CN108948118A - 用于骨生长的氧化固醇-他汀类化合物 - Google Patents

Abstract

提供了用于促进骨生成、骨诱导和/或骨传导的氧化固醇‑他汀类化合物及其合成方法。还提供了在单个容器中合成OXY133‑他汀类化合物的方法，其具有高收率和改进的工艺安全性。还提供了具立体选择性的OXY133‑他汀类化合物的合成方法。

Description

用于骨生长的氧化固醇-他汀类化合物

背景技术

通常使用生物制剂来促进包括骨折愈合和脊柱病症的手术管理的医疗应用中的骨生长。脊柱融合通常由整形外科医生和神经外科医生共同进行，以解决影响腰椎和颈椎的退行性椎间盘疾病和关节炎。历史上，通常从患者的髂嵴采集的自体骨移植已被用于增加椎体节段之间的融合。

一种具骨诱导性并且通常用于促进脊柱融合的蛋白质是重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)。美国食品和药物管理局(FDA)已批准其用于单节段前路腰椎椎体间融合。自此以后，rhBMP-2的使用显著增加并扩展至包括后路腰椎融合以及颈椎融合。

氧化固醇形成了存在于血液中以及人类和动物组织中的胆固醇的氧化衍生物的大家族。已发现氧化固醇存在于动脉粥样硬化病变中，并且在多种生理过程如细胞分化、炎症、细胞凋亡和类固醇产生中发挥作用。一些天然存在的氧化固醇具有强大的成骨特性并且可用于骨生长。当应用于能够分化为成骨细胞和脂肪细胞的多能间充质细胞时，最有效的天然存在的成骨性氧化固醇20(S)-羟基胆固醇既具成骨性又抗脂肪形成。

一种这样的氧化固醇是OXY133或(3S，5S，6S，8R，9S，10R，13S，14S，17S)-17-((S)-2-羟基辛-2-基)-10，13-二甲基十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3，6-二醇，其展现以下结构：

为了合成OXY133，通常存在难以在单个容器中进行的复杂的多步化学反应。例如，为了合成OXY133，可以利用各种保护试剂以在分子进行合成时保护末端基团。此外，还利用各种脱保护试剂，这些试剂增加了成本，降低了安全性并且具有不利的环境影响。此外，OXY133的合成路线可具有小于30％的非常低的收率。

数十年来，已经对于天然存在的人类蛋白质的重组产生形式如rhBMP-2和rhPDGF研究了其诱导或增强新骨形成的能力。虽然这些蛋白质在支持骨愈合方面是有效的，但是在制造复杂性和相关成本方面存在缺点。解决这些缺点的一种方法是鉴定可调节骨信号通路的部分以刺激或增强骨愈合的小分子。两个实例是骨诱导性氧化固醇和他汀类药物。

他汀类药物是广泛用于降低胆固醇的HMG-CoA还原酶抑制剂。还显示某些他汀类药物在体外和体内刺激骨形成。他汀类药物被认为通过刺激成骨细胞分化并通过MAPK和TGFβ受体信号级联减少成骨细胞凋亡来增强骨形成。

尽管氧化固醇和他汀类药物已被证明能增强体内骨愈合，但均未显示出与rhBMP-2一样有效。因此，尽管制造更容易且更便宜，但其最终效用可能受到限制。因为氧化固醇和他汀类药物已被证明对骨形成有影响，并且它们通过不同的机制起作用，所以呈前药或氧化固醇-他汀类化合物形式的局部共递送可以导致大于独立递送时的协同作用。

因此，需要一种具有成本效益的用于促进骨生成、骨诱导和/或骨传导的氧化固醇-他汀类化合物的合成方法。具体而言，具有高收率和改进的工艺安全性的OXY 133-他汀类化合物的合成方法将是有利的。具立体选择性的用于从内源性原料合成OXY133-他汀类化合物、结合物或前药的方法也是有利的。

发明内容

提供了用于促进骨生成、骨诱导和/或骨传导的氧化固醇-他汀类化合物及其合成方法。还提供了在单个容器中合成OXY133-他汀类化合物或结合物的方法，其具有高收率和改进的工艺安全性。还提供了具立体选择性的OXY133-他汀类化合物的合成方法。还提供了具有降低的环境影响并具有低产物成本的OXY133-他汀类结合物的合成方法。

在一些实施方案中，提供一种对应于式III结构的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中R₁是保护基团并且R₃是具有至少一个碳的脂族或环状取代基。在其它方面，R₁是甲基、乙基、甲硅烷基或氨基甲酸酯基基团并且R₃是(C₆-C₂₆)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基和(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基、或(C₄-C₁₀)亚烷基桥或亚杂烷基桥或氨基甲酸酯基或苄基或甲硅烷基，条件是当R₃是(C₆-C₂₆)烷基时，R₁不是叔丁基二甲基甲硅烷基。

在其它实施方案中，提供一种对应于式V结构的氧化固醇-他汀类化合物：

其中R₁是如上所述的保护基团并且R₄是他汀部分。

在某些实施方案中，当式V中的R₁是H时，则提供具有对应于式VI结构的化合物：

其中R₄是获自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀的他汀部分。所得OXY133-阿托伐他汀化合物、OXY133-西立伐他汀化合物、OXY133-氟伐他汀化合物、OXY133-美伐他汀化合物、OXY133-匹伐他汀化合物、OXY133-普伐他汀化合物、OXY133-瑞舒伐他汀化合物和OXY133-辛伐他汀化合物的化学结构示于图9至图16中。

在一个实施方案中，当R₄是洛伐他汀部分时，提供对应于式VII的氧化固醇-他汀类结构：

一些实施方案涉及制备氧化固醇-他汀类化合物的方法，所述方法包括使式I的孕烯醇酮

与R₁X在碱存在下反应，形成式II的孕烯醇酮衍生物：

使所述式II的孕烯醇酮衍生物与有机金属化合物反应，形成式III的C3被保护的二醇衍生物：

转而，使所述式III的C3被保护的二醇衍生物与硼烷化合物反应，形成式IV的氧化固醇衍生物或其药学上可接受的盐：

在式IV的一个实施方案中，当R₁是H并且R₃是己基时，获得OXY 133。在式IV的一些实施方案中，R₁是保护基团，X是卤离子并且R₃是具有至少一个碳的脂族或环状取代基。在其它实施方案中，R₁是甲基、乙基、氨基甲酸酯基或甲硅烷基基团并且R₃是(C₆-C₂₆)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基和(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基、或(C₄-C₁₀)亚烷基桥或亚杂烷基桥。在其它实施方案中，R₃是己基基团。

在一些实施方案中，在制备本公开的氧化固醇-他汀类化合物的方法中利用的有机金属化合物具有式R₃MgX，其中X是卤离子并且R₃包含具有至少一个碳的脂族或环状取代基。在其它实施方案中，所述有机金属化合物可以具有式R₃Li，其中R₃包含具有至少一个碳的脂族或环状取代基。在一个方面，R₃MgX是正己基氯化镁并且与式III化合物在四氢呋喃中反应，形成式IIIa化合物：

可用于制备本公开的氧化固醇-他汀类化合物的方法中的硼烷化合物包括BH₃。使所述式IIIa化合物与BH₃反应，形成硼烷中间体，其然后在过氧化氢中在碱性介质中反应，形成式Va化合物：

可用于该反应的碱包括NaOH、KOH或Ca(OH)₂。

在某些实施方案中，所述式IV化合物可以与包括阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀的他汀类药物反应，形成对应于式IVa的C3被保护的氧化固醇-他汀类化合物：

在某些实施方案中，所述式Va化合物可以与包括阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀的他汀类药物反应，形成对应于式V的C3被保护的氧化固醇-他汀类化合物：

其中R₁是C3保护基团如甲基、乙基、氨基甲酸酯基或甲硅烷基，并且R₄是他汀部分，例如可以由阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀提供。

在其它方面，式V化合物可以通过利用碘源、氟化物源或其它合适的脱保护方法在C3处脱保护，获得式VI化合物：

其中R₄是他汀部分，所述他汀类药物包括阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀。

在一个实施方案中，所述他汀部分R₄源自洛伐他汀，形成对应于式VII的化合物：

在一些实施方案中，所述式Va化合物可以与包括琥珀酸酐、天冬氨酸、乙基氨基甲酸或聚乙二醇的化合物反应；以及使所得化合物与他汀部分R₄偶联，获得式VIII化合物：

其中L是接头。接头L可以是基于聚乙二醇的接头、基于天冬氨酸的接头、基于琥珀酸酯的接头或基于氨基甲酸酯的接头。他汀部分R₄源自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀。在其它方面，所述式VIII化合物可以利用碘源、氟化物源或其它合适的脱保护方法在C3处脱保护，获得式IX化合物：

其中所述碘源是三甲基甲硅烷基碘，所述氟化物源是四正丁基氟化铵或HF吡啶复合物，并且氢源是如在催化加氢过程中所提供的氢气。

在多个实施方案中，上述制备存在或不存在接头L的氧化固醇-他汀类化合物或结合物的方法可以在单个容器中进行，得到氧化固醇-他汀类化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。

在某些实施方案中，本公开提供药物组合物，其包含(i)式V化合物：

或

(ii)式VI化合物：

或

(iii)式VII化合物：

或

(iv)式VIII化合物：

或

(v)式IX化合物：

和药学上可接受的载体或稀释剂，其中R₁是保护基团，R₄是他汀部分并且L是接头。

在其它实施方案中，本公开提供一种治疗患有骨病的哺乳动物的方法。所述治疗方法包括向所述哺乳动物施用有效量的

(i)式V化合物：

或

(ii)式VI化合物：

或

(iii)式VII化合物：

或

(iv)式VIII化合物：

或

(v)式IX化合物：

和药学上可接受的载体或稀释剂，其中R₁是保护基团，R₄是他汀部分并且L是接头。所述氧化固醇-他汀类化合物通过(i)局部递送或(ii)全身递送施用于哺乳动物。所述骨病包括骨折、骨质疏松症或骨质减少。

各种实施方案的其它特征和优点将在下面的描述中在某种程度上阐述，并且在某种程度上将从描述中变得显而易见，或者可通过各种实施方案的实践而了解。各种实施方案的目的和其它优点将通过本说明书和所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。

附图说明

在某种程度上，关于以下描述、所附权利要求和附图，实施方案的其它方面、特征、益处和优点将是显而易见的，其中：

图1示出用包含孕烯醇酮醋酸酯的起始反应物合成OXY133的逐步反应，如本公开的一个实施方案中所示。孕烯醇酮与有机金属化合物反应产生具有两个羟基基团的固醇或二醇。所述固醇或二醇然后与硼烷和过氧化氢反应并纯化，产生OXY133；

图2是从分离并纯化的OXY133获得的1H NMR数据的图示；

图3是从OXY133获得的¹³C NMR数据的图示；

图4是从OXY133获得的红外光谱数据的图示；

图5是从OXY133获得的质谱数据的图示；

图6是从用于合成OXY133的中间体固醇或二醇获得的¹H NMR数据的图示；

图7是从用于合成OXY133的中间体固醇或二醇获得的¹³C NMR数据的图示；

图8是OXY133-洛伐他汀化合物的合成的示意图；

图9是OXY133-阿托伐他汀化合物的化学结构；

图10是OXY133-西立伐他汀化合物的化学结构；

图11是OXY133-氟伐他汀化合物的化学结构；

图12是OXY133-美伐他汀化合物的化学结构；

图13是OXY133-匹伐他汀化合物的化学结构；

图14是OXY133-普伐他汀化合物的化学结构；

图15是OXY133-瑞舒伐他汀化合物的化学结构；和

图16是OXY133-辛伐他汀化合物的化学结构。

应理解，所述图不是按比例绘制的。此外，图中对象之间的关系可能不是按比例的，并且实际上可能与尺寸关系相反。所述图旨在使人理解和清楚所示每个对象的结构，并且因此，为了说明结构的特定特征，某些特征可能被夸大。

具体实施方式

出于本说明书和所附权利要求的目的，除非另外指明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示成分量、材料的百分比或比例、反应条件的所有数字以及其它数值应理解为在所有情况下都由术语″约″修饰。因此，除非相反指示，否则在下面的说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本申请试图获得的所需性质而变化。最低限度地，而不是试图限制等同原则对权利要求范围的应用，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通舍入技术来解释。

尽管阐述本申请广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含必然由它们各自测试测量中存在的标准偏差所导致的某些误差。此外，本文公开的所有范围应被理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如，″1至10″的范围包括最小值1与最大值10之间(并包括其)的任何和所有子范围，即，最小值等于或大于1并且最大值等于或小于10的任何和所有的子范围，例如5.5至10。

定义

应注意，除非清楚且明确地限于一个指示物，否则如在本说明书和所附权利要求中所用的单数形式″一″和″所述″包括复数个指示物。因此，例如，对″烷醇胺″的提及包括一种、两种、三种或更多种烷醇胺。

如本文所用的术语″生物活性剂″通常是指任何改变患者生理学的物质。术语″生物活性剂″在本文中可与术语″治疗剂″、″治疗有效量″和″活性药物成分″、″API″或″药物″互换使用。术语″生物活性″组合物或″药物″组合物在本文中可互换使用。两个术语都是指可以施用于受试者，用于涂覆或存在于引入受试者中的医疗装置中的组合物等。

如本文所用，″受试者″包括表现出可用化合物治疗病状的症状的任何动物。合适的受试者(患者)包括实验室动物(例如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠)，农场动物和家畜或宠物(例如猫、狗或马)。包括非人灵长类动物和人类，包括人类患者。典型的受试者包括表现出由刺猬蛋白(Hedgehog)信号传导刺激的异常量(低于″正常″或″健康″受试者的量)的一种或多种生理活动的动物。异常活动可通过多种机制中的任何一种来调节，包括激活刺猬蛋白活性。异常活动可能导致病理状态。

术语″可生物降解的″包括将通过酶的作用，通过水解作用和/或通过人体内的其它类似机制而随时间推移降解的化合物或组分。在多个实施方案中，″可生物降解的″包括当细胞(例如骨细胞)渗入组分并允许修复缺陷时所述组分可在体内分解或降解成无毒组分。″可生物侵蚀的″是指化合物或组分当与周围组织中存在的物质，流体接触或通过细胞作用时至少部分地随时间推移侵蚀或降解。″可生物吸收的″是指化合物或组分将例如通过细胞或组织在人体内被分解并吸收。″生物相容的″是指化合物或组分不会在目标组织部位造成实质性组织刺激或坏死和/或不会致癌。

如本文所用的术语″烷基″是指通过从母体烷烃、烯烃或炔烃的单个碳原子上去除一个氢原子而衍生的饱和或不饱和的支链、直链或环状的单价烃基。典型的烷基基团包括但不限于甲基；乙基类，例如乙醇、乙基；丙基类，例如丙烷-1-基、丙烷-2-基、环丙烷-1-基、丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、环丙-1-烯-1-基、环丙-2-烯-1-基、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁基类，例如丁烷-1-基、丁烷-2-基、2-甲基-丙烷-1-基、2-甲基-丙烷-2-基、环丁烷-1-基、丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1，3-二烯-1-基、丁-1，3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1，3-二烯-1-基、丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；及类似基团。当意指特定的饱和水平时，使用命名″烯烃基″，如下文所定义。在一些实施方案中，烷基基团是(C1-C40)烷基。在一些实施方案中，烷基基团是(C1-C6)烷基。

如本文所用的术语″烯烃基″是指通过从母体烷烃的单个碳原子上去除一个氢原子而衍生的饱和的支链、直链或环状的烷基基团。典型的烯烃基基团包括但不限于甲醇；乙醇；丙醇类，例如丙烷-1-基、丙烷-2-基(异丙基)、环丙烷-1-基等；丁烷基类，例如丁烷-1-基、丁烷-2-基(仲丁基)、2-甲基-丙烷-1-基(异丁基)、2-甲基-丙烷-2-基(叔丁基)、环丁烷-1-基等；及类似基团。在一些实施方案中，烷烃基基团是(C1-C40)烷烃基。在一些实施方案中，烷烃基基团是(C1-C6)烷烃基。

