CZ349998A3 - Způsob léčení okulárních vaskulárních chorob - Google Patents

Description

1 1 ·· ····

·· ·♦ • · · ♦ · · ·

Léčba očních onemocnění souvisejících s VEGF

Oblast techniky Předkládaný vynález je obecně zaměřen na způsob pro inhibici růstu endotelových buněk a kapilární permeability, které jsou asociovány s vaskulárním endotelovým růstovým faktorem (VEGF), například zvýšeného růstu buněk a permeability indukované VEGF, za použití inhibitoru β izoenzymu proteinkinazy C (PKC). Tyto stavy indukované VEGF jsou těsně spojeny s různými cévními očními chorobami. Předkládaný vynález je zejména zaměřen na použití inhibitoru β izoenzymu protein kinasy C (PKC) pro léčbu očních cévních onemocnění zahrnujících makulární degeneraci, makulární edem, vaskulární retinopatii, uzávěr sítnicové žíly, neovaskularizaci duhovky, histoplasmosu a ischemická onemocnění sítnice.

Dosavadní stav techniky VPF/VEGF je glykosylováný, multifunkční cytokin. Nadměrná exprese VPF/VEGF je spojena s různými cévními chorobami oka. VPF/VEGF indukuje proliferaci endotelových buněk, nadměrnou permeabilitu prostřednictvím aktivace vesikulo-vakuolárními organelami zprostředkovaného transportu, migrace a reorganizace aktinu, která je spojena se změnou tvaru a zvlněním membrány. Mění genovou expresi v endotelových buňkách, včetně zvýšené produkce tkáňového faktoru a několika proteas, včetně intersticiální kolagenasy a urokinase podobného a tkáňového plasminogenového aktivátoru. Většina z těchto stejných genů je indukována forbolmyristatacetatem (PMA) stimulovanou aktivací PKC.

Vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF) spolu s fibroblastovým růstovým faktorem (FGF) a transformujícím růstovým faktorem (TGFS) hrají pravděpodobně hlavní roli ve zprostředkování aktivní intraokulární neovaskularizace u pacientů s ischemickými nemocemi sítnice (Aiello et al., New England Journal Medicine, 331(22): 1480 - 1487 (1994); Amin et al., Invest. Opthalmol Vis. Sci., 35: 3178 - 3188 (1994)).

Jedním z očních onemocnění spojených se zvýšenou expresí VEGF je makulární degenerace. S věkem související makulární degenerace je vedoucí příčinou slepoty ve stáří. Udává se, že makulární degenerace postihuje více než 16% lidí ve věku 85 let a starších a 6% lidí ve věku od 65 do 74 let. Více než 20% pacientů ve věku více než 75 let má makulární degeneraci. Onemocnění je častější u žen (Liebowitz HM, Krueer DE, Maunder LE et al., "The Framingham Eye Study: VI Macular Degeneration", Surv. Opthalmol. 24 (supp. 10: 428 - 457, 1980); Klein et al., "Prevalence of Age Related Maculopathy: The Beaver Dam Study", Opthalmology 99(6): 933 - 943, 1992). Makulární degenerace může být dělena na suchý a vlhký typ, kdy suchý typ je 10-krát častější, ale obecně méně závažný ve své klinické manifestaci. Závažnější vlhký typ, neboli exsudativní makulární degenerace, je spojen s abnormálním vrůstáním choroidálních cév (choroidální neovaskularizací) do subretinálního pigmentového epitelu nebo do subretinálního prostoru a často vede k závažné poruše zraku.

Makulární degenerace je počáteční patologickou lézí při objevu drůz, která představuje abnormální tkáňovou depozici ve vrstvě pigmentového epitelu sítnice (RPE) a o které se soudí, že je sekundární k vaskulární insuficienci. Nové krevní cévy potom prorůstají přes Bruchsovu membránu, která je mezi RPE a kapilárami chorioidei a způsobují invazi do sítnice. Tato invaze do sítnice způsobuje destrukci fotoreceptorů a může vést k hemorhagiím, které redukují zrak.

Jednou z nejběžnějších forem léčby makulární degenerace je laserová terapie. Laserová terapie je používána pro léčbu oblastí neovaskularizace, které nezasahují do centrální makulární oblasti (fovey). Nicméně, po laserové terapii jsou časté recidivy onemocnění (MPS Group, Arch. Opthalmol., svazek 109, str. 1232 - 1241 (1991)). Kromě toho, laserová terapie může vést ke vzniku reziduálního skotomu a proto není optimální terapií pro neovaskularizaci v centrálním makulárním regionu. Pouze omezený počet pacientů splňuje kriteria pro tuto formu léčby, hlavně z důvodu špatně definovaného, nebo skrytého charakteru, choroidální neovaskularizace, jak je často pozorováno. (Freund et al., Amer. Jour. Opthalmol., 115: 786 - 791 (1993)). Jako terapeutické činidlo byl také zkoušen interferon, na základě známé aktivity růstových faktorů jako je fibroblastový růstový faktor stimulovat patologickou angiogenesi. Nicméně, nebyl pozorován žádný příznivý účinek (Kirkpatrick et al., Br. J. Opthalmol. 77: 766 - 770 (1993); Chán et al. , Opthalmology 101: 289 - 300 (1994)) . V nedávné době byl neúspěšně uzavřen klinický pokus zkoušející transformující růstový faktor (TGF) beta-2 pro léčbu makulární degenerace. Biotechnology Newswatch, 1.1.1996. V souvislosti s rychlým stárnutím populace se makulární 4

··· · • · · « *

• · · • · · • · » • · · « · degenerace stává významným zdravotnickým problémem. V současné době zde neexistuje léčba vedoucí k vyléčení a neuspokojivé výsledky získané při léčbě laserem jsou jedinou přijímanou terapií, ačkoliv FDA v nedávné době schválil thalidomid pro použití v klinických pokusech s lidskými pacienty. ("Researchers Focus on Macular Degeneration: Cotnmon Eye Problems, Causes and Treatment Get New Attention" podle Steven Sternberg, Washington Post Health, 31.9.1995). V oboru stále existuje potřeba účinné terapie makulární degenerace.

Makulární edem je spojen s mnoha typy očních cévních onemocnění, jako je retinitis pigmentosa, diabetická retinopatie, pars planitis, obstrukce retinálních žil, senilní hyalitida, a je také spojen s nitroočními chirurgickými výkony (Henkind, Surv. Opthalmol. 28: 431 - 2 (1984); Bird, Surv. Opthalmol. 28: 433 - 6 (1984); Cunha-Vaz), Surv. Opthalmol. 28: 485 - 92 (1984)) . Cystoidní makulární edem je nejčastější komplikací po chirurgickém výkonu pro kataraktu (Yannuzzi,

Surv. Opthalmol. 28: 540 - 53 (1984)) a je pravděpodobně nej Častější příčinou ztráty zraku u pacientů po extrakci čočky (Jampol et al., Surv. Opthalmol. 28: 535 - 9 (1984)). Cystoidní makulární edem je obvykle sám o sobě omezen a i u chronických případů může dojít ke spontálnímu zlepšení (Yannuzzi, Surv. Opthalmol. 28: 540 - 53 (1984)). Nicméně, u malé části pacientů (1 - 15%) může dojít k rozvoji ireversibilního poškození a trvalému poškození zraku (Yannuzzi et al., Opthalmology 88: 847 - 54 (1981)).

