EA001752B1

EA001752B1 - Терапевтическое лечение глазных заболеваний, связанных с фактором роста сосудистого эндотелия

Info

Publication number: EA001752B1
Application number: EA199800970A
Authority: EA
Inventors: Ллойд П. Аиелло; Майкл Р. Джироусек; Джордж Л. Кинг; Луис Виньяти; Дуглас Кирк Вэйс
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2001-08-27
Also published as: NO985067D0; PT918519E; NZ538109A; NO322209B1; EP0918519B1; AU724923B2; EP0918519A1; JP2000514402A; CN1158073C; HK1020017A1; DE69729798D1; KR100364487B1; AU2936197A; ES2224249T3; PL330463A1; NO985067L; BR9710705A; HU226378B1; ATE270548T1; CA2253613C

Abstract

Описывается способ ингибирования роста эндотелиальных клеток, стимулированного ФРСЭ, такого как связанного с дегенерацией желтого пятна, и стимулированной ФРСЭ капиллярной проницаемости, такой как связанной с отеком желтого пятна, в частности, с использованием селективного ПКС ингибитора изофермента, хлористо-водородной соли (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2"-этокси)-3'"(О)-4'"-(N,N-диметиламино)-бутан)-бис-(3,3'-индолил)]-1(Н)-пиррол-2,5-диона.

Description

Предпосылки изобретения Область изобретения

Настоящее изобретение в широком смысле направлено на способ ингибирования роста эндотелиальных клеток и капиллярной проницаемости, связанных с фактором роста сосудистого эндотелия (ФРСЭ), например, увеличенного клеточного роста и проницаемости, вызванных ФРСЭ, с использованием ингибитора изофермента β протеинкиназы С (ПКС). Эти состояния, вызванные ФРСЭ, тесно связаны с разнообразными глазными сосудистыми расстройствами.

Настоящее изобретение направлено особенно на применение ингибитора изофермента β протеинкиназы С (ПКС) для лечения глазных сосудистых расстройств, включая дегенерацию желтого пятна, отек желтого пятна, сосудистую ретинопатию, окклюзию вен сетчатки, неоваскуляризацию радужной оболочки, гистоплазмоз и ишемические заболевания сетчатки.

Описание предшествующего уровня техники

ФСП/ФРСЭ представляет собой гликозилированный, многофункциональный цитокин. Избыточная экспрессия ФСП/ФРСЭ связана с разнообразными глазными сосудистыми расстройствами.

ФСП/ФРСЭ вызывает пролиферацию эндотелиальных клеток, избыточную проницаемость посредством активации транспорта, опосредованного через пузырьково-вакуолярные органеллы, миграции и реорганизации актина с изменениями формы и индуляцией. Он изменяет экспрессию гена эндотелиальных клеток, вызывая повышенную выработку тканевого фактора и нескольких протеаз, включая интерстициальную коллагеназу и как урокиназоподобного активатора, так и активатора тканевого плазминогена. Большинство из этих самых генов индуцируются активацией ПКС, стимулированной форбол миристат ацетатом (ФМА).

Считается, что фактор роста сосудистого эндотелия (ФРСЭ), наряду как с факторами роста фибробластов (ФРФ), так и с трансформирующим фактором роста (ТФРв) играют главную роль в опосредовании активной внутриглазной неоваскуляризации у пациентов с ишемическими заболеваниями сетчатки (А1е11о с1 а1., №\ν Еид1аиб 1оиг. Мебюте, 331(22): 14801487 (1994); Атт е1 а1., 1иуе51 Орй!йа1то1 Уй 8ск, 35:3179-3188 (1994)).

Одним из глазных сосудистых расстройств, связанных с повышенной экспрессией ФРСЭ, является дегенерация желтого пятна. Связанная с возрастом дегенерация является ведущей причиной слепоты у пожилых людей. По данным оценки, дегенерация желтого пятна поражает более чем 16% людей в возрасте 85 лет и старше и 6% людей в возрасте между 65 и 74 годами. Более чем у 20% пациентов в возрасте старше 75 лет имеется дегенерация желтого пятна. Болезнь чаще встречается у женщин (ЫеЬо\\йх НМ, Кгиеег ΌΕ, Маиибег ЬЕ е1 а1., Тйе Егаттдйат Еуе 8ибу: VI Маси1аг Оедепегайои, 8игу. Орй!йа1то1. 24 (кирр 10:428-457, 1980); К1ет е1 а1., Ргеуа1еисе о! Аде Ре1а1еб Маси1ора1йу: Тйе Веауег Эат 81ибу, Орй1йа1то1оду, 99(6):933-943, 1992). Дегенерацию желтого пятна можно разделить на сухой или влажный тип, причем сухой тип встречается в 10 раз чаще, но, в общем, по своим клиническим проявлениям протекает менее тяжело. Более тяжелая влажная или эксудативная дегенерация желтого пятна связана с патологическим ростом хориоидальных сосудов (хориоидальная неоваскуляризация) в подсетчаточный пигментный эпителий или подсетчаточное пространство и часто приводит к тяжелому ухудшению зрения.

Дегенерация желтого пятна имеет первоначальное патологическое поражение, заключающееся в появлении друз, что представляет патологическое отложение ткани внутри слоя пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и, как считается, является вторичным по отношению к сосудистой недостаточности. Затем через оболочку Бруха, расположенную между ПЭС и хориокапиллярами, прорастают новые кровеносные сосуды, внедряясь в сетчатку. Это внедрение в сетчатку вызывает разрушение фоторецепторов и может привести к кровоизлиянию со снижением зрения.

Одним из наиболее обычных видов лечения дегенерации желтого пятна является лазерная терапия. Лазерная терапия применяется для лечения зон неоваскуляризации, которые не распространяются на центральную область желтого пятна (центральная ямка). Однако после лазерной терапии часто происходит рецидив заболевания (МР8 Огоир, Агсй Орй1йа1то1.. Уо1. 109, рр. 1232-1241 (1991)). Кроме того, лазерная терапия может привести к возникновению остаточных скотом и поэтому не является оптимальным способом лечения неоваскуляризации в центральной области желтого пятна. Лишь ограниченное число пациентов отвечают критериям показаний для данного способа лечения, главным образом ввиду недостаточно выявленной или скрытой природы обычно наблюдаемой хориоидальной неоваскуляризации (Егеииб е1 а1., Атег. 1оиг. Орй1йа1то1., 115:786-791 (1993)). В качестве терапевтического средства испытывался также интерферон на основе известной активности факторов роста, таких как фактор роста фибробластов, в отношении стимуляции патологического ангиогенеза. Однако стойкий эффект не наблюдался (Кнкрайгк е1 а1., Вг. 1. Орй1йа1то1., 77:766-770 (1993); Сйаи е1 а1., Орй!йа1то1оду, 101:289-300 (1994)). Совсем недавно безуспешно завершились испытания по использованию трансформирующего фактора роста (ТФР) бета-2 для лечения дегенерации желтого пятна (Вю1есйио1оду №№та1сй, 1аииагу 1, 1996).

С быстрым старением населения дегенерация желтого пятна становится существенной проблемой общественного здравоохранения. В настоящее время нет способов излечения этого заболевания, и единственным принятым способом лечения, дающим менее чем удовлетворительные результаты, является лазерное лечение, хотя БЭЛ недавно одобрила талидомид для применения в клинических исследованиях на людях (Вс5сагс11С5 Босиз оп Маси1аг Эсдспсгайои: Соттоп Еуе РгоЬ1етз, Сапзез апб Тгеа!теп! 6е1 №\ν А!!еп!юп Ьу 8!еуеп 8!етЬегд, \Уаз1ипд1оп Рой Неа11й, Ос!оЬег 31, 1995). Сохраняется настоятельная потребность в способе эффективной медикаментозной терапии дегенерации желтого пятна.

