CN106232612A - 骨选择性成骨性氧固醇双膦酸盐类似物 - Google Patents

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Abstract

氧固醇‑双膦酸盐和氧固醇‑阿伦膦酸化合物、包括它们的组合物以及使用它们来治疗骨病症的方法。

Description

骨选择性成骨性氧固醇双膦酸盐类似物
本申请要求2014年5月2日提交的美国临时申请号61/987,739的权益，所述美国临时申请据此以引用的方式整体并入本文。
本发明根据由国立关节炎以及肌肉骨骼和皮肤疾病研究所(National Instituteof Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)授予的AR065808在政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景
骨质疏松是影响超过1000万美国人的最常见代谢骨疾病，其中接近50％是老年女性，并且超过10％是老年男性群体。(Rachner,T.D.等Lancet 2011,377,1276-1287.Silva,B.C.Annu.Rev.Med.2011 62,307-322.Lyritis,G.P等Ann.N.Y.Acad.Sci.2010,1205,277-283.Khosla,S.等J.Clin.Endocrinol,Metab.2012,97,2272-2282.Aspray,T.J.等Maturitas 2012,71,76-78.Black,D.M.等N.Engl.J.Med.2012,366,2051-2053。)作为显现骨质疏松的一个主要风险因素的骨质减少(骨质量降低)甚至更常见，影响3400万美国人。骨折是骨质疏松和骨质减少的一种广泛并发症，造成重大社会经济代价，诸如住院和残疾，并且非常常见的是：它们是原本健康和活跃老年个体的衰退和死亡的病因。年龄相关的骨质疏松性骨损失和它的所得并发症在衰老群体中导致重大罹病率和死亡率。
成年期的骨健康状况分别取决于骨形成性成骨细胞和骨再吸收性破骨细胞的合成代谢细胞活性和分解代谢细胞活性的协调平衡。多能间质干细胞(也称为骨髓基质细胞，MSC)形成包括成骨细胞和脂肪细胞的多种细胞类型的前体群体。新骨的形成由MSC的成骨性分化驱动，所述分化是一种可被许多因素破坏的过程。衰老、疾病和诸如烟草和酒精滥用的生活方式因素倾向于以成骨细胞分化为代价将MSC群体推向脂肪生成，从而导致常引起完全发展的骨质疏松和骨折修复受损的骨质减少病症。MSC的谱系特异性分化背后的机理可为重要的。各种因素可刺激成骨细胞形成而抑制脂肪生成。
在两种针对骨质疏松的可能治疗策略，即预防骨损失/再吸收或刺激骨生长之中，用双膦酸盐药物的抗再吸收疗法是更确定的。(Khosla,S.等J.Clin.Endocrinol.Metab.2012,97,2272-2282 Sharpe,M.；Noble,S.；Spencer,C.M.Drugs.2001,61,999-1039。)几乎所有当前针对骨质疏松的疗法以及大多数处于临床探究下的潜在新型治疗都旨在降低骨质疏松患者中的骨再吸收水平。在售或处于临床试验中的靶向骨再吸收的机理的疗法包括地诺单抗(Denosumab)(普洛里(Prolia)、唑来膦酸(Zolendronic Acid)(瑞拉斯特(Reclast))、奥丹昔布(Odanacatib)和塞卡替尼(Saracatinib)。抗再吸收药物疗法已在治疗不同于其中已发生骨矿物质密度大量损失的晚期骨质疏松的早期和轻度疾病病例方面最为有效。
或者，尽管FDA在该领域中批准的药物少，但骨合成代谢剂可提供额外治疗选项，特别是关于晚期疾病，并且显著改进骨质疏松管理。当前，可用于治疗重度骨质疏松患者的唯一FDA批准骨合成代谢剂是特立帕肽(teriparatide)(复泰奥(Forteo))，其是一种重组形式的甲状旁腺激素(PTH)，必须通过每日注射间歇施用。复泰奥可引起显著骨形成，并且降低骨折风险，但它的使用由于安全性顾虑而严重受限。由于诸如骨肉瘤风险增加的不利副作用，复泰奥关于患者群体和使用持续时间(小于24个月)的药物标注被高度限制。(Colman,F.等Curr.Osteoporos.Rep.2014,12,385-395.Muschitz,C.等J.BoneMiner.Res.2013,28,196-205.Vescini,F.等Clin.Cases Miner.Bone Metab.2012,9,31-36。)处于临床探究下的其它合成代谢剂包括刺激内源性间断PTH分泌的钙溶解药物、针对称为硬化蛋白(Sclerostin)的成骨细胞抑制剂的抗体、以及Wnt信号传导拮抗剂的抑制剂。(Silva,B.C.等Anna Rev.Med.2011 62,307-322)
在患有轻度骨质疏松的患者中，双膦酸盐药物(例如阿伦膦酸、福善美(Fosamax))可产生显著益处，诸如骨密度改进和骨折风险降低。然而，即使当在空腹条件下摄取时，包括阿伦膦酸的双膦酸盐药物也显示低口服生物可用度(平均0.6-0.7％)。药物连同餐食和饮料(除水以外)一起摄入使生物可用度进一步降低，而在空腹条件下摄入引起大多数患者中严重的上胃肠道刺激。因此，在空腹条件下重复(通常每日)口服给药为使双膦酸盐药物的递送达到药理学上可实现的最大程度所必需，但超过99％的剂量不能被吸收，并且以未使用状态从身体排出。可被吸收的双膦酸盐药物部分可在人体中快速分配，其中约50％的药物结合于骨表面，而其余部分以未改变状态经肾排泄。低口服吸收的物理化学基础被认为与不可避免地作为所有双膦酸盐药物的一部分的带负电荷的膦酸根部分相关。为克服这个缺点，已探究多种策略，包括用脂肪酸和胆汁酸缀合，旨在掩蔽膦酸根电荷效应的前药方法。(Bortolini,O.等Euro.J Med.Chem.2012,52,221-229.Vachal,P.等J Med.Chem.2006,49,3060-3063。)
天然存在的氧固醇可充当对MSC和其它多能间质细胞具有作用的类药分子。存在于人循环和各种组织中的氧固醇可为胆固醇代谢转化以形成类固醇激素和胆汁酸中的短暂中间体。然而，除它们作为被动代谢物的作用之外，天然氧固醇可充当能够调节一定范围的生理现象(在它们之中的是脂质的体内平衡)的信号传导分子，以及控制细胞状态，诸如分化、炎症和凋亡。也就是说，氧固醇可作为组织特异性信号传导的调控剂起作用。关于氧固醇的早期研究考虑了它们的病理性作用，并且假定所有氧固醇无论它们的不同化学组成如何都具有类似性质。氧固醇化学型可具有取决于细胞环境以及氧固醇的精确化学组成的更个别化特征。(Schroepfer,G.J.Physiol.Rev.2000,80,362-554.Gill,S.等Frog.LipidRes.2008,47,391-404.Sottero,B.等Curr.Top.Med.Chem.2009,16,685-705。)一些氧固醇可促进氧化应激。然而，成骨性氧固醇可抑制氧化应激对祖细胞的成骨性分化的不利影响。一些氧固醇被认为是肝X受体(LXR)的内源性配体。然而，氧固醇的成骨活性可能不是LXR活化的结果，而是可通过活化Hh信号传导加以介导。氧固醇诱导的Hh信号传导活化可不依赖于Hh蛋白而发生，并且导致非典型Wnt和Notch信号传导的活化。基线PKA/cAMP、PKC、MAPK和PI3激酶信号传导可涉及于介导细胞对这些氧固醇的应答的各个方面中。(Kha,H.T.等J.Bone Miner.Res.2004,19,830-840.Richardson,J.A.等J.Cell.Biochem.2007,100,1131-1145。)尽管报道了一些氧固醇的细胞毒性，但在以下情况下未见成骨性氧固醇的毒性作用：在体外，使用骨祖细胞，在1-20μM下给药时；或在体内，在大鼠脊柱融合模型中局部施用(40mg)期间；或在小鼠中，每周3次在50mg/kg下ip给药共计8周，如通过不存在行为变化所确定。
发明概述
本发明的一个实施方案是一种包含诸如本文阐述的氧固醇-双膦酸盐化合物(例如Oxy133-阿伦膦酸化合物)的组合物。组合物可包括药学上可接受的载体或稀释剂，并且可为药物制剂。本发明方法包括将制剂局部和/或全身递送至可为人或动物的受试者中，以治疗包括但不限于骨折、骨质疏松和/或骨质减少的骨病症。本发明方法包括用氧固醇-双膦酸盐化合物体外处理成骨祖细胞，以及将它们(成骨祖细胞)随后定位和/或全身性递送至可为人或动物的受试者中，以治疗包括但不限于骨折、骨质疏松和/或骨质减少的骨病症。本发明方法包括向受试者诸如局部和/或全身给予和/或施用包括氧固醇-双膦酸盐化合物的制剂，以刺激组织和/或器官，例如将受益于治疗性活化Hedgehog信号传导路径的组织和/或器官中的Hedgehog信号传导路径。
