HRP20050559A2 - 2-(1h-indazole-6-ylamino)-benzamide compounds as protein kinases inhibitors useful for the treatment of ophthalmic diseases - Google Patents

2-(1h-indazole-6-ylamino)-benzamide compounds as protein kinases inhibitors useful for the treatment of ophthalmic diseases Download PDF

Info

Publication number
HRP20050559A2
HRP20050559A2 HR20050559A HRP20050559A HRP20050559A2 HR P20050559 A2 HRP20050559 A2 HR P20050559A2 HR 20050559 A HR20050559 A HR 20050559A HR P20050559 A HRP20050559 A HR P20050559A HR P20050559 A2 HRP20050559 A2 HR P20050559A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
ylamino
indazol
pharmaceutically acceptable
mmol
image
Prior art date
Application number
HR20050559A
Other languages
English (en)
Inventor
John Borchardt Allen
Steven Kania Robert
Louise Palmer Cynthia
Original Assignee
Pfizer Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Inc. filed Critical Pfizer Inc.
Publication of HRP20050559A2 publication Critical patent/HRP20050559A2/hr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/416—1,2-Diazoles condensed with carbocyclic ring systems, e.g. indazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/54—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D231/56—Benzopyrazoles; Hydrogenated benzopyrazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

Opisani su indazolski spojevi koji moduliraju i/ili sprječavaju očne bolesti i inhibiraju aktivnostizvjesnih proteinskih kinaza. Ovi spojevi i farmaceutski pripravci koji ih sadrže mogu posredovati kod prijenosa signala putem tirozinskih kinaza, testoga modulirati i/ili inhibirati neželjenu staničnu proliferaciju. Ovaj izum također se odnosi na terapijsku odnosno profilaktičku upotrebu farmaceutskih pripravaka koji sadrže takve spojeve, te na postupke liječenja očnih bolesti i raka i drugih bolesnih stanja povezanih s neželjenom angiogenezomi/ili staničnom proliferacijom, poput dijabetičneretinopatije, neovaskularnog glaukoma, reumatoidnog artritisa, te psorijaze, primjenom djelotvornihkoličina takvih spojeva.

Description

Ukrižene reference na srodne patentne prijave
Ova patentna prijava zahtijeva pogodnosti iz US privremene patentne prijave br. 60/434,902, podnesene 12. prosinca 2002., uključene u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe.
Područje izuma
Ovaj izum odnosi se na indazolske spojeve koji posreduju i/ili sprječavaju očne bolesti i inhibiraju aktivnost izvjesnih proteinskih kinaza, te na farmaceutske pripravke koji sadrže takve spojeve. Ovaj izum također se odnosi na terapijsku odnosno profilaktičku upotrebu takvih spojeva i pripravaka, te na postupke liječenja očnih bolesti i raka, kao i drugih bolesnih stanja povezanih s neželjenom angiogenezom i/ili staničnom proliferacijom, primjenom djelotvornih količina takvih spojeva.
Pozadina izuma
Po vid je štetno nekoliko bolesti i stanja stražnjeg segmenta oka. Neki od primjera su makularna degeneracija povezana sa starenjem (ARMD ili AMD), neovaskularizacija mrežnice (CNV), retinopatije (npr. dijabetična retinopatija, vitreoretinopatija, retinopatija u mlađoj dobi), retinitis (npr. citomegalovirusni (CMV) retinitis), uveitis, makularni edem, te glaukom.
Makularna degeneracija povezana sa starenjem (ARMD ili AMD) vodeći je uzrok sljepoće kod starijih osoba. ARMD pogađa centar vidnog polja, te ga zamućuje, otežavajući ili onemogućujući čitanje, vožnju i druge zahtjevne zadaće. Samo u SAD-u godišnje se pojavi približno 200.000 novih slučajeva ARMD. Trenutne procjene otkrivaju da približno 40 % populacije starije od 75 godina, te približno 20 % populacije starije od 60 godina, pati od makularne degeneracije različitog stupnja. "Vlažna" ARMD je tip ARMD koji najčešće uzrokuje sljepoću. Kod vlažne ARMD novonastale krvne žile mrežnice (neovaskularizacija mrežnice (CNV)) propuštaju tekućinu i uzrokuju progresivno oštećenje mrežnice. Specifično za slučaj CNV kod ARMD trenutno su razvijena dva glavna postupka liječenja: (a) fotokoagulacija i (b) upotreba inhibitora angiogeneze.
Međutim, fotokoagulacija može oštetiti mrežnicu, te je nepraktična kada je CNV u blizini foveje. Nadalje, kod fotokoagulacija je čest recidiv CNV s vremenom. Oralna primjena antiangiogenih spojeva također se ispituje kao sistemno liječenje ARMD. Međutim, zbog metaboličkih ograničenja specifičnih za lijek, sistemna primjena obično osigurava supterapijske razine lijeka u oku. Prema tome, kako bi se postiglo djelotvorne intraokularne koncentracije lijeka, potrebna je bilo neprihvatljivo visoka doza ili ponavljanje konvencionalnih doza. Za unos antiangiogenih spojeva lokalno u oko također su razvijeni i različiti usatci. Primjeri takvih usadaka otkriveni su u US patentu br. 5,824,072, Wong; US patentu br. 5,476,511, Gwon i drugi; te US patentu br. 5,773,019, Ashton i drugi, od kojih je svaki uključen u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe.
Neovaskularna bolest oka
Kao što je napomenuto gore, ovaj izum također osigurava postupke liječenja neovaskularnih bolesti oka, uključujući, primjerice, neovaskularizaciju rožnice, neovaskularni glaukom, proliferativnu dijabetičnu retinopatiju, retrolentalnu fibroplaziju i makularnu degeneraciju.
Ukratko, neovaskularizacija rožnice kao rezultat ozljede prednjeg segmenta značajni je uzrok smanjenja oštrine vida i sljepoće i veliki čimbenik rizika za odbacivanje alogenih presadaka rožnice. Kao što je opisano u Burger i suradnici: Lab. Invest., 48, 169-180, (1983.) (uključeno u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe), angiogeneza u rožnici uključuje tri faze: prevaskularni period latencije, aktivnu neovaskularizaciju, te starenje i povlačenje krvnih žila. Identitet i mehanizam različitih angiogenih čimbenika, uključujući elemente upalnog odgovora, poput leukocita, trombocta, citokina, te ikozanoida, ili neidentificirane sastojke plazme, tek treba otkriti.
Trenutno ne postoji nikakva klinički zadovoljavajuća terapija za sprječavanje neovaskularizacije rožnice ili povlačenje postojećih novih krvnih žila u rožnici. Čini se da topikalni kortikosteroidi imaju izvjesnu kliničku primjenu, vjerojatno ograničavajući upalu strome.
Prema tome, u jednom aspektu ovog izuma osigurani su postupci liječenja neovaskularnih bolesti oka, poput neovaskularizacije rožnice (uključujući neovaskularizaciju presađene rožnice), koji se sastoje u koraku primjene na pacijentu terapijski djelotvorne količine antiangiogenog pripravka (kao što je opisano gore) na rožnicu, tako da se spriječi tvorbu krvnih žila. Ukratko, rožnica je tkivo u kojem normalno nema krvnih žila. U izvjesnim patološkim stanjima, Međutim, kapilare se mogu raširiti u rožnicu iz perikornealnog spleta krvnih žila limba. Kada rožnica bude vaskularizirana, ona se također zamuti, što dovodi do slabljenja pacijentove oštrine vida. Gubitak vida može postati potpun ako se rožnica posve zamuti.
Krvne žile mogu ući u rožnicu u različitim uzorcima i do različite dubine, ovisno o procesu koji je potakao neovaskularizaciju. Ove uzorke su oftalmolozi tradicionalno definirali u sljedeće tipove: trahomatozni panus (pannus trachomatosus), leprozni panus (pannus leprosus), panus filktenulozni (pannus filctenulosus), degenerativni panus (pannus degenerativus), te glaukomatozni panus (panus glaukomatosus). U stromu rožnice također mogu invadirati (ući) ogranci prednje cilijarne arterije (što se zove intersticijska vaskularizacija), što uzrokuje nekoliko različitih kliničkih lezija: terminalne omče, "četkasti" uzorak, štitasti oblik, rešetkasti oblik, intersticijske arkade (lukovi) (iz episkleralnih krvnih žila), te aberantne nepravilne krvne žile.
Široki raspon poremećaja može dovesti do neovaskularizacije rožnice, uključujući, primjerice, infekcije rožnice (npr. trahom, keratitis uzrokovan virusom Herpes simplex, lišmenijaza i onkocerkoza), imunološke procese (npr. odbacivanje presatka i Stevens-Johnsonov sindrom), opekline uzrokovane alkalijama, traumu, upalu (bilo kojeg uzroka), toksične i nutricionistički deficijentna stanja, te kao komplikacija kod nošenja kontaktnih leća.
Iako uzroci neovaskularizacije rožnice mogu biti različiti, odgovor rožnice na povredu i naknadno urastanje krvnih žila su slični bez obzira na uzrok. Ukratko, čini se da je lokacija ozljede važna, jer samo jedan lezije smještene unutar kritične udaljenosti od limba potiču angiogeni odgovor. To je vjerojatno zbog toga što angiogeni čimbenici odgovorni za invaziju krvnih žila nastaju na mjestu lezije, te moraju difundirati do mjesta najbližih krvnih žila (rubno područje) kako bi očitovali svoj učinak. Izvan izvjesne udaljenosti od limba, to ne bi više bilo moguće i endotel krvnih žila u rubnom području ne bi bio induciran na rast u rožnicu. U ovom procesu vjerojatno sudjeluje nekoliko angiogenih čimbenika, od kojih su mnogi produkti upalnog odgovora. I doista, čini se da do neovaskularizacije rožnice dolazi samo u vezi s infiltracijom upalnih stanice, a stupanj angiogeneze proporcionalan je stupnju upalne reakcije. Edem rožnice dalje olakšava urastanje krvnih žila olabavljujući osnovu strome rožnice, te osiguravajući put "najmanjeg otpora", kroz koji kapilare mogu rasti.
Nakon početne upalne reakcije, urastanje kapilara u rožnicu protječe na isti način kao i u drugim tkivima. Inače mirne stanice endotela kapilara limba i venula bivaju stimulirane na dijeljenje i seljenje. Stanice endotela pružaju se iz krvnih žila iz kojih su potekle, razgrađuju okolnu bazalnu membranu i tkivo kroz koje će putovati, te se sele prema izvoru angiogenog stimulusa. Slijepi izdanci postaju šuplji, te međusobno anastomoziraju kako bi se dobilo kapilarne omče. Konačni rezultat je uspostava spleta krvnih žila unutar strome rožnice.
Antiangiogeni čimbenici i pripravci prema ovom izumu korisni su kao blokatori stimulacijskih učinaka promotora angiogeneze, smanjujući dijeljenje stanica endotela, smanjujući seljenje stanica endotela, te ometajući aktivnost proteoličkih enzima koje izlučuje endotel.
Bit izuma
U osobito poželjnim izvedbama ovog izuma antiangiogeni čimbenik može se pripraviti za topikalnu primjenu u fiziološkoj otopini (u kombinaciji s bilo kojim konzervansom i antimikrobnim sredstvom koje se uobičajeno upotrebljava u okularnim pripravcima), te primijeniti u obliku kapi za oči. Otopinu ili suspenziju antiangiogenog čimbenika može se pripraviti u čistom obliku, te primijeniti nekoliko puta dnevno. Alternativno, antiangiogeni pripravci, koje se pripravlja kao što je opisano gore, također se može primijeniti i izravno na rožnicu.
U poželjnim izvedbama antiangiogeni pripravak se načini s mukoadhezivnim polimerom, koji se veže na rožnicu. U daljnjim izvedbama antiangiogene čimbenike ili antiangiogene pripravke može se upotrijebiti kao dodatak konvencionalnoj terapiji steroidima.
Topikalna terapija također može biti korisna u profilaktički lezija rožnice, kod kojih se zna da postoji visoka vjerojatnost da izazovu angiogeni odgovor (poput kemijskih opeklina). U tim slučajevima može se odmah početi s liječenjem, vjerojatno u kombinaciji sa steroidima, kako bi se pomoglo spriječiti naknadne komplikacije.
U drugim izvedbama antiangiogene pripravke opisane gore može oftalmolog injicirati izravno u stromu rožnice, pod mikroskopom. Poželjno mjesto injekcije može ovisiti o morfologiji pojedine lezije, no cilj primjene bio bi staviti pripravak na frontu napredovanja vaskulature (tj. rasporediti između krvnih žila i normalne rožnice). U većini slučajeva to bi uključivalo injekcija u rožnicu u blizini limba kako bi se "zaštitilo" rožnicu od napredujućih krvnih žila. Ovaj postupak također se može upotrijebiti ubrzo nakon ozljeđivanja rožnice kako bi se profilaktički spriječilo neovaskularizaciju rožnicu. U ovom slučaju materijal se može injicirati u perilimbičku rožnicu, između lezija rožnice i neželjenu potencijalnu opskrbu krvlju iz limba. Takve postupke također se može upotrijebiti na sličan način kako bi se spriječilo invaziju kapilara u presađene rožnice. Kod oblika injekcija s produljenim otpuštanjem moglo bi biti potrebno samo 2-3 puta godišnje. U injekcijsku otopinu također se može dodati i nesteroidne tvari kako bi se smanjilo upalu zbog same injekcije.
U sljedećem aspektu ovog izuma osigurani su postupci liječenja neovaskularnog glaukoma, koji se sastoje u koraku primjene na pacijentu terapijski djelotvorne količine antiangiogenog pripravka u oko, tako da se spriječi tvorbu krvnih žila.
Ukratko, neovaskularni glaukom je patološko stanje gdje se nove kapilare razvijaju u šarenici oka. Angiogeneza obično započinje iz krvnih žila koje se nalaze na rubu zjenice, te napreduje po bazi šarenice i u trabekularnu mrežu. Fibroblasti i drugi elementi vezivnog tkiva povezani su s rastom kapilara, te nastaje fibrovaskularna membrana koja se širi po prednjoj površini šarenice. Na kraju to tkivo doseže kut prednje komore, gdje tvori sinehije. Ove sinehije se stapaju, tvore ožiljke, te stežu, čime na kraju zatvore kut prednje komore. Stvaranje ožiljaka sprječava adekvatno pražnjenje očne vodice kroz kut u trabekularnu mrežu, što dovodi do porasta intraokularnog tlaka, što može rezultirati sljepoćom.
Neovaskularni glaukom općenito je komplikacija bolesti, od kojih prevladava ishemija mrežnice. Osobito otprilike trećina pacijenata s ovim poremećajem ima dijabetičnu retinopatiju, a 28 % ima okluziju centralne vene mrežnice. Drugi uzroci uključuju kronično odvajanje mrežnice, završni stadij glaukoma, opstruktivna bolest karotidne arterije, retrolentalna fibroplazija, srpasta anemija, intraokularni tumori, te kavernozne fistule karotide. U svojim ranim stadijima neovaskularni glaukom se može dijagnosticirati fluorescentnom biomikroskopijom s velikim povećanjem, gdje otkriva male, proširene, dezorganizirane kapilare (koje propuštaju fluorescein) na površini šarenice. Kasnije gonioskopija demonstrira progresivno obraštanje kuta prednje komore fibrovaskularnim tračcima. Dok je kut prednje komore još otvoren konzervativne terapije mogu biti od pomoći. Međutim, kad se kut zatvori, kirurški zahvat potreban je kako bi se smanjilo tlak.
Prema tome, u jednoj izvedbi ovog izuma može se antiangiogene čimbenike (bilo same ili u antiangiogenom pripravku, kao što je opisano gore) primijeniti topikalno na oko kako bi se liječilo rane oblike neovaskularnog glaukoma.
U drugim izvedbama ovog izuma može se antiangiogene pripravke usaditi injekcijom pripravka u regiju kuta prednje komore. Ovo osigurava produljeni lokalni porast razine antiangiogenog čimbenika, te sprječava rast krvnih žila u to područje. Usađeni ili injicirani antiangiogeni pripravci, smješteni između napredujućih kapilara šarenice i kuta prednje komore mogu "obraniti" otvoreni kut od neovaskularizacije. Kako kapilare neće rasti unutar velikog radijusa oko antiangiogenog pripravka, prostor kuta se može održavati. U drugim izvedbama antiangiogeni pripravak također se može staviti na bilo koju lokaciju tako da se antiangiogeni čimbenik neprestano otpušta u očnu vodicu. To će povećati koncentracija antiangiogenog čimbenika u vodici, koji pak oplakuje površinu šarenice i njene abnormalne kapilare, osiguravajući tako još jedan mehanizam kojim se unaša medikament. Ovi načini terapije također mogu biti korisni kao profilaksa i u kombinaciji s postojećim liječenjima.
U sljedećem aspektu ovog izuma osigurani su postupci liječenja proliferativne dijabetične retinopatije, koji se sastoje u koraku primjene na pacijentu terapijski djelotvorne količine antiangiogenog pripravka u oči, tako da se spriječi tvorbu krvnih žila.
Ukratko, smatralo se da je patologija dijabetične retinopatije slična onoj opisanoj gore za neovaskularni glaukom. Osobito se smatralo da se osnovna dijabetična retinopatija pretvara u proliferativnu dijabetičnu retinopatiju pod utjecajem hipoksije mrežnice. Općenito, neovaskularno tkivo raste iz očnog živca (obično unutar 10 mm od ruba), te s površine mrežnicama u regijama gdje je perfuzija tkiva slaba. Na početku kapilare rastu između unutarnje granične membrane mrežnice i stražnje površine staklovine. Na kraju, krvne žile rastu u staklovinu i kroz unutarnju graničnu membranu. Kao se staklovina steže, pojavljuje se vučna sila na krvne žile, što često rezultira presjecanjem krvnih žila i zasljepljivanjem staklovine zbog krvarenja. Vučna sila vlakana iz ožiljaka u nastajanju u mrežnici također može dovesti do odvajanja mrežnice.
Konvencionalna terapija izbora je paretinalna fotokoagulacija kako bi se smanjilo tkivo mrežnice, te tako smanjilo i potrošnju kisika u mrežnici. Iako je to u početku djelotvorno, visoka je stopa recidiva, uz nastajanje novih lezija u drugim dijelovima mrežnice. Komplikacije ove terapije uključuju smanjenje perifernog vida kod do 50 % pacijenata, mehanička oštećenja rožnice, tvorba mrene uzrokovana laserom, akutni glaukom, te stimulacija subretinalnog neovaskularnog rasta (što može dovesti do gubitka vida). Zbog toga, ovaj zahvat se izvodi samo kada je prisutno nekoliko čimbenika rizika, a odnos između rizika i poboljšanja je jasno na strani zahvata.
Prema tome, u osobito poželjnoj izvedbi ovog izuma se proliferativnu dijabetičnu retinopatiju može liječiti injekcijom jednog ili više antiangiogenih čimbenika (ili antiangiogenih pripravaka) u očnu vodicu ili staklovinu kako bi se povećalo lokalnu koncentraciju antiangiogenog čimbenika u mrežnici. Po mogućnosti, ovo liječenje treba započeti prije pojave teške bolesti, koja zahtijeva fotokoagulaciju. U drugim izvedbama ovog izuma arterije koje opskrbljuju neovaskularne lezije može se embolizirati (pomoću antiangiogenih pripravaka, kao što je opisano gore).
U sljedećem aspektu ovog izuma osigurani su postupci liječenja retrolentalne fibroplazije, koji se sastoje u koraku primjene na pacijentu terapijski djelotvorne količine antiangiogenog čimbenika (ili antiangiogenog pripravka) u oko, tako da se spriječi tvorbu krvnih žila.
Ukratko, retrolentalna fibroplazija je stanje do kojeg dolazi kod nedonošćadi koja prima terapiju kisikom. Periferna vaskulatura mrežnice, osobito na sljepoočnoj strani, ne razvije se posve do kraja fetalnog života. Smatra se da je suvišni kisik (čak i razine koje bi bile fiziološke za normalno novorođenče) i tvorba slobodnih kisikovih radikala važan kao uzrok oštećenja krvnih žila u nezreloj mrežnici.
Te krvne žile se stežu, te postaje strukturno začepljena prilikom izlaganja kisiku. Zbog toga se periferna mrežnica ne vaskularizira, te dolazi do ishemije mrežnice. Kao odgovor na ishemiju dolazi do pojave neovaskularizacije na granici zdrave i ishemične mrežnice.
U 75 % slučajeva ove krvne žile se spontano povlače. Međutim, kod preostalih 25 % kapilare i dalje rastu, fibrovaskularna komponenta se steže, te dolazi do vučne sile i na krvne žile i na mrežnicu. To dovodi do krvarenje u staklovinu i/ili odvajanja mrežnice, što može dovesti do sljepoće. Glaukom sa zatvaranjem neovaskularnog kuta također je komplikacija ovog stanja.
Kako je često nemoguće odrediti koji slučajevi će se spontano riješiti, a koji će biti sve teži, konvencionalno liječenje (tj. kirurški zahvat) se općenito provodi samo kod pacijenata s ustanovljenom bolešću i dobro razvijenom patologijom. Ovaj "čekaj, pa vidi" pristup isključuje rani zahvat i dopušta napredovanje bolesti kod 25 % onih kod kojih dolazi do komplikacija. Prema tome, u jednoj izvedbi ovog izuma topikalnu se primjenu antiangiogenih čimbenika (ili antiangiogenih pripravaka, kao što je opisano gore) može provesti kod dojenčadi koje je pod visokim rizikom od razvoja ovog stanja kako bi se pokušalo smanjiti incidenciju napredovanja retrolentalne fibroplazije. U drugim izvedbama može se upotrijebiti i intravitrealne injekcije i/ili intraokularne usatke antiangiogenog pripravka. Takvi postupci osobito su poželjni u slučajevima ustanovljene bolesti kako bi se smanjilo potrebu za kirurškim zahvatom.
Proteinske kinaze
Proteinske kinaze su porodica enzima koji kataliziraju fosforilaciju hidroksilne skupine specifičnih tirozinskih, serinskih ili treoninskih ostataka u proteinima. U pravilu, takva fosforilacija dramatično mijenja funkciju proteina, te su stoga proteinske kinaze ključne u regulaciji širokog raspona staničnih procesa, uključujući metabolizam, staničnu proliferaciju, staničnu diferencijaciju, te stanično preživljenje. Od mnogih različitih staničnih funkcija kod kojih se zna da je potrebna aktivnost proteinskih kinaza, neki procesi su privlačne mete za terapijski zahvat kod izvjesnih bolesnih stanja. Dva takva primjera su angiogeneza i kontrola staničnog ciklusa, gdje proteinske kinaze imaju ključnu ulogu; ovi procesi su bitni za rast čvrstih tumora, kao i kod drugih bolesti.
Angiogeneza je mehanizam kojim nastaju nove kapilare iz postojećih krvnih žila. Po potrebi, krvožilni sustav ima potencijal da generira nove kapilarne mreže radi održavanja pravilnog funkcioniranja tkiva i organa. Kod odraslih, Međutim, angiogeneza je prilično ograničena, te do nje dolazi samo tijekom zacjeljivanja rana i neovaskularizacije endometrija tijekom menstruacije. Vidjeti Merenmies i suradnici: Cell Growth & Differentiation, 8, 3-10, (1997.), uključeno u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe. U drugu ruku, neželjena angiogeneza je tipična za nekoliko bolesti, poput retinopatija, psorijaze, reumatoidnog artritisa, makularna degeneracija povezan sa starenjem (AMD), te rak (čvrsti tumori). Folkman: Nature Med., 1, 27-31, (1995.), uključeno u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe. Proteinske kinaze, za koje se pokazalo da su uključene u angiogeni proces, uključuju tri člana porodice receptor čimbenika rasta/tirozinska kinaza: VEGF-R2 (receptor čimbenika rasta vaskularnog endotela 2, također poznat kao KDR (receptor kinazne insercijske domene), te kao FLK-1); FGF-R (receptor fibroblastnog čimbenika rasta); te TEK (također poznat kao Tie-2).
