DE60017157T2 - Vermittler von igel signalwegen, deren zusammenstellungen und verwendungen - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Musterbildung ist die Aktivität, durch die embryonale Zellen die geordneten räumlichen Anordnungen der differenzierten Gewebe bilden. Die physische Komplexität der höheren Organismen entsteht während der Embryogenese durch das Zusammenspiel von Zellintrinsischer Abstammung und Zell-extrinsischer Signalisierung. Die induktiven Wechselwirkungen sind für die embryonale Musterung bei der Vertebraten-Entwicklung von der frühesten Erstellung des Körperplans über die Musterung der Organsysteme bis zur Generierung der verschiedenen Zelltypen während der Gewebsdifferenzierung essentiell (Davidson, E., (1990) Development 108:365–389; Gurdon, J.B., (1992) Cell 68:185–199; Jessell, T.M. et al., (1992) Cell 68:257–270). Die Auswirkungen der Zellentwicklungswechselwirkungen sind vielfältig. Typischerweise werden die ansprechenden Zellen durch Induktion der Zellen, die sich sowohl vom nicht induzierten als auch induzierten Zustand der ansprechenden Zellen (Induktionen) unterscheiden, von einem Weg der Zelldifferenzierung auf einen anderen umgeleitet. Mitunter veranlassen Zellen ihre Nachbarn zur Differenzierung wie sie selbst (homogenetische Induktion); in anderen Fällen hemmt eine Zelle ihre Nachbarn an der Differenzierung wie sie selbst. Die zellulären Wechselwirkungen während der frühen Entwicklung können sequentiell sein, derart, dass die Initialinduktion zwischen zwei Zelltypen zu einer fortschreitenden Ausweitung der Verschiedenheit führt. Ferner treten die induktiven Wechselwirkungen nicht nur in Embryonen, sondern auch in erwachsenen Zellen auf und können die Wirkung der Erstellung und Aufrechterhaltung von morphogenetischen Mustern sowie der Auslösung einer Differenzierung haben (J.B. Gurdon (1992) Cell 68:185–199).
  • Die Mitglieder der Hedgehog-Familie unter den Signalisierungsmolekülen vermitteln viele wichtige kurz- und langdauernde Musterungsprozesse während der Invertebraten- und Vertebraten-Entwicklung. Bei der Fliege reguliert ein einziges Hedgehog-Gen die Segment- und Imaginalscheibenmusterung. Bei den Vertebraten ist im Gegensatz dazu eine Hedgehog-Genfamilie an der Kontrolle der Links-rechts-Asymmetrie, Polarität im ZNS, Somiten und Extremitäten, Organogenese, Chondrogenese und Spermatogenese beteiligt.
  • Das erste Hedgehog-Gen wurde durch eine Gendurchmusterung in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster identifiziert (Nüsslein-Volhard, C. und Wieschaus, E. (1980) Nature 287, 795–801). Diese Durchmusterung identifizierte eine Anzahl von Mutationen, die die embryonale und larvale Entwicklung beeinflussen. 1992 und 1993 wurde die molekulare Natur des Drosophila-Hedgehog (hh)-Gens beschrieben (C.F., Lee et al. (1992) Cell 71, 33–50), und seit damals wurden mehrere Hedgehog-Homologe aus verschiedenen Vertebraten-Spezies isoliert. Obgleich in Drosophila und in anderen Invertebraten nur ein Hedgehog-Gen gefunden wurde, sind in Vertebraten mehrere Hedgehog-Gene vorhanden.
  • Die Vertebraten-Familie der Hedgehog-Gene umfasst mindestens 4 Mitglieder, z.B. Paraloge des einzigen Drosophila-Hedgehog-Gens. Beispielhafte Hedgehog-Gene und -Proteine sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 95/18856 und WO 96/17924 beschrieben. Drei dieser Mitglieder, die hier als Desert Hedgehog (Dhh), Sonic Hedgehog (Shh) und Indian Hedgehog (Ihh) bezeichnet werden, kommen offenbar in sämtlichen Vertebraten, einschließlich Fischen, Vögeln und Säugern, vor. Ein viertes Mitglied, das hier als Tiggiewinkle Hedgehog (Thh) bezeichnet wird, tritt speziell nur bei Fischen auf. Desert Hedgehog (Dhh) wird hauptsächlich in den Testes exprimiert, sowohl bei der embryonalen Maus-Entwicklung als auch in den erwachsenen Nagern und bei Menschen; Indian Hedgehog (Ihh) ist an der Knochenentwicklung während der Embryogenese und an der Knochenbildung beim Erwachsenen beteiligt; und das vorstehend beschriebene Shh ist hauptsächlich an morphogenetischen und neuroinduktiven Aktivitäten beteiligt. Angesichts der kritischen induktiven Rollen der Hedgehog-Polypeptide bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung der Vertebraten-Organe ist die Identifizierung der Hedgehog-Interaktionsproteine im Hinblick sowohl auf klinische Zusammenhänge als auch auf die Forschung von überragender Bedeutung.
  • Die verschiedenen Hedgehog-Proteine bestehen aus einem Signalpeptid, einer hoch konservierten N-terminalen Region und einer eher divergierenden C-terminalen Domäne. Zusätzlich zu der Signalsequenzspaltung auf dem sekretorischen Weg (Lee, J.J. et al. (1992) Cell 71:33–50; Tabata, T. et al. (1992) Genes Dev. 2635–2645; Chang, D.E. et al. (1994) Development 120:3339–3353) erfahren die Hedgehog-Vorläuferproteine eine interne autoproteolytische Spaltung, die von den konservierten Sequenzen im C-terminalen Teil abhängt (Lee et al. (1994) Science 266:1528–1537; Porter et al. (1995) Nature 374:363-366). Diese Eigenspaltung führt zu einem N-terminalen 19-kD-Peptid und einem C-terminalen Peptid von 26–28 kD (Lee et al. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot, D.A. et al. (1995 ) Mol. Cell. Biol. 15:2294–2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S.C. et al. (1995) Curr. Biol. 5:944–955; Lai, C.J. et al. (1995) Development 121:2349–2360). Das N-terminale Peptid verbleibt in enger Assoziation mit der Oberfläche der Zellen, in denen es synthetisiert wurde, während das C-terminale Peptid sowohl in vitro als auch in vivo frei diffundierbar ist (Porter, et al. (1995) Nature 374:363; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot et al. (1995) supra; Mart', E. et al. (1995) Development 121:2537–2547; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445–455). Interessanterweise ist die Zelloberflächenretention des N-terminalen Peptids von der Eigenspaltung abhängig, da eine Rumpf-Form von HH, die von einer RNA codiert wird, die exakt an der normalen Position der internen Spaltung endet, in vitro (Porter et al. (1995) supra) und in vivo (Porter, J.A. et al. (1996) Cell 86, 21–34) diffundierbar ist. Biochemische Studien haben gezeigt, dass die autoproteolytische Spaltung des HH-Vorläuferproteins über eine interne Thioester-Zwischenstufe abläuft, die anschließend während einer nucleophilen Substitution gespalten wird. Wahrscheinlich ist das Nucleophil ein kleines lipophiles Molekül ist, das kovalent an das C-terminale Ende des N-Peptids gebunden wird (Porter et al. (1996) supra) und das es an der Zelloberfläche festbindet. Die biologischen Folgen sind tiefgreifend. Als Ergebnis des Festbindens wird eine hohe lokale Konzentration an N-terminalem Hedgehog-Peptid auf der Oberfläche der Hedgehog-produzierenden Zellen erzeugt. Genau dieses N-terminale Peptid ist sowohl notwendig als auch hinreichend für die kurz- und langdauernden Hedgehog-Signalisierungsaktivitäten in Drosophila und Vertebraten (Porter et al. (1995) supra; Ekker et al. (1995) supra; Lai et al. (1995) supra; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445–455; Porter et al. (1996) supra; Fietz, M.J. et al. (1995) Curr. Biol. 5:643–651; Fan, C.-M. et al. (1995) Cell 81:457–465; Mart', E., et al. (1995) Nature 375:322–325; Lopez-Martinez et al. (1995) Curr. Biol. 5:791–795; Ekker, S.C. et al. (1995) Develoment 121:2337–2347; Forbes, A.J. et al. (1996) Development 122:1125–1135).
  • HH wurde mit den kurz- und langdauernden Musterungsprozessen an verschiedenen Stellen während der Drosophila-Entwicklung in Zusammenhang gebracht. Bei der Erstellung der Segmentpolarität in den frühen Embryonen besitzt es kurzreichende Auswirkungen, die offenbar direkt vermittelt werden, während es bei der Musterung der Imaginalscheiben über die Induktion von Sekundärsignalen langdauernde Auswirkungen auslöst.
  • In Vertebraten wurden in den letzten 5 Jahren mehrere Hedgehog-Gene cloniert. Von diesen Genen hat Shh den größten Teil der experimentellen Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da es in verschiedenen Organisationszentren exprimiert wird, die der Ursprung von Signalen sind, die bei Nachbargeweben eine Musterung bewirken. Neuere Belege zeigen, dass Shh an diesen Wechselwirkungen beteiligt ist.
  • Die Expression von Shh beginnt kurz nach dem Einsetzen der Gastrulation im präsumptiven Mittellinien-Mesoderm, dem Knoten in der Maus (Chang et al. (1994) supra; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75:1417–1430), der Ratte (Roelink, H. et al. (1994) Cell 76:761–775) und im Huhn (Riddle, R.D. et al. (1993) Cell 75:1401–1416) und im Schild des Zebrafisches (Ekker et al. (1995) supra; Krauss, S. et al. (1993) Cell 75:1431–1444). Bei Hühnerembryonen entwickelt das Shh-Expressionsmuster im Knoten eine Links-rechts-Asymmetrie, die offensichtlich für die Links-Rechts-Lage des Herzens verantwortlich ist (Levin, M. et al. (1995) Cell 82:803–814).
  • Im ZNS löst das Shh aus der Urwirbelsäule und Bodenplatte anscheinend die ventralen Zellschicksale aus. Bei einer ektopischen Expression bewirkt Shh eine Ventralisation der großen Regionen des Mittel- und Hinterhirns in der Maus (Echelard et al. (1993) supra; Goodrich, L.V. et al. (1996) Genes Dev. 10:301–312), Xenopus (Roelink, H. et al. (1994) supra; Ruiz i Altaba, A. et al. (1995) Mol. Cell. Neurosci. 6:106–121) und im Zebrafisch (Ekker et al. (1995) supra; Krauss et al. (1993) supra; Hammerschmidt, M., et al. (1996) Genes Dev. 10:647–658). In Explantaten des intermediären Neuroektoderms auf Rückenmarksniveau induziert das Shh-Protein die Bodenplatten- und Motorneuronen-Entwicklung mit unterschiedlichen Konzentrationsschwellen, die Bodenplatte bei hoher und die Motorneuronen bei niedrigerer Konzentration (Roelink et al. (1995) supra; Mart' et al. (1995) supra; Tanabe, Y. et al. (1995) Curr. Biol. 5:651–658). Außerdem legt eine Antikörperblockierung nahe, dass das von der Urwirbelsäule produzierte Shh zur Urwirbelsäulen-vermittelten Induktion der Motoneuronenschicksale erforderlich ist (Mart' et al. (1995) supra). Somit ist eine hohe Shh-Konzentration auf der Oberfläche der Shh-produzierenden Mittellinienzellen anscheinend der Grund für die in vitro festgestellte kontaktvermittelte Induktion der Bodenplatte (Placzek, M. et al. (1993) Development 117:205–218) und die Mittellinien-Positionierung der Bodenplatte unmittelbar oberhalb der Urwirbelsäule in vivo. Niedrigere Konzentrationen an Shh, die aus der Urwirbelsäule und aus der Bodenplatte freigesetzt werden, induzieren vermutlich die Motorneuronen in den entfernteren ventrolateralen Regionen bei einem Prozess, von dem sich gezeigt hat, dass er in vitro kontaktunabhängig ist (Yamada, T. et al. (1993) Cell 73:673–686). In Explantaten, die auf Mittel- und Vorhirnniveau entnommen wurden, induziert Shh auch die entsprechenden ventrolateralen neuronalen Zelltypen, dopaminerge (Heynes, M. et al. (1995) Neuron 15:35–44; Wang, M.Z. et al. (1995) Nature Med. 1:1184–1188) bzw. cholinerge (Ericson, J. et al. (1995) Cell 81:747–756) Vorläufer, was anzeigt, dass Shh ein gemeinsamer Auslöser der ventralen Spezifizierung über die gesamte Länge des ZNS ist. Diese Beobachtungen werfen die Frage auf, wie die differentielle Reaktion auf Shh an bestimmten anteroposterioren Positionen reguliert wird.
  • Shh aus der Mittellinie bewirkt auch eine Musterung der paraialen Regionen des Vertebraten-Embryos, der Somiten im Rumpf (Fan et al. (1995) supra und des Kopf-Mesenchyms rostral zu den Somiten (Hammerschmidt et al. (1996) supra). In paraxialen Mesodermexplantaten aus Hühnern und Mäusen beschleunigt Shh die Expression der Sklerotom-spezifischen Marker wie Pax1 und Twist auf Kosten des dermamyotomalen Markers Pax3. Ferner legen Filterbarriere-Experimente nahe, dass Shh die Induktion des Sklerotoms direkt statt durch die Aktivierung eines sekundären signalgebenden Mechanismus vermittelt (Fan, C.-M. und Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79, 1175–1186).
  • Shh induziert auch die myotomale Genexpression (Hammerschmidt et al. (1996) supra; Johnson, R.L. et al. (1994) Cell 79:1165–1173; Münsterberg, A.E. et al. (1995) Genes Dev. 9:2911–2922; Weinberg E.S. et al. (1996) Development 122:271–280), obwohl neuere Experimente belegen, dass die Mitglieder der WNT-Familie, Vertebraten-Homologe von Drosophila wingless, zusammen erforderlich sind (Münsterberg et al. (1995) supra). Unbegreiflicherweise erfordert die myotomale Induktion in Hühnern höhere Shh-Konzentrationen als die Induktion der sklerotomalen Marker (Münsterberg et al. (1995) supra), obwohl das Sklerotom den somitischen Zellen entstammt, die viel näher an der Urwirbelsäule liegen. Ähnliche Ergebnisse wurden im Zebrafisch erhalten, wo hohe Hedgehog-Konzentrationen die myotomale Markergen-Expression auslösen und die sklerotomale Markergen-Expression unterdrücken (Hammerschmidt et al. (1996) supra). Im Gegensatz zu Amnioten stehen diese Beobachtungen allerdings mit der Architektur des Fischembryos im Einklang, da hier das Myotom die vorherrschende und axialere Komponente der Somiten ist. Somit könnte die Modulation der Shh-Signalisierung und der Erwerb neuer signalgebender Faktoren die somitische Struktur während der Vertebraten-Evolution modifiziert haben.
  • In den Vertebraten-Extremitätenknospen reguliert eine Unterserie der posterioren Mesenchymzellen, die "Zone der polarisierenden Aktivität" (ZPA), die anteroposteriore Digitus-Identität (Übersicht bei Honig, L.S. (1981) Nature 291:72–73). Die ektopische Expression von Shh oder die Anwendung von in Shh-Peptid eingeweichten Perlen simuliert die Wirkung der anterioren ZPA-Transplantate und erzeugt eine spiegelbildliche Duplikation der Digiti (Chang et al. (1994) supra; Lopez-Martinez et al. (1995) supra; Riddle et al. (1993) supra) (2g). Somit hängt die Digitus-Identität offenbar hauptsächlich von der Shh-Konzentration ab, obwohl es möglich ist, dass andere Signale diese Information über die beträchtlichen Abstände übertragen können, die anscheinend für die AP-Musterung erforderlich sind (100–150 μm). Entsprechend der Interaktion von HH und DPP in den Drosophila-Imaginalscheiben aktiviert Shh in der Vertebraten-Extremitätenknospe die Expression von Bmp2 (Francis, P.H. et al. (1994) Development 120:209–218), einem dpp-Homolog. Allerdings vermag Bmp2 im Gegensatz zu DPP in Drosophila die polarisierende Wirkung von Shh bei ektopischer Anwendung in der Hühner-Extremitätenknospe nicht nachzustellen (Francis et al. (1994) supra). Zusätzlich zu der anteroposterioren Musterung ist Shh anscheinend auch an der Regulierung des proximodistalen Auswachsens der Extremitäten durch Induktion der Synthese des Fibroblasten-Wachstumsfaktors FGF4 im posterioren apikalen ektodermalen Kamm (Laufer, E. et al. (1994) Cell 79:993–1003; Niswander, L. et al. (1994) Nature 371:609–612) beteiligt.
  • Die enge Verwandtschaft zwischen Hedgehog-Proteinen und BMPs wurde wahrscheinlich an vielen, allerdings wahrscheinlich nicht an allen Stellen der Vertebraten-Hedgehog- Expression konserviert. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Shh im Hühner-Enddarm die Expression von Bmp4, einem anderen Vertebraten-dpp-Homolog, induziert (Roberts, D.J. et al. (1995) Development 121:3163–3174). Außerdem zeigen Shh und Bmp2, 4 oder 6 eine auffallende Korrelation in ihrer Expression in den Epithel- und Mesenchymzellen im Magen, dem urogenitalen System, der Lunge, den Zahnknospen und in den Haarfollikeln (Bitgood, M.J. und McMahon, A.P. (1995) Dev. Biol. 172:126–138). Außerdem wird Ihh, eines der beiden anderen Maus-Hedgehog-Gene, neben den Bmp-exprimierenden Zellen im Darm und im sich entwickelnden Knorpel exprimiert (Bitgood und McMahon (1995) supra).
  • Neuere Beweise legen ein Modell nahe, wobei Ihh eine essentielle Rolle bei der Regulierung der chondrogenen Entwicklung spielt (Roberts et al. (1995) supra). Während der Knorpelbildung gehen die Chondrocyten von einem proliferierenden Zustand über einen intermediären prähypertrophen Zustand in differenzierte hypertrophe Chondrocyten über. Ihh wird in den prähypertrophen Chondrocyten exprimiert und startet eine Signalisierungskaskade, die zur Blockierung der Chondrocytendifferenzierung führt. Sein direktes Ziel ist das Perichondrium um die Ihh-Expressionsdomäne, die durch Expression von Gli und Patched (Ptc), konservierten Transkriptionszielen der Hedgehog-Signale (siehe unten), reagiert. Sehr wahrscheinlich führt dies zu einer Sekundärsignalisierung, die zur Synthese des Parathyroid-Hormon-verwandten Proteins (PTHrP) im periartikulären Perichondrium führt. PTHrP selbst gibt wieder Signale an die prähypertrophen Chondrocyten ab und blockiert ihre weitere Differenzierung. Gleichzeitig unterdrückt PTHrP die Expression von Ihh und bildet dadurch eine negative Rückkopplungsschleife, die die Geschwindigkeit der Chondrozytendifferenzierung moduliert.
  • Patched wurde ursprünglich in Drosophila als Segmentpolaritätsgen identifiziert, eines aus einer Gruppe von Entwicklungsgenen, die die Zelldifferenzierung innerhalb der individuellen Segmente beeinflusst, die in einer homologen Reihe entlang der anteriorposterioren Achse des Embryos auftreten. Siehe Hooper, J.E. et al. (1989) Cell 59:751; und Nakano, Y. et al. (1989) Nature 341:508. Die Expressionsmuster des Vertebraten-Homologs von Patched legt seine Beteiligung an der Entwicklung von Neuralrohr, Skelett, Extremitäten, Kraniofazialstruktur und Haut nahe.
  • Genetische und funktionelle Studien belegen, dass Patched Teil der Hedgehog-Signalisierungskaskade ist, ein evolutionär konservierter Weg, der die Expression einer Anzahl von stromabwärts gelegenen Genen konserviert. Siehe Perrimon, N. (1995) Cell 80:517; und Perrimon, N. (1996) Cell 86:513. Patched nimmt an der konstitutiven transkriptionalen Repression der Zielgene teil; Gegenspieler seiner Wirkung ist ein sezerniertes Glycoprotein, das durch Hedgehog codiert wird, oder ein Vertebraten-Homolog, das eine transkriptionale Aktivierung induziert. Gene unter der Kontrolle dieses Weges umfassen die Mitglieder der Wnt- und TGF-beta-Familie.
  • Die Patched-Proteine besitzen zwei große extrazelluläre Domänen, 12 Transmembransegmente und mehrere cytoplasmatische Segmente. Siehe Hooper, supra; Nakano, supra; Johnson, R.L. et al. (1996) Science 272:1668; und Hahn, H. et al. (1996) Cell 85:841. Die biochemische Rolle von Patched auf dem Hedgehog-Signalisierungsweg ist unklar. Eine direkte Wechselwirkung mit dem Hedgehog-Protein wurde allerdings schon beschrieben (Chen, Y. et al. (1996) Cell 87:553), und Patched kann zusammen mit einem anderen Transmembranprotein, das von dem Smoothened Gen codiert wird, Teil eines Hedgehog-Rezeptorkomplexes sein. Siehe Perrimon, supra; und Chen, supra.
  • Das menschliche Homologe von Patched wurde unlängst cloniert und zu dem Chromosom 9q22.3 kartiert. Siehe Johnson, supra; und Hahn, supra. Diese Region wurde mit dem Basalzellnaevussyndrom (BCNS) in Zusammenhang gebracht, das durch Entwicklungsabnormitäten, einschließlich von kostalen und kraniofazialen Veränderungen, Abnormitäten der Hände und Füße und Spina bifida, gekennzeichnet ist.
  • Auch sporadische Tumore zeigen einen Verlust beider funktioneller Allele von Patched. Von 12 Tumoren, in denen Patched-Mutationen mit einem Einzelstrangkonformationspolymorphismus-Durchmusterungstest identifiziert wurden, zeigten 9 chromosomale Deletionen des zweiten Allels, und die anderen drei wiesen in beiden Allelen inaktivierende Mutationen (Gailani, supra) auf. Die Änderungen traten in der entsprechenden Keimbahn-DNA nicht auf.
  • Der größte Teil der identifizierten Mutationen führte zu vorzeitigen Stopp-Codons oder Rasterverschiebungen. Lench, N.J. et al., Hum. Genet. 1997 Okt.; 100(5–6): 497–502.
  • Mehrere waren allerdings Punktmutationen, die zu Aminosäure-Substitutionen entweder in den extrazellulären oder cytoplasmatischen Domänen führten. Diese Mutationsstellen könnten die funktionelle Bedeutung für die Wechselwirkung mit den extrazellulären Proteinen oder den cytoplasmatischen Mitgliedern des stromabwärts gelegenen Signalisierungsweges belegen.
  • Die Beteiligung von Patched an der Hemmung der Genexpression und das Auftreten von häufigen Alleldeletionen von Patched in BCC unterstützt eine Tumorsuppressorfunktion für dieses Gen. Seine Rolle bei der Regulierung der Genfamilien, von denen bekannt ist, dass sie an der Zellsignalisierung und an der interzellulären Kommunikation beteiligt sind, stellt einen möglichen Mechanismus für die Tumorsuppression bereit.
  • EP 0 056 637 betrifft 4-(3H)-Chinazolinonderivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel, die diese Verbindungen enthalten.
  • A. Rao et al., Journal of Indian Chem. Soc., Bd. 62, Nr. 3, März 1985, Seiten 234-7, diskutieren die Synthese und biologischen Aktivitäten von bestimmten Derivaten von 3-Aryl-4(3H)-chinazolinonen.
  • Singh B.D. et al., Journal of Indian Chem. Soc., Bd. 46, Nr. 1, 1969 beziehen sich auf die Synthese von Imidazo[1,5-a]-chinazolonen.
  • Tiwari S.S. et al., Journal Chem. Soc. Pak., 1981, 3(4), Seiten 215-17, offenbaren die Synthese von 2-Hippuryl-3-arylchinazolinonen und ihre mögliche Verwendung als fertilitätshemmende Verbindungen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (II) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung einer übermäßigen Zellwucherung. Die Verbindungen der Formel (II) sind wie folgt:
    Figure 00100001
    Formel II wobei, sofern Valenz und Stabilität es zulassen,
    R1 und R2 unabhängig bei jedem Vorkommen H, Niederalkyl, Aryl (substituiert oder unsubstituiert), Aralkyl (substituiert oder unsubstituiert), Heteroaryl (substituiert oder unsubstituiert) oder Heteroaralkyl (substituiert oder unsubstituiert) bedeuten;
    L unabhängig bei jedem Vorkommen abwesend ist oder Alkyl, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH2)nO(CH2)p-, -(CH2)nNR2(CH2)p-, -(CH2)nS(CH2)p-, -(CH2)n-Alkenyl(CH2)p-, -(CH2)n-Alkinyl(CH2)p, -O(CH2)n-, -NR2(CH2)n- oder -S(CH2)n- bedeutet;
    X aus -N(R8)-, -O-, -S-, -Se-, -N=N-, -ON=CH-, -(R8)N-N(R8)-, -ON(R8)-, einem Heterocyclus oder einer direkten Bindung zwischen L und Y ausgewählt ist;
    Y aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR2)-, einem heteroaromatischen Rest oder einer direkten Bindung zwischen X und Z ausgewählt ist;
    Z aus -N(R8)-, -O-, -S-, -Se-, -N=N-, -ON=CH-, -R8N-NR8-, -ONR8-, einem Heterocyclus oder einer direkten Bindung zwischen Y und L ausgewählt ist;
    R8 unabhängig bei jedem Vorkommen H, Niederalkyl, Aryl (substituiert oder unsubstituiert), Aralkyl (substituiert oder unsubstituiert), Heteroaryl (substituiert oder unsubstituiert) oder Heteroaralkyl (substituiert oder unsubstituiert) bedeutet oder zwei R8 zusammengenommen zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen 4-bis 8-gliedrigen Ring bilden, wobei der Ring ein oder mehrere Carbonylreste beinhalten kann;
    W einen substituierten oder unsubstituierten Benzo- oder Pyridoring bedeutet, der an den Pyrimidonring kondensiert ist;
    p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10 bedeutet; und
    n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10 bedeutet.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen bedeutet R1 einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylrest. Bei bestimmten Ausführungsformen bedeuten X-Y-Z zusammengenommen einen Harnstoff oder ein Amid. Bei bestimmten Ausführungsformen ist W ein substituierter oder unsubstituierter Benzolring. Bei bestimmten Ausführungsformen bedeutet X einen Diazacarbocyclus. Bei bestimmten Ausführungsformen bedeutet R2 einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylrest. Bei bestimmten Ausführungsformen ist R8 bei jedem Vorkommen unabhängig aus H und Niederalkyl ausgewählt. Bei bestimmten Ausführungsformen ist X aus -N(R8)-, -O-, -S-, einer direkten Bindung ausgewählt; Y ist aus -C(=O), -C(=S)- und S(O2)- ausgewählt; und Z ist aus -N(R8)-, -O-, -S-, einer direkten Bindung ausgewählt, derart, dass mindestens eines von X und Z vorhanden ist. Bei bestimmten Ausführungsformen ist mindestens eines von X und Z vorhanden. Bei bestimmten Ausführungsformen ist Y aus -C(=O)-, -C(=S)- und -S(O2)- ausgewählt.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen hemmt der Hedgehog-Antagonist die Hedgehog-vermittelte Signaltransduktion mit einer ED50 von 1 mM oder weniger, 1μM oder weniger, 100 nM oder weniger, 10 nM oder weniger oder 1 nM oder weniger. Die Zelle kann in vitro oder in vivo mit dem Hedgehog-Antagonisten in Kontakt gebracht werden. Bei bestimmten Ausführungsformen wird der Hedgehog-Antagonist als Teil einer therapeutischen oder kosmetischen Anwendung wie Regulierung von Nervengewebe, Knochen- und Knorpelbildung und -reparatur, Regulierung der Spermatogenese, Regulierung der glatten Muskulatur, Regulierung von Lunge, Leber und anderer Organe, die aus dem Urdarm entstehen, Regulierung der hämatopoietischen Funktion oder Regulierung von Haut- und Haarwachstum verabreicht.
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von einer Verbindung der allgemeinen Struktur der Formel (II)
    Figure 00120001
    wobei, wenn es Valenz und Stabilität erlauben,
    R1 und R2 unabhängig bei jedem Vorkommen H, Niederalkyl, -(CH2)n-Aryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) oder -(CH2)n-Heteroaryl (substituiert oder unsubstituiert) bedeuten;
    L unabhängig bei jedem Vorkommen abwesend ist oder -Alkyl-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH2)nO(CH2)p-, -(CH2)nNR2(CH2)p, -(CH2)nS(CH2)p, -(CH2)nAlkenyl(CH2)p, -(CH2)nAlkinyl(CH2)p, -O(CH2)n-, -NR2(CH2)n- oder -S(CH2)n- bedeutet;
    X NH ist;
    Y aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR2)-, einem heteroaromatischen Rest oder einer direkten Bindung zwischen X und Z ausgewählt ist;
    Z aus -N(R8)-, -O-, -S-, -Se-, N=N-, -ON=CH-, -R8N-NR8-, -ONR8-, einem Heterocyclus oder einer direkten Bindung zwischen Y und L ausgewählt ist;
    R8 unabhängig bei jedem Vorkommen H, Niederakyl, -(CH2)n-Aryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) oder -(CH2)n-Heteroaryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) bedeutet, oder zwei R8 zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können, z. B. mit X1 und Z1 oder X2 und Z2, wobei der Ring ein oder mehrere Carbonylgruppen beinhalten kann;
    W einen substituierten oder unsubstituierten Benzo- oder Pyridoring bedeutet, der an den Pyrimidonring kondensiert ist;
    p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise von 0 bis 3, bedeutet; und
    n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise von 0 bis 5, bedeutet.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen stellt L unmittelbar im Anschluss an X -(unverzweigtes Niederalkyl)- dar. Bei bestimmten Ausführungsformen stellt R1 einen unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring oder einen Aryl- oder Heteroarylring dar, der mit Substituenten substituiert ist, die aus H, einem Halogen, Cyano, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyl, (unverzweigtem Alkyl-O-), Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Amino, Imino, Amido, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Carboxamid, Anhydrid, Silyl, Thioether, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Sulfoxidgruppe, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R8 ausgewählt sind.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen stellt R einen unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring oder ein Aryl- oder Heteroarylring dar, der mit Substituenten substituiert ist, die aus H, Halogen, Cyano, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Nitro, Thiol, Imino, Amido, Carbonyl, Carboxyl, Anhydrid, Thioether, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Keton, Aldehyd und Ester ausgewählt sind. Bei bestimmten Ausführungsformen stellt R1 einen unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring oder einen Aryl- oder Heteroarylring dar, der mit Substituenten substituiert ist, die aus H, Halogen, Cyano, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Nitro, Amido, Carboxyl, Anhydrid, Alkylsulfonyl, Keton, Aldehyd und Ester ausgewählt sind. Bei bestimmten Ausführungsformen ist R2 ein subsituierter oder unsubstituierter Aryl- oder Heteroarylring. Bei bestimmten Ausführungsformen stellt X-Y-Z- eine Amid- oder Harnstoffverknüpfung dar. Bei bestimmten Ausführungsformen stellt R8 bei jedem Vorkommen ein H-Atom dar. Bei bestimmten Ausführungsformen ist R2 ein substituierter oder unsubstituierter Aryl- oder Heteroarylring. Bei bestimmten Ausführungsformen ist L unmittelbar im Anschluss an R1 abwesend.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen besitzt die Verbindung eine aus den in den 32j, k und l beschriebenen Strukturen ausgewählte Struktur
  • Figure 00140001
  • Die Synthese der Verbindungen, wie erfindungsgemäß verwendet, kann ein Verfahren zur Herstellung einer bicyclischen Verbindung umfassen, das das Erhitzen eines Reaktionsgemisches, umfassend eine Verbindung mit einer Struktur der Formel X, mit einem Carbonsäureanhydrid nach dem Schema:
    Figure 00140002
    wobei W einen Aryl- oder Heteroarylring darstellt und R10 einen substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkylalkyl-, Aralkyl- oder Heteroalkylrest darstellt und wobei das Anhydrid eine Struktur (R10CH2C=O)2O aufweist, wobei R'CH2R10 ist, umfasst.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen besteht das Reaktionsgemisch zu Beginn der Umsetzung im Wesentlichen aus der Verbindung der Formel X und dem Carbonsäureanhydrid.
  • Die Synthese kann auch ein Verfahren zur Herstellung eines Amins umfassen, umfassend das Zusammenbringen einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIII mit einem Amin der Struktur H2NR12 nach dem Schema:
    Figure 00150001
    wobei
    W einen Aryl- oder Heteroarylring darstellt;
    R1 H, Niederalkyl, -(CH2)nAryl oder -(CH2)nHeteroaryl darstellt,
    L abwesend ist oder -(CH2)n-Alkyl, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH2)n-Alkenyl-, -(CH2)n-Alkinyl-, -(CH2)nO(CH2)p, -(CH2)nNR2(CH2)p-, -(CH2)nS(CH2)p-, (CH2)n-Alkenyl(CH2)p-, -(CH2)n-Alkinyl(CH2)p-, -O(CH2)n, -NR2(CH2)n- oder -S(CH2)n- darstellt,
    Y' ein Halogenatom darstellt;
    R10 einen subsituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkylalkyl-, Aralkyl- oder Heteroaralkylrest darstellt; und
    R12 einen Niederalkylrest oder eine Silylgruppe darstellt, wobei das Amin und die Verbindung mit einer Struktur der Formel XIII mit einem polaren Lösungsmittel, umfassend weniger als etwa 50 % Wasser, kombiniert werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst das polare Lösungsmittel einen Alkohol. Bei bestimmten Ausführungsformen ist der Alkohol aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, t-Butanol, sec-Butanol, Ethylenglycol und 1,3-Propandiol ausgewählt.
