CN1222850A - 与vegf有关的眼科疾病的治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制VEGF刺激的例如与视网膜变性有关的内皮细胞生长和例如与视网膜水肿有关毛细血管渗透性的方法,尤其是使用PKC同工酶选择性抑制剂(S)－3,4－[N,N′－1,1′－((2″－乙氧基)－3″′(O)－4″′－(N,N－二甲胺基)－丁烷)－双－(3,3′－吲哚基)]－1(H)－吡咯－2,5－双酮盐酸盐。

Description

与VEGF有关的眼科疾病的治疗方法
本申请要求享受美国临时专利申请系列号60/016,658的优先权，优先权日为1996年5月1日。发明背景
1．发明领域
本发明广义上涉及一种抑制与内皮生长因子(VEGF)有关的内皮细胞生长和毛细血管渗透性的方法，例如用一种蛋白激酶C(PKC)的β同工酶抑制剂来抑制VEGF诱导的细胞生长和渗透性的增加。VEGF诱导产生的这些作用和许多眼血管疾病有关。
具体地说，本发明涉及使用一种蛋白激酶C(PKC)的β同工酶抑制剂来治疗眼血管疾病，包括视网膜变性、视网膜水肿、视网膜血管病、视网膜静脉闭塞、虹膜的新血管形成、组织胞浆菌病和视网膜局部缺血病。
2．相关技术的描述
VPF/VEGF是一种糖基化的多功能细胞活素。VPF/VEGF的过度表达和许多眼血管疾病有关。
VPF/VEGF通过活化囊状-空泡状的细胞器介导的传运、迁移和伴有形状改变和皱褶的肌动蛋白组织再生来诱导内皮细胞的增殖和过度渗透性。它改变内皮细胞基因的表达，诱导组织因子和几种蛋白酶生成的增加，包括间质胶原酶以及尿激酶类和组织纤溶酶原激活物。这些相同基因的多数是由肉豆蔻酰佛波醇醋酸酯(PMA)刺激的PKC活化诱导的。
血管内皮生长因子(VEGF)与成纤维细胞生长因子(FGFs)和转化生长因子(TGFβ)被认为在介导激活患有视网膜局部缺血症病人的眼内新血管形成方面起着主要作用(aiello,et al.,New England Jour.Medicine,331(22):1480-1487(1994)；Amin,et al.,InvestOphthalmol Vis Sci.,35:3178-3188(1994))。
与VEGF表达增加有关的眼血管疾病中的一种是视网膜变性。与年龄有关的视网膜变性是导致老年人失明的原因。估计85岁以上超过16％、65到74岁之间超过6％的人患有视网膜变性。超过20％的75岁以上的眼科病人患有视网膜变性。这种病在女性中更加常见(LiebowitzHM,Krueer DE,Maunder LE,et al.,“The Framingham Eye Study:VI视网膜变性，”Surv.Opthalmol.24(supp 10:428-457,1980)；Klein,et al.,“与年龄有关的视网膜病流行情况：The Beaver DamStudy,”Ophthalmology,99(6):933-943,1992)。视网膜变性可分为干型和湿型，干型视网膜变性比湿型多10倍以上，但通常其临床症状要轻一些。湿型或渗出性视网膜黄斑变性的临床症状更严重一些，其和脉络膜血管异常生长(脉络膜的新血管形成)到视网膜下色素上皮或视网膜下间隙中有关，并经常导致严重的视觉损害。
视网膜变性在脉络膜小疣表面造成初始的病理损伤，表现为在视紫红质上皮(RPE)层内反常的组织沉积，并被认为继发于血管机能不全。新的血管于是穿过位于RPE和脉络膜血管层之间的布鲁赫膜生长以至侵袭到视网膜。对视网膜的侵袭引起光感受器的损害并导致能降低视觉的出血。
治疗视网膜变性最常见的方法之一是激光疗法。激光治疗是处理没有延伸到视网膜中心区域(凹区)的新血管形成区域。然而，激光治疗后这种疾病通常会复发(MPS Group,Arch Ophthalmol.,Vol.109,pp.1232-1241(1991))。而且，激光治疗会产生剩余的盲点因此对于视网膜中心区域的新血管形成不是一种最佳的治疗方法。只有有限的病人符合这种治疗形式的合适标准，主要是由于通常见到的脉络膜新血管形成的不清楚的或隐性特性所致(Freund et al.,Amer.Jour.Ophthalmol,115:786-791(1993))。干扰素也已经被试着作为一种治疗剂，这是基于所知的生长因子的活性，例如成纤维生长因子能刺激病理性血管形成。然而，没有观察到一致的效果(Kirkpatrick et al.,Br.J.Ophthalmol.,77:766-770(1993)；Chan et al.,Ophthalmology,101:289-300(1994))。最近，一种用转化生长因子(TGF)β-2来治疗视网膜变性的试验没有成功。Biotechnology Newswatch,January1,1996。
随着人口的快速老龄化，视网膜变性成为一个实际的公众健康问题。目前，没有获得治愈结果并且比满意效果要低的激光治疗仍是唯一可接受的治疗方法，尽管FDA最近批准酞胺哌啶酮用于人体临床试验。(“视网膜变性的研究：常见的眼病、病因和治疗引起了新的注意”，Steven Sternberg,Washington Post Health,1995年10月31日)。人们仍迫切需要研制出能有效治疗视网膜变性的药物。