VEGF-R2, kojeg se eksprimira samo na stanicama endotela, veže potentni angiogeni čimbenik rasta VEGF, te prenosi daljnji prijenos signala putem aktivacije svoje unutarstanične kinazne aktivnosti. Prema tome, očekivalo se da bi izravna inhibicija kinazne aktivnosti VEGF-R2 dovela do smanjenja angiogeneze čak i u prisutnosti egzogenog VEGF (vidjeti Strawn i suradnici: Cancer Research, 56, 3540-3545, (1996.)), kao što se pokazalo kod mutanata VEGF-R2 koji ne uspijevaju provesti prijenos signala. Millauer i suradnici: Cancer Research, 56, 1615-1620, (1996.). Nadalje, čini se da VEGF-R2 nema funkciju kod odraslih osim prijenosa angiogene aktivnosti VEGF. Prema tome, moglo bi se očekivati da selektivni inhibitor kinazne aktivnosti VEGF-R2 ima nisku toksičnost.
Slično tome, FGF-R veže angiogene čimbenike rasta aFGF i bFGF, te sudjeluje u daljnjem unutarstaničnom prijenosu signala. Nedavno je iznijeta sugestija da bi čimbenici rasta poput bFGF mogli imati kritičnu ulogu u poticanju angiogeneze u čvrstim tumorima koji su dosegli izvjesnu veličinu. Yoshiji i suradnici: Cancer Research, 57, 3924-3928, (1997.). Međutim, za razliku od VEGF-R2, FGF-R se eksprimira kod niza različitih tipova stanica u organizmu, te može, no ne nužno, imati važne uloge u drugim normalnim fiziološkim procesima kod odraslih. Pa ipak, objavljeno je da sistemna primjena niskomolekulskog inhibitora kinazne aktivnosti FGF-R blokira angiogenezu potaknutu bFGF-om kod miševa bez očite toksičnosti. Mohammad i suradnici: EMBO Journal, 17, 5996-5904, (1998.).
TEK (također poznat kao Tie-2) je još jedan receptor/tirozinska kinaza kojeg se eksprimira samo na stanicama endotela za kojeg se pokazalo da ima ulogu u angiogenezi. Vezanje čimbenika angiopojetina-1 dovodi do autofosforilacije kinazne domene u TEK, te dovodi do procesa prijenosa signala koji izgleda da posreduje u međudjelovanju stanica endotela s periendotelnim nosećim stanicama, olakšavajući tako zriobu novonastalih krvnih žila. U drugu ruku, čini se da čimbenik angiopojetin-2 antagonizira djelovanje angiopojetina-1 na TEK i ometa angiogenezu. Maisonpierre i suradnici: Science, 277, 55-60, (1997.).
Zbog gore opisanog razvoja predloženo je liječenje angiogeneze upotrebom spojeva koji inhibiraju kinaznu aktivnost VEGF-R2, FGF-R i/ili TEK. Kao primjer, WIPO Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 97/34876, otkriva izvjesne cinolinske derivate koji su inhibitori VEGF-R2, koje se može upotrijebiti u liječenju bolesnih stanja povezanih s abnormalnom angiogenezom i/ili pojačanom propusnošću krvnih žila, poput raka, dijabetesa, psorijaze, reumatoidnog artritisa, Kaposijevog sarkoma, hemangioma, akutnih i kroničnih nefropatija, ateroma, arterijske restenoze, autoimunih bolesti, akutne upale, te očnih bolesti s proliferacijom krvnih žila u mrežnici.
Fosforilaza-kinaza aktivira glikogen-fosforilazu, povećavajući tako razgradnju glikogena i otpuštanje glukoze iz jetre. Proizvodnja glukoze u jetri je deregulirana kod dijabetesa tip 2 i primarni je uzrok hiperglikemije kod gladovanja, što dovodi do mnogih sekundarnih komplikacija koje pogađaju te pacijente. Prema tome, smanjenje otpuštanja glukoze iz jetre smanjilo bi povišene razine glukoze u plazmi. Inhibitori fosforilaza-kinaza trebali bi, stoga, smanjiti fosforilaznu aktivnost i glikogenolizu, smanjujući tako hiperglikemiju kod pacijenata.
Još jedan fiziološki odgovor na VEGF je prekomjerna propusnost krvnih žila, za koju je pretpostavljeno da ima ulogu u ranim stadijima angiogeneze. U ishemičnim tkivima, poput onih koja se pojavljuju u mozgu žrtava inzulta, hipoksija pokreće eksprimiranje VEGF, što dovodi do pojačane propusnosti krvnih žila, a time i do edema okolnog tkiva. U štakorskom modelu inzulta van Bruggen i suradnici (J. Clinical Invest., 104, 1613-20, (1999.)) su opazili da primjena monoklonskog protutijela za VEGF smanjuje volumen infarkta. Prema tome, očekuje se da bi inhibitori VEGFR bili korisni u liječenju inzulta.
Uz svoju ulogu u angiogenezi proteinske kinaze također imaju ključnu ulogu u kontroli staničnog ciklusa. Nekontrolirana stanična proliferacija karakteristika je raka. Stanična proliferacija kao odgovor na različite stimuluse manifestira se deregulacijom ciklusa staničnog dijeljenja, što je proces kojim se stanice razmnožavaju i dijele. Tumorske stanice u pravilu imaju oštećene gene koji izravno ili posredno reguliraju tijek ciklusa staničnog dijeljenja.
Ciklinski ovisne kinaze (CDK) su serinske/treoninske proteinske kinaze koje imaju kritične uloge u reguliranju prijelaze između različitih faza staničnog ciklusa. Vidjeti, npr., članke skupljene u časopisu Science, 274, 1643-1677, (1996.). CDK kompleksi nastaju povezivanjem regulacijske podjedinice ciklina (npr. ciklin A, B1, B2, D1, D2, D3, te E) s kataličkom podjedinicom kinaze (npr. cdc2 (CDK1), CDK2, CDK4, CDK5, te CDK6). Kao što ime implicira, CDK pokazuju apsolutnu ovisnost o ciklinskoj podjedinici kako bi fosforilirali svoje supstrate, a različiti parovi kinaza/ciklin funkcioniraju tako da reguliraju prolaz kroz specifične faze staničnog ciklusa.
Upravo CDK4 u kompleksu s ciklinima D ima kritičnu ulogu u pokretanju ciklusa staničnog dijeljenja iz stanja mirovanja u ono u kojem se stanice angažiraju u stanično dijeljenje. Ovaj tijek meta je niza različitih mehanizama regulacije rasta, i negativnih i pozitivnih. Implicirana je uloga grešaka u ovom kontrolnom sustavu, osobito onih koje utječu na funkciju CDK4, u prelasku stanica u visoko proliferativno stanje karakteristično za malignome, osobito za porodične melanome, karcinome jednjaka, te oblike raka gušterače. Vidjeti, npr., Kamb: Trends in Genetics, 11, 136-140, (1995.); Kamb i suradnici: Science, 264, 436-440, (1994.).
Brojne publikacije opisuju niz različitih kemijskih spojeva korisnih protiv niza različitih terapijskih meta. Kao primjer, WIPO Međunarodne patentne prijave objavljene kao WO 99/23077 i WO 99/23076, opisuju spojeve s indazolom inhibicijskom aktivnošću naspram fosfodiesteraze tip IV, koje se dobiva zamjenom bioizostera s katekolom s onim s indazolom. US patent br. 5,760,028 otkriva heterocikle koji sadrže 3-[1-[3-(imidazolin-2-ilamino)propil]indazol-5-ilkarbonilamino]-2-(benziloksikarbonilamino)propionsku kiselinu, korisne kao antagonisti integrina �v�3 i srodnih receptora adhezivnih proteina na staničnoj površini. WIPO Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 98/09961, otkriva izvjesne derivate indazola i njihovu upotrebu kao inhibitora fosfodiesteraze (PDE) tip IV ili proizvodnje čimbenika tumorske nekroze (TNF) kod sisavaca. Nedavne dopune virtualne biblioteke poznatih spojeva uključuju one opisane kao antiproliferativna terapijska sredstva koja inhibiraju CDK. Kao primjer, US patent br. 5,621,082, Xiong i suradnici, otkriva nukleinsku kiselinu koja kodira inhibitor CDK6, a Evropska patentna prijava objavljena kao 0 666 270 A2, opisuje peptide i peptidne mimetike koji djeluju kao inhibitori CDK1 i CDK2. WIPO Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 97/16447, otkriva izvjesne analoge kromona koji su inhibitori ciklinski ovisnih kinaza, osobito kompleksa CDK/ciklin, poput CDK4/ciklin D1, koje se može upotrijebiti za inhibiranje prekomjerne ili abnormalne stanične proliferacije, te stoga i u liječenju raka. WIPO Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 99/21845, opisuje derivate 4-aminotiazola korisne kao inhibitori CDK. Svi gore nabrojani patenti i/ili patentne prijave uključeni su u ovu specifikaciju kao reference u svojoj cijelosti i u sve svrhe.
Međutim, još uvijek postoji potreba za niskomolekulskim spojevima koje se lako sintetizira i djelotvorni su u inhibiranju jedan ili više kompleksa CDK ili CDK/ciklin. Kako CDK4 može služiti kao opći aktivator staničnog dijeljenja kod većine stanica, a kompleksi CDK4 i ciklini D tipa upravljaju ranom fazom G1 staničnog ciklusa, postoji potreba za djelotvornim inhibitorima CDK4 njihovih kompleksa a ciklinima D tipa, u liječenju jednog ili više tipova tumora. Također, ključne uloge kompleksa ciklin E/CDK2 i ciklin B/CDK1 kinaza u prijelazima G1/S faza odnosno G2/M, pružaju dodatne mete za terapijski zahvat suprimiranja tijeka dereguliranog staničnog ciklusa kod raka.
Još jedna proteinska kinaza, CHK1, ima važnu ulogu kao nadzorna točka u tijeku staničnog ciklusa. Nadzorne točke su kontrolni sustavi koji koordiniraju tijek staničnog ciklusa utječući na tvorbu, aktivaciju i naknadnu inaktivaciju ciklinski ovisnih kinaza. Nadzorne točke sprječavaju tijek staničnog ciklusa u neodgovarajuće vrijeme, održavaju metaboličku ravnotežu stanica dok stanica miruje, a u nekim slučajevima mogu potaknuti apoptozu (programirana stanična smrt) kada zahtjevima nadzorne točke nije udovoljeno. Vidjeti, npr., O'Connor, Cancer Surveys, 29, 151-182, (1997.); Nurse: Cell, 91, 865-867, (1997.); Hartwell i suradnici: Science, 266, 1821-1828, (1994.); Hartwell i suradnici: Science, 246, 629-634, (1989.).
Jedan niz nadzornih točaka prati integritet genoma, gdje, osjetivši oštećenje DNA, te "nadzorne točke za oštećenje DNA" blokiraju tijek staničnog ciklusa u fazama G1 i G2, te usporavaju napredovanje kroz fazu S. O'Connor, Cancer Surveys, 29, 151-182, (1997.); Hartwell i suradnici: Science, 266, 1821-1828, (1994.). Ovakvo ponašanje omogućuje dovršenje procesa popravka DNA prije replikacije genoma i naknadnog razdvajanja ovog genetskog materijala u nove stanice kćeri. Važno je da najčešće mutirani gen kod raka kod ljudi, gen tumorskog supresora p53, proizvodi protein koji je nadzorna točka za oštećenje DNA, koji blokira tijek staničnog ciklusa u fazi G1 i/ili pokreće apoptozu (programirana stanična smrt) nakon oštećenja DNA. Hartwell i suradnici: Science, 266, 1821-1828, (1994.). Također se pokazalo da tumorski supresor p53 pojačava djelovanje nadzorne točke za oštećenje DNA u fazi G2 staničnog ciklusa. Vidjeti, npr., Bunz i suradnici: Science, 28, 1497-1501, (1998.); Winters i suradnici: Oncogene, 17, 673-684, (1998.); Thompson, Oncogene, 15, 3025-3035, (1997.).
Uzevši ključnu prirodu puta tumorskog supresora p53 kod raka kod ljudi, aktivno su traženi terapijski zahvati koji iskorištavaju ranjivosti kod p53-defektivnog raka. Jadna takva ranjivost je u djelovanju nadzorne točke za G2 u p53-defektivnim stanicama raka. Stanice raka, kako im nedostaje kontrola nadzorne točke za G1, osobito su ranjive na ukinuće posljednje preostale prepreke koja ih štiti od kancericidnih učinaka sredstava koja oštećuju DNA: nadzorne točke za G2. Nadzornu točku za G2 regulira kontrolni sustav, očuvan od kvasca do ljudi. U ovom očuvanom sustavu važna je kinaza, CHK1, koja prenosi signale iz kompleksa za traženje oštećenja DNA radi inhibicije aktivacije kompleksa ciklin B/Cdc2 kinaza, koji potiče ulaz u mitozu. Vidjeti, npr., Peng i suradnici: Science, 277, 1501-1505, (1997.); Sanchez i suradnici: Science, 277, 1497-1501, (1997.). Pokazalo se da inaktivacija CHK1 i ukida zastoj u fazi G2 uzrokovan oštećenjem DNA bilo onim uzrokovanim antikanceroznim sredstvima ili endogenim oštećenjem DNA, nego također dovodi do selektivnog ubijanja nastalih stanica defektivnih u nadzornoj točci. Vidjeti, npr., Nurse: Cell, 91, 865-867, (1997.); Weinertn, Science, 277, 1450-1451, (1997.); Walworth i suradnici: Nature, 363, 368-371, (1993.); te Al-Khodairy i suradnici: Molec. Biol. Cell, 5, 147-160, (1994.).
Selektivna manipulacija kontrole nadzorne točke u stanicama raka mogla bi omogućiti široku upotrebu kod kemoterapijskih i radioterapijskih režima kod raka i može, osim toga, omogućiti da se zajedničku karakteristiku raka kod ljudi, "genomsku nestabilnost", iskoristi kao selektivnu bazu za razaranje stanica raka. Niz čimbenika svrstava CHK1 kao ključnu metu kod kontrole nadzorne točke oštećenja DNA. Otkriće inhibitora ove i funkcionalno srodnih kinaza poput Cds1/CHK2, koja je kinaza za koju je nedavno otkriveno da surađuje s CHK1 u reguliranju prolaza kroz fazu S (vidjeti Zeng i suradnici: Nature, 395, 507-510, (1998.); Matsuoka, Science, 282, 1893-1897, (1998.)), moglo bi osigurati vrijedna nova terapijska sredstva za liječenje raka.
Vezanje integrinskog receptora na ECM pokreće unutarstanične signale koje prenosi FAK (fokalna adhezijska kinaza), koji sudjeluju u staničnoj pokretljivosti, staničnoj proliferaciji i preživljenju. Kod raka kod ljudi implicirana je hiperekspresija FAK kod tumorogeneze i metastatskog potencijala preko svoje uloge u signalnim putovima kod kojih posreduje integrin.
Tirozinske kinaze mogu biti receptorskog tipa (s izvanstaničnom, transmembranskom i unutarstaničnom domenom) ili nereceptorskog tipa (budući posve unutarstanične). Smatralo se da kod najmanje jedne od nereceptorskih proteinskih tirozinskih kinaza, konkretno, LCK, dolazi do prijenosa u signala iz T-stanice međudjelovanje proteina na staničnoj površini (Cd4) s ukriženim protu-Cd4 protutijelom. Zahtjevnija rasprava o nereceptorskim tirozinskim kinazama dana je u Bolen: Oncogene, 8, 2025-2031, (1993.), uključeno u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe.
Uz proteinske kinaze identificirane gore, smatra se da su i mnoge druge proteinske kinaze terapijske mete, gdje brojne publikacije otkrivaju inhibitore kinazne aktivnosti, kao što je pregledno iznijeto u sljedećem: US patent br. 6,534,524, objavljen 18. ožujka 2003., US patent br. 6,531,491, objavljen 11. ožujka 2003., PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 00/38665 (objavljena 6. srpnja 2001.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 97/49688 (objavljena 31. prosinca 1997.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 98/23613 (objavljena 4. lipnja 1998.), US patent br. 6,071,935 objavljen 6. lipnja 2000., PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 96/30347 (objavljena 3. listopada 1996.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 96/40142 (objavljena 12. prosinca 1996.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 97/13771 (objavljena 17. travnja 1997.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 95/23141 (objavljena 31. kolovoza 1995.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 03/006059 (objavljena 23. siječnja 2003.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 03/035047 (objavljena 1. svibnja 2003.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 02/064170 (objavljena 22. kolovoza 2002), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 02/41882 (objavljena 30. svibnja 2002.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 02/30453 (objavljena 18. travnja 2002.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 01/85796 (objavljena 15. studenog 2001.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 01/74360 (objavljena 11. listopada 2001.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 01/74296 (objavljena 11. listopada 2001.), PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 01/70268 (objavljena 27. rujna 2001.), Evropska patentna prijava objavljena kao EP 1086705 (objavljena 28. ožujka 2001.), te PCT Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 98/51344 (objavljena 19. studenog 1998.). Svi gore navedeni patenti i patentne prijave uključeni su u ovu specifikaciju kao reference u svojoj cijelosti i u sve svrhe.
Međutim, još uvijek postoji potreba za djelotvornim inhibitorima proteinskih kinaza. Osim toga, kao što je to jasno stručnjacima u ovom području tehnike, poželjno je da inhibitori kinaza posjeduju i visok afinitet za jednu ili više ciljnih kinaza i visoku selektivnost u odnosu na druge proteinske kinaze.
Prema tome, cilj ovog izuma je otkriti potentna sredstva za liječenje očnih bolesti, poput makularne degeneracije povezane sa starenjem (ARMD), neovaskularizacije mrežnice (CNV), retinopatija (npr. dijabetična retinopatija, vitreoretinopatija, retinopatija u mlađoj dobi), retinitisa (npr. citomegalovirusni (CMV) retinitis), uveitisa, makularnog edema i glaukoma.
Još jedan cilj ovog izuma je otkriti potentne inhibitore proteinskih kinaza.
Još jedan cilj ovog izuma je otkriti djelotvorne inhibitore kinaza s jakim i selektivnim afinitetom za jednu ili više određenih kinaza.
Ovi i drugi ciljevi ovog izuma, koji će biti očigledni iz sljedećeg opisa, ostvareni su otkrićem indazolskih spojeva, njihovih farmaceutski prihvatljivih predlijekova, farmaceutski aktivnih metabolita, te farmaceutski njihovih prihvatljivih soli (takve spojeve, predlijekove, metabolite i soli skupno se navodi kao "sredstva"), opisanih niže, koji moduliraju i/ili inhibiraju aktivnost proteinskih kinaza. Farmaceutski pripravci koji sadrže takva sredstva korisni su u liječenju bolesti posredovanih kinaznom aktivnošću, poput raka, kao i drugih bolesnih stanja povezanih s neželjenom angiogenezom i/ili staničnom proliferacijom, poput dijabetične retinopatije, neovaskularnog glaukoma, reumatoidnog artritisa, te psorijaze. Nadalje, ova sredstva imaju pogodna svojstva koja se odnose na modulaciju i/ili inhibiciju kinazne aktivnosti povezane s VEGF-R, FGF-R, CDK kompleksima, CHK1, LCK, TEK, FAK i/ili fosforilaza-kinazom.
U općem aspektu ovaj izum odnosi se na spojeve sljedećih struktura:
[image] [image] [image] [image]
Ovaj izum također se odnosi na postupak moduliranja i/ili inhibiranja kinazne aktivnosti VEGF-R, FGF-R, CDK kompleksa, CHK1, LCK, TEK, FAK i/ili fosforilaza-kinaze primjenom spoja Formule I, II, III ili IV, ili njegovog farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli. Poželjni spojevi prema ovom izumu sa selektivnom aktivnošću naspram kinaza - tj. posjeduju značajnu aktivnost naspram jedne ili više specifičnih kinaza, uz istodobnu manju ili minimalnu aktivnost naspram jedne ili više različitih kinaza. U jednoj poželjnoj izvedbi ovog izuma spojevi prema ovom izumu su oni Formule I sa znatno većom potentnošću naspram receptora VEGF/tirozinske kinaze nego naspram FGF-R1 receptora/tirozinske kinaze. Ovaj izum također se odnosi na postupke moduliranja aktivnosti receptora VEGF/tirozinske kinaze bez značajnog moduliranja aktivnosti FGF receptora/tirozinske kinaze.
Spojeve prema ovom izumu može se pogodno upotrijebiti u kombinaciji s drugim poznatim terapijskim sredstvima. Kao primjer, spojevi Formule I, II, III ili IV koji posjeduju antiangiogenu aktivnost može se suprimijeniti s citotoksičnim kemoterapijskim sredstvima, poput taksola, taksotera, vinblastina, cisplatina, doksorubicina, adriamicina i slično, kako bi se postiglo pojačani antitumorski učinak. Dodatno ili sinergističko pojačanje terapijskog učinka također se može postići suprimjenom spojeva Formule I, II, III ili IV koji posjeduju antiangiogenu aktivnost s drugim antiangiogenim sredstvima, poput kombretastatina A-4, endostatina, prinomitata, celekoksiba, rofekoksiba, EMD121974, IM862, protu-VEGF monoklonskih protutijela, te anti-KDR monoklonskih protutijela. Primjeri dodatnih kombinacija dani su u dokumentima WO 0038716, WO 00387171, WO 0038715, WO 0038730, WO 0038718, Wo 0038665, WO 0037107, WO 0038786, WO 0038719, od kojih su svi istodobno podneseni 22. prosinca 1999. i uključeni u ovu specifikaciju kao reference u svojoj cijelosti i u sve svrhe.
Ovaj izum također se odnosi na farmaceutske pripravke, od kojih svi sadrže djelotvornu količinu sredstva kojeg se bira između spojeva Formule I i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, farmaceutski aktivnih metabolita i farmaceutski prihvatljivih predlijekova; i farmaceutski prihvatljivu podlogu ili vehikulum za takvo sredstvo. Ovaj izum nadalje osigurava postupke liječenja očnih bolesti/stanja i raka, kao i drugih bolesnih stanja povezanih s neželjenom angiogenezom i/ili staničnom proliferacijom, koji se sastoje u primjeni djelotvornih količina takvog sredstva na pacijentu kojem je potrebno takvo liječenje.
Spojevi prema ovom izumu Formule I, II, III i IV korisni su u liječenju očnih bolesti i posredovanju aktivnosti proteinskih kinaza. Specifičnije, ti spojevi su korisni kao antiangiogenetska sredstva i kao sredstva za moduliranje i/ili inhibiranje aktivnosti proteinskih kinaza, osiguravajući tako liječenje očnih bolesti i raka ili drugih bolesti povezanih sa staničnom proliferacijom posredovanih proteinskim kinazama.
Termin "alkil", kao što ga se upotrebljava u ovoj specifikaciji, odnosi se na nerazgranate i razgranate alkilne skupine s 1-12 atoma ugljika. Primjeri alkilnih skupina uključuju metil (Me), etil (Et), n-propil, izopropil, butil, izobutil, sec-butil, tert-butil (t-Bu), pentil, izopentil, tert-pentil, heksil, izoheksil i Slično. Termin "niži alkil" označuje alkil s 1-8 atoma ugljika (C1-8-alkil). Pogodni supstituirani alkili uključuju fluormetil, difluormetil, trifluormetil, 2-fluoretil, 3-fluorpropil, hidroksimetil, 2-hidroksietil, 3-hidroksipropil i Slično.
Termin "alkiliden" odnosi se na dvovalentni radikal s 1-12 atoma ugljika. Primjeri alkilidenskih skupina uključuju CH2, CHCH3, (CH3)2 i Slično.
Termin "alkenil" odnosi se na nerazgranate i razgranate alkenilne skupine s 2-12 atoma ugljika. Primjeri alkenilnih skupine uključuju prop-2-enil, but-2-enil, but-3-enil, 2-metilprop-2-enil, heks-2-enil i Slično.
Termin "alkinil" odnosi se na nerazgranate i razgranate alkinilne skupine s 2-12 atoma ugljika.