  • Die Synthese kann auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung umfassen, umfassend die Durchführung der Schritte nach dem Schema:
    Figure 00160001
    wobei Schritt (A) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel X, wobei W einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring darstellt, wie einen Benzolring, mit einer Aminogruppe und einer Carbonsäuregruppe in benachbarten (ortho) Positionen, mit einem Acylierungsmittel der Formel R10CH2C(=O)X', wobei R10 unabhängig bei jedem Vorkommen einen substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkylalkyl-, Aralkyl- oder Heteroaralkylrest darstellt und X' ein Halogenatom oder -OC(=O)CH2R10 darstellt, unter Bedingungen, die eine Verbindung mit der Struktur der Formel XI erzeugen, umfasst;
    Schritt (B) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XI mit einem Amin der Formel R1LNH2, wobei R1 und L wie vorstehend definiert sind, unter Bedingungen, die zu einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XII (ihren, umfasst;
    Schritt (C) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XII mit einem Halogenierungsmittel wie Chlor, Brom, Iod, N-Bromsuccinimid, N-Chlorsuccinimid, N-Iodsuccinimid, ClBr, IBr, ClI oder einem Reagens, das ein Halogenradikal (wie Cl, Br oder I) erzeugt, unter Bedingungen, die zu einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIII führen, wobei Y' ein Halogenatom wie Cl, Br oder I darstellt, umfasst;
    Schritt (D) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIII mit einem Amin der Formel H2NR12, wobei R12 einen Niederalkylrest oder eine Silylgruppe darstellt, wie einen Trialkylsilyl-, Triarylsilyl-, Dialkylarylsilyl- oder Diarylalkylsilylrest, unter Bedingungen, die zu einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIV führen, umfasst; und
    Schritt (E) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIV mit einem terminalen Rest einer Struktur R2V' unter Herstellung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XX, wobei R2 wie vorstehend definiert ist und V' eine funktionelle Gruppe darstellt, ausgewählt aus ZC(=W)Cl, ZC(=W)Br, Isocyanat, Isothiocyanat, ZC(=W)WC(=W)ZR2, ZSO2Cl, ZSO2Br, ZSOCl, ZSOBr oder einer in situ hergestellten aktivierten Acylierungseinheit, umfasst.
  • Die Synthese kann auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung umfassen, das die Durchführung der Schritte nach dem Schema:
    Figure 00170001
    umfasst,
    wobei Schritt (A) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XV, wobei P' H oder eine Schutzgruppe darstellt, W einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring wie einen Benzolring mit einer Aminogruppe und einer Carbonsäure- oder Estergruppe in nebeneinander liegenden (ortho) Positionen darstellt, mit einem Acylierungsmittel der Formel PXLC(=O)X', wobei X und L wie vorstehend definiert sind, P eine Schutzgruppe darstellt und X' ein Halogenatom, -OC(=O)LXP oder eine funktionelle Gruppe darstellt, die durch Umsetzung einer Carboxylgruppe mit einem Aktivierungsmittel erzeugt wird, wie Carbodiimid (z.B. Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid, etc.), Reagentien auf Phosphorbasis (wie BOP-Cl, PyBROP, etc.), Oxalylchlorid, Phosgen, Triphosgen, Carbonyldiimidazol oder jedes andere Reagens, das mit einer Carbonsäuregruppe reagiert und zu einer reaktiven Zwischenstufe mit, relativ zur Carbonsäure, erhöhter Empfindlichkeit gegenüber der Kopplung mit einem Amin führt, unter Bedingungen, die eine Verbindung mit einer Struktur der Formel XVI erzeugen, umfasst;
    Schritt (B), falls notwendig, die Schutzgruppenentfernung von dem Ester einer Verbindung mit der Struktur der Formel XVI unter Herstellung einer Carbonsäure mit einer Struktur der Formel XVII umfasst;
    Schritt (C) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XVII mit einem Amin der Formel R1LNH2, wobei R1 und L wie vorstehend definiert sind, unter Bedingungen, die eine Verbindung mit einer Struktur der Formel XVIII ergeben, umfasst;
    Schritt (D) die Entfernung der Schutzgruppe P von einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XVIII unter Erzeugung einer Verbindung mit der Struktur der Formel XIX umfasst;
    Schritt (E) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIX mit einem terminalen Rest einer Struktur R2Y' unter Herstellung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XXI, wobei R2 wie vorstehend definiert ist und Y' eine funktionelle Gruppe darstellt, ausgewählt aus ZC(=W)Cl, ZC(=W)Br, Isocyanat, Isothiocyanat, ZC(=W)WC(=W)ZR2, ZSO2Cl, ZSO2Br, ZSOCl, ZSOBr oder einer aktiven in situ hergestellten Acylierungseinheit, umfasst.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1–31 beschreiben die Reaktionen, die zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen geeignet sind.
  • Die 32a–l erläutern erfindungsgemäße repräsentative Verbindungen.
  • 33 stellt die biologischen Testergebnisse für eine beispielhafte erfindungsgemäße Verbindung dar.
  • 34 stellt die Auswirkungen einer beispielhaften erfindungsgemäßen Verbindung auf das Lungengewebe dar.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • 1. Überblick
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass die von Hedgehog, Patched (Ptc), Gli und/oder Smoothened regulierten Signaltransduktionswege mindestens teilweise durch kleine Moleküle gehemmt werden können. Obgleich die Festlegung auf eine bestimmte Theorie nicht gewünscht ist, kann die Aktivierung eines Rezeptors der Mechanismus sein, über den diese Mittel wirken. Beispielsweise kann die Fähigkeit dieser Mittel zur Hemmung der Proliferation von Patched-loss-of-function (Ptclof)-Zellen auf der Fähigkeit solcher Moleküle zur Wechselwirkung mit Hedgehog, Patched oder Smoothened oder zumindest zur Einwirkung auf die Fähigkeit dieser Proteine, einen Hedgehog-, Ptc-und/oder Smoothened-vermittelten Signaltransduktionsweg zu aktivieren, beruhen.
  • Darum wird insbesondere berücksichtigt, dass diese kleinen Moleküle, die mit den Aspekten der Hedgehog-, Ptc- oder Smoothened-Signaltransduktionsaktivität interferieren, auch in der Lage sind, die Proliferation (oder die biologischen Folgen) in Zellen mit einem Hedgehog-gain-of-function-Phänotypus zu hemmen. Bei den bevorzugten Ausführungsformen sind die betreffenden Inhibitoren organische Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 2500 amu, mehr bevorzugt weniger als 1500 amu und noch mehr bevorzugt von weniger als 750 amu und sind in der Lage, mindestens einige der biologischen Aktivitäten der Hedgehog-Proteine, vorzugsweise insbesondere in Zielzellen, zu hemmen.
  • Somit umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren die Verwendung von kleinen Molekülen, die die Ptc-Hemmung der Hedgehog-Signalisierung bei der Regulierung der Reparatur- und/oder Funktionsleistung eines breiten Bereichs von Zellen, Geweben und Organen mit dem Hedgehog-gain-of-function-Phänotypus agonisieren. Beispielsweise besitzt das entsprechende Verfahren therapeutische und kosmetische Anwendungsmöglichkeiten im Bereich der Regulierung von Nervengeweben, Knochen- und Knorpelbildung sowie -reparatur, Regulierung der Spermatogenese, Regulierung der glatten Muskulatur, Regulierung von Lunge, Leber und Gewebe von anderen Organen, die aus dem Urdarm hervorgehen, Regulierung der hämatopoietischen Funktion, Regulierung von Haut- und Haarwachstum etc. Ferner können die betreffenden Verfahren an Zellen, die in Kultur (in vitro) bereitgestellt werden, oder an Zellen in einem vollständigen Tier (in vivo) durchgeführt werden. Siehe beispielsweise die PCT-Veröffentlichungen WO 95/18856 und WO 96/17924 (deren Beschreibungen durch Bezugnahme ausdrücklich mit umfasst sind).
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die betreffende Verwendung darin bestehen, Epithelzellen mit einem Hedgehog-gain-of-function-Phänotypus zu behandeln.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die betreffende Verwendung als Teil eines Behandlungsplanes für das maligne Medulloblastom oder für andere primäre maligne neuroektodermale ZNS-Tumore verwendet werden.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Arzneimittel bereit, umfassend als Wirkstoff einen Hedgehog-Antagonisten oder einen Ptc-Agonisten, wie hier beschrieben, formuliert in einer Menge, die ausreicht, um in vivo die Proliferation oder andere biologische Folgen von Hedgehog-gain-of-function zu hemmen.
  • Die betreffenden Behandlungen unter Verwendung von Hedgehog-Antagonisten können sowohl für menschliche als auch tierische Individuen wirksam sein. Tierische Individuen, auf die die Erfindung anwendbar ist, erstrecken sich sowohl auf Haustiere als auch auf Vieh, das entweder als Haustier oder für kommerzielle Zwecke gezüchtet wird. Beispiele sind Hunde, Katzen, Rindvieh, Pferde, Schafe, Esel und Ziegen.
  • II. Definitionen
  • Zweckmäßigerweise werden bestimmte Begriffe, die in der Beschreibung, in den Beispielen und in den beigefügten Ansprüchen eingesetzt werden, hier zusammengefasst.
  • Der Begriff "aberrante Modifikation oder Mutation" eines Gens bezieht sich auf solche genetischen Läsionen wie beispielsweise Deletionen, Substitution oder Addition von Nucleotiden an ein Gen sowie massive chromosomale Umlagerungen des Gens und/oder abnorme Methylierung des Gens. Gleichermaßen bezieht sich eine Fehlexpression eines Gens auf aberrante Transkriptionsniveaus des Gens relativ zu denjenigen Niveaus in einer normalen Zelle unter ähnlichen Bedingungen sowie auf das Nicht-Wildtyp-Spleißen der aus dem Gen transcribierten mRNA.
  • "Basalzellenkarzinome" existieren in einer Vielzahl von klinischen und histologischen Formen wie knotig-ulzerativ, oberflächlich, pigmentiert, Morphea-ähnlich, Fibroepitheliom- und naevoides Syndrom. Basalzellenkarzinome sind die häufigsten Hautneoplasmen, die beim Menschen festgestellt werden. Der Großteil der neuen Fälle von nicht melanomen Hautkrebsarten fällt in diese Kategorie.
  • "Brandwunden" bezieht sich auf die Fälle, wobei große Hautoberflächen eines Individuums auf Grund von Hitze und/oder chemischen Mitteln entfernt wurden oder verloren gegangen sind.
  • Der Begriff "Karzinom" bezieht sich auf ein malignes neues Wachstum, das aus Epithelzellen aufgebaut ist, die dazu neigen, umgebende Gewebe zu infiltrieren und Metastasen entstehen zu lassen. Beispielhafte Karzinome umfassen: das "Basalzellenkarzinom", das ein Epitheltumor der Haut ist, der, obgleich selten metastasierend, das Potential zur lokalen Invasion und Destruktion besitzt; das "Plattenzellenkarzinom", das sich auf Karzinome bezieht, die aus dem Plattenepithel entstehen und würfelähnliche Zellen aufweisen; die "Karzinosarkome", die maligne Tumore einschließen, bestehend aus karzinomatösem und sarkomatösem Gewebe; das "adenozystische Karzinom", ein Karzinom, das von Zylindern oder Bändern des hyalinen oder muzinen Stromas markiert ist, getrennt oder umgeben von Nestern oder Schnüren von kleinen Epithelzellen, die in den Brust- und Speicheldrüsen und den Schleimdrüsen der Atemwege auftreten; das "epidermoide Karzinom", das sich auf kanzeröse Zellen bezieht, die zur Differenzierung auf dem gleichen Weg wie diejenigen der Epidermis neigen; d.h. sie neigen zur Bildung von Stachelzellen und erfahren eine Verhornung; das "Nasopharyngealkarzinom", das sich auf einen malignen Tumor bezieht, der in der Epithelauskleidung des Raums hinter der Nase entsteht; und das "Nierenzellenkarzinom", das Karzinome des Nierenparenchyms betrifft, die aus Röhrenzellen in variierenden Anordnungen bestehen. Weitere karzinomatöse epitheliale Wachstumsformen sind "Papillome", die gutartige Tumore betreffen, die aus dem Epithel stammen, mit einem Papilloma-Virus als kausatives Mittel; und "Epidermoidome", die einen zerebralen oder meningealen Tumor betreffen, der durch den Einschluss von ektodermalen Elementen zum Zeitpunkt des Schlusses der Neuronalrinne gebildet wird.
  • "Korium" oder "Dermis" bezieht sich auf die Schicht der Haut unterhalb der Epidermis, die aus einem dichten Bett von vaskularisiertem Bindegewebe besteht und die Nerven und terminalen Gefühlsorgane enthält. Die Haarwurzeln und die Talg- und Schweißdrüsen sind Strukturen der Epidermis, die tief in der Epidermis eingebettet sind.
  • "Dentalgewebe" bezieht sich auf Gewebe im Mund, das dem Epithelgewebe entspricht, beispielsweise das Zahnfleischgewebe. Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Behandlung von periodontaler Krankheit geeignet.
  • "Dermaler Hautulzera" bezieht sich auf Läsionen auf der Haut, die durch einen oberflächlichen Verlust von Gewebe, üblicherweise mit Entzündung, verursacht werden. Dermale Hautulzera, die durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt werden können, umfassen Dekubitus-Ulzera, diabetische Ulzera, Venenstau-Ulzera und arterielle Ulzera. Dekubitus-Wunden beziehen sich auf chronische Ulzera auf Grund von Druck, der längere Zeit auf Hautflächen ausgeübt wird. Wunden dieses Typs werden oft als Dekubiti oder Druckgeschwüre bezeichnet. Venenstau-Ulzera beruhen auf der Stagnation des Blutes oder anderer Flüssigkeiten aus defekten Venen. Arterielle Ulzera beziehen sich auf nekrotische Haut in dem Bereich um Arterien mit schlechter Durchblutung.
  • Der Begriff "ED50" bedeutet die Arzneistoffdosis, die 50 % ihrer maximalen Reaktion oder Wirkung hervorruft.
  • Eine "wirksame Menge" von z.B. einem Hedgehog-Antagonisten, bezüglich des betreffenden Behandlungsverfahrens, bezieht sich auf eine Menge des Antagonisten in einer Präparation, die bei Verabreichung als Teil eines gewünschten Dosierungsplanes z.B. eine Änderung in der Zellproliferationsrate und/oder dem Differenzierungszustand einer Zelle und/oder der Überlebensrate einer Zelle nach den akzeptierten klinischen Standards für die zu behandelnde Störung oder den kosmetischen Zweck hervorruft.
  • Der Begriff "Epithel", "epithelial" und "Epithelium" bezieht sich auf die Zellabdeckung der internen und externen Körperoberflächen (kutanös, mukös und serös), einschließlich der Drüsen und anderer davon stammender Strukturen, z.B. epitheliale Kornea-, Ösophagus-, Epidermis- und Haarfollikel-Zellen. Ein anderes beispielhaftes Epithelgewebe umfasst das olfaktorische Epithel, das die pseudostratifizierte Epithelauskleidung der olfaktorischen Region der Nasenhöhle ist und die Rezeptoren für den Geruchssinn enthält; das glanduläre Epithel, das das Epithel bezeichnet, das aus den Sekretionszellen besteht; das Plattenepithel, das sich auf das Epithel bezieht, das aus flachen plattenartigen Zellen besteht. Der Begriff Epithel kann auch ein Übergangsepithel bezeichnen, wie dasjenige, das charakteristischerweise als Auskleidung der Hohlorgane festgestellt wird, die großen mechanischen Änderungen auf Grund von Kontraktion und Distention unterworfen sind, z.B. Gewebe, das einen Übergang zwischen einem stratifizierten Platten- und einem Säulenepithel darstellt.
  • Der Begriff "Epithelisierung" bezieht sich auf das Heilen durch das Wachstum von Epithelgewebe über eine bloßgelegte Oberfläche.
  • Der Begriff "epidermale Drüse" bezieht sich auf eine Aggregation von Zellen, die mit der Epidermis in Verbindung stehen und auf die Sekretion oder Exkretion von Materialien spezialisiert sind, die nicht mit ihren gewöhnlichen metabolischen Bedürfnissen zusammenhängen. Beispielsweise sind "Talgdrüsen" holokrine Drüsen im Korium, die eine ölige Substanz und Sebum sezernieren. Der Begriff "Schweißdrüsen" bezieht sich auf Drüsen, die Schweiß sezernieren, mit Sitz im Korium oder im Unterhautgewebe und Öffnung durch einen Kanal auf der Körperoberfläche.
  • Der Begriff "Epidermis" bezieht sich auf die äußerste nicht vaskularisierte Hautschicht, die vom embryonalen Ektoderm abstammt, mit einer Dickeschwankung von 0,07 bis 1,4 mm. Auf den palmaren und plantaren Oberflächen umfasst sie von innen nach außen 5 Schichten: die Basalschicht, bestehend aus säulenförmigen senkrecht angeordneten Zellen; die Stachelzellen- oder spinöse Schicht, bestehend aus abgeflachten polyedrischen Zellen mit kurzen Fortsätzen oder Stacheln; die granuläre Schicht, bestehend aus abgeflachten granulären Zellen; die klare Schicht, bestehend aus mehreren Schichten von klaren transparenten Zellen, in denen die Nuclei nicht zu unterscheiden sind oder fehlen; und die Hornschicht, bestehend aus abgeflachten, kornifizierten, nicht kernhaltigen Zellen. In der Epidermis der allgemeinen Körperoberfläche ist die klare Schicht im Wesentlichen abwesend.
  • "Exzisionswunden" umfassen Risse, Abrasionen, Schnitte, Punktionen oder Lazerationen in der Epithelschicht der Haut, und sie können sich in die dermale Schicht sowie in das subkutane Fett und darüber hinaus erstrecken. Exzisionswunden können von chirurgischen Eingriffen oder von einem zufälligen Eindringen in die Haut herrühren.
  • Der "Wachstumszustand" einer Zelle bezieht sich auf die Proliferationsrate der Zelle und/oder den Differenzierungszustand der Zelle. Ein "veränderter Wachstumszustand" ist ein Wachstumszustand, der durch eine abnorme Proliferationsrate gekennzeichnet ist, z.B. eine Zelle, die eine erhöhte oder verminderte Proliferationsrate relativ zu einer normalen Zelle aufweist.
  • Der Begriff "Haar" bezieht sich auf eine fadenartige Struktur, insbesondere die spezielle epidermale Struktur, die aus Keratin besteht und sich aus einer im Korium versenkten Papille entwickelt, das nur von Säugern erzeugt wird und für diese Gruppe von Tieren charakteristisch ist. "Haar" kann sich auch auf das Aggregat von solchen Haaren beziehen. Ein "Haarfollikel" bezieht sich auf eine der tubulären Invaginationen der Epidermis, die die Haare umschließen und aus denen die Haare wachsen. "Haarfollikel-Epithelzellen" bezieht sich auf die Epithelzellen, die die Hautpapille im Haarfollikel umgeben, z.B. Stammzellen, äußere Wurzelscheidenzellen, Matrixzellen und innere Wurzelscheidenzellen. Solche Zellen können normale nicht maligne Zellen oder transformierte/immortalisierte Zellen sein.
  • Der Begriff "Hedgehog-Antagonist" bezieht sich auf ein Mittel, das die Bioaktivität von Patched potenziert oder rekapituliert, wie Repression der Transkription von Zielgenen. Bevorzugte Hedgehog-Antagonisten können zur Behebung von Ptc-loss-of-function und/oder Smoothened-gain-of-function verwendet werden, wobei letztere auch als Smoothened-Antagonisten bezeichnet werden. Der Begriff "Hedgehog-Antagonist", wie hier verwendet, bezieht sich nicht nur auf ein Mittel, das durch direkte Hemmung der normalen Funktion des Hedgehog-Proteins wirken kann, sondern auch auf jedes Mittel, das den Hedgehog-Signalisierungsweg hemmt und somit die Funktion von Ptc rekapituliert.
  • Der Begriff "Hedgehog-gain-of-function" bezieht sich auf eine aberrante Modifikation oder Mutation eines Ptc-Gens, Hedgehog-Gens oder eines Smoothened-Gens oder auf eine Abnahme (oder einen Verlust) im Expressionsniveaus eines solchen Gens, was zu einem Phänotypus führt, der dem Kontaktieren einer Zelle mit einem Hedgehog-Protein entspricht, z.B. eine aberrante Aktivierung eines Hedgehog-Weges. Gain-of-function kann einen Verlust der Fähigkeit des Ptc-Genprodukts zur Regulierung des Expressionsniveaus von Ci-Genen, z.B. Gli1, Gli2 und Gli3, umfassen. Der Begriff 'Hedgehog-gain-of-function' wird hier auch zur Bezeichnung eines ähnlichen Zell-Phänotypus' (z.B. derjenige, der einen Proliferationsüberschuss aufweist) verwendet, der auf Grund einer Änderung irgendwo auf dem Hedgehog-Signaltransduktionsweg auftritt, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, einer Modifikation oder Mutation von Hedgehog selbst. Beispielsweise würde eine Tumorzelle mit einer abnorm hohen Proliferationsrate auf Grund der Aktivierung des Hedgehog-Signalisierungsweges einen "Hedgehog-gain-of-function" Phänotypus aufweisen, auch wenn Hedgehog in dieser Zelle nicht mutiert ist.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich "immortalisierte Zellen" auf Zellen, die über chemische und/oder rekombinatorische Mittel so verändert worden sind, dass die Zellen die Fähigkeit zum Wachstum durch eine unendliche Anzahl von Teilungen in Kultur besitzen.
  • "Internes Epithelgewebe" bezieht sich auf Gewebe im Inneren des Körpers, das Merkmale aufweist, entsprechend der Epidermisschicht in der Haut. Beispiele umfassen die Auskleidung des Intestinums. Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Beschleunigung der Heilung bestimmter interner Wunden, beispielsweise Wunden auf Grund eines operativen Eingriffs, geeignet.
  • Der Begriff "Keratose" bezieht sich auf proliferative Hautstörungen, die durch eine Hyperplasie der Hornschicht der Epidermis gekennzeichnet sind. Beispielhafte keratöse Störungen umfassen Keratosis follicularis, Keratosis palmaris und plantaris, Keratosis pharyngea, Keratosis pilaris und aktinische Keratose.
  • Der Begriff "LD50" bedeutet die Arzneistoffdosis, die in 50 % der getesteten Individuen letal ist.
  • Der Begriff "Nagel" bezieht sich auf die kutanöse Hornplatte auf der dorsalen Oberfläche des distalen Endes eines Fingers oder einer Zehe.
  • Der Begriff "Patched-loss-of-function" bezieht sich auf eine aberrante Modifikation oder Mutation eines Ptc-Gens oder auf eine Abnahme des Expressionsniveaus des Gens, die zu einem Phänotypus führt, der dem Kontaktieren einer Zelle mit einem Hedgehog-Protein entspricht, z.B. eine aberrante Aktivierung eines Hedgehog-Weges. Loss-of-function kann einen Verlust der Fähigkeit des Ptc-Genprodukts zur Regulierung des Expressionsniveaus von Ci-Genen, z.B. Gli1, Gli2 und Gli3, umfassen.
  • Ein "Patient" oder ein "Individuum", das durch das erfindungsgemäße Verfahren zu behandeln ist, kann entweder ein Mensch oder ein nicht menschliches Tier bedeuten.
  • Der Begriff "Prodrug" soll Verbindungen umfassen, die unter physiologischen Bedingungen in die erfindungsgemäßen therapeutischen Wirkstoffe umgewandelt werden. Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung eines Prodrug besteht darin, ausgewählte Einheiten einzuschließen, die unter physiologischen Bedingungen unter Erzeugung des gewünschten Moleküls hydrolysiert werden. Bei anderen Ausführungsformen wird das Prodrug durch eine enzymatische Aktivität des Wirtstieres umgewandelt.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich "proliferierend" und "Proliferation" auf Zellen, die eine Mitose duchlaufen.
  • In dieser Anmeldung bezieht sich der Begriff "proliferative Hautstörung" auf jede Störung/Krankheit der Haut, die durch eine unerwünschte oder aberrante Proliferation des kutanen Gewebes gekennzeichnet ist. Diese Bedingungen sind typischerweise durch eine epidermale Zellproliferation oder eine unvollständige Zelldifferenzierung gekennzeichnet und umfassen beispielsweise X-Chromosom-gekoppelte Ichthyose, Psoriasis, atopische Dermatitis, allergische Kontaktdermatitis, epidermolytische Hyperkeratose und seborrhoische Dermatitis. Beispielsweise ist die Epidermodysplasie eine Form einer fehlerhaften Entwicklung der Epidermis. Ein weiteres Beispiel ist die "Epidermolyse", die einen losen Zustand der Epidermis mit Bildung von Hautblasen und Bullae, entweder spontan oder an der Stelle des Traumas, betrifft.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Psoriasis" auf eine Hyperproliferationsstörung der Haut, die die regulativen Mechanismen der Haut ändert. Insbesondere werden Läsionen gebildet, die primäre und sekundäre Veränderungen in der epidermalen Proliferation, entzündliche Reaktionen der Haut und eine Expression von regulatorischen Molekülen wie Lymphokinen und Entzündungsfaktoren umfassen. Die psoriatische Haut ist morphologisch durch einen erhöhten Umsatz von epidermalen Zellen, verdickter Epidermis, abnormer Keratinisierung, entzündlichen Zellinfiltraten in die Dermis-Schicht und durch polymorphonukleäre Leukocyten-Infiltration in die Epidermisschicht, die zu einem erhöhten basalen Zellcyclus führt, gekennzeichnet. Zusätzlich sind hyperkeratotische und parakeratotische Zellen vorhanden.
  • Der Begriff "Haut" bezieht sich auf die äußere Schutzbedeckung des Körpers, bestehend aus dem Corium und der Epidermis, und wird so verstanden, dass sie Schweiß- und Talgdrüsen sowie Haarfollikelstrukturen einschließt. In der vorliegenden Anmeldung kann das Adjektiv "kutanös" verwendet werden und sollte so verstanden werden, dass es sich allgemein auf Attribute der Haut, entsprechend dem Zusammenhang, in dem sie verwendet werden, bezieht.
  • Der Begriff "Smoothened-gain-of-function" bezieht sich auf eine aberrante Modifikation oder Mutation eines Smo-Gens oder auf ein erhöhtes Expressionsniveau des Gens, das zu einem Phänotypus führt, der dem Kontaktieren einer Zelle mit einem Hedgehog-Protein entspricht, z.B. eine aberrante Aktivierung eines Hedgehog-Weges. Obwohl die Festlegung auf eine bestimmte Theorie nicht gewünscht ist, wird festgestellt, dass Ptc nicht direkt in die Zelle signalisieren kann, sondern bei der Hedgehog-Signalisierung statt dessen mit Smoothened, einem anderen Membran-gebundenen Protein, das stromabwärts von Ptc lokalisiert ist, wechselwirkt (Marigo et al., (1996) Nature 384:177–179). Das Gen Smo ist ein Segment-Polaritätsgen, das zur korrekten Musterung eines jeden Segments in Drosophila erforderlich ist (Alcedo et al., (1996) Cell 86:221–232). Menschliche Homologe von Smo wurden bereits identifiziert. Siehe beispielsweise Stone et al. (1996) Nature 384:129–134, und Genbank-Zugang U84401. Das Smoothened-Gen codiert ein integrales Membranprotein mit den Merkmalen von heterotrimeren G-Protein-gekoppelten Rezeptoren; d.h. 7 Transmembranregionen. Dieses Protein zeigt Homologie mit dem Drosophila-Frizzled (Fz)-Protein, einem Glied des Wingless-Weges. Es wurde ursprünglich davon ausgegangen, dass Smo einen Rezeptor des Hh-Signals codiert. Dieser Vorschlag wurde allerdings später widerlegt, da bewiesen wurde, dass Ptc der Hh-Rezeptor ist. Zellen, die Smo exprimieren, vermögen Hh nicht zu binden, was belegt, dass Smo nicht direkt mit Hh wechselwirkt (Nusse, (1996) Nature 384:119–120). Stattdessen wird angenommen, dass das Binden von Sonic Hedgehog (SHH) an seinen Rezeptor, PtcH, die normale Hemmung von Smoothened (Smo), einem siebenspännigen Transmembranprotein, durch PtcH verhindert.
  • Neuerdings wurde berichtet, dass die Aktivierung von Smoothened-Mutationen im sporadischen Basalzellenkarzinom, Xie et al. (1998) Nature 391:90-2, und in primitiven neuroektodermalen Tumoren des zentralen Nervensystems, Reifenberger et al. (1998) Cancer Res. 58:1798–803 auftritt.
  • Der Begriff "therapeutischer Index" bezieht sich auf den therapeutischen Index eines Arzneistoffes, der als LD50/ED50 definiert ist.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich "transformierte Zellen" auf Zellen, die sich spontan in einen Zustand uneingeschränkten Wachstums umgewandelt haben, d.h. sie haben die Fähigkeit zum Wachstum über eine unendliche Anzahl von Teilungen in Kultur erworben. Transformierte Zellen können durch solche Begriffe wie neoplastisch, anaplastisch und/oder hypoplastisch bezüglich ihrer verlorenen Wachstumskontrolle gekennzeichnet werden.
  • Der Begriff "Acylamino" ist aus der Technik bekannt und bezieht sich auf eine Einheit, die durch die allgemeine Formel
    Figure 00290001
    dargestellt werden kann, wobei R9 wie vorstehend definiert ist und R'11 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl oder -(CH2)m-R8 darstellt, wobei m und R8 wie vorstehend definiert sind.
  • Hier bezieht sich der Begriff "aliphatischer Rest" auf einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest und umfasst gesättigte und ungesättigte aliphatische Reste wie einen Alkylrest, einen Alkenylrest und einen Alkinylrest.
  • Die Begriffe "Alkenyl" und "Alkinyl" beziehen sich auf ungesättigte aliphatische Reste mit analoger Länge und möglicher Substitution an den vorstehend beschriebenen Alkylresten, die allerdings mindestens eine Doppel- bzw. Dreifachbindung enthalten.
  • Die Begriffe "Alkoxyl" oder "Alkoxy", wie hier verwendet, beziehen sich auf einen Alkylrest, wie vorstehend definiert, mit einem daran gebundenen Sauerstoffradikal. Repräsentative Alkoxylreste umfassen Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, tert-Butoxy und dergleichen. Ein "Ether" bedeutet zwei über ein Sauerstoffatom kovalent gebundene Kohlenwasserstoffreste. Demnach ist der Substituent eines Alkylrestes, der dieses Alkyl zu einem Ether macht, ein Alkoxylrest oder entspricht einem Alkoxylrest, wie er durch eines von -O-Alkyl, -O-Alkenyl, -O-Alkinyl, -O-(CH2)m-R8 dargestellt werden kann, wobei m und R8 vorstehend beschrieben sind.
  • Der Begriff "Alkyl" bezieht sich auf den Rest aus gesättigten aliphatischen Resten, einschließlich geradkettige Alkylreste, verzweigte Alkylreste, Cycloalkyl (alicyclische) Reste, Alkyl-substituierte Cycloalkylreste, und Cycloalkyl-substituierte Alkylreste. Bei den bevorzugten Ausführungsformen weist ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest 30 oder weniger Kohlenstoffatome in seiner Hauptkette (z.B., C1-C30 für gerade Ketten, C3-C30 verzweigte Ketten) und mehr bevorzugt 20 oder weniger auf. Gleichermaßen weisen die bevorzugten Cycloalkylreste 3–10 Kohlenstoffatome in ihrer Ringstruktur auf, und mehr bevorzugt weisen sie 5, 6 oder 7 Kohlenstoffatome in der Ringstruktur auf.
  • Ferner soll der Begriff "Alkyl" (oder "Niederalkyl"), wie er in der Beschreibung, in den Beispielen und Ansprüchen verwendet wird, sowohl "unsubstituierte Alkylreste" als auch "substituierte Alkylreste" einschließen, wovon letztere sich auf Alkyleinheiten mit Substituenten beziehen, die ein Wasserstoffatom an einem oder mehreren Kohlenstoffatomen der Kohlenwasserstoffhauptkette ersetzen. Solche Substituenten können beispielsweise ein Halogenatom, eine Hydroxyl-, Carbonyl- (wie eine Carboxyl-, eine Alkoxycarbonyl-, eine Formyl- oder eine Acylgruppe), Thiocarbonyl- (wie eine Thioester-, eine Thioacetat- oder eine Thioformiatgruppe), Alkoxyl-, Phosphoryl-, Phosphat-, Phosphonat-, Phosphinat-, Amino-, Amido-, Amidin-, Imin-, Cyano-, Nitro-, Azido-, Sulfhydryl-, Alkylthio-, Sulfat-, Sulfonat-, Sulfamoyl-, Sulfonamid-, Sulfonyl-, Heterocyclyl-, Aralkyl- oder eine aromatische oder heteroaromatische Gruppe einschließen. Für die Fachwelt ist es selbstverständlich, dass die Substituenten-Einheiten an der Kohlenwasserstoffkette gegebenenfalls selbst substituiert sein können. Beispielsweise können die Substituenten eines substituierten Alkylrests substituierte und unsubstituierte Formen von Amino, Azido, Imino, Amido, Phosphoryl (einschließlich von Phosphonat und Phosphinat), Sulfonyl (einschließlich von Sulfat, Sulfonamido, Sulfamoyl und Sulfonat) und Silylgruppen sowie Ether, Alkylthioreste, Carbonylreste (einschließlich von Ketonen, Aldehyden, Carboxylaten und Estern), -CF3, -CN und dergleichen einschließen. Beispielhafte substituierte Alkylreste sind nachstehend beschrieben. Cycloalkylreste können weiterhin mit Alkylresten, Alkenylresten, Alkoxyresten, Alkylthioresten, Aminoalkylresten, Carbonyl-substituierten Alkylresten, -CF3, -CN und dergleichen substituiert sein.
  • Wenn die Anzahl der Kohlenstoffatome nicht anderweitig vorgegeben ist, bedeutet "Niederalkyl", wie hier verwendet, einen Alkylrest, wie vorstehend definiert, allerdings mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in seiner Hauptkettenstruktur. Ebenso weisen "Niederalkenyl" und "Niederalkinyl" ähnliche Kettenlängen auf. In der Anmeldung sind die bevorzugten Alkylreste Niederalkylreste. Bei den bevorzugten Ausführungsformen ist ein hier als Alkylrest bezeichneter Substituent ein Niederalkylrest.
  • Der Begriff "Alkylthio" bezieht sich auf einen Alkylrest, wie vorstehend definiert, mit einem daran gebundenen Schwefelatom. Bei den bevorzugten Ausführungsformen ist die "Alkylthio"-Einheit durch einen der Reste -S-Alkyl, -S-Alkenyl, -S-Alkinyl und -S-(CH2)mR8 dargestellt, wobei m und R8 wie vorstehend definiert sind. Repräsentative Alkylthioreste umfassen Methylthio, Ethylthio und dergleichen.