Отек желтого пятна связан со многими видами глазных сосудистых заболеваний, таких как пигментный ретинит, диабетическая ретинопатия, воспаление ресничного кружка, обструкция вен сетчатки, старческий гиалит, и с внутриглазными хирургическими вмешательствами (Непктб, 8игу. Ор11111а1то1.. 28:431-2 (1984); Впб, 8игу. Орй1йа1то1., 28: 433-6 (1984); СипНа-Уах, 8игу. Орй!йа1то1., 28: 485-92 (1984)). Кистоидный отек желтого пятна является самым часто встречающимся осложнением после операций по поводу катаракты (Уапи/хг 8игу. Орй1йа1то1., 28: 540-53 (1984)) и, возможно, самой частой причиной потери зрения у пациентов, подвергающихся экстракции хрусталика (1атро1 е! а1., 8игу. ОрИйа1то1., 28: 535-9 (1984)). Кистоидный отек желтого пятна обычно самоограничивается, и даже в хронических случаях может произойти спонтанное улучшение (Уапи/хг 8игу. Орй!йа1то1., 28:540-53 (1984)). Однако у небольшой части пациентов (от 1 до 15%) может развиться необратимое повреждение и постоянная утрата зрительной функции (Уапих/1 е! а1., Орй1йа1то1оду, 88: 847-54 (1981)).

Отек желтого пятна является также причиной поздней потери зрения у пациентов с синдромом УодСКоуападСНагаба (УКН) (КШхеп е! а1., ЕКе!. апб Уй. ϋΐδ., 15(6): 475-479 (1995)). Отек желтого пятна тесно связан с микроаневризмами при диабетической ретинопатии, а у лиц, не страдающих диабетом - с серповидноклеточной анемией, окклюзией ответвляющихся вен, поражением сонных артерий или с тяжелой гипертонией (К1еш, Меб. С1ш. N. Ат., 72: 1415-1437 (1989)). При микроаневризмах часто происходит утечка липопротеинового материала, что приводит к образованию твердых эксудатов. Эти эксудаты появляются в виде рассеянной, агрегированной или кольцеподобной конфигурации. Когда эксудаты и жидкость накапливаются в задней части сетчатки, может развиться отек желтого пятна, который может вызвать значительное затуманивание зрения и привести к потере остроты зрения.

Для лечения областей отечной сетчатки, примыкающих к микроаневризмам, применяется лазерная процедура, называемая очаговой фотокоагуляцией. Было показано, что очаговая фотокоагуляция снижает частоту ухудшения остроты зрения на 60% у пациентов с клинически выраженным отеком желтого пятна, но у пациентов с отеком желтого пятна от средней до умеренной степени не наблюдался благоприятный эффект фотокоагуляции (Казкт е! а1., Апп. 1п!. Меб., 117(3): 226-233 (1992)). Операции на стекловидном теле могут улучшить прогноз для зрения только в случаях диабетического отека желтого пятна, связанного с патологической поверхностью раздела между стекловидным телом и желтым пятном (Уапейеп!егге е! а1., 1. Бгапса1з Ό Орй!йа1то1., 16(11): 602-610 (1993)). Проводилась оценка медикаментозных способов лечения отека желтого пятна, таких как оральное и местное применение индометацина (Мгга, Эгад 1п!е11. С1ш. Багт., 20: 548-550 (1986)), а также эритропоетина (Бпебтап е! а1., Атег. 1. К1бпеу Όίδ., 26(1): 202-208 (1995)), но существенный эффект не наблюдался. Существует потребность в способе эффективной медикаментозной терапии отека желтого пятна.

Хотя известно, что ФРСЭ играет некоторую роль в патологии некоторых глазных сосудистых расстройств, остается необходимость определить, обеспечит ли благоприятный терапевтический эффект при лечении таких глазных сосудистых расстройств ингибирование функции, вызываемое ФРСЭ. Настоящее изобретение показывает, что с помощью ингибирования активности ФРСЭ можно снизить патологический потенциал множества из этих глазных сосудистых расстройств.

Сущность изобретения

Целью изобретения является предоставление способов лечения глазных сосудистых расстройств.

Еще одной целью изобретения является предоставление способа ингибирования капиллярной проницаемости, связанной с отеком желтого пятна у млекопитающих.

Еще одной целью изобретения является предоставление способа ингибирования неоваскуляризации, вызванной фактором роста сосудистого эндотелия (ФРСЭ).

Эти и другие цели изобретения достигаются с помощью одного или более вариантов реализации, описанных ниже.

Согласно одному воплощению изобретения предоставляется способ лечения глазных сосудистых расстройств, который включает введение нуждающемуся в таком лечении млекопитающему терапевтически эффективного количества ингибитора изофермента β протеинкиназы С.

Согласно другому воплощению изобретения предоставляется способ печения дегенерации желтого пятна у млекопитающих, который включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества ингибитора изофермента β протеинкиназы С.

Согласно еще одному варианту воплощения изобретения предоставляется способ ингибирования капиллярной проницаемости, связанной с отеком желтого пятна у млекопитающих, который включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества ингибитора изофермента β протеинкиназы С.

Согласно еще одному воплощению изобретения предоставляется способ ингибирования фактора роста сосудистого эндотелия (ФРСЭ), который включает введение млекопитающему подавляющего ФРСЭ количества ингибитора изофермента β протеинкиназы С.

Настоящее изобретение обеспечивает технику соединениями, которые дают профилактический и лечебный эффект при различных глазных сосудистых расстройствах.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано подавляющее действие ингибитора ПКС, (8)-3,4-[К,К'-1,1'-((2-этокси3'(О)-4'-(К,К-диметиламино)-бутан)-бис-(3,3'индолил)]-1(Н)-пиррол-2,5-диона, на рост эндотелиальных клеток, стимулированный рекомбинантным ФРСЭ человека;

на фиг. 2 дополнительно показано подавляющее действие ингибитора ПКС, (8)-3,4[К,К’-1,1’-((2-этокси-3’^п(О)-4’^п-(К,К-диметиламино)-бутан)-бис-(3,3'-индолил)]-1 (Н)-пиррол2,5-диона, на рост эндотелиальных клеток, стимулированный рекомбинантным ФРСЭ человека;

на фиг. 3 показано воздействие ингибитора ПКС на активность эндогенного ФРСЭ, экспрессируемого после культивирования перицитов сетчатки в условиях гипоксии;

на фиг. 4 дополнительно показано подавляющее влияние ингибитора ПКС на рост эндотелиальных клеток, стимулированный рекомбинантным ФРСЭ человека;

на фиг. 5А, 5В показана динамика проницаемости сетчатки, вызванной ФРСЭ;

на фиг. 6 показана реакция проницаемости сетчатки для флюоресцеина на ФРСЭ;

на фиг. 7 показано действие ингибирования и стимуляции ПКС в стекловидном теле на проницаемость сетчатки;

на фиг. 8А, 8В показано ингибирование проницаемости сетчатки в ответ на ФРСЭ с помощью орально вводимого ингибитора протеинкиназы С β.

Подробное описание изобретения

Находкой согласно настоящему изобретению является то, что терапевтическое применение особого класса ингибиторов протеинкиназы С, а именно, ингибиторов изофермента β протеинкиназы С, и особенно, избирательных ингибиторов изофермента β протеинкиназы С, противодействует воздействиям ФРСЭ. В частно сти, открытием настоящего изобретения является то, что применение этого особого класса ингибиторов протеинкиназы С противодействует росту клеток эндотелия и капиллярной проницаемости, особенно, росту клеток эндотелия и капиллярной проницаемости, стимулированным фактором роста ФРСЭ. Следовательно, такие соединения могут применяться терапевтически для лечения заболеваний, связанных с ФРСЭ, в частности, множества глазных сосудистых расстройств.