如本文所用的术语″烯烃基″是指通过从母体烯烃的单个碳原子上去除一个氢原子而衍生的具有至少一个碳碳双键的不饱和的支链、直链或环状的烷基基团。所述基团可以呈围绕所述双键的顺式或反式构象。典型的烯烃基基团包括但不限于乙烯基；丙烯基类，例如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、丙-2-烯-2-基、环丙-1-烯-1-基、环丙-2-烯-1-基；丁烯基类，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1，3-二烯-1-基、丁-1，3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1，3-二烯-1-基等；及类似基团。在一些实施方案中，烯烃基基团是(C2-C40)烯烃基。在一些实施方案中，烯烃基基团是(C2-C6)烯烃基。

如本文所用的术语″炔烃基″是指通过从母体炔烃的单个碳原子上去除一个氢原子而衍生的具有至少一个碳碳三键的不饱和的支链、直链或环状的烷基基团。典型的炔烃基基团包括但不限于乙炔基；丙炔基类，例如丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁炔基类，例如丁-1-炔-1-基、丁-3-炔-1-基等；及类似基团。在一些实施方案中，炔烃基基团是(C2-C40)炔烃基。在一些实施方案中，炔烃基基团是(C2-C6)炔烃基。

如本文所用的术语″烷基二基″是指通过从母体烷烃、烯烃或炔烃的两个不同碳原子中的每一个上去除一个氢原子或者通过从母体烷烃、烯烃或炔烃的单个碳原子上去除两个氢原子而衍生的饱和或不饱和的支链、直链或环状的二价烃基。两个单价基团中心或者二价基团中心的每个价可以与相同或不同原子形成键。典型的烷基二基包括但不限于甲烷二基；乙基二基类，例如乙烷-1，1-二基、乙烷-1，2-二基、乙烯-1，1-二基、乙烯-1，2-二基；丙基二基类，例如丙烷-1，1-二基、丙烷-1，2-二基、丙烷-2，2-二基、丙烷-1，3-二基、环丙烷-1，1-二基、环丙烷-1，2-二基、丙-1-烯-1，1-二基、丙-1-烯-1，2-二基、丙-2-烯-1，2-二基、丙-1-烯-1，3-二基、环丙-1-烯-1，2-二基、环丙-2-烯-1，2-二基、环丙-2-烯-1，1-二基、丙-1-炔-1，3-二基等；丁基二基类，例如丁烷-1，1-二基、丁烷-1，2-二基、丁烷-1，3-二基、丁烷-1，4-二基、丁烷-2，2-二基、2-甲基-丙烷-1，1-二基、2-甲基-丙烷-1，2-二基、环丁烷-1，1-二基、环丁烷-1，2-二基、环丁烷-1，3-二基、丁-1-烯-1，1-二基、丁-1-烯-1，2-二基、丁-1-烯-1，3-二基、丁-1-烯-1，4-二基、2-甲基-丙-1-烯-1，1-二基、2-亚甲烷基-丙烷-1，1-二基、丁-1，3-二烯-1，1-二基、丁-1，3-二烯-1，3-二基、环丁-1-烯-1，2-二基、环丁-1-烯-1，3-二基、环丁-2-烯-1，2-二基、环丁-1，3-二烯-1，2-二基、环丁-1，3-二烯-1，3-二基、丁-1-炔-1，3-二基、丁-1-炔-1，4-二基、丁-1，3-二炔-1，4-二基等；及类似基团。当意指特定的饱和水平时，使用命名烷烃基二基、烯烃基二基和/或炔烃基二基。在一些实施方案中，烷基二基基团是(C1-C40)烷基二基。在一些实施方案中，烷基二基基团是(C1-C6)烷基二基。还考虑了饱和的无环烷烃基二基，其中基团中心位于末端碳，例如甲烷二基(甲桥)；乙烷-1，2-二基(乙桥)；丙烷-1，3-二基(丙桥)；丁烷-1，4-二基(丁桥)；及类似基团(也称为亚烷基桥，定义如下)。

如本文所用的术语″亚烷基桥″是指通过从直链母体烷烃、烯烃或炔烃的两个末端碳原子中的每一个上去除一个氢原子而衍生的具有两个末端单价基团中心的直链烷基二基基团。典型的亚烷基桥基团包括但不限于甲桥；亚乙基桥，例如乙烷桥、乙烯桥、乙炔桥；亚丙基桥，例如丙烷桥、丙[1]烯桥、丙[1，2]二烯桥、丙[1]炔桥等；亚丁基桥，例如丁烷桥、丁[1]烯桥、丁[2]烯桥、丁[1，3]二烯桥、丁[1]炔桥、丁[2]炔桥、丁[1，3]二炔桥等；及类似基团。当意指特定的饱和水平时，使用命名烷烃桥、烯烃桥和/或炔烃桥。在一些实施方案中，亚烷基桥基团是(C1-C40)亚烷基桥。在一些实施方案中，亚烷基桥基团是(C1-C6)亚烷基桥。

如本文所用的术语″杂烷基″、″杂烷烃基″、″杂烯烃基″、″杂烷基二基″和″亚杂烷基桥″分别是指其中一个或多个碳原子各自独立地被相同或不同的杂原子基团代替的烷基、烷烃基、烯烃基、炔烃基、烷基二基和亚烷基桥基团。可以包括在这些基团中的典型的杂原子基团包括但不限于-O-、-S-、-O-O-、-S-S-、-O-S-、--NR′、＝N-N＝、-N＝N-、-N(O)N-、-N＝N-NR′-、-PH-、-P(O)2-、-O-P(O)2-、-SH2-、-S(O)2-等，其中每个R＇独立地是氢，如本文所定义的烷基、烷烃基、烯烃基、炔烃基、芳基、芳基芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基或杂芳基-杂芳基。

如本文所用的术语″芳基″是指通过从母体芳环体系的单个碳原子上去除一个氢原子而衍生的单价芳族烃基团。典型的芳基基团包括但不限于衍生自以下的基团：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、甘菊环、苯、屈、六苯并苯、荧蒽、芴、并六苯、萘并四并苯(hexaphene)、己烯、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、并八苯、辛芬(octaphene)、艾氏剂(octalene)、卵苯(ovalene)、戊-2，4-二烯、并五苯、并环戊二烯、戊芬(pentaphene)、苝、非那烯、菲、二萘品苯、七曜烯、芘、吡蒽、玉红省(rubicene)、苯并菲、三萘等。在一些实施方案中，芳基基团是(C5-C14)芳基或(C5-C10)芳基。在一些实施方案中，芳基是苯基和萘基。

如本文所用的术语″芳基二基″是指通过从母体芳环体系的两个不同碳原子中的每一个上去除一个氢原子或者通过从母体芳环体系的单个碳原子上去除两个氢原子而衍生的二价芳族烃基团。两个单价基团中心或二价中心的每个价可以与相同或不同原子形成键。典型的芳基二基基团包括但不限于衍生自以下的二价基团：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、甘菊环、苯、屈、六苯并苯、荧蒽、氟、并六苯、萘并四并苯、己烯、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、并八苯、辛芬、艾氏剂、卵苯、戊-2，4-二烯、并五苯、并环戊二烯、戊芬、苝、非那烯、菲、二萘品苯、七曜烯、芘、吡蒽、玉红省、苯并菲、三萘等。在一些实施方案中，芳基二基基团是(C5-C14)芳基二基或(C5-C10)芳基二基。例如，一些芳基二基基团是衍生自苯和萘的二价基团，特别是菲-1，4-二基、萘-2，6-二基和萘-2，7-二基。

如本文所用的术语″亚芳基桥″是指通过从母体芳环体系的两个相邻碳原子的每一个上去除一个氢原子而衍生的具有两个相邻单价基团中心的二价桥基。将亚芳基桥基(例如苯桥)连接到母体芳环体系(例如苯)，产生稠合芳环体系(例如萘)。假定所述桥具有与其所产生的稠环体系的连接相一致的最大数量的非累积双键。为了避免重复计算碳原子，当亚芳基桥取代基是通过在包括替代取代基的结构上一起取两个相邻取代基而形成时，亚芳基桥的碳原子代替所述结构的桥接碳原子。举例来说，考虑以下结构：

其中R¹当单独时为氢，或者当与R²一起时为(C5-C14)亚芳基桥；并且R²当单独时为氢，或者当与R¹一起时为(C5-C14)亚芳基桥。

当R¹和R²各自为氢时，所得化合物为苯。当R¹与R²一起为C6亚芳基桥(苯桥)时，所得化合物为萘。当R¹与R²一起为C10亚芳基桥(萘桥)时，所得化合物为蒽或菲。典型的亚芳基桥基团包括但不限于醋蒽烯桥、苊烯桥、醋菲烯桥、蒽桥、甘菊环桥、苯桥(苯并)、屈桥、六苯并苯桥、荧蒽桥、芴桥、并六苯桥、萘并四并苯桥、己烯桥、不对称引达省桥、对称引达省桥、茚桥、萘(萘并)、并八苯桥、辛芬桥、艾氏剂桥、卵苯桥、戊-2，4-二烯桥、并五苯桥、并环戊二烯桥、戊芬桥、苝桥、非那烯桥、菲桥、二萘品苯桥、七曜烯桥、芘桥、吡蒽桥、玉红省桥、苯并菲桥、三萘桥等。在意指特定连接性时，(亚芳基桥的)所涉及桥接碳原子表示在括号中，例如[1，2]苯桥([1，2]苯并)、[1，2]萘桥、[2，3]萘桥等。因此，在上述实例中，当R¹与R²一起为[2，3]萘桥时，所得化合物为蒽。当R¹与R²一起为[1，2]萘桥时，所得化合物为菲。在一个实施方案中，亚芳基桥基团是(C5-C14)或(C5-C10)。

如本文所用的术语″芳基芳基″是指通过从其中通过单键将两个或更多个相同或不同的母体芳环体系直接结合在一起的环系的单个碳原子上去除一个氢原子而衍生的单价烃基团，其中这种直接环结数量比所涉及的母体芳环体系数量少一个。典型的芳基芳基基团包括但不限于联苯基、三苯基、苯基-萘基、联萘基、联苯基-萘基等。当指定构成芳基芳基基团的碳原子数目时，所述数目是指构成每个母体芳环的碳原子。例如，(C1-C14)芳基芳基是其中每个芳环包含5至14个碳的芳基芳基基团，例如联苯基、三苯基、联萘基、苯基萘基等。在一些情况下，芳基芳基基团的每个母体芳环体系独立地是(C5-C14)芳族或(C1-C10)芳族。在一些实施方案中，芳基芳基基团是其中所有母体芳环体系都相同的基团，例如联苯基、三苯基、联萘基、三萘基等。

如本文所用的术语″联芳基″是指具有通过单键直接连接在一起的两个相同的母体芳族体系的芳基芳基基团。典型的联芳基基团包括但不限于联苯基、联萘基、联蒽基等。在一些情况下，芳环体系是(C5-C14)芳环或(C5-C10)芳环。在一个实施方案中，联芳基基团是联苯基。

如本文所用的术语″芳基烷基″是指其中与碳原子(通常为末端或sp2碳原子)键合的氢原子之一被芳基基团代替的无环烷基基团。典型的芳基烷基基团包括但不限于苄基、2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙烷-1-基等。在意指特定的烷基部分时，使用命名芳基烷烃基、芳基烯烃基和/或芳基炔烃基。在一些实施方案中，芳基烷基基团是(C6-C40)芳基烷基，例如，芳基烷基基团的烷烃基、烯烃基或炔烃基部分是(C1-C26)并且芳基部分是(C5-C14)。在一些实施方案中，芳基烷基基团是(C6-C13)，例如，芳基烷基基团的烷烃基、烯烃基或炔烃基部分是(C1-C3)并且芳基部分是(C5-C10)。

如本文所用的术语″杂芳基″是指通过从母体杂芳环体系的单个原子上去除一个氢原子而衍生的单价杂芳族基团。典型的杂芳基基团包括但不限于衍生自以下的基团：吖啶、砷哚、咔唑、β-咔啉、色满、色烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、吲哚啉、吲哚嗪、异苯并呋喃、异色烯、异吲哚、异吲哚啉、异喹啉、异噻唑、异噁唑、萘啶、噁二唑、噁唑、呸啶、菲啶、菲咯啉、吩嗪、酞嗪、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯嗪、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹喔啉、四唑、噻二唑、噻唑、噻吩、三唑、呫吨等。在一些实施方案中，杂芳基基团是5-14元杂芳基或5-10元杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基基团是衍生自其中任何环杂原子都是氮的母体杂芳环体系如咪唑、吲哚、吲唑、异吲哚、萘啶、蝶啶、异喹啉、酞嗪、嘌呤、吡唑、吡嗪、哒嗪、吡啶、吡咯、喹唑啉、喹啉等的那些。

术语″杂芳基二基″是指通过从母体杂芳环体系的两个不同原子中的每一个上去除一个氢原子或者通过从母体杂芳环体系的单个原子上去除两个氢原子而衍生的二价杂芳族基团。两个单价基团中心或单个二价中心的每个价可以与相同或不同原子形成键。典型的杂芳基二基基团包括但不限于衍生自以下的二价基团：吖啶、砷哚、咔唑、β-咔啉、色满、色烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、吲哚啉、吲哚嗪、异苯并呋喃、异色烯、异吲哚、异吲哚啉、异喹啉、异噻唑、异噁唑、萘啶、噁二唑、噁唑、呸啶、菲啶、菲咯啉、吩嗪、酞嗪、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯嗪、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹喔啉、四唑、噻二唑、噻唑、噻吩、三唑、呫吨等。在一些实施方案中，杂芳基二基基团是5-14元杂芳基二基或5-10元杂芳基二基。在一些实施方案中，杂芳基二基基团是衍生自其中任何环杂原子都是氮的母体杂芳环体系如咪唑、吲哚、吲唑、异吲哚、萘啶、蝶啶、异喹啉、酞嗪、嘌呤、吡唑、吡嗪、哒嗪、吡啶、吡咯、喹唑啉、喹啉等的二价基团。

如本文所用的术语″亚杂芳基桥″是指通过从母体杂芳环体系的两个相邻原子中的每一个上去除一个氢原子而衍生的具有两个相邻的单价基团中心的二价桥基。将亚杂芳基桥基(例如吡啶桥)连接到母体芳环体系(例如苯)，产生稠合杂芳环体系(例如喹啉)。假定所述桥具有与其所产生的稠环体系的连接相一致的最大数量的非累积双键。为了避免重复计算碳原子，当亚杂芳基桥取代基是通过在包括替代取代基的结构上一起取两个相邻取代基而形成时，亚杂芳基桥的环原子代替所述结构的桥接环原子。举例来说，考虑以下结构：