  • Die Begriffe "Amin" und "Amino" sind aus der Technik bekannt und beziehen sich sowohl auf unsubstituierte als auch substituierte Amine, z.B. eine Einheit, die durch die allgemeine Formel
    Figure 00310001
    dargestellt werden kann, wobei R9, R10, und R'10 jeweils unabhängig ein Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl, -(CH2)m-R8 darstellen oder R9 und R10 zusammengenommen mit dem N-Atom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen; R8 ein Aryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycyclus darstellt und m 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist. Bei den bevorzugten Ausfülrungsformen kann nur eines von R9 oder R10 eine Carbonylgruppe sein, z.B. bilden R9, R10 und das Stickstoffatom zusammen kein Imid. Bei noch mehr bevorzugten Ausführungsformen stellen R9 und R10 (und gegebenenfalls R'10) jeweils unabhängig ein Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 dar. Somit bedeutet der Begriff "Alkylamin", wie hier verwendet, eine Amingruppe, wie vorstehend definiert, mit einem daran gebundenen substituierten oder unsubstituierten Alkylrest, d.h. mindestens einer von R9 und R10 ist ein Alkylrest.
  • Der Begriff "Amido" ist aus der Technik als Amino-substituierte Carbonylgruppe bekannt und umfasst eine Einheit, die durch die allgemeine Formel:
    Figure 00310002
    dargestellt werden kann, wobei R9, R10 wie vorstehend definiert sind. Bevorzugte Ausführungsformen des Amids schließen Imide, die instabil sein können, nicht ein.
  • Der Begriff "Aralkyl", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Alkylrest, der mit einem Arylrest substituiert ist (z.B. einem aromatischen oder heteroaromatischen Rest).
  • Der Begriff "Aryl", wie hier verwendet, umfasst 5-, 6- und 7-gliedrige aromatische Einringreste, die 0 bis 4 Heteroatome einschließen können, z.B. Benzol, Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Triazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin und Pyrimidin und dergleichen. Diejenigen Arylreste mit Heteroatomen in der Ringstruktur können auch als "Arylheterocyclen" oder "Heteroaromaten" bezeichnet werden. Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen mit solchen Substituenten substituiert sein, wie vorstehend beschrieben, beispielsweise Halogen, Azid, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Alkoxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Sulfonamido, Keton, Aldehyd, Ester, Heterocyclyl, aromatische oder heteroaromatische Reste, -CF3, -CN oder dergleichen. Der Begriff "Aryl" umfasst auch polycyclische Ringsysteme mit 2 oder mehreren cyclischen Ringen, in denen 2 oder mehrere Kohlenstoffatome 2 aneinander gebundenen Ringen (die Ringe sind "anelierte Ringe") gemeinsam angehören, wobei mindestens einer der Ringe aromatisch ist, z.B. können die anderen cyclischen Ringe Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Cycloalkinyl-, Aryl- und/oder Heterocyclylreste sein.
  • Der Begriff "Carbocyclus", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen aromatischen oder nicht aromatischen Ring, in dem jedes Atom des Rings ein Kohlenstoffatom ist.
  • Der Begriff "Carbonyl" ist aus der Technik bekannt und umfasst solche Einheiten, wie sie durch die allgemeine Formel
    Figure 00320001
    dargestellt werden können, wobei X eine Bindung ist oder ein Sauerstoff- oder Schwefelatom darstellt und R11 ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Alkenylrest, -(CH2)m-R8 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz darstellt, R'11 ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Alkenylrest oder -(CH2)m-R8 darstellt, wobei m und R8 wie vorstehend definiert sind. Wo X ein Sauerstoffatom ist und R11 oder R'11 kein Wasserstoffatom ist, stellt die Formel einen "Ester" dar. Wo X ein Sauerstoffatom ist und R11 wie vorstehend definiert ist, wird die Einheit hier als Carboxylgruppe bezeichnet, und insbesondere wo R11 ein Wasserstoffatom ist, stellt die Formel eine "Carboxylsäure" dar. Wo X ein Sauerstoffatom ist und R'11 ein Wasserstoffatom ist, stellt die Formel ein "Formiat" dar. Im Allgemeinen stellt, wo das Sauerstoffatom der obigen Formel durch ein Schwefelatom ersetzt ist, die Formel eine "Thiocarbonyl"-Gruppe dar. Wo X ein Schwefelatom ist und R11 oder R'11 kein Wasserstoffatom ist, stellt die Formel einen "Thioester" dar. Wo X ein Schwefelatom ist und R11 ein Wasserstoffatom ist, stellt die Formel eine "Thiocarbonsäure" dar. Wo X ein Schwefelatom ist und R'11 ein Wasserstoffatom ist, stellt die Formel ein "Thiolformiat" dar. Wo andererseits X eine Bindung ist und R11 kein Wasserstoffatom ist, stellt die obige Formel eine "Keton"-Gruppe dar. Wo X eine Bindung ist und R11 ein Wasserstoffatom ist, stellt die obige Formel eine "Aldehyd"-Gruppe dar.
  • Der Begriff "Heteroatom", wie hier verwendet, bedeutet ein Atom eines jeden Elements, das anders ist als ein Kohlenstoff- oder Wasserstoffatom. Bevorzugte Heteroatome sind Bor, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel und Selen.
  • Der Begriff "Heterocyclyl" oder "heterocyclischer Rest" bezieht sich auf 3- bis 10-gliedrige Ringstrukturen, mehr bevorzugt auf 3- bis 7-gliedrige Ringe, deren Ringstrukturen 1 bis 4 Heteroatome einschließen. Heterocyclen können auch Polycyclen sein. Heterocyclylreste umfassen beispielsweise Thiophen, Thianthren, Furan, Pyran, Isobenzofuran, Chromen, Xanthen, Phenoxathiin, Pyrrol, Imidazol, Pyrazol, Isothiazol, Isoxazol, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Pyridazin, Indolizin, Isoindol, Indol, Indazol, Purin, Chinolizin, Isochinolin, Chinolin, Phthalazin, Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Pteridin, Carbazol, Carbolin, Phenanthridin, Acridin, Pyrimidin, Phenantrolin, Phenazin, Phenarsazin, Phenothiazin, Furazan, Phenoxazin, Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Oxazol, Piperidin, Piperazin, Morpholin, Lactone, Lactame wie Azetidinone und Pyrrolidinone, Sultame, Sultone und dergleichen. Der heterocyclische Ring kann an einer oder mehreren Positionen mit solchen Substituenten, wie vorstehend beschrieben, beispielsweise Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclus, einem aromatischen oder heteroaromatischen Rest, -CF3, -CN oder dergleichen, substituiert sein.
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Nitro" -NO2; der Begriff "Halogen" bezeichnet -F, -Cl, -Br oder -I; der Begriff "Sulfhydryl" bedeutet -SH; der Begriff "Hydroxyl" bedeutet -OH; und der Begriff "Sulfonyl" bedeutet -SO2-.
  • Ein "Phosphonamidit" kann durch die allgemeine Formel
    Figure 00340001
    dargestellt werden, wobei R9 und R10 wie vorstehend definiert sind, Q2 O, S oder N darstellt und R48 einen Niederalkyl- oder einen Arylrest darstellt, Q2 O, S oder N darstellt.
  • Ein "Phosphoramidit" kann durch die allgemeine Formel
    Figure 00340002
    dargestellt werden, wobei R9 und R10 wie vorstehend definiert sind und Q2 O, S oder N darstellt.
  • Ein "Phosphoryl" kann im Allgemeinen durch die Formel
    Figure 00340003
    dargestellt werden, wobei Q1 S oder O darstellt und R46 ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl- oder einen Arylrest darstellt. Wenn zur Substitution beispielsweise eines Alkylrests verwendet, kann die Phosphorylgruppe des Phosphorylalkylrestes durch die allgemeine Formel
    Figure 00340004
    dargestellt werden, wobei Q1 S oder O darstellt und R46 jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, einen Niederalkyl- oder einen Arylrest darstellt, Q2 O, S oder N darstellt. Wenn Q1 ein S-Atom ist, ist die Phosphoryleinheit ein "Phosphorothioat".
  • Der Begriff "Polycyclyl" oder "polycyclischer Rest" bezieht sich auf 2 oder mehrere Ringe (z.B. Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Cycloalkinyl-, Aryl- und/oder Heterocyclylreste), in denen 2 oder mehrere Kohlenstoffatome zwei verknüpften Ringen, d.h. die Ringe sind "anelierte Ringe", gemeinsam angehören. Ringe, die über nicht nebeneinander liegende Atome verknüpft sind, werden als "verbrückte" Ringe bezeichnet. Die Ringe des Polycyclus können jeweils mit solchen Substituenten, wie vorstehend beschrieben, wie beispielsweise Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclylrest, einem aromatischen oder heteroaromatischen Rest, -CF3, -CN oder dergleichen substituiert sein.
  • Der Begriff "Schutzgruppe", wie hier verwendet, bedeutet temporäre Substituenten, die eine potentiell reaktive funktionelle Gruppe vor unerwünschten chemischen Umwandlungen schützt. Beispiele für solche Schutzgruppen umfassen Ester von Carbonsäuren, Silylether von Alkoholen und Acetale und Ketale von Aldehyden bzw. Ketonen. Das Gebiet der Schutzgruppenchemie wurde in einer Übersicht beschrieben (Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe; Wiley: New York, 1991).
  • Ein "Selenoalkyl" bezieht sich auf einen Alkylrest mit einer daran gebundenen substituierten Selenogruppe. Beispielhafte "Selenoether", die am Alkylrest substituiert sein können, sind aus einem von -Se-Alkyl, -Se-Alkenyl, -Se-Alkinyl und -Se-(CH2)m-R8, wobei m und R8 wie vorstehend definiert sind, ausgewählt.
  • Wie hier verwendet, soll der Begriff "substituiert" sämtliche zulässigen Substituenten von organischen Verbindungen einschließen. Im weiten Sinn umfassen die zulässigen Substituenten acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht aromatische Substituenten von organischen Verbindungen. Erläuternde Substituenten umfassen beispielsweise diejenigen, die hier zuvor beschrieben sind. Die zulässigen Substituenten können für die entsprechenden organischen Verbindungen ein oder mehrere und gleich oder verschieden sein. Für die Zwecke der Erfindung können die Heteroatome wie Stickstoff Wasserstoffsubstituenten und/oder alle zulässigen Substituenten für organische Verbindungen, die hier beschrieben sind und die die Valenzen der Heteroatome erfüllen, aufweisen. Die Erfindung soll durch die für organische Verbindungen zulässigen Substituenten keinesfalls eingeschränkt sein.
  • Selbstverständlich umfasst "Substitution" oder "substituiert mit" die inbegriffene Maßgabe, dass eine solche Substitution der zulässigen Valenz des substituierten Atoms und des Substituenten entspricht und dass die Substitution zu einer stabilen Verbindung führt, z.B. die keiner spontanen Umwandlung wie Umlagerung, Cyclisierung, Eliminierung, etc. unterliegt.
  • Der Begriff "Sulfamoyl" ist aus der Technik bekannt und umfasst eine Einheit, die durch die allgemeine Formel
    Figure 00360001
    dargestellt werden kann, wobei R9 und R10 wie vorstehend definiert sind.
  • Der Begriff "Sulfat" ist aus der Technik bekannt und umfasst eine Einheit, die durch die allgemeine Formel
    Figure 00360002
    dargestellt werden kann, wobei R41 wie vorstehend definiert ist.
  • Der Begriff "Sulfonamido" ist aus der Technik bekannt und umfasst eine Einheit, die durch die allgemeine Formel
    Figure 00360003
    dargestellt werden kann, wobei R9 und R'11 wie vorstehend definiert sind.
  • Der Begriff "Sulfonat" ist aus der Technik bekannt und umfasst eine Einheit, die durch die allgemeine Formel
    Figure 00370001
    dargestellt werden kann, wobei R41 ein Elektronenpaar, ein Wasserstoffatom, ein Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylrest ist.
  • Die Begriffe "Sulfoxido" oder "Sulfinyl", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Einheit, die durch die allgemeine Formel
    Figure 00370002
    dargestellt werden kann, wobei R44 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Heterocyclyl-, Aralkyl- oder Arylrest.
  • Analoge Substitutionen können an Alkenyl- und Alkinylresten vorgenommen werden, um beispielsweise Aminoalkenyl-, Aminoalkinyl-, Amidoalkenyl-, Amidoalkinyl-, Iminoalkenyl-, Iminoalkinyl-, Thioalkenyl-, Thioalkinyl-, Carbonyl-substituierte Alkenyl- oder Alkinylreste herzustellen.
  • Wie hier verwendet, soll die Definition eines jeden Begriffes, z.B. Alkyl, m, n, etc., wenn sie mehr als einmal in einer Struktur auftaucht, unabhängig von ihrer Definition anderswo in der gleichen Struktur sein.
  • Die Begriffe Triflyl, Tosyl, Mesyl und Nonaflyl sind aus der Technik bekannt und beziehen sich auf Trifluormethansulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, Methansulfonyl- bzw. Nonafluorbutansulfonyl-Gruppen. Die Begriffe Triflat, Tosylat, Mesylat und Nonaflat sind aus der Technik bekannt und beziehen sich auf funktionelle Trifluormethansulfonatester-, p- Toluolsulfonatester-, Methansulfonatester- und Nonafluorbutansulfonatester-Gruppen bzw. Moleküle, die diese Gruppen enthalten.
  • Die Abkürzungen Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms stellen Methyl, Ethyl, Phenyl, Trifluormethansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, p-Toluolsulfonyl bzw. Methansulfonyl dar. Eine umfassendere Liste der Abkürzungen, die von organischen Chemikern verwendet wird, erscheint in der ersten Ausgabe des jeweiligen Bandes von Journal of Organic Chemistry; diese Liste ist typischerweise tabellarisch dargestellt und hat den Titel Standard List of Abbreviations. Die Abkürzungen, die in der Liste enthalten sind, und sämtliche von organischen Chemikern verwendeten Abkürzungen sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Bestimmte erfindungsgemäße Verbindungen können in speziellen geometrischen oder stereoisomeren Formen existieren. Die vorliegende Erfindung betrachtet alle derartigen Verbindungen, einschließlich der cis- und trans-Isomere, R- und S-Enantiomere, Diastereomere, (D)-Isomere, (L)-Isomere, der racemischen Gemische davon und weiterer Gemische davon, als in den Umfang der Erfindung fallend. Zusätzliche asymmetrische Kohlenstoffatome können in einem Substituenten wie einem Alkylrest vorhanden sein. Alle derartigen Isomere sowie Gemische davon sollen in der Erfindung eingeschlossen sein.
  • Wenn beispielsweise ein bestimmtes Enantiomer einer erfindungsgemäßen Verbindung gewünscht ist, kann es durch asymmetrische Synthese oder durch Derivatisierung mit einer chiralen Hilfsverbindung dargestellt werden, wobei das resultierende diastereomere Gemisch aufgetrennt und der Hilfsrest abgespalten wird, um die reinen gewünschten Enantiomere bereitzustellen. Wenn alternativ das Molekül eine basische funktionelle Gruppe wie Amino oder eine saure funktionelle Gruppe wie Carboxyl enthält, können mit einer entsprechenden optisch aktiven Säure oder Base diastereomere Salze gebildet werden und anschließend die Diastereomere, die so gebildet werden, durch fraktionierte Kristallisation oder chromatographische aus der Technik gut bekannte Mittel aufgelöst und anschließend die reinen Enantiomere gewonnen werden.
  • Die betrachteten Äquivalente der vorstehend beschriebenen Verbindungen umfassen Verbindungen, die ihnen ansonsten entsprechen und die die gleichen allgemeinen Eigenschaften davon aufweisen (z.B. die Fähigkeit, die Hedgehog-Signalisierung zu hemmen), wobei eine oder mehrere einfache Variationen der Substituenten vorgenommen werden, die die Wirksamkeit der Verbindung nicht beeinträchtigt. Im Allgemeinen können die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die in den allgemeinen Reaktionsschemata erläuterten Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise nachstehend beschrieben, oder durch Modifikationen davon unter Verwendung von leicht verfügbaren Ausgangsmaterialien, Reagentien und herkömmlichen Syntheseabläufen. Bei diesen Reaktionen ist es auch möglich, Varianten einzusetzen, die selbst bekannt sind, die allerdings hier nicht erwähnt sind.
  • Für die Zwecke der Erfindung werden die chemischen Elemente nach dem Periodensystem der Elemente, CAS-Version, Handbook of Chemistry and Physics, 67. Ausg., 1986–87, Deckelinnenseite, bezeichnet. Ebenfalls für die Zwecke der Erfindung wird davon ausgegangen, dass der Begriff "Kohlenwasserstoff" sämtliche zulässigen Verbindungen mit mindestens einem Wasserstoff- und einem Kohlenstoffatom einschließt. Im weiten Sinne umfassen die zulässigen Kohlenwasserstoffatome acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht aromatische organische Verbindungen, die substituiert oder unsubstituiert sein können.
  • III. Beispielhafte erfindungsgemäße Verbindungen
  • Wie im Weiteren nachstehend ausführlich beschrieben, wird davon ausgegangen, dass die betreffenden Verfahren unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen kleinen Molekülen durchgeführt werden können, die leicht identifiziert werden können, beispielsweise durch solche Arzneistoff-Durchmusterungstests, wie hier beschrieben. Beispielsweise umfassen die bei den betreffenden Verfahren geeigneten Verbindungen Verbindungen, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt werden können
    Figure 00400001
    Formel II wobei, sofern Valenz und Stabilität es zulassen,
    R1 und R2 unabhängig bei jedem Vorkommen H, Niederalkyl, -(CH2)n-Aryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) oder -(CH2)n-Heteroaralkyl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) bedeuten;
    L unabhängig bei jedem Vorkommen abwesend ist oder -Alkyl, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH2)nO(CH2)p, -(CH2)nNR2(CH2)p-, -(CH2)nS(CH2)p-, -(CH2)n-Alkenyl(CH2)p-, -(CH2)n-Alkinyl(CH2)p-, -O(CH2)n-, -NR2(CH2)n- oder -S(CH2)n- bedeutet;
    X aus -N(R8)-, -O-, -S-, -Se-, N=N-, -ON=CH-, -(R8)N-N(R8)-, -ON(R8)-, einem Heterocyclus oder einer direkten Bindung zwischen L und Y ausgewählt sein kann;
    Y aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR2)-, einem heteroaromatischen Rest oder einer direkten Bindung zwischen X und Z ausgewählt sein kann;
    Z aus -N(R8)-, -O-, -S-, -Se-, -N=N-, -ON=CH-, -R8N-NR8-, -ONR8-, einem Heterocyclus oder einer direkten Bindung zwischen Y und L ausgewählt sein kann;
    R8 unabhängig bei jedem Vorkommen H, Niederalkyl, -(CH2)n-Aryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert), -(CH2)n-Heteroaryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) bedeutet oder zwei
    R8 zusammengenommen einen 4-bis 8-gliedrigen Ring bilden können, z. B. mit X und Z, wobei der Ring eine oder mehrere Carbonylgruppen beinhalten kann;
    W einen substituierten oder unsubstituierten Benzo- oder Pyridoring bedeutet, der an den Pyrimidonring kondensiert ist;
    p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10 bedeutet, vorzugsweise von 0 bis 3 bedeutet; und
    n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10 bedeutet, vorzugsweise von 0 bis 5 bedeutet;
    Bei den Ausführungsformen, wobei Y1 und Z1 abwesend sind und X1 ein Pyrimidon umfasst, können die Verbindungen, die bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, durch die allgemeine Formel (II) dargestellt werden:
    Figure 00410001
    Formel II
    wobei, sofern Valenz und Stabilität es zulassen,
    R1 und R2 unabhängig bei jedem Vorkommen H, Niederalkyl, Aryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert), Aralkyl (z. B. substituiert oder unsubstituiert, z. B. -(CH2)n-Aryl) oder Heteroaryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) oder Heteroaralkyl (z. B. substituiert oder unsubstituiert, z. B. -(CH2)n-Heteroaralkyl-) bedeuten;
    L unabhängig bei jedem Vorkommen abwesend ist oder -(CH2)n-Alkyl, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH2)n-Alkenyl-, -(CH2)n-Alkinyl-, -(CH2)nO(CH2)p-, -(CH2)nNR2(CH2)p-, -(CH2)nS(CH2)p-, -(CH2)n-Alkettyl(CH2)p-, -(CH2)n-Alkinyl(CH2)p-, -O(CH2)n-, -NR2(CH2)n- oder -S(CH2)n- bedeutet, das gegebenenfalls mit einem Rest substituiert sein kann, ausgewählt aus H, substituiertem oder unsubstituiertem Niederalkyl, Alkenyl oder Alkinyl, Cycloalkylalkyl (z. B. substituiert oder unsubstituiert, z. B. -(CH2)n-Cycloalkyl) (z. B. substituiert oder unsubstituiert), Aryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert), Aralkyl (z. B. substituiert oder unsubstituiert, z. B. -(CH2)n-Aryl) oder Heteroaryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) oder Heteroaralkyl (z. B. substituiert oder unsubstituiert, z. B. -(CH2)n-Heteroaralkyl-), vorzugsweise aus H, Niederalkyl, -(CH2)n-Aryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) oder -(CH2)n-Heteroaryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert);
    X aus N(R8)-, -O-, -S-, -Se-, -N=N-, -ON=CH-, -(R8)N-N(R8)-, -ON(R8)-, einem Heterocyclus oder einer direkten Bindung zwischen L und Y ausgewählt sein kann;
    Y aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR2)-, einem heteroaromatischen Rest oder einer direkten Bindung zwischen X und Z ausgewählt sein kann;
    Z aus N(R8)-, -O-, -S-, -Se-, N=N-, -ON=CH-, -R8N-NR8-, -ONR8-, einem Heterocyclus oder einer direkten Bindung zwischen Y und L ausgewählt sein kann;
    R8 unabhängig bei jedem Vorkommen H, Niederalkyl, Aryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert), Aralkyl (z. B. substituiert oder unsubstituiert, z. B. -(CH2)n-Aryl) oder Heteroaryl (z. B. substituiert oder unsubstituiert) oder Heteroaralkyl (z. B. substituiert oder unsubstituiert, z. B. -(CH2)n-Heteroaralkyl-) bedeutet oder zwei R8 zusammengenommen einen 4-bis 8-gliedrigen Ring bilden können, z. B. mit X und Z, wobei der Ring ein oder mehrere Carbonylgruppen beinhalten kann;
    W einen substituierten oder unsubstituierten Benzo- oder Pyridoring bedeutet, der an den Pyrimidonring kondensiert ist;
    p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10 bedeutet, vorzugsweise von 0 bis 3 bedeutet; und
    n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10 bedeutet, vorzugsweise von 0 bis 5 bedeutet.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen stellt R1 einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylrest, z.B. einen Phenylring, einen Pyridinring etc., dar. Bei bestimmten Ausführungsformen, wobei LR1 einen substituierten Aryl- oder Heteroarylrest darstellt, ist R1 vorzugsweise nicht mit einer Isopropoxy (Me2CHO-)-Gruppe substituiert. Bei bestimmten Ausführungsformen, wobei -LR1 einen substituierten Aryl- oder Heteroarylrest darstellt, ist R1 vorzugsweise nicht mit einer Ethergruppe substituiert. Bei bestimmten Ausführungsformen sind die Substituenten an R1 (z.B. außer Wasserstoff) ausgewählt aus Halogen, Cyano, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyl, (unverzweigtem Alkyl-O-), Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Amino, Imino, Amido, Phosphoryl, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Carboxamid, Anhydrid, Silyl, Thioether, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Sulfoxid, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R8. Bei bestimmten Ausführungsformen sind die Nichtwasserstoff-Substituenten ausgewählt aus Halogen, Cyano, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Nitro, Thiol, Imino, Amino, Carbonyl, Carboxyl, Anhydrid, Thioether, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Keton, Aldehyd und Ester. Bei bestimmten Ausführungsformen sind die Nichtwasserstoff-Substituenten ausgewählt aus Halogen, Cyano, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Nitro, Amido, Carboxyl, Anhydrid, Alkylsulfonyl, Keton, Aldehyd und Ester.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann X aus -N(R8)-, -O-, -S-, einer direkten Bindung und einem Heterocyclus ausgewählt sein, Y kann aus -C(=O)-, -C(=S)- und -S(O2)-ausgewählt sein und Z kann aus -N(R8)-, -O-, -S-, einer direkten Bindung und einem Heterocyclus ausgewählt sein. Bei bestimmten solchen Ausführungsformen ist mindestens eines von Z und X anwesend.
  • Bei bestimmten verwandten Ausführungsformen stellen X-Y-Z zusammengenommen einen Harnstoff (NC(O)N) oder ein Amid (NC(O) oder C(O)N) dar.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen ist W ein substituierter oder unsubstituierter Benzolring.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen stellt X einen Diazacarbocyclus wie ein Piperazin, z.B. substituiert oder unsubstituiert, dar.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann X aus -N(R8)-, -O-, -S- einer direkten Bindung ausgewählt sein, Y kann aus -C(=O)-, -C(=S)- und -S(O2)- ausgewählt sein und Z kann aus -N(R8)-, -O-, -S- und einer direkten Bindung ausgewählt sein, derart, dass mindestens eines von X und Z anwesend ist.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen stellt R8 H, Niederalkyl, Aralkyl, Heteroaralkyl, Aryl oder Heteroaryl, z.B. H oder Niederalkyl, dar.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen stellt X -NH- dar.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen stellt -L-X- -(unverzweigtes Niederalkyl)-NH-, z.B. -CH2-NH-, -CH2CH2-NH-, etc. dar.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen können die betreffenden Antagonisten auf der Grundlage ihrer Selektivität für den Hedgehog-Weg ausgewählt werden. Die Selektivität kann für den Hedgehog-Weg gegenüber anderen Wegen oder für die Selektivität zwischen bestimmten Hedgehog-Wegen, z.B. Ptc-1, Ptc-2 etc., gelten.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen hemmen die betreffenden Inhibitoren die Hedgehog-vermittelte Signaltransduktion mit einer ED50 von 1 mM oder weniger, mehr bevorzugt von 1 μM oder weniger und noch mehr bevorzugt von 1 nM oder weniger.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen wird das kleine Molekül zur Verwendung gewählt, da es für eine Patched-Isoform gegenüber der nächsten selektiver ist, z.B. 10-fach und mehr bevorzugt mindestens 100- oder sogar 1000-fach selektiver für einen Patched-Weg (Ptc-1, Ptc-2) gegenüber dem anderen.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen wird eine Verbindung, die ein Antagonist des Hedgehog-Weges ist, zur selektiven Antagonisierung der Hedgehog-Aktivität gegenüber Proteinkinasen, die anders sind als PKA, wie PKC, gewählt, z.B. moduliert die Verbindung die Aktivität des Hedgehog-Weges mindestens um eine Größenordnung stärker als sie die Aktivität einer anderen Proteinkinase moduliert, vorzugsweise um mindestens zwei Größenordnungen stärker, noch mehr bevorzugt um mindestens drei Größenordnungen stärker. Somit kann beispielsweise ein bevorzugter Inhibitor des Hedgehog-Weges die Hedgehog-Aktivität mit einer Ki hemmen, die um mindestens eine Größenordnung geringer ist als seine Ki für die Hemmung von PKC, vorzugsweise um mindestens zwei Größenordnungen geringer, noch mehr bevorzugt um mindestens drei Größenordnungen geringer. Bei bestimmten Ausführungsformen ist Ki für die PKA-Hemmung geringer als 10 nM, vorzugsweise geringer als 1 nM, noch mehr bevorzugt geringer als 0,1 nM.
  • Synthese der betreffenden Verbindungen Bei bestimmten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Techniken und Wege zur Synthese der betreffenden Verbindungen, wie durch die Formeln I–VIII beschrieben.
