ES2234662T3 - Mediadores de rutas de señalizacion hedgehog, composiciones y usos relacionados con los mismos. - Google Patents

Abstract

Uso de un compuesto para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la hiperproliferación de una célula, en el que el compuesto es una molécula orgánica representada por la **fórmula** en la que, en la medida en que la valencia y la estabilidad lo permitan, R1 y R2, independientemente para cada aparición, representan H, alquilo C1-C10, arilo (sustituido o no sustituido), aralquilo (sustituido o no sustituido), heteroarilo (sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (sustituido o no sustituido); L, independientemente para cada situación, está ausente o representa ¿alquenil-, alquinil-, - (CH2)nO(CH2)p-, -(CH2)nNR2(CH2)p-, -(CH2)nS(CH2)p-, - (CH2)nalquenil(CH2)p-, -(CH2)nalquinil(CH2)p-, - O(CH2)n-, -NR2(CH2)n- o -S(CH2)n-; X se selecciona de ¿N(R8)-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, - ON=CH-, (R8)N-N(R8)-, -ON(R8)-, un heterociclo, o un enlace directo entre L e Y; Y se selecciona de ¿C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR2)-, un grupo heteroaromático, o un enlacedirecto entre X y Z; Z se selecciona de ¿N(R8)-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, - ON=CH-, R8N-NR8-, -ONR8-, un heterociclo, o un enlace directo entre Y y L.

Description

Mediadores de rutas de señalización hedgehog, composiciones y usos relacionados con los mismos.

Antecedentes de la invención

La formación de patrones es la actividad mediante la que las células embrionarias forman disposiciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados. La complejidad física de los organismos superiores surge durante la embriogénesis, mediante la interacción de linajes intrínsecos celulares y señalización extrínseca celular. Las interacciones inductivas son esenciales para la formación de patrones embrionarios en el desarrollo de vertebrados desde el establecimiento inicial de la disposición del cuerpo, hasta la formación de patrones de los sistemas de órganos, hasta la generación de los diversos tipos celulares durante la diferenciación tisular (Davidson, E., (1990) Development 108: 365-389; Gurdon, J.B., (1992) Cell 68: 185-199; Jessell, T.M. et al., (1992) Cell 68: 257-270). Los efectos de las interacciones celulares del desarrollo son diversos. Normalmente, las células que responden se desvían de una ruta de diferenciación celular a otra induciendo a las células que difieren tanto de los estados inducido como no inducido de las células que responden (inducciones). A veces, las células inducen a sus vecinas a que se diferencien como ellas mismas (inducción homeogenética); en otros casos una célula inhibe que sus vecinas se diferencien como ella misma. Las interacciones celulares en el desarrollo temprano pueden ser secuenciales, de manera que una inducción inicial entre dos tipos celulares conduzca a una amplificación progresiva de la diversidad. Además, las interacciones inductivas no sólo se producen en las células embrionarias, sino también en las células adultas, y pueden actuar para establecer y mantener patrones morfogenéticos así como para inducir la diferenciación (J.B. Gurdon (1992) Cell 68:185-199).

Los miembros de la familia Hedgehog de moléculas de señalización median muchos procesos importantes de formación de patrones de corto y largo alcance durante el desarrollo de invertebrados y vertebrados. En la mosca, un único gen hedgehog regula la formación de patrones del disco imaginal y segmental. Por el contrario, en los vertebrados, una familia de genes hedgehog participa en el control de la asimetría izquierda-derecha, polaridad en el SNC, somita y extremidades, organogénesis, condrogénesis y espermatogénesis.

El primer gen hedgehog se identificó mediante una detección genética en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Nüsslein-Volhard, C. y Wieschaus, E. (1980) Nature 287, 795-801). Esta detección identificó varias mutaciones que afectan al desarrollo embrionario y larvario. En 1992 y 1993, se notificó la naturaleza molecular del gen hedgehog (hh) de Drosophila (véase, Lee et al., (1992) Cell 71, 33-50) y desde entonces, se han aislado varios homólogos de hedgehog en diversas especies de vertebrados. Aunque sólo se ha encontrado un gen hedgehog en Drosophila y en otros invertebrados, en los vertebrados están presentes múltiples genes Hedgehog.

La familia en vertebrados de los genes hedgehog incluye al menos cuatro miembros, por ejemplo, parálogos del único gen hedgehog de Drosophila. Genes y proteínas hedgehog ejemplo se describen en las publicaciones PCT WO 95/18856 y WO 96/17924. Tres de estos miembros, denominados en el presente documento Desert hedgehog (Dhh), Sonic hedgehog (Shh) e Indian hedgehog (Ihh), existen aparentemente en todos los vertebrados, incluyendo peces, aves y mamíferos. Un cuarto miembro, denominado en el presente documento tiggie-winkle hedgehog (Thh), parece ser específico de peces. Desert hedgehog (Dhh) se expresa principalmente en los testículos, tanto en el desarrollo embrionario del ratón como en roedores y seres humanos adultos; Indian hedgehog (Ihh) participa en el desarrollo óseo durante la embriogénesis y en la formación ósea en el adulto; y Shh, que tal como se describió anteriormente, participa principalmente en las actividades morfogénicas y neuroinductivas. Dados los papeles inductivos críticos de los polipéptidos hedgehog en el desarrollo y el mantenimiento de los órganos de los vertebrados, la identificación de las proteínas que interaccionan con hedgehog es de primordial importancia tanto en el contexto clínico como de investigación.

Las diversas proteínas Hedgehog consisten en un péptido señal, una región N-terminal altamente conservada y un dominio C-terminal más divergente. Además de la escisión de la secuencia señal en la ruta de secreción (Lee, J.J. et al. (1992) Cell 71:33-50; Tabata, T. et al. (1992) Genes Dev. 2635-2645; Chang, D.E. et al. (1994) Development 120:3339-3353), las proteínas precursoras de Hedgehog experimentan una escisión autoproteolítica interna que depende de las secuencias conservadas en la parte C-terminal (Lee et al. (1994) Science 266:1528-1537; Porter et al. (1995) Nature 374:363-366). Esta autoescisión conduce a un péptido N-terminal de 19 kD y a un péptido C-terminal de 26-28 kD (Lee et al. (1992) citado anteriormente; Tabata et al. (1992) citado anteriormente; Chang et al. (1994) citado anteriormente; Lee et al. (1994) citado anteriormente; Bumcrot, D.A., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 2294-2303; Porter et al. (1995) citado anteriormente; Ekker, S.C. et al. (1995) Curr. Biol. 5:944-955; Lai, C.J. et al. (1995) Development 121:2349-2360). El péptido N-terminal permanece fuertemente asociado con la superficie de las células en las que se sintetizó, mientras que el péptido C-terminal puede difundir libremente tanto in vitro como in vivo (Porter et al. (1995) Nature 374:363; Lee et al., (1994) citado anteriormente; Bumcrot et al. (1995) citado anteriormente; Mart', E. et al. (1995) Development 121: 2537-2547; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445-455). De manera interesante, la retención en la superficie celular del péptido N-terminal depende de la autoescisión, ya que una forma truncada de HH codificada por un ARN que termina precisamente en la posición normal de la escisión interna puede difundir in vitro (Porter et al. (1995) citado anteriormente) e in vivo (Porter, J.A. et al. (1996) Cell 86, 21-34). Estudios bioquímicos han demostrado que la escisión autoproteolítica de la proteína precursora de HH continúa a través de un producto intermedio de tioéster interno, que posteriormente se escinde en una sustitución nucleófila. Es probable que el nucleófilo sea una molécula lipófila pequeña que llega a unirse covalentemente al extremo C-terminal del N-péptido (Porter et al. (1996) citado anteriormente) uniéndolo a la superficie de la célula. Las implicaciones biológicas son profundas. Como resultado de la unión, se genera una alta concentración local del péptido Hedgehog N-terminal sobre la superficie de las células que producen Hedgehog. Es este péptido N-terminal el que es necesario y suficiente para las actividades de señalización Hedgehog de corto y largo alcance en Drosophila y vertebrados (Porter et al. (1995) citado anteriormente; Ekker et al. (1995) citado anteriormente; Lai et al. (1995) citado anteriormente; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445-455; Porter et al. (1996) citado anteriormente; Fietz, M.J. et al. (1995) Curr. Biol. 5:643-651; Fan, C.-M et al. (1995) Cell 81:457-465; Mart', E., et al. (1995) Nature 375:322-325; López-Martínez et al. (1995) Curr. Biol. 5:791-795; Ekker, S. C. et al. (1995) Development 121:2337-2347; Forbes, A.J. et al. (1996) Development 122:1125-1135).

HH se ha implicado en procesos de formación de patrones de corto y largo alcance en diversos sitios durante el desarrollo de Drosophila. En el establecimiento de la polaridad de segmento en los embriones tempranos, tiene efectos de corto alcance que parecen estar mediados directamente, mientras que en la formación de patrones de los discos imaginales, induce efectos de largo alcance mediante la inducción de señales secundarias.

En los vertebrados, se han clonado varios genes hedgehog en los últimos años. De estos genes, Shh ha recibido la mayor parte de la atención experimental, ya que se expresa en diferentes centros de organización que son los orígenes de las señales que forman los patrones de los tejidos circundantes. Las pruebas recientes indican que Shh participa en estas interacciones.

La expresión de Shh empieza poco después del comienzo de la gastrulación en el presunto mesodermo de la línea media, el nódulo en el ratón (Chang et al. (1994) citado anteriormente; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75:1417-1430), la rata (Roelink, H. et al. (1994) Cell 76:761-775) y el pollo (Riddle, R.D. et al. (1993) Cell 75:1401-1416) y en la envoltura en el pez cebra (Ekker et al. (1995) citado anteriormente; Krauss, S. et al. (1993) Cell 75:1431-1444). En los embriones de pollo, el patrón de expresión de Shh en el nódulo desarrolla una asimetría izquierda-derecha, que parece ser responsable de la posición izquierda-derecha del corazón (Levin, M. et al. (1995) Cell 82:803-814).

En el SNC, Shh de la notocorda y la placa basal parece inducir los destinos de las células ventrales. Cuando se expresa ectópicamente, Shh conduce a la ventralización de grandes regiones del mesencéfalo y el rombencéfalo en el ratón (Echelard et al. (1993) citado anteriormente; Goodrich, L.V. et al. (1996) Genes Dev. 10:301-312), Xenopus (Roelink, H, et al. (1994) citado anteriormente, Ruiz i Altaba, A. et al. (1995) Mol. Cell. Neurosci. 6:106-121) y el pez cebra (Ekker et al. (1995) citado anteriormente, Krauss et al. (1993) citado anteriormente; Hammerschmidt, M., et al. (1996) Genes Dev. 10:647-658). En explantes de neuroectodermo intermedio en los niveles de la médula espinal, la proteína Shh induce el desarrollo de la placa basal y las neuronas motoras con distintos umbrales de concentración, la placa basal a concentraciones altas y las neuronas motoras a concentraciones inferiores (Roelink et al. (1995) citado anteriormente; Mart' et al. (1995) citado anteriormente; Tanabe, Y. et al. (1995) Curr. Biol. 5:651-658). Además, el bloqueo de anticuerpos sugiere que se requiere Shh producida por la notocorda para la inducción mediada por la notocorda de los destinos de las neuronas motoras (Mart' et al. (1995) citado anteriormente). Por tanto, la alta concentración de Shh sobre la superficie de las células de la línea media que producen Shh parece explicar la inducción mediada por contacto de la placa basal observada in vitro (Placzek, M. et al. (1993) Development 117:205-218), y la colocación en la línea media de la placa basal inmediatamente por encima de la notocorda in vivo. Las concentraciones inferiores de Shh liberadas de la notocorda y de la placa basal inducen presumiblemente a las neuronas motoras en las regiones ventrolaterales más distantes, en un proceso que se ha demostrado que es independiente del contacto in vitro (Yamada, T. et al. (1993) Cell 73:673-686). En explantes tomados en los niveles del mesencéfalo y el prosencéfalo, Shh también induce los tipos celulares neuronales ventrolaterales apropiados, precursores dopaminérgicos (Heynes, M et al. (1995) Neuron 15:35-44; Wang, M.Z. et al. (1995) Nature Med. 1:1184-1188) y colinérgicos (Ericson, J. et al. (1995) Cell (81:747-756), respectivamente, lo que indica que Shh es un inductor común de la especificación ventral sobre la longitud completa del SNC. Estas observaciones plantean la cuestión de cómo está regulada la respuesta diferencial a Shh en posiciones anteroposteriores particulares.

Shh procedente de la línea media también forma los patrones de las regiones paraxiales del embrión de vertebrados, de los somitas en el tronco (Fan et al. (1995) citado anteriormente) y de la región rostral del mesénquima de la cabeza de los somitas (Hammerschmidt et al. (1996) citado anteriormente). En explantes de mesodermo paraxial de pollo y ratón, Shh fomenta la expresión de marcadores específicos de esclerótomo como Pax1 y Twist, a expensas del marcador de dermamiótomo, Pax3. Además, experimentos con filtro barrera sugieren que Shh media la inducción del esclerótomo directamente, en lugar de mediante activación de un mecanismo de señalización secundario (Fan, C.-M. y Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79, 1175-1186).

Shh también induce la expresión del gen de miótomo (Hammerschmidt et al. (1996) citado anteriormente; Johnson, R.L. et al. (1994) Cell 79:1165-1173; Miinsterberg, A.E. et al. (1995) Genes Dev. 9:2911-2922; Weinberg, E.S. et al. (1996) Development 122:271-280; aunque experimentos recientes indican que se requieren conjuntamente miembros de la familia WNT, homólogos en vertebrados de Drosophila wingless, (Miinsterberg et al. (1995) citado anteriormente). De manera desconcertante, la inducción del miótomo en pollos requiere mayores concentraciones de Shh que la inducción de marcadores de esclerótomo (Münsterberg, et al. (1995) citado anteriormente), aunque el esclerótomo se origina a partir de células somáticas situadas mucho más cerca de la notocorda. Se obtuvieron. resultados similares en el pez cebra, donde altas concentraciones de Hedgehog inducen la expresión génica del marcador de miótomo y reprimen la del marcador de esclerótomo (Hammerschmidt et al. (1996) citado anteriormente). Sin embargo, a diferencia de los amniotas, estas observaciones concuerdan con la arquitectura del embrión del pez, ya que aquí, el miótomo es el componente predominante y más axial de los somitas. Por tanto, la modulación de la señalización de Shh y la adquisición de nuevos factores de señalización puede haber modificado la estructura de los somitas durante la evolución de los vertebrados.

En las yemas de las extremidades de los vertebrados, un subconjunto de células mesenquimáticas posteriores, la "Zona de actividad polarizante" (ZPA), regula la identidad del dedo anteroposterior (revisado en Honig, L.S. (1981) Nature 291:72-73). La expresión ectópica de Shh o la aplicación de perlas empapadas en péptido Shh imita el efecto de los injertos de ZPA anterior, generando una duplicación en imagen especular de los dedos (Chang et al. (1994) citado anteriormente; López-Martínez et al. (1995) citado anteriormente; Riddle et al. (1993) citado anteriormente (figura 2g). Por tanto, la identidad de los dedos parece depender principalmente de la concentración de Shh, aunque es posible que otras señales puedan transmitir esta información a lo largo de distancias sustanciales que parecen requerirse por la formación de patrones AP (100-150 \mum).

De manera similar a la interacción de HH y DPP en los discos imaginales de Drosophila, Shh en las yemas de las extremidades de vertebrados activa la expresión de Bmp2 (Francis, P.H. et al. (1994) Development 120:209-218), un homólogo de dpp. Sin embargo, a diferencia de DPP en Drosophila, Bmp2 no imita el efecto polarizante de Shh en la aplicación ectópica en las yemas de las extremidades del pollo (Francis et al. (1994) citado anteriormente). Además de la formación del patrón anteroposterior, Shh también parece participar en la regulación del crecimiento externo proximodistal de las extremidades, induciendo la síntesis del factor de crecimiento de fibroblastos FGF4 en el reborde ectodérmico apical posterior (Laufer, E. et al. (1994) Cell 79:993-1003; Niswander, L. et al. (1994) Nature 371:609-612).

Es probable que la estrecha relación entre las proteínas Hedgehog y BMP se haya conservado en muchos, pero probablemente no en todos, los sitios de la expresión de Hedgehog en vertebrados. Por ejemplo, en el intestino posterior de pollo, se ha demostrado que Shh induce la expresión de Bmp4, otro homólogo de dpp en vertebrados (Roberts, D.J. et al. (1995) Development 121:3163-3174). Además, Shh y Bmp2, 4 ó 6 muestran una sorprendente correlación en su expresión en las células epiteliales y mesenquimáticas del estómago, el sistema genitourinario, el pulmón, las yemas de los dientes y los folículos pilosos (Bitgood, M.J. y McMahon, A.P. (1995) Dev. Biol. 172:126-138). Además, Ihh, uno de los otros dos genes Hedgehog de ratón, se expresa adyacente a las células que expresan Bmp en el intestino y en el cartílago en desarrollo (Bitgood y McMahon (1995) citado anteriormente).

Las pruebas recientes sugieren un modelo en el que Ihh desempeña un papel crucial en la regulación del desarrollo condrogénico (Roberts et al. (1995) citado anteriormente). Durante la formación del cartílago, los condrocitos avanzan desde un estado proliferativo, a través de un estado intermedio prehipertrófico, hasta condrocitos hipertróficos diferenciados. Ihh se expresa en los condrocitos prehipertróficos e inicia una cascada de señalización que conduce al bloqueo de la diferenciación de los condrocitos. Su diana directa es el pericondrio alrededor del dominio de expresión de Ihh, que responde mediante la expresión de Gli y Patched (Ptc), dianas transcripcionales conservadas de las señales de Hedgehog (véase más adelante). Más probablemente, esto conduce a una señalización secundaria que da como resultado la síntesis de la proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) en el pericondrio periarticular. PTHrP envía por sí misma señales de vuelta a los condrocitos prehipertróficos, bloqueando su diferenciación posterior. Al mismo tiempo, PTHrP reprime la expresión de Ihh, forman así un ciclo de retroalimentación negativo que modula la tasa de diferenciación de los condrocitos.

Patched se identificó originalmente en Drosophila como un gen de polaridad de segmento, uno de un grupo de genes del desarrollo que afectan a la diferenciación celular dentro de los segmentos individuales que se producen en una serie homóloga, junto con el eje anterior-posterior del embrión. Véase Hooper, J.E. et al. (1989) Cell 59:751; y Nakano, Y. et al. (1989) Nature 341:508. Los patrones de expresión del homólogo en vertebrados de patched sugieren su participación en el desarrollo del tubo neural, el esqueleto, las extremidades, la estructura craneofacial y la piel.

Estudios genéticos y funcionales demuestran que patched es parte de la cascada de señalización hedgehog, una ruta evolutivamente conservada que regula la expresión de varios genes en dirección 3' (aguas abajo). Véase Perrimon, N. (1995) Cell 80:517; y Perrimon, N. (1996) Cell 86:513. Patched participa en la represión transcripcional constitutiva de los genes diana; a su efecto se opone una glucoproteína secretada, codificada por hedgehog, o un homólogo en vertebrados, que induce la activación transcripcional. Los genes bajo el control de esta ruta incluyen miembros de las familias Wnt y TGF-beta.

Las proteínas patched poseen dos grandes dominios extracelulares, doce segmentos transmembrana y varios segmentos citoplasmáticos. Véase Hooper, citado anteriormente; Nakano, citado anteriormente; Johnson, R.L. et al. (1996) Science 272:1668; y Hahn H. et al (1996) Cell 85:841. El papel bioquímico de patched en la ruta de señalización hedgehog no está claro. Sin embargo, se ha notificado la interacción directa con la proteína hedgehog (Chen, Y. et al. 81996) Cell 87:553) y patched puede participar en un complejo del receptor de hedgehog, junto con otra proteína transmembrana codificada por el gen smoothened. Véase Perrimon, citado anteriormente; y Chen, citado anteriormente.

El homólogo en los seres humanos de patched se clonó y se mapeó recientemente para el cromosoma 9q22.3. Véase Johnson, citado anteriormente; y Hahn, citado anteriormente. Esta región se ha implicado en el síndrome del nevo basocelular (BCNS), que se caracteriza por anomalías en el desarrollo, incluyendo alteraciones craneofaciales y en las costillas, anomalías de las manos y los pies y espina bífida.

Tumores esporádicos también demostraron una pérdida de los dos alelos funcionales de patched. De doce tumores en los que se identificaron mutaciones de patched con un ensayo de detección de polimorfismo conformacional de cadena simple, nueve tenían deleción cromosómica del segundo alelo y los otros tres tenían mutaciones inactivantes en ambos alelos (Galiani, citado anteriormente). Las alteraciones no se produjeron en el ADN de la línea germinal correspondiente.

La mayoría de las mutaciones identificadas dieron como resultado codones de terminación prematuros o cambios de marco. Lench, N.J. et al., Hum. Genet. 1997 Oct; 100(5-6): 497-502. Sin embargo, varias fueron mutaciones puntuales que condujeron a sustituciones de aminoácidos en cualquiera de los dominios extracelulares o citoplasmáticos. Estos sitios de mutación pueden indicar la importancia funcional de la interacción con proteínas extracelulares o con elementos citoplasmáticos de la ruta de señalización aguas abajo.

La implicación de patched en la inhibición de la expresión génica y la aparición de deleciones alélicas secuenciales de patched en BCC (carcinoma de células basales) apoyan una función de supresión tumoral para este gen. Su papel en la regulación de las familias génicas que se sabe que participan en la señalización celular y en la comunicación intercelular proporciona un posible mecanismo de supresión tumoral.

El documento EP 0 056 637 se refiere a derivados de 4(3H)-quinazolinona, a un procedimiento para su producción y a composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos.

A. Rao et al., Journal of Indian Chem. Soc., vol. 62, nº 3, marzo de 1985, páginas 234-7, trata de la síntesis y las actividades biológicas de ciertos derivados de 3-aril-4(3H)-quinazolinonas.

Singh B.D. et al., Journal of Indian Chem. Soc., vol. 46, nº 1, 1969 se refiere a la síntesis de imidazo[1,5-a]-quinazolonas.

Twari S. S. et. al., Journal Chem. Soc. Pak., 1981, 3(4), páginas 215-17, describe la síntesis de 2-hipuril-3-aril-quinazolinonas y su posible uso como compuestos antifertilidad.

Sumario de la invención

La invención se refiere al uso de compuestos de fórmula general (II) para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la hiperproliferación de una célula. Los compuestos de fórmula general (II), son como sigue:

Fórmula II

1

en la que, en la medida en que la valencia y la estabilidad lo permitan,

R_{1} y R_{2}, independientemente para cada aparición, representan H, alquilo inferior, arilo (sustituido o no sustituido), aralquilo (sustituido o no sustituido), heteroarilo (sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (sustituido o no sustituido);

L, independiente para cada aparición, está ausente o representa -alquilo, -alquenil-, alquinil-, -(CH_{2})_{n}O(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}NR_{2}(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}S(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquenil(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquinil(CH_{2})_{p}-, -O(CH_{2})_{n}-, -NR_{2}(CH_{2})_{n}- o -S(CH_{2})_{n}-;

\newpage

X se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, -ON=CH-, (R_{8})N-N(R_{8})-, -ON(R_{8})-, un heterociclo, o un enlace directo entre L e Y;

Y se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR_{2})-, un grupo heteroaromático, o un enlace directo entre X y Z;

Z se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, -ON=CH-, R_{8}N-NR_{8}-, -ONR_{8}-, un heterociclo, o un enlace directo entre Y y L;

R_{8}, independientemente para cada aparición, representa H, alquilo inferior, arilo (sustituido o no sustituido), aralquilo (sustituido o no sustituido), heteroarilo (sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (sustituido o no sustituido), o dos R_{8} tomados juntos forman un anillo de 4 a 8 miembros, junto con los átomos a los que están unidos, anillo que puede incluir uno o más carbonilos;

W representa un anillo bencénico o piridónico, sustituido o no sustituido, condensado al anillo de pirimidona;

p representa, independientemente para cada aparición, un número entero desde 0 hasta 10; y n, individualmente para cada aparición, representa un número entero desde 0 hasta 10.

En ciertas realizaciones, R_{1} representa un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, X-Y-Z tomados juntos representa una urea o una amida. En ciertas realizaciones, W es un anillo bencénico sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, X representa diazacarbociclo. En ciertas realizaciones, R_{2} representa un grupo arilo o heteroarilo, sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, R_{8}, independientemente para cada aparición, se selecciona de H y alquilo inferior. En ciertas realizaciones, X se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S- y un enlace directo; Y se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)- y -S(O_{2})-; y Z se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S- y un enlace directo, de manera que al menos uno de X y Z esté presente. En ciertas realizaciones, al menos uno de X y Z está presente. En ciertas realizaciones, Y se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)- y -S(O_{2})-.

En ciertas realizaciones, el antagonista de hedgehog inhibe la transducción de la señal mediada por hedgehog con una DE_{50} de 1 mM o menos, 1 \muM o menos, 100 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos. La célula puede contactar con el antagonista de hedgehog in vitro o in vivo. En ciertas realizaciones, el antagonista de hedgehog se administra como parte de una aplicación terapéutica o cosmética, tal como regulación de los tejidos neuronales, la formación y reparación de hueso y cartílago, la regulación de la espermatogénesis, la regulación del músculo liso, la regulación del pulmón, el hígado y de otros órganos que provienen del intestino primitivo, la regulación de la función hematopoyética o la regulación del crecimiento de la piel y el cabello.

Todavía en otro aspecto, la invención se refiere al uso de un compuesto que tiene la estructura general de la Fórmula II:

Fórmula II

2

en la que, en la medida en que la valencia y la estabilidad lo permitan,

R_{1} y R_{2}, independientemente para cada aparición, representan H, alquilo inferior, -(CH_{2})_{n}-arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o -(CH_{2})_{n}-heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido);

\newpage

L, independientemente para cada aparición, está ausente o representa -alquilo, -alquenil-, alquinil-, -(CH_{2})_{n}O
(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}NR_{2}(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}S(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquenil(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquinil(CH_{2})_{p}-, -O(CH_{2})_{n}-, -NR_{2}
(CH_{2})_{n}- o -S(CH_{2})_{n}-;

X es -NH-;

Y se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR_{2})-, un grupo heteroaromático, o un enlace directo entre X y Z;

Z se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, -ON=CH-, R_{8}N-NR_{8}-, -ONR_{8}-, un heterociclo, o un enlace directo entre Y y L;

R_{8}, independientemente para cada aparición, representa H, alquilo inferior, -(CH_{2})_{n}-arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), -(CH_{2})_{n}-heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o dos R_{8} tomados juntos forman un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo con X_{1} y Z_{1} o X_{2} y Z_{2}, anillo que puede incluir uno o más carbonilos;

W representa un anillo bencénico o piridónico, sustituido o no sustituido, condensado al anillo de pirimidona;

p representa, independientemente para cada aparición, un número entero desde 0 hasta 10, preferiblemente de 0 a 3; y n, individualmente para cada aparición, representa un número entero desde 0 hasta 10, preferiblemente de 0 a 5.

En ciertas realizaciones, L adyacente a X representa -(alquilo inferior no ramificado)-. En ciertas realizaciones, R_{1} representa un anillo arilo o heteroarilo no sustituido, o un anillo arilo o heteroarilo sustituido con sustituyentes seleccionados de H, halógeno, ciano, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, hidroxilo, (alquil-O no ramificado), sililoxilo, amino, nitro, tiol, amino, imino, amido, fosforilo, fosfonato, fosfina, carbonilo, carboxilo, carboxamida, anhídrido, sililo, tioeter, alquil-sulfonilo, aril-sulfonilo, sulfóxido, selenoéter, cetona, aldehído, éster o -(CH_{2})_{m}-R_{8}.

En ciertas realizaciones, R_{1} representa un anillo arilo o heteroarilo no sustituido, o un anillo arilo o heteroarilo sustituido con sustituyentes seleccionados de H, halógeno, ciano, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, nitro, tiol, imino, amido, carbonilo, carboxilo, anhídrido, tioeter, alquil-sulfonilo, aril-sulfonilo, cetona, aldehído y éster. En ciertas realizaciones, R_{1} representa un anillo arilo o heteroarilo no sustituido, o un anillo arilo o heteroarilo sustituido con sustituyentes seleccionados de H, halógeno, ciano, alquilo, alquenilo, alquinilo, nitro, amido, carboxilo, anhídrido, alquil-sulfonilo, cetona, aldehído y éster. En ciertas realizaciones, R_{2} es arilo sustituido o no sustituido o un anillo heteroarilo. En ciertas realizaciones, X-Y-Z representa una unión amida o urea. En ciertas realizaciones, R_{8} representa H para todas las apariciones. En ciertas realizaciones, R_{2} es un anillo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, L está ausente adyacente a R_{1}.