В способе данного изобретения предпочтительно используются те ингибиторы протеинкиназы С, которые эффективно ингибируют или подавляют изофермент β. Одна подходящая группа соединений в общем описана в предшествующем уровне техники как бисиндолилмалеимиды или макроциклические бисиндолилмалеимиды. Бис-индолилмалеимиды, хорошо известные в предшествующем уровне техники, включают соединения, которые описаны в патентах США 5621098, 5552396, 5545636, 5481003, 5491242 и 5057614, и все они приведены здесь для сведения. Макроциклические бисиндолилмалеимиды, в частности, представлены соединениями формулы I. Эти соединения и способы их получения были раскрыты в патенте США 5552396, который здесь - для сведения. Эти соединения вводятся в терапевтически эффективном количестве млекопитающему для ингибирования роста клеток эндотелия или капиллярной проницаемости, связанных с ФРСЭ, и для подавления воздействий ФРСЭ, связанных с глазными заболеваниями. Эти соединения можно также вводить пациентам, подверженным риску упомянутых выше патологических состояний в качестве профилактических средств.

Один предпочтительный класс соединений для применения в способе изобретения представляет соединения формулы

в которой

Ш представляет -О-, -8-, -8О-, -8О₂-, -СО-, С₂-С₆алкилен, замещенный алкилен, С₂С₆алкенилен, -арил-, -арил(СН₂)_тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл-(СН₂)_тО-, -сконденсированный бициклический-, -сконцентрированный бициклический-(СН₂)_тО-, -ΝΚ³-, -КОК³-, -СОЫН- или -КНСО-;

Х и Υ представляют независимо С₁С₄алкилен, замещенный алкилен, или X, Υ и Ш скомбинированы вместе с образованием -(СН2)_ПЛЛ-;

К¹ радикалы представляют водород или до четырех необязательных заместителей, незави симо выбранных из галогена, С1-С₄алкила, гидрокси, С1-С₄алкокси, галогеналкила, нитро, \К⁴К' или -\Η(.'О(С'|-С₄алкил);

К² представляет водород, СН₃СО-, ΝΗ₂или гидрокси;

К³ представляет водород, (СН₂)_тарил, С₁С₄алкил, -СОО(С1-С₄алкил); «)ΝΙ<⁴ΙΓ.

-(Τ=ΝΗ)ΝΗ₂, -8О(С_гС₄алкил), -8Ο₂(ΝΚ⁴Κ⁵) или -8О₂(С₁-С₄алкил);

К⁴ и К⁵ представляют независимо водород, С₁-С₄алкил, фенил, бензил или комбинируются с азотом, с которым они связаны, образуя насыщенное или ненасыщенное 5- или 6-членное кольцо;

АА представляет аминокислотный остаток;

т представляет независимо 0, 1. 2 или 3; и η представляет независимо 2. 3. 4 или 5. или их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сложные эфиры.

Более предпочтительный класс соединений для применения в данном изобретении представлен формулой I. в которой фрагменты -X^-У- содержат от 4 до 8 атомов, которые могут быть замещенными или незамещенными. Более предпочтительно, фрагменты -Х-^-У- содержат 6 атомов.

Другие предпочтительные соединения для применения в способе данного изобретения являются соединениями формулы I. в которой К¹ и К² представляют независимо водород; и представляет замещенный алкилен, -О-, 8-. -^ΝΗ-. -ΝΗΟ- или -Ν!³. Особенно предпочтительными соединениями для применения в изобретении являются соединения формулы 1а

в которой Ζ представляет -^Η₂)_ρ- или - (СН₂)_рОДС^)^ К⁴ представляет гидрокси, -8Η. С1С4алкил, (СН2)тарил, -ХН(арил), ^(СН3)(СТ3). -ХН(СБ3) или NК⁵К⁶; К⁵ представляет водород или С1-С₄алкил; К⁶ представляет водород, С1-С4 алкил или бензил; р представляет 0. 1 или 2; и т представляет независимо 2 или 3. или их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сложные эфиры. Наиболее предпочтительными соединениями формулы 1а являются те, в которых Ζ представляет С112; а К⁴ представляет -ΝΗ2. ХН(СТ₃), или -Ν(ί.Ί 1₃)₂, или их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сложные эфиры.

Другие предпочтительные соединения для применения в способе настоящего изобретения представляют соединения, в которых в формуле I представляет -О-, Υ представляет замещенный алкилен, а Х представляет алкилен. Эти предпочтительные соединения представлены

в которой Ζ представляет -^Η₂)_ρ-; К⁴ представляет ИК⁵К⁶; -ХН(СТ3) или -Ы(СН3)(СР3); К⁵ и К⁶представляют независимо Н или С1-С₄алкил; р представляет 0. 1 или 2; а т представляет независимо 2 или 3. или их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сложные эфиры. Наиболее предпочтительными соединениями формулы 1Ь являются соединения, в которых р представляет 1; а К⁵ и К⁶ представляют метил.

Соединения формул I. 1а и 1Ь ввиду того, что они содержат основную часть или фрагмент, могут также существовать в виде фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей. Кислоты, обычно используемые для образования таких солей, включают неорганические кислоты, такие как хлористо-водородная, бромисто-водородная, иодисто-водородная, серная и фосфорная кислота, а также органические кислоты, такие как паратолуолсульфоновая, метансульфоновая, щавелевая, парабромфенилсульфоновая, карбоновая, янтарная, лимонная, бензойная, уксусная кислота и родственные неорганические и органические кислоты. Такие фармацевтически приемлемые соли, таким образом, включают сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, иодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формат, изобутират, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберинат, себацинат, фумарат, малеат, 2-бутин-1,4-диоат, 3-гексин-2,5-диоат, бензоат, хлорбензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, ксилолсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гиппурат, β-гидроксибутират, гликолят, малеат, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталин-1 -сульфонат, нафталин-2сульфонат, манделат и аналогичные. Особенно применяются хлористо-водородная соль и мезилат.

В дополнение к фармацевтически приемлемым солям могут также существовать другие соли. Они могут служить в качестве промежуточных продуктов при очистке соединений, при получении других солей или при идентификации и характеристике соединений или промежуточных продуктов.

Фармацевтически приемлемые соли соединений формул I. 1а и Ή могут также сущест вовать в виде различных сольватов, таких как с водой, метанолом, этанолом, диметилформамидом, этилацетатом и аналогичными. Могут также получаться смеси таких сольватов. Источником такого сольвата может быть растворитель кристаллизации, присущий растворителю получения или кристаллизации, или дополнительный к такому растворителю.

Признано, что могут существовать различные стереоизомерные формы соединений формул I, 1а и 1Ь; например, может содержать хиральный атом углерода в замещенной алкиленовой части. Соединения обычно получаются в виде рацематов и могут удобно использоваться в этом виде. Альтернативно, по желанию, с помощью обычных методик могут выделяться или синтезироваться индивидуальные энантиомеры. Такие рацематы и индивидуальные энантиомеры и их смеси образуют часть соединений, используемых в способах настоящего изобретения.

Соединения, используемые в данном изобретении, также охватывают фармацевтически приемлемые пролекарства соединений формул I, 1а и 1Ь. Пролекарство представляет собой лекарство, которое подвергнуто химической модификации и может быть биологически неактивным в участке его действия, но которое может разрушаться или модифицироваться под влиянием одного или более ферментных или других процессов ΐη νΐνο с образованием исходной родительской или биоактивной формы. Вероятно, это пролекарство может иметь фармакокинетический профиль, отличный от родительского, обеспечивая облегчение всасывания через эпителий слизистой оболочки, лучшее образование соли или лучшую растворимость и/или улучшенную системную устойчивость (например, увеличение периода полувыведения из плазмы). Обычно такие химические модификации включают следующие:

1) сложноэфирные или амидные производные, которые могут расщепляться эстеразами или липазами;

2) пептиды, которые могут распознаваться специфичными или неспецифичными протеазами; или

3) производные, которые накапливаются в участке действия посредством мембранной селекции пролекарственной формы или модифицированной пролекарственной формы; или любую комбинацию приведенных выше модификаций 1-3. Обычные способы отбора и получения подходящих производных пролекарств описаны, например, в работе Н. Випдаагб, Эезщп о£ Ргобги§8, (1985).

Синтез различных бис-индол-Ы-малеимидных производных описан в патенте США 5057614, выданном ^аν^8 е! а1., а синтез предпочтительных соединений, подходящих для использования в этом изобретении, описан в ранее указанном патенте США 5552396 и в описании

ЕР 0657411 А1, выданного Еаи1 е! а1., все из которых приведены здесь для сведения.

