UA54427C2 - Спосіб лікування очних захворювань, які пов'язані з фактором васкулярного ендотеліального росту - Google Patents

Abstract

Описано спосіб інгібування росту ендотеліальних клітин, який стимулюється фактором росту ендотелію судин і спричинює таку патологію, як дегенерація макули або її набряк за рахунок підвищення проникності стінок капілярів. Для інгібування такого росту запропоновано застосовувати селективний інгібітор ізоферменту протеїнкінази С (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2"-етокси)-3"'(O)-4'"-(N,N-діметиламіно)-бутан)-біс-(3,3'-індолил)]-1(Η)-піррол-2, 5-діону гідрохлорид.

Description

Опис винаходу

По данной заявке заявляется приоритет на оснований предварительной заявки США МобО/016 658 на патент

США, поданной. 1 мая 1996Гг.

Предпосьілки изобретения 1. Область изобретения

Настоящее изобретение в широком смьісле направлено на способ ингибирования роста зндотелиальньмх клеток и капиллярной проницаемости, связанньїх с фактором роста сосудистого зндотелия (ФРОЗ), например, 710 увеличенного клеточного роста и проницаємости, вьізванньїх ФРОЗ, с использованиєм ингибитора изофермента

Д протеин киназьі С (ПКС). Зти состояния, вьізваннье ФРОЗ, тесно связаньі! с разнообразньми глазньми сосудистьми расстройствами.

Настоящее изобретение направлено особенно на применение ингибитора изофермента р протейин киназь! С (ПКС) для лечения глазньїх сосудистьїх расстройств, включая дегенерацию желтого пятна, отек желтого пятна, т5 сосудистую ретинопатию, окклюзию вен сетчатки, неоваскуляризацмю радужной оболочки, гистоплазмоз и ишемические заболевания сетчатки. 2. Описание предшествующего уровня техники

ФСП/ФРОСЗ о представляет собой гликозилированньій, многофункциональньй цитокин. Избьточная зкспрессия ФСП/ФРСЗ связана с разнообразньіїми глазньіми сосудистьми расстройствами.

ОСП/ФРСОСЗ вьїзьвает пролиферацию зндотелиальньїх клеток, избьточную проницаемость посредством активации транспорта, опосредованного через пузьірьково-вакуолярнье органелль!, миграции и реорганизации актина с изменениями формьї и индуляцией. Он изменяет зкспрессию гена зндотелиальньх клеток, вьізьївая повьшенную вьіработку тканевого фактора и нескольких протеаз, включая интерстициальную коллагеназу и как урокиназо-подобного активатора, так и активатора тканевого плазминогена. Большинство из зтих самьїх генов сч индуцируются активацией ПКС, стимулированной форбол миристатацетатом (ФМА). о

Считается, что фактор роста сосудистого зндотелия (ФРОЗ), наряду как с факторами роста фибробластов (ФРФ), так и с трансформирующим фактором роста (ТФРР) играют главную роль в опосредованиий активной внутриглазной неоваскуляризации у пациентов с ишемическими заболеваниями сетчатки (Аїейо еї аї!., Мем

Епадіапа доиг. Меадісіпе, 331(22): 1480-1487 (1994); Атіп еї а/ї., Іпмеві Орпійа!тої Мів Зеї., 35:3179-3188 (1994)). -

Одним из глазньїх сосудистьїх расстройств, связанньїх с повьишенной зкспрессией ФРОЗ, является сем дегенерация желтого пятна. Связанная с возрастом дегенерация является ведущей причиной слепоть! у пожильх людей. По данньїм оценки, дегенерация желтого пятна поражает более, чем 1695 людей в возрасте 85 ч лет и старше и 695 людей в возрасте между 65 и 74 годами. Более, чем у 2095 пациентов в возрастестарше 75 «Ж лет имеется дегенерация желтого пятна. Болезнь чаще встречаеєется у женщин (Гіером/й2 НМ, Кгеег ОЕ,

Машпаег ГЕ еї аї., "пе Егатіпдапат Еуе Зцау: МІ Масшіаг Оедепегайоп", Зигм. ОрпіпаїЇтої. 24 (взирр 10:428-457, й 1980); Кіеїп еї аїЇ., "Ргемаїепсе ої Аде Кеїаїеа МасціораШйу: Те Веамег ЮОат Зщау", ОрпПпаїЇтоїоду, 99(6):933-943, 1992). Дегенерацию желтого пятна можно разделить на сухой или влажньй тип, причем сухой тип встречается в 10 раз чаще, но в общем по своим клиническим проявлениям протекает менее тяжело. Более « дю тяжелая влажная или зксудативная дегенерация желтого пятна связана с патологическим ростом -о хориоидальньїх сосудов (хорисидальная неоваскуляризация) в подсетчаточньй пигментньй зпителий или с подсетчаточное пространство и часто приводит к тяжелому ухудшению зрения. :з» Дегенерация желтого пятна имеет первоначальное патологическое поражение, заключающееся в появлений друз, что представляет патологическое отложение ткани внутри слоя пигментного зпителия сетчатки (ПЗС) и, как считается, является вторичньім по отношению к сосудистой недостаточности. Затем через оболочку Бруха, сл 15 расположенную между ПЗС и хориокапиллярами, прорастают новьіе кровеноснье сосудь), внедряясь в сетчатку. Зто внедрение в сетчатку вьізьівает разрушение фоторецепторов и может привести к кровоизлиянию т. со снижением зрения. їз Одним из найболее обьічньїх видов лечения дегенерации желтого пятна является лазерная терапия.

Лазерная терапия применяется для лечения зон неоваскуляризации, которье не распространяются на іме) 20 центральную область желтого пятна (центральная ямка). Однако, после лазерной терапии часто происходит -ч рецидив заболевания (МР ОСгоицир, Агсп ОрпіПаїтої., Мої. 109, рр. 1232-1241 (1991)). Кроме того, лазерная терапия может привести к возникновению остаточньїх скотом и позтому не является оптимальньм способом лечения неоваскуляризации в центральной области желтого пятна. Лишь ограниченное число пациентов отвечают критериям показаний для данного способа лечения, главньм образом ввиду недостаточно 59 вьявленной или скрьітой природьії обьічно наблюдаемой хорисидальной неоваскуляризации (Ргецшпа еї а!., Атег.

ГФ) Уошиг. ОрпіпаїЇтої., 115:786-791 (1993)). В качестве терапевтического средства испьітьмвался также интерферон 7 на основе известной активности факторов роста, таких как фактор роста фибробластов, в отношений стимуляции патологического ангиогенеза. Однако, стойкий зффект не наблюдался (Кігк-раїйіК еї аї., Вг. у.

Орпіпаїтої., 77:766-770 (1993); Спап еї аї., ОрпіпаІтоїоду, 101:289-300 (1994)). Совсем недавно безуспешно 60 завершились испьтания по использованию трансформирующего фактора роста (ТФР) бета-2 для лечения дегенерации желтого пятна (ВіоїесппоЇоду Мем/вула(сі, Уапиагу 1, 1996).

С бьістрьиім старением населения дегенерация желтого пятна становится существенной проблемой общественного здравоохранения. В настоящее время нет способов излечения зтого заболевания, и единственньім принятьім способом лечения, дающим менее чем удовлетворительнье результать, является 65 лазерное лечение, хотя ЕОА недавно одобрила талидомид для применения в клинических исследованиях на людях ("Кезеагспез Босиз оп Масшціаг Оедепегайоп: Соттоп Еуе РгоБріетв, Сацвез апіа Тгтеайтепі Сеї Мем

АйЦепіоп" ру Біемеп Зіегпрего, Ууазпіпдіоп Розі Неакй, Осіорег 31, 1995). Сохраняется настоятельная потребность в способе зффективной медикаментозной терапии дегенерации желтого пятна.

Отек желтого пятна связан со многими видами глазньїх сосудистьїх заболеваний, таких как пигментньй ретинит, диабетическая ретинопатия, воспаление ресничного кружка, обструкция вен сетчатки, старческий гиалит, и с внутриглазньмми хирургическими вмешательствами (Непкіпа, Зигу. Орпійа!тої., 28:431-2 (1984); Віга,

Зигум. Орпійаїтої., 28: 433-6 (1984); Сцуппа-Ма7, Зигм. ОрпіПпаї!тої., 28: 485-92 (1984)). Кистоидньій отек желтого пятна является самьмм часто встречающимся осложнением после операций по поводу катаракть 7/0 СХапиглі, Зцгм. Орпіпаїтої., 28: 540-53 (1984)) и, возможно, самой частой причиной потери зрения у пациентов, подвергающихся зкстракции хрусталика (Чатрої! еї аї., З!йигм. ОрпійаїЇтої., 28: 535-9 (1984)). Кистоидньій отек желтого пятна обьічно самоограничивается, и даже в хронических случаях может произойти спонтанное улучшение (Уапиггі, Зигу. Орпіпаїтої., 28: 540-53 (1984)). Однако, у небольшой части пациентов (от 1 до 1595) может развиться необратимое повреждение и постоянная утрата зрительной функции (Мапигі еї аї., 7/5 ОрпіПпаІтоіоду, 88: 847-54 (1981)).