En ciertas realizaciones, el compuesto tiene una estructura seleccionada de las estructuras representadas en las Figuras 32j, k y l,

3

La síntesis de los compuestos usados según la invención puede implicar un método de preparación de un compuesto bicíclico, que comprende calentar una mezcla de reacción que comprende un compuesto que tiene una estructura de Fórmula X con un anhídrido de ácido carboxílico según el esquema:

4

en el que W representa un anillo arilo o heteroarilo, y

R_{10} representa alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, aralquilo o heteroaralquilo sustituido o no sustituido, y en el que el anhídrido tiene una estructura de (R_{10}CH_{2}C=O)_{2}O, en la que R' es CH_{2}R_{10}.

En ciertas realizaciones, la mezcla de reacción consiste esencialmente en el compuesto de fórmula X y el anhídrido de ácido carboxílico al comienzo de la reacción.

La síntesis también puede implicar un método para preparar una amina, que comprende el poner en contacto un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XIII con una amina que tiene una estructura de H_{2}NR_{12} según el esquema:

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en el que W representa un anillo arilo o heteroarilo:

R_{1} representa H, alquilo inferior, -(CH_{2})_{n}-arilo o -(CH_{2})_{n}-heteroarilo;

L está ausente o representa -(CH_{2})_{n}-alquilo, -alquenil-, alquinil-, -(CH_{2})_{n}-alquenil-, -(CH_{2})_{n}-alquinil-, -(CH_{2})_{n}
O(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}NR_{2}(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}S(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquenil(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquinil(CH_{2})_{p}-, -O(CH_{2})_{n}-, -NR_{2}(CH_{2})_{n}- o -S(CH_{2})_{n}-;

Y representa halógeno;

R_{10} representa alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, aralquilo o heteroaralquilo sustituido o no sustituido; y

R_{12} representa un grupo alquilo inferior o un grupo sililo,

en el que la amina y el compuesto que tiene una estructura de Fórmula XIII se combinan con un disolvente polar que comprende menos de aproximadamente un 50% de agua.

En ciertas realizaciones, el disolvente polar comprende alcohol. En ciertas realizaciones el alcohol se selecciona de metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, t-butanol, sec-butanol, etilenglicol, y 1,3-propanodiol.

La síntesis también puede implicar un método para preparar un compuesto que comprende el realizar las etapas según el siguiente esquema:

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en el que la etapa (A) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de Fórmula X, en la que W representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido, tal como un anillo benceno, que tiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico en posiciones adyacentes (orto), con un agente acilante que tiene la fórmula R_{10}CH_{2}C(=O)X', en la que R_{10} independientemente de cada aparición, representa alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, aralquilo o heteroaralquilo sustituido o no sustituido, y X' representa un halógeno o -OC(=O)CH_{2}R_{10}, en condiciones que producen un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XI;

la etapa (B) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XI con una amina que tiene la fórmula R_{1}LNH_{2}, en la que R_{1} y L son como se ha definido anteriormente, en condiciones que dan como resultado un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XII;

la etapa (C) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XII con un agente halogenante, tal como cloro, bromo, yodo, N-bromosuccinimida, N-clorosuccinimida, N-yodosuccinimida, ClBr, IBr, ClI, o un reactivo que genera un radical halógeno (tal como Cl; Br; o I) en condiciones que dan como resultado un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XIII, en la que Y' representa un halógeno tal como Cl, Br o I;

la etapa (D) comprende hacer reaccionar un compuesto que tienen una estructura de Fórmula XIII, con una amina que tiene la fórmula H_{2}NR_{12}; en la que R_{12} representa un grupo alquilo inferior o un grupo sililo, tal como un grupo trialquilsililo, triarilsililo, dialquilarilsililo o diarilalquilsililo, en condiciones que dan como resultado un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XIV; y

la etapa (E) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XIV con un grupo de terminación que tiene una estructura R_{2}V' para producir un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XX, en la que R_{2} es según se ha definido anteriormente, y V' representa un grupo funcional seleccionado de ZC(=W)Cl, ZC(=W)Br, isocianato, isotiocianato, ZC(=W)WC(=W)ZR_{2}, ZSO_{2}Cl, ZSO_{2}Br, ZSOCl, ZSOBr, o un resto acilante activado preparado in situ.

La síntesis también puede implicar un método para preparar un compuesto, que comprende realizar etapas según el esquema:

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en el que la etapa (A) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XV, en la que P' representa H o un grupo protector, W representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido, tal como un anillo benceno, que tiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico o éster en posiciones adyacentes (orto), con un agente acilante que tiene la fórmula PXLC(=O)X', en la que X y L son como se ha definido anteriormente, P representa un grupo protector, y X' representa un halógeno, -OX(=O)LXP, o un grupo funcional generado haciendo reaccionar un grupo carboxilo con un agente activante, tal como carbodiimida (por ejemplo, diisopropilcarbodiimida, diciclohexilcarbodiimida, 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, etc.) reactivos basados en fósforo (tales como BOP-Cl, PyBROP, etc.) cloruro de oxalilo, fosgeno, trifosgeno, carbonildiimidazol, o cualquier otro reactivo que reaccione con un grupo ácido carboxílico dando como resultado un intermedio reactivo que tiene una incrementada susceptibilidad, relativa al ácido carboxílico, frente al acoplamiento con una amina, en condiciones que producen un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XVI;

la etapa (B) comprende desproteger el éster de un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XVI para producir un ácido carboxílico que tiene una estructura de Fórmula XVII, si fuera necesario;

la etapa (C) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XVII con una amina que tiene la fórmula R_{1}LNH_{2}, en la que R_{1} y L son como se ha definido anteriormente, en condiciones que dan como resultado un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XVIII;

la etapa (D) comprende eliminar el grupo protector P de un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XVIII para generar un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XIX;

la etapa (E) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XIX con un grupo de terminación que tiene una estructura R_{2}Y' para producir un compuesto que tiene una estructura de Fórmula XXI, en la que R_{2} es según se ha definido anteriormente, e Y' representa un grupo funcional seleccionado de ZC(=W)Cl, ZC(=W)Br, isocianato, isotiocianato, ZC(=W)WC(=W)ZR_{2}, ZSO_{2}Cl, ZSO_{2}Br, ZSOCl, ZSOBr, o un resto acilante activado preparado in situ.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1-31 representan reacciones útiles para sintetizar compuestos según la presente invención.

Las figuras 32a-1 ilustran compuestos representativos según la presente invención.

La figura 33 presenta los resultados de pruebas biológicas de un compuesto ejemplo de la invención.

La figura 34 presenta los efectos de un compuesto ejemplo de la invención sobre tejido pulmonar.

Descripción detallada de la invención I Perspectiva general

La presente invención se refiere al descubrimiento de que las rutas de transducción de señal reguladas por
hedgehog, patched (ptc), gli y/o smoothened pueden inhibirse, al menos en parte, mediante moléculas pequeñas. Aunque no se desea restringirse a ninguna teoría particular, la activación de un receptor puede ser el mecanismo por el que actúan estos agentes. Por ejemplo, la capacidad de estos agentes para inhibir la proliferación de células de pérdida de función patched (ptc^{lof}) puede deberse a la capacidad de tales moléculas para interaccionar con hedgehog, patched o smoothened, o al menos para interferir con la capacidad de esas proteínas para activar una ruta de transducción de señal mediada por hedgehog, ptc y/o smoothened.

Por tanto, se contempla específicamente que estas moléculas pequeñas que interfieren con aspectos de la actividad de transducción de señal hedgehog, ptc o smoothened, podrán asimismo inhibir la proliferación (u otras consecuencias biológicas) en células que tienen un fenotipo de ganancia de función hedgehog. En las realizaciones preferidas, los inhibidores objeto son moléculas orgánicas que tienen un peso molecular inferior a 2500 amu, más preferiblemente inferior a 1500 amu e incluso más preferiblemente, inferior a 750 amu, y pueden inhibir al menos algunas de las actividades biológicas de las proteínas hedgehog, preferiblemente de manera específica en las células diana.

Por tanto, los métodos de la presente invención incluyen el uso de pequeñas moléculas que son agonistas de la inhibición de ptc de la señalización hedgehog en la regulación de la reparación y/o el rendimiento funcional de una amplia variedad de células, tejidos y órganos que tienen el fenotipo de ganancia de función hedgehog. Por ejemplo, el método objeto tiene aplicaciones terapéuticas y cosméticas que oscilan desde la regulación de los tejidos neuronales, la formación y reparación de hueso y cartílago, la regulación de la espermatogénesis, la regulación del músculo liso, la regulación del pulmón, el hígado y tejido de otros órganos que provienen del intestino primitivo, la regulación de la función hematopoyética, la regulación del crecimiento de la piel y el pelo, etc. Además, los métodos objeto pueden llevarse a cabo en las células que se obtienen en cultivo (in vitro), o en las células en un animal completo (in vivo). Véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 95/18856 y WO 96/17924 (cuyas memorias descriptivas se incorporan expresamente como referencia al presente documento).

En una realización preferida, el uso objeto puede ser tratar células epiteliales que tienen un fenotipo de ganancia de función hedgehog.

En otra realización preferida, el uso objeto puede utilizarse como parte de un régimen de tratamiento para meduloblastoma maligno y otros tumores neuroectodérmicos primitivos malignos del SNC.

En otro aspecto, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden, como principio activo, un antagonista de hedgehog o un agonista de ptc, tal como se describe en el presente documento, formuladas en una cantidad suficiente para inhibir, in vivo, la proliferación u otras consecuencias biológicas de la ganancia de función hedgehog.

Los tratamientos objeto que utilizan antagonistas de hedgehog pueden ser eficaces tanto para sujetos animales como humanos. Los sujetos animales a los que se puede aplicar la invención abarcan los animales domésticos y el ganado, criados tanto como mascotas o para propósitos comerciales. Ejemplos son perros, gatos, reses, caballos, ovejas, cerdos y cabras.

II. Definiciones

Por conveniencia, ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas se reúnen aquí.

La expresión "modificación o mutación aberrante" de un gen se refiere a lesiones genéticas tales como, por ejemplo, deleciones, sustitución o adición de nucleótidos a un gen, así como a redisposiciones cromosómicas burdas del gen y/o metilación anómala del gen. Asimismo, la alteración en la expresión de un gen se refiere a niveles aberrantes de transcripción del gen en relación con los niveles en una célula normal en condiciones similares, así como el proceso de corte y empalme de tipo no natural del ARNm transcrito a partir del gen.

Los "carcinomas de células basales" existen en una variedad de formas clínicas e histológicas, tal como nodulares-ulcerativos, superficiales, pigmentados, de tipo morfea, fibroepiteliomas y síndrome nevoide. Los carcinomas de células basales son los neoplasmas cutáneos más comunes encontrados en los seres humanos. La mayoría de los nuevos casos de cánceres cutáneos distintos a melanoma están dentro de esta categoría.

"Heridas falsas" se refiere a casos en los que grandes áreas superficiales de la piel se han eliminado o perdido de un individuo debido a calor y/o agentes químicos.

El término "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno compuesto de células epiteliales que tienden a infiltrar los tejidos circundantes y dar lugar a metástasis. Ejemplos de carcinomas incluyen: "carcinoma de células basales", que es un tumor epitelial de la piel que, aunque rara vez es metastásico, tiene potencialidades para invasión y destrucción locales, "carcinoma de células escamosas", que se refiere a carcinomas que surgen del epitelio escamoso y que tienen células cuboides; "carcinosarcoma", que incluye tumores malignos compuestos de tejidos carcinomatosos y sarcomatosos; "carcinoma adenoquístico", carcinoma caracterizado por cilindros o bandas de estroma hialino o mucinoso separados o rodeados por nidos o cordones de células epiteliales pequeñas, que se producen en las glándulas mamarias y salivares y glándulas mucosas del tracto respiratorio; "carcinoma epidermoide", que se refiere a células cancerosas que tienden a diferenciarse de la misma forma que las de la epidermis; es decir, tienden a formar células espinosas y experimentan cornificación; "carcinoma nasofaríngeo", que se refiere a un tumor maligno que surge en el revestimiento epitelial del espacio situado detrás de la nariz; y "carcinoma de células renales", que está relacionado con el carcinoma del parénquima renal compuesto de células tubulares en diversas disposiciones. Otros crecimientos epiteliales carcinomatosos son "papilomas", que se refieren a tumores benignos derivados del epitelio y que tienen un papilomavirus como agente causante; y "quistes epidermoides", que se refieren a un tumor cerebral o meníngeo formado por la inclusión de elementos ectodérmicos en el momento del cierre del surco
neural.

El "corion" o "dermis" se refiere a la capa de la piel por debajo de la epidermis, que consiste en un lecho denso de tejido conectivo vascular y que contiene los nervios y los órganos terminales de los sentidos. Las raíces foliculares y las glándulas sebáceas y sudoríparas son estructuras de la epidermis que están profundamente incluidas en la dermis.

El "tejido dental" se refiere al tejido en la boca que es similar al tejido epitelial, por ejemplo, el tejido de la encía. El método de la presente invención es útil para tratar la enfermedad periodontal.

Las "úlceras cutáneas dérmicas" se refieren a lesiones en la piel producidas por pérdida superficial de tejido, normalmente con inflamación. Las úlceras cutáneas dérmicas que pueden tratarse por el método de la presente invención incluyen úlceras de decúbito, úlceras diabéticas, úlceras por insuficiencia venosa y úlceras arteriales. Las heridas de decúbito se refieren a úlceras crónicas que resultan de la presión aplicada a zonas de la piel durante periodos de tiempo prolongados. Las heridas de este tipo a menudo se denominan úlceras por decúbito o úlceras por presión. Las úlceras por insuficiencia venosa resultan del estancamiento de la sangre o de otros fluidos de venas defectuosas. Las úlceras arteriales se refieren a piel necrótica en la zona alrededor de las arterias que tienen escaso flujo de sangre.

El término "DE_{50}" significa la dosis de un fármaco que produce el 50% de su respuesta o efecto máximos.

Una "cantidad eficaz" de, por ejemplo, un antagonista de hedgehog, con respecto al método objeto de tratamiento, se refiere a una cantidad del antagonista en una preparación que, cuando se aplica como parte de un régimen de dosificación deseado provoca, por ejemplo, un cambio en la tasa de proliferación celular y/o en el estado de diferenciación de una célula y/o en la tasa de supervivencia de una célula según criterios clínicamente aceptables para el trastorno que va a tratarse o para el propósito cosmético.

Los términos "epitelia", "epitelial" y "epitelio" se refieren al revestimiento celular de las superficies corporales internas y externas (cutánea, mucosa y serosa), que incluyen las glándulas y otras estructuras derivadas de las mismas, por ejemplo, queratinocitos, células esofágicas, epidérmicas y epiteliales del folículo piloso. Otros tejidos epiteliales ejemplo incluyen: epitelio olfativo, que es el epitelio pseudoestratificado que reviste la región olfativa de la cavidad nasal, y que contiene los receptores para el sentido del olfato; el epitelio glandular, que se refiere al epitelio compuesto de células secretoras; el epitelio escamoso que se refiere al epitelio compuesto de células aplanadas similares a placas. El término epitelio también puede referirse al epitelio de transición, como el que se encuentra característicamente revistiendo los órganos huecos que están sometidos a un gran cambio mecánico debido a contracción y distensión, por ejemplo, tejido que representa una transición entre el epitelio escamoso estratificado y el columnar.

El término "epitelialización" se refiere a la curación por el crecimiento de tejido epitelial sobre una superficie desnudada.

El término "glándula epidérmica" se refiere a una agregación de células asociadas con la epidermis y especializadas en secretar o excretar materiales no relacionados con sus necesidades metabólicas ordinarias. Por ejemplo, las "glándulas sebáceas" son glándulas holocrinas en el corion que secretan una sustancia oleosa y sebo. El término "glándulas sudoríparas" se refiere a las glándulas que secretan sudor, situadas en el corion o tejido subcutáneo, que se abren mediante un conducto en la superficie del cuerpo.

El término "epidermis" se refiere a la capa más externa y no vascularizada de la piel, derivada del ectodermo embrionario, que varía en espesor desde 0,07-1,4 mm. En las superficies palmar y plantar comprende, de dentro afuera, cinco capas: capa basal compuesta de células cilíndricas dispuestas perpendicularmente; capa espinosa o de células espinosas compuesta de células polihédricas aplanadas con prolongaciones cortas o espinas; capa granular compuesta de células granulares aplanadas, capa clara compuesta de varias capas de células transparentes, claras, en las que los núcleos son vagos o están ausentes; y capa córnea compuesta de células aplanadas, cornificadas y anucleadas. En la epidermis de la superficie corporal general, la capa clara normalmente está ausente.

Las "heridas de excisión" incluyen, desgarramientos, abrasiones, cortes, pinchazos o laceraciones en la capa epitelial de la piel y pueden extenderse a la capa dérmica e incluso a la grasa subcutánea y más abajo. Las heridas de excisión pueden resultar de intervenciones quirúrgicas o de penetración accidental de la piel.

El "estado de crecimiento" de una célula se refiere a la tasa de proliferación de la célula y/o al estado de diferenciación de la célula. Un "estado de crecimiento alterado" es un estado de crecimiento caracterizado por una tasa anómala de proliferación, por ejemplo, una célula que muestra un aumento o disminución de la tasa de proliferación con relación a una célula normal.

El término "pelo" se refiere a una estructura filiforme, especialmente la estructura epidérmica especializada compuesta de queratina y que se desarrolla a partir de una papila hundida en el corion, producido sólo por los mamíferos y característico de este grupo de animales. Además, "pelo" puede referirse al conjunto de tales pelos. Un "folículo piloso" se refiere a una de las invaginaciones tubulares de la epidermis que encierra los pelos, y a partir de la cual crecen los pelos. Las "células epiteliales del folículo piloso" se refieren a las células epiteliales que rodean a la papila dérmica en el folículo piloso, por ejemplo, células madre, células de la vaina radicular externa, células de la matriz y células de la vaina radicular interna. Tales células pueden ser células normales no malignas, o células transformadas/inmortalizadas.

El término "antagonista de hedgehog" se refiere a un agente que potencia o recapitula la bioactividad de patched, tal como para reprimir la transcripción de los genes diana. Los antagonistas de hedgehog preferidos pueden utilizarse para superar una pérdida de función ptc y/o una ganancia de función smoothened, denominándose también estos últimos antagonistas de smoothened. El término "antagonista de hedgehog", tal como se usa en el presente documento, se refiere no sólo a cualquier agente que pueda actuar inhibiendo directamente la función normal de la proteína hedgehog, sino también a cualquier agente que inhiba la ruta de señalización hedgehog y, por tanto, recapitula la función de ptc.

El término "ganancia de función hedgehog" se refiere a una modificación o mutación aberrante de un gen ptc, un gen hedgehog, o un gen smoothened, o una disminución (o pérdida) en el nivel de expresión de tal gen, lo que da como resultado un fenotipo que se asemeja a poner en contacto una célula con una proteína hedgehog, por ejemplo, la activación aberrante de una ruta hedgehog. La ganancia de función puede incluir una pérdida de la capacidad del producto del gen ptc para regular el nivel de expresión de los genes Ci, por ejemplo, Gli1, Gli2 y Gli3. El término "ganancia de función hedgehog" también se usa en el presente documento para referirse a cualquier fenotipo celular similar (por ejemplo, que muestra proliferación en exceso) que se produce debido a una alteración en cualquier lugar de la ruta de transducción de señal hedgehog, incluyendo, pero sin limitarse a, una modificación o mutación del propio hedgehog. Por ejemplo, una célula tumoral con una tasa de proliferación anómalamente alta debido a la activación de la ruta de señal hedgehog tendría un fenotipo de "ganancia de función hedgehog", aun cuando hedgehog no estuviera mutado en esa célula.

Tal como se usa en el presente documento, "células inmortalizadas" se refiere a células que se han modificado mediante medios químicos y/o recombinantes, de manera que las células puedan crecer a través de un número indefinido de divisiones en el cultivo.

"Tejido epitelial interno" se refiere al tejido dentro del cuerpo que tiene características similares a la capa epidérmica de la piel. Ejemplos incluyen el revestimiento del intestino. El método de la presente invención es útil para estimular la curación de ciertas heridas internas, por ejemplo, heridas que resultan de la cirugía.

El término "queratosis" se refiere al trastorno cutáneo proliferativo caracterizado por hiperplasia de la capa córnea de la epidermis. Trastornos queratósicos ejemplo incluyen queratosis folicular, queratosis palmar y plantar, queratosis faríngea, queratosis pilar y queratosis actínica.

El término "DL_{50}" significa la dosis de un fármaco que es letal en el 50% de los sujetos de prueba.

El término "uña" se refiere a la placa cutánea córnea sobre la superficie dorsal del extremo distal de un dedo de la mano o del pie.

El término "pérdida de función patched" se refiere a una modificación o mutación aberrante de un gen ptc, o una disminución en el nivel de expresión del gen, lo que da como resultado un fenotipo que se asemeja a poner en contacto una célula con una proteína hedgehog, por ejemplo, la activación aberrante de una ruta hedgehog. La pérdida de función puede incluir una pérdida de la capacidad del producto del gen ptc para regular el nivel de expresión de los genes Ci, por ejemplo, Gli1, Gli2 y Gli3.

Un "paciente" o "sujeto" que tiene que tratarse por el método objeto puede significar o bien un ser humano o un animal no humano.

El término "profármaco" se pretende que englobe compuestos que, en condiciones fisiológicas, se convierten en principios terapéuticamente activos de la presente invención. Un método común de obtener un profármaco es incluir restos seleccionados que se hidrolizan en condiciones fisiológicas para revelar la molécula deseada. En otras realizaciones, el profármaco se convierte mediante una actividad enzimática del animal huésped.

Tal como se usa en el presente documento, "que prolifera" y "proliferación" se refiere a células que experimentan mitosis.

Durante la totalidad de esta solicitud, el término "trastorno cutáneo proliferativo" se refiere a cualquier enfermedad/trastorno de la piel caracterizado por proliferación no deseada o aberrante del tejido cutáneo. Estos estados se caracterizan normalmente por proliferación de células epidérmicas o diferenciación celular incompleta, e incluyen, por ejemplo, ictiosis asociada al cromosoma X, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, hiperqueratosis epidermolítica y dermatitis seborreica. Por ejemplo, la epidermodisplasia es una forma de desarrollo defectuoso de la epidermis. Otro ejemplo es la "epidermólisis", que se refiere a un estado de flacidez de la epidermis con formación de vesículas y ampollas, o bien espontáneamente o en el sitio de un traumatismo.

Tal como se usa en el presente documento, "psoriasis" se refiere a un trastorno cutáneo hiperproliferativo que altera los mecanismos reguladores de la piel. En particular, se forman lesiones que incluyen alteraciones primarias y secundarias en la proliferación epidérmica, respuestas inflamatorias de la piel y una expresión de moléculas reguladoras, tal como linfocinas y factores inflamatorios. La piel psoriásica se caracteriza morfológicamente por un aumento del recambio de las células epidérmicas, epidermis engrosada, queratinización anómala, infiltrados celulares inflamatorios en la capa dérmica e infiltración de leucocitos polimorfonucleares en la capa epidérmica, dando como resultado un aumento del ciclo celular basal. Adicionalmente, están presentes células hiperqueratósicas y paraqueratósicas.

El término "piel" se refiere a la cubierta protectora externa del cuerpo, que consiste en el corion y la epidermis, y se entiende que incluye las glándulas sudoríparas y sebáceas, así como las estructuras del folículo capilar. Durante la totalidad de la presente solicitud, puede utilizarse el adjetivo "cutáneo" y debe entenderse que se refiere generalmente a características de la piel, según sea apropiado para el contexto en el que utilizan.

El término "ganancia de función smoothened" se refiere a una modificación o mutación aberrante de un gen smo, o un aumento en el nivel de expresión del gen, lo que da como resultado un fenotipo que se asemeja a poner en contacto una célula con una proteína hedgehog, por ejemplo, la activación aberrante de una ruta hedgehog. Aunque no se desea restringirse a ninguna teoría particular, se observa que ptc puede no señalizar directamente en la célula, sino que más bien interacciona con smoothened, otra proteína de unión de membrana situada aguas abajo de ptc en la señalización hedgehog (Marigo et al., (1996) Nature 384: 177-179). El gen smo es un gen de polaridad de segmento requerido para la correcta formación del patrón de cada segmento en Drosophila (Alcedo et al., (1996) Cell 86:221-232). Se han identificado homólogos en seres humanos de smo. Véase, por ejemplo, Stone et al. (1996) Nature 384:129-134, y el número de registro U84401 del GenBank. El gen smoothened codifica para una proteína integral de membrana que es característica de los receptores heterotrimétricos asociados a las proteínas G; es decir, 7 regiones transmembrana. Esta proteína muestra homología con la proteína Frizzle (Fz) de Drosophila, un miembro de la ruta wingless. Originalmente se pensó que smo codifica para un receptor de la señal Hh. Sin embargo, esta sugerencia se desmintió posteriormente, ya que se obtuvo la evidencia de que ptc era el receptor de Hh. Las células que expresan Smo no se unen a Hh, lo que indica que smo no interacciona directamente con Hh (Nusse, (1996) Nature 384:119-120). En cambio, se cree que la unión de Sonic hedgehog (SHH) a su receptor, PTCH, evita la inhibición normal por PTCH de smoothened (SMO), una proteína del espacio transmembrana.

Recientemente, se ha notificado que las mutaciones activadoras de smoothened se producen en el carcinoma esporádico de células basales, Xie et al. (1998) Nature 391:90-2, y en los tumores neuroectodérmicos primitivos del sistema nervioso central. Reifengerger et al. (1998) Cancer Res 58: 1798-803.

El término "índice terapéutico" se refiere al índice terapéutico de un fármaco definido como DL_{50}/DE_{50}.

Tal como se usa en el presente documento, "células transformadas" se refiere a células que se han convertido espontáneamente a un estado de crecimiento incontrolado, es decir, han adquirido la capacidad de crecer en un número indefinido de divisiones en cultivo. Las células transformadas pueden estar caracterizadas por términos tales como neoplásicas, anaplásicas y/o hiperplásicas, con respecto a su pérdida de control del crecimiento.

El término "acilamino" está reconocido en la técnica y se refiere a un resto que puede representarse por la fórmula general:

8

en la que R_{9} es tal como se definió anteriormente y R'_{11} representa un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo o -(CH_{2})_{m}-R_{8}, en el que m y R_{8} son tal como se definieron anteriormente.

En el presente documento, el término "grupo alifático" se refiere a un grupo hidrocarburo de cadena lineal, cadena ramificada o alifático cíclico, e incluye grupos alifáticos saturados e insaturados, tal como un grupo alquilo, un grupo alquenilo, y un grupo alquinilo.

Los términos "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a grupos alifáticos insaturados análogos en longitud y la posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un doble o triple enlace, respectivamente.

Los términos "alcoxilo" o "alcoxi", tal como se usan en el presente documento, se refieren a un grupo alquilo, tal como se definió anteriormente, que tiene un radical oxígeno unido al mismo. Grupos alcoxilo representativos incluyen, metoxilo, etoxilo, propiloxilo, terc-butoxilo y similares. Un "éter" son dos hidrocarburos unidos covalentemente mediante un oxígeno. En consecuencia, el sustituyente de un alquilo que convierte ese alquilo en un éter es o se asemeja a un alcoxilo, tal como puede estar representado por uno de -O-alquilo, O-alquenilo, -O-alquinilo, -O-(CH_{2})_{m}-R_{8}, en el que m y R_{8} son tal como se definieron anteriormente.

El término "alquilo" se refiere al radical de grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (alicíclicos), grupos cicloalquilo alquil-sustituidos y grupos alquilo cicloalquil-sustituidos. En las realizaciones preferidas, un alquilo de cadena lineal o cadena ramificada tiene 30 átomos de carbono o menos en el esqueleto (por ejemplo, C_{1}-C_{30} para las cadenas lineales, C_{3}-C_{30} para las cadenas ramificadas), y más preferiblemente 20 o menos. Asimismo, los cicloalquilos preferidos tienen desde 3-10 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferiblemente tienen 5, 6 ó 7 carbonos en la estructura de anillo.