Termin "cikloalkil" odnosi se na zasićene ili djelomično nezasićene karbocikle s 3-12 atoma ugljika, uključujući bicikličke i tricikličke cikloalkilne strukture. Pogodni cikloalkili uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil i slično.
"Heterocikloalkilna" skupina trebala bi značiti zasićeni ili djelomično nezasićeni monociklički radikal koji sadrži atome ugljika, po mogućnosti 4 ili 5 atoma ugljika u prstenu, te najmanje 1 heteroatom, kojeg se bira između dušika, kisika i sumpora.
Termini "aril" i "heteroaril" odnose se na monocikličke i policikličke nezasićene ili aromatske prstenaste strukture, gdje se "aril" odnosi na one koji su karbocikli, a "heteroaril" se odnosi na one koji su heterocikli. Primjeri aromatskih prstenastih struktura uključuju fenil, naftil, 1,2,3,4-tetrahidronaftil, furil, tienil, pirolil, piridinil, pirazolil, imidazolil, pirazinil, piridazinil, 1,2,3-triazinil, 1,2,4-oksadiazolil, 1,3,4-oksadiazolil, 1H-tetrazol-5-il, indolil, kinolinil, benzofuranil, benzotiofenil (tianaftenil) i slično. Takvi ostaci mogu izborno biti supstituirani s kondenziranom prstenastom strukturom ili mostom, primjerice OCH2-O.
Termin "alkoksi" trebao bi biti radikal -O-alkil. Ilustrativni primjeri uključuju metoksi, etoksi, propoksi i slično.
Termin "ariloksi" predstavlja -O-aril, gdje aril je definiran kao gore.
Termin "cikloalkoksil" predstavlja -O-cikloalkil, gdje cikloalkil je definiran kao gore.
Termin "halogen" predstavlja klor, fluor, brom ili jod. Termin "halo" predstavlja klor, fluor, brom ili jod.
Općenito, različiti ostaci ili funkcionalne skupine za variranje formula mogu izborno biti supstituirani s jednim ili više pogodnih supstituenata. Primjeri supstituenata uključuju halogen (F, Cl, Br ili I), niži alkil, -OH, -NO2, -CN, -CO2H, -O-niži alkil, -aril, -aril-niži alkil, -CO2CH3, -CONH2, -OCH2CONH2, -NH2, -SO2NH2, halogenalkil (npr. -CF3, -CH2CF3), -O-halogenalkil (npr. -OCF3, -OCHF2) i Slično.
Termine "koji sadrži" i "uključuje" upotrebljava se u otvorenom, neograničujućem smislu.
Treba imati u vidu da iako spoj Formule I može pokazivati fenomen tautomerije, prikazi formula u ovoj specifikaciji izričito opisuju samo jedan od mogućih tautomernih oblika. Prema tome, treba imati u vidu da bi u ovom izumu formule trebale predstavljati sve tautomerne oblike opisanog spoja, a ne ograničavati se tek na specifični tautomerni oblik opisan prikazima formula.
Neki od spojeva prema ovom izumu mogu postojati kao pojedinačni stereoizomeri (tj. uglavnom čisti od drugih stereoizomera), racemati i/ili smjese enantiomera i/ili dijastereomera. Svi takvi pojedinačni stereoizomeri, racemati i njihove smjese trebali bi ući u opseg zaštite ovog izuma. Po mogućnosti, spojeve prema ovom izumu koji su optički aktivni upotrebljava se u optički čistom obliku.
Kao što to općenito podrazumijevaju stručnjaci u ovom području tehnike, optički čist spoj s 1 kiralnim centrom je onaj koji se uglavnom sastoji od 1 od 2 moguæa enantiomere (tj. enantiomerno je čist), a optički čist spoj s više od 1 kiralnog centra je onaj koji je i dijastereomerno čist i enantiomerno čist. Po mogućnosti, spojevi prema ovom izumu upotrebljava se u obliku koji je najmanje 90 % optički čist, tj. oblik koji sadrži najmanje 90 % pojedinačnog izomera (80 % enantiomera u suvišku ("e.e.") ili dijastereomera u suvišku ("d.e.")), poželjnije najmanje 95 % (90 % e.e. ili d.e.), još poželjnije najmanje 97,5 % (95 % e.e. ili d.e.), a najpoželjnije najmanje 99 % (98 % e.e. ili d.e.).
Uz to, te formule bi trebale pokriti i solatvirane kao i nesolatvirane oblike identificiranih struktura. Kao primjer, Formula I uključuje spojeve indicirane strukture u i hidratiranom i nehidratiran obliku. Drugi primjeri solvata uključuju strukture u kombinaciji s izopropanolom, etanolom, metanol, DMSO, etil-acetatom, octenom kiselinom ili etanolaminom.
Uz spojeve Formule I, II, III i IV, ovaj izum uključuje i farmaceutski prihvatljive predlijekove, farmaceutski aktivne metabolite i farmaceutski prihvatljive soli takvih spojeva.
"Farmaceutski prihvatljivi predlijek" je spoj kojeg se u fiziološkim uvjetima ili solvolizom može prevesti u specificirani spoj ili u farmaceutski prihvatljivu sol takvog spoja.
"Farmaceutski aktivni metabolit" trebao bi značiti farmakološki aktivni produkt metabolizma specificiranog spoja ili njegove soli u organizmu.
Metabolite spoja može se identificirati rutinskim tehnikama, poznatim u ovom području tehnike, a njihove aktivnosti odrediti u ispitivanjima poput onih opisanih u ovoj specifikaciji.
Predlijekove i aktivne metabolite spoja može se identificirati rutinskim tehnikama, poznatim u ovom području tehnike. Vidjeti, npr., G. Bertolini i suradnici: J. Med. Chem., 40, 2011-2016, (1997.); Shan, D. i suradnici: J. Pharm. Sci., 86 (7), 765-767; K. Bagshawe: Drug Dev. Res., 34, 220-230, (1995.); N. Bodor: Advances in Drug Res., 13, 224-331, (1984.); H. Bundgaard: "Design of Prodrugs" (Elsevier Press, (1985.)); i I.K. Larsen: "Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development" (Krogsgaard-Larsen i suradnici: ur., Harwood Academic Publishers, (1991.)).
"Farmaceutski prihvatljiva sol" trebala bi značiti sol koja zadržava biološku djelotvornost slobodnih kiselina i baza specificiranog spoja, te da nije biološki ili inače nepoželjna. Spoj prema ovom izumu može posjedovati dovoljno kiselih, dovoljno bazičnih ili obih funkcionalnih skupina, te odgovarajuće reagirati s bilo kojim od niza anorganskih ili organskih baza i anorganskih i organskih kiselina kako bi tvorio farmaceutski prihvatljivu sol. Primjeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju soli koje se dobiva reakcijom spojeva prema ovom izumu s mineralnom ili organskom kiselinom ili anorganskom bazom, poput soli koje uključuju sulfate, pirosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, fosfate, monohidrogenfosfate, dihidrogenfosfate, metafosfate, pirofosfate, kloride, bromide, jodide, acetate, propionate, dekanoate, kaprilate, akrilate, formijate, izobutirate, kaproate, heptanoate, propiolate, oksalate, malonate, sukcinate, suberate, sebakate, fumarate, maleate, butin-1,4-dioate, heksin-1,6-dioate, benzoate, klorbenzoate, metilbenzoate, dinitrobenzoate, hidroksibenzoate, metoksibenzoate, ftalate, sulfonate, ksilensulfonate, fenilacetate, fenilpropionate, fenilbutirate, citrate, laktate, �-hidroksibutirate, glikolate, tartarate, metansulfonate, propansulfonate, naftalen-1-sulfonate, naftalen-2-sulfonate i mandelate.
Ako je spoj prema ovom izumu baza, željenu farmaceutski prihvatljivu sol može se pripraviti bilo kojim pogodnim postupkom dostupnim u ovom području tehnike, primjerice, obradom slobodne baze anorganskom kiselinom, poput klorovodične kiseline, bromovodične kiseline, sumporne kiseline, dušične kiseline, fosforne kiseline i slično, ili organskom kiselinom, poput octene kiseline, maleinske kiseline, jantarne kiseline, bademove kiseline, fumarne kiseline, malonske kiseline, pirogrožđane kiseline, oksalne kiseline, glikolne kiseline, salicilne kiseline, piranozidilne kiseline, poput glukuronske kiseline ili galakturonske kiseline, �-hidroksi kiseline, poput limunske kiseline ili vinske kiseline, aminokiseline, poput asparaginske kiseline ili glutaminske kiseline, aromatske kiseline, poput benzojeve kiseline ili cimetne kiseline, sulfonske kiseline, poput p-toluensulfonske kiseline ili etansulfonske kiseline, ili slično.
Ako je spoj prema ovom izumu kiselina, željenu farmaceutski prihvatljivu sol može se pripraviti bilo kojim pogodnim postupkom, primjerice obradom slobodne kiseline anorganskom ili organskom bazom, poput amina (primarni, sekundarni ili tercijarni), hidroksida alkalnog metala ili hidroksidom zemnoalkalnog metala, ili slično. Ilustrativni primjeri pogodnih soli uključuju organske soli koje se dobiva iz aminokiselina, poput glicina i arginina, amonijaka, primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, te cikličkih amina, poput piperidina, morfolina i piperazina, te anorganske soli koje se dobiva iz natrija, kalcija, kalija, magnezija, mangana, željeza, bakra, cinka, aluminija i litija.
U slučaju sredstava koja su krutine, stručnjacima u ovom području tehnike je jasno da spojevi prema ovom izumu i soli mogu postojati u različitim kristalnim ili polimorfnim oblicima, od kojih bi svi trebali ući u opseg zaštite ovog izuma i specificirane formule.
Terapijski djelotvorne količine sredstava prema ovom izumu može se upotrijebiti u liječenju bolesti posredovanih modulacijom ili regulacijom proteinskih kinaza. "Djelotvorna količina" trebala bi značiti da je količina sredstva koja, prilikom primjene na sisavcu kojem je potrebno takvo liječenje, dovoljna za liječenje bolesti posredovane aktivnošću jedne ili više proteinskih kinaza, poput tirozinskih kinaza. Prema tome, npr., terapijski djelotvorna količina spoja Formule I, njegove soli, aktivnog metabolita ili predlijeka je količina dovoljna za moduliranje, reguliranje ili inhibiranje aktivnosti jedne ili više proteinskih kinaza, tako da je bolesno stanje posredovano tom aktivnošću smanjeno ili ublaženo.
Količina danog sredstva koja će odgovarati takvoj količini ovisit će o čimbenicima poput određenog spoja, bolesnog stanja i njegove težine, identitetu (npr. težini) sisavca kojem je potrebno liječenje, no ipak je može rutinski odrediti stručnjak u ovom području tehnike. "Liječenje" bi u najmanju ruku trebalo značiti ublažavanje bolesnog stanja kod sisavaca, poput čovjeka, pogođenog, najmanje dijelom, aktivnošću jedne ili više proteinskih kinaza, poput tirozinskih kinaza, i uključuje: sprječavanje bolesnog stanja kod sisavaca, osobito kada se za sisavca nađe da ima sklonost razvoju bolesnog stanja, no još nije postavljena dijagnoza da ga ima; moduliranje i/ili inhibiranje bolesnog stanja; i/ili ublažavanje bolesnog stanja.
Sredstva prema ovom izumu može se pripraviti reakcijama i sinteznim shemama opisanim niže, uz upotrebu tehnika dostupnih u ovom području tehnike i lako dostupnih polaznih materijala.
U jednom općem postupku sinteze spojeve Formule I se dobiva prema sljedećoj reakcijskoj shemi:
[image]
6-nitroindazol (spoj V) obradi se jodom i bazom, npr., NaOH, u vodeno-organskoj smjesi, po mogućnosti s dioksanom. Smjesu se zakiseli, a produkt izdvoji filtracijom. U dobiveni 3-jod-6-nitroindazol u sustavu diklormetan:50 % vodena otopina KOH na 0°C doda se reagens za uvođenje zaštitne skupine ("Pg") (gdje X = halogen), po mogućnosti trimetilsililetoksimetil-klorid (SEM-Cl), i katalizator faznih prijelaza, npr. tetrabutilamonijev bromid (TBABr). Nakon 1-4 sata, dvije faze se razrijedi, organske slojeve odvoji, osuši natrijevim sulfatom, filtrira, te koncentrira. Sirovi produkt pročisti se kromatografijom na silikagelu kako bi se dobilo spojeve formule VI. Obrada spojeva formule VI u pogodnom organskom otapalu pogodnim R1-organometalnim reagensom, po mogućnosti R1-boronskom kiselinom, u prisutnosti vodene otopine baze, npr. natrijevog karbonata, i pogodnog katalizatora, po mogućnosti Pd(PPh3)4, dobije se, nakon ekstrakcije i kromatografije na silikagelu, spojeve formule VII. Supstituent R1 može se zamijeniti u spojevima formule VII ili kasnijim međuproduktima u ovoj shemi oksidativnim cijepanjem (npr. ozonolizom), uz naknadne adicije na dobivenu aldehidnu funkcionalnu skupinu Wittigovom ili kondenzacijskom pretvorbom (tipiziranom u Primjeru 42(a-e)). Obradom spojeva formule VII reducensom, po mogućnosti SnCl2, dobiva se, nakon konvencionalne obrade vodenog sloja i pročišćavanja, spojeve formule VIII. Kod niza derivata gdje Y = NH ili N-niži alkil, spojeve formule VIII može se obraditi aril- ili heteroaril-kloridima, bromidima, jodidima ili triflatima u prisutnosti baze, po mogućnosti Cs2CO3, i katalizatora, po mogućnosti Pd-BINAP, (gdje Y = N-niži alkil, uz naknadni korak alkilacije) kako bi se dobilo spojeve formule X. Kako bi se dobilo druge spojnice Y spojevima formule VIII doda se natrijev nitrit u standardnim uvjetima ohlađene vodene otopine kiseline, uz naknadno dodavanje kalijevog jodida i blago zagrijavanje. Standardnom obradom i pročišćavanjem dobije se jodidne spojeve formule IX.
Obrada spojeva formule IX organometalnim reagensom, npr., butillitijem, potiče litijsko-halogensku izmjenu. Ovaj međuprodukt zatim reagira s R2 elektrofilom, npr. karbonilom ili triflatom, uz moguće posredovanje dodatnih metala i katalizatora, po mogućnosti cinkovog klorida i Pd(PPh3)4, kako bi se dobilo spojeve formule X. Alternativno se spojeve formule IX može obraditi organometalnim reagensom, poput organoboronske kiseline u prisutnosti katalizatora, npr. Pd(PPh3)4, u atmosferi ugljičnog monoksida, kako bi se dobilo spojeve formule X. Alternativno se kod derivata gdje Y = NH ili S, spojeve formule IX može obraditi odgovarajućim aminima ili tiolima u prisutnosti baze, po mogućnosti Cs2CO3 ili K3PO4, i katalizatora, po mogućnosti Pd-BINAP ili Pd-(biscikloheksil)bifenilfosfin, kako bi se dobilo spojeve formule X. Radi dobivanja daljnjih derivata ove serije dalje se može upotrijebiti konvencionalne izmjene funkcionalnih skupina, poput oksidacija, redukcija, alkilacija, acilacija, kondenzacija i uklanjanja zaštite, čime se dobije konačne spojeve Formule I.
Spojeve prema ovom izumu Formule I također se može dobiti općim postupkom prikazanim u sljedećoj shemi:
[image]
6-Jodindazol (XI) obradi se jodom i bazom, npr., NaOH, u vodeno-organskoj smjesi, po mogućnosti s dioksanom. Smjesu se zakiseli, a produkt XII izdvoji filtracijom. U dobiveni 3,6-dijodindazol u sustavu diklormetan:50 % vodena otopina KOH na 0°C doda se reagens za uvođenje zaštitne skupine, po mogućnosti SEM-Cl, i katalizator faznih prijelaza, npr., TBABr. Dvije faze se razrijedi, a organske slojeve odvoji, osuši natrijevim sulfatom, filtrira, te koncentrira. Sirovi produkt pročisti se kromatografijom na silikagelu kako bi se dobilo spojeve formule XIII. Obradom spojeva formule XIII u pogodnom organskom otapalu pogodnim R2-organometalnim reagensom, npr., R2-ZnCl ili bor R2-bornim reagensom i pogodnim katalizatorom, po mogućnosti Pd(PPh3)4, dobije se, nakon ekstrakcije i kromatografije na silikagelu, spojeve formule XIV. Obradom spojeva formule XIV u pogodnom organskom otapalu pogodnim R1-organometalnim reagensom (npr. bor R1-bornim reagensom ili R1-ZnCl), u prisutnosti vodene otopine baze, natrijevog karbonata i pogodnog katalizatora, po mogućnosti Pd(PPh3)4, dobije se, nakon ekstrakcije i kromatografije na silikagelu, spojeve formule XV. Radi dobivanja daljnjih derivata ove serije dalje se može upotrijebiti konvencionalne izmjene funkcionalnih skupina, poput oksidacija, redukcija, alkilacija, acilacija, kondenzacija i uklanjanja zaštite, čime se dobije konačne spojeve Formule I.
Alternativno se spojeve Formule I gdje R2 je supstituirani ili nesupstituirani Y-Ar, gdje Y je O ili S, može dobiti prema sljedećoj općoj shemi:
[image]
Miješanu otopinu 3-klorcikloheks-2-enona (XV) u acetonu, H-R2, i bezvodni kalijev karbonat refluksira 15-24 sata, ohladi se, te filtrira. Koncentriranjem i kromatografiranjem filtrata na silikagelu dobije se 3-R2-cikloheks-2-enon (XVI).
Ketoni formule XVI mogu reagirati s pogodnom bazom (M-B), po mogućnosti litijevim bis(trimetilsilil)amidom, te reagirati s R1-CO-X (gdje X = halogen), čime se nakon standardne obrade kiselinom i pročišćavanja dobije spojeve formule XVII. Ovaj produkt, u HOAc/EtOH, pomiješa se s hidrazin monohidratom, grije na pogodnu temperaturu kroz odgovarajući vremenski period, po mogućnosti 2-4 sata na 60-80°C. Nakon hlađenja, smjesu se izlije u zasićenu otopinu natrijevog bikarbonata, ekstrahira organskim otapalom, koncentrira, te pročisti na silikagelu kako bi se dobilo spojeve formule XVIII. Spojeve formule XVIII može se oksidirati u nizu različitih poznatih postupaka kako bi se dobilo spojeve Formule I.
[image]
Alternativni postupak sinteze spojeva prema ovom izumu je sljedeći:
Uz ove uvjete u koracima a) do i):
a) NaNO2, Br2, HBr, 0-5°C; prinos 48 %;
b) Pd(OAc)2, Pd(o-tolil)3, diizopropiletilamin (DIEA), DMF, H2O, degaziranje, mikrovalovi, 110°C, 1 sat; prinos 68 %;
c) Željezni prah, zasićena vodena otopina NH4OH, EtOH, 45°C; prinos 72 %;
d) Metil-2-brombenzoat, R-BINAP, Pd2(dba)3, Cs2CO3, toluen, degaziranje, 110°C preko noći; prinos 74 %;
e) KOH, MeOH:THF:H2O (3:1:1) 70°C, 2-3 sata; kvantitativno;
f) Zaštićeni amin, HATU, NEt3, DMF, 2 sata na sobnoj temperaturi; prinos 80 %;
g) TsOH (12 % TsOH u HOAc), EtOH (10 % vodena otopina); prinos 44 %;
h) Tributilvinilkositar, Pd(PPh3)4, 2,6-di-t-butil-4-metilfenol, toluen, degaziranje, 105°C; prinos 31 %;
i) Pd(OAc)2, Pd(o-tolil)3, DIEA, DMF, degaziranje, 100°C; prinos približno 70 %.
Druge spojeve Formule I može se dobiti na načine analogne općim postupcima opisanim gore ili detaljnim postupcima opisanim u primjerima u ovoj specifikaciji. Afinitet spojeva prema ovom izumu naspram receptora može se povećati osiguravanjem višestrukih kopija liganda u velikoj blizini, po mogućnosti uz upotrebu kostura kojeg osigurava nosivi ostatak. Pokazalo se da osiguravanje takvih viševalentnih spojeva s optimalnim razmakom između ostataka dramatično poboljšava vezanje na receptor. Vidjeti, npr., Lee i suradnici: Biochem., 23, 4255, (1984.). Viševalentnost i razmak može se kontrolirati odabirom pogodnog nosivi ostatka ili spojnih jedinica. Takvi ostaci uključuju molekulske nosače koji sadrže više različitih funkcionalnih skupina koje mogu reagirati s funkcionalnim skupinama povezanim s spojevima prema ovom izumu. Svakako da se može upotrijebiti niz različitih nosača, uključujući proteine poput BSA ili HAS, gdje više različitih peptida uključuje, primjerice pentapeptide, dekapeptide, pentadekapeptide i slično. Peptidi ili proteini mogu sadržavati željeni broj aminokiselinskih ostataka sa slobodnim amino skupinama u njihovim pobočnim lancima; međutim, da se dobije stabilne spojnice također se može upotrijebiti i druge funkcionalne skupine, poput sulfhidrilnih skupina ili hidroksilnih skupina.
Poželjni su spojevi koji potentno reguliraju, moduliraju ili inhibiraju aktivnost proteinskih kinaza povezanih s receptorima VEGF, FGF, CDK kompleksima, TEK, CHK1, LCK, FAK i fosforilaza-kinazom između ostalog, te koji inhibiraju angiogenezu i/ili staničnu profileraciju i to je jedna poželjna izvedba ovog izuma. Ovaj izum nadalje se odnosi na postupke moduliranja ili inhibiranja aktivnosti proteinskih kinaza, primjerice u tkivu sisavaca, primjenom sredstva prema ovom izumu. Aktivnost spojeva prema ovom izumu kao modulatora aktivnosti proteinskih kinaza, poput aktivnosti kinaza, može se mjeriti bilo kojim od postupaka dostupnih stručnjacima u ovom području tehnike, uključujući ispitivanja in vivo i/ili in vitro. Primjeri pogodnih ispitivanja mjerenja aktivnosti uključuju ona opisana u C. Parast i suradnici: BioChemistry, 37, 16788-16801, (1998.); Jeffrey i suradnici: Nature, 376, 313-320, (1995.); WIPO Međunarodnoj patentnoj prijavi, objavljenoj kao WO 97/34876; te WIPO Međunarodnoj patentnoj prijavi, objavljenoj kao WO 96/14843. Ova svojstva može se procijeniti, primjerice pomoću jednog ili više postupaka biološkog ispitivanja iznijetih u primjerima, niže.
Aktivna sredstva prema ovom izumu može se formulirati u farmaceutske pripravke kao što je opisano niže. Farmaceutski pripravci prema ovom izumu sadrže količinu spoja Formule I, II, III ili IV djelotvornu za moduliranje, reguliranje ili inhibiranje i inertnu, farmaceutski prihvatljivu podlogu ili razrjeđivač. U jednoj izvedbi farmaceutskih pripravaka osigurane su djelotvorne razine sredstava prema ovom izumu kako bi se postiglo terapijske pogodnosti koje uključuju modulaciju proteinskih kinaza. Pod "djelotvornim razinama" misli se na razine kod kojih su učinci proteinskih kinaza, u najmanju ruku, regulirani. Ove pripravke dobiva se u obliku jedinice doziranja koji odgovara načinu primjene, npr. parenteralnoj ili oralnoj primjeni.
Sredstvo prema ovom izumu primjenjuje se u konvencionalnom obliku doziranja, kojeg se načini miješanjem terapijski djelotvorne količine sredstva (npr. spoja Formule I) kao aktivnog sastojka s odgovarajućim farmaceutskim podlogama ili razrjeđivačima, prema konvencionalnim postupcima. Ovi postupci mogu uključivati miješanje, granuliranje i komprimiranje ili otapanje sastojaka, što već odgovara željenom pripravku.
