NO322209B1 - Anvendelse av en proteinkinase C for terapeutisk behandling av VEGF-relaterte oyesykdommer - Google Patents

Description

O ppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av en proteinkinase C for fremstilling av et medikament for behandling av en vaskulær øyeforstyrrelse. Ved denne anvendelsen foregår inhibering av endotelcellevekst og kapillarpermeabilitet forbundet med vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), for eksempel den forøkte cellevekst og permeabilitet som induseres av (VEGF) under anvendelse av en inhibitor for P-isozymet til proteinkinase C (PKC). Disse VEGF-induserte forhold er nært forbundet med mange forskjellige vaskulære øyeforstyrrelser.

Foreliggende oppfinnelse er særlig rettet mot anvendelsen av en inhibitor av p-isozymet til proteinkinase C (PKC) for behandling av vaskulære øyeforstyrrelser, inkludert makular degenerasjon, makulart ødem, vaskulær retinopati, retinal veneokklusjon, irisneovaskularisering, histoplasmose og iskemiske, retinale sykdommer.

Beslektet teknikk

VPF/VEGF er et glykosylert, flerfunksjonen" cytokin. Overekspresjon av VPF/VEGF er forbundet med mange forskjellige vaskulære øyeforstyrrelser.

VPF/VEGF induserer endotelcelleproliferasjon, for stor permeabilitet via aktivering av vesikulær-vakuolar organellformidlet transport, migrering og aktinreorganisering med formendringer og rynking. Den endrer endotelcellegenekspresjon, idet den induserer forøkt produksjon av vevsfaktor og flere proteaser, inkludert interstitiell kollagenase og både de urokinaselignende og vevsplasminogenaktivatorene. Hoveddelen av disse samme genene induseres ved hjelp av aktivering av PKC stimulert med for-bolmyristatacetat (PMA).

Vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) sammen med både fibroblastvekstfaktorer (FGF-er) og transformerende vekst- faktor (TGFP) menes å spille en hovedrolle ved formidling av aktiv intraokular neovaskularisering hos pasienter med iskemiske, retinale sykdommer (Aiello et al., New England Jour. Medicine, 331(22):1480-1487 (1994); Amin et al., Invest Ophthalmol Vis Sei, 35:3178-3188 (1994)).

Én av de vaskulære øyeforstyrrelser som er forbundet med forøkt VEGF-ekspresjon, er makular degenerasjon. Aldersrelatert makular degenerasjon er den ledende årsak til blindhet hos de eldre. Det er beregnet at makular degenerasjon rammer mer enn 16 % av

folk som er 85 år og eldre, og 6 % av folk mellom 65-årsalderen og 74 år. Mer enn 20 % av pasienter over 75-årsalderen har makular degenerasjon. Sykdommen er hyppigere hos kvinner (Liebowitz, H.M., Krueer, D.E., Maunder, L.E. et al., "The Framingham Eye Study: VI Macular Degeneration", Surv. Opthalmol. 24 (supp. 10:428-457,1980); Klein et al., "Prevalence of Age Related Maculopathy: The Beaver Dam Study", Ophthalmology, 99(6):933-943,1992). Makular degenerasjon kan deles opp til tørr og våt type, idet den tørre typen er 10 ganger vanligere, men generelt mindre alvorlig i dens kliniske manifestasjoner. Den mer alvorlige våte eller eksudative makulare degenerasjon er forbundet med den unormale vekst av koroidalkar (koroidalneovaskularisering) i det subretinale pigmentepitel eller subretinale rom, og fører ofte til alvorlig synsforstyrrelse.

Makular degenerasjon har den initielle patologiske skade ved fremkomst av druser som utgjør unormal vevsavsetning i laget av retinal pigmentepitel (RPE) og menes å være sekundær til vaskulær insuffisiens. Nye blodkar vokser så gjennom Bruchs membran som er mellom RPE og koriokapillarene, og invaderer retina. Denne retinale invasjon forårsaker ødeleggelse av fotoreseptorene og kan føre til blødning som reduserer syn.

En av de vanligste formene for behandling av makular degenerasjon er laserterapi. Laserterapi brukes til å behandle områder med neovaskularisering som ikke strekker seg inn i det sentrale makulare området (fovea). Tilbakevending av sykdommen er imidlertid vanlig etter laserterapi (MPS Group, Arch Ophthalmol., vol. 109, s. 1232-1241 (1991)). Dessuten kan laserterapi resultere i restskotomer og er derfor ikke optimal behandling av neovaskularisering i det sentrale makulare området. Bare et begrenset antall av pasienter oppfyller kvaliflkasjonskriteriene for denne formen av behandling, hovedsakelig på grunn av den dårlig definerte eller uklare typen av koroidal neovaskularisering som vanligvis ses (Freund et al., Amer. Jour. Ophthalmol., 115:786-791 (1993)). Interferon er også blitt prøvd som et terapeutisk middel basert på den kjente aktivitet av vekstfaktorer, slik som fibroblastvekstfaktor, på stimulering av patologisk angiogenese. Det er imidlertid ikke blitt observert noen ensartet effekt (Kirkpatrick et al., Br. J. Ophthalmol., 77:766-770 (1993); Chan et al., Ophthalmology, 101:289-300 (1994)). Nyligere ble det uten hell avsluttet et forsøk med anvendelse av transformerende vekstfaktor (TGF) beta-2 for behandling av makular degenerasjon, Biotechnology Newswatch, 1. januar 1996.

Med hurtig aldring av populasjonen byr makular degenerasjon på et vesentlig, allment helseproblem. For tiden er det ingen helbredelse, og de mindre enn tilfredsstillende resultater som oppnås med laserbehandling, er den eneste aksepterte terapi, selv om FDA nylig godkjente thalidomid for anvendelse i en klinisk undersøkelse med menneskepasienter ("Researches Focus on Macular Degeneration: Common Eye Problems, Causes and Treatment Get New Attention", av Steven Steinberg, Washington Post Health, 31. oktober 1995). Det er fortsatt et sterkt behov innen teknikken for en effektiv legemiddelterapi for makular degenerasjon.

Makulart ødem er forbundet med mange typer av vaskulære øyesykdommer, slik som retinitis pigmentosa, diabetisk retinopati, pars planitis, retinal veneobstruksjon, senil hyalitis, og med intraokulare kirurgiske fremgangsmåter (Henkind, Surv. Ophthalmol., 28:431-2 (1984); Bird, Surv. Ophthalmol., 28:433-6 (1984); Cunha-Vaz, Surv. Ophthalmol., 28:485-92 (1984)). Cystoid makulart ødem er den vanligste komplikasjon etter kataraktkirurgi (Yannuzzi, Surv. Ophthalmol., 28:540-53 (1984)) og sannsynligvis den mest vanlige årsak til synstap hos pasienter som gjennomgår linseuttrekk (Jampol et al., Surv. Ophthalmol., 28:535-9 (1984)). Cystoid makulart ødem er vanligvis selvbegrenset, og til og med kroniske tilfeller kan spontant forbedres (Yannuzzi, Surv. Ophthalmol., 28:540-53 (1984)). En Uten andel av pasientene (1-15 %) kan imidlertid utvikle irreversibel skade og permanent synsfeil (Yannuzzi et al., Surv. Opthalmol., 88:847-54 (1981)).