Makulární edem je také příčinou pozdní ztráty zraku u pacientů s Vogt-Koyanagi-Haradovým (VKH) syndromem (Rutzen et al., J. Ret. and Vit. Dis. 15(6): 475 - 479 (1995)). Makulární edem je těsně asociován s mikroaneurysmaty u diabetické retinopatie a u osob bez diabetů se srpkovitou anemii, oklusí rozvětvené žíly, onemocněním karotid nebo těžkou hypertensí (Klein, Med. Clin. N. Am. 72: 1415 - 1437 (1989)). Mikroaneurysmata často propouštějí lipoproteinový materiál, což vede ke tvorbě hustých exsudátů. Tyto exsudaty mají rozptýlenou, agregovanou nebo kruhovitou konfiguraci. Když dojde k nahromadění exsudátů a tekutiny v zadní části sítnice, může vzniknout makulární edem, který může způsobit významné zastření zraku a může vést ke ztrátě zrakové ostrosti.

Laserový postup, nazývaný lokální fotokoagulace, je použit pro léčbu oblastí otoku sítnice v sousedství mikroaneurysmat.

Bylo prokázáno, že lokální fotokoagulace snižuje incidenci zhoršení zrakové ostrosti u 60% pacientů s klinicky významným makulárním edemem, ale nebyl prokázán přínos fotokoagulace u pacientů s mírným až středním makulárním edemem (Raskin et al., Ann. Int. Med. 117(3): 226 - 233 (1992)). Chirurgie na sklivci může zlepšit visuální prognosu pouze v případech diabetického makulárního otoku spojeného s patologickým vitreo-makulárním přechodem (Vaneffenterre et al., J. Francais D. Opthalmol. 16(11): 602 - 610 (1993)). Účinek léků jako je orální nebo lokální indometacin (Miwa, Drug Intell. Clin. Pharm. 20: 548 - 550 (1986)), stejně jako erytropoetin (Friedman et al., Amer. J. Kidney Dis. 26(1) : 202 - 208 (1995)) na makulární edem byl hodnocen, ale nebyl pozorován žádný významný přínos. V oboru existuje potřeba účinného léku pro terapii makulárního edemu. Ačkoliv bylo známo, že VEGF má určitou úlohu v patologii některých očních onemocnění, zbývalo určit, zda inhibice funkce VEGF poskytne terapeutický přínos v léčbě takových očních 6

·· · « ·

cívních onemocnění. Předkládaný vynález prokazuje, že inhibicí aktivity VEGF je možné zmírnit patologický stav způsobený různými očními cévními chorobami.

Podstata vynálezu Předmětem předkládaného vynálezu jsou způsoby pro léčbu očních cévních onemocnění.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu pro inhibici kapilární permeability spojené s makulárním edemem u savců.

Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu pro inhiJpici neovaskularizace indukované vaskulárním endotelovým růstovým faktorem (VEGF) .

Tyto a další předměty předkládaného vynálezu jsou poskytnuty jedním nebo více provedeními popsanými dále. V jednom provedení vynálezu je poskytnut způsob pro léčbu očních cévních onemocnění, který obsahuje podání terapeuticky účinného množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C savcům, kteří potřebují takovou léčbu. V jiném provedení vynálezu je poskytnut způsob pro léčbu makulární degenerace u savců, ve kterém je uvedeným savcům podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C. V ještě jiném provedení vynálezu je poskytnut způsob pro 7 7 • « · · • · » «ι « • · • · «· · · • · · · · « · • * · · · · • · · ···· · • · · φ · • · ··» |« φφ inhibici kapilární permeability spojené s makulárním edemem u savců, ve kterém je uvedeným savcům podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C. V jiném provedení vynálezu je poskytnut způsob pro inhibici vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF)ř ve kterém je uvedeným savcům podáno množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C inhibující VEGF. Předkládaný vynález poskytuje znalosti a identitu sloučenin, které jsou profylaktické a účinné v léčbě různých očních cévních onemocnění.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 ukazuje inhibiční účinek inhibitoru PKC, (S) -3,4- (N,N' -1,1' - ((2' ' -ethoxy) -3' ' ' (0) -4· ' ' - (N,N-dimethylamino) -butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dionu na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Obrázek 2 dále ilustruje inhibiční účinek inhibitoru PKC, (S)-3,4- (N,Ν'-1,1'-((2''-ethoxy) -3 1 '' (0)-4''’-(N,N-dimethylamino)-butan) -bis-(3,3'-indolyl)) -1 (H) -pyrrol-2,5-dionu na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Obrázek 3 ukazuje vliv inhibitoru PKC na aktivitu endogenního VEGF exprivovaného při kultivaci pericytů sítnice za hypoxických podmínek.

Obrázek 4 dále ilustruje inhibiční účinek inhibitoru PKC na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským 8 • · ·· ** VEGF.

Obrázky 5A, 5B ukazují časový průběh retnální permeability indukované VEGF.

Obrázek 6 ukazuje odpověď retinální permeability pro fluorescenční činidlo na VEGF.

Obrázek 7 ukazuje vliv intravitreální inhibice PKC a stimulace na retinální permeabilitu.

Obrázky 8A, 8B ukazují inhibici retinální permeability způsobené VEGF orálně podaným inhibitorem protein kinasy C β.

Objevem předkládaného vynálezu je, že terapeutické použití určité třídy inhibitorů proteinkinasy C, t.j. inhibitorů β-izoenzymu proteinkinasy C, a zejména inhibitorů PKC selektivních pro β-izoenzym, působí proti účinkům VEGF. Konkrétně, objevem předkládaného vynálezu je, že použití této určité třídy inhibitorů proteinkinasy C působí proti růstu endotelových buněk a permeabilitě kapilár, zejména proti růstu endotelových buněk a proti kapilární permeabilitě stimulované růstovým faktorem VEGF. V důsledku toho mohou být takové sloučeniny použity terapeuticky pro léčbu onemocnění spojených s VEGF, zejména pro léčbu různých očních cévních onemocnění.

Způsob podle předkládaného vynálezu výhodně využívá ty inhibitory proteinkinasy C, které účinně inhibují β-izoenzym. Jedna vhodná skupina sloučenin je v oboru obecně popsána jako bis-indolylmaleimidy nebo makrpcyklické bis-indolylmaleimidy.

Bis-indolylmaleimidy, které jsou v oboru dobře známé, zahrnují ty sloučeniny, které jsou popsané v U.S. patentech 5621098, 5552396, 5545636, 5481003, 5491242 a 5057614, které jsou zde všechny uvedeny jako odkaz. Makrocyklické bis-indolylmaleimidy j sou konkrétně representovány sloučeninami podle vzorce I. Tyto sloučeniny, a způsoby pro jejich přípravu, byly popsány v U.S. patentu 5552396, který je zde uveden jako odkaz. Tyto sloučeniny jsou podávány v terapeuticky účinném množství savcům pro inhibici růstu endotelových buněk nebo kapilární permeability spojené s VEGF a pro inhibici účinků VEGF spojených s nemocemi oka. Tyto sloučeniny mohou být také podány pacientům s rizikem vzniku onemocnění popsaných výše jako profylaxe.