其中R¹当单独时为氢，或者当与R²一起时为5-14元亚杂芳基桥；并且R²当单独时为氢，或者当与R¹一起时为5-14元亚杂芳基桥。

当R¹和R²各自为氢时，所得化合物为苯。当R¹与R²一起为6元亚杂芳基桥吡啶桥时，所得化合物为异喹啉、喹啉或喹嗪。当R¹与R²一起为10元亚杂芳基桥(例如异喹啉)时，所得化合物为例如吖啶或菲啶。典型的亚杂芳基桥基团包括但不限于吖啶桥、咔唑桥、β-咔啉桥、色烯桥、噌啉桥、呋喃、咪唑桥、吲唑烯桥、吲哚烯桥、吲哚嗪桥、异苯并呋喃桥、异色烯桥、异吲哚烯桥、异喹啉桥、异噻唑烯桥、异噁唑烯桥、萘啶桥、噁二唑烯桥、噁唑烯桥、呸啶桥、菲啶桥、菲咯啉桥、吩嗪桥、酞嗪桥、蝶啶桥、嘌呤桥、吡喃桥、吡嗪桥、吡唑烯桥、哒嗪桥、吡啶桥、嘧啶桥、吡咯烯桥、吡咯嗪桥、喹唑啉桥、喹啉桥、喹嗪桥、喹喔啉桥、四唑烯桥、噻二唑烯桥、噻唑烯桥、噻吩桥、三唑烯桥、呫吨桥等。在意指特定连接性时，(亚杂芳基桥的)所涉及桥接原子表示在括号中，例如[1，2]吡啶桥、[2，3]吡啶桥、[3，4]吡啶桥等。因此，在上述实例中，当R¹与R²一起为[1，2]吡啶桥时，所得化合物为喹嗪。当R¹与R²一起为[2，3]吡啶桥时，所得化合物为喹啉。当R¹与R²一起为[3，4]吡啶桥时，所得化合物为异喹啉。在一些实施方案中，亚杂芳基桥基团是5-14元亚杂芳基桥或5-10元亚杂芳基桥。在一些实施方案中，亚杂芳基桥基是衍生自其中任何环杂原子都是氮的母体杂芳环体系如咪唑桥、吲哚桥、吲唑桥、异吲哚桥、萘啶桥、蝶啶桥、异喹啉桥、酞嗪桥、嘌呤桥、吡唑桥、吡嗪桥、哒嗪桥、吡啶桥、吡咯桥、喹唑啉桥、喹啉桥等的那些。

如本文所用的术语″杂芳基-杂芳基″是指通过从其中通过单键将两个或更多个相同或不同的母体杂芳环体系直接结合在一起的环系的单个原子上去除一个氢原子而衍生的单价杂芳族基团，其中这种直接环结数量比所涉及的母体杂芳环体系数量少一个。典型的杂芳基-杂芳基基团包括但不限于联吡啶基、三吡啶基、吡啶基嘌呤基、联嘌呤基等。当指定环原子数目时，所述数目是指构成每个母体杂芳环体系的原子数。例如，5-14元杂芳基-杂芳基是其中每个母体杂芳环体系包含5至14个原子的杂芳基-杂芳基基团，例如联吡啶基、三吡啶基等。在一些实施方案中，每个母体杂芳环体系独立地是5-14元杂芳族或5-10元杂芳族。在一些实施方案中，杂芳基-杂芳基基团是其中所有母体杂芳环体系都相同的基团。在一些实施方案中，杂芳基-杂芳基基团是其中每个杂芳基基团衍生自其中任何环杂原子都是氮的母体杂芳环体系如咪唑、吲哚、吲唑、异吲哚、萘啶、蝶啶、异喹啉、酞嗪、嘌呤、吡唑、吡嗪、哒嗪、吡啶、吡咯、喹唑啉、喹啉等的那些。

如本文所用的术语″联杂芳基″是指具有通过单键直接连接在一起的两个相同的母体杂芳环体系的杂芳基-杂芳基基团。典型的联杂芳基基团包括但不限于联吡啶基、联嘌呤基、联喹啉基等。在一些实施方案中，杂芳环体系是5-14元杂芳环或5-10元杂芳环。在一些实施方案中，联杂芳基基团是其中杂芳基基团衍生自其中任何环杂原子都是氮的母体杂芳环体系的那些，例如联咪唑基、联吲哚基、联吲唑基、联异吲哚基、联萘啶基、联蝶啶基、联异喹啉基、联酞嗪基、联嘌呤基、联吡唑基、联吡嗪基、联哒嗪基、联吡啶基、联吡咯基、联喹唑啉基、联喹啉等。

如本文所用的术语″杂芳基烷基″是指其中与碳原子(通常为末端或sp2碳原子)键合的氢原子之一被杂芳基基团代替的无环烷基基团。在意指特定的烷基部分时，使用命名杂芳基烷烃基、杂芳基烯烃基和/或杂芳基炔烃基。在一些实施方案中，杂芳基烷基基团是6-20元杂芳基烷基，例如，杂芳基烷基的烷烃基、烯烃基或炔烃基部分是1-6元并且杂芳基部分是5-14元杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基烷基是6-13元杂芳基烷基，例如，烷烃基、烯烃基或炔烃基部分是1-3元并且杂芳基部分是5-10元杂芳基。

如本文所用的术语″被取代的″是指其中一个或多个氢原子各自独立地被相同或不同的取代基代替的基团。典型的取代基包括但不限于-X、-R、-O-、＝O、-OR、-O-OR、-SR、-S-、＝S、-NRR、＝NR、全卤基(C1-C6)烷基、-CX3、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、--NCO、--NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-S(O)2O-、-S(O)2OH、-S(O)2R、-C(O)R、-C(O)X、-C(S)R、-C(S)X、-C(O)OR、-C(O)O-、-C(S)OR、-C(O)SR、-C(S)SR、-C(O)NRR、-C(S)NRR和-C(NR)NRR，其中每个X独立地是卤素(例如-F或-C1)并且每个R独立地是氢，如本文所定义的烷基、烷烃基、烯烃基、烷烃基、芳基、芳基烷基、芳基芳基、杂芳基、杂芳基烷基或杂芳基-杂芳基。取代任何特定基团的实际取代基将取决于被取代的基团的身份。

如本文所用的术语″溶剂化物″是指包含一个或多个本公开化合物分子与一个或多个溶剂分子的聚集体。形成溶剂化物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。术语″水合物″是指其中溶剂分子是水的聚集体或复合物。溶剂可以是无机溶剂，例如水，在这种情况下溶剂化物可以是水合物。可选地，溶剂可以是有机溶剂，例如乙醇。因此，本公开的化合物可以作为水合物存在，包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相应的溶剂化形式。本公开的化合物可以是真溶剂化物，而在其它情况下，本公开的化合物可以仅保留不定的水或者是水和一些不定溶剂的混合物。

如本文所用的术语″氧化固醇″意在涵盖一种或多种形式的氧化胆固醇。本文所述的氧化固醇独立地或共同地对患者中的骨生长具有活性，如WO 2013169399 A1中所述，所述文献特此通过引用整体并入。

氧化固醇、固醇或二醇可以呈药学上可接受的盐形式。潜在药学上可接受的盐的一些实例包括不会显著增加化合物毒性的那些成盐酸和碱，例如，碱金属如镁、钾和铵的盐，无机酸如盐酸、氢碘酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸的盐，以及有机酸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、古洛糖酸、琥珀酸、芳基磺酸例如对甲苯磺酸的盐等。

氧化固醇、固醇或二醇的药学上可接受的盐包括从药学上可接受的无毒碱或酸(包括无机或有机碱、无机或有机酸和脂肪酸)制备的盐。衍生自无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐、锌盐等。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，包括天然存在的取代胺的取代胺，环状胺和碱性离子交换树脂，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N＇-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡萄糖胺、组氨酸、哈胺、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。当本申请的化合物为碱性时，盐可以由药学上可接受的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备。这类酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、丙二酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸等。也可以使用脂肪酸盐，例如具有大于2个碳、大于8个碳或大于16个碳的脂肪酸盐，如丁酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、花生酸盐等。

在一些实施方案中，为了降低氧化固醇、固醇或二醇的溶解性以帮助获得控释储库效果，氧化固醇、固醇或二醇作为游离碱利用或以具有相对较低溶解性的盐形式利用。例如，本申请可以利用不溶性盐如脂肪酸盐。代表性的脂肪酸盐包括具有8至20个碳溶解性的油酸盐、亚油酸盐或脂肪酸盐，例如棕榈酸盐或硬脂酸盐。

术语″溶剂化物″是由一个或多个溶质分子例如化合物或其药学上可接受的盐与一个或多个溶剂分子形成的复合物或聚集体。这种溶剂化物可以是具有基本上固定摩尔比的溶质和溶剂的结晶固体。合适的溶剂包括例如水、乙醇等。

如本文所用的术语″生物活性″组合物或″药物″组合物可以互换使用。两个术语都指可以施用于受试者的组合物。生物活性或药物组合物在本文中有时被称为本公开的″药物组合物″或″生物活性组合物″。有时，短语″施用OXY133″在本文中用于将该化合物施用于受试者的情形(例如，使受试者与化合物接触，注射化合物，以药物储库施用化合物等)。应理解，用于这种用途的化合物通常可以是包含OXY133的药物组合物或生物活性组合物的形式。

″治疗有效量″或″有效量″使得当施用氧化固醇(例如OXY133)、固醇、二醇时导致生物活性改变，例如增强骨生长等。施用于患者的剂量可以是单剂量或多剂量，这取决于多种因素，包括药物的施用药代动力学性质，施用途径，患者状况和特征(性别、年龄、体重、健康、体型等)和症状程度，同时治疗，治疗频率和所需效果。在一些实施方案中，制剂被设计用于立即释放。在其它实施方案中，制剂被设计用于持续释放。在其它实施方案中，制剂包含一个或多个立即释放表面和一个或多个持续释放表面。

″药学上可接受的载体″是指并非在生物学上或其它方面不合需要的材料，例如，所述材料可以施用于受试者而不引起任何不希望的生物学效应或以有害的方式与包含其的药物组合物的任何其它组分相互作用。

如本文所用的术语″类似物″或″衍生物″涉及在结构和功能中与另一种化学物质类似的化学分子，其通常在结构上相差一个单元或基团，如果它保留与母体化学物质相同功能的话，差异可在于多于一个基团(例如2、3或4个基团)的修饰。这些修饰对于本领域普通技术人员来说是常规的，并且包括例如额外或被取代的化学部分，例如酸的酯或酰胺，保护基团如用于醇或硫醇的苄基基团，和用于胺的叔丁氧基羰基基团。还包括对烷基侧链的修饰，例如烷基取代(例如甲基、二甲基、乙基等)，对侧链的饱和或不饱和水平的修饰，以及添加修饰基团如被取代的苯基和苯氧基。衍生物还可包括结合物如生物素或抗生物素蛋白部分，酶如辣根过氧化物酶等，以及放射性标记、生物发光、化学发光或荧光部分。此外，可将部分加入到本文所述的药剂中以改变其药代动力学性质，例如增加体内或离体的半衰期，或增加其细胞穿透性质，以及其它所需特性。还包括OXY133衍生物，已知其可增强药物的许多所需性质(例如溶解性、生物利用性、制造等)。术语″衍生物″在其范围内还包括对母序列进行的改变，包括提供功能上等同或功能上改善的分子的添加、缺失和/或取代。

术语″部分″是指分子的任何部分。

″储库″包括但不限于胶囊、微球、微粒、微胶囊、微纤维颗粒、纳米球、纳米颗粒、包衣、基质、糯米纸囊剂、丸剂、球粒、乳剂、脂质体、胶束、凝胶或其它药物递送组合物或其组合。在一些实施方案中，适用于储库的材料是药学上可接受的可生物降解的和/或经FDA批准的任何可生物吸收材料或GRAS材料。这些材料可以是聚合物或非聚合物，以及合成的或天然存在的，或其组合。

如本文所用的术语″可植入的″是指保留成功安置在哺乳动物内的潜力的生物相容装置(例如药物储库)。如本文所用的表述″可植入装置″及其类似表述是指可通过手术、注射或其它合适手段植入的物体，其主要功能通过其物理存在或机械性质来实现。

″局部″递送包括其中一种或多种药物沉积在组织(例如骨腔)内或与其紧密接近(例如在约0.1cm内，或优选在约10cm内)的递送。例如，从药物储库局部递送的药物剂量可以例如比口服剂量或注射剂量少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或99.999％。

术语″哺乳动物″是指来自分类学类别″哺乳动物″的生物，包括但不限于人类，其它灵长类动物如黑猩猩、猿、猩猩和猴，大鼠，小鼠，猫，狗，牛，马等。

氧化固醇可以具″成骨性″，其中它可以通过一种或多种机制如骨生成、骨传导和/或骨诱导来增强或加速新骨组织向内生长。

提供了有效且安全地制备包括OXY133的氧化固醇的新型组合物和方法。还提供了可以有效且安全地产生OXY133的方法和组合物。

下面的章节标题不应受到限制，并且可与其它章节标题互换。

氧化固醇

本公开包括成骨氧化固醇(例如OXY133)、固醇或二醇及其在体外促进成骨分化的能力。OXY133是一种特别有效的成骨剂。在各种应用中，OXY133可用于治疗将受益于局部刺激骨形成的病状，例如脊柱融合，骨折修复，骨再生/组织应用，用于牙科植入的颌中的骨密度的增加，骨质疏松症等。OXY133的一个特定优点是，与其它成骨氧化固醇相比，它提供了更大的合成容易性和改进的融合时间。OXY133是可用作骨生长的合成代谢治疗剂的小分子，以及用于治疗多种其它病状的有用药剂。

本申请公开的一个方面是具有下式的化合物，称为OXY133：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。所述OXY133可用作包含OXY133或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物和药学上可接受的载体的生物活性或药物组合物。

本公开的另一方面是用于在细胞或组织中诱导(刺激、增强)刺猬蛋白(Hh)通路介导的应答的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与治疗有效量的OXY133接触。所述细胞或组织可以在体外或在受试者如哺乳动物中。刺猬蛋白(Hh)通路介导的应答涉及刺激成骨细胞分化，骨形态发生和/或骨质增生；刺激毛发生长和/或软骨形成；刺激新血管生成，例如血管生成，从而增强缺血组织的血液供应；或者它是抑制脂肪细胞分化，脂肪细胞形态发生和/或脂肪细胞增殖；或刺激祖细胞进行神经发生。Hh介导的应答可包括用于再生医学的多种类型组织中的任何一种的再生。本公开的另一方面是用于治疗患有骨病、骨质减少、骨质疏松症或骨折的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含OXY133的生物活性组合物或药物组合物。受试者可以在选定的时间间隔下以有效剂型以治疗有效剂量施用生物活性组合物或药物组合物，以例如增加骨质量，改善骨质疏松症的症状，减少、消除、预防或治疗动脉粥样硬化病变等。受试者可以在选定的时间间隔下以有效剂型以治疗有效剂量施用生物活性组合物或药物组合物，以改善骨质疏松症的症状。在一些实施方案中，包含OXYl33的组合物可包括间充质干细胞以在靶向手术区域诱导细胞的成骨细胞分化。

在多个方面，OXY133可以通过局部施用而施用于细胞、组织或器官。例如，OXY133可以用乳膏剂等局部施用，或者它可以被注射或以其它方式直接引入到细胞、组织或器官中，或者它可以用合适的医疗装置例如如本文所讨论的药物储库引入。

在一些实施方案中，OXY133、固醇或二醇的剂量是约10皮克/天至约80毫克/天。OXY133、固醇或二醇的其它剂量包括约2.4纳克/天至约50毫克/天；约50纳克/天至约2.5毫克/天；约250纳克/天至约250微克/天；约250纳克/天至约50微克/天；约250纳克/天至约25微克/天；约250纳克/天至约1微克/天；约300纳克/天至约750纳克/天或约0.50微克/天至500纳克/天。在多个实施方案中，剂量可以是约0.01至约10微克/天或约1纳克/天至约120微克/天。

除化合物OXY133、固醇或二醇之外，本公开的其它实施方案涵盖OXY133中存在的任何立构中心的任何和所有单独的立体异构体，包括化合物的非对映异构体、外消旋体、对映异构体和其它异构体。在本公开的一些实施方案中，OXY133、固醇、氧化固醇、二醇可包括化合物的所有多晶型物、溶剂化物或水合物，例如水合物和与有机溶剂形成的那些。

制备盐的能力取决于化合物的酸性或碱性。化合物的合适的盐包括但不限于酸加成盐，例如用盐酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、碳酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和2-乙酰氧基苯甲酸制得的盐；用糖精制得的盐；碱金属盐，如钠盐和钾盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；以及与有机或无机配体形成的盐，如季铵盐。其它合适的盐包括但不限于化合物的乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷酸盐、己基间苯二酚盐、哈胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代羟酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙碘化物和戊酸盐。

