DE60314013T2

DE60314013T2 - 2-(1h-indazol-6-ylamino)- benzamid-verbindungen als protein kinase inhibitoren und deren verwendung zur behandlung von ophthalmischen krankheiten

Info

Publication number: DE60314013T2
Application number: DE60314013T
Authority: DE
Inventors: Allen J. Agouron Phar San Diego BORCHARDT; Robert Steven Agouron Phar San Diego KANIA; Cynthia L. Agouron Phar San Diego PALMER
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2023-12-09
Also published as: ZA200504339B; PL377713A1; PT1585743E; NO20053486L; PE20041006A1; MXPA05006676A; AR042510A1; OA12977A; KR20050084439A; WO2004056806A1; UY28130A1; BR0317548A; CA2510850A1; AU2003286321A1; KR100730267B1; MA27570A1; PA8592901A1; SI1585743T1; CR7882A; DE60314013D1

Description

VERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Nutzung der US Provisional Patent Application Nr. 60/434 902 , eingereicht am 19. Dezember 2002.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung ist auf Indazolverbindungen, die Augenerkrankungen und die Aktivität bestimmter Proteinkinasen mäßigen und/oder hemmen, und derartige Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet. Die Erfindung ist auch auf die therapeutische oder prophylaktische Verwendung derartiger Verbindungen und Zusammensetzungen gerichtet und sie betrifft Verfahren zur Behandlung von Augenerkrankungen und Krebs sowie anderen Krankheitszuständen, die mit unerwünschter Angiogenese und/oder Zellproliferation in Verbindung stehen, durch Verabreichung wirksamer Mengen derartiger Verbindungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mehrere Erkrankungen und Zustände des hinteren Segments des Auges bedrohen das Sehvermögen. Altersbedingte Makuladegeneration (ARMD oder AMD), Choroideaneovaskularisation (CNV), Retinopathien (beispielsweise diabetische Retinopathie, Vitreoretinopathie, Frühgeborenenretinopathie), Retinitis (beispielsweise Cytomegalovirus(CMV)-Retinitis), Uveitis, Makulaödem und Glaukom sind mehrere Beispiele.
Altersbedingte Makuladegeneration (ARMD oder AMD) ist die führende Ursache von Blindheit bei älteren Personen. ARMD greift das Sehzentrum an und trübt es, was Lesen, Autofahren und andere detaillierte Aufgaben schwierig oder unmöglich macht. Etwa 200000 neue Fälle von ARMD treten jedes Jahr allein in den Vereinigten Staaten auf. Derzeitige Abschätzungen ergeben, dass etwa 40% der Bevölkerung eines Alters von über 75 und etwa 20% der Bevölkerung eines Alters von über 60 an einem gewissen Grad der Makuladegeneration leiden. "Feuchte" ARMD ist der Typ von ARMD, der am häufigsten Blindheit verursacht. Bei feuchter ARMD tritt aus neu gebildeten Choroidea-Blutgefäßen (Choroideaneovaskularisation (CNV)) Flüssigkeit aus und diese verursachen eine fortschreitende Schädigung der Retina. Im speziellen Fall von CNV bei ARMD werden derzeit zwei Hauptbehandlungsverfahren entwickelt, (a) Photokoagulation und (b) die Verwendung von Angiogeneseinhibitoren.
Photokoagulation kann jedoch schädlich für die Retina sein und sie ist nicht praktikabel, wenn die CNV nahe der Fovea liegt. Ferner kann eine Photokoagulation häufig zu wiederkehrender CNV im Laufe der Zeit führen. Eine orale Verabreichung von antiangiogenen Verbindungen wird derzeit auch als systemische Behandlung für ARMD getestet. Jedoch ergibt eine systemische Verabreichung aufgrund von arzneistoffspezifischen Stoffwechselbeschränkungen üblicherweise subtherapeutische Arzneistoffkonzentrationen für das Auge. Daher sind, um wirksame intraokulare Arzneistoffkonzentrationen zu erreichen, entweder eine inakzeptabel hohe Dosis oder wiederholte herkömmliche Dosen erforderlich. Verschiedene Implantate wurden auch zur lokalen Abgabe von antiangiogenen Verbindungen am Auge entwickelt. Beispiele für derartige Implantate sind in US-Patent 5 824 072 von Wong, US-Patent 5 476 511 von Gwon et al. und US-Patent 5 773 019 von Ashton et al., die hierin alle in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke als Bezug aufgenommen sind, offenbart.
Neovaskuläre Erkrankungen des Auges
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Behandlung von neovaskulären Erkrankungen des Auges bereit, die beispielsweise Korneaneovaskularisation, neovaskuläres Glaukom, proliferative diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroblasie und Makuladegeneration umfassen.
Kurz gesagt ist Korneaneovaskularisation infolge einer Läsion des hinteren Segments eine bedeutende Ursache für verminderte Sehschärfe und Blindheit und ein Hauptrisikofaktor für die Abstoßung von Korneaallotransplantaten. Wie von Burger et al., Lab. Invest. 48: 169–180, 1983, das hierin in seiner Gesamtheit für alle Zwecke als Bezug aufgenommen ist, beschrieben wurde, umfasst Korneaangiogenese drei Phasen: eine prävaskuläre Latenzperiode, aktive Neovaskularisation und vaskuläre Reifung und Regression. Die Identität und der Mechanismus verschiedener angiogener Faktoren, die Elemente der Entzündungsreaktion, wie Leukocyten, Plättchen, Cytokine und Eicosanoide, oder nicht-identifizierte Plasmabestandteile umfassen, wurden noch nicht geklärt.
Derzeit besteht keine klinisch zufriedenstellende Therapie zur Hemmung einer Korneaneovaskularisation oder Regression von bestehenden neuen Korneagefäßen. Topische Corticosteroide scheinen eine gewisse klinische Verwendbarkeit, vermutlich durch die Beschränkung der Stromaentzündung, zu besitzen.
Die WO 01/002369 und WO 01/053268 beschreiben Indazolverbindungen, die die Aktivität bestimmter Proteinkinasen hemmen und dadurch eine unerwünschte Zellproliferation hemmen. Derartige Verbindungen sind als zur Behandlung von Krebs und anderen Krankheitszuständen, die mit einer unerwünsch ten Angiogenese und/oder Zellproliferation in Verbindung stehen, wie diabetische Retinopathie, neovaskuläres Glaukom, rheumatoide Arthritis und Psoriasis, verwendbar beschrieben.
Daher werden in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Behandlung von neovaskulären Erkrankungen des Auges, wie Korneaneovaskularisation (einschließlich von Korneatransplantatneovaskularisation), bereitgestellt, wobei diese die Stufe der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer antiangiogenen Zusammensetzung (gemäß der obigen Beschreibung) an die Kornea an einen Patienten derart, dass die Bildung von Blutgefäßen gehemmt wird, umfasst. Kurz gesagt ist die Kornea ein Gewebe, das normalerweise keine Blutgefäße aufweist. Bei bestimmten pathologischen Zuständen können sich jedoch Kapillaren von dem perikornealen vaskulären Plexus des Lirabus in die Kornea erstrecken. Wenn die Kornea vaskularisiert wird, wird sie auch trüb, was zu einer Verringerung der Sehschärfe des Patienten führt. Der Verlust des Sehvermögens kann vollständig sein, wenn die Kornea vollständig opak wird.
Blutgefäße können in die Kornea in einer Vielzahl von Mustern und Tiefen in Abhängigkeit von dem Prozess, der die Neovaskularisation auslöst, eindringen. Diese Muster wurden traditionell durch Augenärzte als die folgenden Typen definiert: Pannus trachomatosus, Pannus leprosus, Pannus phylogenulosus, Pannus degenerativus und Pannus glaucomatosus. Das Korneastroma kann auch von Zweigen der Arteria ciliaris anterioris befallen sein (als interstitielle Vaskularisation bezeichnet), was mehrere deutliche klinische Läsionen verursacht: terminale Schleifen, ein "bürstenähnliches" Muster, eine Doldenform, eine Gitterform, interstitielle Arkaden (von episkleralen Gefäßen) und aberrante unregelmäßige Gefäße.
Eine breite Vielzahl von Erkrankungen kann zu Korneaneovaskularisation führen, wobei diese beispielsweise Korneainfektionen (beispielsweise ein Trachom, Herpes-simplex-Keratitis, Leishmaniose und Onchozerkose), immunologische Prozesse (beispielsweise Transplantatabstoßung und Stevens-Johnson-Syndrom), Laugenverbrennungen, Traumata, Entzündungen (beliebiger Ursache), toxische und Ernährungsmangelzustände und als Komplikation des Tragens von Kontaktlinsen umfassen.
Während die Ursache einer Korneaneovaskularisation variieren kann, ist die Reaktion der Kornea auf die Verletzung und das anschließende Gefäßeinwachsen ungeachtet der Ursache ähnlich. Kurz gesagt scheint der Ort der Läsion von Bedeutung zu sein, da nur die Läsionen, die innerhalb eines kritischen Abstands von dem Limbus gelegen sind, eine angiogene Reaktion auslösen. Dies beruht wahrscheinlich auf der Tatsache, dass die angiogenen Faktoren, die zum Auslösen der Gefäßinvasion verantwortlich sind, am Läsionsort erzeugt werden und zum Ort der nächsten Blutgefäße (dem Limbus) diffundieren müssen, um ihre Wirkung auszuüben. Ab einem bestimmten Abstand von dem Limbus ist dies nicht länger möglich und es erfolgt keine Induktion des Limbusendothels zum Einwachsen in die Kornea. Mehrere angiogene Faktoren sind wahrscheinlich an diesem Prozess beteiligt, wobei viele von diesen Produkte der Entzündungsreaktion sind. Tatsächlich scheint eine Neovaskularisation der Kornea nur in Verbindung mit einem Entzündungszellinfiltrat aufzutreten und der Grad einer Angiogenese ist proportional zum Ausmaß der Entzündungsreaktion. Ein Korneaödem erleichtert ferner das Einwachsen von Blutgefäßen durch Lockerung des Korneastromagerüsts und Bereitstellen eines Pfades des "geringsten Widerstands", durch den die Kapillaren wachsen können.
Nach der Entzündungsreaktion am Anfang schreitet das Kapillarwachstum in die Kornea auf die gleiche Weise, wie es in anderen Geweben erfolgt, fort. Die normalerweise ruhenden Endothelzellen der Limbuskapillaren und -venulen werden zur Teilung und Migration stimuliert. Die Endothelzellen sprossen von ihren Ursprungsgefäßen aus, verdauen die umgebende Basalmembran und das Gewebe, durch das sie treten, und sie wandern zur Quelle des angiogenen Reizes. Die blind endenden Sprosse erhalten ein Lumen und anastomosieren zusammen unter Bildung von Kapillarschleifen. Das Endergebnis ist die Etablierung eines vaskulären Plexus im Korneastroma.
Antiangiogene Faktoren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind durch Blockierung der stimulatorischen Wirkungen von Angiogenesepromotoren, Verringerung der Endothelzellteilung, Verringerung der Endothelzellmigration und Beeinträchtigung der Aktivität der durch das Endothel sezernierten proteolytischen Enzyme wirksam.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann ein antiangiogener Faktor zur topischen Verabreichung in Kochsalzlösung (kombiniert mit beliebigen der Konservierungsmittel und antimikrobiellen Mittel, die üblicherweise bei Augenzubereitungen verwendet werden) hergestellt werden und in Augentropfenform verabreicht werden. Die Lösung oder Suspension des antiangiogenen Faktors kann in deren reinen Form zubereitet und mehrere Male täglich verabreicht werden. Alternativ können antiangiogene Zusammensetzungen, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, auch direkt an der Kornea verabreicht werden.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die antiangiogene Zusammensetzung mit einem mucoadhäsiven Polymer, das an die Kornea bindet, zubereitet. In weiteren Ausführungsformen können die antiangiogenen Faktoren oder antiangiogenen Zusammensetzungen als Zusatz zu einer herkömmlichen Steroidtherapie verwendet werden.
Eine topische Therapie kann auch prophylaktisch bei Kornealäsionen, von denen bekannt ist, dass sie eine hohe Wahrscheinlichkeit zum Auslösen einer angiogenen Reaktion aufweisen (beispielsweise chemische Verbrennungen), günstig sein. In diesen Fällen kann die Behandlung, wie in Kombination mit Steroiden, unmittelbar durchgeführt werden, um die Verhinderung von Folgekomplikationen zu unterstützen.
In weiteren Ausführungsformen können die oben beschriebenen antiangiogenen Zusammensetzungen direkt in das Korneastroma durch einen Augenarzt unter mikroskopischer Führung injiziert werden. Der bevorzugte Injektionsort kann mit der Morphologie der individuellen Läsion variieren, doch sollte das Ziel der Verabreichung das Platzieren der Zusammensetzung an der Vorderfront des Gefäßsystems (d.h. eingefügt zwischen den Blutgefäßen und der normalen Kornea) sein. In den meisten Fällen umfasst dies eine Perilimbuskorneainjektion zum "Schützen" der Kornea vor den fortschreitenden Blutgefäßen. Dieses Verfahren kann auch kurz nach einer Kornealäsion verwendet werden, um prophylaktisch eine Korneaneovaskularisation zu verhindern. In dieser Situation könnte das Material in die Perilimbuskornea eingefügt zwischen der Kornealäsion und deren unerwünschter potentieller Limbusblutversorgung injiziert werden. Derartige Verfahren können auch in ähnlicher Weise zur Verhinderung einer Kapillarinvasion von transplantierten Korneas verwendet werden. In einer Form mit nachhaltiger Freisetzung können Injektionen nur 2- bis 3-mal pro Jahr erforderlich sein. Ein Steroid könnte der Injektionslösung ebenfalls zugesetzt werden, um eine Entzündung infolge der Injektion selbst zu verringern.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Indazolverbindung zur Verwendung als Medikament zur Behandlung eines neovaskulären Glaukoms, wobei diese die Stufe der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer antiangiogenen Zusammensetzung an das Auge an einen Patienten derart, dass die Bildung von Blutgefäßen gehemmt wird, umfasst.
Kurz gesagt ist ein neovaskuläres Glaukom ein pathologischer Zustand, wobei sich neue Kapillaren im Inneren des Auges entwickeln. Die Angiogenese geht üblicherweise von am Pupillenrand lokalisierten Gefäßen aus und sie schreitet über die Iriswurzel und in das Trabekelnetzwerk fort. Fibroblasten und andere Bindegewebeelemente sind mit dem Kapillarwachstum verbunden und es entwickelt sich eine fibrovaskuläre Membran, die sich über die hintere Oberfläche der Iris ausbreitet. Schließlich erreicht dieses Gewebe den hinteren Kammerwinkel, wo es Synechien bildet. Diese Synechien wachsen wiederum zusammen, bilden Narben und kontrahieren, wobei sie letztendlich den hinteren Kammerwinkel absperren. Die Narbenbildung verhindert eine adäquate Drainage von Humor aquosus durch den Winkel und in das Trabekelnetzwerk, was zu einer Erhöhung des Augeninnendrucks führt, was zu Blindheit führen kann.
Ein neovaskuläres Glaukom tritt allgemein als Komplikation von Erkrankungen, bei denen eine Retinaischämie vorherrschend ist, auf. Insbesondere weisen etwa ein Drittel der Patienten mit dieser Erkrankung diabetische Retinopathie auf und 28% weisen einen Verschluss der zentralen Retinavene auf. Andere Fälle umfassen eine chronische Retinaablösung, Glaukom im Endstadium, Carotisverschlusserkrankung, retrolentale Fibroplasie, Sichelzellanämie, intraokulare Tumore und kavernöse Fisteln der Carotis. In dessen frühen Stadien kann ein neovaskuläres Glaukom durch Spaltlampenbiomikroskopie mit hoher Vergrößerung diagnostiziert werden, wobei es kleine, ausgedehnte desorganisierte Kapillaren (die Fluorescein abgeben) auf der Oberfläche der Iris zeigt. Eine spätere Gonioskopie zeigt eine progressive Obliteration des Vorderkammerwinkels durch fibrovaskuläre Bänder. Während der Vorderkammerwinkel noch offen ist, können konservative Therapien hilfreich sein. Sobald jedoch der Winkel geschlossen ist, ist ein chirurgischer Eingriff erforderlich, um den Druck zu mildern.
Daher können in einer Ausführungsform der Erfindung antiangiogene Faktoren (entweder allein oder in einer antiangiogenen Zusammensetzung wie oben beschrieben) topisch am Auge verabreicht werden, um frühe Formen eines neovaskulären Glaukoms zu behandeln.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung können antiangiogene Zusammensetzungen durch Injektion der Zusammensetzung in die Region des Vorderkammerwinkels implantiert werden. Dies ergibt eine nachhaltige lokalisierte Erhöhung eines antiangiogenen Faktors und es verhindert das Wachstum von Blutgefäßen in dem Bereich. Implantierte oder injizierte antiangiogene Zusammensetzungen, die zwischen den fortschreitenden Kapillaren der Iris und dem Vorderkammerwinkel platziert werden, können den offenen Winkel vor einer Neovaskularisation "verteidigen". Da Kapillaren innerhalb eines signifikanten Radius der antiangiogenen Zusammensetzung nicht wachsen, kann das Offensein des Winkels beibehalten werden. In anderen Ausführungsformen kann die antiangiogene Zusammensetzung auch an einer beliebigen Stelle derart platziert werden, dass der antiangiogene Faktor kontinuierlich in den Humor aquosus abgegeben wird.
Dies kann die Konzentration des antiangiogenen Faktors im Humor erhöhen, der wiederum die Oberfläche der Iris und deren anormale Kapillaren badet, wodurch ein weiterer Mechanismus bereitgestellt wird, durch den die Medikation zugeführt wird. Diese therapeutischen Modalitäten können auch prophylaktisch und in Kombination mit bestehenden Behandlungen verwendbar sein.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Indazolverbindung zur Verwendung als Medikament zur Behandlung von proliferativer diabetischer Retinopathie bereitgestellt, wobei diese die Stufe der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer antiangiogenen Zusammensetzung an die Augen an einen Patienten derart, dass die Bildung von Blutgefäßen gehemmt wird, umfasst.
Kurz gesagt wird angenommen, dass die Pathologie von diabetischer Retinopathie ähnlich der oben für neovaskuläres Glaukom ist. Insbesondere wird angenommen, dass eine diabetische Retinopathie im Hintergrund unter dem Einfluss von Retinahypoxie in proliferative diabetische Retinopathie umgewandelt wird. Allgemein sprosst neovaskuläres Gewebe vom optischen Nerv (üblicherweise innerhalb 10 mm vom Rand) und von der Oberfläche der Retina in Regionen, in denen die Gewebedurchblutung schlecht ist, aus. Zunächst wachsen die Kapillaren zwischen der inneren Grenzmembran der Retina und der hinteren Oberfläche des Glaskörpers. Schließlich wachsen die Gefäße in den Glaskörper und durch die innere Grenzmembran. Wenn der Glaskörper kontrahiert, wird auf die Gefäße ein Zug ausgeübt, der häufig zu einem Scheren der Gefäße und Blindwerden des Glaskörpers aufgrund von Hämorrhagie führt. Eine Fasertraktion aufgrund von Narbenbildung in der Retina kann auch eine Retinaablösung hervorrufen.
Die herkömmliche Therapie der Wahl ist eine panretinale Photokoagulation zur Verringerung von Retinagewebe und dadurch Verringerung des Retinasauerstoffbedarfs. Obwohl diese zunächst wirksam ist, besteht eine hohe Rückfallrate mit neuen Läsionen, die sich in anderen Teilen der Retina bilden. Komplikationen dieser Therapie umfassen eine Verringerung des peripheren Sehbereichs von bis zu 50% der Patienten, mechanische Abtragungen der Kornea, eine laserinduzierte Kataraktbildung, akutes Glaukom und die Stimulation von subretinalem neovaskulärem Wachstum (was zu einem Verlust des Sehvermögens führen kann). Infolgedessen wird dieses Verfahren nur durchgeführt, wenn mehrere Risikofaktoren vorhanden sind und das Risiko/Nutzen-Verhältnis klar zugunsten des Eingriffs ist.
Daher kann in speziell bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung eine proliferative diabetische Retinopathie durch Injektion eines antiangiogenen Faktors bzw. von antiangiogenen Faktoren (oder einer antiangiogenen Zusammensetzung) in den Humor aquosus oder den Glaskörper behandelt werden, um die lokale Konzentration eines antiangiogenen Faktors in der Retina zu erhöhen. Vorzugsweise sollte diese Behandlung vor der Ausbildung einer schweren Erkrankung, die eine Photokoagulation erfordert, begonnen werden. In anderen Ausführungsformen der Erfindung können Arterien, die die neovaskulären Läsionen versorgen, embolisiert werden (wobei antiangiogene Zusammensetzungen wie oben beschrieben verwendet werden).
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Indazolverbindung zur Verwendung als Medikament zur Behandlung von retrolentaler Fibroblasie verwendet, wobei diese die Stufe der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines antiangiogenen Faktors (oder einer antiangiogenen Zusammensetzung) an das Auge an einen Patienten derart, dass die Bildung von Blutgefäßen gehemmt wird, umfasst.
Kurz gesagt ist retrolentale Fibroblasie ein Zustand, der bei Frühgeborenen auftritt, die eine Sauerstofftherapie erhalten. Das periphere Retinagefäßsystem, insbesondere auf der temporalen Seite, wird erst am Ende des fetalen Lebens vollständig ausgebildet. Sauerstoff im Überschuss (auch Konzentrationen, die physiologisch angemessen sind) und die Bildung von freien Radikalen von Sauerstoff werden als wichtig beim Verursachen einer Schädigung der Blutgefäße der unreifen Retina angenommen. Diese Gefäße ziehen sich zusammen und werden dann bei Einwirken von Sauerstoff strukturell verschlossen. Infolgedessen kommt es nicht zu einer Vaskularisation der peripheren Retina und es folgt Retinaischämie. Als Reaktion auf die Ischämie wird Neovaskularisation an der Verbindungsstelle der normalen und der ischämischen Retina induziert.
In 75% der Fälle bilden sich diese Gefäße spontan zurück. Jedoch tritt in den verbleibenden 25% fortgesetztes Kapillarwachstum, eine Kontraktion der fibrovaskulären Komponente und eine Traktion auf sowohl die Gefäße als auch die Retina auf. Dies führt zu einer Glaskörperhämorrhagie und/oder Retinaablösung, die zu Blindheit führen kann. Ein neovaskuläres Winkelverschlussglaukom ist auch eine Komplikation dieses Zustands.
Da es häufig unmöglich ist, zu bestimmen, welche Fälle sich spontan lösen und welche bezüglich der Schwere fortschreiten, wird eine herkömmliche Behandlung (d.h. eine Operation) allgemein nur bei Patienten mit etablierter Erkrankung und einer gut entwickelten Pathologie initiiert. Dieser Ansatz des "Abwartens" verhindert eine frühe Intervention und er ermöglicht das Fortschreiten einer Erkrankung in den 25%, bei denen ein komplizierter Verlauf folgt. Daher kann in einer Ausführungsform der Erfindung eine topische Verabreichung von antiangiogenen Faktoren (oder antiangiogenen Zusammensetzungen gemäß der obigen Beschreibung) bei Säuglingen, bei denen ein hohes Risiko zur Entwicklung dieses Zustands besteht, in einem Versuch, das Auftreten einer Progression einer retrolentalen Fibroplasie zu verhindern, durchgeführt werden. In anderen Ausführungsformen können Intraglaskörperinjektionen und/oder intraokulare Implantate einer antiangiogenen Zusammensetzung verwendet werden. Derartige Verfahren sind in Fällen einer etablierten Erkrankung, um die Notwendigkeit einer Operation zu verringern, bevorzugt.
Proteinkinasen
Proteinkinasen sind eine Familie von Enzymen, die die Phosphorylierung der Hydroxylgruppe von spezifischen Tyrosin-, Serin- oder Threoninresten in Proteinen katalysieren. Typischerweise stört eine derartige Phosphorylierung dramatisch die Funktion des Proteins und daher sind Proteinkinasen ein Angelpunkt bei der Regulation einer breiten Vielzahl zellulärer Prozesse, die Metabolisierung, Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Überleben von Zellen umfassen. Von den vielen verschiedenen Zellfunktionen, für die die Aktivität von Proteinkinasen bekanntlich erforderlich ist, stellen einige Prozesse attraktive Ziele für eine therapeutische Intervention für bestimmte Erkrankungszustände dar. Zwei Beispiele sind Angiogenese und Zellzykluskontrolle, wobei Proteinkinasen eine Angelpunktrolle spielen; diese Prozesse sind für das Wachstum solider Tumore sowie anderer Erkrankungen entscheidend wichtig.
Angiogenese ist der Mechanismus, durch den neue Kapillaren aus bestehenden Gefäßen gebildet werden. Wenn es erforder lich ist, hat das Gefäßsystem das Potential zur Erzeugung neuer Kapillarennetzwerke, um das entsprechende Funktionieren von Geweben und Organen aufrechtzuerhalten. Beim Erwachsenen ist jedoch Angiogenese ziemlich beschränkt, wobei sie nur im Prozess der Wundheilung und der Neovaskularisation des Endometriums während der Menstruation auftritt. Siehe Merenmies et al., Cell Growth & Differentiation, 8, 3–10 (1997). Andererseits ist eine unerwünschte Angiogenese ein Kennzeichen von mehreren Erkrankungen, wie Retinopathien, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Krebs (solide Tumore); Folkman, Nature Med., 1, 27–31 (1995). Proteinkinasen, von denen gezeigt wurde, dass sie an dem angiogenen Prozess beteiligt sind, umfassen drei Mitglieder der Wachstumsfaktorrezeptor-Tyrosinkinasefamilie: VEGF-R2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2, der auch als KDR (Kinase Insert Domgin Receptor) und als FLK-1 bekannt ist), FGF-R (Fibroblast Growth Factor Receptor) und TEK (auch als Tie-2 bekannt).
VEGF-R2, die nur an Endothelzellen exprimiert wird, bindet den stark wirksamen angiogenen Wachstumsfaktor VEGF und sie vermittelt die anschließende Signalübermittlung durch Aktivierung von deren intrazellulärer Kinaseaktivität. Daher wird angenommen, dass eine direkte Hemmung der Kinaseaktivität von VEGF-R2 zur Verringerung einer Angiogenese auch in Gegenwart von exogenem VEGF führt (siehe Strawn et al., Cancer Research, 56, 3540–3546 (1996)), was mit Mutanten von VEGF-R2 gezeigt wurde, die keine Signalübertragung vermitteln; Millauer et al., Cancer Research, 56, 1615–1620 (1996). Ferner scheint VEGF-R2 keine Funktion beim Erwachsenen über das Vermitteln der angiogenen Aktivität von VEGF hinaus zu besitzen. Daher sollte ein selektiver Inhibitor der Kinaseaktivität von VEGF-R2 geringe Toxizität zeigen.
In ähnlicher Weise bindet FGF-R die angiogenen Wachstumsfaktoren aFGF und bFGF und sie vermittelt anschließende intrazelluläre Signalübermittlung. Vor kurzem wurde vorgeschlagen, dass Wachstumsfaktoren wie bFGF eine kritische Rolle im Hinblick auf das Induzieren von Angiogenese in soliden Tumoren, die eine bestimmte Größe erreicht haben, spielen können; Yoshiji et al., Cancer Research, 57, 3924–3928 (1997). Im Gegensatz zu VEGF-R2 wird FGF-R jedoch in einer Zahl verschiedener Zellarten im gesamten Körper exprimiert und es kann wichtige Rollen in anderen normalen physiologischen Prozessen im Erwachsenen spielen oder auch nicht. Indessen wurde berichtet, dass eine systemische Verabreichung eines kleinmolekularen Inhibitors der Kinaseaktivität von FGF-R eine bFGF-induzierte Angiogenese bei Mäusen ohne offensichtliche Toxizität blockiert; Mohammed et al., EMBO Journal, 17, 5996–5904 (1998).
TEK (das auch als Tie-2 bekannt ist) ist eine weitere Rezeptortyrosinkinase, die nur in Endolthelzellen exprimiert wird, von der gezeigt wurde, dass sie eine Rolle bei der Angiogenese spielt. Die Bindung des Faktors Angiopoietin-1 führt zur Autophosphorylierung der Kinasedomäne von TEK und sie führt zu einem Signalübermittlungsprozess, der die Interaktion von Endothelzellen mit periendothelialen Trägerzellen zu vermitteln scheint, wodurch die Reifung von neu gebildeten Blutzellen ermöglicht wird. Der Faktor Angiopoietin-2 scheint andererseits antagonistisch auf die Wirkung von Angiopoietin-1 auf TEK zu wirken und er unterbricht die Angiogenese; Maisonpierre et al., Science, 277, 55–60 (1997).
