CN105263500A - 骨选择性成骨性氧固醇-骨靶向剂 - Google Patents

Abstract

提供用于治疗骨病症的化合物和组合物。提供用于治疗骨病症的氧固醇化合物和组合物。所述化合物是(3S,5S,6S,8R,9S,10R,13S,14S,17S)-17-[(2S)-2-羟基辛-2-基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3,6-二醇与连接于3位、6位或20位的BTA-接头如来自四环素片段的缀合物或衍生物。这些成骨性氧固醇化合物刺激hedgehog信号传导路径。各种接头单元易感于某些酯酶。

Description

骨选择性成骨性氧固醇-骨靶向剂

发明背景

本发明涉及骨病症治疗领域。

发明概述

本发明的一实施方案是一种包含氧固醇-骨靶向剂化合物，如本文阐述的化合物，例如Oxy133-四环素衍生物化合物的组合物。氧固醇-骨靶向剂化合物可包括下式化合物：

其中R₁、R₂和R₃独立地是氢、

和/或并且其中R₄是R₁、R₂和R₃中的至少一个不是氢，并且当R₁和R₃是氢时，那么R₂不是举例来说，R₁、R₂和/或R₃可为氢。举例来说，R₁、R₂和/或R₃可不为氢。R₃可为氢。R₂可为氢，并且R₃可为氢。R₁可为氢，并且R₃可为氢。R₃可为氢，并且R₁可不为氢，并且R₂可不为氢。R₃可为氢，并且R₁和R₂可各自为R₃可为氢，并且R₁和R₂可各自为R₃可为氢，并且R₁和R₂可各自为R₁、R₂和R₃可各自为R₁、R₂和R₃可各自为R₁、R₂和R₃可各自为举例来说，化合物可为

组合物可包括药学上可接受的载体或稀释剂，并且可为药物制剂。本发明的方法包括向可为人或动物的受试者中局部和/或全身施用和/或递送氧固醇-骨靶向剂化合物以治疗骨病症，包括但不限于骨折、骨质疏松和/或骨量減少。本发明的方法包括用氧固醇-骨靶向剂化合物体外处理成骨细胞祖细胞，以及将它们(成骨细胞祖细胞)后续局部和/或全身施用和/或递送至可为人或动物的受试者中以治疗骨病症，包括但不限于骨折、骨质疏松和/或骨量減少。本发明的方法包括向细胞给予和/或施用(如局部和/或全身)氧固醇-骨靶向剂化合物例如以刺激所述细胞中的Hedgehog信号传导路径。细胞可为组织或器官的一部分，并且化合物可被体内施用(局部或全身)。本发明的方法包括通过以下方式来治疗例如将受益于治疗性活化组织或器官中的Hedgehog信号传导路径，可为人或动物的受试者：通过向所述组织或器官的细胞施用氧固醇-骨靶向剂来处理所述细胞，以刺激所述组织或器官的所述Hedgehog信号传导路径。

附图简述

图1显示具有BTA-接头连接物的位点的Oxy133化合物的结构。

图2显示四环素以及由PEG(聚乙二醇)接头和四环素片段形成的BTA接头1的结构。

图3说明各种接头单元对酯酶裂解的相对易感性。

图4显示与氧固醇接触的体外骨髓基质细胞M2-10B4的碱性磷酸酶(ALP)酶活性。

图5显示在与氧固醇初始接触之后4天，由M2-10B4细胞达成的ALP基因体外表达。

图6显示在与氧固醇初始接触之后4天，M2-10B4细胞的骨唾液蛋白(BSP)基因的体外表达。

图7显示在与氧固醇初始接触之后4天，M2-10B4细胞的osterix(OSX)基因的体外表达。

图8显示在与氧固醇初始接触之后4天，M2-10B4细胞的Patched1(Ptch)基因的体外表达。

图9显示在与氧固醇初始接触之后4天，M2-10B4细胞的Hedgehog(Hh)相互作用蛋白(HIP)基因的体外表达。

图10显示不接触以及接触羟磷灰石(HAP)的分析物的浓度。

详细描述

以下详细讨论本发明的实施方案。在描述性实施方案中，为清晰起见采用特定术语。然而，本发明不意图限于如此选择的特定术语。相关领域技术人员将认识到在不脱离本发明的精神和范围下可采用其它等效部分，以及开发其它方法。

本申请要求2013年5月2日提交的美国临时申请号61/818,825的权益，所述美国临时申请据此以引用的方式整体并入本文。

骨质疏松是一种影响超过1000万美国人的常见代谢骨疾病，其中接近50％是年长女性，并且超过10％是年长男性群体(T.D.Rachner等,Lancet2011,377,1276-1287；B.C.Silva等,Annu.Rev.Med.2011,62,307-322；G.P.Lyritis等,Ann.N.Y.Acad.Sci.2010,1205,277-283；S.Khosla等,J.Clin.Endocrinol.Metab.2012,97,2272-2282；T.J.Aspray等,Maturitas2012,71,76-78；D.M.Black等,N.Engl.J.Med.2012,366,2051-2053)。作为显现骨质疏松的一个主要风险因素的骨量減少(骨质量降低)甚至更常见，影响3400万美国人(Silva；Lyritis；Khosla；Aspray)。骨折是骨质疏松和骨量減少的一种广泛并发症，造成重大社会经济代价，如住院和失能，并且极其经常的是它们是否则健康和活跃年长个体的退化和死亡病因(Lyritis)。年龄相关的骨质疏松性骨损失和它的所得并发症在衰老群体中导致重大罹病率和死亡率(Rachner；Silva；Lyritis；Khosla；Aspray；Black)。在两种针对骨质疏松的可能治疗策略，即预防骨损失/再吸收或刺激骨生长之中，用双膦酸盐药物的抗再吸收疗法是更确定的(Khosla；M.Sharpe等,Drugs,2001,61,999-1039)。几乎所有当前针对骨质疏松的疗法以及大多数处于临床探究下的潜在新型治疗剂都旨在降低骨质疏松患者中的骨再吸收水平(Khosla；Aspray；Black；L.Brewer等,Eur.J.Clin.Pharmacol.2011,67,321-331)。在售或处于临床试验中的靶向骨再吸收的机理的疗法包括双膦酸盐(例如阿仑膦酸盐(Alendronate))、地诺单抗(Denosumab)(保骼丽(Prolia))、唑来膦酸(ZolendronicAcid)(瑞拉斯特(Reclast))、奥丹昔布(Odanacatib)和塞卡替尼(Saracatinib)(Brewer)。抗再吸收药物疗法已在治疗不同于其中已发生骨矿物质密度大量损失的晚期骨质疏松的早期和轻度疾病病例方面最有效(Khosla；Brewer)。

或者，尽管FDA在这个领域中核准的药物贫乏，但骨合成代谢剂可提供额外治疗选项，特别是关于晚期疾病，并且显著改进骨质疏松管理(E.Canalis,J.Clin.Endocrinol.Metab.2010,95,1496-1504)。当前，可用于治疗重度骨质疏松患者的唯一FDA核准骨合成代谢剂是特立帕肽(teriparatide)(复泰奥(Forteo))，其是一种重组形式的甲状旁腺激素(PTH)，必须通过每日注射间歇施用(F.Vescini等,Clin.CasesMiner.BoneMetab.2012,9,31–36)。复泰奥可引起显著骨形成，并且降低骨折风险，但它的使用由于安全性顾虑而严重受限(Canalis；Vescini；R.Dimitriou等,BMCMedicine2011,9,1-10)。由于如骨肉瘤风险增加的不利副作用，复泰奥关于患者群体和使用持续时间(小于24个月)的药物标注被高度限制。处于临床探究下的其它合成代谢剂包括刺激内源性间断PTH分泌的钙溶解药物以及Wnt信号传导拮抗剂的抑制剂(Rachner；Dimitriou)。