Además, el término "alquilo" (o "alquilo inferior"), tal como se usa durante la totalidad de la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones, pretende incluir tanto los "alquilos no sustituidos" como los "alquilos sustituidos", refiriéndose estos últimos a restos de alquilo que tienen sustituyentes que reemplazan un hidrógeno en uno o más de los carbonos del esqueleto hidrocarbonado. Tales sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, un halógeno, un hidroxilo, un carbonilo (tal como un carboxilo, un alcoxicarbonilo, un formilo, o un acilo), un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato o un tioformiato), un alcoxilo, un fosforilo, un fosfato, un fosfonato, un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano, un nitro, un azido, un sulfhidrilo, un alquiltio, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoílo, un sulfonamido, un sulfonilo, un heterociclilo, un aralquilo o un resto aromático o heteroaromático. Los expertos en la técnica entenderán que los restos sustituidos en la cadena hidrocarbonada pueden estar sustituidos ellos mismos, si resulta apropiado. Por ejemplo, los sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas sustituidas y no sustituidas de amino, azido, imino, amido, fosforilo (incluyendo fosfonato y fosfinato), sulfonilo (incluyendo sulfato, sulfonamido, sulfamoílo y sulfonato), y grupos sililo, así como éteres, alquiltios, carbonilos (incluyendo cetonas, aldehídos, carboxilatos y ésteres), -CF_{3}, -CN y similares. Alquilos sustituidos ejemplo se describen más adelante. Los cicloalquilos pueden estar sustituidos adicionalmente con alquilos, alquenilos, alcoxilos, alquiltios, aminoalquilos, alquilos carbonil-sustituidos, -CF_{3}, -CN y similares.

A menos que el número de carbonos se especifique de otra manera, "alquilo inferior", tal como se usa en el presente documento, significa un grupo alquilo, tal como se definió anteriormente, pero que tiene desde uno hasta diez carbonos, más preferiblemente desde uno hasta seis átomos de carbono en su estructura del esqueleto. Asimismo, "alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" tienen longitudes de cadena similares. Durante la totalidad de la solicitud, los grupos alquilo preferidos son alquilos inferiores. En las realizaciones preferidas, un sustituyente designado en el presente documento como alquilo es un alquilo inferior.

El término "alquiltio" se refiere a un grupo alquilo, tal como se definió anteriormente, que tiene un radical de azufre unido al mismo. En las realizaciones preferidas, el resto de "alquiltio" está representado por uno de - S-alquilo, -S-alquenilo, -S-alquinilo y -S-(CH_{2})_{m}-R_{8}, en el que m y R_{8} son tal como se definieron anteriormente. Grupos alquiltio representativos incluyen metiltio, etiltio, y similares.

Los términos "amina" y "amino" están reconocidos en la técnica y se refieren tanto a aminas sustituidas como no sustituidas, por ejemplo, un resto que puede representarse por la fórmula general:

9

en la que R_{9}, R_{10} y R'_{10} representan cada uno independientemente un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, -(CH_{2})_{m}-R_{8}, o R_{9} y R_{10} tomados junto con el átomo de N al que están unidos completan un heterociclo que tiene desde 4 hasta 8 átomos en la estructura del anillo; R_{8} representa un arilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un heterociclo o un policiclo; y m es cero o un número entero en el intervalo de 1 a 8. En las realizaciones preferidas, sólo uno de R_{9} o R_{10} puede ser un carbonilo, por ejemplo, R_{9}, R_{10} y el nitrógeno juntos no forman una imida. Incluso en las realizaciones más preferidas, R_{9} y R_{10} (y opcionalmente R'_{10}) representan cada uno independientemente un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo o -(CH_{2})_{m}-R_{8}. Por tanto, el término "alquilamina", tal como se usa en el presente documento, significa un grupo amina, tal como se definió anteriormente, que tiene un alquilo sustituido o no sustituido unido al mismo, es decir, al menos uno de R_{9} y R_{10} es un grupo alquilo.

El término "amido" está reconocido en la técnica como un carbonilo amino-sustituido e incluye un resto que puede representarse por la fórmula general:

10

en la que R_{9}, R_{10} son tal como se definieron anteriormente. Las realizaciones preferidas de la amida no incluirán imidas que pueden ser inestables.

El término "aralquilo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo (por ejemplo, un grupo aromático o heteroaromático).

El término "arilo", tal como se usa en el presente documento, incluye grupos aromáticos de anillo único de 5, 6 y 7 miembros que pueden incluir desde cero hasta cuatro heteroátomos, por ejemplo, benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares. Los grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura del anillo también pueden denominarse "heterociclos de arilo" o "heteroaromáticos". El anillo aromático puede estar sustituido en una o más posiciones del anillo con sustituyentes tales como los descritos anteriormente, por ejemplo, halógeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamido, cetona, aldehído, éster, heterociclilo, restos aromáticos o heteroaromáticos, -CF_{3}, -CN o similares. El término "arilo" también incluye sistemas de anillo policíclico que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes (los anillos son "anillos condensados") en los que al menos uno de los anillos es aromático, por ejemplo, los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o heterociclilos.

El término "carbociclo", tal como se usa en el presente documento se refiere a un anillo aromático o no aromático en el que cada átomo del anillo es carbono.

El término "carbonilo" está reconocido en la técnica e incluye restos tales como los que pueden representarse por la fórmula general:

11

en la que X es un enlace o representa un oxígeno o un azufre, y R_{11} representan un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, -(CH_{2})_{m}-R_{8} o una sal farmacéuticamente aceptable, R'_{11} representan un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo o -(CH_{2})_{m}-R_{8}, en la que m y R_{8} son tal como se definieron anteriormente. Cuando X es un oxígeno y R_{11} o R'_{11} no es hidrógeno, la fórmula representa un "éster". Cuando X es un oxígeno, y R_{11} es tal como se definió anteriormente, el resto se denomina en el presente documento un grupo carboxilo, y particularmente cuando R_{11} es un hidrógeno, la fórmula representa un "ácido carboxílico". Cuando X es un oxígeno y R'_{11} es hidrógeno, la fórmula representa un "formiato". En general, cuando el átomo de oxígeno de la fórmula anterior se sustituye por azufre, la fórmula representa un grupo "tiocarbonilo". Cuando X es un azufre y R_{11} o R'_{11} no es hidrógeno, la fórmula representa un "tioéster". Cuando X es un azufre y R_{11} es hidrógeno, la fórmula representa un "ácido tiocarboxílico". Cuando X es un azufre y R'_{11} es hidrógeno, la fórmula representa un "tiolformiato". Por otra parte, cuando X es un enlace y R_{11} no es hidrógeno, la fórmula anterior representa un grupo "cetona". Cuando X es un enlace y R_{11} es hidrógeno, la fórmula anterior representa un grupo "aldehído".

El término "heteroátomo", tal como se usa en el presente documento, significa un átomo de cualquier elemento distinto al carbono o al hidrógeno. Los heteroátomos preferidos son boro, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre y selenio.

Los términos "heterociclilo" o "grupo heterocíclico" se refieren a estructuras de anillo de 3 a 10 miembros, más preferiblemente, anillos de 3 a 7 miembros, cuyas estructuras de anillo incluyen de uno a cuatro heteroátomos. Los heterociclos también pueden ser policiclos. Los grupos heterociclilos incluyen, por ejemplo, tiofeno, tiantreno, furano, pirano, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxantiína, pirrol, imidazol, pirazol, isotiazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, pirimidina, fenantrolina, fenazina, fenarsazina, fenotiazina, furazano, fenoxazina, pirrolidina, oxolano, tiolano, oxazol, piperidina, piperazina, morfolina, lactonas, lactamas, tal como azetidinonas y pirrolidinonas, sultamas, sultonas, y similares. El anillo heterocíclico puede sustituirse en una o más posiciones con sustituyentes tales como los descritos anteriormente, tal como por ejemplo, halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehído, éster, un heterociclilo, un resto aromático o heteroaromático, CF_{3}, -CN, o similares.

Tal como se usa en el presente documento, el término "nitro" significa -NO_{2}; el término "halógeno" designa -F, -Cl, -Br o -I; el término "sufhidrilo" significa -SH; el término "hidroxilo" significa -OH; y el término "sulfonilo" significa -SO_{2}-.

Una "fosfonamidita" puede representarse en la fórmula general:

--- Q_{2} ---

\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\para}{R _{48} }}

--- O ---,

\hskip1cm

o

\hskip1cm

--- Q_{2} ---

\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\para}{R _{48} }}

--- OR_{46}

en la que R_{9} y R_{10} son tal como se definieron anteriormente, Q_{2} representa O, S o N, y R_{48} representa un alquilo inferior o un arilo, Q_{2} representa O, S o N.

Una "fosforamidita" puede representarse en la fórmula general:

--- Q_{2} ---

\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

--- O ---,

\hskip1cm

o

\hskip1cm

--- Q_{2} ---

\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

--- OR_{46}

en la que R_{9} y R_{10} son tal como se definieron anteriormente y Q_{2} representa O, S o N.

Un "fosforilo" puede representarse, en general, por la fórmula:

---

\melm{\delm{\para}{OR _{46} }}{P}{\uelm{\dpara}{Q _{1} }}

---

en la que Q_{1} representa S u O, y R_{46} representa hidrógeno, un alquilo inferior o un arilo. Cuando se usa para sustituir, por ejemplo, un alquilo, el grupo fosforilo del fosforilalquilo puede representarse por la fórmula general:

--- Q_{2} ---

\melm{\delm{\para}{OR _{46} }}{P}{\uelm{\dpara}{Q _{1} }}

--- O ---,

\hskip1cm

o

\hskip1cm

--- Q_{2} ---

\melm{\delm{\para}{OR _{46} }}{P}{\uelm{\dpara}{Q _{1} }}

--- OR_{46}

en la que Q_{1} representa S u O, y cada R_{46} representa independientemente hidrógeno, un alquilo inferior o un arilo, Q_{2} representa O, S o N. Cuando Q_{1} es S, el resto de fosforiloes un "fosforotioato".

Los términos "policiclilo" o "grupo policíclico" se refieren a dos o más anillos (por ejemplo, cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o heterociclilos), en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes, por ejemplo, los anillos son "anillos condensados". Los anillos que están unidos mediante átomos no adyacentes se denominan anillos "que forman puente". Cada uno de los anillos del policiclo puede estar sustituido con sustituyentes tales como los descritos anteriormente, como por ejemplo, halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehído, éster, un heterociclilo, un resto aromático o heteroaromático, CF_{3}, -CN, o similares.

La expresión "grupo protector", tal como se usa en el presente documento, significa sustituyentes temporales que protegen un grupo funcional potencialmente reactivo de transformaciones químicas no deseadas. Ejemplos de tales grupos protectores incluyen ésteres de ácidos carboxílicos, silil éteres de alcoholes y acetales y cetales de aldehídos y cetonas, respectivamente. El campo de la química de grupos protectores se ha revisado (Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª ed.; Willey; Nueva York, 1991).

Un "selenoalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene un grupo seleno sustituido unido al mismo. "Selenoéteres" ejemplo que pueden sustituirse en el grupo alquilo se seleccionan de uno de -Se-alquilo, -Se-alquenilo, -Se-alquinilo y -Se-(CH_{2})m-R_{8}, siendo m y R_{8} tal como se definieron anteriormente.

Tal como se usa en el presente documento, el término "sustituido" se considera que incluye todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. En un aspecto amplio, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos de compuestos orgánicos. Sustituyentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, los descritos anteriormente en el presente documento. Los sustituyentes permisibles pueden ser uno o más y el mismo o diferentes para los compuestos orgánicos apropiados. Para los propósitos de esta invención, los heteroátomos tales como el nitrógeno pueden tener sustituyentes de hidrógeno y/o cualquier sustituyente permisible de compuestos orgánicos descrito en el presente documento que satisfaga las valencias de los heteroátomos. Esta invención no pretende limitarse en modo alguno por los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos.

Se entenderá que "sustitución" o "sustituido con" incluye la condición implícita de que tal sustitución está de acuerdo con la valencia permitida del átomo sustituido y el sustituyente, y que la sustitución da como resultado un compuesto estable, por ejemplo, que no sufre transformación espontáneamente, tal como por redisposición, ciclación, eliminación, etc.

El término "sulfamoílo" está reconocido en la técnica e incluye un resto que puede representarse por la fórmula general:

12

en la que R_{9} y R_{10} son tal como se definieron anteriormente.

El término "sulfato" está reconocido en la técnica e incluye un resto que puede representarse por la fórmula general:

--- O ---

\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}

--- OR_{41}

en la que R_{41} es tal como se definió anteriormente.

El término "sulfonamido" está reconocido en la técnica e incluye un resto que puede representarse por la fórmula general:

---

\delm{N}{\delm{\para}{R _{9} }}

---

\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}

--- R'_{11}

en la que R_{9} y R'_{11} son tal como se definieron anteriormente.

El término "sulfonato" está reconocido en la técnica e incluye un resto que puede representarse por la fórmula general:

---

\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}

--- OR_{41}

en la que R_{41} es un par de electrones, hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arilo.

Los términos "sulfóxido" o "sulfinilo", tal como se usan en el presente documento, se refieren a un resto que puede representarse por la fórmula general:

---

\uelm{S}{\uelm{\dpara}{O}}

--- R_{44}

en la que R_{44} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, aralquilo o arilo.

Pueden hacerse sustituciones análogas a grupos alquenilo y alquinilo para producir, por ejemplo, aminoalquenilos, aminoalquinilos, amidoalquenilos, amidoalquinilos, iminoalquenilos, iminoalquinilos, tioalquenilos, tioalquinilos, alquenilos o alquinilos carbonil-sustituidos.

Tal como se usa en el presente documento, la definición de cada expresión, por ejemplo, alquilo, m, n, etc., cuando se produce más de una vez en cualquier estructura, pretende ser independiente de su definición en otro sitio de la misma estructura.

Los términos triflilo, tosilo, mesilo y nonaflilo están reconocidos en la técnica y se refieren a grupos trifluorometanosulfonilo, p-toluenosulfonilo, metanosulfonilo y nonafluorobutanosulfonilo, respectivamente. Los términos triflato, tosilato, mesilato y nonaflato están reconocidos en la técnica y se refieren a grupos funcionales éster trifluorometanosulfonato, éster de p-toluenosulfonato, éster metanosulfonato y éster nonafluorobutanosulfonato y a las moléculas que contienen dichos grupos, respectivamente.

Las abreviaturas Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms representan metilo, etilo, fenilo, trifluorometanosulfonilo, nonafluorobutanosulfonilo, p-toluenosulfonilo y metanosulfonilo, respectivamente. Una lista más exhaustiva de las abreviaturas utilizadas por los químicos orgánicos, expertos habituales en la técnica, aparece en el primer número de cada volumen del Journal of Organic Chemistry; esta lista se presenta normalmente en una tabla titulada Standard List of Abbreviations (Lista habitual de abreviaturas). Las abreviaturas contenidas en dicha lista y todas las abreviaturas utilizadas por los químicos orgánicos, expertos habituales en la técnica, se incorporan al presente documento como referencia.

Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir en formas geométricas o estereoisoméricas particulares. La presente invención contempla todos esos compuestos, incluyendo los isómeros cis y trans, los enantiómeros R y S, los diastereómeros, los isómeros (D), los isómeros (L), las mezclas racémicas de los mismos y otras mezclas de los mismos, ya que caen dentro del alcance de la invención. Pueden estar presentes átomos de carbono asimétricos adicionales en un sustituyente tal como un grupo alquilo. Se pretende que todos esos isómeros, así como las mezclas de los mismos, estén incluidos en esta invención.

Si se desea, por ejemplo, un enantiómero particular de un compuesto de la presente invención, puede prepararse mediante síntesis asimétrica o por derivación con un auxiliar quiral, en la que la mezcla diastereomérica resultante se separa y el grupo auxiliar se escinde para proporcionar los enantiómeros puros deseados. Alternativamente, cuando la molécula contiene un grupo funcional básico, tal como amino, o un grupo funcional ácido, tal como carboxilo, pueden formarse sales diastereoméricas con un ácido o base ópticamente activos apropiados, seguido por la resolución de los diastereómeros así formados mediante cristalización fraccionada o medios cromatográficos bien conocidos en la técnica, y la recuperación posterior de los enantiómeros puros.

Equivalentes contemplados de los compuestos descritos anteriormente incluyen compuestos que, por lo demás, corresponden a los mismos, y que tienen las mismas propiedades generales de los mismos (por ejemplo, la capacidad para inhibir la señalización hedgehog), en los que se realiza una o más variaciones simples de los sustituyentes que no afectan adversamente a la eficacia del compuesto. En general, los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante los métodos ilustrados en esquemas de reacción generales como, por ejemplo, los descritos más adelante, o mediante modificaciones de los mismos, utilizando materiales de partida, reactivos y procedimientos de síntesis convencionales fácilmente disponibles. En esas reacciones también es posible hacer uso de variantes que son conocidas por sí mismas, pero que no se mencionan en el presente documento.

Para los propósitos de esta invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 67ª Ed., 1986-87, dentro de la cubierta. También para los propósitos de esta invención, se considera que el término "hidrocarburo" incluye todos los compuestos permisibles que tienen al menos un hidrógeno y un átomo de carbono. En un amplio aspecto, los hidrocarburos permisibles incluyen compuestos orgánicos acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos que pueden estar sustituidos o no sustituidos.

III. Compuestos ejemplo de la invención

Tal como se describe en más detalle más adelante, se considera que los métodos objeto pueden llevarse a cabo utilizando una variedad de diferentes moléculas pequeñas que pueden identificarse fácilmente, por ejemplo, mediante ensayos de selección de fármacos tales como los descritos en el presente documento. Por ejemplo, los compuestos útiles en los métodos objeto incluyen compuestos que pueden representarse por la fórmula general (II):

\newpage

Fórmula II

13

en la que, en la medida en que la valencia y la estabilidad lo permitan,

R_{1} y R_{2}, independientemente para cada aparición, representan H, alquilo inferior, -(CH_{2})_{n}arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o -(CH_{2})_{n}heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido);

L, independientemente para cada aparición, está ausente o representa alquilo, -alquenil-, alquinil-, -(CH_{2})_{n}O(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}NR_{2}(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}S(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquenil(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquinil(CH_{2})_{p}-, -O(CH_{2})_{n}-, -NR_{2}(CH_{2})_{n}- o -S(CH_{2})_{n}-;

X puede seleccionarse de -N(R_{8})-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, -ON=CH-, (R_{8})N-N(R_{8})-, -ON(R_{8})-, un heterociclo, o un enlace directo entre L e Y;

Y puede seleccionarse de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR_{2})-, un grupo heteroaromático, o un enlace directo entre X y Z;

Z se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, -ON=CH-, -R_{8}N-NR_{8}-, -ONR_{8}-, un heterociclo, o un enlace directo entre Y y L;

R_{8}, independientemente para cada aparición, representa H, alquilo inferior, -(CH_{2})_{n}arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o -(CH_{2})_{n}heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o dos R_{8} tomados juntos pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con X y Z, anillo que puede incluir uno o más carbonilos;

W representa un anillo bencénico o piridónico, sustituido o no sustituido, condensado al anillo de pirimidona;

p representa, independientemente para cada aparición, un número entero desde 0 hasta 10, preferiblemente desde 0 hasta 3; y

n, individualmente para cada aparición, representa un número entero desde 0 hasta 10, preferiblemente desde 0 hasta 5.

En las realizaciones en las que Y_{1} y Z_{1} están ausentes y X_{1} comprende una pirimidona, los compuestos útiles en la presente invención pueden representarse por la fórmula general (II):

\newpage

Fórmula II

14

en la que, en la medida en que la valencia y la estabilidad lo permitan,

R_{1} y R_{2}, independientemente para cada aparición, representan H, alquilo inferior, arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), aralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH_{2})_{n}arilo), o heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH_{2})_{n}
heteroaralquilo);

L, independientemente para cada aparición, está ausente o representa -(CH_{2})_{n}-alquilo, -alquenil-, alquinil-, -(CH_{2})_{n}
alquenil-, -(CH_{2})_{n}alquinil-, -(CH_{2})_{n}O(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}NR_{2}(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}S(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquenil(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}
alquinil(CH_{2})_{p}-, -O(CH_{2})_{n}-, -NR_{2}(CH_{2})_{n}- o -S(CH_{2})_{n}-; que puede estar opcionalmente sustituido por un grupo seleccionado de H, alquilo inferior sustituido o no sustituido, alquenilo o alquinilo, cicloalquilalquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH_{2})_{n}cicloalquilo), (por ejemplo, sustituido o no sustituido), arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), aralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH_{2})_{n}arilo), o heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo,
-(CH_{2})_{n}heteroaralquilo), preferiblemente de H, alquilo inferior, -(CH_{2})_{n}arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o -(CH_{2})_{n}heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido);

X puede seleccionarse de -N(R_{8})-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, -ON=CH-, -(R_{8})N-N(R_{8})-, -ON(R_{8})-, un heterociclo, o un enlace directo entre L e Y;

Y puede seleccionarse de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR_{2})-, un grupo heteroaromático, o un enlace directo entre X y Z;

Z se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, -ON=CH-, -R_{8}N-NR_{8}-, -ONR_{8}-, un heterociclo, o un enlace directo entre Y y L;

R_{8}, independientemente para cada aparición, representa H, alquilo inferior, arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), aralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH_{2})_{n}arilo), o heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH_{2})_{n}heteroaralquilo, o dos R_{8} tomados juntos pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con X y Z, anillo que puede incluir uno o más carbonilos;

W representa un anillo bencénico o piridónico, sustituido o no sustituido, condensado al anillo de pirimidona;

p representa, independientemente para cada aparición, un número entero desde 0 hasta 10, preferiblemente desde 0 hasta 3; y

n, individualmente para cada aparición, representa un número entero desde 0 hasta 10, preferiblemente desde 0 hasta 5.

En ciertas realizaciones, R_{1} representa un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, un anillo de fenilo, un anillo de piridina, etc. En ciertas realizaciones en las que -LR_{1} representa un grupo arilo o heteroarilo sustituido, R_{1} preferiblemente no está sustituido con un grupo isopropoxilo (Me_{2}CHO-). En ciertas realizaciones en las que -LR_{1} representa un grupo arilo o heteroarilo sustituido, R_{1} preferiblemente no está sustituido con un grupo éter. En ciertas realizaciones, los sustituyentes en R_{1} (por ejemplo, distintos del hidrógeno) se seleccionan de halógeno, ciano, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, hidroxilo, (alquil-O- no ramificado), sililoxilo, amino, nitro, tiol, amino, imino, amido, fosforilo, fosfonato, fosfina, carbonilo, carboxilo, carboxamida, anhídrido, sililo, tioéter, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfóxido, selenoéter, cetona, aldehído, éster o -(CH_{2})_{m}-R_{8}. En ciertas realizaciones, los sustituyentes distintos al hidrógeno se seleccionan de halógeno, ciano, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, nitro, tiol, imino, amido, carbonilo, carboxilo, anhídrido, tioéter, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, cetona, aldehído y éster. En ciertas realizaciones, los sustituyentes distintos del hidrógeno se seleccionan de halógeno, ciano, alquilo, alquenilo, alquinilo, nitro, amido, carboxilo, anhídrido, alquilsulfonilo, cetona, aldehído y éster.

En ciertas realizaciones, X puede seleccionarse de -N(R_{8})-, -O-, -S-, un enlace directo, y un heterociclo, Y puede seleccionarse de -C(=O)-, -C(=S)- y -S(O_{2})-, y Z puede seleccionarse de -N(R_{8})-, -O-, -S-, un enlace directo y un heterociclo. En ciertas tales realizaciones, al menos uno de Z y X está presente.

En ciertas realizaciones relacionadas, X-Y-Z tomados juntos representan una urea (NC(O)N) o una amida (NC(O) o C(O)N).

En ciertas realizaciones, W es un anillo de benceno sustituido o no sustituido.

En ciertas realizaciones, X representa un diazacarbociclo, tal como una piperazina, por ejemplo, sustituida o no sustituida.

En ciertas realizaciones, X puede seleccionarse de -N(R_{8})-, -O-, -S- y un enlace directo, Y puede seleccionarse de -C(=O)-, -C(=S)- y -S(O_{2})-, y Z puede seleccionarse de -N(R_{8})-, -O-, -S- y un enlace directo, de manera que al menos uno de X y Z está presente.

En ciertas realizaciones, R_{8} representa H, alquilo inferior, aralquilo, heteroaralquilo, arilo o heteroarilo, por ejemplo, H o alquilo inferior.

En ciertas realizaciones, X representa -NH-.

En ciertas realizaciones, -L-X- representa -(alquilo inferior no ramificado)-NH-, por ejemplo, -CH_{2}-NH-, -CH_{2}-CH_{2}-NH-, etc.

En ciertas realizaciones, los antagonistas objeto pueden escogerse partiendo de la base de su selectividad para la ruta hedgehog. Esta selectividad puede ser para la ruta hedgehog frente a otras rutas, o para la selectividad entre rutas hedgehog particulares, por ejemplo, ptc-1, ptc-2, etc.

En ciertas realizaciones preferidas, los inhibidores objeto inhiben la transducción de la señal mediada por hedgehog con una DE_{50} de 1 mM o menos, más preferiblemente de 1 \muM o menos, e incluso más preferiblemente de 1 nM o menos.

En realizaciones particulares, la molécula pequeña se escoge para su uso porque es más selectiva para una isoforma patched con respecto a la siguiente, por ejemplo, 10 veces y, más preferiblemente, al menos 100 o incluso 1000 veces más selectiva para una ruta patched (ptc-1, ptc-2) con respecto a otra.

En ciertas realizaciones, un compuesto que es un antagonista de la ruta hedgehog se escoge para antagonizar selectivamente la actividad de hedgehog con respecto a las proteína cinasas distintas a PKA, tal como PKC, por ejemplo, el compuesto modula la actividad de la ruta hedgehog al menos un orden de magnitud más fuertemente que modula la actividad de otra proteína cinasa, preferiblemente al menos dos órdenes de magnitud más fuertemente, incluso más preferiblemente al menos tres órdenes de magnitud más fuertemente. Así, por ejemplo, un inhibidor preferido de la ruta hedgehog puede inhibir la actividad de hedgehog con una K_{i} al menos un orden de magnitud inferior que su K_{i} para la inhibición de la PKC, preferiblemente al menos dos órdenes de magnitud inferior, incluso más preferiblemente al menos tres órdenes de magnitud inferior. En ciertas realizaciones, la K_{i} para la inhibición de PKA es inferior a 10 nM, preferiblemente inferior a 1 nM, incluso más preferiblemente inferior a 0,1 nM.

Síntesis de los compuestos objeto

En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a técnicas y enfoques para la síntesis de los compuestos objeto, tal como se describen por las fórmulas I-VIII.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a un método para preparar un compuesto objeto tal como se explica en el esquema I,

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Esquema I

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en el que la etapa (A) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de fórmula X, en la que W representa un anillo de arilo o heteroarilo, sustituido o no sustituido, tal como un anillo de benceno, que tiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico en posiciones adyacentes (orto), con un agente de acilación que tiene la fórmula R_{10}CH_{2}C(=O)X', en la que R_{10}, independientemente de cada aparición, representa alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, aralquilo o heteroaralquilo, sustituidos o no sustituidos, y X' representa un halógeno o -OC(=O)CH_{2}R_{10}, en condiciones que producen un compuesto que tiene una estructura de fórmula XI;

la etapa (B) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de fórmula XI con una amina que tiene la fórmula R_{1}LNH_{2}, en la que R_{1} y L son tal como se definieron anteriormente, en condiciones que dan como resultado un compuesto que tiene una estructura de fórmula XII;

la etapa (C) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de fórmula XII con un agente halogenante, tal como cloro, bromo, yodo, N-bromosuccinimida, N-clorosuccinimida, N-yodosuccinimida, ClBr, IBr, ClI, o un reactivo que genera un radical halógeno (tal como Cl; Br; o I) en condiciones que dan como resultado un compuesto que tiene una estructura de fórmula XIII, en la que Y' representa un halógeno tal como Cl, Br o I;

la etapa (D) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de fórmula XIII con una amina que tiene la fórmula H_{2}NR_{12}, en la que R_{12} representa un grupo alquilo inferior o un grupo sililo, tal como un grupo trialquilsililo, triarilsililo, dialquilarilsililo o diarilalquilsililo, en condiciones que den como resultado un compuesto que tiene la estructura de fórmula XIV; y

la etapa (E) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de fórmula XIV con un grupo de terminación que tiene una estructura de R_{2}V' para producir un compuesto que tiene una estructura de fórmula XX, en la que R_{2} es tal como se definió anteriormente y V' representa un grupo funcional seleccionado de ZC(=W)Cl, ZC(=W)Br, isocianato, isotiocianato, ZC(=W)WC(=W)ZR_{2}, ZSO_{2}Cl, ZSO_{2}Br, ZSOCl, ZSOBr, o un resto de acilación activado preparado in situ.

