1 H, J = 8 Hz), 7,07(s, 1 H), 6,72-6,83 (m, 1 H), 6,48-6,49 (d, 1 H, J = 2,8 Hz), 4,84 4,76 (s, 2 H), 4,24-4,25 (m, 2 H), 3,94 (m, 2 H), 1,45-1,48 (m, 9H).

Síntese de intermediário 28.

[00471] A uma solução do intermediário 27 (27,5 g, 95,0 mmol) em diclorometano (900 ml_) foi adicionado (COCI)2 (18 g, 142 mmol) a 0Ό sob N2. A mistura foi agitada a 0Ό durante 2 h. TLC (éte r de petróleo /

EtOAc = 1/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, uma solução de NaOMe (13,4 g, 247 mmol) em MeOH (40,8 mL) foi

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157/196 adicionada a -600 sob N 2. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. Adicionou-se água e extraiu-se com diclorometano (200 ml x 3). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na2SÜ4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc de 20 : 1 a 1 : 1) para produzir 0 intermediário 28 (20 g, 56 %) como um sólido branco.

[00472] ¹H RMN (CDCI3, 400 MHz): δ (ppm) 8,37(s, 1 H), 8,02-8,04 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 6,84-6,91 (m, 1 H), 4,80-4,90 (m, 2 H), 4,44 (bs, 2

H), 3,91-3,98 (m, 5 H), 1,41-1,46 (m, 9H).

Síntese de intermediário 29.

29 [00473] Uma solução do intermediário 28 (10 g, 26,5 mmol) e intermediário 3 (4,6 g, 26,5 mmol) em DMF foi adicionada a uma solução de tBuOK (7,4 g, 66,2 mmol) em THF (100 ml_) a 0-10°C. A mistura foi agitada a 0-100 durante 15 min. TLC (éter de petróleo / EtOAc = 1/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 mL x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na2SO4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc de 20 : 1 a 1 : 1) para produzir 0 intermediário 29 (7 g, 52,5 %) como um sólido vermelho.

[00474] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,07 (s, 1 H), 8,028,01 (d, 1 H, J = 4 Hz), 8,96 (s, 1 H), 7,61-7,63 (t, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,45

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158/196 (s, 1 Η), 7,17 (s, 1 Η), 6,57-6,64 (m, 1 Η), 6,47-6,49 (d, 1 H, J = 8 Hz), 5,77-5,80 (d, 1 H J =8,4 Hz), 4,73 4,78 (2 H), 4,52 (bs, 2 H), 3,96 (bs, 2 H),1,25-1,44 (m, 9H).

Síntese de núcleo 3.

núcleo 3 [00475] A uma solução do intermediário 29 (5 g, 9,9 mmol) em diclorometano (50 mL) foi adicionado HCI I dioxano (50 mL, 7 M) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. TLC (diclorometano / MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. O solvente foi concentrado em vácuo. O resíduo foi lavado com metil butil éter terciário e filtrado. A massa filtrante foi secada em vácuo para produzir o núcleo 3 (4 g, 91,9 %) como um sólido laranja.

[00476] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,59 (s, 1 H), 10,46 (bs, 2 H), 8,49 (s, 1 H), 8,18 (s, 1 H), 8,08-8,12 (m, 2 H, J = 14 Hz), 7,88-7,92 (t, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,25-7,29 (t, 1 H, J = 6,8 Hz), 7,047,07 (m, 1 H), 6,22-6,25 (m, 1 H), 4,76 (bs, 2 H), 4,62 (bs, 2 H), 3,68 (bs, 2 H).

Síntese de intermediário 31.

^HCI

Boc dioxano

31 [00477] A uma solução do intermediário 30 (20 g, 94 mmol) em dioxano (100 mL) foi adicionado HCI / dioxano (100 mL, 7 M) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente du-

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159/196 rante 2 horas. TLC (éter de petróleo I EtOAc = 3/1) mostrou que a reação estava completa. A mistura foi vertida em metil butil éter terciário (300 ml_) e filtrada. A massa filtrante foi secada em vácuo para produzir o cloridrato do intermediário 31 (8 g, 57 %) como um sólido branco.

Síntese de intermediário 32.

Trifosgênio ^HN\b Et₃N, DCM Ύ

O [00478] A uma solução de cloridrato do intermediário 31 (7 g, 47 mmol) em diclorometano (180 ml_) foi adicionado EtaN (14,2 g, 141 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, adicionou-se uma solução de Trifosgênio (5,6 g, 19 mmol) em diclorometano (20 ml_) à mistura a 0Ό a 10Ό. A mistura foi agitada em temperatura am biente durante 2 horas. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi lavada com NaHCOs aq., água, salmoura, secada em NazSCri e concentrada em vácuo. O produto cru foi destilado em vácuo para proporcionar o intermediário 32 (2,5 g, 30,5 %) como um óleo incolor.

Síntese de composto 1-5.

[00479] A uma solução do núcleo 3 (5 g, 11,45 mmol) em DMF (70 mL) foi adicionado EtaN (3,5 g, 34,35 mmol) em temperatura ambiente.

A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 10 min. Em

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160/196 seguida, uma solução do intermediário 32 (3,6 g, 20,5 mmol) em DMF (5 ml_) foi adicionada à mistura a 00 a 100. A mis tura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (diclorometano / MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. A mistura foi vertida em água gelada e extraída com metil butil éter terciário para remover as impurezas, depois extraída com EtOAc (100 mL x 5). As fases combinadas de EtOAc foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na₂SO4 e concentradas em vácuo para proporcionar o Composto 1-5 cru (4,5 g, cru) como um sólido laranja.

[00480] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,3 (s, 1 H), 9,58 (s, 1 H), 8,05 (s, 1 H), 7,92 (s, 1 H), 7,65 (d, 1 H, J = 8,8 Hz ), 7,60 (d, 1 H, J = 6,8 Hz ), 7,21 (t, 1 H, J = 8 Hz), 6,78 (d, 1H, J = 9,6 Hz), 6,58 (t, 1 H, J = 6,8 Hz), 5,62 (d, 1H, J = 2 Hz), 4,64 (s, 2 H), 4,55 (s, 2 H), 3,85 (s, 2 H), 3,21-3,37 (m, 2 H), 2,73-2,76 (m, 2 H),1,75-1,76 (m, 2 H), 1,33-1,47 (m, 3 H).

Síntese de composto 1-6.

[00481] A uma solução do intermediário cru 33 (4,5 g) em THF (100 mL) foi adicionado NaBH4 (0,16 g, 4,2 mmol) em porções abaixo de 50. Após adição, a mistura de reação foi agitada a menos de 50 durante 0,5 h. TLC (diclorometano / MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida a mistura foi vertida em água e extraída com EtOAc (100 ml x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na₂SO4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída

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161/196 com diclorometano / MeOH de 200 :1 a 30 : 1) para produzir o composto 1-6 (3 g, 48 % para duas etapas) como um sólido laranja.

[00482] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,24 (s, 1 H), 8,06 (s, 1 H), 7,92 (s, 1 H), 7,64-7,66 (d, 1H, J = 8,8 Hz ), 7,59-7,61 (d, 1H, J = 6,4 Hz ), 7,18-7,22 (t, 1 H J = 8 Hz), 6,78-6,80 (d, 1 H, J = 9,6 Hz), 6,56-6,59 (t, 1 H J = 6,8 Hz), 5,62-5,65 (dd, 1 HJ = 2HzJ = 10 Hz), 4,63 (s, 2 H), 4,55 (s, 2 H), 4,45-4,47 (t, 2 H, J = 5, 2 Hz), 3,85 (s, 2 H), 3,40-3,43 (d, 2 H J = 12,4 Hz), 3,23-3,26 (t, 2 H, J = 4,8 Hz), 2,58-2,65 (t, 2 H, J = 12 Hz), 1,55-1,58 (d, 2 H J = 12,8 Hz), 1,47-1,48 (d, 1 H J = 6,4 Hz), 1,05-1,13 (m, 2 H).

[00483] LC/EM M+1 543,1

Síntese de intermediário 35.

F Trifosgênio

Et₃N, DCM

[00484] A uma solução de cloridrato do intermediário 34 (8,6 g, 55,0 mmol) em diclorometano (240 mL) foi adicionado EtsN (16,7 g, 165,0 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, uma solução de Trifosgênio (6,5 g, 22,0 mmol) em diclorometano (20 mL) foi adicionada à mistura a 0 a 10Ό. A mistura foi agitada em temperatura am biente durante 2 horas. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi lavada com NaHCOs aq., água, salmoura, secada em Na₂SO₄ e concentrada em vácuo. O produto cru foi destilado em vácuo para proporcionar o intermediário 35 (4,2 g, 42 %) como um óleo incolor.

[00485] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 3,80-3,85 (bs, 2 H),

3,71-3,75 (bs, 2 H), 2,01-2,11 (m, 4 H).

Síntese de composto 1-7.

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162/196

[00486] A uma solução do núcleo 3 (3 g, 6,8 mmol) em DMF (40 ml_) foi adicionado EtaN (2,1 g, 20,6 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, uma solução do intermediário 35 (1,4 g, 7,5 mmol) em DMF (5 ml_) foi adicionada à mistura a 0Ό a 10Ό. A mis tura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada, extraída com metil butil éter terciário para remover as impurezas e filtrada. A massa filtrante foi lavada com água (100 ml_ x 3), dissolvida em diclorometano (200 ml_), lavada com salmoura, secada em NazSCri e concentrada em vácuo para produzir o Composto 1-7 (2,2 g, 58 %) como um sólido laranja.

[00487] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,24 (s, 1 H), 8,06 (s, 1 H), 7,91 (s, 1 H), 7,62-7,66 (m, 2 H), 7,19-7,23 (t, 1 H, J = 8 Hz), 6,84-6,86 (d, 1H, J =8,0 Hz), 6,58-6,61 (t, 1 H, J =6,4 Hz), 5,63-5,66 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 4,70 (s, 2 H), 4,58 (bs, 2 H), 3,90 (bs, 2 H), 3,15 (bs, 4 H), 1,93-1,96 (m, 4 H).

[00488] LC/EM M+1 549,1

Síntese de intermediário 37.

Et₃N, DCM

Trifosgênio

O

37 [00489] A uma solução de cloridrato do intermediário 36 (15 g, 100

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163/196 mmol) em diclorometano (430 ml_) foi adicionado EtaN (30,6 g, 300 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, uma solução de Trifosgênio (11,9 g, 40 mmol) em diclorometano (20 ml_) foi adicionada à mistura a 00 a 100. A mistura foi agitada em temperatura am biente durante 2 horas. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi lavada com NaHCOs aq., água, salmoura, secada em NazSCX e concentrada em vácuo. O produto cru foi destilado em vácuo para proporcionar o intermediário 37 (9,2 g, 52 %) como um óleo incolor.