在患有轻度骨质疏松的患者中，双膦酸盐药物(例如阿伦膦酸、福善美(Fosamax))可产生显著益处，如骨密度改进和骨折风险降低(Khosla；Sharpe)。然而，即使当在空腹条件下摄取时，包括阿伦膦酸的双膦酸盐药物也显示低口服生物可用度(平均0.6-0.7％)。药物连同餐食和饮料(除水以外)一起摄入使生物可用度进一步降低，并且在空腹条件下摄入在大多数患者中必然伴有严重上胃肠道刺激(Aspray)。因此，在空腹条件下重复(经常每日)口服给药为使双膦酸盐药物的递送达到药理学上可实现的最大程度所必需，但超过99％的剂量不能被吸收，并且以未使用状态从身体排出。可被吸收的双膦酸盐药物部分可在人体中快速分配，其中约50％的药物结合于骨表面，而其余部分以未改变状态通过肾排泄。低口服吸收的物理化学基础被认为与不可避免地作为所有双膦酸盐药物的一部分的带负电荷的膦酸根部分相关。为克服这个缺点，已探究策略，包括用脂肪酸和胆汁酸缀合，旨在掩蔽膦酸根电荷效应的前药方法(P.Vachal等,J.Med.Chem.2006,49,3060-3063；O.Bortolini等,Euro.J.Med.Chem.2012,52,221-229)。

生物制剂通常在包括骨折愈合和手术管理脊柱病症的医学应用中用于促进骨生长(E.E.Johnson等,Clin.Orthop.Relat.Res.2000,371,61–74；G.R.Mundy,Annu.Rev.Med.2002,53,337–54；G.A.Rodan等,Science2000,289,1508–14；S.T.Yoon,Clin.Orthop.Relat.Res.2002,395,33–43)。与解决影响腰部和颈部脊柱的退变性椎间盘疾病和关节炎相同，常由矫形外科医师和神经外科医师进行脊柱融合。在历史上，通常取自患者的髂嵴的自生性骨移植物已用于加强脊椎层之间的融合。然而，相关供体部位罹病、手术时间增加以及与收集自生性骨移植物相关的失血增加(E.D.Arrington等,Clin.Orthop.Relat.Res.1996,329,300–9.；A.R.Vaccaro等,SpineJ.2002,2,206–15；J.A.Rihn等,Spine2010,35,1629–39)已提供发现安全和有效替代方案的动机。

重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)通常在人中用于促进脊柱融合。它在2002年由美国食物与药品管理局(FDA)核准用于单层前腰部椎体间融合(M.Mitka,JAMA2011,306,1311–2.)。自从这个时间以来rhBMP-2的使用已显著增加，并且对于它的使用的指示已扩展来包括后腰部脊柱融合以及颈部脊柱融合。尽管rhBMP-2具有功效，但新近报道已对它在脊柱融合手术期间被采用时的安全性表示异议。报道的并发症已包括形成血清肿、软组织肿胀、脊椎骨质溶解、形成异位骨、逆行射精和致癌性(K.-U.Lewandrowski,SpineJ.2007,7,609–14；D.A.Wong,SpineJ.2008,8,1011–8；J.D.Smucker等,Spine,2006,31,2813–9；E.J.Carragee,SpineJ.,2011,11,471–91)。此外，已在它于颈部脊柱中使用下观察到气道水肿，从而促使FDA颁布对于它在颈部脊柱手术中使用的公共卫生告示警告。

在本发明的一实施方案中，合成新型分子，所述新型分子是成骨性氧固醇Oxy133与骨靶向剂(BTA)的组合。当全身施用时，这些分子可选择性归巢(home)至骨组织，并且增强骨形成。这些分子可用作用于治疗骨质疏松的骨合成代谢剂。预期骨靶向成骨性氧固醇在全身施用时不具有显著毒性或免疫原性效应。

多能间质干细胞(MSC)细胞性分化成骨形成性成骨细胞可构成合成代谢骨生长的驱动力。某些天然存在的氧固醇可体外诱导MSC成骨性分化同时阻止脂肪生成性分化，并且可在大鼠颅盖缺陷模型中体内刺激局部化骨形成(T.L.Aghaloo等,J.Orthop.Res.2007,25,1488-1497)。已报道对当体外或在大鼠脊柱融合模型中体内使用时成骨活性大于天然存在的氧固醇的新型半合成氧固醇的合成和表征(J.S.Johnson等,J.Cell.Biochem.2011,112,1673-1684；S.R.Montgomery等,J.BoneMiner.Res.2014,接受供发表)。在本发明的一实施方案中，阐述在全身性给药(iv(静脉内)、ip(非肠胃内(intraparenteral))或口服)的情形下作为如为治疗骨质疏松所需的骨合成代谢剂的新型成骨性氧固醇。

作为胆固醇氧化产物的氧固醇在体内形成，并且已牵涉于包括细胞分化和胆固醇代谢的各种生物过程中(G.J.Schroepfer,Physiol.Rev.2000,80,362-554；S.Gill等,Prog.LipidRes.2008,47,391-404；B.Sottero等,Curr.Top.Med.Chem.2009,16,685-705)。见于人和动物循环中以及各种组织中的天然存在的氧固醇可具有骨形成性成骨性质(J.R.Dwyer等,J.Biol.Chem.2007,282,8959-8968；W.K.Kim等,J.BoneMiner.Res.2010,25,782-795；H.T.Kha等,J.BoneMiner.Res.2004,19,830-840；J.A.Richardson等,J.Cell.Biochem.2007,100,1131-1145；C.M.Amantea等,J.Cell.Biochem.2008,105,424-436)。向包括骨髓基质细胞(间质干细胞，MSC)和胚胎成纤维细胞的多能间质骨祖细胞施用这些氧固醇可在体外导致强力成骨性分化以及形成充足矿物化骨基质(Kim；Kha；Richardson)。在不受理论束缚下，这些作用可通过不依赖于经典Hh蛋白来活化Hedgehog(Hh)信号传导路径加以部分地介导(Dwyer)。一个更强力氧固醇家族可具有优于它们所源于的天然存在的氧固醇的成骨和抗脂肪生成活性(J.S.Johnson；Montgomery)。所述分子可在体外显示强力成骨活性，并且在体内刺激强力骨形成和脊柱融合。预期它们不引发显著免疫原性应答(J.S.Johnson；Montgomery)。

成年期的骨健康状况取决于骨形成性成骨细胞和骨再吸收性破骨细胞的分别合成代谢细胞活性和分解代谢细胞活性的协调平衡。多能间质干细胞(也称为骨髓基质细胞，MSC)形成包括成骨细胞和脂肪细胞的多种细胞类型的前体群体。新骨的形成由MSC的成骨性分化驱动，所述分化是一种可被许多因素破坏的过程。衰老、疾病和如烟草和酒精滥用的生活方式因素倾向于以成骨细胞分化为代价将MSC群体推向脂肪生成，从而导致常引起完全发展的骨质疏松和骨折修复受损的骨量減少病症(A.Sloan等,TheSurgeon,2010,8,111-116；D.A.Chakkalakal,AlcoholClin.Exp.Res.2005,12,2077-2090)。MSC的谱系特异性分化背后的机理可为重要的。各种因素可刺激成骨细胞形成，同时抑制脂肪生成。