Makulart ødem er også en årsak til sent tap av syn hos pasienter med Vogt-Koyanagi-Harada(VKH)-syndromet (Rutzen et al., J. Ret. and Vit. Dis., 15(6):475-479 (1995)). Makulart ødem er nært forbundet med mikroaneurysmer ved diabetisk retinopati og hos ikke-diabetespersoner med sigdcelleanemi, forgrenet veneokklusjon, karotidarteriesykdom eller alvorlig hypertensjon (Klein, Med. Clin. N. Am., 72:1415-1437 (1989)). Mikroaneurysmer lekker ofte lipoproteinmateriale, noe som resulterer i dannelsen av harde eksudater. Disse eksudatene fremstår i en spredt, aggregert eller ringlignende konfigurasjon. Når eksudater og væske samles opp i den bakre del av retinaen, kan det fås makulart ødem som kan forårsake betydelig sløring av syn og føre til tap av synsskarphet.

En laserfremgangsmåte, kalt fokal fotokoagulasjon, brukes til å behandle områdene i retinal svelling ved siden av mikroaneurysmer. Fokal fotokoagulasjon er blitt påvist å redusere hyppigheten av forstyrrelse av synsskarphet med 60 % hos pasienter med klinisk signifikant makulart ødem, men det er ikke blitt påvist noen nytte av fotokoagulasjon hos pasienter med svakt til middels makulart ødem (Raskin et al., Ann. Int. Med., 117(3):226-233 (1992)). Glasslegemekirurgi kan forbedre synsprognosen bare i tilfeller med diabetisk makulart ødem forbundet med en patologisk vitreomakular grenseflate (Vaneffenterre et al., J. Francais D Ophtalmol., 16(11):602-610 (1993)). Legemiddelbehandlinger, slik som oral og topisk indometacin (Miwa, Drug Intell. Clin. Pharm., 20:548-550 (1986)), samt erytropoietin (Friedman et al., Amer. J. Kidney Dis., 26(l):202-208 (1995)) er blitt evaluert med hensyn på makulart ødem, men det er ikke blitt observert noen signifikant effekt. Det er et behov innen teknikken for en effektiv legemiddelterapi for makulart ødem.

Selv om VEGF er kjent for å spille en viss rolle innen patologien til visse vaskulære øyeforstyrrelser, gjensto det å bestemme hvorvidt inhibering av funksjonen tilveiebrakt ved hjelp av VEGF ville gi en terapeutisk nytte til behandlingen av slike vaskulære øyeforstyrrelser. Den foreliggende oppfinnelse demonstrerer at ved å inhibere aktiviteten av VEGF kan man forbedre patologien til mange forskjellige av disse vaskulære øyeforstyrrelsene.

O ppfinnelsen

Det er et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe anvendelse for behandling av en vaskulær øyeforstyrrelse.

Det er et annet formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe en anvendelse for inhibering av kapillarpermeabilitet forbundet med makulart ødem hos et pattedyr.

Det er nok et annet formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for inhibering av neovaskularisasjon indusert av vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF).

Ved foreliggende oppfinnelse anvendes forbindelser som er profylaktiske og effektive ved behandling av mange forskjellige vaskulære øyeforstyrrelser.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser inhibitoreffekten av PKC-inhibitoren, (S>3»4-[N,N'-ltl'-((2,,-etDlEsy)-3"XO)-4,,^(N,N-mmetylamino>butan)-bis-(3,3Mndolyl)]-l(H)-p^ rekombinant human-VEGF-stimulert endotelcellevekst. Figur 2 illustrerer ytterligere inhibitoreffekten av PKC-inhibitoren, (S)-3,4-[N,NM,r-((2,^etoksy)-3,,XO)-4,,,-(N)N-o^metylaimno)-butan^^ dion, på rekombinant human-VEGF-stimulert endotelcellevekst. Figur 3 viser virkningen av PKC-inhibitoren på aktiviteten til endogen VEGF uttrykt etter dyrking av retinale pericytter under hypoksiske forhold. Figur 4 illustrerer ytterligere inhibitoreffekten av PKC-inhibitoren på rekombinant human-VEGF-stimulert endotelcellevekst.

Figurene 5 A, 5B viser tidsforløpet for VEGF-indusert retinal permeabilitet.

Figur 6 demonstrerer responsen av fluorescein retinal permeabilitet på VEGF.

Figur 7 demonstrerer effekten av intravitreal PKC-inhibering og -stimulering på retinal permeabilitet. Figurene 8 A, 8B viser inhiberingen av retinal permeabilitet som respons på VEGF ved oralt administrert proteinkinase C-(J-inhibitor.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Det er en oppdagelse ifølge foreliggende oppfinnelse at den terapeutiske anvendelse av en bestemt klasse av proteinkinase C-inhibitorer, det vil si inhibitorer for p-isozymet til proteinkinase C, og spesielt p-isozymselektive inhibitorer for PKC, motvirker effektene av VEGF. Særlig er det en oppdagelse ifølge foreliggende oppfinnelse at anvendelse av denne bestemte klassen av proteinkinase C-inhibitorer motvirker endotelcellevekst og kapillarpermeabilitet, spesielt endotelcelleveksten og kapillarpermeabiliteten stimulert ved hjelp av vekstfaktoren VEGF. Følgelig kan slike forbindelser anvendes for fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av forstyrrelser forbundet med VEGF, særlig mange forskjellige vaskulære øyeforstyrrelser.

Ved foreliggende oppfinnelse benyttes fortrinnsvis de proteinkinase C-inhibitorer som effektivt inhiberer p-isozymet. Én egnet gruppe av forbindelser er generelt beskrevet i teknikkens stand som bis-indolylmaleimider eller makrosykliske bis-indolylmaleimider. Bis-indolyl-maleimider som er godt kjent innen teknikkens stand, omfatter de forbindelsene som er beskrevet i US patentskrifter nr. 5 621 098,5 552 396,5 545 636, 5 481 003,5 491 242 og 5 057 614. Makrosykliske bis-indolylmaleimider er særlig representert av forbindelsene med formel I. Disse forbindelsene og fremgangsmåter for deres fremstilling er blitt beskrevet i US patentskrift nr. 5 552 396. Disse forbindelsene administreres i en terapeutisk effektiv mengde til et pattedyr for å inhibere endotelcellevekst eller kapillarpermeabilitet forbundet med VEGF, og for å inhibere VEGF-effekter forbundet med øyeforstyrrelser. Disse forbindelsene kan også administreres til pasienter med risiko for sykdomstilstandene som er nevnt ovenfor, som profylaktika.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebrakt anvendelse av en proteinkinase C som har formelen:

hvor:

W er -O-, -S-, -SO-, -S02-, -CO-, Q-Ce-alkylen, substituert alkylen, C2-C6- alkenylen, -aryl-, -aryl(CH2)mO-, -heterosyklus-, -heterosyklus-(CH2)mO-, •kondensert bisyklisk-, -kondensert bisyklisk-(CH2)mO-, -NR<3->, -NOR<3->, -CONH-eller-NHCO-; X og Y uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkylen, substituert alkylen, eller sammen med X, Y og W danner -(Cf^VAA-; R<1->er er hydrogen eller opptil fire eventuelle substituenter uavhengig av hverandre valgt fra halogen, Ci-C4-alkyl, hydroksy, Ci-C4-alkoksy, halogenalkyl, nitro, NR<4>R<5> eller -NHCO(Ci-C4-alkyl); R<2> er hydrogen, CH3CO-, NH2 eller hydroksy; R<3> er hydrogen, (CH^-aryl, Ci-C4-alkyl, -COO(C|-C4-alkyl), -CONR<4>R<s>, -(C*NH)NH2t -SO(Ci-C4-alk<y>l)t -S02(NR<4>R<5>) eller -S02(Ci-C4-alkyl); ;R4 og R5 er uavhengig av hverandre hydrogen, Ci-C4-alkyl, fenyl, benzyl eller danner sammen med nitrogenatomet som de er bundet til, en mettet eller ;umettet 5- eller 6-ring; ;AA er en aminosyrerest; ;m er uavhengig av hverandre 0,1,2 eller 3; og ;n er uavhengig av hverandre 2,3,4 eller 5; ;eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller forløperlegemiddel derav, eller en farmasøytisk akseptabel ester derav, for fremstilling av et medikament for behandling av en vaskulær øyeforstyrrelse der øyeforstyrrelsen er valgt fra gruppen bestående av makuladegenerasjon, makulart ødem, vaskulær retinopati, irisneovaskularisering, retinal veneokklusjon, histoplasmose og iskemisk retinalsykdom. ;En mer foretrukket klasse av forbindelser for anvendelse ved denne oppfinnelsen er representert ved formel I hvor restene -X-W-Y- inneholder 4-8 atomer, som kan være substituert eller usubstituert. Mest foretrukket inneholder restene -X-W-Y- 6 atomer. ;Andre foretrukne forbindelser for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen er de forbindelsene med formel I hvor R 1 og R 0 er hydrogen; og W er substituert alkylen, -O-, -S-, -CONH-, -NHCO- eller -NR<3->. Særlig foretrukne forbindelser for anvendelse ved oppfinnelsen er forbindelser med formel Ia: ;hvor: ;Z er -(CH2)P- eller -(CH2)p-0-(CH2)p-; ;R<4> er hydroksy, -SH, Ci-C4-alkyl, (CH2)m-aryl, -NH(aryl), -N(CH3)(CF3), -NH(CF3) eller -NR<5>R6;;R<5> er hydrogen eller Ci-C4-alkyl; ;R<6> er hydrogen, C i -C4-alkyl eller benzyl; ;p er 0,1 eller 2; og ;m er uavhengig av hverandre 2 eller 3; ;eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller forløperlegemiddel derav, eller en farmasøytisk akseptabel ester derav. Mest foretrukne forbindelser med formel Ia er de hvor Z er CH2; og R<4> er -NH2, -NH(CF3) eller -N(CH3)2, eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller forløperlegemiddel derav, eller en farmasøytisk akseptabel ester derav. ;Andre foretrukne forbindelser for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er forbindelser hvor W i formel I er -O-, Y er et substituert alkylen og X er et alkylen. Disse foretrukne forbindelser er representert ved formel Ib: ;hvor: ;Z er-(CH2)p-; ;R<4> er -NR<5>R<6>, -NH(CF3) eller -N(CH3)(CF3); ;R<5> og R<6> er uavhengig av hverandre H eller Ci-C4-alkyl; ;p er 0,1 eller 2; og ;m er uavhengig av hverandre 2 eller 3; ;eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller forløperlegemiddel derav, eller en farmasøytisk akseptabel ester derav. Mest foretrukne forbindelser med formel Ia er de hvor p er 1; og R<5> og R<6> er metyl. ;Ettersom de inneholder en basisk rest, kan forbindelsene med formlene I, Ia og Ib også foreligge som farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter. Syrer som vanligvis anvendes til å danne slike salter, omfatter slike uorganiske syrer som saltsyre, hydrobromsyre, hydrojodsyre, svovelsyre og fosforsyre, samt slike organiske syrer som paratoluensulfonsyre, metansulfonsyre, oksalsyre, parabromfenylsulfonsyre, karbon-syre, ravsyre, sitronsyre, benzosyre, eddiksyre og beslektede uorganiske og organiske syrer. Slike farmasøytisk akseptable salter omfatter således sulfat, pyrosulfat, bisulfat, sulfitt, bisulfltt, fosfat, monohydrogenfosfat, dihydrogenfosfat, metafosfat, pyrofosfat, klorid, bromid, jodid, acetat, propionat, dekanoat, kaprylat, akrylat, formiat, isobutyrat, heptanoat, propiolat, oksalat, malonat, suksinat, suberat, sebacat, fumarat, maleat, 2-butyn-l,4-dioat, 3-heksyn-2,5-dioat, benzoat, klorbenzoat, hydroksybenzoat, metoksybenzoat, ftalat, xylensulfonat, fenylacetat, fenylpropionat, fenylbutyrat, sitrat, laktat, hippurat, P-hydroksybutyrat, glykolat, maleat, tartrat, metansulfonat, propansulfonat, naftalen- 1-sulfonat, naftalen-2-sulfonat, mandelat og lignende. Særlig anvendes saltsyre- og mesylatsaltene. ;I tillegg til farmasøytisk akseptable salter kan det også foreligge andre salter. De kan tjene som mellomprodukter ved rensingen av forbindelsene, ved fremstillingen av andre salter eller ved identifikasjonen og karakteirseringen av forbindelsene eller mellomproduktene. ;De farmasøytisk akseptable salter av forbindelser med formlene I, Ia og Ib kan også foreligge som forskjellige solvater, slik som med vann, metanol, etanol, dimetylformamid, etylacetat og lignende. Blandinger av slike solvater kan også fremstilles. Kilden for et slikt solvat kan være fira oppløsningsmidlet for krystallisasjon, iboende i oppløsningsmidlet for fremstilling eller krystallisasjon, eller i tillegg til slikt oppløsningsmiddel. ;Det er erkjent at forskjellige stereoisomerformer av forbindelsene med formlene I, Ia og Ib kan foreligge; for eksempel kan W inneholde et chiralt karbonatom i den substituerte alkylenrest. Forbindelsene fremstilles normalt som racemater og kan passende anvendes som sådanne. Alternativt kan begge individuelle enantiomerer isoleres eller syntetiseres ved hjelp av vanlige teknikker dersom det er ønsket. Slike racemater og individuelle enantiomerer og blandinger derav utgjør en del av forbindelsene som anvendes ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse. ;Forbindelsene som benyttes ved denne oppfinnelsen, omfatter også de farmasøytisk akseptable forløperlegemidler av forbindelsene med formlene I, Ia og Ib. Et forløper-legemiddel er et legemiddel som er blitt kjemisk modifisert og kan være biologisk inaktivt på sitt virkningssted, men som kan brytes ned eller modifiseres av én eller flere enzymatiske eller andre prosesser in vivo til den bioaktive opphavsform. Dette for-løperlegemiddel kan likeledes ha en annen farmakokinetisk profil enn opphavet, noe som muliggjør lettere absorpsjon over slimhinnen, bedre saltdannelse eller - oppløselighet og/eller forbedret systemisk stabilitet (for eksempel en økning i plasmahalveringstid). Vanligvis omfatter slike kjemiske modifikasjoner de følgende: 1) ester- eller amidderivater som kan spaltes ved hjelp av esteraser eller lipaser; 2) peptider som kan gjenkjennes av spesifikke eller ikke-spesifikke proteaser; eller 3) derivater som akkumulerer på virkningsstedet gjennom membranutvelgelse av en forløperlegemiddelform eller en modifisert forløperlegemiddelform; ;eller hvilken som helst kombinasjon av 1-3 ovenfor. Vanlige fremgangsmåter for utvelgelsen og fremstillingen av egnede forløperlegemiddelderivater er beskrevet for eksempel av H. Bundgaard, Design of Prodrugs (1985). ;Syntesen av forskjellige bis-indol-N-maleimidderivater er beskrevet av Davis et al., US patentskrift nr. 5 057 614, og syntesen av de foretrukne