视网膜水肿和多种眼血管疾病例如视网膜炎色点、糖尿病视网膜病、pars planitis、视网膜静脉阻塞、老年玻璃体膜炎以及眼内外科手术有关(Henkind,Surv.Ophthalmol.28:431-2(1984)；Bird,Surv.Ophthalmol.28；433-6(1984)；Cunha-Vaz,Surv.Ophthalmol.28；485-92(1984))。囊样斑点水肿是白内障手术后最常见的并发症(Yannuzzi,Surv.Ophthalmol.28；540-53(1984))而且可能是做过晶状体摘除术病人失明的最常见原因(Jampol,et al.,Surv.Ophthalmol.28；535-9(1984))。囊样斑点水肿通常是自我限制的，并且甚至慢性病也能自发改善(Yannuzzi,Surv.Ophthalmol.28:540-53(1984))。然而，少量的病人(1-15％)会发展成不可逆损伤并造成永久性视觉功能丧失(Yannuzzi,et al.,Opthalmology,88:847-54(1981))。
视网膜水肿也是造成患有Vogt-Koyanagi-Harada(VKH)综合症的病人后期失明的原因(Rutzen,et al.,J.Ret.and Vit.Dis.,15(6):475-479(1995))。视网膜水肿也与糖尿病视网膜病人和患有镰状细胞性贫血、支状静脉闭塞、颈动脉病或严重高血压的非糖尿病人的微动脉瘤有着密切的联系(Klein,Med.Clin.N.Am.,72:1415-1437(1989))。微动脉瘤经常渗漏出能形成坚硬渗出物的脂蛋白物质。这些渗出物呈现出分散的、聚集的或环状的结构。当渗出物和液体聚集在视网膜的后部时，就会形成视网膜水肿，引起严重的视力模糊并导致视敏度丧失。
一种被称为病灶光致凝固法的激光疗法被用来治疗与微动脉瘤相邻近的视网膜肿胀区域。病灶光致凝固法已经被证明能使患有严重视网膜水肿的病人的视敏度衰退减小60％，但是对患有轻度到中度视网膜水肿的病人病灶光致凝固法没有表现出任何疗效(Raskin,et al.,Ann.Int.Med.,117(3):226-233(1992))。玻璃体手术只有在与玻璃体-视网膜病理界面有关糖尿病型视网膜水肿的情况下才能改善视觉预后(Vaneffenterre,et al.,J.Francais D Ophtalmol.,16(11):602-610(1993))。用于视网膜水肿的药物治疗例如口服或局部给予茚甲新(Miwa,Drug Intell.Clin.Pharm.,20:548-550(1986))和红细胞生成素(Friedman,et al.,Amer.J.Kidney Dis.,26(1):202-208(1995))已经被评价过，但是没有观察到显著的效果。人们需要一种能有效治疗视网膜水肿的药物。
虽然已经知道VEGF在某些眼血管疾病病理中起着一些作用，但仍需要确定是否抑制VEGF的功能能对这些眼血管疾病提供治疗作用。本发明证实了通过抑制VEGF的活性能改善多种眼血管疾病的病理症状。
发明概要
本发明的一个目的是提供治疗一种眼血管疾病的方法。
本发明的另一个目的是提供抑制与哺乳动物视网膜水肿有关的毛细血管渗透性的方法。
本发明的再一个目的是提供一种抑制诱导新血管形成的血管内皮生长因子(VEGF)的方法。
下面通过一个或多个具体实施方案提供本发明的这些和其他目的。
本发明的一个具体实施方案提供了一种治疗眼血管疾病的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物给以一定有效治疗量的蛋白激酶C的β同工酶的一种抑制剂。
本发明的另一个具体实施方案提供了一种治疗哺乳动物中视网膜变性的方法，包括向所述的哺乳动物给以一定有效治疗量的蛋白激酶C的β同工酶的一种抑制剂。
本发明的再一个具体实施方案提供了一种抑制哺乳动物中与视网膜水肿有关的毛细血管渗透性的方法，包括向所述的哺乳动物体中给以一定毛细血管渗透性抑制量的蛋白激酶C的β同工酶的一种抑制剂。
本发明的再一个具体实施方案提供了一种抑制血管内皮生长因子(VEGF)的方法，包括向所述的哺乳动物体中给以一定VEGF抑制量的蛋白激酶C的β同工酶的一种抑制剂。
本发明提供了能有效预防和治疗多种眼血管疾病的一类化合物。
附图的简要说明
图1表明了PKC抑制剂(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-二酮对重组人VEGF刺激的内皮细胞生长的抑制作用。
图2进一步表明了PKC抑制剂(S)-3,4-[N,N＇-1,1′-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-二酮对重组人VEGF刺激的内皮细胞生长的抑制作用。
图3表明了PKC抑制剂对在低氧条件培养的视网膜周边细胞上表达内源性VEGF的活性的效果。
图4进一步表明了PKC抑制剂对重组人VEGF刺激的内皮细胞生长的抑制作用。
图5A,5B表明了VEGF诱导的视网膜渗透性的时间变化过程。
图6表明了视网膜荧光素渗透性对VEGF的反应。
图7表明了玻璃体内PKC对视网膜渗透性的抑制和刺激作用。
图8A,8B表明了口服蛋白激酶C的β同工酶的抑制剂后对视网膜渗透性对VEGF的反应的抑制作用。
发明详述
本发明是用一类特殊的蛋白激酶C抑制剂，即蛋白激酶C的β同工酶抑制剂，尤其是PKC的β同工酶选择性抑制剂来对抗VEGF的作用。本发明尤其是用这类特殊的蛋白激酶C抑制剂对抗内皮细胞生长和毛细血管渗透性，特别是生长因子VEGF刺激的内皮细胞生长和毛细血管渗透性。因此，这类化合物能被用来治疗与VEGF有关的疾病，尤其是多种眼血管疾病。