在多个实施方案中，OXY133、固醇或二醇包括一种或多种生物功能。也就是说，当与间充质干细胞或骨髓基质细胞接触时，OXY133、固醇或二醇可以诱导生物反应。例如，OXY133、固醇或二醇可刺激成骨细胞分化。在一些实施方案中，包括OXY133、固醇或二醇的生物活性组合物在向哺乳动物细胞(例如体外细胞或者人类或动物中的细胞)施用时可以包括一种或多种生物功能。例如，这种生物活性组合物可刺激成骨细胞分化。在一些实施方案中，这样的生物功能可以由刺猬蛋白通路的刺激引起。

制备中间体二醇的方法

在一些实施方案中，本公开提供了用于制备OXY133的中间体二醇的制备方法，如下所示。二醇也可用于促进骨生长。以前用于OXY133生产的合成方法效率低下并且不适合放大制造。OXY133的一些立体异构体的表现不如其它。所公开的方法是立体选择性的，并且产生高收率的以下所示的二醇的特定异构体形式，其已显示产生OXY133的最佳有效异构体形式。

公开了合成中间体二醇的反应的多个实施方案。所合成的二醇具有IUPAC名称(3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇。通常，合成二醇的方法包括使孕烯醇酮、孕烯醇酮醋酸酯或孕烯醇酮衍生物与有机金属试剂反应以促进C20位的烷基化，如下所示：

方案1

在一个实施方案中，如上文方案1中所示，孕烯醇酮醋酸酯(式1)可被有机金属试剂烷基化以合成中间体二醇，上文以式2示出。在一些实施方案中，使孕烯醇酮醋酸酯与格氏试剂反应以促进在孕烯醇酮醋酸酯分子上的C20位的烷基化。在一些实施方案中，使用正己基氯化镁作为有机金属试剂。

方案2

在一些实施方案中，如上文方案2所示，使孕烯醇酮与格氏试剂如正己基氯化镁反应以促进孕烯醇酮分子的C20位的烷基化，形成如式2所示的中间体二醇。

合成中间体二醇(式2)或(3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇的方法具立体选择性并且产生高收率的二醇。例如，在一些实施方案中，二醇的所需立体异构体的收率为约60％至约70％。在一些实施方案中，二醇的所需立体异构体的收率为约50％至约60％。然而，预期收率百分比可以高于或低于这些量。例如，如上所示的式2的收率百分比可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，收率百分比可以高于95％。

在多个实施方案中，烷基化反应在极性有机溶剂如四氢呋喃中进行。然而，该反应可以在各种极性有机溶剂中进行。例如，该反应可以在二乙醚、乙醚、二甲醚等中进行。

在一些实施方案中，将孕烯醇酮或孕烯醇酮醋酸酯用作起始反应物。然而，在其它实施方案中，可使用孕烯醇酮醋酸酯的衍生物。例如，可用于本公开中的化合物的其它具体实例包括：孕烯醇酮硫酸酯，孕烯醇酮磷酸酯，孕烯醇酮甲酸酯，孕烯醇酮半草酸酯，孕烯醇酮半丙二酸酯，孕烯醇酮半戊二酸酯，20-氧代孕甾-5-烯-3β-基羧基甲基醚，3β-羟基孕甾-5-烯-20-酮硫酸酯，3-羟基-19-去甲孕甾-1，3，5(10)-三烯-20-酮，3-羟基-19-去甲孕甾-1，3，5(10)，6，8-五烯-20-酮，17α-异孕烯醇酮硫酸酯，17-乙酰氧基孕烯醇酮硫酸酯，21-羟基孕烯醇酮硫酸酯，20β-乙酰氧基-3β-羟基孕甾-5-烯-硫酸酯，孕烯醇酮硫酸酯20-乙烯缩酮，孕烯醇酮硫酸酯20-羧基甲基肟，20-脱氧孕烯醇酮硫酸酯，21-乙酰氧基-17-羟基孕烯醇酮硫酸酯，17-丙基氧基孕烯醇酮硫酸酯，17-丁基氧基孕烯醇酮硫酸酯，孕烯醇酮硫酸酯的21-硫醇酯，吡啶盐，咪唑盐，6-甲基孕烯醇酮硫酸酯，6，16α-二甲基孕烯醇酮硫酸酯，3β-羟基-6-甲基孕甾-5，16-二烯-20-酮硫酸酯，3β-羟基-6，16-二甲基孕甾-5，16-二烯-20-酮硫酸酯，3β-羟基孕甾-5，16-二烯-20-酮硫酸酯，薯蓣皂素硫酸酯，3β-羟基雄甾-5-烯-17β-甲酸甲酯硫酸酯，3α羟基-5β-孕甾-20-酮甲酸酯，3α-羟基-5β-孕甾-20-酮半草酸酯，3α-羟基-5β-孕甾-20-酮半丙二酸酯，3α-羟基-5β-孕甾-20-酮半琥珀酸酯，3α-羟基-5β-孕甾-20-酮半戊二酸酯，雌二醇-3-甲酸酯，雌二醇-3-半草酸酯，雌二醇-3-半丙二酸酯，雌二醇-3-半琥珀酸酯，雌二醇-3-半戊二酸酯，雌二醇-17-甲基醚，雌二醇-17-甲酸酯，雌二醇-17-半草酸酯，雌二醇-17-半丙二酸酯，雌二醇-17-半琥珀酸酯，雌二醇-17-半戊二酸酯，雌二醇-3-甲基醚，17-脱氧雌酮和17β-羟基雌甾-1，3，5(10)-三烯-3-基羧基甲基醚。

在一些实施方案中，有机金属包含正己基氯化镁。然而，在一些实施方案中，烷基化反应可以使用烷基锂例如正己基锂进行。在多个实施方案中，有机金属包括烷基卤化物。例如，有机金属试剂可具有下式：

R-Mg-X，

其中Mg包含镁，X包含氯、溴、氟、碘或砹，并且R包含烷基、杂烷基、烷烃基、杂烷烃基、烯烃基、杂烯烃基、炔烃基、烷基二基、杂烷基二基、亚烷基桥、亚杂烷基桥、芳基、芳基二基、亚芳基桥、芳基芳基、联芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基二基、亚杂芳基桥、杂芳基-杂芳基、联杂芳基、杂芳基烷基或其组合。在一些实施方案中，R取代基包含(C1-C20)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基和(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基、或(C₄-C₁₀)亚烷基桥或亚杂烷基桥。R取代基可以是环状或无环的，支链或无支链的，被取代或未被取代的，芳族，饱和或不饱和的链，或其组合。在一些实施方案中，R取代基是脂族基团。在一些实施方案中，R取代基是环状基团。在一些实施方案中，R取代基是己基基团。

可选地，有机金属可包含式：R-Li，其中Li包含锂并且R包含烷基、杂烷基、烷烃基、杂烷烃基、烯烃基、杂烯烃基、炔烃基、杂烷烃基、烷基二基、杂烷基二基、亚烷基桥、亚杂烷基桥、芳基、芳基二基、亚芳基桥、芳基芳基、联芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基二基、亚杂芳基桥、杂芳基-杂芳基、联杂芳基、杂芳基烷基或其组合。在一些实施方案中，R取代基包含(C₁-C₂₀)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基和(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基、或(C₄-C₁₀)亚烷基桥或亚杂烷基桥。R取代基可以是环状或无环的，支链或无支链的，被取代或未被取代的，芳族，饱和或不饱和的链，或其组合。在一些实施方案中，R取代基是脂族基团。在一些实施方案中，R取代基是环状基团。在一些实施方案中，R取代基是己基基团。

在一些实施方案中，烷基化反应是放热的，并且可对反应容器进行温度控制以维持最佳的反应动力学。在一些实施方案中，放热反应时每磅溶液释放约1000BTU。由于反应的强烈放热性质，因此格氏试剂必须缓慢加入，以使得挥发性组分例如醚不因反应热而蒸发。在一些实施方案中，反应容器可以通过内部冷却盘管进行冷却。冷却盘管可以通过外部气体/液体制冷单元供应冷却剂。在一些实施方案中，反应容器的内部温度保持在低于15℃、10℃、5℃或1℃。在一些实施方案中，反应容器在烷基化反应期间保持在约0℃以形成式2的中间体二醇。

在多个实施方案中，式2的二醇与副产物一起合成并且可被纯化。例如，所得式2的二醇可以是非对映异构体混合物的副产物。在多个实施方案中，可以分离和纯化式2的二醇。也就是说，式2的二醇可以通过过滤，离心，基于相对挥发性来分离挥发性液体的蒸馏，结晶，重结晶，蒸发以从非挥发性溶质中除去挥发性液体，溶剂萃取以除去杂质，将组合物溶解在其中可溶解其它组分的溶剂中或其它纯化方法，分离和纯化至所需纯度，例如约95％至约99.9％。二醇可以通过使其与有机和/或无机溶剂接触来纯化，所述溶剂例如THF、水、二乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、n，n-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、氨、叔丁醇、正丙醇、乙醇、甲醇、乙酸或其组合。

在多个实施方案中，烷基化步骤和纯化步骤发生在相同的反应容器中。

在一些实施方案中，二醇用氯化铵或乙酸水溶液淬灭以减少存在的阴离子量并中和反应，然后将其与所得有机层分离。分离的残余物通过蒸发回收并通过硅胶柱色谱法纯化。

二醇可以是无水的或呈单水合物形式。然而，在其它实施方案中，纯化的二醇可以其它水合形式例如二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等以及相应的溶剂化形式结晶。在其它实施方案中，纯化的二醇结晶为共晶体或药学上可接受的盐。

制备OXY133的方法

在一些实施方案中，本公开提供了一种制备OXY133的方法，如下所示。先前的OXY133合成方法产生OXY133中间体的非对映异构体混合物，其需要纯化方法来分离。如上文所讨论形成中间体二醇，所公开的方法具立体选择性并且产生高收率的特定异构形式的OXY133。OXY133的式如下所示。

公开了合成OXY133的反应的多个实施方案。OXY133具有IUPAC名称(3S，5S，6S，8R，9S，10R，13S，14S，17S)-17-((S)-2-羟基辛-2-基)-10，13-二甲基十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3，6-二醇。OXY133先前已通过不适于放大的复杂工艺合成，如下所示：

方案3

但是，该反应难以在单个容器中进行。上面显示的反应涉及更多试剂来进行反应步骤(例如阻断和脱保护基团和步骤)，其对环境有不利影响。另外，已知的方法涉及昂贵并且通常难以获得的试剂。此外，方案3中所示的方法得到相对较低的收率，具有更多的降解产物、杂质并产生许多有毒的副产物。

通常，如本文所公开的合成OXY133的方法包括在如下所示的反应中使如本文所述合成的二醇与硼烷反应：

方案4

在一些实施方案中，在反应方案4中通过具有式2的中间体二醇的硼氢化和氧化反应产生粗制和未纯化的OXY133。可用于反应的硼烷化合物包括BH₃，B₂H₆，BH₃S(CH₃)₂(BMS)，具有膦和胺的硼烷加合物，例如硼烷三乙胺；RBH₂形式的单取代硼烷，其中R＝烷基和卤离子，单烷基硼烷(例如IpcBH2、单异松蒎基硼烷)，单溴-和单氯-硼烷，单氯硼烷和1，4-二氧杂环己烷的复合物，包括大体积硼烷的二取代硼烷，例如二烷基硼烷化合物如二乙基硼烷、双-3-甲基-2-丁基硼烷(二仲异戊基硼烷)、9-硼杂双环[3，3，1]壬烷(9-BBN)、二仲异戊基硼烷(Sia2BH)、二环己基硼烷(Chx2BH)、三烷基硼烷、二烷基卤代硼烷、二均三甲苯基硼烷(C₆H₂Me₃)₂BH、烯烃基硼烷、频哪醇硼烷或儿茶酚硼烷或其组合。

简言之，硼氢化和氧化反应是两步反应。硼和氢加在烯烃的双键上以与烯烃形成复合物。因此反应的硼化阶段具立体选择性和区域选择性。反应的氧化阶段涉及碱性过氧化氢水溶液以提供羟基取代基来代替硼。参见Vollhart，KP，Schore，NE，2007，《有机化学：结构和功能(Organic Chemistry：Structure and Function)》，第五版，New York，NY，Custom Publishing Company。因此，中间体具有式2的被保护二醇与硼烷和过氧化氢反应，形成粗制C3被保护的OXY133。在一些实施方案中，形成粗OXY133的步骤发生在与烷基化反应相同的反应容器中。在其它实施方案中，形成粗OXY133的步骤发生在与烷基化反应不同的反应容器中。

与形成中间体二醇的步骤一样，合成OXY133的硼氢化-氧化步骤具立体选择性并且产生高收率。例如，在一些实施方案中，粗OXY133的收率百分比可能高于或低于这些量。例如，如上所示的式2的收率百分比可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，收率百分比可以高于95％。

在多个实施方案中，硼氢化-氧化反应在极性有机溶剂如四氢呋喃中进行。然而，该反应可以在各种极性有机溶剂中进行。例如，该反应可以在二乙醚、乙醚、二甲醚等中进行。

在一些实施方案中，硼氢化-氧化反应是放热的，并且反应容器必须进行温度控制以维持最佳的反应动力学。具体而言，氧化阶段是极其放热的。由于反应的强烈放热性质，过氧化氢因此可以缓慢加入，以使得挥发性组分例如醚不因反应热而蒸发。在一些实施方案中，反应容器可通过内部冷却盘管进行冷却。冷却盘管可以通过外部气体/液体制冷单元供应冷却剂。在一些实施方案中，反应容器的内部温度保持在小于10℃、5℃、1℃或0℃。在一些实施方案中，在硼氢化-氧化反应期间反应容器保持在约-5℃。

在某些实施方案中，被保护的二醇中二醇的盐、水合物、溶剂化物或结晶形式的结晶度百分比为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，结晶度百分比可以是基本上100％，其中基本上100％表明二醇的全部量似乎都是结晶的，最好可以使用本领域已知的方法测定。因此，治疗有效量的二醇可以包括结晶度不同的量。这些包括其中随后将一定量固体形式的结晶二醇溶解、部分溶解、悬浮或分散在液体中的情况。

OXY133的纯化

在一些实施方案中，必须将粗OXY133从反应混合物中分离，然后纯化。在一些实施方案中，将有机溶剂如二氯甲烷加入到粗OXY133反应混合物中，并且分离所得的有机层。一旦分离，粗OXY133就以半固体粘性物质形式存在。粗OXY133可以通过任何合适的手段(例如二氯甲烷等)溶解，并用有机溶剂如甲醇-乙酸乙酯置于硅胶柱中以溶剂化粗OXY133。在一些实施方案中，粗OXY133可以结晶或重结晶。在一些实施方案中，通过在丙酮/水的3∶1混合物中使粗OXY133重结晶来形成纯化的OXY133，如下所示：

方案5

如上所示，在结晶时，纯化的OXY133形成水合物。但是，它可以呈无水形式。在一些实施方案中，本文所述的OXY133的任何结晶形式的结晶度百分比可以相对于OXY133的总量而变化。

在某些实施方案中，OXY133中OXY133的盐、水合物、溶剂化物或结晶形式的结晶度百分比可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，结晶度百分比可以是基本上100％，其中基本上100％表明OXY133的全部量似乎都是结晶的，最好可以使用本领域已知的方法测定。因此，治疗有效量的OXY133可以包括结晶度不同的量。这些包括其中随后将一定量固体形式的结晶OXY133溶解、部分溶解、或者悬浮或分散在液体中的情况。

在一个实施方案中，纯化的OXY133结晶为单水合物。然而，在其它实施方案中，纯化的OXY133可以其它水合形式例如二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等以及相应的溶剂化形式结晶。在其它实施方案中，纯化的OXY133结晶为共晶体或药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，含有粗OXY133的反应混合物可以通过与庚烷混合而固化。随后可将产物过滤并悬浮于二氯甲烷中。在一些实施方案中，粗OXY133可以从悬浮液中过滤并且使用丙酮和水或其它有机或无机溶剂(例如二乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、n，n-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、氨、叔丁醇、正丙醇、乙醇、甲醇、乙酸或其组合)结晶。