Infolge der oben beschriebenen Entwicklungen wurde vorgeschlagen, Angiogenese durch die Verwendung von Verbindungen, die die Kinaseaktivität von VEGF-R2, FGF-R und/oder TEK hemmen, zu behandeln. Beispielsweise offenbart die in ternationale Veröffentlichung der WIPO WO 97/34876 bestimmte Cinnolinderivate, die Inhibitoren von VEGF-R2 sind, die zur Behandlung von Erkrankungszuständen verwendet werden können, die mit anomaler Angiogenese und/oder erhöhter Gefäßpermeabilität in Verbindung stehen, wie Krebs, Diabetes, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Kaposi-Sarkom, Hämangiom, akute und chronische Nephropathien, Atherom, Arterienrestenose, Autoimmunerkrankunegn, akute Entzündungen und Augenerkrankungen mit Retinagefäßproliferation.
Phosphorylasekinase aktiviert Glykogenphosphorylase, wodurch Glykogenabbau und Glucosefreisetzung in der Leber erhöht werden. Die Glucoseproduktion in der Leber ist in Typ-2-Diabetes dysreguliert und sie ist die primäre Ursache von Hyperglykämie beim Fasten, was zu vielen der Sekundärkomplikationen, die diese Patienten erleiden, führt. Daher kann eine Verringerung der Glucosefreisetzung von der Leber erhöhte Plasmaglucosespiegel senken. Inhibitoren von Phosphorylasekinase sollten daher Phosphorylaseaktivität und Glykogenolyse verringern, wodurch Hyperglykämie bei Patienten verringert wird.
Eine weitere physiologische Reaktion auf VEGF ist Gefäßhyperpermeabilität, wobei vorgeschlagen wurde, dass diese eine Rolle in den frühen Stadien einer Angiogenese spielt. In ischämischen Geweben, die beispielsweise im Gehirn von Schlaganfallopfern auftreten, löst Hypoxie die VEGF-Expression aus, was zu einer erhöhten Gefäßpermeabilität und schließlich einem Ödem in den umgebenden Geweben führt. In einem Rattenmodell für einen Schlaganfall wurde durch van Bruggen et al., J. Clinical Invest., 104, 1613–20 (1999), gezeigt, dass die Verabreichung eines monoklonalen Antikörpers für VEGF das Infarktvolumen verringert. Daher wird angenommen, das Inhibitoren von VEGFR zur Behandlung eines Schlaganfalls verwendbar sind.
Zusätzlich zu deren Rolle bei Angiogenese spielen Proteinkinasen auch eine entscheidende Rolle in der Zellzykluskontrolle. Eine unkontrollierte Zellproliferation ist das Zeichen einer Krebserkrankung. Zellproliferation als Reaktion auf verschiedene Reize wird durch eine Deregulation des Zellteilungszyklus, den Prozess, durch den sich Zellen vermehren und teilen, manifestiert. Tumorzellen weisen typischerweise eine Schädigung der Gene, die direkt oder indirekt die Progression durch den Zellteilungszyklus regulieren, auf.
Cyclinabhängige Kinasen (CDKs) sind Serin-Threonin-Proteinkinasen, die entscheidend wichtige Rollen bei der Regulation der Übergänge zwischen verschiedenen Phasen des Zellzyklus spielen. Siehe beispielsweise die in Science, 274, 1643–1677 (1996) zusammengefassten Artikel. CDK-Komplexe werden durch Assoziation einer regulatorischen Cyclinuntereinheit (beispielsweise Cyclin A, B1, B2, D1, D2, D3 und E) und einer katalytischen Kinaseuntereinheit (beispielsweise cdc2 (CDK1), CDK2, CDK4, CDK5 und CDK6) gebildet. Wie dies der Name impliziert, zeigen die CDKs eine absolute Abhängigkeit von der Cyclinuntereinheit, um deren Zielsubstrate zu phosphorylieren, und verschiedene Kinase/Cyclin-Paare bewirken eine Regulation der Progression durch spezifische Phasen des Zellzyklus.
Tatsächlich ist es CDK4, die mit den D-Cyclinen komplexiert ist, die einen entscheidend wichtigen Teil im Hinblick auf das Initiieren des Zellteilungszyklus aus einem ruhenden oder stillen Zustand in einen, in dem Zellen der Zellteilung unterliegen, spielt. Diese Progression unterliegt einer Vielzahl von Wachstumsregulationsmechanismen, die sowohl negativ als auch positiv sind. Aberrationen in diesem Kontrollsystem, insbesondere diejenigen, die die Funktion von CDK beeinflussen, sind an dem Fortschreiten von Zellen in den hochproliferativen Zustand, der für bösartige Erkrankungen, insbesondere familiäre Melanome, Speiseröhrenkarzinome und Bauchspeicheldrüsenkrebserkrankungen charakteristisch sind, beteiligt; siehe beispielsweise Kamb, Trends in Genetics, 11, 136–140 (1995); Kamb et al., Science, 264, 436–440 (1994).
Unzählige Veröffentlichungen beschreiben eine Vielzahl chemischer Verbindungen, die gegenüber einer Vielzahl therapeutischer Ziele verwendbar sind. Beispielsweise beschreibt die internationale Veröffentlichung der WIPO WO 99/23077 und WO 99/23076 indazolhaltige Verbindungen, die Phosphodiesterase-Typ-IV-Hemmaktivität aufweisen, die durch eine Bioisostersubstitution von Catechol durch Indazol hergestellt wurden. Das US-Patent 5 760 028 offenbart Heterocyclen, die 3-[1-[3-(Imidazolin-2-ylamino)propyl]indazol-5-yl-carbonylamino]-2-(benzyloxycarbonylamino)propionsäure umfassen, die als Antagonisten des α_vβ₃-Integrin und verwandter Zelloberflächenadhäsionsproteinrezeptoren verwendbar sind. Die internationale Veröffentlichung der WIPO WO 98/09961 offenbart bestimmte Indazolderivate und deren Verwendung als Inhibitoren von Phosphodiesterase (PDE) Typ IV oder der Produktion von Tumornekrosefaktor (TNF) in einem Säuger. Jüngere Zugänge zu der virtuellen Bibliothek bekannter Verbindungen umfassen diejenigen, die als antiproliferative Therapeutika, die CDKs hemmen, beschrieben wurden. Beispielsweise offenbart das US-Patent 5 621 082 von Xiong et al. Nucleinsäure mit Codierung für einen Inhibitor von CDK6 und die europäische Patentveröffentlichung 0 666 270 A2 beschreibt Peptide und Peptidmimetika, die als Inhibitoren von CDK1 und CDK2 fungieren. Die internationale Veröffentlichung der WIPO WO 97/16447 offenbart bestimmte Analoga von Chromonen, die Inhibitoren von cyclinabhängigen Kinasen, insbesondere von CDK/Cyclin-Kom plexen, wie CDK4/Cyclin D1, sind, die zur Hemmung übermäßiger oder anomaler Zellproliferation und daher zur Behandlung von Krebs verwendet werden können. Die internationale Veröffentlichung der WIPO WO 99/21845 beschreibt 4-Aminothiazolderivate, die als CDK-Inhibitoren verwendbar sind.
Es besteht jedoch immer noch Bedarf an kleinmolekularen Verbindungen, die ohne weiteres synthetisiert werden können und im Hinblick auf die Hemmung von einem oder mehreren CDKs oder CDK/Cyclin-Komplexen wirksam sind. Da CDK4 als genereller Aktivator der Zellteilung in den meisten Zellen dienen kann und Komplexe von CDK4 und D-Typ-Cyclinen die frühe G₁-Phase des Zellzyklus bestimmen, besteht Bedarf an wirksamen Inhibitoren von CDK4 und D-Typ-Cyclin-Komplexen derselben zur Behandlung von einer oder mehreren Tumorarten. Ferner bieten die Angelpunktrollen von Cyclin E/CDK2- und Cyclin B/CDK1-Kinasen in der G₁/S-Phase bzw. G₂/M-Übergängen zusätzliche Ziele für eine therapeutische Intervention zur Unterdrückung einer deregulierten Zellzyklusprogression bei Krebs.
Eine andere Proteinkinase, CHK1, spielt eine wichtige Rolle als Checkpoint der Zellzyklusprogression. Checkpoints sind Kontrollsysteme, die die Zellzyklusprogression durch Beeinflussen der Bildung, Aktivierung und anschließenden Inaktivierung der cyclinabhängigen Kinasen koordinieren. Checkpoints verhindern eine Zellzyklusprogression zu ungeeigneten Zeitpunkten, sie halten die Stoffwechselbalance von Zellen, während die Zelle im Stillstand ist, und sie können in einigen Fällen Apoptose (programmierten Zelltod) induzieren, wenn die Anforderungen des Checkpoints nicht erfüllt werden. Siehe beispielsweise O'Connor, Cancer Surveys, 29, 151–182 (1997); Nurse, Cell, 91, 865–867 (1997); Hartwell et al., Science, 266, 1821–1828 (1994); Hartwell et al., Science, 246, 629–634 (1989).
Eine Reihe von Checkpoints überwacht die Integrität des Genoms, und beim Feststellen einer DNA-Schädigung blockieren diese "DNA-Schädigung-Checkpoints" die Zellzyklusprogression in G₁- und G₂-Phasen und sie verlangsamen die Progression durch die S-Phase. O'Connor, Cancer Surveys, 29, 151–182 (1997); Hartwell et al., Science, 266, 1821–1828 (1994). Diese Aktion macht es möglich, dass DNA-Reparaturprozesse ihre Aufgaben durchführen, bevor die Replikation des Genoms und die anschließende Abtrennung dieses Genmaterials in neue Tochterzellen stattfindet. Bedeutsamerweise produziert das am häufigsten mutierte Gen bei humanen Krebserkrankungen, das p53-Tumorsuppressorgen, ein DNA-Schädigung-Checkpointprotein, das nach einer DNA-Schädigung die Zellzyklusprogression in der G₁-Phase blockiert und/oder Apoptose (programmierten Zelltod) induziert; Hartwell et al., Science, 266, 1821–1828 (1994). Es wurde auch gezeigt, dass der p53-Tumorsuppressor die Wirkung eines DNA-Schädigung-Checkpoints in der G₂-Phase des Zellzyklus verstärkt. Siehe beispielsweise Bunz et al., Science, 28, 1497–1501 (1998); Winters et al., Oncogene, 17, 673–684 (1998); Thompson, Oncogene, 15, 3025–3035 (1997).
In Kenntnis der entscheidenden Natur des p53-Tumorsuppressorpfades bei humanem Krebs wurde aktiv nach therapeutischen Interventionen, die Verletzbarkeiten bei p53-defizientem Krebs nutzen, gesucht. Eine hervorstechende Verletzbarkeit liegt in der Operation des G₂-Checkpoints in p53-defizienten Krebszellen. Krebszellen sind, da ihnen die G₁-Checkpointkontrolle fehlt, besonders verletzbar durch eine Abschaffung der letzten verbleibenden Barriere, die sie vor den krebstötenden Wirkungen von DNA-Schädigungsmitteln schützt: dem G₂-Checkpoint. Der G₂-Checkpoint wird durch ein Kontrollsystem reguliert, das von Hefe bis Men schen konserviert ist. Wichtig in diesem konservierten System ist eine Kinase, CHK1, die Signale von dem DNA-Schädigung-Sensorkomplex zur Hemmung einer Aktivierung der Cyclin B/Cdc2-Kinase, die den Mitosebeginn fördert, übermittelt. Siehe beispielsweise Peng et al., Science, 277, 1501–1505 (1997); Sanchez et al., Science, 277, 1497–1501 (1997). Es wurde gezeigt, dass die Inaktivierung von CHK1 sowohl einen G₂-Stillstand, der durch eine DNA-Schädigung, die durch entweder Antikrebsmittel hervorgerufen wurde, oder eine endogene DNA-Schädigung induziert wurde, abschafft als auch zu einem bevorzugten Abtöten der erhaltenen, Checkpoint-defizienten Zellen führt. Siehe beispielsweise Nurse, Cell, 91, 865–867 (1997); Weinert, Science, 277, 1450–1451 (1997); Walworth et al., Nature, 363, 368–371 (1993) und Al-Khodairy et al., Molec. Biol. Cell, 5, 147–160 (1994).
Die selektive Manipulation einer Checkpointkontrolle in Krebszellen könnte eine breite Verwendung in Krebschemotherapie- und -radiotherapieprotokollen ergeben und ferner ein gemeinsames Kennzeichen einer "Genominstabilität" bei humanem Krebs bieten, das als selektive Basis zur Zerstörung von Krebszellen genutzt werden könnte. Eine Zahl von Faktoren platzieren CHK1 als entscheidendes Ziel der DNA-Schädigung-Checkpointkontrolle. Das Erkennen von Inhibitoren für diese und funktional verwandte Kinasen, wie Cds1/CHK2, eine Kinase, von der vor kurzem entdeckt wurde, dass sie mit CHK1 bei der Regulation der S-Phase-Progression kooperiert (siehe Zeng et al., Nature, 395, 507–510 (1998); Matsuoka, Science, 282, 1893–1897 (1998)), könnte nutzbare neue therapeutische Einheiten zur Behandlung von Krebs liefern.
Die Integrinrezeptorbindung an ECM initiiert intrazelluläre Signale, die durch FAK (Focal Adhesion Kinase) vermittelt werden, die an Zellbeweglichkeit, Zellproliferation und Überleben beteiligt sind. Bei humanen Krebserkrankungen ist eine FAK-Überexpression an Turmorgenese und metastatischem Potential durch deren Rolle in integrinvermittelten Signalisierungswegen beteiligt.
Tyrosinkinasen können vom Rezeptortyp (der extrazelluläre, Transmembran- und intrazelluläre Domänen aufweist) oder Nichtrezeptortyp (der vollständig intrazellulär ist) sein. Von mindestens einer der Nichtrezeptor-Proteintyrosinkinasen, d.h. LCK, wird angenommen, dass sie die Übermittlung in T-Zellen von einem Signal von der Interaktion eines Zelloberflächenproteins (Cd4) mit einem vernetzten Anti-Cd4-Antikörper vermittelt. Eine detailliertere Diskussion von Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen ist in Bolen, Oncogene, 8, 2025–2031 (1993) angegeben.
Zusätzlich zu den oben identifizierten Proteinkinasen wurden viele andere Proteinkinasen als therapeutische Ziele in Betracht gezogen und zahlreiche Veröffentlichungen offenbaren Inhibitoren von Kinaseaktivität, die beispielsweise im folgenden zusammengefasst sind: US-Patent 6 534 524 , erteilt am 18. März 2003, US-Patent 6 531 491 , erteilt am 11. März 2003, internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 00/38665 (veröffentlicht am 6. Juli 2001), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 97/49688 (veröffentlicht am 31. Dezember 1997), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 98/23613 (veröffentlicht am 4. Juni 1998), US-Patent 6 071 935 , erteilt am 6. Juni 2000, internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 96/30347 (veröffentlicht am 3. Oktober 1996), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 96/40142 (veröffentlicht am 19. Dezember 1996), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 97/13771 (veröffentlicht am 17. April 1997), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 95/23141 (veröffentlicht am 31. August 1995), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 03/006059 (veröffentlicht am 23. Januar 2003), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 03/035047 (veröffentlicht am 1. Mai 2003), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 02/064170 (veröffentlicht am 22. August 2002), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 02/41882 (veröffentlicht am 30. Mai 2002), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 02/30453 (veröffentlicht am 18. April 2002), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 01/85796 (veröffentlicht am 15. November 2001), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 01/74360 (veröffentlicht am 11. Oktober 2001), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 01/74296 (veröffentlicht am 11. Oktober 2001), internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 01/70268 (veröffentlicht am 27. September 2001), europäische Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer EP 1 086 705 (veröffentlicht am 28. März 2001) und internationale PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer WO 98/51344 (veröffentlicht 19. November 1998).
Es besteht jedoch immer noch Bedarf an wirksamen Inhibitoren von Proteinkinasen. Darüber hinaus ist es, wie dies dem Fachmann selbstverständlich ist, für Kinaseinhibitoren erwünscht, dass sie sowohl hohe Affinität für die Zielkinase oder die Zielkinasen sowie hohe Selektivität gegenüber anderen Proteinkinasen besitzen.
Daher ist eine Aufgabe der Erfindung die Entdeckung stark wirksamer Mittel zur Behandlung von Augenerkrankungen, wie altersbedingte Makuladegeneration (ARMD), Choroideaneo vaskularisation (CNV), Retinopathien (beispielsweise diabetische Retinopathie, Vitreoretinopathie, Frühgeborenenretinopathie), Retinitis (beispielsweise Cytomegalovirus(CMV)-Retinitis), Uveitis, Makulaödem und Glaukom.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung stark wirksamer Inhibitoren von Proteinkinasen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Entdeckung wirksamer Kinaseinhibitoren, die eine starke und selektive Affinität für eine oder mehrere spezielle Kinasen aufweisen.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung, die aus der folgenden Beschreibung ersichtlich sind, wurden durch die Entdeckung der Indazolverbindungen und pharmazeutisch akzeptabler Salze derselben (derartige Verbindung, Prodrugs, Metabolite und Salze werden kollektiv als "Mittel" bezeichnet), die im folgenden beschrieben sind, die die Aktivität von Proteinkinasen modulieren und/oder hemmen. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die derartige Mittel enthalten, sind bei der Behandlung von Erkrankungen, die durch Kinaseaktivität vermittelt werden, wie Krebserkrankungen, sowie andere Krankheitszustände, die mit unerwünschter Angiogenese und/oder Zellproliferation in Verbindung stehen, wie diabetische Retinopathie, neovaskuläres Glaukom, rheumatoide Arthritis und Psoriasis, verwendbar. Ferner besitzen die Mittel vorteilhafte Eigenschaften in Bezug auf die Modulation und/oder Hemmung der Kinaseaktivität, die mit VEGF-R, FGF-R, CDK-Komplexen, CHK1, LCK, TEK, FAK und/oder Phosphorylasekinase verbunden ist.
In einem generellen Aspekt betrifft die Erfindung die Verbindung mit der im folgenden angegebenen Struktur:
Die Erfindung betrifft ferner ein In-vitro-Verfahren zur Modulation und/oder Hemmung der Kinaseaktivität von VEGF-R, FGF-R, einem CDK-Komplex, CHK1, LCK, TEK, FAK und/oder Phosphorylasekinase durch Verabreichen einer Verbindung der Formel I oder von einem pharmazeutisch akzeptablen Salz derselben. Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die selektive Kinaseaktivität aufweisen, d.h. signifikante Aktivität gegen eine oder mehrere spezifische Kinasen besitzen, während sie eine geringere oder minimale Aktivität gegen eine oder mehrere andere Kinasen besitzen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind Verbindungen der vorliegenden Erfindung diejenigen der Formel I, die eine wesentlich höhere Wirksamkeit gegen VEFG-Rezeptortyrosinkinase als gegen FGF-R1-Rezeptortyrosinkinase besitzen. Die Erfindung ist auch auf Verfahren zur Modulation von VEGF-Rezeptortyrosinkinaseaktivität ohne signifikante Modulation von FGF-Rezeptortyrosinkinaseaktivität gerichtet.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können vorteilhafterweise in Kombination mit anderen bekannten Therapeutika verwendet werden. Beispielsweise können Verbindungen der Formel I, die antiangiogene Aktivität besitzen, mit cytotoxischen Chemotherapeutika, wie Taxol, Taxotere, Vinblastin, Cisplatin, Doxorubicin, Adriamycin und dgl., co-verabreicht werden, um eine verstärkte Antitumorwirkung hervorzurufen. Eine additive oder synergistische Verstärkung der therapeu tischen Wirkung kann auch durch Co-Verabreichung von Verbindungen der Formel I, II, III oder IV, die antiangiogene Aktivität besitzen, mit anderen antiangiogenen Mitteln, wie Combretastatin A-4, Endostatin, Prinomastat, Celecoxib, Rofocoxib, EMD121974, IM862, monoklonale-Anti-VEGF-Antikörper und monoklonale Anti-KDR-Antikörper, erhalten werden. Weitere Kombinationen sind als Beispiele in WO 0038716 , WO 00387171 , WO 0038715 , WO 0038730 , WO 0038718 , WO 0038665 , WO 0037107 , WO 0038786 , WO 0038719 , die alle gleichzeitig am 22. Dezember 1999 eingereicht wurden, angegeben.
Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die jeweils eine wirksame Menge eines Mittels, das aus Verbindungen der Formel I und pharmazeutisch akzeptablen Salzen, pharmazeutisch aktiven Metaboliten und pharmazeutisch akzeptablen Prodrugs derselben ausgewählt ist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel für ein derartiges Mittel umfassen. Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Behandlung von Augenerkrankungen/zuständen und Krebserkrankungen sowie anderen Krankheitszuständen, die mit einer unerwünschten Angiogenese und/oder Zellproliferation verbunden sind, bereit, die das Verabreichen wirksamer Mengen eines derartigen Mittels an einen eine derartige Behandlung benötigenden Patienten umfassen.
Die erfindungsgemäße Verbindung der Formel I ist zur Behandlung von Augenerkrankungen und zur Mäßigung der Aktivität von Proteinkinasen verwendbar. Insbesondere sind die Verbindungen als Antiangiogenesemittel und als Mittel zur Modulation und/oder Hemmung der Aktivität von Proteinkinasen verwendbar, wodurch Behandlungsmöglichkeiten für Augenerkrankungen und Krebserkrankungen oder andere Erkrankungen, die mit durch Proteinkinasen vermittelter Zellproliferation verbunden sind, bereitgestellt werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Alkyl" bezeichnet gerad- und verzweigtkettige Alkylgruppen mit einem bis zwölf Kohlenstoffatomen. Beispiele für Alkylgruppen umfassen Methyl (Me), Ethyl (Et), n-Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek-Butyl, tert-Butyl (t-Bu), Pentyl, Isopentyl, tert-Pentyl, Hexyl, Isohexyl und dgl. Der Ausdruck "Niederalkyl" bezeichnet ein Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen (ein C_1-8-Alkyl). Geeignete substituierte Alkyle umfassen Fluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, 2-Fluorethyl, 3-Fluorpropyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, 3-Hydroxypropyl und dgl.
Der Ausdruck "Alkyliden" bezeichnet einen zweiwertigen Rest mit einem bis zwölf Kohlenstoffatomen. Beispiele für Alkylidengruppen umfassen CH₂, CHCH₃, (CH₃)₂ und dgl.
Der Ausdruck "Alkenyl" bezeichnet gerad- und verzweigtkettige Alkenylgruppen mit zwei bis zwölf Kohlenstoffatomen. Beispiele für Alkenylgruppen umfassen Prop-2-enyl, But-2-enyl, But-3-enyl, 2-Methylprop-2-enyl, Hex-2-enyl und dgl.
Der Ausdruck "Alkinyl" bezeichnet gerad- und verzweigtkettige Alkinylgruppen mit zwei bis zwölf Kohlenstoffatomen.
Der Ausdruck "Cycloalkyl" bezeichnet gesättigte oder partiell ungesättigte Carbocyclen mit drei bis zwölf Kohlenstoffatomen, die bicyclische und tricyclische Cycloalkylstrukturen umfassen. Geeignete Cycloalkyle umfassen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl und dgl.
Eine "Heterocycloalkyl"gruppe soll einen gesättigten oder partiell ungesättigten monocyclischen Rest bedeuten, der Kohlenstoffatome, vorzugsweise 4 oder 5 Ringkohlenstoff atome, und mindestens ein Heteroatom, das aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt ist, enthält.
Die Ausdrücke "Aryl" und "Heteroaryl" bezeichnen monocyclische und polycyclische ungesättigte oder aromatische Ringstrukturen, wobei "Aryl" solche bezeichnet, die Carbocyclen sind, und "Heteroaryl" solche bezeichnet, die Heterocyclen sind. Beispiele für aromatische Ringstrukturen umfassen Phenyl, Naphthyl, 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl, Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Pyridinyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl, 1,2,3-Triazinyl, 1,2,4-Oxadiazolyl, 1,3,4-Oxadiazolyl, 1-H-Tetrazol-5-yl, Indolyl, Chinolinyl, Benzofuranyl, Benzothienyl (Thianaphthenyl) und dgl. Derartige Einheiten können optional durch eine kondensierte Ringstruktur oder eine Brücke, beispielsweise OCH₂-O, substituiert sein.
Der Ausdruck "Alkoxy" soll den Rest -O-Alkyl bedeuten. Erläuterungsbeispiele umfassen Methoxy, Ethoxy, Propoxy und dgl.
Der Ausdruck "Aryloxy" steht für -O-Aryl, worin Aryl wie oben definiert ist.
Der Ausdruck "Cycloalkoxyl" steht für -O-Cycloalkyl, worin Cycloalkyl wie oben definiert ist.
Der Ausdruck "Halogen" steht für Chlor, Fluor, Brom oder Iod. Der Ausdruck "Halo" steht für Chlor, Fluor, Brom oder Iod.
Allgemein können die verschiedenen Einheiten oder funktionellen Gruppen für Variablen in den Formeln optional mit einem oder mehreren geeigneten Substituenten substituiert sein. Beispiele für Substituenten umfassen ein Halogen (F, Cl, Br oder I), Niederalkyl, -OH, -NO₂, -CN, -CO₂H, -O-Niederalkyl, -Aryl, -Aryl-niederalkyl, -CO₂CH₃, -CONH₂, -OCH₂CONH₂, -NH₂, -SO₂NH₂, Halogenalkyl (beispielsweise -CF₃, -CH₂CF₃), -O-Halogenalkyl (beispielsweise -OCF₃, -OCHF₂) und dgl.
Die Ausdrücke "umfassen" und "enthalten" werden im offenen, nicht beschränkenden Sinne verwendet.
Es ist selbstverständlich, dass eine Verbindung der Formel 1 zwar das Phänomen der Tautomerie zeigen kann, die Formelzeichnungen in dieser Beschreibung jedoch ausdrücklich nur eine der möglichen tautomeren Formen angeben. Es ist daher selbstverständlich, dass in der Erfindung die Formeln eine beliebige Tautomerenform der angegebenen Verbindung darstellen sollen und diese nicht auf nur eine spezielle Tautomerenform, die durch die Formelzeichnungen angegeben ist, beschränkt ist.
Einige der erfindungsgemäßen Verbindungen können als einzelne Stereoisomere (d.h. im wesentlichen frei von anderen Stereoisomeren), Racemate und/oder Gemische von Enantiomeren und/oder Diastereomeren existieren. Alle derartigen einzelnen Stereoisomere, Racemate und Gemische derselben sollen im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Verbindungen, die optisch aktiv sind, in optisch reiner Form verwendet.
Wie dem Fachmann allgemein geläufig ist, ist eine optisch reine Verbindung mit einem chiralen Zentrum eine, die im wesentlichen aus einem der zwei möglichen Enantiomere besteht (d.h. enantiomerenrein ist), und eine optisch reine Verbindung mit mehr als einem chiralen Zentrum eine, die im wesentlichen diastereomerenrein und enantiomerenrein ist. Vorzugsweise werden die Verbindungen der vorliegenden Er findung in einer Form verwendet, die mindestens 90% optisch rein ist, d.h. eine Form ist, die mindestens 90% an einem einzelnen Isomer (80% Enantiomerenüberschuss ("ee") oder Diastereomerenüberschuss ("de")), noch günstiger mindestens 95% (90% ee oder de), noch günstiger mindestens 97,5% (95% ee oder de) und noch besser mindestens 99% (98% ee oder de) enthält.
Ferner sollen die Formeln solvatisierte sowie unsolvatisierte Formen der identifizierten Strukturen abdecken. Beispielsweise umfasst die Formel I Verbindungen der angegebenen Struktur in sowohl hydratisierten als auch nichthydratisierten Formen. Andere Beispiele für Solvate umfassen die Strukturen in Kombination mit Isopropanol, Ethanol, Methanol, DMSO, Ethylacetat, Essigsäure oder Ethanolamin.
Zusätzlich zu Verbindungen der Formel I umfasst die Erfindung pharmazeutisch akzeptable Salze dieser Verbindung.
"Eine pharmazeutisch akzeptable Prodrug" ist eine Verbindung, die unter physiologischen Bedingungen oder durch Solvolyse in die spezifizierte Verbindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz dieser Verbindung umgewandelt werden kann.
"Ein pharmazeutisch aktiver Metabolit" soll ein pharmakologisch aktives Produkt bedeuten, das durch Metabolisierung einer spezifizierten Verbindung oder eines Salzes derselben im Körper produziert wird. Metabolite einer Verbindung können unter Verwendung von einschlägig bekannten Routinetechniken identifiziert werden und deren Aktivitäten können unter Verwendung von Tests, beispielsweise den hierin beschriebenen, bestimmt werden.
Prodrugs und aktive Metaboliten einer Verbindung können unter Verwendung von einschlägig bekannten Routinetechniken identifiziert werden. Siehe beispielsweise G. Bertolini et al., J. Med. Chem., 40, 2011–2016 (1997); D. Shan et al., J. Pharm. Sci., 86 (7), 765–767; K. Bagshawe, Drug Dev. Res., 34, 220–230 (1995); N. Bodor, Advances in Drug Res., 13, 224–331 (1984); H. Bundgaard, Design of Prodrugs (Elsevier Press 1985); und I. K. Larsen, Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development (Krogsgaard-Larsen et al., Hrsg., Harwood Academic Publishers, 1991).