En ciertas realizaciones, un compuesto objeto puede prepararse proporcionando un compuesto que tiene una estructura de fórmula XI y realizando las etapas (B) a (E). En ciertas realizaciones, un compuesto objeto puede prepararse proporcionando un compuesto que tiene una estructura de fórmula XII y realizando las etapas (C) a (E). En ciertas realizaciones, un compuesto objeto puede prepararse proporcionando un compuesto que tiene una estructura de fórmula XIII y realizando las etapas (D) a (E). En ciertas realizaciones, un compuesto objeto puede prepararse proporcionando un compuesto que tiene una estructura de fórmula XIV y realizando la etapa (E).

En ciertas realizaciones, la etapa (A) puede llevarse a cabo utilizando un anhídrido, tal como un anhídrido simétrico, que tiene la fórmula R_{10}C(=O)OC(-O)R_{10}. En ciertas realizaciones, la reacción puede llevarse a cabo utilizando el anhídrido como un disolvente, por ejemplo, la mezcla de reacción está sustancialmente libre de un disolvente distinto de anhídrido. En ciertas realizaciones, R_{10}, para ambas apariciones, es un grupo alquilo inferior.

En ciertas realizaciones, la etapa (B) puede llevarse a cabo tratando un compuesto de fórmula XI con una amina en un disolvente no polar, tal como cloroformo, cloruro de metileno, cloruro de etileno, tolueno, benceno, éter, tetrahidrofurano, u otro disolvente no polar, o cualquier combinación de los mismos, seguido por tratar el producto de esa reacción con una base iónica, tal como un alcóxido o hidróxido de metal alcalino, tal como metóxido, etóxido, etc., en un disolvente polar, tal como un disolvente alcohólico, por ejemplo, metanol, etanol, propanol, etilenglicol, propilenglicol, glicerol, etc. En ciertas realizaciones, las condiciones pueden incluir calentar la mezcla de reacción por encima de la temperatura ambiente, por ejemplo, hasta al menos 50ºC, o al menos 75ºC, o incluso al menos 100ºC. En ciertas realizaciones, esta etapa puede convertir un compuesto de fórmula X en un compuesto de fórmula XI en al menos aproximadamente el 80% de rendimiento, o al menos aproximadamente el 85% de rendimiento.

En ciertas realizaciones, la etapa (C) puede llevarse a cabo utilizando un halógeno como agente halogenante, y puede llevarse a cabo en una mezcla de reacción que incluye un ácido carboxílico, tal como ácido acético o ácido propiónico. En ciertas realizaciones, puede añadirse o estar presente en la mezcla de reacción, una base suave, tal como una sal de ácido carboxílico.

En ciertas realizaciones, la etapa (D) puede llevarse a cabo utilizando un disolvente polar, tal como agua, etanol, metanol, etilenglicol, DMF, u otro disolvente polar, o cualquier combinación de disolventes polares. En ciertas realizaciones, el disolvente o mezcla de disolventes comprende menos de aproximadamente el 50% de agua, o es no acuoso, es decir, está sustancialmente libre de agua. En ciertas realizaciones, el disolvente polar comprende un alcohol, tal como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, t-butanol, sec-butanol, etilenglicol y 1,3-propanodiol.

En ciertas realizaciones, la etapa (E) puede llevarse a cabo generando un agente de acilación in situ, por ejemplo, haciendo reaccionar un ácido carboxílico con un agente de activación, tal como una carbodiimida (por ejemplo, diisopropilcarbodiimida, diciclohexilcarbodiimida, 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, etc.), reactivos basados en fósforo (tal como BOP-Cl, PyBROP, etc.), cloruro de oxalilo, fosgeno, trifosgeno, o cualquier otro reactivo que reaccione con un grupo de ácido carboxílico, dando como resultado un producto intermedio reactivo que tiene un aumento de la sensibilidad, con respecto al ácido carboxílico, hacia el acoplamiento con una amina. Una amplia variedad de tales reactivos son bien conocidos en la técnica de síntesis orgánica, especialmente el acoplamiento peptídico. De manera similar, una amina primaria puede tratarse con un equivalente de fosgeno, tal como carbonildiimidazol, fosgeno, trifosgeno, difosgeno, etc., o un equivalente de tiofosgeno, tal como tiofosgeno, tiocarbonildiimidazol, etc., para generar un agente de acilación (por ejemplo, un isocianato, isotiocianato, cloroformamida o clorotioformamida, por ejemplo) capaz de reaccionar con una amina para formar una urea o tiourea, sin necesitar aislamiento o purificación del agente de acilación.

En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a un método para preparar un compuesto objeto tal como se explica en el esquema II,

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en el que la etapa (A) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de fórmula XV, en la que P' representa H o un grupo protector, W representa un anillo de arilo o heteroarilo, sustituido o no sustituido, tal como un anillo de benceno, que tiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico o un grupo éster en posiciones adyacentes (orto), con un agente de acilación que tiene la fórmula PXLC(=O)X', en la que X y L son tal como se definieron anteriormente, P representa un grupo protector y X' representa un halógeno -OC(=O)LXP, o un grupo funcional generado haciendo reaccionar un grupo carboxilo con un agente de activación, tal como una carbodiimida (por ejemplo, diisopropilcarbodiimida, diciclohexilcarbodiimida, 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, etc.), reactivos basados en fósforo (tal como BOP-Cl, PyBROP, etc.), cloruro de oxalilo, fosgeno, trifosgeno, carbonildiimidazol o cualquier otro reactivo que reaccione con un grupo de ácido carboxílico, dando como resultado un producto intermedio reactivo que tiene un aumento de la sensibilidad, con respecto al ácido carboxílico, hacia el acoplamiento con una amina, en condiciones que producen un compuesto que tiene una estructura de fórmula XVI;

la etapa (B) comprende desproteger el éster de un compuesto que tiene una estructura de fórmula XVI para producir un ácido carboxílico que tiene una estructura de fórmula XVII, si es necesario;

la etapa (C) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de fórmula XVII con una amina que tiene la fórmula R_{1}LNH_{2}, en la que R_{1} y L son tal como se definieron anteriormente, en condiciones que dan como resultado un compuesto que tiene una estructura de fórmula XVIII;

la etapa (D) comprende eliminar el grupo protector P de un compuesto que tiene una estructura de fórmula XVIII para generar un compuesto que tiene una estructura de fórmula XIX;

la etapa (E) comprende hacer reaccionar un compuesto que tiene una estructura de fórmula XIX con un grupo de terminación que tiene una estructura de R_{2}Y' para producir un compuesto que tiene una estructura de fórmula XXI, en la que R_{2} es tal como se definió anteriormente, e Y' representa un grupo funcional seleccionado de ZC(=W)Cl, ZC(=W)Br, isocianato, isotiocianato, ZC(=W)WC(=W)ZR_{2}, ZSO_{2}Cl, ZSO_{2}Br, ZSOCl, ZSOBr, o un resto de acilación activo preparado in situ.

En ciertas realizaciones, un compuesto objeto puede prepararse proporcionando un compuesto que tiene una estructura de fórmula XVI y realizando las etapas (B) a (E). En ciertas realizaciones, un compuesto objeto puede prepararse proporcionando un compuesto que tiene una estructura de fórmula XVII y realizando las etapas (C) a (E). En ciertas realizaciones, un compuesto objeto puede prepararse proporcionando un compuesto que tiene una estructura de fórmula XVIII y realizando las etapas (D) a (E). En ciertas realizaciones, un compuesto objeto puede prepararse proporcionando un compuesto que tiene una estructura de fórmula XIX y realizando la etapa (E).

En ciertas realizaciones, la etapa (B) puede llevarse a cabo tratando un compuesto de fórmula XVI con un ácido en presencia de agua, o con una base de hidróxido (por ejemplo, para hidrolizar o saponificar un éster), mediante hidrogenólisis (por ejemplo, para eliminar los ésteres bencílico o alílico), en presencia de una base suave (por ejemplo, para eliminar un éster fluorenilmetílico), añadiendo un ácido de Lewis (por ejemplo, para eliminar un éster metoximetílico), en presencia de un ión fluoruro (por ejemplo, para eliminar un éster 2-sililetílico), o cualquier otro medio adecuado.

En ciertas realizaciones, la etapa (C) puede llevarse a cabo activando el grupo carboxilo del compuesto de fórmula XVII con un agente de activación, tal como una carbodiimida (por ejemplo, diisopropilcarbodiimida, diciclohexilcarbodiimida, 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, etc.), reactivos basados en fósforo (tal como BOP-Cl, PyBROP, etc.), cloruro de oxalilo, fosgeno, trifosgeno, carbonildiimidazol, o cualquier otro reactivo que reaccione con un grupo de ácido carboxílico, dando como resultado un producto intermedio reactivo que tiene un aumento de la sensibilidad, con respecto al ácido carboxílico, hacia el acoplamiento con una amina. Una amplia variedad de tales reactivos son bien conocidos en la técnica de síntesis orgánica, especialmente el acoplamiento peptídico. En ciertas realizaciones, las condiciones pueden incluir calentar la mezcla de reacción por encima de la temperatura ambiente, por ejemplo, hasta al menos 50ºC, o al menos 75ºC, o incluso al menos 100ºC.

En ciertas realizaciones, la etapa (D) puede llevarse a cabo mediante hidrogenólisis (por ejemplo, para eliminar un grupo Alloc o CBz), utilizando una base o un reactivo de hidruro (por ejemplo, para eliminar un grupo trifluoroacetilo), utilizando un ácido, tal como ácido trifluoroacético (por ejemplo, para eliminar un grupo BOC), o mediante cualquier otro medio adecuado para desproteger la amina.

En ciertas realizaciones, la etapa (E) puede llevarse a cabo generando un agente de acilación in situ, por ejemplo, haciendo reaccionar un ácido carboxílico con un agente de activación, tal como una carbodiimida (por ejemplo, diisopropilcarbodiimida, diciclohexilcarbodiimida, 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, etc.), reactivos basados en fósforo (tal como BOP-Cl, PyBROP, etc.), cloruro de oxalilo, fosgeno, trifosgeno, o cualquier otro reactivo que reaccione con un grupo de ácido carboxílico, dando como resultado un producto intermedio reactivo que tiene un aumento de la sensibilidad, con respecto al ácido carboxílico, hacia el acoplamiento con una amina. Una amplia variedad de tales reactivos son bien conocidos en la técnica de síntesis orgánica, especialmente el acoplamiento peptídico. De manera similar, una amina primaria puede tratarse con un equivalente de fosgeno, tal como carbonildiimidazol, fosgeno, trifosgeno, difosgeno, etc., o un equivalente de tiofosgeno, tal como tiofosgeno, tiocarbonildiimidazol, etc. para generar un agente de acilación (por ejemplo, un isocianato, isotiocianato, cloroformamida o clorotioformamida, por ejemplo) capaz de reaccionar con una amina para formar una urea o tiourea, sin necesitar aislamiento o purificación del agente de acilación.

IV. Aplicaciones ejemplo del método y las composiciones

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de modular un estado diferenciado, la supervivencia y/o la proliferación de una célula que tiene un fenotipo de ganancia de función hedgehog, poniendo en contacto las células con un antagonista de hedgehog, según el método objeto y según puedan justificar las circunstancias.

Por ejemplo, la invención contempla que, a la luz de los hallazgos de una participación aparentemente amplia de hedgehog, ptc y smoothened en la formación de disposiciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados en vertebrados, el método objeto podría utilizarse como parte de un procedimiento para generar y/o mantener una serie de tejidos de vertebrados diferentes tanto in vitro como in vivo. El antagonista de hedgehog, ya sea inductivo o anti-inductivo con respecto a la proliferación o la diferenciación de un tejido dado, puede ser, según sea apropiado, cualquiera de las preparaciones descritas anteriormente.

Por ejemplo, el presente método se puede aplicar a técnicas de cultivo celular, en las que, ya sea por motivos genéticos o bioquímicos, las células tienen un fenotipo de ganancia de función hedgehog. In vitro, los sistemas de cultivo neuronales han demostrado ser herramientas fundamentales e indispensables para el estudio del desarrollo neuronal, así como para la identificación de factores neurotróficos, tales como el factor de crecimiento nervioso (NGF), los factores tróficos ciliares (CNTF), y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Un uso del presente método puede ser en cultivos de células madre neuronales, tal como en el uso de tales cultivos para la generación de nuevas neuronas y glía. En tales realizaciones del método objeto, las células cultivadas pueden ponerse en contacto con un antagonista de hedgehog de la presente invención, con el fin de modificar la tasa de proliferación de las células madre neuronales en el cultivo y/o modificar la tasa de diferenciación, o para mantener la integridad de un cultivo de ciertas células neuronales terminalmente diferenciadas. En una realización ejemplo, el método objeto puede utilizarse para el cultivo, por ejemplo, de neuronas sensoriales o, alternativamente, neuronas motoras. Tales cultivos neuronales pueden utilizarse como sistemas de ensayo convenientes, así como fuentes de células implantables para tratamientos terapéuticos.

Según la presente invención, grandes números de células progenitoras neuronales no tumorígenas pueden perpetuarse in vitro y su tasa de proliferación y/o diferenciación puede resultar afectada por el contacto con antagonistas de hedgehog de la presente invención. En general, se proporciona un método que comprende las etapas de aislar las células progenitoras neuronales de un animal, perpetuar estas células in vitro o in vivo, preferiblemente en presencia de factores de crecimiento y regular la diferenciación de estas células en fenotipos neuronales particulares, por ejemplo, neuronas y glía, poniendo en contacto las células con un antagonista de hedgehog.

Se cree que las células progenitoras están bajo una influencia inhibitoria tónica que mantiene a los progenitores en un estado inhibido hasta que se requiere su diferenciación. Sin embargo, se han proporcionado técnicas recientes que permiten que estas células proliferen y, a diferencia de las neuronas que están terminalmente diferenciadas y, por tanto, no se dividen, pueden producirse en un número ilimitado y son sumamente adecuadas para el transplante en huéspedes heterólogos y autólogos con enfermedades neurodegenerativas.

Por "progenitor" se quiere decir una célula madre oligopotente o multipotente que puede dividirse sin límite y, bajo condiciones específicas, puede producir células hija que se diferencian terminalmente, tal como en neuronas y glía. Estas células pueden utilizarse para el transplante en un huésped heterólogo o autólogo. Por heterólogo se quiere decir un huésped distinto del animal del que derivaban originalmente las células progenitoras. Por autólogo se quiere decir el huésped idéntico del que derivaban originalmente las células.

Las células pueden obtenerse de tejido neuronal embrionario, posnatal, infantil o adulto. Mediante cualquier animal se quiere decir cualquier animal multicelular que contenga tejido nervioso. Más particularmente, se quiere decir cualquier pez, reptil, ave, anfibio o mamífero y similares. Los donantes más preferidos son los mamíferos, especialmente los ratones y los seres humanos.

En el caso de un animal donante heterólogo, el animal puede sacrificarse y extraerse el cerebro y la zona específica de interés utilizando un procedimiento estéril. Las zonas del cerebro de particular interés incluyen cualquier zona de la que puedan obtenerse células progenitoras, que servirá para restaurar la función a una zona degenerada del cerebro del huésped. Estas regiones incluyen zonas del sistema nervioso central (SNC), incluyendo la corteza cerebral, cerebelo, mesencéfalo, tronco encefálico, médula espinal y tejido ventricular y zonas del sistema nervioso periférico (SNP) incluyendo el cuerpo carotídeo y la médula suprarrenal. Más particularmente, estas zonas incluyen regiones en los ganglios basales, preferiblemente en el cuerpo estriado que consisten en el caudado y putamen, o varios grupos de células, tal como el globo pálido, el núcleo subtalámico, el núcleo basal que se encuentra que está degenerado en los pacientes con enfermedad de Alzheimer, o la sustancia negra compacta que se encuentra que está degenerada en los pacientes con enfermedad de Parkinson.

Las células progenitoras neuronales heterólogas humanas pueden derivarse de tejido fetal obtenido del aborto provocado, o de un donante de órganos posnatal, infantil o adulto. El tejido neuronal autólogo puede obtenerse por biopsia, o de pacientes que se someten a neurocirugía en la que se extrae tejido neuronal, en particular durante la cirugía por epilepsia y, más particularmente, durante las lobectomías y las extirpaciones del hipocampo temporales.

Las células pueden obtenerse del tejido donante mediante la disociación de las células individuales de la matriz extracelular de conexión del tejido. La disociación puede obtenerse utilizando cualquier procedimiento conocido, incluyendo tratamiento con enzimas, tal como tripsina, colagenasa y similares, o utilizando métodos físicos de disociación, tal como con un instrumento romo o picando con un escalpelo para permitir el crecimiento externo de los tipos celulares específicos de un tejido. La disociación de las células fetales puede llevarse a cabo en un medio de cultivo tisular, mientras que un medio preferido para la disociación de las células infantiles y adultas es el líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa). El LCRa regular contiene NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 1,3 mM, CaCl_{2} 2 mM, NaHCO_{3} 26 mM y G-glucosa 10 mM. El LCRa bajo en Ca^{2+} contiene los mismos componentes, excepto que MgCl_{2} tiene una concentración de 3,2 mM y CaCl_{2} tiene una concentración de 0,1 mM.

Las células disociadas pueden colocarse en cualquier medio de cultivo conocido que pueda soportar el crecimiento celular, incluyendo MEM, DMEM, RPMI, F-12 y similares, que contienen aportes complementarios que se requieren para el metabolismo celular, tal como glutamina y otros aminoácidos, vitaminas, minerales y proteínas útiles tal como transferrina y similares. El medio también puede contener antibióticos para evitar la contaminación con levaduras, bacterias y hongos, tal como penicilina, estreptomicina, gentamicina y similares. En algunos casos, el medio puede contener suero derivado de bovino, equino, pollo y similares. Un medio particularmente preferido para las células es una mezcla de DMEM y F-12.

Las condiciones para el cultivo deben estar próximas a las condiciones fisiológicas. El pH de los medios de cultivo debe estar próximo al pH fisiológico, preferiblemente entre pH 6-8, más preferiblemente próximo a pH 7, incluso más particularmente de aproximadamente pH 7,4. Las células deben cultivarse a una temperatura próxima a la temperatura fisiológica, preferiblemente entre 30ºC-40ºC, más preferiblemente entre 32ºC-38ºC y más preferiblemente entre 35ºC-37ºC.

Las células pueden hacerse crecer en suspensión o en un sustrato fijo, pero la proliferación de los progenitores se realiza preferiblemente en suspensión para generar grandes números de células mediante la formación de "neuroesferas" (véase, por ejemplo, Reynolds et al (1992) Science 255:1070-1709; las publicaciones PCT WO93/01275, WO94/09119, WO94/10292 y WO94/16718). En el caso de propagación (o división) de las células en suspensión, los matraces se agitan bien y se permite que las neuroesferas sedimenten en una esquina del fondo del matraz. Las esferas se transfieren entonces a un tubo de centrifuga de 50 ml y se centrifuga a baja velocidad. El medio se aspira, las células se resuspenden en una pequeña cantidad de medio con factor de crecimiento, y las células se disocian mecánicamente y se resuspenden en alícuotas separadas de los medios.

Las suspensiones celulares en el medio de cultivo se complementan con cualquier factor de crecimiento que permita la proliferación de las células progenitoras y se siembran en cualquier recipiente que pueda mantener las células, aunque tal como se ha explicado anteriormente, preferiblemente en matraces de cultivo o frascos rotativos. Las células proliferan normalmente en un plazo de 3-4 días en una incubadora a 37ºC, y la proliferación puede reiniciarse en cualquier momento después de esto mediante la disociación de las células y la resuspensión en medio reciente que contenga factores de crecimiento.

En ausencia del sustrato, las células se despegan del fondo del matraz y continúan proliferando en la suspensión formando una esfera hueca de células no diferenciadas. Tras aproximadamente 3-10 días in vitro, las agrupaciones en proliferación (neuroesferas) se alimentan cada 2-7 días, y más particularmente cada 2-4 días mediante centrifugación suave y resuspensión en medio que contenga factor de crecimiento.

Tras 6-7 días in vitro, las células individuales en las neuroesferas pueden separarse mediante disociación física de las neuroesferas con un instrumento romo, más particularmente mediante trituración de las neuroesferas con una pipeta. Las células individuales procedentes de las neuroesferas disociadas se suspenden en medio de cultivo que contiene factores de crecimiento, y la diferenciación de las células puede controlarse en el cultivo sembrando en placa (o resuspendiendo) las células en presencia de un antagonista de hedgehog.

Para ilustrar adicionalmente otros usos de los antagonistas de hedgehog objeto, se observa que el injerto intracerebral ha surgido como un enfoque adicional para los tratamientos del sistema nervioso central. Por ejemplo, un enfoque para reparar tejidos cerebrales lesionados supone el transplante de células de animales fetales o neonatales en el cerebro del adulto (Dunnett et al. (1987) J Exp Biol 123:265-289; y Freund et al. (1985) J Neurosci 5:603-616). Las neuronas fetales procedentes de una variedad de regiones cerebrales pueden incorporarse satisfactoriamente en el cerebro del adulto, y tales injertos pueden aliviar defectos del comportamiento. Por ejemplo, el trastorno del movimiento inducido por lesiones de proyecciones dopaminérgicas a los ganglios basales puede evitarse mediante injertos de neuronas dopaminérgicas embrionarias. Las funciones cognitivas complejas que están alteradas tras lesiones de la neocorteza también pueden restaurarse parcialmente mediante injertos de las células corticales embrionarias. El método objeto puede utilizarse para regular el estado de crecimiento en el cultivo, o cuando se utiliza tejido fetal, especialmente células madre neuronales, puede utilizarse para regular la tasa de diferenciación de las células
madre.

Las células madre útiles en la presente invención se conocen generalmente. Por ejemplo, se han identificado varias células de la cresta neural, algunas de las cuales son multipotentes y probablemente representan células de la cresta neural no comprometidas, y otras pueden generar sólo un tipo de célula, tal como las neuronas sensoriales, y probablemente representan células progenitoras comprometidas. El papel de los antagonistas de hedgehog empleados en el presente método para cultivar tales células madre puede ser regular la diferenciación del progenitor no comprometido, o regular la restricción adicional del destino en el desarrollo de una célula progenitora comprometida hacia convertirse en una célula neuronal terminalmente diferenciada. Por ejemplo, el presente método puede utilizarse in vitro para regular la diferenciación de las células de la cresta neural en neurogliocitos, células de Schwann, células cromafines, neuronas parasimpáticas o simpáticas colinérgicas, así como neuronas peptidérgicas o serotonérgicas. Los antagonistas de hedgehog pueden utilizarse solos, o pueden utilizarse en combinación con otros factores neurotróficos que actúan para intensificar más particularmente un destino de diferenciación particular de la célula progenitora
neuronal.

Además de la implantación de las células cultivadas en presencia de antagonistas de hedgehog objeto, todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a la aplicación terapéutica de un antagonista de hedgehog para regular el estado de crecimiento de las neuronas y otras células neuronales, tanto en el sistema nervioso central como en el sistema nervioso periférico. La capacidad de ptc, hedgehog y smoothened para regular la diferenciación neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso y también presumiblemente en el estado adulto, indica que, en ciertos casos, puede esperarse que los antagonistas de hedgehog objeto faciliten el control de las neuronas adultas con respecto al mantenimiento, el rendimiento funcional y el envejecimiento de las células normales; los procesos de reparación y regeneración en las células lesionadas química o mecánicamente; y el tratamiento de la degeneración en ciertos estados patológicos. A la luz de este entendimiento, la presente invención contempla específicamente aplicaciones del método objeto para el protocolo de tratamiento de (prevención y/o reducción de la gravedad de) estados neurológicos que derivan de: (i), lesión aguda, subaguda o crónica al sistema nervioso central, incluyendo lesión por traumatismo, lesión química, lesión vascular y deficiencias (tal como la isquemia que resulta del accidente cerebrovascular), junto con lesión infecciosa/inflamatoria e inducida por tumor; (ii) envejecimiento del sistema nervioso, incluyendo enfermedad de Alzheimer; (iii) enfermedades neurodegenerativas crónicas del sistema nervioso, incluyendo enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y similares, así como degeneraciones espinocerebelosas; y (iv) enfermedades inmunológicas crónicas del sistema nervioso o que afecten al sistema nervioso, incluyendo la esclerosis múltiple.

Según sea apropiado, el método objeto también puede utilizarse en la generación de prótesis nerviosas para la reparación de la lesión del nervio central y periférico. En particular, cuando se intuba un axón aplastado o cortado mediante el uso de un dispositivo protésico, pueden añadirse antagonistas de hedgehog al dispositivo protésico para regular la tasa de crecimiento y la regeneración de los procesos dendríticos. Canales guía nerviosos ejemplo se describen en las patentes de los EE.UU. números 5.092.871 y 4.955.892.

En otra realización, el método objeto puede utilizarse en el tratamiento de las transformaciones neoplásicas o hiperplásicas, tal como puede producirse en el sistema nervioso central. Por ejemplo, los antagonistas de hedgehog pueden utilizarse para producir células transformadas tales que se conviertan en posmitóticas o apoptóticas. Por tanto, el presente método puede utilizarse como parte de un tratamiento para, por ejemplo, gliomas malignos, meningiomas, meduloblastomas, tumores neuroectodérmicos y ependimomas.

En una realización preferida, el método objeto puede utilizarse como parte de un régimen de tratamiento para meduloblastoma maligno y otros tumores neuroectodérmicos primitivos malignos del SNC.

En ciertas realizaciones, el método objeto se utiliza como parte del programa de tratamiento para meduloblastoma. El meduloblastoma, un tumor cerebral primario, es el tumor cerebral más común en niños. Un meduloblastoma es un tumor neuroectodérmico primitivo que surge en la fosa posterior. Constituyen aproximadamente el 25% de todos los tumores cerebrales infantiles (Miller). Histológicamente, son tumores de células pequeñas y redondas dispuestas comúnmente en rosetas verdaderas, pero pueden manifestar cierta diferenciación a astrositos, ependimocitos o neuronas (Rorke; Kleihues). Pueden surgir PNET (tumores neuroectodérmicos primitivos) en otras zonas del cerebro, incluyendo la glándula pineal (pineoblastoma) y el cerebro. Los que surgen en la región supratentorial, generalmente evolucionan peor que sus homólogos PF (de la fosa posterior).

Se sabe que el meduloblastoma/PENT recurre en cualquier sitio del SNC tras la resección y puede hacerse metastásico al hueso. Por tanto, la evaluación antes del tratamiento debe incluir un examen de la médula espinal para excluir la posibilidad de masas ("dropped metastases"). La MRI (imagen por resonancia magnética) potenciada por gadolinio ha sustituido en buena parte a la mielografía para este propósito, y se obtiene la citología de CSF posoperatoriamente como un procedimiento de rutina.

En otras realizaciones, el método objeto se usa como parte del programa de tratamiento para ependimomas. Los ependimomas constituyen aproximadamente el 10% de los tumores cerebrales en niños. A grosso modo, son tumores que surgen del revestimiento ependimal de los ventrículos y que microscópicamente forman rosetas, canales y rosetas perivasculares. En las series de CHOP de 51 niños que se había informado que tenían ependimomas, 3/4 fueron histológicamente benignos. Aproximadamente 2/3 surgieron de la región del 4º ventrículo. Un tercio se presentaron en la región supratentorial. La edad en los picos de presentación es entre el nacimiento y los 4 años, tal como se demuestra por los datos de SEER, así como por los datos de CHOP. La edad media es de aproximadamente 5 años. Debido a que muchos niños con esta enfermedad son bebés, a menudo requieren tratamiento multimodal.

Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a la observación en la técnica de que ptc, hedgehog y/o smoothened participan en las señales morfogénicas implicadas en otras rutas organogénicas de vertebrados, además de en la diferenciación neuronal, tal como se describió anteriormente, teniendo papeles evidentes en otras formaciones de patrón endodérmico, así como en los procesos de diferenciación mesodérmica y endodérmica. Por tanto, la invención contempla que las composiciones que comprenden antagonistas de hedgehog también pueden utilizarse tanto para el cultivo celular como para métodos terapéuticos que supongan la generación y el mantenimiento del tejido no neuronal.

En una realización, la presente invención hace uso del descubrimiento de que ptc, hedgehog y smoothened participan aparentemente en controlar el desarrollo de las células madre responsables de la formación del tracto digestivo, hígado, pulmones y otros órganos que se derivan del intestino primitivo. Shh sirve como una señal inductora desde el endodermo hasta el mesodermo, que es crítica para la morfogénesis del intestino. Por tanto, por ejemplo, los antagonistas de hedgehog del presente método pueden emplearse para regular el desarrollo y el mantenimiento de un hígado artificial que puede tener múltiples funciones metabólicas de un hígado normal. En una realización ejemplo, el método objeto puede usarse para regular la proliferación y la diferenciación de las células madre del tubo digestivo para formar cultivos de hepatocitos que pueden utilizarse para poblar matrices extracelulares, o que pueden encapsularse en polímeros biocompatibles, para formar hígados artificiales implantables y extracorpóreos.