在多个实施方案中，粗OXY133可以通过任何其它传统手段分离和纯化。也就是说，粗OXY133可以通过过滤，离心，基于相对挥发性蒸馏来分离挥发性液体，结晶，重结晶，蒸发以从非挥发性溶质中除去挥发性液体，溶剂萃取以除去杂质，将组合物溶解在其中可溶解其它组分的溶剂中或其它纯化方法，分离和纯化至所需纯度，例如约95％至约99.9％。在多个实施方案中，硼氢化-氧化步骤和纯化步骤发生在相同反应容器中。在多个实施方案中，烷基化步骤、硼氢化-氧化步骤和纯化步骤发生在相同反应容器中。

合成中间体二醇(式2)的方法具立体选择性并且产生高收率的OXY133。例如，在一些实施方案中，纯化的OXY133的收率在约20％与约99％之间。在一些实施方案中，纯化的OXY133的收率在约20％与约80％之间。在一些实施方案中，纯化的OXY133的收率在约25％与约70％或约28％之间。然而，预期收率百分比可能高于或低于这些量。

在一些实施方案中，纯化的OXY133通过结晶形成晶体形式，其通过冷却液体进料流或者添加降低副产物和未使用的反应物在反应混合物中的溶解性的沉淀剂以使得OXY133形成晶体而将OXY133与液体进料流分离。在一些实施方案中，然后通过过滤或离心将固体晶体与剩余液体分离。晶体可以在溶剂中再溶解，然后重结晶，然后通过过滤或离心将晶体与剩余液体分离，以获得高纯度的OXY133样品。在一些实施方案中，然后可以将晶体制粒成所需粒度。

在一些实施方案中，通过核磁共振或质谱法证实所得OXY133的纯度。如图2-5中所示，1H NMR、13C NMR、红外光谱和质谱分析表明OXY1 33产物具有高纯度(例如，具有98重量％至约99.99重量％纯度)。

在一些实施方案中，可以纯化粗OXY133，其中纯化的OXY133以结晶形式形成在溶剂中，然后从溶剂中移出，形成纯度为约98％至约99.99％的高纯度OXY133。在一些实施方案中，OXY133可以在纯化之前或之后经由过滤或真空过滤回收。

制备孕烯醇酮衍生物的方法

在一些实施方案中，本公开提供了用于制备孕烯醇酮衍生物的方法，所述孕烯醇酮衍生物是制备二醇衍生物的有用原料，而所述二醇衍生物又适用于制备OXY133类似物。这些孕烯醇酮衍生物在C3位被保护。有用的孕烯醇酮衍生物包括

其中R₁是保护基团，其可以包括甲基、乙基、苄基、氨基甲酸酯基或甲硅烷基基团。在一些实施方案中，孕烯醇酮衍生物包括其中R1可以是甲基、乙基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、叔丁基、烯丙基、三异丙基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基基团的化合物。通常，合成孕烯醇酮衍生物的方法在本领域中是已知的，并且包括Williamson醚合成和Ullmann缩合。

在某些实施方案中，在Williamson合成之后，为了在C3处提供基于烷基的醚，使孕烯醇酮与烷基卤化物如R₁X在碱存在下反应。在多个实施方案中，R₁可以是C₁-C₅伯烷基基团，包括例如甲基、乙基、丙基、叔丁基。有用的碱包括强碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙。

在其它实施方案中，有用的孕烯醇酮衍生物在C3位包括芳族基团，例如(C₂-C₁₀)芳基或杂芳基基团。在一些实施方案中，为了偶联孕烯醇酮的C3位上的苯酚基团，可以使用Ullman缩合或Williamson醚合成。在Ullmann缩合中，芳族醇如孕烯醇酮可以在约160℃下在铜和强碱存在下与芳基卤化物反应，以在孕烯醇酮的C3处产生芳族醚。如在Williamson醚合成中一样，有用的强碱包括氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钙。

制备二醇衍生物的方法

在某些实施方案中，提供了可用于制备OXY133类似物的中间体C3被保护二醇的制备方法。通常，在C3位被保护的中间体二醇衍生物的合成方法包括使孕烯醇酮衍生物例如孕烯醇酮醚、酯或氨基甲酸酯与有机金属试剂反应以促进在孕烯醇酮C20位的烷基化，如下图所示：

其中R₁可以是具有至少一个碳的脂族或环状取代基。在其它实施方案中，R₁可以是叔丁基、烯丙基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、氨基甲酸酯基或甲硅烷基基团。然而，在一些实施方案中，当在被保护二醇的C20位存在正己基基团时，则R₁不能是叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)。

在多个实施方案中，制备氧化固醇衍生物的方法包括使式II的孕烯醇酮衍生物：

与有机金属化合物反应，以形成式III的C3被保护的二醇衍生物：

其中R₁是保护基团并且R₃是(C₆-C₂₆)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基和(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基、或(C₄-C₁₀)亚烷基桥或亚杂烷基桥。

可用于制备式IV化合物的有机金属化合物是式R₃MgX的化合物，其中X是卤离子并且R₃包含具有至少一个碳的脂族或环状取代基。在其它方面，有机金属化合物包含式R₃Li，其中R₃包含具有至少一个碳的脂族或环状取代基。在其它方面，R₃是(C6-C26)烷基或杂烷基、(C2-C20)芳基或杂芳基、(C6-C26)芳基烷基或杂烷基和(C5-C20)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C4-C10)烷基二基或杂烷基二基、或(C4-C10)亚烷基桥或亚杂烷基桥。在一些实施方案中，R₃是己基基团。

中间体C3被保护二醇(式III)的合成方法具立体选择性并产生高收率的C3被保护二醇。例如，在一些实施方案中，二醇的所需立体异构体的收率在约60％与约70％之间。在一些实施方案中，二醇的所需立体异构体的收率在约50％与约60％之间。然而，预期收率百分比可能高于或低于这些量。例如，如上所示的式2的收率百分比可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，收率百分比可以高于95％。

在多个实施方案中，与格氏试剂的烷基化反应在极性有机溶剂如四氢呋喃中进行。然而，该反应可以在各种极性有机溶剂中进行。例如，该反应可以在二乙醚、乙醚、二甲醚等中进行。

在一些实施方案中，有机金属格氏试剂包含正己基氯化镁。然而，在一些实施方案中，烷基化反应可以使用烷基锂例如正己基锂进行。在多个实施方案中，有机金属试剂包括烷基卤化物。例如，有机金属试剂可具有下式：

R₃-Mg-X，

其中Mg包含镁，X包含氯、溴、氟、碘或砹，并且R₃包含烷基、杂烷基、烷烃基、杂烷烃基、烯烃基、杂烯烃基、炔烃基、杂烷烃基、烷基二基、杂烷基二基、亚烷基桥、亚杂烷基桥、芳基、芳基二基、亚芳基桥、芳基芳基、联芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基二基、亚杂芳基桥、杂芳基-杂芳基、联杂芳基、杂芳基烷基或其组合。在一些实施方案中，R₃取代基包含(C₁-C₂₀)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基和(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基、或(C₄-C₁₀)亚烷基桥或亚杂烷基桥。R₃取代基可以是环状或无环的，支链或无支链的，被取代或未被取代的，芳族，饱和或不饱和的链，或其组合。在一些实施方案中，R₃取代基是脂族基团。在一些实施方案中，R₃取代基是环状基团。在一些实施方案中，R₃取代基是己基基团。

可选地，有机金属试剂可包含式：

R₃-Li，

其中Li包含锂并且R₃包含烷基、杂烷基、烷烃基、杂烷烃基、烯烃基、杂烯烃基、炔烃基、杂烷烃基、烷基二基、杂烷基二基、亚烷基桥、亚杂烷基桥、芳基、芳基二基、亚芳基桥、芳基芳基、联芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基二基、亚杂芳基桥、杂芳基-杂芳基、联杂芳基、杂芳基烷基或其组合。在一些实施方案中，R₃取代基包含(c₁-C₂₀)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基和(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基、或(C₄-C₁₀)亚烷基桥或亚杂烷基桥。R₃取代基可以是环状或无环的，支链或无支链的，被取代或未被取代的，芳族，饱和或不饱和的链，或其组合。在一些实施方案中，R₃取代基是脂族基团。在一些实施方案中，R₃取代基是环状基团。在一些实施方案中，R₃取代基是己基基团。

在一些实施方案中，烷基化反应是放热的，并且可对反应容器进行温度控制以维持最佳的反应动力学。在一些实施方案中，放热反应时每磅溶液释放约1000BTU。由于反应的强烈放热性质，因此格氏试剂可以缓慢加入，以使得挥发性组分例如醚不因反应热而蒸发。在一些实施方案中，反应容器可以通过内部冷却盘管进行冷却。冷却盘管可以通过外部气体/液体制冷单元供应冷却剂。在一些实施方案中，反应容器的内部温度保持在低于15℃、10℃、5℃或1℃。在一些实施方案中，反应容器在烷基化反应期间保持在约0℃以形成中间体式III的被保护二醇。

在多个实施方案中，式III的被保护二醇与副产物一起合成并且可被纯化。例如，所得式III的被保护二醇可以是非对映异构体混合物的副产物。在多个实施方案中，可以分离和纯化式III的被保护二醇。也就是说，式III的C3被保护二醇可以通过过滤，离心，基于相对挥发性来分离挥发性液体的蒸馏，结晶，重结晶，蒸发以从非挥发性溶质中除去挥发性液体，溶剂萃取以除去杂质，将组合物溶解于其中可溶解其它组分的溶剂中或其它纯化方法，分离和纯化至所需纯度，例如约95％至约99.9％。C3被保护的二醇可以通过使其与有机和/或无机溶剂接触来纯化，所述溶剂例如THF、水、二乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、n，n-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、氨、叔丁醇、正丙醇、乙醇、甲醇、乙酸或其组合。

在多个实施方案中，烷基化步骤和纯化步骤发生在相同的反应容器中。

在一些实施方案中，C3被保护的二醇用氯化铵或乙酸水溶液淬灭以减少存在的阴离子量并中和反应，并且将其与所得有机层分离。分离的残余物通过蒸发回收并通过硅胶柱色谱法纯化。

C3被保护的二醇可以是无水的或呈单水合物形式。然而，在其它实施方案中，纯化的二醇可以其它水合形式例如二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等以及相应的溶剂化形式结晶。在其它实施方案中，纯化的被保护二醇结晶为共晶体或药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，式III的二醇衍生物可以与硼烷化合物反应，形成式IV的在C3被保护的氧化固醇的衍生物或其药学上可接受的盐：

制备氧化固醇-他汀类化合物的方法

通常，如本文所公开的在C3被保护的OXY133的合成方法包括使如上所述合成的被保护二醇与硼烷以下面所示的反应进行反应：

方案6

在一些实施方案中，在反应方案6中通过中间体具有式IIIa的被保护二醇的硼氢化和氧化反应产生粗制和未纯化的C3被保护的OXY133。可用于反应的硼烷化合物包括BH₃，B₂H₆，BH₃S(CH₃)₂(BMS)，具有膦和胺的硼烷加合物，例如硼烷三乙胺；RBH₂形式的单取代硼烷，其中R＝烷基和卤离子，单烷基硼烷(例如IpcBH2、单异松蒎基硼烷)，单溴-和单氯-硼烷，单氯硼烷和1，4-二氧杂环己烷的复合物，包括大体积硼烷的二取代硼烷，例如二烷基硼烷化合物如二乙基硼烷、双-3-甲基-2-丁基硼烷(二仲异戊基硼烷)、9-硼杂双环[3，3，1]壬烷(9-BBN)、二仲异戊基硼烷(Sia2BH)、二环己基硼烷(Chx2BH)、三烷基硼烷、二烷基卤代硼烷、二均三甲苯基硼烷(C₆H₂Me₃)₂BH、烯烃基硼烷、频哪醇硼烷或儿茶酚硼烷或其组合。

简言之，如方案6中所示，硼氢化和氧化反应是两步反应。硼和氢加在烯烃的双键上以与烯烃形成复合物。因此反应的硼化阶段具立体选择性和区域选择性。反应的氧化阶段涉及碱性过氧化氢水溶液以提供羟基取代基来代替硼。参见Vollhart，KP，Schore，NE，2007，《有机化学：结构和功能(Organic Chemistry：Structure and Function)》，第五版，New York，NY，Custom Publishing Company。因此，具有式III的C3被保护的中间体二醇与硼烷和过氧化氢反应，形成粗制C3被保护的OXY133。在一些实施方案中，形成粗制C3被保护的OXY133的步骤发生在与烷基化反应相同的反应容器中。在其它实施方案中，形成粗制C3被保护的OXY133的步骤发生在与烷基化反应不同的反应容器中。

与形成中间体二醇的步骤一样，合成C3被保护的OXY133的硼氢化-氧化步骤具立体选择性并且产生高收率。例如，在一些实施方案中，粗OXY133的收率百分比可能高于或低于这些量。例如，如上所示的式2的收率百分比可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，收率百分比可以高于95％。

在多个实施方案中，硼氢化-氧化反应在极性有机溶剂如四氢呋喃中进行。然而，该反应可以在各种极性有机溶剂中进行。例如，该反应可以在二乙醚、乙醚、二甲醚等中进行。

在一些实施方案中，硼氢化-氧化反应是放热的，并且反应容器可以进行温度控制以维持最佳的反应动力学。具体而言，氧化阶段是极其放热的。由于反应的强烈放热性质，过氧化氢因此可以缓慢加入，以使得挥发性组分例如醚不因反应热而蒸发。在一些实施方案中，反应容器可通过内部冷却盘管进行冷却。冷却盘管可以通过外部气体/液体制冷单元供应冷却剂。在一些实施方案中，反应容器的内部温度保持在小于10℃、5℃、1℃或0℃。在一些实施方案中，在硼氢化-氧化反应期间反应容器保持在约-5℃。

在某些实施方案中，C3被保护的二醇中二醇的盐、水合物、溶剂化物或结晶形式的结晶度百分比可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，结晶度百分比可以是基本上100％，其中基本上100％表明C3被保护的二醇的全部量似乎都是结晶的，最好可以使用本领域已知的方法测定。因此，治疗有效量的二醇可以包括结晶度不同的量。这些包括其中随后将一定量固体形式的C3被保护的结晶二醇溶解、部分溶解、或者悬浮或分散在液体中的情况。

化合物OXY133可以作为一种有效的成骨性氧化固醇，其在大鼠和兔脊柱融合模型中体外诱导骨祖细胞的成骨分化和体内诱导稳定的骨形成。因此，OXY133是用于局部施用的候选药物，可应用于脊柱融合和不愈合骨折修复。

当考虑式Va的C3被保护的OXY133分子时，显然只有两个其它位点可用于形成OXY133-他汀类化合物或与另一化合物部分形成复合物，即在C6和C20处。在式Va的C3被保护的OXY133分子中，C6-羟基基团相比于C20位上的羟基基团对另一种药物更具反应性，因为其周围没有其它基团阻碍与羟基基团反应，C20位上的羟基基团则相反，其在一些实施方案中具有直链烷基基团。

在多个实施方案中，被保护的OXY133分子可以通过C6-羟基基团与药物如HMG-CoA还原酶抑制剂或他汀部分进行反应，所述他汀部分例如下表1中所示的瑞舒伐他汀阿托伐他汀普伐他汀氟伐他汀匹伐他汀辛伐他汀或洛伐他汀的部分。