"Ein pharmazeutisch akzeptables Salz" soll ein Salz bedeuten, das die biologische Wirksamkeit der freien Säuren und Basen der spezifizierten Verbindung beibehält und nicht biologisch oder in anderer Weise ungünstig ist. Eine Verbindung der Erfindung kann ausreichend saure, ausreichend basische oder beide funktionellen Gruppen besitzen und entsprechend mit einer beliebigen Zahl anorganischer oder organischer Basen und anorganischer und organischer Säuren unter Bildung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes reagieren. Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen die Salze, die durch Reaktion der Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer anorganischen oder organischen Säure oder einer anorganischen Base hergestellt werden, beispielsweise Salze, die Sulfate, Pyrosulfate, Bisulfate, Sulfite, Bisulfite, Phosphate, Monohydrogenphosphate, Dihydrogenphosphate, Metaphosphate, Pyrophosphate, Chloride, Bromide, Iodide, Acetate, Propionate, Decanoate, Caprylate, Acrylate, Formiate, Isobutyrate, Caproate, Heptanoate, Propiolate, Oxalate, Malonate, Succinate, Suberate, Sebacate, Fumarate, Maleate, Butin-1,4-dioate, Hexin-1,6-dioate, Benzoate, Chlorbenzoate, Methylbenzoate, Dinitrobenzoate, Hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, Phthalate, Sulfonate, Xylolsulfonate, Phenylacetate, Phenylpropionate, Phenylbutyrate, Citrate, Lactate, γ-Hydroxybutyrate, Glykolate, Tartrate, Methansulfonate, Propansulfonate, Naphtha lin-1-sulfonate, Naphthalin-2-sulfonate und Mandelate umfassen.
Wenn die erfindungsgemäße Verbindung eine Base ist, kann das gewünschte pharmazeutisch akzeptable Salz durch ein beliebiges geeignetes Verfahren, das einschlägig verfügbar ist, beispielsweise Behandlung der freien Base mit einer Säure, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dgl., oder mit einer organischen Säure, wie Essigsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Mandelsäure, Fumarsäure, Malonsäure, Benztraubensäure, Oxalsäure, Glykolsäure, Salicylsäure, eine Pyranosidylsäure, wie Glucuronsäure oder Galacturonsäure, eine alpha-Hydroxysäure, wie Citronensäure oder Weinsäure, eine Aminosäure, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure, eine aromatische Säure, wie Benzoesäure oder Zimtsäure, eine Sulfonsäure, wie p-Toluolsulfonsäure oder Ethansulfonsäure, oder dgl. hergestellt werden.
Wenn die erfindungsgemäße Verbindung eine Säure ist, kann das gewünschte pharmazeutisch akzeptable Salz durch ein beliebiges geeignetes Verfahren, beispielsweise Behandeln der freien Säure mit einer anorganischen oder organischen Base, wie einem (primären, sekundären oder tertiären) Amin, einem Alkalimetallhydroxid oder Erdalkalimetallhydroxid oder dgl., hergestellt werden. Erläuterungsbeispiele für geeignete Salze umfassen organische Salze, die von Aminosäuren, wie Glycin und Arginin, Ammoniak, primären, sekundären und tertiären Aminen und cyclischen Aminen, wie Piperidin, Morpholin und Piperazin, abgeleitet sind, und anorganische Salze, die von Natrium, Calcium, Kalium, Magnesium, Mangan, Eisen, Kupfer, Zink, Aluminium und Lithium abgeleitet sind.
Für den Fall von Mitteln, die Feststoffe sind, ist es dem Fachmann selbstverständlich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen und Salze in verschiedenen Kristall- oder Polymorphformen existieren können, die alle im Umfang der vorliegenden Erfindung und spezifizierter Formeln liegen sollen.
Therapeutisch wirksame Mengen der erfindungsgemäßen Mittel können zur Behandlung von Erkrankungen, die durch die Modulation oder Regulation von Proteinkinasen abgeschwächt werden, verwendet werden. Eine "wirksame Menge" soll die Menge eines Mittels bedeuten, die, wenn sie einem eine derartige Behandlung benötigenden Säuger verabreicht wird, zum Bewirken einer Behandlung einer Erkrankung, die durch die Aktivität von einer oder mehreren Proteinkinasen, beispielsweise Tyrosinkinasen, vermittelt wird, ausreichend ist. Daher ist beispielsweise eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel I, eines Salzes, aktiven Metabolits oder einer Prodrug derselben eine Menge, die zur Modulation, Regulation der Hemmung der Aktivität von einer oder mehreren Proteinkinasen derart, dass der Krankheitszustand, der durch diese Aktivität vermittelt wird, verringert oder gemildert wird, ausreichend ist.
Die Menge eines derartigen Mittels, die einer derartigen Menge entspricht, variiert in Abhängigkeit von Faktoren wie der speziellen Verbindung, dem Krankheitszustand und dessen Schwere, der Identität (beispielsweise dem Gewicht) des eine Behandlung benötigenden Säugers, sie kann jedoch routinemäßig durch den Fachmann bestimmt werden. "Behandeln" soll mindestens die Linderung eines Krankheitszustands in einem Säuger, beispielsweise einem Menschen, der betroffen ist, zumindest teilweise durch die Aktivität von einer oder mehreren Proteinkinasen, wie Tyrosinkinasen, bedeuten und es umfasst das Verhindern des Auftretens eines Krankheitszustands in einem Säuger, insbesondere wenn ermittelt wurde, dass eine Prädisposition des Säugers für den Krankheitszustand besteht, jedoch die Diagnose, dass er diese hat, noch nicht gestellt wurde; die Modulation und/oder Hemmung des Krankheitszustands und/oder die Linderung des Krankheitszustands.
Die erfindungsgemäßen Mittel können unter Verwendung der im folgenden beschriebenen Reaktionswege und Syntheseschemata unter Verwendung der einschlägig verfügbaren Techniken unter Verwendung von ohne weiteres erhältlichen Ausgangsmaterialien hergestellt werden.
In einem generellen Syntheseverfahren werden Verbindungen der Formel I nach dem folgenden Reaktionsschema hergestellt:
6-Nitroindazol (Verbindung V) wird mit Iod und einer Base, beispielsweise NaOH, in einem wässrigen/organischen Gemisch, vorzugsweise mit Dioxan behandelt. Das Gemisch wird angesäuert und das Produkt wird durch Filtration isoliert.
Zu dem erhaltenen 3-Iod-6-nitroindazol in Dichlormethan/50%-iges wässriges KOH bei 0°C wird ein Schutzgruppe("Pg")-Reagens (worin X = Halogen), vorzugsweise Trimethylsilylethoxymethylchlorid (SEM-Cl), und ein Phasentransferkatalysator, beispielsweise Tetrabutylammoniumbromid (TBABr), gegeben. Nach 1–4 h werden die zwei Phasen verdünnt, die organische Phase abgetrennt, mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das rohe Produkt wird durch Silicagelchromatographie gereinigt, wobei Verbindungen der Formel VI erhalten werden. Die Behandlung von Verbindungen der Formel VI in einem geeigneten organischen Lösemittel mit einem geeigneten organometallischen Reagens von R¹, vorzugsweise einer R¹-Boronsäure, in Gegenwart einer wässrigen Base, beispielsweise Natriumcarbonat, und eines geeigneten Katalysators, vorzugsweise Pd(PPh₃)₄, ergibt nach Extraktionsaufarbeitung und Silicagelchromatographie Verbindungen der Formel VII. Der R¹-Substituent kann durch Verbindungen der Formel VII oder spätere Zwischenprodukte in diesem Reaktionsschema durch oxidative Spaltung (beispielsweise Ozonolyse) ausgetauscht werden, worauf Additionen an der gebildeten Aldehydfunktionalität mit Wittig- oder Kondensationsumwandlungen folgen (typische Angaben in Beispiel 42(a–e)). Die Behandlung von Verbindungen der Formel VII mit einem Reduktionsmittel, vorzugsweise SnCl₂, ergibt nach herkömmlichem wässrigem Aufarbeiten und Reinigung Verbindungen der Formel VIII. Für die Reihe von Derivaten, worin Y = NH oder N-Niederalkyl, können Verbindungen der Formel VIII mit Aryl- oder Heteroarylchloriden, -bromiden, -iodiden oder -triflaten in Gegenwart einer Base, vorzugsweise Cs₂CO₃, und eines Katalysators, vorzugsweise Pd-BINAP (und, wenn Y = N-Niederalkyl, mit einer anschließenden Alkylierungsstufe) behandelt werden, wobei Verbindungen der Formel X erhalten werden. Zur Bildung anderer Y-Verknüpfungen wird Natriumnitrit zu Verbindungen der Formel VIII unter wässrigen sauren Bedingungen unter standardmäßi gem Kühlen gegeben, worauf die Zugabe von Kaliumiodid und leichtes Erwärmen folgen. Standardmäßige Aufarbeitung und Reinigung ergibt Iodidverbindungen der Formel IX.
Die Behandlung von Verbindungen der Formel IX mit einem organometallischen Reagens, beispielsweise Butyllithium, fördert einen Lithium-Halogen-Austausch. Dieses Zwischenprodukt wird dann mit einem R²-Elektrophil, beispielsweise einem Carbonyl oder Triflat, durch die mögliche Vermittlung zusätzlicher Metalle und Katalysatoren, vorzugsweise Zinkchlorid und Pd(PPh₃)₄, umgesetzt, wobei Verbindungen der Formel X erhalten werden. Alternativ können Verbindungen der Formel IX mit einem organometallischen Reagens, wie einer Organoboronsäure, in Gegenwart eines Katalysators, beispielsweise Pd(PPh₃)₄, in einer Kohlenmonoxidatmosphäre behandelt werden, wobei Verbindungen der Formel X erhalten werden. Alternativ können Verbindungen der Formel IX für Derivate, worin Y = NH oder S, mit entsprechenden Aminen oder Thiolen in Gegenwart einer Base, vorzugsweise Cs₂CO₃ oder K₃PO₄, und eines Katalysators, vorzugsweise Pd-BINAP oder Pd-(Bis-cyclohexyl)biphenylphosphin, behandelt werden, wobei Verbindungen der Formel X erhalten werden. Herkömmliche Austauschreaktionen funktioneller Gruppen, wie Oxidationen, Reduktionen, Alkylierungen, Acylierungen, Kondensationen und Entschützungsreaktionen, können dann zur weiteren Derivatisierung dieser Reihe verwendet werden, wobei die Endverbindungen der Formel I erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I können auch nach in dem folgenden Reaktionsschema angegebenen allgemeinen Verfahren hergestellt werden:
6-Iodindazol (XI) wird mit Iod und einer Base, beispielsweise NaOH, in einem wässrigen/organischen Gemisch, vorzugsweise mit Dioxan, behandelt. Das Gemisch wird angesäuert und das Produkt XII wird durch Filtration isoliert. Zu dem gebildeten 3,6-Diiodindazol in Dichlormethan/50%-iges wässriges KOH bei 0°C wird ein Schutzgruppereagens, vorzugsweise SEM-Cl, und ein Phasentransferkatalysator, beispielsweise TBABr, gegeben. Die zwei Phasen werden verdünnt, die organische Phase wird abgetrennt, mit Natrium sulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das rohe Produkt wird durch Silicagelchromatographie gereinigt, wobei Verbindungen der Formel XIII erhalten werden. Die Behandlung von Verbindungen der Formel XIII in einem geeigneten organischen Lösemittel mit einem geeigneten organometallischen Reagens von R², beispielsweise R²-ZnCl, oder einem R²-Borreagens und einem geeigneten Katalysator, vorzugsweise Pd(PPh₃)₄, ergibt nach Extraktionsaufarbeitung und Silicagelchromatographie Verbindungen der Formel XIV. Die Behandlung von Verbindungen der Formel XIV in einem geeigneten organischen Lösemittel mit einem geeigneten organometallischen Reagens von R¹ (beispielsweise Bor-R¹-Borreagens oder R¹-ZnCl) in Gegenwart einer wässrigen Base, Natriumcarbonat, und eines geeigneten Katalysators, vorzugsweise Pd(PPh₃)₄, ergibt nach Extraktionsaufarbeitung und Silicagelchromatographie Verbindungen der Formel XV. Herkömmliche Austauschreaktionen funktioneller Gruppen, wie Oxidationen, Reduktionen, Alkylierungen, Acylierungen, Kondensationen und Entschützungsreaktionen, können dann zur weiteren Derivatisierung dieser Reihe verwendet werden, wobei die Endverbindungen der Formel I erhalten werden.
Alternativ können Verbindungen der Formel I, worin R² ein substituiertes oder unsubstituiertes Y-Ar ist, worin Y O oder S ist, nach dem folgenden allgemeinen Reaktionsschema hergestellt werden:
Eine gerührte Acetonlösung von 3-Chlor-cyclohex-2-enon (XV), H-R² und wasserfreiem Kaliumcarbonat wird 15–24 h refluxiert, gekühlt und filtriert. Konzentrieren und Chromatographieren des Filtrats auf Silicagel ergeben 3-R²-Cyclohex-2-enon (XVI).
Die Ketone der Formel XVI können mit einer geeigneten Base (M-B), vorzugsweise Lithium-bis(trimethylsilyl)amid, umgesetzt werden und mit R¹-CO-X (worin X = Halogen) umgesetzt werden, was nach standardmäßiger saurer Aufarbeitung und Reinigung Verbindungen der Formel XVII ergibt. Dieses Produkt wird in HOAc/EtOH in Kombination mit Hydrazinmonohydrat bei einer geeigneten Temperatur über einen geeigneten Zeitraum, vorzugsweise bei 60–80°C über 2–4 h erhitzt. Nach Abkühlen wird das Gemisch in eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung gegossen, mit einem organischen Lösemittel extrahiert, eingeengt und auf Silicagel gereinigt, wobei Verbindungen der Formel XVIII erhalten werden. Verbindungen der Formel XVIII können unter Verwendung einer Vielzahl bekannter Verfahren oxidiert werden, wobei Verbindungen der Formel I erhalten werden.
Ein alternatives Verfahren zur Synthese der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird im folgenden angegeben, wobei die Verbindungen der Stufen a) bis i) die folgenden sind:

a) NaNO₂, Br₂, HBr, 0-–5°C, 48% Ausbeute;
b) Pd(OAc)₂, Pd(O-Tolyl)₃, Diisopropylethylamin (DIEA), DMF, H₂O, entgast, Mikrowelle, 110°C, 1 h, 68% Ausbeute;
c) Eisenpulver, gesättigtes wässriges NH₄OH, EtOH, 45°C, 72% Ausbeute;
d) Methyl-2-brombenzoat, R-BINAP, Pd₂(dba)₃, Cs₂CO₃, Toluol, entgast, 110°C über Nacht, 74% Ausbeute;
e) KOH, MeOH/THF/H₂O (3/1/1) 70°C, 2–3 h, quantitativ;
f) Geschütztes Amin, HATU, Net₃, DMF, Raumtemperatur über 2 h, 80% Ausbeute;
g) TsOH (12% TsOH in HOAc), EtOH (10% wässrig), 44% Ausbeute;
h) Tributylvinlyzinn, Pd(PPh₃)₄, 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol, Toluol, entgast, 105°C, 31% Ausbeute;
i) Pd(OAc)₂, Pd(o-Tolyl)₃, DIEA, DMF, entgast, 100°C, etwa 70% Ausbeute.

Weitere Verbindungen der Formel I können auf zu den oben beschriebenen allgemeinen Verfahren oder den in den Beispielen beschriebenen detaillierten Verfahren analoge Weise hergestellt werden. Die Affinität der Verbindungen der Erfindung für einen Rezeptor kann durch die Bereitstellung mehrerer Kopien des Liganden in enger Nähe, vorzugsweise unter Verwendung eines durch eine Trägereinheit bereitgestellten Gerüsts verstärkt werden. Es wurde gezeigt, dass die Bereitstellung von derartigen Verbindungen mit mehreren Valenzen mit optimalem Abstand zwischen den Einheiten die Bindung an einen Rezeptor dramatisch verbessert. Siehe beispielsweise Lee et al., Biochem, 23, 4255 (1984). Die meh reren Valenzen und der Abstand können durch die Wahl einer geeigneten Trägereinheit oder von Linkereinheiten gesteuert werden. Derartige Einheiten umfassen molekulare Träger, die eine Mehrzahl funktioneller Gruppen enthalten, die mit funktionellen Gruppen, die mit den Verbindungen der Erfindung verbunden sind, umgesetzt werden können. Natürlich kann eine Vielzahl von Trägern verwendet werden, wobei diese Proteine, wie BSA oder HAS, eine Mehrzahl von Peptiden, die beispielsweise Pentapeptide, Decapeptide, Pentadecapeptide und dgl. umfassen, verwendet werden. Die Peptide oder Proteine können die gewünschte Zahl von Aminosäureresten mit freien Aminogruppen in deren Seitenketten enthalten, jedoch können andere funktionelle Gruppen, wie Sulfhydrylgruppen oder Hydroxylgruppen, ebenfalls verwendet werden, um stabile Verbindungen zu erhalten.
Verbindungen, die wirksam die Proteinkinaseaktivität, die mit Rezeptoren VEGF, FGF, CDK-Komplexen, TEK, CHK1, LCK, FAK und unter anderem Phosphorylasekinase verbunden ist, regulieren, modulieren oder hemmen, und die Angiogenese und/oder Zellproliferation hemmen, werden gewünscht und sind eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Die vorliegende Erfindung ist ferner auf In-vitro-Verfahren zur Modulation oder Hemmung von Proteinkinaseaktivität, beispielsweise in Sängergewebe, durch Verabreichen eines erfindungsgemäßen Mittels gerichtet. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen als Modulatoren der Proteinkinaseaktivität, beispielsweise der Aktivität von Kinasen, kann durch ein beliebiges der Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, die In-vitro-Assays umfassen, ermittelt werden. Beispiele für geeignete Assays für Aktivitätsmessungen umfassen diejenigen, die in C. Parast et al., Biochemistry, 37, 16788–16801 (1998); Jeffrey et al., Nature, 376, 313–320 (1995); der internationalen Veröffentlichung der WIPO WO 97/34876 und der internationalen Veröffentlichung der WIPO WO 96/14843 beschrieben sind. Diese Eigenschaften können beispielsweise durch die Verwendung von einem oder mehreren der biologischen Testverfahren, die in den folgenden Beispielen angegeben sind, getestet werden.
Die aktiven Mittel der Erfindung können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der folgenden Beschreibung formuliert werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Erfindung umfassen eine wirksame modulierende, regulierende oder hemmende Menge einer Verbindung der Formel I und einen inerten, pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein inertes pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel. In einer Ausführungsform der pharmazeutischen Zusammensetzungen werden wirksame Konzentrationsmengen der erfindungsgemäßen Mittel so bereitgestellt, dass therapeutischer Nutzen, der die Modulation von Proteinkinasen umfasst, erhalten wird. "Wirksame Konzentrationsmengen" bedeutet Konzentrationsmengen, bei denen die Wirkungen von Proteinkinasen als Minimum reguliert werden. Diese Zusammensetzungen werden in einer zur Verabreichungsart, beispielsweise parenteralen oder oralen Verabreichung, geeigneten Dosierungseinheitsform hergestellt.
Ein erfindungsgemäßes Mittel wird in einer herkömmlichen Dosierungsform, die durch Kombination einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels (beispielsweise einer Verbindung der Formel I) als Wirkstoff mit geeigneten pharmazeutischen Trägern oder Verdünnungsmitteln gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt wird, verabreicht. Diese Verfahren können das Mischen, Granulieren und Komprimieren oder Lösen der für die gewünschte Zubereitung geeigneten Bestandteile umfassen.
Der verwendete pharmazeutische Träger kann entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Beispiele für feste Träger sind Lactose, Saccharose, Talkum, Gelatine, Agaragar, Pektin, Akaziengummi, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dgl. Beispiele für flüssige Träger sind Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Wasser und dgl. In ähnlicher Weise kann der Träger oder das Verdünnungsmittel ein einschlägig bekanntes Material der Zeitverzögerung oder zeitlichen Freisetzung, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat allein oder mit einem Wachs, Ethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylmethacrylat und dgl., umfassen.
Eine Vielzahl pharmazeutischer Formen kann verwendet werden. Daher kann, wenn ein fester Träger verwendet wird, die Zubereitung tablettiert, in einer harten Gelatinekapsel in Pulver- oder Pelletform platziert oder in der Form einer Pastille oder einer Lutschtablette sein. Die Menge des festen Trägers kann variieren, sie beträgt jedoch generell etwa 25 mg bis etwa 1 g. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, kann die Zubereitung in der Form eines Sirups, einer Emulsion, von Tropfen, einer weichen Gelatinekapsel, einer sterilen injizierbaren Lösung oder Suspension in einer Ampulle oder einer Suspension in einer nichtwässrigen Flüssigkeit sein.
Um eine stabile wasserlösliche Dosisform zu erhalten, wird ein pharmazeutisch akzeptables Salz eines erfindungsgemäßen Mittels in einer wässrigen Lösung einer organischen oder anorganischen Säure, beispielsweise einer 0,3 M Lösung von Bernsteinsäure oder Citronensäure, gelöst. Wenn eine lösliche Salzform nicht verfügbar ist, kann das Mittel in einem geeigneten Co-Lösemittel oder Kombinationen von Co-Lösemitteln gelöst werden. Beispiele für geeignete Co-Lösemittel umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Alkohol, Propylenglykol, Polyethylenglykol 300, Polysorbat 80, Glycerin und dgl. in Konzentrationen im Bereich von 0–60% des Gesamtvolumens. In einem Ausführungsbeispiel wird eine Ver bindung der Formel I in DMSO gelöst und mit Wasser verdünnt. Die Zusammensetzung kann auch in der Form einer Lösung einer Salzform des Wirkstoffs in einem geeigneten wässrigen Vehikel, wie Wasser oder isotonische Kochsalz- oder Dextroselösung, sein.
Es ist klar, dass die aktuellen Dosierungen der in den Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendeten Mittel entsprechend dem speziellen verwendeten Komplex, der speziellen formulierten Zusammensetzung, dem Verabreichungsmodus und der speziellen Stelle, dem speziellen Wirt und der speziellen Erkrankung, die zu behandeln sind, variiert. Optimale Dosierungen für einen gegebenen Satz von Bedingungen können durch den Fachmann unter Verwendung herkömmlicher Dosierungsbestimmungstests im Hinblick auf die experimentellen Daten für ein Mittel festgelegt werden. Zur oralen Verabreichung beträgt eine allgemein verwendete Beispieltagesdosis etwa 0,001 bis etwa 1000 mg/kg Körpergewicht, noch besser etwa 0,001 bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht, wobei Behandlungsabläufe in entsprechenden Abständen wiederholt werden. Die Verabreichung von Prodrugs wird typischerweise in Gewichtsmengen dosiert, die den Gewichtsmengen der vollständig aktiven Form chemisch äquivalent sind.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können in zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen allgemein bekannten Weisen, beispielsweise unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie Mischen, Lösen, Granulieren, Drageeherstellung, Schlämmen, Emulgieren, Verkapseln, Einfangen oder Lyophilisieren, hergestellt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen können auf herkömmliche Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Trägern formuliert werden, wobei diese aus Streckmitteln und Hilfsstoffen ausgewählt werden können, die die Prozessierung der aktiven Verbindungen zu Zubereitungen, die pharmazeutisch verwendet werden können, ermöglichen.
Eine geeignete Formulierung hängt von dem gewählten Verabreichungsweg ab. Zur Injektion können die Mittel der Erfindung in wässrige Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatible Puffer, wie Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösungspuffer, formuliert werden. Zur transmukosalen Verabreichung werden Durchdringungsmittel, die für die zu durchdringende Barriere geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Derartige Durchdringungsmittel sind allgemein einschlägig bekannt.
Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen ohne weiteres durch Kombination der aktiven Verbindungen mit einschlägig bekannten pharmazeutisch akzeptablen Trägern formuliert werden. Derartige Träger ermöglichen die Formulierung der Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dgl., zur oralen Einnahme durch einen zu behandelnden Patienten. Pharmazeutische Zubereitungen zur oralen Verwendung können unter Verwendung eines festen Streckmittels im Gemisch mit dem Wirkstoff (Mittel), optional Mahlen des gebildeten Gemischs und Verarbeiten des Granulatgemischs nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, falls gewünscht, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten, erhalten werden. Geeignete Streckmittel umfassen: Füllstoffe, wie Zucker, die Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit umfassen; und Cellulosezubereitungen, beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Gummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht, können Desintegrationsmittel, wie vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agaragar oder Alginsäure oder ein Salz derselben, wie Natriumalginat, zugegeben werden.
Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die optional Gummiarabicum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösemittel oder Lösemittelgemische enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageeüberzügen zur Identifizierung oder zur Charakterisierung verschiedener Kombinationen von Wirkstoffen zugegeben werden.
Pharmazeutische Zubereitungen, die oral verwendet werden können, umfassen aus Gelatine hergestellte Durchdrückkapseln sowie weiche versiegelte Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie Glycerin oder Sorbit, bestehen. Die Durchdrückkapseln können die Wirkstoffe im Gemisch mit Füllstoffen, wie Lactose, Bindemitteln, wie Stärkearten, und/oder Gleitmitteln, wie Talkum oder Magnesiumstearat, und optional Stabilisierungsmitteln enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Mittel in geeigneten Flüssigkeiten, wie Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglykolen, gelöst oder suspendiert sein. Ferner können Stabilisierungsmittel zugesetzt sein. Alle Formulierungen zur oralen Verabreichung sollten in für eine derartige Verabreichung geeigneten Dosierungen sein. Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen, die auf herkömmliche Weise formuliert wurden, erhalten.
Zur intranasalen Verabreichung oder Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung günstigerweise in der Form einer Aerosolspraypräsentation von Druckpackungen oder einer Vernebelungsvorrichtung unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, beispielsweise Dichlordifluormethan, Tri chlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas, abgegeben. Im Falle eines druckbeaufschlagten Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Anbringen eines Ventils zur Abgabe einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Kapseln und Patronen aus Gelatine zur Verwendung in einer Inhaliervorrichtung oder einem Insufflator und dgl. können so formuliert werden, dass sie ein Pulvergemisch von der Erfindung und einer geeigneten Pulvergrundlage, wie Lactose oder Stärke, enthalten.
Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung durch Injektion, beispielsweise durch eine Bolusinjektion oder eine kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen für eine Injektion können in Einheitsdosierungsform, beispielsweise in Ampullen oder in Mehrfachdosisbehältern, mit einem zugesetzten Konservierungsmittel präsentiert werden. Die Zusammensetzungen können Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln erhalten und sie können Formulierungsmittel, wie Suspendiermittel, Stabilisierungsmittel und/oder Dispergiermittel, enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Ferner können Suspensionen der aktiven Mittel als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösemittel oder Vehikel umfassen Fettöle, wie Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposome. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Optional kann die Suspension auch geeignete Stabilisierungsmittel oder Mittel, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Zubereitung von hochkonzentrierten Lösungen zu ermöglichen, enthalten.
Zur Verabreichung am Auge wird eine Verbindung der Formel I in einem pharmazeutisch akzeptablen ophthalmischen Vehikel derart, dass die Verbindung in Kontakt mit der Augenoberfläche über einen ausreichenden Zeitraum, um das Eindringen der Verbindung in die Kornea und/oder Sklera und innere Bereiche des Auges, die beispielsweise Vorderkammer, Hinterkammer, Glaskörper, Humor aquosus, Humor vitreus, Kornea, Iris/Ziliarkörper, Linse, Choroidea/Retina und Sklera umfassen, zu ermöglichen, steht, zugeführt. Das pharmazeutisch akzeptable ophthalmische Vehikel kann eine Salbe, ein pflanzliches Öl oder ein Verkapselungsmaterial sein. Eine Verbindung der Erfindung kann auch direkt in den Humor vitreus oder Humor aquosus injiziert werden.
Ferner kann eine Verbindung auch durch bekannte akzeptable Verfahren, beispielsweise Subtenon- und/oder subkonjunktivale Injektionen, verabreicht werden. Wie auf dem Gebiet der Ophthalmologie bekannt ist, besteht die Makula primär aus Retinazapfen und sie ist der Bereich der maximalen Sehschärfe in der Retina. Die Tenon-Kapsel oder Tenon-Membran ist auf der Sklera angebracht. Die Konjunktiva 36 bedeckt einen kurzen Bereich des Augapfels hinter dem Limbus (die Bindehaut des Augapfels) und sie faltet sich nach oben (die obere Tasche) oder nach unten (die untere Tasche), wobei sie die inneren Bereiche des oberen Augenlids bzw. unteren Augenlids bedeckt. Die Konjunktiva ist oben auf der Tenon-Kapsel angebracht.