En otra realización, las composiciones terapéuticas de antagonistas de hedgehog pueden utilizarse junto con el transplante de tales hígados artificiales, así como de estructuras hepáticas embrionarias, para regular la captación del implante intraperitoneal, la vascularización y la diferenciación y el mantenimiento in vivo del tejido hepático injertado.

Todavía en otra realización, el método objeto puede emplearse terapéuticamente para regular tales órganos tras el ataque físico, químico o patológico. Por ejemplo, las composiciones terapéuticas que comprenden antagonistas de hedgehog pueden utilizarse en la reparación del hígado posterior a una hepatectomía parcial.

La generación del páncreas y del intestino delgado a partir del intestino embrionario depende de la señalización intercelular entre las células endodérmicas y mesodérmicas del intestino. En particular, se ha sugerido que la diferenciación del mesodermo intestinal en el músculo liso depende de señales procedentes de las células endodérmicas adyacentes. Un mediador candidato de señales derivadas del endodermo en el intestino posterior embrionario es Sonic hedgehog. Véase, por ejemplo, Apelqvist et al. (1997) Curr Biol 7:801-4. El gen Shh se expresa en todo el endodermo del intestino embrionario, con la excepción del endodermo de la yema pancreática, que en su lugar expresa altos niveles de la proteína homeodominio lpf1/Pdx1 (factor promotor de la insulina 1/caja homeótica pancreática y duodenal 1), un regulador esencial del desarrollo pancreático temprano. Apelqvist et al., citado anteriormente han examinado si la expresión diferencial de Shh en el tubo del intestino embrionario controla la diferenciación del mesodermo circundante en derivados especializados del mesodermo de intestino delgado y páncreas. Para probar esto, utilizaron el promotor del gen lpf1/Pdx1 para expresar selectivamente Shh en el desarrollo del epitelio pancreático. En el ratón transgénico lpf1/Pdx1 - Shh, el mesodermo pancreático se desarrolla en músculo liso y células intersticiales de Cajal, características del intestino, en lugar de en mesénquima pancreático y bazo. Además, los explantes pancreáticos expuestos a Shh experimentaron un programa similar de diferenciación intestinal. Estos resultados evidencian que la expresión diferencial de Shh derivada endodérmicamente controla el destino del mesodermo adyacente en diferentes regiones del tubo intestinal.

En el contexto de la presente invención, se contempla por tanto que los antagonistas de hedgehog objeto pueden utilizarse para controlar o regular la proliferación y/o la diferenciación del tejido pancreático tanto in vivo como in vitro.

Hay una amplia variedad de estados patológicos de proliferación y diferenciación celular para los que los inhibidores de la presente invención pueden proporcionar beneficios terapéuticos, siendo la estrategia general, por ejemplo, la corrección de la expresión de insulina aberrante, o de la modulación de la diferenciación. Sin embargo, más generalmente, la presente invención se refiere a un método de inducir y/o mantener un estado diferenciado, potenciar la supervivencia y/o afectar a la proliferación de células pancreáticas, poniendo en contacto las células con los inhibidores objeto. Por ejemplo, la invención contempla que, a la luz de la participación aparente de ptc, hedgehog y smoothened en la formación de disposiciones espaciales ordenadas de los tejidos pancreáticos, el método objeto podría utilizarse como parte de una técnica para generar y/o mantener tal tejido, tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, la modulación de la función de hedgehog puede emplearse tanto en cultivo celular como en métodos terapéuticos que supongan la generación y el mantenimiento de células \beta y también posiblemente para tejido no pancreático, tal como en el control del desarrollo y el mantenimiento del tejido a partir del tracto digestivo, bazo, pulmones, órganos urogenitales (por ejemplo, la vejiga) y otros órganos que se derivan del intestino primitivo.

En una realización ejemplo, el presente método puede utilizarse en el tratamiento de trastornos hiperplásicos y neoplásicos que afectan al tejido pancreático, particularmente los caracterizados por la proliferación aberrante de células pancreáticas. Por ejemplo, los cánceres pancreáticos están caracterizados por proliferación anómala de células pancreáticas que pueden dar como resultado alteraciones en la capacidad de secreción de la insulina del páncreas. Por ejemplo, ciertas hiperplasias pancreáticas, tal como los carcinomas pancreáticos, pueden dar como resultado hipoinsulinemia debido a disfunción de las células \beta o a la disminución de la masa celular del islote. En la medida en que la señalización aberrante de ptc, hedgehog y smoothened puede indicarse en la progresión de la enfermedad, los inhibidores objeto pueden utilizarse para potenciar la regeneración del tejido tras el tratamiento anti-tumoral.

Además, la manipulación de las propiedades de señalización hedgehog en diferentes puntos puede ser útil como parte de una estrategia de reestructuración/reparación del tejido pancreático tanto in vivo como in vitro. En una realización, la presente invención hace uso de la participación aparente de ptc, hedgehog y smoothened en la regulación del desarrollo del tejido pancreático. En general, el método objeto puede emplearse terapéuticamente para regular el páncreas tras el ataque físico, químico o patológico. Todavía en otra realización, el método objeto puede aplicarse a técnicas de cultivo celular y, en particular, puede emplearse para potenciar la generación inicial de dispositivos protésicos de tejido pancreático. La manipulación de la proliferación y la diferenciación del tejido pancreático, por ejemplo, alterando la actividad de hedgehog, pueden proporcionar un medio para controlar más cuidadosamente las características de un tejido cultivado. En una realización ejemplo, el método objeto puede utilizarse para aumentar la producción de dispositivos protésicos que requieren islotes de células \beta, tal como en los dispositivos de encapsulación descritos, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. concedida a Aebischer et al. número 4.892.538, la patente de los EE.UU. concedida a Aebischer et al. número 5.106.627, la patente de los EE.UU. concedida a Lim número 4.391.909 y la patente de los EE.UU. concedida a Sefton número 4.353.888. Las células progenitoras iniciales para los islotes pancreáticos son multipotenciales y aparentemente coactivan todos los genes específicos del islote desde el momento en que aparecen por primera vez. A medida que avanza el desarrollo, la expresión de las hormonas específicas del islote, tal como la insulina, se restringe al patrón de expresión característico de las células del islote maduras. Sin embargo, el fenotipo de las células islote maduras no es estable en cultivo, ya que puede observarse la reaparición de rasgos embrionarios en las células \beta maduras. Mediante la utilización de los antagonistas de hedgehog objeto, puede regularse la ruta de diferenciación o el índice proliferativo de las células.

Además, la manipulación del estado de diferenciación del tejido pancreático puede utilizarse junto con el transplante de páncreas artificial, de manera que se mejore la implantación, la vascularización y la diferenciación y el mantenimiento in vivo del tejido injertado. Por ejemplo, puede utilizarse la manipulación de la función hedgehog para que afecte a la diferenciación tisular como medio para mantener la viabilidad del injerto.

Bellusci et al. (1997) Development 124:53 informan que Sonic hedgehog regula la proliferación de células mesenquimáticas de pulmón in vivo. En consecuencia, el presente método puede utilizarse para regular la regeneración del tejido pulmonar, por ejemplo, en el tratamiento del enfisema.

Fujita et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 238:658 informaron de que Sonic hedgehog se expresa en células de adenocarcinoma y carcinoma escamoso de pulmón en seres humanos. La expresión de Sonic hedgehog también se detectó en tejidos de carcinoma escamoso de pulmón en seres humanos, pero no en el tejido pulmonar normal del mismo paciente. También observaron que Sonic hedgehog estimula la incorporación de BrdU en las células de carcinoma y estimula su crecimiento celular, mientras que anti-Shh-N inhibió su crecimiento celular. Estos resultados sugieren que ptc, hedgehog y/o smoothened están implicados en el crecimiento celular de tal tejido pulmonar transformado y, por tanto, indica que el método objeto puede utilizarse como parte de un tratamiento de adenocarcinomas y carcinoma pulmonares, y otros trastornos proliferativos que implican al epitelio pulmonar.

Basándose en una evidencia tal como la participación de la ruta hedgehog en estos tumores, o la expresión detectada de hedgehog o su receptor en estos tejidos durante el desarrollo, muchos otros tumores pueden resultar afectados por el tratamiento con los compuestos objeto. Tales tumores incluyen, pero en modo alguno se limitan a, tumores relacionados con el síndrome de Gorlin (por ejemplo, meduloblastoma, meningioma, etc.), tumores demostrados en ratones deficientes (knock-out) en pct (por ejemplo, hemangioma, rabdomiosarcoma, etc.), tumores que resultan de la amplificación de gli-1 (por ejemplo, glioblastoma, sarcoma, etc.), tumores relacionados con TRC8, un homólogo de ptc (por ejemplo, carcinoma renal, carcinoma tiroideo, etc.), tumores relacionados con Ext-1 (por ejemplo, cáncer de huesos, etc.), tumores inducidos por Shh (por ejemplo, cáncer de pulmón, condrosarcomas, etc.) y otros tumores (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer genitourinario (por ejemplo, riñón, vejiga, uréter, próstata, etc.), cáncer suprarrenal, cáncer gastrointestinal (por ejemplo, estómago, intestino, etc.), etc.).

Todavía en otra realización de la presente invención, las composiciones que comprenden antagonistas de hedgehog pueden utilizarse en la generación in vitro de tejido esquelético, tal como a partir de células madre esqueletogénicas, así como en el tratamiento in vivo de deficiencias del tejido esquelético. La presente invención contempla particularmente el uso de antagonistas de hedgehog para regular la tasa de condrogénesis y/u osteogénesis. Por "deficiencia del tejido esquelético" se quiere decir una deficiencia en el hueso u otro tejido conectivo del esqueleto en cualquier sitio en el que se desee restaurar el hueso o el tejido conectivo, independientemente de cómo se origine la deficiencia, por ejemplo, ya sea como resultado de intervención quirúrgica, extirpación de un tumor, úlcera, implante, fractura u otros estados traumáticos o degenerativos.

Por ejemplo, el método de la presente invención puede utilizarse como parte de un régimen para restaurar la función del cartílago para un tejido conectivo. Tales métodos son útiles, por ejemplo, en la reparación de defectos o lesiones en el tejido de cartílago que es el resultado del desgaste degenerativo, tal como el que da como resultado artritis, así como en otros trastornos mecánicos que pueden producirse por traumatismo en el tejido, tal como un desplazamiento del tejido de menisco roto, meniscectomía, una luxación de una articulación por un ligamento roto, malignidad en las articulaciones, fractura ósea o enfermedad hereditaria. El presente método reparador también es útil para remodelar la matriz del cartílago, tal como en la cirugía plástica o reconstructiva, así como cirugía periodontal. El presente método también puede aplicarse para mejorar un procedimiento reparador previo, por ejemplo, tras reparación quirúrgica de un menisco, ligamento, o cartílago. Además, puede evitar el comienzo o la exacerbación de una enfermedad degenerativa si se aplica suficientemente pronto tras el traumatismo.

En una realización de la presente invención, el método objeto comprende tratar el tejido conectivo afectado con una cantidad terapéuticamente suficiente de un antagonista de hedgehog, particularmente un antagonista selectivo para la señal de transducción de Indian hedgehog, para regular una respuesta de reparación del cartílago en el tejido conectivo controlando la tasa de diferenciación y/o proliferación de condrocitos embebidos en el tejido. Tales tejidos conectivos como cartílago articular, cartílago interarticular (meniscos), cartílago costal (que conecta las costillas verdaderas y el esternón), ligamentos y tendones son particularmente susceptibles al tratamiento en las terapias reconstructivas y/o regenerativas utilizando el método objeto. Tal como se usa en el presente documento, las terapias regenerativas incluyen el tratamiento de estados degenerativos que han progresado hasta el punto en el que la alteración del tejido es obviamente manifiesta, así como los tratamientos preventivos de tejido en el que la degeneración está en sus fases iniciales o es inminente.

En una realización ilustrativa, el método objeto puede utilizarse como parte de una intervención terapéutica en el tratamiento del cartílago de una articulación diartródica, tal como una rodilla, un tobillo, un codo, una cadera, una muñeca, un nudillo de un dedo de la mano o del pie, o una articulación tempomandibular. El tratamiento puede dirigirse al menisco de la articulación, al cartílago articular de la articulación, o a ambos. Para ilustrar adicionalmente, el método objeto puede utilizarse para tratar un trastorno degenerativo de una rodilla, tal como el que podría ser el resultado de una lesión traumática (por ejemplo, una lesión deportiva o desgaste excesivo) u osteoartritis. Los antagonistas objeto pueden administrarse como una inyección en la articulación con, por ejemplo, una aguja artroscópica. En algunos casos, el agente inyectado puede estar en la forma de un hidrogel u otro vehículo de liberación lenta descrito anteriormente, con el fin de permitir un contacto más prolongado y regular del agente con el tejido tratado.

La presente invención contempla además el uso del método objeto en el campo del transplante de cartílago y los tratamientos con un dispositivo protésico. Sin embargo, surgen problemas, por ejemplo, debido a que las características del cartílago y el fibrocartílago varían entre los diferentes tejidos, tal como entre articular, cartílago de menisco, ligamentos y tendones, entre los dos extremos del mismo ligamento o tendón, y entre las partes superficiales y profundas del tejido. La disposición zonal de estos tejidos puede reflejar un cambio gradual en las propiedades mecánicas y se produce fracaso cuando el tejido implantado, que no se ha diferenciado en esas condiciones, no tiene capacidad para responder apropiadamente. Por ejemplo, cuando se usa cartílago de menisco para reparar ligamentos cruzados anteriores, el tejido sufre una metaplasia a tejido fibroso puro. Regulando la tasa de condrogénesis, el método objeto puede usarse para encarar particularmente este problema, ayudando a controlar adaptativamente las células implantadas en el nuevo entorno y asemejándose eficazmente a los condrocitos hipertróficos de una fase de desarrollo temprana del tejido.

De una forma similar, el método objeto puede aplicarse para potenciar tanto la generación de dispositivos protésicos de cartílago y sus implantaciones. La necesidad de un tratamiento mejorado ha motivado la investigación dirigida a crear nuevo cartílago que se basa en moldes de colágeno - glucosaminoglucano (Stone et al. (1990) Clin Orthop Relat Red 252:129), condrocitos aislados (Grande et al. (1989) J Orthop Res 7:208; y Takigawa et al. (1987) Bone Miner 2:449) y condrocitos unidos a polímeros naturales o sintéticos (Walitani et al. (1989) J Bone Jt Surg 71B:74; Vacanti et al (1991) Plast Reconstr Surg 88:753; von Schroeder et al. (1991) J Biomed Mater Res 25:329; Freed et al. (1993) J Biomed Mater Res 27:11; y la patente de los EE.UU. concedida a Vacanti et al. número 5.041.138). Por ejemplo, pueden hacerse crecer condrocitos en cultivo en estructuras biodegradables, biocompatibles, altamente porosas, formadas a partir de polímeros tales como poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico), gel de agarosa u otros polímeros que se degradan con el tiempo en función de la hidrólisis del esqueleto de polímero en monómeros inocuos. Las matrices de diseñan para permitir el intercambio adecuado de nutrientes y gases con las células hasta que se produce el injerto. Las células pueden cultivarse in vitro hasta que se ha desarrollado el volumen y la densidad celulares adecuados para que se implanten las células. Una ventaja de las matrices es que pueden colarse o moldearse en una forma deseada de manera individual, de manera que el producto final se asemeje estrechamente a la propia oreja o nariz del paciente (a modo de ejemplo), o pueden usarse matrices flexibles que permitan la manipulación en el momento de la implantación, como en una articulación.

En una realización del método objeto, los implantes se ponen en contacto con un antagonista de hedgehog durante ciertas fases del proceso de cultivo, con el fin de controlar la tasa de diferenciación de los condrocitos y la formación de condrocitos hipertróficos en el cultivo.

En otra realización, el dispositivo implantado se trata con un antagonista de hedgehog con el fin de remodelar activamente la matriz implantada y hacerla más adecuada para la función deseada. Tal como se explicó anteriormente con respecto a los transplantes de tejido, los transplantes artificiales experimentan la misma deficiencia de no derivarse en un entorno que es comparable al entorno mecánico real en el que se implanta la matriz. La capacidad de regular los condrocitos en la matriz mediante el método objeto puede permitir que el implante adquiera características similares a las del tejido al que se desea sustituir.

Todavía en otra realización, el método objeto se usa para potenciar la unión de los dispositivos protésicos. Para ilustrar, el método objeto puede usarse en la implantación de una prótesis periodontal, en la que el tratamiento del tejido conectivo circundante estimula la formación de ligamento periodontal alrededor de la prótesis.

Todavía en realizaciones adicionales, el método objeto puede emplearse como parte de un régimen para la generación de hueso (osteogénesis) en un sitio en el animal en el que tal tejido esquelético es deficiente. Indian hedgehog está particularmente asociado con los condrocitos hipertróficos que finalmente se reemplazan por osteoblastos. Por ejemplo, la administración de un antagonista de hedgehog de la presente invención puede emplearse como parte de un método para regular la tasa de pérdida ósea en un sujeto. Por ejemplo, pueden emplearse preparaciones que comprenden antagonistas de hedgehog, por ejemplo, para controlar la osificación endocondral en la formación de un "modelo" para la osificación.

Todavía en otra realización de la presente invención, puede usarse un antagonista de hedgehog para regular la espermatogénesis. Se ha demostrado que las proteínas hedgehog, particularmente Dhh, participan en la diferenciación y/o proliferación y mantenimiento de las células germinales testiculares. La expresión de Dhh se inicia en precursores de la célula de Sertoli poco después de la activación de Sry (gen determinante testicular) y persiste en los testículos en el adulto. Los machos son viables pero estériles, debido a una ausencia completa de esperma maduro. El examen de los testículos en desarrollo en diferentes antecedentes genéticos sugiere que Dhh regula las fases temprana y tardía de la espermatogénesis. Bitgood et al. (1996) Curr Biol 6:298. En una realización preferida, el antagonista de hedgehog puede usarse como anticonceptivo. De una forma similar, los antagonistas de hedgehog del método objeto son potencialmente útiles para modular la función ovárica normal.

El método objeto también tiene amplia aplicabilidad para el tratamiento o la profilaxis de trastornos que afectan al tejido epitelial, así como en usos cosméticos. En general, el método puede caracterizarse como que incluye una etapa de administración a un animal de una cantidad de un antagonista de hedgehog eficaz para modificar el estado de crecimiento de un tejido epitelial tratado. El modo de administración y los regímenes de dosificación variarán dependiendo del (de los) tejido(s) epitelial(s) que va(n) a tratarse. Por ejemplo, se preferirán las formulaciones tópicas cuando el tejido tratado sea tejido epidérmico, tal como tejidos dérmicos o mucosos.

Un método que "potencia la curación de una herida" da como resultado que la herida cure más rápidamente como resultado del tratamiento, de lo que una herida similar tarda en curarse en ausencia del tratamiento. "Estimulación de la curación de heridas" también puede significar que el método regula la proliferación y/o el crecimiento de, entre otros, queratinocitos, o que la herida cura con menos cicatrización, menos contracción de la herida, menos deposición de colágeno y más área superficial. En ciertos casos, "estimulación de la curación de heridas" también puede significar que ciertos métodos de curación de heridas han mejorado sus tasas de éxito (por ejemplo, las tasas tomadas de injertos cutáneos), cuando se usan junto con el método de la presente invención.

Pese al avance significativo en las técnicas quirúrgicas reconstructivas, la cicatrización puede ser un obstáculo importante en la recuperación de la función y el aspecto normales de la piel curada. Esto es particularmente cierto cuando la cicatrización patológica, tal como queloides o cicatrices hipertróficas de las manos o la cara producen incapacidad funcional o deformidad física. En las circunstancias más graves, tal cicatrización puede empujar a dificultades psicosociales y a una vida de penurias económicas. La reparación de heridas incluye las fases de hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación. La fase proliferativa incluye la multiplicación de fibroblastos y células endoteliales y epiteliales. Mediante el uso del método objeto, puede controlarse la tasa de proliferación de las células epiteliales en y próximas a la herida con el fin de acelerar el cierre de la herida y/o minimizar la formación de tejido de
cicatriz.

El presente tratamiento también puede ser eficaz como parte de un régimen terapéutico para tratar úlceras orales y paraorales, por ejemplo, que resultan de la radiación y/o la quimioterapia. Tales úlceras se desarrollan comúnmente en un plazo de días tras el tratamiento de quimioterapia o radiación. Estas úlceras normalmente comienzan como lesiones pequeñas, dolorosas, con formas irregulares, cubiertas normalmente por una fina membrana necrótica gris y rodeadas por tejido inflamatorio. En muchos casos, la falta de tratamiento da como resultado la proliferación de tejido alrededor de la periferia de la lesión de manera inflamatoria. Por ejemplo, el epitelio que rodea la úlcera normalmente demuestra actividad proliferativa, lo que da como resultado pérdida en la continuidad del epitelio superficial. Estas lesiones, debido a su tamaño y a la pérdida de integridad epitelial, predisponen al organismo a una infección secundaria potencial. La ingestión habitual de alimentos y agua llega a ser un acontecimiento muy doloroso y, si las úlceras proliferan por todo el tubo digestivo, normalmente se manifiesta diarrea con todos sus factores de complicación. Según la presente invención, un tratamiento para tales úlceras que incluya la aplicación de un antagonista de hedgehog puede reducir la proliferación y diferenciación anómalas del epitelio afectado, ayudando a reducir la gravedad de los posteriores acontecimientos inflamatorios.

El método y las composiciones objeto también pueden utilizarse para tratar heridas que resultan de enfermedades dermatológicas, tales como lesiones que resultan de trastornos autoinmunitarios, tal como psoriasis. La dermatitis atópica se refiere al traumatismo de la piel que resulta de alergias asociadas con una respuesta inmunitaria producida por alergenos tal como polen, alimentos, caspa, venenos de insectos y toxinas de plantas.

En otras realizaciones, las preparaciones antiproliferativas de los antagonistas de hedgehog pueden utilizarse para inhibir la proliferación de células epiteliales en el cristalino para evitar complicaciones posoperatorias de la extracción de cataratas extracapsulares. Las cataratas es una enfermedad ocular resistente al tratamiento y se han realizado diversos estudios sobre un tratamiento de las cataratas. Sin embargo, en la actualidad, el tratamiento de las cataratas se logra mediante intervenciones quirúrgicas. La cirugía de cataratas se lleva aplicando desde hace mucho tiempo y se han examinado diversos métodos quirúrgicos. La extracción extracapsular del cristalino se ha convertido en el método de elección para extirpar las cataratas. Las principales ventajas médicas de esta técnica con respecto a la extracción intracapsular son la menor incidencia de edema macular cistoide afáquico y desprendimiento de retina. La extracción extracapsular también se requiere para la implantación de lentes intraoculares de tipo cámara posterior que ahora se considera que son las lentes de elección en la mayoría de los casos.

Sin embargo, una desventaja de la extracción extracapsular de cataratas es la elevada incidencia de opacificación de la cápsula posterior del cristalino, denominada a menudo tras-catarata ("after-cataract"), que puede producirse en hasta el 50% de los casos en un plazo de tres años tras la intervención quirúrgica. La tras-catarata se produce por la proliferación de células epiteliales de la cápsula anterior y ecuatorial del cristalino que quedan tras la extracción extracapsular del cristalino. Estas células proliferan para producir anillos de Sommerling, y junto con los fibroblastos que también se depositan y se producen en la cápsula posterior, producen la opacificación de la cápsula posterior, lo que interfiere con la visión. La prevención de tras-catarata sería preferible al tratamiento. Para inhibir la formación de cataratas secundarias, el método objeto proporciona un medio para inhibir la proliferación de las células epiteliales restantes del cristalino. Por ejemplo, puede inducirse a tales células a que permanezcan quiescentes mediante la instilación de una disolución que contiene una preparación de antagonista de hedgehog en la cámara anterior del ojo tras la extracción del cristalino. Además, la disolución puede equilibrarse osmóticamente para proporcionar la dosis eficaz mínima cuando se instila en la cámara anterior del ojo, inhibiendo así el crecimiento epitelial subcapsular con cierta especificidad.

El método objeto también puede utilizarse en el tratamiento de corneopatías caracterizadas por proliferación de células epiteliales queratinocíticas, tal como por ejemplo en los trastornos epiteliales oculares, tales como crecimiento epitelial hacia dentro o carcinomas de células escamosas de la superficie ocular.

Levine et al. (1997) J Neurosci 17:6277 muestran que las proteínas hedgehog pueden regular la mitogénesis y la diferenciación de los fotorreceptores en la retina de vertebrados y que Ihh es un factor candidato del epitelio pigmentado para potenciar la proliferación de los progenitores retinianos y la diferenciación de los fotorreceptores. Asimismo, Jensen et al. (1997) Development 124:363 demostraron que el tratamiento de cultivos de las células retinianas de ratón perinatal con el fragmento amino-terminal de la proteína Sonic hedgehog dio como resultado un aumento en la proporción de células que incorporan bromodesoxiuridina, en el número de células totales, y en los fotorreceptores de bastón, las células amacrinas y los neurogliocitos de Muller, lo que sugiere que Sonic hedgehog potencia la proliferación de las células precursoras retinianas. Por tanto, el método objeto puede utilizarse en el tratamiento de las enfermedades proliferativas de las células retinianas y para regular la diferenciación de los fotorreceptores.

Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del método objeto para controlar el crecimiento del pelo. El pelo está compuesto básicamente por queratina, una proteína resistente e insoluble; su resistencia principal reside en su puente disulfuro de cistina. Cada pelo individual comprende un eje cilíndrico y una raíz, y está contenido en un folículo, una depresión lageniforme en la piel. La parte inferior del folículo contiene una proyección con forma de dedo denominada papila, que consiste en tejido conectivo a partir del cual crece el pelo, y a través del cual vasos sanguíneos suministran nutrientes a las células. El eje es la parte que se extiende hacia fuera de la superficie de la piel, mientras que la raíz se ha descrito como la parte insertada del pelo. La base de la raíz se extiende hasta el bulbo del pelo, que descansa sobre la papila. Las células a partir de las que se produce el pelo crecen en el bulbo del folículo; se extruyen en forma de fibras a medida que proliferan las células en el folículo. El "crecimiento" del pelo se refiere a la formación y la elongación de la fibra del pelo por las células que se dividen.

Tal como es bien conocido en la técnica, el ciclo común del pelo se divide en tres fases: anágena, catágena y telógena. Durante la fase activa (anágena), las células madre epidérmicas de la papila dérmica se dividen rápidamente. Las células hija se mueven hacia arriba y se diferencian para formar las capas concéntricas del propio pelo. La fase de transición, catágena, se caracteriza por el cese de la mitosis de las células madre en el folículo. La fase de reposo se conoce como telógena, en la que el pelo se mantiene dentro del cuero cabelludo durante varias semanas antes de que un nuevo pelo emergente que se desarrolla por debajo, desplace el eje de la fase telógena de su folículo. A partir de este modelo ha quedado claro que cuanto más grande es el conjunto de células madre en división que se diferencian en células pilosas, más crecimiento de pelo se produce. En consecuencia, pueden llevarse a cabo métodos para aumentar o reducir el crecimiento del pelo mediante potenciación o inhibición, respectivamente, de la proliferación de estas células madre.

En ciertas realizaciones, el método objeto puede emplearse como una forma de reducir el crecimiento de pelo humano, en contraposición a su eliminación convencional mediante corte, afeitado o depilación. Por ejemplo, el presente método puede utilizarse en el tratamiento de la tricosis, caracterizada por el crecimiento anómalamente rápido o denso del pelo, por ejemplo, hipertricosis. En una realización ejemplo, los antagonistas de hedgehog pueden utilizarse para tratar el hirsutismo, un trastorno caracterizado por una vellosidad anómala. El método objeto también puede proporcionar un proceso para prolongar la duración de la depilación.

Además, dado que un antagonista de hedgehog a menudo será cistostático para las células epiteliales, en lugar de citotóxico, tales agentes pueden utilizarse para proteger las células del folículo piloso de agentes citotóxicos que requieren progresión en la fase S del ciclo celular para su eficacia, por ejemplo, muerte inducida por radiación. El tratamiento mediante el método objeto puede proporcionar protección haciendo que las células del folículo piloso se vuelvan quiescentes, por ejemplo, inhibiendo que las células entren en la fase S y, por tanto, evitando que las células del folículo sufran catástrofe mitótica o muerte celular programada. Por ejemplo, los antagonistas de hedgehog pueden utilizarse para los pacientes que se someten a quimioterapias o radioterapias, que normalmente dan como resultado pérdida del cabello. Mediante la inhibición de la progresión del ciclo celular durante tales terapias, el tratamiento objeto puede proteger las células del folículo piloso de la muerte que, en caso contrario, podría resultar de la activación de los programas de muerte celular. Una vez concluido el tratamiento, el presente método también puede eliminarse con el alivio concomitante de la inhibición de la proliferación de las células del folículo.

