CZ296711B6

CZ296711B6 - Lécivo pro prevenci a lécení ocních cévních onemocnení

Info

Publication number: CZ296711B6
Application number: CZ0349998A
Authority: CZ
Inventors: P. Aiello@Lloyd; R. Jirousek@Michael; L. King@George; Vignati@Louis; Kirk Ways@Douglas
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2006-05-17
Also published as: NO985067D0; PT918519E; NZ538109A; NO322209B1; EP0918519B1; AU724923B2; EP0918519A1; JP2000514402A; CN1158073C; HK1020017A1; DE69729798D1; KR100364487B1; AU2936197A; ES2224249T3; PL330463A1; NO985067L; BR9710705A; HU226378B1; EA001752B1; ATE270548T1

Abstract

Pouzití inhibitoru .beta. izozymu proteinkinázy C, obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky prijatelné soli pro prípravu léciva pro lécení ocních cévních onemocnení vybraných ze skupiny skládající se z makulární degenerace, makulárního edému, vaskulární retinopatie, neovaskularizace duhovky, okluze sítnicové zíly, histoplazmózy a ischemických onemocnení sítnice.

Description

Léčivo pro prevenci a léčení očních cévních onemocnění (57) Anotace:

Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C, obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny skládající se z makulární degenerace, makulárního edému, vaskulámí retinopatie, neovaskularizace duhovky, okluze sítnicové žíly, histoplazmózy a ischemických onemocnění sítnice.

R²

Léčivo pro prevenci a léčení očních cévních onemocnění

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká léčení pro prevenci a léčení očních cévních onemocnění a je obecně zaměřen na inhibici růstu endotelových buněk a kapilární permeability, které jsou asociovány s vaskulárním endotelovým růstovým faktorem (VEGF), například zvýšeného růstu buněk a permeability indukované VEGF, za použití inhibitoru β-izoenzymu proteinkinázy C (PKC). Tyto stavy indukované VEGF jsou těsně spojeny s různými cévními očními chorobami.

Předkládaný vynález je zejména zaměřen na použití inhibitoru Q izoenzymu proteinkinázy C (PKC) pro léčbu očních cévních onemocnění zahrnujících makulární degeneraci, makulámí edém, vaskulární retinopatii, uzávěr sítnicové žíly, neovaskularizaci duhovky, histoplazmózu a ischemická onemocnění sítnice.

Dosavadní stav techniky

VPF/VEGF je glykosylovaný, multifunkční cytokin. Nadměrná exprese VPF/VEGF je spojena s různými cévními chorobami oka.

VPF/VEGF indukuje proliferaci endotelových buněk, nadměrnou permeabilitu prostřednictvím aktivace vesikulo-vakuolámími organelami zprostředkovaného transportu, migrace a reorganizace aktinu, která je spojena se změnou tvaru a zvlněním membrány. Mění genovou expresi v endotelových buňkách, včetně zvýšené produkce tkáňového faktoru a několika proteáz, včetně intersticiální kalogenázy a urokináze podobného a tkáňového plazminogenového aktivátoru. Většina z těchto stejných genů je indukována forbolmyristátacetátem (PMA) stimulovanou aktivací PKC.

Vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF) spolu s fíbroblastovým růstovým faktorem (FGF) a transformujícím růstovým faktorem (TGFP) hrají pravděpodobně hrají roli ve zprostředkování aktivní intraokulární neovaskularizace u pacientů s ischemickými nemocemi sítnice (Aiello et al., New England Joumal Medicine, 331(22): 1480 - 1487 (1994); Amin et al., Invest. Opthalmol Vis. Sci., 35: 3178 - 3188 (1994)).

Jedním z očních onemocnění spojených se zvýšenou expresí VEGF je makulámí degenerace. S věkem související makulární degenerace je vedoucí příčinou slepoty ve stáří. Udává se, že makulární degenerace postihuje více než 16 % lidí ve věku 85 let a starších a 6 % lidí ve věku od 65 do 74 let. Více než 20 % pacientů ve věku více než 75 let má makulámí degeneraci. Onemocnění je častější u žen (Liebowitz HM, Krueer DE, Maunder LE et al., „The Framingham Eye Study: VI Macular Degeneration“, Surv. Opthalmol. 24 (supp. 10: 428 - 457, 1980); Klein et al., „Prevalence of Age Related Maculopathy: The Beaver Dam Study“, Opthalmology 99(6): 933 943, 1992). Makulární degenerace může být dělena na suchý a vlhký typ, kdy suchý typ je lOkrát častější, ale obecně méně závažný ve své klinické manifestaci. Závažnější vlhký typ, neboli exsudativní makulámí degenerace, je spojen s abnormálním vrůstáním choroidálních cév (choroidální neovaskularizaci) do subretinálního pigmentového epitelu nebo do subretinálního prostoru a často vede k závažné poruše zraku.

Makulární degenerace je počáteční patologickou lézí při objevu drůz, která představuje abnormální tkáňovou depozici ve vrstvě pigmentového epitelu sítnice (RPE) a o které se soudí, že je sekundární k vaskulární insuficienci. Nové krevní cévy potom prorůstají přes Bruchsovu membránu, která je mezi RPE a kapilárami chorioidei a způsobují invazi do sítnice. Tato invaze do sítnice způsobuje destrukci fotoreceptorů a může vést k hemoragiím, které redukují zrak.

-1 CZ 296711 B6

Jednou z nejběžnějších forem léčby makulární degenerace je laserová terapie. Laserová terapie je používána pro léčbu oblastí neovaskularizace, které nezasahují do centrální makulární oblasti (fovey). Nicméně, po laserové terapii jsou časté recidivy onemocnění (MPS Group, Arch. Opthalmol., svazek 109, str. 1232 - 1241 (1991)). Kromě toho, laserová terapie může vést ke vzniku reziduálního skotomu a proto není optimální terapií pro neovaskularizaci v centrálním makulárním regionu. Pouze omezený počet pacientů splňuje kritéria pro tuto formu léčby, hlavně z důvodu špatně definovaného, nebo skrytého charakteru, choroidální neovaskularizace, jak je často pozorováno. (Freund et al., Amer. Jour. Opthalmol., 115: 786 - 791 (1993)). Jako terapeutické činidlo byl také zkoušen interferon, na základě známé aktivity růstových faktorů jako je fibroblastový růstový faktor stimulovat patologickou angiogenezi. Nicméně, nebyl pozorován žádný příznivý účinek (Kirkpatrick et al., Br. J. Opthalmol. 77: 766 - 770 (1993); Chán et al., Opthalmology 101: 289 - 300 (1994)). V nedávné době byl neúspěšně uzavřen klinický pokus zkoušející transformující růstový faktor (TGF) beta-2 pro léčbu makulární degenerace. Biotechnology Newswatch, 1.1. 1996.

V souvislosti s rychlým stárnutím populace se makulární degenerace stává významným zdravotnickým problémem. V současné době zde neexistuje léčba vedoucí k vyléčení a neuspokojivé výsledky získané při léčbě laserem jsou jedinou přijímanou terapií, ačkoliv FDA v nedávné době schválil thalidomid pro použití v klinických pokusech s lidskými pacienty. („Researchers Focus on Macular Degeneration: Common Eye Problems, Causes and Treatment Get New Attention“ podle Staven Stemberg, Washington Post Health, 31, 9. 1995). V oboru stále existuje potřeba účinné terapie makulární degenerace.

Makulární edém je spojen s mnoha typy očních cévních onemocnění, jako je retinitis pigmentosa, diabetická retinopatie, pars planitis, obstrukce retinálních žil, senilní hyalitida, a je také spojen s nitroočními chirurgickými výkony (Henkind, Surv. Opthalmol. 28: 431 -2 (1984); Bird, Surv. Opthalmol. 28: 433 - (1984); Cunha-Vaz), Surv. Opthalmol. 28: 485 - 92 (1984)). Cystoidní makulární edém je nejčastější komplikací po chirurgickém výkonu pro kataraktu (Yannuzzi, Surv. Opthalmol. 28: 540 - 53 (1984)) a je pravděpodobně nejčastější příčinou ztráty zraku u pacientů po extrakci čočky (Jampol et al., Surv. Opthalmol. 28: 535 - 9 (1984)). Cystoidní makulární edém je obvykle sám o sobě omezen a i u chronických případů může dojít ke spontánnímu zlepšení (Yannuzzi, Surv. Opthalmol. 28: 540 - 53 (1984)). Nicméně, u malé části pacientů (1 - 15 %) může dojít k rozvoji ireverzibilního poškození a trvalému poškození zraku (Yannuzzi et al., Opthalmology 88: 847 - 54 (1981)).