Die Sklera und die Tenon-Kapsel legen die äußere Oberfläche des Augapfels fest. Zur Behandlung von ARMD, CNV, Retinopathien, Retinitis, Uveitis, zystoidem Makulaödem (CME), Glaukom und anderen Erkrankungen oder Zuständen des hinteren Segments des Auges ist es günstig, ein Depot einer spe zifischen Menge eines ophthalmisch akzeptablen pharmazeutischen Wirkstoffs direkt auf der äußeren Oberfläche der Sklera und unter der Tenon-Kapsel anzulegen. Ferner ist es in Fällen von ARMD und CME noch günstiger, das Depot direkt auf der äußeren Oberfläche der Sklera unter der Tenon-Kapsel und generell über der Makula anzulegen. In einer Untersuchung unter Verwendung von New Zealand White Rabbits wurde ein Arzneistoffdepot von 4,9(11)-Pregnadien-17α,21-diol-2,30-dion-21-acetat, einem angiostatischen Steroid, das von Steraloids, Inc. von Wilton, New Hampshire, erhältlich ist, direkt auf der äußeren Oberfläche der Sklera unter der Tenon-Kapsel und leicht hinter dem Äquator des Kaninchenauges angelegt. Ein derartiges Arzneistoffdepot führte zu einer Konzentration des angiostatischen Steroids, die über die gesamte Retina gemittelt und am Tag nach der Infektion ermittelt wurde, die zehnfach größer als eine ähnliche Konzentration war, die durch ein Depot, das unter der Konjunktiva, jedoch über der Tenon-Kapsel des Kaninchenauges lokalisiert war, geliefert wurde. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Tenon-Kapsel eines New Zealand White Rabbit sehr dünn ist, sind diese vorteilhaften Ergebnisse äußerst unerwartet. Es ist wichtig, festzustellen, dass die Tenon-Kapsel des menschlichen Auges ebenfalls sehr dünn ist. 4,9(11)-Pregnadien-17α,21-diol-2,30-dion-21-acetat und die verwandte Verbindung 4,9(11)-Pregnadien-17α,21-diol-3,20-dion sind in US-Patent 5 770 592 und 5 679 666 vollständiger beschrieben.
Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, beispielsweise sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung sein. Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen, beispielsweise Suppositorien oder Retentionsklistieren, die beispielsweise herkömmliche Suppositoriumgrundlagen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten, formuliert werden.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotpräparat formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär), intramuskuläre Injektion oder durch die oben genannte Subtenon- oder intravitreale Injektion verabreicht werden.
In speziell bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können die Verbindungen zur topischen Verabreichung in Kochsalzlösung (kombiniert mit beliebigen Konservierungsmitteln und antimikrobiellen Mitteln, die üblicherweise bei Augenzubereitungen verwendet werden) hergestellt und in Augentropfenform verabreicht werden. Die Lösung oder Suspension eines antiangiogenen Faktors kann in dessen reiner Form hergestellt und mehrere Male pro Tag verabreicht werden. Alternativ können antiangiogene Zusammensetzungen, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, auch direkt an der Kornea verabreicht werden.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Zusammensetzung mit einem mukoadhäsiven Polymer, das an die Kornea bindet, hergestellt. Daher können beispielsweise die Verbindungen mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien (beispielsweise als Emulsion in einem akzeptablen Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwerlösliche Derivate, beispielsweise als schwerlösliches Salz, formuliert werden. In weiteren Ausführungsformen können die antiangiogenen Faktoren oder antiangiogenen Zusammensetzungen als Zusatz zu einer herkömmlichen Steroidtherapie verwendet werden.
Ein pharmazeutischer Träger für hydrophobe Verbindungen ist ein Co-Lösemittelsystem, das Benzylalkohol, ein unpolares grenzflächenaktives Mittel, ein wassermischbares organi sches Polymer und eine wässrige Phase umfasst. Das Co-Lösemittelsystem kann ein VPD-Co-Lösemittelsystem sein. VPD ist eine Lösung aus 3% (Gew/V) Benzylalkohol, 8% (Gew/V) des unpolaren grenzflächenaktiven Mittels Polysorbate 80 und 65% (Gew/V) Polyethylenglykol 300, die in absolutem Ethanol auf das Volumen aufgefüllt ist. Das VPD-Co-Lösemittelsystem (VPD:5W) enthält VPF, das 1:1 mit 5% Dextrose in wässriger Lösung verdünnt ist. Dieses Co-Lösemittelsystem löst hydrophobe Verbindungen gut und es ergibt selbst bei systemischer Verabreichung geringe Toxizität. Natürlich können die Proportionen eines Co-Lösemittelsystems beträchtlich variiert werden, ohne dessen Löslichkeit- und Toxizitätseigenschaften zu zerstören. Ferner kann die Identität der Co-Lösemittelkomponenten variiert werden; beispielsweise können andere unpolare grenzflächenaktive Mittel niedriger Toxizität anstelle von Polysorbate 80 verwendet werden, die Fraktionsgröße von Polyethylenglykol variiert werden, andere biologisch kompatible Polymere Polyethylenglykol ersetzen, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon; und andere Zucker oder Polysaccharide Dextrose ersetzen.
Alternativ können andere Abgabesysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden. Liposome und Emulsionen sind bekannte Beispiele für Abgabevehikel oder Träger für hydrophobe Arzneistoffe. Bestimmte organische Lösemittel, wie Dimethylsulfoxid, können ebenfalls verwendet werden, obgleich üblicherweise auf Kosten einer größeren Toxizität. Ferner können die Verbindungen unter Verwendung eines Systems mit nachhaltiger Freisetzung, beispielsweise semipermeable Matrizes fester hydrophober Polymere, die das therapeutische Mittel enthalten, abgegeben werden. Verschiedene Materialien mit nachhaltiger Freisetzung sind etabliert und dem Fachmann geläufig. Kapseln mit nachhaltiger Freisetzung können in Abhängigkeit von deren chemischer Natur die Verbindungen über einige Wochen bis über 100 Tage abgeben. In Abhängigkeit von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagens können weitere Strategien zur Proteinstabilisierung verwendet werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete Träger oder Streckmittel in fester Phase oder Gelphase umfassen. Beispiele für derartige Träger oder Streckmittel umfassen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Zucker, Stärkearten, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie Polyethylenglykole.
Die Verbindungen der Erfindung kann als Salze mit pharmazeutisch kompatiblen Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren gebildet werden, wobei diese Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure und dgl. umfassen. Salze tendieren dazu, in wässrigen oder anderen protonhaltigen Lösemitteln stärker löslich zu sein als die entsprechenden Formen der freien Base.
Die Zubereitung von der Verbindung der Formel I und Referenzverbindungen ist in den folgenden Beispielen detailliert beschrieben, doch kann der Fachmann erkennen, dass die beschriebenen chemischen Reaktionen ohne weiteres zur Herstellung einer Zahl anderer Proteinkinaseinhibitoren der Erfindung angepasst werden können. Beispielsweise kann die Synthese von nicht als Beispielen angegebenen Verbindungen gemäß der Erfindung erfolgreich durch dem Fachmann geläufige Modifikationen, beispielsweise durch entsprechendes Schützen störender Gruppen, durch Wechsel zu anderen einschlägig bekannten geeigneten Reagenzien oder durch Durchführen von Routinemodifikationen von Reaktionsbedingungen durchgeführt werden. Alternativ können andere Reaktionen, die hierin offenbart sind oder einschlägig bekannt sind, Anwendbarkeit zur Herstellung anderer Verbindungen der Erfindung zeigen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND VON BEISPIELEN BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
In den im folgenden beschriebenen Beispielen sind, falls nicht anders angegeben, alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben und alle Teile und Prozentangaben auf das Gewicht bezogen. Reagenzien wurden von Handelslieferanten, wie Aldrich Chemical Company oder Lancaster Synthesis Ltd. gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet, falls nicht anders angegeben. Tetrahydrofuran (THF), N,N-Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan, Toluol und Dioxan wurden von Aldrich in Sicherheitsverschlussflaschen gekauft und so verwendet, wie sie erhalten wurden. Alle Lösemittel wurden unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Standardverfahren, falls nicht anders angegeben, gereinigt.
Die im folgenden angegebenen Reaktionen erfolgten allgemein unter einem positiven Argon- oder Stickstoffdruck oder mit einem Trockenröhrchen bei Umgebungstemperatur (falls nicht anders angegeben) in wasserfreien Lösemitteln und die Reaktionskolben wurden mit Gummisepta zur Einführung von Substraten und Reagenzien über eine Spritze versehen. Glaswaren wurden ofengetrocknet und/oder durch Wärme getrocknet. Analytische Dünnschichtchromatographie (DC) wurde auf Silicagel 60 F 254-Platten mit Glasrücken von Analtech (0,25 mm) durchgeführt und mit den geeigneten Lösemittelverhältnissen (V/V) isoliert und ggf. bezeichnet. Die Reaktionen wurden durch DC getestet und nach der Beurteilung durch den Verbrauch des Ausgangsmaterials beendet.
Die Sichtbarmachung der DC-Platten erfolgte mit einem p-Anisaldehyd-Sprühreagens oder Phosphomolybdänsäurereagens (Aldrich Chemical 20 Gew.-% in Ethanol) und unter Wärmeaktivierung. Die Aufarbeitungen erfolgten typischerweise durch Verdoppeln des Reaktionsvolumens mit dem Reaktionslösemittel oder Extraktionslösemittel und dann Waschen mit den angegeben wässrigen Lösungen unter Verwendung von 25 Vol.-% des Extraktionsvolumens, falls nicht anders angegeben. Produktlösungen wurden über wasserfreiem Na₂SO₄ vor der Filtration getrocknet und ein Verdampfen der Lösemittel unter vermindertem Druck auf einem Rotationsverdampfer wurde als unter Vakuum entfernte Lösemittel bezeichnet. Flashsäulenchromatographie (Still et al, J. Org. Chem., 43, 2923 (1978)) erfolgte unter Verwendung von Flashsilicagel von Baker-Qualität (47–61 μm) und eines Silicagel/Rohmaterial-Verhältnisses von etwa 20:1 bis 50:1, falls nicht anders angegeben. Eine Hydrogenolyse erfolgte bei dem angegebenen Druck in den Beispielen oder bei Umgebungsdruck.
¹H-NMR-Spektren wurden auf einem Bruker-Instrument, das bei 300 MHz arbeitete, aufgezeichnet und ¹³C-NMR-Spektren wurden im Betrieb mit 75 MHz aufgezeichnet. NMR-Spektren wurden als CDCl₃-Lösungen (in ppm angegeben) unter Verwendung von Chloroform als Bezugsstandard (7,25 ppm und 77,00 ppm) oder CD₃OD (3,4 und 4,8 ppm und 49,3 ppm) oder internes Tetramethylsilan (0,00 ppm) ggf. erhalten. Andere NMR-Lösemittel wurden nach Bedarf verwendet. Wenn Peakmultiplizitäten angegeben sind, werden die folgenden Abkürzungen verwendet: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), m (Multiplett), br (verbreitert), dd (Dublett von Dubletts), dt (Dublett von Tripletts). Kopplungskonstanten sind, wenn sie angegeben werden, in Hertz (Hz).
Infrarot (IR)-Spektren wurden auf einem Perkin-Elmer FT-IR-Spektrometer als pure Öle, als KBr-Pellets oder als CDCl₃-Lösungen aufgezeichnet und, wenn sie angegeben sind, in Wellenzahlen (cm^–1) angegeben. Die meisten Spektren wurden unter Verwendung von LSIMS oder Elektrospray erhalten. Alle Schmelzpunkte (Fp) sind unkorrigiert.
Beispiel 1(a) 2-(4-Chlor-2-nitro-phenyl)-malonsäuredimethylester
Zu einer gerührten Aufschlämmung von NaH (36,0 g, 1500 mmol) in NMP (1,0 l) wurde tropfenweise Dimethylmalonat (137,4 ml, 1200 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde nach Bedarf gekühlt, um die Innentemperatur unter 30°C zu halten. Nach Aufhören der Gasentwicklung wurde 2,4-Dichlornitrobenzol (192 g, 1000 mmol) zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Es wurde vorsichtig auf 65°C erhitzt, bis die Reaktion nach der Bestimmung durch HPLC vollständig war. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und dann über 500 ml Eis, das mit 150 ml konz. HCl gemischt war, gegossen. Der pH-Wert der wässrigen Schicht wurde unter Verwendung von 1 N NaOH auf neutral eingestellt. Die Feststoffe wurden durch Filtration über ein grobes Frittenfilter entfernt und mit Wasser (3 l) gespült. Die gelben Feststoffe wurden über Nacht getrocknet. Ausbeute 261,5 g, 91%.
Beispiel 1(b) (4-Chlor-2-nitro-phenyl)-essigsäuremethylester
Eine Lösung von 2-(4-Chlor-2-nitro-phenyl)-malonsäuredimethylester (195 g, 679,4 mmol) in Wasser (100 ml) und NMP (1000 ml) wurde 3,5 h auf Rückflusstemperatur erhitzt. Das Lösemittel wurde durch Rotationsverdampfung zu einem Öl entfernt. Das Öl wurde in EtOAc gelöst und dann mit Wasser (5 × 300 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde dann mit EtOAc (4 × 300 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen. Die organischen Schichten wurden kombiniert und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen der Feststoffe durch Filtration wurde das Lösemittel abgedampft, wobei das gewünschte Produkt als oranger/brauner Feststoff erhalten wurde (160,0 g, 95%).
Beispiel 1(c) (2-Acetylamino-4-chlor-phenyl)-essigsäuremethylester
Ein argongefüllter Koblen wurde mit (4-Chlor-2-nitro-phenyl)-essigsäuremethylester (40 g, 175 mmol), 10% Pd/C (2,5 g), Essigsäureanhydrid (64 ml, 677 mmol), Wasser (9 ml) und Essigsäure (150 ml) beschickt. Der Kolben wurde mit Wasserstoffgas mit 30 psi vakuumgespült und kräftig geschüttelt. Nach 2 h wurde weiteres 10% Pd/C (2 g) zugegeben und die Reaktion war nach insgesamt 4 h Reaktionszeit vollständig. Das 10% Pd/C wurde Filtration entfernt und das Lösemittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt.
Beispiel 1(d) 6-Chlor-1H-indazol-3-carbonsäuremethylester
Zu einer Lösung von (2-Acetylamino-4-chlor-phenyl)-essigsäuremethylester (32,0 g, 133 mmol) in Essigsäure (200 ml), die bei 90°C gerührt wurde, wurde tert-Butylnitrit (20,5 ml, 172,3 mmol) über 1 h gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser (1,4 l) gegossen und die Feststoffe wurden durch Filtration gewonnen. Der gelbe Niederschlag wurde in EtOAc gelöst, dann mit gesättigtem NaCl gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und zu einem Feststoff eingeengt. Die Feststoffe wurden mit Hexanen verrieben und filtriert, wobei das gewünschte Material erhalten wurde (21,63 g, 77%).
Beispiel 1(e) 6-Chlor-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-carbonsäuremethylester
Zu einer Aufschlämmung von 6-Chlor-1H-indazol-3-carbonsäuremethylester (8,3 g, 39,5 mmol) in MeCN (200 ml) wurden 3,4-Dihydro-2H-pyran (5,4 ml, 59,3 mmol) und p-Toluolsulfonsäure (237 mg, 1,25 mmol) gegeben. Nach Rühren des Reaktionsgemischs während 10 min wurde gesättigtes NaHCO₃ (1 ml) zugegeben und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung auf ein Volumen von 100 ml entfernt. Das Gemisch wurde mit EtOAc verdünnt und mit Wasser (50 ml) und dann mit gesättigtem NaCl (50 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde dann über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Entfernen der Feststoffe durch Filtration wurde die organische Schicht durch Rotationsverdampfung zu einem Öl eingeengt. Das Produkt wurde aus dem Öl unter Verwendung von Hexanen ausgefällt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde (7,667 g, 66% Ausbeute).
Beispiel 1(f) 6-(2-Methoxycarbonyl-phenylamino)-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-carbonsäuremethylester
Zu einer Lösung von 6-Chlor-1H-indazol-3-carbonsäuremethylester (2,94 g, 10,0 mmol) in 1,2-Dimethoxyethan (30 ml) wurden K₃PO₄ (5,32 g, 25,0 mmol), Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium (459 mg, 0,05 mmol), 2-(Dicyclohexylphosphino)biphenyl (701 mg, 2,0 mmol) und Methylanthranilat (2,59 ml, 20,0 mmol) gegeben. Die Lösung wurde dreimal mit Argon vakuumgespült, bevor sie 18 h auf 80°C erhitzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt. Nach Waschen der Feststoffe mit Ethylacetat wurde das Lösemittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Das verbliebene Öl wurde chromatographiert (150 g Silicagel, 10–30% EtOAc/Hex), wobei 1,23 g (51%) des gewünschten Produkts erhalten wurden.
Beispiel 1(g) 6-(2-Methoxycarbonyl-phenylamino)-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-carbonsäure
Zu einer Lösung von 6-(2-Methoxycarbonyl-phenylamino)-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-carbonsäuremethylester (2,05 g, 5 mmol) in Methanol (18 ml) und Tetrahydrofuran (8 ml) wurde eine Lösung von Natriumhydroxid (0,30 g, 7,5 mmol) in Wasser (2,7 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 1 N HCl zu einem pH-Wert von 1 neutralisiert. Das Gemisch wurde mit EtOAc (25 ml) und Wasser (25 ml) verdünnt. Nach Trennen der Schichten wurde die wässrige Schicht mit CH₂Cl₂ (3 × 25 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit gesättigtem NaCl (100 ml) gewaschen und dann über Na₂SO₄ getrocknet. Die Feststoffe wurden filtriert und die Flüssigkeit wurde zu einem Öl eingeengt. Das Produkt wurde aus EtOAc und Hexanen kristallisiert, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde (1,616 g, 82%).
Beispiel 1(h) 2-[3-Methylcarbamoyl-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylaminol-benzoesäuremethylester
Zu einer Lösung von 6-(2-Methoxycarbonyl-phenylamino)-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-carbonsäure (0,50 g, 1,27 mmol) in DMF wurden Triethylamin (0,42 ml, 3,04 mmol), Methylamin (1,9 ml, 3,81 mmol) und HATU (0,578 g, 1,52 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h gerührt und dann durch Rotationsverdampfung eingeengt. Das rohe Öl wurde chromatographiert (50 g Silicagel, 25–50% EtOAc/Hexane), wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde (214 mg, 42%).
Beispiel 1(i) 2-[3-Methylcarbamoyl-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure
Zu einer Lösung von 2-[3-Methylcarbamoyl-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäuremethylester (0,20 g, 0,49 mmol) in Ethanol (1,4 ml) und Tetrahydrofuran (0,6 ml) wurde eine Lösung von Natriumhydroxid (59 mg, 1,47 mmol) in Wasser (0,3 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h auf 60°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur gekühlt. Der pH-Wert wurde mit 2 N HCl auf einen pH von 2 eingestellt. EtOAc (30 ml) und Wasser (30 ml) wurden zugegeben, die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc (3 × 20 ml) extrahiert und die organischen Schichten wurden vereinigt. Nach Waschen mit Wasser (15 ml) wurde die organische Schicht über Na₂SO₄ getrocknet. Die Feststoffe wurden abfiltriert und die organische Phase wurde eingedampft, wobei ein gelber Feststoff erhalten wurde (193 mg, 100%).
Beispiel 1(j) 6-(2-Prop-2-inylcarbamoyl-phenylamino)-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-carbonsäuremethylamid
Zu einer Lösung von 2-[3-Methylcarbamoyl-1-(tetrahydropyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (150 mg, 0,381 mmol) in DMF (3,6 ml) wurden Propargylamin (0,052 ml, 0,76 mmol), TEA (0,264 ml, 1,90 mmol) und HATU (217 mg, 0,571 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h gerührt und dann mit EtOAc (30 ml) und Wasser (30 ml) verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc (2 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigtem NaCl (15 ml) gewaschen und dann über Na₂SO₄ getrocknet. Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt und die Flüssigkeit wurde durch Rotationsverdampfung eingeengt, wobei ein gelbes Öl erhalten wurde (164 mg, 100%).
Referenzbeispiel 1(k) 6-(2-Prop-2-inylcarbamoyl-phenylamino)-1H-indazol-3-carbonsäuremethylamid
6-(2-Prop-2-inylcarbamoyl-phenylamino)-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-carbonsäuremethylamid (30 mg) wird in 1,5 ml eines 90:10:1-Gemischs von CH₂Cl₂:TFA:Triethylsilan gelöst und 2 h auf Rückflusstemperatur erhitzt. Die Lösung wird mit Toluol (40 ml) verdünnt und durch Rotationsverdampfung zu einem Öl eingeengt. Das Öl wird in DMF (1 ml) gelöst und unter Verwendung eines 0,2-μm-Spritzenfilters filtriert. Präparative HPLC wird zur Isolierung der gewünschten Verbindung verwendet (12 mg, 50%). ¹H-NMR (CDCl₃-d) δ 9,96 (1H, s), ☐☐☐☐s), ??? 8,28 (1H, d, J = 8,85 Hz), 7,47 (1H, m), 7,34 (1H, m), 7,22 (1H, m), 7,15 (1H, dd, J1 = 8,76 Hz, J2 = 1,79 Hz), 6,99 (1H, m), 6,86 (1H, t, J = 6,97 Hz), 6,31 (1H, m), 4,23 (2H, dd, J1 = 5,18 Hz, J2 = 2,54 Hz), 3,49 (3H, s), 2,29 (s, 1H).
Anal. berechnet für C₁₉H₁₇N₅O₂·1,0MeOH·0,1TFA: C, 62,08, H, 5,44; N, 17,92. Gefunden: C, 61,78; H, 5,45; N, 18,04.
Beispiel 2(a) [6-Chlor-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-yl]methanol
Zu einer Lösung von 6-Chlor-1H-indazol-3-carbonsäuremethylester (2,94 g, 10,0 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (50 ml), die auf –78°C gekühlt war, wurde langsam DIBAL-H (3,56 ml, 20,0 mmol) gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, wobei HPLC dann zeigte, dass 10% Ausgangsmaterial verblieben. Zusätzliches DIBAL-H (0,35 ml) wurde dann zugegeben und es wurde 10 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc (1000 ml) verdünnt und mit 1 N HCl (2 × 100 ml) gewaschen. Es wurde ferner mit 1 N NaHCO₃ (100 ml) und dann mit gesättigtem NaCl (100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und dann zu einem weißen Feststoff eingeengt (2,65 g, 99,5%).
Beispiel 2(b) 6-Chlor-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-carbaldehyd
Eine Lösung von [6-Chlor-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-3-yl]methanol (1,75 g, 6,58 mmol), IBX (2,76 g, 9,87 mmol) und DMSO (27 ml) wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in EtOAc und Wasser verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und mit gesättigtem NaCl (100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und dann zu einem Feststoff eingeengt. Der Feststoff wurde in CH₂Cl₂ gelöst und filtriert. Die organische Phase wurde eingedampft, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde (1,707 g, 92%).
Beispiel 2(c) 1-(6-Chlor-1H-indazol-3-yl)-2-(5-ethylpyridin-2-yl)-ethanol
Zu einer gerührten Lösung von 4-Ethyl-2-methylpyridin (0,458 g, 3,79 mmol) in THF (4 ml) bei –50°C wird langsam Butyllithium (1,5 ml, 2,5 M, 3,79 mmol) gegeben und 10 min gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wird langsam eine Lösung von 6-Chlor-1H-indazol-3-carbaldehyd (0,5 g, 1,89 mmol) in THF (4 ml) gegeben. Nach Rühren während 10 min wurde das Reaktionsgemisch mit 1 N Citronensäure (10 ml) gequencht. Das Gemisch wurde mit EtOAc (50 ml), Wasser (20 ml) und gesättigtem NaCl (10 ml) verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc (3 × 15 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und mit gesättigtem NaCl (20 ml) gewaschen. Nach Trocknen der organischen Schicht über Na₂SO₄ wurden die Feststoffe durch Filtration entfernt und die Flüssigkeit durch Rotationsverdampfung zu einem Öl eingeengt. Chromatographie (40 g Silicagel, 60–100% EtOAc/Hex) ergibt das gewünschte Produkt (142 mg, 32%) und zurückgewonnenen 6-Chlor-1H-indazol-3-carbaldehyd (348 mg).
Beispiel 2(d) 6-Chlor-3-[2-(5-ethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol
Zu einer gerührten Lösung von 1-(6-Chlor-1H-indazol-3-yl)-2-(5-ethyl-pyridin-2-yl)-ethanol (232 mg, 0,60 mmol) in CH₂Cl₂ wurden TEA (0,25 ml, 1,81 mmol) und Mesylchlorid (0,070 ml, 0,90 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min gerührt und dann wurde DBU (2 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 18 h refluxiert und dann mit 40 ml 1 N Citronensäure gequencht. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit 20 ml CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und durch Rotationsverdampfung eingeengt. Reinigung durch Chromatographie (12 g Silicagel, 50–70% EtOAc/Hexane) ergab die gewünschte Verbindung (135 mg, 71%).
Beispiel 2(e) 2-{3-[2-(5-Ethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzoesäuremethylester,
1,2-Dimethoxymethan (2 ml) wurde zu 6-Chlor-3-[2-(5-ethylpyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol (130 mg, 0,354 mmol), Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium (16 mg, 0,018 mmol), (Dicyclohexylphosphino)biphenyl (25 mg, 0,07 mmol), K₃PO₄ (0,188 g, 0,885 mmol) und Methylanthranilat (0,092 ml, 0,71 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mit Argon (4×) vakuumgespült und dann 19 h auf 80°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc (20 ml) verdünnt und über einen Silicagelpfropfen filtriert. Nach Waschen mit EtOAc (50 ml) wurde das Lösemittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Das rohe Öl wurde durch Chromatographie (40 g Silicagel, 30–40% EtOAc/Hexane) gereinigt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde (54 mg, 32%).
Beispiel 2(f) 2-{3-[2-(5-Ethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzoesäure
Zu einer Lösung von 2-{3-[2-(5-Ethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzoesäuremethylester (50 mg, 0,104 mmol) in Methanol (0,42 ml) und THF (10 ml) wurde eine Lösung von Natriumhydroxid (12 mg, 0,311 mmol) in Wasser (0,05 ml) gegeben. Die Lösung wurde 3,5 h auf 60°C erhitzt und dann mit gesättigtem NH₄Cl neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (20 ml) verdünnt und dann mit EtOAc (2 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden zunächst über Na₂SO₄ getrocknet und dann wurden die Feststoffe durch Filtration entfernt. Das gewünschte Produkt (48,7 mg, 100%) wurde nach Rotationsverdampfung zum Entfernen der Lösemittel gewonnen.
Referenzbeispiel 2(g) 2-{3-[2-(5-Ethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-N-prop-2-inyl-benzamid
Zu 2-{3-[2-(5-Ethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6- ylamino}-benzoesäure (49 mg, 0,105 mmol) wurden 2 ml eines 90:10:1-Gemischs von CH₂Cl₂:TFA:TES gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h unter Refluxieren gerührt und dann mit Toluol (20 ml) verdünnt. Das Lösemittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei ein dickes Öl erhalten wurde. Das Öl wurde in DMF (1 ml) gelöst und zu dieser Lösung wurden TEA (0,072 ml, 0,52 mmol), Propargylamin (0,014 ml, 0,208 mmol) und HATU (59 mg, 0,156 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h gerührt und dann durch präparative HPLC gereinigt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde (29 mg, 66%). %). ¹H-NMR (CDCl₃-d) δ 9,83 (1H, s), 8,63 (2H, s), 8,04 (2H, m), 7,68 (2H, s), 7,47 (1H, m), 7,32 (1H, d, J = 1,51 Hz), 7,10 (1H, dd, J1 = 8,67 Hz, J2 = 1,88 Hz), 6,93 (1H, m), 6,07 (2H, dd, J1 = 5,09 Hz, J2 = 2,26 Hz), 3,15 (1H, t, J = 2,35 Hz), 2,97 (2H, s), 2,74 (1H, s), 2,29 (1H, s), 1,27 (3H, t, J = 7,44 Hz).
Anal. berechnet für C₂₆H₂₃N₅O·0,3H₂O·1,2TFA: C, 60,51; H, 4,43; N, 12,42. Gefunden: C, 60,38; H, 4,73; N, 12,44.
Referenzbeispiel 2(h) N-Cyclopropyl-2-{3-[(E)-2-(4-methylpyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzamid
Die Titelverbindung wurde analog zu dem oben beschriebenen 2-{3-[2-(5-Ethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-N-prop-2-inyl-benzamid hergestellt, wobei 4-Ethyl-2-methyl-pyridin durch 2,4-Dimethyl-pyridin in der Stufe, in der 1-(6-Chlor-1H-indazol-3-yl)-2-(5-ethyl-pyridin-2-yl)-ethanol hergestellt wurde, ersetzt wurde und Propargylamin durch Cyclopropylamin in der letzten Stufe der Reak tionsfolge ersetzt wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 9,85 (1H, s), 8,56 (2H, m), 8,20 (3H, m), 7,53 (5H, m), 7,35 (1H, s), 7,2 (1H, d, J = 6,5 Hz), 7,0 (1H, s), 2,83 (1H, m), 0,70 (2H, m), 0,56 (2H, m). ESIMS (M + H⁺): 410,3.