forbindelser som er egnet for anvendelse ved denne oppfinnelsen, er beskrevet i det tidligere identifiserte US patentskrift nr. 5 552 396 og av Faul et al., EP patentpublikasjon nr. 0 657 411 Al. ;Én særlig foretrukket proteinkinase-P-inhibitor for anvendelse ifølge denne oppfinnelsen er forbindelsen som er beskrevet i eksempel 5g ((S)-3,4-[N,N'-l,r-((2"-etoksy)-3"XO)-4m<->(N,N-dimetylamino)-butan)-bis-(3,3,-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dionhydrokloridsalt), i det ovenfor nevnte US patentskrift nr. 5 552 396. Denne forbindelsen er en sterk proteinkinase C-inhibitor. Den er selektiv for proteinkinase C i forhold til andre kinaser, og er svært isozymselektiv, det vil si at den er selektiv for ;beta-1- og beta-2-isozymene. Andre salter av denne forbindelsen ville også være favorisert, spesielt mesylatsaltene. ;Et foretrukket mesylatsalt kan fremstilles ved å omsette en forbindelse med formel II: ;med metansulfonsyre i et ikke-reaktivt, organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis en blanding av organisk oppløsningsmiddel og vann, og mest foretrukket vann-aceton. Andre oppløsningsmidler, slik som metanol, aceton, etylacetat og blandinger derav, kan anvendes. Forholdet mellom oppløsningsmiddel og vann er ikke av avgjørende betydning og bestemmes generelt av oppløseligheten til reagensene. Foretrukne volumforhold mellom oppløsningsmiddel og vann er generelt fra 0,1:1 til 100:1 opp-løsningsmiddel:vann. Fortrinnsvis er forholdet 1:1 til 20:1, og mest foretrukket 5:1 til 10:1. Det optimale forhold er avhengig av det valgte oppløsningsmiddel og er fortrinnsvis aceton ved et forhold mellom oppløsningsmiddel og vann på 9:1. ;Reaksjonen omfatter vanligvis omtrent ekvimolare mengder av de to reagensene, selv om andre forhold, spesielt de hvor metansulfonsyren er i overskudd, kan anvendes. Til-setningshastigheten for metansulfonsyre er ikke av avgjørende betydning for reaksjonen, og den kan tilsettes hurtig (< 5 minutter) eller sakte i løpet av 6 eller flere timer. Reaksjonen utføres ved temperaturer som varierer fra 0 °C til refluks. Reaksjonsblandingen omrøres inntil dannelse av saltet er fullstendig, som bestemt ved hjelp av røntgenpulverdiffraksjon, og kan ta fra 5 minutter til 12 timer. ;Saltene ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles fortrinnsvis og hurtig som en krystallinsk form. Trihydratformen av saltet kan lett omdannes til monohydratet etter tørking eller eksponering for 20-60 % relativ fuktighet. Saltet er i det vesentlige krystallinsk, idet det oppviser et definert smeltepunkt, dobbeltbrytning og et røntgendiffraksjonsmønster. Generelt har krystallene mindre enn 10 % amorft, fast stoff, fortrinnsvis mindre enn 5 %, og mest foretrukket mindre enn 1 %, amorft, fast stoff. ;Mesylatsaltet isoleres ved filtrering eller andre separasjonsteknikker som er anerkjent innen teknikken, direkte fra reaksjonsblandingen i utbytter som varierer fra 50 % til 100 %. Rekrystallisasjon og andre renseteknikker som er kjent innen teknikken, kan anvendes for å rense saltet ytterligere om ønsket. ;Endotelceller i vevskultur stimulert av vekstfaktorer, slik som VEGF, utviser en høyere veksthastighet enn den basale cellulære veksthastighet. Eksperimenter utført ved foreliggende oppfinnelse har vist at når den administreres in vitro ved en konsentrasjon på ca. 0,1 til 100 nM, inhiberer proteinkinase C-inhibitoren, (S)-3,4-[N,N'-l,l,-((2"-etoksy)-3"XO)-4",-(N,N-dimetylamino)-butan)-bis-(3,3,-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dionsyresalt, signifikant ikke-basal cellevekst stimulert av vekstfaktor (slik som VEGF). ;Det er viktig at andre testinger har demonstrert at normal endotelcellevekst i vevskultur ikke inhiberes av denne forbindelsen, som vist ved mangelen på inhibering av endotelcellevekst uten VEGF-stimulering i normoksiske kondisjonal- ;medier. I hypoksisk kondisjonerte medier øker celleveksthastigheten på grunn av økningen i innholdet av den endogene vekstfaktor, VEGF, frembrakt ved hjelp av de hypoksiske celler. Igjen normaliserer proteinkinase C-inhibitoren (S)-3,4-[N,N'-l,r-((2"-etoksy)-3"XO)-4m-(N,N-dimetylamino)-butan)-bis-(3,3,-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dionsyresalt celleveksten indusert av slike hypoksiske betingelser. ;Forsøk tilveiebrakt ved foreliggende oppfinnelse demonstrerer at kapillarpermeabilitet også påvirkes av vekstfaktorer, slik som VEGF. Testing har vist at VEGF i en dyre-modell signifikant øker kapillarpermeabiliteten opptil tre ganger. Denne VEGF-avhengige kapillarpermeabilitetsøkning er også doseavhengig. I henhold til dyretestingen in vivo inhiberte administrering av proteinkinase C-inhibitor ved en konsentrasjon på ca. 25 mg/kg/dag før VEGF-utfordring i stor grad kapillarpermeabiliteten indusert ved hjelp av VEGF. Anvendelse av konsentrasjoner fra 1 nM til 5 mM, og fortrinnsvis fra 1 nM til 500 nM, er det særlig tenkt på. Inhiberingen kan være opptil 80 % og er generelt spesifikk for vekstfaktorindusert kapillarpermeabilitet. Kapillarpermeabilitet kan måles ved hjelp av fluoresceinangiografi. Særlig ved makulart ødem er fluoresceinangiografi en retinal fotografisk fremgangsmåte som omfatter injeksjon av et fluorescerende fargestoff i blodstrømmen for å påvise områder med lekkasje i retina. ;Selv om man ikke ønsker å begrense seg til noen teknisk forklaring, mener søkeren at endringer i retinalperfusjon som oppstår fra redusert blodstrømning, retinalkapillart tap, perifervaskulaturagenese eller obliterasjon, eller separasjon av den koroidale blodtilførsel fra retinaen alle kan resultere i relativ retinal iskemi. Denne iskemien stimulerer syntesen og utskillelsen av vekstfaktorer, slik som VEGF, i retinale pericytter, endotelceller, det retinale pigmentepitel, gliaceller og muligens andre celletyper; og fører deretter til retinal neovaskularisasjon og forøkt kapillarpermeabilitet. Disse tilstandene er forbundet med mange forskjellige vaskulære øyeforstyrrelser. ;Inhibitorene for p-isozymet til PKC beskrevet i foreliggende oppfinnelse kan anvendes til å behandle de sykdomstilstandene som er forbundet med endotelcellevekst og kapillarpermeabilitet, spesielt mange forskjellige vaskulære øyeforstyrrelser. ;Vaskulære øyeforstyrrelser som lar seg behandle ved hjelp av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter makular degenerasjon, makulart ødem, vaskulær retinopati, retinaveneokklusjon, irisneovaskularisering, histoplasmose og iskemiske retinale sykdommer. Makular degenerasjon kan være aldersrelatert. Makulart ødem kan være forbundet med sukkersyke eller sentral retinal okklusjon. Slik det her er brukt, omfatter uttrykket vaskulær retinopati ikke diabetisk retinopati, men omfatter vaskulær retinopati forbundet med sigdcelleanemi, for tidlig fødte barn og neovaskularisering i vinkel- eller trabekelnettverket. Irisneovaskularisering kan være sukkersyke- eller ikke-sukkersykeforbundet. ;Fagfolk innen teknikken vil forstå at en terapeutisk effektiv mengde av en inhibitor for P-isozymet til proteinkinase C i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er den mengden som er tilstrekkelig til å inhibere veksten av endotelceller eller utviklingen av kapillarpermeabilitet ved å inhibere VEGF, og at denne mengden varierer blant annet avhengig av en angrepet