天然存在的氧固醇可充当对MSC和其它多能间质细胞具有作用的药物样分子(Aghaloo；Dwyer；Kim；Kha；Richardson；Amantea)。存在于人循环和各种组织中的氧固醇可为胆固醇代谢转化以形成类固醇激素和胆汁酸中的短命中间体(Schroepfer)。然而，除它们作为被动代谢物的作用之外，天然氧固醇可充当能够调节一定范围的生理现象(在它们之中的是脂质的体内平衡)的信号传导分子，以及控制细胞状态，如分化、炎症和凋亡(Gill)。也就是说，氧固醇可作为组织特异性信号传导的调控剂起作用。对氧固醇的早期研究考虑了它们的病理性作用，并且假定所有氧固醇无论它们的不同化学组成如何都具有类似性质(Sottero)。氧固醇化学型可具有取决于细胞环境以及氧固醇的精确化学组成的更个别化特征(S.Nachtergaele等,Nat.Chem.Biol.2012,8,211-220)。一些氧固醇可促进氧化应激(Sottero)。然而，成骨性氧固醇可抑制氧化应激对祖细胞的成骨性分化的不利影响(D.Shouhed,J.Cell.Biochem.2005,95,1276-1283)。一些氧固醇被认为是LXR受体的内源性配体。然而，氧固醇的成骨活性可能不是LXR活化的结果，而是可通过活化Hh信号传导加以介导(Dwyer)。氧固醇诱导的Hh信号传导活化可不依赖于Hh蛋白而发生，并且导致非典型Wnt和Notch信号传导的活化(Kha；Amantea)。基线PKA/cAMP、PKC、MAPK和PI3激酶信号传导可涉及于介导细胞对这些氧固醇的应答的各个方面中(Kha；Richardson)。尽管报道一些氧固醇具有细胞毒性(Schroepfer)，但在以下情况下未见成骨性氧固醇的毒性作用：在体外，使用骨祖细胞，在1-20μM下给药时；或在体内，在大鼠脊柱融合模型中局部施用(40mg)期间；或在小鼠中，每周3次在50mg/kg下ip给药共计8周，如通过不存在行为变化所确定。

天然存在的氧固醇20(S)-羟基胆固醇、22(S)-羟基胆固醇和22(R)-羟基胆固醇可用作潜在成骨剂(Kha；Richardson；Amantea)。鉴定一系列在体外与在体内均有效的强力成骨性氧固醇类似物。这个半合成氧固醇家族的成员在通过胶原蛋白海绵在横突之间局部施加时在大鼠中诱导强力骨形成和脊柱融合(J.S.Johnson)。化合物OXY133是系列中具有增强的成骨活性的类似物(图1)(Montgomery)。Oxy133可诱导培养的人初级间质干细胞中的骨发生，并且相较于其它类似物以加速方式诱导大鼠中的脊柱融合。在非啮齿动物骨疾病模型，如兔脊柱融合和兔颅盖缺陷模型中，Oxy133可诱导强力骨发生。Oxy133是一种供局部施用，潜在应用于脊柱融合和修复不愈合骨折中的药物开发候选物。然而，当预期全身性施用如Oxy133的氧固醇作为用以刺激骨质疏松中的骨形成的潜在合成代谢因素时，必须考虑它们在人肝微粒体(HLM)中的短暂半衰期(<5分钟)以及未必有利于在骨组织中沉积的组织分布。此外，由于可能的骨发生机理，所以可能明智的是短暂活化MSC中的Hh路径，从而增加对骨组织的选择性，同时使对其它组织的暴露最小。这可通过使骨靶向剂(BTA)连接于将它选择性递送至骨的氧固醇分子来实现。

骨特异性药物递送并非仅可适用于可为骨疾病勉强接受的药物(例如雌二醇(estradiol)和双氯芬酸(diclofenac))以增加功效，使副作用最小，并且允许达成适当给药(S.Zhang等,Chem.Soc.Rev.2007,36,507-31)。在本发明的一实施方案中，骨特异性药物递送的观念被应用于先前未针对全身性骨疾病加以测试的成骨性分子以致使它们作为骨质疏松的有效治疗剂。具有成骨性质的基于氧固醇的Hh信号传导激动剂可属于这个种类。骨特异性药物递送剂可通过可水解接头键合来连接于它们的药物分子(M.W.Orme等,Bioorg.Med.Chem.Lett.1994,4,1375-1380；Zhang)。

化合物Oxy133(图1)可充当强力成骨性氧固醇，其体外诱导骨祖细胞的成骨性分化，并且在大鼠和兔脊柱融合模型中体内诱导强力骨形成。成骨性氧固醇Oxy149是Oxy133和作为四环素的衍生物的骨靶向剂(BTA)的组合。如图1中所示，我们已鉴定通过丁二酸或天冬氨酸接头使BTA连接于Oxy133的三个位点，即在碳3、碳6和碳20的羟基处。四环素BTA片段的接头连接物包括但不限于基于丁二酸酯的接头和基于聚乙二醇(PEG)的接头单元，如产生图2中描绘的BTA-接头1的那些。举例来说，Oxy133-BTA类似物可具有连接在碳6的羟基处的BTA。本文也阐述其它类似物，其中BTA可连接于碳3或碳20，或连接于超过一个碳，从而导致在Oxy133上具有总计2个或3个BTA单元。

通过例如用于矫形医学的骨特异性药物递送系统进行的骨特异性药物递送并非仅可适用于可为骨疾病勉强接受的药物(例如：雌二醇和双氯芬酸)以增加功效，使副作用最小，并且允许达成适当给药。这个观念可扩展至先前未针对全身性骨疾病加以测试的成骨性分子，从而潜在使得它们成为骨质疏松的有效治疗剂。具有成骨性质的基于氧固醇的Hedgehog(Hh)信号传导激动剂大部分属于这个种类。在具有高骨亲和力，在寡肽至各种双膦酸盐的范围内的已知化学实体之中，抗生素四环素是一种相对无毒，口服可用以及“人富有经验的”骨靶向剂或部分。然而，它的强力抗生素活性、化学复杂性和缺乏稳定性限制未改性四环素作为骨靶向剂(BTA)的临床潜力。因此，四环素片段被考虑为BTA单元。后者缺乏抗微生物活性和过度化学复杂性，同时相较于四环素在羟磷灰石结合测定中保留大部分(80％)的骨亲和力。四环素BTA片段的接头连接物可包括基于丁二酸酯的接头和基于聚乙二醇(PEG)的接头单元，例如图2中描绘的BTA-接头1的接头单元。BTA剂可通过可水解接头键合来连接于药物分子。非可水解键合可用于其中药物分子在缀合于BTA单元之后保留药理学活性的情况下。可使用酯基团，因为它们相对于更不稳定的硫酯和更稳定的酰胺处于有利稳定性范围(L.Gil等,Bioorg.Med.Chem.1999,7,901-919)。酯基团的体内稳定性可通过邻近于酯基团放置的取代加以进一步精细调谐(T.C.Bruice等,BioorganicMechanisms,第1卷,W.A.Benjamin,NewYork,1966,1-258)。因此，Oxy133-BTA酯缀合物可适于全身性给药(口服、ip或iv)，所述给药导致选择性沉积在骨组织中，随后进行酶促接头水解并在控制速率下将成骨剂Oxy133释放至靶标组织中。BTA-接头1如此连接于Oxy133的6位以形成缀合物Oxy149(3a)可通过酯键联直接偶联于丁二酸酐来实现，如下所描绘。