Referenzbeispiel 3(a) N-Methoxy-2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3'(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), O-Methylhydroxylaminhydrochlorid (15 mg, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,42 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 21,6 mg (67%) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,23 (1H, s), 8,71 (1H, d, J = 2,2 Hz), 8,05 (4H, m), 7,51 (5H, m), 7,25 (1H, s), 7,10 (1H, d, J = 7,7 Hz), 6,91 (1H, m), 5,98 (1H, m), 4,31 (1H, d, J = 14,3 Hz), 7,20 (1H, d, J = 7,3), 4,42 (2H, d, J = 3,2). ESIMS (M + H⁺): 412,1.
Referenzbeispiel 3(b) N-Allyloxy-2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3-(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), O-Allylhydroxylaminhydrochlorid (18,3 mg, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,42 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 25,5 mg (74%) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,28 (1H, s), 8,67 (2H, d, J = 3,4), 8,05 (4H, m), 7,48 (5H, m), 7,23 (1H, s), 7,04 (1H, d, J = 7,6 Hz), 6,91 (1H, m), 3,69 (3H, s). ESIMS (M + H⁺): 386,1.
Referenzbeispiel 3(c) N-Isopropoxy-2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3-(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), O-Isopropylhydroxylaminhydrochlorid (18,7 mg, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,42 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 17,4 mg (50%) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,23 (1H, s), 8,69 (H, d, J = 2,1), 8,03 (4H, m), 7,50 (5H, m), 7,23 (1H, s), 7,04 (1H, d, J = 6,7 Hz), 6,92 (1H, m), 5,98 (1H, m), 4,13 (1H, m), 1,29 (6H, d, J = 8,1). ESIMS (M + H⁺): 414,1.
Referenzbeispiel 3(d) N-Cyclopropyl-2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3-(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), O-Cyclopropylamin-hydroxylaminhydrochlorid (11,6 μl, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,25 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 11,7 mg (35%) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,81 (1H, s), 8,68 (1H, d, J = 1,7), 8,51 (1H, s), 8,01 (4H, m), 7,50 (5H, m), 7,24 (1H, s), 7,03 (1H, d, J = 5,3), 6,89 (1H, t, J = 4,2), 2,84 (1H, m), 0,72 (2H, m), 0,56 (2H, m). ESIMS (M + H⁺): 396,1.
Referenzbeispiel 3(f) 1-Methyl-1H-pyrrol-2-carbonsäure-N'-(1-{2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-phenyl}-methanoyl)-hydrazid
Eine Lösung von 2-[3-(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), 1-Methyl-1H- pyrrol-2-carbonsäurehydrazid (23,3 mg, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,42 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 16,1 mg (40%) der Titelverbindung als gelber Feststoff erhalten wurden. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,39 (1H, s), 10,00 (1H, s), 9,52 (1H, s), 8,57 (1H, d, J = 2,4), 8,07 (4H, m), 7,77 (1H, d, J = 5,2), 7,51 (4 H, m), 7,32 (1H, s), 7,09 (1H, d, J = 6,3 Hz), 6,98 (3H, m), 6,13 (1H, m), 3,87 (3H, s). ESIMS (M + H⁺): 478,1.
Referenzbeispiel 3(g) N-Benzyl-2-[3-((E)-2-pyridin-2-ylvinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3-(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), Benzylamin (18,2 μl, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,42 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 45,2 mg (76%) der Titelverbindung als TFA-Salz erhalten wurden. (1,5 H₂O, 2,1 TFA, effektives MG = 711,98). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,86 (1H, s), 9,14 (1H, t, J = 5,4), 8,73 (1H, d, J = 4,8), 8,29 (4H, m), 7,56 (1H, d, J = 7,0), 7,74 (2H, m), 7,89 (2H, m), 7,31 (5H, m), 7,16 (1H, d, J = 7,8), 6,93 (1H, t, J = 7,3), 4,46 (2H, d, J = 6,1). ESIMS (M + H⁺): 446,5.
Referenzbeispiel 3(h) N-(2-Methoxy-benzyl)-2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3-(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), o-Methoxybenzylamin (21,8 μl, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,42 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 46 mg (81%) der Titelverbindung als TFA-Salz erhalten wurden. (1,5 H₂O, 1,5 TFA, effektives MG = 673,59). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,83 (1H, s), 9,03 (1H, t, J = 3,4), 8,70 (1H, d, J = 3,7), 8,08 (4H, m), 7,82 (1H, d, J = 7,4), 7,49 (4H, m), 7,21 (3H, m), 6,96 (4H, m), 4,48 (2H, d, J = 6,3). ESIMS (M + H⁺): 476,1.
Referenzbeispiel 3(i) N-Furan-2-ylmethyl-2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3-(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), C-Furan-2-ylmethylamin (19 μl, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,42 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht ge rührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 45 mg (85%) der Titelverbindung als TFA-Salz erhalten werden. (1,5 H₂O, 1,5 TFA, effektives MG = 633,52). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,82 (1H, s), 9,05 (1H, t, J = 2,6), 8,73 (1H, d, J = 3,7), 8,13 (4H, m), 7,73 (1H, d, J = 6,8), 7,57 (2H, m), 7,26 (1H, s), 7,03 (1H, d, J = 7,5), 6,40 (1H, m), 6,28 (1H, m), 4,48 (2H, d, J = 6,5). ESIMS (M + H⁺): 436,1.
Referenzbeispiel 3(j) N-Cyclobutyl-2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3-(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), Cyclobutylamin (18,2 μl, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,42 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 43,2 mg (92%) der Titelverbindung als TFA-Salz erhalten werden. (1,5H₂O, 1,1TFA, effektives MG = 561,92). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,78 (1H, s), 8,72 (2H, m), 8,13 (4H, m), 7,70 (1H, d, J = 7,1), 7,58 (2H, m), 7,41 (2H, m), 7,27 (1H, s), 6,89 (1H, t, J = 4,2), 2,84 (1H, m), 0,72 (2H, m), 0,56 (2H, m). ESIMS (M + H⁺): 396,1.
Referenzbeispiel 3(k) N-(2-Methyl-allyl)-2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3-(2-Pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (50,0 mg, 0,084 mmol), 2-Methyl-allylamin (16,4 μl, 0,17 mmol), Triethylamin (58 μl, 0,42 mmol), die in DMF (0,8 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (48 mg, 0,13 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 45 mg (91%) der Titelverbindung als TFA-Salz erhalten werden. (1,6 H₂O, 1,3 TFA, effektives MG = 586,53). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,78 (1H, s), 8,72 (2H, m), 8,13 (4H, m), 7,70 (1H, d, J = 7,1), 7,58 (2H, m), 7,41 (2H, m), 7,27 (1H, s), 7,06 (1H, d, J = 7,1), 6,91 (1H, t, J = 7,5), 4,42 (1H, m), 2,22 (2H, m), 2,08 (2H, m), 1,68 (2H, m). ESIMS (M + H⁺): 410,1.
Beispiel 3(l) 6-Nitro-3-pyridin-2-ylethinyl-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol
Ein Gemisch von 3-Iod-6-nitro-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol (838 mg, 2,0 mmol), 2-Ethinyl-pyridin (242 μl, 2,4 mmol) und Triethylamin (6,0 ml) wurde entgast und mit Argon gespült, dann mit CuI (8 mg, 0,042 mmol) und Pd(PPh₃)₂Cl₂ (16 mg, 0,023 mmol) behandelt. Das gebildete Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wonach dann HPLC zeigte, dass das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war. Das Gemisch wurde durch Abstreifen flüchtiger Stoffe unter Hochvakuum gereinigt, dann durch einen Silicapfropfen gegeben und mit Ethylacetat eluiert. Das gebildete Produkt wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet. ESIMS (M + H⁺): 395,1.
Beispiel 3(m) 3-Pyridin-2-ylethinyl-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamin
Ein Gemisch von 6-Nitro-3-pyridin-2-ylethinyl-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol (2 mmol), SnCl₂ (1,37 g, 6,0 mmol), Wasser (0,5 ml) und MeOH (10 ml) wurde in einem Ölbad von 60°C 30 min gerührt, wonach dann HPLC eine vollständige Reduktion zeigte. Das gebildete Gemisch wurde von Methanol befreit, in EtOAc (50 ml) suspendiert und mit 1 M NaOH (18 ml) verdünnt. Die gebildete Emulsion wurde sanft mit EtOAc (10 × 25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 1 M Na₂CO₃, Kochsalzlösung extrahiert, über MgSO₄ getrocknet, eingeengt und über einen Silicapfropfen filtriert und mit EtOAc eluiert. Die Ausbeute an rohem Produkt für zwei Stufen betrug 701 mg, 96% Massengewinnung. ESIMS (M + H⁺): 365,1.
Beispiel 3(n) 2-[3-Pyridin-2-ylethinyl-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäuremethylester
Ein Gemisch von 3-Pyridin-2-ylethinyl-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamin (560 mg, 1,54 mmol), 2-Brommethylbenzoat (647,5 μl, 4,61 mmol), Biphenyl-2-yl-dicyclohexyl-phosphan (107,8 mg, 0,308 mmol), Pd₂(dba)₃ (70,5 mg, 0,768 mmol), K₃PO₄ (816 mg, 3,844 mmol) und Dimethoxyethan (1,7 ml) wurde mit Stickstoff vakuumgespült, dann in einem Ölbad bei 70°C 24 h erhitzt. Das schwarze Gemisch wurde mit Methylenchlorid verdünnt und filtriert, eingeengt und chromatographiert (20% bis 40% Ethylacetat/Hexane). Die Ausbeute an gelbem/orangefarbenem Öl betrug 260 mg, 35%, für drei Stufen.
Beispiel 3(o) 2-[3-Pyridin-2-ylethinyl-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure
2-[3-Pyridin-2-ylethinyl-1-(2-trimethylsilanyl- ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäuremethylester (253 mg, 0,517 mmol) wurde zu einer Lösung von NaOH (62 mg, 1,55 mmol), das in THF (1,0 ml), MeOH (2,25 ml) und Wasser (0,5 ml) gelöst war, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt, wonach dann HPLC zeigte, dass das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 N HCl neutralisiert, mit Ethylacetat extrahiert, dann mit Kochsalzlösung gewaschen und mit MgSO₄ getrocknet. Nach Einengen unter Vakuum wurden 249 mg eines gelben Feststoffs erhalten (99% Massengewinnung). Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung verwendet. ESIMS (M – H^–): 483,0.
Beispiel 3(p) 2-[3-Pyridin-2-ylethinyl-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure
Eine Lösung von 2-[3-Pyridin-2-ylethinyl-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (231 mg, 0,477 mmol), 1 M Tetrabutylammoniumfluorid in THF (3,8 ml, 3,816 mmol) und Ethylendiamin (127 μl, 1,908 mmol) wurde 6 h in einem Ölbad bei 80°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Essigsäure (218 μl, 3,816 mmol) gequencht, mit Wasser verdünnt und mit EtOAc (10 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet.
Nach Einengen bildet sich ein Feststoff, der mit CH₂Cl₂ verrieben wurde, wobei das Produkt als gelbes Pulver erhalten wurde (124 mg, 73%). ESIMS (M – H^–): 353,0.
Referenzbeispiel 3(q) N-Prop-2-inyl-2-[3-((E)-2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Eine Lösung von 2-[3-Pyridin-2-ylethinyl-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (41 mg, 0,117 mmol), Propargylamin (24 μl, 0,35 mmol), Triethylamin (81 μl, 0,58 mmol), die in DMF (0,5 ml) gelöst waren, wurde mit HATU (89 mg, 0,233 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei 27 mg (59%) der Titelverbindung als gelbes Öl erhalten wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,78 (1H, s), 8,99 (1H, m), 8,61 (1H, d, J = 2,1), 7,88 (1H, s), 7,72 (3H, m), 7,43 (4H, m), 7,29 (1H, s), 7,04 (1H, d, J = 7,3), 6,91 (1H, t, J = 5,2), 4,04 (2H, s), 3,04 (1H, s).
ESIMS (M + H⁺): 392,1.
Beispiel 4(a): 2-Brom-4,6-dimethyl-pyridin
Eine Lösung von 48%-igem HBr (aq) (Aldrich, 65 ml, 1,2 mol, 10 eq) wurde auf –5°C gekühlt und mit 4,6-Dimethylpyridin-2-ylamin (Aldrich, 15,0 g, 0,12 mol, 1,0 eq) behandelt. Das dicke weiße Salzgemisch wurde mit einem mechanischen Rührer gerührt, während Brom (Aldrich, 19,7 ml, 0,38 mol, 3,1 eq) tropfenweise zugegeben wurde. Das gebildete rote Gemisch wurde mit einer wässrigen Lösung (32 ml H₂O) von NaNO₂ (Aldrich, 22,1 g, 0,32 mol, 2,6 eq) über 1 h behandelt. Die Temperatur wurde während der Nitritzugabe unter 5°C gehalten und dann über 2 h stufenweise auf 20°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde mit NaOH (aq) auf pH 14 eingestellt und mit MTBE extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das rohe Produkt (29 g eines roten Öls) wurde durch Flashchromatographie gereinigt (Silica, 350 g) und mit 2–7% Ethylacetat-Cyclohexan eluiert, wobei ein orangefarbenes Öl erhalten wurde (11,0 g, 48%).
¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) δ 7,30 (1H, s), 7,13 (1H, s), 2,39 (3H, s), 2,26 (3H, s). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, 75 MHz) δ 159,4, 151,3, 140,9, 125,7, 124,0, 23,7, 20,3. ESI m/z 186/188 (M + H)⁺.
Beispiel 4(b): 3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-6-nitro-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol
Eine Suspension von 2-Brom-4,6-dimethylpyridin (2,42 g, 13 mmol), 3-Vinyl-6-nitro-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol (2,37 g, 8,67 mmol), Palladiumacetat (0,145 g, 0,65 mmol), Tri-ortho-tolylphosphin (0,791 g, 2,6 mmol) und Diisopropylethylamin (2,4 ml, 13,8 mmol) in wässrigem DMF (85%, 34,5 ml) wurde durch Durchperlen mit Argon während 5 min entgast, worauf eine Ultraschallbehandlung während 5 min folgte, bevor in einem Mikrowellengerät (300 Watt, 10% Leistung) bei 110°C 40 min erhitzt wurde. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch in kaltes Wasser getropft. Der gebildete gelbe Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen. Die Feststoffe wurden in Ethylacetat gelöst, getrocknet (Natriumsulfat) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 20% Ethylacetat in einem Gemisch von Chloroform und Hexanen (1:1) als Elutionsmittel gereinigt. Produkt von der Chromatographie wurde mit MTBE/Hexanen verrieben, wobei ein sauberes Produkt als gelber Feststoff erhalten wurde. Die Mutterlauge wurde auf ähnliche Weise auf Silicagel und durch anschließendes Verreiben erneut gereinigt, wobei weiteres sauberes Produkt in einer Ausbeute von 68% erhalten wurde.
¹H-NMR (CDCl₃): δ 8,54 (1H, s), 8,15 (1H, d, J = 9,4 Hz), 8,08 (1H, dd, J = 9,04, 1,9 Hz), 7,87 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,55 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,14 (1H, s), 6,90 (1H, s), 5,82 (1H, dd, J = 9,0, 3,0 Hz), 4,08–4,01 (1H, m), 3,84–3,76 (1H, m), 2,56 (3H, s), 2,62–2,54 (1H, m), 2,34 (3H, s), 2,24–2,10 (2H, m), 1,88–1,68 (3H, m).
Beispiel 5: 3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamin
Eine Suspension von 3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-6-nitro-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol (4,22 g, 11,16 mmol), Eisenpulver (2,71 g, 48,51 mmol) und gesättigtem wässrigem NH₄Cl (25 ml) in 25 ml Ethanol wurde 18 h bei 45°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und über Filterpapier unter Waschen mit Methanol filtriert. Die Lösemittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc (2×) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 4,02 g (quantitativ) eines rostfarbenen Feststoffs erhalten wurden und ohne weitere Reinigung verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 7,79 (1H, s), 7,74 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,35 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,29 (1H, s), 6,96 (1H, s), 6,63 (2H, m), 5,57 (1H, dd, J = 2,4, 9,5 Hz), 5,44 (2H, breites s), 3,88 (1H, m), 3,67 (1H, m), 2,45 (3H, s), 2,37 (1H, m), 2,29 (3H, s), 1,99 (2H, m), 1,73 (1H, m), 1,57 (2H, m).
Beispiel 6: 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäuremethylester
Eine gerührte Suspension von 3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamin (870 mg, 2,5 mmol), 2-Brombenzoesäuremethylester (0,44 ml, 3,12 mmol), R-BINAP (78 mg, 0,125 mmol), Pd₂(dba)₃ (29 mg, 0,03 mmol) und Cäsiumcarbonat (1,22 g, 3,75 mmol) in Toluol (6 ml) wurde entgast und 18 h bei 100°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, in gesättigtes NaHCO₃ gegossen und mit EtOAc (2×) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde auf Silicagel unter Elution mit einem Gradienten von 5–10% EtOAc in CH₂Cl₂ flashchromatographiert, wobei 964 mg (80%) eines gelben Schaums erhalten wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,49 (1H, s), 8,13 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,94 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,58 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,48 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,47 (1H, m), 7,37 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,34 (1H, s), 7,19 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 6,99 (1H, s), 6,89 (1, H, t, J = 8,1 Hz), 5,83 (1H, d J = 7,2 Hz), 3,88 (3H, s), 3,75 (1H, m), 2,48 (3H, s), 2,41 (2H, m), 2,31 (3H, s), 2,02 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,59 (2H, m).
Anal. berechnet für C₂₉H₃₀N₄O₃·0,15EtOAc: C, 71,71; H, 6,34; N, 11,30. Gefunden: C, 71,60; H, 6,14; N, 11,37.
Beispiel 7: 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure
Zu einer gerührten Lösung von 2-[3-[2-(4,6-Dimethylpyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäuremethylester (1,98 g, 4,11 mmol) in THF:MeOH (12 ml, 3:1) wurde Kaliumhydroxid (1,15 g, 20,5 mmol), das in H₂O (3 ml) gelöst war, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei 70°C erhitzt, gekühlt, unter vermindertem Druck auf etwa 5 ml eingeengt und mit weiterem Wasser verdünnt. Die Lösung wurde mit 2 N HCl neutralisiert und der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen, wobei 2,00 g (quantitativ) eines leuchtend gelben Feststoffs erhalten wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,12 (1H, breites s), 9,82 (1H, s), 8,13 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,95 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz), 7,89 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,60 (1H, s), 7,50 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,46 (1H, d, J = 6,9 Hz), 7,37 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,20 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,06 (1H, s), 6,86 (1H, t, J = 6,9 Hz), 5,85 (1H, d, J = 7,3 Hz), 3,82 (2H, m), 2,50 (3H, s, verdeckt durch DMSO), 2,48 (2H, m), 2,34 (3H, s), 2,03 (2H, m), 1,76 (1H, m), 1,59 (2H, m). Anal. berechnet für C₂₈H₂₈N₄O₃·0,5KOH: C, 67,72; H, 5,79; N, 11,28. Gefunden: C, 67,65; H, 5,88; N, 11,07.
Beispiel 8: 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure-p-toluolsulfonat
Ein Gemisch von 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure (2 mmol) und p-Toluolsulfonsäure (10 mmol) in wässrigem Methanol (90%, 20 ml) wurde 18 h bei 70°C gerührt. Nach dem Abkühlen wurde die gebildete dicke gelbe Aufschlämmung filtriert und die Feststoffe wurden mit Methanol gewaschen, wobei 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure als das Tosylatsalz in einer Ausbeute von 85% als blassgelber Feststoff erhalten wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 13,43 (1H, s), 9,78 (1H, s), 8,24–8,19 (2H, m), 8,09 (1H, d, J = 9,04 Hz), 7,95 (1H, dd, J = 7,9, 1,1 Hz), 7,62–7,55 (2H, m), 7,49–7,38 (5H, m), 7,20 (1H, dd, J = 9,0, 1,9 Hz), 7,09 (2H, d, J = 8,3 Hz), 6,86 (1H, dt, J = 7,9, 1,1 Hz), 2,67 (3H, s), 2,54 (3H, s), 2,27 (3H, s).
Beispiel 9: N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl]-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Herstellung gemäß der Beschreibung für Beispiel 33(a) Stufe (v) in der US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/609 335 , eingereicht am 30. Juni 2000, wobei jedoch 4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inylamin und 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,56 (1H, s), 9,01 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,81 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,66 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,41 (4H, m), 7,32 (1H, s), 7,09 (1H, dd, J = 1,8, 8,7 Hz), 6,98 (1H, s), 6,89 (1H, t, J = 8,0 Hz), 5,79 (1H, dd, J = 2,4, 9,2 Hz), 4,28 (2H, s), 4,09 (2H, m), 3,86 (1H, m), 3,72 (1H, m), 2,46 (3H, s), 2,42 (1H, m), 2,30 (3H, s), 2,08 (2H, m), 1,74 (1H, m), 1,57 (2H, m), 0,80 (9H, s), 0,03 (6H, s).
Anal. berechnet für C₃₈H₄₇N₅O₃Si·0,7H₂O: C, 68,89; H, 7,36; N, 10,57. Gefunden: C, 68,99; H, 7,36; N, 10,21.
Beispiel 10: 2-{3-[(E)-2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-N-(4-hydroxy-but-2-inyl)-benzamid
Eine gerührte Lösung von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl]-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid (737 mg, 1,13 mmol) und p-Toluolsulfonsäure (8,2 ml, 12% in HOAc) wurde 2 h bei 70°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und vorsichtig in gesättigtes NaHCO₃ gegossen und mit EtOAc (2×) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung (2×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde auf Silicagel unter Elution mit CH₂Cl₂:EtOAc:MeOH (1:1:0,1) flashchromatographiert, wobei 225 mg (44%) eines weißen Feststoffs erhalten wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,91 (1H, s), 9,84 (s, 1H), 9,01 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,84 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,2 Hz), 7,43 (3H, m), 7,31 (1H, s), 7,26 (1H, s), 7,02 (1H, dd, J = 1,6, 8,7 Hz), 6,97 (1H, s), 6,89 (1H, t, J = 6,7 Hz), 5,12 (1H, t, J = 5,8 Hz), 4,10 (2H, d, J = 5,3 Hz), 4,07 (2H, d, J = 5,8 Hz), 2,47 (3H, s), 2,31 (3H, s).
Anal. berechnet für C₂₇H₂₅N₅O₂·1,1H₂O: C, 68,80; H, 5,82; N, 14,86. Gefunden: C, 68,72; H, 5,81; N, 14,65.
Beispiel 11: 4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inylamin
Zu einer eiskalten gerührten Lösung des bekannten 4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-in-1-ol (3,14 g, 15,7 mol) in THF (50 ml) wurden DBU (2,6 ml, 17,4 mmol) und DPPA (3,8 ml, 17,6 mmol) gegeben. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht in einer inerten Atmosphäre gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in gesättigtes NaHCO₃ gegossen und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde mit EtOAc (2×) reextrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄) und unter Vakuum eingeengt. Triphenylphosphin (4,61 g, 17,6 mmol) wurde zu diesem rohen Azid gegeben, das in THF (50 ml) gelöst wurde, worauf H₂O (0,44 ml) zugegeben wurde. Die gebildete Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand wurde in einem 1:1-Gemisch von Et₂O/Petrolether aufgeschlämmt. Die Feststoffe wurden entfernt und das Filtrat wurde einge engt und durch Flashchromatographie auf Silicagel unter Elution mit CH₂Cl₂/MeOH (19:1) gereinigt, wobei ein bernsteinfarbenes Öl erhalten wurde.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 4,19 (2H, t, J = 1,9 Hz), 3,33 (2H, t, J = 1,9 Hz), 0,79 (9H, s), 0,00 (6H, s).
Beispiel 12: 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-N-prop-2-inyl-benzamid
Herstellung gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und Propargylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,87 (1H, s), 9,04 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,44 (4H, m), 7,34 (1H, s), 7,12 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 6,99 (1H, s), 6,91 (1H, t, J = 5,8 Hz), 5,81 (1H, dd, J = 2,4, 9,2 Hz), 4,07 (2H, dd, J = 2,5, 5,7 Hz), 3,88 (1H, m), 3,74 (1H, m), 3,12 (1H, t, J = 2,5 Hz), 2,48 (3H, s), 2,43 (1H, m), 2,31 (3H, s), 2,01 (2H, m), 1,74 (1H, m), 1,58 (2H, m).
Anal. berechnet für C₃₁H₃₁N₅O₂·1,1H₂O·0,3TBME: C, 70,73; H, 6,72; N, 12,69. Gefunden: C, 70,56; H, 6,45; N, 12,49.
Referenzbeispiel 13: N-(Prop-2-inyl)-2-{3-[(E)-2-(2,4-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 7, wobei jedoch N-(3-Cyclopropyl-prop-2-inyl)-2-[3-(2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-(2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 12,90 (1H, s), 9,78 (1H, s), 9,01 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,3 Hz), 7,84 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,68 (1H, dd, J = 7,9, 1,1 Hz), 7,45–7,36 (3H, m), 7,30 (1H, s), 7,25 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,01 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 6,96 (1H, s), 6,88 (1H, dt, J = 6,8, 1,9 Hz), 4,04 (2H, dd, J = 5,6, 2,6 Hz), 3,11 (1H, t, J = 2,6 Hz), 2,46 (3H, s), 2,29 (3H, s).
Beispiel 14: 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-N-(2-methylallyl)-benzamid
Herstellung gemäß der Beschreibung für Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und 2-Methyl-allylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,87 (1H, s), 8,82, (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,82 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,74 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,43 (4H, m), 7,33 (1H, s), 7,10 (1H, d, J = 8,7 Hz), 6,99 (1H, s), 6,92 (1H, t, J = 7,8 Hz), 5,80 (1H, dd, J = 2,2, 9,2 Hz), 4,83 (2H, d, J = 11,8 Hz), 3,83 (4H, m), 3,47 (3H, s), 2,44 (1H, m), 2,31 (3H, s), 2,00 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,73 (3H, s), 1,58 (2H, m).
Anal. berechnet für C₃₂H₃₅N₅O₂·1,09H₂O: C, 71,00; H, 6,92; N, 12,94. Gefunden: C, 71,40; H, 6,89; N, 12,54.
Referenzbeispiel 15: 2-{3-[-2-(2,4-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-N-(2-methyl-allyl)-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 7, wobei jedoch N-(2-Methyl-allyl)-2-[3-(2-(4,6-dimethyl-pyridin-2- yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-(2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,89 (1H, s), 9,75 (1H, s), 8,79 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,05 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,74 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,45–7,33 (4H, m), 7,23 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,00–6,97 (2H, m), 6,90 (1H, dt, J = 7,9, 1,1 Hz), 4,81 (2H, d, J = 11,3 Hz), 3,81 (2 H, d, J = 5,6 Hz), 2,47 (3H, s), 2,30 (3H, s), 1,71 (3H, s).
Alternatives Syntheseschema
Beispiel 16(a): Cyclopropyl-prop-2-in-1-ol
In einen Rundkolben, der 70 ml wasserfreies THF enthielt, der in einem Eisbad von –10°C gekühlt wurde, wurden 65,6 ml 1,6 M BuLi in Hexanen (105 mmol) gegeben. 5-Chlor-pent-1-in (5,13 g, 50 mmol) wurde langsam zugegeben, während die Temperatur bei –10 bis 0°C gehalten wurde. Das Gemisch wurde 2 h unter Argon bei 0°C gerührt. Paraformaldehyd (3 g, 100 mmol) wurde als Feststoff zugegeben. Das Gemisch wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht unter Argon gerührt. Am nächsten Tag wurden Wasser zugegeben und etwa 50 ml 1 N wässrige HCl zugegeben. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingeengt. Das rohe Produkt wurde durch Säulenchromatographie unter Elution mit 20% Et₂O in Hexanen gereinigt, wobei 3 g Cyclopropyl-prop-2-in-1-ol als Öl erhalten wurden (62% Ausbeute).
¹H-NMR (CDCl₃) δ 4,22 (dd, 2H, J = 6,04, 2,01 Hz), 1,46 (t, 1H, J = 6,04 Hz), 1,26 (m, 1H), 0,77 (m, 2H), 0,70 (m, 2 H).
Beispiel 16(b): 3-Cyclopropyl-prop-2-inylazid
Cyclopropyl-prop-2-in-1-ol (3,28 g, 34,1 mmol) wurde in 40 ml Toluol gelöst, mit DPPA (11,26 g, 40,9 mmol) und anschließend DBU (6,24 g, 40,9 mmol) versetzt, während die Temperatur mit einem Wasserbad beibehalten wurde. Das Gemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und mit 100 ml Hexan und 15 ml CH₂Cl₂ verdünnt. Das Gemisch wurde viermal mit Wasser und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter Rotationsverdampfung mit einem kalten Wasserbad eingeengt, um den größten Teil der organischen Lösemittel zu entfernen, wobei etwas Toluol (flüchtiges Produkt) zurückblieb. Das verbliebene Öl wurde für die nächste Stufe verwendet.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 3,85 (s, 2H), 1,26 (m, 1H), 0,80 (m, 2 H), 0,72 (m, 2H).