Одним особенно предпочтительным ингибитором протеинкиназы-β для использования в способе данного изобретения является соединение, описанное в примере 5д (хлористо-водородная соль (8)-3,4-[Ы,Ы'-1,Г-((2-этокси)-3'(О)4'-(Ы,Ы-диметиламино)-бутан)-бис-(3,3'-индолил)]-1(Н)-пиррол-2,5-диона) упомянутого выше патента США 5552396. Это соединение является мощным ингибитором протеинкиназы С. Оно является селективным по отношению к протеинкиназе С, в сравнении с другими киназами и является высоко изоферментселективным, т.е. оно является селективным в отношении бета-1 и бета-2 изоферментов. Благоприятны также другие соли данного соединения, особенно мезилатные соли.

Предпочтительная мезилатная соль может быть получена с помощью реакции соединения формулы II

с метансульфоновой кислотой в не реакционноспособном органическом растворителе, предпочтительно смеси органического растворителя и воды, и наиболее предпочтительно водаацетон. Могут применяться и другие растворители, такие как метанол, ацетон, этилацетат и их смеси. Соотношение растворителя и воды не имеет принципиального значения и обычно определяется растворимостью реагентов. Предпочтительные соотношения растворителя и воды обычно составляют в интервале от 0,1:1 до 100:1 по объему. Предпочтительно, соотношение составляет от 1:1 до 20:1, и наиболее предпочтительно от 5:1 до 10:1. Оптимальное соотношение зависит от выбранного растворителя, и предпочтительным является ацетон при соотношении растворителя и воды 9:1.

В реакции обычно участвуют эквимолярные количества двух реагентов, хотя могут применяться другие соотношения, особенно такие, при которых имеется избыток метансульфоновой кислоты. Скорость добавления метансульфоновой кислоты не имеет принципиального значения для реакции, и она может добавляться быстро (<5 мин) или медленно в течение 6 ч или более. Реакция проводится при температурах в диапазоне от 0°С до температуры дефлегмации. Реакционная смесь перемешивается до тех пор, пока не завершится образование соли, что определяется по данным порош ковой рентгенограммы и может занимать от 5 мин до 12 ч.

Соли настоящего изобретения предпочтительно и легко получаются в кристаллической форме. Тригидратную форму соли можно легко превратить в моногидрат после сушки или воздействия относительной влажности от 20 до 60%. Соль является, по существу, кристаллической, имеющей определенную точку плавления, двойное лучепреломление и характер рентгеновской дифракции. Обычно кристаллы имеют менее чем 10% аморфного твердого вещества, предпочтительно менее чем 5% и наиболее предпочтительно менее чем 1% аморфного твердого вещества.

Мезилатная соль выделяется с помощью фильтрования или других признанных в данной области техники приемов разделения непосредственно из реакционной смеси с выходом в диапазоне от 50 до 100%. При желании для дальнейшей очистки могут применяться перекристаллизация и другие приемы очистки, известные в данной области.

Эндотелиальные клетки в тканевой культуре, стимулированные факторами роста, такими как ФРСЭ, проявляют более высокую скорость роста, чем скорость роста базальных клеток. Эксперименты, выполненные согласно настоящему изобретению, показали, что при введении ίη νίΐτο в концентрации приблизительно от 0,1 до 100 нмоль, ингибитор протеин киназы С кислотная соль (§)-3,4-Щ,№-1,1'-((2-этокси)3'(О)-4'-ЩА-диметиламино)-бутан)-бис-(3,3'индолил)] -1 (Н)-пиррол-2,5 -диона значительно ингибирует рост не базальных клеток, стимулированных фактором роста (таким как ФРСЭ).

Важно, другие исследования показали, что рост нормальных эндотелиальных клеток в тканевой культуре не ингибируется этим соединением, по данным отсутствия ингибирования роста эндотелиальных клеток без стимуляции ФРСЭ в нормоксических кондиционированных средах. В гипоксических кондиционированных средах скорость клеточного роста возрастает вследствие увеличения содержания эндогенного фактора роста, ФРСЭ, вырабатываемого гипоксическими клетками. И снова ингибитор протеинкиназы С, кислотная соль (δ)-3,4-[Ν,Ν'-1,1'((2 -этокси)-3 '(О) -4' -(Ν,Ν-диметиламино)бутан)-бис-(3,3'-индолил)]-1 (Н)-пиррол-2,5диона, нормализует клеточный рост, вызванный такими гипоксическими условиями.

Эксперименты, предоставленные в настоящем изобретении, показывают, что факторы роста, такие как ФРСЭ, также воздействуют на капиллярную проницаемость. Исследования показали, что в экспериментальной модели ФРСЭ значительно увеличивает капиллярную проницаемость, вплоть до трехкратного уровня. Это зависимое от ФРСЭ увеличение капиллярной проницаемости также является дозозависимым. В соответствии с исследованиями на жи вотных ίη νίνο, введение ингибитора протеинкиназы С в концентрации приблизительно 25 мг/кг/день перед провокационной пробой с введением ФРСЭ значительно ингибировало капиллярную проницаемость, вызванную ФРСЭ. Особенно предполагается применение концентраций от 1 нмоль до 5 ммоль и предпочтительно от 1 до 500 нмоль. Ингибирование может достигать 80% и обычно специфично для капиллярной проницаемости, вызванной фактором роста. Капиллярную проницаемость можно измерить с помощью ангиографии с флюоресцеином. В частности, при отеке желтого пятна ангиография с флюоресцеином является процедурой фотографирования сетчатки, включающей инъекцию флюоресцентного красителя в поток крови для выявления зон утечки в сетчатку.

Хотя и не желая ограничиваться какимлибо техническим объяснением, заявитель (заявители) считают, что изменения перфузии сетчатки, возникающие вследствие сниженного кровотока, потеря капилляров сетчатки, агенез или облитерация периферической сосудистой системы или отделения хориоидального кровоснабжения от сетчатки - все это может в результате привести к относительной ишемии сетчатки. Эта ишемия стимулирует синтез и секрецию факторов роста, таких как ФРСЭ в перицитах сетчатки, эндотелиальных клетках, пигментном эпителии сетчатки, клетках глии и, возможно, в других типах клеток; и впоследствии ведет к неоваскуляризации сетчатки и повышенной капиллярной проницаемости. Эти состояния связаны со множеством глазных сосудистых расстройств.

Ингибиторы β изофермента ПКС согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения болезненных состояний, связанных с ростом эндотелиальных клеток и капиллярной проницаемости, особенно множества глазных сосудистых расстройств.

Глазные сосудистые расстройства, которые можно лечить с помощью соединений настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются, дегенерацию желтого пятна, отек желтого пятна, сосудистую ретинопатию, окклюзию вен сетчатки, неоваскуляризацию радужной оболочки, гистоплазмоз и ишемические заболевания сетчатки. Дегенерация желтого пятна может быть возрастной. Отек желтого пятна может быть связан с диабетом или окклюзией центральной вены сетчатки. Используемая здесь фраза сосудистая ретинопатия не включает диабетическую ретинопатию, но включает сосудистую ретинопатию, связанную с серповидноклеточной анемией, недоношенностью (преждевременным развитием) младенцев и неоваскуляризацией угла или трабекулярной сети. Неоваскуляризация радужной оболочки может быть диабетической или не связанной с диабетом.

Специалист в данной области очевидно понимает, что терапевтически эффективное количество ингибиторов протеинкиназы С-β, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой количество, достаточное для ингибирования роста эндотелиальных клеток или развития проницаемости капилляров путем ингибирования ФРСЭ, и что данное количество варьирует в зависимости от размера пораженной ткани, концентрации соединения в терапевтической готовой форме и массы тела пациента. Обычно количество ингибитора β изофермента протеинкиназы С, вводимого в качестве терапевтического средства для лечения глазных сосудистых расстройств, определяется в каждом случае лечащим врачом. В качестве руководства при установлении соответствующей дозы будут рассматриваться степень неоваскуляризации, масса тела и возраст пациента.