Makulární edém je také příčinou pozdní ztráty zraku u pacientů s Vogt-Koyanagi-FIaradovým (VKH) syndromem (Rutzen et al., J. Ret. and Vit. Dis. 15(6): 475-479 (1995)). Makulární edém je těsně asociován s mikroaneurysmaty u diabetické retinopatie a u osob bez diabetů se srpkovitou anémií, okluzí rozvětvené žíly, onemocněním karotid, nebo těžkou hypertenzí (Klein, Med. Clin. N. Am. 72: 1415 - 1437 (1989)). Mikroaneurysmata často propouštějí lipoproteinový materiál, což vede ke tvorbě hustých exsudátů. Tyto exsudáty mají rozptýlenou, agregovanou nebo kruhovitou konfiguraci. Když dojde k nahromadění exsudátů a tekutiny v zadní části sítnice, může vzniknout makulární edém, který může způsobit významné zastření zraku a může vést ke ztrátě zrakové ostrosti.

Laserový postup, nazývaný lokální fotokoagulace, je použit pro léčbu oblastí otoku sítnice v sousedství mikroaneurysmat. Bylo prokázáno, že lokální fotokoagulace snižuje incidenci zhoršení zrakové ostrosti u 60 % pacientů s klinicky významným makulárním edémem, ale nebyl prokázán přínos fotokoagulace u pacientů s mírným až středním makulárním edémem (Raskin et al., Ann. Int. Med. 117 (3): 226 - 233 (1992)). Chirurgie na sklivci může zlepšit vizuální prognózu pouze v případech diabetického makulárního otoku spojeného s patologickým vitreo-makulámím přechodem (Vaneffenteree et al., J. Francais D. Opthalmol. 16(11): 602 - 610 (1993)). Účinek léků jako je orální nebo lokální indometacin (Miwa, Drug Intell. Clin. Pharm. 20: 548 - 550 (1986)), stejně jako erytropoetin (Friedman et al., Amer. J. Kidney Dis. 26 (1): 202 - 208 (1995))

-2CZ 296711 B6 na makulární edém byl hodnocen, ale nebyl pozorován žádný významný přínos. V oboru existuje potřeba účinného léku pro terapii makulárního edému.

Ačkoliv bylo známo, že VEGF má určitou úlohu v terapii některých očních onemocnění, zbývalo určit, zda inhibice funkce VEGF poskytne terapeutický přínos v léčbě takových očních cévních onemocnění. Předkládaný vynález prokazuje, že inhibicí aktivity VEGF je možné zmírnit patologický stav způsobený různými očními cévními chorobami.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C, obecného vzorce I

R²

(i) nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro přípravu léčiva pro léční očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny skládající se z makulární degenerace, makulárního edému, vaskulámí retinopatie, neovaskularizace duhovky, okluze sítnicové žíly, histoplazmózy a ischemických onemocnění sítnice, kde

W představuje skupinu -O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -CO-, C₂-C₆ alkylen se 2 až 6 atomy uhlíku, alkenylen se 2 až 6 atomy uhlíku, -aryl-, -aryl(CH₂)_mO~, kde aryl představuje fenyl- nebo naftylskupinu a je popřípadě substituován jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze souboru hydroxy, karboxy, C]-C₄ alkoxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 haloalkyl, nitro, -NR⁴R⁵, -NHCO^-Q alkyl), NHCO(benzyl), -NHCO(fenyl), SH, S(C!-C4 alkyl), -OCO(C!-C4 alkyl), -SO2(NR⁴R⁵), -SO2(Ci-C₄ alkyl), -SO₂ (fenyl), nebo halo; -heterocyklus-, heterocyklus(CH₂)_mO-, kde heterocyklus představuje pětičlenný nebo šestičlenný kruh, který je popřípadě substituován jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze souboru C1-C4 alkyl, Ci-C₄alkoxy, hydroxy, acetyl, karboxy, Ci-C₄ haloalkyl, nitro, NR⁴R⁵, -NHCO(Ci-C4 alkyl), -NHCO(benzyl), -NHCO(fenyl), SH, S(Ct-C4 alkyl), -OCO(Ci-C4 alkyl), -SO2(NR⁴R⁵), -SO2(Ci~C₄ alkyl), -SO₂(fenyl) nebo halo a který obsahuje 1 až 4 heteroatomy, které mohou být stejné nebo různé a které jsou zvoleny ze síry, kyslíku a dusíku, přičemž když heterocyklus obsahuje ve dvou sousedních polohách atomy uhlíku, mohou být tyto sousední atomy uhlíku uspořádány tak, že vytvářejí skupinu vzorce -CH=CH-, za předpokladu, že 1) když heterocyklický kruh obsahuje 5 členů, heteroatomy zahrnují do 2 atomů síry nebo 2 atomů kyslíku, ale ne obojí a 2) když heterocyklický kruh obsahuje 6 členů a je aromatický, síra a kyslík nejsou přítomny; -fúzovaný bicyklický zbytek-, -fúzovaný bicyklický zbytek-(CH₂)_mO-, přičemž fúzovaný bicyklický zbytek představuje stabilní fúzovaný bicyklický kruh vzorce

-3CZ 296711 B6

kde kruh označený „Hetero“ představuje pětičlenný nebo šestičlenný kruh, který je popřípadě substituován jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze souboru Ci-C₄ alkyl, Cj-C₄alkoxy, hydroxy, karboxy, C]-C₄ haloalkyl, nitro, NR⁴R⁵, -NHCO(C]-C4 alkyl), -NHCO(benzyl), -NHCO(fenyl), SH, S^-C, alkyl), -OCOÍCj-C, alkyl), -SO2 (NR⁴R⁵), -SO2(C!-C₄alkyl), -SO₂ (fenyl) nebo halo a který obsahuje 1 až 3 heteroatomy které mohou být stejné nebo různě a které jsou zvoleny ze síry, kyslíku a dusíku, přičemž když heterocyklus obsahuje ve dvou sousedních polohách atomy uhlíku, mohou být tyto sousední atomy uhlíku uspořádány tak, že vytvářejí skupinu vzorce -CH=CH- za předpokladu, že 1) když kruh Hetero obsahuje 5 člen, heteroatomy zahrnují do 2 atomů síry nebo 2 atomů kyslíku, ale ne obojí a 2) když kruh Hetero obsahuje 6 členů a je aromatický, síra a kyslík nejsou přítomny; -NR³-, -NOR³-, -CONH-, nebo-NHCO-;

X a Y představuje každý nezávisle alkylenskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo X a Y a W dohromady tvoří seskupení -(CH₂)_n-AA-;

R¹ představuje atom vodíku nebo až čtyři případné substituenty nezávisle vybrané z halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, halogenalkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, nitroskupiny, skupiny NR⁴R⁵ nebo skupiny NHCOalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části;

R² představuje atom vodíku, skupinu CH₃CO-, NH₂ nebo hydroxyskupinu;

R³ představuje atom vodíku, skupinu (CH2)maryl, kde aryl představuje fenyl- nebo naftylskupinu a je popřípadě substituován jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze souboru hydroxy, karboxy, Ci-C4 alkoxy, Ci-C4 alkyl, C]-C4 haloalkyl, nitro, -NR⁴R⁵, -NHCO(C]-C4 alkyl), NHCO(benzyl), -NHCO(fenyl), SH, S(Cj-C₄ alkyl), -OCOÍCj-C, alkyl), -SO₂(NR⁴R⁵), —SO2(C|—C4 alkyl), -SO2(fenyl), nebo halo; alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu -COOalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, -CONR⁴R⁵, -(C=NH)NH2, -SOalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, -SO₂(NR⁴R⁵) nebo -SO₂alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku;

R⁴ a R⁵ představuje každý nezávisle atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, fenylskupinu, benzylskupinu, nebo, brány dohromady spolu s dusíkem, k němuž jsou připojeny, představují nasycený nebo nenasycený pětičlenný nebo šestičlenný kruh;

AA představuje aminokyselinový zbytek vzorce

-N

-4CZ 296711 B6 kde R představuje variabilní boční řetězec aminokyseliny, vybraný ze souboru, zahrnujícího:

CHj

CH₃-,

HjN—C-NH—ČHi-CMj-CHr.

2-aminoadipovou kyselinu, 3-aminoadipovou kyselinu, β-alanin, 2-aminomáselnou kyselinu, 4-aminomáselnou kyselinu, 6-aminokapronovou kyselinu, 2-aminoheptanovou kyselinu, 2aminoizomáselnou kyselinu, 3-aminoizomáselnou kyselinu, 2-aminopimelovou kyselinu, 2,4diaminomáselnou kyselinu, desmosin, 2,2'-diaminopimelovou kyselinu, 2,3-diaminopropionovou kyselinu, N-ethylglycin, N-eťhylasparagin, hydroxylysin, allohydroxylysin, 3-hydroxyprolin, 4-hydroxyprolin, izodesmosin, allo-izoleucin, naftylglycin, N-methylglycin, N-methylizoleucin, N-methyllysin, norvalin, norleucin, omithin, fenylglycin, kyanoalanin, γ-karboxyglutamát, O-fosfoserin, a-naftylalanin, β-naftylalanin, S-galaktosylcystein, glycinamid, Nformylmethionin a tyrosin-O-sulfát; a R⁷ představuje atom vodíku nebo hydroxyskupinu;

m je nezávisle číslo 0, 1, 2 nebo 3; a n je nezávisle číslo 2, 3, 4 nebo 5.

Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny definované výše, kterým je bis-indolylmaleimid nebo makrocyklický bis-indolylmalenimid.

Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C při léčbě očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny definované výše, který je selektivní pro izozym, přičemž izozymová selektivita je vybrána ze selektivity pro beta-1 a beta-2 izozym.

Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy při léčbě očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny skládající se z makulámí degenerace, makulárního edému a okluze sítnicové žíly.

-5CZ 296711 B6

Předmět podle předloženého vynálezu je ilustrován provedeními popsanými dále.

Předložený vynález poskytuje znalosti a popisuje použití sloučenin, které jsou profylaktické a účinné v léčivech pro léčbu různých očních cévních onemocnění.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 ukazuje inhibiční účinek inhibitoru PKC, (S)-3,4-(N,N'-l,l'-((2-ethoxy)-3'(O)4'-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl))-l(H)-pyrrol-2,5-dionu na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Obrázek 2 dále ilustruje inhibiční účinek inhibitoru PKC, (S)-3,4—(N,N'-l,l'-((2-ethoxy)3'(O)-4'-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl))-l(H)-pyrrol-2,5-dionu na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Obrázek 3 ukazuje vliv inhibitoru PKC na aktivitu endogenního VEGF exprimovaného při kultivaci pericitů sítnice za hypoxických podmínek.

Obrázek 4 dále ilustruje inhibiční účinek inhibitoru PKC na růst endotelových buněk stimulovaných rekombinantním lidským VEGF.

Obrázky 5A, 5B ukazují časový průběh retinální permeability indukované VEGF.

Obrázek 6 ukazuje odpověď retinální permeability pro fluorescenční činidlo na VEGF.

Obrázek 7 ukazuje vliv intravitreální inhibice PKC a stimulace na retinální permeabilitu.

Obrázek 8A, 8B ukazují inhibici retinální permeability způsobené VEGF orálně podaným inhibitorem proteinkinázy C β.

Objevem předkládaného vynálezu je, že terapeutické použití určité třídy inhibitorů proteinkinázy C, tj. inhibitorů β-izoenzymu proteinkinázy C, a zejména inhibitorů PKC selektivních pro βizoenzym, působí proti účinkům VEGF. Konkrétně, objevem předkládaného vynálezu je, že použití této určité třídy inhibitorů proteinkinázy C působí proti růstu endotelových buněk a permeabilitě kapilár, zejména proti růstu endotelových buněk a proti kapilární permeabilitě stimulované růstovým faktorem VEGF. V důsledku toho mohou být takové sloučeniny použity terapeuticky pro léčbu onemocnění spojených s VEGF, zejména pro léčbu různých očních cévních onemocnění.

Způsob podle předkládaného vynálezu výhodně využívá ty inhibitory proteinkinázy C, které účinně inhibují β-izoenzym. Jedna vhodná skupina sloučenin je v oboru obecně popsána jako bis-indolylmaleimidy nebo makrocyklické bis-indolylmaleimidy. Bis-indolylmaleimidy, které jsou v oboru dobře známé, zahrnují ty sloučeniny, které jsou popsané v patentech US 5621098, US 555296, US 5545636, US 5481003, US 5491242 a US 5057614, které jsou zde všechny uvedeny jako odkaz. Makrocyklické bis-indolylmaleimidy jsou konkrétně reprezentovány sloučeninami podle vzorce I. Tyto sloučeniny, a způsoby pro jejich přípravu, byly popsány v patentu US 5552396, který je zde uveden jako odkaz. Tyto sloučeniny jsou podávány v terapeuticky účinném množství savcům pro inhibici růstu endotelových buněk nebo kapilární permeability spojené s VEGF a pro inhibici účinků VEGF spojených s nemocemi oka. Tyto sloučeniny mohou být také podávány pacientům s rizikem vzniku onemocnění popsaných výše jako profylaxe.

-6CZ 296711 B6

Jedna výhodná třída sloučenin pro použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu má obecný vzorec I.

R²

(I) kde:

W je -0-, -S-, —SO—, —SO₂—, —CO—, C₂-C₆ alkylen, substituovaný alkylen, C₂-C₆ alkenylen, -aryl-, -aryl(CH₂)_mO-, -heterocyklus-(CH₂)_mO-, -fúzovaný, bicyklický-, -fúzovaný bicyklický-(CH₂)_mO-, -NR³-, -NOR³-, -C0NH-, nebo -NHCO-;

X a Y jsou nezávisle C1-C4 alkylen, substituovaný alkylen nebo tvoří X, Y a W dohromady -(CH₂),-AA-;

R¹ jsou vodíky nebo více než čtyři volitelné substituenty nezávisle vybrané z halogenu, C]C4 alkyl, hydroxy, C1-C4 alkoxy, haloalkyl, nitro, NR⁴R⁵ nebo NHCO (Cj-C4 alkyl);

R² je vodík, CH₃CO-, NH₂ nebo hydroxy;

R³ je vodík, (CH2)maryl, Cj-C4 alkyl, -COO(C,-C4 alkyl), -CONR⁴R⁵, -(C=NH)NH2, -SO(CiC₄ alkyl), -SO₂(NR⁴R⁵) nebo -SO₂(C,-C₄ alkyl);

R⁴ a R⁵ jsou nezávisle vodík, Ci-C₄ alkyl, fenyl, benzyl, nebo jsou kombinovány na dusíku, na který jsou navázány za vzniku 5- nebo óčlenného kruhu;

AA je aminokyselinový zbytek;

m je nezávisle 0, 1, 2 nebo 3; a n je nezávisle 2, 3, 4 nebo 5, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo estery.

Výhodnější třída sloučenin pro použití v předkládaném vynálezu je představována vzorcem I, ve kterém skupiny -X-W-Y- obsahují 4 až 8 atomů, které mohou být substituované nebo nesubstituované. Nejvýhodněji obsahují skupiny -X-W-Y- 6 atomů.

Jinými výhodnými sloučeninami pro použití v předkládaném vynálezu jsou ty sloučeniny podle vzorce I, ve kterých jsou R¹ a R² vodíky; a W je substituovaný alkylen, -O-, S-, -CONH-, -NHCO- nebo -NR³-. Zejména výhodné sloučeniny pro použití v předkládaném vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce la:

Η

kde Z je -(CH₂)_P- nebo -(CH₂)_P -O-(CH₂)_P-; R⁴ je hydroxy, -SH, C]-C4 alkyl, (CH2)m aryl, -NH(aryl), -N(CH3)(CF3), -NH(CF3) nebo -NR⁵R⁶; R⁵ je vodík nebo Cj-C4 alkyl; R⁶ je vodík, C]-C4 alkyl nebo benzyl; p je 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo estery. Nejvýhodnější sloučeniny podle vzorce la jsou ty, kde Z je CH2; a R⁴ je -NH2, -NH(CF₃) nebo -N(CH₃)₂, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo estery.

Jinými vhodnými sloučeninami pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu jsou sloučeniny, ve kterých je W ve vzorci 1-0-, Y je substituovaný alkylen a X je alkylen. Tyto výhodné sloučeniny jsou reprezentovány vzorcem Ib:

kde Z je -(CH₂)_P_; R⁴ je -N(CH3)(CF3), -NH(CF3) nebo -NR⁵R⁶; R⁵ a R⁶ jsou nezávisle H nebo Ci-C4 alkyl; p je 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo estery. Nejvýhodnější sloučeniny podle vzorce Ib jsou ty, kde p je 1; a R⁵ a R⁶jsou methyl.

Jelikož obsahují bazickou skupinu, mohou sloučeniny podle vzorců I, la a Ib také existovat jako farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinu. Kyseliny běžně používané pro tvorbu takových solí zahrnují anorganické kyseliny jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, sírová a fosforečná, stejně jako organické kyseliny jako je kyselina para-toluensulfonová, methansulfonová, šťavelová, para-bromfenylsulfonová, uhličitá, jantarová, citrónová, benzoová, octová a příbuzné anorganické a organické kyseliny. Takové farmaceuticky přijatelné soli zahrnují sulfát, pyrosulfát, bisulfát, sulfit, bisulfít, fosfát, mono-hydrogenfosfát, dihydrogenfosfát, metafosfát, pyrofosfát, chlorid, bromid, jodid, octan, propionát, dekanoát, kaprylát, akrylát, formát, isobutyrát, heptanoát, propiolát, oxalát, malonát, sukcinát, suberát, sebakát, fumarát, malát, 2-butyn-l,4-dioát, 3-hexyne-2,5-dioát, benzoát, chlorobenzoát, hydroxybenzoát, methoxybenzoát, ftalát, xylensulfonát, fenylacetát, fenylpropionát, fenylbutyrát, citrát, laktát, hippurát, β-hydroxybutyrát, glykolát, malát, vína, methansulfonát, propansulfonát, naftalen-1sulfonát, naftalen-2-sulfonát, mandlan a podobně. Jsou používány zejména hydrochloridové a mesylátové soli.