Отек желтого пятна является также причиной поздней потери зрения у пациентов с синдромом

Моді-Коуападі-Нагада (МКН) (Киїгеп еї аї., 9У.Кеї. апа Мії. Оів., 15(6): 475-479 (1995)). Отек желтого пятна тесно связан с микроаневризмами при диабетической ретинопатии, а у лиц, не страдающих диабетом - с серповидноклеточной анемией, окклюзией ответвляющихся вен, поражением сонньїх артерий или с тяжелой гипертонией (Ківїп, Мей. Сііп. М. Ат. 72: 1415-1437 (1989)). При микроаневризмах часто происходит утечка липопротеинового материала, что приводит к образованию твердьїх зксудатов. Зти зксудать! появляются в виде рассеянной, агрегированной или кольцеподобной конфигурации. Когда зксудать! и жидкость накапливаются в задней части сетчатки, может развиться отек желтого пятна, которьій может вьізвать значительное затуманивание зрения и привести к потере остроть! зрения. с

Для лечения областей отечной сетчатки, примьшающих к микроаневризмам, применяется лазерная процедура, назьіваемая очаговой фотокоагуляцией. Бьіло показано, что очаговая фотокоагуляция снижает і) частоту ухудшения остроть! зрения на 6095 у пациентов с клинически вьіраженньім отеком желтого пятна, но у пациентов с отеком желтого пятна от средней до умеренной степени не наблюдался благоприятньй зффект фотокоагуляции (Кагвкіп еї аї., Апп. Іпї. Меай., 117(3): 226-233 (1992)). Операции на стекловидном теле могут М зо улучшить прогноз для зрения только в случаях диабетического отека желтого пятна, связанного с патологической поверхностью раздела между стекловидньім телом и желтьм пятном (МапепПепіегте еї аї., 9. с

Егапсаіїз О ОрпіВпаїтої., 16(11): 602-610 (1993)). Проводилась оценка медикаментозньїх способов лечения отека «г желтого пятна, таких как оральное и местное применение индометацина (Міша, ЮОгад Іпіей. Сіїпй. Рагт., 20: 548-550 (1986)), а также зритропоетина (Егіедтап еї аїЇ., Атег. 9. Кіапеу Оів., 26(1): 202-208 (1995)), но « существенньй зффект не наблюдался. Существуеєт потребность в способе зффективной медикаментозной ю терапий отека желтого пятна.

Хотя известно, что ФРОЗ играет некоторую роль в патологии некоторьїх глазньїх сосудистьїх расстройств, остается необходимость определить, обеспечит ли благоприятньійй терапевтический зффект при лечений таких глазньїх сосудистьїх расстройств ингибирование функции, вьізьваемое ФРОСЗ. Настоящее изобретение « показьшваєт, что с помощью ингибирования активности ФРСЗ можно снизить патологический потенциал в с множества из зтих глазньїх сосудистьїх расстройств.

Сущность изобретения ;» Целью изобретения является предоставление способов лечения глазньїх сосудистьїх расстройств.

Еще одной целью изобретения является предоставление способа ингибирования капиллярной проницаемости, связанной с отеком желтого пятна у млекопитающих. с Еще одной целью изобретения является предоставление способа ингибирования неоваскуляризации, вьізванной фактором роста сосудистого зндотелия (ФРС). о Зти и другие цели изобретения достигаются с помощью одного или более вариантов реализации, описанньх ї5» ниже.

Согласно одному воплощению изобретения предоставляется способ лечения глазньїх сосудистьх о расстройств, которьій включаеєт введениег нуждающемуся в таком лечений млекопитающему терапевтически

І зффективного количества ингибитора изофермента р протейн киназь С.

Согласно другому воплощению изобретения предоставляется способ печения дегенерации желтого пятна у млекопитающих, которьій включает введение млекопитающему терапевтически зффективного количества МиНнгибитора изофермента р протейин киназь С.

Согласно еще одному варианту воплощения изобретения предоставляется способ ингибирования і) капиллярной проницаемости, связанной с отеком желтого пятна у млекопитающих, которьій включает введение іме) млекопитающему терапевтически зффективного количества ингибитора изофермента р протейин киназь С.

Согласно еще одному воплощению изобретения предоставляется способ ингибирования фактора роста 60о сосудистого зндотелия (ФРОСЗ), которьій включаєт введение млекопитающему подавляющего ФРОЗ количества ингибитора изофермента р протеин киназь С.

Настоящее изобретение обеспечиваєт технику соединениями, которне дают профилактический и лечебньй зффект при различньх глазньїх сосудистьїх расстройствах.

Краткое описание чертежей 65 На фиг1 показано подавляющее действие ингибитора ПКС, (5)-3,4-(М,М'-1,1-((2"-зтокси-3"(0)-4"7-(М,М-диметиламино)-бутан)-бис-(3, З-индолил) 1-1 (Н)-пиррол-2,

5-диона, на рост зндотелиальньхх клеток, стимулированньй рекомбинантньм ФРОЗ человека.

На фиг.2 дополнительно показано подавляющее действие ингибитора ПКС, (5) -3,4- |М, М-1,1- ( (2" -зтокси-3" (0) -4"- (М, М-диметиламино) -бутан) -бис- (3,3'-мндолил)| -1 (Н) -пиррол-2, 5-диона, на рост

Зндотелиальньл клеток, стимулированньйй рекомбинантньім ФРОЗ человека.

На фиг.3 показано воздействие ингибитора ПКС на активность зндогенного ФРОСЗ, зкспрессируемого после культивирования перицитов сетчатки в условиях гипоксии.

На фиг.4 дополнительно показано подавляющее влияние ингибитора ПКС на рост зндотелиальньїх клеток, стимулированньїй рекомбинантньім ФРОСЗ человека. 70 На фиг.5А, 58 показана динамика проницаемости сетчатки, вьізванной ФРОСЗ.

На фиг.б показана реакция проницаемости сетчатки для флюоресцеина на ФРОЗ.

На фиг.7 показано действие ингибирования и стимуляции ПКС в стекловидном теле на проницаемость сетчатки.

На фиг.8А, 88 показано ингибирование проницаемости сетчатки в ответ на ФРСЗ с помощью орально /5 ВВводИимОГгОо ингибитора протейн киназь С р.

Подробное описание изобретения

Находкой согласно настоящему изобретению является то, что терапевтическое применение особого класса ингибиторов протеин киназьі С, а именно, ингибиторов изофермента р протеин киназьі С, и особенно, избирательньїх ингибиторов изофермента Др протеин киназьі С, противодействуєт воздействиям ФРОСЗ. В частности, откритием настоящего изобретения является то, что применение зтого особого класса ингибиторов протеин киназьі С противодействует росту клеток зндотелия и капиллярной проницаемости, особенно, росту клеток зндотелия и капиллярной проницаемости, стимулированньм фактором роста ФРОЗ. Следовательно, такие соединения могут применяться терапевтически для лечения заболеваний, связанньїх с ФРСЗ, в частности, множества глазньїх сосудистьїх расстройств. Ге!

В способе данного изобретения предпочтительно используются те ингибиторь! протеин киназьї С, которье о зффективно ингибируют или подавляют изофермент р. Одна подходящая группа соединений в общем описана в предшествующем уровне техники как бис-индолилмалеимидьї или макроциклические бис-индолилмалеимидьі.