  • Beispielsweise betrifft die vorliegende Erfindung bei bestimmten Ausführungsformen ein Verfahren zur Herstellung einer betreffenden Verbindung, wie in Schema I ausgeführt. Schema I
    Figure 00460001
    wobei Schritt (A) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel X, wobei W einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring wie einen Benzolring mit einer Aminogruppe und einer Carbonsäuregruppe in benachbarten (ortho-) Positionen darstellt, mit einem Acylierungsmittel der Formel R10CH2C(=O)X', wobei R10 unabhängig für jedes Vorkommen substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Aralkyl oder Heteroaralkyl darstellt und X' ein Halogen oder -OC(=O)CH2R10 darstellt, unter Bedingungen, die eine Verbindung mit einer Struktur der Formel XI erzeugen, umfasst;
    Schritt (B) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XI mit einem Amin der Formel R1LNH2, wobei R1 und L wie vorstehend definiert sind, unter Bedingungen, die eine Verbindung der Struktur der Formel XII ergeben, umfasst;
    Schritt (C) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XII mit einem Halogenierungsmittel wie Chlor, Brom, Iod, N-Bromsuccinimid, N-Chlorsuccinimid, N-Iodsuccinimid, ClBr, IBr, ClI oder einem Reagens, das ein Halogenradikal (wie Cl; Br; oder I) erzeugt, unter Bedingungen, die eine Verbindung mit einer Struktur der Formel XIII ergeben, wobei Y' ein Halogen wie Cl, Br oder I darstellt, umfasst;
    Schritt (D) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIII mit einem Amin der Formel H2NR12, wobei R12 einen Niederalkylrest oder eine Silylgruppe wie einen Trialkylsilyl-, Triarylsilyl-, Dialkylarylsilyl- oder einen Diarylalkylsilylrest darstellt, unter Bedingungen, die eine Verbindung mit einer Struktur der Formel XIV ergeben, umfasst; und
    Schritt (E) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIV mit einer terminalen Gruppe mit einer Struktur R2V' unter Herstellung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XX, wobei R2 wie vorstehend definiert ist und V' eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus ZC(=W)Cl, ZC(=W)Br, Isocyanat, Isothiocyanat, ZC(=W)WC(=W)ZR2, ZSO2Cl, ZSO2Br, ZSOCl, ZSOBr oder eine in situ hergestellte aktivierte acylierende Einheit darstellt, umfasst.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann eine betreffende Verbindung durch Bereitstellen einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XI und Durchführung der Schritte (B) bis (E) hergestellt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann eine betreffende Verbindung durch Bereitstellen einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XII und Durchführen der Schritte (C) bis (E) hergestellt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann eine betreffende Verbindung durch Bereitstellen einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIII und Durchführen der Schritte (D) bis (E) hergestellt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann eine betreffende Verbindung durch Bereitstellen einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIV und Durchführen von Schritt (E) hergestellt werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann Schritt (A) unter Verwendung eines Anhydrids wie eines symmetrischen Anhydrids der Formel R10C(=O)OC(=O)R10 durchgeführt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann die Reaktion unter Verwendung des Anhydrids als Lösungsmittel durchgeführt werden, z.B. ist das Reaktionsgemisch im Wesentlichen frei von einem Lösungsmittel, das anders ist als das Anhydrid. Bei bestimmten Ausführungsformen ist R10 für beide Vorkommen ein Niederalkylrest.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann Schritt (B) durch Behandeln einer Verbindung der Formel XI mit einem Amin in einem nicht-polaren Lösungsmittel wie Chloroform, Methylenchlorid, Ethylenchlorid, Toluol, Benzol, Ether, Tetrahydrofuran oder einem anderen nicht polaren Lösungsmittel oder einer Kombination davon und anschließendes Behandeln des Produkts dieser Reaktion mit einer ionischen Base wie einem Alkalimetallhydroxid oder einem -alkoxid wie Methoxid, Ethoxid, etc. in einem polaren Lösungsmittel wie einem alkoholischen Lösungsmittel, z.B. Methanol, Ethanol, Propanol, Ethylen, Glycol, Propylenglycol, Glycerin etc., hergestellt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen können die Bedingungen das Erhitzen des Reaktionsgemisches über Raumtemperatur, z.B. auf mindestens 50 °C oder mindestens 75 °C oder auch auf mindestens 100 °C, einschließen. Bei bestimmten Ausführungsformen kann dieser Schritt eine Verbindung der Formel X in eine Verbindung der Formel XI mit mindestens etwa 80 % Ausbeute oder mindestens etwa 85 % Ausbeute umwandeln.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann Schritt (C) unter Verwendung eines Halogens als Halogenierungsmittel und in einem Reaktionsgemisch, einschließlich einer Carbonsäure wie Essigsäure oder Propionsäure, durchgeführt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann dem Reaktionsgemisch eine milde Base wie ein Carbonsäuresalz zugesetzt werden, oder sie kann darin anwesend sein.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann Schritt (D) unter Verwendung eines polaren Lösungsmittels wie Wasser, Ethanol, Methanol, Ethylenglycol DMF oder eines anderen polaren Lösungsmittels oder jeder Kombination von polaren Lösungsmitteln durchgeführt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst das Lösungsmittel oder das Lösungsmittelgemisch weniger als etwa 50 % Wasser oder ist nicht wässrig, d.h. es ist im Wesentlichen frei von Wasser. Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst das polare Lösungsmittel einen Alkohol wie Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, t-Butanol, sec-Butanol, Ethylenglycol und 1,3-Propandiol.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann Schritt (E) durch Erzeugen eines Acylierungsmittels in situ, beispielsweise durch Umsetzung einer Carbonsäure mit einem Aktivierungsmittel wie Carbodiimid (z.B. Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethylcarbodiimid, etc.), Reagentien auf Phosphorbasis (wie BOP-Cl, PyBROP, etc.), Oxalylchlorid, Phosgen, Triphosgen oder jedem anderen Reagens, das mit einer Carbonsäuregruppe reagiert, wobei sich eine reaktive Zwischenstufe mit einer erhöhten Empfindlichkeit, relativ zu der Carbonsäure, gegenüber der Kupplung mit einem Amin ergibt, durchgeführt werden. Eine breite Vielzahl von solchen Reagentien ist aus der organischen Synthesetechnik, insbesondere der Peptidkupplung, gut bekannt. Gleichermaßen kann ein primäres Amin mit einem Phosgenäquivalent wie Carbonyldiimidazol, Phosgen, Triphosgen, Diphosgen, etc. oder einem Thiophosgenäquivalent wie Thiophosgen, Thiocarbonyldiimidazol etc. unter Erzeugung eines Acylierungsmittels (z.B. Isocyanat, Isothiocyanat, Chlorformamid oder Chlorthioformamid), das mit einem Amin unter Bildung eines Harnstoffs oder Thioharnstoffs ohne die Notwendigkeit der Isolierung oder Reinigung des Acylierungsmittels zu reagieren in der Lage ist, behandelt werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer betreffenden Verbindung, wie in Schema II ausgeführt
    Figure 00490001
    wobei Schritt (A) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XV, wobei P' H oder eine Schutzgruppe darstellt, W einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylring wie einen Benzolring mit einer Aminogruppe und einer Carbonsäure- oder Estergruppe in nebeneinander liegenden (ortho-) Positionen darstellt, mit einem Acylierungsmittel der Formel PXLC(=O)X', wobei X und L wie vorstehend definiert sind, P eine Schutzgruppe darstellt und X' ein Halogen, -OC(=O)LXP oder eine funktionelle Gruppe darstellt, die durch Umsetzung einer Carboxylgruppe mit einem Aktivierungsmittel wie Carbodiimid (z.B. Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid, etc.), Reagentien auf Phosphorbasis (wie BOP-Cl, PyBROP, etc.), Oxalylchlorid, Phosgen, Triphosgen, Carbonyldiimidazol oder einem anderen Reagens, das mit einer Carbonsäuregruppe reagiert und eine reaktive Zwischenstufe mit einer erhöhten Empfindlichkeit, relativ zu der Carbonsäure, gegenüber der Kupplung mit einem Amin ergibt, unter Bedingungen, die eine Verbindung mit einer Struktur der Formel XVI erzeugen, umfasst;
    Schritt (B), falls notwendig, die Schutzgruppenentfernung von dem Ester einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XVI unter Herstellung einer Carbonsäure mit einer Struktur der Formel XVII umfasst;
    Schritt (C) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XVII mit einem Amin der Formel R1LNH2, wobei R1 und L wie vorstehend definiert sind, unter Bedingungen, die eine Verbindung mit einer Struktur der Formel XVIII ergeben, umfasst;
    Schritt (D) die Entfernung der Schutzgruppe P von einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XVIII unter Erzeugung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIX umfasst;
    Schritt (E) die Umsetzung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIX mit einer terminalen Gruppe mit einer Struktur R2Y' unter Herstellung einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XXI, wobei R2 wie vorstehend definiert ist und Y' eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus ZC(=W)Cl, ZC(=W)Br, Isocyanat, Isothiocyanat, ZC(=W)WC(=W)ZR2, ZSO2Cl, ZSO2Br, ZSOCl, ZSOBr oder eine in situ hergestellte aktive acylierende Einheit darstellt, umfasst.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann eine betreffende Verbindung durch Bereitstellen einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XVI und Durchführung der Schritte (B) bis (E) hergestellt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann eine betreffende Verbindung durch Bereitstellen einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XVII und Durchführen der Schritte (C) bis (E) hergestellt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann eine betreffende Verbindung durch Bereitstellen einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XVIII und Durchführen der Schritte (D) bis (E) hergestellt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann eine betreffende Verbindung durch Bereitstellen einer Verbindung mit einer Struktur der Formel XIX und Durchführen von Schritt (E) hergestellt werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann Schritt (B) durch Behandeln einer Verbindung der Formel XVI mit einer Säure in Gegenwart von Wasser oder mit einer Hydroxidbase (z.B. zur Hydrolyse oder Verseifung eines Esters), durch Hydrogenolyse (z.B. zur Entfernung von Benzyl- oder Allylestern), in Gegenwart einer milden Base (z.B. zur Entfernung eines Fluorenylmethylesters), durch Zugabe einer Lewis-Säure (z.B. zur Entfernung eines Methoxymethylesters), in Gegenwart eines Fluoridions (z.B. zur Entfernung eines 2-Silylethylesters) oder jedes anderen geeigneten Mittels durchgeführt werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann Schritt (C) durch Aktivieren der Carboxylgruppe der Verbindung der Formel XVII mit einem Aktivierungsmittel wie Carbodiimid (z.B. Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid, etc.), Reagentien auf Phosphorbasis (wie BOP-Cl, PyBROP, etc.), Oxalylchlorid, Phosgen, Triphosgen, Carbonyldiimidazol oder jedem anderen Reagens, das mit einer Carbonsäuregruppe reagiert und zu einer reaktiven Zwischenstufe mit erhöhter Empfindlichkeit, relativ zu der Carbonsäure, gegenüber der Kupplung mit einem Amin führt, durchgeführt werden. Eine breite Vielzahl solcher Reagentien ist aus der organischen Synthesetechnik, insbesondere der Peptidkupplung, gut bekannt. Bei bestimmten Ausführungsformen können die Bedingungen das Erhitzen des Reaktionsgemisches über Raumtemperatur, z.B. auf mindestens 50 °C oder auf mindestens 75 °C oder sogar auf mindestens 100 °C, einschließen.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann Schritt (D) durch Hydrogenolyse (z.B. zur Entfernung einer Alloc- oder CBz-Gruppe) unter Verwendung einer Base oder eines Hydridreagens (z.B. zur Entfernung einer Trifluoracetylgruppe), durch Verwenden einer Säure wie Trifluoressigsäure (z.B. zur Entfernung einer BOC-Gruppe) oder durch jedes andere beliebige Mittel, das zur Entfernung von Schutzgruppen von dem Amin geeignet ist, durchgeführt werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann Schritt (E) durch Erzeugen eines Acylierungsmittels in situ, beispielsweise durch Umsetzen einer Carbonsäure mit einem Aktivierungsmittel wie Carbodiimid (z.B. Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid, etc.), Reagentien auf Phosphorbasis (wie BOP-Cl, PyBROP, etc.), Oxalylchlorid, Phosgen, Triphosgen oder jedem anderen Reagens, das mit einer Carbonsäuregruppe reagiert und eine reaktive Zwischenstufe mit erhöhter Empfindlichkeit, relativ zu der Carbonsäure, gegenüber der Kupplung mit einem Amin ergibt, durchgeführt werden. Eine breite Vielzahl von solchen Reagentien ist aus der organischen Synthesetechnik, insbesondere der Peptidkupplung, gut bekannt. Gleichermaßen kann ein primäres Amin mit einem Phosgenäquivalent wie Carbonyldiimidazol, Phosgen, Triphosgen, Diphosgen etc. oder einem Thiophosgen-Äquivalent wie Thiophosgen, Thiocarbonyldiimidazol etc. zur Erzeugung eines Acylierungsmittels (z.B. einem Isocyanat, Isothiocyanat, Chlorformamid oder Chlorthioformamid), das in der Lage ist, mit einem Amin unter Bildung eines Harnstoffs oder eines Thioharnstoffs zu reagieren, ohne notwendige Isolierung oder Reinigung des Acylierungsmittels behandelt werden.
  • IV. Beispielhafte Anwendungen des Verfahrens und der Zusammensetzungen
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modulierung eines differenzierten Zustands, des Überlebens und/oder der Proliferation einer Zelle mit einem Hedgehog-gain-of-function-Phänotypus durch Zusammenbringen der Zellen mit einem Hedgehog-Antagonisten nach dem betreffenden Verfahren und wie es die Umstände garantieren können.
  • Bei der Erfindung wird beispielsweise davon ausgegangen, dass im Lichte der Feststellungen einer scheinbar breiten Beteiligung von Hedgehog, Ptc und Smoothened an der Bildung der geordneten räumlichen Anordnungen von differenzierten Geweben in Vertebraten das betreffende Verfahren als Teil eines Verfahrens zur Erzeugung und/oder Aufrechterhaltung einer Anordnung von verschiedenem Vertebratengewebe sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden könnte. Der Hedgehog-Antagonist kann, gleich ob bezüglich Proliferation oder Differenzierung eines gegebenen Gewebes induktiv oder induktionshemmend ist, gegebenenfalls eine der vorstehend beschriebenen Präparationen sein.
  • Beispielsweise ist das vorliegende Verfahren auf Zellkulturtechniken anwendbar, wobei die Zellen, gleich ob aus genetischen oder biochemischen Gründen, einen Hedgehog-gain-of-function-Phänotypus aufweisen. In vitro hat es sich erwiesen, dass neuronale Kultursysteme fundamentale und unerlässliche Werkzeuge zum Studium der neuralen Entwicklung sowie zur Identifizierung von neurotropen Faktoren wie Nervenwachstumsfaktor (NGF), ziliare trophische Faktoren (CNTF) und der aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktor (BDNF) sind. Eine Anwendung des vorliegenden Verfahrens kann in Kulturen von neuronalen Stammzellen sein, wie bei der Verwendung von solchen Kulturen zur Erzeugung neuer Neuronen und Glia-Zellen. Bei solchen Ausführungsformen des betreffenden Verfahrens können die kultivierten Zellen mit einem erfindungsgemäßen Hedgehog-Antagonisten kontaktiert werden, um die Proliferationsrate der neuronalen Stammzellen in der Kultur und/oder die Differenzierungsrate zu ändern oder die Integrität einer Kultur bestimmter terminal differenzierter Nervenzellen aufrechtzuerhalten. Bei einer beispielhaften Ausführungsform kann das betreffende Verfahren zur Kultivierung beispielsweise von sensorischen Neuronen oder alternativ von Motoneuronen verwendet werden. Solche neuronalen Kulturen können als zweckmäßige Testsysteme sowie als Quellen von implantierbaren Zellen für therapeutische Behandlungen eingesetzt werden.
  • Erfindungsgemäß können große Anzahlen von nicht tumorigenen neuronalen Vorläuferzellen in vitro aufrechterhalten werden, und ihre Proliferierungs- und/oder Differenzierungsrate kann durch Kontakt mit den erfindungsgemäßen Hedgehog-Antagonisten beeinflusst werden. Im Allgemeinen wird ein Verfahren bereit gestellt, das die Schritte der Isolierung von neuronalen Vorläuferzellen aus einem Tier, Aufrechterhaltung dieser Zellen in vitro oder in vivo, vorzugsweise in Gegenwart von Wachstumsfaktoren, und Regulierung der Differenzierung dieser Zellen zu bestimmten neuralen Phänotypen, z.B. Neuronen und Glia-Zellen, durch Kontakt der Zellen mit einem Hedgehog-Antagonisten umfasst.
  • Von den Vorläuferzellen wird angenommen, dass sie unter einem tonischen inhibitorischen Einfluss stehen, der die Vorläufer in einem supprimierten Zustand hält, bis ihre Differenzierung erforderlich ist. Allerdings wurden neuere Techniken bereitgestellt, durch die sich diese Zellen proliferieren lassen, und im Gegensatz zu Neuronen, die terminal differenziert und darum nicht teilbar sind, können sie in unbegrenzter Anzahl produziert werden und sind zur Transplantation in heterologe und autologe Wirte mit neurodegenerativen Krankheiten äußerst geeignet.
  • "Vorläufer" bedeutet eine oligo- oder multipotente Stammzelle, die in der Lage ist, sich grenzenlos zu teilen und unter speziellen Bedingungen Tochterzellen produzieren kann, die sich terminal differenzieren, wie in Neuronen und Glia. Die Zellen können zur Transplantation in einen heterologen oder autologen Wirt verwendet werden. Heterolog bedeutet ein Wirt, der anders ist als das Tier, aus dem die Vorläuferzellen ursprünglich stammten. Autolog bedeutet der identische Wirt, aus dem die Zellen ursprünglich stammten.
  • Die Zellen können aus embryonalem, postnatalem, juvenilem oder adultem Nervengewebe aus jedem beliebigen Tier erhalten werden. Jedes beliebige Tier bedeutet jedes beliebige mehrzellige Tier, das Nervengewebe enthält. Insbesondere ist ein Fisch, Reptil, Vogel, Amphibium oder ein Säuger und dergleichen gemeint. Die besonders bevorzugten Spender sind Säuger, insbesondere Mäuse und Menschen.
  • Im Falle eines heterologen Spendertiers kann das Tier euthanisiert und das Gehirn und spezielle Bereiche von Interesse unter Verwendung eines sterilen Vorgangs entfernt werden. Die Hirnbereiche von besonderem Interesse umfassen jeden Bereich, aus dem die Vorläuferzellen erhalten werden können, die dazu dienen, die Funktion einem degenerierten Bereich des Wirtsgehirns zurückzubringen. Diese Regionen umfassen Bereiche des Zentralnervensystems (ZNS), einschließlich von Hirnrinde, Cerebellum, Mittelhirn, Hirnstamm, Rückenmark und ventrikulärem Gewebe, und Bereiche des peripheren Nervensystems (PNS), einschließlich Karotidkörper und Nebennierenmark. Insbesondere umfassen diese Bereiche Regionen in den Basalganglien, vorzugsweise das Striatum, das aus Caudatum und Putamen besteht, oder verschiedene Zellgruppen wie Globus pallidus, subthalamischer Nucleus, Nucleus basalis, von dem festgestellt wurde, dass er in Patienten mit Alzheimer Krankheit degeneriert ist, oder Substantia nigra pars compacta, von der festgestellt wurde, dass sie in Patienten mit Parkinson-Krankheit degeneriert ist.
  • Menschliche heterologe neurale Vorläuferzellen können aus fetalem Gewebe, das aus einem Wahl-Abortus erhalten wurde, oder aus einem postnatalen, juvenilen oder adulten Organspender stammen. Autologes Nervengewebe kann aus einer Biopsie oder aus Patienten stammen, die sich einer Nervenoperation, wobei Nervengewebe entfernt wird, insbesondere einer Epilepsieoperation und insbesondere temporalen Lobektomien und Hippokampus-Ektomien unterziehen.
  • Die Zellen können aus dem Spendergewebe durch Dissoziation der einzelnen Zellen aus der verbindenden extrazellulären Matrix des Gewebes erhalten werden. Die Dissoziation kann unter Verwendung eines bekannten Verfahrens, einschließlich Behandlung mit Enzymen wie Trypsin, Collagenase und dergleichen, oder unter Verwendung physikalischer Dissoziationsverfahren, wie mit einem stumpfen Instrument oder durch Zerkleinern mit einem Skalpell, um das Auswachsen spezifischer Zelltypen aus einem Gewebe zu ermöglichen, erhalten werden. Die Dissoziation von fetalen Zellen kann in einem Gewebekulturmedium durchgeführt werden, während ein bevorzugtes Medium zur Dissoziation von juvenilen und adulten Zellen künstliche Rückenmarkflüssigkeit (aCSF) ist. Reguläre aCSF enthält 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 und 10 mM D-Glucose. Ca2+-arme aCSF enthält die gleichen Bestandteile außer MgCl2 in einer Konzentration von 3,2 mM und CaCl2 in einer Konzentration von 0,1 mM.
  • Die dissoziierten Zellen können in jedes bekannte Kulturmedium eingebracht werden, das in der Lage ist, das Zellwachstum zu unterstützen, einschließlich MEM, DMEM, RPMI, F-12 und dergleichen, das Anreicherungen enthält, die für den Zellmetabolismus erforderlich sind, wie Glutamin und andere Aminosäuren, Vitamine, Mineralien und geeignete Proteine wie Transferrin und dergleichen. Das Medium kann auch Antibiotika zur Verhinderung einer Verunreinigung mit Hefe, Bakterien und Pilzen enthalten, wie Penicillin, Streptomycin, Gentamicin und dergleichen. In einigen Fällen kann das Medium Serum aus Rindern, Pferden, Hühnern und dergleichen enthalten. Ein besonders bevorzugtes Medium für Zellen ist ein Gemisch von DMEM und F-12.
  • Die Kulturbedingungen sollten den physiologischen Bedingungen nahe kommen. Der pH-Wert der Kulturmedien sollte nahe am physiologischen pH liegen, vorzugsweise zwischen pH 6 bis 8, mehr bevorzugt nahe an pH 7 liegen, insbesondere etwa pH 7,4 betragen. Die Zellen sollten bei einer Temperatur in der Nähe der physiologischen Temperatur, vorzugsweise zwischen 30 bis 40 °C, mehr bevorzugt zwischen 32 bis 38 °C und besonders bevorzugt zwischen 35 bis 37 °C kultiviert werden.
  • Die Zellen können in Suspension oder auf einem festen Substrat gezüchtet werden, allerdings erfolgt die Proliferation der Vorläufer vorzugsweise in Suspension, um große Anzahlen von Zellen durch die Bildung von "Nervenkügelchen" (siehe beispielsweise Reynolds et al. (1992) Science 255:1070–1709; und PCT-Veröffentlichungen WO 93/01275, WO 94/09119, WO 94/10292 und WO 94/16718) zu erzeugen. Im Falle einer Vermehrung (oder Spaltung) der Suspensionszellen werden die Kolben gut geschüttelt und man läßt die Nervenkügelchen in der Bodenecke des Kolbens absetzen. Sodann werden die Kügelchen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert. Das Medium wird abgesaugt, die Zellen in einer kleinen Menge Medium mit Wachstumsfaktor resuspendiert, und die Zellen werden mechanisch dissoziiert und in getrennten Medium-Aliquoten resuspendiert.
  • Die Zellsuspensionen werden in dem Kulturmedium mit einem Wachstumsfaktor angereichert, der die Proliferation der Vorläuferzellen ermöglicht und in ein Aufnahmegefäß ausgesät, das in der Lage ist, die Zellen, wie vorstehend ausgeführt, aufrecht zu erhalten, vorzugsweise in Kultur- oder Rollflaschen. Die Zellen proliferieren typischerweise innerhalb von 3 bis 4 Tagen in einem 37-°C-Inkubator, und die Proliferation kann zu jeder beliebigen Zeit danach durch Dissoziation der Zellen und Resuspendieren in frischem Medium, das Wachstumsfaktoren enthält, reinitiiert werden.
  • In Abwesenheit von Substrat heben sich die Zellen vom Boden der Flasche ab und proliferieren weiterhin in Suspension und bilden eine hohle Kugel von undifferenzierten Zellen. Nach etwa 3 bis 10 Tagen in vitro werden die proliferierenden Cluster (Nervenkügelchen) alle 2 bis 7 Tage, insbesondere alle 2 bis 4 Tage, durch vorsichtiges Zentrifugieren und Resuspendieren in einem Medium, das Wachstumsfaktor enthält, gefüttert.
  • Nach 6 bis 7 Tagen in vitro können die einzelnen Zellen in den Nervenkügelchen durch physikalische Dissoziation der Nervenkügelchen mit einem stumpfen Instrument, insbesondere durch Verreiben der Nervenkügelchen mit einer Pipette, getrennt werden. Einzelne Zellen aus den dissoziierten Nervenkügelchen werden in Kulturmedium, das Wachstumsfaktoren enthält, suspendiert, und die Differenzierung der Zellen kann in Kultur durch Plattieren (oder Resuspendieren) der Zellen in Gegenwart eines Hedgehog-Antagonisten kontrolliert werden.
  • Um die weiteren Anwendungen der betreffenden Hedgehog-Antagonisten weiter zu erläutern, wird angemerkt, dass das intrazerebrale Transplantieren als zusätzlicher Weg von Zentralnervensystem-Therapien entstanden ist. Beispielsweise umfasst ein Weg der Wiederherstellung von beschädigten Hirngeweben die Transplantation von Zellen aus fetalen oder neonatalen Tieren in das Erwachsenengehirn (Dunnett et al. /1987) J Exp Biol 123:265–289; und Freund et al. (1985) J Neurosci 5:603–616). Fetale Neuronen aus einer Vielzahl von Gehirnregionen können erfolgreich in das erwachsene Gehirn eingepflanzt werden, und solche Transplantate können Verhaltensfehler lindern. Beispielsweise kann eine Bewegungsstörung, die durch Läsionen der dopaminergen Projektionen zu den Basalganglien ausgelöst wurde, durch Transplantate von embryonalen dopaminergen Neuronen verhindert werden. Komplexe kognitive Funktionen, die nach Läsionen des Neokortex beeinträchtigt sind, können durch Transplantate von embryonalen kortikalen Zellen ebenfalls teilweise wiederhergestellt werden. Das betreffende Verfahren kann zur Regulierung des Wachstumszustands in Kultur verwendet werden, oder wo fetales Gewebe, insbesondere neuronale Stammzellen, verwendet wird, kann es zur Regulierung der Differenzierungsrate der Stammzellen eingesetzt wird.
  • Stammzellen, die bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind allgemein bekannt. Beispielsweise wurden bereits neuronale Crista-Zellen identifiziert, von denen einige multipotent sind und wahrscheinlich nicht determinierte neuronale Crista-Zellen darstellen und andere nur einen Zelltyp wie sensorische Neuronen erzeugen können und wahrscheinlich determinierte Vorläuferzellen darstellen. Die Rolle der Hedgehog-Antagonisten, die bei dem vorliegenden Verfahren eingesetzt werden, um solche Stammzellen zu kultivieren, kann darin bestehen, die Differenzierung des nicht determinierten Vorläufers zu regulieren oder die weitere Restriktion des Entwicklungsschicksals einer determinierten Vorläuferzelle zu einer terminal differenzierten Nervenzelle zu werden, zu regulieren. Beispielsweise kann das vorliegende Verfahren in vitro verwendet werden, um die Differenzierung neuronaler Crista-Zellen zu Glia-Zellen, Schwann-Zellen, Chromaffin-Zellen, cholinergen sympathischen oder parasympathischen Neuronen sowie peptidergen und serotonergen Neuronen zu regulieren. Die Hedgehog-Antagonisten können allein verwendet werden, oder sie können in Kombination mit anderen neurotrophen Faktoren verwendet werden, deren Wirkung in der besonderen Verstärkung eines bestimmten Differenzierungsschicksals der neuronalen Vorläuferzellen besteht.
  • Zusätzlich zu der Implantation von Zellen, die in Gegenwart der betreffenden Hedgehog-Antagonisten kultiviert worden sind, betrifft noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die therapeutische Anwendung eines Hedgehog-Antagonisten zur Regulierung des Wachstumszustands von Neuronen und anderen Nervenzellen sowohl im Zentralnervensystem als auch im peripheren Nervensystem. Die Fähigkeit von Ptc, Hedgehog und Smoothened zur Regulierung der neuronalen Differenzierung während der Entwicklung des Nervensystems und auch vermutlich im erwachsenen Zustand belegt, dass die betreffenden Hedgehog-Antagonisten in bestimmten Fällen erwartungsgemäß die Kontrolle von adulten Neuronen bezüglich Aufrechterhaltung, funktioneller Leistung und Alterung von normalen Zellen; Reparatur- und Regenerierungsverfahren in chemisch oder mechanisch verletzten Zellen; und Behandlung der Degeneration in bestimmten pathologischen Zuständen ermöglichen. Im Lichte dieses Verständnisses betrachtet die vorliegende Erfindung insbesondere die Anwendungen des betreffenden Verfahrens auf das Behandlungsprotokoll (Prävention und/oder Linderung der Schwere) von neurologischen Zuständen auf Grund von: (i) akuter, subakuter oder chronischer Verletzung des Nervensystems, einschließlich traumatischer Verletzung, chemischer Verletzung, vaskulärer Verletzung und von Defiziten (wie Ischämie auf Grund von Schlaganfall), zusammen mit einer infektiösen/entzündlichen und tumorinduzierten Verletzung; (ii) Alterung des Nervensystems, einschließlich von Alzheimer Krankheit; (iii) chronischen neurodegenerativen Krankheiten des Nervensystems, einschließlich von Parkinson- Krankheit, Huntington chorea, amylotrophischer Lateralsklerose und dergleichen sowie spinozerebellärer Degenerationen; und (iv) chronischen immunologischen Krankheiten des Nervensystems oder die das Nervensystem befallen, einschließlich multipler Sklerose.
  • Gegebenenfalls kann das betreffende Verfahren auch bei der Erzeugung von Nervenprothesen zur Reparatur eines zentralen und peripheren Nervenschadens verwendet werden. Insbesondere wo ein gequetschtes oder beschädigtes Axon durch Verwendung einer prothetischen Vorrichtung intubiert wird, können der prothetischen Vorrichtung Hedgehog-Antagonisten zugefügt werden, um die Wachstumsgeschwindigkeit und Regenerierungsgeschwindigkeit der dendritischen Prozesse zu regulieren. Beispielhafte Nervenleitungskanäle sind in den US-Patentschriften 5 092 871 und 4 955 892 beschrieben.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform kann das betreffende Verfahren bei der Behandlung von neoplastischen oder hyperplastischen Transformationen verwendet werden, wie sie im Zentralnervensystem vorkommen können. Beispielsweise können die Hedgehog-Antagonisten verwendet werden, um solche transformierten Zellen dazu zu veranlassen, entweder postmitotisch oder apoptotisch zu werden. Die vorliegende Erfindung kann darum als Teil einer Behandlung für z.B. maligne Gliome, Meningiome, Medulloblastome, neuroektodermale Tumore und Ependymome verwendet werden.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das betreffende Verfahren als Teil eines Behandlungsplans für das maligne Medulloblastom und für andere maligne neuroektodermale primäre ZNS-Tumore verwendet werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen wird das betreffende Verfahren als Teil eines Behandlungsprogramms für Medulloblastom verwendet. Das Medulloblastom, ein primärer Gehirntumor, ist der häufigste Gehirntumor bei Kindern. Ein Medulloblastom ist ein primitiver neuroektodermaler Tumor, der in der Fossa posterior entsteht. Sie machen etwa 25 % aller pädiatrischen Gehirntumore aus (Miller). Histologisch sind sie kleine runde Zelltumore, die üblicherweise in echten Rosetten angeordnet sind, können allerdings eine gewisse Differenzierung zu Astrocyten, Ependymalzellen oder Neuronen zeigen (Rorke; Kleihues). PNETs können in anderen Bereichen des Gehirns entstehen, einschließlich Zirbeldrüse (Pineoblastom) und Cerebrum. Diejenigen, die in der supratentorialen Region entstehen, verhalten sich in der Regel schlechter als ihre PF-Gegenstücke.
  • Medulloblastom/PNETs treten bekanntlich irgendwo im ZNS nach einer Resektion auf und können auch zum Knochen metastasieren. Die Vorbehandlungsbewertung sollte darum eine Untersuchung des Rückenmarks einschließen, um die Möglichkeit von "gestreuten ("dropped") Metastasen" auszuschließen. Gadolinium-verstärkte MRI hat zum großen Teil die Myelographie für diesen Zweck ersetzt, und eine CSF-Cytologie wird postoperativ als Routineverfahren erhalten.
  • Bei anderen Ausführungsformen wird das betreffende Verfahren als Teil des Behandlungsprogramms für Ependymome verwendet. Ependymome machen etwa 10 % der pädiatrischen Gehirntumore bei Kindern aus. Es handelt sich im Großen und Ganzen um Tumore, die aus der ependymalen Auskleidung der Ventrikel entstehen und mikroskopisch Rosetten, Kanäle und perivaskuläre Rosetten bilden. In der CHOP-Serie von 51 Kindern, bei denen Ependymome beschrieben wurden, waren 3/4 histologisch gutartig. Etwa 2/3 entstanden aus der Region des 4. Ventrikels. 1/3 zeigte sich in der supratentorialen Region. Das Alter bei der Präsentation weist ein Maximum zwischen der Geburt und dem 4. Lebensjahr auf, wie durch die SEER-Daten sowie die Daten aus CHOP gezeigt. Das mittlere Alter beträgt etwa 5 Jahre. Da so viele Kinder mit dieser Krankheit Säuglinge sind, erfordern sie oft eine multimodale Therapie.
  • Wieder eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Feststellung aus der Technik, dass Ptc, Hedgehog und/oder Smoothened an morphogenen Signalen beteiligt sind, die zusätzlich zu der neuronalen Differenzierung, wie vorstehend beschrieben, an anderen organogenen Wegen der Vertebraten beteiligt sind und bei einer anderen endodermalen Musterung sowie sowohl bei mesodermalen als auch endodermalen Differenzierungsprozessen offensichtliche Rollen spielen. Somit wird bei der Erfindung erwogen, dass die Zusammensetzungen, die Hedgehog-Antagonisten umfassen, sowohl für Zellkulturen als auch therapeutische Verfahren verwendet werden können, die die Generierung und Aufrechterhaltung von nicht-Nervengewebe umfassen.
  • Bei einer Ausführungsform macht die vorliegende Erfindung von der Entdeckung Gebrauch, dass Ptc, Hedgehog und Smoothened offensichtlich an der Kontrolle der Entwicklung von Stammellen beteiligt sind, die für die Bildung von Verdauungstrakt, Leber, Lungen und weiteren Organen verantwortlich sind, die dem primitiven Darm entstammen. Shh dient als induktives Signal aus dem Endoderm zum Mesoderm, das für die Darm-Morphogenese kritisch ist. Darum können beispielsweise die Hedgehog-Antagonisten des vorliegenden Verfahrens zur Regulierung der Entwicklung und Aufrechterhaltung einer künstlichen Leber eingesetzt werden, die die vielfältigen Stoffwechselfunktionen einer normalen Leber aufweisen kann. Bei einer beispielhaften Ausführungsform kann das betreffende Verfahren zur Regulierung der Proliferation und Differenzierung der Verdauungskanal-Stammzellen unter Bildung von Hepatocyten-Kulturen verwendet werden, die zur Besiedlung extrazellulärer Matrices verwendet werden können oder die zur Bildung sowohl einer implantierbaren als auch extrakorporalen künstlichen Leber in biokompatible Polymere eingekapselt werden können.
  • Bei einer anderen Ausführungsform können die therapeutischen Zusammensetzungen von Hedgehog-Antagonisten in Verbindung mit einer Transplantation von solchen künstlichen Lebern sowie von embryonalen Leberstrukturen verwendet werden, um die Aufnahme der intraperitonealen Implantation, die Vaskularisierung und die in vivo-Differenzierung und Aufrechterhaltung des transplantierten Lebergewebes zu regulieren.
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform kann das betreffende Verfahren therapeutisch eingesetzt werden, um solche Organe nach einem physikalischen, chemischen oder pathologischen Angriff zu regulieren. Beispielsweise können therapeutische Zusammensetzungen, die Hedgehog-Antagonisten umfassen, bei der Leberreparatur im Anschluss an eine partielle Hepatektomie verwendet werden.
  • Die Generierung von Pankreas und Dünndarm aus dem embryonalen Darm hängt von der interzellulären Signalisierung zwischen den endodermalen und mesodermalen Zellen des Darms ab. Insbesondere wurde vorgeschlagen, dass die Differenzierung des intestinalen Mesoderms zu glatter Muskulatur von Signalen aus den benachbarten Endodermzellen abhängt. Ein Mediatorkandidat für die aus dem Endoderm stammenden Signale im embryonalen Enddarm ist Sonic Hedgehog. Siehe beispielsweise Apelqvist et al. (1997) Curr Biol 7:801-4. Das Shh-Gen wird überall im embryonalen Darm-Endoderm exprimiert, mit Ausnahme des Pankreasknospen-Endoderms, das statt dessen hohe Konzentrationen des Homöodomänen-Proteins Ipf1/Pdx1 (Insulinpromotorfaktor 1/pankreatische und duodenale Homöobox 1) exprimiert, ein essentieller Regulator der frühen Pankreasentwicklung. Apelqvist et al., supra, haben überprüft, ob die differentielle Expression von Shh im embryonalen Darmkanal die Differenzierung des umgebenden Mesoderms zu spezialisierten Mesodermderivaten von Dünndarm und Pankreas kontrolliert. Um dies zu testen, verwendeten sie den Promotor des Ipf1/Pdx2-Gens, um Shh in dem sich entwickelnden Pankreasepithel selektiv zu exprimieren. In Ipf1/Pdx1-Shh-transgenen Mäusen entwickelte sich das Pankreasmesoderm zu glatter Muskulatur und interstitialen Cajalzellen, die für den Darm charakteristisch sind, statt zu Pankreasmesenchym und Milz. Auch durchliefen Pankreasexplantate, die Shh exponiert waren, ein ähnliches Programm der interstitialen Differenzierung. Diese Ergebnisse liefern den Beweis, dass die differentielle Expression von Shh endodermalen Ursprungs das Schicksal des benachbarten Mesoderms in verschiedenen Regionen des Darmkanals kontrolliert.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird darum davon ausgegangen, dass die betreffenden Hedgehog-Antagonisten zur Kontrolle oder Regulierung der Proliferation und/oder Differenzierung von Pankreasgewebe sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden können.
  • Es existiert eine breite Vielzahl von pathologischen Zellproliferations- und Differenzierungsbedingungen, für die die erfindungsgemäßen Inhibitoren therapeutische Vorteile bereitstellen können, wobei die allgemeine Strategie beispielsweise in der Korrektur einer aberranten Insulinexpression oder Modulation der Differenzierung besteht. Allgemeiner allerdings betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Induktion und/oder Aufrechterhaltung eines differenzierten Zustands, zur Verstärkung des Überlebens und/oder Beeinflussens der Proliferation von Pankreaszellen durch Zusammenbringen der Zellen mit den betreffenden Inhibitoren. Beispielsweise wird bei der Erfindung erwogen, dass im Lichte der offensichtlichen Beteiligung von Ptc, Hedgehog und Smoothened an der Bildung von geordneten räumlichen Anordnungen der Pankreasgewebe das betreffende Verfahren als Teil einer Technik zur Generierung und/oder Aufrechterhaltung solchen Gewebes sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden könnte. Beispielsweise kann die Modulation der Funktion von Hedgehog sowohl in Zellkultur als auch bei therapeutischen Verfahren, die die Generierung und Aufrechterhaltung von Betazellen umfassen, und möglicherweise auch für nicht Pankreasgewebe verwendet werden, wie bei der Kontrolle der Entwicklung und Aufrechterhaltung von Gewebe aus dem Verdauungstrakt, aus der Milz, den Lungen, den Urogenitalorganen (z.B. Blase) und aus anderen Organen, die aus dem primitiven Darm stammen.