El método objeto también puede utilizarse en el tratamiento de la foliculitis, tal como la foliculitis decalvante, la foliculitis uleritematosa reticulada y la foliculitis queloidea. Por ejemplo, una preparación cosmética de un antagonista de hedgehog puede aplicarse tópicamente en el tratamiento de la pseudofoliculitis, un trastorno crónico que se produce con más frecuencia en la región submandibular del cuello y que está asociada con el afeitado, cuyas lesiones características son pústulas y pápulas eritematosas que contienen pelos insertados.

En otro aspecto de la invención, el método objeto puede utilizarse para inducir diferenciación y/o para inhibir la proliferación de tejido epitelialmente derivado. Tales formas de estas moléculas pueden proporcionar una base para la terapia de diferenciación para el tratamiento de los estados hiperplásicos y/o neoplásicos que implican al tejido epitelial. Por ejemplo, tales preparaciones pueden utilizarse para el tratamiento de las enfermedades cutáneas en las que hay una proliferación o crecimiento anómalos de las células de la piel.

Por ejemplo, las preparaciones farmacéuticas de la invención están dirigidas al tratamiento de estados epidérmicos hiperplásicos, tales como queratosis, así como para el tratamiento de estados epidérmicos neoplásicos, tales como los caracterizados por una alta tasa de proliferación de diversos cánceres cutáneos, como por ejemplo, el carcinoma de células escamosas. El método objeto también puede utilizarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias que afectan a la piel, en particular, de enfermedades dermatológicas que incluyan queratinización y/o proliferación mórbida de la epidermis, como por ejemplo, producidas por psoriasis o dermatosis atópica.

Muchas enfermedades comunes de la piel, tales como la psoriasis, el carcinoma de células escamosas, el queratoacantoma y la queratosis actínica, se caracterizan por proliferación y crecimiento anómalos localizados. Por ejemplo, en la psoriasis, que se caracteriza por placas escamosas, rojas y elevadas de la piel, se sabe que los queratinocitos proliferan mucho más rápidamente de lo normal y que se diferencian menos completamente.

En una realización, las preparaciones de la presente invención son adecuadas para el tratamiento de dolencias dermatológicas asociadas con trastornos de queratinización que producen la proliferación anómala de las células cutáneas, trastornos que pueden caracterizarse por componentes inflamatorios o no inflamatorios. Como ilustración, pueden utilizarse preparaciones terapéuticas de un antagonista de hedgehog, por ejemplo, que potencie la quiescencia o la diferenciación, para tratar diversas formas de psoriasis, ya sea cutánea, mucosa o ungueal. La psoriasis, tal como se describió anteriormente, se caracteriza normalmente por queratinocitos epidérmicos que presentan una marcada activación proliferativa y diferenciación a lo largo de una ruta "regenerativa". El tratamiento con una realización antiproliferativa del método objeto puede utilizarse para revertir la activación epidérmica patológica y puede proporcionar una base para la remisión sostenida de la enfermedad.

Una variedad de lesiones queratósicas también son candidatas para el tratamiento con el método objeto. Las queratosis actínicas, por ejemplo, son tumores premalignos inflamatorios superficiales que surgen de la piel irradiada y expuesta al sol. Las lesiones son de eritematosas a pardas con escamación variable. Los tratamientos actuales incluyen criocirugía y cirugía excisional. Sin embargo, estos tratamientos son dolorosos y a menudo producen cicatrices estéticamente inadmisibles. En consecuencia, el tratamiento de la queratosis, tal como la queratosis actínica, puede incluir la aplicación, preferiblemente tópica, de una composición de antagonista de hedgehog en cantidades suficientes para inhibir la hiperproliferación de las células epidérmicas/epidermoides de la lesión.

El acné representa todavía otra dolencia dermatológica que puede tratarse medianteel método objeto. El acné vulgaris, por ejemplo, es una enfermedad multifactorial que se produce más comúnmente en los adolescentes y adultos jóvenes, y que está caracterizada por la aparición de lesiones inflamatorias y no inflamatorias en la cara y en la parte superior del tronco. El defecto básico que da origen al acné vulgaris es la hipercornificación del conducto de una glándula sebácea hiperactiva. La hipercornificación bloquea la movilidad normal de los microorganismos de la piel y los folículos, y al hacerlo así, estimula la liberación de lipasas por las bacterias Propinobacterium acnes y Staphylococcus epidermidis y la levadura Pitosporum ovale. El tratamiento con un antagonista de hedgehog antiproliferativo, particularmente en preparaciones tópicas, puede ser útil para evitar las características de transición de los conductos, por ejemplo, la hipercornificación, que conducen a la formación de la lesión. El tratamiento objeto puede incluir además, por ejemplo, antibióticos, retinoides y antiandrógenos.

La presente invención también proporciona un método para tratar varias formas de dermatitis. La dermatitis es un término descriptivo que se refiere a lesiones escasamente delimitadas que son pruríticas, eritematosas, escamosas, vesiculosas, supurantes, agrietadas o con costra. Estas lesiones por cualquiera de una amplia variedad de causas. Los tipos más comunes de dermatitis son dermatitis atópica, de contacto y del pañal. Por ejemplo, la dermatitis seborreica es una dermatitis crónica, normalmente prurítica, con eritema, formación de escamas secas, húmedas o grasas, y parches con costra amarilla en diversas zonas, especialmente en el cuero cabelludo, con exfoliación de una cantidad excesiva de escamas secas. El método objeto también puede utilizarse en el tratamiento de la dermatitis por estasis, una dermatitis a menudo crónica, normalmente eccematosa. La dermatitis actínica es la dermatitis debida a la exposición a radiación actínica, tal como la procedente del sol, las ondas ultravioletas o la radicación X o gamma. Según la presente invención, el método objeto puede utilizarse en el tratamiento y/o la prevención de ciertos síntomas de la dermatitis producida por la proliferación no deseada de las células epiteliales. Tales terapias para estas diversas formas de dermatitis también pueden incluir corticosteroides, antipuríticos y antibióticos, tópicos y sistémicos.

Las dolencias que pueden tratarse mediante el método objeto son trastornos específicos para seres no humanos, tales como la sarna.

Todavía en otra realización, el método objeto también puede utilizarse en el tratamiento de cánceres humanos, tales como tumores de tejidos epiteliales, tales como la piel. Por ejemplo, los antagonistas de hedgehog pueden emplearse, en el método objeto, como parte de un tratamiento para carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas humanos, y similares.

En otro aspecto, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de hedgehog. Los antagonistas de hedgehog para su uso en el método objeto pueden formularse convenientemente para la administración con un medio biológicamente aceptable, tal como agua, solución salina tamponada, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares) o mezclas adecuadas de los mismos. La concentración óptima del (de los) principio(s) activo(s) en el medio escogido puede determinarse empíricamente, según procedimientos bien conocidos por los químicos farmacéuticos. Tal como se usa en el presente documento, "medio biológicamente aceptable" incluye cualquiera de todos los disolventes, medios de dispersión y similares, que puedan ser apropiados para la vía deseada de administración de la preparación farmacéutica. El uso de tales medios para los principios farmacéuticamente activos se conoce en la técnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con la actividad de los antagonistas de hedgehog, se contempla su uso en la preparación farmacéutica de la invención. Vehículos adecuados y su formulación incluida de otras proteínas se describen, por ejemplo, en el libro Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa., EE.UU. 1985). Estos vehículos incluyen "formulaciones de depósito" inyectables.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también incluyen composiciones veterinarias, por ejemplo, preparaciones farmacéuticas de antagonistas de hedgehog adecuados para usos veterinarios, por ejemplo, para el tratamiento de ganado o animales domésticos, por ejemplo, perros.

También pueden proporcionarse métodos de introducción mediante dispositivos recargables o biodegradables. Se han desarrollado y probado in vivo en los últimos años varios dispositivos poliméricos de liberación lenta para la administración controlada de los fármacos, incluyendo productos biofarmacéuticos proteicos. Puede usarse una variedad de polímeros biocompatibles (incluyendo hidrogeles), incluyendo polímeros biodegradables y no degradables, para formar un implante para la liberación sostenida de un antagonista de hedgehog en un sitio diana particular.

Las preparaciones de la presente invención pueden administrarse por vía oral, parenteral, tópica o rectal. Naturalmente, se administran mediante formas adecuadas para cada vía de administración. Por ejemplo, se administran en forma de comprimidos o cápsulas, mediante inyección, inhalación, loción ocular, pomada, supositorio, parche de liberación controlada, etc., administración mediante inyección, infusión o inhalación; tópica mediante loción o pomada; y rectal mediante supositorios. Las administraciones oral y tópica son las preferidas.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", tal como se usan en el presente documento, significan modos de administración distintos de la administración entérica o tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal.

Las expresiones "administración sistémica", "administrado por vía sistémica", "administración periférica" y "administrado por vía periférica", tal como se usan en el presente documento, significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material, distinta a directamente en el sistema nervioso central, de manera que entre en el sistema del paciente y, por tanto, se someta a metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, la administración subcutánea.

Estos compuestos pueden administrarse a seres humanos y a otros animales para el tratamiento mediante cualquier vía de administración adecuada, incluyendo por vía oral, nasal, mediante por ejemplo, un pulverizador, por vía rectal, intravaginal, parenteral, intracisternal, y por vía tópica, mediante polvos, pomadas o gotas, incluyendo por vía bucal y sublingual.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas farmacéuticas aceptables farmacéuticamente, tal como se describe más adelante, o mediante otros métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Los niveles de dosis reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden variarse de manera que se obtenga una cantidad de principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente.

El nivel de dosis seleccionado depende de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, o del éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con el antagonista de hedgehog particular empleado, la edad, sexo, peso, estado, salud general e historia médica anterior del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas medicas.

Un médico o veterinario que sea un experto habitual en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar con dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos, con el fin de lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado.

En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis eficaz más baja para producir un efecto terapéutico. Tal dosis eficaz dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Generalmente, las dosis intravenosa, intracerebroventricular y subcutánea de los compuestos de esta invención para un paciente oscilarán desde aproximadamente 0,0001 hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día.

Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado en intervalos apropiados durante todo el día, opcionalmente, en formas farmacéuticas unitarias.

El término "tratamiento" pretende englobar también profilaxis, terapia y cura.

El paciente que recibe este tratamiento es cualquier animal que lo necesite, incluyendo primates, en particular seres humanos, y otros mamíferos tales como equinos, reses, cerdos y ovejas; y aves de corral y mascotas en general.

El compuesto de la invención puede administrarse como tal o en mezcla con vehículos farmacéuticamente aceptables y/o estériles y también puede administrarse junto con otros agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas, aminoglucósidos y glucopéptidos. Por tanto, el tratamiento conjunto incluye la administración secuencial, simultánea y separada del compuesto activo de una forma que los efectos terapéuticos del primero administrado no desaparezcan por completo cuando se administra el siguiente.

V. Composiciones farmacéuticas

Aunque es posible para un compuesto de la presente invención administrarse solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición). Los antagonistas de hedgehog según la invención pueden formularse para su administración en cualquier forma conveniente para su uso en medicina humana y veterinaria. En ciertas realizaciones, el compuesto incluido en la preparación farmacéutica puede ser activo por sí mismo, o puede ser un profármaco, por ejemplo, capaz de convertirse en un compuesto activo en un entorno fisiológico.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos descritos anteriormente, formulados junto con uno o más vehículos (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Tal como se describe en detalle más adelante, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse especialmente para la administración en forma sólida o líquida, incluyendo las adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, impregnaciones (drenches) (disoluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación sobre la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa, como por ejemplo, una disolución o suspensión estéril ; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, pomada o pulverización aplicada sobre la piel; o (4) vía intravaginal o intrarrectal, por ejemplo, como un óvulo vaginal, crema o espuma. Sin embargo, en ciertas realizaciones, los compuestos objeto pueden disolverse o suspenderse simplemente en agua estéril. En ciertas realizaciones, la preparación farmacéutica es no pirogénica, es decir, no eleva la temperatura corporal de un paciente.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en el presente documento, significa tal cantidad de un compuesto, material o composición que comprende un compuesto de la presente invención que es eficaz para producir cierto efecto terapéutico deseado superando un fenotipo de ganancia de función hedgehog en al menos una subpoblación de células en un animal y bloqueando así las consecuencias biológicas de esa ruta en las células tratadas, en una razón beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del criterio médico sólido, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones excesivos, acorde con una razón beneficio/riesgo razonable.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, implicado en llevar o transportar los antagonistas objeto de un órgano, o parte del organismo, a otro órgano, o parte del organismo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otos componentes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tal como lactosa, glucosa y sacarosa; (2), almidones, tal como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tal como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (5) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tal como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tal como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tal como propilenglicol; (11) polioles, tal como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tal como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tal como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (19) solución Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones tampón fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en las formulaciones farmacéuticas.

Tal como se explicó anteriormente, ciertas realizaciones de los presentes antagonistas de hedgehog pueden contener un grupo funcional básico, tal como amino o alquilamino y, por tanto, pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en este sentido, se refiere a sales de adición de ácido orgánico o inorgánico, relativamente no tóxicas de los compuestos de la presente invención. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos de la invención, o haciendo reaccionar por separado un compuesto purificado de la invención en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, y aislando la sal así formada. Sales representativas incluyen sales bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato y laurilsulfonato y similares. (Véase, por ejemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19).

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos objeto incluyen sales no tóxicas convencionales o sales de amonio cuaternario de los compuestos, por ejemplo, a partir de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Por ejemplo, tales sales no tóxicas convencionales incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etanodisulfónico, oxálico, isotiónico y similares.

En otros casos, los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos y, por tanto, pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables", en estos casos, se refiere a sales de adición de bases orgánicas e inorgánicas, relativamente no tóxicas, de los compuestos de la presente invención. Estas sales pueden prepararse asimismo in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos de la invención, o haciendo reaccionar por separado un compuesto purificado en su forma de ácido libre con una base adecuada tal como hidróxido, carbonato o bicarbonato, de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amoniaco o con una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria, farmacéuticamente aceptable. Sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares. Aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares. (Véase, por ejemplo, Berge et al., citado anteriormente).

Agentes de humectación, emulsionantes y lubricantes, tal como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes saborizantes y aromatizantes, conservantes y antioxidantes, también pueden estar presentes en las composiciones.

Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tal como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2). antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tal como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria o pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica de farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material vehículo para producir una forma farmacéutica individual variará dependiendo del huésped que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material vehículo para producir una forma farmacéutica individual será generalmente aquella cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. En general, del cien por cien, esta cantidad oscilará desde aproximadamente el 1 por ciento hasta aproximadamente el noventa y nueve por ciento de principio activo, preferiblemente desde aproximadamente el 5 por ciento hasta aproximadamente el 70 por ciento, más preferiblemente desde aproximadamente el 10 por ciento hasta aproximadamente el 30 por
ciento.

Los métodos para preparar estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de asociar un compuesto de la presente invención con el vehículo y, opcionalmente uno o más componentes auxiliares. En general, las formulaciones se preparar asociando uniforme e íntimamente un compuesto de la presente invención con vehículos líquidos, o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y después, si es necesario, dar forma al producto.

Las formulaciones de la invención adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sobres, píldoras, comprimidos, pastillas (utilizando una base edulcorada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos, gránulos o como una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (utilizando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga) y/o como enjuagues bucales y similares, conteniendo cada una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como principio activo. Un compuesto de la presente invención también puede administrarse como un bolo, electuario o pasta.

En las formas farmacéuticas sólidas de la invención para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), el principio activo se mezcla con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o extendedores, tal como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, tal como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tal como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la disolución, tal como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tal como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes de humectación tal como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tal como caolín y arcilla bentonita; (9) lubricantes, tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes tamponantes. Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden emplearse como filtros en cápsulas de gelatina cargadas duras y blandas que utilizan excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Un comprimido puede obtenerse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes auxiliares. Los comprimidos sometidos a compresión pueden prepararse usando un agente aglutinante (por ejemplo, gelatina o hipromelosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo, glicolato de almidón sódico o carboximetilcelulosa sódica reticulada), tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden obtenerse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.

Los comprimidos y otras formas farmacéuticas sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, tal como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden marcarse opcionalmente o prepararse con recubrimientos y envueltas, tal como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También pueden formularse de manera que proporcionen liberación lenta o sostenida del principio activo utilizando en el mismo, por ejemplo, hipromelosa en diversas proporciones para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene las bacterias, o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición en la que liberen el(los) principio(s) activo(s) sólo, o preferentemente, en una cierta parte del tracto gastrointestinal, opcionalmente de una manera sostenida. Ejemplos de composiciones de inclusión que pueden utilizarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada, si resulta apropiado, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente.

Las formas farmacéuticas líquidas para la administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires, farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tal como, por ejemplo, agua y otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tal como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitano, y mezclas de los mismos.

Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes de humectación, agentes emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, saborizantes, colorantes, aromatizantes y agentes conservantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión tal como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Se sabe que los esteroles, tal como el colesterol, formarán complejos con las ciclodextrinas. Por tanto, en las realizaciones preferidas, cuando el inhibidor es un alcaloide esteroideo, puede formularse con ciclodextrinas, tal como \alpha, \beta y \gamma-ciclodextrina, dimetil-\beta-ciclodextrina y 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la invención para la administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes y vehículos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera para supositorios o un salicilato, y que es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a la temperatura corporal y, por tanto, se fundirá en el recto o en la cavidad vaginal y liberará el antagonista de hedgehog activo.

Las formulaciones de la presente invención que son adecuadas para la administración vaginal también incluyen formulaciones en óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizaciones que contienen vehículos tales como los que se sabe en la técnica que son apropiados.

Formas farmacéuticas apropiadas para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen polvos, pulverizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches e inhalaciones. El compuesto activo puede mezclarse en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propelente que pueda requerirse.

Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta invención, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.

Los polvos y las pulverizaciones pueden contener, además de un compuesto de esta invención, excipientes tal como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Las pulverizaciones pueden contener adicionalmente propelentes habituales, tal como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tal como butano y propano.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar la administración controlada de un compuesto de la presente invención al cuerpo. Tales formas farmacéuticas pueden obtenerse disolviendo o dispersando los antagonistas de hedgehog en el medio apropiado. También pueden utilizarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo de los antagonistas de hedgehog a través de la piel. La velocidad de tal flujo puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el compuesto en un gel o matriz polimérica.

Las formulaciones oftálmicas, pomadas, polvos, disoluciones oculares y similares, también se contempla que están dentro del alcance de esta invención.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención adecuadas para la administración parenteral comprenden uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones, acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles, farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que convierten la formulación en isotónica con la sangre del receptor deseado o agentes de suspensión o espesantes.

Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes de humectación, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante la inclusión de diversos agentes antifúngicos y antibacterianos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tal como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede provocarse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tal como monoestearato de aluminio y
gelatina.

En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, es deseable ralentizar la absorción del fármaco de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede llevarse a cabo mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tienen escasa solubilidad en agua. La tasa de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma farmacéutica administrada por vía parenteral se lleva a cabo disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso.

Las formas de liberación prolongada inyectables se obtienen formando matrices microencapsuladas de los compuestos objeto en polímeros biodegradables, tal como polilactida-poliglicólido. Dependiendo de la razón del fármaco con respecto al polímero, y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación del fármaco. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de liberación prolongada también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.

Cuando los compuestos de la presente invención se administran como productos farmacéuticos a seres humanos y animales, pueden administrarse per se o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, del 0,1 al 99,5% (más preferiblemente, del 0,5 al 90%) del principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La adición del compuesto activo de la invención a la alimentación del animal se lleva a cabo preferiblemente preparando una premezcla alimenticia apropiada que contiene el compuesto activo en una cantidad eficaz e incorporando la premezcla a la ración completa.

Alternativamente, puede mezclarse con el alimento un concentrado intermedio o aporte complementario alimenticio que contienen el principio activo. La forma en la que tales premezclas alimenticias y raciones completas pueden prepararse y administrarse se describen en los libros de la bibliografía (tales como "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman y CO., San Francisco, EE.UU., 1969 o "Livestock Feeds and Feeding" O and B Books, Corvallis, Ore., EE.UU., 1977).

VI. Esquemas sintéticos e identificación de antagonistas activos

Los alcaloides esteroideos objeto, y congéneres de los mismos, pueden prepararse fácilmente empleando tecnologías de acoplamiento cruzado de Suzuki, Stille y similares. Estas reacciones de acoplamiento se llevan a cabo en condiciones relativamente suaves y toleran una amplia variedad de funcionalidad "espectadora".

a. Bibliotecas combinatorias

Los compuestos de la presente invención, particularmente las bibliotecas o variantes que tienen varias clases representativas de sustituyentes, pueden tratarse mediante química combinatoria y otros esquemas de síntesis paralelos (véase, por ejemplo, el documento PCT WO 94/08051). El resultado es que pueden seleccionarse rápidamente grandes bibliotecas de compuestos relacionados, por ejemplo, una biblioteca abigarrada de los compuestos representados anteriormente, en ensayos de alto rendimiento con el fin de identificar potenciales compuestos líderes antagonistas de hedgehog, así como para refinar la especificidad, toxicidad y/o el perfil citotóxico-cinético de un compuesto líder. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos de bioactividad de ptc, hedgehog o smoothened, tal como puede desarrollarse utilizando células con pérdida de función ptc, ganancia de función hedgehog o ganancia de función smoothened, para seleccionar una biblioteca de los compuestos objeto para los que tienen actividad agonista frente a ptc o actividad antagonista frente a hedgehog o smoothened.

Únicamente como ilustración, una biblioteca combinatoria para los propósitos de la presente invención es una mezcla de compuestos químicamente relacionados que pueden seleccionarse juntos para una propiedad deseada. La preparación de muchos compuestos relacionados en una única reacción reduce y simplifica enormemente el número de procesos de selección que es necesario llevar a cabo. La selección para las propiedades físicas apropiadas puede realizarse mediante métodos convencionales.

Puede crearse diversidad en la biblioteca a una variedad de niveles diferentes. Por ejemplo, los grupos arilo sustrato utilizados en las reacciones de combinación pueden ser diferentes en lo que se refiere al resto arilo central, por ejemplo, una diversidad en lo que se refiere a la estructura del anillo, y/o pueden variar con respecto a los otros sustituyentes.

Se dispone de una variedad de recursos técnicos en la técnica para generar bibliotecas combinatorias de pequeñas moléculas orgánicas tal como los agonistas de hedgehog objeto. Véase, por ejemplo, Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14:83; las patentes de los EE.UU. concedidas a Affymax 5.359.115 y 5.362.899; la patente de los EE.UU. concedida a Ellman 5.288.514; la publicación PCT concedida a Still et al. WO 94/08051; las patentes de los EE.UU. concedidas a ArQule 5.736.412 y 5.712.171; Chen et al. (1994) JACS 116:2661; Kerr et al. (1993) JACS 115:252; las publicaciones PCT WO92/10092, WO93/09668 y WO91/07087; y la publicación PCT concedida a Lerner et al. WO93/20242). En consecuencia, puede sintetizarse una variedad de bibliotecas del orden de aproximadamente 100 hasta 1.000.000 o más diversómeros de antagonistas de hedgehog objeto y seleccionarse para una actividad o propiedad particulares.

En una realización a modo de ejemplo, puede sintetizarse una biblioteca de diversómeros de antagonistas de hedgehog candidatos utilizando un esquema adaptado a las técnicas descritas en la publicación PCT concedida a Still et al. WO 94/08051, por ejemplo, que están unidas a una perla polimérica mediante un grupo hidrolizable o fotolizable, situado opcionalmente en una de las posiciones de los antagonistas candidatos o un sustituyente de un producto intermedio sintético. Según la técnica de Still et al., la biblioteca se sintetiza en un conjunto de perlas, incluyendo cada perla un conjunto de etiquetas que identifican los diversómeros particulares en esa perla. La biblioteca de perlas pueden "sembrarse en placa" entonces con células con pérdida de función ptc, ganancia de función hedgehog o ganancia de función smoothened para las que se busca un antagonista de hedgehog. Los diversómeros pueden liberarse de la perla, por ejemplo, mediante hidrólisis.

Las estructuras de los compuestos útiles en la presente invención se prestan fácilmente a una síntesis eficaz. La naturaleza de las estructuras, tal como se describe generalmente por las fórmulas I y II, permite el montaje de tales compuestos usando cierta combinación de los restos X, Y y Z, tal como se explicó anteriormente. Los restos X y Z son de naturaleza heteroatómica y, por tanto, permiten la formación de diversos enlaces con el carbono. Los restos Y, cuando están presentes, toman la forma de restos electrófilos, tal como grupos carbonilo y sulfonilo, y los reactivos están fácilmente disponibles para la unión de tales restos a grupos heteroatómicos similares a X y Z. La inmensa mayoría de tales reacciones, incluyendo las representadas en las figuras 11, 12, 15 y 16 son extremadamente suaves y extremadamente fidedignas y, por tanto, son perfectamente adecuadas para la química combinatoria. La naturaleza simplista de tales enfoques combinatorios con respecto a la generación de una biblioteca de compuestos de prueba es evidente en el siguiente esquema ejemplo (P = grupo protector), en el que los diversos grupos de un compuesto según la fórmula II están unidos combinatoriamente (por ejemplo, utilizando uno de los métodos descritos anteriormente), con funcionalización combinatoria del sistema de anillo central (por ejemplo W) confiriendo diversidad adicional a la biblioteca. Puede obtenerse incluso más diversidad, por ejemplo, utilizando una variedad de grupos electrófilos cuando se añade una subunidad, es decir, utilizando una variedad de PO-Ar-L-C(O)Cl, PO-Ar-L-NCO, PO-Ar-L-SO_{2}Cl, etc., cuando se añade la subunidad R_{2}.

17

Muchas variaciones de las rutas anteriores y otras relacionadas permiten la síntesis de bibliotecas ampliamente diversas de compuestos que pueden probarse como inhibidores de la función hedgehog.

b. Ensayos de selección

Hay una variedad de ensayos disponibles para determinar la capacidad de un compuesto para ser agonista de la función ptc o antagonista de la función smoothened o hedgehog, muchos de los cuales pueden disponerse en formatos de alto rendimiento. En muchos programas de selección de fármacos que prueban bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables los ensayos de alto rendimiento con el fin de maximizar el número de compuestos inspeccionados en un periodo de tiempo dado. Por tanto, las bibliotecas de productos naturales y sintéticos pueden muestrearse para otros compuestos que sean antagonistas de hedgehog.

Además de los ensayos libres de células, los compuestos de prueba también pueden probarse en ensayos basados en células. En una realización, la célula que tiene un fenotipo de pérdida de función ptc, ganancia de función hedgehog o ganancia de función smoothened puede ponerse en contacto con un agente de prueba de interés, con la puntuación del ensayo para, por ejemplo, inhibición de la proliferación de la célula en presencia del agente de prueba.

Se han relacionado varios productos génicos en la transducción de señal mediada por patched, incluyendo patched, factores de transcripción de la familia cubitus interruptus (ci), fused (fu) de serina/treonina cinasa y los productos génicos de costal-2, smoothened y supressor of fused.

La inducción de células por proteínas hedgehog pone en movimiento una cascada que implica la activación y la inhibición de efectores aguas abajo, cuya consecuencia final es, en algunos casos, un cambio detectable en la transcripción o la traducción de un gen. Las dianas transcripcionales potenciales de la señalización mediada por hedgehog son el gen patched (Hidalgo e Inhgam, 1990 Development 110, 291-201; Marigo et al., 1996) y los homólogos en vertebrados del gen cubitus interruptus de Drosophila, los genes GLI (Hui et al. (1994) Dev Biol 162:402-413). Se ha demostrado que la expresión del gen patched está inducida en las células de la yema de las extremidades y la placa neural que es responsable de Shh. (Marigo et al. (1996) PNAS 93:9346-51; Marigo et al. (1996) Development 122:1225-1233). Los genes Gli codifican para supuestos factores de transcripción que tienen dominios de dedos de zinc de unión a ADN (Orenic et al. (1990) Genes & Dev 4:1053-1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10:634-642). Se ha informado de que la transcripción del gen Gli se regula por incremento en respuesta a hedgehog en las yemas de las extremidades, mientras que la transcripción del gen Gli3 se regula por disminución en respuesta a la inducción de hedgehog (Marigo et al. (1996) Development 122:1225-1233). Mediante la selección de secuencias reguladoras transcripcionales a partir de tales genes diana, por ejemplo, a partir de los genes patched o Gli, que son responsables de la regulación por incremento o disminución de estos genes en respuesta a la señalización hedgehog, y que unen operativamente tales promotores a un gen reporter (informador), se puede obtener un ensayo basado en la transcripción que es sensible a la capacidad de un compuesto de prueba específico para modificar las rutas de señalización mediadas por hedgehog. Por tanto, la expresión del gen reporter proporciona una herramienta de selección valiosa para el desarrollo de compuestos que actúan como antagonistas de hedgehog.