Kromě farmaceuticky přijatelných solí mohou také existovat jiné soli. Tyto soli mohou sloužit jako meziprodukty při přečištění sloučenin, při přípravě jiných solí nebo při identifikaci a charakterizaci sloučenin nebo meziproduktů.

Farmaceuticky přijatelné soli sloučenin podle vzorců I, la a Ib mohou také existovat jako různé solváty, jako jsou solváty s vodou, methanolem, ethanolem, dimethylformamidem, ethylacetátem, a podobně. Mohou být také připraveny směsi takových solvátů. Zdroj takového solvátu může být rozpouštědlo pro krystalizaci, vlastní rozpouštědlo pro přípravu nebo krystalizaci nebo jiné takové rozpouštědlo.

Je známo, že mohou existovat různé stereoizomerické formy sloučenin podle vzorce I, la a Ib; například, W může obsahovat chirální atom uhlíku v substituované alkylenové skupině. Sloučeniny jsou normálně připraveny jako racemické směsi a mohou být běžně jako takové použity. Alternativně mohou být izolovány oba jednotlivé enantiomery, nebo mohou být syntetizovány běžnými technikami, pokud je to žádoucí. Takové racemické směsi a jednotlivé enantiomery a jejich směsi tvoří část sloučenin použitých ve způsobech podle předkládaného vynálezu.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu také zahrnují farmaceuticky přijatelná proléčiva sloučenin podle vzorce I, la a Ib. Proléčivo je léčivo, které bylo chemicky modifikováno a může být biologicky inaktivní v místě svého účinku, ale které může být degradováno nebo modifikováno jedním nebo více enzymatickými nebo jinými in vivo procesy na původní bioaktivní formu. Toto proléčivo bude pravděpodobně mít jiný farmakokinetický profil než původní léčivo, který bude umožňovat lepší absorpci přes slizniční epitel, lepší tvorbu solí a rozpustnost a/nebo zlepšenou systémovou stabilitu (například prodloužený plazmatický poločas). Typicky zahrnují takové chemické modifikace:

1) esterové nebo amidové deriváty, které mohou být štěpeny esterázami nebo lipázami;

2) peptidy, které mohou být rozpoznávány jednou nebo více proteázami; nebo

3) deriváty, které jsou akumulovány v místě účinku prostřednictvím membránové selekce proléčiva nebo modifikovaného proléčiva; nebo jakoukoliv kombinaci 1 až 3. Běžné postupy pro výběr a přípravu vhodných derivátů působících jako proléčiva jsou popsány, například, v H. Bundgaard, Design of Prodrugs (1985).

Syntéza různých bis-indol-N-maleimidových derivátů je popsána v Davis et al., patent US 5057614 a syntézy výhodných sloučenin vhodných pro použití v předkládaném vynálezu jsou popsány v dříve uvedeném patentu US 5552396 a v Faul et al., přihláška EP 0657411 Al, které jsou zde uvedeny jako odkaz.

Jedním zejména výhodným inhibitorem proteinkinázy β podle předkládaného vynálezu je sloučenina popsaná v příkladu 5g ((S)-3,4-(N,N'-l,l'-((2-ethoxy)-3'(OH”'-(N,N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl))-l(H)-pyrrol-2, 5-dion hydrochloridová sůl) podle výše uvedeného patentu US 5552396. Tato sloučenina je silným inhibitorem proteinkinázy C. Je selektivní pro proteinkinázu C vzhledem k ostatním kinázám a je vysoce selektivní pro izoenzym, t.j. je selektivní pro beta-1 a beta-2 izoenzymy. Také soli této sloučeniny mohou být výhodně použity, jako například mesylátové soli.

-9CZ 296711 B6

Výhodné mesylátové soli mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce II:

(II) s methansulfonovou kyselinou v nereaktivním organickém rozpouštědle, výhodně ve směsi organické rozpouštědlo/voda, a nejlépe ve směsi voda-aceton. Jiná rozpouštědla jak je methanol, aceton, ethylacetát a jejich směsi mohou být také použita. Poměr rozpouštědla ku vodě není zásadní a obecně je určen rozpustností reagens. Výhodné poměry rozpouštědla k vodě jsou obecně od 0,1:1 do 100:1 podle objemu. Výhodně je poměr 1:1 až 20:1 a nejlépe je 5:1 do 10:1. Optimální poměr závisí na vybraném rozpouštědle a výhodně je to 9 dílů acetonu ku 1 dílu vody.

Reakce obvykle vyžaduje přibližně ekvimolární množství dvou reagens, ačkoliv jiné poměry, zejména takové, kde je převaha kyseliny methansulfonové, mohou být také použity. Rychlost přidání kyseliny methansulfonové není zásadní pro reakci a kyselina může být přidána rychle (za méně než 5 minut) nebo pomalu v průběhu 6 nebo více hodin. Reakce je prováděna při teplotách v rozsahu od 0 °C do refluxu. Reakční směs je míšena do té doby, dokud není tvorba soli dokončena, jak je určeno rentgenovou difrakcí v prášku, což může trvat od 5 minut do 12 hodin.

Soli podle předkládaného vynálezu jsou výhodně a snadno připraveny jako krystalická forma. Trihydrátové formy solí mohou být snadno přeměněny na monohydráty sušením nebo expozicí 20 - 60% relativní vlhkosti. Sůl je významně krystalická, když vykazuje definovanou teplotu tání, dvojlom a charakter rentgenové difrakce. Obecně krystaly obsahují méně než 10 % amorfní pevné látky, lépe méně než 5 % a nejlépe méně než 1 % amorfní pevné látky.

Mesylátová sůl je izolována filtrací nebo jinými technikami separace, které jsou známy v oboru přímo z reakční směsi za zisku v rozmezí od 50% do 100 %. Rekrystalizace a jiné techniky přečištění v oboru známé mohou být použity k dalšímu přečištění solí, pokud je to žádoucí.

Endotelové buňky v tkáňové kultuře stimulované růstovým faktory jako je VEGF vykazují vyšší rychlost růstu než je základní rychlost růstu buněk. Pokusy provedené v předkládaném vynálezu ukázaly, že při podání in vitro, v koncentraci od přibližně 0,1 do 100 nM, způsobuje inhibitor proteinkinázy C, (S)-3,4-(N,N'-l, 1 '-((2''-ethoxy)-3'(O)-4'-(N,N-dimethylamino)-butan)bis-(3,3'-indolyl))-l(H)-pyrrol-2,5-dionová sůl s kyselinou signifikantní inhibici růstovým faktorem (jako například VEGF) stimulovaného non-bazálního růstu buněk.

Důležité je, že další testování prokázalo, že normální endotelové buňky kultivované ve tkáňové kultuře nejsou inhibovány touto sloučeninou, jak bylo prokázáno chyběním inhibice růstu endotelových buněk bez stimulace VEGF v normooxickém kondicionovaném médiu. V hypoxickém kondicionovaném médiu se rychlost růstu zvyšuje díky zvýšení obsahu endogenního růstového faktoru, VEGF, který je produkován hypoxickými buňkami. Opět, inhibitor proteinkinázy C, (S)3,4-(N,N'-1,1 '-((2-ethoxy)-3'' '(O)-4'' '-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3 '-indolyl))

-10CZ 296711 B6 (H)-pyrrol-2,5-dionová sůl s kyselinou, normalizuje růst buněk indukovaný takovými hypoxickými podmínkami.

Pokusy provedené v předkládaném vynálezu demonstrují, že permeabilita kapilár je také ovlivněna růstovými faktory jako je VEGF. Testování ukázalo, že ve zvířecím modelu VEGF významně zvyšuje permeabilitu kapilár až na trojnásobek. Toto zvýšení permeability kapilár závislé na VEGF je také závislé na dávce. Podle in vivo testování na zvířatech, podání inhibitoru proteinkinázy C v koncentraci okolo 25 mg/kg/den před expozicí VEGF významně inhibuje permeabilitu kapilár indukovanou VEGF. Konkrétně se předpokládá použití koncentrací od 1 nM do 5 mM, a zejména od 1 nM do 500 nM. Inhibice může být více než 80% a obecně je specifická pro permeabilitu kapilár indukovanou růstovým faktorem. Kapilární permeabilita může být měřena fluorescenční angiografíí. Zejména při makulárním edému je fluorescenční angiografíe fotografickou technikou, která vyžaduje injekci fluorescenční barviva do krevního řečiště a detekci oblastí úniku barviva do sítnice.