一个实施方案包括具有下式的化合物
其中R1、R2和R3独立地选自由以下组成的组：氢、
R1、R2和R3中的至少一个可不为氢。R4可为具有1至5个碳的烷基。化合物可具有下式
化合物可具有下式
其中R选自由以下组成的组：
化合物可具有下式
化合物可具有下式
化合物可具有下式
化合物可具有下式
化合物可具有下式
其中R1、R2和R3独立地选自由以下组成的组：氢、
其药学上可接受的盐。化合物可具有下式
一个实施方案包括这些化合物的药学上可接受的盐以及这些化合物的钠盐。一个实施方案包括一种药物组合物，其包含一种或多种这些化合物以及药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的方法包括通过向罹患骨病症的人或动物受试者施用有效量的这些化合物中的至少一个来治疗所述受试者。可施用化合物以实现向受试者局部或全身性递送。例如，骨病症可为骨折、骨质疏松或骨质减少。可例如在体外使成骨祖细胞与有效量的这些化合物中的至少一个接触。可例如局部或全身向受试者施用接触的成骨祖细胞。
本发明的用于处理细胞的方法包括向所述细胞施用有效量的这些化合物中的至少一个，以使所述细胞中的Hedgehog信号传导路径被刺激。细胞可为组织或器官的一部分。可在体内施用化合物。本发明的用于治疗将受益于治疗性活化组织或器官中Hedgehog信号传导路径的人或动物受试者的方法包括处理组织或器官的细胞，以使所述组织或器官的所述Hedgehog信号传导路径被刺激。
本发明的一个实施方案包括用于治疗骨病症的这些化合物中的一个或多个。本发明的一个实施方案包括这些化合物中的一个或多个制造用于治疗骨病症的药剂的用途。
附图简述
图1显示在6天之后，OXY133-ALN缀合物在M2细胞中对碱性磷酸酶(ALP)、骨唾液蛋白(BSP)和osterix(OSX)的成骨性基因表达的影响(各棒条上方的数值表示超过对照的诱导倍数)。
图2显示在30天之后观察到的OXY133-ALN缀合物对M2细胞中矿物化的影响。
图3A说明31P-NMR形象化HAP结合测定程序和实验设计。图3B显示来自HAP结合测定的结果。
图4A显示根据对于图3A的实验所述的条件的HAP结合测定的结果，其中600mg HAP用于“大量HAP上样”条件。图4B和4C显示根据对于图3A的实验所述的条件的HAP结合测定的结果，其中150mg HAP用于“低量HAP上样”条件。
图5显示本发明的若干化合物。
详细描述
以下详细讨论本发明的实施方案。在描述实施方案时，为明晰起见采用特定术语。然而，本发明不意图限于如此选择的特定术语。相关领域技术人员将认识到在不脱离本发明的精神和范围下可采用其它等效部分，以及开发其它方法。
天然存在的氧固醇20(S)-羟基胆固醇、22(S)-羟基胆固醇和22(R)-羟基胆固醇可用作潜在成骨剂。鉴定了一系列在体外与在体内均有效的强力成骨性氧固醇类似物。该半合成氧固醇家族的成员在通过胶原蛋白海绵在横突之间局部施加时在大鼠中诱导强健的骨形成和脊柱融合。(Johnson,J.S.等J.Cell.Biochem.2011,112,1673-1684。)
作为胆固醇氧化产物的氧固醇在体内形成，并且已牵涉于包括细胞分化和胆固醇代谢的各种生物过程中。见于人和动物循环中以及各种组织中的天然存在的氧固醇可具有骨形成性成骨性质。向包括骨髓基质细胞(间质干细胞，MSC)和胚胎纤维母细胞的多能间质骨祖细胞施用这些氧固醇可在体外导致强健的成骨性分化以及形成充足矿物化骨基质。在不受理论束缚下，这些作用可通过不依赖于经典Hh蛋白来活化Hedgehog(Hh)信号传导路径加以部分地介导。一个更强力氧固醇家族可具有优于它们所源于的天然存在的氧固醇的成骨和抗脂肪生成活性。所述分子可在体外显示强力成骨活性，并且在体内刺激强健的骨形成和脊柱融合。预期它们不引发显著免疫原性应答。
OXY133是系列中具有增强的成骨活性的类似物。Oxy133可诱导培养的人初级间质干细胞中的骨发生，并且相较于其它类似物以加速方式诱导大鼠中的脊柱融合。在非啮齿动物骨疾病模型，诸如兔脊柱融合和兔颅盖缺陷模型中，Oxy133可诱导强健的骨发生。Oxy133是一种供局部施用，潜在应用于脊柱融合和修复不愈合骨折中的药物开发候选物。(Montgomery,S.R.等J.Bone Miner.Res.2014,29,1872-1885。)然而，当预期全身性施用如Oxy133的氧固醇作为用以刺激骨质疏松中的骨形成的潜在合成代谢因素时，必须考虑它们在人肝微粒体(HLM)中的短暂半衰期(<5分钟)以及不一定有利于在骨组织中沉积的组织分布。此外，由于可能的骨发生机理，所以可能明智的是短暂活化MSC中的Hh路径，从而增加对骨组织的选择性，同时使对其它组织的暴露最小。这可通过使双膦酸根阿伦膦酸连接于将它选择性递送至骨中的氧固醇分子来实现。
双膦酸盐可抑制骨再吸收，并且具有骨选择性亲和力。双膦酸盐在缀合于其它药物时可充当骨特异性药物递送剂，因为它们使除骨以外的组织基本上不受暴露。
多能间质干细胞(MSC)细胞性分化成骨形成性成骨细胞可构成合成代谢骨生长的驱动力。某些天然存在的氧固醇可体外诱导MSC成骨性分化同时阻止脂肪生成性分化，并且可在大鼠颅盖缺陷模型中体内刺激局部骨形成。已报道当在体外使用或在大鼠脊柱融合模型中体内使用时，相比于天然存在的氧固醇具有更大成骨活性的新型半合成氧固醇的合成和表征。在本发明的一个实施方案中，阐述在全身性给药(iv(静脉内)、ip(非肠胃内(intraparenteral))、subcu(皮下)或口服)的情形下作为如为治疗骨质疏松所需的骨合成代谢剂的新型成骨性氧固醇。
当全身施用时，这些分子可选择性归巢(home)至骨组织，并且增强骨形成。这些分子可用作用于治疗骨质疏松的骨合成代谢剂。预期骨靶向成骨性氧固醇在全身施用时不具有任何显著毒性或免疫原性效应。
本发明的一个实施方案包括通过使氧固醇化合物OXY133缀合于双膦酸盐药物阿伦膦酸来形成的成骨性氧固醇。OXY133-阿伦膦酸缀合类似物可用作用于治疗骨质疏松的全身活性骨合成代谢剂。OXY133-阿伦膦酸缀合物可具有增加的羟磷灰石结合选择性，并且它们在刺激骨祖细胞的成骨性分化方面具有增加的功效。OXY133-阿伦膦酸缀合物可用于在骨质疏松中进行干预，所述干预以骨祖细胞体内成骨性分化为目标，从而在各种骨骼部位处刺激新骨形成。双膦酸盐显示低口服可用度和可耐受性。氧固醇-阿伦膦酸缀合物可具有改进的药理学性质。为使潜在副作用最小以及增强向骨组织中的递送，使强力成骨性氧固醇缀合于阿伦膦酸。
在本发明的一个实施方案中，合成是成骨性氧固醇Oxy133与双膦酸盐分子阿伦膦酸的组合的新型OXY133-ALN缀合物分子。如下所示，双膦酸盐-接头可连接在OXY133的3、6和/或20位处：
骨特异性药物递送并非仅可适用于可为骨疾病勉强接受的药物(例如雌二醇(estradiol)和双氯芬酸(diclofenac))以增加功效，使副作用最小，并且允许达成适当给药。在本发明的一个实施方案中，骨特异性药物递送的观念被应用于先前未针对全身性骨疾病加以测试的成骨性分子以致使它们作为骨质疏松的有效治疗剂。具有成骨性质的基于氧固醇的Hh信号传导激动剂可属于这个种类。骨特异性药物递送剂可通过可水解接头键合来连接于它们的药物分子。非可水解键合可用于其中药物分子在缀合于骨靶向性单元之后保留药理学活性的情况下。可使用酯基，因为它们相对于更不稳定的硫酯和更稳定的酰胺处于有利稳定性范围。(Gil,L.等Bioorg.Med.Chem.1999,7,901-919。)酯基的体内稳定性可通过邻近于酯基放置的取代加以进一步精细调谐。因此，Oxy133-阿仑膦酸盐酯缀合物可用于全身性给药(口服、ip、subcu或iv)，所述给药导致选择性沉积在骨组织中，随后进行酶促接头水解并在控制速率下将成骨剂Oxy133释放至靶标组织中。
在本发明的一个实施方案中，OXY133-ALN缀合物包含一个或多个通过接头在OXY133的一个或多个位置处缀合于OXY133的ALN。在本发明的一个实施方案中，ALN可通过接头在OXY133的3、6和/或20位处与OXY133缀合。
例如如下所示的类似物2、3和4，其中OXY133通过3和/或6位以源于琥珀酸(a系列)、天冬氨酸(b系列)、甘氨酸氨基甲酸酯接头(c系列)或直接连接的氨基甲酸酯(d系列)的酯或氨基甲酸酯接头单元缀合于阿伦膦酸。氨基甲酸酯接头相较于酯接头可对酯酶水解更稳定，并且基于琥珀酸的接头相较于基于天冬氨酸的接头可对酯酶水解更稳定，所述基于天冬氨酸的接头可更易于经受对氨基酯键的酶促水解。酯水解速率的差异可有益地用于精细调谐Oxy133在靶标骨组织中的释放。此处为方便起见显示完全质子化形式的缀合物，但可制备双膦酸的任何盐形式。通常，制备缀合物的钠盐。