Upotrijebljena farmaceutska može biti bilo čvrsta ili tekuća. Primjeri čvrstih podloga su laktoza, saharoza, talk, želatina, agar, pektin, arapska guma, magnezijev stearat, stearinska kiselina i Slično. Primjeri tekućih podloga su sirup, kikirikijevo ulje, maslinovo ulje, voda i slično. Slično tome, podloga ili razrjeđivač može uključivati materijal za vremensko kašnjenje ili otpuštanje u vremenu poznat u ovom području tehnike, poput gliceril-monostearata ili gliceril-distearata samog ili s voskom, etilcelulozom, hidroksipropilmetilcelulozom, metil-metakriliratima i slično.
Može se upotrijebiti niz različitih farmaceutskih oblika. Prema tome, ako se upotrebljava čvrsta podloga, pripravak se može tabletirati, staviti u tvrdu želatinsku kapsulu u obliku praha ili peleta, ili biti u obliku dražeje ili pastile. Količina čvrste podloge može biti različita, no općenito će se kretati od otprilike 25 mg do otprilike 1 g. Ako se upotrebljava tekuća podloga, pripravak će biti u obliku sirupa, emulzije, kapi, meke želatinske kapsule, sterilne injekcijske otopine ili suspenzije u ampuli ili bočici ili suspenzije u nevodenoj tekućini.
Kako bi se dobilo stabilan oblik doziranja topiv u vodi, farmaceutski prihvatljivu sol sredstva prema ovom izumu otopi se u vodenoj otopini organske ili anorganske kiseline, poput 0,3 M otopine jantarne kiseline ili limunske kiseline. Ako topivi solni oblik nije dostupan, sredstvo se može otopiti u pogodnom suotapalu ili kombinacijama suotapala. Primjeri pogodnih suotapala uključuju, no ne ograničuju se na alkohol, propilen-glikol, polietilen-glikol 300, polisorbat 80, gilcerol i slično, u rasponu koncentracija od 0-60 % ukupnog volumena. U primjeru izvedbe spoj Formule I otopi se u DMSO-u, te razrijedi vodom. Pripravak također može biti u obliku otopine solnog oblika aktivnog sastojka u odgovarajućem vodenom vehikulumu, poput vode ili izotonične fiziološke otopine ili otopine dekstroze.
Treba imati u vidu da će stvarne doze sredstava upotrijebljene u pripravcima prema ovom izumu ovisiti o određenom kompleksu kojeg se upotrebljava, određenom formuliranom pripravku, načinu primjene i određenom mjestu, domaćinu i bolesti koju se liječi. Stručnjaci u ovom području tehnike mogu odrediti optimalne doze za dane uvjete u konvencionalnim ispitivanjima za određivanje doze imajući u vidu eksperimentalne podatke za dano sredstvo. Prilikom oralne primjene primjer dnevne općenito upotrijebljene doze je otprilike 0,001-1000 mg/kg tjelesne težine, poželjnije otprilike 0,001-50 mg/kg tjelesne težine, gdje se liječenje ponavlja u odgovarajućim intervalima. Primijenjene predlijekove u pravilu se dozira u težinskim razinama koje su kemijski ekvivalentne težinskim razinama posve aktivnog oblika.
Pripravke prema ovom izumu može se načiniti na načine općenito poznate u proizvodnji farmaceutskih pripravaka, npr. uz upotrebu konvencionalnih tehnika, poput miješanja, otapanja, granuliranja, dražiranja, levigiranja, emulgiranja, inkapsuliranja, uhvaćenja ili liofiliziranja. Farmaceutske pripravke može se formulirati u konvencionalan način, uz upotrebu jedne ili više fiziološki prihvatljivih podloga, koje se može birati između pomoćnih tvari i pomoćnih sredstava koja olakšavaju procesiranje aktivnih spojeva u pripravke koje se može upotrijebiti farmaceutski.
Prava formulacija ovisi o odabranom načinu primjene. Kod injekcija se sredstva prema ovom izumu može formulirati u vodene otopine, po mogućnosti u fiziološki kompatibilne pufere, poput Hanksove otopine, Ringerove otopine ili pufera na bazi fiziološke otopine. Prilikom transmukozalne primjene u formulaciji se upotrebljava sredstva za penetraciju koja odgovaraju prepreci koju treba svladati. Takva sredstva za penetraciju općenito su poznata u ovom području tehnike.
Prilikom oralne primjene spojeve se može lako formulirati miješanjem aktivnih spojeva s farmaceutski prihvatljivim podlogama poznatim u ovom području tehnike. Takve podloge omogućuju formuliranje spojeva prema ovom izumu u tablete, pilule, dražeje, kapsule, tekućine, gelove, sirupe, guste otopine, suspenzije i slično, namijenjene oralnom unosu u pacijenta kojeg treba liječiti. Farmaceutske pripravke namijenjene oralnoj upotrebi može se načiniti uz upotrebu čvrste pomoćne tvari u smjesi s aktivnim sastojkom (sredstvom), uz izborno mljevenje dobivene smjese, te procesiranjem smjese granula nakon dodavanja pogodnih pomoćnih sredstava, po želji, kako bi se dobilo tablete ili dražejne jezgre. Pogodne pomoćne tvari uključuju: punila, poput šećera, uključujući laktozu, saharozu, manitol ili sorbitol; te celulozne pripravke, primjerice kukuruzni škrob, pšenični škrob, rižin škrob, krumpirov škrob, želatinu, gumu, metilcelulozu, hidroksipropilmetilcelulozu, natrij-karboksimetilcelulozu ili polivinilpirolidon (PVP).
Po želji, može se dodati i sredstva za raspadanje, poput umreženog polivinilpirolidona, agara ili alginske kiseline ili njene soli, poput natrijevog alginata.
Dražejnim jezgrama doda se pogodne obloge. U tu svrhu može se upotrijebiti koncentrirane šećerne otopine, koje izborno mogu sadržavati arapsku gumu, polivinilpirolidon, Carbopol gel, polietilen-glikol i/ili titanijev dioksid, otopine za lakiranje, te pogodna organska otapala ili smjese otapala. Tabletama ili oblogama za dražeje može se dodati i bojila ili pigmente radi identifikacije ili karakteriziranja različitih kombinacija aktivnih sredstava.
Farmaceutski pripravci koje se može upotrijebiti oralno uključuju push-fit kapsule, načinjene od želatine, kao i meke, hermetički zatvorene kapsule načinjene od želatine i plastifikatora, poput glicerola ili sorbitola. Push-fit kapsule mogu sadržavati aktivne sastojke u smjesi s punilima, poput laktoze, vezivima, poput škrobova, i/ili maziva, poput talka ili magnezijevog stearata, i, izborno, stabilizatorima. U mekim kapsulama aktivna sredstva se može otopiti ili suspendirati u pogodnim tekućinama, poput masnih ulja, tekućeg parafina ili tekućih polietilen-glikola. Uz to, može se dodati i stabilizatore. Sve formulacije za oralnu primjenu trebale bi biti u doziranjima pogodnim za takvu primjena. Kod bukalne primjena pripravci mogu biti u obliku tableta ili pastila, formuliranih na konvencionalan način.
Kod intranazalne primjene ili inhalacijom spojevi namijenjeni upotrebi prema ovom izumu pogodno se unaša u obliku prezentacije aerosolnog spreja iz pakiranja ili nebulizatora pod tlakom, uz upotrebu pogodnog pogonskog plina, npr. diklordifluormetana, triklorfluormetana, diklortetrafluoretana, ugljičnog dioksida ili drugog pogodnog plina. U slučaju aerosola pod tlakom jedinicu doziranja može se odrediti pomoću ventila, kojim se unaša odmjerena količina. Kapsule i uloške od želatine namijenjeni upotrebi u inhalatoru ili insuflatororu i Slično može se formulirati tako da sadrže praškastu smjesu spoja i pogodne praškaste podloge, poput laktoze ili škroba.
Spojeve se može formulirati za parenteralnu primjenu injekcijom, npr. bolusnom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Injekcijske formulacije može se prezentirati u obliku jedinice doziranja, npr. u ampulama ili u višedoznim spremnicima, uz dodatak konzervansa. Pripravci mogu biti u obliku suspenzija, otopina ili emulzija u uljnim ili vodenim vehikulumima, te mogu sadržavati formulacijska sredstva, poput sredstava za suspendiranje, stabiliziranje i/ili dispergiranje.
Farmaceutske formulacije za parenteralnu primjenu uključuju vodene otopine aktivnih spojeva u obliku topivom u vodi. Uz to, suspenzije aktivnih sredstava može se pripraviti kao odgovarajuće uljne injekcijske suspenzije. Pogodna lipofilna otapala ili vehikulumi uključuju masna ulja, poput sezamovog ulja, ili sintetske estere masnih kiselina, poput etil-oleata ili triglicerida, ili liposome. Vodene injekcijske suspenzije mogu sadržavati tvari koje povećavaju viskoznost suspenzije, poput natrij-karboksimetilceluloze, sorbitola ili dekstrana. Izborno, suspenzija također može sadržavati pogodne stabilizatore ili sredstva koja povećavaju topivost spojeva, kako bi se omogućilo dobivanje visoko koncentriranih otopina.
Prilikom primjene u oko, spoj Formule I, II, III ili IV se unaša u farmaceutski prihvatljivom oftalmičkom vehikulumu, tako da spoj ostaje u kontaktu s površinom oka kroz dovoljan vremenski period kako bi se omogućilo da spoj prođe kroz rožnicu i/ili bjeloočnicu i unutarnje regije oka, uključujući, primjerice, prednju komoru, stražnju komoru, staklasto tijelo, očnu vodicu, staklastu tekućinu, rožnicu, šarenicu/zrakasto tijelo, leću, žilnicu/mrežnicu i bjeloočnicu. Farmaceutski prihvatljivi oftalmički vehikulum može biti mast, biljno ulje ili inkapsulacijski materijal. Spoj prema ovom izumu također se može injicirati izravno u staklastu tekućinu ili očnu vodicu.
Nadalje, spoj se također može primijeniti dobro poznatim, prihvatljivim postupcima, poput suptenonskih i/ili supkonjunktivnih injekcija. Kao što je dobro poznato u oftalmologiji, makulu prije svega čine čunjići mrežnice i to je regija maksimalne oštrine vida u mrežnici. Tenonova čahura ili Tenonova membrana u dodiru je s bjeloočnicom. Očna spojnica 36 pokriva usko područje očne jabučice iza limba (bulbarna očna spojnica), te se presavija prema gore (prostor ispod gornjeg kapka ) ili dolje (prostor ispod donjeg kapka) da pokrije unutarnje površine gornjeg kapka odnosno donjeg kapka. Očna spojnica u je dodiru s površinom Tenonove čahure.
Bjeloočnica i Tenonova čahura definiraju vanjsku površinu očne jabučice. Prilikom liječenja ARMD, CNV, retinopatija, retinitisa, uveitisa, cistoidnog makularnog edema (CME), glaukoma i drugih bolesti ili stanja stražnjeg segmenta oka, poželjno je ostaviti depo specifične količine oftalmički prihvatljivog farmaceutski aktivnog sredstva izravno na vanjsku površinu bjeloočnice i ispod Tenonove čahure. Uz to, u slučaju ARMD i CME najpoželjnije je ostaviti depo izravno na vanjsku površinu bjeloočnice, ispod Tenonove čahure, općenito iznad žute pjege. U ispitivanju na novozelandskim bijelim kuniæima depo lijeka 4,9(11)-pregnadien-17�,21-diol-3,20-dion-21-acetata, angiostatskog steroida dostupnog od strane firme Steraloids, Inc., Wilton, New Hampshire, je ostavljen izravno na vanjsku površinu bjeloočnice, ispod Tenonove čahure, blago iza ekvatora očiju kuniæa. Takav depo lijeka doveo je do koncentracije angiostatskog steroida, s prosjekom preko cijele mrežnice, što je izmjereno dan nakon injekcije, koja je otprilike 10 × veća od one prilikom unosa putem depoa smještenog ispod očne spojnice nego iznad Tenonove čahure očiju kuniæa. S obzirom da je Tenonova čahura kod novozelandskog bijelog kuniæa vrlo tanka, ovi povoljni rezultati su vrlo neočekivani. Važno je primijetiti da je Tenonova čahura ljudskog oka također vrlo tanka. 4,9(11)-Pregnadien-17�,21-diol-3,20-dion-21-acetat i srodan spoj 4,9(11)-pregnadien-17�,21-diol-3,20-dion su potanje opisani u US patentima br. 5,770,592 i 5,679,666, uključenima u ovu specifikaciju u svojoj cijelosti kao reference.
Alternativno aktivni sastojak može biti u obliku praha za zgotavljanje s pogodnim vehikulumom, npr. sterilnom apirogenom vodom, prije upotrebe. Spojeve se također može formulirati u rektalne pripravke, poput supozitorija ili retencijskih klizmi, koji npr. sadrže konvencionalne supozitorijske podloge, poput kakao-maslaca ili drugih glicerida.
Uz formulacije opisane gore, spojeve se također može formulirati kao depo pripravak. Takve dugodjelujuće formulacije može se primijeniti usađivanjem (primjerice supkutano ili intramuskularno), intramuskularnom injekcijom ili gore navedenom suptenonskom ili intravitrealnom injekcijom.
U osobito poželjnim izvedbama ovog izuma spojeve se može pripraviti za topikalnu primjenu u fiziološkoj otopini (u kombinaciji s bilo kojim konzervansom i antimikrobnim sredstvom koje se uobičajeno upotrebljava u okularnim pripravcima), te primijeniti u obliku kapi za oči. Otopinu ili suspenziju antiangiogenog čimbenika može se pripraviti u čistom obliku, te primijeniti nekoliko puta dnevno. Alternativno se antiangiogene pripravke, koje se pripravlja kao što je opisano gore, također može primijeniti izravno na rožnicu.
U poželjnim izvedbama pripravak se načini s mukoadhezivnim polimerom, koji se veže na rožnicu. Prema tome, primjerice, spojeve se može formulirati s pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (primjerice u obliku emulzije u prihvatljivom ulju) ili ionskoizmjenjivačkim smolama, ili kao niskotopive derivate, primjerice kao niskotopivu sol. U daljnjim izvedbama antiangiogene čimbenike ili antiangiogene pripravke se može upotrijebiti kao dodatak konvencionalnoj terapiji steroidima.
Farmaceutska podloga za hidrofobne spojeve je sustav suotapala koji sadrži benzil-alkohol, nepolarni surfaktant, organski polimer koji se miješa s vodom i vodenu fazu. Sustav suotapala može biti VPD sustav suotapala. VPD je otopina 3 % tež./vol. benzil-alkohola, 8 % tež./vol. nepolarnog surfaktanta polisorbata 80 i 65 % tež./vol. polietilen-glikola 300, dopunjen do konačnog volumena apsolutnim etanolom. VPD sustav suotapala (VPD:5W) sadrži VPD razrijeđen 1:1,5 % vodenom otopinom dekstroze. Ovaj sustav suotapala dobro otapa hidrofobne spojeve, a i sam je nisko toksičan prilikom sistemne primjene. Odnosi u sustavu suotapala svakako mogu znatno varirati bez štetnog utjecaja po topivost i toksičnost kao svojstva. Nadalje, identitet komponenata suotapala može varirati: primjerice, umjesto polisorbata 80 može se upotrijebiti i druge nisko toksične nepolarne surfaktante; veličina polietilen-glikolske frakcije može varirati; polietilen-glikol mogu zamijeniti i drugi biokompatibilni polimeri, npr. polivinilpirolidon; dekstrozu se može zamijeniti i drugim šećerima ili polisaharidima.
Alternativno se može upotrijebiti i druge sustave za unos hidrofobnih farmaceutskih spojeva. Liposomi i emulzije poznati su primjeri vehikuluma za unos ili podloga za hidrofobne lijekove. Također može se upotrijebiti i izvjesna organska otapala poput dimetil-sulfoksida, iako obično pod cijenu veće toksičnost. Uz to, spojeve se može unašati i uz upotrebu sustava za produljeno otpuštanje, poput polupropusnih matrica čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže terapijsko sredstvo. Uobičajeni su različiti materijali za produljeno otpuštanje i poznati su stručnjacima u ovom području tehnike. Kapsule za produljeno otpuštanje mogu, ovisno o svojoj kemijskoj prirodi, otpuštati spojeve nekoliko tjedana, pa do preko 100 dana. Ovisno o kemijskoj prirodi i biološkoj stabilnosti terapijskog reagensa može se upotrijebiti i dodatne strategije za stabilizaciju proteina.
Farmaceutski pripravci također mogu sadržavati i pogodne čvrste ili želatinozne podloge ili pomoćne tvari. Primjeri takvih podloga ili pomoćnih tvari uključuju kalcijev karbonat, kalcijev fosfat, šećera, škrobove, celulozne derivate, želatinu i polimere poput polietilen-glikola.
Neke od spojeva prema ovom izumu može se dobiti u obliku soli s farmaceutski kompatibilnim protuionima. Farmaceutski kompatibilne soli može se dobiti s mnogim kiselinama, uključujući klorovodičnu, sumpornu, octenu, mliječnu, vinsku, jabučnu, jantarnu itd. Soli su često topivije u vodenim ili drugim protonskim otapalima nego odgovarajući slobodni bazični oblici.
Dobivanje poželjnih spojeva prema ovom izumu detaljno je opisano u sljedećim primjerima, no stručnjak u ovom području tehnike će prepoznati da se opisane kemijske reakcije može lako prilagoditi za dobivanje niza drugih inhibitora proteinskih kinaza prema ovom izumu. Kao primjer, sintezu spojeva koji nisu dani u ovom izumu primjerima prema može se uspješno provesti modifikacijama očiglednim stručnjacima u ovom području tehnike, npr. odgovarajućim zaštitnim interferirajućim skupinama, zamjenom s drugim pogodnim reagensima poznatim u ovom području tehnike, ili rutinskim modifikacijama reakcijskih uvjeta. Alternativno se druge reakcije opisane u ovoj specifikaciji ili poznate u ovom području tehnike može prepoznati kao primjenjive u dobivanju drugih spojeva prema ovom izumu.
Detaljni opis izuma i primjeri poželjnih izvedaba
U primjerima opisanim niže, ukoliko se drugačije ne naznači, sve temperature su iznijete u °C, a svi udjeli i postoci su težinski. Reagensi su nabavljeni iz komercijalnih izvora, poput Aldrich Chemical Company ili Lancaster Synthesis Ltd. i upotrijebljeni bez daljnjeg pročišćavanja, ukoliko se drugačije ne naznači. Tetrahidrofuran (THF), N,N-dimetilformamid (DMF), diklormetan, toluen i dioksan su nabavljeni od strane firme Aldrich, u sigurnosno zatvorenim bocama, i upotrijebljeni kao što su i primljeni. Sva otapala pročišćena su uz standardnim postupcima, dobro poznatim stručnjacima u ovom području tehnike, ukoliko se drugačije ne naznači.
Reakcije iznijete niže općenito se provodi pod povišenim tlakom argona ili dušika, ili u epruveti za sušenje, na temperaturi okoliša (ukoliko se drugačije ne navede), u bezvodnim otapalima, a reakcijske tikvice su opremljene gumenim pregradama za uvođenje supstrata i reagensa putem injekcije. Stakleno posuđe osušeno je u peći i/ili osušeno toplinom. Analitička tankoslojna kromatografija (TLC) provedena je na pločama silikagela 60 F 254 Analtech (0,25 mm) na staklenoj podlozi, uz eluiranje otapalima u odgovarajućem odnosu (vol./vol.), što je naznačeno po potrebi. Reakcije su ispitane TLC-om i prekinute prema procjeni potrošnje polaznog materijala.
Vizualizacija TLC ploča provedena je sprejanjem p-anisaldehidom kao reagensom ili fosfomolibdenskom kiselinom kao reagensom (Aldrich Chemical 20 %, težinski, u etanolu), te aktivirana toplinom. Obrada je u pravilu provedena udvostručenjem reakcijskog volumena reakcijim otapalom ili ekstrakcijskim otapalom, te ispiranjem naznačenim vodenim otopinama uz upotrebu 25 %, volumno, ekstrakcijskog volumena, ukoliko se drugačije ne naznači. Otopine produkta osušene su preko bezvodnog Na2SO4 prije filtracije i otparavanja otapala pod sniženim tlakom u rotacijskom otparivaču, što je navedeno kao otapala uklonjena u vakuumu. Flash-kromatografija na stupcu (Still i suradnici: J. Org. Chem., 43, 2923, (1978.)) provedena je na flash-silikagelu (47-61 µm) Bakerovog stupnja, uz odnos silikagel:sirovi materijal od otprilike 20:1-50:1, ukoliko se drugačije ne navede. Hidrogenoliza je provedena pod tlakom navedenim u primjerima ili pod atmosferskim tlakom.
Spektri 1H-NMR zabilježeni su na instrumentu Bruker, uz rad na 300 MHz, a spektri 13C-NMR zabilježeni su uz rad na 75 MHz. Spektri NMR dobiveni su za otopine u CDCl3 (zabilježeno u ppm), uz upotrebu kloroforma kao referentnog standarda (7,25 ppm i 77,00 ppm) ili CD3OD (3,4 i 4,8 ppm i 49,3 ppm), ili interno u odnosu na tetrametilsilan (0,00 ppm), po potrebi. Po potrebi su upotrijebljena i druga otapala za NMR. Kada su zabilježeni multipliciteti pikova, upotrijebljene su sljedeće kratice: s (singlet), d (dublet), t (triplet), m (multiplet), br (proširen (broadened)), dd (dublet dubleta), dt (dublet tripleta). Konstante sprezanja, kada su dane, zabilježene su u Hertzima (Hz).
Infracrveni (IR) spektri zabilježeni su na Perkin-Elmer FT-IR spektrometru kao čista ulja, kao KBr peleti ili kao otopine u CDCl3, a kada su dani zabilježeni su kao valni brojevi (cm–1). Maseni spektri dobiveni su uz upotrebu LSIMS ili elektrospreja. Sva tališta su nekorigirana.
Primjer 1(a)
Dimetilni ester 2-(4-klor-2-nitrofenil)malonske kiseline
[image]
U miješani mulj NaH (36,0 g, 1500 mmol) u NMP-u (1,0 l) doda se dimetil-malonat (137,4 ml, 1200 mmol) u kapima. Reakcijsku smjesu se ohladi po potrebi kako bi se održalo unutarnju temperaturu ispod 30°C. Nakon što prestane razvijanje plina u reakcijsku smjesu se doda 2,4-diklornitrobenzen (192 g, 1000 mmol). To se pažljivo grije do 65°C dok reakcija nije gotova, što se odredi HPLC-om. Reakcijsku smjesu se ohladi do sobne temperature, te izlije na 500 ml leda, pomiješanog s 150 ml konc. HCl. pH vodenog sloja podesi se do neutralnog uz upotrebu 1 N NaOH. Krutine se ukloni filtriranjem kroz grubo sinterirani filtar, te ispere vodom (3 l). Žute krutine se ostavi neka se osuše preko noći. Prinos: 261,5 g, 91 %.
Primjer 1(b)
Metilni ester (4-klor-2-nitrofenil)octene kiseline
[image]
Otopinu dimetilnog estera 2-(4-klor-2-nitrofenil)malonske kiseline (195 g, 679,4 mmol) u vodi (100 ml) i NMP-u (1000 ml) grije se 3,5 sati do refluksa. Otapalo se ukloni u rotacijskom otparivaču do ulja. Ulje se otopi u EtOAc, te ispere vodom (5 × 300 ml). Vodeni sloj se zatim ekstrahira s EtOAc (4 × 300 ml). Organski sloj se ispere vodom. Organske slojeve se pomiješa, te osuši preko MgSO4. Nakon uklanjanja krutina filtracijom otapalo se otpari kako bi se dobilo željeni produkt u obliku narančasto-smeđe krutine (160,0 g, 95 %).
Primjer 1(c)
Metilni ester (2-acetilamino-4-klorfenil)octene kiseline
[image]
U tikvicu napunjenu argonom stavi se metilni ester (4-klor-2-nitrofenil)octene kiseline (40 g, 175 mmol), 10 % Pd/C (2,5 g), acetanhidrid (64 ml, 677 mmol), voda (9 ml) i octena kiselina (150 ml). Tikvicu se vakuumski propuše plinovitim vodikom pod tlakom od 207 kPa (30 psi), te snažno protrese. Nakon 2 sata, doda se još 10 % Pd/C (2 g), a reakcija je gotova nakon ukupno 4 sata reakcijskog vremena. 10 % Pd/C se ukloni filtracijom, a otapalo se ukloni u rotacijskom otparivaču.