vevsstørrelse, konsentrasjonen av forbindelsen i det terapeutiske preparat og kroppsvekten til pasienten. Generelt vil en mengde av en inhibitor for P-isoenzymet til proteinkinase C som skal administreres som et terapeutisk middel for behandling av vaskulære øyeforstyrrelser, bli bestemt fra tilfelle til tilfelle av den behandlende lege. Som en retningslinje vil omfanget av neovaskulairseringen, kroppsvekten og alderen til pasienten bli vurdert når det fastsettes en passende dose. Generelt er en egnet dose en som resulterer i en konsentrasjon av inhibitoren for P-isozymet til proteinkinase C på behandlingsstedet i området fra 0,5 nM til 200 uM, og mer vanlig 0,5 nM til 200 nM. Det forventes at serumkonsentrasjoner på 0,5 nM til 100 nM bør være tilstrekkelig under de fleste omstendigheter. ;For å oppnå disse behandlingskonsentrasj onene vil en pasient som trenger behandling sannsynligvis få administrert mellom ca. 0,001 mg pr. dag pr. kg kroppsvekt og 50,0 mg pr. dag pr. kg. Vanligvis burde det ikke være nødvendig med mer enn ca. 1,0 til 10,0 mg pr. dag pr. kg kroppsvekt av proteinkinase C-P-inhibitoren. Som angitt ovenfor, kan de ovenfor nevnte mengder variere fra tilfelle til tilfelle. ;Forbindelsene med formel I og de foretrukne forbindelser med formlene Ia og Ib formuleres fortrinnsvis før administrering. Egnede farmasøytiske preparater fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter under anvendelse av velkjente og lett tilgjengelige bestanddeler. Ved fremstilling av preparatene egnet for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, vil den aktive bestanddel vanligvis bli blandet med en bærer, eller fortynnet ved hjelp av en bærer, eller innelukket i en bærer som kan være i form av en kapsel, liten pose, papir eller annen beholder. Når bæreren tjener som et fortynningsmiddel, kan den være et fast, halvfast eller flytende materiale som virker som et vehikkel, en eksipiens eller et medium for den aktive bestanddel. Prepa- ;ratene kan således være i form av tabletter, piller, pulvere, sugetabletter, små poser, kapsler som inneholder pulver, eliksirer, suspensjoner, emulsjoner, oppløsninger, siruper, aerosol (som et fast stoff eller i et flytende medium), myke og harde gelatin-kapsler, suppositorier, sterile, injiserbare oppløsninger og sterile, emballerte pulvere enten for oral eller topisk applikasjon. ;Noen eksempler på egnede bærere, eksipiens og fortynningsmidler omfatter laktose, dekstrose, sukrose, sorbitol, mannitol, stivelser, gummi akasie, kalsiumfosfater, alginat, tragant, gelatin, kalsiumsilikat, mikrokrystallinsk cellulose, polyvinylpyrrolidon, cellulose, vann, sirup, metylcellulose, metyl- og propylhydroksybenzoater, talkum, magnesiumstearat og mineralolje. Preparatene kan i tillegg omfatte smøremidler, fuktemidler, emulgeringsmidler og oppslemmingsmidler, konserveringsmidler, søtningsmidler eller smaksmidler. Preparatene ifølge oppfinnelsen kan formuleres slik at de gir hurtig, langvarig eller forsinket frigjørelse av den aktive bestanddel etter administrering til pasienten. Preparatene formuleres fortrinnsvis i en enhetsdoseirngsform, hvor hver dosering inneholder fra ca. 0,05 mg til ca. 3 g, mer vanlig ca. 750 mg, av den aktive bestanddel. Det vil imidlertid forstås at den terapeutiske dosering som administreres, vil bli bestemt av legen på bakgrunn av de relevante omstendigheter, inkludert alvorligheten av tilstanden som skal behandles, valget av forbindelse som skal administreres og den valgte admimstreringsvei. De ovenfor nevnte doseringsområder er derfor ikke ment å begrense omfanget av oppfinnelsen på noen måte. Uttrykket "enhetsdoseringsform" henviser til fysikalsk atskilte enheter som er egnet som enhetsdoseringer for humanindivider og andre pattedyr, hvor hver enhet inneholder en forutbestemt mengde aktivt materiale beregnet til å gi den ønskede terapeutiske effekt, sammen med en egnet farmasøytisk bærer. ;I tillegg til preparatene ovenfor, hvor de fleste kan administreres oralt, kan forbindelsene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, også administreres topisk. Topiske preparater omfatter salver, kremer og geler. ;Salver fremstilles generelt ved å anvende enten (1) en oljeholdig base, det vil si en som består av faste oljer eller hydrokarboner, slik som hvit vaselin eller mineralolje, eller (2) en absorberende base, det vil si en som består av et vannfritt stoff eller stoffer som kan absorbere vann, for eksempel vannfri lanolin. Vanligvis tilsettes den aktive bestanddel (forbindelse) etter dannelse av basen, enten oljeholdig eller absorberende, inntil en mengde som gir den ønskede konsentrasjon. ;Kremer er emulsjoner av olje og vann. De består av en oljefase (indre fase) som omfatter typiske faste oljer, hydrokarboner og lignende, slik som vokser, vaselin, mineralolje og lignende, og en vannfase (kontinuerlig fase) som omfatter vann og hvilke som helst vannoppløselige stoffer, slik som tilsatte salter. De to fasene stabiliseres ved å anvende et emulger- ;ingsmiddel, for eksempel et overflateaktivt middel, slik som natriumlaurylsulfat; hydrofile kolloider, slik som kolloidale akasieleirestoffer, "veegum" og lignende. Etter dannelse av emulsjonen tilsettes den aktive bestanddel (forbindelse) vanligvis i en slik mengde at den ønskede konsentrasjon oppnås. ;Geler omfatter en base valgt fra en oljeholdig base, vann eller en emulsjonssuspensjonsbase. Til basen tilsettes et geldannelsesmiddel som danner en matriks i basen, noe som øker dens viskositet. Eksempler på geldannelsesmidler er hydroksypropylcellulose, akrylsyrepolymerer og lignende. Vanligvis tilsettes den aktive bestanddel (forbindelse) til preparatet ved den ønskede konsentrasjon på et tidspunkt forut for tilsetningen av geldannelsesmidlet. ;Mengden av forbindelse som inkorporeres i et topisk preparat, er ikke av avgjørende betydning; konsentrasjonen bør være innenfor et område som er tilstrekkelig til å muliggjøre hurtig applikasjon av preparatet til det angrepne vevsområdet i en mengde som vil avlevere den ønskede mengde forbindelse til det ønskede behandlingssted. ;Den vanlige mengde av et topisk preparat som skal appliseres til et angrepet vev, vil avhenge av den angrepne vevsstørrelse og konsentrasjonen av forbindelsen i preparatet. Generelt vil preparatet bli applisert til det angrepne vev i en mengde som gir fra ca. 1 til ca. 500 ug forbindelse pr. cm<2> av det angrepne vev. Fortrinnsvis vil den appliserte mengde forbindelse variere fra ca. 30 til ca. 300 ug/cm , mer foretrukket fra ca. 50 til ca. 200 ug/cm<2>, og mest foretrukket fra ca. 60 til ca. 100 ug/cm2. ;De følgende preparateksempler er bare illustrerende og er ikke ment å begrense omfanget av oppfinnelsen på noen måte. ;Preparat 1 ;Hardgelatinkapsler fremstilles ved å anvende de følgende bestanddeler: ;;Bestanddelene ovenfor blandes og fylles i hardgelatinkapsler i mengder på 460 mg. ;Preparat 2 ;En tablett fremstilles ved å anvende bestanddelene nedenunder: ;Bestanddelene blandes og presses til tabletter som hver veier 665 mg. ;Preparat 3 ;Tabletter som hver inneholder 60 mg aktiv bestanddel, lages på følgende måte: ;;Den aktive bestanddel, stivelse og cellulose sendes gjennom en sikt med 354 um åpninger og blandes grundig. Oppløsningen av polyvinylpyrrolidon blandes med de resulterende pulvere, som så sendes gjennom