Бис-индолилмалеимидь, хорошо известнье в предшествующем уровне техники, включают соединения, которье описаньі! в патентах США 5621098, 5552396, 5545636, 5481003, 5491242 и 5057614, и все они приведень! здесь ї- для сведения. Макроциклические бис-индолилмалеимидь, в частности, представлень! соединениями формуль! сч

Ї. Зти соединения и способьії их получения бьіли раскрьїтьї в патенте США 5 552 396, которьій здесь - для сведения. Зти соединения вводятся в терапевтически зффективном количестве млекопитающему для « ингибирования роста клеток зндотелия или капиллярной проницаемости, связанньїх с ФРОЗ, и для подавления « воздействий ФРОЗ, связанньїх с глазньіми заболеваниями. Зти соединения можно также вводить пациентам, подверженньїм риску упомянутьїх вьіше патологических состояний в качестве профилактических средств. ІФ)

Один предпочтительньйй класс соединений для применения в способе изобретения представляет соединения формуль!: « г () й о, с 0- М 0 х

М М

! і 1 хі - У щ» т» в которой:

М представляет -О-, -5-, -50-, -505-, -СО-, Со-Св алкилен, замещенньій алкилен, Со-Св алкенилен, -арил-, о -арил (СНо)тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл- (СНо)тО- -сконденсированньій бициклический-, -сконцентрированньй "м бициклический- (СНо)тО-, -«МВЗ-, -МОВЗ-, -«СОМН- или -МНСО-;

Х и Х представляют независимо С.-Су; алкилен, замещенньй алкилен, или Х, У и МУ скомбинировань! имеете с образованием -(СНо)пАА-; 99 В" радикаль! представляют водород или до четьірех необязательньхх заместителей, независимо вьібранньйх (ФІ из галогена, Сі-Су алкила, гидрокси, С4і-Су; алкокси, галогеналкила, нитро, МАВ или -МНСО(С1-Су алкил); т в2 представляет водород, СНУСО-, МН» или гидрокси;

ВЗ представляет водород, (СНо)т арил, Сі-Сзалкил, -СОФ(С.-Суа алкил); -СОМА"В?, «С-МНІМН», -ВО(С1-Са до алкил), -ВОХ(МА"А) или -505 (С1-Су алкил);

В" и ВЕ? представляют независимо водород, С1-С. алкил, фенил, бензил или комбинируются с азотом, с которьїм они связаньї, образуя насьіщенное или ненасьшщенное 5 или б--ленное кольцо;

АА представляет аминокислотньй остаток; т представляет независимо 0,1, 2 или З; и 65 п представляет независимо 2, З, 4 или 5, или их фармацевтически приемлемьсе соли, пролекарства или сложнье зфирнь!.

Более предпочтительньїй класс соединений для применения в данном изобретениий представлен формулой

І, в которой фрагменть! -Х-МУ-Ж- содержат от 4 до 8 атомов, которье могут бьіть замещенньми или не замещенньми. Более предпочтительно, фрагменть -Х-М/-ЖУ-содержат 6 атомов.

Другие предпочтительнье соединения для применения в способе данного изобретения являются соединениями формульй і, в которой Бо и БК? представляют независимо водород; и МУ представляєт замещенньй алкилен, -О-, 5-, -СОМН-, -МНСО- или -МАЗ. Особенно предпочтительньмми соединениями для применения в изобретений являются соединения формульі Іа: 706 Н (Іа) і й

М М

«Сну їв ри? ї сч ре (о) в которой 7 представляет -(СН 2)р - или - (СНо)р-О-(СНо)р; В" представляєт гидрокси, -ЗН, С.-С; алкил, зо (СН.)тарил, -МН(арил), - -ЖеСН») (СЕз), - МН(СЕ»5) или МАО; в представляет водород или С.4-Су алкил; о представляет водород, Ге

С.-С, алкил или бензил; р представляет 0,1 или 2; и т представляєт независимо 2 или 3, или их « фармацевтически приемлемье соли, пролекарства или сложнье зфирь. Наиболее предпочтительньми соединениями формуль! 1а являются те, в которьх 7 представляет СН »: а В? представляет -МН», МН(СЕз), - зв мли -М(СНз)», или их фармацевтически приемлемнье соли, пролекарства или сложнье зфирнь!. ю

Другие предпочтительнье соединения для применения в способе настоящего изобретения представляют соединения, в которьїх МУ в формуле | представляет -О-, У представляєт замещенньій алкилен, а Х представляет алкилен. Зти предпочтительнье соединения представлень формулой Ір: «

Іа

Н (а) З с і .

І» 0-20 лиш. 1 щ» ї» М М їмо) «сири (сну, ж ще о |! о Кк іме) в которой 2 представляет -(СН о)р-; В" представляєт МЕ 99; -МН(СЕз) или -М(СНз) (СЕз); В? и Во бо представляют независимо Н или С.-Су; алкил; р представляеєт 0,1 или 2; а т представляет независимо 2 или 3, или их фармацевтически приемлемьсе соли, пролекарства или сложнье зфирьі. Найболее предпочтительньми соединениями формуль! 15 являются соединения, в которьх р представляет 1; а КЗ и З представляют метил.

Соединения формул І, їа и ІБ ввиду того, что они содержат основную часть или фрагмент, могут также существовать в виде фармацевтически приемлемьх кислотно-аддитивньїх солей. Кислоть!, обьічно 65 используемье для образования таких солей, включают неорганические кислоть, такие как хлористоводородная, бромистоводородная, иодистоводородная, серная и фосфорная кислота, а также органические кислоть, такие как пара-толуолсульфоновая, метан-сульфоновая, щавелевая, пара-бромфенилсульфоновая, карбоновая, янтарная, лимонная, бензойная, уксусная кислота и родственньюе неорганические и органические кислоть.

Такие фармацевтически приемлемье соли, таким образом, включают сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, иодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формат, изобутират, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберинат, себацинат, фумарат, малеат, 2-бутин-1,4-дисат, З-гексин-2,5-дисоат, бензоат, хлорбензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, ксилолсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гиппурат, р-гидроксибутират, гликолят, малеат, тартрат, метансульфонат, 7/0 пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, манделат и аналогичнье. Особенно применяются хлористоводородная соль и мезилат.

В дополнение к фармацевтически приемлемьм солям могут также существовать другие соли. Они могут служить в качестве промежуточньїх продуктов при очистке соединений, при получении других солей или при идентификации и характеристике соединений или промежуточньїх продуктов.

Фармацевтически приемлемье соли соединений формул І, їа и ІБ могут также существовать в виде различньїх сольватов, таких как с водой, метанолом, зтанолом, диметилформамидом, зтилацетатом и аналогичньми. Могут также получаться смеси таких сольватов. Йсточником такого сольвата может бьть растворитель кристаллизации/ присущий растворителю получения или кристаллизации, или дополнительньй к такому растворителю.

Признано, что могут существовать различнье стереоизомернье формь! соединений формул І, а и ІБ; например, М/ может содержать хиральньій атом углерода в замещенной алкиленовой части. Соединения обьічно получаются в виде рацематов и могут удобно использоваться в зтом виде. Альтернативно, по желанию, с помощью обьічньїх методик могут вьіделяться или синтезироваться индивидуальнье знантиомерь!. Такие рацемать! и индивидуальнье знантиомерь и их смеси образуют часть соединений, используемьх в способах сі настоящего изобретения.

Соединения, используемье в данном изобретении, также охватьвшают фармацевтически приемлемьсе о пролекарства соединений формул І, Іа и ІБ. Пролекарство представляет собой лекарство, которое подвергнуто химической модификации и может бьіть биологически неактивньім в участке его действия, но которое может разрушаться или модифицироваться под влиянием одного или более ферментньїх или других процессов іп мімо ї- с образованием исходной родительской или бисактивной формьі. Вероятно, зто пролекарство может иметь фармакокинетический профиль, отличньій от родительского, обеспечивая облегчение всасьвания через сч зпителий слизистой оболочки, лучшее образование соли или лучшую растворимость и/или улучшенную «ф системную устойчивость (например, увеличение периода полувьвведения из плазмьї). Обьічно такие химические модификации включают следующие: З 1) сложнозфирньсе или амидньсе производньсе, которье могут расщепляться зстеразами или липазами; ю 2) пептидь, которне могут распознаваться спедцифичньми или неспецифичньіми протеазами; или

З) производньюе, которье накапливаются в участке действия посредством мембранной селекции пролекарственной формь или модифицированной пролекарственной формь; или любую комбинацию приведенньїх вьіше модификаций 1-3. Обьчнье способьі отбора и получения подходящих производньх « пролекарств описань, например, в работе К. Випоаагсі, Оевідп ої Ргодгидв, (1985). шщ с Синтез различньїх бис-индол-М-малеиймидньїх производньїх описан в патенте США 5 057 614, вьіданном й Оамів еї аЇ., а синтез предпочтительньїх соединений, подходящих для использования в зтом изобретении, и? описан в ранее указанном патенте США 5.552 396 и в описаний ЕР 0 657 4А11А1, вьіданного РЕаці еї аї., все из которьїх приведень! здесь для сведения.