Primjer 1(d)
Metilni ester 6-klor-1H-indazol-3-karboksilne kiseline
[image]
U otopinu metilnog estera (2-acetilamino-4-klorfenil)octene kiseline (32,0 g, 133 mmol) u octenoj kiselini (200 ml) miješanu na 90°C dodaje se tert-butil-nitrit (20,5 ml, 172,3 mmol) u trajanju od 1 sata. Reakcijsku smjesu izlije se u vodu (1,4 l), a krutine prikupi filtracijom. Žuti talog otopi se u EtOAc, te ispere zasićenom otopinom NaCl. Organski sloj osuši se preko MgSO4, filtrira, te koncentrira do krutine. Krutine se triturira heksanima, te filtrira kako bi se dobilo željeni materijal (21,63 g, 77 %).
Primjer 1(e)
Metilni ester 6-klor-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-karboksilne kiseline
[image]
U mulj metilnog estera 6-klor-1H-indazol-3-karboksilne kiseline (8,3 g, 39,5 mmol) u MeCN (200 ml) doda se 3,4-dihidro-2H-piran (5,4 ml, 59,3 mmol) i p-toluensulfonska kiselina (237 mg, 1,25 mmol). Nakon što se reakcijsku smjesu ostavi neka se miješa 10 minuta doda se zasićena otopina NaHCO3 (1 ml), a otapalo ukloni u rotacijskom otparivaču do volumena od 100 ml. Smjesu se razrijedi s EtOAc, te ispere vodom (50 ml) i zasićenom otopinom NaCl (50 ml). Organski sloj se zatim osuši preko Na2SO4. Nakon što se krutine ukloni filtracijom organski sloj se koncentrira do ulja u rotacijskom otparivaču. Produkt se istaloži iz ulja uz upotrebu heksana kako bi se dobilo željeni produkt (prinos: 7,667 g, 66 %).
Primjer 1(f)
Metilni ester 6-(2-metoksikarbonilfenilamino)-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-karboksilne kiseline
[image]
U otopinu metilnog estera 6-klor-1H-indazol-3-karboksilne kiseline (2,94 g, 10,0 mmol) u 1,2-dimetoksietanu (30 ml) doda se K3PO4 (5,32 g, 25,0 mmol), tris(dibenzilidenaceton)dipaladij (459 mg, 0,05 mmol), 2-(dicikloheksilfosfino)bifenil (701 mg, 2,0 mmol) i metil-antranilat (2,59 ml, 20,0 mmol). Otopinu se vakuumski 3 × propuše argonom prije nego se 18 sati grije do 80°C. Reakcijsku smjesu se ohladi do sobne temperature, a krutine ukloni filtracijom. Nakon ispiranja krutina etil-acetatom otapalo se ukloni u rotacijskom otparivaču. Preostalo ulje se kromatografira (150 g silikagela, 10-30 % EtOAc:heksani) kako bi se dobilo 1,23 g (51 %) željenog produkta.
Primjer 1(g)
6-(2-metoksikarbonilfenilamino)-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-karboksilna kiselina
[image]
U otopinu metilnog estera 6-(2-metoksikarbonilfenilamino)-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-karboksilne kiseline (2,05 g, 5 mmol) u metanolu (18 ml) i tetrahidrofuranu (8 ml) doda se otopina natrijevog hidroksida (0,30g, 7,5 mmol) u vodi (2,7 ml). Reakcijsku smjesu miješa se 3 sata na sobnoj temperaturi, te neutralizira s 1 N HCl do pH 1. Smjesu se razrijedi s EtOAc (25 ml) i vodom (25 ml). Nakon razdvajanja slojeva vodeni se ispere s CH2Cl2 (3 × 25 ml). Pomiješane organske ekstrakte ispere se zasićenom otopinom NaCl (100 ml), te osuši preko Na2SO4. Krutine se filtrira, a tekućinu koncentrira do ulja. Produkt se kristalizira iz EtOAc i heksana kako bi se dobilo željeni produkt (1,616 g, 82 %).
Primjer 1(h)
Metilni ester 2-[3-metilkarbamoil-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline
[image]
U otopinu 6-(2-metoksikarbonilfenilamino)-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-karboksilne kiseline (0,50g, 1,27 mmol) u DMF-u doda se trietilamin (0,42 ml, 3,04 mmol), metilamin (1,9 ml, 3,81 mmol) i HATU (0,578 g, 1,52 mmol). Reakcijsku smjesu miješa se 3 sata, te koncentrira u rotacijskom otparivaču. Sirovo ulje se kromatografira (50 g silikagela, 25-50 % EtOAc:heksani) kako bi se dobilo željeni produkt (214 mg, 42 %).
Primjer 1(i)
2-[3-metilkarbamoil-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeva kiselina
[image]
U otopinu metilnog estera 2-[3-metilkarbamoil-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (0,20g, 0,49 mmol) u metanolu (1,4 ml) i tetrahidrofuran (0,6 ml) doda se otopina natrijevog hidroksida (59 mg, 1,47 mmol) u vodi (0,3 ml). Reakcijsku smjesu grije se 1 sat do 60°C, te ohladi do sobne temperature. pH se s 2 N HCl podesi do pH 2. Doda se EtOAc (30 ml) i voda (30 ml), a slojeve razdvoji. Vodeni se ekstrahira s EtOAc (3 × 20 ml), a organske pomiješa. Nakon ispiranja vodom (15 ml) organski sloj osuši se preko Na2SO4. Krutine se otfiltrira, a organski sloj otpari kako bi se dobilo žutu krutinu (193 mg, 100 %).
Primjer 1(j)
Metilamid 6-(2-prop-2-inilkarbamoilfenilamino)-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-karboksilne kiseline
[image]
U otopinu 2-[3-metilkarbamoil-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (150 mg, 0,381 mmol) u DMF-u (3,6 ml) doda se propargilamin (0,052 ml, 0,761 mmol), TEA (0,264 ml, 1,90 mmol) i HATU (217 mg, 0,571 mmol). Reakcijsku smjesu miješa se 4 sata, te razrijedi s EtOAc (30 ml) i vodom (30 ml). Slojeve se razdvoji, a vodeni ekstrahira s EtOAc (2 × 20 ml). Pomiješane organske slojeve ispere se zasićenom otopinom NaCl (15 ml), te osuši preko Na2SO4. Krutine se ukloni filtracijom, a tekućinu koncentrira u rotacijskom otparivaču do žutog ulja (164 mg, 100 %).
Primjer 1(k)
Metilamid 6-(2-prop-2-inilkarbamoilfenilamino)-1H-indazol-3-karboksilne kiseline
[image]
Metilamid 6-(2-prop-2-inilkarbamoilfenilamino)-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-karboksilne kiseline (30 mg) otopi se u 1,5 ml 90:10:1 smjese CH2Cl2:TFA:trietilsilan, te grije 2 sata do refluksa. Otopinu se razrijedi toluenom (40 ml). te koncentrira u rotacijskom otparivaču do ulja. Ulje se otopi u DMF-u (1 ml), te filtira uz kroz 0,2 µm injekcijski filtar. Kako bi se izdvojilo željeni spoj (12 mg, 50 %) upotrijebi se preparativni HPLC.
1H-NMR (CDCl3-d): � 9,96(1H, s), ıs), ??? 8,28 (1H, d, J = 8,85 Hz), 7,47 (1H, m), 7,34 (1H, m), 7,22 (1H, m), 7,15 (1H, dd, J1 = 8,76 Hz, J2 = 1,79 Hz), 6,99 (1H, m), 6,86(1H, t, J = 6,97 Hz), 6,31 (1H, m), 4,23 (2H, dd, J1 = 518 Hz, J2 = 2,54 Hz), 3,49 (3H, s), 2,29 (s, 1H).
[image]
Primjer 2(a)
[6-klor-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-il]metanol
[image]
U otopinu metilnog estera 6-klor-1H-indazol-3-karboksilne kiseline (2,94 g, 10,0 mmol) u suhom CH2Cl2 (50 ml) ohlađenu do -78°C polako se doda DIBAL-H (3,56 ml, 20,0 mmol). Nakon što je dodavanje gotovo, the reakcijsku smjesu pusti se neka se zagrije do sobne temperature, gdje HPLC ukazuje da je preostalo još 10 % polaznog materijala. Zatim se doda još DIBAL-H (0,35 ml), te miješa 10 minuta. Reakcijsku smjesu se razrijedi s EtOAc (1000 ml), te ispere s 1 N HCl (2 × 100 ml). To se zatim ispere s 1 N NaHCO3 (100 ml) i zasićenom otopinom NaCl (100 ml). Organski sloj osuši se preko MgSO4, filtrira, te koncentrira do bijele krutine (2,65 g, 99,5 %).
Primjer 2(b)
6-klor-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-karbaldehid
[image]
Otopinu [6-klor-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-3-il]metanola (1,75 g, 6,58 mmol), IBX (2,76 g, 9,87 mmol) i DMSO (27 ml) miješa se preko noći. Reakcijsku smjesu se razrijedi u EtOAc i vodi. Slojeve se razdvoji, a vodeni ekstrahira s EtOAc (3 × 100 ml). Organske slojeve se pomiješa, te ispere zasićenom otopinom NaCl (100 ml). Organski sloj osuši se preko MgSO4, filtrira, te koncentrira do krutine. Krutinu se otopi u CH2Cl2, te filtrira. Organski sloj se otpari kako bi se dobilo željeni produkt (1,707g, 92 %).
Primjer 2(c)
1-(6-klor-1H-indazol-3-il)-2-(5-etilpiridin-2-il)etanol
[image]
U miješanu otopinu 4-etil-2-metilpiridina (0,458 g, 3,79 mmol) u THF-u (4 ml) na -50°C polako se doda butillitij (1,5 ml, 2,5 M, 3,79 mmol), te miješa 10 minuta. U reakcijsku smjesu polako se doda otopina 6-klor-1H-indazol-3-karbaldehida (0,5 g, 1,89 mmol) u THF-u (4 ml). Nakon 10 minuta miješanja reakcijsku smjesu se ugasi 1 N limunskom kiselinom (10 ml). Smjesu se razrijedi s EtOAc (50 ml), vodom (20 ml) i zasićenom otopinom NaCl (10 ml). Slojeve se razdvoji, a vodeni ekstrahira s EtOAc (3 × 15 ml). Organske slojeve se pomiješa, te ispere zasićenom otopinom NaCl (20 ml). Nakon sušenja organskog sloja preko Na2SO4 krutine se ukloni filtracijom, a tekućinu koncentrira do ulja u rotacijskom otparivaču. Kromatografijom (40 g silikagela, 60-100 % EtOAc:heksani) se dobije željeni produkt (142 mg, 32 %), te prikupi 6-klor-1H-indazol-3-karbaldehid (348 mg).
Primjer 2(d)
6-klor-3-[2-(5-etilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol
[image]
U miješanu otopinu 1-(6-klor-1H-indazol-3-il)-2-(5-etilpiridin-2-il)etanola (232 mg, 0,60 mmol) u CH2Cl2 doda se TEA (0,25 ml, 1,81 mmol) i mesil-klorid (0,070 ml, 0,90 mmol). Reakcijsku smjesu miješa se 30 minuta, te se doda DBU (2 ml). Reakcijsku smjesu refluksira se 18 sati, te ugasi s 40 ml 1 N limunske kiseline. Slojeve se razdvoji, a vodeni ekstrahira s 20 ml CH2Cl2. Pomiješane organske slojeve osuši se preko Na2SO4, filtrira, te koncentrira u rotacijskom otparivaču. Pročišćavanjem kromatografijom (12 g silikagela, 50-70 % EtOAc:heksani) dobije se željeni spoj (135 mg, 71 %).
Primjer 2(e)
Metilni ester 2-{3-[2-(5-etilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzojeve kiseline
[image]
U 6-klor-3-[2-(5-etilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol (130 mg, 0,354 mmol), tris(dibenzilidenaceton)dipaladij (16 mg, 0,018 mmol), -(dicikloheksilfosfino)bifenil (25 mg, 0,071 mmol), K3PO4 (0,188 g, 0,885 mmol) i metil-antranilat (0,092 ml, 0,71 mmol) doda se 1,2-dimetoksimetan (2 ml). Reakcijsku smjesu se vakuumski propuše argonom (4 ×), te grije 19 sati do 80°C. Reakcijsku smjesu se razrijedi s EtOAc (20 ml), te filtrira kroz čep od silikagela. Nakon ispiranja s EtOAc (50 ml) otapalo se ukloni u rotacijskom otparivaču. Sirovo ulje se pročisti kromatografijom (40 g silikagela, 30-40 % EtOAc:heksani) kako bi se dobilo željeni produkt (54 mg, 32 %).
Primjer 2(f)
2-{3-[2-(5-etilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzojeva kiselina
[image]
U otopinu metilnog estera 2-{3-[2-(5-etilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzojeve kiseline (50 mg, 0,104 mmol) u metanolu (0,42 ml) i THF-u (0,10 ml) doda se otopina natrijevog hidroksida (12 mg, 0,311 mmol) u vodi (0,05 ml). Otopinu se grije 3,5 sati do 60°C, te neutralizira zasićenom otopinom NH4Cl. Reakcijsku smjesu se razrijedi vodom (20 ml), te ekstrahira s EtOAc (2 × 20 ml). Pomiješane ekstrakte najprije se osuši preko Na2SO4, te se krutine ukloni filtracijom. Željeni produkt (48,7 mg, 100 %) prikupi se nakon otparavanja u rotacijskom otparivaču kako bi se uklonilo otapala.
Primjer 2(g)
2-{3-[2-(5-etilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-prop-2-inilbenzamid
[image]
U 2-{3-[2-(5-etilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzojevu kiselinu (49 mg, 0,105 mmol) doda se 2 ml 90:10:1 smjese CH2Cl2:TFA:TES. Reakcijsku smjesu miješa se 1 sat na refluksu, te razrijedi toluenom (20 ml). Otapalo se ukloni u rotacijskom otparivaču kako bi se dobilo gusto ulje. Ulje se otopi u DMF-u (1 ml), a u tu otopinu doda se TEA (0,072 ml, 0,52 mmol), propargilamin (0,014 ml, 0,208 mmol) i HATU (59 mg, 0,156 mmol). Reakcijsku smjesu miješa se 3 sata, te pročisti preparacijskim HPLC-om kako bi se dobilo željeni produkt (29 mg, 66 %).
1H-NMR (CDCl3-d): � 9,83 (1H, s), 8,63 (2H, s), 8,04 (2H, m), 7,68 (2H, s), 7,47 (1H, m), 7,32 (1H, d, J = 1,51 Hz), 7,10 (1H, dd, J1 = 8,67 Hz, J2 = 1,88 Hz), 6,93 (1H, m), 6,07 (2H, dd, J1 = 5,09 Hz, J2 = 2,26 Hz), 3,15 (1H, t, J = 2,35 Hz), 2,97 (2H, s), 2,74 (1H, s), 2,29 (1H, s), 1,27 (3H, t, J = 7,44 Hz).
[image]
Primjer 2(h)
N-ciklopropil-2-{3-[(E)-2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzamid
[image]
Naslovni spoj dobije se analogno 2-{3-[2-(5-etilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-prop-2-inilbenzamidu, kao što je opisano gore, zamjenom 4-etil-2-metilpiridina 2,4-dimetilpiridinom u koraku gdje se dobiva 1-(6-klor-1H-indazol-3-il)-2-(5-etilpiridin-2-il)etanol, te zamjenom propargilamina ciklopropilaminom u konačnom koraku u nizu.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,85 (1H, s), 8,56 (2H, m), 8,20 (3H, m), 7,53 (5H, m), 7,35 (1H, s), 7,2 (1H, d, J = 6,5 Hz), 7,0 (1H, s), 2,83 (1H, m), 0,70 (2H, m), 0,56 (2H, m).
ESIMS [M + H]+: 410,3.
Primjer 3(a)
N-metoksi-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), O-metilhidroksilamin-hidroklorida (15 mg, 0,17 mmol), trietilamina (58 µl, 0,42 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 21,6 mg (67 %) naslovnog spoja u obliku žute krutine.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,23 (1H, s), 8,71 (1H, d, J = 2,2), 8,05 (4H, m), 7,51 (5H, m), 7,25 (1H, s), 7,10 (1H, d, J = 7,7 Hz), 6,91 (1H, m), 5,98 (1H, m), 4,31 (1H, d, J = 14,3), 7,20 (1H, d, J = 7,3),4,42 (2H, d, J = 3,2).
ESIMS [M + H]+: 412,1.
Primjer 3(b)
N-aliloksi-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), O-alilhidroksilamin-hidroklorida (18,3 mg, 0,17 mmol), trietilamina (58 µl, 0,42 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 25,5 mg (74 %) naslovnog spoja u obliku žute krutine.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,28 (1H, s), 8,67 (2H, d, J = 3A), 8,05 (4H, m), 7,48 (5H, m), 7,23 (1H, s), 7,04 (1H, d, J = 7,6 Hz), 6,91 (1H, m), 3,69 (3H, s).
ESIMS [M + H]+: 386,1.
Primjer 3(c)
N-izopropoksi-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), O-izopropilhidroksilamin-hidroklorida (18,7 mg, 0,17 mmol), trietilamin (58 µl, 0,42 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 17,4 mg (50 %) naslovnog spoja u obliku žute krutine.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,23 (1H, s), 8,69 (H, d, J = 2,1), 8,03 (4H, m), 7,50 (5H, m), 7,23 (1H, s), 7,04 (1H, d, J = 6,7 Hz), 6,92 (1H, m), 5,98 (1H, m), 4,13 (1H, m), 1,29 (6H, d, J = 8,1).
ESIMS [M + H]+: 414,1.
Primjer 3(d)
[image]
N-ciklopropil-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), ciklopropilamina (11,6 µl, 0,17 mmol), trietilamina (58 µl, 0,25 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 11,7 mg (35 %) naslovnog spoja u obliku žute krutine.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,81 (1H, s), 8,68 (1H, d, J = 1,7), 8,51 (1H, s), 8,01 (4H, m), 7,50 (5H, m), 7,24 (1H, s), 7,03 (1H, d, J = 5,3), 6,89 (1H, t, J = 4,2), 2,84 (1H, m), 0,72 (2H, m), 0,56 (2H, m).
ESIMS [M + H]+: 396,1.
Primjer 3(f)
N'-(1-{2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]fesnil}metanoil)hidrazid 1-metil-1H-pirol-2-karboksilne kiseline
[image]
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), hidrazida 1-metil-1H-pirol-2-karboksilne kiseline (23,3 mg, 0,17 mmol) i trietilamina (58 µl, 0,42 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 16,1 mg (40 %) naslovnog spoja u obliku žute krutine.
1H-NMR (DMSO-d6): � 10,39 (1H, s), 10,00 (1H, s), 9,52 (1H, s), 8,67 (1H, d, J =2,4), 8,07 (4H, m), 7,77 (1H, d, J = 5,2), 7,51 (4H, m), 7,32 (1H, s), 7,09 (1H, d, J = 6,3), 6,98 (3H, m), 6,13 (1H, m), 3,87 (3H, s).
ESIMS [M + H]+: 478,1.
Primjer 3(g)
N-Benzil-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), benzilamina (18,2 µl, 0,17 mmol) i trietilamina (58 µl, 0,42 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 45,2 mg (76 %) naslovnog spoja u obliku soli s TFA (1,5 H2O, 2,1 TFA, efektivna mol.tež. = 711,98).
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,86 (1H, s), 9,14 (1H, t, J = 5,4), 8,73 (1H, d, J = 4,8), 8,29 (4H, m), 7,56 (1H, d, J = 7,0), 7,74 (2H, m), 7,89 (2H, m), 7,31 (5H, m), 7,16 (1H, d, J = 7,8), 6,93 (1H, t, J = 7,3), 4,46 (2H, d, J = 6,1).
ESIMS [M + H]+: 446,5.
Primjer 3(h)
N-(2-metoksibenzil)-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), O-metoksibenzilamina (21,8 µl, 0,17 mmol) i trietilamina (58 µl, 0,42 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 46 mg (81 %) naslovnog spoja u obliku soli s TFA (1,5 H2O, 1,5 TFA, efektivna mol.tež. = 673,59).
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,83 (1H, s), 9,03 (1H, t, J = 3,4), 8,70 (1H, d, J = 3,7), 8,08 (4H, m), 7,82 (1H, d, J = 7,4), 7,49 (4H, m), 7,21 (3H, m), 6,96 (4H, m), 4,48 (2H, d, J = 6,3).
ESIMS [M + H]+: 476,1.
Primjer 3(i)
N-furan-2-ilmetil-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), C-furan-2-ilmetilamina (19 µl, 0,17 mmol) i trietilamina (58 µl, 0,42 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 45 mg (85 %) naslovnog spoja u obliku soli s TFA (1,5 H2O, 1,5 TFA, efektivna mol.tež. = 633,52).
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,82(1H, s), 9,05 (1H, t, J = 2,6), 8,73 (1H, d, J = 3,7), 8,13 (4H, m), 7,73 (1H, d, J = 6,8), 7,57 (2H, m), 7,26 (1H, s), 7,03 (1H, d, J = 7,5), 6,40 (1H, m), 6,28 (1H, m), 4,48 (2H, d, J = 6,5).
ESIMS [M + H]+: 436,1.
Primjer 3(j)
N-ciklobutil-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), ciklobutilamina (18,2 µl, 0,17 mmol) i trietilamina (58 µl, 0,42 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 43,2 mg (92 %) naslovnog spoja u obliku soli s TFA (1,5 H2O, 1,1 TFA, efektivna mol.tež. = 561,92).
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,78 (1H, s), 8,72 (2H, m), 8,13 (4H, m), 7,70 (1H, d, J = 7,1), 7,58 (2H, m), 7,41 (2H, m), 7,27 (1H, s), 6,89 (1H, t, J = 4,2), 2,84 (1H, m), 0,72 (2H, m), 0,56 (2H, m).
ESIMS [M + H]+: 396,1.
Primjer 3(k)
N-(2-metilalil)-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Otopinu 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (50,0 mg, 0,084 mmol), 2-metilalilamina (16,4 µl, 0,17 mmol) i trietilamina (58 µl, 0,42 mmol) otopljenog u DMF-u (0,8 ml) obradi se s HATU (48 mg, 0,13 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 45 mg (91 %) naslovnog spoja u obliku soli s TFA (1,6 H2O, 1,3 TFA, efektivna mol.tež. = 586,53).
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,78 (1H, s), 8,72 (2H, m), 8,13 (4H, m), 7,70 (1H, d, J = 7,1), 7,58 (2H, m), 7,41 (2H, m), 7,27 (1H, s), 7,06 (1H, d, J = 7,1), 6,91 (1H, t, J = 7,5), 4,42 (1H, m), 2,22 (2H, m), 2,08 (2H, m), 1,68 (2H, m).
ESIMS [M + H]+: 410,1.
Primjer 3(l)
6-nitro-3-piridin-2-iletinil-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol
[image]
Smjesu 3-jod-6-nitro-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil}-1H-indazola (838 mg, 2,0 mmol), 2-etinilpiridina (242 µl, 2,4 mmol) i trietilamina (6,0 ml) se degazira, propuše argonom, te obradi s CuI (8 mg, 0,042 mmol) i Pd(PPh3)2Cl2 (16 mg, 0,023 mmol). Dobivenu smjesu miješa se preko noći na sobnoj temperaturi, gdje HPLC ukazuje da je potrošen sav polazni materijal. Smjesu se pročisti uklanjanjem hlapivih tvari u visokom vakuumu, te propuštanjem kroz čep od silikagela, uz eluiranje etil-acetatom. Dobiveni produkt upotrijebi se u sljedećem koraku bez daljnjeg pročišćavanja.
ESIMS [M + H]+: 395,1.