在一个实施方案中，C3被保护的OXY133分子可以在C6与洛伐他汀反应以形成具有式VIIa的氧化固醇-他汀类化合物：

一旦形成，C3被保护的OXY133洛伐他汀化合物可以使用本领域普通技术人员已知的经典化学方法在C3处脱保护。例如，如果C3处的保护基团是甲硅烷基基团，则可以使用氟化物源如四正丁基氟化铵(TBAF)或和HF吡啶复合物进行脱保护。在其它方面，当C3处的保护基团是甲基或另一种直链烷基时，可以使用碘源如三甲基甲硅烷基碘、(CH₃)₃SiI、碘三甲基硅烷(TMSI)。当式VIIa的化合物脱保护时，OXY133-洛伐他汀化合物由式VII形成：

图8示出氧化固醇-他汀类化合物的整个合成。

图9是OXY133-阿托伐他汀化合物的化学结构。图10是OXY133-西立伐他汀化合物的化学结构。图11是OXY133-氟伐他汀化合物的化学结构。图12是OXY133-美伐他汀化合物的化学结构。图13是OXY133-匹伐他汀化合物的化学结构。图14是OXY133-普伐他汀化合物的化学结构。图15是OXY133-瑞舒伐他汀化合物的化学结构。图16是OXY133-辛伐他汀化合物的化学结构。

在某些实施方案中，骨特异性药物递送剂例如他汀类可经由可水解的接头键L连接到C3被保护的OXY133分子上。例如，他汀类或其部分的接头连接包括但不限于基于琥珀酸酯的接头、基于天冬氨酸的接头和/或基于氨基甲酸酯的接头。

在多个实施方案中，他汀类可经由可水解接头键与药物分子连接。在药物分子与他汀类结合后保留药理学活性的情况下，可以使用不可水解的键。可以使用酯基团，因为它们相对于更不稳定的硫酯和更稳定的酰胺提供有利的稳定性范围(L.Gil等，《生物有机化学与医药化学(Bioorg.Med.Chem.)》，1999，7，901-919)。酯基团的体内稳定性可通过邻近酯基团安置的取代而进一步微调(T.C.Bruice等，《生物有机机理(BioorganicMechanisms)》，第1卷，W.A.Benjamin，New York，1966，1-258)。在一些实施方案中，C3被保护的OXY133-他汀类化合物可适于全身给药(口服、腹膜内或静脉内)，其需要在骨组织中选择性沉积，接着酶促接头水解并以受控速率释放成骨剂OXY 133和他汀类药物进入靶组织。这种将他汀或他汀部分R₄与C3被保护的OXY133的6位连接以形成C3被保护的OXY133-他汀类的复合物可以通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDCI)存在下经由酯键直接偶联琥珀酸酐来实现，如下所示：

其中R₁如上文所定义并且R₄是他汀或他汀部分。

可用于其它实施方案中用于结合C3被保护的OXY133的接头L包括但不限于基于天冬氨酸的接头、基于琥珀酸酯的接头或基于氨基甲酸酯的接头，如下所示：

氧化固醇-他汀类化合物或前药的用途

氧化固醇是胆固醇的衍生物，其已显示具有一系列的活性，包括细胞凋亡和胆固醇体内平衡。已经鉴定出一组骨诱导性氧化固醇，其刺激体外间充质干细胞分化，诱导骨形成并支持体内脊柱融合。氧化固醇被认为是通过激活刺猬蛋白信号通路来影响骨形成。

在使用中，OXY133为骨骼病状提供治疗性处理。OXY133促进骨形成，成骨细胞分化，骨形态发生和/或骨质增生。治疗可以施用来治疗开放性骨折和高度不愈合风险的骨折，以及具有脊柱病症的受试者。也就是说，OXY133可以诱导脊柱融合，并且可能有助于治疗影响腰椎或颈椎的退行性椎间盘疾病或关节炎。

已显示用OXY133处理的间充质干细胞具有增加的成骨细胞分化。因此，在一些实施方案中，可将OXY133植入具有间充质干细胞的脊柱部位，以通过成骨细胞分化诱导骨生长。骨膜组织是在正常骨折修复期间早期涉及的一种组织类型，并且可以募集骨折修复所需的各种细胞类型(例如，间充质干细胞)和骨生长因子。因此，在一些实施方案中，骨膜组织被用作脱矿质骨组合物中的间充质干细胞和/或生长因子的来源。

数十年来，已经针对天然存在的人类蛋白质的重组产生形式，例如rhBMP-2和rhPDGF，研究了其诱导或增强新骨形成的能力。虽然这些蛋白质在支持骨愈合方面是有效的，但在制造复杂性和相关成本方面存在缺点。解决这些缺点的一种方法是鉴定调节骨信号通路的部分以刺激或增强骨愈合的小分子。两个实例是骨诱导性氧化固醇和他汀类药物。

他汀类药物是广泛用于降低胆固醇的HMG-CoA还原酶抑制剂。还显示某些他汀类药物在体外和体内刺激骨形成。他汀类药物被认为通过刺激成骨细胞分化并通过MAPK和TGFβ受体信号级联减少成骨细胞凋亡来增强骨形成。

尽管氧化固醇和他汀类药物已被证明增强体内骨愈合，但均未显示出与rhBMP-2一样有效。因此，尽管制造更容易且更便宜，但其最终效用可能受到限制。因为氧化固醇和他汀类药物已被证明对骨形成有影响，并且它们通过不同的机制起作用，所以呈前药或氧化固醇-他汀类化合物形式的局部共递送可以导致大于独立递送时的协同作用。

在一些实施方案中，可将OXY133-他汀类化合物植入或直接注射到患者的手术部位。在一些实施方案中，从上述方法获得的OXY133-他汀类化合物呈储库形式。在多个实施方案中，可将多个储库(例如球粒)施用于手术部位。在一些实施方案中，提供多个储库(例如，在试剂盒中)并将其施用于手术部位并且三角包围和/或围绕骨生长所需的部位。在多个实施方案中，多个储库包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个储库。在一些实施方案中，使用增塑剂来降低玻璃化转变温度以影响装置的稳定性。

在多个实施方案中，储库包含OXY133-他汀类化合物和呈无定形、结晶或半结晶形式的可生物降解的聚合物；其中结晶形式可包括多晶型物、溶剂化物或水合物。

在一些实施方案中，OXY133-他汀类化合物在固体或半固体形式的装置中施用。所述固体或半固体形式的装置可具有在约1至约2000厘泊(cps)、1至约200cps、或1至约100cps范围内的给药前粘度。在将固体或半固体装置施用于目标部位之后，半固体或固体储库的粘度将增加，并且半固体将具有在约1×10²至约6×10⁵达因/平方厘米、或2×10⁴至约5×10⁵达因/平方厘米、或5×10⁴至约5×10⁵达因/平方厘米范围内的弹性模量。

在多个实施方案中，半固体或固体储库可包含如通过特性粘度显示的分子量(MW)为约0.10dL/g至约1.2dL/g或者约0.20dL/g至约0.50dL/g的聚合物。其它特性粘度范围包括但不限于约0.05至约0.15dL/g、约0.10至约0.20dL/g、约0.15至约0.25dL/g、约0.20至约0.30dL/g、约0.25至约0.35dL/g、约0.30至约0.35dL/g、约0.35至约0.45dL/g、约0.40至约0.45dL/g、约0.45至约0.55dL/g、约0.50至约0.70dL/g、约0.55至约0.6dL/g、约0.60至约0.80dL/g、约0.70至约0.90dL/g、约0.80至约1.00dL/g、约0.90至约1.10dL/g、约1.0至约1.2dL/g、约1.1至约1.3dL/g、约1.2至约1.4dL/g、约1.3至约1.5dL/g、约1.4至约1.6dL/g、约1.5至约1.7dL/g、约1.6至约1.8dL/g、约1.7至约1.9dL/g、或约1.8至约2.1dL/g。

在一些实施方案中，储库可能不是完全可生物降解的。例如，所述装置可包含聚氨酯，聚脲，聚醚(酰胺)，PEBA，热塑性弹性体烯烃，共聚酯，和苯乙烯热塑性弹性体，钢，铝，不锈钢，钛，具有高有色金属含量和低相对比例的铁的金属合金，碳装置，玻璃装置，塑料，陶瓷，甲基丙烯酸酯，聚(N-异丙基丙烯酰胺)，PEO-PPO-PEO(pluronics)或其组合。通常，这些类型的基质可能需要在一段时间后被去除。

在多个实施方案中，储库(例如装置)可包含可生物侵蚀的、可生物吸收的和/或可生物降解的生物聚合物，其可以提供OXY133-他汀类化合物的立即释放或持续释放。合适的持续释放生物聚合物的实例包括但不限于聚(α-羟基酸)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，聚丙交酯(PLA)，聚乙交酯(PG)，聚(α-羟基酸)的聚乙二醇(PEG)结合物，聚(原酸酯)(POE)，聚(酯酰胺)，聚阿司匹林，聚磷腈(polyphosphagene)，淀粉，预胶凝化淀粉，透明质酸，壳聚糖，明胶，藻酸盐，白蛋白，纤维蛋白，维生素E化合物如α生育酚乙酸酯、d-α生育酚琥珀酸酯，D，L-丙交酯或L-丙交酯-己内酯，葡聚糖，乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯醇(PVA)，PVA-g-PLGA，PEGT-PBT共聚物(Polyactive)，PEO-PPO-PAA共聚物，PLGA-PEO-PLGA，PEG-PLG，PLA-PLGA，泊洛沙姆407，PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物，SAIB(蔗糖乙酸异丁酸酯)或其组合。

在一些实施方案中，储库包含至少一种可生物降解的聚合物，其中所述至少一种可生物降解的聚合物包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、D-丙交酯、D，L-丙交酯、L-丙交酯、D，L-丙交酯-共-ε-己内酯、L-丙交酯-共-ε-己内酯、D，L-丙交酯-共-乙交酯-共-ε-己内酯、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯)、聚(L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D-丙交酯-共-己内酯)、聚(D，L-丙交酯)、聚(D-丙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚(酯酰胺)中的一种或多种或其组合。

在一些实施方案中，储库包含至少一种可生物降解的材料，其重量％为以储库的总重量计约99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、35％、25％、20％、15％、10％或5％，并且其余是活性和/或非活性药物成分。

甘露糖醇、海藻糖、葡聚糖、mPEG和/或PEG可用作聚合物的增塑剂。在一些实施方案中，聚合物和/或增塑剂也可涂覆在储库上以提供所需的释放曲线。在一些实施方案中，涂层厚度可以很薄，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50微米至较厚涂层60、65、70、75、80、85、90、95、100微米，以延迟OXY133-他汀类化合物、固醇或二醇从储库(例如装置)的释放。在一些实施方案中，储库上的涂层范围在约5微米至约250微米或5微米至约200微米范围内以延迟从装置的释放。

储库(例如装置)可以具有不同的尺寸、形状和配置。在确定储库的大小、形状和配置时，可以考虑几个因素。例如，尺寸和形状都可以容易地将储库定位在目标组织部位。此外，应选择系统的形状和大小，以减少或防止储库在植入后移动。在多个实施方案中，储库的形状可以像棒或平坦表面，例如薄膜或薄片(例如带状)等。柔性可能是一个考虑因素以便于装置的安置。

装置上可以包括射线照相标志物，以允许使用者将储库(例如装置)准确地定位到患者的目标部位。这些射线照相标志物还将允许使用者随着时间推移追踪储库(例如装置)在部位处的移动和降解。在这个实施方案中，使用者可以使用众多诊断成像程序中的任一种来精确地定位部位中的储库(例如装置)。这些诊断成像程序包括例如X射线成像或荧光透视。这种放射照相标志物的实例包括但不限于钡、磷酸盐、铋、碘、钽、钨和/或金属珠粒或颗粒。在多个实施方案中，放射照相标志物可以是围绕储库(例如装置)的球形或环。

在一些实施方案中，可使用可作为递送装置例如注射器、枪形递送装置的一部分的″套管″或″针″或者适于将OXY133、固醇或二醇应用于靶向器官或解剖区域的任何医疗装置将OXY133-他汀类化合物施用于目标部位。所述装置的套管或针被设计成对患者造成最小的身体和心理创伤。

在一些实施方案中，储库可以使用缝合针缝合到目标组织部位。除此之外，针的尺寸将取决于植入部位。例如，不同手术程序中肌肉平面的宽度可以在1-40cm变化。因此，在多个实施方案中可以针对这些特定区域对针进行设计。

本公开的实施方案可用作由治疗有效量的如本文所定义的本公开化合物和药学上可接受的载体或稀释剂制备的药物组合物。本公开的化合物可以配制成药物组合物并以适合于所选择施用途径的多种形式施用于需要治疗的受试者例如哺乳动物如人类患者，例如，口服，经鼻，腹膜内或肠胃外，通过静脉内、肌肉内、局部或皮下途径，或通过注射到组织中。

因此，本公开的化合物可以与药学上可接受的媒介物如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体组合而全身施用(例如口服)，或者通过吸入或吹入施用。它们可以封装在硬或软壳明胶胶囊中，可以压制成片剂，或者可以直接掺入患者饮食的食物中。对于口服治疗施用，所述化合物可以与一种或多种赋形剂组合，并且以可摄取片剂、口含片、糖锭、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。所述化合物可以与惰性粉末状载体组合并被受试者吸入或吹入。这样的组合物和制剂应含有至少0.1％的本发明实施方案的化合物。当然，组合物和制剂的百分比可以变化，并且可以在给定单位剂型重量的约2％至约60％之间。这种治疗上有用的组合物中的化合物量使得将获得有效剂量水平。

片剂、糖锭、丸剂、胶囊等也可以含有以下：粘合剂如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；并且可加入甜味剂如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或者调味剂如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可作为包衣存在或以其它方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可含有活性化合物，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味剂如樱桃或橙调味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料都应该是药学上可接受的，并且所用量基本上无毒。另外，化合物可以被掺入到持续释放制剂和装置中。例如，化合物可以被掺入到定时释放胶囊、定时释放片剂、定时释放丸剂和定时释放聚合物或纳米颗粒中。

本公开中描述的化合物也可以通过输注或注射经静脉内或腹膜内或皮下施用。化合物溶液可以在任选与无毒表面活性剂混合的水中制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。

适用于注射或输注的药物剂型可以包括包含所述化合物的无菌水溶液或分散体或无菌粉末，所述无菌粉末适于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散体，任选地包封在脂质体中。在所有情况下，最终剂型在制造和储存条件下应是无菌的、流体和稳定的。液体载体或媒介物可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其合适混合物的溶剂或液体分散介质。例如，通过形成脂质体，通过在分散体的情况下维持所需粒度或通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可以通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶产生可注射组合物的延长吸收。

无菌可注射溶液是通过将所需量的化合物与根据需要的上面列举的各种其它成分一起掺入适当溶剂中，接着过滤灭菌来制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上以前无菌过滤溶液中存在的任何其它所需成分的粉末。

对于局部施用，所述化合物可以纯形式应用。然而，可能需要将它们作为与皮肤病学可接受的载体(其可以是固体或液体)组合的组合物或制剂形式施用于皮肤。

有用的固体载体包括细粉状固体，例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。其它固体载体包括无毒聚合物纳米颗粒或微粒。有用的液体载体包括水、醇或二醇或者水/醇/二醇共混物，其中化合物可以任选借助于无毒表面活性剂以有效水平溶解或分散。可以加入佐剂如香料和其它抗微生物剂以优化针对给定用途的性质。所得液体组合物可以经由吸收垫、浸渍绷带和其它敷料应用，或者使用泵式或气雾剂喷雾器喷雾到受影响的区域上。

增稠剂如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料也可与液体载体一起使用，以形成可涂抹糊剂、凝胶剂、软膏剂、皂剂等，供直接应用到使用者的皮肤。

可用于将化合物递送至皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例是本领域已知的；例如参见Jacquet等(美国专利No.4,608，392)，Geria(美国专利No.4,992,478)，Smith等(美国专利No.4,559,157)和Wortzman(美国专利No.4,820,508)，所有这些都特此通过引用并入。