(在Oxy133中，6-羟基比3-羟基对丁二酸酐更具反应性。)在C3H10T1/2细胞中，所得缀合物OXY149保留母体Oxy133的大部分成骨活性，这通过在4天处理之后对成骨性分化标志碱性磷酸酶活性的诱导水平所确定(对照：2±1；Oxy133(1μM)：390±10；Oxy149(1μM)：100±12；Oxy149(5μM)：500±18；Oxy149(10μM)：480±12；Oxy149(20μM)：470±25)。可使用可调谐接头连接物通过OXY133的3位和/或6位连接BTA-接头1。

以下描绘其中Oxy133以源于丁二酸(a系列)或天冬氨酸(b系列)的酯接头单元和氨基甲酸酯接头单元(c系列)通过3位和/或6位缀合于BTA的类似物2、3和4，也就是具有可调谐接头连接物的氧固醇-BTA缀合物。

氨基甲酸酯接头相较于酯接头应对酯酶水解更稳定。基于丁二酸的接头相较于基于天冬氨酸的接头应对酯酶水解更稳定，所述基于天冬氨酸的接头可更易于经受对氨基酯键的酶促水解。酯水解速率的差异可用于精细调谐Oxy133在靶标骨组织中的释放。举例来说，使用氨基甲酸酯单元缀合于BTA的Oxy133应比在使用天冬氨酸酯形成缀合物时更稳定。各种接头单元对酯酶裂解的这种相对易感性说明于图3中。

以下显示从孕烯醇酮(5)起始合成Oxy133-BTA缀合的类似物2、3和4。孕烯醇酮可通过已知方法，通过以下方式转化成差异性保护的Oxy133衍生物6a-c：保护3-羟基，添加侧链，使5-烯硼氢化-氧化，接着视所需类似物而定将羟基选择性保护或脱保护。可制备这些化合物的偶联伴侣。

首先，在3-羟基和/或6-羟基处用丁二酸酐或保护的天冬氨酸使差异性保护的Oxy133衍生物6a-c酰化，并且接着使所得羧酸偶联于BTA-接头1以提供酯缀合物，如图6中所描绘。在酯偶联反应之后，叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBS)以及在2-4b的情况下氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基乙酯(Teoc)单元可用氟化四正丁铵(TBAF)裂解以提供并有丁二酸接头(2-4a)和天冬氨酸接头(2-4b)的最终产物。化合物3a对应于图3中所示的在初步研究中获得的Oxy149。氨基甲酸酯连接的类似物2-4c通过以下方式来制备：使甘氨酸甲酯转化成异氰酸酯以使Oxy133衍生物6a-c氨甲酰化，此后合成以类似方式继续进行。

Oxy133-BTA的衍生物可1)在基于C3H10T1/2细胞的测定筛选中具有比Oxy149更大的成骨活性，也许基于更有利的细胞可裂解性质，并且2)显示优化羟磷灰石结合能力。

使用详尽酰化条件，可使在C-20处的叔醇酰化以提供如下描绘的过酰化氧固醇-BTA缀合物类似物。

以下显示从Oxy133化合物起始，用以获得化合物3b(Oxy154)、4a(Oxy153)和4b(Oxy155)(显示于图4中)的合成途径。

以下提供以上描述其合成的若干分子的概述。

本发明的一实施方案涉及包含Oxy133或由一些本发明者先前所述的其它成骨性氧固醇的杂交分子，其中氧固醇被连接于由一些本发明者所述的其它形式的四环素衍生的骨靶向部分。一些所述部分例如描述于美国专利7,196,220和美国专利7,196,220中。

成骨性氧固醇分子可连接(缀合)于所述四环素衍生物，并且如本文所述加以使用。代表性所述氧固醇包括Oxy8、Oxy34、Oxy40和Oxy49或由本发明者或由其他人先前所述的其它适合氧固醇。一些所述杂交分子包括以下。

这些氧固醇和氧固醇-骨靶向剂(BTA)缀合物可为可用作用于治疗骨质疏松的治疗剂的药物组合物的一部分。

氧固醇形成胆固醇的存在于循环中以及人和动物组织中的氧化衍生物的家族。已发现氧固醇存在于动脉粥样硬化性病变中，并且在各种生理过程，如细胞分化、炎症、凋亡和类固醇产生中起作用。一些天然存在的氧固醇可具有成骨性质(Kha)。天然存在的氧固醇20(S)-羟基胆固醇(“20S”)(W.-K.Kim,J.BoneMiner.Res.2007,22,1711–9)在施加于能够分化成成骨细胞和脂肪细胞的多能间质细胞时具有成骨性与抗脂肪生成性两者。可对20S进行结构改性以合成20S的更强力类似物，包括Oxy34和Oxy49，其可通过活化Hedgehog(Hh)信号传导来诱导骨髓基质细胞(MSC)的成骨性分化，并且抑制脂肪生成性分化(J.S.Johnson)。Oxy34和Oxy49可在大鼠后侧脊柱融合模型中体内刺激脊柱融合(J.S.Johnson)。氧固醇可构成供医师治疗例如长骨骨折、脊柱病症和骨质疏松的更可行临床选项。

本发明的实施方案的化合物适用作用如本文定义的治疗有效量的本发明化合物以及药学上可接受的载体或稀释剂制备的药物组合物。

本发明化合物可被配制成药物组合物，并且以适合于所选施用途径的多种形式向需要治疗的受试者(例如哺乳动物，如人患者)施用，所述施用途径例如口服、经鼻、腹膜内或胃肠外、通过静脉内、肌肉内、表面或皮下途径、或通过向组织中注射。

因此，本发明化合物可与药学上可接受的媒介物(如惰性稀释剂或可吸收可食用载体)组合来全身施用(例如口服施用)，或通过吸入或吹入施用。它们可封闭在硬质或软质外壳明胶胶囊中，可压制成片剂，或可直接掺入患者的膳食的食物。对于口服治疗性施用，化合物可与一种或多种赋形剂组合，并且以可摄取片剂、经颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。化合物可与惰性粉状载体组合，并且由受试者吸入或吹入。所述组合物和制剂应含有至少0.1％的本发明的一实施方案的化合物。组合物和制剂的百分比当然可变化，并且可以适宜地在给定单位剂型的重量的约2％至约60％之间。化合物在所述治疗适用组合物中的量是如此以致将获得有效剂量水平。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有以下各物：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；以及甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜(aspartame)或调味剂，如胡椒薄荷、冬青油，或可添加樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除以上类型的物质之外，它也可含有液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可作为包衣存在或可存在以另外改进固体单位剂型的实物形式。举例来说，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、虫胶或糖等包覆。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂，如樱桃或橙调味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何物质都应为药学上可接受的，并且在所用量下大致上无毒。此外，化合物可并入持续释放制剂和装置中。举例来说，化合物可并入定时释放胶囊、定时释放片剂、定时释放丸剂和定时释放聚合物或纳米粒子中。

化合物也可通过输注或注射加以静脉内或腹膜內或皮下施用。可于水中制备化合物的溶液，任选与无毒表面活性剂混合。也可于甘油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中以及于油中制备分散液。在一般储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。

适于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散液或包含适合于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液，任选囊封在脂质体中的化合物的无菌粉末。在所有情况下，最终剂型在制造和储存条件下都应是无菌、流动以及稳定的。液体载体或媒介物可为溶剂或液体分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适合混合物。适当流动性可例如通过形成脂质体、在分散液的情况下通过维持所需粒径或通过使用表面活性剂加以维持。防止微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等)来达成。在许多情况下，将为优选的是包括等张剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来达成。

通过将化合物以所需量在必要时与以上列举的各种其它成分一起并入适当溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分外加存在于先前无菌过滤溶液中的任何其它所需成分的粉末。