Одним особенно предпочтительньім ингибитором протеин киназьі- Д для использования в способе данного с изобретения является соединениєе, описанное в примере 59 (хлористоводородная соль (5)-3,4-ІМ, М'-1,1- ((2"-зтокси) -3" (0) -4"- (М, М-диметиламино) -бутан) -бис-(3, 3'-индолил)|-1(Н)-пиррол-2,5-диона) е упомянутого вьіше патента США 5 552 396. Зто соединение является мощньм ингибитором протейин киназь С. г» Оно является селективньім по отношению к протеин киназе С, в сравнениий с другими киназами и является Ввісоко изофермент-селективнь!м, т.е. оно является селективньім в отношений бета-1 и бета-2 изоферментов. о Благоприятнь! также другие соли данного соединения, особенно мезилатнье соли. "і Предпочтительная мезилатная соль может бьіть получена с помощью реакции согдинения формульі ІІ: о й о ще

ГФ) іти й у. 60 я н ' о 65 о с метансульфоновой кислотой в не реакционноспособном органическом растворителе, предпочтительно смеси органического растворителя к водьі, и найболее предпочтительно вода-ацетон. Могут применялся и другие растворители, такие как метанол, ацетон, зтил-ацетат и их смеси. Соотношение растворителя и водь не 9 имеет принципиального значения и обьічно определяется растворимостью реагентов. Предпочтительнье соотношения растворителя и водь обьчно составляют в интервале от 0,1:1 до 10011 по обьему.

Предпочтительно, соотношение составляет от 1:11 до 20:11, и найболее предпочтительно от 5:1 до 101.

Оптимальное соотношение зависит от вьібранного растворителя, и предпочтительньм является ацетон при соотношений растворителя и водь 9:1. то В реакции обьічно участвуют зквимолярнье количества двух реагентов, хотя могут применяться другие соотношения, особенно такие, при которьїх имеется избьток метансульфоновой кислотьі. Скорость добавления метансульфоновой кислоть! не имеет принципиального значения для реакции, и она может добавляться бьістро («5 мин.) или медленно в течение б часов или более. Реакция проводится при температурах в диапазоне от 07С до температурьь дефлегмации. Реакционная смесь перемешиваєтся до тех пор, пока не завершится їз образование соли, что определяется по данньім порошковой рентгенограммь! и может занимать от 5 мин. до 12 часов.

Соли настоящего изобретения предпочтительно и легко получаются в кристаллической форме.

Тригидратную форму соли можно легко превратить в моногидрат после сушки или воздействия относительной влажности от 20 до бО9Уо. Соль является, по существу, кристаллической, имеющей определенную точку 720 плавления, двойное лучепреломление и характер рентгеновской дифракции. Обьічно кристалль! имеют менее, чем 1095 аморфного твердого вещества, предпочтительно менее, чем 595 и найболее предпочтительно менее, чем 1965 аморфного твердого вещества.

Мезилатная соль вьіделяется с помощью фильтрования или других признанньїх в данной области техники приемов разделения непосредственно из реакционной смеси с вьїходом в диапазоне от 5095 до 10095. При см желаний для дальнейшей очистки могут применяться перекристаллизация и другие приємь очистки, известнье (С) в данной области.

Зндотелиальнье клетки в тканевой культуре, стимулированнье факторами роста, такими как ФРСЗ, проявляют более вьісокую скорость роста, чем скорость роста базальньїх клеток. Зксперименть!, вбіполненнье м согласно настоящему изобретению, показали, что при введений іп міго в концентрации приблизительно от 0,1 до ЛО0Онмоль, ингибитор протеин киназьі С о кислотная соль (5)-3,4-ІМ,М'-1,1- ((2"-зтокси)-3" (0)-4"- се (М,М-диметиламино) -бутан) -бис- (3,3'-индолил)|І-1 (Н)-пиррол-2,5-диона значительно ингибирует рост не « базальньїхх клеток, стимулированньїх фактором роста (таким как ФРСЗ).

Важно, другие исследования показали, что рост нормальньїх зндотелиальньїх клеток в тканевой культуре не «Ж ингибируется зтим соединением, по данньім отсутствия ингибирования роста зндотелиальньїх клеток без ою стимуляции ФРОЗ в нормоксических кондиционированньх средах. В гипоксических кондиционированньїх средах скорость клеточного роста возрастает вследствие увеличения содержания зндогенного фактора роста, ФРОЗ, вьірабатьіваемого гипоксическими клетками. МИ снова ингибитор протеин киназьі С, кислотная соль (5) -3,4-

ІМ,М'-1,1- ((2"-зтокси)-3" (0) -4"7-(М,М-диметиламино) -бутан) -бис- (3,3'-индолил)|-1 « дю (Н)-пиррол-2,5-диона, нормализует клеточньй рост, вьізванньій такими гипоксическими условиями. з

Зкспериментьі), предоставленнье в настоящем изобретении, показьивают, что факторь! роста, такие как с ФРОЗ, также воздействуют на капиллярную проницаемость. Исследования показали, что в зкспериментальной :з» модели ФРОЗ значительно увеличивает капиллярную проницаемость, вплоть до трехкратного уровня. Зто зависимое от ФРОЗ увеличение капиллярной проницаемости также является дозозависимь!м. В соответствий с исследованиями на животньх іп мімо, введение ингибитора протеин киназьі С в концентрации приблизительно сл 15 25 мг/кгідень перед провокационной пробой с введением ФРОЗ значительно ингибировало капиллярную проницаемость, вбізванную ФРОСЗ. Особенно предполагается применение концентраций от 1 нмоль до 5 ммоль ї и предпочтительно от 1 нмоль до 500 нмоль. Ингибирование может достигать 8095 и обьічно специфично для 1» капиллярной проницаемости, вьізванной фактором роста. Капиллярную проницаемость можно измерить с помощью ангиографии с флюоресцеином. В частности, при отеке желтого пятна ангиография с флюоресцеийном іме) 50 является процедурой фотографирования сетчатки, включающей иньекцию флюоресцентного красителя в поток -ч крови для вьіявления зон утечки в сетчатку.

Хотя и не желая ограничиваться каким-либо техническим обьяснением, заявитель (заявители) считают, что изменения перфузии сетчатки, возникающие вследствие сниженного кровотока, потеря капилляров сетчатки, агенез или облитерация периферической сосудистой системь! или отделения хорисидального кровоснабжения от сетчатки - все зто может в результате привести к относительной ишемии сетчатки. Зта ишемия стимулирует

ГФ) синтез и секрецию факторов роста, таких как ФРОЗ в перицитах сетчатки, зндотелиальньх клетках, пигментном 7 зпителии сетчатки, клетках глийи и, возможно, в других типах клеток; и впоследствийи ведет к неоваскуляризации сетчатки и повьшенной капиллярной проницаемости. Зти состояния связаньій со множеством глазньїх сосудистьїх расстройств. бо Ингибиторьї Д изофермента ПКС согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения болезненньїх состояний, связанньїх с ростом зндотелиальньїх клеток и капиллярной проницаемости, особенно множества глазньїх сосудистьїх расстройств.

Глазнье сосудистье расстройства, которне можно лечить с помощью соединений настоящего изобретения, дб Включают, но не ограничиваются, дегенерацию желтого пятна, отек желтого пятна, сосудистую ретинопатию, окклюзию вен сетчатки, неоваскуляризацию радужной оболочки, гистоплазмоз и ишемические заболевания сетчатки. Дегенерация желтого пятна может бьіть возрастной. Отек желтого пятна может бьіть связан с диабетом или окклюзией центральной вень! сетчатки. Используемая здесь фраза сосудистая ретинопатия не включаеєет диабетическую ретинопатию, но включаєт сосудистую ретинопатию, связанную с серповидноклеточной анемией, недоношенностью (преждевременньм развитием) младенцев и неоваскуляризацией угла или трабекулярной сети. Неоваскуляризация радужной оболочки может бьть диабетической или не связанной с диабетом.

Специалист в данной области очевидно понимаєт, что терапевтически зффективное количество ингибиторов протейн киназь С-р, применяемьїх в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой 7/0 Количество, достаточное для ингибирования роста зндотелиальньх клеток или развития проницаєемости капилляров путем ингибирования ФРСОСЗ, и что данное количество варьирует в зависимости от размера пораженной ткани, концентрации соединения в терапевтической готовой форме и массь! тела пациента. Обьічно количество ингибитора Д изофермента протеийн киназь! С, вводимого в качестве терапевтического средства для лечения глазньїх сосудистьїх расстройств определяеєется в каждом случаеє лечащим врачом. В качестве 75 руководства при установлений соответствующей дозьі будут рассматриваться степень неоваскуляризации, масса тела и возраст пациента.

Обьічно подходящей дозой является доза, которая дает концентрацию ингибитора р изофермента протеин киназьі С в участке лечения, в диапазоне от 0,5 нмоль до 200 мкмоль, а более обьічно от 0,5 нмоль до 200 нмоль. Ожидается, что в большинстве случаев должна бьіть достаточной концентрация в сьіворотке от 0,5 нНмоль до 100 нмоль.