en sikt med 1,41 mm åpninger. De derved fremstilte granuler tørkes ved 50 °C og sendes gjennom en sikt med 1,00 mm åpninger. Natriumkarboksymetylstivelsen, magnesiumstearatet og talkumen, tidligere sendt gjennom en sikt med 0,250 mm åpninger, tilsettes så til granulene som etter blanding presses på en tablettmaskin, hvorved man får tabletter som hver veier 150 mg. ;Eksempler ;Disse eksemplene viser alle anvendelsene av (S)-3,4-[N,N,-l,l,-((2,,-etoksy)-3",(0)-4w<->;(N,N-dimetylaimno)-butan)-bis-(3,3'-in^ det gjelder å inhibere endotelcellevekst in vitro og inhibere in vivo forøkt kapillarpermeabilitet stimulert ved hjelp av VEGF. ;Eksempel 1 ;I dette eksemplet ble inhibitoreffekten til den angitte forbindelse på VEGF-stimulert endotelcellevekst undersøkt ved å anvende rekombinant human-VEGF. ;Bovine retinaendotelceller ble isolert fira nyuttatte kalveøyne ved homogenisering og en serie filtreringstrinn. Primære endotelcellekulturer ble dyrket i fibronektin(NYBen Reagents, New York Blood Center)-belagte skåler (Costar) inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 5,5 mM glukose, 10 % plasmaavledet hesteserum (Wheaton, Scientific), 50 mg heparin pr. liter og 50 enheter endotel-cellevekstfaktor pr. liter (Boehringer Mannheim). Etter at cellene nådde sammenflyting ble mediet skiftet for å inkludere 5 % bovint fosterserum (HyClonc). Medium ble byttet hver 3. dag. Endotelcellehomogenitet ble bekreftet med antifaktor Vlll-antistoffer. ;Effekten av den angitte PKC-inhibitor på VEGF-virkning in vitro ble evaluert ved å anvende sparsomt utplatede kulturer av de bovine, mikrovaskulære retinaendotelceller som gjennomgår vekststimulering etter tilsetning av VEGF. Bovine retinaendotelceller ble utplatet sparsomt (ca. 2500 celler pr. brønn) i 24-brønners skåler (Costar), inkubert over natten i DMEM inneholdende 10 % kalveserum (GIBCO). Mediet ble skiftet neste dag. ;For å undersøke virkningen av den angitte PKC-inhibitor på endotelcellevekst ble det utført ett sett forsøk hvor celleveksten i fravær av aktivt middel tjente som en kontroll, og så ble virkningen av tilsetningen av den angitte PKC-inhibitor både i nærvær av VEGF (25 ng/ml, Genentech) og i fråvær av VEGF undersøkt. Etter inkubasjon ved 37 °C i 4 dager ble cellene lysert i 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS), og DNA-innhold ble målt ved å anvende Hoechst 33258-fargestoff og et fluorometer (modell TKO-100, Hoefer). ;Alle bestemmelser ble utført minst tre ganger, og forsøkene ble gjentatt minst tre ganger. Resultatene er ut- ;trykt som gjennomsnitt ± SD for alle forsøk. Analyse av resultater in vitro ble utført ved hjelp av ikke-paret Studenfs ;Mest. En P-verdi på < 0,050 ble ansett som statistisk signifikant. ;Figur 1 illustrerer resultatene som ble oppnådd ved å anvende rekombinant VEGF. Som vist ved hjelp av de tre spaltene lengst til venstre i figuren, hadde tilsetningen av den angitte PKC-inhibitor til endotelcellekulturen praktisk talt ingen virkning på den basale veksthastighet (spalte 1). Veksthastigheten økte vesentlig etter tilsetningen av VEGF (fjerde kolonne). Denne veksthastigheten avtok signifikant etter tilsetningen av > 0,5 nM av den angitte PKC-inhibitor (de fire spaltene lengst til høyre). ;Eksempel 2 ;Dette eksemplet er likt med arbeidet rapportert i figur 1 og illustrerer ytterligere inhibitoreffekten av den angitte PKC-inhibitor på VEGF-stimulert endotelcellevekst under anvendelse av rekombinant human-VEGF. ;Ved å anvende fremgangsmåtene ifølge eksempel 1 ble bovine retinaendotelceller isolert og dyrket; så ble det fremstilt sparsomt utplatede kulturer. Igjen ble det, ved å anvende fremgangsmåten ifølge eksempel 1, utført forsøk hvor virkningen av den angitte PKC-inhibitor på endotelcellevekst både i nærvær av VEGF (25 ng/ml, Genentech) og i fravær av VEGF ble undersøkt. Etter inkubasjon ved 37 °C i 4 dager ble cellene lysert i 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS), og DNA-innhold ble målt ved å anvende Hoechst 33258-fargestoff og et fluorometer (modell TKO-100, Hoefer). ;Figur 2 illustrerer resultatene av dette arbeidet. Som vist ved hjelp av kolonnene over teksten -VEGF, hadde tilsetningen av den angitte PKC-inhibitor til endotelcellekulturen ved fra 0,1 nM til 100 nM praktisk talt ingen innvirkning på den basale veksthastighet til cellene. Stimulering av endotelcellene med rekombinant human-VEGF (25 ng/ml) ga en signifikant økning i cellulært DNA-innhold etter 4 dager, noe som er en indikasjon på en økning i veksthastighet sammenlignet med ustimulerte celler (sammenlign -VEGF ved 0 med +VEGF ved 0). Denne veksthastigheten avtok signifikant etter tilsetningen av den angitte PKC-inhibitor (de fire spaltene lengst til høyre over teksten +VEGF). Særlig ble VEGF-stimulatorkapasiteten redusert svakt i nærvær av 0,1 nM av PKC-inhibitoren og ble praktisk talt helt fjernet ved samtidig tilsetning av 1 nM og mer av PKC-inhibitoren. ;Eksempel 3 ;Dette eksemplet undersøker innvirkningen av den angitte PKC-inhibitor på aktiviteten til endogen VEGF uttrykt etter dyrking av retinapericytter under hypoksiske betingelser. ;Bovine retinaendotelceller og retinale pericytter ble isolert fra nyuttatte kalveøyne ved homogenisering og en serie filtreringstrinn. Endotelcellene ble dyrket og sparsomt dyrket på plater under anvendelse av fremgangsmåtene ifølge eksempel 1. Ved å anvende lignende teknikker ble bovine retinapericytter dyrket i DMEM/5,5 mM glukose med 20 % bovint fosterserum. Hypoksisk kondisjonert medium for endogen VEGF-ekspresjon og normoksisk kondisjonert kontrollmedium ble fremstilt i henhold til de respektive følgende fremgangsmåter. Sammenflytende retinapericyttmonolag ble eksponert i 24 timer for 2 % (V5 % CO2/93 % N2 under anvendelse av en Lab-Line Instruments avansert datamaskinregulert infrarød C02-inkubator med vannkappe med redusert oksygenkontroll (modell 480). Alle cellene ble holdt ved 37 °C og oppviste ingen morfologiske endringer ved lysmikroskopi, utelukket trypanblått-fargestoff (> 98 %) og kunne deretter overføres normalt. Celler inkubert under normoksiske betingelser (95 % luft/5 % CO2) fra den samme porsjon og overføring ble brukt som kontroller. Medium ble deretter samlet opp og filtrert (Nalgene, 0,22 um) før bruk. ;I dette eksemplet ble det utført forsøk hvor virkningen av den angitte PKC-inhibitor på endotelcellevekst i nærvær av enten normoksisk kondisjonert medium eller hypoksisk kondisjonert medium ble undersøkt. Som det ble gjort i de tidligere eksempler, ble cellene etter inkubasjon ved 37 °C i 4 dager lysert i 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS), og DNA-innhold ble målt ved å anvende Hoechst 33258-fargestoff og et fluorometer (modell TKO-100, Hoefer). ;I testene rapportert i figur 3 ble den angitte PKC-inhibitor anvendt ved en konsentrasjon på 10 nM. Som vist i figur 3, ble retinaendotelcellevekst stimulert ved hjelp av kondisjonert medium fra retinapericytter dyrket under hypoksiske betingelser som er kjent for å indusere VEGF-ekspresjon (sammenlign spalte 1 med spalte 3 i figur 3). Denne vekststimuleringen ble undertrykt (normalisert) i nærvær av saltsyresaltet av (S)-3.4- [N,N*-l, l,-((2"-etoksy)-3"XO)-4"'-(N,N-dimetylarruno)-butan)-bis-(3,3,-m^^ l(H)-pyrrol-2,5-dion av PKC-inhibitoren (sammenlign spalte 3 med spalte 4).