  • Bei einer beispielhaften Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren bei der Behandlung von hyperplastischen und neoplastischen Störungen verwendet werden, die das Pankreasgewebe beeinflussen, insbesondere diejenigen, die durch eine aberrante Proliferation von Pankreaszellen charakterisiert sind. Beispielsweise ist Bauchspeichelkrebs durch eine abnorme Proliferation von Pankreaszellen gekennzeichnet, was zu Änderungen der Insulin-sekretorischen Kapazität des Pankreas führen kann. Beispielsweise können bestimmte Pankreas-Hyperplasien wie Pankreaskarzinome auf Grund einer Dysfunktion der Betazellen oder einer verminderten Inselzellenmasse zu einer Hypoinsulinämie führen. In dem Ausmaß, in dem bei fortschreitender Krankheit eine aberrante Ptc-, Hedgehog- und Smoothened-Signalisierung belegt werden kann, können die betreffenden Inhibitoren zur Verstärkung der Regenerierung des Gewebes nach der Antitumortherapie eingesetzt werden.
  • Außerdem können Manipulationen der Hedgehog-Signalisierungseigenschaften zu verschiedenen Punkten als Teil einer Strategie zur Neuformung/Reparatur von Pankreasgewebe sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden. Bei einer Ausführungsform nutzt die vorliegende Erfindung die offensichtliche Beteiligung von Ptc-, Hedgehog- und Smoothened an der Regulierung der Entwicklung von Pankreasgewebe. Im Allgemeinen kann das betreffende Verfahren therapeutisch eingesetzt werden, um den Pankreas nach einem physikalischen, chemischen oder pathologischen Angriff zu regulieren. Bei wieder einer anderen Ausführungsform kann das betreffende Verfahren auf Zellkulturtechniken angewandt werden, und insbesondere kann es zur Verstärkung der initialen Generierung von prothetischen Pankreasgewebe-Vorrichtungen eingesetzt werden. Die Manipulation der Proliferation und Differenzierung von Pankreasgewebe beispielsweise durch eine veränderte Hedgehog-Aktivität kann ein Mittel zur sorgfältigeren Kontrolle der Merkmale eines kultivierten Gewebes bereitstellen. Bei einer beispielhaften Ausführungsform kann das betreffende Verfahren zur Steigerung der Produktion von Prothesevorrichtungen verwendet werden, die Beta-Inselzellen erfordern, wie sie bei den Einkapselungsvorrichtungen verwendet werden, die beispielsweise in der U.S.-Patentschrift Nr. 4 892 538 von Aebischer et al., der U.S.-Patentschrift Nr. 5 106 627 von Aebischer et al., der U.S.-Patentschrift Nr. 4 391 909 von Lim und der U.S.-Patentschrift Nr. 4 353 888 von Sefton beschrieben sind. Die frühen Vorläuferzellen der Pankreas-Inselzellen haben ein vielfältiges Potential, und anscheinend koaktivieren sie sämtliche Inselzellen-spezifischen Gene von dem Zeitpunkt an, an dem sie zum ersten Mal auftreten. Bei fortschreitender Entwicklung wird die Expression von Inselzellen-spezifischen Hormonen wie Insulin auf das Muster der Expression beschränkt, das für reife Inselzellen charakteristisch ist. Der Phänotypus von reifen Inselzellen ist allerdings in Kultur nicht stabil, da ein Wiederauftreten von embryonalen Zügen in reifen Betazellen festgestellt werden kann. Unter Verwendung der betreffenden Hedgehog-Antagonisten kann der Differenzierungsweg oder der Proliferationsindex der Zellen reguliert werden.
  • Außerdem kann eine Manipulation des Differenzierungszustands des Pankreasgewebes in Verbindung mit einer Transplantation von künstlichem Pankreas verwendet werden, so dass die Implantation, Vaskularisation und in vivo-Differenzierung und -Aufrechterhaltung des transplantierten Gewebes gefördert wird. Beispielsweise kann die Manipulation der Hedgehog-Funktion zur Beeinflussung der Gewebsdifferenzierung als Mittel der Aufrechterhaltung der Transplantat-Überlebensfähigkeit eingesetzt werden.
  • Bellusci et al. (1997) Development 124:53 berichten, dass Sonic Hedgehog die Lungenmesenchymzellenproliferation in vivo reguliert. Demnach kann das vorliegende Verfahren zur Regulierung der Regenerierung von Lungengewebe, z.B. bei der Behandlung des Emphysems, eingesetzt werden.
  • Fujita et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 238:658 berichteten, dass Sonic Hedgehog im menschlichen Lungen-Plattenepithelkarzinom- und in Adenokarzinomzellen exprimiert wird. Die Expression von Sonic Hedgehog wurde auch in menschlichen Lungen-Plattenepithelkarzinomgeweben, allerdings nicht im gesunden Lungengewebe des gleichen Patienten nachgewiesen. Sie stellten auch fest, dass Sonic Hedgehog den Einbau von BrdU in die Karzinomzellen stimuliert und ihr Zellwachstum stimuliert, während anti-Shh-N ihr Zellwachstum hemmte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein Ptc, Hedgehog und Smoothened am Zellwachstum eines solchen transformierten Lungengewebes beteiligt ist, und belegt darum, dass das betreffende Verfahren als Teil einer Behandlung von Lungenkarzinom und Adenokarzinomen und anderen proliferativen Störungen, die das Lungenepithel einbeziehen, verwendet werden kann.
  • Viele andere Tumore können, auf der Grundlage des Nachweises wie eine Beteiligung des Hedgehog-Weges an diesen Tumoren oder eine nachgewiesene Expression von Hedgehog oder seinem Rezeptor in diesen Geweben während der Entwicklung von der Behandlung mit den betreffenden Verbindungen beeinflusst werden. Solche Tumore umfassen, sind jedoch keinesfalls beschränkt auf, Tumore, die mit dem Gorlin-Syndrom verwandt sind (z.B. Medulloblastom, Meningiom usw.), in pct-knock out-Mäusen nachgewiesene Tumore (z.B. Hämangiom, Rhabdomyosarkom usw.), aus gli-1-Amplifikation resultierende Tumore (z.B. Glioblastom, Sarkom usw.), mit TRC8, einemptc-Homolog, verbundene Tumore (z.B. Nierenkarzinom, Schilddrüsenkarzinom usw.), Ext-1-verwandte Tumore (z.B. Knochenkrebs etc.), Shh-induzierte Tumore (z.B. Lungenkrebs, Chondrosarkome etc.) und andere Tumore (z. B. Brustkrebs, Urogenitalkrebs (z.B. Niere, Blase, Harnleiter, Prostata etc.), Nebennierenkrebs, Gastrointestinalkrebs (z.B. Magen, Darm usw.), etc.).
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Zusammensetzungen, die Hedgehog-Antagonisten umfassen, bei der in vitro-Generierung von Skelettgewebe wie aus skelettogenen Stammzellen sowie bei der in vivo-Behandlung von Skelettgewebemängeln verwendet werden. Die vorliegende Erfindung erwägt insbesondere die Verwendung der Hedgehog-Antagonisten zur Regulierung der Geschwindigkeit der Chondrogenese und/oder Osteogenese. "Skelettgewebemängel" bedeutet einen Mangel im Knochen oder in einem anderen Skelettbindegewebe an einer beliebigen Stelle, an der die Wiederherstellung des Knochens oder des Bindegewebes gewünscht ist, ohne Rücksicht auf die Ursache des Mangels, z.B. ob als Ergebnis von operativem Eingriff, Tumorentfernung, Ulzeration, Implantation, Fraktur oder anderen traumatischen oder degenerativen Zuständen.
  • Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren als Teil eines Behandlungsplans zur Wiederherstellung der Knorpelfunktion zu Bindegewebe verwendet werden. Solche Verfahren sind beispielsweise bei der Reparatur von Defekten oder Läsionen im Knorpelgewebe geeignet, die das Ergebnis eines degenerativen Verschleißes wie desjenigen, der zu Arthritis führt, sowie anderer mechanischer Störungen, die durch ein Trauma des Gewebes wie Dislokation von gerissenem Meniskusgewebe, Meniskektomie, Luxation eines Gelenks auf Grund eines gerissenen Bands, Malignität der Gelenke, Knochenfraktur oder durch eine erbliche Krankheit verursacht werden können, sind. Das vorliegende Reparaturverfahren ist auch zur Remodellierung von Knorpelmatrix wie bei einer plastischen oder rekonstruktiven Operation sowie bei einer Periodontaloperation geeignet. Das vorliegende Verfahren kann auch zur Verbesserung eines bisherigen Reparaturverfahrens eingesetzt werden, beispielsweise nach einer operativen Reparatur eines Meniskus, eines Bandes oder eines Knorpels. Außerdem kann es bei rechtzeitiger Anwendung nach dem Trauma eine einsetzende Exazerbation der degenerativen Erkrankung verhindern.
  • Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das betreffende Verfahren die Behandlung des betroffenen Bindegewebes mit einer therapeutisch ausreichenden Menge eines Hedgehog-Antagonisten, insbesondere eines Antagonisten, der gegenüber der Indian Hedgehog-Signaltransduktion selektiv ist, um eine Knorpelreparaturreaktion in dem Bindegewebe durch Handhabung der Geschwindigkeit der Differenzierung und/oder Proliferation der in das Gewebe eingebetteten Chondrocyten zu regulieren. Solche Bindegewebe wie artikulärer Knorpel, interartikulärer Knorpel (Menisci), kostaler Knorpel (verbindet die echten Rippen und das Sternum), Bänder und Sehnen, sprechen auf die Behandlung bei der rekonstruktiven und/oder regenerativen Therapie unter Anwendung des betreffenden Verfahrens besonders an. Wie hier verwendet, umfassen die regenerativen Therapien die Behandlung von degenerativen Zuständen, die bis zu dem Punkt fortgeschritten sind, an dem die Störung des Gewebes offensichtlich manifest ist, sowie präventive Behandlungen des Gewebes, wobei die Degeneration sich in ihren frühesten Stadien befindet oder imminent ist.
  • Bei einer erläuternden Ausführungsform kann das betreffende Verfahren als Teil einer therapeutischen Intervention bei der Behandlung des Knorpels eines echten Gelenkes wie ein Knie, ein Fußknöchel, ein Ellbogen, eine Hüfte, ein Handgelenk, ein Finger- oder Zehenknöchel oder ein temporo-mandibuläres Gelenk eingesetzt werden. Die Behandlung kann auf den Meniskus des Gelenks, auf den Gelenkknorpel des Gelenkes oder auf beides ausgerichtet sein. Zur weiteren Erläuterung kann das betreffende Verfahren zur Behandlung einer degenerativen Störung eines Knies eingesetzt werden, wie sie das Ergebnis einer traumatischen Verletzung (z.B. einer Sportverletzung oder eines übermäßigen Verschleisses) oder von Osteoarthritis sein könnte. Die betreffenden Antagonisten können als Injektion in das Gelenk mit beispielsweise einer arthroskopischen Nadel verabreicht werden. In einigen Fällen kann das injizierte Mittel in Form eines Hydrogels oder eines anderen langsam freisetzenden Vehikels, das vorstehend beschrieben ist, vorliegen, um einen noch längeren und regelmäßigen Kontakt des Mittels mit dem behandelten Gewebe zu ermöglichen.
  • Weiterhin erwägt die vorliegende Erfindung die Verwendung des betreffenden Verfahrens auf dem Gebiet der Knorpeltransplantations- und Prothesenvorrichtungstherapie. Es treten allerdings Probleme auf, da beispielsweise die Eigenschaften von Knorpel und Faserknorpel zwischen verschiedenem Gewebe wie zwischen Gelenk-, Meniskusknorpel, Bändern und Sehnen, zwischen den beiden Enden des gleichen Bandes oder der gleichen Sehne und zwischen den oberflächlichen und tiefen Teilen des Gewebes variieren. Die zonale Anordnung dieser Gewebe kann eine graduelle Änderung in den mechanischen Eigenschaften widerspiegeln, und ein Versagen tritt auf, wenn dem implantierten, unter diesen Bedingungen noch nicht differenzierten Gewebe die Fähigkeit fehlt, entsprechend zu reagieren. Wenn beispielsweise Meniskusknorpel zur Reparatur der vorderen Kreuzbänder verwendet wird, erfährt das Gewebe eine Metaplasie zu reinem Fasergewebe. Durch Regulierung der Chondrogeneserate kann das betreffende Verfahren insbesondere zur Behandlung dieses Problems durch Unterstützung einer adaptiven Kontrolle der implantierten Zellen in der neuen Umgebung und wirksamen Angleichung der hypertrophen Chondrocyten eines früheren Entwicklungsstadiums des Gewebes verwendet werden.
  • Gleichermaßen kann das betreffende Verfahren zur Verbesserung sowohl der Herstellung von Knorpelprothesevorrichtungen als auch ihrer Implantation angewandt werden. Der Bedarf an einer verbesserten Behandlung hat die Forschung motiviert, die darauf ausgerichtet war, neues Knorpelgewebe auf der Basis von Collagen-Glycosaminoglycan-Matritzen (Stone et al. (1990) Clin Orthop Relat Red 252:129), isolierten Chondrocyten (Grande et al. (1989) J Orthop Res 7:208; und Takigawa et al. (1987) Bone Miner 2:449) und Chondrocyten, die an natürliche oder synthetische Polymere angeheftet sind (Walitani et al. (1989) J Bone Jt Surg 71B:74; Vacanti et al. (1991) Plast Reconstr Surg 88:753; von Schroeder et al. (1991) J Biomed Mater Res 25:329; Freed et al. (1993) J Biomed Mater Res 27:11; und U.S.-Patentschrift Nr. 5 041 138 von Vacanti et al.), zu erzeugen. Beispielsweise können Chondrocyten in Kultur auf biologisch abbaubaren biokompatiblen hoch porösen Gerüsten gezüchtet werden, die aus Polymeren wie Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Agarosegel oder anderen Polymeren, die mit der Zeit als Funktion der Hydrolyse des Polymergerüstes zu ungefährlichen Monomeren zerfallen, gebildet sind. Die Matrizen sind so ausgelegt, dass ein angemessener Nährstoff- und Gasaustausch zu den Zellen möglich ist, bis die Transplantation erfolgt. Die Zellen können in vitro kultiviert werden, bis sich ein angemessenes Zellvolumen und eine angemessene Zelldichte für die zu implantierenden Zellen entwickelt haben. Ein Vorteil der Matrizen besteht darin, dass sie in eine gewünschte Form auf einer individuellen Grundlage gegossen oder geformt werden können, so dass das Endprodukt sehr stark dem eigenen Ohr des Patienten oder der eigenen Nase des Patienten (zum Beispiel) gleicht, oder es können biegsame Matrices eingesetzt werden, die die Manipulation zum Zeitpunkt der Implantation, wie in ein Gelenk, möglich macht.
  • Bei einer Ausführungsform des betreffenden Verfahrens werden die Implantate mit einem Hedgehog-Antagonisten während bestimmter Stadien des Kultivierungsprozesses zusammengebracht, um die Differenzierungsgeschwindigkeit der Chondrocyten und die Bildung von hypertrophen Chondrocyten in der Kultur zu handhaben.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform wird die implantierte Vorrichtung mit einem Hedgehog-Antagonisten behandelt, um die implantierte Matrix aktiv zu remodellieren und um sie für ihre beabsichtigte Funktion geeigneter zu machen. Wie vorstehend bezüglich der Gewebetransplantate ausgeführt, weisen die künstlichen Transplantate den gleichen Nachteil auf, dass sie nicht in einer Anordnung übernommen werden, die mit der tatsächlichen mechanischen Umgebung, in der die Matrix implantiert ist, vergleichbar ist. Die Fähigkeit zur Regulierung der Chondrocyten in der Matrix durch das betreffende Verfahren kann es ermöglichen, dass das Implantat Merkmale erwirbt, die dem Gewebe, für dessen Ersatz es beabsichtigt ist, entsprechen.
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform wird das betreffende Verfahren verwendet, um die Fixierung von Prothesevorrichtungen zu verstärken. Zur Erläuterung kann das betreffende Verfahren bei der Implantation einer periodontalen Prothese angewandt werden, wobei die Behandlung des umgebenden Bindegewebes die Bildung des Periodontiums über der Prothese stimuliert.
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform kann das betreffende Verfahren als Teil eines Plans zur Generierung von Knochen (Osteogenese) an einer Stelle in dem Tier, in dem es an einem solchen Skelettgewebe mangelt, eingesetzt werden. Indian Hedgehog ist insbesondere mit den hypertrophen Chondrocyten assoziiert, die schließlich durch die Osteoblasten ersetzt werden. Beispielsweise kann die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Hedgehog-Antagonisten als Teil eines Verfahrens zur Regulierung der Knochenverlustrate in einem Individuum eingesetzt werden. Es können beispielsweise Präparationen eingesetzt werden, die Hedgehog-Antagonisten umfassen, beispielsweise zur Kontrolle der enchondralen Ossifikation bei der Bildung eines "Modells" für die Ossifikation.
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Hedgehog-Antagonist zur Regulierung der Spermatogenese verwendet werden. Die Hedgehog-Proteine, insbesondere Dhh, haben gezeigt, dass sie an der Differenzierung und/oder Proliferation und Aufrechterhaltung von testikulären Keimzellen beteiligt sind. Die Dhh-Expression wird in den Sertoli-Zellvorläufern kurz nach der Aktivierung von Sry (testikuläres Bestimmungsgen) gestartet und dauert in den Testes bis ins Erwachsenenalter an. Männer sind lebensfähig, allerdings auf Grund eines vollständigen Fehlens von reifem Sperma unfruchtbar. Die Untersuchung der sich entwickelnden Testes unter verschiedenen genetischen Hintergründen legt nahe, dass Dhh sowohl das frühe als auch späte Stadium der Spermatogenese reguliert. Bitgood et al. (1996) Curr Biol 6:298. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann der Hedgehog-Antagonist als Kontrazeptivum eingesetzt werden. Gleichermaßen sind die Hedgehog-Antagonisten des betreffenden Verfahrens potentiell zur Modulierung der normalen Eierstockfunktion geeignet.
  • Das betreffende Verfahren besitzt auch eine breite Anwendungsmöglichkeit bei der Behandlung oder Prophylaxe von Störungen, die das Epithelgewebe betreffen, sowie bei kosmetischen Anwendungen. Im Allgemeinen kann das Verfahren so charakterisiert werden, dass es einen Schritt der Verabreichung einer Menge eines Hedgehog-Antagonisten, die wirksam ist, um den Wachstumszustand eines behandelten Epithelgewebes zu ändern, an ein Tier einschließt. Verabreichungsweise und Dosierungsvorgaben variieren in Abhängigkeit von dem (den) zu behandelnden Epithelgewebe(n). Bevorzugt sind beispielsweise topische Formulierungen, wobei das behandelte Gewebe epidermales Gewebe wie Haut- oder Schleimhautgewebe ist.
  • Ein Verfahren, das "die Wundheilung beschleunigt", führt als Ergebnis der Behandlung zu einer schnelleren Wundheilung, als eine ähnliche Wunde in Abwesenheit der Behandlung heilt. "Beschleunigung der Wundheilung" kann auch bedeuten, dass das Verfahren die Proliferation und/oder das Wachstum von, inter alia, Keratinocyten reguliert oder dass die Wunde mit weniger Narbenbildung, weniger Wundkontraktion, weniger Collagenablagerung und mehr oberflächlicher Oberfläche abheilt. Bei bestimmten Fällen kann "Beschleunigung der Wundheilung" auch bedeuten, dass bestimmte Verfahren der Wundheilung verbesserte Erfolgsraten (z.B. die Aufnahmerate von Hauttransplantaten) bei Verwendung zusammen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aufweisen.
  • Trotz eines wesentlichen Fortschritts in den chirurgischen Rekonstruktionstechniken kann die Narbenbildung ein bedeutendes Hindernis bei der Wiedererlangung der normalen Funktion und des normalen Aussehens von geheilter Haut darstellen. Dies gilt insbesondere dann, wenn eine pathologische Narbenbildung wie Keloide oder hypertrophe Narben von Händen oder Gesicht, zu einer funktionellen Behinderung oder körperlichen Missbildung führt. In besonders schweren Fällen kann sich eine solche Narbenbildung in psychosozialer Not und in einem Leben von wirtschaftlicher Armut niederschlagen. Die Wundenreparatur umfasst die Stadien der Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung. Das Proliferationsstadium umfasst die Vervielfachung von Fibroblasten und Endothel- und Epithelzellen. Durch die Verwendung des betreffenden Verfahrens kann die Proliferationsrate der Epithelzellen in und um die Wunde kontrolliert werden, um den Verschluss der Wunde zu beschleunigen und/oder die Bildung von Narbengewebe zu minimieren.
  • Die vorliegende Behandlung kann auch als Teil eines Therapieplans zur Behandlung oraler und paraoraler Ulzera, z.B. auf Grund von Bestrahlung und/oder Chemotherapie, wirksam sein. Solche Ulzera entwickeln sich gewöhnlich innerhalb von Tagen nach der Chemotherapie oder nach einer Strahlentherapie. Die Ulzera beginnen in der Regel als kleine schmerzhafte unregelmäßig geformte Läsionen, üblicherweise bedeckt von einer zarten grauen nekrotischen Membran und umgeben von entzündlichem Gewebe. In vielen Fällen führt eine mangelnde Behandlung zur Proliferation von Gewebe um die Peripherie der Läsion auf entzündlicher Basis. Beispielsweise zeigt das Epithel an den Rändern des Ulkus in der Regel eine proliferative Aktivität, was zu einem Verlust der Kontinuität des Oberflächenepithels führt. Diese Läsionen machen den Körper auf Grund ihrer Größe und des Verlusts an Epithelintegrität für eine potentielle Sekundärinfektion anfällig. Die gewohnte Aufnahme von Nahrung und Wasser wird zu einem sehr schmerzhaften Ereignis, und wenn die Ulzera durch die Speiseröhre proliferieren, ist in der Regel eine Diarrhoe mit all ihren Komplikationsfaktoren evident. Erfindungsgemäß kann für solche Ulzera eine Behandlung, die die Anwendung eines Hedgehog-Antagonisten umfasst, die abnorme Proliferation und Differenzierung des betroffenen Epithels herabsetzen, wodurch die Minderung der Schwere der späteren Entzündungsereignisse gefördert wird.
  • Das betreffende Verfahren und die betreffenden Zusammensetzungen können auch zur Behandlung von Wunden auf Grund dermatologischer Krankheiten wie Läsionen auf Grund von Autoimmunstörungen wie Psoriasis verwendet werden. Atopische Dermititis bezieht sich auf ein Hauttrauma auf Grund von Allergien, die mit einer Immunantwort zusammenhängen, die durch Allergene wie Pollen, Lebensmittel, Ärger, Insektengifte und Pflanzentoxine verursacht wird.
  • Bei anderen Ausführungsformen können proliferationshemmende Präparationen von Hedgehog-Antagonisten zur Hemmung der Linsenepithelzellen-Proliferation verwendet werden, um die postoperativen Komplikationen einer extrakapsulären Kataraktextraktion zu verhindern. Katarakt ist eine schwer zu handhabende Augenerkrankung, und es wurden bereits verschiedene Studien zu einer Behandlung des Katarakts vorgenommen. Die Behandlung des Katarakts wird derzeit allerdings operativ vorgenommen. Die Kataraktoperation wird seit langem angewandt, und verschiedene operative Verfahren wurden überprüft. Die extrakapsuläre Linsenextraktion wurde zur Entfernung von Katarakten zum Verfahren der Wahl. Der medizinische Hauptvorteil bei dieser Technik gegenüber der intrakapsulären Extraktion besteht in einer geringeren Inzidenz eines aphakischen zystoiden makulösen Ödems und einer Netzhautablösung. Die extrakapsuläre Extraktion ist auch zur Implantation von Intraokularlinsen vom hinteren Kammertyp erforderlich, die nun in den meisten Fällen als Linsen der Wahl betrachtet werden.
  • Ein Nachteil der extrakapsulären Kataraktextraktion besteht allerdings in der hohen Inzidenz einer hinteren Linsenkapseleintrübung, oft auch Nachkatarakt genannt, die bei bis zu 50 % der Fälle innerhalb von 3 Jahren nach der Operation auftreten kann. Ein Nachkatarakt wird durch die Proliferation der äquatorialen und anterioren Kapsellinsen-Epithelzellen verursacht, die nach der extrakapsulären Linsenextraktion zurückbleiben. Die Zellen proliferieren unter Bewirkung von Sommerling-Ringen, und zusammen mit Fibroblasten, die sich ebenfalls ablagern und auf der hinteren Kapsel auftreten, verursachen sie eine Eintrübung der hinteren Kapsel, die die Sicht beeinträchtigt. Die Prävention des Nachkatarakts wäre einer Behandlung vorzuziehen. Zur Hemmung der sekundären Kataraktbildung stellt das betreffende Verfahren ein Mittel zur Hemmung der Proliferation der verbleibenden Linsenepithelzellen bereit. Beispielsweise können solche Zellen durch Instillation einer Lösung, die eine Hedgehog-Antagonisten-Präparation enthält, in die vordere Augenkammer nach der Linsenentfernung dazu gebracht werden, in Ruhe zu verharren. Außerdem kann die Lösung osmotisch ausgeglichen sein, um eine minimale wirksame Dosis bei Instillation in die vordere Augenkammer bereitzustellen, wodurch subkapsuläres Epithelwachstum mit gewisser Spezifität gehemmt wird.
  • Das betreffende Verfahren kann auch bei der Behandlung von Korneopathien angewandt werden, die durch eine korneale Epithelzellen-Proliferation gekennzeichnet sind, wie beispielsweise bei okularen Epithelstörungen wie Epithelwachstum nach unten oder Plattenzellenkarzinome der Augenoberfläche.
  • Levine et al. (1997) J Neurosci 17:6277 zeigen, dass Hedgehog-Proteine die Mitogenese und Photorezeptor-Differenzierung in der Vertebraten-Retina regulieren können und Ihh ein Kandidaten-Faktor aus dem pigmentierten Epithel zur Beschleunigung der Retinavorläufer-Proliferation und der Photorezeptor-Differenzierung ist. Gleichermaßen zeigten Jensen et al. (1997) Development 124:363, dass die Behandlung von Kulturen von perinatalen Maus-Retinazellen mit dem aminoterminalen Fragment des Sonic-Hedgehog-Proteins zu einem erhöhten Anteil der Zellen, die Bromdesoxyuridin umfassen, an der Gesamtzellanzahl und an den Stäbchen-Photorezeptoren, den amakrinen Zellen und den Müllerschen Glia-Zellen führt, was nahe legt, dass Sonic Hedgehog die Proliferation der Retinavorläuferzellen beschleunigt. Somit kann das betreffende Verfahren bei der Behandlung von proliferativen Krankheiten der Retinazellen und zur Regulierung der Photorezeptor-Differenzierung verwendet werden.
  • Wieder eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des betreffenden Verfahrens zur Kontrolle des Haarwachstums. Haar besteht im Grunde genommen aus Keratin, einem zähen und unlöslichen Protein; seine Hauptfestigkeit liegt in seiner Cystin-Disulfid-Bindung. Jedes einzelne Haar umfasst einen zylindrischen Schaft und eine Wurzel und ist in einem Follikel, einer flaschenartigen Depression in der Haut, enthalten. Der Fuß des Follikels enthält eine fingerartige Erhebung, die als Papille bezeichnet wird und die aus Bindegewebe besteht, aus dem das Haar wächst und durch das Blutgefäße die Zellen mit Nahrung versorgen. Der Schaft ist der Teil, der sich von der Hautoberfläche nach außen erstreckt, während die Wurzel als der versenkte Teil des Haares beschrieben wurde. Die Basis der Wurzel expandiert zur Haarzwiebel, die auf der Papille ruht. Die Zellen, aus denen das Haar produziert wird, wachsen in der Zwiebel des Follikels. Sie werden in Form von Fasern ausgestoßen, wenn die Zellen in dem Follikel proliferieren. Haar-"Wachstum" bezieht sich auf die Bildung und Verlängerung der Haarfaser durch die sich teilenden Zellen.
  • Wie es aus der Technik gut bekannt ist, ist der übliche Haarcyclus in drei Stadien unterteilt: anagen, katagen und telogen. Während der aktiven (anagenen) Phase teilen sich die epidermalen Stammzellen der dermalen Papille sehr schnell. Tochterzellen bewegen sich nach oben und differenzieren unter Bildung der konzentrischen Schichten des Haars selbst. Der Übergangszustand, katagen, ist durch eine nachlassende Mitose der Stammzellen in dem Follikel gekennzeichnet. Der Ruhezustand ist als telogen bekannt, wobei das Haar innerhalb der Kopfhaut für mehrere Wochen festgehalten wird, bevor ein auftauchendes neues Haar, das sich unter ihm entwickelt, den Telogenphasenschaft von seinem Follikel verdrängt. Aus diesem Modell wird deutlich, dass umso mehr Haarwachstum auftritt, je größer der Pool an sich teilenden Stammzellen ist, die zu Haarzellen differenzieren. Demnach können Verfahren zur Erhöhung oder Verminderung des Haarwachstums durch Potenzieren bzw. Hemmen der Proliferation dieser Stammzellen durchgeführt werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann das betreffende Verfahren als Weg der Verminderung des Wachstums von Menschenhaar, im Gegensatz zu seiner üblichen Entfernung durch Schneiden, Rasieren oder Depilation eingesetzt werden. Beispielsweise kann das vorliegende Verfahren bei der Behandlung der Trichose eingesetzt werden, deren Merkmal ein abnorm schnelles oder dichtes Haarwachstum ist, z.B. Hypertrichose. Bei einer beispielhaften Ausführungsform können Hedgehog-Antagonisten zur Handhabung des Hirsutismus eingesetzt werden, eine Störung die durch eine abnorme Behaarung gekennzeichnet ist. Das betreffende Verfahren kann auch ein Verfahren zur verlängerten Depilationsdauer bereitstellen.
  • Da ein Hedgehog-Antagonist auf Epithelzellen oft cytostatisch statt cytotoxisch ist, können solche Mittel ferner zum Schutz der Haarfollikelzellen vor cytotoxischen Mitteln verwendet werden, die für eine Wirksamkeit die Progression in die S-Phase des Zellzyklus erfordern, z.B. einen strahlungsinduzierten Tod. Die Behandlung durch das betreffende Verfahren kann einen Schutz bereitstellen, indem die Haarfollikelzellen dazu gebracht werden, in Ruhe zu verharren, z.B. durch Hemmung der Zellen am Eintritt in die S-Phase und dadurch Hinderung der Follikelzellen am Durchlaufen einer mitotischen Katastrophe oder von programmiertem Zelltod. Beispielsweise können Hedgehog-Antagonisten für Patienten, die eine Chemo- oder Strahlentherapie erfahren, die üblicherweise zu einem Haarverlust führt, verwendet werden. Durch die Hemmung der Zellzyklus-Progression während solcher Therapien kann die betreffende Behandlung die Haarfollikelzellen vor dem Tod schützen, der sich sonst durch die Aktivierung der Zelltodprogramme ergibt. Nach Abschluss der Therapie kann das vorliegende Verfahren auch unter gleichzeitiger Verminderung der Hemmung der Follikelzellen-Proliferation entfernt werden.
  • Das betreffende Verfahren kann auch bei der Behandlung von Folliculitis wie Folliculitis decalvans, Folliculitis ulerythematosa reticulata oder Keloid-Folliculitis verwendet werden. Beispielsweise kann eine kosmetische Präparation eines Hedgehog-Antagonisten bei der Behandlung von Pseudofolliculitis, einer chronischen Störung, die am häufigsten in der submandibulären Region des Nackens auftritt und die mit dem Rasieren zusammenhängt, deren charakteristische Läsionen erythematöse Papeln und Pusteln, in denen versenkte Haare enthalten sind, topisch angewandt werden.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das betreffende Verfahren zur Induktion von Differenzierung und/oder Hemmung der Proliferation von Gewebe epithelialen Ursprungs verwendet werden. Solche Formen dieser Moleküle können eine Grundlage für eine Differenzierungstherapie für die Behandlung von hyperplastischen und/oder neoplastischen Zuständen bereitstellen, die das Epithelgewebe einbeziehen. Beispielsweise können solche Präparationen zur Behandlung von Hautkrankheiten verwendet werden, wobei eine abnorme Proliferation oder ein Wachstum von Zellen der Haut vorliegt.
  • Beispielsweise sind die erfindungsgemäßen Arzneimittel zur Behandlung der hyperplastischen epidermalen Zustände wie Keratose sowie zur Behandlung von neoplastischen epidermalen Zuständen wie diejenigen, die durch eine hohe Proliferationsrate für verschiedene Hautkrebsarten wie beispielsweise Plattenzellkarzinom gekennzeichnet sind, ausgelegt. Das betreffende Verfahren kann auch bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, die die Haut betreffen, insbesondere dermatologischen Krankheiten, die eine morbide Proliferation und/oder Keratinisierung der Epidermis umfassen, wie beispielsweise durch Psoriasis oder atopische Dermatose verursacht, verwendet werden.
  • Viele allgemeine Krankheiten der Haut wie Psoriasis, Plattenzellenkarzinom, Keratoakanthom und aktinische Keratose sind durch lokales) abnormes) Proliferation und Wachstum gekennzeichnet. Beispielsweise proliferieren bei Psoriasis, die durch schuppige rote, erhabene Plaques auf der Haut gekennzeichnet ist, die Keratinozyten bekanntlich viel schneller als normal und differenzieren weniger vollständig.
  • Bei einer Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Präparationen zur Behandlung von dermatologischen Leiden geeignet, die mit Keratinisierungsstörungen verbunden sind, die zu einer abnormen Proliferation der Hautzellen führen, wobei die Störungen entweder durch entzündliche oder nicht entzündliche Komponenten gekennzeichnet sein können. Zur Erläuterung können therapeutische Präparationen eines Hedgehog-Antagonisten, z.B. desjenigen, der die Ruhestellung oder Differenzierung unterstützt, zur Behandlung verschiedener Formen der Psoriasis, gleich ob kutanös, mukosal oder ungual, verwendet werden. Psoriasis, wie vorstehend beschrieben, ist typischerweise durch epidermale Keratinocyten gekennzeichnet, die eine deutliche proliferative Aktivierung und Differenzierung entlang eines "regenerativen" Weges zeigen. Die Behandlung mit einer proliferationshemmenden Ausführungsform des betreffenden Verfahrens kann zur Umkehr der pathologischen epidermalen Aktivierung verwendet werden und kann eine Grundlage für die lang anhaltende Remission der Krankheit bereitstellen.