Для получения зтих лечебньїх концентраций нуждающемуся в лечений пациенту, вероятно, будет вводиться приблизительно от 0,001мг в день на кг массьї тела до 50,Омг в день на кг. Обьічно потребуется не более, чем приблизительно от 1,0 до 10,0мг в день на їкг массьі тела ингибитора протеин киназьі С-Дд. Как отмечалось вьіше, указаннье количества могут варьировать от случая к случаю. Ге

Соединения формульї І и предпочтительнье соединения формульї Іа и ІБ предпочтительно преобразуются в (5) готовне формь! или препарать! перед введением. Подходящие фармацевтические готовье формь! получают с помощью известньїх способов с использованием хорошо известньїх и легко доступньїх ингредиентов. При приготовлений композиций, подходящих для применения в способе настоящего изобретения, активньй ингредиент обьічно смешивается с носителем или разбавляется носителем, или помещается внутрь носителя, ї- которьій может бьіть в форме капсульі, саше, бумаги или другого контейнера. Когда носитель служит в качестве сч разбавителя, он может бьіть твердьім, полутвердьім или жидким материалом, которьій действует в качестве носителя, наполнителя или средь! для активного ингредиента. Так композиции могут бьіть в форме таблеток, «І пилюль, порошков, пастилок, саше, каше, зликсиров, суспензий, змульсий, растворов, сиропов, азрозоля (в « виде твердого вещества или в жидкой среде), мягких и твердь желатиновьїх капсул, в форме свечей, стерильньїх растворов для иньекций и стерильньїх упакованньїх порошков или для орального, или для местного Іо) применения.

Некоторье примерь! подходящих носителей, зксципиентов и разбавителей включают лактозу, декстрозу, сахарозньїй сорбит, маннит, крахмаль, камедь акации, фосфать! кальция, альгинат, трагакант, желатин, силикат « кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, водньй сироп, метилцеллюлозу, метил и пропилгидроксибензоать!, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Готовье - с формь! могут дополнительно включать смазочнье агентьї, увлажняющие агенть, змульгирующие и и суспендирующие агентьії, подслацивающие средства или агентьї или ароматизирующие средства. Композиции ,» изобретения могут составляться так, чтобьї обеспечить бьістрое, длительное или отсроченное вьісвобождение активного ингредиента после введения пациенту. Композиции предпочтительно составляются в форме единичной дозьі, причем каждая доза содержит от приблизительно 0,05мг до приблизительно Зг, более обьічно, 1 приблизительно 75О0мг активного ингредиента. Однако, следует понимать, что введенная терапевтическая доза ї» определяеєется врачом с учетом соответствующих обстоятельств, включая тяжесть подлежащего лечению состояния, вьібор подлежащего введению соединения и вьібранньій путь введения. Позтому указаннье вьіше т» диапазоньі дозировки никоим образом не предназначеньі! для ограничения обьема притязаний изобретения. 7 50 Термин "форма единичной дозь" относится к физически дискретньм единицам, подходящих в качестве стандартньїх доз для людей и других млекопитающих, причем каждая единица содержит заданное количество і активного материала, рассчитанное с целью вьізвать желательньій терапевтический зффект, в сочетаниий с подходящим фармацевтическим носителем.

В дополнение к указанньмм вьіше готовьім формам, большинство из которьїх может вводиться орально, соединения, применяемье в способе настоящего изобретения, могут также применяться местно. Формь! для о местного применения включают мази, кремь! и гели.

Мази обьчно получают с использованием или (1) маслянистой основь), т.е. основь, состоящей из іме) фиксированньїх масел или углеводородов, таких как бельй вазелин, или минеральное масло, или (2) абсорбентной основьї, т.е. основьі, состоящей из безводного вещества или веществ, которье могут поглощать 60 воду, например, безводньій ланолин. Обьічно после образования основьі, маслянистой или абсорбентной, добавляется активньй ингредиент (соединение) в количестве, обеспечивающем желаемую концентрацию.

Кремь! представляют собой масляно/водную змульсию. Они состоят из масляной фазь! (внутренней фазьї), обьчно включающей фиксированнье масла, углеводородьі и аналогичнье, такие как воски, вазелин, минеральное масло и аналогичнье, и водную фазу (непрерьівная фаза) включающую воду и любье 65 водо-растворимье вещества, такие как соли. Зти две фазьй стабилизируются с использованием змульгирующего средства, например, поверхностно-активного вещества, такого как натрийлаурилсульфат,

гидрофильнье коллоидьі, такие как коллоиднье глиньі акации, камедь и аналогичнье. После составления змульсийи обьічно добавляется активньйй ингредиент (соединениє) в количестве, необходимом для достижения желательной концентрации.

Гели включают основу, вьібранную из маслянистой основьї, водьі или змульсионно-суспензионной основь. К основе добавляеєется желирующее средство, которое формирует в основе матрицу, увеличивая ее вязкость.

Примерами желирующих агентов являются гидроксипропилцеллюлоза, полимерь акриловой кислоть! и аналогичнье. Обьчно активньій ингредиент (соединения) добавляеєется в готовую форму в желательной концентрации в момент, предшествующий добавлению желирующего агента. 70 Количество соединения, включаемого в сготовую форму для местного применения, не имеет принципиального значения; концентрация должна бьть в диапазоне, достаточном для обеспечения возможности бьістрого нанесения готового препарата на область пораженной ткани в количестве, которое доставит желаемое количество соединения в желаемьїй участок лечения.

Обьічное количество готовой формь для местного применения, которое предполагаеєется нанести на 7/5 пораженную ткань, зависит от размера пораженной ткани и концентрации соединения в форме. Обьчно готовьй препарат наносится на пораженную ткань в количестве, обеспечивающем приблизительно от 1 до 500мкг соединения на їсм пораженной ткани. Предпочтительно, нанесенное количество соединения находится в диапазоне приблизительно от 30 до ЗбОмкг/см2, более предпочтительно, приблизительно от 50 до 200мкг/см2 и найболее предпочтительно, приблизительно от 60 до 100мкг/см?.

Следующие примерь! готовьіх форм или препаратов являются только иллюстративньми и никоим образом не предназначеньї для ограничения обьема притязаний согласно изобретению.

Готовая форма

Твердье желатиновье капсуль! изготовленьї с использованием следующих ингредиентов: с

Количество (мг/капсулу)

Активное средство 250 і)

Крахмал вьсушенньй 200

Стеарат магния 10

Всего Абомг у

Указаннье ингредиенть! смешивают и ими в количествах 46бОмг заполняют твердье желатиновье капсульі. с

Готовая форма «

Таблетка изготавливаєется с использованием указанньїх ниже ингредиентов: «

Количество (мг/капсулу) ю

Активное средство 250 целлюлоза, микрокристаллическая 400 двуокись кремния, мелкодисперсная 10 стеариновая кислота 5 «

Всего ббБ5мг шщ с Компоненть! смешивают и прессуют для образования таблеток, масса каждой из которьїх составляет 6б5мг. :з» Готовая форма

Таблетки, каждая из которьїх содержит бОмг активного ингредиента, изготавливаются следующим образом:

Количество (мг/капсулу) 1

Активное средство бомг

Сг» крахмал 4БМГ ї» микрокристаллическая целлюлоза ЗБмг поливинилпирролидон (в виде 1095 раствора в воде) АмМг ко 50 растворимьй крахмал натрийкарбоксиметил 4, БмМг «М стеарат магния О,Бмг тальк 1мг

Всего 150мг 59 Активньй ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сито Мо45 меш США и тщательно смешивают.

ГФ) Раствор поливиниллирролидона смешивают с полученньми в результате порошками, которне пропускают т через сито Мо14 меш США. Полученнье таким образом грануль! сушат при 50"С и пропускают через сито Мо18 меш США. Растворимьіїй крахмал, стеарат магния и тальк, ранее пропущеннье через сито МобО меш США, затем добавляют в гранульі, которне после смешивания прессуют с помощью таблетирующего устройства для 60 получения таблеток, каждая из которьїх имеет массу 150мг.

Примерь!

Все зти примерьї демонстрируют использование хлористоводородной соли (5) -3,4- (М, М'-1,1- (2"-зтокси) -3"7 (0) -4"- (М, М-диметиламино) -бутан) -бис- (3,3'-индолил)| -1 (Н) -пиррол-2, 5-диона для ингибирования іп мйго роста зндотелиальньх клеток и ингибирования іп мімо увеличенной капиллярной проницаемости, бо стимулированной ФРС.