Eksempel 4

Dette eksemplet er likt med arbeidet rapportert i figurene 1 og 2, og illustrerer ytterligere inhibitoreffekten av den angitte PKC-inhibitor på VEGF-stimulert endotelcellevekst under anvendelse av rekombinant human-VEGF.

Ved å anvende fremgangsmåtene ifølge eksempel 1 ble bovine retinaendotelceller isolert og dyrket; så ble sparsomt utplatede kulturer fremstilt. Igjen ble det utført forsøk under anvendelse av fremgangsmåten ifølge eksempel 1, hvor virkningen av den angitte PKC-inhibitor på endotelcellevekst både i nærvær av (+VEGF) (25 ng/ml, Genentech) og fråvær av VEGF (-VEGF) ble undersøkt. Som ovenfor ble cellene etter inkubasjon ved 37 °C i 4 dager lysert i 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS), og DNA-innhold ble målt under anvendelse av Hoechst 33258-fargestoff og et fluorometer (modell TKO-100, Hoefer).

Figur 4 illustrerer resultatene av dette arbeidet. Som vist ved hjelp av spaltene over teksten -VEGF, hadde tilsetningen av den angitte PKC-inhibitor til endotelcellekulturen ved en konsentrasjon på 10 nM praktisk talt ingen innvirkning på den basale veksthastighet til cellene. Stimulering av endotelcellene med rekombinant human-VEGF (25 ng/ml) ga en signifikant økning i cellulært DNA-innhold, noe som er en indikasjon på en økning i veksthastighet sammenlignet med ustimulerte celler (sammenlign -VEGF-kontroll med +VEGF-kontroll). Denne veksthastigheten avtok signifikant etter tilsetningen av den angitte PKC-inhibitor ved en konsentrasjon på 10 nM.

Disse resultatene viser at den angitte klasse av PKC-inhibitorer, og særlig (S)-3,4-[N,N<f->1,1 ,-((2"-etoksy)-3,"(0)-4,,,-(N,N-dimetylamino)-butan)-bis-(3,3,-indolyl)]- l(H)-pyrrol-2.5- dion, forhindrer stimulering in vitro av retinaendotelcellevekst ved hjelp av både eksogen og hypoksiindusert VEGF. Ettersom VEGF-ekspresjon er blitt knyttet nært til neovaskularisering forbundet med makular degenerasjon, understøtter disse resultatene anvendelsen av disse PKC-inhibitorene som en terapi for behandlingen av makular degenerasjon.

Eksempel 5

Dette eksemplet viser tidsforløpet for VEGF-indusert retinapermeabilitet.

Ett øye fra hver rotte fikk en intervitreal injeksjon av 2,0 ng VEGF (beregnet sluttkonsentrasjon 25 ng/ml). Det kontralaterale øyet fikk et lignende volum av kontrolloppløsning. Etter 10 minutter ble 30 ul fluorescein injisert gjennom kateteret i den høyre halsvene. Fluorfotometri av glasslegemet ble utført på de angitte tidspunkter etter fluoresceininjeksjon.