本发明的方法优选使用能有效抑制β同工酶的蛋白激酶C抑制剂。一组合适的化合物在以前的技术中通常被描述为双-吲哚基马来酰亚胺或大环双-吲哚基马来酰亚胺。在以前的技术中被很好地认识的双-吲哚马来酰亚胺包括在美国专利5621098,5552396,5545636,5481003,5491242和5057614中描述的那些化合物,这些文献都被列入本发明参考范围内。大环双-吲哚马来酰亚胺以通式Ⅰ化合物作为特定代表。这些化合物和它们的制备方法已经在美国专利5,552,396中公开过，此专利也列入本发明的参考文献中。这些化合物以有效治疗量给哺乳动物给药来抑制与VEGF有关的内皮细胞生长和毛细血管渗透性，并抑制与眼疾病有关的VEGF作用。这些化合物也可以作为预防剂给受到上述疾病危及的病人给药。
本发明优选使用的是如通式Ⅰ所示的一类化合物：
(Ⅰ)插入原文P9中的结构式
Figure A9719569900101
其中：
W代表-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CO-、C2-C6亚烷基、取代亚烷基、C2-C6链烯基、-芳基-、-芳基-(CH2)mO-、-杂环-、-杂环-(CH2)mO-、-稠合双环-、-稠合双环-(CH2)mO-、-NR3-、-NOR3-、-CONH-或-NHCO-；
X和Y分别独立地代表C1-C4亚烷基、取代亚烷基，或X、Y和W结合在一起形成-(CH2)n-AA-；
R1代表氢或最多至四个的独立选自卤素、C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基、卤代烷基、硝基、NR4R5、或NHCO(C1-C4烷基)中的任选取代基；
R2代表氢、CH3CO-、NH2或羟基；
R3代表羟基、(CH2)m芳基、C1-C4烷基、-COO(C1-C4烷基)、-CONR4R5、-(C=NH)NH2、-SO(C1-C4烷基)、-SO2(NR4R5)或-SO2(C1-C4烷基)；
R4和R5独立地代表氢、C1-C4烷基、苯基、苄基或结合到N上形成饱和或不饱和的五元或六元环；
AA代表一个氨基酸残基；
m独立地代表0、1、2或3；和
n独立地代表2、3、4或5，
或其药物可接受盐、前药或酯。
本发明更优选的一类化合物如结构Ⅰ所示，其中组成部分-X-W-Y-含有4-8个原子，可能被取代或没被取代。组成部分-X-W-Y-最优选含有6个原子。
本发明的方法使用的其他优选化合物是如通式Ⅰ所示，其中R1和R2代表氢，W代表取代的亚烷基、-O-、-S-、-CONH-、-NHCO-、或-NR3-的化合物。本发明尤其优选的是如通式Ⅰa所示的化合物：其中Z代表-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R4代表羟基、-SH、C1-C4烷基、(CH2)m芳基、-NH(芳基)、-N(CH3)(CF3)、-NH(CF3)或-NR5R6；R5代表氢或C1-C4烷基；R6代表氢、C1-C4烷基或苄基；p代表0、1或2；m独立地代表2或3，或其药物可接受盐、前药或酯。最优先的式Ⅰa化合物是Z是-CH2那些；及R4是-NH2-,-NH(CF3)，或-N(CH3)2，或药用盐，前药或酯。
本发明的方法使用的其他优选化合物是如通式Ⅰ所示，其中W代表-O-、Y代表取代的亚烷基、X代表亚烷基的化合物。这些优选的化合物如通式Ⅰb所示：
Figure A9719569900112
其中Z代表-(CH2)p-；R4代表-NR5R6、-NH(CF3)或-N(CH3)(CF3)；R5和R6独立地代表H或C1-C4烷基；p代表0、1或2；m独立地代表2或3，或其药物可接受盐、前药或酯。最优选的化合物是通式Ⅰb中p代表1、R5和R6代表甲基的化合物。
因为它们含有一个基本的组成部分，通式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb化合物也能以其药物可接受酸加成盐的形式存在。通常用来形成这类盐的酸包括：无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸；和有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、乙二酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸；以及相关的无机酸和有机酸。这些药物可接受盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、溴酸盐、碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、2-丁炔-1,4-二酸盐、3-己炔-2,5-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马尿酸盐、β-羟丁酸盐、羟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐和类似的盐。尤其使用盐酸盐和甲磺酰盐。
除了药物可接受盐，其他盐也可以存在。它们可以在化合物纯化、其它盐的制备以及化合物或中间体的和定性过程中充当中间体。
通式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb的化合物的药物可接受盐也能以多种溶剂化物形式存在，例如以水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺和乙酸乙酯及类似溶剂的溶剂化物存在。这些溶剂化物的混合物也能制备。这类溶剂化物可能是在溶剂结晶中形成的，是在溶剂的制备或结晶中固有的，或外来的。