可通过不同合成途径获得最终OXY133-ALN缀合物。例如，Oxy133-阿仑膦酸盐缀合物2、3和4的合成可从孕烯醇酮(pregnenolone)5开始，所述孕烯醇酮可通过以下方式转化成被差异性保护的OXY133衍生物6：保护3-羟基，添加侧链、使5-烯硼氢化-氧化，接着视所需类似物而定将羟基选择性保护或脱保护，如下所示：
可通过各种合成途径制备这些化合物的偶联配偶体。可用琥珀酸酐、保护的天冬氨酸或甘氨酸甲酯在3-羟基和/或6-羟基处使OXY133或衍生物6酰化，并且所得羧酸可接着被活化成N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚衍生物，接着偶联于阿伦膦酸以产生缀合物。
条件：a.琥珀酸酐(对于2，8当量；对于3，1.5当量)，DMAP(0.1当量)，Et3N(10当量)，DCM，室温，过夜；对于2，定量，对于3，约40％。b.三光气(0.66当量)，pyr(5当量)，glyOMe(3当量)，DCM，室温，1小时。c.K2CO3，MeOH/H2O，室温，过夜，定量。d.CDI(7当量)，THF，室温，过夜；接着ALN(nBu4N+)3，DMF，室温，过夜；DOWEX 50WX4 100-200 Na型，约15％；e.pTsOH(0.1当量)，MeOH/DCM，室温，30分钟。f. AC2O(1.4当量)，pyr，室温，过夜，58％。
由于ALN和活化酯中间体具有不相容的溶解度特征，所以形成阿伦膦酸的四丁铵盐为使用DMF实现成功偶联反应所必需。使极具极性的双膦酸根部分附接于Oxy133是非常大的合成挑战，因为所得缀合物不溶于有机溶剂中，不能通过传统正相色谱法纯化，并且具有表面活性剂样性质。由于与膦酸官能基的竞争性副反应，所以不可能与ALN直接形成酰胺键。因此，通过分离的活化酯形成ALN缀合物，所述活化酯在单独步骤中在碱性条件下偶联于ALN。利用ALN盐形式，并且使用反相固相提取(SPE)柱体进行纯化从而允许以50-100mg规模达成适宜制备。使用四丁铵盐极大增强最终缀合物在SPE柱体上的保留。尽管钠盐基本上没有保留，但四丁铵盐只有用含大量甲醇的流动相方可洗脱。最后，用Dowex阳离子交换树脂将剩余四丁铵盐交换成钠盐以提供适于生物测试的OXY-ALN缀合物。
条件：a.DCC，NHS，DCM，室温，过夜，约70％；b)ALN(nBu4N+))3，DMF，室温，过夜；DOWEX 50WX4 100-200 Na型，约50％；c)DCC，pNO2PhOH，DCM，室温，过夜，约65％。
在本发明的另一个实施方案中，彻底酰化条件可用于实现在20位处的叔醇酰化，并且形成全酰化氧固醇-双膦酸盐缀合物。OXY133-ALN缀合物的彻底酰化产生在3、6和20位处具有以相同或不同R基团达成的酰化的OXY133-ALN缀合物。以下是以相同R基团使OXY133彻底酰化的3个实例：
在本发明的另一个实施方案中，已合成OXY133-ALN缀合物。以下提供OXY133-ALN缀合物的实例和它们的合成。OXY133和OXY133-ALN缀合物(OXY166、OXY167、OXY174、OXY175、OXY176、OXY177和OXY178)的结构的概述提供于图5中。以下提供合成特定OXY133-ALN缀合物的实施例。
实施例1：合成Oxy166和中间体
OXY166具有连接于OXY133的3和6位的琥珀酸酯接头单元。OXY166可直接由OXY133合成，而不需要保护基操作。
将Oxy133(236mg，5.61x10-4mol，1当量)与DMAP，4-二甲基氨基吡啶(6.8mg，5.61x10-5mol，0.1当量)和三乙胺(566mg，5.61x10-3mol，10当量)一起溶解于5mL二氯甲烷中。添加固体形式的琥珀酸酐(449mg，8.42x10-4，8当量)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。在早晨，于1NHCl水溶液中稀释溶液并用二氯甲烷提取。合并的二氯甲烷部分用水洗涤一次，接着用Na2SO4干燥并浓缩以产生粗品8。向粗品8中添加N,N’-二环己基碳二亚胺DCC(208mg，1.0x10-3mol，1.8当量)和N-羟基丁二酰亚胺(101mg，1.0x10-3mol，1.8当量)，接着将其溶解于2.5mL二氯甲烷中并剧烈搅拌过夜。在早晨，过滤反应混合物，通过旋转蒸发浓缩，用EtOAc带出，再次过滤，接着通过SiO2色谱法(70％EtOAc:C6)纯化以提供261mg(57％(经2步))21。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ4.73(m,2H),2.93-2.87(m,4H),2.83(s,8H),2.80-2.70(m,4H),2.06-1.98(m,2H),1.90-1.85(m,1H),1.77-1.68(m,2H),1.66-1.62(m,1H),1.60-1.54(m,1H),1.53-1.47(m,3H),1.46-1.35(m,3H),1.34-1.18(m,13H),1.15-0.98(m,4H),0.96-0.90(m,1H),0.89-0.85(m,6H),0.82(s,3H),0.68(m,1H)ppm。
将中间体21(45mg，5.49x10-5mol，1当量)溶解于0.3mL无水DMF中，向其中添加由阿伦膦酸制备的阿仑膦酸三-四丁铵盐(27mg，1.10x10-4mol，2当量)于0.3mL无水DMF中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，接着浓缩。通过重复添加和移除甲苯来以旋转蒸发移除过量DMF。将该粗制混合物溶解于水中，并且上样于2g C-18固相提取柱体上。柱体最初用水/MeOH混合物洗脱，所述混合物从0％MeOH逐渐增加至50％MeOH。合并具有所需化合物的级分，浓缩，接着使用Dowex 50WX4 100-200树脂交换成钠盐。通过冻干来移除水以产生30mg(约45％)呈钠盐形式的Oxy166。1H-NMR关键共振(500MHz,D2O):64.54(bs,2H),3.07(t,6.2Hz,4H),2.51(m,4H),2.42(m,4H),1.94-0.64(宽峰)ppm。HRMS：C43H77N2O21P4的[M-2H]2-计算值：540.1951；实测值：540.1576m/z。
实施例2：合成Oxy167和中间体
OXY167具有连接于OXY133的6位的琥珀酸酯接头单元。该连接可通过使Oxy133偶联于琥珀酸酐来实现以产生中间体13。活化酯在水性介质中偶联于阿伦膦酸可产生化合物OXY167。
将中间体6(300mg，5.61x10-4mol，1当量)与4-二甲基氨基吡啶DMAP(6.8mg，5.61x10-5mol，0.1当量)和三乙胺(283mg，2.24x10-3mol，5当量)一起溶解于5mL二氯甲烷中。添加固体形式的琥珀酸酐(84mg，8.42x10-4，1.5当量)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。在早晨，于1N HCl水溶液中稀释溶液并用二氯甲烷提取。合并的二氯甲烷部分用水洗涤一次，接着用Na2SO4干燥并浓缩以产生365mg粗品12。将粗品12溶解于2mL DCM:MeOH的1:1混合物中，向其中添加固体形式的对甲苯磺酸单水合物(11mg，5.61x10-5mol，0.1当量)，并且在室温下搅拌反应30分钟。添加20mL饱和NaCO3H水溶液，接着用乙酸乙酯提取。合并的有机级分经Na2SO4干燥，浓缩以产生粗品13，其不经进一步纯化即使用。向粗品13中添加N,N’-二环己基碳二亚胺DCC(208mg，1.0x10-3mol，1.8当量)和N-羟基丁二酰亚胺(101mg，1.0x10- 3mol，1.8当量)，接着将其溶解于2.5mL二氯甲烷中并剧烈搅拌过夜。在早晨，过滤反应混合物，通过旋转蒸发浓缩，溶解于EtOAc中，再次过滤，接着通过SiO2色谱法(70％EtOAc:C6)纯化以提供98mg(28％(经3步))22。1H-NMR(400MHz,CDC13):δ(关键共振):4.69(ddd,10.8Hz,10.8Hz,4.8Hz,1H),3.52(dddd,10.8Hz,10.8Hz,4.8Hz,4.8Hz,1H),2.61(m,2H),2.60(2,4H),2.56(m,2H)ppm。