Обычно подходящей дозой является доза, которая дает концентрацию ингибитора β изофермента протеинкиназы С в участке лечения, в диапазоне от 0,5 нмоль до 200 мкмоль, а более обычно от 0,5 до 200 нмоль. Ожидается, что в большинстве случаев должна быть достаточной концентрация в сыворотке от 0,5 до 100 нмоль.

Для получения этих лечебных концентраций нуждающемуся в лечении пациенту, вероятно, будет вводиться приблизительно от 0,001 мг в день на 1 кг массы тела до 50,0 мг в день на 1 кг. Обычно потребуется не более чем приблизительно от 1,0 до 10,0 мг в день на 1 кг массы тела ингибитора протеинкиназы С-β. Как отмечалось выше, указанные количества могут варьировать от случая к случаю.

Соединения формулы I и предпочтительные соединения формулы 1а и 1Ь предпочтительно преобразуются в готовые формы или препараты перед введением. Подходящие фармацевтические готовые формы получают с помощью известных способов с использованием хорошо известных и легко доступных ингредиентов. При приготовлении композиций, подходящих для применения в способе настоящего изобретения, активный ингредиент обычно смешивается с носителем или разбавляется носителем, или помещается внутрь носителя, который может быть в форме капсулы, саше, бумаги или другого контейнера. Когда носитель служит в качестве разбавителя, он может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, который действует в качестве носителя, наполнителя или среды для активного ингредиента. Так композиции могут быть в форме таблеток, пилюль, порошков, пастилок, саше, каше, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозоля (в виде твердого вещества или в жидкой среде), мягких и твердых желатиновых капсул, в форме свечей, стерильных растворов для инъекций и стерильных упакованных порошков или для орального, или для местного применения.

Некоторые примеры подходящих носителей, эксципиентов и разбавителей включают лактозу, декстрозу, сахарозный сорбит, маннит, крахмалы, камедь акации, фосфаты кальция, альгинат, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, водный сироп, метилцеллюлозу, метил и пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Готовые формы могут дополнительно включать смазочные агенты, увлажняющие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подслащивающие средства или агенты или ароматизирующие средства. Композиции изобретения могут составляться так, чтобы обеспечить быстрое, длительное или отсроченное высвобождение активного ингредиента после введения пациенту. Композиции предпочтительно составляются в форме единичной дозы, причем каждая доза содержит от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 3 г, более обычно приблизительно 750 мг активного ингредиента. Однако следует понимать, что введенная терапевтическая доза определяется врачом с учетом соответствующих обстоятельств, включая тяжесть подлежащего лечению состояния, выбор подлежащего введению соединения и выбранный путь введения. Поэтому указанные выше диапазоны дозировки никоим образом не предназначены для ограничения объема притязаний изобретения. Термин форма единичной дозы относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве стандартных доз для людей и других млекопитающих, причем каждая единица содержит заданное количество активного материала, рассчитанное с целью вызвать желательный терапевтический эффект, в сочетании с подходящим фармацевтическим носителем.

В дополнение к указанным выше готовым формам, большинство из которых может вводиться орально, соединения, применяемые в способе настоящего изобретения, могут также применяться местно. Формы для местного применения включают мази, кремы и гели.

Мази обычно получают с использованием или 1) маслянистой основы, т.е. основы, состоящей из фиксированных масел или углеводородов, таких как белый вазелин, или минеральное масло, или 2) абсорбентной основы, т. е. основы, состоящей из безводного вещества или веществ, которые могут поглощать воду, например, безводный ланолин. Обычно после образования основы, маслянистой или абсорбентной, добавляется активный ингредиент (соединение) в количестве, обеспечивающем желаемую концентрацию.

Кремы представляют собой масляно/водную эмульсию. Они состоят из масляной фазы (внутренней фазы), обычно включающей фиксированные масла, углеводороды и аналогичные, такие как воски, вазелин, минеральное масло и аналогичные, и водную фазу (непрерывная фаза), включающую воду и любые водорастворимые вещества, такие как соли. Эти две фазы стабилизируются с использованием эмульгирующего средства, например поверхностноактивного вещества, такого как натрийлаурилсульфат, гидрофильные коллоиды, такие как коллоидные глины акации, камедь и аналогичные. После составления эмульсии обычно добавляется активный ингредиент (соединение) в количестве, необходимом для достижения желательной концентрации.

Гели включают основу, выбранную из маслянистой основы, воды или эмульсионносуспензионной основы. К основе добавляется желирующее средство, которое формирует в основе матрицу, увеличивая ее вязкость. Примерами желирующих агентов являются гидроксипропилцеллюлоза, полимеры акриловой кислоты и аналогичные. Обычно активный ингредиент (соединения) добавляется в готовую форму в желательной концентрации в момент, предшествующий добавлению желирующего агента.

Количество соединения, включаемого в готовую форму для местного применения, не имеет принципиального значения; концентрация должна быть в диапазоне, достаточном для обеспечения возможности быстрого нанесения готового препарата на область пораженной ткани в количестве, которое доставит желаемое количество соединения в желаемый участок лечения.

Обычное количество готовой формы для местного применения, которое предполагается нанести на пораженную ткань, зависит от размера пораженной ткани и концентрации соединения в форме. Обычно готовый препарат наносится на пораженную ткань в количестве, обеспечивающем приблизительно от 1 до 500 мкг соединения на 1 см² пораженной ткани. Предпочтительно нанесенное количество соединения находится в диапазоне приблизительно от 30 до 300 мкг/см², более предпочтительно приблизительно от 50 до 200 мкг/см² и наиболее предпочтительно приблизительно от 60 до 100 мкг/см².

Следующие примеры готовых форм или препаратов являются только иллюстративными и никоим образом не предназначены для ограничения объема притязаний согласно изобретению.

Готовая форма

Твердые желатиновые капсулы изготовлены с использованием следующих ингредиентов: Количество (мг/капсулу)

Активное средство250

Крахмал высушенный200

Стеарат магния10

Всего 460 мг

Указанные ингредиенты смешивают и ими в количествах 460 мг заполняют твердые желатиновые капсулы.

Готовая форма

Таблетка изготавливается с использованием указанных ниже ингредиентов:

Количество (мг/капсулу)

Активное средство250

Целлюлоза микрокристаллическая400

Двуокись кремния мелкодисперсная10

Стеариновая кислота5

Всего 665 мг

Компоненты смешивают и прессуют для образования таблеток, масса каждой из которых составляет 665 мг.

Готовая форма

Таблетки, каждая из которых содержит 60

мг активного ингредиента,	изготавливаются
следующим образом:	Количество (мг/капсулу)
Активное средство	60 мг
Крахмал	45 мг
Микрокристаллическая целлюлоза Поливинилпирролидон (в виде	35 мг
10% раствора в воде) Растворимый крахмал натрийкар-	4 мг
боксиметил	4,5 мг
Стеарат магния	0,5 мг
Тальк	1 мг
Всего	150 мг

Активный ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сито № 45 меш США и тщательно смешивают. Раствор поливинилпирролидона смешивают с полученными в результате порошками, которые пропускают через сито № 14 меш США. Полученные таким образом гранулы сушат при 50°С и пропускают через сито № 18 меш США. Растворимый крахмал, стеарат магния и тальк, ранее пропущенные через сито № 60 меш США, затем добавляют в гранулы, которые после смешивания прессуют с помощью таблетирующего устройства для получения таблеток, каждая из которых имеет массу 150 мг.

Примеры

Все эти примеры демонстрируют использование хлористо-водородной соли (8)-3,4|НИ-1,Г-((2-этокси)-3' (О)-4' -(Ν,Ν-диметиламино)-бутан) -бис-(3,3'-индолил)]-1 (Н) -пиррол-

2,5-диона для ингибирования ίη νίΐτο роста эндотелиальных клеток и ингибирования ίη νίνο увеличенной капиллярной проницаемости, стимулированной ФРСЭ.

Пример 1.

В данном примере ингибирующий эффект указанного соединения в отношении роста клеток, стимулированного ФРСЭ, исследуют с использованием рекомбинантного человеческого ФРСЭ.