通式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb的化合物可能存在多种立体异构形式，W可能在取代的亚烷基部分含有手性碳原子。化合物通常以消旋体形式制备并能方便地使用。同样，如果需要的话，两种单独的对映体也可以用常规的技术拆分或合成。这些消旋体和单独对映体以及它们的混合物构成了本发明方法使用的化合物的一部分。
本发明使用的化合物也包括式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb的化合物的药物可接受前药。前药是经过化学修饰并且在其活性位点可能没有生物活性的药物，但在体内过程中被一种或多种酶或其它因素降解或修饰变成具有生物活性的母药形式。与其母药相比，前药可能具有不同的药代动力学特性，穿过上皮粘膜的易化吸收，更好的成盐或溶解度，和/或改善的全身稳定性(例如延长的血液半衰期)。典型的化学修饰如下：
(1)能被酯酶或脂肪酶裂解的酯或酰胺衍生物；
(2)能被特异性或非特异性蛋白酶识别的肽；或
(3)通过膜选择前药或修饰的前药而累积在作用位点的衍生物；或上面1-3的任何组合；选择和制备合适前药的常规方法在例如，H.Bundgaard的前药的设计(1985)中描述。
在Davis等人的美国专利5,057,614中描述了合成双-吲哚-N-马来酰亚胺衍生物的方法，在已授权的美国专利5,552,396和Faul等人的欧洲专利申请公开0657411A1中描述了合成适合本发明使用的优选化合物的方法，这些专利都被列入本发明的参考文献中。
前面提到的美国专利5,552,396的实施例5g中描述了本发明一种特别优选使用的蛋白激酶β抑制剂((S)-3,4-[N,N′-1,1′-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-双酮盐酸盐)。这个化合物是有效的蛋白激酶C抑制剂。它对于蛋白激酶C选择性比对其它激酶强并且具有很高的同工酶选择性，即具有β-1和β-2同工酶选择性。这些化合物的其他盐也是合适的，尤其是甲磺酸盐。
一个优选的甲磺酸盐可通过将结构式Ⅱ的化合物与甲磺酸在惰性有机溶剂中反应来制备：所述惰性有机溶剂优选有机溶剂/水混合物，最优选水-丙酮混合物。其他溶剂例如甲醇、丙酮、乙酸乙酯和它们的混合物也是可行的。有机溶剂与水的配比不重要并且通常由反应物的溶解性决定。优选的有机溶剂与水的配比通常是0.1∶1-100∶1，这是溶剂与水的体积比。优选1∶1-20∶1最优选5∶1-10∶1。最佳的配比依赖于所选择的溶剂，丙酮优选与水以9∶1的比例混合。
两种反应物通常以约等摩尔的量反应，虽然其他配比，特别是其中甲磺酸过量的配比也是可行的。甲磺酸的加入速度比对反应不重要并且可以快速加入(＜5分钟)或用6小时或更长时间慢慢加入。反应在0℃到回流温度的范围内进行。反应混合物一直搅拌到完全成盐，用X-射线粉末衍射来确定并且反应可进行5分钟-12小时。
本发明的盐优选并且容易制成结晶形式。盐的三水合物形式可以通过干燥或暴露在20-60％相对湿度条件下迅速地转化为一水合物形式。盐实质上是晶体形式使其具有确定的熔点、双折射和X-射线衍射图形。通常，晶体有不超过10％的无定形固体，优选有不超过5％，最优选不超过1％的无定形固体。
甲磺酰盐通过过滤或其他本领域已知的分离技术从反应混合物中直接分离，产率为50％-100％。如果需要，可以用重结晶和其他本领域已知的纯化技术将盐进一步纯化。
在组织培养中由生长因子例如VEGF刺激的内皮细胞表现出比基底细胞快很多的生长速度。本发明进行的试验表明，当以约0.1-100nM浓度体外给药时，蛋白激酶C抑制剂(S)-3,4-[N,N′-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-双酮酸盐能显著地抑制生长因子(例如VEGF)刺激的非基底细胞的生长。
重要的是，其他试验已经证实，组织培养中正常的细胞生长不被此化合物抑制，表现为在含氧量条件下的培养基中没有VEGF刺激的内皮细胞生长不被抑制。在低氧条件下的培养基中，由于由低氧细胞产生的内源性生长因子VEGF的增加而使细胞生长速度增加。蛋白激酶C抑制剂(S)-3,4-[N,N＇-1,1′-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-双酮酸盐又能使这种低氧条件诱导的细胞生长恢复正常。
本发明提供的试验证实了毛细血管渗透性也受生长因子例如VEGF的影响。试验表明在一个动物模型中，VEGF最多能将毛细血管渗透性显著提高到3倍。这种依赖于VEGF的毛细血管渗透性的增高也与剂量有关。根据动物体内试验，蛋白激酶C抑制剂以约25mg/kg/天的浓度在VEGF之前给药能大大抑制VEGF诱导的毛细血管渗透性。特别考虑以1nM-5mM优选以1nM-500nM的浓度使用。抑制作用最高能达到80％并且通常对生长因子诱导的毛细血管渗透性具有特异性。毛细血管渗透性能通过血管荧光造影术测定。尤其在视网膜水肿中，血管荧光造影术是将荧光染料注射到血液中来检测视网膜内的渗透区域的视网膜造影过程。
虽然不希望受到任何技术说明的限制，本申请人相信，所有由血流下降引起的视网膜灌注变化、视网膜毛细血管缺失、周边脉管系统发育不全或闭塞、来自视网膜的脉络膜血液的供给分离都能导致相对的视网膜局部缺血。这种局部缺血刺激生长因子例如VEGF在视网膜周皮细胞、内皮细胞、视紫红质上皮细胞、神经胶质细胞和其他可能类型的细胞内进行合成和分泌；随后导致视网膜新血管的形成和毛细血管渗透性的增加。这些病理状态和多种眼血管疾病有关。