将中间体22(50mg，8.09x10-5mol，1当量)溶解于0.3mL无水DMF中，向其中添加由阿伦膦酸制备的阿仑膦酸三-四丁铵盐(20mg，8.09x10-5mol，1当量)于0.3mL无水DMF中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，接着浓缩。通过重复添加和移除甲苯来以旋转蒸发移除过量DMF。将该粗制混合物溶解于水中，并且上样于2g C-18固相提取柱体上。柱体最初用水/MeOH混合物洗脱，所述混合物从0％MeOH逐渐增加至50％MeOH。合并具有所需化合物的级分，浓缩，接着使用Dowex 50WX4 100-200树脂交换成钠盐。通过冻干来移除水以产生33mg(约50％)呈钠盐形式的Oxy167。1H-NMR关键共振(500MHz,D2O):δ4.60(bs,与HDO重叠),3.41(bs,1H),3.08(bs,2H),2.59-2.35(m,4H),2.01-0.56(宽峰)ppm。HRMS：C35H62NO12P2的[M-H]-计算值：750.3753；实测值：750.3149m/z。
实施例3：合成Oxy174和中间体
OXY174具有连接于OXY133的3位的琥珀酸酯接头单元。通过使OXY133与琥珀酸酐反应以产生中间体10来合成OXY174，所述中间体在与阿仑膦酸四正丁铵盐反应之前被活化成N-羟基丁二酰亚胺酯23。
向OXY133(80mg，1.9x10-4mol，1当量)于2mL二氯甲烷中的溶液中添加三乙胺(0.08mL)、DMAP(约1mg，0.05当量)和琥珀酸酐(20mg，1.9x10-4mol，1当量)。在室温下搅拌混合物6小时，此后添加第二份琥珀酸酐(20mg，1当量)。在室温下18小时之后，用饱和NaHCO3溶液(20mL)和二氯甲烷(10mL)稀释反应混合物。分离各层，并且用二氯甲烷(3x10mL)提取水层。合并的有机层用0.5M HCl溶液和水洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发溶剂。粗产物通过硅胶色谱法(EtOAc，接着含10％MeOH的EtOAc)纯化以提供富含回收的起始物质的级分、富含所需9(40mg，38％)的级分和混合级分。1H-NMR(CDCl3,300MHZ)δ:4.71(1H,dddd,J＝11.2,11.2,4.4,4.4Hz),3.36(1H,ddd,J＝10.8,10.8,4.4Hz),2.65(4H,m),2.19(1H,m),2.10-1.90(3H,m),1.85-1.60(7H,m),1.55-1.38(7H,m),1.25(11H,brs),1.20-0.95(4H,m),0.90(3H,m),0.86(3H,s),0.80(3H,s)0.62(2H,m)ppm。
向粗品9(520mg，1.0x10-3mol.,1当量)于二氯甲烷(6mL)和N-羟基丁二酰亚胺(230mg，2.0x10-3mol，2当量)中的溶液中一次性添加固体N,N’-二环己基碳二亚胺DCC(412mg，2.0x10-3mol，2当量)。在室温下搅拌混合物6小时，此后通过蒸发来移除溶剂。将混合物再混悬于EtOAc(20mL)中并过滤。通过硅胶色谱法(己烷，EtOAc，梯度)纯化提供所需产物23(最小极性级分，240mg，38％)、异构产物(中等极性级分，90mg，14％)和Oxy133回收物(极性级分，150mg，35％)。1H-NMR(CDC13,300MHz)δ:4.71(1H,dddd,J＝11.2,11.2,4.4,4.4Hz),3.40(1H,ddd,J＝10.8,10.8,4.4Hz),3.92(2H,m),2.79(4H,s),2.62(2H,m),2.19(1H,m),2.10-1.90(3H,m),1.85-1.60(7H,m),1.55-1.38(7H,m),1.25(11H,brs),1.20-0.95(4H,m),0.90(3H,m),0.86(3H,s),0.80(3H,s)0.62(2H,m)ppm。
按照用于合成Oxy167的程序由23(110mg，1.8x10-4mol，1当量)合成Oxy 174以在冻干之后提供35mg(24％)Oxy174。HRMS：C35H62NO12P2的[M-H]-计算值：750.3753；实测值：750.3741m/z。
由于ALN和诸如23的活化酯中间体具有不相容的溶解度特征，所以形成阿伦膦酸的四丁铵盐是使用DMF实现成功偶联反应所必需的。使极具极性的双膦酸根部分附接于Oxy133是非常大的合成挑战，因为所得缀合物不溶于有机溶剂中，不能通过传统正相色谱法纯化，并且具有表面活性剂样性质。利用ALN盐形式，并且使用反相固相提取(SPE)柱体进行纯化从而允许以50-100mg规模达成适宜制备。使用四丁铵盐极大增强最终缀合物在SPE柱体上的保留。尽管钠盐基本上没有保留，但四丁铵盐只有用含大量甲醇的流动相方可洗脱。最后，用Dowex阳离子交换树脂将剩余四丁铵盐交换成钠盐以提供适于生物测试的OXY174。
实施例4：合成Oxy175和中间体
OXY175具有连接于OXY133的6位的氨基甲酸酯接头单元。由于与膦酸官能基的竞争性副反应，所以不可能与ALN直接形成酰胺键。因此，通过分离的活化酯形成ALN缀合物，所述活化酯在单独步骤中在碱性条件下偶联于ALN。
OXY175的合成以6开始，其中使6(315mg，5.89x10-4mol，1当量)与三光气(58mg，1.96x10-4mol，1/3当量)组合于3mL无水THF中并在室温下搅拌。通过注射器来立刻添加吡啶(232mg，2.9x10-3，5当量)，并且在室温下搅拌反应混合物15分钟。将甘氨酸甲酯盐酸盐(151mg，1.20x10-4mol，2当量)溶解于1M NaOH水溶液中，将其用二氯甲烷提取，经Na2SO4干燥并通过旋转蒸发浓缩。将所得游离胺溶解于1mL无水THF中，并且通过注射器添加至反应混合物中。在1小时之后，反应用1M HCl水溶液淬灭，用乙酸乙酯提取，用Na2SO4干燥，浓缩并通过SiO2色谱法(20％EtOAc:C6)纯化以提供194(51％)mg呈白色泡沫状的14。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ5.12(dd,～5.2Hz,～5.5Hz,1H),4.53(ddd,10.8Hz,10.8Hz,4.5Hz,1H),3.98(dd,18.5Hz,5.5Hz,11-1),3.92(dd,18.5Hz,5.2Hz,1H),3.74(s,3H),3.48(dddd,10.3Hz,10.3Hz,4.8Hz,4.8Hz,1H),2.03(m,2H),1.79-1.56(m,6H),1.53-1.37(m,5H),1.36-1.07(m,18H),1.05-0.93(m,3H),0.91-0.86(m,3H),0.86(s,9H),0.83(s,3H),0.80(s,3H),0.62(m,1H),0.26(s,6H)ppm。
将中间体14(194mg，2.98x10-4mol，1当量)溶解于3mL MeOH中，并且添加固体形式的对甲苯磺酸单水合物(5.6mg，2.98x10-5mol，0.1当量)并在室温下搅拌混合物30分钟。添加20mL饱和NaCO3H水溶液，接着用乙酸乙酯提取。合并的有机级分经Na2SO4干燥，浓缩以产生158mg呈白色泡沫状的15，其不经进一步纯化即使用。将15(64mg，1.19x10-4mol，1当量)溶解于2mL 9:1 MeOH:H2O溶液中，向其中添加固体形式的K2CO3(66mg，4.76x10-4，4当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，用1N HCl水溶液淬灭并提取至EtOAc中，将其经Na2SO4干燥，浓缩以产生60mg粗品16，其不经进一步纯化即使用。在圆底烧瓶中向16(60mg，1.15x10-4mol)中添加固体N,N’-二环己基碳二亚胺DCC(27mg，1.31x10-4mol，1.1当量)，向其中立刻添加对硝基苯酚(22mg，1.55x10-4mol，1.3当量)于2mL DCM中的溶液，并且将混合物在室温下搅拌过夜。过滤反应混合物，浓缩，溶解于EtOAc中，接着再次过滤。在浓缩后，残余物通过SiO2色谱法(50％EtOAc:C6)纯化以产生46mg(62％(经3步))呈无色油状的25。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ8.25(d,9.1Hz,2H),7.30(d,9.1Hz,2H),5.40(t,5.7Hz,1H),4.58(m,1H),4.21(d,5.7Hz,2H),3.49(m,1H),2.06-1.99(m,2H),1.98-1.84(m,3H),1.81-1.75(m,2H),1.72-1.67(m,2H),1.64-1.45(m,4H),1.44-1.34(m,3H),1.33-1.17(m,17H),1.15-1.06(m,2H),1.06-0.96(m,2H),0.93-0.88(m,1H),0.87-0.82(m,6H),0.80(s,3H),0.62(m,1H)ppm。