Bez omezení na jakékoliv technické vysvětlení vynálezce soudí, že změny v prokrvení sítnice vznikají v důsledku sníženého toku krve, ztráty sítnicových kapilát, geneze periferní vaskulatury nebo její obliterace, nebo separace choroidálního krevního zásobení od sítnice mohou všechny vést k relativní ischemii sítnice. Tato ischemie stimuluje syntézu a sekreci růstových faktorů jako je VEGF vpericytech sítnice, endotelových buňkách, pigmentovém epitelu sítnice, galiích a pravděpodobně v dalších typech buněk; a ve svém důsledku vede k neovaskularizaci sítnice a ke zvýšené permeabilitě kapilár. Tyto stavy jsou spojeny s různými cévními chorobami oka.

Inhibitory β-izoenzymu PKC popsané v předkládaném vynálezu mohou být použity pro léěbu onemocnění spojených s růstem endotelových buněk a s permeabilitou kapilár, zejména pro léčbu různých očních cévních onemocnění.

Oční cévní onemocnění, která je možno léčit sloučeninami podle předkládaného vynálezu zahrnují, ale nejsou omezena na makulámí degeneraci, makulámí edém, vaskulámí retinopatii, okluzi retinální žíly, neovaskularizaci duhovky, histoplazmózu a ischemická onemocnění sítnice. Makulární degenerace může souviset s věkem. Makulámí edém může být spojen s diabetem nebo s centrální okluzi sítnice. Jak je zde použit, nezahrnuje výraz vaskulární retinopatie diabetickou retinopatii, ale zahrnuje vaskulámí retinopatii spojenou se srpkovitou anémií, s nedonošenci a neovaskularizaci úhlu nebo trabekulámí sítě. Neovaskularizace duhovky může být spojena s diabetem, nebo nemusí být ve spojitosti s diabetem.

Odborník v oboru pozná, že terapeuticky účinné množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinázy C podle předkládaného vynálezu je množství dostatečné pro inhibici růstu endotelových buněk nebo pro vývoj permeability kapilár pomocí inhibice VEGF a že toto množství se liší - mimo jiné - v závislosti na velikosti poškozené tkáně, na koncentraci sloučeniny v terapeutickém přípravku a na tělesné hmotnosti pacienta. Obecně, množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinázy C podaného jako terapeutické činidlo pro léčbu očních cévních onemocnění bude určeno případ od případu ošetřujícím lékařem. Při stanovení vhodné dávky by měl být brán v úvahu rozsah neovaskularizace, tělesná hmotnost a věk pacienta.

Obecně, vhodná dávka je taková, která vede ke koncentraci inhibitoru β-izoenzymu proteinkinázy C v léčeném místě v rozmezí od 0,5 nM do 200 μΜ, lépe od 0,5 nM do 200 nM. Očekává se, že sérové koncentrace od 0,5 nM do 100 nM budou dostatečné za většiny okolností.

Pro získání těchto léčebných koncentrací bude pacientovi, který potřebuje léčbu, pravděpodobně podáno mezi přibližně 0,01 mg na den na kg tělesné hmotnosti a 50,0 mg na den na kg. Obvykle by nemělo být potřeba více než přibližně 0,1 až 10,0 mg na den na kg tělesné hmotnosti inhibitoru proteinkinázy C β. Jak bylo uvedeno výše, množství se bude lišit případ od případu.

-11 CZ 296711 B6

Sloučeniny obecného vzorce I a výhodné sloučeniny obecného vzorce Ia a IB jsou výhodně formulovány před podáním. Vhodné farmaceutické přípravky jsou připraveny podle známých postupů za použití dobře známých a snadno dostupných přísad. Při výrobě sloučenin vhodných pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu bude aktivní složka obvykle smísena s nosičem, nebo bude ředěna v nosiči, nebo bude uzavřena v nosiči, který může být ve formě kapsle, pytlíků, papírků nebo jiného kontejneru. Pokud slouží nosič jako ředidlo, pak to může být solidní, semisolidní nebo kapalný materiál, který účinkuje jako vehikulum, přísada nebo médium pro aktivní složku. Tak může být přípravek ve formě tablet, pilulek, prášku, pastilek,pytlíků, oplatek, elixírů, suspenzí, emulzí, roztoků, sirupů, aerosolu (ve formě pevné látky nebo v kapalném médiu), kapslí z tvrdé a měkké želatiny, čípků, sterilních roztoků pro injekce a sterilně balených prášků pro bud’ orální, nebo lokální aplikaci.

Některé příklady vhodných nosičů, přísad a ředidel zahrnují laktózu, dextrózu, sacharózu, sorbitol, mannitol, škroby, akácii, fosforečnany vápenaté, alginát, tragant, želatinu, křemičitan vápenatý, mikrokrystalickou celulózu, polyvinylpyrrolidon, celulózu, vodní sirup, methylcelulózu, methyl a propylhydroxybenzoáty, talek, stearan hořeěnatý a minerální olej. Přípravek může dále obsahovat zvlhčovači činidla, kluzná činidla, emulzifíkační a suspendující činidla, konzervační činidla, sladidla a chuťová korigens. Přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován tak, aby umožňoval rychlé, zpomalené nebo oddálené uvolňování aktivní složky po podání pacientovi. Přípravky jsou výhodně formulovány v jednotkové dávkové formě, kdy každá dávka obsahuje od přibližně 0,05 mg do přibližně 3 g, lépe okolo 750 mg aktivní složky. Nicméně je jasné, že podaná terapeutická dávka bude určena lékařem podle okolností včetně závažnosti léčeného stavu, výběru sloučeniny, která je podána a vybraného způsobu podání. Proto nelimitují výše uvedené rozsahy dávek žádným způsobem rozsah předkládaného vynálezu. Termín Jednotková dávková forma“ označuje fyzikálně samostatnou jednotku, která je vhodná jako jednotková dávka pro lidské pacienty a jiné savce, kdy každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivního materiálu, které je vypočítané tak, aby produkovalo požadovaný terapeutický účinek, spolu s vhodným farmaceutickým nosičem.

Kromě výše uvedených formulací, z nichž většina může být podána orálně, mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu také podány lokálně. Lokální přípravky zahrnují masti, krémy a gely.

Masti jsou obvykle připraveny za použití buď (1) olejové báze, tj. báze skládající se z fixovaných olejů nebo uhlovodíků, jako je bílá vazelína nebo minerální olej, nebo (2) absorbentní báze, tj. báze skládající se z anhydridní substance nebo substancí, které mohou absorbovat vodu, jako je například anhydridní lanolin. Obvykle je po vytvoření báze, ať olejové nebo absorbentní, přidána aktivní složka (sloučenina) v množství dostatečném pro vytvoření požadované koncentrace.

Krémy jsou emulze olej/voda. Skládají se z olejové báze (vnitřní fáze), která typicky obsahuje fixované oleje, uhlovodíky a podobně, jako jsou vosky, vazelína, minerální olej a podobně, a vodnou fázi (souvislou fázi), která obsahuje vodu a jakékoliv substance rozpustné ve vodě, jako jsou přidané soli. Dvě fáze jsou stabilizovány za použití emulzifikačního činidla, například povrchově aktivního činidla, jako je například laurylsíran sodný; hydrofilní koloidy, jako je například laurylsíran sodný; hydrofilní koloidy, jako je akáciová koloidní hmota, veegum, a podobně. Při tvorbě emulze je aktivní složka (sloučenina) obvykle přidána v množství dostatečném pro dosažení požadované koncentrace.

Gely obsahují bázi vybranou z olejových bází, vody nebo báze emulze-suspenze. K této bázi je přidáno činidlo způsobující tvorbu gelu, které vytvoří matrici v bázi tím, že zvýší její viskozitu. Příklady činidel způsobujících tvorbu gelu jsou hydroxypropylcelulóza, polymery kyseliny akrylové, a podobně. Obvykle je aktivní složka (sloučenina) přidána do přípravku v požadované koncentraci v době před přidáním činidla způsobujícího tvorbu gelu.

-12CZ 296711 B6

Množství sloučeniny obsažené v přípravku pro lokální podání není zásadní; koncentrace by měla být v rozmezí dostatečném pro umožnění snadné aplikace přípravku na postiženou oblast tkáně v množství, které dodá požadované množství sloučeniny do požadovaného léčeného místa.