  • Eine Vielzahl von anderen keratotischen Läsionen sind ebenfalls Kandidaten zur Behandlung mit dem betreffenden Verfahren. Aktinische Keratosen sind beispielsweise oberflächliche entzündliche prämaligne Tumore, die von sonnenexponierter und bestrahlter Haut herrühren. Die Läsionen sind erythematös bis braun mit variabler Schuppung. Die derzeitigen Therapien umfassen die Exzision und Kryo-Operation. Diese Behandlungen sind jedoch schmerzhaft und führen oft zu einer kosmetisch nicht akzeptablen Narbenbildung. Demnach kann die Behandlung der Keratose wie aktinische Keratose die Anwendung, vorzugsweise topisch, einer Hedgehog-Antagonisten-Zusammensetzung in Mengen umfassen, die zur Hemmung der übermäßigen Zellwucherung der epidermalen/epidermoiden Zellen der Läsion ausreichen.
  • Akne stellt noch ein weiteres dermatologisches Leiden dar, das durch das betreffende Verfahren behandelt werden kann. Akne vulgaris ist beispielsweise eine multifaktorielle Krankheit, die sehr häufig bei Teenagern und jungen Erwachsenen auftritt und durch das Auftreten von entzündlichen und nicht entzündlichen Läsionen im Gesicht und auf dem oberen Rumpf gekennzeichnet ist. Der basale Defekt, der die Akne vulgaris entstehen lässt, ist eine Hyperkornifizierung des Duktus einer hyperaktiven Talgdrüse. Die Hyperkornifizierung blockiert die normale Mobilität der Haut- und Follikelmikroorganismen, und dadurch stimuliert sie die Freisetzung von Lipasen durch Propinobacterium acnes- und Staphylococcus epidermis-Bakterien und Pitrosporum ovale, eine Hefe. Die Behandlung mit einem proliferationshemmenden Hedgehog-Antagonisten, insbesondere topischen Präparationen, kann zur Verhinderung der vorübergehenden Merkmale der Dukti, z.B. übermäßige Verhornung, geeignet sein, die zur Läsionsbildung führt. Die betreffende Behandlung kann außerdem Antibiotika, Retinoide und Antiandrogene einschließen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung verschiedener Formen der Dermatitis bereit. Dermatitis ist ein beschreibender Begriff, der sich auf schlecht abgegrenzte Läsionen bezieht, die entweder pruritisch, erythematös, schuppig, blasig, nässend, rissig oder verkrustet sind. Diese Läsionen entstehen aus vielerlei Gründen. Die häufigsten Typen von Dermatitis sind atopische Dermatitis, Kontakt- und Windeldermatitis. Beispielsweise ist die seborrhöische Dermatitis eine chronische, üblicherweise pruritische Dermatitis mit Erythem, trockener, feuchter oder fettiger Schuppenbildung und gelben krustigen Flecken auf verschiedenen Bereichen, insbesondere der Kopfhaut, mit Exfoliation einer übermäßigen Menge an trockenen Schuppen. Das betreffende Verfahren kann auch bei der Behandlung von Stauungsekzem, einer oft chronischen, in der Regel ekzematösen Dermatitis, verwendet werden. Aktinische Dermatitis ist eine Dermatitis auf Grund von Exposition gegenüber aktinischer Strahlung, wie diejenige aus der Sonne, ultraviolette Strahlen oder Röntgen- oder Gammastrahlen. Erfindungsgemäß kann das betreffende Verfahren bei der Behandlung und/oder Prävention bestimmter Symptome der Dermatitis verwendet werden, die durch eine unerwünschte Proliferation von Epithelzellen hervorgerufen wird. Solche Therapien für diese verschiedenen Formen der Dermatitis können auch topische und systemische Kortikosteroide, Antipruritika und Antibiotika umfassen.
  • Die Leiden, die durch das betreffende Verfahren behandelt werden können, sind für nichtmenschliche Individuen spezifische Störungen, wie Krätze.
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform kann das betreffende Verfahren bei der Behandlung von menschlichen Krebsarten wie Tumore der Epithelgewebe wie der Haut verwendet werden. Beispielsweise können Hedgehog-Antagonisten bei den betreffenden Verfahren als Teil einer Behandlung für menschliche Karzinome, Adenokarzinome, Sarkome und dergleichen eingesetzt werden.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Arzneimittel, die Hedgehog-Antagonisten umfassen, bereit. Die Hedgehog-Antagonisten zur Verwendung bei dem betreffenden Verfahren können zweckmäßigerweise zur Verabreichung mit einem biologisch verträglichen Medium wie Wasser, gepufferter Salzlösung, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen) oder geeigneten Gemischen davon formuliert werden. Die optimale Konzentration des (der) Bestandteils(e) in dem gewählten Medium kann empirisch nach den medizinischen Chemikern gut bekannten Verfahren bestimmt werden. Wie hier verwendet, umfasst "biologisch verträgliches Medium" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien und dergleichen, die für den gewünschten Verabreichungsweg des Arzneimittels geeignet sein können. Die Verwendung solcher Medien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist aus der Technik bekannt. Seine Verwendung in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel wird in Erwägung gezogen, außer das konventionelle Medium oder Mittel ist mit der Aktivität des Hedgehog-Antagonisten inkompatibel. Geeignete Vehikel und ihre Formulierung, einschließlich von anderen Proteinen, sind beispielsweise in dem Buch Remingston's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985) beschrieben. Diese Vehikel umfassen injizierbare "Depotformulierungen".
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen können auch veterinärmedizinische Zusammensetzungen umfassen, z.B. Arzneimittel von Hedgehog-Antagonisten, die für den veterinärmedizinischen Gebrauch geeignet sind, z.B. zur Behandlung von Vieh oder Haustieren, z.B. Hunden.
  • Die Einbringverfahren können auch durch wiederaufladbare oder biologisch abbaubare Vorrichtungen bereitgestellt werden. Verschiedene langsam freisetzende polymere Vorrichtungen wurden bereits entwickelt und in den letzten Jahren für die kontrollierte Abgabe von Arzneistoffen einschließlich proteinartiger Biopharmazeutika in vivo getestet. Eine Vielzahl von biokompatiblen Polymeren (einschließlich Hydrogelen), einschließlich sowohl biologisch abbaubarer als auch nicht abbaubarer Polymere, können zur Bildung eines Implantats zur lang anhaltenden Freisetzung eines Hedgehog-Antagonisten an einer bestimmten Zielstelle verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Präparationen können oral, parenteral, topisch oder rektal verabreicht werden. Sie werden natürlich in Formen verabreicht, die für jeden Verabreichungsweg geeignet sind. Beispielsweise werden sie in Tabletten- oder in Kapselform, durch Injektion, Inhalation, als Augenlösung, Salbe, Zäpfchen, kontrolliert freisetzende Pflaster etc., Verabreichung durch Injektion, Infusion oder Inhalation; topisch durch Lotion oder Salbe; und rektal durch Suppositorien verabreicht. Die orale und die topische Verabreichung sind bevorzugt.
  • Die Begriffe "parenterale Verabreichung" und "parenteral verabreicht", wie hier verwendet, bedeuten Verabreichungsweisen, die anders sind als die enterale und die topische Verabreichung, in der Regel durch Injektion, und sie umfassen ohne Einschränkung intravenöse, intramuskuläre, interarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intracardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre, subkapsuläre, subarachnoide, intraspinale und intrasternale Injektionen und Infusionen.
  • Die Begriffe "systemische Verabreichung", "systemisch verabreicht", "periphere Verabreichung" und "peripher verabreicht", wie hier verwendet, bedeuten die Verabreichung einer Verbindung, eines Arzneistoffes oder eines anderen Materials, die anders ist als direkt in das Zentralnervensystem, derart, dass es in das Patienten-System eintritt und somit Gegenstand des Metabolismus und anderer gleichartiger Prozesse ist, beispielsweise die subkutane Verabreichung.
  • Die Verbindungen können an Menschen und andere Tiere zur Therapie auf jedem geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden, einschließlich oral, nasal wie beispielsweise durch ein Spray, rektal, intravaginal, parenteral, intrazisternal und topisch wie durch Puder, Salben oder Tropfen, einschließlich buccal und sublingual.
  • Ohne Rücksicht auf den gewählten Verabreichungsweg werden die erfindungsgemäßen Verbindungen, die in einer geeigneten hydratisierten Form verwendet werden können, und/oder die erfindungsgemäßen Arzneimittel zu pharmazeutisch verträglichen Dosierungsformen, wie nachstehend beschrieben, oder durch jedes andere herkömmliche aus der Fachwelt bekannte Verfahren formuliert.
  • Die tatsächlichen Dosierungsniveaus der Wirkstoffe in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln können variiert werden, so dass eine Menge des Wirkstoffs erhalten wird, die wirksam ist, um die gewünschte therapeutische Reaktion für einen bestimmten Patienten, eine gewünschte Zusammensetzung und eine gewünschte Verabreichungsweise zu erreichen, ohne für den Patienten toxisch zu sein.
  • Das gewählte Dosierungsniveau hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich von Aktivität der bestimmten erfindungsgemäßen eingesetzten Verbindung oder des Esters, Salzes oder des Amids davon, dem Verabreichungsweg, der Verabreichungszeit, Exkretionsgeschwindigkeit der bestimmten Verbindung, die eingesetzt wird, Dauer der Behandlung, anderen Arzneistoffen, Verbindungen und/oder Materialien, die in Kombination mit dem bestimmten eingesetzten Hedgehog-Antagonisten verwendet werden, Alter, Geschlecht, Gewicht, Kondition, allgemeinem Gesundheitszustand und medizinischer Vorgeschichte des Patienten, der behandelt wird, und gleichartigen aus dem medizinischen Gebiet gut bekannten Faktoren.
  • Ein Arzt oder Tierarzt kann die wirksame Menge des Arzneimittels, die erforderlich ist, leicht bestimmen und verschreiben. Beispielsweise kann der Arzt oder Tierarzt die Dosen der erfindungsgemäßen Verbindungen, die in dem Arzneimittel eingesetzt werden, bei Konzentrationen starten, die niedriger sind als diejenigen, die erforderlich sind, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, und die Dosierung stufenweise erhöhen, bis die gewünschte Wirkung erreicht ist.
  • Im Allgemeinen ist eine geeignete Tagesdosis einer erfindungsgemäßen Verbindung diejenige Menge der Verbindung mit der geringsten Dosis, die wirksam ist, um eine therapeutische Wirkung hervorzurufen. Eine solche wirksame Dosis hängt allgemein von den vorstehend beschriebenen Faktoren ab. In der Regel reichen die intravenösen, intrazerebroventrikulären und subkutanen Dosen der erfindungsgemäßen Verbindungen von etwa 0,0001 bis etwa 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag.
  • Falls gewünscht, kann die wirksame Tagesdosis der aktiven Verbindung in 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr Unterdosen verabreicht werden, die in entsprechenden Zeitintervallen während des Tages getrennt, gegebenenfalls in Einheitsdosierungsformen verabreicht werden.
  • Der Begriff "Behandlung" soll auch die Prophylaxe, Therapie und Heilung einschließen.
  • Der Patient, der diese Behandlung erhält, ist jedes bedürftige Tier, einschließlich Primaten, insbesondere Menschen, und anderen Säugern wie Pferde, Rindvieh, Schweine und Schafe und Geflügel und Haustiere allgemein.
  • Die erfindungsgemäße Verbindung kann als solche oder in Gemischen mit pharmazeutisch verträglichen und/oder sterilen Trägern verabreicht werden und kann auch in Verbindung mit anderen antimikrobiellen Mitteln wie Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglycosiden und Glycopeptiden verabreicht werden. Eine konjunktive Therapie umfasst somit eine sequentielle, simultane und separate Verabreichung der aktiven Verbindung in einer Art, dass die therapeutischen Wirkungen der am ersten verabreichten Verbindung nicht vollkommen verschwunden sind, wenn die nächste Verbindung verabreicht wird.
  • V. Arzneimittel
  • Obgleich es möglich ist, eine erfindungsgemäße Verbindung allein zu verabreichen, ist es bevorzugt, die Verbindung als pharmazeutische Formulierung (Zusammensetzung) zu verabreichen. Die erfindungsgemäßen Hedgehog-Antagonisten können zur Verabreichung auf jedem zweckmäßigen Weg zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin formuliert werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann die Verbindung, die in dem Arzneimittel eingeschlossen ist, an sich aktiv sein oder kann ein Prodrug sein, das z.B. in der Lage ist, in einem physiologischen Umfeld in eine aktive Verbindung umgewandelt zu werden.
  • Somit stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen bereit, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge von einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen Verbindungen, die zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern (Hilfsstoffen) und/oder Verdünnungsmitteln formuliert ist. Wie nachstehend ausführlich beschrieben, können die erfindungsgemäßen Arzneimittel speziell zur Verabreichung in flüssiger oder fester Form, einschließlich derjenigen, die für folgendes geeignet sind, formuliert werden: (1) orale Verabreichung, beispielsweise Getränke (wässrige oder nicht wässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, Boli, Pulver, Granulatkörner, Pasten zur Anwendung auf der Zunge; (2) parenterale Verabreichung, beispielsweise durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, wie beispielsweise eine sterile Lösung oder Suspension; (3) topische Anwendung, beispielsweise als Creme, Salbe oder Spray, das auf die Haut aufgetragen wird oder (4) intravaginal oder intrarektal, beispielsweise als Pessar, Creme oder Schaum. Bei bestimmten Ausführungsformen können die betreffenden Verbindungen allerdings einfach in sterilem Wasser gelöst oder suspendiert werden. Bei bestimmten Ausführungsformen ist das Arzneimittel nicht pyrogen, d.h. es erhöht die Körpertemperatur eines Patienten nicht.
  • Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge", wie hier verwendet, bedeutet die Menge einer Verbindung, eines Materials oder einer Zusammensetzung, die/das eine erfindungsgemäße Verbindung umfasst, die wirksam ist zur Erzeugung einer gewünschten therapeutischen Wirkung durch Aufhebung eines Hedgehog-gain-of-function-Phänotypus in mindestens einer Subpopulation von Zellen in einem Tier und dadurch Blockieren der biologischen Folgen dieses Weges in den behandelten Zellen, und zwar in einem sinnvollen Verhältnis von Vorteil zu Risiko, das auf jede medizinische Behandlung anwendbar ist.
  • Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" wird hier eingesetzt, um diejenigen Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen zu bezeichnen, die im Rahmen einer sinnvollen medizinischen Beurteilung zur Verwendung in Kontakt mit den Geweben menschlicher Wesen und von Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktion oder ohne ein anderes Problem oder eine andere Komplikation, die mit einem sinnvollen Verhältnis von Vorteil zu Risiko im Einklang stehen, geeignet sind.
  • Der Begriff "pharmazeutisch verträglicher Träger", wie hier verwendet, bedeutet ein pharmazeutisch verträgliches Material, eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung oder ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel wie eine Flüssigkeit oder ein fester Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, ein Exzipient, Lösungsmittel oder Einkapselungsmaterial, das am Tragen oder am Transport der betreffenden Antagonisten von einem Organ oder einem Teil des Körpers zu einem anderen Organ oder Teil des Körpers beteiligt ist. Jeder Träger muss in dem Sinne "verträglich" sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Patienten nicht gesundheitsschädlich ist. Einige Beispiele für Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, umfassen: (1) Zucker wie Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken wie Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Cellulose und ihre Derivate wie Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; (4) Tragantpulver; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Talk; (8) Exzipientien wie Kakaobutter und Suppositorienwachse; (9) Öle wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Färberdistelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maiskeimöl und Sojaöl; (10) Glycole wie Propylenglycol; (11) Polyole wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglycol; (12) Ester wie Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffermittel wie Magnesiumhydroxid und Alluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Salzlösung; (18) Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) Phosphatpufferlösungen; und (21) andere nicht toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden.
  • Wie vorstehend ausgeführt, können bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Hedgehog-Antagonisten eine basische funktionelle Gruppe wie Amino oder Alkylamino enthalten und sind somit in der Lage, mit pharmazeutisch verträglichen Säuren pharmazeutisch verträgliche Salze zu bilden. Der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich in dieser Hinsicht auf die relativ nicht toxischen anorganischen oder organischen Säure-Additionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen. Die Salze können in situ während der letzten Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen oder durch getrennte Umsetzung einer gereinigten erfindungsgemäßen Verbindung in ihrer freien Basenform mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und Isolieren des so gebildeten Salzes hergestellt werden. Repräsentative Salze umfassen die Hydrobromid-, Hydrochlorid-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-, Nitrat-, Acetat-, Valerat-, Oleat-, Palmitat-, Stearat-, Laurat-, Benzoat-, Lactat-, Phosphat-, Tosylat-, Citrat-, Maleat-, Fumarat-, Succinat-, Tartrat-, Naphthylat-, Mesylat-, Glucoheptonat-, Lactobionat- und Laurylsulphonat-Salze und dergleichen. (Siehe beispielsweise Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19).
  • Die pharmazeutisch verträglichen Salze der betreffenden Verbindungen umfassen die herkömmlichen nicht toxischen Salze oder die quaternären Ammoniumsalze der Verbindungen z.B. aus nicht toxischen organischen oder anorganischen Säuren. Beispielsweise umfassen solche herkömmlichen nicht toxischen Salze diejenigen, die sich von anorganischen Säuren ableiten, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Sulfaminsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen; und die Salze, die aus organischen Säuren hergestellt werden, wie Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Glycolsäure, Stearinsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Palmitinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Phenylessigsäure, Glutaminsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Sulfanilsäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Fumarsäure, Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, Oxalsäure, Isothionsäure und dergleichen.
  • In anderen Fällen können die erfindungsgemäßen Verbindungen eine oder mehrere funktionelle Säure-Gruppen enthalten und sind somit in der Lage, pharmazeutisch verträgliche Salze mit pharmazeutisch verträglichen Basen zu bilden. Der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich in diesen Fällen auf relativ nicht toxische anorganische und organische Basen-Additionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen. Ebenso können die Salze in situ während der letzten Isolierung und Reinigung der Verbindungen oder durch getrenntes Umsetzen der gereinigten Verbindung in ihrer freien Säureform mit einer geeigneten Base wie das Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines pharmazeutisch verträglichen Metallkations, mit Ammoniak oder mit einem pharmazeutisch verträglichen organischen primären, sekundären oder tertiären Amin hergestellt werden. Repräsentative Alkali- oder Erdalkalisalze umfassen die Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Aluminiumsalze und dergleichen. Repräsentative organische Amine, die zur Bildung der Basen-Additionssalze geeignet sind, umfassen Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergleichen (siehe beispielsweise Berge et al., supra).
  • Netzmittel, Emulgatoren und Gleitmittel wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat sowie Farbmittel, Trennmittel, Überzugsmittel, Süßungsmittel, Aroma- und Duftstoffe, Konservierungsstoffe und Antioxidantien können ebenfalls in den Zusammensetzungen vorhanden sein.
  • Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Antioxidantien umfassen: (1) wasserlösliche Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfat und dergleichen; (2) Öl-lösliche Antioxidantien wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, alpha-Tocopherol und dergleichen; und (3) Metall-chelatisierende Mittel wie Citronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbit, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
  • Die erfindungsgemäßen Formulierungen umfassen diejenigen, die zur oralen, nasalen, topischen (einschließlich bukkal und sublingual), rektalen, vaginalen und/oder parenteralen Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können zweckmäßigerweise in einer Einheitsdosierungsform dargereicht werden und können durch beliebige, aus dem pharmazeutischen Gebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Menge an Wirkstoff, die mit einem Trägermaterial unter Herstellung einer Einzeldosierungsform kombiniert werden kann, variiert je nach Wirt, der behandelt wird, und der bestimmten Verabreichungsweise. Die Menge des Wirkstoffs, die mit einem Trägermaterial unter Herstellung einer Einzeldosierungsform kombiniert werden kann, ist im Allgemeinen die Menge der Verbindung, die eine therapeutische Wirkung hervorruft. Im Allgemeinen reicht diese Menge, bezogen auf 100 %, von etwa 1 % bis etwa 99 % Wirkstoff, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 70 %, besonders bevorzugt von etwa 10 % bis etwa 30 %.
  • Die Verfahren zur Herstellung dieser Formulierungen oder Zusammensetzungen umfassen den Schritt des Zusammenbringens einer erfindungsgemäßen Verbindung mit dem Träger und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen. In der Regel werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und inniges Zusammenbringen einer erfindungsgemäßen Verbindung mit flüssigen Trägern oder mit fein zerteilten festen Trägern oder mit beiden und sodann, falls notwendig, Formen des Produkts hergestellt.
  • Die erfindungsgemäßen Formulierungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können in Form von Kapseln, Oblatenkapseln, Pillen, Tabletten, Lutschpastillen (unter Verwendung einer aromatisierten Grundlage, in der Regel Saccharose und Akaziengummi oder Tragant), Pulver, Granulatkörnern oder als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht wässrigen Flüssigkeit oder als Öl-in-Wasser- oder als Wasser-in-Öl-Flüssigemulsion oder als Elixier oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Grundlage wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Akaziengummi) und/oder als Mundspülungen und dergleichen, die jeweils eine festgelegte Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung als Wirkstoff enthalten, vorliegen. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann auch als Bolus, Latwerge oder Paste verabreicht werden.
  • In den festen erfindungsgemäßen Dosierungsformen zur oralen Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granulatkörner und dergleichen) wird der Wirkstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder einem der folgenden Substanzen vermischt: (1) Füllstoffe oder Streckmittel wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und/oder Kieselsäure; (2) Bindemittel wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Akaziengummi; (3) Befeuchtungsmittel wie Glycerin; (4) Zerfallshilfen wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte Silicate und Natriumcarbonat; (5) Lösungsverzögerungsmittel wie Paraffin; (6) Absorptionsbeschleuniger wie quaternäre Ammoniumverbindungen; (7) Netzmittel wie beispielsweise Cetylalkohol und Glycerinmonostearat; (8) Absorbentien wie Kaolin- und Bentonitton; (9) Gleitmittel wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglycole, Natriumlaurylsulfat und Gemische davon; und (10) Farbmittel. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Arzneimittel auch Pufferungsmittel umfassen. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in gefüllten Weich- und Hartgelatinekapseln unter Verwendung solcher Exzipientien wie Lactose oder Milchzucker sowie hochmolekulare Polyethylenglycole und dergleichen eingesetzt werden.
  • Eine Tablette kann durch Kompression oder Formen hergestellt werden, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen. Komprimierte Tabletten können auch unter Verwendung von einem Bindemittel (beispielsweise Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose), Gleitmittel, inerten Verdünnungsmittel, Konservierungsstoff, Zerfallshilfe (beispielsweise Natriumstärkeglycolat oder vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktiven Mittel oder Dispersionsmittel hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen in einer geeigneten Maschine eines Gemisches der pulverisierten, mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel befeuchteten Verbindung hergestellt werden.
  • Die Tabletten und andere feste Dosierungsformen der erfindungsgemäßen Arzneimittel wie Dragees, Kapseln, Pillen und Granulatkörner können gegebenenfalls eingekerbt oder mit Überzügen und Schalen wie magensaftresistente Überzüge und andere aus der pharmazeutischen Formulierungstechnik gut bekannte Überzüge hergestellt werden. Sie können auch formuliert werden, so dass eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs darin unter Verwendung von beispielsweise Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen zur Bereitstellung des gewünschten Freisetzungsprofils, anderen Polymermatrizen, Liposomen und/oder Mikrokügelchen bereitgestellt wird. Sie können beispielsweise auch durch Filtration über ein Bakterienrückhaltefilter oder durch Einarbeiten von Sterilisierungsmitteln in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, die in sterilem Wasser gelöst werden können, oder von einem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor der Anwendung sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können gegebenenfalls auch Trübungsmittel enthalten und können von einer Zusammensetzung sein, die den (die) Wirkstoff(e) nur oder vorzugsweise in einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltrakts gegebenenfalls verzögert freisetzen. Beispiele für Einbettungszusammensetzungen, die verwendet werden können, umfassen polymere Substanzen und Wachse. Der Wirkstoff kann auch in mikroeingekapselter Form vorliegen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben beschriebenen Exzipientien.
  • Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu dem Wirkstoff können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel enthalten, die üblicherweise in der Technik verwendet werden, wie beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, solubilisierende Mittel und Emulgatoren wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Öle (insbesondere Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Keimöl, Olivenöl, Castoröl und Sesamöl), Glycerin, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglycole und Fettsäureester von Sorbitan und Gemische davon.
  • Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Adjuvantien wie Netzmittel, Emulgatoren und Suspensionmittel, Süßstoffe, Aromastoffe, Farbmittel, Duftstoffe und Konservierungsstoffe einschließen.
  • Suspensionen können zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Suspensionmittel enthalten, wie beispielsweise ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant und Gemische davon.
  • Es ist bekannt, dass Sterine, wie Cholesterin, Komplexe mit Cyclodextrinen bilden. Somit kann der Inhibitor bei bevorzugten Ausführungsformen, wenn er ein Steroidalkaloid ist, mit Cyclodextrinen wie α-, β- und γ-Cyclodextrin, Dimethyl-β-cyclodextrin und 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin formuliert werden.
  • Die Formulierungen der erfindungsgemäßen Arneimittel zur rektalen oder vaginalen Verabreichung können als Suppositorien dargereicht werden, die durch Mischen von einer oder mehreren erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem oder mehreren geeigneten nicht reizenden Exzipientien oder Trägern, die beispielsweise Kakaobutter, Polyethylenglycol, ein Suppositorienwachs oder ein Salicylat umfassen und die bei Raumtemperatur fest, bei Körpertemperatur allerdings flüssig sind und darum im Rektum oder in der Vaginalhöhle schmelzen und den aktiven Hedgehog-Antagonisten freisetzen, hergestellt werden können.
  • Die erfindungsgemäßen Formulierungen, die zur vaginalen Verabreichung geeignet sind, umfassen auch Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprühformulierungen, die solche Träger enthalten, wie sie aus der Technik als geeignet bekannt sind.
  • Dosierungsformen zur topischen oder transdermalen Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung umfassen Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen, Pflaster und Mittel zur Inhalation. Die aktive Verbindung kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und mit beliebigen Konservierungsstoffen, Puffern oder Treibmitteln, die erforderlich sein können, vermischt werden.
  • Die Salben, Pasten, Cremen und Gele können zusätzlich zu einer erfindungsgemäßen aktiven Verbindung Exzipientien wie tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silicone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Gemische davon, enthalten.
  • Pulver und Sprays können zusätzlich zu einer erfindungsgemäßen Verbindung Exzipientien, wie Lactose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilicate und Polyamidpulver oder Gemische dieser Substanzen enthalten. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige unsubstituierte Kohlenwasserstoffe wie Butan und Propan enthalten.
  • Transdermalpflaster haben den zusätzlichen Vorteil der Bereitstellung einer kontrollierten Abgabe einer erfindungsgemäßen Verbindung an den Körper. Solche Dosierungsformen können durch Auflösen oder Dispergieren der Hedgehog-Antagonisten in dem entsprechenden Medium hergestellt werden. Absorptionsverstärker können ebenfalls zur Erhöhung des Flusses der Hedgehog-Antagonisten durch die Haut eingesetzt werden. Die Geschwindigkeit eines solchen Flusses kann entweder durch Bereitstellen einer geschwindigkeitskontrollierenden Membran oder Dispergieren der Verbindung in einer polymeren Matrix oder einem polymeren Gel kontrolliert werden.
  • Ophthalmische Formulierungen, Augensalben, -puder, -löungen und dergleichen werden ebenfalls als innerhalb des Umfangs der Erfindung betrachtet.
  • Erfindungsgemäße Arneimittel, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch verträglichen sterilen isotonischen wässrigen oder nicht wässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen oder sterile Pulver, die zu sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen unmittelbar vor Gebrauch rekonstituiert werden können, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika, gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen, oder Suspensions- oder Verdickungsmittel enthalten können.
  • Beispiele für geeignete wässrige und nicht wässrige Träger, die in den erfindungsgemäßen Arzneimittel eingesetzt werden können, umfassen Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische davon, Pflanzenöle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Eine angemessene Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung von Überzugsmaterialien wie Lecithin, durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle von Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden.
  • Die Zusammensetzungen können auch Adjuvantien wie Konservierungsstoffe, Netzmittel, Emulgatoren und Dispersionsmittel enthalten. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch den Einschluss verschiedener bakterizider und fungizider Mittel, beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen, sichergestellt werden. Es kann auch erwünscht sein, isotonische Mittel wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen in die Zusammensetzungen einzuschließen. Zusätzlich kann eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form durch den Einschluss von Mitteln, die die Absorption verzögern, wie Aluminiummonostearat und Gelatine, bewirkt werden.
  • In einigen Fällen ist es zur Verlängerung der Wirkung eines Arzneistoffes erwünscht, die Absorption des Arzneimittels aus der subkutanen oder intramuskulären Injektionslösung zu verlangsamen. Dies kann durch die Verwendung einer flüssigen Suspension aus kristallinem oder amorphem Material mit schlechter Wasserlöslichkeit erreicht werden. Die Absorptionsgeschwindigkeit des Arzneistoffes hängt dann von seiner Auflösungsgeschwindigkeit ab, die ihrerseits von der Kristallgröße und der Kristallform abhängen kann. Alternativ wird eine verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Arzneistoffform durch Auflösen oder Suspendieren des Arzneistoffes in einem Öl-Vehikel erreicht.
  • Injizierbare Depotformen werden durch Bilden von Mikroeinkapselungsmatrizen für die betreffenden Verbindungen in biologisch abbaubaren Polymeren wie Polylactid-Polyglycolid hergestellt. In Abhängigkeit von dem Verhältnis von Arzneistoff zu Polymer und der Natur des bestimmten eingesetzten Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneistofffreisetzung kontrolliert werden. Beispiele für andere biologisch abbaubare Polymere umfassen Poly(orthoester) und Poly(anhydride). Injizierbare Depotformulierungen werden auch durch Einschließen des Arzneistoffes in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit dem Körpergewebe kompatibel sind, hergestellt.
  • Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen als pharmazeutisch wirksame Verbindungen an Menschen und Tiere verabreicht werden, können sie als solche oder als Arzneimittel verabreicht werden, die beispielsweise 0,1 bis 99,5 % (mehr bevorzugt 0,5 bis 90 %) Wirkstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten.
  • Die Zugabe der erfindungsgemäßen aktiven Verbindung zum Tierfutter wird vorzugsweise durch Herstellen einer entsprechenden Fütterungsvormischung, die die aktive Verbindung in einer wirksamen Menge enthält, und Einarbeiten der Vormischung in die komplette Ration erreicht.
  • Alternativ kann ein intermediäres Konzentrat oder ein Futter-Ergänzungsmittel, das den Wirkstoff enthält, dem Futter zugemischt werden. Der Weg, auf dem solche Futtervormischungen und Komplettrationen hergestellt und verabreicht werden können, ist in Nachschlagewerken beschrieben (wie "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman und CO., San Francisco, U.S.A., 1969 oder "Livestock Feeds and Feeding" O and B Bücher, Corvallis, Ore., U.S.A., 1977).
  • VI. Syntheseschemata und Identifizierung der aktiven Antagonisten
  • Die betreffenden Steroidalkaloide und Artverwandte davon können leicht durch Einsatz der Kreuzkupplungstechnik von Suzuki, Stille und dergleichen hergestellt werden. Die Kupplungsreaktionen werden unter relativ milden Bedingungen hergestellt und tolerieren einen breiten Bereich an "Zuschauer"-Funktionalität.
  • a. Kombinationsbibliotheken
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere die Bibliotheken der Varianten mit verschiedenen repräsentativen Klassen von Substituenten, sind der kombinatorischen Chemie und anderen parallelen Syntheseschemata zugänglich (siehe beispielsweise PCT WO 94/08051). Das Ergebnis besteht darin, dass große Bibliotheken von verwandten Verbindungen, z.B. eine sehr gemischte Bibliothek von vorstehend dargestellten Verbindungen, schnell in Tests mit hohem Durchsatz durchmustert werden können, um potentielle Hedgehog-Antagonisten-Leitverbindungen zu identifizieren und um die Spezifität, Toxizität und/oder das cytotoxisch-kinetische Profil einer Leitverbindung zu verfeinern. Beispielsweise können Ptc-, Hedgehog- oder Smoothened-Bioaktivitätstests, wie sie unter Verwendung von Zellen entweder mit Ptc-loss-of-function, Hedgehog-gain-of-function oder Smoothened-gain-of-function entwickelt werden können, zur Durchmusterung einer Bibliothek der betreffenden Verbindungen auf diejenigen mit agonistischer Aktivität gegenüber Ptc oder agonistische Aktivität gegenüber Hedgehog oder Smoothened verwendet werden.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine Kombinationsbibliothek, nur zur Erläuterung, ein Gemisch von chemisch verwandten Verbindungen, die zusammen auf eine gewünschte Eigenschaft durchmustert werden können. Die Herstellung von vielen verwandten Verbindungen in einer einzigen Reaktion vermindert und vereinfacht die Anzahl der Durchmusterungsprozesse, die durchgeführt werden müssen, sehr stark. Die Durchmusterung auf die entsprechenden physikalischen Eigenschaften kann durch herkömmliche Verfahren vorgenommen werden.
  • Die Vielfalt der Bibliothek kann in einer Vielzahl von verschiedenen Niveaus erzeugt werden. Beispielsweise können die Substrat-Arylgruppen, die in den Kombinationsreaktionen verwendet werden, hinsichtlich der arylischen Kerneinheit verschieden sein, z.B. eine Änderung bezüglich der Ringstruktur, und/oder sie können bezüglich der anderen Substituenten verändert sein.
  • Der Technik steht eine Vielzahl von Verfahren zur Generierung von Kombinationsbibliotheken aus kleinen organischen Molekülen wie die betreffenden Hedgehog-Antagonisten zur Verfügung. Siehe beispielsweise Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14:83; U.S.-Patentschriften 5 359 115 und 5 362 899 von Affymax; U.S. Patentschrift 5 288 514 von Ellman; PCT-Veröffentlichung WO 94/08051 von Still et al.; U.S.-Patentschriften 5 736 412 und 5 712 171 von ArQule; Chen et al. (1994) JACS 116:2661; Kerr et al. (1993) JACS 115:252; PCT-Veröffentlichungen WO 92/10092, WO 93/09668 und WO 91/07087; und PCT-Veröffentlichung WO 93/20242 von Lerner et al.). Demnach kann eine Vielzahl von Bibliotheken in der Größenordnung von etwa 100 bis 1000000 oder mehr Diversomeren der betreffenden Hedgehog-Antagonisten synthetisiert und auf eine bestimmte Aktivität oder Eigenschaft durchmustert werden.