也就是说，添加氨基甲酸酯接头以及将C-3醇脱保护产生中间体15。使中间体15皂化，并且用对硝基苯酚活化以提供储存稳定的活化酯25，其在与阿仑膦酸四正丁铵盐反应后对NH-羰基给与ALN酰胺α(Oxy175)。
将中间体25(43mg，6.7x10-5mol，1当量)溶解于0.3mL无水DMF中，向其中添加由阿伦膦酸制备的阿仑膦酸三-四丁铵盐(17mg，6.7x10-5mol，1当量)于0.3mL无水DMF中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，接着浓缩。通过重复添加和移除甲苯来以旋转蒸发移除过量DMF。将该粗制混合物溶解于水中，并且上样于2g C-18固相提取柱体上。柱体最初用水MeOH混合物洗脱，所述混合物从0％MeOH逐渐增加至50％MeOH。合并具有所需化合物的级分，浓缩，接着使用Dowex 50WX4 100-200树脂交换成钠盐。通过冻干来移除水以产生25mg(约44％)呈钠盐形式的Oxy175。1H-NMR关键共振(500MHz,D2O):δ4.46(bs,1H),3.77(bs,1H),3.63(bs,1H),3.41(bs,1H),3.12(bs,2H),2.24-0.13(宽峰)ppm。HRMS：C34H61NO12P2的[M-H]-计算值：751.3705；实测值：751.3367m/z。
实施例5：合成Oxy176和中间体
OXY176具有连接于OXY133的3和6位的氨基甲酸酯接头单元。OXY176可直接由OXY133合成。
在室温下搅拌含Oxy133(300mg，7.14x10-4mol，1当量)和三光气(141mg，4.76x10- 4mol，2/3当量)的4mL无水THF。通过注射器来立刻添加吡啶(232mg，2.9x10-3，5当量)，并且搅拌反应混合物15分钟。将甘氨酸甲酯盐酸盐(269mg，2.14x10-3mol，3当量)溶解于1M NaOH水溶液中，将其用二氯甲烷提取，经Na2SO4干燥并通过旋转蒸发浓缩。将所得游离胺溶解于1mL无水THF中，并且通过注射器添加至反应混合物中。在1小时之后，反应用1M HCl水溶液淬灭，用乙酸乙酯提取，用Na2SO4干燥，浓缩并通过SiO2色谱法(50％EtOAc:C6)纯化以提供130mg(约28％)呈油状的10，其含有一些单官能化化合物并且不经进一步纯化即使用。将10(约130mg，2.0x10-4mol，1当量)溶解于2mL MeOH:H2O(9:1)中，向其中添加固体形式的K2CO3(165mg，1.2x10-4，6当量)。将混合物在室温下搅拌过夜，用1N HCl水溶液淬灭，用乙酸乙酯提取，经Na2SO4干燥并浓缩以产生粗品11。在圆底烧瓶中使11(约100mg，1.60x104mol，1当量)与固体N,N’-二环己基碳二亚胺DCC(73mg，3.53x10-4mol，2.2当量)合并。向该混合物中添加对硝基苯酚(56mg，4.0x10-4mol，2.5当量)于2mL无水DCM中的溶液，将其在室温下剧烈搅拌过夜。在早晨，过滤混合物，通过旋转蒸发来移除DCM，将混合物混悬于EtOAc中，过滤，浓缩并通过SiO2色谱法纯化以产生30mg(约18％)所需26。1H-NMR(500MHz,CDC13):δ8.24(d,9.2Hz,4H),7.30(d,9.2Hz,4H),5.31(m,1H),5.22(m,1H),4.59(m,2H),4.20(m,4H),2.06-1.98(m,2H),1.90-1.85(m,1H),1.77-1.68(m,2H),1.66-1.62(m,1H),1.60-1.54(m,1H),1.53-1.47(m,3H),1.46-1.35(m,3H),1.34-1.18(m,13H),1.15-0.98(m,4H),0.96-0.90(m,1H),0.89-0.85(m,6H),0.82(s,3H),0.68(m,1H)ppm。
类似于Oxy166，由23制备Oxy176。1H-NMR关键共振(500MHz,D2O):δ4.40(bs,2H),3.70(m,4H),3.12(m,4H),2.01-0.55(宽峰)ppm。HRMS：C41H75N4O21P2的[M-H]-计算值：1083.3380；实测值：1083.3754m/z。
实施例6：合成Oxy177和中间体
OXY177具有连接于OXY133的3位的氨基甲酸酯接头单元。在使C6-羟基酰化之后移除TBS以产生中间体18。接着用甘氨酸甲酯形成氨基甲酸酯以产生19，使其皂化并活化成对硝基苯酚酯24。24在与阿仑膦酸四正丁铵盐反应后提供Oxy177。
将中间体6(330mg，6.17x10-4mol，1当量)溶解于0.6mL无水吡啶中，向其中添加乙酸酐(88mg，8.64x10-4mol，1.4当量)并将混合物在室温下搅拌过夜。反应于1N HCl水溶液中稀释，用乙醚和己烷的50:50混合物提取，经Na2SO4干燥，通过旋转蒸发浓缩并通过SiO2色谱法纯化以提供206mg(58％)17。将17(206mg，3.57x10-4mol，1当量)溶解于2mL 1:1 MeOH:DCM中，并且添加固体形式的对甲苯磺酸单水合物(7mg，3.57x10-5mol，0.1当量)并在室温下搅拌混合物30分钟。添加20mL饱和NaCO3H水溶液，接着用乙酸乙酯提取。合并的有机级分经Na2SO4干燥，浓缩并通过SiO2(50％EtOAc:C6)纯化以产生102mg(62％)呈白色泡沫状的18。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ4.66(ddd,10.8Hz,10.8Hz,4.3Hz,1H),3.53(m,1H),2.05(m,1H),2.02(s,3H),2.01(m,1H),1,86(m,1H),1.80(m,1H),
1.71(m,2H),1.67-1.60(m,1H),1.59-1.47(m,4H),1.46-1.35(m,3H),1.34-1.19(m,14H),1.18-1.08(m,4H),1.06-0.97(m,2H),0.92-0.84(m,6H),0.82(s,3H),0.66(m,1H)ppm。
按照用于合成15的程序，由18制备中间体19。1H-NMR(500MHz,CDC13):δ5.08(t,5.314z,1H),4.66(ddd,10.7Hz,10.7Hz,4.7Hz,1H),4.56(m,1H),3.96(d,5.5Hz,1H),3.75(s,3H),2.06(m,1H),2.02(s,3H),1.97(m,1H),1.87(m,2H),1.72(m,2H),1.64(m,1H),1.60(s,1H),1.56(m,1H),1.50(m,2H),1.46-1.40(m,2H),1.32-1.21(m,15H),1.67-0.99(m,5H),0.93-0.85(m,7H),0.82(s,3H),0.68(m,1H)ppm。
将中间体19(37mg，6.4x10-5mol，1当量)溶解于1mL MeOH:H2O(1:1)中并添加35mg固体K2CO3，并且将混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物于1N HCl水溶液中稀释，接着用EtOAc提取，干燥并浓缩以产生粗制20，其不经进一步纯化即使用。根据用于合成24的程序，由22合成24以产生23mg(53％，2步)。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ8.27(d,9.1Hz,2H),7.31(d,9.1Hz,2H),5.23(t,5.7Hz,1H),4.60(dddd,10.9Hz,10.9Hz,4.6Hz,4.6Hz,1H),4.23(d,5.7Hz,2H),3.39(ddd,10.8Hz,10.8Hz,4.5Hz,1H),2.26(m,1H),2.05(m,1II),1.99(m,1H),1.88(m,1H),1.74-1.67(m,3H),1.65-1.59(m,2H),1.53-1.41(m,5H),1.34-1.22(m,14H),1.17(m,2H),1.11-1.01(m,4H),0.89-0.84(m,8H),0.67(m,1H)ppm。