Бычьи эндотелиальные клетки сетчатки выделяют из свежих глаз телят с помощью гомогенизации и серии этапов фильтрации. Первичные культуры эндотелиальных клеток выращивают в покрытых фибронектином (ΝΥΒβη Веадейк. Νο\ν Уотк В1ооб СсгИсг) чашках (Со81ат), содержащих модифицированную среду Ои1Ьессо'5 Еад1е'§ (ΌΜΕΜ) с 5,5 ммоль глюкозы, 10% полученной из плазмы лошадиной сыворотки (\У11еа1оп. БаеиНДс). 50 мг гепарина на 1 л и 50 единиц фактора роста эндотелиальных клеток на 1 л (Воейпидет МаииНет). После того, как клетки достигнут слияния, среду меняют, включая 5% сыворотки плода теленка (НуС1оис). Среду меняют 1 раз в 3 дня. Гомогенность эндотелиальных клеток подтверждают с помощью антител против фактора VIII.

Влияние указанного ингибитора ПКС на действие ФРСЭ ш уйто оценивают с использованием высеянных с низкой плотностью на чашки культур микрососудистых эндотелиальных клеток бычьей сетчатки, которые претерпевают стимуляцию роста после добавления ФРСЭ. Эндотелиальные клетки бычьей сетчатки высевают с низкой плотностью (-2500 клеток на 1 ячейку или лунку) на 24-луночные чашки (Со81ат). инкубированные в течение ночи в ΌΜΕΜ. содержащей 10% телячью сыворотку (С1ВСО). Среду меняют на следующий день.

Для исследования воздействия указанного ингибитора ПКС на рост эндотелиальных клеток, проводят одну серию экспериментов, в которой рост клеток в отсутствие какого-либо средства служит в качестве контроля, а затем исследуют воздействие добавления указанного ингибитора ПКС и в присутствии ВРСЭ (25 нг/мл; Сеие1есй). и в отсутствие ФРСЭ. После инкубации при 37°С в течение 4 дней клетки лизируют в 0.1% додецилсульфате натрия (НДС) и измеряют содержание ДНК с использованием красителя НоесйЧ 33258 и флюорометра (модель ТКО-100; НоеГег).

Все определения выполняют, по меньшей мере, трижды и эксперименты повторяют минимум три раза. Результаты выражают в виде средних ± стандартное отклонение по всем экспериментам. Анализ результатов ш уйто выполняют с помощью непарного теста по Стьюденту. Величину Р, составляющую <0,050. считают статистически достоверной.

На фиг. 1 показаны результаты, полученные с использованием рекомбинантного ФРСЭ. Как показано тремя самыми левыми столбиками на фигуре, добавление указанного ингибитора ПКС в культуру эндотелиальных клеток, по существу, не оказывало воздействия на исходную скорость роста (первый столбик). Скорость роста существенно возросла после добавления ФРСЭ (четвертый столбик). Эта скорость роста значительно уменьшается после добавления >0.5 нмоль указанного ингибитора ПКС (четыре самых правых столбика).

Пример 2.

Этот пример аналогичен работе, представленной на фиг. 1 , и дополнительно иллюстрирует ингибирующее влияние указанного ингибитора ПКС на рост клеток, стимулированный ФРСЭ, с использованием рекомбинантного человеческого ФРСЭ.

Используя процедуры примера 1. выделяют и выращивают бычьи эндотелиальные клетки сетчатки; затем получают засеянные на чашки культуры с низкой плотностью. Опять же используя процедуру примера 1. проводят эксперименты, в которых исследуют влияние указанного ингибитора ПКС на рост эндотелиальных клеток и в присутствии ФРСЭ (25 нг/мл; Сеие1есй). и в отсутствие ФРСЭ. После инкубации при 37°С в течение 4 дней клетки лизируют в 0.1% додецилсульфате натрия (НДС) и измеряют содержание ДНК с использованием красителя НоесйЧ 33258 и флюорометра (модель ТКО-100; НоеГег).

На фиг. 2 показаны результаты этой работы. Как показано столбиками над подписью -ФРСЭ, добавление указанного ингибитора ПКС в культуру эндотелиальных клеток при концентрации от 0.1 до 100 нмоль, по существу, не оказывало воздействия на исходную скорость роста клеток. Стимуляция эндотелиальных клеток рекомбинантным человеческим ФРСЭ (25 нг/мл) вызывала достоверное увеличение содержания клеточной ДНК через 4 дня, что указывает на увеличение скорости роста, в сравнении с нестимулированными клетками (сравните -ФРСЭ при 0 с +ФРСЭ при 0). Эта скорость роста значительно уменьшается после добавления указанного ингибитора ПКС (четыре самых правых столбика над надписью +ФРСЭ). В частности, стимулирующая способность ФРСЭ слегка снижалась в присутствии 0.1 нмоль ингибитора ПКС и, по существу, полностью устранялась одновременным добавлением ингибитора ПКС в концентрации 1 нмоль и выше.

Пример 3.

В этом примере исследуют воздействие указанного ингибитора ПКС на активность эндогенного ФРСЭ, экспрессируемую после культивации перицитов сетчатки в условиях гипоксии.

Бычьи эндотелиальные клетки сетчатки и перициты сетчатки выделяют из свежих глаз телят с помощью гомогенизации и серии этапов фильтрации. Используя процедуры примера 1. эндотелиальные клетки выращивают и с низкой плотностью культивируют на чашках. Используя аналогичные методики, перициты бычьей сетчатки культивируют в ΌΜΕΜ/5.5 ммоль глюкозы с 20% сыворотки плода теленка.

Гипоксическую кондиционированную среду для экспрессии эндогенного ФРСЭ и нормоксическую кондиционированную контрольную среду соответственно готовят, выполняя следующие процедуры. Слившиеся монослои пе рицитов сетчатки подвергают воздействию в течение 24 ч 2% О₂/5% СО₂/93% Ν₂ с использованием совершенного, контролируемого компьютером инкубатора СО₂ ЬаЬ-Ьше ИтЛгитспй с инфракрасной водяной рубашкой и контролем пониженного содержания кислорода (модель 480). Все клетки сохранялись при 37°С и при световой микроскопии в них не было никаких морфологических изменений, они исключали краситель трипан синий (>98%) и в последующем их можно было нормально пересевать. Клетки, инкубированные в нормоксических условиях (95% воздуха/5% СО₂) из той же партии и пересева используют в качестве контролей. Среду затем собирают и перед использованием фильтруют (№11депе: 0,22 мкм).

В этом примере проводят эксперименты, в которых исследуют воздействие указанного ингибитора ПКС на рост эндотелиальных клеток в присутствии или нормоксической кондиционированной среды, или гипоксической кондиционированной среды. Как и в предыдущих экспериментах, после инкубации при 37°С в течение 4 дней клетки лизируют в 0,1% додецилсульфате натрия (НДС) и измеряют содержание ДНК с использованием красителя НоеейЧ 33258 и флюорометра (модель ТКО-100; НоеГег).

В исследованиях, представленных на фиг. 3, указанный ингибитор ПКС используют в концентрации 10 нмоль. Как показано на фиг. 3, рост эндотелиальных клеток сетчатки стимулируется кондиционированной средой из перицитов сетчатки, культивированных в гипоксических условиях, которые, как известно, вызывают экспрессию ФРСЭ (сравните столбик 1 со столбиком 3 на фиг. 3). Эта стимуляция роста подавляется (нормализуется) в присутствии соли хлористо-водородной кислоты (8)-3,4-[Ν,Ν'1,Г-((2-этокси)-3'(О)-4'-(Ч№диметиламино)бутан)-бис-(3,3'-индолил)]-1 (Н)-пиррол-2,5диона ингибитора ПКС (сравните столбик 3 со столбиком 4).

Пример 4.

Этот пример аналогичен работе, представленной на фиг. 1 и 2, и дополнительно иллюстрирует ингибирующее действие указанного ингибитора ПКС на рост клеток, стимулированный ФРСЭ, с использованием рекомбинантного человеческого ФРСЭ.