本公开中描述的化合物的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性来确定。用于将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人类的方法是本领域已知的；例如参见美国专利No.4,938,949，其特此通过引用并入。

例如，化妆品在液体组合物例如洗剂中的浓度可以是约0.1重量％至约25重量％，或者约0.5-10重量％。半固体或固体组合物例如凝胶或粉末中的浓度可以是约0.1重量％至约5重量％，或者约0.5重量％至约2.5重量％。

用于治疗所需的化合物的量将不仅随着所选的特定盐而变化，而且随着施用途径、所治疗病状的性质、患者的年龄和状况而变化，并且将最终由主治医师或临床医师决定。

本公开的前药的有效剂量和施用途径是常规的。药剂的确切量(有效剂量)在不同受试者之间将有所变化，取决于例如受试者的物种、年龄、体重和一般或临床状况，所治疗的任何病症的严重程度或机制，所用的特定药剂或媒介物，施用方法和时间安排等。治疗有效剂量可以通过本领域技术人员已知的常规方法凭经验确定。参见例如《治疗剂的药理学基石出(The Pharmacological Basis of Therapeutics)》，Goodman和Gilman编，Macmillan Publishing Co.，New York。例如，最初可以在细胞培养测定法或合适的动物模型中估计有效剂量。动物模型也可用于确定适当的浓度范围和施用途径。然后可以使用这些信息来确定用于人类施用的有用剂量和途径。治疗剂量也可以通过类似于可比治疗剂的剂量来选择。

考虑到病例的细节(例如，受试者，疾病，所涉及的疾病状态以及治疗是否是预防性的)，主治医师将选择特定的施用模式和给药方案。治疗可能涉及在几天到几个月甚至几年的一段时期内每天一次或每天多次剂量的化合物。

然而，一般来说，合适的剂量将在每天每公斤体重约0.001至约100mg的范围内，例如约0.01至约100mg，例如高于约0.1mg，或者在每天每公斤接受者体重约1至约10mg的范围内。例如，合适的剂量可以是每天每公斤体重约1mg、10mg或50mg。

所述化合物以单位剂型方便地施用；例如每单位剂型含有0.05至10000mg、0.5至10000mg、5至1000mg、或约100mg的活性成分。

可以施用本公开中描述的前药化合物以实现以下血浆峰浓度：例如，约0.5至约75μM、约1至50μM、约2至约30μM、或约5至约25μM。示例性的血浆浓度包括至少或不超过0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100或200μM。例如，血浆水平可以是约1至100微摩尔浓度或约10至约25微摩尔浓度。这可以例如通过静脉内注射所述化合物任选于盐水中的0.05％至5％溶液，或者作为含有约1-100mg化合物的大丸剂口服施用来实现。可以通过连续输注以提供每小时每公斤体重约0.00005-5mg，例如至少或不超过0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5或5mg/kg/hr来维持期望的血液水平。可选地，这种水平可以通过间歇输注来获得，所述输注包含每公斤体重约0.0002-20mg，例如至少或不超过每公斤体重0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20或50mg的化合物。

前药化合物可方便地以单剂量或以适当时间间隔施用的分剂量形式提供，例如每天一剂或每天两次、三次、四次或更多次子剂量。子剂量本身可以进一步分开，例如分成多次离散松散间隔的施用；例如来自吹入器的多次吸入。

本公开的一个方面是生物活性或药物组合物，其包含本文所述的OXY133-他汀类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及药学上可接受的载体。这些生物活性或药物组合物在本文中有时被称为″药物组合物″或″本公开的生物活性组合物″。有时，短语″化合物的施用″在本文中用于将该前药化合物施用于受试者(例如，使受试者与化合物接触)的情形。应理解，用于这种用途的前药化合物通常可以是包含前药化合物的药物组合物或生物活性组合物的形式。

本公开的另一方面是用于在例如受试者中的细胞或组织中诱导(刺激、增强)刺猬蛋白(Hh)通路介导的应答的方法，其包括使所述细胞或组织与有效量(例如，治疗有效量)的氧化固醇-他汀类前药接触，其中刺猬蛋白(Hh)通路介导的应答是刺激成骨细胞分化、骨形态发生和/或骨质增生。Hh介导的应答可用于再生医学。

本公开的另一方面是用于治疗患有骨病、骨质减少、骨质疏松症或骨折的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含OXY133-他汀类前药的生物活性组合物或药物组合物。可以在选定的时间间隔下以有效剂型向受试者施用治疗有效剂量的生物活性组合物或药物组合物，以例如增加骨质量，改善骨质疏松症的症状，或者减少、消除、预防或治疗将从骨形态发生和/或骨质增生增加中受益的其它病状。可以在选定的时间间隔下以有效剂型向受试者施用治疗有效剂量的生物活性组合物或药物组合物，以改善骨质疏松症的症状。在一个实施方案中，通过采集哺乳动物间充质干细胞(例如来自受试者或来自合适的哺乳动物，或来自组织或细胞库)，用化合物处理哺乳动物间充质细胞以诱导细胞的成骨细胞分化，并将分化细胞施用于受试者，来治疗受试者以诱导骨形成。

在本公开的任何方法中，可以通过局部施用将OXY133-他汀类化合物施用于细胞、组织或器官。例如，OXY133-他汀类化合物可以用乳膏剂等局部应用，或者可以将其注射或以其它方式直接引入细胞、组织或器官中，或者可以将其与合适的医疗装置(例如植入物)一起引入。可选地，所述化合物可以全身施用，例如口服、静脉内(通过IV)，或经由注射如腹膜内(ip)注射或皮下注射。

本公开的另一方面是用于实施本文所述的一种或多种方法的试剂盒。所述试剂盒可以包含有效量(例如治疗有效量)的化合物，任选在容器中。

本公开的另一方面是用于受试者(例如动物如人类)体内的植入物，其包含具有表面的基质。所述植入物的表面或内部包含生物活性组合物或药物组合物，其包含足以诱导周围骨组织中的骨形成的量的OXY133-他汀类化合物。

除了本文阐述的化合物之外，本公开的其它实施方案涵盖在式中显示的任何立构中心处的任何和所有单独的立体异构体，包括化合物的非对映异构体、外消旋体、对映异构体和其它异构体。在本公开的实施方案中，包括化合物的所有多晶型物和溶剂化物，例如水合物和与有机溶剂形成的那些。这种溶剂化物可以是具有基本上固定摩尔比的溶质和溶剂的结晶固体。本领域普通技术人员知道合适的溶剂，例如水、乙醇或二甲亚砜。这些异构体、多晶型物和溶剂化物可通过本领域已知的方法制备，例如通过区域特异性和/或对映选择性合成和拆分。

制备盐的能力取决于氧化固醇-他汀类化合物或前药的酸性或碱性。化合物的合适的盐包括但不限于酸加成盐，例如用盐酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、碳酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和2-乙酰氧基苯甲酸制得的盐；用糖精制得的盐；碱金属盐，如钠盐和钾盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；以及与有机或无机配体形成的盐，如季铵盐。

其它合适的盐包括但不限于本公开中所述化合物的乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷酸盐、己基间苯二酚盐、哈胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代羟酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙碘化物和戊酸盐。应理解，本文中对于化合物的提及包括其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在特别是用于治疗受试者的本公开的任何方法、组合物或试剂盒中，本公开的组合物可以任选地与一种或多种其它合适的治疗剂组合。可以使用适合于治疗特定病状的任何治疗剂。合适的药剂或药物对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。例如，对于骨病的治疗，常规治疗药物可以与本公开的组合物组合使用。一些此类药剂包括例如甲状旁腺激素、氟化钠、胰岛素样生长因子I(ILGF-I)、胰岛素样生长因子II(ILGF-II)、转化生长因子β(TGF-β)、细胞色素P450抑制剂、成骨前列腺素类、BMP 2、BMP4、BMP 7、BMP 14，和/或双膦酸盐或其它骨吸收抑制剂。

在一些实施方案中，本公开的组合物或化合物可以配制为药物组合物，其包含本公开的组合物和药学上可接受的载体。如本领域技术人员所熟知的，自然选择载体以使活性成分的任何降解最小化并使受试者中的任何不良副作用最小化。关于药物组合物的药学上可接受的载体和其它组分的讨论，参见例如《雷明顿制药科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)》，第18版，Mack Publishing Company，1990。一些合适的药物载体对于本领域技术人员是显而易见的，并且包括例如水(包括无菌和/或去离子水)、合适的缓冲液(如PBS)、生理盐水、细胞培养基(如DMEM)、人造脑脊液、二甲亚砜(DMSO)等。

本领域的普通技术人员应理解，本公开的特定制剂将至少部分取决于所使用的特定药剂或药剂组合和所选择的施用途径。因此，本公开组合物的合适制剂存在宽泛变化。下面讨论一些代表性的制剂。其它对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。化合物可以局部施用或直接施用于需要治疗的细胞、组织或器官，或者其可以全身施用。

适于口服施用的制剂或组合物可以包含液体溶液，例如溶于稀释剂如水、盐水或果汁中的有效量的化合物；胶囊、小药囊或片剂，各自含有预定量的活性成分，呈固体、颗粒或冷冻干燥单元；在含水液体中的溶液或悬浮液；和水包油乳剂或油包水乳剂。片剂形式可以包括以下中的一种或多种：乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸，和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学上相容的载体。适用于口服递送的制剂也可以掺入合成和天然聚合物微球体中，或用于保护本公开的药剂免于在胃肠道内降解的其它手段。

适于肠胃外施用(例如静脉内)的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。所述制剂可以单位剂量或多剂量密封容器如安瓿和小瓶中呈现，并且可以储存在冷冻干燥(例如，冻干)条件中，其仅需要在即将使用之前加入无菌液体载体例如水，以用于注射。即时注射溶液和混悬液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

单独或与其它治疗剂(包括OXY133-他汀类前药)组合的化合物可以制成气雾剂制剂以经由吸入施用。这些气雾剂制剂可以置于加压的可接受的推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。

适于局部施用的制剂包括在调味剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性成分的口含锭；在惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分的锭剂；在合适的液体载体中包含活性成分的漱口剂；或乳膏剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂、润滑剂、喷雾剂、栓剂等。

其它合适的制剂包括例如适合定时释放化合物的水凝胶和聚合物，或用于小剂量递送化合物的纳米颗粒。

本领域的普通技术人员应理解，可以基于手头的特定应用来选择、调整或开发合适或适当的制剂。此外，本公开的药物组合物可以制成通过多种不同途径施用，不管是全身的，局部的还是两者。这样的实例包括但不限于：经关节内、颅内、皮内、肝内、肌肉内、眼内、腹膜内、鞘内、静脉内、皮下、透皮施用或直接施用到骨区动脉粥样硬化部位，例如通过直接注射，用导管或其它医疗装置引入，局部应用，直接应用，和/或通过将装置植入动脉或其它适当的组织部位。

化合物可以配制成包含在手术或医疗装置或植入物中或者适合于通过手术或医疗装置或植入物释放。在某些方面，植入物可以被涂覆或以其它方式用化合物处理。例如，水凝胶或其它聚合物如生物相容性和/或可生物降解的聚合物可用于涂覆具有本公开组合物的植入物(例如，组合物可适于通过使用水凝胶或其它聚合物与医疗装置一起使用)。用于涂覆具有药剂的医疗装置的聚合物和共聚物在本领域中是众所周知的。医疗装置和植入物的实例包括但不限于缝合线和假体如假体关节，并且可以是例如销、螺钉、板或假体关节的形状。

在本公开的一些实施方案中，化合物可以刺激或抑制治疗反应，如通过各种常规测定法中的任一种所测量，相比于未经处理的对照样品改变约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、150％、200％或更多。也包括这些范围内的中间值。

化合物的剂量可以是单位剂型，例如片剂或胶囊。如本文所用，术语″单位剂型″是指适合作为动物(例如人类)受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的本公开药剂，单独或与其它治疗剂组合，以与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物相结合足以产生所需作用的量计算。

本领域的普通技术人员可以常规地确定用于所用组合物的确切制剂的适当剂量、时间表和施用方法，以便实现药剂在个体患者中的所需有效量或有效浓度。除了分析疾病、病症或病状的适当临床症状之外，本领域的普通技术人员还可以通过直接或间接分析适当的患者样品(例如血液和/或组织)而容易地确定和使用化合物的″有效浓度″的适当指标。

当确定适合于特定患者的个体方案和剂量水平等时，在本公开的上下文中施用于动物如人类的化合物或其组合物的确切剂量在不同受试者之间将有所变化，取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况，所治疗的任何病症的严重程度或机制，所用的特定药剂或媒介物，其施用模式，患者正在服用的其它药物，以及主治医师通常考虑的其它因素。用于达到体内所需浓度的剂量将由以下确定：化合物形式的效力，宿主中与化合物相关的药效学，存在或不存在另外的药剂，受感染个体的疾病状态的严重程度，以及在全身施用的情况下，个体的体重和年龄。剂量大小还可以通过可能伴随所用的特定药剂或其组合物的任何不利副作用的存在来确定。只要有可能，通常希望不良副作用保持最低。

例如，剂量可以在约5ng(纳克)至约1000mg(毫克)、或约100ng至约600mg、或约1mg至约500mg、或约20mg至约400mg的范围内施用。例如，可以选择剂量以实现约0.0001mg/kg至约1500mg/kg、或约1mg/kg至约1000mg/kg、或约5mg/kg至约150mg/kg、或约20mg/kg至约100mg/kg的剂量/体重比。例如，剂量单位可以在约1ng至约5000mg、或约5ng至约1000mg、或约100ng至约600mg、或约1mg至约500mg、或约20mg至约400mg、或约40mg至约200mg的化合物或包含化合物的组合物的范围内。在本公开的一个实施方案中，本公开中描述的化合物的量(例如几克)是局部施用的，例如在脊柱融合术中作为支架的一部分施用。

氧化固醇-他汀类化合物的剂量可以按照需要每天一次、每天两次、每天四次或每天多于四次施用，以引起所需的治疗作用。例如，可以选择剂量施用方案以实现本公开化合物的血清浓度在约0.01至约1000nM、或约0.1至约750nM、或约1至约500nM、或约20至约500nM、或约100至约500nM、或约200至约400nM的范围内。例如，可以选择剂量施用方案以实现本公开化合物的半最大剂量的平均血清浓度在约1μg/L(微克/升)至约2000μg/L、或约2μg/L至约1000μg/L、或约5μg/L至约500μg/L、或约10μg/L至约400μg/L、或约20μg/L至约200μg/L、或约40μg/L至约100μg/L的范围内。

本公开的某些实施方案还可以包括用另外的药剂进行治疗，所述另外的药剂独立作用或与氧化固醇-他汀类化合物协同作用以改善治疗结果。当以组合疗法提供时，除氧化固醇-他汀类化合物以外的药剂可以与所述化合物同时提供，或者根据需要交错给药。两种(或更多种)药物也可以组合在组合物中。组合使用时各自的剂量可以少于单独使用时的剂量。本领域技术人员可以使用标准剂量参数来确定合适的剂量。

在本公开的一个实施方案中，试剂盒可用于本文公开的任何方法，无论是体外还是体内。这种试剂盒包含化合物或其生物活性或药物组合物，并且可以包含一种或多种其它氧化固醇，例如其导致Hh通路介导的活性增加，或其他合适的治疗剂。任选地，所述试剂盒包含用于执行该方法的说明书。本公开的试剂盒的任选元件包括合适的缓冲液，药学上可接受的载体等，容器，或包装材料。试剂盒的试剂可以在使试剂稳定的容器中，例如呈冻干形式或稳定化液体。试剂还可以是单次使用形式，例如单剂量形式。本领域的普通技术人员将认识到适合于实施本公开的任何方法的试剂盒组分。