Los ensayos basados en el gen reporter de esta invención miden la fase final de la cascada de acontecimientos descrita anteriormente, por ejemplo, modulación transcripcional. En consecuencia, con la puesta en práctica de una realización del ensayo, se inserta un constructo del gen reporter en la célula reactiva con el fin de generar una señal de detección que depende de la pérdida de función ptc, la ganancia de función hedgehog, la ganancia de función smoothened, o la estimulación por la propia SHH. La cantidad de transcripción procedente del gen reporter puede medirse utilizando cualquier método conocido para el experto en la técnica que sea adecuado. Por ejemplo, la expresión del ARNm a partir del gen reporter puede detectarse utilizando protección ARNasa o PCR basada en ARN, o el producto proteico del gen reporter puede identificarse mediante una tinción característica o una actividad biológica intrínseca. La cantidad de expresión a partir del gen reporter se compara entonces con la cantidad de expresión en la misma célula en ausencia del compuesto de prueba o puede compararse con la cantidad de transcripción en una célula sustancialmente idéntica que carece de la proteína receptora objetivo. Cualquier disminución de la cantidad de transcripción significativa desde el punto de vista estadístico o de otro modo indica que el compuesto de prueba ha funcionado como agonista en cierto modo de la señal ptc normal (o ha funcionado como antagonista de la señal hedgehog o smoothened de ganancia de función), por ejemplo, el compuesto de prueba es un antagonista de hedgehog potencial.

Ejemplos

La invención que se está describiendo ahora generalmente, se entenderá más fácilmente en referencia a los ejemplos siguientes que se incluyen meramente con objeto de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención.

Descubrimiento de compuesto líder/ensayo de selección de alto rendimiento

Los compuestos que van a probarse se disuelven de DMSO hasta una concentración de 10 mM y se almacenan a -20ºC. Para activar la ruta Hedgehog en las células del ensayo, se utiliza una forma octilada (modificada por lípidos) del fragmento N-terminal de la proteína Sonic Hedgehog (OCT-SHH). Este fragmento de SHH N-terminal se produce mediante bacterias.

Los compuestos pueden probarse en el ensayo "Gli-Luc" más adelante, utilizando la línea celular 10T(s12), en la que las células contienen un constructo reporter que responde a Hedgehog utilizando Luciferasa como gen reporter. De esta forma puede medirse la actividad de la ruta de señalización Hedgehog mediante la respuesta Gli-Luc.

Las células 10t1/2(s12) se siembran en una placa de microtitulación de 96 pocillos (MTP) a 20.000 células/pocillo en medio completo [DMEM con el 10% de FBS]. Después, se colocaron las placas en la incubadora para su incubación durante la noche (O/N), a 37ºC y 5% de CO_{2}. Tras 24 h, el medio se sustituye con medio de ensayo de Luciferasa (DMEM con el 0,5% de FBS). Los compuestos se descongelan y se diluyen en medio de ensayo a 3:1000 (aproximadamente 300 veces) dando como resultado una concentración de partida de aproximadamente 30 \muM.

Posteriormente, se añaden 150 \mul de cada muestra 30 \muM en los primeros pocillos (por triplicado). Las muestras MTP se diluyen entonces en diluciones de 3 veces hasta un total de siete pocillos, dando como resultado finalmente un régimen de siete diluciones por triplicado para cada compuesto. A continuación se diluye el ligando proteico OCT-SHH en el medio de ensayo de Luciferasa y se añade a cada pocillo a una concentración final de 0,3 \mug/ml. Las placas se devuelven entonces a la incubadora para incubación adicional O/N, a 37ºC y el 5% de CO_{2}. Tras aproximadamente 24 h, las placas se extraen de la incubadora y el medio se aspira/desecha. Los pocillos se lavan una vez con tampón del ensayo [PBS + Mg^{2+} 1 mM y Ca^{2+} 1 mM]. Después se añaden 50 \mul del tampón del ensayo a cada pocillo. El reactivo de ensayo de Luciferasa se prepara tal como lo describe el vendedor (kit LucLite de Packard) y se añaden 50 \mul a cada pocillo. Las placas se incuban a temperatura ambiente (RT) durante aproximadamente 30 minutos tras los que se lee la señal, de nuevo a RT, en un dispositivo TopCount (Packard).

Los compuestos identificados en este ensayo se representan en la figura 32. El descubrimiento de estos inhibidores de la actividad de la transcripción de Gli inducida por Shh ejemplifica la utilidad de las reivindicaciones en esta patente. Las actividades de estos compuestos se presentan en la tabla 1 a continuación.

TABLA 1

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En la figura 33 se presentan datos adicionales. El ratón 456 es un heterocigoto deficiente en Ptc que recibió irradiación UV durante 6 meses. El ratón desarrolló muchas lesiones de BCC pequeñas, que se volvieron azules tras tinción por X-gal. El ratón se sacrificó y la piel se extirpó con un sacabocados cutáneo de 2 mm. Estos sacabocados cutáneos se cultivaron luego durante 6 días. En comparación con el vehículo (DMSO), el compuesto 11 puede disminuir el número de y el tamaño de las lesiones de BCC (manchas azules en el dibujo). El efecto fue más obvio cuando se añadieron 10 \muM de 11 al medio de cultivo, en lugar de 5 \muM de 11. En resumen, este experimento sugiere que 11 puede inhibir las lesiones de BCC murinas en el ratón número 456.

Todavía en otro experimento, se recogieron pulmones con ptc-1 (dII) lacZ en estadio E12.5 y se identificaron embriones transgénicos por detección de lacZ utilizando marcadores. Los explantes de pulmón se hicieron crecer sumergidos en medio de explante de ratón (basado en DMEM, aditivos optimizados para el cultivo de pulmones de ratón) durante 48 h, se fijaron en fijador de lacZ, se enjuagaron y se tiñeron para lacZ O/N a 37ºC. El tejido control no se trató, mientras que el tejido de prueba se trató con 11. Los resultados se representan en la figura 34: (A) Control no tratado. La fuerte expresión de lacZ puede observarse en el mesénquima proximal y distal. (B) El tratamiento con 11 conduce a disminución significativa de la expresión del gen reporter, tal como se evidencia especialmente por la débil señal que rodea los extremos en ramificación distales del epitelio del pulmón en crecimiento.

Preparación de compuestos de la presente invención a. Esquemas sintéticos ilustrativos

Los esquemas de síntesis ejemplo para generar antagonistas de hedgehog útiles en los métodos y composiciones de la presente invención se muestran en las figuras 1-31.

Las condiciones de reacción en los esquemas ilustrados de las Figuras 1-31 son como sigue:

1)

R_{1}CH_{2}CN, NaNH_{2}, tolueno

(Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)

2)

H_{2}SO_{4}, H_{2}O, reflujo

(Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)

3)

H_{2}SO_{4}, EtOH, reflujo

(Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)

4)

NaOH, EtOH, reflujo

5)

(Boc)_{2}O, ZM NaOH, THF

6)

LiHDMS, R_{1}X, THF

(solicitud de patente concedida a Merck número WO 96/06609)

7)

Pd-C, H_{2}, MeOH

8)

t-BuONO, CuBr, HBr, H_{2}O

(J. Org. Chem. 1977, 42, 2426)

9)

ArB(OH)_{2}, Pd(PPh_{3})_{4}, Dioxano

(J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223)

10)

R_{12}(H)C=CR_{13}R_{14}, Pd(OAc)_{2}, Et_{3}N, DMF

(Org. React. 1982, 27, 345)

11)

Tf_{2}O, THF

(J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486)

12)

ArSnBu_{3}, Pd(PPh_{3})_{4}, Dioxano

(J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486)

13)

KMnO_{4}, Py, H_{2}O

(J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223)

14)

NaOR_{1}, THF

15)

NaSR_{1}, THF

16)

HNR_{1} R_{13},THF

17)

HONO, NaBF_{4}

(Adv. Fluorine Chem. 1965, 4, 1-34)

18)

Pd(OAc)_{2}, NaH, DPPF, PhCH_{3}, R_{1}OH

(J. Org. Chem. 1997, 62; 5413-5418)

19)

i. R_{1}X, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}, ii. R_{13}X

20)

SOCl_{2}, cat DMF

21)

CH_{2}N_{2}, Et_{2}O

22)

Ag_{2}O, Na_{2}CO_{3}, Na_{2}S_{2}O_{3}, H_{2}O

(Tetrahedron Lett. 1979, 2667)

23)

AgO_{2}CPh, Et_{3}N, MeOH

(Org. Syn., 1970, 50, 77; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5432)

24)

LiOH, THF-MeOH

25)

(EtO)_{2}P(O)CH_{2}CO_{2}R, BuLi, THF

26)

MeO_{2}CCH(Br)=P(Ph)_{3}, benceno

27)

KOH o KOtBu

28)

Base, X(CH_{2})_{n},CO_{2}R

29)

DPPA, Et_{3}N, tolueno

(Synthesis 1985, 220)

30)

HONO, H_{2}O

31)

SO_{2}, CuCl, HCl, H_{2}O

(Synthesis 1969, 1-10, 6)

32)

reactivo de Lawesson, tolueno

(Tetrahedron Asym. 1996, 7, 12, 3553)

33)

R_{2}M, disolvente

34)

30% H_{2}O_{2}, CH_{3}CO_{2}H glacial

(Helv. Chim. Acta. 1968, 349, 323)

35)

Trifosgeno, CH_{2}Cl_{2}

(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)

36)

i. (EtO)_{2}P(O)CHLiSO_{2}Oi-Pr, THF, ii. Nal

37)

Ph_{3}PCH_{3}l, NaCH_{2}S(O)CH_{3}, DMSO

(Synthesis 1987, 498)

38)

Br_{2}, CHCl_{3} u otro disolvente

(Synthesis 1987, 498)

39)

BuLi, Bu_{3}SnCl

40)

ClSO_{2}OTMS, CCl_{4}

(Chem. Ber. 1995, 128, 575-580)

41)

MeOH-HCl, reflujo

42)

LAH, Et_{2}O o LiBH_{4}, EtOH o BH_{3}-THF

(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)

43)

MsCl, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}

(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)

44)

Na_{2}SO_{3}, H_{2}O

(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)

45)

R_{2}R_{4}NH, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}

46)

R_{2}M, disolvente

47)

CH_{3}NH(OCH_{3}), EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF

(Tetrahedron Lett, 1981, 22, 3815)

48)

MeLi, THF

49)

mCPBA, CH_{2}Cl_{2}

50)

HONO, Cu_{2}0, Cu(NO_{3})_{2}, H_{2}O

(J. Org. Chem. 1977, 42; 2053)

51)

R_{1}M, disolvente

52)

HONO, NaS(S)COEt, H_{2}O

(Org. Synth. 1947, 27, 81)

53)

HSR_{2} o HSR_{4}, CH_{2}Cl_{2}

54)

i.BuOC(O)Cl, Et_{3}N, NH_{3}, THF

55)

R_{2}R_{4}NH, CH_{2}Cl_{2}, NaBH(OAc)_{3}

56)

R_{2}R_{4}NH, MeOH/CH_{3}CO_{2}H, NaBH_{3}CN

57)

R_{2}OH, EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF

58)

R_{2}OH, HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF

59)

R_{2}R_{4}NH, EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF

60)

R_{2}R_{4}NH, HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF

61)

POCl_{3}, Py, CH_{2}Cl_{2}

62)

R_{2}R_{4}NCO, disolvente

63)

R_{2}OC(O)Cl, Et_{3}N, disolvente

64)

R_{2}CO_{2}H, EDC o HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF

65)

R_{2}X, Et_{3}N, disolvente

66)

(CH_{3}S)_{2}C=N(CN), DMF, EtOH

(J. Med. Chem. 1994, 37, 57-66)

67)

R_{2}SO_{2}Cl, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}

68)

R_{2}- o R_{3}- o R_{4}CHO, MeOH/CH_{3}CO_{2}H, NaBH_{3}CN

(Synthesis 1975, 135-146)

69)

Boc(Tr)-D o L-CysOH, HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF

70)

Boc(Tr)-D o L-CysH, NaBH_{3}CN, MeOH/CH_{3}CO_{2}H

(Synthesis 1975, 135-146)

71)

S-Tr-N-Boc cisteinal, ClCH_{2}CH_{2}Cl o THF, NaBH(OAc)_{3}

(J. Org. Chem. 1996, 61: 3849-3862)

72)

TFA, CH_{2}Cl_{2}, Et_{3}SiH o (3:1:1) tioanisol/etanoditiol/DMS

73)

TFA, CH_{2}Cl_{2}

74)

DPPA, Et_{3}N, tolueno, HOCH_{2}CH_{2}SiCH_{3}

(Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3515)

75)

TBAF, THF

76)

Base, TrSH o BnSH

77)

Base, R_{2}X o R_{4}X

78)

R_{3}NH_{2}, MeOH/CH_{3}CO_{2}H, NaBH_{3}CN

79)

N_{2}H_{4}, KOH

80)

Pd_{2}(dba)_{3}, P(o-tol)_{3}, RNH_{2}, NaOtBu, Dioxano, R_{1}NH_{2}

(Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7181-7184).

81)

Cianamida.

82)

Fmoc-Cl, bicarbonato sódico

83)

BnCOCl, carbonato sódico.

84)

AlilOCOCl, piridina.

85)

Bromuro de bencilo, base.

86)

Cloruro de oxalilo, DMSO.

87)

RCONH_{2}.

88)

Carbonildiimidazol, disolventes neutros (por ejemplo, DCM, DMF, THF, tolueno).

89)

Tiocarbonildiimidazol, disolventes neutros (por ejemplo, DCM, DMF, THF, tolueno).

90)

Bromuro de cianógeno, disolventes neutros (por ejemplo, DCM, DMF, THF, tolueno).

91)

RCOCl, trietilamina

92)

RNHNH_{2}, EDC

93)

RO_{2}COCl, Et_{3}N, DCM.

94)

MsOH, Piridina (J. Het. Chem., 1980,607.)

95)

Base, disolventes neutros (por ejemplo, DCM, tolueno, THF).

96)

H_{2}NOR, EDC.

97)

RCSNH_{2}.

98)

RCOCHBrR, disolventes neutros (por ejemplo, DCM, DMF, THF, tolueno), (Org. Proc. Prep. Intl., 1992, 24, 127).

99)

CH_{2}N_{2}, HCl. (Synthesis, 1993, 197).

100)

NH2NHR, disolventes neutros (por ejemplo, DCM, DMF, THF, tolueno).

101)

RSO_{2}Cl, DMAP. (Tetrahedron Lett., 1993, 34, 2749).

102)

Et_{3}N, RX. (J. Org. Chem., 1990, 55, 6037).

103)

NOCl o Cl_{2} (J. Org. Chem., 1990, 55, 3916).

104)

H_{2}NOH, disolventes neutros (por ejemplo, DCM, DMF, THF, tolueno).

105)

RCCR, disolventes neutros (DCM, THF, Tolueno).

106)

RCHCHR, disolventes neutros (DCM, THF, Tolueno).

107)

H_{2}NOH, HCl.

108)

Tiocarbonildiimidazol, SiO_{2} o BF_{3}OEt_{2}. (J. Med. Chem., 1995, 39, 5228).

109)

Tiocarbonildiimidazol, DBU o DBN. (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228).

110)

HNO_{2}, HCl.

111)

ClCH_{2}CO_{2}Et (Org. Reactions, 1959, 10, 143).

112)

Morfolina enamina (Eur. J. Med. Chem., 1982, 17, 27).

113)

RCOCHR^{'}CN

114)

RCOCHR'CO_{2}Et

115)

Na_{2}SO_{3}

116)

H_{2}NCHRCO_{2}Et

117)

EtO_{2}CCHRNCO

118)

RCNHNH_{2}.

119)

RCOCO_{2}H, (J. Med. Chem., 1995,38,3741).

120)

RCHO, KOAc.

121)

2-Fluoronitrobenceno.

122)

SnCl_{2}, EtOH, DMF.

123)

RCHO, NaBH_{3}CN, HOAc.

124)

NH_{3}, MeOH.

125)

2,4,6-Me_{3}PhSO_{2}NH_{2}.

126)

Et_{2}NH, CH_{2}Cl_{2}

127)

MeOC(O)Cl, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}

128)

R_{2}NH_{2}, EDC, HOBT, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}

129)

DBU, PhCH_{3}

130)

BocNHCH(CH_{2}STr)CH_{2}NH_{2}, EDC, HOBT, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}

131)

R_{2}NHCH_{2}CO_{2}Me, HBTU, HOBT, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}

132)

BocNHCH(CH_{2}STr)CH_{2}OMs, LiHMDS, THF

133)

R_{2}NHCH_{2}C0_{2}Me, NaBH(OAc)_{3}, ClCH_{2}CH_{2}Cl o THF

134)

R_{2}NHCH_{2}CH(OEt)_{2}, HBTU, HOBT, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}

135)

NaBH(OAc)_{3}, ClCH_{2}CH_{2}Cl o THF, AcOH.

136)

Piperidina, DMF.

137)

Pd(Ph_{3}P)_{4}, Bu_{3}SnH.

138)

RC0_{2}H, EDC, HOBT, Et_{3}N, DCM.

139)

RNH_{2}, disolventes neutros.

140)

RCHO, NaBH_{3}CN, HOAc.

141)

RNCO, disolvente.

142)

RCO_{2}H, EDC o HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF.

143)

RCOCl, Trietilamina

144)

RSO_{2}Cl, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}.

145)

SnCl_{2}, EtOH, DMF.

146)

RNH_{2}, EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF.

147)

Dibromoetano, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}

148)

Cloruro de oxalilo, disolventes neutros.

149)

LiOH, THF-MeOH.

150)

Carbonildiimidazol, disolventes neutros (por ejemplo, DCM, DMF, THF, tolueno).

151)

RNH_{2}, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}.

152)

Base, RX.

153)

DBU, PhCH_{3}

154)

DPPA, Et_{3}N, tolueno (Synthesis 1985, 220)

155)

SOCl_{2}, cat DMF.

156)

ArH, ácido de Lewis (AlCl_{3}, SnCl_{4}, TiCl_{4}), CH_{2}Cl_{2}.

157)

H_{2}NCHRCO_{2}Et, disolventes neutros.

158)

BocHNCHRCO_{2}H, EDC O HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF.

159)

TFA, CH_{2}Cl_{2}.

b. Preparación ilustrativa de subunidades de arilo

Cualquier subunidad arilo puede funcionalizarse usando una amplia variedad de reacciones conocidas por los expertos en la técnica. La química de los anillos aromáticos y heteroaromáticos es rica, y sólo puede presentarse en el presente documento una muestra de reacciones útiles. A continuación se muestran varios ejemplos ilustrativos.

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Acoplamiento de Suzuki nº 1:

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20

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Acoplamiento de Suzuki nº 2:

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21

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Acoplamiento de Stille nº 1:

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22

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Acoplamiento de Stille nº 2:

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23

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Acoplamiento de Stille nº 3

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24

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c. Preparación ilustrativa de sustratos de acoplamiento

Los miembros de las clases generales de los sustratos de acoplamiento explicados anteriormente - arilestannanos, ácidos arilborónicos, triflatos de arilo, y haluros de arilo - están disponibles de los heterociclos padre. En general, las transformaciones requeridas para preparar un sustrato de acoplamiento son fiables y fáciles de ampliar a escala. A continuación se muestran ejemplos ilustrativos.

Preparación de yoduro de arilo

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25

Preparación de estannano de arilo

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26

Preparación de triflato de arilo

27

Preparación de ácido aril borónico

28

d. Procedimientos ejemplo para preparar compuestos objeto

Ruta 1

29

Éster metílico del ácido 2-(2-benciloxicarbonilamino-acetilamino-benzoico (1)

A una disolución de N-\alpha-Cbz-glicina (2,0 g, 9,56 mmol), en tetrahidrofurano (20 ml), se añadió 1-1'-carbonildiimidazol (1,64 g, 10,13 mmol) seguido 2 horas después por antranilato de metilo (1,28 g, 8,47 mmol). Tras agitar toda la noche se eliminó el tetrahidrofurano a vacío y el residuo se volvió a disolver en acetato de etilo, se lavó con ácido clorhídrico acuoso al 10% (2x), hidrógeno carbonato sódico saturado acuoso (2x), se secó (MgSO_{4}) y se concentró dando un residuo oleoso que se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice [eluyente: acetato de etilo: hexano, 30 : 70, v/v \rightarrow acetato de etilo] dando el benzoato del título (1) (0,31 g, 11%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 3,89 (s, 3H), 4,10 (d, 2H), 5,19 (s, 2H), 7,11 (t, 1H), 7,31-7,41 (m, 5H), 7,56 (t, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,69 (d, 1H) y 11,54 (s, 1H).

Ácido 2-(2-benciloxicarbonilamino-acetilamino-benzoico (2)

Se añadió hidróxido de litio (55 mg, 1,32 mmol) en agua (0,8 ml) a una disolución del benzoato (1) (300 mg, 0,88 mmol) en dioxano (4 ml). Tras agitar toda la noche, la mezcla se concentró a 40ºC dando un aceite viscoso, que se trató con ácido clorhídrico acuoso al 10% (3 ml), extrayéndose la emulsión resultante formada con acetato de etilo (4x). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron dando el ácido benzoico del título (2) cuantitativamente como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 3,84 (d, 2H), 5,12 (s, 2H), 7,21 (t, 1H), 7,35-7,44 (m, 5H), 7,65 (t, 1H), 8,04 (t, 1H), 8,65 (d, 1H) y 11,74 (s, 1H).

Ester bencílico del ácido [3-(4-fluoro-fenil)-4-oxo-3,4-dihidro-quinazolin-2-ilmetil]-carbámico (3)

A una disolución del ácido benzoico (2) (180 mg, 0,55 mmol) en tetrahidrofurano (6 ml) se añadió 1,1'-carbonildiimidazol (98 mg, 0,60 mmol). Tras un periodo de 2 h, se añadió 4-fluoroanilina (61 mg, 0,55 mmol) en tetrahidrofurano (1,5 ml) y la mezcla se agitó a 75ºC toda la noche. Se eliminó el tetrahidrofurano a vacío y el residuo se volvió a disolver en acetato de etilo, se lavó con ácido clorhídrico acuoso al 10%, hidrógeno carbonato sódico saturado acuoso, se secó (MgSO_{4}) y se concentró dando un residuo oleoso que se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice [eluyente: acetato de etilo: hexano, 20:80, v/v \rightarrow 60:40 v/v] dando la quinazolina del título (3) (0,11 g, 50%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 4,01 (d, 2H), 5,13 (s, 2H), 6,27 (s, 1H), 7,31-7,39 (m, 9H), 7,52 (t, 1H), 7,71 (d, 1H), 7,81 (t, 1H) y 8,28 (d, 1H).

2-Aminometil-3-(4-fluoro-fenil)-3H-quinazolin-4-ona (4)

Se evacuó una mezcla agitada de la quinazolina (3) (63 mg, 0,16 mmol), paladio al 10% sobre carbón activado (18 mg) y metanol (4,4 ml), usando una bomba aspiradora y se rellenó con hidrógeno. Una vez que se ha consumido el material de partida, monitorizado por análisis de CCF (cromatografía en capa fina), la mezcla se filtró a través de una almohadilla de Celite que se lavó con metanol (2x) y se concentró dando la amina del título (4) (40 mg, 93%) como un sólido amarillo:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 3,50 (s, 2H), 7,25 (d aparente, 4H), 7,50 (t, 1H), 7,75-7,82 (m, 2H), y 8,28 (d, 1H).

1-(4-Cloro-3-trifluorometil-fenil)-3-[3-(4-fluoro-fenil)-4-oxo-3,4-dihidroquinazolin-2-ilmetil]urea (5)

A una mezcla de la amina (4) (14 mg, 0,05 mmol) en cloroformo, se añadió isocianato de 3-trifluorometilfenilo (10 mg, 0,05 mmol). Tras agitar toda la noche el disolvente se eliminó a vacío, se trituró con hexanos, se filtró y se secó dando la urea del título (5) (24 mg, 98%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 4,08 (s, 2H), 6,52 (s, 1H), 7,16-7,38 (m, 4H), 7,48-7,53 (m, 2H), 7,59 (d, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,75 (t, 1H), 7,81 (s, 1H) y 8,29 (d, 1H).

1-(2,6-Dicloro-piridin-4-il)-3-[3-(4-fluoro-fenil)-4-oxo-3,4-dihidroquinazolin-2-ilmetil]urea (6)

A una mezcla de la amina (4) (14 mg, 0,05 mmol) en cloroformo, se añadió isocianato de 2,6-dicloropiridilo (11 mg, 0,05 mmol). Tras agitar toda la noche, el disolvente se eliminó a vacío, se trituró con hexanos, se filtró y se secó dando la urea del título (6) (22 mg, 96%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 4,09 (d, 2H), 6,41 (sa, 1H), 6,69 (dd, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,87 (dd, 1H), 7,07 (t, 1H), 7,22-7,27 (m, 3H), 7,52 (t, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,79 (t, 1H) y 8,29 (dd, 1H).

\newpage

Ruta 2

30

2-Etil-3,1-[4H]benzoxazin-ona (7)

Se calentaron ácido antranílico (100 g, 0,73 mol) y anhídrido propiónico (420 ml) hasta 140ºC durante 3,5 h, en un matraz provisto con cabezal de destilación de Claisen. Se incrementó la temperatura hasta 170-180ºC, y se eliminaron el ácido propiónico y el anhídrido propiónico a presión reducida dando un sólido marrón, que se trituró con hexano, se filtró y se secó dando la benzoxazina del título (7) (115,8 g, 91%), como un sólido blanquecino:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,35 (t, 3H), 2,71 (q, 2H), 7,45-7,50 (m, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,75-7,79 (m, 1H), 8,16 (dd, 1H).

2-Etil-3-(4'-fluoro-fenil)-quinazolin-4-ona (8)

Se calentó una disolución de la benzoxacina (7) (5,0 g, 28,6 mmol) y 4-fluoroanilina (3,37 g, 30,0 mmol) en cloroformo (12 ml) a reflujo toda la noche. Una vez que se consumió completamente la benzoxacina (7) monitorizado por CCF, se eliminó el disolvente y el sólido blanquecino residual se suspendió en etilenglicol (8 ml) al que se había añadido hidróxido sódico (51 mg) y la suspensión se calentó hasta 120-140ºC en un aparato de destilación. El agua producida se destiló durante una periodo de calentamiento de 5 h, y la disolución oscura se dejó enfriar a temperatura ambiente toda la noche. Se ajustó el pH a 7-8 por adición de ácido clorhídrico al 3%, y el precipitado se filtró y se secó dando la quinazolinona del título (8) (4,42 g, 58%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,23 (t, 3H), 2,44 (q, 2H), 7,24 (d aparente, 4H), 7,44-7,49 (m, 1H), 7,71-7,79 (m, 2H), 8,26 (dd, 1H).

2-(1'Bromoetil)-3-(4''-fluoro-fenil)-quinazolin-4-ona (9)

A una mezcla agitada de la quinazolinona (8) (94,0 g, 0,35 mmol), acetato sódico anhidro (35,2 g, 0,43 mol) y ácido acético glacial (448 ml) a 40ºC bajo una atmósfera de nitrógeno, se añadió gota a gota una disolución de bromo (76,8 g, 0,48 mol) en ácido acético glacial (243 ml), mientras que se mantenía la mezcla a aproximadamente 40ºC durante un periodo de 5 h. La mezcla se vertió en agua (5,26 l), se agitó durante 1 h y se filtró. La torta del filtrado se lavó con agua templada (2,8 l) y se secó dando el bromuro del título (9) (117,2 g, 96%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,99 (d, 3H), 4,48 (q, 1H), 7,07-7,25 (m, 3H), 7,44-7,52 (m, 2H), 7,73-7,75 (m, 2H), 8,21 (d, 1H).

2-[(1'-Metilamino)-etil]-3-(4''-fluorofenil)-quinazolin-4-ona (10)

Se añadió una disolución 8,03 molar de metilamina en etanol (923 ml, 7,41 mol) en el bromuro (9) (117,0 g, 0,34 mol) y la suspensión se calentó hasta 40ºC. Después de 1 h el material de partida se consumió totalmente, según se monitorizó por CCF y el disolvente y el exceso de metilamina se eliminaron bajo presión reducida. El residuo se suspendió en diclorometano (1,2 l), se agitó durante 1 h a temperatura ambiente, filtrándose el clorhidrato de metilamonio precipitado, y se lavó con diclorometano (117 ml). Las fases orgánicas combinadas se concentraron y se secaron (MgSO_{4}) dando la amina del título (10) cuantitativamente como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,30 (d, 3H), 2,33 (s, 3H), 3,38 (q, 1H), 7,26-7,34 (m, 4H), 7,51-7,55 (m, 1H), 7,76-7,85 (m, 2H), 8,31 (dd, 1H).