Используя процедуру примера 1, выделяют и выращивают бычьи эндотелиальные клетки сетчатки; затем получают культуры, высеянные с низкой плотностью на чашки. Опять же, используя процедуру примера 1, проводят эксперименты, в которых исследуют влияние указанного ингибитора ПКС на рост эндотелиальных клеток и в присутствии (+ФРСЭ)(25 нг/мл; Сепе1ее11). и в отсутствие ФРСЭ (-ФРСЭ). Как указано выше, после инкубации при 37°С в течение 4 дней клетки лизируют в 0,1% додецилсульфате натрия (НДС), и измеряют содержание ДНК с использованием красителя НоеейЧ 33258 и флюорометра (модель ТКО-100; НоеГег).

На фиг. 4 показаны результаты этой работы. Как показано столбиками над подписью -ФРСЭ, добавление указанного ингибитора ПКС в культуру эндотелиальных клеток при концентрации 10 нмоль, по существу, не оказывало воздействия на исходную скорость роста клеток. Стимуляция эндотелиальных клеток рекомбинантным человеческим ФРСЭ (25 нг/мл) вызывала достоверное увеличение содержания клеточной ДНК, что указывает на увеличение скорости роста, в сравнении с нестимулированными клетками (сравните -ФРСЭ контроль с +ФРСЭ контролем). Эта скорость роста значительно уменьшается после добавления указанного ингибитора ПКС в концентрации 10 нмоль. Эти результаты показывают, что раскрытый класс ингибиторов ПКС и, в частности, (8)-3,4[ЧЧ-1,Г-((2-этокси)-3' (О)-4' -(Ν,Ν-диметиламино)-бутан) -бис-(3,3'-индолил)]-1 (Н) -пиррол-

2,5-дион предотвращает стимуляцию ίη νίΐτο роста эндотелиальных клеток, как экзогенным, так и индуцированным гипоксией ФРСЭ. Поскольку экспрессия ФРСЭ была тесно связана с неоваскуляризацией, связанной с дегенерацией желтого пятна, эти результаты подтверждают пользу данных ингибиторов ПКС в качестве терапии для лечения дегенерации желтого пятна.

Пример 5.

Этот пример показывает динамику проницаемости сетчатки, индуцируемой ФРСЭ.

В один глаз каждой крысы внутрь стекловидного тела производят инъекцию 2,0 нг ФРСЭ (определенная конечная концентрация 25 нг/мл). В противоположный глаз вводят аналогичный объем контрольного раствора. Через 10 мин через катетер в правую яремную вену производят инъекцию 30 микролитров флюоресцеина. Флюорофотометрию стекловидного тела выполняют в указанные отрезки времени после инъекции флюоресцеина.

Как показано на фиг. 5А, в глазах, обработанных ФРСЭ, наблюдается отчетливое увеличение проницаемости флюоресцеина в стекловидное тело. Это становится статистически достоверным в пределах 10 мин после ангиограмной инъекции флюоресцеина и сохраняется в течение, по меньшей мере, 30 мин. На фиг. 5В показано, что эта стимуляция, выраженная в процентах от контроля, демонстрирует наличие дополнительной утечки флюоресцеина в глазах, обработанных ФРСЭ, с течением времени.

Пример 6.

Этот пример показывает дозозависимую реакцию проницаемости сетчатки на флюоресцеин в ответ на ФРСЭ.

В один глаз каждого животного производят инъекцию контрольного раствора, тогда как в противоположный глаз производят инъекцию различных доз ФРСЭ. Через 10 мин производят внутривенную инъекцию флюоресцеина и через 30 мин анализируют количество утечки в стекловидное тело. Как показано на фиг. 6, наблюдалось дозозависимое увеличение проницаемости сетчатки. Стимуляция была максимальной от 14 до 20 нг/мл, что, как известно, можно получить у людей.

Пример 7.

Этот пример показывает эффект ингибитора ПКС, хлористо-водородной соли (8)-3,4[Ν,Ν'- 1,1'-((2-этокси)-3 ”’(О)-4’-(НХ-диметиламино)-бутан)-бис-(3,3'-индолил)]-1(Н)-пиррол-

2,5-диона при введении в стекловидное тело и стимуляции ПКС проницаемости сетчатки.

Как указано на фиг. 1, в глаза крыс производят инъекцию или 2,0 нг ФРСЭ на 1 глаз, 10 нмоля ПКС β ингибитора, или одного микрограмма РЭБи (агониста ПКС). Инъекцию ПКС β ингибитора производят за 15 мин до добавления ФРСЭ. Через 10 мин после добавления ФРСЭ производят внутривенно введение флюоресцеина и через 30 мин оценивают содержание флюоресцеина в стекловидном теле.

Как показано на фиг. 7, внутривенная инъекция ФРСЭ выявила ожидаемую стимуляцию проницаемости сетчатки. Инъекция ПКС β ингибитора в стекловидное тело за 15 мин до инъекции ФРСЭ устраняла большую часть реакции в виде увеличения проницаемости. Прямая стимуляция протеинкиназы С путем инъекции РЭБи показала увеличение проницаемости, очень похожее на ФРСЭ.

Пример 8.

Этот пример демонстрирует ингибирование проницаемости сетчатки в ответ на ФРСЭ под воздействием орального введения хлористо-водородной соли (8)-3,4-[Ν,Ν'-1,1'-((2этокси)-3'(О)-4'-(Н^диметиламино)-бутан)бис-(3,3'-индолил)]-1 (Н)-пиррол-2, 5 -диона.

Крыс кормят кормом, смешанным с ингибитором β протеинкиназы С в дозах, указанных на фиг. 8 А и 8В. После такого кормления в течение 1 недели, как обсуждалось ранее, определяют проницаемость сетчатки в ответ на внутривенную инъекцию 2,0 нг ФРСЭ. Оральное введение ингибитора β ПКС этого изобретения в течение одной недели снижало проницаемость сетчатки в ответ на ФРСЭ. Это было наиболее заметно при более высоких дозах.

В предшествующем описании раскрыты принципы, предпочтительные варианты реализации и виды практического применения. Однако изобретение, защита которого предполагается в данном случае, не должно рассматриваться как ограниченное конкретными раскрытыми формами, поскольку они должны расцениваться как иллюстративные, а не ограничивающие. Специалисты в данной области могут вносить вариации и изменения, не отходя от существа изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения глазных сосудистых расстройств, выбранных из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, отека желтого пятна, сосудистой ретинопатии, неоваскуляризации радужной оболочки, окклюзии вен сетчатки, гистоплазмоза и ишемической болезни сетчатки, который включает введение нуждающемуся в таком лечении млекопитающему терапевтически эффективного количества ингибитора β изофермента протеинкиназы С следующей формулы в которой представляет -О-, -8-, -80-, -8О₂-, -СО-, С2-С6алкилен, замещенный алкилен, С2С₆алкенилен, -арил-, -арил(СН₂)_тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл-(СН₂)_тО-, -сконденсированный бициклический-, -сконденсированный бициклический-(СН₂)_тО-, -ΝΚ³-, -ΝΟΚ³-, -ΟΟΝΗили -ХНСО-,

Х и Υ представляют независимо С₁С₄алкилен, замещенный алкилен или X, Υ и скомбинированы вместе, образуя -(СН₂)_ПАА-,

Κ¹ радикалы представляют водород или до четырех необязательных заместителей, независимо выбранных из галогена, СгС4алкила, гидрокси, С1-С4алкокси, галогеналкил, нитро, ΝΚ⁴Κ⁵ или -ННСО(С1-С4алкила),

Κ² представляет водород, СН₃СО-, ΝΗ₂или гидрокси,

Κ³ представляет водород, (СН₂)_тарил, С₁С₄алкил, СОО(С1-С₄алкил), -СО\1<¹1<⁵,

-(С=ЯН)КН2, -8О(С1-С4алкил), -8Ο2(ΝΚ⁴Κ⁵) или -8О₂(С₁-С₄алкил),

Κ⁴ и Κ⁵ представляют независимо водород, С₁-С₄алкил, фенил, бензил или скомбинированы с азотом, с которым они связаны, образуя насыщенное или ненасыщенное 5- или 6-членное кольцо,