Obvyklé množství lokálního přípravku, které je aplikováno na postiženou tkáň, závisí na velikosti poškozené tkáně a na koncentraci sloučeniny v přípravku. Obecně, přípravek bude aplikován na postiženou tkáň v množství od přibližně 1 do přibližně 500 pg sloučeniny na cm² postižené tkáně. Výhodně bude aplikované množství sloučeniny v rozmezí od přibližně 30 do přibližně 300 pg/cm², lépe od přibližně 50 do přibližně 200 pg/cm², a nejlépe od přibližně 60 do přibližně 100 pg/cm².

Následující příklady přípravků jsou pouze ilustrativní a nejsou míněny jako jakékoliv omezení rozsahu předkládaného vynálezu.

Přípravek 1

Kapse z tuhé želatiny jsou připraveny za použití následujících složek:

množství (mg/kapsli)

Aktivní složka250

Škrob, sušený200

Stearan hořečnatý 10

Celkem 460mg

Výše uvedené složky jsou smíseny a plněny do kapslí z tuhé želatiny v množství 460 mg.

Přípravek 2

Tableta je připravena za použití následujících složek:

množství (mg/kapsli)

Aktivní složka

Celulóza, mikrokrystalická

Oxid křemičitý, porézní

Kyselina stearová

Celkem

250

400

665 mg

Složky jsou smíseny a stlačeny do formy tablet, kde každá tableta obsahuje 665 mg.

Přípravek 3

Tablety obsahující 60 mg aktivní složky jsou připraveny následujícím způsobem:

množství (mg/tabletu)

Aktivní složka

Škrob

Mikrokrystalická celulóza Polyvinylpyrrolidon (jako 10% roztok ve vodě) Karboxymethyl škrob sodný Stearan hořečnatý

Talek

Celkem mg mg mg mg

4,5 mg

0,5 mg

150 mg

-13 CZ 296711 B6

Aktivní složka, škrob a celulóza jsou prosety přes U.S. síto č. 45 a jsou důkladně promíseny. Roztok polyvinylpyrrolidonu je smí sen s vzniklým práškem, který je potom proset přes U.S. síto č. 14. Takto produkované granule jsou sušeny při 50 °C a jsou prosety přes U.S. síto č. 18. Karboxymethyl škrob sodný, stearan hořečnatý a talek, předem proseté přes U.S. síto č. 60, jsou potom přidány ke granulím které jsou po míšení stlačeny na přístroji pro výrobu tablet za zisku tablet o hmotnosti 150 mg.

Příklady provedení vynálezu

Všechny tyto příklady demonstrují použití (Sj-3,4-(N,N'-l,T-((2-ethoxy)-3'(O)-4'-(N,Ndimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl))-l(H)-pyrrol-2,5-dion hydrochloridové soli pro inhibici růstu endotelových buněk in vitro a pro inhibici zvýšené kapilární permeability, stimulované VEGF, in vivo.

Příklad 1

V tomto příkladu byl inhibiční účinek uvedené sloučeniny na růst endotelových buněk stimulovaný VEGF vyšetřován za použití rekombinantního lidského VEGF.

Hovězí endotelové buňky sítnice byly izolovány z čerstvých telecích očí homogenizací a sérií kroků filtrace. Primární kultury endotelových buněk byly kultivovány na fíbronektinem (NYBen Reagents, New York, Blook Center) potažených plotnách (Coster) obsahujících Dulbeccovo modifikované Eagovo médium (DMEM) s 5,5 mM glukózy, 10% plazmatické koňské sérum (Wheaton, Scientifíc), 50 mg heparinu na litr a 50 jednotek růstového faktoru endotelových buněk na litr (Boehringer Mannheim). Poté, co dosáhly buňky konfluence, bylo médium změněno tak, aby obsahovalo 5% fetální hovězí sérum (HyClone). Médium bylo měněno každé tři dny. Homogenita endotelových buněk byla potvrzena anti-faktor VIII protilátkami.

Účinek uvedeného PKC inhibitoru na působení VEGF in vitro byl hodnocen za použití řídce rozmístěných kultur endotelových buněk hovězí sítnicové mikrovaskulatury, které jsou stimulovány po přidání VEGF. Endotelové buňky hovězí sítnice byly umístěny v nízké koncentraci (asi 2500 buněk na jamku) na 24-jamkové plotně (Coster) a byly inkubovány přes noc v DMEM obsahujícím 10% telecí sérum (GIBCO). Médium bylo vyměněno následující den.

Pro vyšetření vlivu uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk byla provedena jedna sada pokusů, ve které růst buněk za absence jakéhokoliv aktivního činidla sloužil jako kontrola a pak byl vyšetřován vliv přidání uvedeného inhibitoru PKC jak v přítomnosti VEGF (25 ng/ml; Genetech), tak za absence VEGF. Po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-100; Hoefer).

Všechny vyšetření byla provedena nejméně třikrát a pokusy byly opakovány nejméně třikrát. Výsledky jsou pro všechny pokusy vyjádřeny jako průměr ± SD. Analýza in vitro výsledků byla provedena nepárovým Student t testem. Hodnota P < 0,050 byla považována za statisticky významnou.

Obrázek 1 ukazuje výsledky získané za použití rekombinantního VEGF. Jak je vidět ve třech sloupcích na obrázku nejvíce nalevo, přidání uvedeného inhibitoru PKC ke kultuře endotelových buněk nemělo žádný vliv na základní růst buněk (sloupec 1). Rychlost růstu se významně zvýšila po přidání VEGF (čtvrtý sloupec). Tato růstová rychlost byla významně snížena po přidání > 0,5 nM uvedeného inhibitoru PKC (čtyři pravé sloupce).

-14CZ 296711 B6

Příklad 2

Tento příklad je podobný práci popsané na obrázku 1 a dále ilustruje inhibiční účinek uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantní lidský VEGF.

Za použití postupů podle příkladu 1 byly izolovány a kultivovány endotelové buňky hovězí sítnice; potom byly připraveny kultury s nízkou koncentrací buněk. Opět, za použití postupu podle příkladu 1, byly provedeny pokusy, ve kterých byl vyšetřován vliv přidání uvedeného inhibitoru PKC jak v přítomnosti VEGF (25 ng/ml; Genetech), tak za absence VEGF. Po inkubaci po dobu 4 dní při 37;C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-100; Hoefer).

Obrázek 2 ukazuje výsledky tohoto pokusu. Jak je ukázáno ve sloupcích pod označením - VEGF, nemělo přidání uvedeného inhibitoru PKC ke kultuře endotelových buněk v koncentraci od 0,01 nM do 100 nM v podstatě žádný vliv na základní rychlost růstu buněk. Stimulace endotelových buněk rekombinantním lidským VEGF (25 ng/ml) produkovala významné zvýšení buněčného obsahu DNA po 4 dnech, což ukazuje na zvýšení rychlosti růstu, ve srovnání s nestimulovanými buňkami (srovnání - VEGF v 0 a +VEGF v 0). Tato růstová rychlost byla významně snížena po přidání uvedeného inhibitoru PKC (čtyři pravé sloupce pod označením +VEGF). Přesněji, stimulační kapacita VEGF byla mírně redukována za přítomnosti 0,1 nM inhibitoru PKC a byla v podstatě zcela eliminována simultánním přidáním 1 nM a vyšším množství inhibitoru PKC.

Příklad 3

Tento příklad vyšetřuje vliv uvedeného inhibitoru PKC na aktivitu endogenního VEGF vyjádřenou při kultivaci pericytů sítnice za hypoxických podmínek.

Endotelové buňky hovězí sítnice a pericyty sítnice byly izolovány z čerstvých telecích očí homogenizací a sérií kroků filtrace. Endotelové buňky byly kultivovány a usídleny v nízkých koncentracích na plotnách za použití postupů popsaných v příkladu 1. Za použití podobných technik byly pericyty hovězí sítnice kultivovány v DMEM/5,5 mM glukóza s 20% fetálním hovězím sérem.

Hypoxické kondicionované médium pro endogenní VEGF expresi a normoxické kondicionované kontrolní médium byly připraveny v příslušném pořadí podle následujících postupů. Konfluentní monovrstva pericitů sítnice byla vystavena na dobu 24 hodin 2% O₂/5 % CO₂/93 % N₂ za použití Lab-Line Instruments pokročilého počítačem kontrolovaného infračerveného CO₂ inkubátoru s vodním pláštěm s redukovanou kyslíkovou kontrolou (model 480). Všechny buňky byly udržovány při teplotě 37 °C a nevykazovaly žádné morfologické změny při optické mikroskopii, vylučovaly trypanovou modř (> 98 %) a mohly být dále normálně pasážovány. Buňky inkubované za normoxických podmínek (95 % vzduch/5 % CO₂) ze stejné vsádky a pasážované byly použity jako kontrola. Médium bylo potom odebráno a filtrováno (Nagene; 0,22 pm) před použitím.

V tomto příkladu byly provedeny pokusy, ve kterých byl vyšetřován vliv uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk za přítomnosti buď normoxického kondicionovaného média nebo hypoxického kondicionovaného média. Stejně jako to bylo provedeno v předcházejících příkladech, po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1 % dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-100; Hoefer).