对于表面施用，化合物可以纯净形式施加。然而，可能合乎需要的是与皮肤病学上可接受的可为固体或液体的载体组合，以组合物或制剂形式向皮肤施用它们。

适用固体载体包括精细分散固体，如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。其它固体载体包括无毒聚合纳米粒子或微粒。适用液体载体包括化合物可任选借助于无毒表面活性剂在有效水平下溶解或分散于其中的水、醇或二醇或水/醇/二醇共混物。可添加如芳香剂和其它抗微生物剂的佐剂以最优化用于给定用途的性质。所得液体组合物可从吸收垫施加，用于浸渍绷带和其它敷料，或使用泵型喷雾器或气雾剂喷雾器喷雾于受影响区域上。

如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物质的增稠剂也可与液体载体一起用于形成用于直接向使用者的皮肤施加的可涂敷糊剂、凝胶剂、软膏剂、皂剂等。

可用于向皮肤递送化合物的适用皮肤学组合物的实例为本领域所知；例如参见Jacquet等(美国专利号4,608,392)、Geria(美国专利号4,992,478)、Smith等(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)，其全部据此以引用的方式并入本文。

可通过比较式I化合物的体外活性和在动物模型中的体内活性来确定它们的适用剂量。用于将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法为本领域所知；例如参见美国专利号4,938,949，其据此以引用的方式并入本文。

举例来说，化合物在如洗剂的液体组合物中的浓度可为约0.1-25重量％或约0.5-10重量％。在如凝胶剂或粉末的半固体或固体组合物中的浓度可为约0.1-5重量％或约0.5-2.5重量％。

为在治疗中使用所需的化合物的量将不仅随所选特定盐而变化，而且也随施用途径、所治疗病状的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且将最终由主治医师或临床医师裁量。

本发明的药剂的有效剂量和施用途径是常规的。视例如受试者的物种、年龄、重量和一般或临床状况；所治疗的任何病症的严重性或机理；所用特定试剂或媒介物；施用方法和时程等而定，药剂的精确量(有效剂量)将在受试者与受试者之间变化。可通过为本领域技术人员所知的常规程序凭经验确定治疗有效剂量。参见例如ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,Goodman和Gilman编,MacmillanPublishingCo.,NewYork。举例来说，可最初在细胞培养测定中或在适合动物模型中估计有效剂量。动物模型也可用于确定适当浓度范围和施用途径。所述信息可接着用于确定适用于在人中施用的剂量和途径。治疗剂量也可通过与类似治疗剂的剂量类比来选择。

特定施用模式和剂量方案将由照护临床医师在考虑病例的细目(例如受试者、疾病、涉及的疾病病况以及治疗是否是防治性的)的情况下选择。治疗可涉及历经数天至数月或甚至数年的时期每日或每日多次用化合物给药。

然而，一般来说，适合剂量将在每天约0.001至约100mg/kg体重，例如约0.01至约100mg/kg体重的范围内，如每天每千克接受者体重高于约0.1mg，或在约1至约10mg的范围内。举例来说，适合剂量可为每天约1mg/kg、10mg/kg或50mg/kg体重。

化合物宜以单位剂型施用；例如每单位剂型含有0.05至10000mg、0.5至10000mg、5至1000mg、或约100mg活性成分。

可施用化合物以实现例如约0.5至约75μM、约1至50μM、约2至约30μM、或约5至约25μM的峰值血浆浓度。示例性合乎需要的血浆浓度包括至少或不超过0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100或200μM。举例来说，血浆水平可为约1至100微摩尔或约10至约25微摩尔。这可例如通过静脉内注射0.05至5％的化合物任选于盐水中的溶液，或以含有约1-100mg的化合物的大丸剂形式口服施用来实现。可通过连续输注以提供每小时每kg体重约0.00005-5mg，例如至少或不超过0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5或5mg/kg/h来维持合乎需要的血液水平。或者，可通过含有每kg体重约0.0002-20mg，例如每kg体重至少或不超过0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20或50mg化合物的间断输液来获得所述水平。

化合物可以适宜地以单次剂量形式提供或以在适当间隔下施用的分次剂量形式，例如以每天一次剂量形式，或以每天两次、三次、四次或大于四次亚剂量形式提供。亚剂量自身可进一步例如分成许多次个别宽松间隔施用；如从吹入器多次吸入。

本发明的一方面是一种包含本文阐述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物以及药学上可接受的载体的生物活性或药物组合物。术语“生物活性”组合物或“药物”组合物在本文中可互换使用。两个术语均指可向受试者施用，用于涂布被引入受试者中的医学装置或存在于所述医学装置中等的组合物。这些生物活性或药物组合物在本文中有时称为“本发明的药物组合物或生物活性组合物”。有时，短语“施用化合物”在本文中用于向受试者施用这种化合物的情形下(例如使所述受试者与所述化合物接触)。应了解用于所述用途的化合物可通常呈包含化合物的药物组合物或生物活性组合物形式。

本发明的另一方面是一种用于诱导(刺激、增强)例如受试者的细胞或组织中Hedgehog(Hh)路径介导的应答的方法，其包括使所述细胞或组织与有效量(例如治疗有效量)的化合物接触，其中所述Hedgehog(Hh)路径介导的应答是刺激成骨性分化、骨形态发生和/或骨质增生。Hh介导的应答可适用于再生医学中。

本发明的另一方面是一种用于治疗患有骨病症、骨量減少、骨质疏松或骨折的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含化合物的生物活性组合物或药物组合物。可在治疗有效剂量下在所选间隔下以有效剂型向受试者施用生物活性组合物或药物组合物以例如增加骨质量，改善骨质疏松的症状，或减轻、消除、预防或治疗将受益于骨形态发生和/或骨质增生增加的其它病状。可在治疗有效剂量下在所选间隔下以有效剂型向受试者施用生物活性组合物或药物组合物以改善骨质疏松的症状。在一个实施方案中，通过以下方式来治疗受试者以诱导骨形成：收集哺乳动物间质干细胞(例如从受试者或从适合哺乳动物，或从组织或细胞库)，用化合物处理哺乳动物间质细胞以诱导细胞的成骨性分化，并且向受试者施用分化的细胞。

在任何本发明方法中，可通过局部施用向细胞、组织或器官施用化合物。举例来说，化合物可与乳膏剂等一起局部施加，或它可被注射或另外直接引入至细胞、组织或器官中，或它可与适合医学装置(例如移植物)一起加以引入。或者，化合物可全身施用，例如口服、静脉内(通过IV)或通过注射，如腹膜内(ip)注射或皮下(subcu)注射。

本发明的另一方面是一种用于执行一种或多种本文所述的方法的试剂盒。试剂盒可包括任选于容器中的有效量(例如治疗有效量)的化合物。

本发明的另一方面是一种用于受试者(例如动物，如人)的身体中的移植物，其包括具有表面的基材。移植物的表面或内部包括以足以诱导周围骨组织中的骨形成的量包含化合物的生物活性组合物或药物组合物。

任选地，本发明的生物活性组合物、方法、试剂盒或医学装置可包含一种或多种其它适合治疗剂，例如像甲状旁腺激素、氟化钠、胰岛素样生长因子I(ILGF-I)、胰岛素样生长因子II(ILGF-II)、转化生长因子β(TGF-β)、细胞色素P450抑制剂、成骨性类前列腺素、BMP2、BMP4、BMP7、BMP14和/或抗再吸收剂，例如像双膦酸盐。