Пример 1

В данном опримере ингибирующий зффект указанного соединения в отношений роста клеток, стимулированного ФРОЗ, исследуют с использованием рекомбинантного человеческого ФРСЗ.

Бьічьи зндотелиальньсе клетки сетчатки вьіделяют из свежих глаз телят с помощью гомогенизации и серии зтапов фильтрации. Первичнье культурьї зндотелиальньїх клеток вьіращивают в покрьїтьїх фибронектином (МУВеп Кеадепів, Мем МогкК Віоод Сепіег) чашках (Совіаг), содержащих модифицированную среду ЮшШрессо 5

Еадчієзз (ОМЕМ) с 5,5 ммоль глюкозьі, 1096 полученной из плазмьї лошадиной сьіворотки (М/пеайп, Зсіепійіс), 5Омг гепарина на Тл и 50 единиц фактора роста зндотелиальньїх клеток на 1л (Воепгіпдег МаппПпеїіт). После 7/0 того, как клетки достигнут слияния, среду меняют, включая 595 сьіворотки плода теленка (НуСіопс). Среду меняют 1 раз в З дня. Гомогенность зндотелиальньїх клеток подтверждают с помощью антител против фактора

М.

Влияние указанного ингибитора ПКС на действие ФРОЗ іп міго оценивают с использованием вьсеянньх с низкой плотностью на чашки культур микрососудистьїх зндотелиальньїх клеток бьічьей сетчатки, которье /5 претерпевают стимуляцию роста после добавления ФРСОЗ. Зндотелиальньсе клетки бьічьей сетчатки внісевают с низкой плотностью («2500 клеток на 1 ячейку или лунку) на 24-луночнье чашки (Созіаг), инкубированнье в течение ночи в ОМЕМ, содержащей 10905 телячью сьіворотку (СІВСО). Среду меняют на следующий день.

Для исследования воздействия указанного ингибитора ПКС на рост зндотелиальньх клеток, проводят одну серию зкспериментов, в которой рост клеток в отсутствие какого-либо средства служит в качестве контроля, а го затем исследуют воздействие добавления указанного ингибитора ПКС и в присутствий ВРОСЗ (25нг/мл;

Сепейесі), и в отсутствие ФРОЗ. После инкубации при 37"С в течение 4 дней клетки лизируют в 0,195 додецилсульфате натрия (НДС), и измеряют содержание ДНК с использованием красителя Ноеспві 33258 и флюорометра (модель ТКО-100; Ноетег).

Все определения вьіполняют, по меньшей мере, триждьі, и зкспериментьї повторяют минимум три раза. с Результать! вниіражают в виде средних х стандартное отклонение по всем зкспериментам. Анализ результатов іп мійго вьшолняют с помощью непарного теста по Стьюденту. Величину Р, составляющую «0,050, считают о статистически достоверной.

На фиг.1 показань! результатьії, полученнье с использованием рекомбинантного ФРОСЗ. Как показано тремя самьми левьми столбиками на фиг., добавлениє указанного ингибитора ПКС в культуру зндотелиальньх

Зо клеток, по существу, не оказьівало воздействия на исходную скорость роста (первьій столбик). Скорость роста существенно возросла после добавления ФРОЗ (четвертьй столбик). Зта скорость роста значительно с уменьшается после добавления 20,5 нмоль указанного ингибитора ПКС (четьіре самьїх правьїх столбика). «І

Пример 2

Зтот пример аналогичен работе, представленной на фиг.1, и дополнительно иллюстрирует ингибирующее З

Зз5 Влияние указанного ингибитора ПКС она рост клеток, стимулированньй ФРСОСЗ, с использованием ю рекомбинантного человеческого ФРСОЗ.

Используя процедурь! примера 1, вьіделяют и вьіращивают бьічьи зндотелиальнье клетки сетчатки; затем получают засеяннье на чашки культурьі с низкой плотностью. Опять же используя процедуру примера 1, проводят зксперименть!, в которьїх исследуют влияние указанного ингибитора ПКС на рост зндотелиальньх « клеток и в присутствий ФРОЗ (25нг/мл; Сепейесі), и в отсутствие ФРОЗ. После инкубации при 37"С в'течение4 щу с дней клетки лизируют в 0,195 додецилсульфате натрия (НДС) и измеряют содержание ДНК с использованием й красителя Ноеспві 33258 и флюорометра (модель ТКО-100; Ноетгег). и? На фиг.2 показань!ї результать! зтой работьі. Как показано столбиками над подписью - ФРОСЗ, добавление указанного ингибитора ПКС в культуру зндотелиальньх клеток при концентрации от 0,1 нмоль до 100 нмоль, по существу, не оказьівало воздействия на исходную скорость роста клеток. Стимуляция зндотелиальньхх клеток сл рекомбинантньім человеческим ФРОЗ (25нг/мл) вьізьівала достоверное увеличение содержания клеточной ДНК через 4 дня, что указьвает на увеличение скорости роста, в сравнениий с нестимулированньми клетками ть (сравните - ФРОЗ при 0 с ї- ФРОЗ при 0). Зта скорость роста значительно уменьшается после добавления ї» указанного ингибитора ПКС (четьіре самьх правьх столбика над надписью ж- ФРСОСЗ). В частности, 5р стимулирующая способность ФРОЗ слегка снижалась в присутствий 0,1 нмоль ингибитора ПКС и, по существу, о полностью устранялась одновременньім добавлением ингибитора ПКС в концентрации 1 нмоль и вьіше. "І Пример З

В зтом примере исследуют воздействие указанного ингибитора ПКС на активность зндогенного ФРСОЗ, зкспрессируемую после культивации перицитов сетчатки в условиях гипоксии.

Бьічьи зндотелиальнье клетки сетчатки и перицить! сетчатки вьіделяют из свежих глаз телят с помощью гомогенизации и серии зтапов фильтрации. Используя процедурьі примера 1, зндотелиальнье клетки іФ) вьращивают и с низкой плотностью культивируют на чашках. Используя аналогичнье методики, перицить! ко бьічьей сетчатки культивируют в ОМЕМ/5,5ммоль глюкозь с 2095 сьіворотки плода теленка.

Гипоксическую кондиционированную среду для зкспрессии озндогенного ФРОЗ и нормоксическую бо Ккондиционированную контрольную среду соответственно готовят, вьіполняя следующие процедурьі. Слившиеся монослои перицитов сетчатки подвергают воздействию в течение 24 часов 295 0525/5956 СО5/9395 Мо с использованием совершенного, контролируемого компьютером инкубатора СО» Іар-ііпе Іпвігитепів с инфракрасной водяной рубашкой и контролем пониженного содержания кислорода (модель 480). Все клетки сохранялись при 377"С и при световой микроскопии в них не бьіло никаких морфологических изменений, они б5 Мсключали краситель трипан синий (298906) и в последующем их можно бьіло нормально пересевать. Клетки, инкубированнье в нормоксических условиях (9595 воздуха/596 СОз) из той же партии и пересева используют в качестве контролен. Среду затем собирают и перед использованием фильтруют (МаїЇдепе; 0,22мкм).

В зтом примере проводят зксперименть!, в которьїх исследуют воздействие указанного ингибитора ПКС на рост зндотелиальньїх клеток в присутствиий или нормоксической кондиционированной средь, или гипоксической

Кондиционированной средь. Как и в предьідущих зкспериментах, после инкубации при 37"С в течение 4 дней клетки лизируют в 0,196 додецилсульфате натрия (НДС) и измеряют содержание ДНК с использованием красителя Ноеспві 33258 и флюорометра (модель ТКО-100; Ноетгег). - В исследованиях, представленньїх на фиг.3, указанньій ингибитор ПКС используют в концентрации 10 нмоль. Как показано на фиг.3, рост зндотелиальньїх клеток сетчатки стимулируется кондиционированной 7/0 средой из перицитов сетчатки, культивированньх в гипоксических условиях, которье, как известно, вьізьівают зкспрессию ФРОЗ (сравните столбик 1 со столбиком З на фиг.3). Зта стимуляция роста подавляется (нормализуеєется) в присутствий соли хлористоводородной кислоть! (5) -3, 4- ІМ,М'-1,1- ((2"-зтокси). -3"(0 -47- (М, М-диметиламино) -бутан) -бис- (3,3'-индолил)| -1 (Н) -пиррол-2, 5-диона ингибитора ПКС (сравните столбик З со столбиком 4).

Пример 4

Зтот пример аналогичен работе, представленной на фиг1і и 2, и дополнительно иллюстрирует ингибирующее действие указанного ингибитора ПКСна рост клеток/ стимулированньій ФРСОЗ, с использованием рекомбинантного человеческого ФРСОЗ.