Jedna výhodná třída sloučenin pro použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu má vzorec:

N N

kde: W je -0-, -S-, -SO-, -S02-, -CO-, C2-Cs alkylen, substituovaný alkylen, C -C alkenylen, -aryl-, -aryl(CH ) 0-, -heterocyklus-(CH2)mO-, -fušovaný, bicyklický-, -fušovaný 10 #·

• ♦ ···· · ··« ·· ·· bicyklický-(CH2)mO-, -NR3-, -NOR3-, -CONH-, nebo -NHCO-; X a Y jsou nezávisle C^-C^ alkylen, substituovaný alkylen nebo tvoří X, Y a W dohromady -(CH2)n-AA-;

Rx jsou vodíky nebo více než čtyři volitelné substituenty nezávisle vybrané z halogenu, 0χ-04 alkyl, hydroxy, Ci-C4 alkoxy, haloalkyl, nitro, NR4RS, nebo NHCOÍC^-C^ alkyl); R2 je vodík, CH3CO-, NH2 nebo hydroxy; R3 je vodík, CH2)maryl, C^-C^ alkyl, -COO(Ci-C4 alkyl), -COONR4Rs, -(C=NH)NH2, -SO (C^-C^alkyl) , -S02(NR4Rs) nebo -S02(Ci-C4 alkyl); R4 a R5 jsou nezávisle vodík, C^-C^ alkyl, fenyl, benzyl, nebo jsou kombinovány na dusíku, na který jsou navázány za vzniku 5 nebo 6 členého kruhu; AA je aminokyselinový zbytek; m je nezávisle 0, 1, 2 nebo 3; a n je nezávisle 2, 3, 4 nebo 5, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo estery. Výhodnější třída sloučenin pro použití v předkládaném vynálezu je představována vzorcem I, ve kterém skupiny -X-W-Y-obsahují 4 až 8 atomů, které mohou být substituované nebo 11 11 « · · · · · • · · • · # «* ·· • · · · · · • t · * ♦ « · «· · « · • · · · ·«· ·· ·· nesubstituované. Nejvýhodněji obsahují skupiny -X-W-Y- 6 atomů.

Jinými výhodnými sloučeninami pro použití v předkládaném vynálezu jsou ty sloučeniny podle vzorce I, ve kterých jsou R1 a R2 vodíky; a W je substituovaný alkylen, -0-, S-, -C0NH-, -NHCO- nebo -NR3-. Zejména výhodné sloučeniny pro použití v předkládaném vynálezu jsou sloučeniny podle vzorce Ia:

(Ia) kde Z je nebo - (CHa) -0- (CH2)p-; R4 je hydroxy, -SH, Ci-C4 alkyl, (CH2)m aryl, -NH(aryl), -N(CH3)(CF3) , -NH(CF3) nebo -NRsRe; Rs je vodík nebo C^-C^ alkyl; Re je vodík, C^-C^ alkyl nebo benzyl; p je 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo estery. Nejvýhodnější sloučeniny podle vzorce Ia jsou ty, kde Z je CH2; a R4 je -NH2, -NH(CF3) nebo -N(CH3)2, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo estery.

Jinými vhodnými sloučeninami pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu jsou sloučeniny, ve kterých je W ve 12 «* ···· ···· · ♦ ·· ·· ·· I · · · I · ·· ·· · · 4 • · 4 • Φ ·· vzorci I -0-, Υ je substituovaný alkylen a X je alkylen. Tyto výhodné sloučeniny jsou representovány vzorcem Ib:

H

kde Z je -(CH ) R* je -N(CH ) (CFJ , -NH(CF ) nebo -NRsRe; Rs a R6 jsou nezávisle H nebo C -C alkyl; p je 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo estery. Nejvýhodnější sloučeniny podle vzorce Ib jsou ty, kde p je 1; a Rs a Re jsou methyl.

Jelikož obsahují bazickou skupinou, mohou sloučeniny podle vzorců I, Ia a Ib také existovat jako farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou. Kyseliny běžně používané pro tvorbu takových solí zahrnují anorganické kyseliny jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, sírová a fosforečná, stejně jako organické kyseliny jako je kyselina para-toluensulfonová, methansulfonová, ščavelová, para-bromfenylsulfonová, uhličitá, jantarová, citrónová, benzoová, octová a příbuzné anorganické a organické kyseliny. Takové farmaceuticky přijatelné soli zahrnují sulfát, 13 • · ·*· · 4 • · 4 Μ ·· pyrosulfat, bisulfat, sulfit, bisulfit, fosfát, mono-hydrogenfosfat, dihydrogenfosfat, metafosfat, pyrofosfat, chlorid, bromid, jodid, octan, propionat, dekanoat, kaprylat, akrylat, formát, isobutyrat, heptanoat, propiolat, oxalat, malonat, sukcinat, suberat, sebacate, fumarat, malat, 2-butyn-l,4-dioat, 3-hexyne-2,5-dioat, benzoat, chlorobenzoat, hydroxybenzoat, methoxybenzoat, ftalat, xylensulfonat, fenylacetat, fenylpropionat, fenylbutyrat, citrát, laktat, hippurat, β-hydroxybutýrat, glykolat, malat, vinan, methansulfonat, propansulfonat, naftalen-l-sulfonat, naftalen-2-sulfonat, mandlan a podobně. Jsou používány zejména hydrochloridové a mesylatové soli.

Kromě farmaceuticky přijatelných solí mohou také existovat jiné soli. Tyto soli mohou sloužit jako meziprodukty při přečištění sloučenin, při přípravě jiných solí nebo při identifikaci a charakterizaci sloučenin nebo meziproduktů.

Farmaceuticky přijatelné soli sloučenin podle vzorců I, Ia a Ib mohou také existovat jako různé solvaty, jako jsou solvaty s vodou, methanolem, ethanolem, dimethylformamidem, ethylacetatem a podobně. Mohou být také připraveny směsi takových solvatů. Zdroj takového solvatu může být rozpouštědlo pro krystalizaci, vlastní rozpouštědlo pro přípravu nebo krystalizaci nebo jiné takové rozpouštědlo.

Je známo, že mohou existovat různé stereoizomerické formy sloučenin podle vzorce I, Ia a Ib; například, W může obsahovat chirální atom uhlíku v substituované alkylenové skupině. Sloučeniny jsou normálně připraveny jako racemické směsi a mohou být běžně jako takové použity. Alternativně mohou být 14 14 Μ ·»♦·

• · « ·<►·· *· ·· • I · · • · ·♦ ·«· · · • · · • I #· izolovány oba jednotlivé enantiomery, nebo mohou být syntetizovány běžnými technikami, pokud je to žádoucí. Takové racemické směsi a jednotlivé enantiomery a jejich směsi tvoří část sloučenin použitých ve způsobech podle předkládaného vynálezu.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu také zahrnují farmaceuticky přijatelná proléčiva sloučenin podle vzorce I, Ia a Ib. Proléčivo je léčivo, které bylo chemicky modifikováno a může být biologicky inaktivní v místě svého účinku, ale které může být degradováno nebo modifikováno jedním nebo více enzymatickými nebo jinými in vivo procesy na původní bioaktivní formu. Toto proléčivo bude pravděpodobně mít jiný farmakokinetický profil než původní léčivo, který bude umožňovat lepší absorpci přes slizniční epitel, lepší tvorbu solí a rozpustnost a/nebo zlepšenou systémovou stabilitu (například prodloužený plasmatický poločas). Typicky zahrnují takové chemické modifikace: 1) esterové nebo amidové deriváty, které mohou být štěpeny esterasami nebo lipasami; 2) peptidy, které mohou být rozpoznávány jednou nebo více proteasami; nebo 3) deriváty, které jsou akumulovány v místě účinku prostřednictvím membránové selekce proléčiva nebo modifikovaného proléčiva; nebo jakoukoliv kombinaci 1 až 3. Běžné postupy pro výběr a přípravu vhodných derivátů působících jako proléčiva jsou popsány, například, v H. Bundgaard, Design of Prodrugs (1985). «· 99*9 • · * • * • · * • · ·»*· * ·· 9 9 9 9 9 9*9 99 9 9 9 *99 9 9 99 9 9 9 99· 9 9 9 99 99 99 99 9 9 9 X5