本发明中描述的PKCβ同工酶抑制剂能被用来治疗与内皮细胞生长和毛细血管渗透性有关的疾病，尤其是多种眼血管疾病。
适于本发明化合物治疗的眼血管疾病包括但不仅限于视网膜变性、视网膜水肿、视网膜血管病、视网膜静脉阻塞、虹膜新血管形成、组织胞浆菌病和视网膜局部缺血症。视网膜变性可能和年龄有关。视网膜水肿和糖尿病或视网膜中心阻塞有关。本发明中使用的术语视网膜血管病不包括糖尿病视网膜症，但包括与镰状细胞性贫血、早产儿、角状或柱状网状组织的新血管形成有关的视网膜血管病。虹膜的新血管形成可能与糖尿病有关或无关。
本领域普通技术人员能知道本发明中的PKCβ同工酶抑制剂的有效治疗量是能通过抑制VEGF而充分抑制内皮细胞生长或毛细血管渗透性增加的量，并且此剂量特别依赖于受作用的组织的大小、治疗制剂中化合物的浓度和病人的体重。通常，作为治疗剂来治疗眼血管疾病的蛋白激酶Cβ同工酶抑制剂的给药量由主治医师根据不同的病例来决定。作为指导准则，在调整合适的给药剂量时，要考虑病人新血管形成的程度、体重和年龄。
通常，合适的剂量是能使蛋白激酶Cβ同工酶抑制剂在治疗位点的浓度达到0.5nM-200μM，更经常是0.5nM-200nM。预期在大多数情况下化合物在血清中浓度达到0.5nM-100nM时应该是足够的。
为了达到治疗浓度，需要治疗的病人应以约0.001mg-50.0mg/天/kg体重的量给药。通常，不超过约1.0-10.0mg/天/kg体重的蛋白激酶Cβ同工酶抑制剂应该是需要的。就象上面提过的一样，所述的剂量也根据不同的病例而变化。
通式Ⅰ和优选的通式Ⅰa和Ⅰb的化合物优选在给药前先制成制剂。合适的药用制剂通过熟知的技术并采用可方便获得的组分制备。在制备适于本发明的方法使用的组合物时，活性组分通常和载体混合或用载体稀释或装入以胶囊、小药囊、纸袋或其他容器形式存在的载体中。当载体作为稀释剂时，可能采用固体、半固体或液体材料作为活性组分的载体、赋形剂或介质。因此，组合物可以制成片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂(固体或在液体介质中)、软和硬明胶胶囊剂、栓剂、无菌注射液以及口服或局部使用的无菌包装粉剂。
合适的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、含水糖浆、甲基纤维素、苯甲酸甲酯和苯甲酸丙基羟酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外制剂中还包括润滑剂、湿润剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂。本发明的组合物可以配制成病人给药后使活性组分快速、持续或延迟释放的剂型。组合物优选以一个单位剂量形式制剂，每单位剂量含有约0.05mg-约3g更经常是约750mg的活性组分。然而，需要知道的是给予的治疗剂量由主治医生根据相关情况包括要治疗疾病的严重程度、给药化合物的选择和给药途径的选择来决定。因此，上面的剂量范围不以任何方式限制本发明的范围。术语“单位剂量形式”指适于作为受治疗的人和其它哺乳动物单位剂量的实际上不连续的单位，每一单位含有一预定量的预计能产生希望的治疗效果的活性组分和合适的药用载体。
除了上面提到的大多数是口服给药的制剂外，本发明使用的化合物也能局部给药。局部给药制剂包括软膏剂、乳膏剂和凝胶剂。
油膏通常用(1)油脂性基质，即由脂肪油或碳氢化合物组成的基质，例如白凡士林或矿物油，或(2)能吸收基质，即由无水物质或能吸水物质组成的基质，例如无水羊毛脂制备。通常，在基质形成后，无论是油脂性的还是吸收性的，活性组分(化合物)都以能达到所希望的浓度的量加入。
乳膏剂和油/水乳剂。它们由油相(分散相)和水相(连续相)组成，油相包括典型的脂肪油、碳氢化合物和类似物，例如蜡、凡士林、矿物油和类似物；水相包括水和水溶性物质，例如加成盐。两种相用乳化剂稳定，乳化剂例如是表面活性剂，如十二烷基硫酸钠；亲水胶体，如阿拉伯胶态白土、硅酸镁铝以及类似物。在乳剂的制剂过程中，活性组分(化合物)以能达到所希望浓度的量加入。
凝胶含有从油脂性基质、水或乳液-悬浮液基质中选择的基质。将在基质中形成母质的胶凝剂加入基质中以增加其粘性。胶凝剂的实例有羟丙基纤维素、丙烯酸聚合物以及类似物。通常，在制剂过程中，活性组分(化合物)以所希望的浓度在加入凝胶剂之前加入。
化合物混合到局部给药制剂中的量不是关键的；其浓度应该在一定范围内，在此范围内足以能使备用制剂以一定的量作用到待治疗组织，此一定量的制剂能使化合物以所希望的量释放到希望治疗的位点。
通常，局部用制剂用于欲治疗组织所需的常规量依赖于需治疗组织的大小和制剂中化合物的浓度。通常制剂以约1-约500μg化合物/cm2治疗组织的量施用于被作用的组织，化合物优选以约30-约300μg/cm2，更优选约50-约200μg/cm2，最优选约60-约100μg/cm2的量给药。
下面制剂的具体实例只是作为说明而不是以任何方式限制本发明的范围。
制剂1
明胶硬胶囊用下面的组分制备：
                                            量
                                         (mg/胶囊)
活性剂                                      250
干燥淀粉                                    200