按照对于合成Oxy174所述的程序，由24制备Oxy177。1H-NMR关键共振(500MHz,D2O):δ4.43(bs,1H),3.80(m,1H),3.67(m,IH),3.37(bs,1H),3.12(bs,2H),2.11-0.40(宽峰)ppm。HRMS：C34H61NO12P2的[M-H]-计算值：751.3705；实测值：751.3665m/z。
实施例7：合成Oxy178
OXY178在OXY133与阿伦膦酸之间在OXY133的3和6位处具有直接氨基甲酸酯连接。OXY178可直接由OXY133合成，而不需要保护基操作。
向Oxy133(520mg，1.2x10-3mol，1当量)于无水THF(6mL)中的溶液中一次性添加羰基二咪唑(1.4g，8.4x10-3mol，7当量)。在室温下16小时之后，混合物用水(20mL)和EtOAc(20mL)稀释。在分离有机层之后，水层用EtOAc(2x20mL)反提取。合并的有机层用盐水洗涤并经Na2SO4干燥。粗品27(其含有残余咪唑)不经进一步纯化即使用。1H-NMR(CDCl3,300MHZ)δ:8.12,8.01(2H,s),7.4,7.38(2H,s),7.06,7.04,(2H,s),4.81(2H,m),2.19(1H,m),2.10-1.90(3H,m),1.85-1.60(7H,m),1.55-1.38(7H,m),1.25(11H,brs),1.20-0.95(4H,m),0.90(3H,m),0.86(3H,s),0.80(3H,s)0.62(2H,m)ppm。
根据用于合成Oxy166的程序，由粗品27(0.24g，约0.4mmol)合成Oxy178以在冻干之后提供65mg(15％)Oxy178。1H-NMR关键共振(D2O,300MHz)δ:4.41(2H,m),3.00(4H,m),2.10-0.62(宽峰)。HRMS：C37H69N2O12P2的[M-H]-计算值：969.3450；实测值：969.3100m/z。
可制备以下显示的Oxy178单氨基甲酸酯类似物。
本发明不限于本说明书中提供的实施例。例如，在一个实施方案中，OXY133-ALN缀合物可在OXY133的20位处缀合。本领域普通技术人员将了解OXY133-ALN缀合物可包含不同接头单元。
本文所述的化合物可具有一个或多个带电荷原子。例如，化合物可为两性离子，但总体可为中性。视pH和其它因素而定，其它实施方案可具有一个或多个带电荷基团。在这些实施方案中，化合物可与适合反离子缔合。如何制备盐或交换反离子是本领域所熟知的。通常，所述盐可通过以下方式制备：使这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当碱(诸如Na、Ca、Mg或K氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或使这些化合物的游离碱形式与化学计算量的适当酸反应。所述反应通常在水中，或在有机溶剂中，或在两者的混合物中进行。可例如通过诸如离子交换色谱法的离子交换技术来改变反离子。除非明确指示反离子或盐，否则意指所有两性离子、盐和反离子。在某些实施方案中，盐或反离子可在药学上可为向受试者施用所接受。
在化学结构的某些表现形式中，显示化合物的完全质子化形式。除非另外明确指示，应了解该化合物也可为化合物的盐形式。在化学结构的某些表现形式中，显示化合物的盐形式。除非另外明确指示，应了解该化合物也可为具有不同质子化程度的那个盐形式，也可为不同盐形式，或可为化合物的完全质子化形式。
在另一个实施方案中，这些氧固醇和氧固醇-双膦酸盐缀合物可为药物组合物的一部分，所述药物组合物可用作用于治疗骨质疏松的治疗剂。
实施例8：OXY133-ALN缀合物的生物活性
在M2-10B4骨祖细胞中测试Oxy133-ALN缀合物以确定成骨活性，并且确认它们在诱导成骨性分化方面的作用机理。通过我们先前报道的方案来测定碱性磷酸酶(ALP)活性、对成骨性分化标志物基因(ALP；骨唾液蛋白(BSP)；和osterix(OSX))表达的诱导以及作为细胞外基质矿物化的量度的45Ca并入。本发明者已显示这些体外测定意味着在多种动物模型中体内刺激骨形成。在处理6和14天之后测量由OXY133-ALN缀合物诱导的ALP、BSP和OSX基因表达，6天之后的结果显示于图1中。
分组测定琥珀酸酯连接的系列(Oxy166、Oxy167、Oxy174)和氨基甲酸酯系列(Oxy175、Oxy176和Oxy177)。当相较于对照未处理细胞时，OXY133-ALN缀合物通常诱导成骨性基因表达，并且程度小于未缀合OXY133。可能是OXY133必须从OXY133-ALN缀合物释放以诱导成骨性基因表达。OXY133-ALN化合物在这些体外实验中根据接头对酯酶裂解的预期易感性显示不同活性水平，从而指示基于接头的位置和身份的“调谐能力”。在两个系列中，单C-6官能化化合物最具活性(Oxy167、Oxy175)，并且与对酶促水解的相对稳定性一致，琥珀酸酯连接的系列(Oxy167)比氨基甲酸酯连接的系列(Oxy175)更具活性。该结果反映在ALP活性诱导实验方面。用4μM特异性Hh路径抑制剂环巴胺(cyclopamine)预处理细胞抑制由所有氧固醇对成骨性基因的诱导，从而指示Hh路径在介导它们的成骨性效应方面具有作用，并且类似于已对于未缀合OXY133和其它成骨性氧固醇所观察。用类似物和未缀合OXY133历经30天孵育时期以M2细胞进行定量45Ca矿物化测定，如图2中所示。因此，所有化合物都导致显著水平的矿物化，从而表明由氧固醇诱导来经受成骨性分化的长期细胞功能性可被正面影响。结果证明活性程度视Oxy133-ALN缀合物的结构而不同，并且所有化合物都与大量矿物化相关联。
实施例9：考查OXY133-ALN缀合物的羟磷灰石(HAP)结合能力
双膦酸盐的骨结合性质是由于它们对羟磷灰石(HAP)中的钙的亲和力。可通过使分析物的溶液与HAP一起孵育，以及测量上清液中剩余的化合物的比例来测量相对HAP结合能力。该HAP结合测定关于已知在临床上展现亲合骨连接的双膦酸盐是有效的，并且意味着多种其它化合物的体内骨沉积。如图3中所示，进行与这些研究类似，但适合于Oxy133-ALN缀合物的独特性质的体外HAP结合测定。因为ALN和Oxy133-ALN缀合物是UV/Vis非活性的，显现宽1H-NMR共振，并且难以用质谱分析检测，所以基于31P-NMR的方法用于测量未结合于HAP的分析物的分数。该方法是有利的，因为样品可被直接分析而不衍生化或进行过度操作，并且可相对于未暴露于测定条件的外部标准品加以可靠积分。可通过使用反转门控去偶脉冲序列和足够长久的弛豫延迟(d1)来获得对一定范围的分析物的可靠定量。
在以下条件下进行HAP结合测定：通过倒置来使1mL含4mM分析物的50mM tris缓冲液(在pH 7.5下)与HAP(或无HAP(用于对照))一起孵育15分钟。通过温和离心使HAP沉淀，并且直接添加上清液至含有积分标准品和D2O的NMR管中。使用反转门控去偶脉冲序列，以30度脉冲角和30秒弛豫延迟(两倍弛豫时间不影响相对积分面积)在122MHz下获取31P-NMR。程序说明于图3A中。如图3B中所示，31P-NMR波谱显示对照(A)和HAP处理的阿仑膦酸盐样品(B)，其相对于保持恒定的内部标准品加以积分。
测定本发明的OXY133-ALN缀合物相对于ALN的结合强度，并且记录由Oxy133-ALN缀合物的程度(单ALN连接的缀合物对双ALN连接的缀合物)、位置(C3-OH对C6-OH)和性质(琥珀酸酯对甘氨酸酯)造成的任何结合亲和力差异。ALN用作阳性对照，而苯甲基膦酸(BnP)作为确立的阴性对照。600mg HAP用于“大量HAP上样”条件(图4A)，并且150mg HAP用于“低量HAP上样”条件(图4B)。
实验条件：通过倒置来使1mL含4mM分析物的50mM tris缓冲液(pH 7.5)与指定量的HAP(或无HAP(用于对照))一起孵育15分钟。通过温和离心使HAP沉淀，并且直接添加上清液至含有积分标准品和D2O的NMR管中。使用反转门控去偶脉冲序列，以30度脉冲角、30秒弛豫延迟(两倍弛豫时间不影响相对积分面积)在122MHz下获取31P-NMR。31P-NMR波谱(图3B)显示对照(A–蓝色波谱)和HAP处理的阿仑膦酸盐样品(B–红色波谱)，其相对于保持恒定的内部标准品加以积分。