[00490] ¹H RMN (CDCI₃,400 MHz): δ (ppm) 4,40 (s, 2 H), 3,90-3,94 (d, 2 H, J = 13, 2 Hz), 3,41-3,44 (d, 1 H, J = 13, 2 Hz), 3,23-3,36 (d, 1 H, J = 12,8 Hz), 1,90-2,04 (m, 2 H),1,80-1,86 (m, 2 H).

Síntese de composto 1-8.

o

núcleo 3

Et₃N, DMF

Composto 1-8 [00491] A uma solução do núcleo 3 (3 g, 6,8 mmol) em DMF (40 ml_) foi adicionado EtaN (2,1 g, 20,6 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, uma solução do intermediário 37 (1,3 g, 7,5 mmol) em DMF (5 ml_) foi adicionada à mistura a 00-100. A mistu ra foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (diclorometano / MeOH = 10/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 mL x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secaPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 183/245

164/196 das em Na₂SO₄ e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com diclorometano / MeOH de 200 : 1 a 50 : 1) para produzir o composto 1-8 (2,3 g, 62 %) como um sólido laranja.

[00492] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,24 (s, 1 H), 8,05 (s, 1 H), 7,92 (s, 1 H), 7,60-7,66 (m, 2 H), 7,20-7,24 (t, 1 H, J =7,6 Hz), 6,80-6,82 (d, 1 H, J = 9, 2 Hz), 6,57-6,59 (t, 1HJ = 6,8 Hz), 5,645,67 (d, 1HJ= 10 Hz), 4,60 (s, 2 H), 4,54 (bs, 2 H), 4,19 (s, 2 H), 3,84 (bs, 2 H), 3,20-3,24 (d, 2 HJ = 12,8 Hz), 3,01-3,04 (d, 2 H, J = 12 Hz),1,74 (s, 4 H).

[00493] LC/EM M+1 541,1

Síntese de intermediário 39.

39 [00494] A uma solução do intermediário 38 (20 g, 113 mmol) em MeOH (100 ml_) foi adicionado HCI / MeOH (4 M, 100 ml_), depois foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi concentrada em vácuo. Ao resíduo foi adicionada água (500 ml_), depois extraída com EtOAc (200 ml_ x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas em Na₂SO₄ e concentradas em vácuo para produzir o intermediário cru 39 (21 g) como um sólido castanho, que foi utilizado diretamente na etapa seguinte sem purificação.

Síntese de intermediário 40.

40

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165/196 [00495] A uma solução do intermediário cru 39 (21 g) em MeOH (100 ml_) foi adicionado NH3 / MeOH (6 M, 100 ml_). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi vertida em EtOAc (500 ml_) e depois filtrada. A massa filtrante foi secada em vácuo para produzir 0 intermediário 40 (8 g, 40 % para duas etapas) como um sólido esbranquiçado.

[00496] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 7,86 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,80 (s br, 1 H), 7,72 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,62-7,66 (m, 1 H), 7,37-7,41 (m, 1 H), 7,22 (s br, 1 H), 3,88 (s, 2 H).

Síntese de intermediário 41.

[00497] A uma solução do intermediário 28 (10 g, 26,5 mmol) e intermediário 40 (4,6 g, 26,5 mmol) em DMF (120 ml_) foi adicionada uma solução de tBuOK (7,4 g, 66,2 mmol) em THF (100 ml) a 0-100. A mistura foi agitada a 0-100 durante 15 min. TLC (éter de petróleo / EtOAc =1/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 ml_ x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em NazSOq e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash (eluída com éter de petróleo / EtOAc de 10 : 5 a 1 : 2) para produzir 0 intermediário 41 (5 g, 37,5 %) como um sólido vermelho.

[00498] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,07 (s, 1 H), 8,028,01 (d, 1 H, J = 4 Hz), 8,96 (s, 1 H), 7,61-7,63 (t, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,45 (s, 1 H), 7,17 (s, 1 H), 6,57-6,64 (m, 1 H), 6,47-6,49 (d, 1 H, J = 8 Hz),

5,77-5,80 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 4,73-4,78 (d, 2 H), 4,52 (bs, 2 H), 3,96

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166/196 (bs, 2 Η),1,25-1,44 (m, 9H).

Síntese de intermediário 42.

[00499] A uma solução do intermediário 41 (5g, 9,9 mmol) em diclorometano (50 ml) foi adicionado HCI / dioxano (50 ml, 7M) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. TLC (diclorometano / MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. O solvente foi concentrado para produzir o intermediário 42 (4 g, 92 %) como um sólido laranja.

[00500] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,59 (s, 1 H), 10,46 (s, 1 H), 8,49 (s, 1 H), 8,17 (s, 1 H), 8,08-8,12 (m, 2 H, J = 14 Hz), 7,88-7,92 (t, 1H, J = 8,4 Hz), 7,25-7,29 (t, 1H, J = 13,6 Hz), 7,047,07 (t, 1 H, J = 10 Hz), 6,22-6,25 (m, 1 H), 4,76 (s, 2 H), 4,62 (s, 2 H), 4,45 (s, 2 H), 3,68 (s, 2 H).

Síntese de composto 1-9.

[00501] A uma solução do intermediário 42 (2 g, 4,9 mmol) e cloreto de 1-piperidinacarbonila (1,1 g, 7,4 mmol) em DMF (20 ml) adicionouse EtaN (1,5 g, 14,9 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 min. TLC (diclorometano /

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MeOH = 15/1) indicou que a reação estava completa. A mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (100 mL x 4). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na2SO4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi lavado com metil butil éter terciário e filtrado. A massa filtrante foi secada em vácuo para produzir o composto 1-9 (1,1 g, 43,1 %) como um sólido laranja.

[00502] ¹H RMN (DMSO-c/₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,48 (s, 1 H), 8,23 (s, 1 H), 7,83-7,86 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,68-7,76 (m, 1 H), 7,35-7,39 (t, 1 H, J = 7,6 Hz), 6,89-6,92 (m, 1 H), 6,04-6,07 (m, 1 H), 4,66 (s, 2 H), 4,57-4,65 (bs, 2 H), 3,83-3,90 (m, 2 H), 3,01-3,05 (m,4 H), 1,46-1,49 (m, 6 H).

[00503] LC/EM M+514,1

Síntese de Composto 1-12.

[00504] O Composto 1-12 pode ser sintetizado de uma maneira similar ao Composto I-7 usando 3,3-difluropiperidina como o material de partida.

[00505] ¹H RMN (DMSO-d₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,25 (s, 1 H), 8,06 (s, 1 H), 7,93 (s, 1 H), 7,58-7,66 (m, 2 H), 7,18-7,23 (t, 1 H, J = 8 Hz), 6,81-6,79 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 6,58-6,61 (t, 1 H, J = 6,4 Hz), 5,65-5,67 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 4,66 (s, 2 H), 4,56 (bs, 2 H), 3,88 (bs, 2 H), 3,31 3,64 (bs, 2 H), 3,07 (bs, 2 H), 1,96-2,01 (bs, 2 H), 1,69 (bs, 2 H).

[00506] LC/EM M+1 549,1

Síntese de Composto 1-13.

[00507] Composto 1-13 como mostrado no Esquema Sintético 9.

_Zl Trifosgênio 4 _Q ^Boc^^N X/^NH --------Bocⁿ-<3nEt₃N, DCM ci

44 [00508] A síntese de Intermediário 44 de uma maneira similar ao

Intermediário 47, rendimento 43 %.

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168/196 [00509] ¹H RMN (400 M Hz, CDCI₃) δ 1,47 (9H, s), 1,91-1,94 (2 H, m), 3,37-3,56 (4 H, m), 4,40-4,70 (1 H, m), 4,71-4,74 (1 H, m)

[00510] A síntese de Intermediário 45 de uma maneira similar ao Intermediário 48, cru.

Síntese de Composto 1-13

[00511] A síntese de Composto 1-13 é similar ao Composto 1-19, rendimento 20,7 % para duas etapas.

[00512] ¹H RMN (400 M Hz, DMSO-d₆) δ 1,45-1,48 (1 H, d, J = 9, 2 Hz), 1,54-1,56 (1 H, d, J = 9, 2 Hz), 2,71-2,73 (1 H, d, J = 9, 2 Hz), 2,88-2,90 (1 H, d, J = 8,4 Hz), 2,97-2,99 (1 H, d, J = 9,6 Hz), 3,35-3,37 (1 H, d, J = 8,0 Hz), 3,49 (1 H, s), 3,75-3,76 (1 H, m), 3,90-3,92 (1 H, m), 4,04 (1 H, s), 4,46-4,50 (1 H, m),4,58-4,74 (3 H, m), 5,60-5,62 (1 H, d, J = 8,4 Hz), 6,60-6,63 (1 H, m), 6,78-6,80 (1 H, d, J = 9,6 Hz), 7,207,24 (1 H, m), 7,63-7,66 (2 H, m), 7,90 (1 H, s), 8,06 (1 H, s).

[00513] EM Calculado: 525,5; EM Encontrado: 526,2 [M+1]⁺.

Síntese de Composto 1-14.

[00514] O Composto 1-14 pode ser sintetizado de uma maneira similar ao Composto I-8.

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169/196 [00515] LC/EM M+1 548,2

Síntese de Composto 1-15.

[00516] O Composto 1-15 pode ser sintetizado de uma maneira similar ao Composto I-7.

[00517] LC/EM M+1 556,2

Síntese de Composto 1-16.

[00518] O Composto 1-16 pode ser sintetizado de uma maneira similar ao Composto I-7.

[00519] LC/EM M+1 556,2

Síntese de Composto 1-17.

[00520] O Composto 1-17 pode ser sintetizado de uma maneira similar ao Composto I-7.

[00521] LC/EM M+1 599,2

Síntese de Composto 1-18.

[00522] O Composto 1-18 pode ser sintetizado de uma maneira similar ao Composto I-8.

[00523] LC/EM M+1 591,2

Síntese de Composto 1-19.

/—Trifosgênio o —\

HN /n-Boc--------N'^Boc ^X— ^H Et₃N, DCM Cl

47 [00524] A uma solução do Intermediário 46 (1,0 g, 4,67 mmol) em diclorometano (25 mL) adicionou-se EtaN (1,41 g, 14,0 mmol). A suspensão foi agitada e tratada gota a gota com Trifosgênio (0,55 g, 1,87 mmol) em DCM (5 mL) a 0-10Ό. Depois da adição estar completa, a suspensão foi agitada durante 2 horas em temperatura ambiente. A mistura de reação foi vertida em água gelada (20 mL), extraída com DCM e a camada orgânica foi lavada com NaHCOs (aq), salmoura, secada em NazSCri, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi puPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 189/245

170/196 rificado por cromatografia de coluna em silica gel para produzir o Intermediário 47 (0,6 g, 46,5 %) como um óleo incolor.