АА представляет аминокислотный остаток, т представляет независимо 0, 1, 2 или 3, а η представляет независимо 2, 3, 4 или 5, или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сложный эфир.
2. Способ по п.1, в котором ингибитор β изофермента протеинкиназы С представляет собой бис-индолилмалеимид или макроциклический бис-индолилмалеимид.
3. Способ по п.1, в котором ингибитор является изофермент-селективным и изофермент выбран из группы, состоящей из изоферментов бета-1 и бета-2.
4. Способ по п.3, в котором ингибитор протеинкиназы С представляет соединение, имеющее следующую формулу

Р^г в которой представляет -О-, -8-, -8О-, -8О₂-, -СО-, С₂-С₆алкилен, замещенный алкилен, С₂С₆алкенилен, -арил-, -арил(СН₂)_тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл-(СН₂)_тО-, -сконденсированный бициклический-, -сконденсированный бициклический-(СН₂)_тО-, -ΝΚ³-, -ΝΟΚ³-, -СОЫН- или -ЫНСО-,

Х и Υ представляют независимо С_гС₄алкилен, замещенный алкилен, или X, Υ и скомбинированы вместе, образуя -(СН₂)_ПАА-,

К¹ радикалы представляют водород или до четырех необязательных заместителей, независимо выбранных из галогена, С1-С4алкила, гидрокси, С1-С4алкокси, галогеналкил, нитро, ΝΚ⁴Κ⁵ или ^НСО(СгС₄алкила),

К² представляет водород, СН₃СО-, ΝΗ₂или гидрокси,

К³ представляет водород, (СН₂)_тарил, С₁С₄алкил, -СОО(С₁-С₄алкил), -С('Ж<'¹К\

-(С=КН)КН₂, -8О(С₁-С₄алкил), -8О₂^К⁴К⁵) или -8О₂(С₁-С₄алкил),

К⁴ и К⁵ представляют независимо водород, С₁-С₄алкил, фенил, бензил или скомбинированы с азотом, с которым они связаны, образуя насыщенное или ненасыщенное 5- или 6-членное кольцо,

АА представляет аминокислотный остаток, т представляет независимо 0, 1, 2 или 3, а η представляет независимо 2, 3, 4 или 5, или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сложный эфир.
5. Способ по п.4, в котором ингибитор протеинкиназы С имеет следующую формулу в которой Ζ представляет -(СН₂)_р- или -(СН₂)_рО-(СН2)_Р,

К⁴ представляет гидрокси, -8Н, С₁С₄алкил, (СН₂)_тарил, ^Н(арил), ^(СН₃)(СЕ₃), -КН(СЕ₃) или ΝΚ⁵Κ⁶,

К⁵ представляет водород или С₁-С₄ алкил,

К⁶ представляет водород, С₁-С₄алкил или бензил, р представляет 0, 1 или 2, а т представляет независимо 2 или 3, или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сложный эфир.
6. Способ по п.4, в котором ингибитор протеинкиназы С представляет соединение следующей формулы н

I , К в которой Ζ представляет -(СН2)р-,

К⁴ представляет ΝΚ⁵Κ⁶, -ЫН(СР₃) или <Н₃) (СГ₃),

К⁵ и К⁶ представляют независимо Н или С₁-С₄алкил, р представляет 0, 1 или 2, а т представляет независимо 2 или 3, или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сложный эфир.
7. Способ по п.4, в котором ингибитор протеинкиназы С представляет (8)-3,4-[Ν,Ν'1,Г-((2-этокси)-3’(О)-4’-(К,К-диметиламино) бутан)-бис-(3,3'-индолил)]-1(Н)-пиррол-2,5дион или его фармацевтически приемлемую кислотную соль.
8. Способ по п.1, в котором глазное сосудистое расстройство выбрано из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, отека желтого пятна, сосудистой ретинопатии, неоваскуляризации радужной оболочки, окклюзии вен сетчатки, гистоплазмоза и ишемической болезни сетчатки.
9. Способ по п.1, в котором глазное сосудистое расстройство выбрано из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, отека желтого пятна и окклюзии вен сетчатки.
10. Способ по п.8, в котором указанная сосудистая ретинопатия представляет собой ретинопатию недоношенности или преждевременного развития.
11. Способ ингибирования роста клеток эндотелия, стимулированного ФРСЭ, который включает введение нуждающемуся в таком лечении млекопитающему терапевтически эффективного количества ингибитора β изофермента протеинкиназы С общей формулы в которой представляет -О-, -8-, -8О-, -8О₂-, -СО-, С₂-С₆алкилен, замещенный алкилен, С₂С6алкенилен, -арил-, -арил(СН2)тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл-(СН2)тО-, -сконденсированный бициклический-, -сконденсированный бициклический-(СН₂)_тО-, -ΝΚ³-, -КОК³-, -СОКН- или -ЫНСО-,

Х и Υ представляют независимо С_гС₄алкилен, замещенный алкилен или X, Υ и скомбинированы вместе, образуя -(СН₂)_ПЛА-,

К¹ радикалы представляют водород или до четырех необязательных заместителей, независимо выбранных из галогена, С1-С4алкила, гидрокси, С1-С4алкокси, галогеналкил, нитро, ΝΚ⁴Κ⁵ или -ЫНСО(С1-С₄алкила),

К² представляет водород, СН₃СО-, ΝΗ₂или гидрокси,

К³ представляет водород, (СН₂)_тарил, С₁С₄алкил, -СОО(С₁-С₄алкил), -ССЖ1<¹Ж,

-^=ΝΗ)ΝΗ₂, -8О(С1-С4алкил), -δθ2(ΝΚ⁴Κ⁵) или -8О₂(С₁-С₄алкил),

К⁴ и К⁵ представляют независимо водород, С₁-С₄алкил, фенил, бензил или скомбинированы с азотом, с которым они связаны, образуя насыщенное или ненасыщенное 5- или 6-членное кольцо,

АА представляет аминокислотный остаток, т представляет независимо 0, 1, 2 или 3, а η представляет независимо 2, 3, 4 или 5, или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сложный эфир.
12. Способ подавления связанной с отеком капиллярной проницаемости, стимулированной ФРСЭ, который включает введение нуждающемуся в таком лечении млекопитающему терапевтически эффективного количества ингибитора β изофермента протеинкиназы С общей формулы в которой представляет -О-, -8-, -8О-, -8О₂-, -СО-, С₂-С₆алкилен, замещенный алкилен, С₂С₆алкенилен, -арил-, -арил(СН₂)_тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл-(СН₂)_тО-, -сконденсированный бициклический-, -сконденсированный бициклический-(СН₂)_тО-, -Ν^-, Л'ОК'-, -ΟΝΗили -КНСО-,

Х и Υ представляют независимо С₁С₄алкилен, замещенный алкилен или X, Υ и скомбинированы вместе, образуя -(СН₂)_ПЛЛ-,

К¹ радикалы представляют водород или до четырех необязательных заместителей, независимо выбранных из галогена, С1-С4алкила, гидрокси, С1-С4алкокси, галогеналкил, нитро, ΝΙ<Ί<⁵ или ^НСО(С1-С4алкила),

К² представляет водород, СН3СО, ΝΗ2 или гидрокси,

К³ представляет водород, (СН₂)_т арил, С₁С₄алкил, -СОО(С₁-С₄алкил), -СО№⁴К⁵,

-^=ΝΗ)ΝΗ2, -8О(С1-С4алкил), -8О2^К⁴К⁵) или -8О₂(С₁-С₄алкил),

К⁴ и К⁵ представляют независимо водород, С₁-С₄алкил, фенил, бензил или скомбинированы с азотом, с которым они связаны, образуя насыщенное или ненасыщенное 5- или 6-членное кольцо,

АЛ представляет аминокислотный остаток, т представляет независимо 0, 1, 2 или 3, а η представляет независимо 2, 3, 4 или 5, или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сложный эфир.