Primjer 3(m)
3-piridin-2-iletinil-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamin
[image]
Smjesu 6-nitro-3-piridin-2-iletinil-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazola (2 mmol), SnCl2 (1,37g, 6,0 mmol), vode (0,5 ml) i MeOH (10 ml) miješa se 30 minuta u uljnoj kupelji na 60 °C, gdje HPLC ukazuje na potpunu redukciju. Dobivenu smjesu očisti se od metanola, suspendira u EtOAc (50 ml), te razrijedi s 1 M NaOH (18 ml). Dobivenu emulziju oprezno se ekstrahira s EtOAc (10 × 25 ml). Pomiješane organske slojeve ekstrahira se s 1 M Na2CO3 i slanom vodom, osuši preko MgSO4, koncentrira, te filtrira kroz jastučić od silikagela, uz eluiranje s EtOAc. Prinos sirovog produkta u dva koraka je 701 mg, uz 96 % prikupljene mase.
ESIMS [M + H]+: 365,1.
Primjer 3(n)
Metilni ester 2-[3-piridin-2-iletinil-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline
[image]
Smjesu 3-piridin-2-iletinil-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamina (560 mg, 1,54 mmol), 2-brommetil-benzoata (647,5 µl, 4,61 mmol), bifenil-2-ildicikloheksilfosfana (107,8 mg, 0,308 mmol), Pd2(dba)3 (70,5 mg, 0,0768 mmol), K3PO4 (816 mg, 3,844 mmol) i dimetoksietana (1,7 ml) vakuumski se propuše dušikom, te grije 24 sata u uljnoj kupelji na 70°C. Crnu smjesu razrijedi se metilen-kloridom, te filtrira, koncentrira i kromatografira (20-40 % etilacetat:heksani). Prinos žuto-narančastog ulja je 260 mg, 35 %, u tri koraka.
Primjer 3(o)
2-[3-piridin-2-iletinil-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeva kiselina
[image]
2-[3-piridin-2-iletinil-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline metilni ester (253 mg, 0,517 mmol), doda se na otopina NaOH (62 mg, 1,55 mmol), otopljen u THF-u (1,0 ml), MeOH (2,25 ml), i voda (0,5 ml). Reakcijsku smjesu miješa se na sobnoj temperaturi tijekom 1 sata, gdje HPLC ukazuje da je potrošen sav polazni materijal. Reakcijsku smjesu se neutralizira s 1 N HCL, ekstrahira etilacetatom, te zatim ispere slanom vodom i osuši s MgSO4. Nakon koncentriranja u vakuumu, dobije se 249 mg žute krutine (99 % uz prikupljene mase). Ovaj materijal upotrijebi se bez daljnjeg pročišćavanja.
ESIMS [M – H]–: 483,0.
Primjer 3(p)
2-[3-piridin-2-iletinil-1H-indazol-6-ilamino]benzojeva kiselina
[image]
Otopinu 2-[3-piridin-2-iletinil-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (231 mg, 0,477), 1 M tetrabutilamonijevog fluorida u THF-u (3,8 ml, 3,816 mmol) i etilendiamina (127 µl, 1,908 mmol), miješa se 6 sati u uljnoj kupelji na 80°C. Reakcijsku smjesu ugasi se octenom kiselinom (218 µl, 3,816 mmol), razrijedi vodom, te ekstrahira s EtOAc (10 × 50 ml). Pomiješane organske slojeve ispere se slanom vodom, te osuši preko MgSO4. Nakon koncentriranja dobije se krutina, koju se triturira s CH2Cl2, čime se dobije produkt u obliku žutog praha (124 mg, 73 %).
ESIMS [M – H]–: 353,0.
Primjer 3(q)
N-prop-2-inil-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Otopinu 2-(3-piridin-2-iletinil-1H-indazol-6-ilamino)benzojeve kiseline (41 mg, 0,117 mmol), propargilamina (24 µl, 0,35 mmol) i trietilamina (81 µl, 0,58 mmol) otopljenog u DMF-u (0,5 ml) obradi se s HATU (89 mg, 0,233 mmol). Smjesu se miješa preko noći, te pročisti HPLC-om s reverznom fazom, čime se dobije 27 mg (59 %) naslovnog spoja u obliku žute krutine.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,78 (1H, s), 8,99 (1H, m), 8,61 (1H, d, J = 2,1), 7,88 (1H, s), 7,72 (3H, m), 7,43 (4H, m), 7,29 (1H, s), 7,04 (1H, d, J = 7,3), 6,91 (1H, t, J = 5,2), 4,04 (2H, s), 3,04 (1H, s).
ESIMS [M + H]+: 392,1.
Primjer 4(a)
2-brom-4,6-dimetilpiridin
[image]
Otopinu 48 % HBr(aq) (Aldrich, 65 ml, 1,2 mol, 10 ekv.) ohladi se do -5°C, te obradi 4,6-dimetilpiridin-2-ilaminom (Aldrich, 15,0 g, 0,12 mol, 1,0 ekv.). Gustu bijelu smjesu soli miješa se mehaničkom miješalicom, uz ukapavanje broma (Aldrich, 19,7 ml, 0,38 mol, 3,1 ekv.). Dobivenu crvenu smjesu obrađuje se vodenom otopinom (32 ml H2O) NaNO2 (Aldrich, 22,1 g, 0,32 mol, 2,6 ekv.), u trajanju od 1 sata. Temperaturu se održava ispod 5°C prilikom dodavanja nitrita, te postupno grije do 20°C, u trajanju od 2 sata. Reakcijsku smjesu podesi se s NaOH(aq) do pH 14, te ekstrahira MTBE-om. Organske ekstrakte ispere se vodom i slanom vodom, osuši preko magnezijevog sulfata, filtrira, te koncentrira pod sniženim tlakom. Sirovi produkt (29 g crvenog ulja) pročisti se flash-kromatografijom (silikagel, 350 g), te eluira smjesom 2-7 % etil-acetat:cikloheksan, čime se dobije narančasto ulje (11,0 g, 48 %).
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): � 7,30 (1H, s), 7,13 (1H, s), 2,39 (3H, s), 2,26 (3H, s).
13C-NMR (75 MHz , DMSO-d6): � 159,4, 151,3, 140,9, 125,7, 124,0, 23,7, 20,3.
ESI m/z: 186/188 [M + H]+.
Primjer 4(b)
3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-6-nitro-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol
[image]
Suspenziju 2-brom-4,6-dimetilpiridina (2,42 g, 13 mmol), 3-vinil-6-nitro-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazola (2,37g, 8,67 mmol), paladijevog acetata (0,145 g, 0,65 mmol), tri-ortho-tolilfosfina (0,791 g, 2,6 mmol) i diizopropiletilamina (2,4 ml, 13,8 mmol) u vodenoj otopini DMF-a (85 %, 34,5 ml) degazira se propuhivanjem argonom u trajanju od 5 minuta, te sonificira 5 minuta prije grijanja u mikrovalnom uređaju (300 W, snaga na 10 %), na 110°C, u trajanju od 40 minuta. Nakon hlađenja smjesu se baci u hladnu vodu. Dobiveni žuti talog prikupi se filtracijom. Krutine se otopi u etil-acetatu, osuši (natrijev sulfat), te koncentrira pod sniženim tlakom. Ostatak se pročisti na silikagelu uz upotrebu gradijenta 0-20 % etil-acetata u smjesi kloroforma i heksana (1:1) kao eluensa. Kromatografirani produkt triturira se smjesom MTBE:heksani kako bi se dobilo čisti produkt u obliku žute krutine. Matični lug ponovno se pročisti na sličan način na silikagelu, te triturira kako bi se dobilo još čistog produkta, u prinosu od 68 %.
1H-NMR (CDCl3): � 8,54 (1H, s), 8,15 (1H, d, J = 9,4 Hz), 8,08 (1H, dd, J = 9,04, 1,9 Hz), 7,87 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,55 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,14 (1H, s), 6,90 (1H, s), 5,82 (1H, dd, J = 9,0, 3,0 Hz), 4,08-4,01 (1H, m), 3,84-3,76 (1H, m), 2,56 (3H, s), 2,62-2,54 (1H, m), 2,34 (3H, s), 2,24-2,10 (2H, m), 1,88-1,68 (3H, m).
Primjer 5
3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamin
[image]
Suspenziju 3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-6-nitro-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazola (4,22 g, 11,16 mmol), željeznog praha (2,71g, 48,51 mmol) i zasićene vodene otopine NH4Cl (25 ml) u 25 ml etanola grije se 18 sati na 45°C. Reakcijsku smjesu se ohladi, te filtrira kroz filtarski papir, uz ispiranje metanolom. Otapala se ukloni pod sniženim tlakom, a vodeni sloj ekstrahira s EtOAc (2 ×). Pomiješane organske slojeve ispere se slanom vodom, osuši (MgSO4), te koncentrira pod sniženim tlakom kako bi se dobilo 4,02 g (kvantitativno) krutine boje hrđe, te upotrijebi bez daljnjeg pročišćavanja.
1H-NMR (DMSO-d6): � 7,79 (1H, s), 7,74 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,35 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,29 (1H, s), 6,96 (1H, s), 6,63 (2H, m), 5,57 (1H, dd, J = 2,4, 9,5 Hz), 5,44 (2H, broad s), 3,88 (1H, m), 3,67 (1H, m), 2,45 (3H, s), 2,37 (1H, m), 2,29 (3H, s), 1,99 (2H, m), 1,73 (1H, m), 1,57 (2H, m).
Primjer 6
Metilni ester 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline
[image]
Miješanu suspenziju 3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamina (870 mg, 2,5 mmol), metilnog estera 2-brombenzojeve kiseline (0,44 ml, 3,12 mmol), R-BINAP (78 mg, 0,125 mmol), Pd2(dba)3 (29 mg, 0,03 mmol) i cezijevog karbonata (1,22 g, 3,75 mmol) u toluenu (6 ml) se degazira, te grije 18 sati na 100°C. Reakcijsku smjesu se ohladi, izlije u zasićenu otopinu NaHCO3, te ekstrahira s EtOAc (2 ×). Pomiješane organske slojeve ispere se slanom vodom, osuši (MgSO4), te koncentrira pod sniženim tlakom. Ostatak se flash-kromatografira na silikagelu, uz eluiranje gradijentom 5-10 % EtOAc u CH2Cl2 kako bi se dobilo 964 mg (80 %) žute pjene.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,49 (1H, s), 8,13 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,94 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,58 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,48 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,47 (1H, m), 7,37 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,34 (1H, s), 7,19 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 6,99 (1H, s), 6,89 (1H, t, J = 8,1 Hz), 5,83 (1H, d, J = 7,2 Hz), 3,88 (3H, s), 3,75 (1H, m), 2,48 (3H, s), 2,41 (2H, m), 2,31 (3H, s), 2,02 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,59 (2H, m).
[image]
Primjer 7
2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeva kiselina
[image]
U miješanu otopinu metilnog estera 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (1,98 g, 4,11 mmol) u smjesi THF:MeOH (12 ml, 3:1) doda se kalijev hidroksid (1,15 g, 20,5 mmol) otopljen u H2O (3 ml). Reakcijsku smjesu grije se 2 sata na 70°C, ohladi, koncentrira pod sniženim tlakom do otprilike 5 ml, te razrijedi s još vode. Otopinu se neutralizira s 2 N HCl, a talog prikupi filtracijom, te ispere vodom kako bi se dobilo 2,00g (kvantitativno) jarkožute krutine.
1H-NMR (DSMO-d6): � 13,12 (1H, broad s), 9,82 (1H, s), 8,13 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,95 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz), 7,89 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,60 (1H, s), 7,50 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,46 (1H, d, J = 6,9 Hz), 7,37 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,20 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,06 (1H, s), 6,86 (1H, t, J = 6,9 Hz), 5,85 (1H, d, J = 7,3 Hz), 3,82 (2H, m), 2,50 (3H, s, zasjenjeno DMSO-om), 2,48 (2H, m), 2,34 (3H, s), 2,03 (2H, m), 1,76 (1H, m), 1,59 (2H, m).
[image]
Primjer 8
p-toluensulfonat 2-{3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzojeve kiseline
[image]
Smjesu 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (2 mmol) i p-toluensufonske kiseline (10 mmol) u vodenoj otopini metanola (90 %, 20 ml) miješa se 18 sati na 70°C. Nakon hlađenja dobiveni gusti žuti mulj se otfiltrira, a krutine ispere metanolom kako bi se dobilo 2-{3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzojevu kiselinu u obliku tosilatne soli, u prinosu od 85 % u obliku blijedožute krutine.
1H-NMR (DMSO-d6): � 13,43 (1H, s), 9,78 (1H, s), 8,24-8,19 (2H, m), 8,09 (1H, d, J = 9,04 Hz), 7,95 (1H, dd, J = 7,9, 1,1 Hz), 7,62-7,55 (2H, m), 7,49-7,38 (5H, m), 7,20 (1H, dd, J = 9,0, 1,9 Hz), 7,09 (2H, d, J = 8,3 Hz), 6,86 (1H, dt, J = 7,9, 1,1 Hz), 2,67 (3H, s), 2,54 (3H, s), 2,27 (3H, s).
Primjer 9
N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil]-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 33(a), koraku (v), u US patentnoj prijavi serijski broj 09/609,335, podnesenoj 30. lipnja 2000., uključenoj u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe, s tim što se upotrebljava 4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inilamin i 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,56 (1H, s), 9,01 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,81 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,66 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,41 (4H, m), 7,32 (1H, s), 7,09 (1H, dd, J = 1,8, 8,7 Hz), 6,98 (1H, s), 6,89 (1H, t, J = 8,0 Hz), 5,79 (1H, dd, J = 2,4, 9,2 Hz), 4,28 (2H, s), 4,09 (2H, m), 3,86(1H, m), 3,72 (1H, m), 2,46 (3H, s), 2,42 (1H, m), 2,30 (3H, s), 2,08 (2H, m), 1,74 (1H, m), 1,57 (2H, m), 0,80 (9H, s), 0,03 (6H, s).
[image]
Primjer 10
2-{3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-(4-hidroksibut-2-inil)benzamid
[image]
Miješanu otopinu N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil]-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida (737 mg, 1,13 mmol) i p-toluensulfonske kiseline (8,2 ml, 12 % u HOAc) grije se 2 sata na 70°C. Reakcijsku smjesu se ohladi, oprezno izlije u zasićenu otopinu NaHCO3, te ekstrahira s EtOAc (2 ×). Pomiješane organske slojeve ispere se slanom vodom (2 ×), osuši (MgSO4), te koncentrira pod sniženim tlakom. Ostatak se flash-kromatografira na silikagelu, uz eluiranje smjesom CH2Cl2:EtOAc:MeOH (1:1:0,1) kako bi se dobilo 225 mg (44 %) bijele krutine.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,91 (1H, s), 9,84 (s, 1H), 9,01 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,84 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,2 Hz), 7,43 (3H, m), 7,31 (1H, s), 7,26 (1H, s), 7,02 (1H, dd, J = 1,6, 8,7 Hz), 6,97 (1H, s), 6,89 (1H, t, J = 6,7 Hz), 5,12 (1H, t, J = 5,8 Hz), 4,10 (2H, d, J = 5,3 Hz), 4,07 (2H, d, J = 5,8 Hz), 2,47 (3H, s), 2,31 (3H, s).
[image]
Primjer 11
4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inilamin
[image]
U ledeno hladnu miješanu otopinu poznatog 4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-in-1-ola (3,14 g, 15,7 mmol) u THF-u (50 ml) doda se DBU (2,6 ml, 17,4 mmol) i DPPA (3,8 ml, 17,6 mmol). Otopinu se grije do sobne temperature, te preko noći miješa u inertnoj atmosferi. Reakcijsku smjesu izlije se u zasićenu otopinu NaHCO3, a slojeve razdvoji. Vodeni sloj ponovno se ekstrahira s EtOAc (2 ×), a pomiješane organske slojeve osuši (Na2SO4), te koncentrira u vakuumu. Ovom sirovom azidu otopljenom u THF-u (50 ml) doda se trifenilfosfin (4,61 g, 17,6 mmol), a zatim se doda H2O (0,44 ml). Dobivenu otopinu miješa se preko noći na sobnoj temperaturi, koncentrira pod sniženim tlakom, a ostatak razmulji u 1:1 smjesi Et2O/pet eter. Krutine se ukloni, a filtrat koncentrira i pročisti flash-kromatografijom na silikagelu, uz eluiranje smjesom CH2Cl2:MeOH (19:1) kako bi se dobilo ulje boje jantara.
1H-NMR (CDCl3): � 4,19 (2H, t, J = 1,9 Hz), 3,33 (2H, t, J = 1,9 Hz), 0,79 (9H, s), 0,00 (6H, s).
Primjer 12
2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]-N-prop-2-inilbenzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i propargilamin.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,87 (1H, s), 9,04 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,44 (4H, m), 7,34 (1H, s), 7,12 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 6,99 (1H, s), 6,91 (1H, t, J = 5,8 Hz), 5,81 (1H, dd, J = 2,4, 9,2 Hz), 4,07 (2H, dd, J = 2,5, 5,7 Hz), 3,88 (1H, m), 3,74 (1H, m), 3,12 (1H, t, J = 2,5 Hz), 2,48 (3H, s), 2,43 (1H, m), 2,31 (3H, s), 2,01 (2H, m), 1,74 (1H, m), 1,58 (2H, m).
[image] Primjer 13
N-(prop-2-inil)-2-{3-[(E)-2-(2,4-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, s tim što se upotrebljava N-(3-ciklopropilprop-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,90 (1H, s), 9,78 (1H, s), 9,01 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,3 Hz), 7,84 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,68 (1H, dd, J = 7,9, 1,1 Hz), 7,45-7,36 (3H, m), 7,30 (1H, s), 7,25 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,01 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 6,96 (1H,s), 6,88 (1H, dt, J = 6,8, 1,9 Hz), 4,04 (2H, dd, J = 5,6, 2,6 Hz), 3,11 (1H, t, J = 2,6 Hz), 2,46 (3H, s), 2,29 (3H, s).
Primjer 14
2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]-N-(2-metilalil)benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i 2-metilalilamin.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,87 (1H, s), 8,82 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,82 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,74 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,43 (4H, m), 7,33 (1H, s), 7,10 (1H, d, J = 8,7 Hz), 6,99 (1H, s), 6,92 (1H, t, J = 7,8 Hz), 5,80 (1H, dd, J = 2,2, 9,2 Hz), 4,83 (2H, d, J = 11,8 Hz), 3,83 (4H, m), 2,47 (3H, s), 2,44 (1H, m), 2,31 (3H, s), 2,00 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,73 (3H, s), 1,58 (2H, m).
[image] Primjer 15
2-{3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-(2-metilalil)benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, s tim što se upotrebljava N-(2-metilalil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,89 (1H, s), 9,75 (1H, s), 8,79 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,05 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,74 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,45-7,33 (4H, m), 7,23 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,00-6,97 (2H, m), 6,90 (1H, dt, J = 7,9, 1,1 Hz), 4,81 (2H, d, J = 11,3 Hz), 3,81 (2H, d, J = 5,6 Hz), 2,47 (3H, s), 2,30 (3H, s), 1,71 (3H, s).
Alternativna sintezna shema
[image]
Primjer 16(a)
ciklopropilprop-2-in-1-ol
[image]
U tikvicu okruglog dna sa 70 ml bezvodnog THF-a, ohlađenu u ledenoj kupelji na -10°C, doda se 65,6 ml 1,6 M BuLi u heksanima (105 mmol). 5-klorpent-1-in (5,13 g, 50 mmol) uvodi se polako uz održavanje temperature na -10-0°C. Smjesu se miješa 2 sata na 0°C u atmosferi argona. Doda se paraformaldehid (3 g, 100 mmol) u obliku krutine. Smjesu se polako zagrijava do sobne temperature, te miješa preko noći u atmosferi argona. Sljedeći dan doda se voda i približno 50 ml 1 N vodene otopine HCl. Smjesu se ekstrahira etil-acetatom, a pomiješane organske slojeve ispere slanom vodom, osuši preko Na2SO4, filtrira, te koncentrira. Sirovi produkt pročisti se na stupcu, uz eluiranje s 20 % Et2O u heksanima kako bi se dobilo 3 g 3-ciklopropilprop-2-in-1-ola u obliku ulja (prinos: 62 %).
1H-NMR (CDCl3): � 4,22 (dd, 2H, J = 6,04, 2,01 Hz), 1,46 (t, 1H, J = 6,04 Hz), 1,26 (m, 1H), 0,77 (m, 2H), 0,70 (m, 2H).
Primjer 16(b)
3-ciklopropilprop-2-inil-azid
[image]
3-ciklopropilprop-2-in-1-ol (3,28 g, 34,1 mmol) otopi se u 40 ml toluena, doda se DPPA (11,26 g, 40,9 mmol), te DBU (6,24 g, 40,9 mmol), uz održavanje temperature vodenom kupelji. Smjesu se miješa 1 sat na sobnoj temperaturi, te razrijedi s 100 ml heksana i 15 ml CH2Cl2. Smjesu se 4 × ispere vodom, te 1 × slanom vodom, osuši preko Na2SO4, filtrira, te koncentrira u rotacijskom otparivaču s hladnom vodenom kupelji kako bi se uklonilo veći dio organskog otapala, uz zaostajanje malo toluena (produkt je hlapljiv). Preostalo ulje upotrijebi se u idućem koraku.
1H-NMR (CDCl3): � 3,85 (s, 2H), 1,26 (m, 1H), 0,80 (m, 2H), 0,72 (m, 2H).
Primjer 16(c)
3-ciklopropilprop-2-inilamin
[image]
3-ciklopropilprop-2-inilazid (približno 34 mmol) se otopi u 100 ml THF-a, doda se 1 ml vode, uz dodatak PPh3 (13,37 g, 51 mmol) u obliku krutine, uz održavanje temperature vodenom kupelji. Smjesu se miješa 1 sat na sobnoj temperaturi. U smjesu se doda 150 ml 1 N vodene otopine HCl. Smjesu se 3 × ispere metilen-kloridom. Vodeni sloj zaluži se s 5 N NaOH do pH 10-12. Smjesu se ekstrahira etil-acetatom. Vodeni sloj provjeri se TLC-bojanjem kako bi se pratilo napredovanje ekstrakcije amina u organsku fazu. Pomiješani organski sloj osuši se preko Na2SO4, filtrira, te koncentrira kako bi se dobilo 1,62 g željenog produkta (produkt je hlapljiv, sadrži zaostalo otapalo EtOAc) (prinos: 50 % u 2 koraka).
1H-NMR (CDCl3): � 3,37 (d, 2H, J = 2 Hz), 1,22 (m, 1H), 0,74 (m, 2H), 0,65 (m, 2H).
Primjer 17
N-(3-ciklopropilprop-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije da se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu E i 3-ciklopropilprop-2-inilamin.
1H-NMR (CDCl3): � 9,51 (1H, s), 7,97 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,81 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,51-7,42 (3H, m), 7,34-7,29 (2H, m), 7,16 (1H, s), 7,11 (1H, dd, J = 9,0, 1,9 Hz), 6,85 (1H, s), 6,81 (1H, dt, J = 7,2, 1,1 Hz), 6,23 (1H, t, J = 7,2 Hz), 5,61 (1H, dd, J = 9,0, 2,6 Hz), 4,17 (2H, dd, J = 5,3, 2,3 Hz), 4,07-4,00 (1H, m), 3,75-3,66 (1H, m), 2,63-2,50 (1H, m), 2,54 (3H, s), 2,32 (3H, s), 2,20-2,02 (2H, m), 1,79-1,62 (3H, m), 1,29-1,19 (1H, m), 0,77-0,67 (4H, m).
Primjer 18
N-(3-cikloprop-2-inil)-2-{3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]-N-prop-2-inilbenzamid umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,90 (1H, s), 9,79 (1H, s), 8,91 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,68 (1H, dd, J = 7,9, 1,1 Hz), 7,49- 7,38 (3H, m), 7,29 (1H, s), 7,25 (1H, d, J = 1,9 Hz), 6,99 (1H, dd, J = 9,0, 2,3 Hz), 6,96 (1H, s), 6,88 (1H, dt, J = 7,9, 1,5 Hz), 4,00 (2H, dd, J = 5,6, 1,9 Hz), 2,46 (3H, s), 2,29 (3H, s), 1,31-1,23 (1H, m), 0,75-0,70 (2H, m), 0,57-0,52 (2H, m).