多种病状可以用单独使用或与其它治疗剂组合使用的氧化固醇-他汀类化合物进行治疗。氧化固醇-他汀类化合物可导致刺猬蛋白通路活性的增加。

氧化固醇-他汀类化合物的一种作用可以是靶向多能细胞以诱导其谱系特异性分化成各种细胞类型，例如成骨细胞。例如，用化合物处理的间充质干细胞可以显示成骨细胞分化标志物的诱导表达。不希望受到任何特定机制的束缚，提出该谱系特异性分化是由于在这些细胞中诱导刺猬蛋白信号传导。然而，无论化合物的作用机制如何，本文讨论的治疗方法都包括在本公开中。氧化固醇-他汀类化合物可用于治疗将受益于骨形成刺激、成骨细胞分化、骨形态发生和/或骨质增生的病状。这些病状或治疗包括例如用于刺激脊柱融合或骨质疏松症、骨折修复或愈合中的局部化骨形成的骨诱导性疗法，颌中骨形成增加具有临床益处的牙科手术，由创伤引起的颅面骨缺损或者先天性缺损如腭裂/唇裂的修复，以及其中原生骨生长不足的许多其它肌肉骨骼病症，这对本领域技术人员将是显而易见的。可以施用治疗以治疗开放性骨折和具有高度不愈合风险的骨折，以及患有脊柱病症的受试者，包括需要脊柱融合(例如，前路腰椎椎体间融合、后路腰椎脊柱融合和颈椎融合)的受试者或具有影响腰椎和颈椎的退行性椎间盘疾病或关节炎的受试者。此外，氧化固醇-他汀类化合物可用于治疗骨质疏松症，特别是在由破骨细胞的骨吸收增加且同时成骨细胞的骨形成减少所导致的衰老和绝经后群体中。

更具体地说，可以进行以下类型的骨相关治疗。在一些实施方案中，使用由相容性分子(例如但不限于胶原蛋白I)组成的支架，可以将化合物用作在体内局部递送的成骨剂以刺激局部化骨形成，所述支架吸收所述化合物，然后被放置于体内。例如，含有氧化固醇-他汀类化合物的支架可放置在横突之间或者需要两个或更多个椎骨融合的椎间盘中，例如在脊柱融合、假关节和不愈合融合中。在其它实施方案中，将含有氧化固醇-他汀类化合物的支架放置在骨折骨中以刺激骨形成和骨折愈合；放置在其中需要通过化合物进行骨再生的骨缺损如颅顶或上颌面骨缺损中；或者放置在颌骨中以刺激骨形成，作为在诸如牙科植入物的牙科手术之前再生骨的手段。在其它实施方案中，氧化固醇-他汀类化合物可用作体外成骨剂。例如，可将其施用于骨祖细胞，例如间充质干细胞，以便在将这些细胞应用于如上所述的整形外科和其它手术之前刺激它们的成骨分化，以刺激局部化骨形成。在其它实施方案中，可以在体外使用氧化固醇-他汀类化合物以刺激骨祖细胞中的刺猬蛋白信号通路，从而导致细胞在体外或体内的成骨分化。

在前述和下面的实施例中，所有温度都以摄氏度表示；并且除非另有说明，否则所有份数和百分数都以重量计。上述的成骨性氧化固醇可用于直接局部施用于相关靶细胞、组织或器官。

本申请的这些和其它方面将在考虑以下实施例时得到进一步理解，所述实施例旨在说明本申请的某些特定实施方案，但并非旨在限制其如通过权利要求所限定的范围。

实施例

实施例1

从孕烯醇酮醋酸酯制备

在剧烈电磁搅拌和冰浴冷却下，将8.25mL正己基氯化镁(2M，16.5毫摩尔)的THF溶液加入到孕烯醇酮醋酸酯的THF溶液中。孕烯醇酮醋酸酯溶液在4.5mL THF中含有1.79g化合物1孕烯醇酮醋酸酯(5毫摩尔)。经2分钟进行添加。添加完成后，将混合物在室温下搅拌3.5小时，此时混合物变成凝胶。然后将凝胶用饱和NH₄C1水溶液和MTBE(甲基叔丁基醚)的混合物消化。将有机层分离，用水洗涤三次并蒸发。通过使用EtOAc(乙酸乙酯)/石油醚混合物(比率70/30)的硅胶柱色谱法分离残余物，得到呈白色固体状的化合物2二醇。提取1.29g(3.21毫摩尔)固体二醇，分离收率为64％。反应如下A所示：

二醇在CDCl₃中在400MHz下的¹H NMR数据如下所示：δ：0.8-1.9(40H)，1.98(m，1H)，2.09(m，1H)，2.23(m，1H)，2.29(m，1H)，3.52(m，1H)，5.35(m，1H)，如图6中所示。二醇在CDCl₃中在100MHz下的¹³C NMR数据在图7中如下所示：d：13.6，14.1，19.4，20.9，22.4，22.6，23.8，24.2，26.4，30.0，31.3，31.6，31.8，31.9，36.5，37.3，40.1，42.3，42.6，44.0，50.1，56.9，57.6，71.7，75.2，121.6，140.8。

所产生的二醇的IUPAC名称为(3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇。

实施例2

从孕烯醇酮制备

作为实施例1的替代，上述反应方案A的化合物2可以从下文方案B中所示的孕烯醇酮利用与化合物1转化为化合物2所用相同的程序来制备。在该程序中，10g孕烯醇酮被转化为7.05g化合物2，其收率为55％。

反应方案B

将2500mL的正己基氯化镁(2M，5摩尔)装入反应器中并将溶液冷却至-5℃。将孕烯醇酮醋酸酯于THF中的溶液以保持内部反应温度低于1℃的速率装入反应器中。孕烯醇酮溶液在8升THF中含有500g孕烯醇酮(1.4摩尔)。添加完成后，将混合物在0℃保持1小时，然后使其升温至室温过夜。反应混合物变成固体凝胶状物质。加入2升另外的THF，接着加入10ml冰醋酸。将反应混合物冷却至5℃，并通过加入350ml冰醋酸淬灭，得到溶液。将反应混合物减压浓缩成浓糖浆状物。将化合物溶于二氯甲烷中，用水洗涤，最后用饱和碳酸氢钠洗涤。将有机层减压浓缩成琥珀色油状物。质量回收为约800克。粗物质在下一步中原样使用。

所产生的二醇的IUPAC名称为(3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇。

实施例3

将粗己基二醇产物(800克)溶于8升THF中，装入反应器中，并冷却至-5℃。以维持内部反应温度低于1℃的速率装入6300mL硼烷-THF复合物(1M，6.3摩尔，4.5当量)的THF溶液。一旦添加完成，将反应混合物在0℃搅拌1.5小时，然后使其升温至室温过夜。反应如下所示。

通过加入10％氢氧化钠(4750mL)和30％过氧化氢(1375mL)的混合物使反应混合物淬灭。淬灭极其放热并且需要几个小时才能完成。内部温度保持低于10℃。淬灭体积添加完成后，将混合物保持冷却1.5小时，然后使其升温到室温过夜。然后加入8升二氯甲烷。将有机层分离并用7升新鲜水洗涤，并减压浓缩。分离出呈粘性油状物质的产物，其在放置后固化。

将产物溶于4升二氯甲烷中，并置于用二氯甲烷制备的硅胶柱上。首先用25％乙酸乙酯洗脱柱以洗脱7-甲基-7-十三烷基醇副产物。随后，用10％甲醇-乙酸乙酯洗脱柱以溶剂化OXY133。将收集的洗脱份合并，并减压浓缩成蜡状固体。将化合物溶于丙酮-水混合物(3∶1)中并减压浓缩以除去残余溶剂。所得粗OXY133被用于下一步。

可选地，从硼氢化/氧化回收的粘稠产物可以通过与庚烷一起搅拌而固化，并且通过过滤分离产物。将分离的产物悬浮在二氯甲烷(7.3mL二氯甲烷/g固体)中。通过过滤分离产物并且原样用于下一步。

实施例4

通过在回流下将630克粗OXY133溶于1500ml的3∶1丙酮/水混合物中，然后冷却至室温，使OXY133重结晶。通过真空过滤回收结晶固体并干燥，得到336g，从化合物1的总收率为28％。所产生的OXY133是单水合物，并且IUPAC名称为(3S，5S，6S，8R，9S，10R，13S，14S，17S)-17-((S)-2-羟基辛-2-基)-10，13-二甲基十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3，6-二醇单水合物。

图1示出用包含孕烯醇酮醋酸酯的起始反应物合成OXY133的分步反应。使孕烯醇酮与有机金属化合物反应，产生具有两个羟基基团的固醇或二醇。然后将所述固醇或二醇与硼烷和过氧化氢反应并纯化以产生OXY133。

OXY133在CDCl₃中在400MHz下的¹H NMR数据如下所示：δ：0.66(m，1H)，0.85(m，10H)，1.23(m，18H)，1.47(m，9H)，1.68(m，4H)，1.81(m，1H)，1.99(m，1H)，2.06(m.1H)，2.18(m，1H)，3.42(m，1H)，3.58(m，1H)。OXY133在CDCl₃中在400MHz下的¹³C NMR数据如下所示：d：13.7，14.0，14.3，21.2，22.5，22.8，23.9，24.4，26.6，30.1，31.1，32.1，32.5，33.9，36.5，37.5，40.4，41.7，43.1，44.3，51.9，53.9，56.5，57.9，69.6，71.3，75.4。OXY133的红外光谱数据显示在3342cm^-1、2929cm^-1、2872cm^-1、2849cm^-1的峰。OXY133的涡轮喷雾质谱数据显示以下峰：438.4m/z[M+NH₄]+，420.4m/z(M-H₂O+NH₄]+，403.4m/z[M-H₂O+H]+，385.4m/z[M-2H₂O+H]+。OXY133的¹H NMR、¹³C NMR、IR和MS数据分别示于图2、图3、图4和图5中。图6是从中间体固醇或二醇合成OXY133所得的¹H NMR数据的图示。图7是从中间体固醇或二醇合成OXY133所得的¹³C NMR数据的图示；

实施例5

从孕烯醇酮醋酸酯的替代单容器程序

将100mL正己基氯化镁(2M的THF溶液，200毫摩尔)装入烧瓶并冷却至-10℃。滴加含有20g孕烯醇酮醋酸酯(56毫摩尔)的200ml无水THF溶液，同时保持内部反应温度低于-10℃。添加完成后，将混合物搅拌30分钟，然后使其升温至室温。在室温下4小时后，混合物变成凝胶状的可搅拌物。将混合物冷却至0℃，并滴加200mL硼烷-THF复合物(1M的THF溶液，200毫摩尔)，同时保持内部温度低于0℃。一旦添加完成，使所得溶液升温至室温过夜。

将混合物冷却至0℃并通过缓慢加入10％NaOH(190mL)和30％H₂O₂(55mL)的混合物淬灭。一旦淬灭完成，用MTBE(总共800mL)萃取混合物，得到乳液。加入盐水并分离各层。将有机相减压浓缩成透明粘稠的油状物。使用先前描述的塞柱法进一步纯化所述油状物。

对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在不脱离本文教导的精神或范围的情况下，可以对本文描述的各种实施方案进行各种修改和变化。因此，各种实施方案预期涵盖在本教导范围内的各种实施方案的其它修改和变化。

Claims (20)

1.一种制备氧化固醇-他汀类化合物的方法，所述方法包括使式I的孕烯醇酮

与R₁X在碱存在下反应，形成式II的孕烯醇酮衍生物：

使所述式II的孕烯醇酮衍生物与有机金属化合物反应，形成式III的二醇衍生物：

使所述式III的二醇衍生物与硼烷化合物反应，形成式IV的氧化固醇或其药学上可接受的盐：

使所述式IV的氧化固醇与他汀类反应，形成所述氧化固醇-他汀类化合物，其中R₁是保护基团，X是卤离子并且R₃是具有至少一个碳的脂族或环状取代基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中R₁是甲基、乙基、甲硅烷基或氨基甲酸酯基基团并且R₃是(C₆-C₂₆)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基或者(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基，或(C₄-C₁₀)亚烷基桥或亚杂烷基桥。

3.根据权利要求1所述的方法，其中(i)所述有机金属化合物包含式R₃MgX，其中X是卤离子并且R₃是具有至少一个碳的脂族或环状取代基；或(ii)所述有机金属化合物包含式R₃Li，其中R₃是具有至少一个碳的脂族或环状取代基；或(iii)R₁是甲基、乙基、叔丁基、烯丙基、氨基甲酸酯基或甲硅烷基基团；或(iv)R₁是甲基、乙基、叔丁基、烯丙基、氨基甲酸酯基、三异丙基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基基团。

4.根据权利要求3所述的方法，其中R₃MgX是正己基氯化镁并且在四氢呋喃中反应，形成式IIIa化合物：

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述硼烷化合物是(i)BH₃，其在与式IIIa反应后形成硼烷中间体；(ii)使步骤(i)的所述硼烷中间体与过氧化氢在NaOH、KOH或Ca(OH)₂反应，形成式Va化合物：

6.根据权利要求5所述的方法，其还包括使所述式Va化合物与包括阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀的他汀类反应，形成具有下式的所述氧化固醇-他汀类化合物：

其中R₁是甲基、乙基、甲硅烷基或氨基甲酸酯基基团并且R₄是他汀部分。

7.根据权利要求6所述的方法，其还包括利用碘源或氟化物源使C₃被保护的氧化固醇-他汀类化合物脱保护，获得式VI化合物：

其中R₄是阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀的部分。

8.根据权利要求7所述的方法，其中R₄是式VII的氧化固醇-他汀类化合物：

9.根据权利要求5所述的方法，其还包括使所述式Va化合物与包括琥珀酸酐、天冬氨酸、乙基氨基甲酸或聚乙二醇的化合物反应；使所得化合物与他汀部分R₄偶联，获得式VIII化合物：

其中L是接头，所述接头是基于天冬氨酸的接头、基于琥珀酸酯的接头或基于氨基甲酸酯的接头并且所述他汀部分R₄是阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀。

10.根据权利要求9所述的方法，其还包括利用碘源或氟化物源使所述式VIII化合物脱保护，获得式IX化合物：

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述碘源是三甲基甲硅烷基碘，所述氟化物源是四正丁基氟化铵或HF吡啶复合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述反应在单个容器中进行，以得到氧化固醇-他汀类化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述反应在单个容器中进行，以得到含有所述接头L的氧化固醇-他汀类化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。

14.一种药物组合物，其包含(i)式V化合物：

或

(ii)式VI化合物：

或

(iii)式VII化合物：

或

(iv)式VIII化合物：

或

(v)式IX化合物：

和药学上可接受的载体或稀释剂，其中R₁是保护基团，R₄是他汀部分并且L是接头。

15.一种治疗患有骨病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的

(i)式V化合物：

或

(ii)式VI化合物：

或

(iii)式VII化合物：

或

(iv)式VIII化合物：

或

(v)式IX化合物：

和药学上可接受的载体或稀释剂，其中R₁是保护基团，R₄是他汀部分并且L是接头，并且所述化合物通过局部递送或全身递送施用于所述哺乳动物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述骨病包括骨折、骨质疏松症或骨质减少。

17.一种化合物，其对应于结构：

或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中R₁是保护基团并且R₃是具有至少一个碳的脂族或环状取代基。

18.根据权利要求17所述的化合物，其中R₁是甲基、乙基、甲硅烷基或氨基甲酸酯基基团并且R₃是(C₆-C₂₆)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基和(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基、或(C₄-C₁₀)亚烷基桥或亚杂烷基桥或氨基甲酸酯基或苄基或甲硅烷基，条件是当R₃是(C₆-C₂₆)烷基时，R₁不是叔丁基二甲基甲硅烷基。

19.一种氧化固醇-他汀类化合物，其对应于结构：

其中R₁是甲基、乙基或甲硅烷基基团并且R₄是他汀部分。

20.根据权利要求19所述的化合物，其对应于结构：

其中R₄是阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀的部分或者R₄是洛伐他汀部分，并且所述氧化固醇-他汀类化合物对应于结构：