Beispiel 16(c): 3-Cyclopropyl-prop-2-inylamin
3-Cyclopropyl-prop-2-inylazid (etwa 34 mmol) wurde in 100 ml THF gelöst, mit 1 ml Wasser versetzt und anschließend mit PPh₃ (13,37 g, 51 mmol) als Feststoff versetzt, während die Temperatur mit einem Wasserbad beibehalten wurde. Das Gemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt. 150 ml 1 N wässrige HCl wurden zu dem Gemisch gegeben. Das Gemisch wurde mit Methylenchlorid dreimal gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit 5 N NaOH bis zu einem pH-Wert von 10–12 basisch gemacht. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Schicht wurde durch DC-Anfärbung überprüft, um das Fortschreiten der Extraktion von Amin in die organische Phase zu überwachen. Die vereinigte organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingeengt, wobei 1,62 g gewünschtes Produkt erhalten wurden (flüchtiges Produkt, enthält verbliebenes EtOAc-Lösemittel) (50% Ausbeute für zwei Stufen).
¹H-NMR (CDCl₃) δ 3,57 (d, 2H, J = 2 Hz), 1,22 (m, 1H), 0,74 (m, 2H), 0,65 (m, 2H).
Beispiel 17: N-(3-Cyclopropyl-prop-2-inyl)-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Herstellung gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure E und 3-Cyclopropyl-prop-2-inylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (CDCl₃): δ 9,51 (1H, s), 7,97 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,81 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,51–7,42 (3H, m), 7,34–7,29 (2H, m), 7,16 (1H, s), 7,11 (1H, dd, J = 9,0, 1,9 Hz), 6,85 (1H, s), 6,81 (1H, dt, J = 7,2, 1,1 Hz), 6,23 (1H, t, J = 7,2 Hz), 5,61 (2H, dd, J = 9,0, 2,6 Hz), 4,17 (2H, dd, J = 5,3, 2,3 Hz), 4,07–4,00 (1H, m), 3,75–3,66 (1H, m), 2,63–2,50 (1H, m), 2,54 (3H, s), 2,32 (3H, s), 2,20–2,02 (2H, m), 1,79–1,62 (3H, m), 1,29–1,19 (1H, m), 0,77–0,67 (4H, m).
Referenzbeispiel 18: N-(3-Cycloprop-2-inyl)-2-{3-[(E)-2-(2,4-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 7, wobei jedoch 2-[3-(2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1-indazol-6-ylamino]-N-prop-2-inylbenzamid anstelle von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-(2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 12,90 (1H, s), 9,79 (1H, s), 8,91 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,68 (1H, dd, J = 7,9, 1,1 Hz), 7,49–7,38 (3H, m), 7,29 (1H, s), 7,25 (1H, d, J = 1,9 Hz), 6,99 (1H, dd, J = 9,0, 2,3 Hz), 6,96 (1H, s), 6,88 (1H, dt, J = 7,9, 1,5 Hz), 4,00 (2H, dd, J = 5,6, 1,9 Hz), 2,46 (3H, s), 2,29 (3H, s), 1,31–1,23 (1H, m), 0,75–0,70 (2H, m), 0,57–0,52 (2H, m).
Beispiel 19(a): 2-Butin-1,4-diol-monoacetat
Zu einer Lösung von Butin-1,4-diol (5 g, 58 mmol) in trockenem THF bei Raumtemperatur wurde portionsweise Natriumhydrid (60%-ige Dispersion in Öl, 2,32 g, 58 mmol) gegeben. Nach 4,3 h wurde Acetylchlorid (4,12 ml, 58 mmol) zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur während 22 h wurde das Gemisch unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde zweimal aus Toluol eingeengt, bevor auf Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Dichlormethan (1:3) als Elutionsmittel gereinigt wurde, wobei 2-Butin-1,4-diol-monoacetat als Öl in 49% Ausbeute erhalten wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 5,23 (1H, bs), 4,70 (2H, t, J = 1,8 Hz), 4,09 (2H, s), 2,03 (3H, s).
Beispiel 19(b): Essigsäure-4-amino-but-2-inylester
Herstellung gemäß der Beschreibung in Beispiel 8, wobei jedoch 2-Butin-1,4-diol-monoacetat anstelle von 4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-in-1-ol verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 4,77 (2H, s), 4,20 (2H, s), 2,04 (3H, s).
Referenzbeispiel 20: Essigsäure-4-(2-{3-[(E)-2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzoylamino)-but-2-inylester
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-(2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-indazol-6-ylamino]-benzoesäure-p-toluolsulfonat und Essigsäure-4-amino-but-2-inylester verwendet wurden.
¹H-NMR (CD₃CN): δ 11,00 (1H, bs), 9,59 (1H, s), 7,99 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,58 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,49–7,37 (4H, m), 7,32 (1H, s), 7,21 (1H, s), 7,06 (1H, dd, J = 8,8, 1,8 Hz), 6,96 (1H, s), 6,90 (1H, t, J = 7,8 Hz), 4,63 (2H, s), 4,16 (2H, d, J = 5,6 Hz), 2,49 (3H, s), 2,32 (3H, s), 2,01 (3H, s).
Beispiel 21: 2-[3-[(E)-2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-nicotinsäuremethylester
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 3, wobei jedoch 2-Brom-nicotinsäuremethylester anstelle von 2- Brom-benzoesäuremethylester verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,36 (1H, s), 8,50 (1H, dd, J = 4,7, 1,9 Hz), 8,36 (1H, d, J = 1,4 Hz), 8,30 (1H, dd, J = 7,8, 2,0 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,48 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,44 (1H, s), 7,33 (1H, s), 6,98–6,93 (2H, m), 5,80 (1H, d, J = 7,0 Hz), 2,93 (3H, s), 3,93–3,90 (1H, m), 3,80–3,75 (1H, m), 2,46 (3H, s), 2,30 (3H, s), 2,10–1,97 (2H, m), 1,89–1,60 (3H, m).
Beispiel 22: 2-[3-[(E)-2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-nicotinsäure
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 4, wobei jedoch 2-[3-[(E)-2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-nicotinsäuremethylester anstelle von 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäuremethylester verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,73 (1H, s), 8,49 (1H, d, J = 1,9 Hz), 8,45 (1H, s), 8,31 (1H, dd, J = 7,7, 1,8 Hz), 8,16–7,97 (3H, m), 7,70 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,50 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,37 (1H, s), 6,96 (1H, dd, J = 7,7, 4,8 Hz), 5,87 (1H, d, J = 8,4 Hz), 3,95–3,90 (1H, m), 3,79–3,70 (1H, m), 2,63 (3H, s), 2,47 (3H, s), 2,07–1,99 (2H, m), 1,81–1,62 (3H, m).
Referenzbeispiel 23: 2-[3-[(E)-2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino]-N-(4-hydroxy-but-2-inyl)-nicotinamid
Ein rohes Gemisch von N-(4-Hydroxy-but-2-inyl)-2-[3-[-2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-nicotinamid und N-[4-(tert-Butyldimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-nicotinamid wurde aus 2-[3-[(E)-2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-nicotinsäure und 4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inylamin gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6 hergestellt und anschließend in 2-[3-[(E)-2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino]-N-(4-hydroxy-but-2-inyl)-nicotinamid gemäß der Beschreibung für Beispiel 7 umgewandelt, wobei jedoch ein Gemisch von N-(4-Hydroxy-but-2-inyl)-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-nicotinamid und N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-[-2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-nicotinamid anstelle von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 12,99 (1H, s), 11,21 (1H, s), 9,26 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,50 (1H, d, J = 1,9 Hz), 8,41 (1H, dd, J = 4,9, 1,9 Hz), 8,16 (1H, dd, J = 8,3, 1,9 Hz), 8,04 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,42 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,31 (1H, s), 7,06 (1H, dd, J = 8,7, 1,5 Hz), 6,96 (1H, s), 6,93 (1H, dd, J = 7,5, 4,9 Hz), 5,14 (1H, t, J = 5,6 Hz), 4,16 (2H, d, J = 5,6 Hz), 4,08 (2H, d, J = 7,2 Hz), 2,46 (3H, s), 2,30 (3H, s).
Beispiel 24: 2-{3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-nicotinsure-p-toluolsulfonat
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 5, wobei jedoch 2-{3-[(E)-2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino)-nicotinsäure anstelle von 2-{3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino)-benzoesäure verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 13,49 (1H, s), 10,80 (1H, s), 8,63 (1H, d, J = 1,5 Hz), 8,49 (1H, dd, J = 4,8, 1,9 Hz), 8,31 (1H, dd, J = 7,7, 1,9 Hz), 8,24–8,19 (2H, m), 8,06 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,60–7,55 (2H, m), 7,46 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,22 (1H, dd, J = 8,8, 1,7 Hz), 7,09 (2H, d, J = 7,9 Hz), 6,95 (1H, dd, J = 7,7, 4,7 Hz), 2,66 (3H, s), 2,54 (3H, s), 2,27 (3H, s).
Referenzbeispiel 25: N-(3-Cyclopropyl-prop-2-inyl)-2-{3-[(E)-2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-nicotinamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch 2-{3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-nicotinsäure-p-toluolsulfonat und 3-Cyclopropyl-prop-2-inylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 13,01 (1H, s), 11,20 (1H, s), 9,19 (1H, bt), 8,51 (1H, s), 8,40 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,15 (1H, d, J = 7,5 Hz), 8,05 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,42 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,31 (1H, s), 7,05 (1H, d, J = 8,3 Hz), 6,96 (1H, s), 6,92 (1H, dd, J = 7,5, 4,9 Hz), 4,06 (2H, d, J = 4,14 Hz), 2,46 (3H, s), 2,29 (3H, s), 1,33–1,28 (1H, m), 0,77–0,72 (2H, m), 0,60–0,55 (2H, m).
Beispiel 26: 4-Methyl-2-vinyl-pyridin
Ein gelbes Gemisch von 2-Brom-4-methyl-pyridin (Aldrich, 5,2 g, 30,5 mmol, 1,9 eq), 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (Aldrich, 67 mg, 0,3 mmol, 1 Mol-%), Tributyl-vinyl-stannan (Aldrich, 26,8 ml, 9,15 mmol, 3,0 eq) und Tetra kis(triphenylphosphin)palladium(0) (Strem, 1,8 g, 1,5 mmol, 5 Mol-%) in Toluol (100 ml) wurde entgast und mit Argon gespült. Eine bernsteinfarbene Lösung wurde nach Erwärmen des Gemischs auf 100°C erhalten. Das Reaktionsgemisch wurde nach 18 h durch Zugabe von 1,0 M HCl gequencht. Der saure Extrakt wurde mit Ether gewaschen, mit festem Natriumbicarbonat auf pH 9 eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das rohe Produkt (3,7 g eines braunen Öls) wurde durch Flashchromatographie (Silica) gereinigt und mit 0–5% Ethylacetat/Dichlormethan eluiert, wobei ein klares Öl erhalten wurde (1,9 g, 53%).
¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) δ 8,39 (1H, d, J = 4,9 Hz), 7,33 (1H, s), 7,10 (1H, dd, J = 5,0, 0,8 Hz), 6,77 (1H, dd, 17,5, 10,8 Hz), 6,20 (1H, dd, J = 17,5, 1,7 Hz), 5,44 (1H, dd, J = 10,8, 1,8 Hz), 2,31 (3H, s). ESIMS m/z 120 (M + H)⁺.
Beispiel 27: 3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-phenyl]-6-nitro-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol
Eine Suspension von 4-Methyl-2-vinyl-pyridin (Beispiel 23) (1,9 g, 15,97 mmol), 6-Nitro-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-3-vinyl-1H-indazol (4,96 g, 13,3 mmol), Pd(OAc)₂ (149 mg, 0,66 mmol), P(o-Tolyl)₃ und DIEA (3,5 ml, 19,96 mmol) in entgastem DMF (50 ml) wurde 18 h bei 100°C unter Argon erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und die Feststoffe wurden durch Filtration unter Waschen mit EtOAc entfernt. Das Filtrat wurde mit EtOAc verdünnt und mit Kochsalzlösung (2×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde auf Silicagel unter Elution mit Hexanen:EtOAc (3:1) chromatographiert, wobei 3,40 g (70%) eines leuchtend gelben Feststoffs erhalten wurden.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,56 (1H, s), 8,50 (1H, d, J = 5,0 Hz), 8,11 (2H, m), 7,89 (1H, d, J = 16,3 Hz), 7,61 (1H, s), 7,03 (1H, d, J = 4,3 Hz), 5,83 (1H, dd, J = 2,6, 9,0 Hz), 4,06 (1H, m), 3,82 (1H, m), 2,58 (1H, m), 2,39 (3H, s), 2,18 (2H, m), 1,78 (3H, m).
Anal. berechnet für C₂₀H₂₀N₄O₃: C, 65,92; H, 5,53; N, 15,38. Gefunden: C, 65,80; H, 5,52; N, 15,15.
Beispiel 28: 3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamin
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 2, wobei jedoch 3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-6-nitro-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol (Beispiel 24) anstelle von 3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-6-nitro-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 8,43 (1H, d, J = 4,8 Hz), 7,79–7,73 (2H, m), 7,50 (1H, s), 7,39 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,09 (1 H, d, J = 4,8 Hz), 6,64–6,62 (2H, m), 5,57 (1H, dd, J = 9,8, 2,5 Hz), 5,48 (2H, bs), 3,92–3,85 (1H, m), 3,72–3,64 (1H, m), 2,43–2,34 (1H, m), 2,33 (3H, s), 2,97–2,00 (1H, m), 1,96–1,90 (1H, m), 1,79–1,66 (1H, m), 1,60–1,53 (2H, m).
Beispiel 29: 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäuremethylester
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 3, wobei jedoch 3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamin anstelle von 3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamin verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,48 (1H, s), 8,45 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,13 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,93 (1H, dd, J = 8,3, 1,9 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,58 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,54–7,44 (3H, m), 7,38 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,18 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 7,11 (1H, d, J = 4,9 Hz), 6,87 (1H, t, J = 8,3 Hz), 5,83 (1H, dd, J = 9,4, 2,3 Hz), 3,87 (3H, 1H), 3,93–3,84 (1H, m), 3,77–3,69 (1H, m), 2,46–2,37 (1H, m), 2,34 (3H, s), 2,10–1,4 (2H, m), 1,81–1,53 (3H, m).
Beispiel 30: 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 4, wobei jedoch 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäuremethylester anstelle von 2-[3-[2-(4,6-Dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäuremethylester (Beispiel 3) verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 13,17 (1H, breites s), 9,83 (1H, s), 8,51 (1H, d, J = 5,2 Hz), 8,14 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,95 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,94 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz), 7,73 (1H, s), 7,60 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,59 (1H, s), 7,54 (1H, s), 7,46 (1H, m), 7,37 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,23 (2H, m), 6,86 (1H, t, J = 6,9 Hz), 5,87 (1H, d, J = 7,6H), 3,90 (1H, m), 3,76 (3H, m), 2,45 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,03 (2H, m), 1,77 (1H, m), 1,59 (2H, m).
Beispiel 31: 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-N-prop-2-inyl-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch Propargylamin und 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,87 (1H, s), 9,03 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,53 (1H, s), 7,44 (4H, m), 7,13 (2H, m), 6,91 (1H, t, J = 7,9 Hz), 5,81 (1H, dd, J = 2,2, 9,6 Hz), 4,07 (2H, dd, J = 2,5, 5,5 Hz), 3,89 (1H, m), 3,75 (1H, m), 3,12 (1H, t, J = 2,5 Hz), 2,42 (1H, m), 2,36 (3H, s), 2,00 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,58 (2H, m).
Referenzbeispiel 32: 2-{3-[(E)2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-N-prop-2-inyl-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 7, wobei jedoch 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-N-prop-2-inyl-benzamid anstelle von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl]-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2- yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,93 (s), 9,79 (1H, s), 9,02 (1H, t, J = 5,4 Hz), 8,45 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,45 (4H, m), 7,27 (1H, s), 7,10 (1H, d, J = 4,9 Hz), 7,03 (1H, d, J = 8,8 Hz), 6,90 (1H, t, J = 7,9 Hz), 4,06 (2H, dd, J = 2,4, 5,4 Hz), 3,12 (1H, t, J = 2,4 Hz), 2,35 (3H, s).
Anal. berechnet für C₂₅H₂₁N₅O·0,35CH₂Cl₂: C, 69,64; H, 5,00; N, 16,02. Gefunden: C, 69,65; H, 5,15; N, 15,80.
Beispiel 33: N-(2-Methyl-allyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch 2-Methyl-allylamin und 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,86 (1H, s), 8,81 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,75 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,54 (1H, s), 7,50 (1H, t, J = 16,4 Hz), 7,43 (3H, m), 7,11 (2 H, m), 6,92 (1H, t, J = 8,1 Hz), 5,81 (1H, dd, J = 2,5, 9,8 Hz), 4,83 (2H, d, J = 11,5 Hz), 3,81 (4H, m), 2,41 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2,00 (2H, m), 1,76 (1H, m), 1,73 (3 H, s), 1,58 (2H, m).
Anal. berechnet für C₃₁H₃₃N₅O₂·0,80TBME: C, 72,71; H, 7,43; N, 12,11. Gefunden: C, 72,43; H, 7,57; N, 12,02.
Referenzbeispiel 34: N-(2-Methyl-allyl)-2-{[(E)-2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 7, wobei jedoch N-(2-Methyl-allyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl]-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,90 (1H, s), 9,76 (1H, s), 8,80 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,45 (1H, d, J = 5,1 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,75 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,51 (1H, s), 7,48 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,43 (2H, m), 7,24 (1H, s), 7,10 (1H, d, J = 4,9 Hz), 7,00 (1H, dd, J = 1,9, 8,9 Hz), 6,91 (1H, t, J = 8,1 Hz), 4,82 (2H, d, J = 11,3 Hz), 3,83 (2H, d, J = 5,8 Hz), 2,35 (3H, s), 1,73 (3H, s).
Anal. berechnet für C₂₆H₂₅N₅O·0,20H₂O: C, 73,11; H, 5,99; N, 16,40. Gefunden: C, 73,13; H, 6,03; N, 16,13.
Beispiel 35: N-(3-Cyclopropyl-prop-2-inyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und 3-Cyclopropyl-prop-2-inylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9,88 (1H, bs), 8,93 (1H, bt), 8,46 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,54–7,40 (5H, m), 7,14–7,11 (2H, m), 6,90 (1H, t, J = 6,1 Hz), 5,81 (1d, J = 7,5 Hz), 4,02 (2H, d, J = 3,6 Hz), 3,95–3,85 (1H, m), 3,79–3,72 (1H, m), 2,49–2,35 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2,15–2,01 (2H, m), 1,87–1,55 (3H, m), 1,30–1,25 (1H, m), 0,77–0,70 (2H, m), 0,59–0,54 (2H, m).
Referenzbeispiel 36: N-(3-Cycloprop-2-inyl)-2-{3-[(E)-2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 7, wobei jedoch N-(3-Cycloprop-2-inyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl]-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 12,91 (1H, s), 9,79 (1H, s), 8,91 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,87 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,67 (1H, dd, J = 7,9, 1,5 Hz), 7,50–7,35 (4H, m), 7,24 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,09 (1H, d, J = 4,9 Hz), 7,00 (1H, dd, J = 8,7, 1,5 Hz), 6,88 (1H, dt, J = 4,1, 1,5 Hz), 4,00 (2H, dd, J = 5,3, 1,9 Hz), 2,34 (3H, s), 1,31–1,23 (1H, m), 0,75–0,69 (2H, m), 0,56–0,52 (2H, m).
Referenzbeispiel 37: 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino]-N-pyridin-2-ylmethyl-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6 und Beispiel 7, wobei jedoch 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und C-Pyridin-2-yl-methylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz), δ 12,91 (1H, s), 9,77 (1H, s), 9,19 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,50 (1H, d, J = 4,1 Hz), 8,45 (1H, d, J = 5,0 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,82–7,70 (2H, m), 7,51–7,25 (7H, m), 7,10 (1H, d, J = 4,6 Hz), 6,98 (1H, dd, J = 8,8, 1,8 Hz), 6,96–6,91 (1H, m), 4,58 (2H, d, J = 5,9 Hz), 2,35 (3H, s).
ESIMS m/z 461 (M + H)⁺.
Anal. berechnet für C₂₈H₂₄N₆O × 0,3MTBE: C, 72,71; H, 5,77; N, 17,25. Gefunden: C, 72,38; H, 5,80; N, 16,88.
Referenzbeispiel 38: 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino]-N-pyridin-4-ylmethyl-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6 und Beispiel 7, wobei jedoch 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und C-Pyridin-4-yl-methylamin verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) δ 12,90 (1H, s), 9,73 (1H, s), 9,21 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,49–8,44 (3H, m), 8,06 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,81 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,51–7,40 (4H, m), 7,31 (2H, d, J = 5,9 Hz), 7,24 (1H, s), 7,11 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,00 (1H, dd, J = 8,7, 1,7 Hz), 6,97–6,92 (1H, m), 4,50 (2H, d, J = 5,9 Hz), 2,35 (3H, s).
ESIMS m/z 461 (M + H)⁺.
Anal. berechnet für C₂₈H₂₄N₆O × 0,4H₂O × 0,7MTBE: C, 71,36; H, 6,45; N, 15,85. Gefunden: C, 71,27; H, 6,29; N, 15,53.
Referenzbeispiel 39: N-(6-Methyl-pyridin-2-ylmethyl)-2-{3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6 und Beispiel 7, wobei jedoch 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und C-(6-Methyl-pyridin-2-yl)-methylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) δ 12,92 (1H, s), 9,76 (1H, s), 9,20 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,05 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,81 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,59 (1H, t, J = 7,7 Hz), 7,49–7,37 (4H, m), 7,23 (1H, s), 7,11–7,08 (3H, m), 6,99 (1H, dd, J = 8,7, 1,6 Hz), 6,95–6,90 (1H, m), 4,51 (2H, d, J = 5,9 Hz), 2,42 (3H, s), 2,33 (3H, s).
ESIMS m/z 475 (M + H)⁺.
Anal. berechnet für C₂₉H₂₆N₆O × 0,4DCM: C, 68,98; H, 5,29; N, 16,39. Gefunden: C, 68,84; H, 5,42; N, 16,20.
Beispiel 40: N-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-ylmethyl)-2-[(E)-3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und C-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-yl)-methylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,81 (1H, s), 9,05 (1H, bt), 8,46 8,7 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,71 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,54–7,40 (5H, m), 7,11–7,09 (2H, m), 6,91 (1H, t, J = 6,9 Hz), 5,94 (1H, s), 5,80 (1H, d, J = 7,3 Hz), 4,45 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,93–3,85 (1H, m), 3,78–3,69 (1H, m), 3,73 (3H, s), 2,45–2,35 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,06–1,95 (2H, m), 1,85–1,53 (m, 3H).
Referenzbeispiel 41: N-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-ylmethyl)-2-[(E)-3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 7, wobei jedoch N-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-ylmethyl)-2-[(E)-3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-[4-(tert- Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,90 (1H, s), 9,70 (1H, s), 9,03 (1H, t, J = 6,0 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,87 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,50–7,38 (4H, m), 7,22 (1H, s), 7,1 (1H, d, J = 5,6 Hz), 6,99 (1H, dd, J = 8,7, 1,5 Hz), 6,90 (1H, dt, J = 7,9, 1,9 Hz), 5,91 (1H, s), 4,43 (2H, d, J = 5,6 Hz), 3,72 (3H, s), 2,34 (3H, s), 2,05 (3H, s).
Beispiel 42: 1-Methyl-1H-benzimidazol-2-carbaldehydoxim
Zu einer gerührten Suspension von 1-Methyl-1H-benzimidazol-2-carbaldehyd (980 mg, 6,61 mmol) in H₂O (10 ml) wurde eine Lösung von Natriumacetat (3,25 g, 39,68 mmol) und Hydroxylaminhydrochlorid (1,38 g, 19,84 mmol) in 10 ml H₂O gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und der dicke Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 1,02 g (94%) eines weißen Feststoffs erhalten wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,06 (1H, s), 8,28 (1H, s), 7,65 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,60 (1H, d, J = 6,8 Hz), 7,32 (1H, t, J = 7,2 Hz), 7,23 (1H, t, J = 6,8 Hz), 4,00 (3H, s). Anal. berechnet für C₉H₉N₃O: C, 61,70; H, 5,18; N, 23,99. Gefunden: C, 61,80; H, 5,23; N, 23,98.
Beispiel 43: C-(1-Methyl-1H-benzimidazol-2-yl)-methylamindihydrochlorid
Eine Parr-Druckflasche wurde mit l-Methyl-1H-benzimidazol-2-carbaldehydoxim M (267 mg, 1,6 mmol), 10% Palladium auf Kohle (75 mg), konz. HCl (2 Tropfen) und EtOH (25 ml) beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde unter 45 psi H₂ 2 h geschüttelt, bevor der Katalysator durch Filtration entfernt wurde. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand wurde mit Et₂O verrieben, wobei 340 mg (90%) eines weißen Feststoffs als das Dihydrochloridsalz erhalten wurden und ohne weitere Reinigung verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 8,87 (2H, breites s), 7,72 (2H, m), 7,38 (2H, m), 4,50 (2H, 2), 3,98 (3H, s)
Beispiel 44: N-(1-Methyl-1H-benzimidazol-2-ylmethyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch C-(1-Methyl-1H-benzimidazol-2-yl)-methylaminhydrochlorid N und 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,82 (1H, s), 9,20 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,46 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,74 (1H, d, H = 7,3 Hz), 7,58 (1H, d, J = 7,2 Hz), 7,50 (6H, m), 7,19 (4H, m), 6,92 (1H, t, J = 8,1 Hz), 5,78 (1H, dd, J = 2,5, 9,5 Hz), 4,79 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,89 (1H, m), 3,83 (3H, s), 3,71 (1H, m), 2,41 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2,00 (2H, m), 1,74 (1H, m), 1,57 (2H, m).
Anal. berechnet für C₃₆H₃₅N₇O₂·0,65Hexane: C, 73,31; H, 6,80; N, 15,00. Gefunden: C, 72,92; H, 6,90; N, 14,71.
Referenzbeispiel 45: N-(1-Methyl-1H-benzimidazol-2-ylmethyl)-2-{3-[(E)-2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 7, wobei jedoch N-(1-Methyl-1H-benzimidazol-2-ylmethyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-[4-(tert-Butyldimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl]-2-[3-[2-(4,6-dimethylpyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydropyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,93 (1H, s), 9,73 (1H, s), 9,19 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,45 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,74 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,60–7,36 (6H, m), 7,29–7,14 (3H, m), 7,10 (1H, d, J = 4,7 Hz), 7,04 (1H, dd, J = 1,8, 8,9 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,3 Hz), 4,79 (2H, d, J = 5,3 Hz), 3,83 (3H, s), 2,35 (3H, s).
Anal. berechnet für C₃₁H₂₇N₇O·1,80H₂O·0,40CH₂Cl₂: C, 65,02; H, 5,46; N, 16,91. Gefunden: C, 64,97; H, 5,82; N, 17,09.
Beispiel 46: 1-Methyl-1H-imidazol-2-carbaldehydoxim
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 39, wobei jedoch 1-Methyl-1H-imidazol-2-carbaldehyd anstelle von 1-Methyl-1H-benzimidazol-2-carbaldehyd verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 11,50 (1H, s), 8,05 (1H, s), 7,28 (1H, s), 6,95 (1H, s), 3,80 (3H, s).
Anal. berechnet für C₅H₇N₃O: C, 47,99; H, 5,64; N, 33,58. Gefunden: C, 48,22; H, 5,58; N, 33,45.
Beispiel 47: C-(1-Methyl-1H-imidazol-2-yl)-methylamindihydrochlorid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 40, wobei jedoch 1-Methyl-1H-imidazol-2-carbaldehydoxim anstelle von 1-Methyl-1H-benzimidazol-2-carbaldehydoxim verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 7,45 (1H, s), 7,29 (1H, s), 4,25 (21H, s), 3,79 (3H, s).
Beispiel 48: N-(1-Methyl-1H-imidazol-2-ylmethyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch C-(1-Methyl-1H-imidazol-2-yl)-methylaminhydrochlorid und 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,83 (1 H s), 9,03 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,45 (1H, d, J = 4,7 Hz), 8,09 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,5 Hz), 8,67 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,53–7,39 (4H, m), 7,11 (3H, m), 6,90 (1H, d, J = 6,9 Hz), 6,86 (1H, s), 5,79 (1H, d, H = 8,9 Hz), 5,75 (1H, s), 4,54 (1H, d, J = 5,5 Hz), 3,85–3,70 (2H, m), 3,66 (2H, s), 2,35 (3H, s), 2,10 (2H, m), 1,70 (2H, m), 1,60 (3H, m).
Anal. berechnet für C₃₂H₃₃N₇O₂·0,8CH₂Cl₂: C, 63,99; H, 5,672; N, 15,93. Gefunden: C, 63,95; H, 5,72; N, 16,01.