硬脂酸镁                                     10
总量                                        460mg
将上面的组分混合并以460mg的量装入明胶硬胶囊中。
                        制剂2
片剂用下面的组分制备：
                                             量
                                    (mg/片)
活性剂                                250
微晶纤维素                            400
煅烧的二氧化硅                         10
硬脂酸                                  5
总量665mg
将组分混合并压制成片重为665mg的片剂。
              制剂3
每片含60mg活性组分的片剂用下面的组分制备：
                                       量
                                     (mg/片)
活性剂                                60mg
淀粉                                  45mg
微晶纤维素                            35mg
聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶液)             4mg
羧甲基淀粉钠                          4.5mg
硬脂酸镁                              0.5mg
滑石粉                                 1mg
总量                                  150mg
将活性组分、淀粉和纤维素过美国No.45目筛并充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液和得到的粉末混合，过美国No.14目筛。将制得的颗粒在50℃条件下干燥，然后过美国No.18目筛。将羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石粉先过美国No.60目筛，然后加入到颗粒中，混合后在压片机上压制成片，每片重150mg。
实施例
这些实施例都是用来证明使用(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-双酮盐酸盐能在体外抑制由VEGF刺激的内皮细胞生长和在体内抑制VEGF刺激的毛细血管渗透性增加。实施例1
在本实施例中，使用重组人VEGF来验证上面提到的化合物对由VEGF刺激的内皮细胞生长的抑制效果。
牛视网膜内皮细胞是从新鲜的小牛眼睛中通过均化和一系列过滤步骤提取到的。原代内皮细胞培养物是在粘连蛋白包被的(NYBenReagent，纽约血液中心)的培养皿(Coster)中生长，该培养皿中含有Dulbecco＇s修饰的Eagle′s培养基(DMEM)，以及5.5mM葡萄糖，10％的血浆来源的马血清(Wheaton,Scientific)。每升有50mg肝素和50单位内皮细胞生长因子(Boehringer Mannheim)。细胞融合后，培养基变为含有5％胎牛血清(HyClone)。培养基每3天更换一次。内皮细胞的纯一性用反因子Ⅷ抗体来确定。
所提及的PKC抑制剂在体外对VEGF作用的抑制效果通过牛视网膜微血管内皮细胞的稀疏涂布培养物来评价，加入VEGF刺激细胞生长。牛视网膜内皮细胞在24-孔培养皿(Coster)中稀疏涂布(每孔中约有2500个细胞)，在含有10％小牛血清(GIBCO)的DMEM中过夜培养。第二天将基质更换。
为了测定所提及的PKC抑制剂对内皮细胞生长影响的效果，进行了一系列的试验，其中不含任何活性剂的细胞生长作为对照组，然后测定加入所提及的PKC抑制剂在含有VEGF(25ng/ml；Genentech)和不含有VEGF的两种情况下的效果。在37℃培养4天后，将细胞溶解在0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)中，用Hoechst 33258染料和荧光计(TK0-100型；Hoefer)测定DNA含量。
所有测定至少平行地进行3次，试验最少重复3次。所有试验结果都用±SD表示。体外结果分析通过非成对斯氏T检验进行。P值＜0.050被认为具有显著的统计学差异。
图1说明了用重组VEGF得到的结果。如图上最左边3个柱形所示，把所提及的PKC抑制剂加入内皮细胞培养物对基础生长速度本质上没有影响(柱1)。加入VEGF使细胞生长速度有实质性增加(柱4)。加入浓度＞0.5nM的所提及PKC抑制剂时，这种细胞生长速度有实质性的减小(最右边4个柱)。实施例2
本实施例与图1所报告的工作一样并进一步阐明了所提及的PKC抑制剂对VEGF刺激的内皮细胞生长的抑制效果，试验使用重组的人VEGF。