Primjer 19(a)
Monoacetat 2-butin-1,4-diola
[image]
U otopinu butin-1,4-diola (5 g, 58 mmol) u suhom THF-u na sobnoj temperaturi doda se natrijev hidrid u obrocima (60 % disperzija u ulju, 2,32 g, 58 mmol). Nakon 4,3 sata doda se acetil-klorid (4,12 ml, 58 mmol). Nakon 22 sata miješanja na sobnoj temperaturi smjesu se koncentrira pod sniženim tlakom. Ostatak se 2 × koncentrira iz toluena prije pročišćavanja na silikagelu uz upotrebu smjese etil-acetat:diklormetan (1:3) kao eluensa kako bi se dobilo monoacetat 2-butin-1,4-diola u obliku ulja, u prinosu od 49 %.
1H-NMR (DMSO-d6): � 5,23 (1H, bs),4,70(2H, t, J = 1,8 Hz), 4,09 (2H, s), 2,03 (3H, s).
Primjer 19(b)
4-aminobut-2-inilni ester octene kiseline
[image]
Dobije se na način sličan kao što je opisano u Primjeru 8, s tim što se upotrebljava 2-butin-1,4-diol-monoacetat umjesto 4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-in-1-ola.
1H-NMR (DMSO-d6): � 4,77 (2H, s), 4,20 (2H, s), 2,04 (3H, s).
Primjer 20
4-(2-{3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzoilamino)but-2-inilni ester octene kiseline
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava p-toluensulfonat 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline i 4-aminobut-2-inilni ester octene kiseline.
1H-NMR (CD3CN): � 11,00 (1H, bs), 9,59 (1H, s), 7,99 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,58 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,49-7,37 (4H, m), 7,32 (1H,s), 7,21 (1H, s), 7,06 (1H, dd, J = 8,8, 1,8 Hz), 6,96 (1H, s), 6,90 (1H, t, J = 7,8 Hz), 4,63 (2H, s), 4,16 (2H, d, J = 5,6 Hz), 2,49 (3H, s), 2,32 (3H, s), 2,01 (3H, s).
Primjer 21
Metilni ester 2-[3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]nikotinske kiseline
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 3, gore, s tim što se upotrebljava metilni ester 2-bromnikotinske kiseline umjesto metilnog estera 2-brombenzojeve kiseline.
1H-NMR (DMSO-d6): � 10,36 (1H, s), 8,50 (1H, dd, J = 4,7, 1,9 Hz), 8,36 (1H, d, J = 1,4 Hz), 8,30 (1H, dd, J = 7,8, 2,0 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,48 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,44 (1H, s), 7,33 (1H, s), 6,98-6,93 (2H, m), 5,80 (1H, d, J = 7,0 Hz), 2,93 (3H, s), 3,93-3,90 (1H, m), 3,80-3,75 (1H, m), 2,46 (3H, s), 2,30 (3H, s), 2,10-1,97 (2H, m), 1,89-1,60 (3H, m).
Primjer 22
2-[3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]nikotinska kiselina
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 4, s tim što se upotrebljava metilni ester 2-[3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]nikotinske kiseline umjesto metilnog estera 2-[3-[2-(4,6-dim etilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline.
1H-NMR (DMSO-d6): � 10,73 (1H, s), 8,49 (1H, d, J = 1,9 Hz), 8,45 (1H, s), 8,31 (1H, dd, J = 7,7, 1,8 Hz), 8,16-7,97 (3H, m), 7,70 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,50 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,37 (1H, s), 6,96 (1H, dd, J = 7,7, 4,8 Hz), 5,87 (1H, d, J = 8,4 Hz), 3,95-3,90 (1H, m), 3,79-3,70 (1H, m), 2,63 (3H, s), 2,47 (3H, s), 2,07-1,99 (2H, m), 1,81-1,62 (3H, m).
Primjer 23
2-{3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-(4-hidroksibut-2-inil)nikotinamid
[image]
Sirovu smjesa N-(4-hidroksibut-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]nikotinamida i N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]nikotinamida dobije se iz 2-[3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]nikotinske kiseline i 4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inilamina na način sličan onom opisanom u Primjeru 6 gore, te prevede u 2-{3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-(4-hidroksibut-2-inil)nikotinamid na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, s tim što se upotrebljava smjesu N-(4-hidroksibut-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]nikotinamida i N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]nikotinamida umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,99 (1H, s), 11,21 (1H, s), 9,26 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,50 (1H, d, J = 1,9 Hz), 8,41 (1H, dd, J = 4,9, 1,9 Hz), 8,16 (1H, dd, J = 8,3, 1,9 Hz), 8,04 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,42 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,31 (1H,s), 7,06 (1H, dd, J = 8,7, 1,5 Hz), 6,96 (1H, s), 6,93 (1H, dd, J = 7,5, 4,9 Hz), 5,14 (1H, t, J = 5,6 Hz), 4,16 (2H, d, J = 5,6 Hz), 4,08 (2H, d, J = 7,2 Hz), 2,46 (3H, s), 2,30 (3H, s).
Primjer 24
p-toluensulfonat 2-{3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}nikotinske kiseline
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 5, s tim što se upotrebljava 2-[3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]nikotinsku kiselinu umjesto 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline.
1H-NMR (DMSO-d6): � 13,49 (1H, s), 10,80 (1H, s), 8,63 (1H, d, J = 1,5 Hz), 8,49 (1H, dd, J = 4,8, 1,9 Hz), 8,31 (1H, dd, J = 7,7, 1,9 Hz), 8,24-8,19 (2H, m), 8,06 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,60-7,55 (2H, m), 7,46 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,22 (1H, dd, J = 8,8, 1,7 Hz), 7,09 (2H, d, J = 7,9 Hz), 6,95 (1H, dd, J = 7,7, 4,7 Hz), 2,66 (3H, s), 2,54 (3H, s), 2,27 (3H, s).
Primjer 25
tert-(3-ciklopropilprop-2-inil)-2-{3-[(E)-2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}nikotinamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava p-toluensulfonat 2-{3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}nikotinske kiseline i 3-ciklopropilprop-2-inilamin.
1H-NMR (DMSO-d6): 513,01 (1H, s), 11,20 (1H, s), 9,19 (1H, bt), 8,51 (1H, s), 8,40 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,15 (1H, d, J = 7,5 Hz), 8,05 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,42 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,31 (1H, s), 7,05 (1H, d, J = 8,3 Hz), 6,96 (1H, s), 6,92 (1H, dd, J = 7,5, 4,9 Hz), 4,06 (2H, d, J = 4,14 Hz), 2,46 (3H, s), 2,29 (3H, s), 1,33-1,28 (1H, m), 0,77-0,72 (2H, m), 0,60-0,55 (2H, m).
Primjer 26
4-metil-2-vinilpiridin
[image]
Žutu smjesu 2-brom-4-metilpiridina (Aldrich, 5,2 g, 30,5 mmol, 1,0 ekv.), 2,6-di-tert-butil-4-metilfenola (Aldrich, 67 mg, 0,3 mmol, 1mol %), tributilvinilstanana (Aldrich, 26,8 ml, 91,5 mmol, 3,0 ekv.) i tetrakis(trifenilfosfin)paladija(0) (Strem, 1,8 g, 1,5 mmol, 5mol %) u toluenu (100 ml) se degazira i pročisti argonom. Grijanjem smjese do 100°C dobije se otopina boje jantara. Reakcijsku smjesu ugasi se nakon 18 sati dodavanjem 1,0 M HCl. Kiseli ekstrakt ispere se eterom, čvrstim natrijevim bikarbonatom podesi do pH 9, te ekstrahira etil-acetatom. Organske ekstrakte ispere se slanom vodom, osuši preko magnezijevog sulfata, filtrira, te koncentrira pod sniženim tlakom. Sirovi produkt (3,7 g smeđeg ulja) pročisti se flash-kromatografijom (silikagel), te eluira smjesom 0-5 % etil-acetat:diklormetan, čime se dobije bistro ulje (1,9 g, 53 %).
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): � 8,39 (1H, d, J = 4,9 Hz), 7,33 (1H, s), 7,10 (1H, dd, J = 5,0, 0,8 Hz), 6,77 (1H, dd, 17,5, 10,8 Hz), 6,20 (1H, dd, J = 17,5, 1,7 Hz), 5,44 (1H, dd, J = 10,8, 1,8 Hz), 2,31 (3H, s).
ESIMS m/z 120 [M + H]+.
Primjer 27
3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-6-nitro-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol
[image]
Suspenziju 4-metil-2-vinilpiridina (Primjer 23) (1,9g, 15,97 mmol), 6-nitro-1-(tetrahidropiran-2-il)-3-vinil-1H-indazola (4,96g, 13,3 mmol), Pd(OAc)2 (149 mg, 0,66 mmol), P(o-tolil)3 i DIEA (3,5 ml, 19,96 mmol) u degaziranom DMF-u (50 ml) grije se u atmosferi argona 18 sati na 100°C. Reakcijsku smjesu se ohladi, a krutine ukloni filtracijom, uz ispiranje s EtOAc. Filtrat se razrijedi s EtOAc, ispere slanom vodom (2 ×), osuši (MgSO4), te koncentrira pod sniženim tlakom. Ostatak se kromatografira na silikagelu, uz eluiranje smjesom heksani:EtOAc (3:1) kako bi se dobilo 3,40g (70 %) jarkožute krutine.
1H-NMR (CDCl3): � 8,56 (1H, s), 8,50 (1H, d, J = 5,0 Hz), 8,11 (2H, m), 7,89 (1H, d, J = 16,3 Hz), 7,61 (1H, s), 7,03 (1H, d, J = 4,3 Hz), 5,83 (1H, dd, J = 2,6, 9,0 Hz), 4,06 (1H, m), 3,82 (1H, m), 2,58 (1H, m), 2,39 (3H, s), 2,18 (2H, m), 1,78 (3H, m).
[image]
Primjer 28
3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamin
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 2, s tim što se upotrebljava [2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-6-nitro-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol (Primjer 24) umjesto 3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-6-nitro-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazola.
1H-NMR (DMSO-d6): � 8,43 (1H, d, J = 4,8 Hz), 7,79-7,73 (2H, m), 7,50 (1H, s), 7,39 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,09 (1H, d, J = 4,8 Hz), 6,64-6,62 (2H, m), 5,57 (1H, dd, J = 9,8, 2,5 Hz), 5,48 (2H, bs), 3,92-3,85 (1H, m), 3,72-3,64 (1H, m), 2,43-2,34 (1H, m), 2,33 (3H, s), 2,07-2,00 (1H, m), 1,96-1,90 (1H, m), 1,79-1,66 (1H, m), 1,60-1,53 (2H, m).
Primjer 29
Metilni ester 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 3, s tim što se upotrebljava 3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamin umjesto 3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamina.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,48 (1H, s), 8,45 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,13 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,93 (1H, dd, J = 8,3, 1,9 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,58 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,54-7,44 (3H, m), 7,36 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,18 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 7,11 (1H, d, J = 4,9 Hz), 6,87 (1H, t, J = 8,3 Hz), 5,83 (1H, dd, J = 9,4, 2,3 Hz), 3,87 (3H, 1H), 3,93-3,84 (1H, m), 3,77- 3,69 (1H, m), 2,46-2,37 (1H, m), 2,34 (3H, s), 2,10-1,94 (2H, m), 1,81-1,53 (3H, m).
Primjer 30
2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeva kiselina
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 4, gore, s tim što se upotrebljava metilni ester 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline umjesto metilnog estera 2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline (Primjer 3).
1H-NMR (DMSO-d6): � 13,17 (1H, broad s), 9,83 (1H, s), 8,51 (1H, d, J = 5,2 Hz), 8,14 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,95 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,94 (dd, 1H, J = 1,5, 8,0 Hz), 7,73 (1H, s), 7,60 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,59 (1H, s), 7,54 (1H, s), 7,46 (1H, m), 7,37 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,23 (2H, m), 6,86 (1H, t, J = 6,9 Hz), 5,87 (1H, d, J = 7,6 Hz), 3,90 (1H, m), 3,76 (1H, m), 2,45 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,03 (2H, m), 1,77 (1H, m), 1,59 (2H, m).
Primjer 31
2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]-N-prop-2-inilbenzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava propargilamin i 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,87 (1H, s), 9,03 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,53 (1H, s), 7,44 (4H, m), 7,13 (2H, m), 6,91 (1H, t, J = 7,9 Hz), 5,81 (1H, dd, J = 2,2, 9,6 Hz), 4,07 (2H, dd, J = 2,5, 5,5 Hz), 3,89 (1H, m), 3,75 (1H, m), 3,12 (1H, t, J = 2,5 Hz), 2,42 (1H, m), 2,36 (3H, s), 2,00 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,58 (2H, m).
[image]
Primjer 32
2-{3-[(E)-2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-prop-2-inilbenzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]-N-prop-2-inilbenzamid umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil]-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,93, s), 9,79 (1H, s), 9,02 (1H, t, J = 5,4 Hz), 8,45 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,45 (4H, m), 7,27 (1H, s), ), 7,10 (1H, d, J = 4,9 Hz), 7,03 (1H, d, J = 8,8 Hz), 6,90 (1H, t, J = 7,9 Hz), 4,06 (2H, dd, J = 2,4, 5,4 Hz), 3,12 (1H, t, J = 2,4 Hz), 2,35 (3H, s).
[image] Primjer 33
N-(2-metilalil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-metilalilamin i 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,86 (1H, s), 8,81 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,75 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,54 (1H, s), 7,50 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,43 (3H, m), 7,11 (2H, m), 6,92 (1H, t, J = 8,1 Hz), 5,81 (1H, dd, J = 2,5, 9,8 Hz), 4,83 (2H, d, J = 11,5 Hz), 3,81 (4H, m), 2,41 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2,00 (2H, m), 1,76 (1H, m), 1,73 (3H, s), 1,58 (2H, m).
[image]
Primjer 34
N-(2-metilalil)-2-{[(E)-2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, s tim što se upotrebljava N-(2-metilalil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil]-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,90 (1H, s), 9,76 (1H, s), 8,80 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,45 (1H, d, J = 5,1 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,75 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,51 (1H, s), 7,48 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,43 (2H, m), 7,24 (1H, s), 7,10 (1H, d, J = 4,9 Hz), 7,00 (1H, dd, J = 1,9, 8,9 Hz), 6,91 (1H, t, J = 8,1 Hz), 4,82 (2H, d, J = 11,3 Hz), 3,83 (2H, d, J = 5,8 Hz), 2,35 (3H, s), 1,73 (3H, s).
[image] Primjer 35
N-(3-ciklopropilprop-2-inil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i 3-ciklopropilprop-2-inilamin.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,88 (1H, bs), 8,93 (1H, bt), 8,46 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,54-7,40 (5H, m), 7,14-7,11 (2H, m), 6,90 (1H, t, J = 6,1 Hz), 5,81 (1H, d, J = 7,5 Hz), 4,02 (2H, d, J = 3,6 Hz), 3,95-3,85 (1H, m), 3,79-3,72 (1H, m), 2,49-2,35 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2,15-2,01 (2H, m), 1,87-1,55 (3H, m), 1,30-1,25 (1H, m), 0,77-0,70 (2H, m), 0,59-0,54 (2H, m).
Primjer 36
N-(3-cikloprop-2-inil)-2-{3-[(E)-2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, gore, s tim što se upotrebljava N-(3-cikloprop-2-inil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,91 (1H, s), 9,79 (1H, s), 8,91 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,87 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,67 (1H, dd, J = 7,9, 1,5 Hz), 7,50-7,35 (4H, m), 7,24 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,09 (1H, d, J = 4,9 Hz), 7,00 (1H, dd, J = 8,7, 1,5 Hz), 6,88 (1H, dt, J = 4,1, 1,5 Hz), 4,00 (2H, dd, J = 5,3, 1,9 Hz), 2,34 (3H, s), 1,31-1,23 (1H, m), 0,75-0,69 (2H, m), 0,56-0,52 (2H, m).
Primjer 37
2-{3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-piridin-2-ilmetilbenzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6 i Primjer 7, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i C-piridin-2-ilmetilamin.
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): � 12,91 (1H, s), 9,77 (1H, s), 9,19 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,50 (1H, d, J = 4,1 Hz), 8,45 (1H, d, J = 5,0 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,82-7,70 (2H, m), 7,51-7,25 (7H, m), 7,10 (1H, d, J = 4,6 Hz), 6,98 (1H, dd, J = 8,8, 1,8 Hz), 6,96-6,91 (1H, m), 4,58 (2H, d, J = 5,9 Hz), 2,35 (3H, s).
ESIMS m/z 461 [M + H]+.
[image]
Primjer 38
2-{3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-piridin-4-ilmetilbenzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjerima 6 i 7, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i C-piridin-4-ilmetilamin.
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): � 12,90 (1H, s), 9,73 (1H, s), 9,21 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,49- 8,44 (3H, m), 8,06 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,81 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,51-7,40 (4H, m), 7,31 (2H, d, J = 5,9 Hz), 7,24 (1H, s), 7,11 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,00 (1H, dd, J = 8,7, 1,7 Hz), 6,97-6,92 (1H, m), 4,50 (2H, d, J = 5,9 Hz), 2,35 (3H, s).
ESIMS m/z 461 [M + H]+.
[image] Primjer 39
N-(6-metilpiridin-2-ilmetil)-2-{3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjerima 6 i 7, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i C-(6-metilpiridin-2-il)metilamin.
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): � 12,92 (1H, s), 9,76 (1H, s), 9,20 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,05 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,81 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,59 (1H, t, J = 7,7 Hz), 7,49-7,37 (4H, m), 7,23 (1H, s), 7,11-7,08 (3H, m), 6,99 (1H, dd, J = 8,7, 1,6 Hz), 6,95-6,90 (1H, m), 4,51 (2H, d, J = 5,9 Hz), 2,42 (3H, s), 2,33 (3H, s).
ESIMS m/z 475 [M + H]+.
[image]
Primjer 40
N-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[(E)-3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-{3-[2-(4-metilpiridin-2-ilvinil)-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i C-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-il)metilamin.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,81(1H, s), 9,05 (1H, bt), 8,46 8,7 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,71 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,54-7,40 (5H, m), 7,11-7,09 (2H, m), 6,91 (1H, t, J = 6,9 Hz), 5,94 (1H, s), 5,80 (1H, d, J = 7,3 Hz), 4,45 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,93-3,85 (1H, m), 3,78-3,69 (1H, m), 3,73 (3H, s), 2,45-2,35 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,06-1,95 (2H, m), 1,85-1,53 (m, 3H).
Primjer 41
N-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-{3-[(E)-2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, s tim što se upotrebljava N-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[(E)-3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,90 (1H, s), 9,70 (1H, s), 9,03 (1H, t, J = 6,0 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,87 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,50-7,38 (4H, m), 7,22 (1H, s), 7,1 (1H, d, J = 5,6 Hz), 6,99 (1H, dd, J = 8,7, 1,5 Hz), 6,90 (1H, dt, J = 7,9, 1,9 Hz), 5,91 (1H, s), 4,43 (2H, d, J = 5,6 Hz), 3,72 (3H, s), 2,34 (3H, s), 2,05 (3H, s).
Primjer 42
1-metil-1H-benzoimidazol-2-karbaldehid-oksim
[image]
U miješanu suspenziju 1-metil-1H-benzoimidazol-2-karbaldehida (980 mg, 6,61 mmol) u H2O (10 ml) doda se otopina natrijevog acetata (3,25 g, 39,68 mmol) i hidroksilamin-hidroklorid (1,38 g, 19,84 mmol) u 10 ml H2O. Reakcijsku smjesu miješa se 2 sata na sobnoj temperaturi, a gusti talog prikupi filtracijom, ispere vodom, te osuši u vakuumu kako bi se dobilo 1,02 g (94 %) bijele krutine.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,06 (1H, s), 8,28 (1H, s), 7,65 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,60 (1H, d, J = 6,8 Hz), 7,32 (1H, t, J = 7,2 Hz), 7,23 (1H, t, J = 6,8 Hz), 4,00 (3H, s).
[image]
Primjer 43
C-(1-metil-1H-benzoimidazol-2-il)metilamin-dihidroklorid
[image]
U Parrovu tlačnu bocu stavi se 1-metil-1H-benzoimidazol-2-karbaldehid-oksim M (267 mg, 1,6 mmol), 10 % paladija na ugljiku (75 mg), konc. HCl (2 kapi) i EtOH (25 ml). Reakcijsku smjesu se trese 2 sata pod tlakom H2 od 310 kPa (45 psi) prije nego se katalizator ukloni filtracijom. Filtrat se koncentrira pod sniženim tlakom, a ostatak triturira s Et2O kako bi se dobilo 340 mg (90 %) bijele krutine u obliku dihidrokloridne soli, te upotrijebi bez daljnjeg pročišćavanja.
1H-NMR (DSMO-d6): � 8,87 (2H, broad s), 7,72 (2H, m), 7,38 (2H, m), 4,50 (2H, s), 3,89 (3H, s).
Primjer 44
N-(1-metil-1H-benzoimidazol-2-ilmetil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava C-(1-metil-1H-benzoimidazol-2-il)metilamin-hidroklorid N i 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,82 (1H, s), 9,20 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,46 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,74 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,58 (1H, d, J = 7,2 Hz), 7,50 (6H, m), 7,19 (4H, m), 6,92 (1H, t, J = 8,1 Hz), 5,78 (1H, dd, J = 2,5, 9,5 Hz), 4,79 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,89 (1H, m), 3,83 (3H, s), 3,71 (1H, m), 2,41 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2,00 (2H, m), 1,74 (1H, m), 1,57 (2H, m).
[image]
Primjer 45
N-(1-metil-1H-benzoimidazol-2-ilmetil)-2-{3-[(E)2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, s tim što se upotrebljava N-(1-metil-1H-benzoimidazol-2-ilmetil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil]-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,93 (1H, s), 9,73 (1H, s), 9,19 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,45 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,74 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,60-7,36 (6H, m), 7,29-7,14 (3H, m), 7,10 (1H, d, J = 4,7 Hz), 7,04 (1H, dd, J = 1,8, 8,9 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,3 Hz), 4,79 (2H, d, J = 5,3 Hz), 3,83 (3H, s), 2,35 (3H, s).
[image] Primjer 46
1-metil-1H-imidazol-2-karbaldehid-oksim
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 39, s tim što se upotrebljava 1-metil-1H-imidazol-2-karbaldehid umjesto 1-metil-1H-benzoimidazol-2-karbaldehida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 11,50 (1H, s), 8,05 (1H, s), 7,28 (1H, s), 6,95 (1H, s), 3,80 (3H, s).
[image]
Primjer 47
C-(1-metil-1H-imidazol-2-il)metilamin-dihidroklorid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 40, s tim što se upotrebljava 1-metil-1H-imidazol-2-karbaldehid-oksim umjesto 1-metil-1H-benzoimidazol-2-karbaldehid-oksima.
1H-NMR (DMSO-d6): � 7,45 (1H, s), 7,29 (1H, s), 4,25 (21H, s), 3,79 (3H, s).
Primjer 48
N-(1-metil-1H-imidazol-2-ilmetil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava C-(1-metil-1H-imidazol-2-il)metilamin-hidroklorid i 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,83 (1H, s 9,03 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,45 (1H, d, J = 4,7 Hz), 8,09 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,85 (1H, d, J = 16,5 Hz), 8,67 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,53-7,39 (4H, m), 7,11 (3H, m), 6,90 (1H, d, J = 6,9 Hz), 6,86 (1H, s), 5,79 (1H, d, J = 8,9 Hz), 5,75 (1H, s), 4,54 (1H, d, J = 5,5 Hz), 3,85 - 3,70 (2H, m), 3,66 (3H, s), 2,35 (3H, s), 2,10 (2H, m), 1,70 (2H, m), 1,60 (3H, m).