除本文阐述的化合物之外，本发明的其它实施方案涵盖在各式中所示的任何立体中心处的任何和所有个别立体异构体，包括化合物的非对映异构体、外消旋物、对映异构体和其它异构体。在本发明的实施方案中，包括化合物的所有多晶型物和溶剂合物，如水合物和用有机溶剂形成的那些。“溶剂合物”是由一个或多个溶质分子(例如化合物或其药学上可接受的盐)和一个或多个溶剂分子形成的复合物或聚集体。所述溶剂合物可为溶质与溶剂的摩尔比大致上固定的结晶固体。适合溶剂将由本领域普通技术人员所知，例如水、乙醇或二甲亚砜。所述异构体、多晶型物和溶剂合物可通过本领域中已知的方法来制备，如通过区域特异性和/或对映选择性合成和解析。

制备盐的能力取决于化合物的酸性或碱性。化合物的适合盐包括但不限于酸加成盐，如用盐酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、碳酸、肉桂酸、杏仁酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、羟基乙烷磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和2-乙酰氧基苯甲酸制备的那些；用糖精制备的盐；碱金属盐，如钠盐和钾盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；以及用有机或无机配体形成的盐，如季铵盐。

其它适合盐包括但不限于化合物的乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙(calciumedetate)、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐(clavulanate)、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海卓胺(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、杏仁酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐(mucate)、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、双羟萘酸盐(pamoate/embonate)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式乙酸盐、丁二酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物和戊酸盐。

应了解在本文中提及化合物包括其药学上可接受的盐或溶剂合物。

在具体来说用于治疗受试者的任何本发明的方法、组合物或试剂盒中，本发明的组合物可任选与一种或多种其它适合治疗剂组合。可使用适于治疗特定病状的任何治疗剂。适合所述药剂或药物将对本领域技术人员是明显的。举例来说，对于治疗骨病症，常规治疗药物可与本发明的组合物组合使用。一些所述药剂包括例如甲状旁腺激素、氟化钠、胰岛素样生长因子I(ILGF-I)、胰岛素样生长因子II(ILGF-II)、转化生长因子β(TGF-β)、细胞色素P450抑制剂、成骨性类前列腺素、BMP2、BMP4、BMP7、BMP14和/或双膦酸盐或其它骨再吸收抑制剂。

本发明的组合物或化合物可被配制成包含本发明的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。就“药学上可接受的载体”来说，其意指不为在生物学上或在其它方面不合需要的物质，即所述物质可向受试者施用而不引起任何不合需要生物作用或以有害方式与其中含有它的医药组合物的任何其它组分相互作用。如将为本领域技术人员所熟知，必然选择载体以使活性成分的任何降解最小，并且使受试者中的任何不利副作用最小。对于药学上可接受的载体和医药组合物的其它组分的讨论，参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPublishingCompany,1990。一些适合药物载体将对熟练工作者是明显的，并且包括例如水(包括无菌水和/或去离子水)、适合缓冲液(如PBS)、生理盐水、细胞培养基(如DMEM)、人工脑脊髓液、二甲亚砜(DMSO)等。

本领域技术人员将了解本发明的特定制剂将至少部分地取决于所采用的特定药剂或药剂的组合以及所选施用途径。因此，存在本发明组合物的适合制剂的广泛变化形式。以下讨论一些代表性制剂。其它将对熟练工作者是明显的。化合物可局部或直接向需要处理的细胞、组织或器官施用，或它可全身施用。

适于口服施用的制剂或组合物可由以下组成：液体溶液，如溶解于稀释剂，如水、盐水或果汁中的有效量的化合物；呈固体、颗粒或冷冻干燥细胞形式的胶囊、药囊或片剂，各自含有预定量的活性成分；于水性液体中的溶液或混悬液；以及水包油乳液或油包水乳液。片剂形式可包括以下中的一个或多个：乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂和药理学上可相容的载体。适于口服递送的制剂也可并入合成和天然聚合微球体中或其它部件中以保护本发明的药剂在胃肠道内免遭降解。

适于胃肠外施用(例如静脉内)的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包括混悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可提供于单位剂量或多剂量密封容器，如安瓿和小瓶中，并且可以冷冻干燥(即冻干)状态储存，仅需要在使用之前即刻添加注射用无菌液体载体，例如水。即时注射溶液和混悬液可由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

可将化合物单独或与其它治疗剂组合制备成待通过吸入施用的气雾剂制剂。这些气雾剂制剂可被放置至加压可接受的推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。

适于表面施用的制剂包括糖锭，其在通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶的调味剂中包含活性成分；软锭剂，其在如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基质中包含活性成分；嗽口剂，其在适合液体载体中包含活性成分；或乳膏剂、乳液、混悬液、溶液、凝胶剂、乳膏剂、糊剂、泡沫剂、润滑剂、喷雾剂、栓剂等。

其它适合制剂包括例如适于定时释放化合物的水凝胶和聚合物或用于小剂量递送化合物的纳米粒子。所述制剂为本领域技术人员所熟知。

本领域技术人员将了解可基于所探讨的特定应用选择、改适或开发适合或适当制剂。此外，可制备用于通过多种不同途径(全身性、局部或两者)来施用的本发明的药物组合物。所述实例包括但不限于以以下方式进行的施用：关节内、颅内、皮内、肝内、肌肉内、眼内、腹膜内、鞘内、静脉内、皮下、经皮、或如通过直接注射来直接向骨区域动脉粥样硬化性部位中、用导管或其它医学装置引入、表面施加、直接施加和/或通过将装置植入动脉或其它适当组织部位中。

化合物可被配制以含于手术或医学装置或植入物内，或被改适以由手术或医学装置或植入物释放。在某些方面，植入物可用化合物涂布或另外处理。举例来说，水凝胶或如生物可相容和/或生物可降解聚合物的其它聚合物可用于用本发明的组合物涂布植入物(即组合物可通过使用水凝胶或其它聚合物加以改适以与医学装置一起使用)。用于用药剂涂布医学装置的聚合物和共聚物在本领域中是熟知的。医学装置和植入物的实例包括但不限于缝合线和假体，如假体关节，并且可呈例如销、螺钉、板或假体关节的形状。

如本文所用，化合物的“有效量”是指可导致至少可检测作用的量。如本文所用的“治疗有效量”是指历经合理时期可在所治疗的受试者中导致至少可检测治疗性应答(例如改善一种或多种症状)的量。

在本发明的实施方案中，如通过多种常规测定中的任一个所测量，化合物可使治疗性应答受刺激或受抑制为未处理对照样品中的治疗性应答的约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、150％、200％或大于200％或更多。也包括这些范围内的中间值。

化合物的剂量可呈单位剂型，如片剂或胶囊。如本文所用的术语“单位剂型”是指适合作为用于动物(例如人)受试者的单一剂量的物理离散单元，各单元含有预定量的单独或与其它治疗剂组合的本发明的药剂以及药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物，所述预定量以足以产生所需作用的量加以计算。

本领域技术人员可以常规方式确定所用组合物的精确制剂的适当剂量、时程和施用方法以实现药剂在个别患者中的所需有效量或有效浓度。除分析疾病、病症或病状的适当临床症状之外，本领域技术人员也可通过直接或间接分析适当患者样品(例如血液和/或组织)来容易地确定和使用化合物的“有效浓度”的适当指标。

在本发明的情形下，视受试者的物种、年龄、重量和一般状况；所治疗的任何病症的严重性或机理；所用特定试剂或媒介物；它的施用模式；患者正服用的其它药物；以及由主治医师在确定适于特定患者的个别方案和剂量水平时通常考虑的其它因素等而定，向如人的动物施用的化合物或其组合物的精确剂量将在受试者与受试者之间变化。用于实现所需体内浓度的剂量将由化合物所呈形式的效价、宿主中与化合物相关的药力学、伴有或不伴有其它药剂、受感染个体的疾病病况的严重性、以及在全身性施用的情况下个体的体重和年龄决定。剂量大小也可由可伴随所用特定药剂或其组合物的任何不利副作用的存在性决定。只要有可能，通常合乎需要的是使不利副作用最小。