Syntesa různých bis-indol-N-maleimidových derivátů je popsána v Davis et al., U.S. patent 5057614 a syntesy výhodných sloučenin vhodných pro použití v předkládaném vynálezu jsou popsány v dříve uvedeném U.S. patentu 5552396 a v Faul et al., EP přihláška 0657411 Al, které jsou zde uvedeny jako odkaz.

Jedním zejména výhodným inhibitorem proteinkinasy β podle předkládaného vynálezu je sloučenina popsaná v příkladu 5g ((S)-3,4-(Ν,Ν'-Ι,Ι1-((2'1-ethoxy)-3'''(O)-4'1’-(N, N-dimethylamino)- butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2, 5-dion hydrochloridová sůl) podle výše uvedeného U.S. patentu 5552396. Tato sloučenina je silným inhibitorem proteinkinasy C. Je selektivní pro proteinkinasu C vzhledem k ostatním kinasam a je vysoce selektivní pro izoenzym, t.j. je selektivní pro beta-1 a beta-2 izoenzymy. Také soli této sloučeniny mohou být výhodně použity, jako například mesylatové soli.

Výhodné mesylatové soli mohou být připraveny reakcí sloučeniny podle vzorce II

(II) 16 • * ·· ···· • · · ·· Μ s methansulfonovou kyselinou v nereaktivním organickém rozpouštědle, výhodně ve směsi organické rozpouštědlo/voda, a nejlépe ve směsi voda-aceton. Jiná rozpouštědla jako je methanol, aceton, ethylacetat a jejich směsi mohou být také použita. Poměr rozpouštědla ku vodě není zásadní a obecně je určen rozpustností reagens. Výhodné poměry rozpouštědla k vodě jsou obecně od 0,1:1 do 100:1 podle objemu. Výhodně je poměr 1:1 až 20:1 a nejlépe je 5:1 až 10:1. Optimální poměr závisí na vybraném rozpouštědle a výhodně je to 9 dílů acetonu ku 1 dílu vody.

Reakce obvykle vyžaduje přibližně ekvimolární množství dvou reagens, ačkoliv jiné poměry, zejména takové, kde je převaha kyseliny methansulfonové, mohou být také použity. Rychlost přidání kyseliny methansulfonové není zásadní pro reakci a kyselina může být přidána rychle (za méně než 5 minut) nebo pomalu v průběhu 6 nebo více hodin. Reakce je prováděna při teplotách v rozsahu od 0 °C do refluxu. Reakční směs je míšena do té doby, dokud není tvorba soli dokončena, jak je určeno rentgenovou difrakcí v prášku, což může trvat od 5 minut do 12 hodin. soli podle předkládaného vynálezu jsou výhodně a snadno připraveny jako krystalická forma. Trihydratové formy soli mohou být snadno přeměněny na monohydraty sušením nebo expozicí 20 - 60% relativní vlhkosti. Sůl je významně krystalická, když vykazuje definovanou teplotu tání, dvoj lom a charakter rentgenové difrakce. Obecně krystaly obsahují méně než 10% amorfní pevné látky, lépe méně než 5% a nejlépe méně než 1% amorfní pevné látky.

Mesylatová sůl je izolována filtrací nebo jinými technikami separace, které jsou známy v oboru přímo z reakční směsi za zisku v rozmezí od 50% do 100%. Rekrystalizace a jiné techniky přečištění v oboru známé mohou být použity k dalšímu přečištění solí, pokud je to žádoucí.

Endotelové buňky v tkáňové kultuře stimulované růstovými faktory jako je VEGF vykazují vyšší rychlost růstu než je základní rychlost růstu buněk. Pokusy provedené v předkládaném vynálezu ukázaly, že při podání in vitro, v koncentraci od přibližně 0,1 do 100 nM, způsobuje inhibitor proteinkinasy C, (8)-3,4 -(N, Ν'-1,1'-((2" -ethoxy) -3 ' ' ' (O) -4 ' ' ' - (N, N-dimethylamino)- butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dionová sůl s kyselinou signifikantní inhibici růstovým faktorem (jako například VEGF) stimulovaného non-bazálního růstu buněk. Důležité je, že další testování prokázalo, že normální endotelové buňky kultivované ve tkáňové kultuře nejsou inhibovány touto sloučeninou, jak bylo prokázáno chyběním inhibice růstu endotelových buněk bez stimulace VEGF v normooxickém kondicionovaném mediu. V hypoxickém kondicionováném mediu se rychlost růstu zvyšuje díky zvýšení obsahu endogenního růstového faktoru, VEGF, který je produkován hypoxickými buňkami. Opět, inhibitor proteinkinasy C, (S)-3, 4-(N,N’-1,1'-((2''-ethoxy)-3'''(0)-4'''-(N, N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dionová sůl s kyselinou, normalizuje růst buněk indukovaný takovými hypoxickými podmínkami.

Pokusy provedené v předkládaném vynálezu demonstrují, že permeabilita kapilár je také ovlivněna růstovými faktory jako 18 • t • · · « » · · · ·· · · * • · · ·· »· je VEGF. Testování ukázalo, že ve zvířecím modelu VEGF významně zvyšuje permeabilitu kapilár až na trojnásobek. Toto zvýšení permeability kapilár závislé na VEGF je také závislé na dávce. Podle in vivo testování na zvířatech, podání inhibitoru proteinkinasy C v koncentraci okolo 25 mg/kg/den před expozicí VEGF významně inhibuje permeabilitu kapilár indukovanou VEGF. Konkréktě se předpokládá použití koncentrací od l nM do 5 mM, a zejména od 1 nM do 500 nM. Inhibice může být více než 80% a obecně je specifická pro permeabilitu kapilár indukovanou růstovým faktorem. Kapilární permeabilita může být měřena flurescenční angiografií. Zejména při makulárním edemu je fluorescenční angiografie fotografickou technikou, která vyžaduje injekci fluorescenčního barviva do krevního řečiště a detekci oblastí úniku barviva do sítnice.

Bez omezení na jakékoliv technické vysvětlení vynálezci soudí, že změny v prokrvení sítnice vznikající v důsledku sníženého toku krve, ztráty sítnicových kapilár, agenese periferní vaskulatury nebo její obliterace, nebo separace choroidálního krevního zásobení od sítnice mohou všechny vést k relativní ischemii sítnice. Tato ischemie stimuluje syntesu a sekreci růstových faktorů jako je VEGF v pericytech sítnice, endotelových buňkách, pigmentovém epitelu sítnice, gliích a pravděpodobně v dalších typech buněk; a ve svém důsledku vede k neovaskularizaci sítnice a ke zvýšené permeabilitě kapilár.