使用实施例1中的技术，分离和生长牛视网膜内皮细胞；随后制备稀疏涂布的培养物。再使用实施例1中的技术操作，进行试验以测定加入所提及的PKC抑制剂对含有VEGF(25ng/ml；Genentech)和不含有VEGF的两种情况下的影响。在37℃培养4天后，将细胞溶解在0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)中，用Hoechst 33258染料和荧光计(TKO-100型；Hoefer)测定DNA含量。
图2说明了本实施例的结果。如-VEGF图上面的柱形所示，把所提及的PKC抑制剂以0.1nM-100nM浓度加入内皮细胞培养物对细胞基础生长速度都没有本质影响。用重组人VEGF(25ng/ml)刺激内皮细胞，4天后细胞中DNA含量与没受刺激的细胞相比有显著的增加(-VEGF与+VEGF在抑制剂浓度为0时相比)，这表示生长速度的增加。加入所提及的PKC抑制剂使细胞生长速度有实质性减小(+VEGF图上面最右边4个柱)。尤其当PKC抑制剂浓度为0.1nM时VEGF的刺激能力轻微下降，当同时加入的PKC抑制剂浓度达到1nM及更大时VEGF的刺激能力完全被消除。实施例3
本实施例测定了所提及的PKC抑制剂对在无氧条件下培养的视网膜周皮细胞上表达的内源性VEGF活性的影响。
牛视网膜内皮细胞和视网膜周皮细胞通过均化和一系列过滤步骤从新鲜的小牛眼中提取。内皮细胞用实施例1中的技术来生长并在培养皿中稀疏涂布培养。牛视网膜周皮细胞用相同的技术在含有20％胎牛血清的DMEM/5.5mM葡萄糖中培养。
用来表达内源性VEGF的无氧条件的培养基和正常氧条件的对照培养基各自依据下面的方法制备。用预先装有计算机控制的水套CO2红外线恒温箱的Lab-Line仪器将融合的单层视网膜周皮细胞暴露于2％O2/5％CO2/93％N2条件下24小时，所述的恒温箱装有减少O2控制器(480型)。所有细胞维持在37℃，通过用光学显微镜检查发现细胞没有任何形态改变并不含台盼蓝染料(＞98％)，随后能正常传代。来自同批同代的细胞在正常氧(95％空气/5％CO2)条件下培养以作为对照组。随后培养基在使用前收集并过滤(Nalgene；0.22μm)。
在本实施例中，进行的试验是测定PKC抑制剂对在有氧条件培养基或无氧条件培养基中的内皮细胞生长的影响。如前面实施例中所做的一样，在37℃培养4天后，将细胞溶解在0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)中，用Hoechst 33258染料和荧光计(TKO-100型；Hoefer)测定DNA含量。
在图3说明的试验中，所提及的PKC抑制剂使用的浓度是10nM。如图3所示，视网膜内皮细胞生长受到由在无氧条件下培养的视网膜周皮细胞制备成的条件培养基刺激，这种无氧条件能诱导VEGF表达(比较图3中柱1到柱3)。当存在PKC抑制剂(S)-3,4-[N,N′-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-
丁烷)-双-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-双酮盐酸盐时，生长刺激被抑制(正常化)(比较数柱3到柱4)。实施例4
本实施例与图1和2报告的工作相同并进一步说明所提及的PKC抑制剂对VEGF所刺激的内皮细胞生长的抑制效果，试验使用重组人VEGF。
使用实施例1中的技术分离和生长牛视网膜内皮细胞；制备稀疏涂布的培养物。再使用实施例1中的技术操作，进行试验以测定所提及的PKC抑制剂的加入在含有(+VEGF)(25ng/ml；Genentech)和不含有VEGF(-VEGF)的两种情况中的影响。同上，在37℃培养4天后，将细胞溶解在0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)中，用Hoechst 33258染料和荧光计(TKO-100型；Hoefer)测定DNA含量。
图4说明了本工作的结果。如-VEGF图上面的柱形所示，把所提及的PKC抑制剂以10nM浓度加入内皮细胞培养物对细胞基础生长速度没有本质影响。重组人VEGF(25ng/ml)对内皮细胞的刺激作用使细胞中DNA的含量同没有VEGF刺激的细胞相比有了显著的增加，这表示细胞生长速度的增加(比较-VEGF对照组与+VEGF对照组)。所提及的PKC抑制剂以10nM浓度加入使生长速度被显著减小。
这些结果证实所披露的一系列PKC抑制剂尤其是(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-双酮能在体外阻止由外原的或低氧诱导的VEGF对视网膜内皮细胞生长的刺激。既然VEGF的表达与和视网膜变性有关的新血管形成密切相关，这些结果证实了PKC抑制剂能作为治疗剂治疗视网膜变性。实施例5
本实施例表明了VEGF诱导视网膜渗透性的时间过程。
在每只大鼠的一只眼睛的玻璃体内注射2.0ngVEGF(估计最终浓度为25ng/ml)。相反一侧的眼睛注射同样体积的对照溶液。10分钟后，将30微升荧光素溶液通过导管注射到右颈静脉中。玻璃体的荧光光度测定在荧光素注射后指定时间进行。
如图5A所示，注射过VEGF的眼睛内，玻璃体对荧光素的渗透性有明显的增加。在荧光素血管造影注射10分钟内具有统计学显著的差异，并且维持至少30分钟。图5B表明以对照百分比表示的刺激作用证实了注射过VEGF的眼睛超时后有额外的荧光素渗漏。实施例6
本实施例表明了视网膜中荧光素的渗透性对VEGF剂量的反应。
在每只动物的一只眼睛内注射对照溶液，相反一侧的眼睛注射不同剂量的VEGF。10分钟后静脉注射荧光素，30分钟后分析玻璃体内荧光素渗透量。如图6所示，视网膜渗透量的增长依赖于VEGF的剂量。刺激作用在14-20ng/ml时能达到人可以获得的最大值。实施例7