举例来说，剂量可在约5ng(纳克)至约1000mg(毫克)、或约100ng至约600mg、或约1mg至约500mg、或约20mg至约400mg的范围内施用。举例来说，可选择剂量以实现剂量与体重比率是约0.0001mg/kg至约1500mg/kg、或约1mg/kg至约1000mg/kg、或约5mg/kg至约150mg/kg、或约20mg/kg至约100mg/kg。举例来说，化合物或包含化合物的组合物的剂量单位可在约1ng至约5000mg、或约5ng至约1000mg、或约100ng至约600mg、或约1mg至约500mg、或约20mg至约400mg、或约40mg至约200mg的范围内。在本发明的一个实施方案中，如在脊柱融合程序中作为骨架的一部分局部施用如上化合物的量(例如数克)。

根据需要可每天一次、每天两次、每天四次、或每天超过四次施用剂量以引发所需治疗作用。举例来说，可选择剂量施用方案以实现本发明化合物的血清浓度在约0.01至约1000nM、或约0.1至约750nM、或约1至约500nM、或约20至约500nM、或约100至约500nM、或约200至约400nM的范围内。举例来说，可选择剂量施用方案以实现本发明化合物的半数最大剂量的平均血清浓度在约1μg/L(每升微克数)至约2000μg/L、或约2μg/L至约1000μg/L、或约5μg/L至约500μg/L、或约10μg/L至约400μg/L、或约20μg/L至约200μg/L、或约40μg/L至约100μg/L的范围内。

本发明的某些实施方案也可包括用独立或与化合物协同起作用的另一药剂治疗以改进治疗结果。当以组合疗法给与时，除化合物以外的药剂可与化合物同时给与，或根据需要可交错给药。两种(或更多种)药物也可组合在组合物中。当组合使用时的各个剂量可小于任一单独使用时。适合剂量可由熟练工作者使用标准剂量参数确定。

如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数个指示物。

如本文所用的“受试者”包括展现可用化合物治疗的病状的症状的任何动物。适合受试者(患者)包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物以及家养动物或宠物(如猫、狗或马)。包括非人灵长类动物和人，包括人患者。典型受试者包括展现一种或多种通过Hedgehog信号传导刺激的生理活性的量异常(量低于“正常”或“健康”受试者)的动物。异常活性可通过包括活化Hedgehog活性的多种机理中的任一个来调控。异常活性可导致病理性状况。

本发明的一个实施方案是一种在体外或在体内适用于任何本文公开的方法的试剂盒。所述试剂盒包括化合物或其生物活性或药物组合物，并且可包括一种或多种例如导致Hh路径介导的活性增加的其它氧固醇，或其它适合治疗剂。任选地，试剂盒包括用于执行方法的说明书。本发明的试剂盒的任选组分包括适合缓冲剂、药学上可接受的载体等、容器或包装材料。试剂盒的试剂可处于试剂例如以冻干形式或稳定化液体形式于其中稳定的容器中。试剂也可呈单次使用形式，例如呈单次剂量形式。熟练工作者将认识到试剂盒的适于执行任何本发明方法的组分。

多种病状可用单独或与其它治疗剂组合使用的化合物治疗。

化合物可导致Hedgehog路径活性增加。

化合物的一个作用可在于靶向多能细胞以诱导它们谱系特异性分化成各种细胞类型，例如成骨细胞。举例来说，用化合物处理的间质干细胞可显示成骨细胞分化的标志物的诱导表达。在不希望受任何特定机理束缚下，据表明这个谱系特异性分化归因于诱导这些细胞中的Hedgehog信号传导。然而，无论化合物起作用所依的机理如何，本文讨论的治疗方法都包括在本发明中。化合物可适用于治疗将受益于刺激骨形成、成骨性分化、骨形态发生和/或骨质增生的病状。在这些病状或治疗之中的是例如用于刺激脊柱融合或骨质疏松中的局部化骨形成的骨诱导性疗法、骨折修复或愈合、增加颚中的骨形成具有临床益处的牙科程序、修复由创伤或先天性缺陷(如腭裂/唇裂)诱发的颅面骨缺陷、以及将对熟练工作者是明显的其中天然骨生长不足的许多其它肌肉骨骼病症。治疗可被施用以治疗开放性骨折和处于不愈合的高风险下的骨折，并且可被施用于患有脊柱病症的受试者中，所述受试者包括需要脊柱融合(例如前腰部椎体间融合、后腰部脊柱融合和颈部脊柱融合)的受试者或患有影响腰部和颈部脊柱的退变性椎间盘疾病或关节炎的受试者。此外，化合物可用于治疗具体来说衰老和绝经后群体的由破骨细胞达成的骨再吸收增加同时成骨细胞达成的骨形成降低所致的骨质疏松。

更具体来说，可进行以下类型的骨相关治疗：

1.化合物可用作使用由如但不限于胶原蛋白I的可相容分子组成的骨架在身体内局部递送以刺激局部化骨形成的成骨剂，所述骨架吸收所述化合物，接着被放置在身体内部。举例来说，骨架含有化合物，并且可被放置在横突之间或例如在脊柱融合、假关节病和不愈合融合中需要融合两个或更多个脊椎所处的椎间盘中。在其它实施方案中，将含有化合物的骨架放置在骨折骨中以刺激骨形成和骨折愈合；放置在需要由化合物达成骨再生所处的骨缺陷，如颅盖或上颌面骨缺陷中；或作为一种在如牙科植入的牙科程序之前使骨再生的手段放置在颚骨中以刺激骨形成。

2.化合物可用作体外成骨剂。举例来说，它可被向骨祖细胞，例如间质干细胞施用以刺激它们成骨性分化，随后在如以上在1)中指示的矫形和其它程序中施加所述细胞以刺激局部化骨形成。

3.化合物可体外用于刺激骨祖细胞中的Hedgehog信号传导路径，由此体外或体内导致细胞成骨性分化。

在前述事项中以及在以下实施例中，所有温度都以未修正的摄氏度阐述；并且除非另外指示，否则所有份和百分比都以重量计。

上述成骨性氧固醇适用于直接局部化施用至目标靶标细胞、组织或器官。

实施例

Oxy149(3a)、Oxy153(4a)、Oxy154(3b)和Oxy155(4b)是化合物Oxy133的BTA缀合类似物，其诱导骨祖骨髓基质细胞M2-10B4的成骨性分化。通过对碱性磷酸酶(ALP)酶活性的诱导以及成骨性分化标志物基因ALP、骨唾液蛋白(bonesialoprotein，BSP)和osterix(OSX)的诱导表达来评估成骨性分化。

与在1μM的浓度下的这些氧固醇中的各个体外接触的骨髓基质细胞M2-10B4的ALP活性显示于图4中。相较于其中不使氧固醇与细胞接触的对照(对照具有1.01的相对表达)，在与在1μM的浓度下的各氧固醇初始接触之后4天，M2-10B4细胞中的ALP的体外基因表达显示于图5中。

这些氧固醇的基于使M2-10B4细胞中的ALP活化的EC50的概述呈现于表1中。

氧固醇	EC50
		Oxy149	0.40μM
Oxy153	1.40μM
		Oxy 154	0.63μM
Oxy155	0.33μM

表1

在与在1μM的浓度下的各氧固醇初始接触之后4天，M2-10B4细胞中的BSP的体外基因表达显示于图6中。在与在1μM的浓度下的各氧固醇初始接触之后4天，M2-10B4细胞中的OSX的体外基因表达显示于图7中。