  • Bei einer beispielhaften Ausführungsform kann eine Bibliothek der Hedgehog-Antagonisten-Diversomerkandidaten unter Anwendung eines Schemas synthetisiert werden, das an die in der PTC-Veröffentlichung WO 94/08051 von Still et al. beschriebenen Techniken angepasst wurde, z.B. Binden an eine Polymerperle über eine hydrolysierbare oder photolysierbare Gruppe, die gegebenenfalls an einer der Positionen der Antagonistenkandidaten oder einem Substituenten einer synthetischen Zwischenstufe lokalisiert ist. Demnach wird nach der Technik von Still et al. die Bibliothek auf einer Serie von Perlen synthetisiert, wobei jede Perle eine Serie von Markierungen einschließt, die das bestimmte Diversomer auf dieser Perle identifizieren. Sodann kann die Perlenbibliothek mit Ptc-loss-of-function, Hedgehog-gain-of-function oder Smoothened-gain-of-function-Zellen, für die ein Hedgehog-Antagonist gesucht wird, "ausplattiert" werden. Die Diversomere können aus der Perle z.B. durch Hydrolyse freigesetzt werden.
  • Die Strukturen der bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Verbindungen lassen sich leicht wirksam synthetisieren. Die Natur der Strukturen, wie allgemein durch die Formeln I und II beschrieben, gestattet die Zusammenlagerung solcher Verbindungen unter Verwendung einer Kombination der X-, Y- und Z-Einheiten, wie vorstehend ausgeführt. Die X- und Z-Einheiten sind heteroatomarer Natur und gestatten somit die Bildung von diversen Bindungen an ein Kohlenstoffatom. Die Y-Einheiten nehmen, wenn sie vorhanden sind, die Form von elektrophilen Einheiten ein, wie Carbonyl- und Sulfonylgruppen, und Reagentien zum Anknüpfen solcher Einheiten an heteroatomare Gruppen wie X und Z sind leicht zugänglich. Die breite Mehrheit solcher Reaktionen, einschließlich derjenigen, die in den 11, 12, 15 und 16 abgebildet sind, ist sowohl extrem mild als auch extrem zuverlässig und ist somit für die Kombinationschemie perfekt geeignet. Die leichte Natur eines solchen Kombinationsweges zur Generierung einer Bibliothek von Testverbindungen geht aus dem beispielhaften nachstehenden Schema (P = Schutzgruppe) hervor, wobei die verschiedenen Gruppen einer Verbindung nach Formel II mit einer kombinatorischen Funktionalisierung des Kern-Ring-Systems (z.B. W) kombinatorisch verknüpft werden (z.B. unter Anwendung von einem der vorstehend beschriebenen Verfahren), was der Bibliothek eine zusätzliche Vielfalt verleiht. Eine noch größere Vielfalt kann beispielsweise unter Verwendung eines Bereichs von elektrophilen Resten beim Anhängen einer Untereinheit, d.h. unter Verwendung eines Bereichs von PO-Ar-L-C(O)Cl, PO-Ar-L-NCO, PO-Ar-L-SO2Cl, etc. beim Anhängen der Untereinheit R2, erreicht werden.
  • Figure 00940001
  • Viele Variationen von obigem und verwandten Wegen gestatten die Synthese von hochgradig diversen Bibliotheken von Verbindungen, die als Inhibitoren der Hedgehog-Funktion getestet werden können.
  • b. Durchmusterungs-Tests
  • Es existiert eine Vielzahl von Tests, die zur Bestimmung der Fähigkeit einer Verbindung zur Agonisierung der Ptc-Funktion oder zur Antagonisierung der Smoothened- oder Hedgehog-Funktion zur Verfügung stehen, wovon viele für durchsatzstarke Formate ausgelegt sein können. Bei vielen Arzneistoff-Durchmusterungsprogrammen, die Bibliotheken von Verbindungen und von natürlichen Extrakten testen, sind umsatzstarke Tests erwünscht, um die Anzahl der in einem gegebenen Zeitraum überprüften Verbindungen zu maximieren. Somit können Bibliotheken von synthetischen Produkten und Naturstoffen auf andere Verbindungen, die Hedgehog-Antagonisten sind, überprüft werden.
  • Zusätzlich zu zellfreien Tests können die Testverbindungen auch durch Tests auf Zellbasis getestet werden. Bei einer Ausführungsform können Zellen mit einem Ptc-loss-of-function-, Hedgehog-gain-of-function-, oder Smoothened-gain-of-function-Phänotypus mit einem Testreagens von Interesse kontaktiert werden, wobei das Ziel des Tests z.B. in der Hemmung oder Proliferation der Zelle in Gegenwart des Testreagens besteht.
  • Eine Anzahl von Genprodukten wurde mit der Patched-vermittelten Signaltransduktion in Zusammenhang gebracht, einschließlich Patched, der Transkriptionsfaktoren der Familie Cubitus interruptus (Ci), der Serin/Threoninkinase Fused (Fu) und den Genprodukten von Costal-2, Smoothened und Suppressor of fused.
  • Die Induktion der Zellen durch Hedgehog-Proteine setzt eine Kaskade in Bewegung, die die Aktivierung und Hemmung der stromabwärts gelegenen Effektoren umfasst, deren letztendliche Folge in einigen Fällen in einer nachweisbaren Änderung in der Transkription oder Translation eines Gens besteht. Mögliche Transkriptionsziele der Hedgehog-vermittelten Signalisierung sind das Patched-Gen (Hidalgo und Ingham, 1990 Development 110, 291–301; Marigo et al., 1996) und die Vertebraten-Homologen des Drosophila-Cubitus-interruptus-Gens, der Gli-Gene (Hui et al. (1994) Dev Biol 162:402–413). Es hat sich gezeigt, dass die Patched-Genexpression in den Zellen der Extremitätenknospen und der Neuralplatte, die auf Shh ansprechen, ausgelöst werden (Marigo et al. (1996) PNAS 93:9346-51; Marigo et al. (1996) Development 122:1225–1233). Die Gli-Gene codieren die putativen Transkriptionsfaktoren mit Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen (Orenic et al. (1990) Genes & Dev 4:1053–1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10:634–642). Die Transkription der Gli-Gene wurde als Reaktion auf Hedgehog in den Extremitätenknospen als aufwärts reguliert beschrieben, während die Transkription des Gli3-Gens als Reaktion auf die Hedgehog-Induktion abwärts reguliert wird (Marigo et al. (1996) Development 122:1225–1233). Durch die Selektion von regulatorischen Transkriptionsequenzen aus solchen Zielgenen, z.B. aus Patched- oder Gli-Genen, die für die Aufwärts- oder Abwärts-Regulierung dieser Gene als Reaktion auf die Hedgehog-Signalisierung verantwortlich sind und die solche Promotoren mit einem Reportergen funktionell verknüpfen, kann ein Test auf der Basis der Transkription hergeleitet werden, der auf die Fähigkeit einer spezifischen Testverbindung, die Hedgehog-vermittelten Signalisierungswege zu modifizieren, empfindlich ist. Somit stellt die Expression des Reportergens ein wertvolles Durchmusterungsinstrument für die Entwicklung von Verbindungen bereit, die als Antagonisten von Hedgehog wirken.
  • Die Reportergen-basierenden erfindungsgemäßen Tests messen das Endstadium der oben beschriebenen Kaskade von Ereignissen, z.B. die Transkriptionsmodulierung. Demnach wird bei der Durchführung einer Ausführungsform des Tests ein Reportergen-Konstrukt in die reagierende Zelle inseriert, um ein Nachweissignal zu generieren, das von Ptc-loss-of-function, Hedgehog-gain-of-function, Smoothened-gain-of-function oder von der Stimulierung durch SHH selbst abhängt. Die Menge der Transkription aus dem Reportergen kann unter Anwendung eines jeden, der Fachwelt als geeignet bekannten Verfahrens gemessen werden. Beispielsweise kann die mRNA-Expression aus dem Reportergen unter Verwendung von RNAse-Protektion oder RNAse-basierender PCR nachgewiesen werden, oder das Proteinprodukt des Reportergens kann durch eine charakteristische Anfärbung oder eine von Natur aus vorhandene biologische Aktivität identifiziert werden. Die Menge der Expression aus dem Reportergen wird sodann mit der Menge der Expression entweder in der gleichen Zelle in Abwesenheit der Testverbindung verglichen, oder sie kann mit der Menge der Transkription in einer im Wesentlichen identischen Zelle verglichen werden, der das Ziel-Rezeptorprotein fehlt. Jede statistisch oder anderweitig signifikante Abnahme in der Menge der Transkription zeigt an, dass die Testverbindung in irgendeiner Weise das normale Ptc-Signal agonisiert (oder das Hedgehog-gain-of-function- oder Smoothened-Signal antagonisiert) hat, z.B. ist die Testverbindung ein potentieller Hedgehog-Antagonist.
  • Beispiele
  • Die Erfindung wird nun, nachdem sie allgemein beschrieben worden ist, unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele umfassender verstanden werden, die nur zu Erläuterungszwecken bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind und die Erfindung nicht einschränken sollen.
  • Leitverbindungsentdeckung/durchsatzstarker Durchmusterungstest
  • Die zu testenden Verbindungen werden zu einer Konzentration von 10 mM in DMSO gelöst und bei –20°C gelagert. Zur Aktivierung des Hedgehog-Weges in den Testzellen wird eine octylierte (Lipid-modifizierte) Form des N-terminalen Fragments des Sonic Hedgehog-Proteins (OCT-SHH) verwendet. Dieses N-terminale SHH-Fragment wird bakteriell produziert.
  • Die Verbindungen können in dem "Gli-Luc"-Test nachstehend unter Verwendung der Zelllinie 10Z(s12), wobei die Zellen ein Hedgehog-responsives Reporterkonstrukt enthalten, unter Verwendung von Luciferase als Reportergen getestet werden. Auf diesem Weg kann die Signalisierungsaktivität des Hedgehog-Weges über die Gli-Luc-Reaktion gemessen werden.
  • 10t1/2(s12)-Zellen werden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (MTP) mit 20000 Zellen/Vertiefung in Vollmedium [DMEM mit 10 % FBS] ausplattiert. Anschließend werden die Platten zur Inkubation über Nacht (O/N) bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator verbracht. Nach 24 h wird das Medium durch Luciferase-Testmedium (DMEM mit 0,5 % FBS) ersetzt. Die Verbindungen werden aufgetaut und in Testmedium bei 3:1000 (etwa 300-fach) verdünnt, was eine Startkonzentration von etwa 30 μM ergibt.
  • Anschließend werden den ersten Vertiefungen 150 μl von jeder 30-μM-Probe (in dreifacher Ausführung) zugesetzt. Die MTP-Proben werden sodann in 3-fachen Verdünnungen auf insgesamt 7 Vertiefungen verdünnt, was schließlich für jede Verbindung zu einer Vielzahl von 7 Verdünnungen in dreifacher Ausführung führt. Als nächstes wird der Proteinligand OCT-SHH in Luciferase-Testmedium verdünnt und jeder Vertiefung in einer Endkonzentration von 0,3 μg/ml zugesetzt. Die Platten werden anschließend wieder zur weiteren Inkubation O/N bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator verbracht. Nach etwa 24 h werden die Platten aus dem Inkubator genommen, und das Medium wird abgesaugt/verworfen. Die Vertiefungen werden einmal mit Testpuffer [PBS + 1 mM Mg2+ und 1 mM Ca2+] gewaschen. Anschließend werden jeder Vertiefung 50 μl Testpuffer zugesetzt. Das Luciferase-Testreagens wird, wie vom Verkäufer (LucLite-Kit von Packard) beschrieben, hergestellt, und 50 μl werden jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platten werden bei Raumtemperatur (RT) etwa 30 min inkubiert, wonach die Signale, wiederum bei Raumtemperatur, auf einem Topcount (Packard) gelesen werden.
  • Die bei diesem Test identifizierten Verbindungen sind in 32 abgebildet. Die Entdeckung dieser SHH-induzierten Gli-Transkriptionsaktivität-Inhibitoren ist ein Beispiel für die Brauchbarkeit der Ansprüche in dieser Patentschrift. Die Aktivitäten für diese Verbindungen sind in Tabelle 1 nachstehend dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00980001
  • Zusätzliche Daten sind in 33 dargestellt. Die Maus 456 ist eine Ptc-knockout-Heterocygote, die 6 Monate lang eine UV-Bestrahlung erhielt. Die Maus entwickelte viele kleine BCC-Läsionen, die nach X-Gal-Anfärbung blau waren. Die Maus wurde getötet, und die Haut wurde mit einem 2-mm-Hautstanzgerät ausgeschnitten. Die Hautausstanzungen wurden sodann 6 Tage lang kultiviert. Im Vergleich mit Vehikel (DMSO) kann Verbindung 11 die Anzahl und Größe der BCC-Läsionen (blaue Punkte im Bild) herabsetzen. Die Wirkung war offensichtlicher, wenn dem Kulturmedium 10 μM 11 anstatt 5 μM 11 zugesetzt wurden. Kurz gesagt legt dieses Experiment nahe, dass 11 in der Lage ist, die murinen BCC-Läsionen in der Maus Nr. 456 zu hemmen.
  • Bei wieder einem anderen Experiment wurden alte E12.5-Ptc-1 (d11)-lacZ-Lungen geerntet und die transgenen Embryonen durch lacZ-Nachweis unter Verwendung der Schwänze identifiziert. Die Lungenexplantate wurden in Maus-Explantationsmedium (DMEM-Basis, Zusätze optimiert auf die Kultur der Mauslungen) 48 h eingetaucht, in lacZ-Fixativ fixiert, gespült und auf lacZ O/N bei 37 °C angefärbt. Das Kontrollgewebe war unbehandelt, während das Testgewebe mit 11 behandelt war. Die Ergebnisse sind in 34 abgebildet: (A) Unbehandelte Kontrolle. Im distalen und proximalen Mesenchym kann eine starke lacZ-Expression festgestellt werden. (B) Behandlung mit 11 führt zu einer nennenswerten Abnahme der Reportergenexpression, was insbesondere durch das schwache Signal bewiesen wird, das die distalen Verzweigungsspitzen des wachsenden Lungenepithels umgibt.
  • Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen
  • a. Erläuternde Syntheseschemata
  • Die beispielhaften Syntheseschemata zur Herstellung der Hedgehog-Antagonisten, die bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind in den 1–31 gezeigt. Die Reaktionsbedingungen in den erläuterten Schemata der 1–31 sind wie folgt:
    • 1) R1 CH2CN, NaNH2, Toluol (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
    • 2) H2SO4, H2O, Rückfluss (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
    • 3) H2SO4, EtOH, Rückfluss (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
    • 4) NaOH, EtOH, Rückfluss
    • 5) (Boc)2O, 2M NaOH, THF
    • 6) LiHDMS, R1X, THF (Merck-Patentanmeldung Nr. WO 96/06609)
    • 7) Pd-C, H2, MeOH
    • 8) t-BuONO, CuBr, HBr, H2O (J. Org. Chem. 1977, 42, 2426)
    • 9) ArB(OH)2, Pd(PPh3)4, Dioxan (J. Med. Chem. 1996, 39, 217–223)
    • 10) R12(H)C=CR13R14, Pd(OAc)2, Et3N, DMF (Org. React. 1982, 27, 345)
    • 11) Tf2O, THF (J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478–5486)
    • 12) ArSnBu3, Pd(PPh3)4, Dioxan (J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478–5486)
    • 13) KMnO4, Py, H2O (J. Med. Chem. 1996, 39, 217–223)
    • 14) NaOR1, THF
    • 15) NaSR1, THF
    • 16) HNR1R13, THF
    • 17) HONO, NaBF4 (Adv. Fluorine Chem. 1965, 4, 1–30)
    • 18) Pd(OAc)2, NaH, DPPF; PhCH3, R1OH (J. Org. Chem. 1997, 62, 5413–5418)
    • 19) i. R1X, Et3N, CH2Cl2, ii. R13X
    • 20) SOCl2, kat DMF
    • 21) CH2N2, Et2O
    • 22) Ag2O, Na2CO3, Na2S2O3, H2O (Tetrahedron Lett. 1979, 2667)
    • 23) AgO2CPh, Et3N, MeOH (Org. Syn., 1970, 50, 77; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5432)
    • 24) LiOH, THF-MeOH
    • 25) (EtO)2P(O)CH2CO2R, BuLi, THF
    • 26) MeO2CCH(Br)=P(Ph)3, Benzol
    • 27) KOH oder KOtBu
    • 28) Base, X(CH2)nCO2R
    • 29) DPPA, Et3N, Toluol (Synthesis 1985, 220)
    • 30) HONO, H2O
    • 31) SO2, CuCl, HCl, H2O (Synthesis 1969, 1–10, 6)
    • 32) Lawesson-Reagens, Toluol (Tetrahedron Asym. 1996, 7, 12, 3553)
    • 33) R2M, Lösungsmittel
    • 34) 30 % H2O2, Eisessig CH3CO2H (Helv. Chim. Acta. 1968, 349, 323)
    • 35) Triphosgen, CH2Cl2 (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
    • 36) i. (EtO)2P(O)CHLiSO2Oi-Pr, THF, ii. NaI
    • 37) Ph3PCH3I, NaCH2S(O)CH3, DMSO (Synthesis 1987, 498)
    • 38) Br2, CHCl3 oder anderes Lösungsmittel (Synthesis 1987, 498)
    • 39) BuLi, Bu3SnCl
    • 40) ClSO2OTMS, CCL4 (Chem. Ber. 1995, 128, 575–580)
    • 41) MeOH-HCl, Rückfluss
    • 42) LAH, Et2O oder LiBH4, EtOH oder BH3-THF (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
    • 43) MsCl, Et3N, CH2Cl2 (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
    • 44) Na2SO3, H2O (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
    • 45) R2R4NH, Et3N, CH2Cl2
    • 46) R2M, Lösungsmittel
    • 47) CH3NH(OCH3), EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF (Tetrahedron Lett., 1981, 22, 3815)
    • 48) MeLi, THF
    • 49) mCPBA, CH2Cl2
    • 50) HONO, Cu2O, Cu(NO3)2, H2O (J. Org. Chem. 1977, 42, 2053)
    • 51) R1M, Lösungsmittel
    • 52) HONO, NaS(S)COEt, H2O (Org. Synth. 1947, 27, 81)
    • 53) HSR2 oder HSR4, CH2Cl2
    • 54) i-BuOC(O)Cl, Et3N, NH3, THF
    • 55) R2R4NH, CH2Cl2, NaBH(OAc)3
    • 56) R2R4NH, MeOH/CH3CO2H, NaBH3CN
    • 57) R2OH, EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 58) R2OH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 59) R2R4NH, EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 60) R2R4NH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 61) POCl3, Py, CH2Cl2
    • 62) R2R4NCO, Lösungsmittel
    • 63) R2OC(O)Cl, Et3N, Lösungsmittel
    • 64) R2CO2H, EDC oder HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 65) R2X, Et3N, Lösungsmittel
    • 66) (CH3S)2C=N(CN), DMF, EtOH (J. Med. Chem. 1994, 37, 57–66)
    • 67) R2SO2Cl, Et3N, CH2Cl2
    • 68) R2- oder R3- oder R4CHO, MeOH/CH3CO2H, NaBH3CN (Synthesis 1975, 135–146)
    • 69) Boc(Tr)-D oder L-CysOH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 70) Boc(Tr)-D oder L-CysH, NaBH3CN, MeOH/CH3CO2H (Synthesis 1975, 135–146)
    • 71) S-Tr-N-Boc-Cysteinal, ClCH2CH2Cl oder THF, NaBH(OAc)3 (J. Org. Chem. 1996, 61, 3849–3862)
    • 72) TFA, CH2Cl2, Et3SiH oder (3:1:1) Thioanisol/Ethandithiol/DMS
    • 73) TFA, CH2Cl2
    • 74) DPPA, Et3N, Toluol, HOCH2CH2SiCH3 (Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3515)
    • 75) TBAF, THF
    • 76) Base, TrSH oder BnSH
    • 77) Base, R2X oder R4X
    • 78) R3NH2, MeOH/CH3CO2H, NaBH3CN
    • 79) N2H4, KOH
    • 80) Pd2(dba)3, P(o-tol)3, RNH2, NaOtBu, Dioxan, R1 NH2 (Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7181–7184)
    • 81) Cyanamid
    • 82) Fmoc-Cl, Natrimbicarbonat
    • 83) BnCOCl, Natriumcarbonat
    • 84) AllylOCOCl, Pyridin
    • 85) Benzylbromid, Base
    • 86) Oxalylchlorid, DMSO
    • 87) RCONH2
    • 88) Carbonyldiimidazol, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 89) Thiocarbonyldiimidazol, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 90) Cyanogenbromid, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 91) RCOCl, Triethylamin
    • 92) RNHNH2, EDC
    • 93) RO2CCOCl, Et3N, DCM
    • 94) MsOH, Pyridin (J. Het. Chem., 1980, 607)
    • 95) Base, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, Toluol, THF)
    • 96) H2NOR, EDC
    • 97) RCSNH2
    • 98) RCOCHBrR, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol), (Org. Proc. Prep. Intl., 1992, 24, 127)
    • 99) CH2N2, HCl (Synthesis, 1993, 197)
    • 100) NH2NHR, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 101) RSO2Cl, DMAP (Tetrahedron Lett., 1993, 34, 2749)
    • 102) Et3N, RX (J. Org. Chem., 1990, 55, 6037)
    • 103) NOCl oder Cl2 (J. Org. Chem., 1990, 55, 3916)
    • 104) H2NOH, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 105) RCCR, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, THF, Toluol)
    • 106) RCHCHR, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, THF, Toluol)
    • 107) H2NOH; HCl
    • 108) Thiocarbonyldiimidazol, SiO2 oder BF3OEt2 (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228)
    • 109) Thiocarbonyldiimidazol, DBU oder DBN (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228)
    • 110) HNO2, HCl
    • 111) ClCH2CO2Et (Org. Reactions, 1959, 10, 143)
    • 112) Morpholinenamin (Eur. J. Med. Chem., 1982, 17, 27)
    • 113) RCOCHR'CN
    • 114) RCOCHR'CO2Et
    • 115) Na2SO3
    • 116) H2NCHRCO2Et
    • 117) EtO2CCHRNCO
    • 118) RCNHNH2
    • 119) RCOCO2H, (J. Med. Chem., 1995, 38, 3741)
    • 120) RCHO, KOAc
    • 121) 2-Fluornitrobenzol
    • 122) SnCl2, EtOH, DMF
    • 123) RCHO, NaBH3CN, HOAc
    • 124) NH3, MeOH
    • 125) 2,4,6-Me3PhSO2NH2
    • 126) Et2NH, CH2Cl2
    • 127) MeOC(O)Cl, Et3N, CH2Cl2
    • 128) R2NH2, EDC, HOBT, Et3N, CH2Cl2
    • 129) DBU, PhCH3
    • 130) BocNHCH(CH2STr)CH2NH2, EDC, HOBT, Et3N, CH2Cl2
    • 131) R2NHCH2CO2Me, HBTU, HOBT, Et3N, CH2Cl2
    • 132) BocNHCH(CH2STr)CH2OMs, LiHMDS, THF
    • 133) R2NHCH2O2Me, NaBH(OAc)3, ClCH2CH2Cl oder THF
    • 134) R2NHCH2CH(OEt)2, HBTU, HOBT, Et3N, CH2Cl2
    • 135) NaBH(OAc)3, ClCH2CH2Cl oder THF, AcOH
    • 136) Piperidin, DMF
    • 137) Pd(Ph3P)4, Bu3SnH
    • 138) RCO2H, EDC, HOBT, Et3N, DCM
    • 139) RNH2, neutrale Lösungsmittel
    • 140) RCHO, NaBH3CN, HOAc
    • 141) RNCO, Lösungsmittel
    • 142) RCO2H, EDC oder HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 143) RCOCl, Triethylamin
    • 144) RSO2Cl, Et3N, CH2Cl2
    • 145) SnCl2, EtOH, DMF
    • 146) RNH2, EDC, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 147) Dibromethan, Et3N, CH2Cl2
    • 148) Oxalylchlorid, neutrale Lösungsmittel
    • 149) LiOH, THF-MeOH
    • 150) Carbonyldiimidazol, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
    • 151) RNH2, Et3N, CH2Cl2
    • 152) Base, RX
    • 153) DBU, PhCH3
    • 154) DPPA, Et3N, Toluol(Synthesis 1985, 220)
    • 155) SOCl2, kat DMF
    • 156) ArH, Lewis Säure (AlCl3, SnCl4, TiCl4), CH2Cl2
    • 157) H2NCHRCO2Et, neutrale Lösungsmittel
    • 158) BocHNCHRCO2H, EDC oder HBTU, HOBt, DIEA, CH2Cl2 oder DMF
    • 159) TFA, CH2Cl2
  • b. Erläuternde Herstellung der Aryl-Untereinheiten
  • Die Aryl-Untereinheiten können unter Anwendung einer breiten Vielzahl von der Fachwelt bekannten Reaktionen funktionalisiert werden. Die Chemie aromatischer und heteroaromatischer Ringe ist reichhaltig, und es kann hier nur ein probeweiser Auszug an brauchbaren Reaktionen präsentiert werden. Eine Anzahl von erläuternden Beispielen ist nachstehend gezeigt.
  • Suzuki-Kupplung Nr. 1
    Figure 01060001
  • Suzuki-Kupplung Nr. 2
    Figure 01060002
  • Stille-Kupplung Nr. 1
    Figure 01070001
  • Stille-Kupplung Nr. 2
    Figure 01070002
  • Stille-Kupplung Nr. 3
    Figure 01070003
  • c. Erläuternde Herstellung der Kopplungssubstrate
  • Die Mitglieder der allgemeinen Klasse der vorstehend ausgeführten Kopplungssubstrate – Arylstannane, Arylborsäuren, Aryltriflate und Arylhalogenide – sind aus den Stammheterocyclen erhältlich. Im Allgemeinen sind die zur Herstellung eines Kopplungssubstrates erforderlichen Transformationen zuverlässig und einer Maßstabsausweitung zugänglich. Erläuternde Beispiele sind nachstehend gezeigt.
  • Herstellung eines Aryliodids
    Figure 01080001
  • Herstellung eines Arylstannans
    Figure 01080002
  • Herstellung eines Aryltriflats
    Figure 01080003
  • Herstellung von Arylborsäure
    Figure 01090001
  • d. Beispielhafte Verfahrensweisen zur Herstellung der betreffenden Verbindungen Weg 1
    Figure 01090002
  • 2-(2-Benzyloxycarbonylamino-acetylamino)-benzoesäuremethylester (1)
  • Einer Lösung von N-α-Cbz-glycin (2,0 g, 9,56 mol) in Tetrahydrofuran (20 ml) wurden 1,1'-Carbonyldiimidazol (1,64 g, 10,13 mmol) und anschließend 2 h später Methylantranilat (1,28 g, 8,47 mmol) zugesetzt. Nach Rühren über Nacht wurde das Tetrahydrofuran in vacuo entfernt, und der Rückstand wurde wieder in Ethylacetat gelöst, mit 10 % wässriger Chlorwasserstoffsäure (2 ×), gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (2 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter Erhalt eines öligen Rückstands, der einer Kieselgel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Ethylacetat:Hexan, 30:70 v/v → Ethylacetat] unter Erhalt des Titel-Benzoat (1) (0,31 g, 11 %) als weißer Feststoff unterzogen wurde, konzentriert:
    δ (360 MHz; CDCl3) 3,89 (s, 3H), 4,10 (d, 2H), 5,19 (s, 2H), 7,11 (t, 1H), 7,31–7,41 (m, 5H), 7,56 (t, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,69 (d, 1H) und 11,54 (s, 1H).
  • 2-(2-Benzyloxycarbonylamino-acetylamino)-benzoesäure (2)
  • Lithiumhydroxid (55 mg, 1,32 mmol) in Wasser (0,8 ml) wurde einer Lösung des Benzoats (1) (300 mg, 0,88 mmol) in Dioxan (4 ml) zugesetzt. Nach Rühren über Nacht wurde das Reaktionsgemisch bei 40 °C unter Erhalt eines viskosen Öls, das mit 10 % wässriger Chlorwasserstoffsäure (3 ml) behandelt wurde, konzentriert, wobei die resultierende gebildete Emulsion mit Ethylacetat (4 ×) extrahiert wurde. Die organischen Phasen wurden vereinigt, getrocknet (MgSO4) und unter Erhalt der Titel-Benzoesäure (2) quantitativ als weißer Feststoff konzentriert:
    δ (360 MHz; DMSO) 3,84 (d, 2H), 5,12 (s, 2H), 7,21 (t, 1H), 7,35–7,44 (m, 5H), 7,65 (t, 1H), 8,04 (t, 1H), 8,65 (d, 1H) und 11,74 (s, 1H).
  • [3-(4-Fluorphenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-chinazolin-2-ylmethyl]-carbaminsäurebenzylester (3)
  • Einer Lösung der Benzoesäure (2) (180 mg, 0,55 mmol) in Tetrahydrofuran (6 ml) wurde 1,1'-Carbonyldiimidazol (98 mg, 0,60 mmol) zugesetzt. Nach einem Zeitraum von 2 h wurde 4-Fluoranilin (61 mg, 0,55 mmol) in Tetrahydrofuran (1,5 ml) zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 75 °C gerührt. Das Tetrahydrofuran wurde in vacuo entfernt, und der Rückstand wurde wieder in Ethylacetat aufgelöst, mit 10 % wässriger Chlorwasserstoffsäure, gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter Erhalt eines öligen Rückstands, der einer Kieselgel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Ethylacetat:Hexan, 20:80, v/v → 60:40, v/v] unter Erhalt des Titels-Chinazolinons (3) (0,11 g, 50 %) als weißer Feststoff unterzogen wurde, konzentriert:
    δ (360 MHz; CDCl3) 4,01 (d, 2H), 5,13 (s, 2H), 6,27 (s–, 1H), 7,31–7,39 (m, 9H), 7,52 (t, 1H), 7,71 (d, 1H), 7,81 (t, 1H) und 8,28 (d, 1H).
  • 2-Aminomethyl-3-(4-fluorphenyl)-3H-chinazolin-4-on (4)
  • Ein gerührtes Gemisch des Chinazolinons (3) (63 mg, 0,16 mmol), 10 % Palladium-auf-Aktivkohle (18 mg) und Methanol (4,4 ml) wurde unter Verwendung einer Saugpumpe evakuiert und mit Wasserstoff gefüllt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC-Analyse aufgezeichnet, wurde das Gemisch über ein Celitekissen filtriert, das mit Methanol (2 ×) gewaschen und unter Erhalt des Titel-Amins (4) (40 mg, 93 %) als gelber Feststoff konzentriert wurde:
    δ (360 MHz; CDCl3) 3,50 (s, 2H), 7,25 (offenbar d, 4H), 7,50 (t, 1H), 7,75–7,82 (m, 2H) und 8,28 (d, 1H).
  • 1-(4-Chlor-3-trifluormethyl-phenyl)-3-[3-(4-fluor-phenyl)-4-oxo-3,4-dihydrochinazolin-2-ylmethyl]-harnstoff (5)
  • Einem Gemisch des Amins (4) (14 mg, 0,05 mmol) in Chloroform (0,5 ml) wurde 3-Trifluormethylphenylisocyanat (10 mg, 0,05 mmol) zugesetzt. Nach Rühren über Nacht wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt, mit Hexanen verrieben, filtriert und unter Erhalt des Titel-Harnstoffs (5) (24 mg, 98 %) als weißer Feststoff getrocknet:
    δ (360 MHz; CDCl3) 4,08 (s, 2H), 6,52 (s, 1H), 7,16–7,38 (m, 4H), 7,48–7,53 (m, 2H), 7,59 (d, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,75 (t, 1H), 7,81 (s, 1H) und 8,29 (d, 1H).
  • 1-(2,6-Dichlor-pyridin-4-yl)-3-[3-(4-fluor-phenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-chinazolin-2-ylmethyl]-harnstoff (6)
  • Einem Gemisch des Amins (4) (14 mg, 0,05 mmol) in Chloroform (0,5 ml) wurde 2,6-Dichlorpyridinisocyanat (11 mg, 0,05 mmol) zugesetzt. Nach Rühren über Nacht wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt, mit Hexanen verrieben, filtriert und unter Erhalt des Titel-Harnstoffes (6) (22 mg, 96 %) als weißer Feststoff getrocknet:
    δ (360 MHz MHz; CDCl3) 4,09 (d, 2H), 6,41 (br s, 1H), 6,69 (dd, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,87 (dd, 1H), 7,07 (t, 1H), 7,22–7,27 (m, 3H), 7,52 (t, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,79 (t, 1H) und 8,29 (dd, 1H).
  • Weg 2
    Figure 01120001
  • 2-Ethyl-3,1-[4H]benzoxazin-4-on (7)
  • Anthranilsäure (100 g, 0,73 mol) und Propionsäureanhydrid (420 ml) wurden 3,5 h auf 140 °C in einem mit einem Claisen-Destillationsaufsatz ausgestatteten Kolben erhitzt. Die Temperatur wurde auf 170 bis 180 °C erhöht, und Propionsäure und das Propionsäureanhydrid wurden unter vermindertem Druck unter Erhalt eines braunen Feststoffs entfernt, der mit Hexan verrieben, filtriert und unter Erhalt des Titels-Benzoxazin (7) (115,8 g, 91 %) als nicht ganz weißer Feststoff getrocknet wurde:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,35 (t, 3H), 2,71 (q, 2H), 7,45–7,50 (m, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,75–7,79 (m, 1H), 8,16 (dd, 1H).