Referenzbeispiel 49: N-(1-Methyl-1H-imidazol-2-ylmethyl)-2-{3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 7, wobei jedoch N-(1-Methyl-1H-imidazol-2-ylmethyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl]-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,89 (1H, s), 9,72 (1H, s), 8,99 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,05 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,66 (1H, d, J = 6,7 Hz), 7,49–7,36 (4H, m), 7,24 (1H, m), 7,09 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,02 (1H, d, J = 8,8 Hz), 6,88 (1H, t, J = 6,9 Hz), 6,81 (1H, s), 4,52 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,29 (3H, s), 2,34 (3H, s).
Anal. berechnet für C₂₇H₂₅N₇O·0,35CH₂Cl₂: C, 66,59; H, 5,25; N, 19,88. Gefunden: C, 66,48; H, 5,65; N, 19,56.
Beispiel 50: N-(4-Hydroxy-but-2-inyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für obiges Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-[2-(4-Methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und 4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 9,48 (H s), 8,46 (1H, d, J = 5,3 Hz), 7,92 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,52 (1H, d, H = 16,6 Hz), 7,46–7,41 (2H, m), 7,34–7,31 (3H, m), 7,12 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 6,99 (1H, d, J = 4,9 Hz), 6,81 (1H, t, J = 6,8 Hz), 6,40 (1H, t, J = 4,9 Hz), 5,62 (1H, dd, J = 9,4, 3,0 Hz), 4,28–4,23 (4H, m), 4,08–4,01 (1H, m), 3,76–3,67 (1H, m), 2,63–2,49 (1H, m), 2,38 (3H, s), 2,22–2,06 (2H, m), 1,80–1,60 (3H, m).
Referenzbeispiel 51: 2-{3-[(E)-2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-N-(4-hydroxy-but-2-inyl)-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 7, wobei jedoch ein Gemisch von N-(4-Hydroxy-but-2-inyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid und N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-[2-(4-methyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-[2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1-(tetrahydro-pyran-2-yl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,92 (1H, s), 9,83 (1H, s), 9,00 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,87 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,68 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,50–7,38 (4H, m), 7,26 (1H, s), 7,09 (1H, d, J = 5,3 Hz), 7,01 (1H, dd, J = 8,7, 1,5 Hz), 6,88 (1H, dt, J = 6,8, 1,5 Hz), 5,11 (1H, t, J = 3,0 Hz), 4,10–4,04 (4H, m), 2,34 (3H, s).
Beispiel 52: 2-[3-(Pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamin]-benzoesäuremethylester
Hergestellt gemäß der Beschreibung für die obigen Beispiele 2 und 3, wobei jedoch von 6-Nitro-3-styryl-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol statt von 6-Iod-3-styryl-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol ausgegangen wurde.
Dieses Material wurde als rohes Gemisch von Produkt und 2-Amino-benzoesäuremethylester in die nächste Stufe weitergeführt.
Beispiel 53: 2-[3-(Pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure
Isoliert als Nebenprodukt aus der Reaktion von N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl]-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid und TRAF unter Verwendung eines Verfahrens ähnlich Beispiel 11 in der US-Anmeldung des Aktenzeichens 09/609 335 , eingereicht am 30. Juni 2000, die hierin in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke aufgenommen ist.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,19 (1H, breites s), 10,00 (1H, s), 9,13 (1H, s), 8,37 (1H, d, J = 8,7 Hz), 8,06 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,75 (1H, s), 7,64 (2H, t, J = 2,3 Hz), 7,54 (2H, m), 7,35 (1H, dd, J = 1,9, 8,7 Hz), 6,99 (1H, m), 6,33 (2H, t, J = 2,3 Hz), 5,89 (2H, s), 3,68 (2H, t, J = 8,1 Hz), 0,94 (2H, t, J = 8,1 Hz), 0,00 (9H, s).
Beispiel 54: N-(3-Cyclopropyl-prop-2-inyl)-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der obigen Beschreibung für Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-(Pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und 3-Cyclopropyl-prop-2-inylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,93 (1H, s), 8,99 (1H, s), 8,95 (1H, d, J = 5,6 Hz), 8,20 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,68 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,51 (4H, m), 7,37 (1H, t, J = 6,8 Hz), 7,14 (1H, d, J = 9,0 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,5 Hz), 6,21 (2H, t, J = 2,3 Hz), 5,74 (2H, s), 4,00 (2H, dd, J = 2,0, 5,6 Hz), 3,55 (2H, t, J = 7,9 Hz), 1,26 (1H, m), 0,82 (2H, t, J = 7,9 Hz), 0,72 (2H, m), 0,54 (2H, m), –0,12 (9H, s).
Referenzbeispiel 55: N-(3-Cyclopropyl-prop-2-inyl)-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 11 in der US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/609 335 , eingereicht am 30. Juni 2000, wobei jedoch N-(3-Cyclopropyl-prop-2-inyl)-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-Methyl-N-{3-styryl-1-[2-trimethyl-silanyl)-ethoxymethyl]-1H-indazol-6-yl}-benzol-1,3-diamin verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,29 (1H, s), 9,83 (1H, s), 8,98 (1H, s), 8,95 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,19 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,68 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,52 (2H, t, J = 2,3 Hz), 7,43 (2H, m), 7,29 (1H, s), 7,07 (1H, dd, J = 1,9, 8,7 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,4 Hz), 6,21 (2H, t, J = 2,3 Hz), 4,01 (2H, dd, J = 1,7, 5,5 Hz), 1,27 (1H, m), 0,73 (2H, m), 0,55 (2H, m).
Anal. berechnet für C₂₅H₂₂N₆O·0,05Hexane·0,30H₂O: C, 70,31; H, 5,43; N, 19,45. Gefunden: C, 70,63; H, 5,38; N, 19,18.
Beispiel 56: N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl]-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der obigen Beschreibung für Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-(Pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und 4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,04 (1H, s), 9,16 (1H, t, J = 5,3 Hz), 9,10 (1H, s), 8,31 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,78 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,67 (4H, m), 7,49 (1H, t, J = 8,5 Hz), 7,24 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 7,03 (1H, t, J = 7,4 Hz), 6,33 (2H, t, J = 2,3 Hz), 5,85 (2H, s), 4,83 (2H, s), 4,19 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,66 (2H, t, J = 7,9 Hz), 0,94 (2H, m), 0,89 (9H, s), 0,13 (6H, s), 0,00 (9H, s).
Referenzbeispiel 57: N-(4-Hydroxy-but-2-inyl)-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 11 in der US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/609 335 , eingereicht am 30. Juni 2000, wobei jedoch N-[4-(tert-Butyl-dimethyl-silanyloxy)-but-2-inyl)-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-Methyl-N-{3-styryl-1-[2-trimethyl-silanyl)-ethoxymethyl]-1H-indazol-6-yl}-benzol-1,3-diamin verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,30 (1H, s), 9,87 (1H, s), 9,04 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,99 (1H, s), 8,19 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,46 (4H, m), 7,31 (1H, s), 7,08 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,3 Hz), 6,21 (2H, t, J = 2,1 Hz), 5,14 (1H, t, J = 5,8 Hz), 4,10 (2H, d, J = 5,5 Hz), 4,06 (2H, d, J = 5,8 Hz).
Anal. berechnet für C₂₃H₂₀N₆O₂·0,35Hexane·0,20H₂O: C, 67,45; H, 5,86; N, 18,81. Gefunden: C, 67,70; H, 5,73; N, 18,56.
Beispiel 58: 2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-carbonitril
2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-carbonitril wurde aus Ethyl-1,3-dimethylpyrazol-5-carboxylat nach Verfahren, die für 1-Methyl-pyrazol-5-carbonitril von Castellanos, Maria und Montserrat, Llinas; JCS Perkins Trans I (1985) 1209–1215, veröffentlicht wurden, hergestellt.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 6,52 (1H, s), 3,96 (3H, s), 2,27 (3H, s).
Beispiel 59: C-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-yl)-methylamin
Eine Suspension von 2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-carbonitril (654 mg, 5,4 mmol) und 10% Palladium auf Kohle (200 mg) in Ethanol (15 ml) wurde in einer Parr-Hydriervorrichtung unter 45 psi H₂ 17 h geschüttelt. Das Gemisch wurde über Celite filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 608 mg eines Öls erhalten wurden, das ohne eine weitere Reinigung verwendet wurde.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 5,91 (1H, s), 3,81, 3,73 (2H, 2 s), 3,75 (3H, s), 2,21 (3H, s).
Beispiel 60: N-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-ylmethyl)-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der obigen Beschreibung für Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-(Pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und C-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-yl)-methylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 9,56 (1H, s), 8,68 (1H, s), 8,30 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,49 (1H, d, J = 8,3 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 7,9, 1,5 Hz), 7,36–7,31 (2H, m), 7,23 (2H, t, J = 2,6 Hz), 7,17 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 6,83 (1H, t, J = 7,2 Hz), 6,32 (1H, bt), 6,29 (2H, t, J = 2,3 Hz), 6,01 (1H, s), 5,67 (2H, s), 4,61 (2H, d, J = 5,6 Hz), 3,60 (3H, s), 3,58 (2H, t, J = 8,3 Hz), 2,22 (3H, s), 0,90 (2H, t, J = 8,7 Hz), 0,06 (9H, s).
Referenzbeispiel 61: N-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-ylmethyl)-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 11 in der US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/609 335 , eingereicht am 30. Juni 2000, wobei jedoch N-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-ylmethyl)-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid anstelle von N-Methyl-N-{3-styryl-1-[2-trimethyl-silanyl)-ethoxymethyl]-1H-indazol-6-yl}-benzol-1,3-diamin verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,27 (1H, s), 9,72 (1H, s), 9,05 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,97 (1H, s), 8,16 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,68 (1H, dd, J = 8,3, 1,9 Hz), 7,50 (2H, t, J = 2,6 Hz), 7,46–7,38 (2H, m), 7,25 (1H, s), 7,05 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 6,91 (1H, t, J = 6,80 Hz), 6,20 (2H, t, J = 2,3 Hz), 5,91 (1H, s), 4,43 (2H, d, J = 5,6 Hz), 3,71 (3H, s), 2,04 (3H, s).
Referenzbeispiel 62: 2-[3-(Pyrrol-1-yliminomethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure
Hergestellt gemäß der Beschreibung für Beispiel 11 in der US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/609 335 , eingereicht am 30. Juni 2000, wobei jedoch 2-[3-(Pyrrol-1-yliminomethyl)-1-(2-trimethylsilanyl-ethoxymethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure anstelle von N-Methyl-N-{3-styryl-1-[2-trimethyl-silanyl)-ethoxymethyl]-1H-indazol-6-yl}-benzol-1,3-diamin verwendet wurde.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,12 (1H, s), 12,70 (1H, s), 8,94 (1H, s), 8,10 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,91 (1H, dd, J = 1,7, 7,7 Hz), 7,50 (2H, t, J = 2,3 Hz), 7,36 (1H, t, J = 7,9 Hz), 7,27 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,16 (1H, t, J = 7,5 Hz), 6,94 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 6,68 (1H, t, J = 7,5 Hz), 6,19 (2H, t, J = 2,3 Hz).
Referenzbeispiel 63: N-Prop-2-inyl-2-[3-(pyrrol-1-yliminomethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der obigen Beschreibung für Beispiel 6, wobei jedoch 2-[3-(Pyrrol-1-yliminomethyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoesäure und Propargylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,30 (1H, s), 9,82 (1H, s), 9,04 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,98 (1H, s), 8,19 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,45 (4H, m), 7,31 (1H, s), 7,08 (1H, d, J = 8,6 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,6 Hz), 6,21 (2H, s), 4,05 (2H, s), 3,13 (1H, s).
Anal. berechnet für C₂₂H₁₉N₆O·0,40H₂O·0,05Hexane: C, 67,97; H, 5,01; N, 21,33. Gefunden: C, 67,91; H, 4,78; N, 21,00.
Referenzbeispiel 64: N-(4-Hydroxy-but-2-inyl)-2-[3-(2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der obigen Beschreibung für Beispiel 6, wobei jedoch Tetrabutylammonium-2-[3-(2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoat und 4-Amino-but-2-in-1-ol verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,95 (1H, s), 9,84 (1H, s), 9,02 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,59 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,90 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,80 (1H, t, J = 7,2 Hz), 7,70–7,64 (2H, m), 7,51 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,45–7,36 (2H, m), 7,27–7,24 (2H, m), 7,02 (1H, d, J = 9,0 Hz), 6,88 (1H, t, J = 7,2 Hz), 5,13 (1H, t, J = 5,6 Hz), 4,10–4,04 (4H, m).
Referenzbeispiel 65: N-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazol-3-ylmethyl)-2-[3-(2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzamid
Hergestellt gemäß der obigen Beschreibung für Beispiel 6, wobei jedoch Tetrabutylammonium-2-[3-(2-pyridin-2-yl-vinyl)-1H-indazol-6-ylamino]-benzoat und C-(2,5-Dimethyl-2H-pyrazo-3-yl)-methylamin verwendet wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,93 (1H, s), 9,70 (1H, s), 9,04 (1H, bt), 8,58 (1H, d, J = 4,0 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,79 (1H, t, J = 8,6 Hz), 7,71–7,64 (2H, m), 7,50 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,44–7,39 (2H, m), 7,28–7,23 (2H, m), 7,00 (1H, d, J = 8,8 Hz), 6,90 (1H, t, J = 8,0 Hz), 5,91 (1H, s), 4,43 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,71 (3H, s), 2,04 (3H, s).
Die oben beschriebenen Beispielverbindungen können auf deren Aktivität unter Verwendung der im folgenden beschriebenen Tests getestet werden.
BIOLOGISCHE TESTS: ENZYMASSAYS
Die Stimulation der Zellproliferation durch Wachstumsfaktoren wie VEGF, FGF und andere ist von deren Induktion der Autophosphorylierung der einzelnen jeweiligen Rezeptortyrosinkinasen abhängig. Daher kann die Fähigkeit eines Proteinkinaseinhibitors zur Blockierung der Autophosphorylierung durch Hemmung der Peptidsubstrate ermittelt werden. Zur Ermittlung der Proteinkinasehemmaktivität der Verbin dungen wurden die im folgenden angegebenen Konstrukte ersonnen.
VEGF-R2-Konstrukt für Assay:
Dieses Konstrukt bestimmt die Fähigkeit einer Testverbindung zur Hemmung von Tyrosinkinaseaktivität. Ein Konstrukt (VEGF-R2Δ50) der Cytosoldomäne des humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (VEGF-R2), dem die 50 zentralen Reste der 68 Reste der Kinaseinsertdomäne fehlen, wurde in einem Baculovirus/Insektenzellensystem exprimiert. Von den 1356 Resten von VEGF-R2 voller Länge enthält VEGF-R2Δ50 die Reste 806–939 und 990–1171 und auch eine Punktmutation (E990V) innerhalb der Kinaseinsertdomäne, bezogen auf Wildtyp-VEGF-R2. Die Autophosphorylierung des gereinigten Konstrukts wurde durch Inkubation des Enzyms mit einer Konzentration von 4 μM in Gegenwart von 3 mM ATP und 40 mM MgCl₂ in 100 mM HEPES, pH 7,5, das 5% Glycerin und 5 mM DTT enthielt, bei 4°C während 2 h durchgeführt. Nach der Autophosphorylierung wurde für dieses Konstrukt gezeigt, dass es katalytische Aktivität besitzt, die im wesentlichen äquivalent zu dem autophosphorylierten Kinasedomänekonstrukt des Wildtyps ist. Siehe Parast et al., Biochemistry, 37, 16788–16801 (1998).
FGF-R1-Konstrukt für Assay:
Die intrazelluläre Kinasedomäne von humanem FGF-R1 wurde unter Verwendung des Baculovirus-Vektor-Expressionssystems ausgehend von dem endogenen Methioninrest 456 bis Glutamat 766 entsprechend dem Restnummerierungssystem von Mohammadi et al., Mol. Cell. Biol., 16, 977–989 (1996) exprimiert. Ferner weist das Konstrukt auch die folgenden 3 Aminosäuresubstitutionen auf: L457V, C488A und C548S.
LCK-Konstrukt für Assay:
Die LCK-Tyrosinkinase wurde in Insektenzellen als N-termi nale Deletion ausgehend vom Aminosäurerest 223 bis zum Ende des Proteins am Rest 509 mit den folgenden zwei Aminosäuresubstitutionen am N-Terminus: P233M und C224D exprimiert.
CHK1-Konstrukt für Assay:
Am C-Terminus His-etikettiertes humanes CHK1 voller Länge (FL-CHK1) wurde unter Verwendung des Baculovirus/Insektenzellensystems exprimiert. Es enthält 6 Histidinreste (6 × His-Tag) am C-Terminus des humanen CHK1 mit 476 Aminosäuren. Das Protein wurde durch herkömmliche chromatographische Techniken gereinigt.
CDK2/Cyclin-A-Konstrukt für Assay:
CDK2 wurde unter Verwendung veröffentlichter Verfahren (Rosenblatt et al., J. Mol. Biol., 230, 1317–1319 (1993)) ausgehend von Insektenzellen, die mit einem Baculovirus-Expressionsvektor infiziert worden waren, gereinigt. Cyclin A wurde ausgehend von E. coli-Zellen, die rekombinantes Cyclin A voller Länge exprimieren, gereinigt und ein verkürztes Cyclin-A-Konstrukt wurde durch begrenzte Proteolyse erzeugt und wie zuvor beschrieben gereinigt (Jeffrey et al., Nature, 376, 313–320 (1995)).
CDK4/Cyclin-D-Konstrukt für Assay:
Ein Komplex von humanem CDK4 und Cyclin D3 oder ein Komplex von Cyclin D1 und einem Fusionsprotein von humanem CDK4 und Glutathion-S-Transferase (GST-CDK4) wurde unter Verwendung herkömmlicher biochemischer chromatographischer Techniken ausgehend von Insektenzellen, die mit den entsprechenden Baculovirus-Expressionsvektoren co-infiziert worden waren, gereinigt.
FAK-Konstrukt für Assay:
Die katalytische Domäne von humanem FAK (FAKcd409) wurde unter Verwendung des Baculovirus-Vektor-Expressionssystems exprimiert. Die exprimierte Domäne von 280 Aminosäuren umfasst die Reste Methionin 409 bis Glutamat 689. Eine Aminosäuresubstitution (P410T) existiert, bezogen auf. die Sequenz der Hinterlegungsnummer L13616, veröffentlicht von G. S. Whithey et al., DNA Cell Biol, 9, 823–30 (1993). Das Protein wurde unter Verwendung klassischer chromatographischer Techniken gereinigt.
TIE-2(TEK)-Konstrukt für Assay:
Die TIE-2-Tyrosinkinasedomäne wurde in Insektenzellen als N-terminale Deletion ausgehend von dem Aminosäurerest 774 bis zum Ende des Proteins am Rest 1124 exprimiert. Dieses Konstrukt trägt ebenfalls eine R774M-Mutation, die als der Start-Methioninrest bei der Translation dient.
VEGF-R2-Assay
Gekoppelter spektrophotometrischer (FLVK-P)-Assay
Die Produktion von ADP aus ATP, die einen Phosphoryltransfer begleitet, wurde mit der Oxidation von NADH unter Verwendung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und einem System mit Pyruvatkinase (PK) und Milchsäuredehydrogenase (LDH) gekoppelt. Die Oxidation von NADH wurde durch Verfolgen der Abnahme der Extinktion bei 340 nm (e₃₄₀ = 6,22 cm^–1mM^–1) unter Verwendung eines Beckman DU 650-Spektrophotometers überwacht. Die Assaybedingungen für phosphoryliertes VEGF-R2Δ50 (in den folgenden Tabellen als FLVK-P angegeben) waren die folgenden: 1 mM PEP, 250 μM NADH, 50 Einheiten LDH/ml, 20 Einheiten PK/ml, 5 mM DTT, 5,1 mM Poly(E₄Y₁), 1 mM ATP und 25 mM MgCl₂ in 200 mM HEPES, pH 7,5. Die Assaybedingungen für nicht-phosphoryliertes VEGF-R2Δ50 (in den folgenden Tabellen als FLVK angegeben) waren die folgenden: 1 mM PEP, 250 μM NADH, 50 Einheiten LDH/ml, 20 Einheiten PK/ml, 5 mM DTT, 20 mM Poly(E₄Y₁), 3 mM ATP und 60 mM MgCl₂ und 2 mM MnCl₂, in 200 mM HEPES, pH 7,5. Die Assays wurden mit 5 bis 40 nM Enzym initiiert. K_i-Werte wurden durch Ermitteln der Enzymaktivität in Gegenwart variierender Konzentrationen von Testverbindungen bestimmt. Die Daten wurden unter Verwendung von Enzymkinetik- und Kaleidagraph-Software analysiert.
ELISA-Assay
Die Bildung von Phosphogastrin wurde unter Verwendung von biotinyliertem Gastrinpeptid (1–17) als Substrat überwacht. Biotinyliertes Phosphogastrin wurde unter Verwendung von streptavidinbeschichteten 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten immobilisiert und anschließend unter Verwendung von mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Antiphosphotyrosin-Antikörper detektiert. Die Aktivität von Meerrettichperoxidase wurde unter Verwendung von 2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzathiazolin-sulfonat(6)]-diammoniumsalz (ABTS) überwacht. Typische Assaylösungen enthielten: 2 μM biotinyliertes Gastrinpeptid, 5 mM DTT, 20 μM ATP, 26 mM MgCl₂ und 2 mM MnCl₂ in 200 mM HEPES, pH 7,5. Der Assay wurde mit 0,8 nM phosphoryliertem VEGF-R2Δ50 initiiert. Die Meerrettichperoxidaseaktivität wurde unter Verwendung von 10 mM ABTS getestet. Die Meerrettichperoxidasereaktion wurde durch Zugabe von Säure (H₂SO₄) gequencht, worauf die Ablesung der Extinktion bei 405 nm folgte. K_i-Werte wurden durch Ermitteln der Enzymaktivität in Gegenwart variierender Konzentrationen von Testverbindungen bestimmt. Die Daten wurden unter Verwendung von Enzymkinetik- und Kaleidagraph-Software analysiert.
FGF-R-Assay
Der spektrophotometrische Assay wurde wie oben für VEGF-R2 beschrieben durchgeführt, wobei jedoch folgende Änderungen der Konzentration erfolgten: FGF-R = 50 nM, ATP = 2 mM und Poly(E₄Y₁) = 15 mM.
LCK-Assay
Der spektrophotometrische Assay wurde wie oben für VEGF-R2 beschrieben durchgeführt, wobei jedoch folgende Änderungen der Konzentration erfolgten: LCK = 60 nM, MgCl₂ = 0 mM, Poly(E₄Y₁) = 20 mM.
CHK1-Assay
Die Produktion von ADP aus ATP, die den Phosphoryltransfer zu dem synthetischen Substratpeptid Syntide-2 (PLARTLSVAGLPGKK) begleitet, wurde mit der Oxidation von NADH unter Verwendung von Phosphoenolpyruvat (PEP) durch die Wirkungen von Pyruvatkinase (PK) und Milchsäuredehydrogenase (LDH) gekoppelt. Die Oxidation von NADH wurde durch Verfolgen der Abnahme. der Extinktion bei 340 nm (ε₃₄₀ = 6,22 cm^–1mM^–1) unter Verwendung eines HP8452-Spektrophotometers überwacht. Typische Reaktionslösungen enthielten: 4 mN PEP, 0,15 mM NADH, 28 Einheiten LDH/ml, 16 Einheiten PK/ml, 3 mM DTT, 0,125 mM Syntide-2, 0,15 mM ATP, 25 mM MgCl₂ in 50 mM TRIS, pH 7,5, und 400 mM NaCl. Die Assays wurden mit 10 nM FL-CHK1 initiiert. K_i-Werte wurden durch Ermitteln der Anfangsenzymaktivität in Gegenwart variierender Konzentrationen von Testverbindungen bestimmt. Die Daten wurden unter Verwendung von Enzymkinetik- und Kaleidagraph-Software analysiert.
CDK2/Cyclin-A- und CDK4/Cyclin-D-Assays
Cyclinabhängige Kinaseaktivität wurde durch quantitative Bestimmung des enzymkatalysierten, zeitabhängigen Einbaus von radioaktivem Phosphat von [³²P]ATP in ein rekombinantes Fragment des Retinoblastomproteins ermittelt. Falls nicht anders angegeben, wurden Assays in 96-Vertiefungen-Platten in einem Gesamtvolumen von 50 μl in Gegenwart von 10 mM HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) (pH 7,4), 10 mM MgCl₂, 25 μM Adenosintriphosphat (ATP), 1 mg/ml Ovalbumin, 5 μg/ml Leupeptin, 1 mM Dithiothreit, 10 mM β-Glycerophosphat, 0,1 mM Natriumvanadat, 1 mM Natriumfluorid, 2,5 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), 2% (V/V) Dimethylsulfoxid und 0,03–0,2 μCi [³²P]ATP durchgeführt. Das Substrat (0,3–0,5 μg) war gereinigtes rekombinantes Retinoblastomproteinfragment (Rb) (die Reste 386–928 des nativen Retinoblastomproteins, 62,3 kDa, die den Großteil der Phosphorylierungsstellen, die sich im nativen 106-kDa-Protein finden, sowie ein Tag von sechs Histidinresten zur leichten Reinigung enthalten). Die Reaktionen wurden mit CDK2 (150 nM CDK2/Cyclin-A-Komplex) oder CKD4 (50 nM CDK4/Cyclin-D3-Komplex) initiiert, bei 30°C inkubiert und nach 20 min durch Zugabe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis 250 mM beendet. Das phosphorylierte Substrat wurde dann auf einer Nitrocellulosemembran unter Verwendung eines 96-Vertiefungen-Filtrationsverteilers eingefangen und nicht-eingearbeitete Radioaktivität wurde durch wiederholtes Waschen mit 0,85%-iger Phosphorsäure entfernt. Die Radioaktivität wurde durch Exposition der getrockneten Nitrocellulosemembranen gegenüber einem Phosphorimager quantitativ bestimmt. Scheinbare K_i-Werte wurden durch Testen der Enzymaktivität in Gegenwart verschiedener Verbindungskonzentrationen und Subtraktion der in Abwesenheit von Enzym ermittelten Hintergrundradioaktivität ermittelt. Die kinetischen Parameter (kcat, Km für ATP) wurden für jedes Enzym unter den üblichen Assaybedingungen durch Bestimmen der Abhängigkeit der Anfangsraten von der ATP-Konzentration ermittelt. Die Daten wurden an eine Gleichung zur kompetitiven Hemmung unter Verwendung von Kaleidagraph (Synergy Software) angepasst oder an eine Gleichung zur kompetitiven Hemmung fester Bindung unter Verwendung der Software KineTic (BioKin, Ltd.) angepasst. Die ermittelten K_i-Werte für bekannte Inhibitoren gegen CDK4 und CDK2 stimmten mit veröffentlichten IC₅₀-Werten überein. Die spezifische Aktivität von CDK4 war ungeachtet einer Komplexierung mit Cyclin D3 voller Länge oder dem verkürzten Cyclin-D3-Konstrukt die gleiche; beide Komplexe ergaben ferner sehr ähnliche K_i-Werte für ausgewählte Inhibitoren.
FAK-Assay
FAK HTS verwendete den Fluoreszenzpolarisationsassay, der von LJL Biosystems geliefert wird. Die Kineasereaktion enthielt: 100 mM Hepes pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM ATP und 1 mg/ml Poly Glu-Tyr (4:1). Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 nM FAKcd409 initiiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA und anschließende Zugabe von fluoreszenzmarkiertem Peptid und Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, die beide von LJL Biosystems geliefert werden, beendet. Hemmungsergebnisse werden auf einem Analyst(LJL)-Detektor abgelesen.
TIE-2 spektrophotometrischer Assay
Die kinasekatalysierte Produktion von ADP aus ATP, die den Phosphoryltransfer auf das statistische Copolymer Poly(Glu₄Tyr) begleitet, wurde mit der Oxidation von NADH über die Aktivitäten von Pyruvatkinase (PK) und Milchsäuredehydrogenase (LDH) gekoppelt. Die NADH-Umwandlung in NAD⁺ wurde durch Abnahme der Extinktion bei 340 nm (ε = 6,22 cm^–1 mW^–1) unter Verwendung eines Beckman DU540-Spektrophotometers überwacht. Typische Reaktionslösungen enthielten 1 mM Phosphoenolpyruvat, 0,24 mM NADH, 40 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 2,9 mg/ml Poly(Glu₄Tyr), 0,5 mM ATP, 15 Einheiten/ml PK, 15 Einheiten/ml LDH in 100 mM HEPES, pH 7,5. Die Assays wurden durch Zugabe von 4 bis 12 nM phosphoryliertem Tie-2 (aa 775–1122) initiiert. Die prozentuale Hemmung wurde dreifach mit einer 1 μM Konzentration des Inhibitors bestimmt.