[00525] ¹H RMN (400 M Hz, CDCI₃) δ 1,20-1,27 (2 H, m), 1,41 (9H, s), 1,72-1,79 (3 H, m), 2,84-2,90 (1 H, m), 3,03-3,09 (3 H, m), 4,324,35 (2 H, m), 4,66 (1 H, brs).

Síntese de Composto 1-19

[00526] A uma solução de Núcleo 3 (1,0 g, 2,29 mmol) em DMF (13 ml_) adicionou-se EtsN (0,70 g, 6,87 mmol). A suspensão foi agitada e tratada gota a gota com Intermediário 47 (0,70 g, 2,52 mmol) em DMF (2 ml_) a 0-10Ό. Depois da adição estar completa, a suspensão foi agitada durante 2 horas em temperatura ambiente. A mistura de reação foi vertida em água gelada (60 ml_), filtrada e concentrada em vácuo para proporcionar 0 Intermediário 48 (1,0 g, cru) como um sólido vermelho.

Síntese de Composto 1-19

[00527] A uma solução do Intermediário 48 (1,0 g, cru) em DCM (30 ml_) foi adicionado HCI / dioxano (10 ml_, 8 mol / L) em temperatura ambiente, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 hrs. A mistura de reação foi filtrada e a massa filtrante foi dissolvida em água, ajustada em pH 8-9 com NazCOs (aq), novamente filtrada,

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171/196 lavada com água e concentrada em vácuo para produzir o Composto 1-19 (130 mg, 10,5 %, duas etapas) como um sólido vermelho.

[00528] ¹H RMN (400 M Hz, DMSO-d₆) δ 1,03-1,11 (2 H, m), 1,131,62 (3 H, m), 2,44-2,82 (4 H, m), 3,41-3,44 (2 H, m), 3,85 (2 H, m), 4,54 (2 H, m), 4,64 (2 H, m), 5,64-5,66 (1 H, d, J = 9,6 Hz), 6,56-6,58 (1 H, m), 6,78-6,81 (1 H, m), 7,19-7,23 (1 H, m), 7,60-7,66 (2 H, m), 7,92 (1 H, s), 8,06 (1 H, s).

[00529] EM Calculado: 541,6; EM Encontrado: 542,2 ([M+1]⁺.

Síntese de Composto 1-20.

50 [00530] A uma solução do Intermediário 49 (15 g, 130,2 mmol) em DCM (1,5 L) adicionou-se EtaN (19,8 g, 195,3 mmol) e DMAP (0,8 g, 6,5 mmol). A suspensão foi agitada e tratada gota a gota com tercbutilclorodifenilsilano (53,7 g, 195,3 mmol) a 0-10Ό. Após a adição estar completa, a suspensão foi agitada durante 5 horas em temperatura ambiente. A mistura de reação foi vertida em água gelada (500 ml_), extraída com DCM (300 ml_ x 2) e a camada orgânica foi lavada com salmoura (300 ml_ x 2), secada em NazSCU, filtrada e concentrada em vácuo para proporcionar o Intermediário 50. (30 g, cru) como um óleo amarelo.

Síntese de Intermediário 51

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172/196 [00531] A uma solução do Intermediário 50 (30 g, cru, 84,8 mmol) em DCM (900 ml_) adicionou-se Et₃N (25,8 g, 254,5 mmol). A suspensão foi agitada e tratada gota a gota com Trifosgênio (10,1 g, 33,9 mmol) em DCM (50 ml_) a 0-10Ό. Depois da adição estar completa, a suspensão foi agitada durante 2 horas em temperatura ambiente. A mistura de reação foi vertida em água gelada (300 ml_), extraída com DCM e a camada orgânica foi lavada com NaHCO₃ (aq), salmoura, secada em NazSCri, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em silica gel para produzir o Intermediário 51 (3,1 g, 8,8 %) como um óleo incolor.

[00532] ¹H RMN (400 M Hz, CDCI₃) δ 1,05 (9H, s), 1,22-1,29 (2 H, m), 1,78-1,83 (3 H, m), 2,84-2,90 (1 H, m), 3,01-3,07 (1 H, m), 3,503,51 (2 H, d, J = 5,6 Hz), 4,30-4,34 (2 H, m), 7,36-7,45 (6 H, m), 7,627,64 (4 H, m).

Síntese de Intermediário 52

[00533] A uma solução de Núcleo de CF₃ (1,6 g, 3,28 mmol) em DMF (15 ml_) foi adicionado Et₃N (1,0 g, 9,84 mmol). A suspensão foi agitada e tratada gota a gota com Intermediário 51 (1,5 g, 3,60 mmol) em DMF (5 ml_) a 0-10Ό. Depois da adição estar comp leta, a suspensão foi agitada durante 2 horas em temperatura ambiente. A mistura de reação foi vertida em água gelada (80 ml_), filtrada, e a massa filtrante foi lavada com água e concentrou-se MTBE em vácuo para proporcionar o Intermediário 52 (0,98 g, cru) como um sólido vermelho.

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Síntese de Composto 1-20:

Composto 1-20 [00534] A uma solução do Intermediário 52 (0,98 g, cru) em THF (20 ml_) foi adicionado TBAF (0,56 g, 1,77 mmol) em THF (10 ml_) em temperatura ambiente, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas em temperatura ambiente. A mistura de reação foi vertida em água gelada (40 ml_), filtrada e a massa filtrante foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em silica gel para produzir o Composto 1-20 (160 mg, 22,8 %) como um sólido laranja.

[00535] ¹H RMN (400 M Hz, DMSO-d₆) δ 1,05-1,13 (2 H, m), 1,481,58 (3 H, m), 2,54-2,67 (2 H, m), 3,23-3,26 (2 H, m), 3,40-3,44 (2 H, m), 3,87-3,90 (2 H, m)4,44-4,47 (1 H, m) 4,62-4,69 (2 H, m), 4,72 (2 H, s), 6,31 (1 H, s), 6,53-6,56 (1 H, m), 7,14-7,20 (2 H, m), 7,60-7,64 (2 H, m), 7,92 (1 H, s), 8,16 (1 H, s), 11,29 (1 H, s).

[00536] EM Calculado: 592,6; EM Encontrado: 593,2 ([M+1]⁺.

Síntese de Composto 1-21.

[00537] A síntese do Intermediário 53 de uma maneira similar ao

Intermediário 52. A síntese do Núcleo de CN pode ser preparada a

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174/196 partir do Núcleo 1 por deslocamento de Br utilizando condições descritas no Esquema 3 seguido de desbloqueio como condições de utilização como descrito para o Núcleo 1 para o intermediário 10.

Síntese de Composto 1-21

[00538] A síntese de Composto 1-21 é de uma maneira similar à etapa final na síntese de Composto I-20, rendimento 28,6 %.

[00539] ¹H RMN (400 M Hz, DMSO-d₆) õ 1,08-1,13 (2 H, m), 1,471,56 (1 H, m), 1,56-1,59 (2 H, m), 2,58-2,65 (2 H, m), 3,23-3,26 (2 H, m), 3,40-3,43 (2 H, m), 3,86 (2 H, s), 4,45-4,61 (1 H, m),4,61(2 H, s), 4,68 (2 H, s), 6,44 (1 H, s), 6,53-6,57 (1 H, m), 7,19-7,24 (1 H, m), 7,28 (1 H, s), 7,54-7,56 (1 H, d, J= 6,8 Hz), 7,67-7,69 (2 H, d, J= 9, 2 Hz), 7,98 (1 H,s), 8,08 (1 H, s), 11,32 (1 H, s).

[00540] EM Calculado: 549,6; EM Encontrado: 550,2[M+1]⁺.

[00541] Síntese de Compostos 1-22 EM Calculado: 620,14; EM Encontrado: 621,1 [M+1 ]⁺, 23, 24 EM Calculado: 586,14; EM Encontrado: 587,1 [M+1]⁺, 26, 27 [00542] EM Calculado: 584,17; EM Encontrado: 565,1 [M+1 ]⁺, pode ser sintetizada de uma maneira similar ao Composto 1-7.

Síntese de Composto 1-25.

[00543] O Composto 1-25 pode ser sintetizado como mostrado no Esquema Sintético 11.

Síntese de intermediário 55

55

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175/196 [00544] A uma solução do composto 54 (2,3 g, 13,2 mmol) em DCM (30 ml_) adicionou-se EtaN (2,9 g, 29,1 mmol) e BOC2O (3,5 g, 15,9 mmol). Em seguida a mistura foi agitada em T.A. durante 2 horas. TLC (DCM / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura, secada em Na2SO4 e concentrada em vácuo para produzir 0 intermediário 55 (2,3 g, 57,8 %) como um sólido branco.

Síntese de intermediário 56

BnBr, K₂CO₃

[00545] A uma solução do intermediário 55 (2,3 g, 9,7 mmol) em DMF (30 mL) foi adicionado NaH (0,5 g, 13,6 mmol) a 0-100. Em seguida, adicionou-se BnBr (2,5 g, 14,6 mmol) à mistura, após ser agitada em T.A. durante 2 horas. TLC (PE / EtOAc = 3/1) mostrou que a reação estava completa. A reação foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc. A fase orgânica combinada foi lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secada em Na2SÜ4 e concentrada em vácuo para produzir um produto cru, que foi purificado por cromatografia em silica gel para produzir 0 intermediário 56 (2,8 g, 87,5 %) como um sólido branco.

Síntese de intermediário 57

[00546] A uma solução do intermediário 56 (2,8 g, 8,6 mmol) em dioxano (10 mL) foi adicionado HCI / dioxano (7 M, 30 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (PE / EtOAc = 3/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, a mistuPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 195/245

176/196 ra foi concentrada em vácuo para produzir o intermediário 57 (1,9 g, cru) como um óleo amarelo.

Síntese de intermediário 58

Trifosgênio

Et₃N, DCM

[00547] A uma solução do intermediário 57 (1,9 g, cru) em DCM (50 ml) adicionou-se EtsN (2,1 g, 21,1 mmol) a 0-100, depois Trifosgênio (0,8 g, 2,8 mmol) em DCM foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (PE / EtOAc = 5/1) mostrou que a reação estava completa. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com NaHCOs (aq), água, salmoura, secadas em Na₂SO4 e concentradas em vácuo para produzir um produto cru que foi purificado por cromatografia em silica gel para proporciona o intermediário 58 (0,6 g, 24,2 % para duas etapas) como um sólido branco.