  • 2-Ethyl-3-(4'-fluor-phenyl)-chinazolin-4-on (8)
  • Eine Lösung des Benzoxazins (7) (5,0 g, 28,6 mmol) und 4-Fluoranilin (3,37 g, 30,3 mmol) in Chloroform (12 ml) wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Nach vollständigem Verbrauch des Benzoxazins (7), wie durch TLC aufgezeichnet, wurde das Lösungsmittel entfernt, und der verbleibende nicht ganz weiße Rückstand wurde in Ethylenglycol (8 ml) aufgenommen, dem Natriumhydroxid (51 mg) zugesetzt wurde, und die Suspension wurde in einem Destillationsgerät auf 120–140 °C erhitzt. Das erzeugte Wasser wurde während eines Heizzeitraums von 5 h abdestilliert, und die dunkle Lösung wurde über Nacht auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen. Der pH wurde durch Zugabe von 3 % wässriger Chlorwasserstoffsäure auf 7 bis 8 eingestellt, und der Niederschlag wurde filtriert und unter Erhalt des Titel-Chinazolinons (8) (4,42 g, 58 %) als weißer Feststoff getrocknet: (360 MHz; CDCl3) 1,23 (t, 3H), 2,44 (q, 2H), 7,24 (offenbar d, 4H), 7,44–7,49 (m, 1H), 7,71–7,79 (m, 2H), 8,26 (dd, 1H).
  • 2-(1'-Bromethyl)-3-(4''-fluorphenyl)-chinazolin-4-on (9)
  • Einem gerührten Gemisch aus dem Chinazolinon (8) (94,0 g, 0,35 mmol), wasserfreiem Natriumacetat (35,2 g, 0,43 mol) und Eisessig (448 ml) bei 40 °C unter einer Stickstoffatmosphäre wurde eine Lösung von Brom (76,8 g, 0,48 mol) in Eisessig (243 ml) zugetropft, während das Gemisch während eines Zeitraums von 5 h bei etwa 40 °C gehalten wurde. Das Gemisch wurde auf Wasser (5,26 l) gegossen, 1 h gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wurde mit warmem Wasser (2,8 l) gewaschen und unter Erhalt des Titel-Bromids (9) (117,2 g, 96 %) als weißer Feststoff getrocknet:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,99 (d, 3H), 4,48 (q, 1H), 7,07–7,25 (m, 3H), 7,44–7,52 (m, 2H), 7,73-7,75 (m, 2H), 8,21 (d, 1H).
  • 2-[(1'-Methylamin)-ethyl]-3-(4''-fluorphenyl)-chinazolin-4-on (10)
  • Dem Bromid (9) (117,0 g, 0,34 mol) wurde eine 8,03 M Lösung von Methylamin in Ethanol (923 ml, 7,41 mol) zugesetzt, und die Suspension wurde auf 40 °C erwärmt. Nach 1 h war das Ausgangsmaterial vollständig verbraucht, wie durch TLC aufgezeichnet, und das Lösungsmittel und überschüssiges Methylamin wurden unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (1,2 l) aufgenommen, 1 h bei Umgebungstemperatur gerührt, wobei das ausgefallene Methylammoniumhydrochlorid abfiltriert und mit Dichlormethan (117 ml) gewaschen wurde. Die vereinigten organischen Phasen wurden unter quantitativem Erhalt des Titel-Amins (10) als weißer Feststoff konzentriert und getrocknet (MgSO4):
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,30 (d, 3H), 2,33 (s, 3H), 3,38 (q, 1H), 7,26–7,34 (m, 4H), 7,51–7,55 (m, 1H), 7,76–7,85 (m, 2H), 8,31 (dd, 1H).
  • 2-{1'-[N-(3"-Trifluormethylphenylcarbamoyl)-N-methyl-amino]ethyl}-3-(4'''-fluorphenyl)-chinazolin-4-on (11)
  • Einer Lösung des Amins (10) (18,9 g, 0,065 mol) und Chloroform (150 ml) wurde eine Lösung von 3-Trifluormethylphenylisocyanat (11,9 g, 0,065 mol) in Chloroform (39 ml) zugesetzt, während die Temperatur unter 30 °C gehalten wurde. Das Gemisch wurde 1 h bei Umgebungstemperatur gerührt, und der gebildete Niederschlag wurde filtriert, mit Chloroform gewaschen und unter Erhalt des Titel-Harnstoffs (11) (20,2 g, 65 %) als nicht ganz weißer Feststoff getrocknet:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,55 (d, 3H), 2,92 (s, 3H), 5,16 (q, 1H), 7,09 (br s, 1H), 7,18–7,23 (m, 1H), 7,29–7,30 (m, 3H), 7,34–7,43 (m, 2H), 7,55–7,58 (m, 3H), 7,80–7,88 (m, 2H), 8,31 (d, 1H).
  • 2-{1''-[N-(2''-Methoxy-5''-trifluormethylphenylcarbamoyl)-N-methyl-amino]ethyl}-3-(4'''-fluorphenyl)-chinazolin-4-on (12)
  • Eine Lösung von 2-Methoxy-5-trifluormethylanilin (42 mg, 0,22 mmol) in Ethylacetat (1,2 ml) wurde einer Lösung von Triphosgen (80 mg, 0,27 mmol) in Ethylacetat (1,2 ml) zugesetzt, katalytische Mengen an Kohle wurden zugesetzt und das Gemisch unter 2 h Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf Umgebungstemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft, wobei der resultierende Rückstand in Chloroform (1,2 ml) aufgenommen wurde. Eine Lösung des Amins (10) (65 mg, 0,22 mmol) in Chloroform (1,2 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch bei Umgebungstemperatur gerührt, bis das Ausgangsmaterial vollständig verbraucht war. Das Lösungsmittel wurde eingedampft, und das Rohprodukt wurde der Kieselgel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Dichlormethan → Ethylacetat] unterzogen, wobei der Titel-Harnstoff (12) (98 mg, 87 %) als weißer Feststoff isoliert wurde:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,40 (d, 3H), 2,88 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 5,25 (q, 1H), 6,80 (d, 1H), 6,97–7,03 (m, 2H), 7,13–7,18 (m, 3H), 7,20–7,25 (m, 1H), 7,40–7,45 (m, 1H), 7,65–7,74 (m, 2H), 8,18–8,22 (m, 2H).
  • N-{1-[3-(4-Fluor-phenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-chinazolin-2-yl]-ethyl}-N-methyl-3-trifluormethyl-benzamid (13)
  • Einer Lösung des Amins (10) (50 mg, 0,17 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,03 ml, 0,17 mmol) in Dichlormethan (0,5 ml) wurde 3-Trifluormethylbenzoylchlorid (0,03 ml 0,19 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Nach 12 h wurden einige Kristalle von 4-Dimethylaminopridin zugesetzt, und das Rühren wurde für weitere 12 h fortgesetzt. Das Gemisch wurde mit Wasser gestoppt, mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter Erhalt des Titel-Benzamid (13) quantitativ als weißer Schaum konzentriert:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,53 (d, 3H), 3,16 (s, 3H), 5,36 (q, 1H), 7,24–7,36 (m, 3H), 7,45–7,56 (m, 3H), 7,64–7,82 (m, 5H), 8,29 (br d, 1H).
  • N-{1-[3-(4-Fluor-phenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-chinazolin-2-yl]-ethyl}-N-methyl-3-trifluormethyl-benzolsulfonamid (14)
  • Einer Lösung des Amins (10) (50 mg, 0,17 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,03 ml, 0,17 mmol) in Dichlormethan (0,5 ml) wurde 3-Trifluormethylphenylsulfonylchlorid (0,03 ml, 0,19 mmol) zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Nach 12 h wurden einige Kristalle von 4-Dimethylaminopyridin zugesetzt, und das Rühren wurde für weitere 12 h fortgesetzt. Das Gemisch wurde mit Wasser gestoppt, mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter Erhalt des Titel-Sufonamids (14) quantitativ als weißer Schaum konzentriert:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,28 (d, 3H), 3,16 (s, 3H), 4,92 (q, 1H), 7,18–7,30 (m, 2H), 7,35–7,50 (m, 5H), 7,62 (br d, 1H), 7,70 (dt, 1H), 7,79 (br d, 1H), 7,87 (br s, 1H), 8,25 (dd, 1H).
  • 2-{1-[Bis(2-methoxy-ethyl)-amino]ethyl}-3-(4-fluor-phenyl)-3H-chinazolin-4-on (15)
  • Eine Lösung des Bromids (9) (71,5 mg, 0,21 mmol), Tetrahydrofuran (1,0 ml) und Bis(2-methoxyethyl)amin (0,33 ml, 2,26 mmol) wurde auf 70 °C erhitzt. Nach 6,5 h wurde die Reaktion teilweise konzentriert, und Ethylacetat (1 ml) und Wasser (1 ml) wurden zugesetzt, wobei das Gemisch kräftig 1 h gerührt wurde. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Wasser (2 × 1 ml) gewaschen; getrocknet (MgSO4), filtriert und unter Erhalt des Titel-Amins (15) (61 mg, 74 %) als Öl konzentriert:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,35 (d, 3H), 2,51–2,56 (m, 2H), 2,74–2,83 (m, 2H), 2,98–3,11 (m, 4H), 3,12 (s, 6H), 3,79 (q, 1H), 7,13–7,27 (m, 3H), 7,45–7,54 (m, 2H), 7,74–7,76 (m, 2H), 8,26 (d, 1H).
  • Weg 3
    Figure 01160001
  • 2-Ethyl-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-4-on (16)
  • Eine Suspension von 2-Aminonicotinsäure (1,0 g, 7,24 mmol) in Propionsäureanhydrid (10 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre 1 h auf 120 °C erhitzt. Die Temperatur wurde zur Entfernung der Propionsäure und des Propionsäureanhydrids unter vermindertem Druck auf 167 °C erhöht. Der resultierende braune Feststoff wurde mit Hexan verrieben und unter Erhalt des Titel-Pyrido-oxazins (16) (1,10 g, 86 %) als weißer Feststoff getrocknet:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,43 (t, 3H), 2,82 (q, 2H), 7,48 (dd, 1H), 8,53 (dd, 1H), 8,98 (d, 1H).
  • 2-Ethyl-3-(4-fluor-phenyl)-3H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-4-on (17)
  • Eine Suspension des Pyrido-oxazins (16) (0,5 g, 2,84 mmol) und 4-Fluoranilin (0,32 g, 2,84 mmol) in Toluol (21 ml) wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert, und Ethylenglycol (2 ml) und Natriumhydroxid (5 mg) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde erneut 4 h auf 120 °C erhitzt, und Ethylenglycol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der resultierende dunkelbraune Feststoff wurde einer Kieselgel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Etnylacetat:Hexan, 20:80, v/v → 100:0, v/v] unter Erhalt des Titel-Pyridopyrimdinons (17) (244 mg, 32 %) als beigefarbener Feststoff unterzogen:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,31 (t, 3H), 2,49 (q, 2H), 7,25–7,28 (m, 4H), 7,44 (dd, 1H), 8,59 (dd, 1H), 9,00 (dd, 1H).
  • 2-(1-Brom-ethyl)-3-(4-fluor-phenyl)-3H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-4-on (18)
  • Eine Suspension des Chinazolinons (17) (50,0 g, 0,56 mmol) und wasserfreiem Natriumacetat in Eisessig (1,0 mg) wurde auf 40 °C erhitzt und tropfenweise mit einer Lösung von Brom (90 mg, 0,56 mmol) in Eisessig (5 ml) behandelt. Nach vollständigem Verbrauch des Ausgangsmaterials, gemäß TLC-Analyse, wurde das Gemisch auf Wasser (5 ml) gegossen, mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat basisch gemacht und mit tert-Butylmethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und unter Erhalt eines Feststoffs konzentriert, der durch Kieselgel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Ethylacetat: Hexan, 50:50, v/v] unter Erhalt des Titel-Bromids (18) (166 mg, 85 %) als nicht ganz weißer Feststoff gereinigt wurde:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,21 (d, 3H), 4,58 (q, 1H), 7,15–7,34 (m, 3H), 7,51 (dd, 1H), 7,55–7,60 (m, 1H), 8,62 (dd, 1H), 9,05 (dd, 1H).
  • 3-(4-Fluor-phenyl)-2-(1-methylamino-ethyl)-3H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-4-on (19)
  • Eine Suspension des Bromids (18) (80 mg, 0,23 mmol) und einer 8,03 M Lösung von Methylamin in Ethanol (0,64 ml) wurde 3 h auf 40 °C erhitzt und bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die resultierende Suspension wurde unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert, und der resultierende hellbraune feste Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und unter Erhalt des Titel-Amins (19) (57 mg, 83 %) als beigefarbener Feststoff über einen Kieselgelpropf filtriert. (Das Rohmaterial wurde direkt im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung herangezogen).
  • 1-{1-[3[(4-Fluor-phenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-pyrido[2,3-d]pyrimidin-2-yl]ethyl}-1-methyl-3-(3-trifluormethyl-phenyl)-harnstoff (20)
  • Einer Lösung des Amins (19) (30 mg, 0,1 mmol) in Dichlormethan (0,2 ml) wurde 3-Trifluormethylphenylisocyanat (19 mg, 0,1 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt, wonach der Niederschlag filtriert, mit Dichlormethan gewaschen und unter Erhalt des Titel-Harnstoffs (20) (6 mg, 13 %) als weißer Feststoff getrocknet wurde:
    δ (360 MHz; CDCl3) 2,17 (d, 3H), 3,15 (s, 3H), 5,23 (q, 1H), 7,15 (br s, 1H), 7,22–7,31 (m, 4H), 7,38 (t, 1H), 7,49 (d, 1H), 7,50–7,56 (m, 2H), 7,62 (br s, 1H), 8,62 (dd, 1H), 9,00 (d, 1H).
  • Weg 4
    Figure 01180001
  • 3-Exo-tert-butoxycarbonylamino-bicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-exo-carbonsäure (21)
  • Eine Lösung von 3-exo-Amino-bicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-exo-carbonsäure (1,0 g, 6,5 mmol), 1 N wässrigem Natriumhydroxid (6,5 ml) und Dioxan (6,5 ml) wurde auf einem Eisbad gekühlt, und Di-tert-butyldicarbonat (3,0 g, 13,8 mmol) wurde unter fortwährendem Rühren für 10 min bei 0 °C und für 6 h bei Umgebungstemperatur zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde teilweise eingedampft, und der pH wurde durch Zugabe von 1 N wässrigem Kaliumhydrogensulfat (ca. 8 ml) auf 1–2 eingestellt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (3 × 10 ml) extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (MgSO4) und unter Erhalt der Titel-Säure (21) (1,41 g, 85 %) als weißer Feststoff konzentriert:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,70 (s, 9H), 1,89 (m, 1H), 2,31 (m, 1H), 2,84 (m, 1H), 2,98 (m, 1H), 3,22 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 6,44 (m, 2H), 7,21 (m, 1H).
  • [3-Exo-(4-fluor-phenylcarbamoyl)-bicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-exo-yl]-carbaminsäure-tert-butylester (22)
  • Eine Lösung der Säure (21) (1,4 g, 5,5 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (20 ml) wurde auf –10 °C abgekühlt und tropfenweise mit Triethylamin (0,77 ml, 5,5 mmol) und anschließend mit Isobutylchlorformiat (0,72 ml, 5,5 mmol) behandelt. Die resultierende Suspension wurde bei –10 °C 10 min gerührt, bevor eine Lösung von 4-Fluoranilin (0,53 ml, 5,5 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (5 ml) zugesetzt wurde, wobei die Temperatur 5 h zwischen –8 und –17 °C gehalten und das Gemisch über Nacht auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen wurde. Das Triethylaminhydrochlorid wurde abfiltriert, mit Tetrahydrofuran gewaschen, und das Lösungsmittel wurde zur Trockene eingedampft, wobei die resultierenden Feststoffe mit Wasser (20 ml) gewaschen und unter Erhalt des Titel-Carbaminsäureesters (22) quantitativ als weißer Feststoff getrocknet wurden:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,24 (s, 9H), 1,66 (d, 1H), 2,06 (d, 1H), 2,45 (d, 1H), 2,71 (br s, 1H), 3,08 (br s, 1H), 3,93–4,06 (m, 1H), 4,96 (d, 1H), 6,18–6,24 (m, 2H), 6,94–7,02 (m, 2H), 7,48-7,50 (m, 2H), 7,98 (br s, 1H).
  • 3-Exo-amino-bicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-exo-carbonsäure(4-fluor-phenyl)-amid (23)
  • Einer Lösung des Carbaminsäureesters (22) (2,24 g) in Dichlormethan (50 ml) wurde Trifluoressigsäure (5 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 4 h gerührt, bevor Wasser (50 ml) zugesetzt wurde. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und mit Dichlormethan (25 ml) gewaschen, filtriert und mit 2 N Natriumhydroxid basisch gemacht. Die basische wässrige Phase wurde mit Dichlormethan (2 × 25 ml) extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen wurden mit Salzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter Erhalt des Titel-Amins (23) (870 mg, (64 % über 2 Stufen aus (21)) als Feststoff konzentriert:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,59 (d, 9H), 1,71 (br d, 2H), 2,13 (d, 1H), 2,37 (d, 1H), 2,59 (br s, 1H), 3,09 (br s, 1H), 3,24 (d, 1H), 6,20 (br s, 2H), 6,99 (t, 2H), 7,47–7,51 (m, 2H), 8,54 (br s, 1H).
  • 2-Ethyl-3-(4-fluor-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on (24)
  • Eine Lösung des Amins (23) (43 mg, 0,17 mmol) in Triethylorthopropionat (0,5 ml, 2,38 mmol) wurde 26 h auf 100 °C erhitzt, wonach überschüssiges Lösungsmittel und flüchtige Coprodukte unter reduziertem Druck unter Erhalt des Titel-Pyrimidons (24) (41 mg, quant.) als kristalliner Feststoff verdampft wurden:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,17 (t, 3H), 2,37 (q, 2H), 6,45 (d, 1H), 7,17–7,27 (m, 4H), 7,93 (d, 1H).
  • 2-(1-Brom-ethyl)-3-(4-fluor-phenyl)-3H-pyrimidin-4-on (25)
  • Eine Lösung des Pyrimidinons (24) (150 mg, 0,69 mmol) und Natriumacetat (140 mg) in Eisessig (1,5 ml) wurde auf 40 °C erwärmt und tropfenweise mit einer zuvor gebildeten Bromlösung (0,7 ml Brom in 10 ml Eisessig) (0,55 ml, 0,69 mmol) behandelt. Nach 2 h wurde dem Gemisch Wasser (20 ml) zugesetzt, das anschließend mit Kaliumcarbonat basisch gemacht und mit Dichlormethan (2 × 10 ml) extrahiert wurde. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter Erhalt des Titel-Bromids (25) (196 mg, 96 %) als blassbraunes Öl konzentriert wurde:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,95 (d, 3H), 4,46 (q, 1H), 6,50 (d, 1H), 7,12–7,16 (m, 1H), 7,20–7,28 (m, 2H), 7,43–7,50 (m, 1H), 8,81 (d, 1H).
  • 3-(4-Fluor-phenyl)-2-(1-methylamino-ethyl)-3H-pyrimidin-4-on (26)
  • Das Bromid (25) (190 mg, 0,64 mmol) wurde in einer 33%igen Lösung von Methylamin in Ethanol (5 ml) gelöst und bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach 3,5 h wurden Lösungsmittel und Methylaminüberschuss unter reduziertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde zwischen Wasser (10 ml) und Dichlormethan (10 ml) verteilt. Die organische Schicht wurde wieder mit Wasser (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter Erhalt des Titel-Amins (26) (120 mg, 76 %) als gelbes Öl konzentriert:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,20 (d, 3H), 2,23 (s, 3H), 3,26 (q, 1H), 6,44 (d, 1H), 7,16–7,33 (m, 4H), 7,98 (d, 1H).
  • 1-{1-[1-(4-Fluor-phenyl)-6-oxo-1,6-dihydro-pyrimidin-2-yl]ethyl}-1-methyl-3-(3-trifluormethyl-phenyl)-harnstoff (27)
  • Das Amin (26) (12 mg, 0,05 mmol) und 3-Trifluormethylphenylisocyanat (7,5 ml, 0,05 mmol) wurden in Chloroform (0,2 ml) gelöst und bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach vollständiger Umwandlung des Ausgangsmaterials, gemäß TLC-Analyse, wurde das Lösungsmittel entfernt, und der resultierende Rückstand wurde einer Kieselgel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Dichlormethan] unter Erhalt des Titel-Harnstoffs (27) (14 mg, quant.) als Feststoff unterzogen:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,61 (m, 3H), 2,87 (s, 3H), 5,04 (m, 1H), 6,41 (m, 1H), 6,64 (s, 1H), 7,11–7,48 (m, 8H), 7,86 (m, 1H).
  • Nitro-Reduktion zu Anilinen
    Figure 01210001
  • 2-{1'-[N-(3''-amino-carbamoyl)-N-methyl-amino]ethyl}-3-(4'''-fluorphenyl)-chinazolin-4-on (29)
  • Eine Lösung von 2-{1'-[N-(3''-Nitro-carbamoyl)-N-methyl-amino]ethyl}-3-(4'''fluorphenyl)-chinazolin-4-on (28) (168 mg, 0,036 mmol), Dichlormethin (5 ml) und Ethylacetat (5 ml) wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre in Gegenwart von 10 % aktiviertem Palladium-auf-Kohle gerührt, bis das Ausgangsmaterial vollständig verbraucht war. Das Gemisch wurde über Celite filtriert und unter Erhalt des Titel-Anilins (29) (100 mg, 65 %) zur Trockene konzentriert:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,48 (d, 3H), 2,88 (s, 3H), 5,17 (q, 1H), 6,39 (br s, 1H), 6,50 (br s, 1H), 6,92 (br s, 1H), 6,60 (br s, 1H), 7,02 (t, 1H), 7,15–7,33 (m, 4H), 7,49–7,55 (m, 1H), 7,75–7,82 (m, 2H), 8,27 (d, 1H).
  • Ein in situ Verfahren zur Derivatisierung des angehängten Amins wurde, wie durch das folgende Protokoll als Beispiel angeführt, entwickelt:
  • Figure 01220001
  • 1-{1-[3-(Fluor-phenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-chinazolin-2-yl]-ethyl}-1-methyl-3-(3-trifluormethansulfonyl-phenyl)-harnstoff (31)
  • Eine Lösung von Triphosgen (160 mg, 0,54 mmol) und Ethylacetat (2,5 ml) wurde einer Lösung von (3-Aminophenyl)trifluormethylsulfonat (100 mg, 0,44 mmol) und Ethylacetat (2,5 ml) zugesetzt. Nach 5 min Rühren wurde das Gemisch unter Rückfluss erhitzt, bis es klar wurde. Das Gemisch wurde konzentriert und erneut in Chloroform (2,5 ml) aufgelöst, wozu eine Lösung des Amins (30) (130 mg, 0,44 mmol) in Chloroform (2,5 ml) zugesetzt wurde. Nach vollständigem Verbrauch des gesamten Ausgangsmaterials, gemäß TLC, wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan und dann Ethylacetat als Elutionsmittel unter Erhalt des Titel-Harnstoffs (31) (226 mg, 94 %) als Feststoff unterzogen:
    δ (360 MHz; CDCl3) 1,43 (d, 3H), 2,88 (s, 3H), 4,98 (br s, 1H), 7,08–7,14 (m, 1H), 7,16-7,31 (m, 3H), 7,45–7,54 (m, 3H), 7,60 (d, 1H), 7,69–7,80 (m, 3H), 7,96 (d, 1H) und 8,22 (d, 1H).
  • 1-{1-[3-(4-Fluor-phenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-chinazolin-2-yl]-ethyl}-3-(3-trifluormethyl-4-nitro-phenyl)-1-methyl-harnstoff (32)
  • Eine Lösung von Triphosgen (80 mg, 0,27 mmol) und Ethylacetat (1,2 ml) wurde einer Lösung von 4-Nitro-3-trifluormethylanilin (45 mg, 0,22 mmol) und Ethylacetat (1,2 ml) zugesetzt. Nach 5 min Rühren wurde das Gemisch unter Rückfluss erhitzt, bis es klar wurde. Das Gemisch wurde konzentriert und wieder in Chloroform (1,2 ml) aufgelöst, wozu eine Lösung des Amins (30) (65 mg, 0,22 mmol) in Chloroform (1,2 ml) gegeben wurde. Nach Verbrauch des gesamten Ausgangsmaterials, gemäß TLC, wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan, anschließend von Ethylacetat als Elutionsmittel unter Erhalt des Titel-Harnstoffs (32) (112 mg, 97 %) als Feststoff unterzogen:
    δH (360 MHz; CDCl3) 1,45 (d, 3H), 2,80 (s, 3H), 4,90 (br s, 1H), 7,05–7,25 (m, 4H), 7,48 (t, 1H), 7,63–7,79 (m, 4H), 7,86 (d, 1H) und 8,19 (d, 1H).
  • 1-{1-[3-(4-Fluor-phenyl)-4-oxo-3,4-dihydro-chinazolin-2-yl]-ethyl}-3-[3-trifluormethyl-4-(4-methyl)-piperazin-1-yl)-phenyl]-1-methyl-harnstoff (33)
  • Eine Lösung des Triphosgen (80 mg, 0,27 mmol) und Ethylacetat (1,2 ml) wurde zu einer Lösung von 4-(N-methylpiperazin)-3-trifluormethylanilin (56 mg, 0,22 mmol) und Ethylacetat (1,2 ml) gegeben. Nach 5 min Rühren wurde das Gemisch unter Rückfluss erhitzt, bis es klar wurde. Das Gemisch wurde konzentriert und wieder in Chloroform (1,2 ml) aufgelöst, wozu eine Lösung des Amins (30) (65 mg, 0,22 mmol) in Chloroform (1,2 ml) gegeben wurde. Nach Verbrauch des gesamten Ausgangsmaterials, gemäß TLC, wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat, dann von 5–10 % Methanol in Dichlormethan als Elutionsmittel unter Erhalt des Titel-Harnstoffs (33) (25 mg, 20 %) als Feststoff unterzogen:
    δH (360 MHz; CDCl3) 1,38 (d, 3H), 1,97 (br s, 2H), 2,26 (s, 3H), 2,47 (br s, 2H), 2,72–2,86 (m, 7H), 4,92–5,05 (m, 1H), 6,80–6,93 (br s, 1H), 7,08 (t, 1H), 7,12–7,27 (m, 4H), 7,34 (s, 1H), 7,41 (t, 2H), 7,63–7,74 (m, 2H) und 8,16 (d, 1H).
  • Sämtliche vorstehend zitierten Referenzen sind hiermit unter Bezugnahme mit umfasst.
  • Äquivalente
  • Die Fachwelt weiß oder ist in der Lage, unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten viele Äquivalente für die spezifischen Ausführungsformen der Erfindung, die hier beschrieben sind, sicherzustellen. Solche Äquivalente sollen durch die folgenden Ansprüche mit umfasst sein.

Claims (32)

  1. Verwendung einer Verbindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung einer übermäßigen Zellwucherung, wobei die Verbindung ein organisches Molekül der allgemeinen Formel (II) ist:
    Figure 01250001
    Formel II wobei, sofern Valenz und Stabilität es zulassen, R1 und R2 unabhängig bei jedem Vorkommen H, C1-C10-Alkyl, Aryl (substituiert oder unsubstituiert), Aralkyl (substituiert oder unsubstituiert), Heteroaryl (substituiert oder unsubstituiert) oder Heteroaralkyl (substituiert oder unsubstituiert) bedeuten; L unabhängig bei jedem Vorkommen abwesend ist oder -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH2)nO(CH2)p-, -(CH2)nNR2(CH2)p-, -(CH2)nS(CH2)p-, -(CH2)n-Alkenyl(CH2)p-, -(CH2)n-Alkinyl(CH2)p-, -O(CH2)n-, NR2(CH2)n- oder -S(CH2)n- bedeutet; X aus -N(R8)-, -O-, -S-, -Se-, N=N-, -ON=CH-, -(R8)N-N(R8)-, -ON(R8)-, einem Heterocyclus oder einer direkten Bindung zwischen L und Y ausgewählt ist; Y aus -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR2)-, einem heteroaromatischen Rest oder einer direkten Bindung zwischen X und Z ausgewählt ist; Z aus N(R8)-, -O-, -S-, -Se-, N=N-, -ON=CH-, -R8N-NR8-, -ONR8-, einem Heterocyclus oder einer direkten Bindung zwischen Y und L ausgewählt ist; R8 unabhängig bei jedem Vorkommen H, C1-C10-Alkyl, Aryl (substituiert oder unsubstituiert), Aralkyl (substituiert oder unsubstituiert), Heteroaryl (substituiert oder unsubstituiert) oder Heteroaralkyl (substituiert oder unsubstituiert) bedeutet oder zwei R8 zusammengenommen zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen 4-bis 8-gliedrigen Ring bilden, wobei der Ring ein oder mehrere Carbonylreste beinhalten kann; W einen substituierten oder unsubstituierten Benzo- oder Pyridoring bedeutet, der an den Pyrimidonring kondensiert ist; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10 bedeutet; und n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10 bedeutet; wobei sich der Ausdruck „Heteroaryl" oder „Heteroaralkyl" auf einen Arylrest mit bis zu 4 Heteroatomen bezieht und wobei sich der Audruck „substituiert" auf einen Substituenten bezieht, der aus Halogen, Azid, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Alkoxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Sulfonamido, Keton, Aldehyd, Ester, Heterocyclyl, aromatischen oder heteroaromatischen Einheiten, -CF3 oder -CN ausgewählt ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zelle einen Hedgehog-gain-of-function-Phänotypus aufweist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R1 einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylrest bedeutet.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei X-Y-Z zusammengenommen einen Harnstoff oder ein Amid bedeutet.
  5. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei W ein substituierter oder unsubstituierter Benzoring ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei X einen Diazacarbocyclus bedeutet.
  7. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei R2 einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylrest bedeutet.
  8. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei R8 unabhängig bei jedem Vorkommen aus H und C1-C10-Alkyl ausgewählt ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei X aus -N(R8)-, -O-, -S- und einer direkten Bindung ausgewählt ist; Y aus -C(=O)-, -C(=S)- und -S(O2)- ausgewählt ist; und Z aus -N(R8)-, -O-, -S- und einer direkten Bindung ausgewählt ist, so daß mindestens einer der Reste X und Z vorhanden ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei mindestens einer der Reste X und Z vorhanden ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei Y aus -C(=O)-, -C(=S)- und -S(O2)- ausgewählt ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung eine Hedgehog-vermittelte Signaltransduktion mit einem ED50-Wert von 1 mM oder weniger hemmt.
  13. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung eine Hedgehog-vermittelte Signaltransduktion mit einem ED50-Wert von 1 μM oder weniger hemmt.
  14. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung eine Hedgehog-vermittelte Signaltransduktion mit einem ED50-Wert von 1 nM oder weniger hemmt.
  15. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung als Teil einer therapeutischen oder kosmetischen Anwendung zu verabreichen ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die therapeutische oder kosmetische Anwendung aus der Regulierung von Nervengeweben, Knochen- und Knorpelbildung und -reparatur, Regulierung der Spermatogenese, Regulierung von glattem Muskel, Regulierung der vom Archenteron (Urdarm) stammenden Lunge, Leber und anderen Organen, Regulierung der hämatopoietischen Funktion oder Regulierung des Haut- und Haarwachstums ausgewählt ist.
  17. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei Y aus -C(=O) und -C(=S)- ausgewählt ist.
  18. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei Z aus -N(R8)-, -O-, -S- und einer direkten Bindung ausgewählt ist.
  19. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei R2 einen Niederalkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylrest bedeutet.
  20. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei R8 unabhängig bei jedem Vorkommen aus H und C1-C10-Alkyl ausgewählt ist.
  21. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das zu R1 benachbarte L abwesend ist und das zu X benachbarte L ein substituiertes oder unsubstituiertes Methylen ist.
  22. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 3 bedeutet.
  23. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei n unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 5 bedeutet.
  24. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei R2 einen substituierten oder unsubstituierten Aryl- oder Heteroarylrest bedeutet.
  25. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei mindestens einer der Reste X und Z vorhanden ist.
  26. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei Z aus -N(R8)-, -O- und -S- ausgewählt ist.
  27. Verwendung einer Verbindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, wobei die Verbindung ein organisches Molekül der allgemeinen Formel (II), wie in einem vorhergehenden Anspruch definiert, ist.
  28. Verwendung nach Anspruch 27, wobei der Krebs ein Basalzellenkarzinom ist.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei das Basalzellenkarzinom in klinischer oder histologischer Form vorliegt und aus knotigem Geschwür-, oberflächlichem, pigmentiertem, Morphea-ähnlichem, Fibroepitheliom- und nävoidem Syndrom ausgewählt ist.
  30. Verwendung nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem Krebs um folgende handelt: Plattenepithelkarzinom (z.B. Lungenplattenepithelkarzinom), Karzinosarkom, adenoid-zystisches Karzinom, Epidermoidkarzinom, Nasopharyngealkarzinom, klarzelliges Nierenkarzinom, Papillom, Epidermoidom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Tumore, die mit dem Gorlin-Syndrom verwandt sind (z.B. Medulloblastom, Meningiom usw.), in pct-knock out-Mäusen nachgewiesene Tumore (z.B. Hämangiom, Rhabdomyosarkom usw.), aus gli-I-Amplifikation resultierende Tumore (z.B. Glioblastom, Sarkom usw.), mit ptc-Homolog-TRC8 verbundene Tumore (z.B. Nierenkarzinom, Schilddrüsenkarzinom usw.), Ext-I-verwandte Tumore (z.B. Knochenkrebs usw.), Shh-induzierte Tumore (z.B. Lungenkrebs, Chondrosarkome usw.), Brustkrebs, Urogenitalkrebs (z.B. Niere, Blase, Harnleiter, Prostata usw.), Nebennierenkrebs, Gastrointestinalkrebs (z.B. Magen, Darm usw.), bösartige Neuroektodermtumore des primären ZNS (z.B. bösartiges Medulloblastom), bösartige Gliome, Meningiome, Neuroektodermtumore, Ependymome, Pinealoblastom oder Keratoakanthom.
  31. Verwendung einer Verbindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung unerwünschten Haarwachstums, wobei die Verbindung ein organisches Molekül der allgemeinen Formel (II), wie in einem vorhergehenden Anspruch definiert, ist.
  32. Verwendung nach Anspruch 27, wobei die Zusammensetzung zur topischen Verabreichung formuliert ist.
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