TIE-2-DELFIA-Assay
Die Bildung von Phosphotyrosin wurde unter Verwendung von biotinyliertem p34cdc2 (aa6-20 = KVEKIGEGTYGVVYK)-Peptid als Substrat überwacht. Biotinyliertes Peptid wurde unter Verwendung von mit NeutrAvidin^TM-beschichteten 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten immobilisiert und anschließend unter Verwendung von Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (PY20), der an Europium-Nl-Chelat konjugiert war, detektiert. Typische Assaylösungen enthielten: 1 μM biotinyliertes p34cdc2-Peptid, 150 μM ATP, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01% BSA, 5% Glycerin, 2% DMSO, 25 mM HEPES, pH 7,5. Der Assay wurde in der NeutrAvidin-Platte mit 50 nM der TIE2-intrazellulären-Domäne initiiert. Die Kinasereaktion wurde mit 50 mM EDTA beendet. Die Platten wurden dann gewaschen und Europiumantikörper wurde zugegeben. Nach der Inkubation wurden sie erneut gewaschen und DELFIA^TM Enhancement Solution wurde zugegeben. Die Platten wurden mit zeitaufgelösten Standard-Europium-Einstellungen abgelesen (Anregung 340 nm, Emission 615 nm, Verzögerung 400 μs, Fenster 400 μs). Die prozentuale Hemmung wurde unter Bezug auf Intraplattenvertiefungen, denen DMSO statt Verbindung in DMSO zugesetzt wurde, unter Subtrahieren des Hintergrunds von sowohl Versuch als auch Kontrolle unter Bezug auf eine Intraplattenvertiefung, der EDTA vor Zugabe eines Enzyms zugesetzt wurde, berechnet.
HUVEC-Proliferationsassay
Dieser Assay bestimmt die Fähigkeit einer Testverbindung zur Hemmung der wachstumsfaktorstimulierten Proliferation von humanen Nabelschnurvene-Endothelzellen ("HUVEC"). HUVEC-Zellen (Passage 3–4, Clonetics, Corp.) wurden in EGM2-Kulturmedium (Clonetics Corp) in T75-Kolben aufgetaut. Frisches EGM2-Medium wurde 24 h später zu den Kolben gege ben. Vier oder fünf Tage später wurden die Zellen einem anderen Kulturmedium ausgesetzt (F12K-Medium, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 60 μg/ml Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) und 0,1 mg/ml Heparin ergänzt war). Exponentiell wachsende HUVEC-Zellen wurden in Experimenten danach verwendet. Zehn- bis zwölftausend HUVEC-Zellen wurden in 96-Vertiefungen-Schalen in 100 μl reichem Kulturmedium (oben beschrieben) ausplattiert. Die Zellen wurden 24 h in diesem Medium anheften gelassen. Das Medium wurde dann durch Absaugen entfernt und 105 μl Verknappungsmedium (F12K + 1% FBS) wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 24 h wurden 15 μl Testmittel, das in 1% DMSO in Verknappungsmedium gelöst war, oder dieses Vehikel allein in jede Behandlungsvertiefung gegeben, wobei die DMSO-Endkonzentration 0,1% betrug. 1 h später wurden 30 μl VEGF (30 ng/ml) in Verknappungsmedium zu allen Vertiefungen mit Ausnahme derjenigen, die unbehandelte Kontrollen enthielten, gegeben; wobei die VEGF-Endkonzentration 6 ng/ml betrug. Die Zellproliferation wurde 72 h später durch MTT-Farbstoffreduktion quantitativ bestimmt, wobei die Zellen hierbei 4 h MTT (Promega Corp.) ausgesetzt wurden. Die Farbstoffreduktion wurde durch Zugabe einer Stopplösung (Promega Corp.) gestoppt und die Extinktion bei 595 λ wurde auf einer 96-Vertiefungen-Spektrophotometerplattenlesevorrichtung bestimmt.
IC₅₀-Werte wurden durch Kurvenanpassung der Reaktion von A⁵⁹⁵ auf verschiedene Konzentrationen des Testmittels berechnet; typischerweise wurden sieben um 0,5log getrennte Konzentrationen mit dreifachen Vertiefungen bei jeder Konzentration verwendet. Zum Screening von Verbindungsbibliothekplatten wurden eine oder zwei Konzentrationen (eine Vertiefung pro Konzentration) verwendet und die prozentuale Hemmung wurde durch die folgende Formel berechnet:
% Hemmung = (Kontrolle – Test) ÷ (Kontrolle – Verknappung)
wobei
Kontrolle = A⁵⁹⁵, wenn VEGF ohne Testmittel vorhanden ist
Test = A⁵⁹⁵, wenn VEGF mit Testmittel vorhanden ist
Verknappung = A⁵⁹⁵, wenn VEGF und Testmittel beide nicht vorhanden sind.
Maus-PK-Assay
Die Pharmakokinetik (beispielsweise Absorption und Eliminierung) von Arzneistoffen in Mäusen wurde unter Verwendung des im folgenden angegebenen Experiments analysiert. Testverbindungen wurden als Lösung oder Suspension in einem 30:70 (PEG 400:angesäuertes H₂O) Vehikel oder als Suspension in 0,5% CMC formuliert. Dies wurde oral (p.o.) und intraperitoneal (i.p.) in variablen Dosen zwei verschiedenen Gruppen (n = 4) von B6 weiblichen Mäusen verabreicht. Blutproben wurden durch eine orbitale Blutentnahme an den Zeitpunkten: 0 h (vor Dosisgabe), 0,5 h, 1,0 h, 2,0 h und 4,0 h und 7,0 h nach der Dosisgabe gewonnen. Plasma wurde von jeder Probe durch Zentrifugation mit 2500 rpm während 5 min erhalten. Die Testverbindung wurde aus dem Plasma durch ein organisches Proteinfällungsverfahren extrahiert. Für jeden Blutentnahmezeitpunkt wurden 50 μl Plasma mit 1,0 ml Acetonitril vereinigt, 2 min verwirbelt und dann mit 4000 rpm 15 min zentrifugiert, um das Protein auszufällen und die Testverbindung zu extrahieren. Als nächstes wurde der Acetonitrilüberstand (der die Testverbindung enthaltende Extrakt) in neue Teströhrchen gegossen und auf einer heißen Platte (25°C) unter einem N₂-Gasstrom eingedampft. Zu jedem Röhrchen, das den getrockneten Testverbindungsextrakt enthielt, wurden 125 μl mobile Phase (60:40, 0,025 M NH₄H₂PO₄ + 2,5 ml/l TEA:Acetonitril) gegeben. Die Testverbindung wurde in der mobilen Phase durch Verwirbeln resuspendiert und weiteres Protein wurde durch Zentrifugation mit 4000 rpm während 5 min entfernt. Jede Probe wurde in eine HPLC-Ampulle zur Testverbindungsanalyse auf einem Hewlett Packard 1100 Serie-HPLC mit UV-Detektion gegossen. Für jede Probe wurden 95 01 auf eine Phenomenex-Prodigy Reverse Phase C-18, 150 × 3,2 mm-Säule injiziert und mit einem über 10 min gefahrenen 45–50% Acetonitrilgradienten eluiert. Plasmakonzentrationen der Testverbindung (μg/ml) wurden durch einen Vergleich mit einer Standardkurve (Peakfläche gegen Konzentration μg/ml) unter Verwendung bekannter Konzentrationen der Testverbindung, die in der oben beschriebenen Weise aus Plasmaproben extrahiert wurden, bestimmt. Zusammen mit den Standards und unbekannten Proben wurden drei Gruppen (n = 4) von Qualitätskontrollen (0,25 μg/ml, 1,5 μg/ml und 7,5 μg/ml) durchgeführt, um die Konsistenz der Analyse sicherzustellen. Die Standardkurve wies R2 > 0,99 auf und die Qualitätskontrollen lagen alle innerhalb von 10% von deren erwarteten Werten. Die quantitativ bestimmten Testproben wurden zur optischen Anzeige unter Verwendung von Kalidagraph-Software aufgetragen und deren pharmakokinetische Parameter wurden unter Verwendung von WIN NONLIN-Software bestimmt. Beispiel 1(a) ergab die folgenden Ergebnisse: 0,69 (Maus pK, AUC, ip, μg-h/ml); 0,33 (Maus pK, AUC, po, μg-h/ml).
KDR (VEGFR2)-Phosphorylierung in PAE-KDR-Zellen-Assay
Dieser Assay bestimmt die Fähigkeit einer Testverbindung zur Hemmung der Autophosphorylierung von KDR in Schweineaortaendothel(PAE)-KDR-Zellen. PAE-Zellen, die humanes KDR überexprimieren, wurden in diesem Assay verwendet. Die Zellen wurden in Ham's F12-Medium, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 400 μg/ml G418 ergänzt war, kultiviert. Dreißigtausend Zellen wurden in jede Vertiefung einer 96-Vertiefungen-Platte in 75 μl Wachstumsmedium gesät und 6 h bei 37°C anhaften gelassen. Die Zellen wurden dann Ver knappungsmedium (Ham's F12-Medium, das mit 0,1% FBS ergänzt war) 16 h ausgesetzt. Nach der Beendigung der Verknappungsperiode wurden 10 μl Testmittel in 5% DMSO in Verknappungsmedium zu den Testvertiefungen gegeben und 10 μl Vehikel (5% DMSO in Verknappungsmedium) in die Kontrollvertiefungen gegeben. Die DMSO-Endkonzentration in jeder Vertiefung betrug 0,5%. Die Platten wurden mit 37 μC 1 h inkubiert und die Zellen wurden dann mit 500 mg/ml VEGF (im Handel erhältlich von R & D System) in Gegenwart von 2 mM Na₃VO₄ 8 min stimuliert. Die Zellen wurden einmal mit 1 mm Na₃VO₄ in HBSS gewaschen und durch Zugabe von 50 μl Lysepuffer pro Vertiefung lysiert. 100 μl Verdünnungspuffer wurden dann zu jeder Vertiefung gegeben und das verdünnte Zelllysat wurde in eine 96-Vertiefungen-Ziegen-Anti-Kaninchen-beschichtete-Platte (im Handel von Pierce erhältlich), die mit Kaninchen-Anti-humaner-Anti-FLK-1-C-20-Antikörper vorbeschichtet war, (im Handel von Santa Cruz erhältlich) überführt. Die Platten wurden 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und siebenmal mit 1% Tween 20 in PBS gewaschen. HRP-PY20 (im Handel von Santa Cruz erhältlich) wurde verdünnt und für eine Inkubation von 30 min zu der Platte gegeben. Die Platten wurden dann erneut gewaschen und TMB-Peroxidasesubstrat (im Handel von Kirkegaard & Perry erhältlich) wurde für eine Inkubation von 10 min zugegeben. 100 μl 0,09 N H₂SO₄ wurden zu jeder Vertiefung der 96-Vertiefungen-Platte zum Stoppen der Reaktion gegeben. Der Phosphorylierungsstatus wurde durch Spektrophotometerablesung bei 450 nm festgestellt. IC₅₀-Werte wurden durch Kurvenanpassung unter Verwendung einer Vierparameteranalyse berechnet.
Assay der PAE-PDGFRβ-Phosphorylierung in PAE-PDGFRβ-Zellen
Dieser Assay bestimmt die Fähigkeit einer Testverbindung zur Hemmung der Autophosphorylierung von PEDGRβ in Schweineaortaendothel (PAE)-PDGFRβ-Zellen. PAE-Zellen, die humanes PDGFRβ überexprimieren, wurden in diesem Assay verwendet. Die Zellen wurden in Ham's F12-Medium, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 400 μg/ml G41B ergänzt war, kultiviert. Zwanzigtausend Zellen wurden in jede Vertiefung einer 96-Vertiefungen-Platte in 50 μl Wachstumsmedium gesät und 6 h bei 37°C anhaften gelassen. Die Zellen wurden dann dem Verknappungsmedium (Ham's F12-Medium, das mit 0,1% FBS ergänzt war) 16 h ausgesetzt. Nach der Beendigung der Verknappungsperiode wurden 10 μl Testmittel in 5% DMSO in Verknappungsmedium zu den Testvertiefungen gegeben und 10 μl Vehikel (5% DMSO in Verknappungsmedium) in die Kontrollvertiefungen gegeben. Die DMSO-Endkonzentration in jeder Vertiefung betrug 0,5%. Die Platten wurden bei 37°C 1 h inkubiert und die Zellen wurden dann mit 1 μg/ml PDGF-BB (R & D System) in Gegenwart von 2 mM Na₃VO₄ 8 min stimuliert. Die Zellen wurden einmal mit 1 mm Na₃VO₄ in HBSS gewaschen und durch Zugabe von 50 μl Lysepuffer pro Vertiefung lysiert. 100 μl Verdünnungspuffer wurden dann zu jeder Vertiefung gegeben und das verdünnte Zelllysat wurde in eine 96-Vertiefungen-Ziegen-Anti-Kaninchen-beschichtete-Platte (Pierce), die mit Kaninchen-Anti-humaner-PDGFRβ-Antikörper (Santa Cruz) vorbeschichtet war, überführt. Die Platten wurden 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und siebenmal mit 1% Tween 20 in PBS gewaschen. HRP-PY20 (Santa Cruz) wurde verdünnt und für eine Inkubation von 30 min zu der Platte gegeben. Die Platten wurden dann erneut gewaschen und TMB-Peroxidasesubstrat (Kirkegaard & Perry) wurde für eine Inkubation von 10 min zugegeben. 100 μl 0,09 N H₂SO₄ wurden zu jeder Vertiefung der 96-Vertiefungen-Platte zum Stoppen der Reaktion gegeben. Der Phosphorylierungsstatus wurde durch Spektrophotometerablesung bei 450 nm festgestellt. IC₅₀-Werte wurden durch Kurvenanpassung unter Verwendung einer Vierparameteranalyse berechnet.
Humaner Lebermikrosom(HLM)-Assay
Die Verbindungsmetabolisierung in humanen Lebermikrosomen wurde durch die folgenden LC-MS-Analyse-Assayverfahren ermittelt. Zunächst wurden humane Lebermikrosomen (HLM) aufgetaut und auf 5 mg/ml mit kaltem 100 mM Kaliumphosphat(KPO4)puffer verdünnt. Geeignete Mengen von KPO4-Puffer, NADPH-Regenerationslösung (die B-NADP, Glucose-6-phosphat, Glucose-6-phosphatdehydrogenase und MgCl₂ enthält) und HLM wurden in Glasröhrchen von 13 × 100 mm bei 37°C 10 min vorinkubiert (3 Röhrchen pro Testverbindung, dreifach). Testverbindung (Endkonzentration 5 ☐M) wurde zu jedem Röhrchen zum Initiieren der Reaktion gegeben und es wurde durch leichtes Verwirbeln gemischt, worauf Inkubation bei 37°C folgte. Zum Zeitpunkt t = 0,2 h wurde eine 250-μl-Probe von jedem Inkubationsröhrchen in getrennte Glasröhrchen von 12 × 75 mm, die 1 ml eiskaltes Acetonitril mit 0,05 μm Reserpin enthielten, entfernt. Die Proben wurden mit 4000 rpm 20 min zur Ausfällung von Proteinen und Salz zentrifugiert (Beckman Allegra 6KR, S/N ALK98D06, 634). Der Überstand wurde in neue Glasröhrchen von 12 × 75 mm überführt und durch einen Speed-Vac Centrifugal Vacuum Evaporator eingedampft. Die Proben wurden in 200 μl 0,1% Ameisensäure/Acetonitril (90/10) rekonstituiert und zum Lösen kräftig verwirbelt. Die Proben wurden dann in getrennte Polypropylenmikrozentrifugenröhrchen überführt und mit 14000 × g 10 min zentrifugiert (Fisher Micro 14, S/N M0017580). Für jede Wiederholung (1–3) am jeweiligen Zeitpunkt (0 und 2 h) wurde eine Aliquotprobe jeder Testverbindung in ein einzelnes HPLC-Ampulleninsert (6 Gesamtproben) zur LC-MS-Analyse, die im folgenden beschrieben ist, kombiniert.
Die kombinierten Verbindungsproben wurden in das LC-MS-System, das aus einem Hewlett-Packard HP1100 Diode Array HPLC und einem Micromass Quattro II Triple Quadruple Mass Spectrometer, das im positiven Elektrospray SIR-Modus arbeitete (das zum spezifischen Scannen des Molekülions jeder Testverbindung programmiert war), bestand, injiziert. Jeder Testverbindungspeak wurde an jedem Zeitpunkt integriert. Für jede Verbindung wurde die Peakfläche an jedem Zeitpunkt (n = 3) Bemittelt und diese mittlere Peakfläche bei 2 h wurde durch die mittlere Peakfläche zum Zeitpunkt 0 h dividiert, wobei die nach 2 h verbliebene Prozentmenge der Testverbindung erhalten wurde.

Die Ergebnisse der Tests der Verbindungen unter Verwendung verschiedener Assays sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst, wobei die Angabe "% @" die prozentuale Hemmung bei der angegebenen Konzentration angibt, "*"-Werte Ki (nM) oder% Hemmung bei einer Verbindungskonzentration von 1 μM für * oder 50 nM für **, falls nicht anders angegeben, darstellen. "NT" bezeichnet keine signifikante Hemmung oder nicht getestet. TABELLE 1

Beispiel Nr.	FLVK Ki% Hemmung @ 50 nM	FLVK P**	LckP* % Hemmung @1 μM	FGF-P % Hemmung @1 μM	HUVEC IC₅₀ (nM)	HUVEC + Albumin IC₅₀ (nM)	% verbleibend (HLM)	PAE PDGFR autophos IC₅₀ (nM)	PAE KDR IC₅₀ (nM) Mittel	bFGF Huvec IC₅₀ (nM) Mittel
3(a)	98	NT	30	99	12,7	NT	NT	NT	NT	NT
3(b)	98	NT	27	96	5,7	NT	84@ 2 h	NT	NT	NT
3(c)	91	NT	9	83	0,43	9,2	46@ 0,5 h	NT	NT	NT
3(d)	89	NT	11	80	0,4	7,5	68@ 2 h	3,5	NT	47
3(f) 3(g)	95 95	NT	41 28	60 72	NT 1,1	> 100 NT	NT 72@ 0,5 h	NT NT	NT NT	NT NT
3(h)	96	NT	37	85	1,6	NT	75@ 0,5 h	0,63	NT	NT
3(i)	88	NT	22	45	0,2	NT	NT	1,9	NT	1000
3(j)	80	NT	17	43	1,7	NT	65@ 0,5 h	4,7	NT	NT
3(k)	74	NT	19	36	0,8	NT	75@ 0,5 h	5	NT	1000
3(q)	47	NT	7	31	5	NT	82@ 0,5 h	5,2	NT	NT
2(h)	84	NT	NT	75	1,6	NT	74@ 0,5 h	2,8	NT	70
1(k)	27	NT	NT	12	> 10	NT	NT	NT	NT	NT
2(g)	83	NT	NT	79	0,71	NT	85@ 0,5 h	10,5	NT	173
64	94	NT	NT	39	0,15	NT	66@ 0,5 h	5,5	NT	1250
65	3,11 nM	NT	NT	NT	3,4	NT	86@ 0,5 h	5,8	NT	NT
61	65	NT	NT	14	6,5	NT	NT	NT	NT	662
41	45	NT	NT	11	6,4	NT	NT	NT	NT	3775
51	82	NT	NT	52	NT	NT	NT	NT	NT	NT
15	64	NT	NT	29	1,5	NT	NT	12,3	NT	1613
36	95	0,3 nM	NT	69	1,67	NT	NT	NT	1,62	935

TABELLE 1 FORTSETZUNG
Beispiel Nr.	FLVK Ki % Hemmung @ 50 nM	FLVK P**	LckP* % Hemmung @1 μM	FGF-P % Hemmung @1 μM	HUVEC IC50 (nM)	HUVEC + Albumin IC50 (nM)	% verbleibend (HLM)	PAE PDGFR autophos IC50 (nM)	PAE KDR IC₅₀ (nM) Mittel	bFGF Huvec IC₅₀ (nM) Mittel
13	80	NT	NT	63	NT	NT	NT	6	NT	NT
18	94	NT	NT	59%	NT	NT	NT	NT	NT	1882
20	91	NT	NT	35%	0,084	NT	NT	NT	NT	NT
37	90	NT	NT	45	NT	NT	NT	NT	0,76	NT
38	75	NT	NT	NT	NT	0,68	NT	2	NT	NT
39	96	NT	NT	76%	NT	NT	NT	4,7	NT	NT
32	78	NT	NT	70%	0,61	NT	97@ 0,5 h	0,5	NT	NT
55	97	NT	NT	67%	0,2	NT	NT	3,7	NT	NT
57	91	NT	NT	52%	< 1,8	NT	NT	1,3	NT	NT
63	85	NT	NT	63%	0,1	NT	NT	2,4	NT	NT
34	72	NT	NT	NT	NT	NT	NT	4,5	NT	NT
10	76	6,07	NT	38, 197 nM	0,67	NT	80@ 0,5 h	21	NT	NT
45	28	NT	NT	24	NT	NT	NT	NT	NT	NT
49	11	NT	NT	36	NT	NT	NT	NT	NT	NT
23	23	NT	NT	56	NT	NT	NT	40	NT	NT
25	64	NT	NT	13	3	NT	NT	NT	NT	NT

In-vivo-Assay von Retinagefäßentwicklung bei neonatalen Ratten
Die Entwicklung des Retinagefäßsystems bei Ratten erfolgt vom postnatalen Tag 1 bis zum postnatalen Tag 14 (P1–P14). Dieser Prozess ist von der Aktivität von VEGF abhängig (J. Stone et al., J. Neurosci., 15, 4738 (1995)). Frühere Arbeiten zeigten, dass VEGF auch als Überlebensfaktor für die Gefäße der Retina während einer frühen Gefäßentwicklung wirkt (Aton et al., Nat. Med., 1, 1024 (1995)). Zum Testen der Fähigkeit spezifischer Verbindungen zur Hemmung der Aktivität von VEGF in vivo wurden Verbindungen in einem geeigneten Vehikel, üblicherweise 50% Polyethylenglykol, durchschnittliches Molekulargewicht 400 Dalton, und eine 50%-ige Lösung von 300 mM Saccharose in entionisiertem Wasser, formuliert. Typischerweise wurden zwei Mikroliter (2 μl) der Arzneistofflösung in den mittleren Glaskörper des Auges von Rattenjungen am postnatalen Tag 8 oder 9 injiziert. Sechs Tage nach der intravitrealen Injektion wurden die Tiere getötet und die Retinas vom verbleibenden Augengewebe freiseziert. Die isolierten Retinas wurden dann einem histochemischen Anfärbungsprotokoll unterzogen, das die Endothelzellen spezifisch anfärbt (Lutty und McLeod, Arch. Ophthalmol., 110, 267 (1992)), wobei das Ausmaß der Vaskularisation in der Gewebeprobe ersichtlich wird. Die individuellen Retinas werden dann auf Glasträger plan montiert und zur Bestimmung des Ausmaßes der Vaskularisation untersucht. Wirksame Verbindungen hemmen die weitere Entwicklung des Retinagefäßsystems und sie induzieren eine Regression von nahezu den größten Gefäßen in der Retina. Der Grad der Gefäßregression wurde zum Feststellen der relativen Wirksamkeit der Verbindungen nach einer In-vivo-Verabreichung verwendet. Die Gefäßregression wird auf einer subjektiven Skala von einem bis drei Pluszeichen eingestuft, wobei ein Pluszeichen eine detektierbare Regression, die als etwa 25% oder weniger beurteilt wird, ist, zwei Pluszeichen bei einer Beurteilung eine Regression von etwa 25–75% bedeuten und drei Pluszeichen für Retinas mit nahezu totaler Regression (etwa 75% oder größer) vergeben werden.
Für eine stärker quantitative Analyse der Regression wurden Bilder von ADPase-angefärbten, plan montierten Retinas mit einer Digitalkamera, die an einem Seziermikroskop angebracht ist, aufgenommen. Die Retinabilder wurden dann in Bildanalysesoftware (Image Pro Plus 4.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD) importiert. Die Software wurde zum Be stimmen des Prozentsatzes der Fläche der Retina, die angefärbte Gefäße enthielt, verwendet. Dieser Wert für das Versuchsauge wurde mit dem für das kontralaterale Auge, das Vehikel injiziert erhielt, des gleichen Tiers ermittelten, verglichen. Die Verringerung der Gefäßfläche, die in dem Auge, das eine Verbindung erhielt, beobachtet wurde, im Vergleich zu dem Auge, das Vehikel injiziert erhielt, wurde dann als "prozentuale Regression" für diese Probe ausgedrückt. Die Werte der prozentualen Regression wurden für Gruppen von 5–8 Tieren Bemittelt.
In Proben, in denen eine Betrachtung durch das Mikroskop eine nahezu totale Regression zeigte, wurde ein Wert der prozentualen Regression von 65–70% routinemäßig ermittelt. Dies beruhte auf Farbstoffablagerungen in Retinafalten, Falten, die durch das zur Arzneistoffinjektion verwendete Vehikel induziert wurden. Die Bildanalysesoftware interpretierte diese Farbstoff enthaltenden Falten als Gefäße. Kein Versuch wurde zur Korrektur dieser Falten unternommen, da sie von Auge zu Auge variierten. Daher ist festzuhalten, dass die berichteten Werte der prozentualen Regression das Ergebnis einer konservativen Messung sind, die eine genaue Rangordnung von Verbindungen ergibt, jedoch deren absolute Wirksamkeit unterschätzt.
In-vivo-Assay von Retinagefäßentwicklung im Modell für Frühgeborenenretinopathie bei neonatalen Ratten
Ein zweites Modell einer VEGF-abhängigen Retinaneovaskularisation wurde zur Beurteilung der Aktivitäten dieser Reihe von Verbindungen verwendet. In diesem Modell (Penn et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 2063 (1995)) werden Rattenjunge (n = 16) mit deren Mutter in eine computerkontrollierte Kammer, die die Sauerstoffkonzentration regelt, gegeben. Die Tiere werden 24 h einer Sauerstoffkonzentra tion von 50% und anschließend 24 h einer Sauerstoffkonzentration von 10% ausgesetzt. Dieser wechselnde Zyklus von Hyperoxie und anschließender Hypoxie wird 7-mal wiederholt, wonach die Tiere in Raumluft entfernt werden (P14). Verbindungen werden durch intravitreale Injektion bei der Entfernung zu Raumluft verabreicht und die Tiere werden 6 Tage später getötet (P20). Die isolierten Retinas werden dann isoliert, angefärbt montiert und wie oben detailliert angegeben in dem Entwicklungsmodell analysiert. Die Wirksamkeit wurde auch gemäß der Beschreibung für das Entwicklungsmodell gradmäßig beurteilt.
Die oben beschriebenen Beispielverbindungen können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen nach den folgenden allgemeinen Beispielen formuliert werden.
Beispiel 1: Parenterale Zusammensetzung
Zur Herstellung einer zur Verabreichung durch Injektion geeigneten parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzung werden 100 mg eines wasserlöslichen Salzes einer Verbindung der Formel I in DMSO gelöst und dann mit 10 ml 0,9%-iger steriler Kochsalzlösung gemischt. Das Gemisch wird in eine zur Verabreichung durch Injektion geeignete Dosierungseinheitsform eingearbeitet.
Beispiel 2: Orale Zusammensetzung
Zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur oralen Abgabe werden 100 mg einer Verbindung der Formel I mit 750 mg Lactose gemischt. Das Gemisch wird in eine orale Dosierungseinheit, beispielsweise ein harte Gelatinekapsel, die zur oralen Verabreichung geeignet ist, eingearbeitet.
Beispiel 3: Intraokulare Zusammensetzung
Zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit nachhaltiger Freisetzung zur intraokularen Abgabe wird eine Verbindung der Formel I in einer neutralen isotonischen Lösung von Hyaluronsäure (Konzentration 1,5%) in Phosphatpuffer (pH 7,4) unter Bildung einer 1%-igen Suspension suspendiert.

Claims

Verbindung der Formel
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz derselben.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament zur Behandlung von altersbedingter Makuladegeneration bei einem Säuger.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament zur Behandlung von Choroideaneovaskularisation bei einem Säuger.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament zur Behandlung von Retinopathie bei einem Säuger.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 4, wobei die Retinopathie diabetische Retinopathie, Vitreoretinopathie oder Frühgeborenenretinopathie umfasst.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament zur Behand lung von Retinitis bei einem Säuger.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 6, wobei die Retinitis Cytomegalovirus-Retinitis umfasst.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament zur Behandlung eines Makulaödems bei einem Säuger.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament zur Behandlung einer Augenerkrankung bei einem Säuger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die umfasst: (a) eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes nach Anspruch 1 und (b) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel oder ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel hierfür.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament zur Behandlung eines Erkrankungszustands eines Säugers, der durch Proteinkinaseaktivität vermittelt wird.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 11, wobei der Erkrankungszustand eines Säugers mit Tumorwachstum, Zellproliferation oder Angiogenese in Verbindung steht.
Verwendung einer Verbindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes gemäß der Definition in Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Aktivität eines Proteinkinaserezeptors.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Proteinkinaserezeptor ein VEGF-Rezeptor ist.
Verwendung der Verbindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung gemäß der Definition in einem der Ansprüche 2 bis 9, 11 oder 12.
Verbindung oder pharmazeutisch akzeptables Salz nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Medizin.