Используя процедуру примера 1, вьіделяют и вьіращивают бьічьи зндотелиальнье клетки сетчатки; затем 2о получают культурь, вьісеяннье с низкой плотностью на чашки. Опять же, используя процедуру примера 1, проводят зксперименть!, в которьїх исследуют влияние указанного ингибитора ПКС на рост зндотелиальньх клеток и в присутствий (-ФРОЗ)(25нг/мл; Сепеїесі), и в отсутствие ФРОЗ (-ФРСОСЗ). Как указано вьіше, после инкубации при 37"С в течение 4 дней клетки лизируют в 0,195 додецилсульфате натрия (НДС), и измеряют содержание ДНК с использованием красителя Ноеспві 33258 и флюорометра (модель ТКО-100; Ноегег). сч

На фиг.4 показань!ї результать! зтой работьі. Как показано столбиками над подписью - ФРОСЗ, добавление указанного ингибитора ПКС в культуру зндотелиальньїх клеток при концентрации 10 нмоль, по существу, не і) оказьвало воздействия вна исходную оскорость роста клеток. Стимуляция зндотелиальньх клеток рекомбинантньім человеческим ФРОЗ (25нг/мл) вьізьівала достоверное увеличение содержания клеточной ДНК, что указьівает на увеличение скорости роста, в сравнений с нестимулированньми клетками (сравните - ФРСЗ М зо Контроль с ЯФРОЗ контролем). Зта скорость роста значительно уменьшаеєтся после добавления указанного ингибитора ПКС в концентрации 10 нмоль. с

Зти результать! показьивают, что раскрьїтьій класс ингибиторов ПКС и, в частности, (5)-3, 4-ІМ,М'-1,1'-( «г (2"-зтокси)-3" (0)-4"- (М, М-диметиламино) -бутан) -бис- (3,3-индолил)| -1 (Н) -пиррол-2, 5-дион предотвращаєт стимуляцию іп міго роста зндотелиальньїх клеток, как зкзогенньм, так и индуцированньім - гипоксией ФРОСЗ. Поскольку зкспрессия ФРОСЗ бьла тесно связана с неоваскуляризацией, связанной с ю дегенерацией желтого пятна, зти результатьь подтверждают пользу данньїх ингибиторов ПКС в качестве терапий для лечения дегенерации желтого пятна.

Пример 5

Зтот пример показьівает динамику проницаемости сетчатки, индуцируемой ФРОЗ. «

В один глаз каждой крьісьі внутрь стекловидного тела производят иньекцию 2,О0нг ФРОСЗ (определенная з с конечная концентрация 25нг/мл). В противоположньїй глаз вводят аналогичньій обьем контрольного раствора.

Через 10 мин через катетер в правую яремную вену производят иньекцию 30 микролитров флюоресцеина. ;» Флюорофотометрию стекловидного тела вьіполняют в указаннье оотрезки времени после иньекции флюоресцеина.

Как показано на фиг.5А, в глазах, обработанньїх ФРОЗ, наблюдается отчетливое увеличение проницаемости с флюоресцеийна в стекловидное тело. Зто становится статистически достоверньм в пределах 1Омин после ангиограмной иньекции флюоресцеийна и сохраняется в течениеє, по меньшей мере, 30 мин. На фиг.5В показано, о что зта стимуляция, вьіраженная в процентах от контроля, демонстрирует наличие дополнительной утечки їх флюоресцеийна в глазах, обработанньїх ФРОЗ, с течением времени.

Пример 6 о Зтот пример показьшшаєт дозозависимую реакцию проницаемости сетчатки на флюоресцеин в ответ на

І ФРСОЗ.

В один глаз каждого животного производят иньекцию контрольного раствора, тогда Как в противоположньй глаз производят иньекцию различньх доз ФРОСЗ. Через 10 мин производят внутривенную иньекцию вв флюоресцеина и через 30 мин анализируют количество утечки в стекловидное тело. Как показано на фиг.б, наблюдалось дозозависимое увеличение проницаемости сетчатки. Стимуляция бьіла максимальной от 14 до (Ф) 2Онг/мл, что, как известно, можно получить у людей. ка Пример 7

Зтот пример показьівает зффект ингибитора ПКС, хлористоводородной соли (5) -3,4- |М,М'-1,1- (2"-зтокси) во 0737 (0) -47- (М,М-диметиламино) -бутан) -бис- (3,3'-индолил)| -1 (Н) -пиррол-2, 5-диона при введений в стекловидное тело и стимуляции ПКС проницаемости сетчатки.

Как указано на фиг.7, в глаза крьіс производят иньекцию или 2,0нг ФРСЗ на 1 глаз, 10 нмоля ПКС др ингибитора, или одного микрограмма РОВИ (агониста ПКС). Иньекцию ПКС р ингибитора производят за 15 мин до добавления ФРСЗ. Через 10 мин после добавления ФРОЗ производят внутривенно введение флюоресцеина 65 М через 30 мин оценивают содержание флюоресцейина в стекловидном теле.

Как показано на фиг.7, внутривенная иньекция ФРСОЗ вьявила ожидаемую стимуляцию проницаемости сетчатки. Иньекция ПКС Д ингибитора в стекловидное тело за 15 мин до иньекций ФРОЗ устраняла большую часть реакции в виде увеличения проницаемости. Прямая стимуляция протеин киназьі! С путем иньекциий РОВИО показала увеличение проницаемости, очень похожее на ФРОЗ.

Пример 8

Зтот пример демонстрирует ингибирование проницаемости сетчатки в ответ на ФРСОЗ под воздействием орального введения хлористоводородной осоли (5) -3,4- |М,М- 1,1- ((2'-зтокси) -3" (0) -4"- (М,М-диметиламино) -бутан) -бис- (3,3'-индолил)) -1 (Н) -пиррол-2, 5-диона.

Крьс кормят кормом, смешанньмм с ингибитором Д протеин киназьі С в дозах, указанньїх на фиг.ЗА и 88. 70 После такого кормления в течение 1 нед,, как обсуждалось ранее, определяют проницаемость сетчатки в ответ на внутривенную иньекцию 2,О0нг ФРСЗ. Оральное введение ингибитора ВД ПКС зтого изобретения в течение идной нед. снижало проницаемость сетчатки в ответ на ФРОЗ. Зто бьіло найболее заметно при более вьісоких дозах.

В предшествующем описаний раскрьть принципьї, предпочтительнье вариантьі реализации и видь 75 практического применения. Однако, изобретение, защита которого предполагается в данном случае, не должно рассматриваться как ограниченное конкретньмми раскрьїтьми формами, поскольку они должнь! расцениваться как иллюстративнье, а не ограничивающие. Специалистьі в данной области могут вносить вариации и изменения, не отходя от существа изобретения.

Ф ормула винаходу 1. Способ лечения глазньїх сосудистьїх расстройств, состоящих из дегенерации желтого пятна, отека желтого пятна, сосудистой ретинопатии, неоваскуляризации радужной оболочки, окклюзии вен сетчатки, с гистоплазмоза и ишемической болезни сетчатки, которьій включает введение нуждающемуся в таком лечений млекопитающему терапевтически зффективного количества ингибитора В-изофермента протеинкиназь! С і) следующей формуль!: . рг ;() ц -

О-- -0 с 1 1 ій

К в- «г у 7 ю у у соби « в которой: в с М представляет -О-, -5-, -50-, -505-, -СО-, -С2-Св алкилен, замещенньй алкилен, Со-Св алкенилен, -арил-, . -арил-(СНо)тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл-«(СНо)тО-, -конденсированньій бицикл-, -конденсированньй "» бицикл-(СН 5)то-, -МВЗ-, -МОВЗ-, -СОМН- или -МНСО-;

Х и Х представляют независимо С.-Су; алкилен, замещенньй алкилен или Х, У и МУ скомбинировань! вместе, образуя «СНо)пАА-; 1 В" радикаль представляют водород или до четьірех необязательньїх заместителей, независимо вьібранньх їз из галогена, Сі-Су алкила, гидрокси, С4і-Су; алкокси, галогеналкила, нитро, МАВ или -МНСО(С1-Су алкила); 2 представляет водород, СНУСО-, МН» или гидрокси; е ВЗ представляет водород, (СНо)т арил, С41-Су алкил, -СОФ(С1-Су алкил), -СОМВ" В, -«С-МН)МН», -ЗО(С4-Са

Ма 7 алкил), -505(МВ" ВЕ) или -505(С1-Су алкил); «м В и В? представляют независимо водород, С1-С4 алкил, фенил, бензил или скомбинировань с азотом, с которьїм они связаньі, образуя насьщенное или ненасьіщенное 5- или б--ленное кольцо;

АА представляет аминокислотньй остаток; т представляет независимо 0, 1, 2 или З;а п представляет независимо 2, З, 4 или 5, (Ф. или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства или сложного зфира.