[00548] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 7,24-7,36 (m, 5 H), 4,66-5,27 (m, 2 H),4,16-4,55 (m, 2 H), 3,60-3,65 (m, 1 H), 3,23-3,30 (m, 1 H), 3,17-3,21 (m, 1 H), 2,24-2,42 (m, 1 H), 1,94-2,03 (m, 1H).

Síntese de intermediário 59

[00549] A uma solução do núcleo 3 (1,1 g, 2,6 mmol) em DMF (10 mL) adicionou-se EtsN (0,6 g, 6,0 mmol), depois 0 intermediário 58 (0,6 g, 2,0 mmol) em DMF foi adicionado gota a gota a 0-10 °C, a mistura

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177/196 foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. TLC (DCM / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e MTBE, filtrada e a massa filtrante foi lavada com MTBE e concentrada em vácuo para produzir o intermediário 59 (1,0 g, 76,3 %) como um sólido amarelo.

[00550] ¹H RMN (DMSO-d₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,24 (s, 1 H), 8,06 (s, 1 H), 7,89 (s, 1 H), 7,63-7,66 (m, 2 H), 7,26-7,32 (m, 3 H), 7,13-7,22 (m, 3 H), 6,79-6,83 (m, 1 H), 6,56 (t, 1H, J = 6,4 Hz), 5,64-5,67 (m, 1 H), 4,40-4,72 (m, 6 H), 3,87-3,89 (m, 1 H), 3,70-3,79 (m, 2 H), 3,383,39 (m, 1 H), 3,33 (s, 2 H), 3,17-3,16 (m, 1 H), 2,06-2,14 (m, 1 H), 1,86-1,90 (m, 1H).

Síntese de Composto 1-26

[00551] A uma solução do intermediário 59 (1,0 g, 1,5 mmol) em

EtOH (5 ml_) foi adicionado HCI (12M, 10 ml_). A mistura foi aquecida em refluxo durante 4 horas. TLC (DCM / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi resfriada, ajustada em pH 7-8 com NazCOs (aq), filtrada e a massa filtrante foi lavada com MTBE e secada em vácuo para proporcionar o Composto 1-25 (0,4 g, 46,5 %) como um sólido laranja.

[00552] ¹H RMN (DMSO-d₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,24 (s, 1 H), 8,06 (s, 1 H), 7,92 (s, 1 H), 7,63-7,67 (m, 2 H), 7,23 (t, 1 H, J =7,6 Hz), 6,82 (dd, 1H, J = 2,0 Hz , 9,6 Hz), 6,62 (t, 1H, J = 6,4 Hz), 5,75-5,76 (m, 1

H), 5,65 (dd, 1H, J = 2,4 Hz , 10,0 Hz),4,65-4,74 (m, 2 H), 4,49-4,62 (m, 2 H), 3,83-3,95 (m, 2 H), 3,67-3,69 (m, 1 H), 3,16-3,25 (m, 2 H),

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3,05-3,10 (m, 2 Η), 2,07-2,14 (m, 1 Η), 1,86-1,88 (m, 1H).

[00553] EM Calculado: 564,17; EM Encontrado: 565,1 [M+1 ]⁺, Síntese de Composto 1-28.

[00554] O Composto 1-28 EM Calculado: 513,19; EM Encontrado:

514,2 [M+1 ]⁺pode ser sintetizado como mostrado no Esquema Sintético 12. O intermediário 60 convertido no Intermediário 61 que é transportado para o Composto I-28 utilizando as condições descritas para o Intermediário 2 ao Intermediário 3 e Intermediário 28 para o Núcleo 3 e Nero 3 para o Composto 1-1.

Síntese de intermediário 61.

[00555] A uma solução de 60 (10 g, 91,7 mmol) em POCI3 (200 mL) adicionou-se malonato de dietila (73,4 g, 458,3 mmol). A mistura de reação foi aquecida em refluxo e agitada durante 3 horas. Após resfriamento, a mistura de reação foi vertida em água gelada, adicionou-se NaHCOs até pH = 7 - 8, extraiu-se com EtOAc. A fase orgânica foi lavada com salmoura, secada em Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash para produzir 61 (1,8 g, 9,5 %) como um sólido branco.

[00556] ¹H RMN (DMSO-d₆): δ (ppm) 8,43 (d, 1 H, J = 6,8 Hz), 7,75 (d, 1 H, J = 9, 2 Hz), 7,37-7,41 (t, 1 H), 6,99-7,02 (t, 1 H), 4,41 (s, 2 H), 4,10-4,16 (q, 2 H), 1,17-1,21 (t, 3 H).

[00557] A síntese do Composto 1-29 e do Composto 30 pode ser sintetizada de uma maneira similar ao material não deuterado utilizando os materiais de partida deuterados apropriados.

Síntese de Composto 1-31.

[00558] O Composto 1-31 pode ser sintetizado como mostrado no

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Esquema Sintético 13.

Síntese de intermediário 65

66 [00559] A uma solução do composto 65 (5,0 g, 23,5 mmol) em THF (50 mL) adicionou-se TMSCF3 (4,0 g, 28,2 mmol) e TBAF (28,2 mL,

28,2 mmol) a 00. Em seguida a mistura foi aquecida e agitada a 300 durante 3 horas. TLC (PE / EtOAc =1/1) mostrou que a reação estava completa. A mistura foi vertida em água gelada e extraída com EtOAc (40 mL x 3). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura, secada em Na₂SO₄ e concentrada em vácuo para produzir o intermediário 66 (6 g, cru) como um óleo amarelo.

[00560] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 4,10-4,16 (m, 2 H), 3,76-3,77 (m, 1 H), 2,70-2,71 (m, 2 H), 2,21 (d, 1 H, J =6,0 Hz), 1,851,89 (m, 2 H), 1,56-1,64 (m, 1 H), 1,53-1,54 (m, 3 H), 1,46 (s, 9H).

Síntese de intermediário 67

67 [00561] A uma solução do intermediário 66 (5 g, 17,7 mmol) em DMF (50 mL) foi adicionado NaH (1,0 g, 24,7 mmol) a 0-100 e depois BnBr (4,5 g, 26,5 mmol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (PE / EtOAc = 2/1) mostrou que a reação estava completa. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secadas em Na₂SO₄ e concentradas em vácuo para

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180/196 proporcionar o intermediário 67 (7,5 g, cru) como um óleo amarelo.

Síntese de intermediário 68

Bn

68

[00562] A uma solução do intermediário 67 (7,5 g, cru) em dioxano (10 ml_) foi adicionado HCI / dioxano (7 M, 50 ml_), depois a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3 h. TLC (PE / EtOAc = 2/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida a mistura foi concentrada em vácuo para produzir o intermediário 68 (6,6 g, cru) como um óleo amarelo.

Síntese de intermediário 69

Trifosgênio Et₃N, DCM

H 68 θ9 [00563] A uma solução do intermediário 68 (6,6 g, cru) em DCM (130 ml_) adicionou-se EtsN (6,5 g, 63,9 mmol) a 0-10Ό, depois Trifosgênio (2,5 g, 8,5 mmol) em DCM (20 ml) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (PE / EtOAc = 5/1) mostrou que a reação estava completa. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com NaHCOs (aq), água, salmoura, secadas em Na₂SO₄ e concentradas em vácuo para produzir um produto cru que foi purificado por cromatografia em silica gel para produzir o intermediário 69 (2,0 g, 33,8 % para três etapas) como um sólido branco.

[00564] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 7,32-7,41 (m, 5 H),

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4,86 (d, 1 H, J = 11,2 Hz), 4,52 (d, 1 H, J = 11,2 Hz), 4,33 (d, 2 H, J = 12,4 Hz), 3,55-3,57 (m, 1 H), 3,00-3,03 (m, 1 H), 2,81-2,84 (m, 1 H), 1,89-1,97 (m, 2 H), 1,61-1,64 (m, 1 H), 1,45-1,53 (m, 2 H).

Síntese de intermediário 70

[00565] A uma solução do núcleo 3 (2,3 g, 5,4 mmol) em DMF (40 ml_) adicionou-se EtaN (1,6 g, 16,2 mmol), depois o intermediário 69 (2,0 g, 6 mmol) em DMF (10 ml) foi adicionado gota a gota a 0-10Ό, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (DCM / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada, filtrada e a massa filtrante foi lavada com MTBE e concentrada em vácuo para produzir o intermediário 70 (0,7 g, 17,9 %) como um sólido vermelho.

[00566] ¹H RMN (DMSO-d₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,25 (s, 1 H), 8,06 (s, 1 H), 7,92 (s, 1 H), 7,59-7,65 (m, 2 H), 7,32-7,37 (m, 5 H), 7,15-7,20 (m, 1 H), 6,73 (dd, 1 H, J = 2,0 Hz, 9,6 Hz), 6,54-6,56 (m, 1 H), 5,63 (dd, 1 H, J = 2,4 Hz, 10,0 Hz), 4,74 (d, 1 H, J = 11,2 Hz), 4,54-4,64 (m, 5 H), 4,01 (t, 1 H J = 4,8 Hz), 3,84-3,86 (m, 2 H), 3,41-3,46 (m, 2 H), 2,63-2,65 (m, 2 H), 1,75-1,90 (m, 1 H),1,53-1,62 (m, 2 H), 1,37-1,40 (m, 2 H).

Síntese de Composto 1-31

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[00567] A uma solução do intermediário 70 (0,7 g, 1,0 mmol) em EtOH (20 ml_) foi adicionado HCI (12M, 10 ml_). A mistura foi aquecida em refluxo durante 5 horas. TLC (D / M = 10/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida a mistura foi resfriada, ajustada em pH 7-8 com NazCCh (aq), filtrada, e a massa filtrante foi lavada com MTBE e concentrada em vácuo para produzir o Composto 1-31 (211 mg, 30 %) como um sólido amarelo.

[00568] ¹H RMN (DMSO-d₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,25 (s, 1 H), 8,06 (s, 1 H), 7,92 (s, 1 H), 7,59-7,67 (m, 2 H), 7,18-7,22 (m, 1 H), 6,77-6,79 (m, 1 H), 6,55 (t, 1 H, J = 6,8 Hz), 6,17 (d, 1 H, J = 7, 2 Hz), 5,64 (dd, 1 H, J = 2,0 Hz, 10,0 Hz), 4,64 (s, 2 H), 4,56 (s, 2 H), 3,77-3,85 (m, 3 H), 3,42-3,46 (m, 2 H), 2,59-2,67 (m, 2 H), 1,73-1,74 (m, 1 H), 1,60 (bm, 1 H), 1,36-1,52 (m, 3 H).