V testech uvedených na obrázku 3 byl uvedený inhibitor PKC použit v koncentraci 10 nM. Jak je ukázáno na obrázku 3, růst endotelových buněk sítnice byl stimulován kondicionovaným médiem z pericytů sítnice kultivovaných za hypoxických podmínek, o kterých je známo, že indukují expresi VEGF (srovnej sloupec 1 ke sloupci 3 na obrázku 3). Tento růst byl potlačen (normalizo

- 15 CZ 296711 B6 ván) za přítomnosti soli inhibitoru PKC (S)-3,4-(N,N'-l,l'-((2-ethoxy)-3'(0)Y'-(N,Ndimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl))-l(H)-pyrrol-2,5-dionu s kyselinou chlorovodíkovou (porovnej sloupec 3 ku sloupci 4).

Příklad 4

Tento příklad je podobný práci popsané na obrázku 1 a 2 a dále ilustruje inhibiční účinek uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Za použití postupů podle příkladu 1 byly izolovány a kultivovány endotelové buňky hovězí sítnice; potom byly připraveny kultury s nízkou koncentrací buněk. Opět, za použití postupu podle příkladu 1, byly provedeny pokusy, ve kterých byl vyšetřován vliv přidání uvedeného inhibitoru PKC jak za přítomnosti VEGF (+VEGF) (25 ng/ml; Genetech), tak za absence VEGF (-VEGF). Stejně jako výše, po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-100; Hoefer).

Obrázek 4 ukazuje výsledky tohoto pokusu. Jak je ukázáno ve sloupcích pod označením -VEGF, nemělo přidání uvedeného inhibitoru PKC ke kultuře endotelových buněk v koncentraci lOnM v podstatě žádný vliv na základní rychlost růstu buněk. Stimulace endotelových buněk rekombinantním lidským VEGF (25 ng/ml) produkovala významné zvýšení buněčného obsahu DNA po 4 dnech, což ukazuje na zvýšení rychlosti růstu, ve srovnání s nestimulovanými buňkami (srovnej VEGF v 0 a +VEGF v 0). Tato růstová rychlost byla významně snížena po přidání uvedeného inhibitoru PKC v koncentraci 10 nm.

Tyto výsledky ukazují, že objevená třída inhibitorů PKC a přesněji, (S)-3,4-(N,N'-l,l'-((2ethoxy)-3'(O)-4'-(N,N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl))-l(H)-pyrrol-2,5-dion, brání in vitro stimulaci růstu endotelových buněk sítnice jak exogenním, tak hypoxií indukovaným VEGF. Protože exprese VEGF je těsně spojena s neovaskularizací asociovanou s makulámí degenerací, podporují tyto výsledky použití těchto inhibitorů PKC v terapii makulámí degenerace.

Příklad 5

Tento příklad demonstruje časový průběh permeability sítnice indukované VEGF.

Do jednoho oka každé krysy byla podána intravitreální injekce 2,0 ng VEGF (při konečné koncentraci 25 ng/ml). Kontralaterální oko dostalo podobný objem kontrolního roztoku. Po 10 minutách bylo 30 mikrolitrů fluorescenčního činidla injikováno katétrem do pravé véna jugularis. Fluorofotometrie sklivce byla provedena v ukázaných časech po injekci fluorescenčního činidla.

Jak je ukázáno na obrázku 5A, je zde jasné zvýšení v permeabilitě fluorescenčního činidla do sklivce v očích ošetřených VEGF. Toto zvýšení se stává statisticky významným po 10 minutách od injekce fluorescenčního činidla a přetrvává po dobu nejméně 30 minut. Obrázek 5B ukazuje, že tato stimulace vyjádřená jako procento kontroly ukazuje, že zde existuje další pronikání fluorescenčního činidla v očích ošetřených VEGF v průběhu času.

-16CZ 296711 B6

Příklad 6

Tento příklad ukazuje dávkovou závislost permeability sítnice pro fluorescenční činidlo v odpovědi na VEGF.

Do jednoho oka každého zvířete byl injikován kontrolní roztok, zatímco do kontralaterálního oka byly injikovány různé dávky VEGF. O 10 minut později byla podána intravenózní injekce fluorescenčního činidla a velikost úniku do sklivce byla analyzována po 30 minutách. Jak je ukázáno na obrázku 6, existuje zde zvýšení permeability sítnice závislé na dávce VEGF. Stimulace byla maximální při 14 až 20 ng/ml o kterých je známo, že jsou získány u lidí.

Příklad 7

Tento příklad ukazuje účinek intravitreálního inhibitoru PKC (S)-3,4—(N,N'-l,l'-((2-ethoxy)3'(O)-4'-N,N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl))-l(H)-pyrrol-2,5-dion-hydrochloridové soli a jeho stimulaci permeability sítnice.

Do očí krys byla podána injekce buď 2,0 ng VEGF na oko, 10 nM PKC β inhibitoru nebo jeden mikrogram PDBU (agonista PKC), jak je ukázáno na obrázku 7. ΡΚΟβ inhibitor byl injikován 15 minut před přidáním VEGF. 10 minut po přidání VEGF bylo podáno fluorescenční činidlo a obsah fluorescenčního činidla ve sklivci byl hodnocen po 30 minutách.

Jak je ukázáno na obrázku 7, intravitreální injekce VEGF ukázala očekávanou stimulaci permeability sítnice. Intravitreální injekce PKCfl inhibitoru 15 minut před injekcí VEGF eliminovala většinu vyvolané permeability. Přímá stimulace proteinkinázy C injekcí PDBU demonstrovala zvýšení permeability, které bylo velice podobné tomu, které bylo způsobeno VEGF.

Příklad 8

Tento příklad ukazuje inhibice permeability sítnice v odpovědi na VEGF orálně podaným inhibitorem proteinkinázy C β, kterým je (S)—3,4-(N,N'-l,T-((2-ethoxy)-3'(O)-4'-(N,N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl))-l(H)-pyrrol-2,5-dion, hydrochloridová sůl.

Krysy byly krmeny potravou smíšenou s inhibitorem proteinkinázy C β v dávkách, které jsou ukázány na obrázcích 8A a 8B. Po jednom týdnu byla určena permeabilita sítnice v odpovědi na 2,0 ng intravitreálně injikovaného VEGF způsobem, který byl uveden výše. Orální podávání PKCfl inhibitoru podle předkládaného vynálezu trvající jeden týden redukovalo permeabilitu sítnice v odpovědi na VEGF. Tato skutečnost byla nejvýraznější při vysokých dávkách.

Principy, výhodná provedení a způsoby podle předkládaného vynálezu byly popsány ve výše uvedené přihlášce. Nicméně, vynález není omezen na určité popsané formy, které jsou spíše ilustrativní než limitující. Odborníky v oboru mohou být provedeny různé variace a změny, bez odchýlení se od rozsahu a duchu vynálezu.

-17CZ 296711 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C, obecného vzorce I

I

N

I (i) nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro přípravu léčiva pro léční očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny skládající se z makulámí degenerace, makulámího edému, vaskulámí retinopatie, neovaskularizace duhovky, okluze sítnicové žíly, histoplazmózy a ischemických onemocnění sítnice, kde ve vzorci:

W představuje skupinu -0-, -S-, -SO-, -SO₂-, -CO-, C₂-C₆ alkylen se 2 až 6 atomy uhlíku, alkenylen se 2 až 6 atomy uhlíku, -aryl-, -aryl(CH₂)_mO-, kde aryl představuje fenyl- nebo naftylskupinu a je popřípadě substituován jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze souboru hydroxy, karboxy, Ci~C₄ alkoxy, Ci-C₄ alkyl, Ci~C₄ haloalkyl, nitro, -NR⁴R⁵, -NHCO(C!-C4 alkyl), NHCO(benzyl), -NHCO(fenyl), SH, S(Ci-C4 alkyl), -OCO(Ci-C4 alkyl), -SO2(NR⁴R⁵), -SO2(C]-C₄ alkyl), -SO₂ (fenyl), nebo halo; -heterocyklus-, heterocyklus(CH₂)_mO-, kde heterocyklus představuje pětičlenný nebo šestičlenný kruh, který je popřípadě substituován jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze souboru Ci-C₄ alkyl, Ci-C₄alkoxy, hydroxy, acetyl, karboxy, C]-C₄ haloalkyl, nitro, NR⁴R⁵, -NHCO(Ci-C4 alkyl), -NHCO(benzyl), -NHCO(fenyl), SH, S(Cj-C4 alkyl), -OCO^-C^ alkyl), -SO2(NR⁴R⁵), -SO2(Ci~C₄alkyl), -SO₂(fenyl) nebo halo a který obsahuje 1 až 4 heteroatomy, které mohou být stejné nebo různé a které jsou zvoleny ze síry, kyslíku a dusíku, přičemž když heterocyklus obsahuje ve dvou sousedních polohách atomy uhlíku, mohou být tyto sousední atomy uhlíku uspořádány tak, že vytvářejí skupinu vzorce -CH=CH-, za předpokladu, že 1) když heterocyklický kruh obsahuje 5 členů, heteroatomy zahrnují do 2 atomů síry nebo 2 atomů kyslíku, ale ne obojí a 2) když heterocyklický kruh obsahuje 6 členů a je aromatický, síra a kyslík nejsou přítomny; -fúzovaný bicyklický zbytek-, -fúzovaný bicyklický zbytek-(CH₂)_mO-, přičemž fúzovaný bicyklický zbytek představuje stabilní fúzovaný bicyklický kruh vzorce kde kruh označený „Hetero“ představuje pětičlenný nebo šestičlenný kruh, který je popřípadě substituován jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze souboru Cj-C₄ alkyl, Ci~C₄alkoxy, hydroxy, karboxy, Cj-C₄ haloalkyl, nitro, NR⁴R⁵, -NHCO(Ci-C4 alkyl), -NHCO(benzyl), -NHCO(fenyl), SH, S(Ci-C4 alkyl), -OCO(C!-C4 alkyl), -SO2 (NR⁴R⁵), -SO2(Cj-C₄