ГІ 2. Способ по п.ї, в котором ингибитор В-изофермента протеинкиназь С представляет собой бис-индолилмалеиймид или макроциклический бис-индолилмалеимид. во З. Способ по п.1, в котором ингибитор является изофермент-селективньмм, и изофермент вьібирают из группьї, состоящей из изоферментов бета-1 и бета-2. 4. Способ по п.3, в котором ингибитор протеинкиназьі С представляет соединение, имеющее следующую формулу: б5

Claims (1)

1. р 2 () М ОО -О ' Й х й Й М - М І 1 у в которой: М представляет -О-, -5-, -50-, -505-, -СО-, -С2-Св алкилен, замещенньй алкилен, Со-Св алкенилен, -арил-, -арил-(СНо)тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл-«(СНо)тО-, -конденсированньій бицикл-, -конденсированньй бицикл-(СН 5)то-, -МВЗ-, -МОВЗ-, -СОМН- или -МНСО-; Х и Х представляют независимо С.-С; алкилен, замещенньй алкилен или Х, У и МУ скомбинировань вместе, образуя -СНо)пАА-; В! радикаль! представляют водород или до четьірех необязательньїх заместителей, независимо вьібранньх из галогена, Сі-Су алкила, гидрокси, С4і-Су; алкокси, галогеналкила, нитро, МАВ или -МНСО(С1-Су алкила); 2 представляет водород, СНУСО-, МН» или гидрокси; ВЗ представляет водород, (СНо)т арил, С41-Су алкил, -СОФ(С1-Су алкил), -СОМВ" В, -«С-МН)МН», -ЗО(С4-Са алкил), -ВОЗХ(МА ВУ) или -505(С1-Су алкил); с 29 В и В? представляют независимо водород, С1-С4 алкил, фенил, бензил или скомбинированьі с азотом, с (3 которьїм они связань, образуя насьіщенное или ненасьіщенное 5- или б--ленное кольцо; АА представляет аминокислотньй остаток; т представляет независимо 0, 1, 2 или З;а ча зо п представляет независимо 2, З, 4 или 5, или его фармацевтически приегмлемую соль, пролекарство или сложньїй зфир. Ге

   5. Способ по п.4, в котором ингибитор протеинкиназьі С имеет следующую формулу: « Іа) Н щі ' «І з О-и 2-0 ю ше лишити. (в) | М / (в 2 с М М " І Б сСнае Їсню. ій и ь Ї а їх Є з 20 в которой 2 представляет -"СНо)р или -«СНо)р-О-(СНо)р-; В" представляет гидрокси, -ЗН, С41-Са алкил, (СНо)тарил, -МН(арил), -СНазуСЕ»з), -«МН(СЕз) или МЕРЕ; У о представляет водород или С.4-Су алкил; до представляет водород, С.4-С; алкил или бензил; р представляєт 0, 1 или 2; а т представляет независимо 2 или 3, ГФ) или представляет его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сложньїй зфир.

   7 б. Способ по п.4, в котором ингибитор протеинкиназьі С представляет собой соединение следующей формуль!: бо б5 н ; (ІБ) М (б, (6 70 М М Їм за Їсн , 2 е і: 5--/ 7 ра в которой 2 представляет -«"СНо)р-; ВЕ представляєт -МЕ?ЕУ; -МН(СЕз) или -ЩСНЗХСЕз), 2: и 85 представляют независимо Н или С.-Су алкил; р представляєт 0, 1 или 2; а т представляет независимо 2 или 3, или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сложньій зфир. с

   7. Способ по п.4, в котором ингибитор протеинкиназь ІФ; представляет Ге) (5)-3,4-(М,М'-1,1'-((2"-зтокси)-3"7(0)-477-(М,М-диметиламино)-бутан)-бис-(3,3'-индолил)|-1(Н)-пиррол-2,5-дио н или его фармацевтически пригмлемую кислотную соль.

   8. Способ по п.1, в котором глазное сосудистое расстройство вьібрано из группьі, состоящей из дегенерации желтого пятна, отека желтого пятна, сосудистой ретинопатии, неоваскуляризации радужной оболочки, окклюзии т вен сетчатки, гистоплазмоза и ишемической болезни сетчатки. с

   9. Способ по п.1, в котором глазное сосудистое расстройство вьібрано из группьі, состоящей из дегенерации желтого пятна, отека желтого пятна и окклюзии вен сетчатки. З

   10. Способ по п. 8, в котором указанная сосудистая ретинопатия представляет собой ретинопатию «І недоношенности или преждевременного развития.

   11. Способ ингибирования роста клеток зндотелия, стимулированного фактором роста сосудистого юю зндотелия, которьій включает введение нуждающемуся в таком лечений млекопитающему терапевтически зффективного количества ингибитора В-изофермента протеинкиназьі С общей формуль!: рг що) « М о - с Оши и - » " р 1 р 1 Х / 1 М М щ х у ї» цих ма 70 в которой: М представляет -О-, -5-, -50-, -505-, -СО-, -С2-Св алкилен, замещенньй алкилен, Со-Св алкенилен, -арил-, "М -арил-(СНо)тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл-«(СНо)тО-, -конденсированньій бицикл-, -конденсированньй бицикл-(СН 5)то-, -МВЗ-, -МОВЗ-, -СОМН- или -МНСО-; Х и Х представляют независимо С.-Су; алкилен, замещенньй алкилен или Х, У и МУ скомбинировань! вместе, образуя -СНо)пАА-; ГФ) В" радикаль представляют водород или до четьірех необязательньїх заместителей, независимо вьібранньх ГІ из галогена, Сі-Су алкила, гидрокси, С4і-Су; алкокси, галогеналкила, нитро, МАВ или -МНСО(С1-Су алкила); 2 представляет водород, СНУСО-, МН» или гидрокси; 60 ВЗ представляет водород, (СНо)т арил, С41-Су алкил, -СОФ(С1-Су алкил), -СОМВ" В, -«С-МН)МН», -ЗО(С4-Са алкил), -ВОЗХ(МА ВУ) или -505(С1-Су алкил); В и В? представляют независимо водород, С1-С4 алкил, фенил, бензил или скомбинировань с азотом, с которьїм они связаньї, образуя насьіщенное или ненасьщенное 5-или б--ленное кольцо; АА представляет аминокислотньй остаток; 65 т представляет независимо 0, 1, 2 или З;а п представляет независимо 2, З, 4 или 5,

   или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства или сложного зфира.

   12. Способ подавления связанной с отеком капиллярной проницаемости, стимулированной фактором роста сосудистого зндотелия, которьій включаєт введение нуждающемуся в таком лечений млекопитающему Терапевтически зффективного количества ингибитора В-изофермента протеинкиназьі С общей формуль!: р 2 () ' М й р 1 р 1 М - М х У в которой: М представляет -О-, -5-, -50-, -505-, -СО-, -С2-Св алкилен, замещенньй алкилен, Со-Св алкенилен, -арил-, -арил-(СНо)тО-, -гетероцикл-, -гетероцикл-«(СНо)тО-, -конденсированньій бицикл-, -конденсированньй бицикл-(СН 5)то-, -МВЗ-, -МОВЗ-, -СОМН- или -МНСО-; Х и Х представляют независимо С.-Су; алкилен, замещенньй алкилен или Х, У и МУ скомбинировань! вместе, образуя -СНо)пАА-; В радикаль! представляют водород или до четьірех необязательньхх заместителей, независимо вьібранньх с из галогена, Сі-С; алкила, гидрокси, С4і-С; алкокси, галогеналкила, нитро, МАВ или -МНСО(С1-Су алкила); о 2 представляет водород, СНУСО-, МН» или гидрокси; ВЗ представляет водород, (СНо)т арил, С41-Су алкил, -СОФ(С1-Су алкил), -СОМВ" В, -«С-МН)МН», -ЗО(С4-Са алкил), -ВОЗХ(МА ВУ) или -505(С1-Су алкил); 4, рвр5 в. зо К" и КК? представляют независимо водород, С1-С; алкил, фенил, бензил или скомбинировань! с азотом, с которьїм они связаньї, образуя насьщенное или ненасьіщенное 5-или б--ленное кольцо; Ге АА представляет аминокислотньй остаток; « т представляет независимо 0, 1, 2 или З;а п представляет независимо 2, З, 4 или 5, чІ или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства или сложного зфира. ою -

   с . а 1 т» т» з 50 і ко бо б5