本实施例证实了PKC抑制剂(S)-3,4-[N,N′-1,1′-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-双酮盐酸盐在玻璃体中的作用和其对视网膜渗透性的刺激作用。
鼠的两只眼睛每只注射如图7所示的2.0ngVEGF、10nMPKCβ抑制剂或1毫克PDBU(一种PKC激动剂)。PKCβ抑制剂在VEGF加入之前15分钟注射。VEGF注射10分钟后，静脉注射荧光素，30分钟后评价玻璃体中荧光素的量。
如图7所示，VEGF注射到玻璃体后表现出了预期的视网膜渗透性刺激作用。在VEGF注射之前15分钟注射PKCβ抑制剂消除了大部分渗透性反应。注射对蛋白激酶C有直接刺激作用的PDBU使渗透性增加，这和注射VEGF的效果非常相似。实施例8
本实施例证实了口服给药蛋白激酶Cβ抑制剂(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-双酮盐酸盐对VEGF刺激的视网膜渗透性的抑制作用。
给鼠进食混有蛋白激酶Cβ抑制剂的食物，其中抑制剂的剂量如图8A和8B所示。饲养一周后，用前面讨论过的方法测定视网膜渗透性对玻璃体内注射的2.0ng的VEGF的反应。本发明的PKCβ抑制剂口服给药一周后降低了视网膜渗透性对VEGF的反应。在较高剂量时效果最显著。
本发明的原理、优选实施方案和操作方式已经在前面的说明书中描述过了。然而这儿所要保护的发明不应理解为将其限制于所公开的特定方式，因为它们只是阐述性的而不是限制性的。本领域普通技术人员在不脱离本发明主题的前提下可以对本发明做一些变化和改变。

Claims (12)

1．一种治疗眼血管疾病的方法，该方法包括给与需要治疗的哺乳动物有效治疗量的蛋白激酶Cβ同工酶抑制剂。
2．根据权利要求1的方法，其中所述的蛋白激酶Cβ同工酶抑制剂是双-吲哚基马来酰亚胺或大环双-吲哚基马来酰亚胺。
3．根据权利要求1的方法，其中所述的抑制剂是同工酶选择性的并且同工酶选择性是选自β-1和β-2同工酶的。
4．根据权利要求3的方法，其中所述的蛋白激酶C抑制剂具有下面的通式：其中：
W代表-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CO-、C2-C6亚烷基、取代亚烷基、C2-C6链烯基、-芳基-、-芳基-(CH2)mO-、-杂环-、-杂环-(CH2)mO-、-稠合双环-、-稠合双环-(CH2)mO-、-NR3、-NOR-、-CONH-或-NHCO-；
X和Y分别独立地代表C1-C4亚烷基、取代亚烷基，或X、Y和W结合在一起形成-(CH2)n-AA-；
R1代表氢或最多至四个独立地选自卤素、C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基、卤代烷基、硝基、NR4R5或NHCO(C1-C4烷基)任选性取代基；
R2代表氢、CH3CO-、NH2或羟基；
R3代表羟基、(CH2)m芳基、C1-C4烷基、-COO(C1-C4烷基)、-CONR4R5、-(C=NH)NH2、-SO(C1-C4烷基)、-SO2(NR4R5)或-SO2(C1-C4烷基)；
R4和R5分别独立地代表氢、C1-C4烷基、苯基、苄基或结合到N上形成饱和的不饱和的五元或六元环；
AA代表一个氨基酸残基；
m独立地代表0、1、2或3；和
n独立地代表2、3、4或5，
或其药物可接受盐、前药或酯。
5．根据权利要求4的方法，其中所述的蛋白激酶C抑制剂具有下面的通式：其中：
Z代表-(CH2)p-或-O-(CH2)p、-(CH2)p-O-(CH2)p-；R4代表羟基、-SH、C1-C4烷基、(CH2)m芳基、-NH(芳基)、-N(CH3)(CF3)、-NH(CF3)或-NR5R6；R5代表氢或C1-C4烷基；R6代表氢、C1-C4烷基或苄基；p代表0、1或2；m独立地代表2或3，或其药物可接受盐、前药或酯。
6．根据权利要求4的方法，其中所述的蛋白激酶C抑制剂具有下面的通式：
Figure A9719569900032
其中：
其中Z代表-(CH2)p-；R4代表-NR5R6、-NH(CF3)或-N(CH3)(CF3)；R5和R6分别独立地代表H或C1-C4烷基；p代表0、1或2；m独立地代表2或3，或其药物可接受盐、前药或酯。
7．根据权利要求4的方法，其中所述的蛋白激酶C包含(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-双-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-双酮或其药物可接受酸盐。
8．根据权利要求1的方法，其中所述的眼血管疾病是选自视网膜变性、视网膜水肿、视网膜血管病、虹膜的新血管形成、视网膜静脉阻塞、组织胞浆菌病和视网膜局部缺血病。
9．根据权利要求1的方法，其中所述的眼血管疾病是选自视网膜变性、视网膜水肿和视网膜静脉阻塞。
10．根据权利要求8的方法，其中所述的视网膜血管病是视网膜早熟病。
11．一种抑制VEGF刺激的内皮细胞生长的方法，该方法包括给与需要治疗的哺乳动物有效治疗量的蛋白激酶Cβ同工酶抑制剂。
12．一种抑制VEGF刺激的与视网膜水肿有关的毛细血管渗透性的方法，该方法包括给与需要治疗的哺乳动物有效治疗量的蛋白激酶Cβ同工酶抑制剂。
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