Tyto stavy jsou spojeny s různými cévními chorobami oka.

Inhibitory β-izoenzymu PKC popsané v předkládaném vynálezu mohou být použity pro léčbu onemocnění spojených s růstem endotelových buněk a s permeabilitou kapilár, zejména pro léčbu různých očních cévních onemocnění.

·· •I ·♦·*

» I • · · Oční cévní onemocnění, která je možno léčit sloučeninami podle předkládaného vynálezu zahrnují, ale nejsou omezena na, makulární degeneraci, makulární edem, vaskulární retinopatii, oklusy retinální žíly, neovaskularizaci duhovky, histoplasmosu a ischemická onemocnění sítnice. Makulární degenerace může souviset s věkem. Makulární edem může být spojen s diabetem nebo s centrální oklusí sítnice. Jak je zde použit, nezahrnuje výraz vaskulární retinopatie diabetickou retinopatii, ale zahrnuje vaskulární retinopatii spojenou se srpkovitou anemií, s nedonošenci a neovaskularizaci úhlu nebo trabekulární sítě. Neovaskularizace duhovky může být spojena s diabetem, nebo nemusí být ve spojitosti s diabetem.

Odborník v oboru pozná, že terapeuticky účinné množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C podle předkládaného vynálezu je množství dostatečné pro inhibici růstu endotelových buněk nebo pro vývoj permeability kapilár pomocí inhibice VEGF a že toto množství se liší - mimo jiné - v závislosti na velikosti poškozené tkáně, na koncentraci sloučeniny v terapeutickém přípravku a na tělesné hmotnosti pacienta.

Obecně, množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C podaného jako terapeutické činidlo pro léčbu očních cévních onemocnění bude určeno případ od případu ošetřujícím lékařem. Při stanovení vhodné dávky by měl být brán v úvahu rozsah neovaskularizace, tělesná hmotnost a věk pacienta.

Obecně, vhodná dávka je taková, která vede ke koncentraci inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C v léčeném místě v rozmezí od 0,5 nM do 200 μΜ, lépe od 0,5 nM do 200 nM. Očekává se, že sérové koncentrace od 0,5 nM do 100 nM budou dostatečné za většiny okolností. 20 I · ·

Pro získání těchto léčebných koncentrací bude pacientovi, který potřebuje léčbu, pravděpodobně podáno mezi přibližně 0,001 mg na den na kg tělesné hmotnosti a 50,0 mg na den na kg. Obvykle by nemělo být potřeba více než přibližně 1,0 až 10,0 mg na den na kg tělesné hmotnosti inhibitoru proteinkinasy C β.

Jak bylo uvedeno výše, množství se bude lišit případ od případu.

Sloučeniny podle vzorce I a výhodné sloučeniny podle vzorce Ia a Ib jsou výhodně formulovány před podáním. Vhodné farmaceutické přípravky jsou připraveny podle známých postupů za použití dobře známých a snadno dostupných přísad. Při výrobě sloučenin vhodných pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu bude aktivní složka obvykle smísena s nosičem, neboo bude ředěna v nosiči, nebo bude uzavřena v nosiči, který může být ve formě kapsle, pytlíků, papírků nebo jiného kontaineru. Pokud slouží nosič jako ředidlo, pak to může být soliní, semisolidní nebo kapalný materiál, který účinkuje jako vehikulum, přísada nebo medium pro aktivní složku. Tak může být přípravek ve formě tablet, pilulek, prášku, pastilek, pytlíků, oplatek, elixírů, suspenzí, emulsí, roztoků, sirupů, aerosolu (ve formě pevné látky nebo v kapalném mediu), kapslí z tvrdé a měkké želatiny, čípků, sterilních roztoků pro injekce a sterilně balených prášků pro buď orální, nebo lokální aplikaci. Některé příklady vhodných nosičů, přísad a ředidel zahrnují laktosu, dextrosu, sacharosu, sorbitol, manitol, škroby, akacii, fosforečnany vápenaté, alginat, tragant, želatinu, křemičitan vápenatý, mikrokrystalickou celulosu, polyvinylpyrrolidon, celulosu, vodní sirup, methylcelulosu, methyl a propylhydroxybenzoaty, talek, steran hořečnatý a

21 21

• ·· • # • « •· ···· minerální olej. Přípravek může dále obsahovat zvlhčovači činidla, kluzná činidla, emulsifikační a suspendující činidla, konzervační činidla, sladidla a chuťová korigens. Přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován tak, aby umožňoval rychlé, zpomalené nebo oddálené uvolňování aktivní složky po podání pacientovi. Přípravky jsou výhodně formulovány v jednotkové dávkové formě, kdy každá dávka obsahuje od přibližně 0,05 mg do přibližně 3 g, lépe okolo 750 mg aktivní složky. Nicméně je jasné, že podaná terapeutická dávka bude určena lékařem podle okolností včetně závažnosti léčeného stavu, výběru sloučeniny, která je podána a vybraného způsobu podání. Proto nelimitují výše uvedené rozsahy dávek žádným způsobem rozsah předkládaného vynálezu. Termín "jednotková dávková forma" označuje fyzikálně samostatnou jednotku, která je vhodná jako jednotková dávka pro lidské pacienty a jiné savce, kdy každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivního materiálu, které je vypočítané tak, aby produkovalo požadovaný terapeutický účinek, spolu s vhodným farmaceutickým nosičem.

Kromě výše uvedených formulací, z nichž většina může být podána orálně, mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu také podány lokálně. Lokální přípravky zahrnují masti, krémy a gely.

Masti jsou obvykle připraveny za použití buď (l) olejové baze, t.j. baze skládající se z fixovaných olejů nebo uhlovodíků, jako je bílá vazelína nebo minerální olej, nebo (2) absorbentní baze, t.j. baze skládající se z anhydridní substance nebo substancí, které mohou absorbovat vodu, jako je například anhydridní lanolin. Obvykle je po vytvoření baze, ati

22 22 » · · ♦ • 9 *· * * * • ·* ·· · · * • · « »· *· olejové nebo absorbentní, přidána aktivní složka (sloučenina) v množství dostatečném pro vytvoření požadované koncentrace.

Krémy jsou emulse olej/voda. Skládají se z olejové fáze (vnitřní fáze), která typicky obsahuje fixované oleje, uhlovodíky a podobně, jako jsou vosky, vazelína, minerální olej a podobně, a vodnou fázi (souvislou fázi), která obsahuje vodu a jakékoliv substance rozpustné ve vodě, jako jsou přidané soli. Dvě fáze jsou stabilizovány za použití emulsifikačního činidla, například povrchově aktivního činidla, jako je například lauryl síran sodný; hydrofilní koloidy, jako je akaciová koloidní hmota, veegum, a podobně. Při tvorbě emulse je aktivní složka (sloučenina) obvykle přidána v množství dostatečném pro dosažení požadované koncentrace.