[00569] EM Calculado: 610,2; EM Encontrado: 611,2 [M+1 ]⁺

Síntese de Composto 1-32.

[00570] O Composto 1-32 EM Calculado: 555,24; EM Encontrado:

556.2 [M+1]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do Composto 1-19.

Síntese de Composto I-33.

[00571] O Composto 1-33 EM Calculado: 569,26; EM Encontrado:

570.2 [M+1]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do Composto 1-8.

Síntese de Composto 1-34.

[00572] O Composto 1-34 EM Calculado: 527,21; EM Encontrado:

528,1 [M+1]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

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Composto 1-19.

Síntese de Composto I-35.

[00573] O Composto I-35 EM Calculado: 541,22; EM Encontrado:

542.1 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

Composto 1-19.

Síntese de Composto I-36.

[00574] O Composto I-36 EM Calculado: 555,24; EM Encontrado:

556.2 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

Composto 1-8.

Síntese de Composto 1-37.

[00575] O Composto 1-37 pode ser sintetizado como mostrado no

Esquema Sintético 14.

Síntese de intermediário 72

2,4-dimetoxi„ . / \ benzaldeído

Boc-N )—\ ---------^X' NH₂ NaBHAc₃

[00576] A uma solução do composto 71 (5,0 g, 23,3 mmol) em THF (300 ml_) foi adicionado 2,4-dimetoxibenzaldeído (3,9 g, 23,3 mmol), depois a mistura foi agitada em T.A. durante 2 h. NaBHAcs (7,4 g, 35 mmol) foi adicionado lentamente a 0Ό. Em seguida, a mistura foi agitada em T.A. durante 3 horas. TLC (DCM / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. A camada orgânica foi lavada com salmoura, secada em Na₂SO₄ e concentrada em vácuo para produzir o intermediário 72 (9 g, cru) como um óleo amarelo.

Síntese de intermediário 73

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184/196 [00577] A uma solução do intermediário 72 (9,0 g, impuro) em DCM (300 ml) adicionou-se EtsN (7,5 g, 74,1 mmol) a 0-100, depois Trifosgênio (2,9 g, 9,9 mmol) em DCM (30 ml) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (PE / EtOAc = 3/1) mostrou que a reação estava completa. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com NaHCOs (aq), água, salmoura, secadas em Na2SÜ4 e concentradas em vácuo para produzir um produto cru, que foi purificado por cromatografia em silica gel para produzir o intermediário 73 (3,0 g, 30 % para duas etapas) como óleo amarelo.

[00578] ¹H RMN (CDCI₃, 400 MHz): δ (ppm) 7,07-7,19 (m, 1 H), 6,45-6,49 (m, 2 H),4,65 (s, 1 H), 4,54 (s, 1 H), 4,09-4,14 (m, 2 H), 3,81 (s, 3 H), 3,80 (s, 3 H,), 3,29 (d, 1 H, J = 6,8 Hz), 3,14 (s, 1 H), 2,64-2,67 (m, 2 H), 1,90-1,91 (m, 1 H), 1,60-1,66 (m, 2 H),1,46 (s, 9 H), 1,12-1,18 (m, 2 H).

Síntese de intermediário 74

[00579] A uma solução do núcleo 3 (2,8 g, 6,4 mmol) em DMF (30 ml) adicionou-se EtsN (1,9 g, 19,2 mmol), depois 0 intermediário 73 (3,0 g, 7,0 mmol) em DMF (5 ml) foi adicionado gota a gota a 0-100, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. TLC (DCM / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. A mistura foi vertida em água gelada e MTBE e filtrada, e a massa filtrante foi lavada com MTBE e concentrada em vácuo para produzir 0 intermediPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 204/245

185/196 ário 74 (1,2 g, 24 %) como um sólido amarelo.

[00580] ¹H RMN (DMSO-d₆, 400 MHz): δ (ppm) 11,23 (s, 1 H), 8,09 (s, 1 H), 7,91 (s, 1 H), 7,57-7,64 (m, 2 H), 7,08 (t, 1 H, J =8,0 Hz), 6,98 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 6,71 (dd, 1H, J = 1,6 Hz, 9, 2 Hz), 6,49 (d, 1H, J = 2,0 Hz ), 6,42-6,45 (m, 2 H), 5,59-5,62 (m, 1 H),4,65 (s, 2 H), 4,53 (s, 2 H), 4,14 (s, 2 H), 3.,82-3,88 (m, 4 H), 3,72 (s, 3 H), 3,62 (s, 3 H), 2,75 (d, 2 H, J =6,8 Hz), 2,50-2,51 (m, 2 H), 1,58 (s, 1 H), 1,42-1,45 (m, 2

H),1,34 (s, 9 H), 0,71-0,75 (m, 2 H).

Síntese de Composto 1-37

[00581] A uma solução do intermediário 74 (1,2 g, 1,5 mmol) em DCM (30 ml_) foi adicionado HCI / dioxano (7 M, 10 ml_). A mistura foi agitada em T.A. durante 2 horas. TLC (DCM / MeOH = 10/1) indicou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi vertida em água gelada e filtrada, e a massa filtrante foi dissolvida com água ajustada em pH 7-8 com NazCOs (aq), filtrada novamente, e a massa filtrante foi lavada com MTBE e secada em vácuo para produzir o Composto 1-37 (0,27 g, 32,9 %) como um sólido vermelho.

[00582] ¹H RMN (DMSO-d₆, 400 MHz): δ (ppm) 8,07 (s, 1 H), 7,90 (s, 1 H), 7,64 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 7,19-7,23 (m, 1 H), 6,76-6,78 (m, 1 H), 6,58-6,62 (t, 1 H), 6,50 (s, 1 H), 5,66 (dd, 1 H, J = 2,0 Hz, 10,0 Hz), 4,78 (s, 2 H), 4,53 (s, 2 H), 3,90 (bm, 2 H), 2,84 (s, 4 H), 2,30-2,36 (m, 2 H),1,41 (bd, 3 H, J = 10,8 Hz), 0,84-0,92 (m, 2 H).

[00583] EM Calculado: 541,22; EM Encontrado: 542,2 [M+1]⁺

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Síntese de Composto 1-38.

[00584] O Composto 1-38 EM Calculado: 555,24; EM Encontrado:

556.2 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

Composto 1-19.

Síntese de Composto I-39.

[00585] O Composto I-39 EM Calculado: 569,26; EM Encontrado:

570.3 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

Composto 1-8.

Síntese de Composto 1-40.

[00586] O Composto 1-40 EM Calculado: 539,21; EM Encontrado:

540.2 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

Composto 1-8.

Síntese de Composto 1-41.

[00587] O Composto 1-41 EM Calculado: 581,26; EM Encontrado:

582.3 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

Composto 1-8.

Síntese de Composto 1-42.

[00588] O Composto 1-42 EM Calculado: 581,26; EM Encontrado:

582,3 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

Composto 1-8.

Síntese de Composto 1-43.

[00589] O Composto 1-43 EM Calculado: 636,14; EM Encontrado:

637.1 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

Composto 1-18.

Síntese de Composto I-44.

[00590] O Composto I-44 EM Calculado: 614,17; EM Encontrado:

615.1 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do

Composto 1-18.

Síntese de Composto I-45.

[00591] O Composto 1-45 EM Calculado: 562,24; EM Encontrado:

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563.3 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do Composto 1-36.

Síntese de Composto 1-46.

[00592] O Composto 1-46 EM Calculado: 576,26; EM Encontrado:

577.3 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do Composto 1-39.

Síntese de Composto 1-47.

[00593] O Composto 1-47 EM Calculado: 588,26; EM Encontrado:

589.3 [M+1 ]⁺ pode ser sintetizado de uma maneira similar à síntese do Composto 1-42.

Síntese de Composto 1-48.

[00594] O Composto 1-48 EM Calculado: 530,19; EM Encontrado:

531,2 [M+1]⁺pode ser sintetizado como mostrado no Esquema Sintético 15 para produzir o Intermediário 79. O Intermediário 79 é transportado para o produto final como mostrado no Esquema 6 (Intermediário 23 ao núcleo 3) e Esquema 8 (Intermediário 42 ao Intermediário

I-9).

Síntese de Intermediário 76

[00595] A uma solução do Intermediário 75 (20 g, 98,5 mmol) em THF seco (130 ml_) adicionou-se BHa.MezS (10 M, 49 ml_, 492,6 mmol) em T.A. sob N2. A mistura foi agitada em TA durante 2 horas e depois aquecida a 50Ό durante 1 hora. TLC (DCM / MeOH = 5/1) indicou que a reação estava completa. A mistura foi resfriada em T.A., e MeOH (50 mL) foi adicionado lentamente a 00, a mistura foi concentrada para produzir 0 Intermediário 76 cru (20 g, > 100 %) como um sólido amarelo.

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188/196 [00596] ¹H RMN (DMSO-d₆): δ (ppm) 8,32 (dd, 1 H, J = 7, 2 Hz, 10,4 Hz), 7,80 (dd, 1 H, J =8,0 Hz,11,6 Hz), 5,77-5,79 (t, 1 H), 4,82 (d, 2 H, J =3,6 Hz).

Síntese do Intermediário 77.

77

Síntese de Composto 1-46.

[00597] A uma solução do Intermediário 76 (20 g, cru) em THF (300 ml_) foi adicionado ΜπΟς (42,8 g, 492,5 mmol) em T.A. sob N2. A mistura foi agitada a 800 durante 5 horas. TLC (PE I EtOAc = 5/1) mostrou que a reação estava completa. Em seguida, a mistura foi filtrada e concentrada para produzir 0 Intermediário 77 (20 g, > 100 %) como um óleo amarelo. ¹H RMN (DMSO-de): δ (ppm) 10,17 (s, 1 H), 8,45-8,50 (dd, 1 H, J =6,8 Hz, 10,0 Hz), 7,99-8,04 (dd, 1 H, J =8,0 Hz, 10,0 Hz).

Síntese do Intermediário 78.

78 [00598] A uma solução do Intermediário 77 (20 g, cru) em tolueno seco (180 ml_) foram adicionados n-BuOH (26 g) e TsOH (2 g) em T.A. A mistura de reação foi agitada a 120TD durante 3 h. E removida a água usando um aparelho de Dean-stark. TLC (PE / EtOAc = 5/1) mostrou que a reação estava completa. A mistura foi concentrada em vácuo para produzir um composto cru. O composto cru foi purificado por cromatografia em silica gel (PE / EtOAc = 1:0 - 200 : 1) para proPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 208/245

189/196 porcionar o Intermediário 78 (15 g, 48 % para três etapas) como um óleo amarelo.