相对于对照测定Oxy166，并且其相对于ALN展现更强力HAP结合(图4A)。未结合的Oxy166接近检测水平，所以用较低HAP上样量考查各种Oxy133-ALN缀合物(图4B)。因为由氨基甲酸酯系列的可能互变异构形式所致的31P信号增宽，开发1H-NMR方法。在具有内部积分标准品(顺丁烯二酸)的D2O中进行HAP结合测定对ALN给出用31P方法获得的相同值，并且揭示Oxy177与OXY-ALN系列中的其余各物具有相等结合亲和力(图4C)。所有Oxy133-ALN缀合物都比单独ALN具有更大HAP结合能力。增加邻近于寻骨部分(bone-seeking moiety)的亲脂性似乎改进体外HAP结合。ALN缀合的性质和程度似乎不影响HAP结合。短接头用于Oxy133-ALN缀合物中，以使此符合其中与HAP表面的结合发生在受限“活性扭结位点”处的模型。在诸如连接的区域化学性或接头的类型的结构方面的相对微小变化不影响观察到的结合与ALN高度强力结合HAP一致。因此，根据Oxy133-ALN缀合物的HAP结合亲和力的测量结果，观察到不依赖于阿仑膦酸盐连接程度、位点或性质的强烈HAP结合。这可与Oxy133-ALN缀合物体内沉积在骨中相关联。基于它们的在Oxy133-ALN缀合物之间类似的HAP结合亲和力，Oxy133-ALN缀合物应展现强烈骨亲和力，并且有希望用于治疗。
药物组合物和施用
本发明的实施方案的化合物适用作用如本文定义的治疗有效量的本发明化合物以及药学上可接受的载体或稀释剂制备的药物组合物。
本发明化合物可被配制成药物组合物，并且以适合于所选施用途径的多种形式向需要治疗的受试者(例如哺乳动物，诸如人患者)施用，所述施用途径例如口服、经鼻、腹膜内或胃肠外、通过静脉内、肌肉内、局部或皮下途径、或通过向组织中注射。
因此，本发明化合物可与药学上可接受的媒介物(诸如惰性稀释剂或可吸收可食用载体)组合来全身施用(例如口服施用)，或通过吸入或吹入施用。它们可封闭在硬质或软质外壳明胶胶囊中，可压制成片剂，或可直接与患者的膳食的食物合并。对于口服治疗性施用，化合物可与一种或多种赋形剂组合，并且以可摄取片剂、经颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。化合物可与精细惰性粉状载体组合，并且由受试者吸入或加以吹入。所述组合物和制剂应含有至少0.1％的本发明的一个实施方案的化合物。组合物和制剂的百分比当然可变化，并且可宜在给定单位剂型的重量的约2％至约60％之间。化合物在所述治疗适用组合物中的量是如此以致将获得有效剂量水平。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有以下各物：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；以及甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜(aspartame)或调味剂，诸如胡椒薄荷、冬青油，或可添加樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除以上类型的物质之外，它也可含有液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可作为包衣存在或可存在以另外改进固体单位剂型的实物形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、虫胶或糖等包覆。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂，诸如樱桃或橙调味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何物质都应为药学上可接受的，并且在所用量下大致上无毒。此外，化合物可并入持续释放制剂和装置中。例如，化合物可并入定时释放胶囊、定时释放片剂、定时释放丸剂和定时释放聚合物或纳米粒子中。
化合物也可通过输注或注射加以静脉内或腹膜内施用。可于水中制备化合物的溶液，任选与无毒表面活性剂混合。也可于甘油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中以及于油中制备分散液。在一般储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。
适于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散液或包含适合于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液，任选囊封在脂质体中的化合物的无菌粉剂。在所有情况下，最终剂型在制造和储存条件下都应是无菌、流动以及稳定的。液体载体或媒介物可为溶剂或液体分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适合的混合物。适当流动性可例如通过形成脂质体、在分散液的情况下通过维持所需粒度或通过使用表面活性剂加以维持。防止微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等)来达成。在许多情况下，将为优选的是包括等张剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来达成。
通过将化合物以所需量在必要时与以上列举的各种其它成分一起并入适当溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分外加存在于先前无菌过滤溶液中的任何额外所需成分的粉剂。
对于局部施用，化合物可以纯净形式施加。然而，可能合乎需要的是与皮肤病学上可接受的可为固体或液体的载体组合，以组合物或制剂形式向皮肤施用它们。
适用固体载体包括精细分散固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。其它固体载体包括无毒聚合纳米粒子或微粒。适用液体载体包括化合物可任选借助于无毒表面活性剂在有效水平下溶解或分散于其中的水、醇或二醇或水/醇/二醇掺合物。可添加诸如芳香剂和额外抗微生物剂的佐剂以使用于给定用途的性质最优化。所得液体组合物可从吸收垫施加，用于浸渍绷带和其它敷料，或使用泵型喷雾器或气雾剂喷雾器喷雾于受影响区域上。
诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物质的增稠剂也可与液体载体一起用于形成用于直接向使用者的皮肤施加的可涂敷糊剂、凝胶剂、软膏剂、皂剂等。
可用于向皮肤递送化合物的适用皮肤学组合物的实例为本领域所知；例如参见Jacquet等(美国专利号4,608,392)、Geria(美国专利号4,992,478)、Smith等(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)，其全部据此以引用的方式并入本文。
可通过比较式I化合物的体外活性和在动物模型中的体内活性来确定它们的适用剂量。用于将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法为本领域所知；例如参见美国专利号4,938,949，其据此以引用的方式并入本文。
例如，化合物在诸如洗剂的液体组合物中的浓度可为约0.1-25重量％或约0.5-10重量％。在诸如凝胶剂或粉剂的半固体或固体组合物中的浓度可为约0.1-5重量％或约0.5-2.5重量％。
为在治疗中使用所需的化合物的量将不仅随所选特定盐而变化，而且也随施用途径、所治疗病状的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且将最终由主治医师或临床医师判断。
本发明的药剂的有效剂量和施用途径是常规的。视例如受试者的物种、年龄、重量和一般或临床状况；所治疗的任何病症的严重性或机理；所用特定试剂或媒介物；施用方法和时程等而定，药剂的精确量(有效剂量)将在受试者与受试者之间变化。可通过为本领域技术人员所知的常规程序凭经验确定治疗有效剂量。参见例如The PharmacologicalBasis of Therapeutics,Goodman和Gilman编,Macmillan Publishing Co.,New York。例如，可最初在细胞培养测定中或在适合动物模型中估计有效剂量。动物模型也可用于确定适当浓度范围和施用途径。所述信息可接着用于确定适用于在人中施用的剂量和途径。治疗剂量也可通过与类似治疗剂的剂量类比来选择。
特定施用模式和剂量方案将由照护临床医师在考虑病例的细目(例如受试者、疾病、涉及的疾病状态以及治疗是否是防治性的)的情况下选择。治疗可涉及历经数天至数月或甚至数年的时期每日或每日多次用化合物给药。
然而，一般来说，适合剂量将在每天每kg体重约0.001至约100mg，例如约0.01至约100mg的范围内，诸如每天每千克接受者体重高于约0.1mg，或在约1至约10mg的范围内。例如，适合剂量可为每天每kg体重约1mg、10mg或50mg。