Gely obsahují bázi vybranou z olejových baží, vody nebo baze emulse-suspenze. K této bázi je přidáno činidlo způsobující tvorbu gelu, které vytvoří matrici v bázi tím, že zvýší její viskozitu. Příklady činidel způsobujících tvorbu gelu jsou hydroxypropylcelulosa, polymery kyseliny akrylové, a podobně. Obvykle je aktivní složka (sloučenina) přidána do přípravku v požadované koncentraci v době před přidáním činidla způsobujícího tvorbu gelu.

Množství sloučeniny obsažené v přípravku pro lokální podání není zásadní; koncentrace by měla být v rozmezí dostatečném pro umožnění snadné aplikace přípravku na postiženou oblast tkáně v množství, které dodá požadované množství sloučeniny do požadovaného léčeného místa.

Obvyklé množství lokálního přípravku, které je aplikováno na

postiženou tkáň závisí na velikosti poškozené tkáně a na koncentraci sloučeniny v přípravku. Obecně, přípravek bude aplikován na postiženou tkáň v množství od přibližně 1 do přibližně 500 /xg sloučeniny na cm2 postižené tkáně. Výhodně bude aplikované množství sloučeniny v rozmezí od přibližně 30 do přibližně 300 ptg/cm2, lépe od přibližně 50 do přibližně 200 μg/cm2, a nejlépe od přibližně 60 do přibližně 100 μg/cm2. Následující příklady přípravků jsou pouze ilustrativní a nejsou míněny jako jakékoliv omezení rozsahu předkládaného vynálezu. Přípravek 1

Kapsle z tuhé želatiny jsou připraveny za použití následujících složek: množství (mg/kapsli)

Aktivní složka 250 Škrob, sušený 200

Stearan hořečnatý 10

Celkem 460 mg Výše uvedené složky jsou smíseny a plněny do kapslí z tuhé želatiny v množství 460 mg. Přípravek 2

Tableta je připravena za použití následujících složek: 24 24 • · · • · · · · • · · ·· ♦ · * « ♦ · · # · ··♦· * množství (mg/kapsli)

Aktivní složka 250

Celulosa, mikrokrystalická 400

Oxid křemičitý, poresní 10

Kyselina stearová 5

Celkem 665 mg

Složky jsou smíseny a stlačeny do formy tablet, kde každá tableta obsahuje 665 mg. Přípravek 3

Tablety obsahující 60 mg aktivní složky jsou připraveny následujícím způsobem: množství (mg/tabletu)

Aktivní složka 60 mg Škrob 45 mg Mikrokrystalická celulosa 35 mg Polyvinylpyrrolidon 4 mg (jako 10% roztok ve vodě) Karboxymethyl škrob sodný 4,5 mg Stearan hořečnatý 0,5 mg Talek 1 Celkem 150 mg

Aktivní složka, škrob a celulosa jsou prosety přes U.S. síto Č. 45 a jsou důkladně promíseny. ARoztok polyvinylpyrrolidonu je smísen s vzniklým práškem, který je potom proset přes U.S. síto č. 14. Takto produkované granule jsou sušeny při 50 °C a jsou prosety přes U.S. síto č. 18. Karboxymethyl škrob sodný, 25

• · · · · stearan hořečnatý a talek, předem proseté přes U.S. síto č. 60, jsou potom přidány ke granulím, které jsou po míšení stlačeny na přístroji pro výrobu tablet za zisku tablet o hmotnosti 150 mg. Příklady provedení vynálezu Všechny tyto příklady demonstrují použití (S)-3,4-(Ν,Ν'-1, l' - ((2 ' 1 -ethoxy) -3 11 1 (0) -41 ’ 1 - (Ν,Ν-dimethylamino) -butan) -bis- (3,3 -indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dion hydrochloridové soli pro inhibici růstu endotelových buněk in vitro a pro inhibici zvýšené kapilární permeability, stimulované VEGF, in vivo. Příklad 1 V tomto příkladu byl inhibiční účinek uvedené sloučeniny na růst endotelových buněk stimulovaný VEGF vyšetřován za použití rekombinantního lidského VEGF.

Hovězí endotelové buňky sítnice byly izolovány z čerstvých telecích očí homogenizací a sérií kroků filtrace. Primární kultury endotelových buněk byly kultivovány na fibronetinem (NYBen Reagents, New York Blood Center) potažených plotnách (Costar) obsahujících Dulbeccovo modifikované Eagovo medium (DMEM) s 5,5 mM glukosy, 10% plasmatické koňské sérum (Wheaton, Scientific), 50 mg heparinu na litr a 50 jednotek růstového faktoru endotelových buněk na litr (Boehringer Mannheim) . Poté, co dosáhly buňky konfluence, bylo medium změněno tak, aby obsahovalo 5% fetální hovězí sérum (HyClone). Medium bylo měněno každé tři dny. Homogenita endotelových buněk byla potvrzena anti-faktor VIII protilátkami. 26 ·· I i ·· Účinek uvedeného PKC inhibitoru na působení VEGF in vitro byl hodnocen za použití řídce rozmístěných kultur endotelových buněk hovězí sítnicové mikrovaskulatury, které jsou stimulovány po přidání VEGF. Endotelové buňky hovězí sítnice byly umístěny v nízké koncentraci (asi 2500 buněk na jamku) na 24-jamkové plotně (Costar) a byly inkubovány přes noc v DMEM obsahujícím 10% telecí sérum (GIBCO). Medium bylo vyměněno následující den.

Pro vyšetření vlivu uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk byla provedena jedna sada pokusů, ve které růst buněk za absence jakéhokoliv aktivního činidla sloužil jako kontrola a pak byl vyšetřován vliv přidání uvedeného inhibitoru PKC jak v přítomnosti VEGF (25 ng/ml; Genetech) , tak za absence VEGF. Po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-lOO; Hoefer). Všechna vyšetření byla provedena nejméně třikrát a pokusy byly opakovány nejméně třikrát. Výsledky jsou pro všechny pokusy vyjádřeny jako průměry ± SD. Analýza in vitro výsledků byla provedena nepárovým Student t testem. Hodnota p < 0,050 byla považována za statisticky významnou.

Obrázek 1 ukazuje výsledky získané za použití rekombinantního VEGF. Jak je vidět ve třech sloupcích na obrázku nejvíce nalevo, přidání uvedeného inhibitoru PKC ke kultuře endotelových buněk nemělo žádný vliv na základní růst buněk (sloupec 1). Rychlost růstu se významně zvýšila po přidání VEGF (čtvrtý sloupec). Tato růstová rychlost byla významně snížena po přidání > 0,5 nM uvedeného inhibitoru PKC

27 ·« ·♦·· • · · • t (čtyři pravé sloupce). Příklad 2

Tento příklad je podobný práci popsané na obrázku 1 a dále ilustruje inhibiční činek uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Za použití postupů podle příkladu 1 byly izolovány a kultivovány endotelové buňky hovězí sítnice; potom byly připraveny kultury s nízkou koncentrací buněk. Opět, za použití postupu podle příkladu 1, byly provedeny pokusy, ve kterých byl vyšetřován vliv přidání uvedeného inhibitoru PKC jak v přítomnosti VEGF (25 ng/ml; Genetech), tak za absence VEGF.

Po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-100; Hoefer).