Som vist i figur 5 A, er det en klar økning i permeabilitet av fluorescein inn i glasslegemet i øynene behandlet med VEGF. Dette blir statistisk signifikant i løpet av 10 minutter med fluoresceinangiograminjeksjon og opprettholdes i minst 30 minutter. Figur 5B viser denne stimuleringen uttrykt som prosent av kontroll, noe som viser at det er ytterligere fluoresceinlekkasje på de VEGF-behandlede øyne over tid.

Eksempel 6

Dette eksemplet viser doseresponsen av retinapermeabilitet til fluorescein, som respons på VEGF.

Ett øye hos hvert dyr fikk injisert kontroll, mens det kontralaterale øyet fikk injisert forskjellige doser av VEGF. 10 minutter senere ble intravenøs fluorescein injisert og mengden av glasslegemelekkasje analysert etter 30 minutter. Som vist i figur 6, var det en VEGF-doseavhengig økning i retinapermeabilitet. Stimulering var maksimal ved 14-20 ng/ml, som er kjent for å bli oppnådd hos mennesker.

Eksempel 7

Dette eksemplet viser effekten av intravitreal PKC-inhibitor, (S)-3,4-[N,N,-l,l'-((2M<->etoksy)-3,,XO>4",-(N,N-dimetylaimno)-butan)-bis-(3,3,-mdo^^^ hydrokloridsalt, og dets stimulering på retinapermeabilitet.

Øyne hos rotter fikk enten injisert 2,0 ng VEGF pr. øye, 10 nm av PKC-p-inhibitor eller 1 ug PDBU (en PKC-agonist), som angitt i figur 7. PKC-p-inhibitor ble injisert 15 minutter før VEGF-tilsetning. 10 minutter etter VEGF-tilsetning ble intravenøs fluorescein gitt, og fluorescein i glasslegemet ble fastlagt etter 30 minutter.

Som vist i figur 7, oppviste intravitreal injeksjon av VEGF den forventede stimulering av retinapermeabilitet. Intravitreal injeksjon av PKC-p-inhibitor 15 minutter før injeksjon av VEGF eliminerte mesteparten av permeabilitetsresponsen. Direkte stimulering av proteinkinase C ved injeksjon av PDBU viste en økning i permeabilitet som er svært lik med VEGF.

Eksempel 8

Dette eksemplet viser inhiberingen av retinapermeabilitet som respons på VEGF ved hjelp av den oralt administrerte proteinkinase C-p-inhibitor (S)-3,4-[N,N'-l,r-((2"-etoksy)-3"XO)-4w,-(N,N-di^ dionhydrokloridsalt.

Rotter fikk tilført mat blandet med proteinkinase C-P-inhibitor ved dosene som er angitt i figurene 8 A og 8B. Etter 1 uke på denne maten ble retinapermeabilitet som respons på 2,0 ng intravitrealt injisert VEGF bestemt, som omtalt tidligere. Oral administrering av PKC-P-inhibitor ifølge denne oppfinnelsen i 1 uke reduserte retmapermeabiliteten som respons på VEGF. Dette var mest merkbart ved høyere doser.

Claims (8)

1. Anvendelse av en proteinkinase C-inhibitor med den følgende formel: hvor: W er -O-, -S-, -SO-, -S02-, -CO-, C2-C6-a]kylen, substituert alkylen, C2-C6- alkenylen, -aryl-, -aryl(CH2)mO-, -heterosyklus-, -heterosyklus-(CH2)mO- -kondensert bisyklisk-, -kondensert bisyklisk-(CH2)mO-, -NR<3->, -NOR<3->, CONH-eller-NHCO-; X og Y uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkylen, substituert alkylen, eller sammen med X, Y og W danner -(CH^-AA-; Kx- er er hydrogen eller opptil fire eventuelle substituenter uavhengig av hverandre valgt fra halogen, Ci-C4-alkyl, hydroksy, Ci-C4-alkoksy, halogenalkyl, nitro, NR<4>R5 eller -NHCO(Ci-C4-alkyl); R<2> er hydrogen, CH3CO-, NH2 eller hydroksy; R<3> er hydrogen, (CH2)m-aryl, Ci-C4-alkyl, -COO(Ci-C4-alkyl), -CONRV, - (C=NH)NH2, -SO(Ci-C4-alkyl), ^(NRV) eller -S02(Ci-C4-alkyl); R<4> og R<5> er uavhengig av hverandre hydrogen, Ci-C4-alkyl, fenyl, benzyl eller danner sammen med nitrogenatomet som de er bundet til, en mettet eller umettet 5- eller 6-ring; AA er en aminosyrerest; m er uavhengig av hverandre 0,1,2 eller 3; og n er uavhengig av hverandre 2,3,4 eller 5; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller forløperlegemiddel derav, eller en farmasøytisk akseptabel ester derav, for fremstilling av et medikament for behandling av en vaskulær øyeforstyrrelse der øyeforstyrrelsen er valgt fra gruppen bestående av makuladegenerasj on, makulart ødem, vaskulær retinopati, irisneovaskularisering, retinal veneokklusjon, histoplasmose og iskemisk retinalsykdom.

2. Anvendelse ifølge krav 1, der proteinkinase C-inhibitoren har den følgende formel: hvor: Z er -(CH2)P- eller -(CH2)p-0-(CH2)p-; R<4> er hydroksy, -SH, Ci-C4-alkyl, (CH2)m-aryl, -NH(aryl), -N(CH3)(CF3), - NH(CF3) eller -NR5R6; R<5> er hydrogen eller Ci-C4-alkyl; R<6> er hydrogen, Ci-C4-alkyl eller benzyl; p er 0,1 eller 2; og m er uavhengig av hverandre 2 eller 3; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller forløperlegemiddel derav, eller en farmasøytisk akseptabel ester derav.

3. Anvendelse ifølge krav 1, der proteinkinase C-inhibitoren har den følgende formel: hvor: Z er-(CH2)p-; R<4> er -NR<5>R<6>, -NH(CF3) eller -N(CH3)(CF3); R<5> og R<6> er uavhengig av hverandre H eller Ci-C4-alkyl; p er 0,1 eller 2; og m er uavhengig av hverandre 2 eller 3; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller forløperlegemiddel derav, eller en farmasøytisk akseptabel ester derav.

4. Anvendelse ifølge krav 1, der proteinkinase C-inhibitoren er (S)-3,4-[N,N'-l,r-((2"-etoksy)-3"^0)-4,,,-(N,^ eller dets farmasøytisk akseptable syresalt.

5. Anvendelse ifølge krav 4, der den vaskulære øyeforstyrrelsen er makulart ødem.

6. Anvendelse ifølge krav 5, der den vaskulære øyeforstyrrelsen er diabetisk makulart ødem.

7. Anvendelse ifølge krav 4, der den vaskulære øyeforstyrrelsen er makuladegenerasjon.

8. Anvendelse ifølge krav 7, der den vaskulære øyeforstyrrelsen er aldersrelatert makuladegenerasj on.