化合物宜以单位剂型施用；例如每单位剂型含有0.05至10000mg、0.5至10000mg、5至1000mg、或约100mg活性成分。
可施用化合物以实现例如约0.5至约75μM、约1至50μM、约2至约30μM、或约5至约25μM的峰值血浆浓度。示例性合乎需要的血浆浓度包括至少或至多0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100或200μM。例如，血浆水平可为约1至100微体积摩尔浓度或约10至约25微体积摩尔浓度。这可例如通过静脉内注射0.05至5％的化合物任选于盐水中的溶液，或以含有约1-100mg的化合物的大丸剂形式口服施用来实现。可通过连续输注以提供每小时每kg体重约0.00005-5mg，例如至少或至多0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5或5mg/kg/h来维持合乎需要的血液水平。或者，可通过含有每kg体重约0.0002-20mg，例如每kg体重至少或至多0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20或50mg化合物的间断输液来获得所述水平。
化合物可宜以单剂量形式呈现或以在适当间隔下施用的分次剂量形式，例如以每天一次剂量形式，或以每天两次、三次、四次或更多次亚剂量形式呈现。亚剂量自身可进一步例如分成许多次个别宽松间隔施用；诸如从吹入器多次吸入。
本申请中提及、引用或参考的所有文件、参考文献和信息，包括但不限于期刊文章、专利申请和专利都据此以引用的方式整体并入本文，就好像各自已个别地并入本文一样。所述文件包括但不限于美国专利申请公布号2006-0270645A1、2006-0251735A1、2009-0202660A1、2009-0220562A1、2010-0034781A1、2010-0048944A1、2010-0105645A1、2010-0012030A1、2011-0008297A1和2012-0309730A1以及国际申请公布号WO2014/179756、WO2013/169399、WO2013/169397和WO2011/006087。
本说明书中说明和讨论的实施方案仅意图教导本领域技术人员为本发明者所知的用以进行和使用本发明的最佳方式。本说明书中没有事物应被视为限制本发明的范围。呈现的所有实施例都是代表性的和非限制性的。如由本领域技术人员鉴于以上教义所了解，可在不脱离本发明下修改或改变本发明的上述实施方案。因此，应了解在权利要求和它们的等效物的范围内，本发明可不同于如明确描述加以实施。

Claims (51)

1.一种下式化合物：
其中R1、R2和R3独立地选自由以下组成的组：氢、
其中R1、R2和R3中的至少一个不是氢，并且
其中R4是具有1至5个碳的烷基，及
其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的化合物，其具有下式：
其中R1、R2和R3独立地选自由以下组成的组：氢、
及
其药学上可接受的盐。
3.如权利要求2所述的化合物，其具有下式：
其中R选自由以下组成的组：
及
其药学上可接受的盐。
4.如权利要求2所述的化合物，其具有下式：
5.如权利要求4所述的化合物，
其中R1和R2选自由以下组成的组：
及
其药学上可接受的盐。
6.如权利要求2所述的化合物，其具有下式：
其中R选自由以下组成的组：
及
其药学上可接受的盐。
7.如权利要求6所述的化合物，
其中R选自由以下组成的组：
及
其药学上可接受的盐。
8.如权利要求2所述的化合物，其具有下式：
及
其药学上可接受的盐。
9.如权利要求8所述的化合物，
其中R1选自由以下组成的组：
及
其药学上可接受的盐。
10.如权利要求2所述的化合物，其具有下式：
及
其药学上可接受的盐。
11.如权利要求10所述的化合物，
其中R2选自由以下组成的组：
及
其药学上可接受的盐。
12.如权利要求1所述的化合物，其具有下式：
其中R1、R2和R3独立地选自由以下组成的组：氢、
及
其药学上可接受的盐。
13.如权利要求12所述的化合物，其具有下式：
及
其药学上可接受的盐。
14.如权利要求13所述的化合物，其具有下式：
及其药学上可接受的盐。
15.如权利要求14所述的化合物，其中所述化合物是钠盐。
16.如权利要求13所述的化合物，其具有下式：
及其药学上可接受的盐。
17.如权利要求16所述的化合物，其中所述化合物是钠盐。
18.如权利要求13所述的化合物，其具有下式：
及其药学上可接受的盐。
19.如权利要求18所述的化合物，其中所述化合物是钠盐。
20.如权利要求13所述的化合物，其具有下式：
及其药学上可接受的盐。
21.如权利要求20所述的化合物，其中所述化合物是钠盐。
22.如权利要求13所述的化合物，其具有下式：
及其药学上可接受的盐。
23.如权利要求22所述的化合物，其中所述化合物是钠盐。
24.如权利要求13所述的化合物，其具有下式：
及其药学上可接受的盐。
25.如权利要求24所述的化合物，其中所述化合物是钠盐。
26.如权利要求13所述的化合物，其具有下式：
及其药学上可接受的盐。
27.如权利要求26所述的化合物，其中所述化合物是钠盐。
28.如权利要求13所述的化合物，其具有下式：
及其药学上可接受的盐。
29.如权利要求28所述的化合物，其中所述化合物是钠盐。
30.如权利要求13所述的化合物，其具有下式：
及其药学上可接受的盐。
31.如权利要求30所述的化合物，其中所述化合物是钠盐。
32.一种药物组合物，其包含如权利要求1至31中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体或稀释剂。
33.一种用于治疗罹患骨病症的人或动物受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1至31中任一项所述的化合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中施用所述化合物以实现向所述受试者局部递送。
35.如权利要求33所述的方法，其中施用所述化合物以实现向所述受试者全身性递送。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述骨病症选自由骨折、骨质疏松和骨质减少组成的组。
37.一种用于治疗罹患骨病症的人或动物受试者的方法，其包括使成骨祖细胞与有效量的如权利要求1至31中任一项所述的化合物接触。
38.如权利要求37所述的方法，其中使所述成骨祖细胞与所述化合物体外接触。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述骨病症选自由骨折、骨质疏松和骨质减少组成的组。
40.一种用于治疗罹患骨病症的人或动物受试者的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求37所述的接触的成骨祖细胞。
41.如权利要求40所述的方法，其中向所述受试者局部施用所述接触的成骨祖细胞。
42.如权利要求40所述的方法，其中向所述受试者全身施用所述接触的成骨祖细胞。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述骨病症选自由骨折、骨质疏松和骨质减少组成的组。
44.一种用于处理细胞的方法，其包括向所述细胞施用有效量的如权利要求1至31中任一项所述的化合物，以使所述细胞中的Hedgehog信号传导路径被刺激。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述细胞是组织或器官的一部分。
46.如权利要求44所述的方法，其中体内施用所述化合物。
47.一种用于治疗将受益于治疗性活化组织或器官中Hedgehog信号传导路径的人或动物受试者的方法，其包括如权利要求44中所阐述处理所述组织或器官的细胞，以使所述组织或器官的所述Hedgehog信号传导路径被刺激。
48.如权利要求1至31中任一项所述的化合物，其用于治疗骨病症。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述骨病症选自由骨折、骨质疏松和骨质减少组成的组。
50.一种如权利要求1至31中任一项所述的化合物的用途，其用于制造用以治疗骨病症的药剂。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述骨病症选自由骨折、骨质疏松和骨质减少组成的组。
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