[00599] ¹H RMN (DMSO-d₆): δ (ppm) 8,22-8,27 (dd, 1 H, J = 7, 2 Hz, 10,0 Hz), 7,63-7,68 (dd, 1 H, J = 8,4 Hz,11, 2 Hz), 5,88 (s, 1 H), 3,47-3,59 (m, 4 H), 1,47-1,54 (m, 4 H), 1,27-1,40 (m, 4 H), 0,83-0,89 (m, 6 H).

Síntese do Intermediário 79.

Y NO₂

CH(OBu)₂ [00600] A uma solução do Intermediário 78 (15 g, 47,3 mmol) em THF (450 mL) foi adicionada solução de brometo de vinilmagnésio (1 M, 189 mL, 189,2 mmol) gota a gota a -40Ό sob N2. A mistura foi agitada a -40Ό durante 1 h. TLC (PE / EtOAc = 5/1) mostrou que a reação estava completa, adicionou-se NH4CI aq. a -400 a 00, extraiu-se com EtOAc e concentrou-se para produzir um composto cru. O composto cru foi purificado por cromatografia em silica gel para proporcionar 0 composto (10 g) como um óleo amarelo. A uma solução do composto (10 g) em EtOAc (100 mL) foi adicionado HCI (0,5 N, 100 mL) gota a gota. A mistura foi agitada em T.A. durante 1 hora. TLC (PE / EtOAc = 5/1) mostrou que a reação estava completa. A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura, secada com Na2SO4, filtrada e concentrada em vácuo para proporcionar 0 Intermediário 79 (6 g, 70,5 %) como um sólido amarelo.

[00601] ¹H RMN (DMSO-d₆): δ (ppm) 11,99 (s, 1 H), 10,08 (s, 1 H),

7,89-7,94 (dd, 1 H, J =7,6 Hz, 10,8 Hz), 7,54 (d, 1 H, J =3, 2 Hz), 6,72 (d, 1 H, J =3, 2 Hz)

Exemplos Biológicos

Ensaio:

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 209/245

190/196 [00602] Atividades enzimáticas utilizando GSK3 humana recombinante utilizando um ensaio enzimático in vitro para inibição de GSK3a e GSK3p.

Enzimas e Substratos:

Ensaio Enzima Usada (ng)/Reação Substrato/ATP

GSK3a 13 0,1 mg/ml GSKtide/ATP a 10 uM

GSK3p 13 0,1 mg/ml GSKtide/ATP a 10 uM

Condições de Ensaio:

[00603] O ensaio foi realizado utilizando um kit de ensaio de cinase de luminescência Kinase-Glo Max (Promega). Ele mede a atividade de cinase quantificando a quantidade de ATP remanescente na solução após uma reação de cinase. O sinal luminescente do ensaio está correlacionado com a quantidade de ATP presente e está inversamente correlacionado com a quantidade de atividade de cinase. Os compostos foram diluídos em 10 % de DMSO e 5 μΙ da diluição foram adicionados a uma reação de 50 μΙ, de modo que a concentração final de DMSO foi de 1 % em todas as reações. As reações enzimáticas foram realizadas a 300 por 40 minutos. A mistura de reação de 50 μΙ contém 40 mM de Tris, pH 7,4, 10 mM de MgCL, 0,1 mg / ml de BSA, 2 mM de DTT, 0,1 mg / ml de substrato de GSKtide, 10 μΜ de ATP e GSK3. Após a reação enzimática, foram adicionados 50 μΙ da solução de ensaio de cinase de Luminescência Kinase-Glo Max (Promega) a cada reação, e a placa incubada por 15 minutos em temperatura ambiente. O sinal de luminescência foi medido usando um leitor de microplacas BioTek Synergy 2.

Análise de dados:

[00604] Os ensaios de atividade de cinase foram realizados em duplicata em cada concentração. Os dados de luminescência foram analisados usando o software de computador Graphpad Prism. A diferença entre intensidades de luminescência na ausência de Cinase (Lut) e na presença de Cinase (Luc) foi definida como 100 % de atividade (Lut

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 210/245

191/196

- Luc). Utilizando o sinal de luminescência (Lu) na presença do composto, a % de atividade foi calculada como: % de atividade = {(Lut - Lu) / (Lut - Luc)} x 100 %, onde Lu = intensidade de luminescência na presença do composto (todas as percentagens abaixo de zero foram mostradas na tabela).

[00605] Os valores de % de atividade versus uma série de concentrações de compostos foram então plotados usando uma análise de regressão não linear da curva dose-resposta Sigmoidal gerada com a equação Y = B + (TB) /1+10 ((LogEC50-X) Declividade de Hill), onde Y = atividade percentual, B = atividade percentual mínima, T = atividade percentual máxima, X = logaritmo do composto e Declividade de Hill = fator de declividade ou coeficiente de Hill. O valor de IC50 foi determinado pela concentração causando metade da atividade percentual máxima.

[00606] Tabela de atividade para os compostos vs GSK-alfa e GSKbeta:

[00607] A tabela abaixo mostra a atividade de certos compostos. Para potência, + indica maior que cerca de 1 μΜ; ++ indica cerca de 100 nM a 1 μΜ; +++ indica cerca de 10 nM a 100 nM e ++++ indica cerca de 1 nM a 10 nM.

Composto	Potência Alfa	Potência Beta
Composto 1-1	++++	++++
Composto I-2	++++	++++
Composto I-3	++++	++++
Composto I-4	++++	++++
Composto I-6	++++	++++
Composto I-7	++++	++++
Composto I-8	++++	++++
Composto I-9	+++	++++
Composto 1-10	++++	++++

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 211/245

192/196

Composto	Potência Alfa	Potência Beta
Composto 1-12	++++	++++
Composto 1-13	++++	++++
Composto 1-14	++++	++++
Composto 1-15	++++	++++
Composto 1-16	++++	++++
Composto 1-17	++++	++++
Composto 1-18	++++	++++
Composto 1-19	++++	++++
Composto I-20	++++	++++
Composto 1-21	++++	++++
Composto I-22	++++	++++
Composto I-24	++++	++++
Composto I-25	++++	++++
Composto I-27	++++	++++
Composto I-28	++++	++++
Composto 1-31	++++	++++
Composto I-32	++++	++++
Composto I-33	++++	++++
Composto I-34	++++	++++
Composto I-35	++++	++++
Composto I-36	++++	++++
Composto I-37	++++	++++
Composto I-38	++++	++++
Composto I-39	++++	++++
Composto I-40	++++	++++
Composto 1-41	++++	++++
Composto I-42	++++	++++
Composto I-43	++++	++++
Composto I-44	++++	++++
Composto I-45	++++	++++
Composto I-46	++++	++++

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 212/245

193/196

Composto	Potência Alfa	Potência Beta
Composto 1-47	++++	++++
Composto 1-48	++++	++++

Ensaio: Cepas de Camundongo [00608] Os camundongos Lgr5-EGFP-IRES-Cre-ER (Barker et al., 2007) (http://jaxmice.jax.org/strain/008875.html) são utilizados para analisar os efeitos das moléculas pequenas na expansão da célulatronco coclear.

[00609] Isolamento de células-tronco do ouvido interno: Todos os estudos com animais são conduzidos sob um protocolo institucional aprovado de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health. Para experimentos com camundongos neonatais (dias pós-natais 1-3), as cócleas são dissecadas em HBSS e o Órgão de Corti é separado da estria vascular e do modíolo. Os órgãos de Corti são, em seguida, tratados com Cell Recovery Solution (Corning) por 1 h para separar o epitélio coclear do mesênquima subjacente. Os epitélios são, em seguida, recolhidos e tratados com TrypLE (Life Technologies) durante 15-20 minutos a 370. As células individuais obtidas por trituração mecânica são filtradas (40 pm) e suspensas em Matrigel (Corning) para cultura 3D.

Expansão de Células Positivas para Lgr5 [00610] As células são cultivadas em uma mistura de 1: 1 de DMEM e F12, suplementada com Glutamax (GIBCO), N2, B27 (Invitrogen), EGF (50 ng/ml; Chemicon), bFGF (50 ng/ml; Chemicon), IGF1 (50 ng/ml; Chemicon) e a composição aqui fornecida. Os meios são mudados a cada dois dias.

[00611] A diferenciação de colônias celulares de Células Progenitoras - Células Tronco Positivas para Lgr5 são diferenciadas em uma mistura de 1:1 de DMEM e F12, suplementada com Glutamax (GIBPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 213/245

194/196

CO), N2, B27 (Invitrogen), com adição de fármacos específicos ou após a remoção de fatores de crescimento sem adição de fármaco. Moléculas pequenas são adicionadas à cultura para testar seu efeito sobre a diferenciação.

Análise [00612] As células positivas para Lgr5 são quantificadas após 10 dias (D10) em cultura em múltiplas condições. As colônias celulares são dissociadas em células únicas usando TrypLE (Gibco). As células são em seguida coradas com iodeto de propídio (PI) e são analisadas usando um citômetro de fluxo para a expressão de Lgr5-GFP. O número de células positivas para GFP e a percentagem de células positivas para GFP é quantificado.

[00613] As células positivas para Atoh1-nGFP são quantificadas no dia 0 (DO) e no dia 10 (D10) do tratamento de diferenciação para determinar o número de células ciliadas que tem se diferenciado. Colônias de células são incubadas em Cell Recovery Solution para liberar as colônias de Matrigel e dissociadas em células individuais usando TrypLE. O número total e a percentagem de células positivas para GFP são quantificadas utilizando um citômetro de fluxo para múltiplas condições de cultura. ANOVA é usado para comparar os meios através das condições, e o teste t de Student bicaudal é usado para comparar cada condição com o tratamento com o maior rendimento.

[00614] A tabela aqui mostra a atividade de certos compostos. Para potência, + indica maior que cerca de 1 μΜ;++ indica cerca de 100 nM a 1 μΜ; e +++ indica cerca de 1 nM a 100 nM. Para o % de células, + indica cerca de 0-5%;++ indica cerca de 6-10%; e +++ indica maior que cerca de 11 %.