-18CZ 296711 B6 alkyl), -SO₂ (fenyl) nebo halo a který obsahuje 1 až 3 heteroatomy které mohou být stejné nebo různé a které jsou zvoleny ze síry, kyslíku a dusíku, přičemž když heterocyklus obsahuje ve dvou sousedních polohách atomy uhlíku, mohou být tyto sousední atomy uhlíku uspořádány tak, že vytvářejí skupinu vzorce -CH=CH- za předpokladu, že 1) když kruh Hetero obsahuje 5 členů, heteroatomy zahrnují do 2 atomů síry nebo 2 atomů kyslíku, ale ne obojí a 2) když kruh Hetero obsahuje 6 členů a je aromatický, síra a kyslík nejsou přítomny; -NR³-, -NOR³-, -CONH-, nebo -NHCO-;

X a Y představuje každý nezávisle alkylenskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo X, Y a W dohromady tvoří seskupení -(CH₂)_n-AA-;

R² představuje atom vodíku, skupinu CH₃CO-, NH₂ nebo hydroxyskupinu;

R³ představuje atom vodíku, skupinu (CH2)maryl, kde aryl představuje fenyl- nebo naftylskupinu a je popřípadě substituován jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze souboru hydroxy, karboxy, C]-C4 alkoxy, Cj-C4 alkyl, C]-C4 haloalkyl, nitro, -NR⁴R⁵, -NHCO(C]-C4 alkyl), NHCO(benzyl), -NHCO(fenyl), SH, S(C!-C₄ alkyl), -OCO(Cr-C₄ alkyl), -SO₂(NR⁴R⁵), -SO2(Ci-C4 alkyl), -SO2(fenyl), nebo halo; alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu -COOalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, -CONR⁴R⁵, -(C=NH)NH2, -SOalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, -SO₂(NR⁴R⁵) nebo -SO₂alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku;

AA představuje aminokyselinový zbytek vzorce

-N nebo kde R představuje variabilní boční řetězec aminokyseliny, vybraný ze souboru, zahrnujícího:

-19CZ 296711 B6

CHj-_ř

CHj CHj^ /CH—, /CH-CHi-,

Cfí/ CHj (Ala) (Val) CLeu>

H— . HO-CMí. BjW—CH,—CH,—CH,— (Oly) (S«r) (ψ)

HH,

C-CH,

O (Thrt (Cy>) OW <Am>

NH

KHí ^C-CHl-CHíO

H (3W (KU)

2-aminoadipovou kyselinu, 3-aminoadipovou kyselinu, β-alanin, 2-aminomáselnou kyselinu, 4-aminomáselnou kyselinu, 6-aminokapronovou kyselinu, 2-aminoheptanovou kyselinu, 2-aminoizomáselnou kyselinu, 3-aminoizomáselnou kyselinu, 2-aminopimelovou kyselinu, 2,4-diaminomáselnou kyselinu, desmosin, 2,2'-diaminopimelovou kyselinu, 2,3-diaminopropionovou kyselinu, N-ethylglycin, N-ethylasparagin, hydroxylysin, allohydroxylysin, 3-hydroxyprolin, 4hydroxyprolin, izodesmosin, allo-izoleucin, naftylglycin, N-methylglycin, N-methylizoleucin, N-methyllysin, norvalin, norleucin, omithin, fenylglycin, kyanoalanin, γ-karboxyglutamát, Ofosfoserin, cc-naftylalanin, β-naftylalanin, S-galaktosylcystein, glycinamid, N-formylmethionin a tyrosin-O-sulfát; a R⁷ představuje atom vodíku nebo hydroxyskupinu;

2. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny definované v nároku 1, kterým je bis-indolylmaleimid nebo makrocyklický bis-indolylmalenimid.

3. Použití inhibitor β izozymu proteinkinázy C podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupin definované v nároku 1, který je selektivní pro izozym, přičemž izozymováselektivita je vybrána ze selektivity pro beta-1 a beta-2 izozym.

4. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle nároku 3 pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny definované v nároku 1, kterým je sloučenina obecného vzorce

-20CZ 296711 B6 kde

Z představuje skupinu -(CH₂)_P- nebo -(CH₂)_P -O-(CH₂)_P-;

R⁴ představuje hydroxyskupinu, skupinu -SH, alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu (CH2)maryl nebo -NH(aryl) kde aryl představuje fenyl- nebo naíitylskupinu a je popřípadě substituován jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze souboru hydroxy, karboxy, CjC4 alkoxy, Ci-C4 alkyl, Cj-C4 haloalkyl, nitro, -NR⁴R⁵, -NHCO(Ci-C4 alkyl), NHCO(benzyl), NHCO(fenyl), SH, S(C,-C₄ alkyl), -OCO(Ci-C₄ alkyl), -SO₂(NR⁴R⁵), -SO^Cj-C, alkyl), -SO₂(fenyl), nebo halo; -N(CH₃)(CF₃), -NH(CF₃) nebo -NR⁵R⁶;

R⁵ představuje atom vodíku nebo alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

R⁶ představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo benzylskupinu;

p je číslo 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle číslo 2 nebo 3;

nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

5. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle nároku 3 pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny definované v nároku 1, kterým je sloučenina obecného vzorce kde

Z představuje skupinu -(CH₂)_P-;

R⁴ představuje skupinu -N(CH₃)(CF₃), -NH(CF₃) nebo -NR⁵R⁶;

-21 CZ 296711 B6

R⁵ a R⁶ představuje každý nezávisle atom vodíku nebo alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku;

p je číslo 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle číslo 2 nebo 3;

nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

6. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle nároku 3 pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny definované v nároku 1, který zahrnuje (S)~ 3,4-(N,N'-l,l'-((2-ethoxy)-3'(O)-4'-(N,N-dimethylamino)butan)bis-(3,3'-indolyl))-l(H)pyrrol-2,5-dion, nebo jeho farmaceuticky přijatelnou adiční sůl s kyselinou.

7. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle některého z nároků 1 až 6 pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny skládající se zmakulámí degenerace, makulámího edému, vaskulámí retinopatie, neovaskularizace duhovky, okluze sítnice žíly, histoplazmózy a ischemických onemocnění sítnice.

8. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle některého z nároků 1 až 7 pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny skládající se z makulámí degenerace, makulárního edému a okluze sítnicové žíly.

9. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle některého z nároků 1 až 8 pro přípravu léčiva pro léčení očních cévních onemocnění vybraných ze skupiny skládající se zmakulámí degenerace a makulámího edému.

10. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle některého z nároků 1 až 7 pro přípravu léčiva pro léčení vaskulární retinopatie, kterou je retinopatie nedonošenců.

11. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčení inhibice růstu endotelových buněk stimulovaného VEGF.

12. Použití inhibitoru β izozymu proteinkinázy C podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčení inhibice VEGF stimulované kapilární permeability spojené s edémem.

10 výkresů

-22CZ 296711 B6

Obsah DNA (ng/jamku)

V+100nm

-23 CZ 296711 B6

Ob s ah DNA (ng/jamku) (nM) inhibitor PKC-E

Obr.

-24CZ 296711 B6 ng DNA na jamku

Hypoxické kondicionované medium

H------------------I

Normoxické kondicionované medium

Obr.

-25CZ 296711 B6 ng DNA na jamku

Kontrola

-26CZ 296711 B6

O Kontrola • VEGF

Unik FA

-Ii-------------------1-------------------1------------------1-------------------r-------------------1-------------------r~

0 5 10 15 20 25 30