Obrázek 2 ukazuje výsledky tohoto pokusu. Jak je ukázáno ve sloupcích pod označením -VEGF, nemělo přidání uvedeného inhibitoru PKC ke kultuře endotelových buněk v koncentraci od 0,01 nM do 100 nM v podstatě žádný vliv na základní rychlost růstu buněk. Stimulace endotelových buněk rekombinantním lidským VEGF (25 ng/ml) produkovala významné zvýšení buněčného obsahu DNA po 4 dnech, což ukazuje na zvýšení rychlosti růstu, ve srovnání s nestimulovánými buňkami (srovnání -VEGF v 0 a +VEGF v 0). Tato růstová rychlost byla významně snížena po přidání uvedeného inhibitoru PKC (čtyři pravé sloupce pod označením +VEGF). Přesněji, stimulační kapacita VEGF byla mírně redukována za přítomnosti 0,1 nM inhibitoru PKC a byla v podstatě zcela eliminována simultáním přidáním l nM a vyšším

množství inhibitoru PKC. Příklad 3

Tento příklad vyšetřuje vliv uvedeného inhibitoru PKC na aktivitu endogenního VEGF vyjádřenou při kultivaci pericytů sítnice za hypoxických podmínek.

Endotelové buňky hovězí sítnice a pericyty sítnice byly izolovány z čerstvých telecích očí homogenizací a sérií kroků filtrace. Endotelové buňky byly kultivovány a usídleny v nízkých koncentracích na plotnách za použití postupů popsaných v příkladu 1. Za použití podobných technik byly pericyty hovězí sítnice kultivovány v DMEM/5.5 mM glukosa s 20% fetálním hovězím sérem.

Hypoxické kondicionované medium pro endogenní VEGF expresi a normoxické kondicionované kontrolní medium byly připraveny v příslušném pořadí podle následujících postupů.Konfluentní monovrstva pericytů sítnice byla vystavena na dobu 24 hodin 2% Oa/5% C02/93% Na za použití Lab-Line Instruments pokročilého počítačem kontrolovaného infračerveného C02 inkubátoru s vodním pláštěm s redukovanou kyslíkovou kontrolou (model 480). všechny buňky byly udržovány při teplotě 37 °C a nevykazovaly žádné morfologické změny při optické mikroskopii, vylučovaly trypanovou modř {> 98%) a mohly být dále normálně pasážovány. Buňky inkubované za normoxických podmínek (95% vzduch/5% C02) ze stejné vsádky a pasážované byly použity jako kontrola.

Medium bylo potom odebráno a filtrováno (Nagene; 0,22 μιη) před použitím. V tomto příkladu byly provedeny pokusy, ve kterých byl vyšetřován vliv uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk za přítomnosti buď normoxického kondicionovaného media nebo hypoxického kondicionovaného media. Stejně jako to bylo provedeno v předcházejících příkladech, po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-lOO; Hoefer). V testech uvedených na obrázku 3 byl uvedený inhibitor PKC použit v koncentraci 10 nM. Jak je ukázáno na obrázku 3 růst endotelových buněk sítnice byl stimulován kondicionovaným mediem z pericytů sítnice kultivovaných za hypoxických podmínek, o kterých je známo, že indukují expresi VEGF (srovnej sloupec 1 ke sloupci 3 na obrázku 3) . Tento růst byl potlačen (normalizován) za přítomnosti soli inhibitoru PKC (S)-3,4-(N,N'-1,1'-((2'1-ethoxy)-3’»’(0)-4’·*-(N,N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3’-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dionu s kyselinou chlorovodíkovou (porovnej sloupec 3 ku sloupci 4). Příklad 4

Tento příklad je podobný práci popsané na obrázku 1 a 2 a dále ilustruje inhibiční činek uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Za použití postupů podle příkladu 1 byly izolovány a kultivovány endotelové buňky hovězí sítnice; potom byly připraveny kultury s nízkou koncentrací buněk. Opět, za použití postupu podle příkladu 1, byly provedeny pokusy, ve kterých byl vyšetřován vliv přidání uvedeného inhibitoru PKC jak za přítomnosti VEGF (+VEGF) (25 ng/ml; Genetech), tak za absence VEGF (-VEGF). Stejně jako výše, po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-lOO; Hoefer).

Obrázek 4 ukazuje výsledky tohoto pokusu. Jak je ukázáno ve sloupcích pod označením -VEGF, nemělo přidání uvedeného inhibitoru PKC ke kultuře endotelových buněk v koncentraci 10 nM v podstatě žádný vliv na základní rychlost růstu buněk. Stimulace endotelových buněk rekombinantním lidským VEGF (25 ng/ml) produkovala významné zvýšení buněčného obsahu DNA po 4 dnech, což ukazuje na zvýšení rychlosti růstu, ve srovnání s nestimulovanými buňkami (srovnej -VEGF v 0 a +VEGF v 0) . Tato růstová rychlost byla významně snížena po přidání uvedeného inhibitoru PKC v koncentraci 10 nm.

Tyto výsledky ukazují, že objevená třída inhibitorů PKC a přesněji, (S)-3,4-(N,N'-1,1'-((2''-ethoxy)-3''« (0)-4''’-(N,N--dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dion, brání in vitro stimulaci růstu endotelových buněk sítnice jak exogenním, tak hypoxií indukovaným VEGF. Protože exprese VEGF je těsně spojena s neovaskularizací asociovanou s makulární degenerací, podporují tyto výsledky použití těchto inhibitorů PKC v terapii makulární degenerace. Příklad 5

Tento příklad demonstruje časový průběh permeability sítnice indukované VEGF. 31 31 ····

# · ··· ··· ·♦ ·· • · · ► · ·· • · · · 4 • · 4 ·· *·

Do jednoho oka každé krysy byla podána intravitreální injekce 2,0 ng VEGF (při konečné koncentraci 25 ng/ml). Kontralaterální oko dostalo podobný objem kontrolního roztoku. Po 10 minutách bylo 30 mikrolitrů fluorescenčního činidla injikováno katetrem do pravé véna jugularis. Fluorofotometrie sklivce byla provedena v ukázaných časech po injekci fluorescenčního činidla.

Jak je ukázáno na obrázku 5A, je zde jasné zvýšení v permeabilitě fluorescenčního činidla do sklivce v očích ošetřených VEGF. Toto zvýšení se stává statisticky významným po 10 minutách od injekce fluorescenčního činidla a přetrvává po dobu nejméně 30 minut. Obrázek 5B ukazuje, že tato stimulace vyjádřená jako procento kontroly ukazuje, že zde existuje další pronikání fluorescenčního činidla v očích ošetřených VEGF v průběhu Času. Příklad 6

Tento příklad ukazuje dávkovou závislost permeability sítnice pro fluorescenční činidlo v odpovědi na VEGF.

Do jednoho oka každého zvířete byl injikován kontrolní roztok, zatímco do kontralaterálního oka byly injikovány různé dávky VEGF. O 10 minut později byla podána intravenosní injekce fluorescenčního činidla a velikost úniku do sklivce byla analyzována po 30 minutách. Jak je ukázáno na obrázku 6, existuje zde zvýšení permeability sítnice závilé na dávce VEGF. Stimulace byla maximální při 14 až 20 ng/ml o kterých je známo, že jsou získávány u lidí. 32 ·« ···· ·· • ' ♦ ··· ·· t %·· • · ··. ··· · « Příklad 7

Tento příklad ukazuje účinek intravitreálního inhibitoru PKC (S)-3,4-(Ν,Ν--1,1'-((2' '-ethoxy)-3''' (0)-4‘''-(N,N--dimethylamino)-butan)-bis- (3,3’-indolyl))-l(H)-pyrrol-2,5-dion -hydrochloridové soli a jeho stimulaci permeability sítnice.