Composto	Potência	% de células
Composto 1-1	+++	+++
Composto I-2	+++	+++

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 214/245

195/196

Composto	Potência	% de células
Composto 1-3	+++	+++
Composto 1-4	++	+++
Composto 1-6	+++	+++
Composto 1-7	+++	++
Composto 1-8	+++	+++
Composto 1-9	+	+++
Composto 1-10	+	+
Composto 1-12	+++	+++
Composto 1-13	+	+++
Composto 1-14	+	+
Composto 1-15	+	++
Composto 1-16	++	+++
Composto 1-17	+	+
Composto 1-19	+	+++
Composto I-20	+	+++
Composto 1-21	+	+++
Composto I-22	+++	++
Composto I-24	+++	++
Composto I-27	+++	+++
Composto 1-31	+++	+++
Composto I-32	+	+++
Composto I-33	++	+++
Composto I-34	+	++
Composto I-35	+	+
Composto I-37	+	+
Composto I-38	+	+
Composto I-40	+	+
Composto 1-41	+	+++

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 215/245

196/196

Composto	Potência	% de células
Composto 1-41	+	+++
Composto I-43	++	+++
Composto I-44	++	+++
Composto I-48	+++	++

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 216/245

Claims

1/24

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de que possui a Fórmula (I):

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, em que:

Q¹ éCH ou N;

Q² é C ou N;

Q³ é C ou N;

em que pelo menos um dentre Q¹, Q², e Q³ é N;

R¹ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^1a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^1a é Ci-C4alquila;

R² é selecionado a partir do grupo consistindo em halo, C1C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -O-Ci-C4alquila, NH2, -NH(Ci-C4alquil), -N(Ci-C4alquil)2, -NHC(O)R^2a, e -S(O)2NH₂; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^2a é Ci-C4alquila;

R³ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^3a, e -S(O)2NH₂; em que a alquila é opciPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 217/245

2/24 onalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^3a é Ci-C4alquila;

Ar é selecionado a partir do grupo consistindo em

-Z-W-X-Y- é -C(R^Z)2-C(R^W)2-N(R^X)-C(R^Y)2-, -C(R^z)2-C(R^w)2CH(R^x)-C(R^y)2-, ou -C(R^w)2-CH(R^x)-C(R^y)2-;

cada R^z é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^z juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo;

cada R^w é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^w juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo;

ou R^z e R^w juntamente com os carbonos aos quais eles são ligados formam uma Cs-Cecicloalquila;

R^x é selecionado a partir do grupo consistindo em -COR^X1, SO₂R^X1, heteroarila, e -(Ci-C4alquileno)-(C3-C8cicloalquil), e em que o (Ci-C4alquileno)-(C3-C8cicloalquil) é opcionalmente substitutído com um a quatro halo no Ci-C4alquileno;

em que R^X1 é heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com um a doze substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em deutério, halo, [C(R^x1a)2]p-CN, -CF3, Ci-C4alquila, -(CH2)P-OH, -[C(R^x1a)2]_p-OH, [C(R^x1a)2]p-O-Ci-C4alquila, -NHCOCi-C4alquila, -CONHCi-C4alquila, COH, -CO2H, -[C(R^x1a)2]_p-COO-Ci-C₄alquila, -(CH₂)_P-NH₂, -[C(R^x1a)₂]_pPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 218/245

3/24

NH₂, -[C(R^x1a)2]p-NH-Ci-C4alquila, -[C(R^x1a)2]_p-N-(Ci-C₄alquil)₂; em que p é 0, 1, 2, ou 3; em que cada R^x1a é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, -CF3, e C1C₄alquila, ou ambos R^x1agrupos juntamente formam Cs-Cecicloalquila;

ou R^X1 é N(R^X2)₂ em que R^X2é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, alquila, alquila substituída, em que a substituição de alquila pode ser halo, heterociclos e heterociclos substituídos;

cada R^Y é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C₄alquila, ou ambos grupos R^Y juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo; e m é 0, 1, ou 2;

contanto que 0 composto não seja

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R^x é -COR^X1.

3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R^X1 é piperidina, 2,8-diazaespiro[4,5]decano, 2,5diazabiciclo[2,2,1]heptano, ou 8-oxa-3-azabiciclo[3.2.1]octano, cada dos quais é opcionalmente substitutído com um a doze substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em deutério, halo, Ci-C4alquila, -[C(RX^1a)2]_p-OH, -(CH₂)_p-NMe₂, -(CH₂)_PNHMe, -(CH₂)_p-NH₂; em que p é 0, 1,2, ou 3.

4. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que R^X1 é piperidina, opcionalmente substituída com

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 219/245

4/24 um a seis substituintes de halo.

5. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a piperidina é opcionalmente substitutída com [C(R^x1a)₂]_P-OH, -(CH₂)_P-NMe₂.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R^x é heteroarila.

7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a heteroarila é monocíclica ou bibicíclica.

8. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a heteroarila contém um a três nitrogênios.

9. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R^x é -(Ci-C4alquileno)-(C3-C8cicloalquila).

10. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o -(Ci-C4alquileno)-(C3-C8cicloalquil) é substituído com um ou dois halogênios no Ci-C4alquileno.

11. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a Cs-Cscicloalquila é ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou ciclo-hexila.

12. Composto, caracterizado pelo fato de que possui a Fórmula (Ia):

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, em que:

Q¹ éCH ou N;

Q² é C ou N;

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 220/245

5/24

Q³ é C ou N;

em que pelo menos um dentre Q¹, Q², e Q³ é N;

R¹ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^3a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^1a é Ci-C4alquila;

R² é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C₄alquila, -NH₂, -NH(Ci-C₄alquil), -N(Ci-C₄alquil)₂, -NHC(O)R^2a, e S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^2a é C1 -C4alquiIa;

R³ é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C4alquila, -NH2, -NHC(O)R^3a, e -S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^3a é Ci-C4alquila;

Ar é selecionado a partir do grupo consistindo em

mente substitutído com deutério, halo, alquila, alcóxi, e CN;

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 221/245

6/24

Q⁷ é selecionado a partir de S, O, CH₂, e NR^Q7; em que R^Q7é hidrogênio ou opcionalmente substituída Ci-C4alquiIa;

R^x é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, R^X1, -COR^X1, -SO₂R^X1, -(Ci-C4alquileno)-R^x1, e em que o -(CiC4alquileno)-R^x1 é opcionalmente substitutído com um a quatro halo no Ci-C4alquileno;

em que R^X1 é Cs-Cscicloalquila, heteroarila, ou heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com um a doze substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em deutério, halo, -[C(R^x1a)2]p-CN, -CF3, Ci-C4alquila, -(CH2)POH, -[C(R^x1a)2]_p-OH, -[C(R^x1a)2]p-O-Ci-C4alquila, -NHCOCi-C4alquila, CONHCi-C4alquila, COH, -CO2H, -[C(R^x1a)2]_p-COO-Ci-C₄alquila, (CH₂)_p-NH₂, -[C(R^x1a)₂]_p-NH₂, -[C(R^x1a)2]p-NH-Ci-C4alquila, -[C(R^x1a)2]_pN-(Ci-C4alquil)₂; em que p é 0, 1, 2, ou 3; em que cada R^x1a é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, -CF3, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^x1a juntamente formam Cs-Cecicloalquila;

ou R^X1 é N(R^X2)₂ em que R^X2 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, alquila, alquila substituída, em que a substituição de alquila pode ser halo, heterociclos e heterociclos substituíPetição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 222/245

7/24 dos;

cada R^Y é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^Y juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo; e m é 0, 1, ou 2.

13. Composto, caracterizado pelo fato de que possui a Fórmula (Ib):

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, em que:

Q¹ éCH ou N;

Q² é C ou N;

Q³ é C ou N;

em que pelo menos um dentre Q¹, Q², e Q³ é N; e contanto que quando Q¹ for CH e Q³ for C, Q² não seja N;

R² é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halo, Ci-C4alquila, Ci-C4alquenila, Ci-C4alquinila, -CN, -OH, -OCi-C₄alquila, -NH₂, -NH(Ci-C₄alquil), -N(Ci-C₄alquil)₂, -NHC(O)R^2a, e S(O)2NH2; em que a alquila é opcionalmente substituída com um a 3

Petição 870190059906, de 27/06/2019, pág. 223/245

8/24 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halo e -OH; e em que R^2a é Ci-C4alquiIa;

Ar é selecionado a partir do grupo consistindo em

n ; em que Ar é opcionalmente substitutído com deutério, halo, alquila, alcóxi, e CN;

cada Q⁶ é independentemente selecionado a partir de CR^Q6e N; em que CR^Q6 é hidrogênio, halo, -CN, alquila inferior, ou alquila substituída;

Q⁷ é selecionado a partir de S, O, CH2, e NR^Q7; em que R^Q7é hidrogênio ou opcionalmente substituída C1 -C4alquiIa;

-Z-W-X-Y- é -C(R^z)2-C(R^w)2-N(R^x)-C(R^y)2-, -C(R^z)₂-C(R^w)2CH(R^x)-C(R^y)2-, ou -C(R^w)2-CH(R^x)-C(R^y)2-;

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9/24 cada R^w é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, e Ci-C4alquila, ou ambos grupos R^w juntamente formam Cs-Cecicloalquila ou oxo;

R^x é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, R^X1, -COR^X1, -SO2R^X1, -(Ci-C4alquileno)-R^x1, e em que o -(CiC4alquileno)-R^x1 é opcionalmente substitutído com um a quatro halo no Ci-C4alquileno;

em que R^X1 é Cs-Cscicloalquila, heteroarila, ou heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com um a doze substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em deutério, halo, -[C(R^x1a)2]P-CN, -CF3, Ci-C4alquila, -(CFkjpOH, -[C(R^x1a)2]_P-OH, -[C(R^x1a)2]p-O-Ci-C4alquila, -NHCOCi-C4alquila, CONHCi-C4alquila, COH, -CO2H, -[C(R^x1a)2]p-COO-Ci-C₄alquila, (CH₂)_p-NH2, -[C(R^x1a)2]P-NH2, -[C(R^x1a)2]p-NH-Ci-C₄alquila, -[C(R^x1a)₂]_PN-(Ci-C4alquil)2; em que p é 0, 1, 2, ou 3; em que cada R^x1a é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, deutério, halo, -CF3, e Ci-C4alquila, ou ambos R^x1a grupos juntamente formam Cs-Cecicloalquila;

ou R^X1 é N(R^X2)₂ em que R^X2 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, alquila, alquila substituída, em que a substituição de alquila pode ser halo, heterociclos e heterociclos substituídos;

14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que Q¹ é CH; Q² é N; e Q³ é C.

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15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que Q¹ é N; Q² é C; e Q³ é N.

16. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que Q¹ é CH; Q² é C; e Q³ é N.

17. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que Q¹ é N; Q² é N; e Q³ é C.

18. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que R¹ é hidrogênio ou halo.

19. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que R² é halo.

20. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que R² é selecionado a partir do grupo consistindo em halo, -CF3, -CN, -C^CH, -NH2, e NHC(O)CH₃.

21. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que R³ é hidrogênio ou halo.

22. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica-

Qf ções 1 e 13 a 21, caracterizado pelo fato de que Ar é n

23. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que -Z-W-X-Y- é -C(R^Z)2C(R^w)2-N(R^x)-C(R^y)₂-.

24. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que -Z-W-X-Y- é -C(R^Z)₂C(R^w)2-CH(R^x)-C(R^y)2-.

25. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 24, caracterizado pelo fato de que cada R^z é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e halo.

26. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 24, caracterizado pelo fato de que ambos grupos R^z junta-

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11/24 mente formam Cs-Cecicloalquila.

27. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que R^z e R^w juntamente com os carbonos aos quais eles são ligados formam uma Cs-Cecicloalquila.

28. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que -Z-W-X-Y- é -C(R^W)2CH(R^x)-C(R^y)₂-.

29. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que cada R^w é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e halo.

30. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que ambos grupos R^w juntamente formam Cs-Cecicloalquila.

31. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que cada R^Y é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e halo.

32. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que ambos grupos R^Y juntamente formam Cs-Cecicloalquila.

33. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 32, caracterizado pelo fato de que R^x é R^X1, em que R^X1 é heteroarila.

34. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 32, caracterizado pelo fato de que R^x é -COR^X1.

35. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 32, caracterizado pelo fato de que R^x é -SO2R^X1.

36. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 32, caracterizado pelo fato de que R^x é -(Ci-C4alquileno)R^X1.

37. Composto de acordo com qualquer uma das reivindica-

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12/24 ções 34 a 36, caracterizado pelo fato de que R^X1 é Cs-Cscicloalquila.

38. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que R^X1 é heterociclila, em que a heterociclila é opcionalmente substitutída com um a doze substituintes que é halo.

39. Composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo consistindo em

Composto 1-1 H /=\ zA cf₃ <\ ,^N~Í V-/A M.; tiJ ⁿ G-N / \ y-^Nv_/ o ; Composto I-2 H Οΐ/Π⁰\—í ,CN N ^N ) \ o ; Composto I-3 H °Gr° Z QícQ N ^N ) \ o ; Composto I-4 H Ά—Γ _/^NH₂ CWc0 N I ) k^Nk o ; Composto I-5 n ^H Qr/_V ^N \ J J N o . o,

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Composto 1-6 n ^H Qrt,, ^N \ J J N Λ~ν o OH j Composto 1-7 H O/^Nv° Λ—Γ y N o ; Composto 1-8 H °Ύ^ΝΧ° M3 Π J 9_-ⁿ N o J o Composto 1-9 H °Ύ^ΝΧ° /=\^/=< T v/« —N / \ y-^Nv_/ ° ; Composto 1-10 H O^^Nx^O h _ZO N N \ ^vO o ; Composto 1-11 H Λ—Λ /CHF2 QicO N ^N ) rO o ; Composto 1-12 ζ-ϊ^ΝΗ/==) o f r^N\X \L ( Ti o ;

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Composto 1-13 N-n ° A=k o r-N, k ^HN\Qn-V^N'^^^f o H J Composto 1-14 N-n O Cú /v^NH Α=η o (zk^No ; Composto 1-15 n-* ° C^^N /-%^NH A=\ o % ÁYll \__,N-Z o ; Composto 1-16 N-n 0 Cú /v^NH A=\ o Aⁿ\Âs 00¼. o ; Composto 1-17 ;Ó^NH /=) o CJCXv ° ^F ; Composto 1-18 N-n O k 1 I A ^NH /=( O r^N\Â ° ; Composto 1-19 N-n O e ^NH A=\ o Cxi ^h ₂N \-W o ;

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Composto 1-20 n-^ ° (j\5^H F=( o /Vô £JOx<^fHO \_P^F ° ; Composto 1-21 N-n ° j5^nh f=( o ( al /—Z \ N HO ° ; Composto I-22 N-n O JvÃ [[ nh v da F -Λ N-Z a 0 Composto I-23 (^^N ;Ó^NH /^Z 0 F Λ^Ν\Α 5a ( al ^{F 0} ; Composto I-24 N-n O r-A XÃ C ^NH /==^ O F Λ^Ν\Α 5a < Γ1 Oa^N^^^F ^{F 0} ; Composto I-25 N-tt O r-Z VÃ Í ^NH Λ=Ζ O a cvi >Z ' wW^F f*A /i-Z ⁰ ;

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Composto 1-26 N O /==\ O ^f\ z-, \ n F-4—/ \ HO VX A ° ; Composto 1-27 N-π O KA [ ^NHjX O ef ^^ΝγΧ ° ; Composto 1-28 H O^^NS^O N-/ \—ζ \ vu CM N N \ ^yC ° ; Composto 1-29 n-^ ° ζ^^Ν MA^NH/=( o Γ, X d. P p _n Γ Y|i ^DdW ^DÍTd ° ; Composto 1-30 N-n 0 X Ã n^X'nh d /=(A ^DShL X ^D>( Ml / \^D n-W^_f\ _zN-Z ⁰ ; Composto 1-31 H \—Γ F Qíc0 ^N ) cf₃ \^n rvA OH ° ;

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Composto 1-32 H O;sZ^N^O N 1 ? ΔΑ--_s ΰ ^H ; Composto 1-33 H O^^Nx^O Λ—Λ ^,F N 1 ) / \--\ J ^N ° ¹ ; Composto 1-34 H \.—Γ .F QíüU N N' \ Γ \-NH₂y-N/ ⁰ ; Composto 1-35 H O=y^NyíO O N [ / ,___ H / y-N. y-N / \ 0 J Composto 1-36 H Ο^ζ^Ν^Ο Λ_Λ f N / Γ \-N y-^Nx_/ ^x O J Composto 1-37 H O^^N\^O QíoJ N^Z ^X_-N H /--y y-^N\ / nh

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Composto 1-38 H O^^N^O \—Γ F N N \ ---N / r---_XΥ^Ν_χ_/ NH o J Composto 1-39 H oVs-sO Λ—Λ /F QAcQ im n'\ A-n / .-- y-N^___Γ N Composto 1-40 o zV o dv \ Composto 1-41 H qíhA N / f / ,___ Γ~ N X_-N / Y \ y-^N\ 0 j Composto I-42 H Λ_Λ F QdToZ? N ^N ) f \ í^NvP O J Composto I-43 H O^^Ns^O Ά=Λ ^/^cf3 l\T f V Y—T-F ° V ;

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Composto 1-44 H OAAO Λ=Λ _z^/^cf3 CnH? N \ ^F\z^F __ O O J Composto 1-45 H cAAo Λ—Λ CN 'x^-N / \-N y-N/ \ O J Composto 1-46 H \—Γ .CN N^X N^Z \ / __Γ o' —¹ J Composto 1-47 o_v ^zAA Λ o z ² z—' / 0 Composto 1-48 0' o O

40. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

41. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que compreende ainda o inibidor de

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HDAC.

42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que compreende ainda o inibidor de TGF beta.

43. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que compreende ainda o inibidor de BMP.

44. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizada pelo fato de que compreende ainda poloxâmero.

45. Método de expandir uma população de célula coclear em um tecido coclear compreendendo uma população origem, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o tecido coclear com um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo ou uma composição farmacêutico como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 44.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o tecido coclear está em um indivíduo.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o contato do tecido coclear com a composição é obtido administrando-se a composição transtimpanicamente ao indivíduo.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o contato do tecido coclear com a composição resulta em melhoria do funcionamento auditivo do indivíduo.

49. Método de facilitar a geração de células de tecido, caracterizado pelo fato de que compreendende administrar ou fazer com que seja administrado a uma população de células-tronco um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um

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21/24 sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 44.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que as células de tecido são células cocleares.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que as células do tecido são células ciliadas do ouvido interno.

52. Método para tratar um indivíduo que tem, ou está em risco de desenvolver, uma doença associada com ausência ou falta de certas células de tecido, caracterizado pelo fato de que compreendende administrar ou fazer com que seja administrado a uma população de células-tronco um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 44.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que as células de tecido são células cocleares.

54. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que as células do tecido são células ciliadas do ouvido interno.

55. Método para tratar um indivíduo que tem, ou está em risco de desenvolver a perda auditiva, caracterizado pelo fato de que compreendendo a administração de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 44.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado transtimpanicamente a um tecido coclear do indivíduo.

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57. Método de facilitar a geração de células ciliadas do ouvido interno, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, sozinho ou em combinação com um inibidor de HDAC, para expandir a população de células-tronco do tecido coclear.

58. Método de regeneração da audição em mamíferos, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, sozinho ou em combinação com um inibidor de HDAC.

59. Método de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que a administração a uma população de célulastronco é de um indivíduo in vivo.

60. Método de geração de células ciliadas do ouvido interno, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, sozinho ou em combinação com um inibidor de HDAC, em que o método prolifera células LGR5+ em uma população inicial in vivo, resultando em uma população expandida de células LGR5+, resultando na geração de células ciliadas do ouvido interno.

61. Método de facilitar a geração de células intestinais, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, sozinho ou em combinação com um inibidor de HDAC, para expandir a população de célulastronco do epitélio intestinal.

62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o epitélio intestinal é regenerado.

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63. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o método é um tratamento para promover o reparo de mucosas danificadas relacionadas com a mucosite gastrointestinal induzida por quimioterapia, Doença do Enxerto Versus Hospedeiro, úlcera gástrica, de Crohn ou colite ulcerativa.

64. Método de expandir a população de células Lgr5+ do epitélio intestinal, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, sozinho ou em combinação com um inibidor de HDAC.

65. Método de uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, sozinho ou em combinação com um inibidor de HDAC, caracterizado pelo fato de ser para regenerar células intestinais da população de células Lgr5+ em mamíferos.

66. Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que compreende um tratamento para promover o reparo de mucosas danificadas relacionadas com mucosite gastrointestinal induzida por quimioterapia, Doença do Enxerto Versus Hospedeiro, úlcera gástrica, de Crohn ou colite ulcerativa.

67. Método de proliferação de células epiteliais Lgr5+ in vivo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

68. Método de expandir uma população de células vestibulares em um tecido vestibular, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o tecido vestibular com (i) um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e (ii) um Inibidor de TGF-β para formar uma população expandida de células no tecido vestibular.

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69. Sistema para o tratamento de um indivíduo que tem ou está em risco de desenvolver uma doença associada com ausência ou falta de certas células de tecido, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de:

um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo; e um dispositivo administrativo trans-timpânico.

70. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de um indivíduo que tem, ou está em risco de desenvolver, uma doença associada com ausência ou falta de certas células de tecido.

71. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de um indivíduo que tem, ou está em risco de desenvolver, perda auditiva.

72. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar um indivíduo que tem, ou está em risco de desenvolver, uma doença associada com ausência ou falta de certas células do tecido.

73. Uso de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou tautômero do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar um indivíduo que tem, ou está em risco de desenvolver, perda auditiva.