Oxy149、Oxy153、Oxy154和Oxy155使M2-10B4细胞中的Hedgehog(Hh)信号传导活化，如通过Hh靶标基因Patched1(Ptch)和Hh相互作用蛋白(HIP)的表达被诱导所确定。此外，这些氧固醇通过活化Hh信号传导来诱导成骨性分化，如通过Hh路径抑制剂环巴胺(cyclopamine，Cyp)对氧固醇诱导的成骨性分化的抑制作用所评估。在与在1μM的浓度下的各氧固醇初始接触之后4天，M2-10B4细胞中的Ptch基因的体外表达显示于图8中。在与在1μM的浓度下的各氧固醇初始接触之后4天，M2-10B4细胞中的HIP基因的体外表达显示于图9中。

Hh路径抑制剂环巴胺可抑制氧固醇诱导的碱性磷酸酶活性。使环巴胺(Cyc；5μM)与接触以及不接触各氧固醇的M2-10B4骨髓基质细胞体外接触的影响显示于表2中。

处理	ALP活性(单位/mg蛋白±SD)
		对照	1±1
Oxy133(1μM)	714±5
		Oxy133+Cyc	31±7
Oxy149(1μM)	358±51
		Oxy149+Cyc	26±3
Oxy153(5μM)	154±36
		Oxy153+Cyc	19±7

Oxy154(1μM)	390±68
		Oxy154+Cyc	18±2
Oxy155(1μM)	582±8
		Oxy155+Cyc	39±2
Cyc	1±1

表2

Oxy133的BTA缀合类似物，即Oxy149、Oxy153、Oxy154和Oxy155可体外结合羟磷灰石(HAP)骨矿物质。如下进行体外HAP结合测定。在100％二甲亚砜(DMSO)中制备各分析物的1mM溶液。接着进行进一步稀释以形成各分析物于具有20％DMSO的50mMTris-HCl缓冲液(在pH7.5下)中的20μM溶液。雌二醇用作阴性对照，并且在20μM的浓度下不显示与HAP结合。所用HAP浓度是50mg/mL。

对于各分析物，一式三份制备样品。将对照样品(1mL20μM分析物)转移至微量离心管中。向微量离心管中的第二组样品(1mL20μM分析物)中添加50mgHAP。涡旋样品，在室温下倒置温和混合10分钟，接着在4,400rpm下离心2分钟以使样品中含有的HAP沉积。将上清液转移至另一组微量离心管中。

使用Bio-RadSmart-Spec3000获得各分析物从220至520nm的电子光谱扫描(紫外-可见)。空白是50mMTris-HCl缓冲液，pH7.5，20％DMSO。确定最大吸收波长(λ_max)，并且使用Beer-Lambert定律计算消光系数(ε)。

在λ_max下测量与HAP一起孵育的样品的吸光度，并且接着使用Beer-Lambert定律和先前计算的ε确定分析物的摩尔浓度。不接触以及接触HAP的分析物17β-雌二醇、Oxy149、Oxy153和Oxy155的浓度显示于图10中。

随后使用以下结合％公式计算各样品的被吸收至HAP的分析物的分数，

(H_o-H)/H_o*100＝结合％

其中H_o是对照样品的平均浓度，而H是用HAP处理的样品的平均计算浓度。17β-雌二醇、Oxy149、Oxy153和Oxy155与HAP的结合百分比概述于表3中。

化合物	与羟磷灰石结合％
		17β-雌二醇	-1.95％
Oxy149	67.44％
		Oxy153	95.78％
Oxy155	76.68％

表3

本申请中提及、引用或参考的所有文件、参考文献和信息，包括但不限于期刊文章、专利申请和专利都据此以引用的方式整体并入本文，就好像各自已个别地并入本文一样。所述文件包括但不限于具有序列号61/643,746的美国临时专利申请(2012年5月7日提交)、具有序列号PCT/US2013/032693的国际申请(2013年3月15日提交)、具有序列号61/643,776的美国临时专利申请(2012年5月7日提交)和具有序列号PCT/US2013/032650的国际申请(2013年3月15日提交)。所述文件也包括但不限于公布为WO/2008/115469、WO/2008/082520、WO/2007/098281、WO/2007/028101、WO/2006/110490、WO/2005/020928和WO/2004/019884的专利合作条约(PCT)国际申请。

本说明书中说明和讨论的实施方案仅意图教导本领域技术人员为本发明者所知的用以进行和使用本发明的最佳方式。本说明书中没有事物应被视为限制本发明的范围。呈现的所有实例都是代表性的以及非限制性的。如由本领域技术人员鉴于以上教导所了解，可在不脱离本发明下修改或改变本发明的上述实施方案。因此，应了解在权利要求和它们的等效物的范围内，本发明可不同于如明确描述加以实施。

Claims (26)

1.一种下式化合物：

其中R₁、R₂和R₃独立地选自由以下组成的组：氢、

其中R₄是

其中R₁、R₂和R₃中的至少一个不是氢，并且

其中当R₁和R₃是氢时，那么R₂不是

2.如权利要求1所述的化合物，其中R₃是氢。

3.如权利要求1所述的化合物，其中R₂是氢，并且R₃是氢。

4.如权利要求1所述的化合物，其中R₁是氢，并且R₃是氢。

5.如权利要求1所述的化合物，其中R₃是氢，并且R₁不是氢，并且R₂不是氢。

6.如权利要求1所述的化合物，其中R₃是氢，并且R₁和R₂各自是

7.如权利要求1所述的化合物，其中R₃是氢，并且R₁和R₂各自是

8.如权利要求1所述的化合物，其中R₃是氢，并且R₁和R₂各自是

9.如权利要求1所述的化合物，其中R₁、R₂和R₃各自是

10.如权利要求1所述的化合物，其中R₁、R₂和R₃各自是

11.如权利要求1所述的化合物，其中R₁、R₂和R₃各自是

12.如权利要求1所述的化合物，其选自由以下组成的组：

13.一种药物组合物，其包含权利要求1的化合物以及药学上可接受的载体或稀释剂。

14.一种用于治疗罹患骨病症的受试者(人或动物)的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1所述的化合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中施用所述化合物以实现向所述受试者局部化递送。

16.如权利要求14所述的方法，其中施用所述化合物以实现向所述受试者全身性递送。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述骨病症选自由骨折、骨质疏松和骨量減少组成的组。

18.一种用于治疗罹患骨病症的受试者(人或动物)的方法，其包括使成骨细胞祖细胞与有效量的权利要求1所述的化合物接触。

19.如权利要求18所述的方法，其中使所述成骨细胞祖细胞与所述化合物体外接触。

20.一种用于治疗罹患骨病症的受试者(人或动物)的方法，其包括向所述受试者施用权利要求18所述的经接触的成骨细胞祖细胞。

21.如权利要求20所述的方法，其中向所述受试者局部施用所述经接触的成骨细胞祖细胞。

22.如权利要求20所述的方法，其中向所述受试者全身施用所述经接触的成骨细胞祖细胞。

23.一种用于处理细胞的方法，其包括向所述细胞施用有效量的权利要求1所述的化合物，以刺激所述细胞中的Hedgehog信号传导路径。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞是组织或器官的一部分。

25.如权利要求23所述的方法，其中体内施用(局部和/或全身)所述化合物。

26.一种用于治疗将受益于治疗性活化组织或器官中的Hedgehog信号传导路径的受试者(人或动物)的方法，其包括如权利要求23中所阐述处理所述组织或器官的细胞，以刺激所述组织或器官的所述Hedgehog信号传导路径。