2-{1'-[N-(3''-trifluorometilfenilcarbamoil)-N-metil-amino]etil}-3-(4''fluorofenil)-quinazolin-4-ona (11)

A una disolución de la amina (10) (18,9 g, 0,065 mol) y cloroformo (150 ml) se añadió una disolución de isocianato de 3-trifluorometilfenilo (11,0 g, 0,065 mol) en cloroformo (39 ml), mientras que se mantenía la temperatura por debajo de 30ºC. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, y el precipitado formado se filtró, se lavó con cloroformo y se secó dando la urea del título (11) (20,2 g, 65%) como un sólido blanquecino:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,55 (d, 3H), 2,92 (s, 3H), 5,16 (q, 1H), 7,09 (s a, 1H), 7,18-7,23 (m, 1H), 7,29-7,30 (m, 3H), 7,34-7,43 (m, 2H), 7,55-7,58 (m, 3H), 7,80-7,88 (m, 2H), 8,31 (d, 1H).

2-{1'-[N-(2''-metoxi-5''-trifluorometilfenilcarbamoil)-N-metil-amino]etil}-3-(4''fluorofenil)-quinazolin-4-ona (12)

Se añadió una disolución de 2-metoxi-5-trifluorometilanilina (42 mg, 0,22 mmol) en acetato de etilo (1,2 ml) a una disolución de trifosgeno (80 mg, 0,27 mmol) en acetato de etilo (1,2 ml), se añadieron cantidades catalíticas de carbón activado y la mezcla se calentó a reflujo durante 2 h. Tras enfriar a temperatura ambiente, el disolvente se evaporó a presión reducida, suspendiéndose el residuo resultante en cloroformo (1,2 ml). Se añadió una disolución de la amina (10) (65 mg, 0,22 mmol) en cloroformo (1,2 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que se consumió totalmente el material de partida. Se evaporó el disolvente y el producto bruto se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice [eluyente: Diclorometano \rightarrow acetato de etilo], aislándose la urea del título (12) (98 mg, 87%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,40 (d, 3H), 2,88 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 5,25 (q, 1H), 6,80 (d, 1H), 6,97-7,03 (m, 2H), 7,13-7,18 (m, 3H), 7,20-7,25 (m, 1H), 7,40-7,45 (m, 1H), 7,65-7,74 (m, 2H), 8,18-8,22 (m, 2H).

N-{1-[3-(4-Fluoro-fenil)-4-oxo-3,4-dihidro-quinazolin-2-il]etil}-N-metil-3-trifluorometil-benzamida (13)

A una disolución de la amina (10) (50 mg, 0,17 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,03 ml, 0,17 mmol) en diclorometano (0,5 ml) se añadió cloruro de 3-trifluorometilbenzoilo (0,03 ml, 0,19 mmol). La mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. Tras 12 h se añadieron algunos cristales de 4-dimetilaminopiridina, y la agitación se continuó durante otras 12 h. La mezcla se extinguió con agua, se lavó con hidrógeno carbonato sódico acuoso saturado, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró proporcionando la benzamida del título (13) de forma cuantitativa como una espuma blanca:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,53 (d, 3H), 3,16 (s, 3H), 5,36 (q, 1H), 7,24-7,36 (m, 3H), 7,45-7,56 (m, 3H), 7,64-7,82 (m, 5H), 8,29 (d a, 1H).

N-{1-[3-(4-Fluoro-fenil)-4-oxo-3,4-dihidro-quinazolin-2-il]etil}-N-metil-3-trifluorometil-bencenosulfonamida (14)

A una disolución de la amina (10) (50 mg, 0,17 mmol) y N,N-diiospropiletilamina (0,03 ml, 0,17 mmol) en diclorometano (0,5 ml) se añadió cloruro de 3-trifluorometilfenilsulfonilo (0,03 ml, 0,19 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. Tras 12 h se añadieron algunos cristales de 4-dimetilaminopiridina, y la agitación se continuó durante otras 12 h. La mezcla se extinguió con agua, se lavó con hidrógeno carbonato sódico acuoso saturado, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró proporcionando la benzamida del título (14) de forma cuantitativa como una espuma blanca:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,28 (d, 3H), 3,16 (s, 3H), 4,92 (q, 1H), 7,18-7,30 (m, 2H), 7,35-7,50 (m, 5H), 7,62 (d a, 1H), 7,70 (dt, 1H), 7,79 (d a, 1H), 7,87 (s a, 1H), 8,25 (dd, 1H).

2-{1-Bis-(2-metoxi-etil)amino]-etil}-3-(4-fluoro-fenil)3-H-quinazolin-4-ona (15)

Una disolución del bromuro (9) (71,5 mg, 0,21 mmol), tetrahidrofurano (1,0 ml) y bis-(2-metoxietil)amina (0,33 ml, 2,26 mmol) se calentó hasta 70ºC. Tras 6,5 horas, la reacción se concentró parcialmente, y se añadieron acetato de etilo (1 ml) y agua (1 ml) agitándose la mezcla con fuerza durante 1h. Se separó la capa orgánica, se lavó con agua (2 x 1 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a vacío dando la amina del título (15) (61 mg, 74%) como un aceite:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,35 (d, 3H), 2,51-2,56 (m, 2H), 2,74-2,83 (m, 2H), 2,98-3,11 (m, 4H), 3,12 (s, 6H), 3,79 (q, 1H), 7,13-7,27 (m, 3H), 7,45-7,54 (m, 2H), 7,74-7,76 (m, 2H), 8,26 (d, 1H).

Ruta 3

31

2-Etil-pirido[2.3-d][1.3]oxazin-4-ona (16)

Una suspensión de ácido 2-aminonicotínico (1,0 g, 7,24 mmol) en anhídrido propiónico (10 ml) se calentó a 120ºC durante 1 h bajo atmósfera de nitrógeno. La temperatura se incrementó hasta 167ºC para eliminar el ácido propiónico y el anhídrido propiónico bajo presión reducida. El sólido marrón resultante se trituró con hexano y se secó dando la pirido-oxazina del título (16) (1,10 g, 86%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,43 (t, 3H), 2,82 (q, 2H), 7,48 (dd, 1H), 8,53 (dd, 1H), 8,98 (d, 1H).

2-Etil-3-(4-fluoro-fenil)-3H-pirido[23-d]pirimidin-4-ona (17)

Se calentó una suspensión de la pirido-oxazina (16) (0,5 g, 2,84 mmol) y 4- fluoroanilina (0,32 g, 2,84 mmol) en tolueno (21 ml) a reflujo durante toda la noche. La disolución se concentró hasta sequedad bajo presión reducida y se añadieron etilenglicol (2 ml) e hidróxido sódico (5 mg). La mezcla se calentó otra vez a 120ºC durante 4 h, y se destiló el etilenglicol a presión reducida. El sólido marrón oscuro resultante se sometió cromatografía en columna sobre gel de sílice [eluyente: acetato de etilo : hexano, 20:80 v/v \rightarrow 100:0 v/v] dando la pirido-pirimidona del título (17) (244 mg, 32%) como un sólido beige:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,31 (t, 3H), 2,49 (q, 2H), 7,25-7,28 (m, 4H), 7,44 (dd, 1H), 8,59 (dd, 1H), 9,00 (dd, 1H).

2-(1-Bromo-etil)-3-(4-fluoro-fenil)-3H-pirido[2.3-d]pirimidin-4-ona (18)

Se calentó una suspensión de la quinazolinona (17) 850,0 g, 0,56 mmol) y acetato sódico anhidro (56 mg) en ácido acético glacial (1,0 ml) hasta 40ºC y se trató gota a gota con una disolución de bromo (90 mg, 0,56 mmol) en ácido acético glacial (5 ml). Una vez que el material de partida se consumió totalmente por análisis CCF, la mezcla se vertió en agua (5 ml), se basificó con hidrógeno carbonato sódico saturado acuoso y se extrajo con terc-butilmetil éter. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron hasta dar un sólido que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice [eluyente: acetato de etilo: hexano, 50:50, v/v] dando el bromuro del título (18) (166 mg, 85%) como un sólido blanquecino.

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,21 (d, 3H), 4,58 (q, 1H), 7,15-7,34 (m, 3H), 7,51 (dd, 1H), 7,55-7,60 (m, 1H), 8,62 (dd, 1H), 9,05 (dd, 1H).

3-(4-Fluoro-fenil)-2-(1-metilamino-etil)-3H-pirido[2.3-d]pirimidin-4-ona (19)

Se calentó una suspensión del bromuro (18) (80 mg, 0,23 mmol) y disolución de metilamina en etanol 8,03 M (0,64 ml) hasta 40ºC durante 3 h, y se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La suspensión resultante se concentró hasta sequedad bajo presión reducida, y el sólido marrón claro resultante se suspendió en diclorometano y se filtró a través de un tapón de gel de sílice dando la amina del título (19) (57 mg, 83%) como un sólido beige. (El material bruto se tomó directamente para la siguiente etapa sin purificación adicional).

1-{1-[3[(4-fluoro-fenil)4-oxo-3,4-dihidro-pirido[2.3-d]pirimidin-2-il]-etil}-1-metil-3-(3-trifluorometil-fenil)-urea (20)

A una disolución de la amina (19) (30 mg, 0,1 mmol) en diclorometano (0,2 ml) se añadió isocianato de 3-trifluorometil-fenilo (19 mg, 0,1 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche, después de lo cual se filtró el precipitado, se lavó con diclorometano y se secó dando la urea del título (20) (6 mg, 13%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 2,17 (d, 3H), 3,15 (s, 3H), 5,23 (q, 1H), 7,15 (s a, 1H), 7,22-7,31 (m, 4H), 7,38 (t, 1H), 7,49 (d, 1H), 7,50-7,56 (m, 2H), 7,62 (s a, 1H), 8,62 (dd, 1H), 9,00 (d, 1H).

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Ruta 4

32

Ácido 3-exo-terc-butoxicarbonilamino-biciclo[2.2.1]hept-5-eno-2-exo-carboxílico (21)

Una disolución de ácido 3-exo-amino-biciclo[2.2.1]hept-5-eno-2-exo-carboxílico (1,0 g, 6,5 mmol), hidróxido sódico acuoso 1N (6,5 ml) y dioxano (6,5 ml) se enfrió en un baño de hielo, y se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (3,0 g, 13,8 mmol) con agitación continuada durante 10 minutos a 0ºC y 6 h a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó parcialmente y se ajustó el pH a 1-2 por adición de hidrógeno sulfato potásico acuoso 1N (\sim 8 ml). La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 ml) y las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO_{4}), y se concentraron dando el ácido del título (21) (1,41 g, 85%) como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,70 (s, 9H), 1,89 (m, 1H), 2,31 (m, 1H), 2,84 (m, 1H), 2,98 (m, 1H), 3,22 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 6,44 (m, 2H), 7,21 (m, 1H).

Éster terc-butílico del ácido [3-exo-(4-fluoro-fenilcarbamoil)-biciclo[2.2.1]hept-5-eno-2-exo-il]-carbámico (22)

Una disolución del ácido (21) (1,4 g, 5,5 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (20 ml) se enfrió a -10ºC y se trató gota a gota con trietilamina (0,77 ml, 5,5 mmol) seguido por cloroformiato de isobutilo (0,72 ml, 5,5 mmol). La suspensión resultante se agitó durante 10 minutos a -10ºC antes de añadir una disolución de 4-fluoroanilina (0,53 ml, 5,5 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (5 ml), manteniéndose la temperatura entre -8 y -17ºC durante 5 h y dejando que la mezcla se temple a temperatura ambiente toda la noche. El clorhidrato de trietilamina se eliminó por filtración, se lavó con tetrahidrofurano, y el disolvente se evaporó hasta sequedad, lavándose los sólidos resultantes con agua (20 ml) y secándose dando el éster del ácido carbámico del título (22) cuantitativamente como un sólido blanco:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,24 (s, 9H), 1,66 (d, 1H), 2,06 (d, 1H), 2,45 (d, 1H), 2,71 (s a, 1H), 3,08 (s a, 1H), 3,93-4,06 (m, 1H), 4,96 (d, 1H), 6,18-6,24 (m, 2H), 6,94-7,02 (m, 2H), 7,48-7,50 (m, 2H), 7,98 (s a, 1H).

(4-fluoro-fenil)-amida del ácido 3-exo-amino-biciclo[2.2.1]hept-5-eno-2-exo-carboxílico (23)

A una disolución de éster del ácido carbámico (22) (2,24 g) en diclorometano (50 ml) se añadió ácido trifluoroacético (5 ml). La disolución se agitó a temperatura ambiente durante 4 h antes de que se añadiera agua (50 ml). Se separó la fase acuosa y se lavó con diclorometano (25 ml), se filtró y se basificó con hidróxido sódico 2N. La fase acuosa basificada se extrajo con diclorometano (2 x 25 ml), y las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron (MgSO_{4}), y se concentraron dando la amina del título (23) (870 mg, (64% después de 2 etapas a partir de (21)) como un sólido.

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,59 (d, 1H), 1,71 (d a, 2H), 2,13 (d, 1H), 2,37 (d, 1H), 2,59 (s a, 1H), 3,09 (s a, 1H), 3,24 (d, 1H), 6,20 (s a, 2H), 6,99 (t, 2H), 7,47-7,51 (m, 2H), 8,54 (s a, 1H).

2-Etil-3-(4-fluoro-fenil)-3H-pirimidin-4-ona (24)

Una disolución de la amina (23) (43 mg, 0,17 mmol) en trietilortopropionato (0,5 ml, 2,38 mmol) se calentó hasta 100ºC durante 26 h, después de lo cual se evaporaron el exceso de disolvente y los coproductos volátiles a presión reducida dando la pirimidona del título (24) (41 mg, cuant.) como un sólido cristalino:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,17 (t, 3H), 2,37 (q, 2H), 6,45 (d, 1H), 7,17-7,27 (m, 4H), 7,93 (d, 1H).

2-(1-Bromo-etil)-3-(4-fluoro-fenil)-3H-pirimidin-4-ona (25)

Una disolución de la pirimidona (24) (150 mg, 0,69 mmol) y acetato sódico (140 mg) en ácido acético glacial (1,5 ml) se templó hasta 40ºC y se trató gota a gota con una disolución de bromo preformada (0,7 ml de bromo en 10 ml de ácido acético glacial) (0,55 ml, 0,69 mmol). Tras 2 h, se añadió agua (20 ml) a la mezcla que se basificó de forma subsiguiente con carbonato potásico, y se extrajo con diclorometano (2 x 10 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (10 ml) se secaron (MgSO_{4}), y se concentraron dando el bromuro del título (25) (196 mg, 96%) como un aceite marrón pálido:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,95 (d, 3H), 4,46 (q, 1H), 6,50 (d, 1H), 7,12-7,16 (m, 1H), 7,20-7,28 (m, 2H), 7,43-7,50 (m, 1H), 8,81 (d, 1H).

3-(4-Fluoro-fenil)-2-(1-metilamino-etil)-3H-pirimidin-4-ona (26)

El bromuro (25) (190 mg, 0,64 mmol) se disolvió en una disolución al 33% de metilamina en etanol (5 ml) y se agitó a temperatura ambiente. Tras 3,5 h, se evaporaron el disolvente y el exceso de metilamina a presión reducida y el residuo se repartió entre agua (10 ml) y diclorometano (10 ml). La capa orgánica se lavó otra vez con agua (10 ml), se secó (MgSO_{4}), y se concentró dando la amina del título (26) (120 mg, 76%) como un aceite amarillo:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,20 (d, 3H), 2,23 (s, 3H), 3,26 (q, 1H), 6,44 (d, 1H), 7,16-7,33 (m, 4H), 7,98 (d, 1H).

1-{1-[1(4-Fluoro-fenil)-6-oxo-1,6-dihidro-pirimidin-2-il]-etil}-1-metil-3-(3-trifluorometil-fenil)-urea (27)

Se disolvieron la amina (26) (12 mg, 0,05 mmol) e isocianato de 3-trifluorometilfenilo (7,5 l, 0,05 mmol) en cloroformo (0,2 ml) y se agitaron a temperatura ambiente. Tras la conversión completa del material de partida por análisis por CCF, el disolvente se eliminó y el residuo resultante se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice [eluyente: diclorometano] dando la urea del título (27) (14 mg, cuant.) como un sólido:

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,61 (m, 3H), 2,87 (s, 3H), 5,04 (m, 1H), 6,41 (m, 1H), 6,64 (s, 1H), 7,11-7,48 (m, 8H), 7,86 (m, 1H).

Nitro reducción a anilinas

33

2-{1'-[N-3''-(amino-carbamoil)-N-metil-amino]etil}-3-(4'''-fluorofenil)-quinazolin-4-ona (29)

Una disolución de 2-{1'-[N-(3''nitro-carbamoil)-N-metil-amino]etil}-3-(4'''-fluorofenil)-quinazolin-4-ona (28)
(168 mg, 0,036 mmol), diclorometano (5 ml) y acetato de etilo (5 ml) se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno en presencia de paladio activado sobre carbón al 10% hasta que el material de partida se consumió totalmente. La mezcla se filtró a través de Celite y se concentró hasta sequedad dando la anilina del título (29) (100 mg, 65%):

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,48 (d, 3H), 2,88 (s, 3H), 5,17 (q, 1H), 6,39 (s a, 1H), 6,50 (s a, 1H), 6,92 (s a, 1H), 6,60 (s a, 1H), 7,02 (t, 1H), 7,15-7,33 (m, 4H), 7,49-7,55 (m, 1H), 7,75-7,82 (m, 2H), 8,27 (d, 1H).

Se desarrolló un método in situ para derivatizar la amina colgante, según se ejemplifica en el siguiente protocolo:

34

1-{1-[3(Fluoro-fenil)-4-oxo-3,4-dihidro-quinazolin-2-il]-etil}-1-metil-3-(3-trifluorometanosulfonil-fenil)-urea (31)

Una disolución de trifosgeno (160 mg, 0,54 mmol) y acetato de etilo (2,5 ml) se añadió a una disolución de (3-aminofenil)trifluorometil sulfona (100 mg, 0,44 mmol) y acetato de etilo (2,5 ml). Tras agitar durante 5 minutos la mezcla se puso a reflujo hasta que estaba hasta transparente. La mezcla se concentró y se volvió a disolver en cloroformo (2,5 ml) hasta que se añadió una disolución de la amina (30) (130 mg, 0,44 mmol) en cloroformo (2,5 ml). Una vez que todo el material de partida se había consumido por CCF, el disolvente se eliminó a vacío y se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice usando diclorometano y después acetato de etilo como eluyente dando la urea del título (31) (226 mg, 94%) como un sólido.

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,43 (d, 3H), 2,88 (s, 3H), 4,98 (s a, 1H), 7,08-7,14 (m, 1H), 7,16-7,31 (m, 3H), 7,45-7,54 (m, 3H), 7,60 (d, 1H), 7,69-7,80 (m, 3H), 7,96 (d, 1H) y 8,22 (d, 1H).

1-{1-[3(4-Fluoro-fenil)-4-oxo-3,4-dihidro-quinazolin-2-il]-etil}-3-(3- trifluorometil-4-nitro-fenil)-1-metil-urea (32)

Una disolución de trifosgeno (80 mg, 0,27 mmol) y acetato de etilo (1,2 ml) se añadió a una disolución de (4-nitro-3-trifluorometilanilina (45 mg, 0,22 mmol) y acetato de etilo (1,2 ml). Tras agitar durante 5 minutos la mezcla se puso a reflujo hasta que estaba hasta transparente. La mezcla se concentró y se volvió a disolver en cloroformo (1,2 ml) hasta que se añadió una disolución de la amina (30) (65 mg, 0,22 mmol) en cloroformo (1,2 ml). Una vez que todo el material de partida se había consumido por CCF, el disolvente se eliminó a vacío y se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice usando diclorometano y después acetato de etilo como eluyente dando la urea del título (32) (112 mg, 97%) como un sólido.

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,45 (d, 3H), 2,80 (s, 3H), 4,90 (s a, 1H), 7,05- 7,25 (m, 4H), 7,48 (t, 1H), 7,63-7,79 (m, 4H), 7,86 (d, 1H), y 8,19 (d, 1H).

1-{1-[3(4-Fluoro-fenil)-4-oxo-3,4-dihidro-quinazolin-2-il]-etil}-3-(3- trifluorometil-4-(4-metil)-piperazin-i-il)-fenil)-1-metil-urea (33)

Una disolución de trifosgeno (80 mg, 0,27 mmol) y acetato de etilo (1,2 ml) se añadió a una disolución de 4-(N-metilpiperazina)-3-trifluorometil anilina (56 mg, 0,22 mmol) y acetato de etilo (1,2 ml). Tras agitar durante 5 minutos, la mezcla se puso a reflujo hasta que estaba transparente. La mezcla se concentró y se volvió a disolver en cloroformo (1,2 ml) hasta que se añadió una disolución de la amina (30) (65 mg, 0,22 mmol) en cloroformo (1,2 ml). Una vez que todo el material de partida se había consumido por CCF, el disolvente se eliminó a vacío y se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice usando acetato de etilo y después metanol al 5-10% en diclorometano como eluyente dando la urea del título (33) (25 mg, 20%) como un sólido.

\delta (360 MHz; CDCl_{3}) 1,38 (d, 3H), 1,97 (s a, 2H), 2,26 (s, 3H), 2, 47 (s a, 2H), 2,72-2,86 (m, 7H), 4,92-5,05 (m, 1H), 6,80-6,93 (s a, 1H), 7,08 (t, 1H), 7,12-7,27 (m, 4H), 7,34 (s, 1H) 7,41 (t, 2H), 7,63-7,74 (m, 2H) y 8,16 (d, 1H).

Todas las referencias citadas anteriormente se incorporan por el presente documento como referencia en el presente documento.

Equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de establecer, utilizando únicamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Tales equivalentes se pretende que estén englobados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (32)

1. Uso de un compuesto para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la hiperproliferación de una célula, en el que el compuesto es una molécula orgánica representada por la fórmula general (II):

35

en la que, en la medida en que la valencia y la estabilidad lo permitan,

R_{1} y R_{2}, independientemente para cada aparición, representan H, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo (sustituido o no sustituido), aralquilo (sustituido o no sustituido), heteroarilo (sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (sustituido o no sustituido);

L, independientemente para cada situación, está ausente o representa -alquenil-, alquinil-, -(CH_{2})_{n}O(CH_{2})_{p}-,
-(CH_{2})_{n}NR_{2}(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}S(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquenil(CH_{2})_{p}-, -(CH_{2})_{n}alquinil(CH_{2})_{p}-, -O(CH_{2})_{n}-, -NR_{2}(CH_{2})_{n}- o -S(CH_{2})_{n}-;

X se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, -ON=CH-, (R_{8})N-N(R_{8})-, -ON(R_{8})-, un heterociclo, o un enlace directo entre L e Y;

Y se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR_{2})-, un grupo heteroaromático, o un enlace directo entre X y Z;

Z se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S-, -Se- -N=N-, -ON=CH-, R_{8}N-NR_{8}-, -ONR_{8}-, un heterociclo, o un enlace directo entre Y y L;

R_{8}, independientemente para cada situación, representa H, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo (sustituido o no sustituido), aralquilo (sustituido o no sustituido), heteroarilo (sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (sustituido o no sustituido), o dos R_{8} tomados juntos forman un anillo de 4 a 8 miembros, junto con los átomos a los que están unidos, cuyo anillo que puede incluir uno o más carbonilos;

W representa un anillo bencénico o piridónico, sustituido o no sustituido, unido al anillo de pirimidona;

p representa, independientemente para cada situación, un número entero desde 0 hasta 10; y n, individualmente para cada situación, representa un número entero desde 0 hasta 10,

en el que el término "heteroarilo" o "heteroaralquilo" se refiere a un grupo arilo que tiene hasta 4 heteroátomos y en el que el término "sustituido" se refiere a un sustituyente seleccionado de halógeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamido, cetona, aldehído, éster, heterociclilo, restos aromáticos o heteroaromáticos, -CF_{3}, o -CN.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la célula tiene un fenotipo de ganancia de función hedgehog.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que R_{1} representa un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido.

4. Uso según la reivindicación 1-3, en el que X-Y-Z tomados juntos representan una urea o una amida.

5. Uso según la reivindicación 1-3, en el que W es un anillo bencénico sustituido o no sustituido.

6. Uso según la reivindicación 1-3, en el que X representa diazacarbociclo.

7. Uso según la reivindicación 1-3, en el que R_{2} representa un grupo arilo o heteroarilo, sustituido o no sustituido.

8. Uso según la reivindicación 1-3, en el que R_{8}, independientemente para cada situación, se selecciona de H y alquilo C_{1}-C_{10}.

9. Uso según la reivindicación 1-3, en el que X se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S- y un enlace directo; Y se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)- y -S(O_{2})-; y Z se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S- y un enlace directo, de manera que al menos uno de X y Z esté presente.

10. Uso según la reivindicación 1-3, en el que al menos uno de X y Z está presente.

11. Uso según la reivindicación 1-3, en el que Y se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)- y -S(O_{2})-.

12. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto inhibe la transducción de la señal mediada por hedgehog con una DE_{50} de 1 mM o menos.

13. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto inhibe la transducción de la señal mediada por hedgehog con una DE_{50} de 1 \muM o menos.

14. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto inhibe la transducción de la señal mediada por hedgehog con una DE_{50} de 1 nM o menos.

15. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto tiene que administrarse como parte de una aplicación terapéutica o cosmética.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que la aplicación terapéutica o cosmética se selecciona de la regulación de los tejidos neuronales, la formación y reparación de hueso y cartílago, la regulación de la espermatogénesis, la regulación del músculo liso, la regulación del pulmón, el hígado y de otros órganos que provienen del intestino primitivo, la regulación de la función hematopoyética o la regulación del crecimiento de la piel y el pelo.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Y se selecciona de -C(=O) y -C(=S)-.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Z se selecciona de -N(R_{8})-, -O-, -S- y un enlace directo.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{2} representa un alquilo inferior, grupo arilo o heteroarilo, sustituido o no sustituido.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{8}, independientemente para cada situación, se selecciona de H y alquilo C_{1}-C_{10}.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que L adyacente a R1 está ausente, y L adyacente a X es un metileno sustituido o no sustituido.

22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que p, individualmente para cada situación, representa un número entero en el intervalo de 0 a 3.

23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que n, individualmente para cada situación, representa un número entero en el intervalo de 0 a 5.

24. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{2} representa un grupo arilo o heteroarilo, sustituido o no sustituido.

25. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos uno de X y Z está presente.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Z se selecciona de -N(R_{8})-, -O- y -S-.

27. Uso de un compuesto para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, en el que el compuesto es una molécula orgánica representada por la fórmula general (II), tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

28. Uso según la reivindicación 27, en el que dicho cáncer es carcinoma de células basales.

29. Uso según la reivindicación 28, en el que dicho carcinoma de células basales existe en una forma clínica o histológica seleccionada de nodular-ulcerativo, superficial, pigmentado, de tipo morfea, fibroepitelioma y síndrome nevoide.

30. Uso según la reivindicación 27, en el que dicho cáncer es: carcinoma de células escamosas (por ejemplo, carcinoma escamoso de pulmón), carcinosarcoma, carcinoma adenocístico, carcinoma epidermoide, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células renales, papiloma, quiste epidermoide, cáncer pancreático, tumores relacionados con el síndrome de Gorlin (por ejemplo, meduloblastoma, meningioma, etc.), tumores evidenciados en ratones deficientes en pct (por ejemplo, hemangioma, rabdomiosarcoma, etc.), tumores que resultan de la amplificación de gli-1 (por ejemplo, glioblastoma, sarcoma, etc.), tumores relacionados con TRC8, un homólogo de ptc (por ejemplo, carcinoma renal, carcinoma tiroideo, etc.), tumores relacionados con Ext-1 (por ejemplo, cáncer de huesos, etc.), tumores inducidos por Shh (por ejemplo, cáncer de pulmón, condrosarcomas, etc.), cáncer de mama, cáncer urogenital (por ejemplo, riñón, vejiga, uréter, próstata, etc.), cáncer suprarrenal, cáncer gastrointestinal (por ejemplo, estómago, intestino, etc.), tumores neuroectodérmicos primarios malignos del SNC (por ejemplo, meduloblastoma maligno), gliomas malignos, meningiomas, tumores neuroectodérmicos, ependimomas, pineoblastoma o queratoacantoma.

31. Uso de un compuesto para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento del pelo no deseado, en el que el compuesto es una molécula orgánica representada por la fórmula general (II), tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

32. Uso según la reivindicación 27, en el que la composición se formula para la administración tópica.