Do očí krys byla podána injekce buď 2,0 ng VEGF na oko, 10 nM PKC β inhibitoru nebo jeden mikrogram PDBU (agonista PKC) , jak je ukázáno na obrázku 7. PKCfi inhibitor byl inj ikován 15 minut před přidáním VEGF. 10 minut po přidání VEGF bylo podáno fluorescenční činidlo a obsah fluorescenčního činidla ve sklivci byl hodnocen po 30 minutách.

Jak je ukázáno na obrázku 7, intravitreální injekce VEGF ukázala očekávanou stimulaci permeability sítnice. Intravitreální injekce PKCfi inhibitoru 15 minut před injekcí VEGF eliminovala většinu vyvolané permeability. Přímá stimulace proteinkinasy C injekcí PDBU demonstrovala zvýšení permeability, které bylo velice podobné tomu, které bylo způsobeno VEGF. Příklad 8

Tento příklad ukazuje inhibici permeability sítnice v odpovědi na VEGF orálně podaným inhibitorem proteinkinasy C β, kterým je (S)-3,4-(N,N' -1,1' - ( (2' '-ethoxy)-3’ ' (O) -4 * ' - (N, řídíme thylamino) -butan) -bis- (3,3' -indolyl)) -1 (H) -pyrrol-2,5-dion, hydrochloridová sůl.

Krysy byly krmeny potravou smíšenou s inhibitorem proteinkinasy C β v dávkách, které jsou ukázány na obrázcích 8A a 33 33 m ·· ·· ···· • · · #· ·· • • · • · • ·· • * -• · · • · ···· · • • a»« • • • ··· • ·« • • ·* 8B. Po jednom týdnu byla určena permeabilita sítnice v odpovědi na 2,0 ng intravitreálně injikovaného VEGF způsobem, který byl uveden výše. Orální podávání PKCS inhibitoru podle předkládaného vynálezu trvající jeden týden redukovalo permeabilitu sítnice v odpovědi na VEGF. Tato skutečnost byla nejvýraznější při vysokých dávkách.

Principy, výhodná provedení a způsoby podle předkládaného vynálezu byly popsány ve výše uvedené přihlášce. Nicméně, vynález není omezen na určité popsané formy, které které jsou spíše ilustrativní než limitující. Odborníky v oboru mohou být provedeny různé variace a změny, bez odchýlení se od rozsahu a duchu vynálezu. á

Claims (11)

1. 34 • · ··· · Ί*ι

   • · * ·· ·· IPatento-v-ěš η á r oky 1. Způsob pro léčbu očních cévních onemocnění vyznačující se tím, že savcům, kteří potřebují takovou léčbu, je podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β izoenzymu proteinkinasy C.
2. 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že inhibitorem β izoenzymu proteinkinasy C je bis-indolylmaleimid nebo makrocyklický bis-indolylmaleimid.
3. 3. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený inhibitor je selektivní pro izoenzym a izoenzymová selektivita je vybrána ze skupiny skládající se z beta-1 a beta-2 izoenzymů.
4. 4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že inhibitor proteinkinasy C má následující vzorec: R2

   N N

   kde: W je -0-, -S-, -S0-, -S02-, -C0-, C2-Cfi alkylen, substituovaný alkylen, C2-Cg alkenylen, -aryl-, -aryl(CH2)mO-, 35 • · « · • · · · · -heterocyklus-,-heterocyklus-(CH2)mO-, -fušovaný bicyklický-ř -fušovaný bicyklický-(CH2)mO-, -NR3-, -NOR3-, -CONH-, nebo -NHCO-; X a Y jsou nezávisle Cx-C4 alkylen, substituovaný alkylen nebo tvoří X, Y a W dohromady -(CHa)n-AA-; R1 jsou vodíky nebo až čtyři volitelné substituenty nezávisle vybrané z halogen, Cx-C4 alkyl, hydroxy, C1-C4 alkoxy, haloalkyl, nitro, NR4R1, nebo NHCO(Ci-C4 alkyl); R2 je vodík, CH3CO-, NHa nebo hydroxy; R3 je vodík, (CH2)maryl, Cx-C4 alkyl, -COO(Cx-C4 alkyl), -CONR4R1, -<C=NH)NH2, -SO(Cx-C4alkyl), -S02(NR4Rs) nebo -S02(Cx-C4 alkyl); R4 a Rs jsou nezávisle vodík, Cx-C4 alkyl, fenyl, benzyl, nebo jsou kombinovány na dusíku, na který jsou navázány, za vzniku nasyceného nebo nenasyceného 5 nebo 6 členného kruhu; AA je aminokyselinový zbytek; m je nezávisle 0, 1, 2 nebo 3; a n je nezávisle 2, 3, 4 nebo 5, nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo estery. 1 Způsob podle nároku 4vyznačující se tím, 36 ··»· • ·· · že inhibitor proteinkinasy C má následující vzorec: H (Ia) Z i R kde Z je nebo - (CHa)p-0- (CHa)p-; R4 je hydroxy, -SH, C^-C^ alkyl, (CHa)m aryl, -NH(aryl), -N(CH3)(CF3), -NH(CF ) nebo -NRBRe; RB je vodík nebo C -C alkyl; R6 je vodík, C^-C^ alkyl nebo benzyl; p je 0, l nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo ester.
5. 6. Způsob podle nároku 4vyznačujícísetím, že inhibitor proteinkinasy C má následující vzorec: H

   • % « Μ ♦· ·»· ···

   < CH2 > m CCHg m

   Z IR 4

   37 37 % · ···· kde Z je -(CH ) R4 je -N(CH ) (CFJ , -NH(CF) nebo -NR5R6; 2 p 3 3 3 Rs a Re jsou nezávisle H nebo C^-C^ alkyl; p je 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo ester.
6. 7. Způsob podle nároku 4vyznačující se tím, že inhibitor proteinkinasy C obsahuje (S)-3,4-(N,N'-1,1'-((2''--ethoxy)-3’''(O)-41''-(Ν,Ν-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'--indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dion nebo jeho farmaceuticky přijatelnou adiční sůl s kyselinou.
7. 8. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že oční cévní onemocnění je vybráno ze skupiny skládající se z makulární degenerace, makulárního edemu, vaskulární retinopatie, neovaskularizace duhovky, okluse sítnicové žíly, histoplasmosy a ischemických onemocnění sítnice.
8. 9. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že oční cévní onemocnění je vybráno ze skupiny skládající se z makulární degenerace, makulárního edemu a okluse sítnicové žíly.
9. 10. Způsob podle nároku 8vyznačující se tím, že uvedená vaskulární retinopatie je retinopatie nedonošenců.
10. 11. Způsob pro inhibici růstu endotelovych buněk stimulovaného VEGF vyznačující se tím, že savcům, kteří potřebují takovou léčbu, je podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β izoenzymu proteinkinasy C.
11. 12. Způsob pro inhibici VEGF stimulované kapilární permeability spojené s edemem vyznačující se tím, že savcům,

    38 • «

    kteří potřebují takovou léčbu, je podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β izoenzymu proteinkinasy C.