[image] Primjer 49
N-(1-metil-1H-imidazol-2-ilmetil)-2-{3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, s tim što se upotrebljava N-(1-metil-1H-imidazol-2-ilmetil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil]-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,89 (1H, s 9,72 (1H, s 8,99 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,05 (1H, d, J = 8,7 H), 7,86 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,66 (1H, d, J = 6,7 Hz), 7,49-7,36 (4H, m), 7,24 (1H, m), 7,09 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,02 (1H, d, J = 8,8 Hz), 6,88 (1H, t, J = 6,9 Hz), 6,81 (1H, s), 4,52 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,29 (3H, s), 2,34 (3H, s).
[image]
Primjer 50
N-(4-hidroksibut-2-inil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, s tim što se upotrebljava 2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i 4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inilamin.
1H-NMR (CDCl3): � 9,48 (H, s), 8,46 (1H, d, J = 5,3 Hz), 7,92 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,83 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,52 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,46-7,41 (2H, m), 7,34-7,31 (3H, m), 7,12 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 6,99 (1H, d, J = 4,9 Hz), 6,81 (1H, t, J = 6,8 Hz), 6,40 (1H, t, J = 4,9 Hz), 5,62 (1H, dd, J = 9,4, 3,0 Hz), 4,28-4,23 (4H, m), 4,08-4,01 (1H, m), 3,76-3,67 (1H, m), 2,63-2,49 (1H, m), 2,38 (3H, s), 2,22-2,06 (2H, m), 1,80-1,60 (3H, m).
Primjer 51
2-{3-[(E)-2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1H-indazol-6-ilamino}-N-(4-hidroksibut-2-inil)benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 7, s tim što se upotrebljava smjesu N-(4-hidroksibut-2-inil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida i N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi) but -2-inil)-2-[3-[2-(4-metilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida umjesto N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil)-2-[3-[2-(4,6-dimetilpiridin-2-il)vinil]-1-(tetrahidropiran-2-il)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,92 (1H, s), 9,83 (1H, s), 9,00 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,44 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,87 (1H, d, J = 16,6 Hz), 7,68 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,50-7,38 (4H, m), 7,26 (1H, s), 7,09 (1H, d, J = 5,3 Hz), 7,01 (1H, dd, J = 8,7, 1,5 Hz), 6,88 (1H,dt, J = 6,8, 1,5 Hz), 5,11 (1H, t, J = 3,0 Hz), 4,10-4,04 (4H, m), 2,34 (3H, s).
Primjer 52
Metilni ester 2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeve kiseline
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjerima 2 i 3, gore, s tim što je polazni materijal 6-nitro-3-stiril-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol umjesto 6-jod-3-stiril-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazola. Ovaj materijal uzima se kao sirovu smjesu produkta i metilnog estera 2-aminobenzojeve kiseline u sljedeći korak.
Primjer 53
2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeva kiselina
[image]
Izdvaja se kao nusprodukt reakcije N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil]-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamida i TBAF-a, u postupku Sličnom onom u Primjeru 11, u US serijski broj 09/609,335, podnesenoj 30. lipnja 2000., uključenoj u ovu specifikaciju u svojoj cijelosti i u sve svrhe.
1H-NMR (DMSO-d6): � 13,19 (1H, broad s 10,00 (1H, s, 9,13 (1H, s), 8,37 (1H, d, J = 8,7 Hz), 8,06 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,75 (1H, s), 7,64 (2H, t, J = 2,3 Hz), 7,54 (2H, m), 7,35 (1H, dd, J = 1,9, 8,7 Hz), 6,99 (1H, m), 6,33 (2H, t, J = 2,3 Hz), 5,89 (2H, s), 3,68 (2H, t, J = 8,1 Hz), 0,94 (2H, t, J = 8,1 Hz), 0,00 (9H, s).
Primjer 54
N-(3-ciklopropilprop-2-inil)-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i 3-ciklopropilprop-2-inilamin.
1H-NMR (DMSO-d6): � 9,93 (1H, s 8,99 (1H,s), 8,95 (1H, d, J = 5,6 Hz), 8,20 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,68 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,51 (4H, m), 7,37 (1H, t, J = 6,8 Hz), 7,14 (1H, d, J = 9,0 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,5 Hz), 6,21 (2H, t, J = 2,3 Hz), 5,74 (2H, s), 4,00 (2H, dd, J = 2,0, 5,6 Hz), 3,55 (2H, t, J = 7,9 Hz), 1,26 (1H, m), 0,82 (2H, t, J = 7,9 Hz), 0,72 (2H, m) 0,54 (2H, m), -0,12 (9H, s).
Primjer 55
N-(3-ciklopropilprop-2-inil)-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 11, u US patentnoj prijavi serijski broj 09/609,335, podnesenoj 30. lipnja 2000., uključenoj u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe, s tim što se upotrebljava N-(3-ciklopropilprop-2-inil)-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-metil-N-{3-stiril-1-[2-trimetilsilanil)etoksimetil]-1H-indazol-6-il}benzen-1,3-diamina.
1H-NMR (DMSO-d6): � 13,29 (1H, s), 9,83 (1H, s 8,98 (1H, s), 8,95 (1H, t, J = 5,5 Hz), 8,19 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,68 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,52 (2H, t, J = 2,3 Hz), 7,43 (2H, m), 7,29 (1H, s), 7,07 (1H, dd, J = 1,9, 8,7 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,4 Hz), 6,21 (2H, t, J = 2,3 Hz), 4,01 (2H, dd, J = 1,7, 5,5 Hz), 1,27 (1H, m), 0,73 (2H, m), 0,55 (2H, m).
[image] Primjer 56
N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil]-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i 4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inilamin.
1H-NMR (DMSO-d6): � 10,04 (1H, s 9,16 (1H, t, J = 5,3 Hz), 9,10 (1H,s), 8,31 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,78 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,67 (4H, m), 7,49 (1H, t, J = 8,5 Hz), 7,24 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 7,03 (1H, t, J = 7,4 Hz), 6,33 (2H, t, J = 2,3 Hz), 5,85 (2H, s), 4,83 (2H, s), 4,19 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,66 (2H, t, J = 7,9 Hz), 0,94 (2H, m), 0,89 (9H, s), 0,13 (6H, s), 0,00 (9H, s).
Primjer 57
N-(4-hidroksibut-2-inil)-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 11, u US patentnoj prijavi serijski broj 09/609,335, podnesenoj 30. lipnja 2000., uključenoj u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe, s tim što se upotrebljava N-[4-(tert-butildimetilsilaniloksi)but-2-inil]-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-metil-N-{3-stiril-1-[2-trimetilsilanil)etoksimetil]-1H-indazol-6-il}benzen-1,3-diamina.
1H-NMR (DMSO-d6): � 13,30 (1H, s), 9,87 (1H, g 9,04 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,99 (1H, s), 8,19 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,46 (4H, m), 7,31 (1H, s), 7,08 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,3 Hz), 6,21 (2H, t, J = 2,1 Hz), 5,14 (1H, t, J = 5,8 Hz), 4,10 (2H, d, J = 5,5 Hz), 4,06 (2H, d, J = 5,8 Hz).
[image] Primjer 58
2,5-dimetil-2H-pirazol-3-karbonitril
[image]
2,5-dimetil-2H-pirazol-3-karbonitril dobije se iz etil-1,3-dimetilpirazol-5-karboksilata, u postupcima objavljenim za 1-metilpirazol-5-karbonitril, u Maria Castellanos i Llinas Montserrat: JCS Perkins Trans I, 1209-1215, (1985.).
1H-NMR (CDCl3): � 6,52(1H, s), 3,96 (3H, s), 2,27 (3H, s).
Primjer 59
C-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-il)metilamin
[image]
Suspenziju 2,5-dimetil-2H-pirazol-3-karbonitrila (654 mg, 5,4 mmol) i 10 % paladija na ugljiku (200 mg) u etanolu (15 ml) trese se u Parrovom uređaju za hidrogenaciju, pod tlakom H2 od 310 kPa (45 psi), u trajanju od 17 sati. Smjesu se filtrira kroz Celite, a filtrat koncentrira pod sniženim tlakom kako bi se dobilo 608 mg ulja, koje se upotrebi bez ikakvog daljnjeg pročišćavanja.
1H-NMR (CDCl3): � 5,91 (1H, s), 3,81, 3,73 (2H,2s), 3,75 (3H, s), 2,21 (3H, s).
Primjer 60
N-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i C-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-il)metilamin.
1H-NMR (CDCl3): � 9,56 (1H, s), 8,68 (1H, s), 8,30 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,49 (1H, d, J = 8,3 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 7,9, 1,5 Hz), 7,36-7,31 (2H, m), 7,23 (2H, t, J = 2,6 Hz), 7,17 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 6,83 (1H, t, J = 7,2 Hz), 6,32 (1H, bt), 6,29 (2H, t, J = 2,3 Hz), 6,01 (1H, s), 5,67 (2H, s), 4,61 (2H, d, J = 5,6 Hz), 3,60 (3H, s), 3,58 (2H, t, J = 8,3 Hz), 2,22 (3H, s), 0,90 (2H, t, J = 8,7 Hz), 0,06 (9H, s).
Primjer 61
N-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 11, u US patentnoj prijavi serijski broj 09/609,335, podnesenoj 30. lipnja 2000., uključenoj u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe, s tim što se upotrebljava N-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksi metil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid umjesto N-metil-N-{3-stiril-1-[2-trimetilsilanil)etoksimetil]-1H-indazol-6-il}benzen-1,3-diamina.
1H-NMR (DMSO-d6): � 13,27 (1H, s), 9,72 (1H, s), 9,05 (1H, t, J = 5,3 Hz), 8,97 (1H, s), 8,16 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,68 (1H, dd, J = 8,3, 1,9 Hz), 7,50 (2H, t, J = 2,6 Hz), 7,46-7,38 (2H, m), 7,25 (1H, s), 7,05 (1H, dd, J = 8,7, 1,9 Hz), 6,91 (1H, t, J = 6,80 Hz), 6,20 (2H, t, J = 2,3 Hz), 5,91 (1H, s), 4,43 (2H, d, J = 5,6 Hz), 3,71 (3H, s), 2,04 (3H, s).
Primjer 62
2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojeva kiselina
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 11, u US patentnoj prijavi serijski broj 09/609,335, podnesenoj 30. lipnja 2000., uključenoj u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti i u sve svrhe, s tim što se upotrebljava 2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilaniletoksimetil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu umjesto N-metil-N-{3-stiril-1-[2-trimetilsilanil)etoksimetil]-1H-indazol-6-il}benzen-1,3-diamina.
1H-NMR (DMSO-d6): � 13,12 (1H, s), 12,70 (1H, s), 8,94 (1H, s), 8,10 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,91 (1H, dd, J = 1,7, 7,7 Hz), 7,50 (2H, t, J = 2,3 Hz), 7,36 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,27 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,16 (1H, t, J = 7,5 Hz), 6,94 (1H, dd, J = 1,7, 8,7 Hz), 6,68 (1H, t, J = 7,5 Hz), 6,19(2H, t, J = 2,3 Hz).
Primjer 63
N-prop-2-inil-2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava 2-[3-(pirol-1-iliminometil)-1H-indazol-6-ilamino]benzojevu kiselinu i propargilamin.
1H-NMR (DMSO-d6): � 13,30 (1H, s), 9,82 (1H, s), 9,04 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,98 (1H, s), 8,19 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,69 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,45(4H, m), 7,31 (1H, s), 7,08 (1H, d, J = 8,6 Hz), 6,91 (1H, t, J = 7,6 Hz), 6,21 (2H, s), 4,05 (2H, s), 3,13 (1H, s).
[image]
Primjer 64
N-(4-hidroksibut-2-inil)-2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava tetrabutilamonijev 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzoat i 4-aminobut-2-in-1-ol.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,95 (1H, s), 9,84 (1H, s), 9,02 (1H, t, J = 5,6 Hz), 8,59 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,90 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,80 (1H, t, J = 7,2 Hz), 7,70-7,64 (2H, m), 7,51 (1H, d, J = 16,2 Hz), 7,45-7,36 (2H, m), 7,27- 7,24 (2H, m), 7,02 (1H, d, J = 9,0 Hz), 6,88 (1H, t, J = 7,2 Hz), 5,13 (1H, t, J = 5,6 Hz), 4,10-4,04 (4H, m).
Primjer 65
N-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzamid
[image]
Dobije se na način sličan onom opisanom u Primjeru 6, gore, s tim što se upotrebljava tetrabutilamonijev 2-[3-(2-piridin-2-ilvinil)-1H-indazol-6-ilamino]benzoat i C-(2,5-dimetil-2H-pirazol-3-il)metilamin.
1H-NMR (DMSO-d6): � 12,93 (1H, s), 9,70 (1H, s), 9,04 (1H,bt), 8,58 (1H, d, J = 4,0 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,88 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,79 (1H, t, J = 8,6 Hz), 7,71-7,64 (2H, m), 7,50 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,44-7,39 (2H, m), 7,28-7,23 (2H, m), 7,00 (1H, d, J = 8,8 Hz), 6,90 (1H, t, J = 8,0 Hz), 5,91 (1H, s), 4,43 (2H, d, J = 5,5 Hz), 3,71 (3H, s), 2,04 (3H, s).
Primjere spojeva opisanih gore može se ispitati na njihovu aktivnost u ispitivanjima opisanim niže.
Biološko ispitivanje: enzimska ispitivanja
Stimulacija stanične proliferacije čimbenicima rasta poput VEFG, FGF i drugih ovisi o njima izazvanoj autofosforilaciji svakog od odgovarajućih receptorskih tirozinskih kinaza. Prema tome, sposobnost inhibitora proteinskih kinaza da blokira autofosforilaciju može se mjeriti inhibicijom peptidnih supstrata. Kako bi se izmjerilo inhibicijsku aktivnost spojeva naspram proteinskih kinaza osmišljeni su sljedeći konstrukti.
Konstrukt VEGF-R2 za ispitivanje
Ovaj konstrukt određuje sposobnost ispitivanog spoja da inhibira aktivnost tirozinske kinaze. Konstrukt (VEGF-R2�50) citosolne domene ljudskog receptora čimbenika rasta vaskularnog endotela 2 (VEGF-R2) kojem nedostaje 50 centralnih ostataka od 68 ostataka kinazne insercijske domene eksprimira se u sustavu bakulovirus/stanica kukca. Od 1356 ostataka pune duljine VEGF-R2 VEGF-R2�50 sadrži ostatke 806-939 i 990-1171, a također i 1 točkastu mutaciju (E990V) unutar kinazne insercijske domene u odnosu na divlji tip VEGF-R2. Autofosforilacija pročišćenog konstrukta provedena je inkubacijom enzima u koncentraciji od 4 µM u prisutnosti 3 mM ATP-a i 40 mM MgCl2 u 100 mM HEPES-u, pH 7,5, koji sadrži 5 % glicerol i 5 mM DTT, na 4°C, u trajanju od 2 sata. Nakon autofosforilacije, pokazalo se da ovaj konstrukt posjeduje kataličku aktivnost uglavnom ekvivalentnu divljem tipu konstrukta autofosforilirane kinazne domene. Vidjeti Parast i suradnici: Biochemistry, 37, 16788-16801, (1998.).
Konstrukt FGF-R1 za ispitivanje
Unutarstanična kinazna domena ljudskog FGF-R1 eksprimira se uz upotrebu bakulovirusnog vektora kao ekspresijskog sustava, počevši od endogenog metioninskog ostatka 456 do glutamata 766, prema sustavu za numeriranje ostatka u Mohammadi i suradnici: Mol. Cell. Biol., 16, 977-989, (1996.). Uz to, taj konstrukt također ima 3 sljedeće aminokiselinske supstitucije: L457V, C488A i C584S.
Konstrukt LCK za ispitivanje
Tirozinska kinaza LCK eksprimira se u stanicama kukaca kao N-terminalna delecija, počevši od aminokiselinskog ostatka 223 do kraja proteina na ostatku 509, uz sljedeće 2 aminokiselinske supstitucije na N-terminusu: P233M i C224D.
Konstrukt CHK1 za ispitivanje
C-terminalno His-obilježeni ljudski CHK1 pune duljine (FL-CHK1) eksprimira se uz upotrebu sustava bakulovirus/stanica kukca. Sadrži 6 histidinskih ostataka (6 × His-biljeg) na C-terminusu 476 aminokiselina dugog ljudskog CHK1. Protein se pročisti konvencionalnim kromatografskim tehnikama.
Konstrukt CDK2/ciklin A za ispitivanje
CDK2 se pročisti postupcima objavljenim u literaturi (Rosenblatt i suradnici: J. Mol. Biol., 230, 1317-1319, (1993.)) iz stanica kukaca inficiranih bakulovirusnim ekspresijskim vektorom. Ciklin A pročisti se iz stanica E. coli koje eksprimiraju rekombinantni ciklin A pune duljine i skraćeni ciklin Konstrukt se načini ograničenom proteolizom, te pročisti kao što je opisano ranije (Jeffrey i suradnici: Nature, 376, 313-320, (1995.)).
Konstrukt CDK4/ciklin D za ispitivanje
Kompleks ljudskog CDK4 s ciklinom D3, ili kompleks ciklina D1 s fuzijskim proteinom ljudskog CDK4 s glutation-S-transferazom (GST-CDK4), pročisti se uz upotrebu tradicionalnih biokemijskih kromatografskih tehnika iz stanica kukaca suinficiranih odgovarajućim bakulovirusnim ekspresijski vektorima.
Konstrukt FAK za ispitivanje
Katalička domena ljudskog FAK (FAKcd409) eksprimira se uz upotrebu bakulovirusnog vektora kao ekspresijskog sustava. Eksprimirana domena duga 280 aminokiselina sadrži ostatke metionin 409 do glutamata 689. Prisutna je 1 aminokiselinska supstitucija (P410T) u odnosu na identifikacijski broj slijeda L13616, objavljen u G.S. Whithey i suradnici: DNA Cell Biol., 9, 823-30, (1993.). Protein se pročisti uz upotrebu klasičnih kromatografskih tehnika.
Konstrukt TIE-2 (TEK) za ispitivanje
Tirozinska kinazna domena TIE-2 eksprimira se u stanicama kukaca kao N-terminalna delecija, počevši od aminokiselinskog ostatka 774 do kraja proteina na ostatku 1124. Ovaj konstrukt također nosi mutaciju R774M, koja služi kao inicijalni metioninski ostatak u translaciji.
Ispitivanje s VEGF-R2
Spregnuto spektrofotometrijsko ispitivanje (FLVK-P)
Nastajanje ADP iz ATP koje prati prijenos fosforila spregnuto je s oksidacijom NADH uz upotrebu fosfoenolpiruvata (PEP) i sustava s piruvat-kinazom (PK) i laktat-dehidrogenazom (LDH). Oksidaciju NADH prati se pomoću smanjenja apsorbancije na 340 nm (e340 = 6,22 cm–1mM–1), pomoću spektrofotometra Beckman DU 650. Uvjeti ispitivanja za fosforilirani VEGF-R2�50 (naznačen kao FLVK-P u tablicama, niže) su sljedeći: 1 mM PEP; 250 nM NADH; 50 jedinica LDH/ml; 20 jedinica PK/ml; 5 mM DTT; 5,1 mM poli(E4Y1); 1 mM ATP; te 25 mM MgCl2 u 200 mM HEPES-a, pH 7,5. Uvjeti ispitivanja za nefosforilirani VEGF-R2�50 (naznačen kao FLVK u tablicama) su sljedeći: 1 mM PEP; 250 nM NADH; 50 jedinica LDH/ml; 20 jedinica PK/ml; 5 mM DTT; 20 mM poli(E4Y1); 3 mM ATP; te 60 mM MgCl2 i 2 mM MnCl2 u 200 mM HEPES-a, pH 7,5. Ispitivanja su započeta s 5-40 nM enzima. Vrijednosti Ki odredi se mjerenjem enzimske aktivnosti u prisutnosti različitih koncentracija ispitivanih spojeva. Podaci su analizirani uz upotrebu softvera Enzyme Kinetic i Kaleidagraph.
ELISA ispitivanje
Nastajanje fosfogastrina prati se uz upotrebu biotiniliranog peptida gastrina (1-17) kao supstrata. Biotinilirani fosfogastrin imobilizira se uz upotrebu mikrotitarskih ploče s 96 jažica obloženih streptavidinom, uz naknadnu detekciju uz upotrebu protufosfotirozinskog protutijela, konjugirano s peroksidazom iz hrena. Aktivnost peroksidaze iz hrena prati se uz upotrebu diamonijeve soli 2,2'-azino-di[3-etilbenzatiazolinsulfonata (6)] (ABTS). Tipične otopine za ispitivanje sadrže: 2 µM biotinilirani peptid gastrin; 5 mM DTT; 20 nM ATP; 26 mM MgCl2; te 2 mM MnCl2 u 200 mM HEPES-a, pH 7,5. Ispitivanje se započne s 0,8 nM fosforiliranog VEGF-R2�50. Aktivnost peroksidaze iz hrena ispitivana je pomoću ABTS-a, 10 mM. Reakcijsku smjesu za peroksidazu iz hrena ugasi se dodavanjem kiseline (H2SO4), te se očita apsorbancija na 405 nm. Vrijednosti Ki odredi se mjerenjem enzimske aktivnosti u prisutnosti različitih koncentracija ispitivanih spojeva. Podaci su analizirani uz upotrebu softvera Enzyme Kinetic i Kaleidagraph.
Ispitivanje FGF-R
Spektrofotometrijsko ispitivanje provedeno je kao što je opisano gore, za VEGF-R2, uz sljedeće promjene koncentracije: FGF-R = 50 nM, ATP = 2 mM, te poli(E4Y1) = 15 mM.
Ispitivanje LCK
Spektrofotometrijsko ispitivanje provedeno je kao što je opisano gore, za VEGF-R2, uz sljedeće promjene koncentracije: LCK = 60 nM, MgCl2 = 0 mM, poli(E4Y1) = 20 mM.
Ispitivanje CHK1
Nastajanje ADP iz ATP koje prati prijenos fosforila na sintetski supstratni peptid Sintid-2 (PLARTLSVAGLPGKK) spregnuto je s oksidacijom NADH uz upotrebu fosfoenolpiruvata (PEP) djelovanjem piruvat-kinaze (PK) i laktat-dehidrogenaze (LDH). Oksidaciju NADH prati se pomoću smanjenja apsorbancije na 340 nm (�340 = 6,22 cm–1mM–1) uz upotrebu spektrofotometra HP8452. Tipične reakcijske otopine sadrže: 4 mN PEP; 0,15 mM NADH; 28 jedinica LDH/ml; 16 jedinica PK/ml; 3 mM DTT; 0,125 mM Sintid-2; 0,15 mM ATP; 25 mM MgCl2 u 50 mM TRIS-u, pH 7,5; te 400 mM NaCl. Ispitivanja su započeta s 10 nM FL-CHK1. Vrijednosti Ki odredi se mjerenjem početne enzimske aktivnosti u prisutnosti različitih koncentracija ispitivanih spojeva. Podaci su analizirani uz upotrebu softvera Enzyme Kinetic i Kaleidagraph.
Ispitivanja kompleksa CDK2/ciklin A i CDK4/ciklin D
Aktivnost ciklinski ovisne kinaze mjeri se kvantificiranjem enzimski katalizirane, vremenski ovisne ugradnje radioaktivnog fosfata iz [32P]ATP-a u rekombinantni fragment retinoblastom-proteina. Ukoliko se drugačije ne naznači, ispitivanja se provodi na pločama s 96 jažica u ukupnom volumenu od 50 µl, u prisutnosti 10 mM HEPES-a (N-[2-hidroksietil]piperazin-N'-[2-etansulfonska kiselina]) (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 25 µM adenozin-trifosfata (ATP), 1 mg/ml ovalbumina, 5 µg/ml leupeptina, 1 mM ditiotreitola, 10 mM �-glicerofosfata, 0,1 mM natrijevog vanadata, 1 mM natrijevog fluorida, 2,5 mM etilen-glikol-bis((3-aminoetil-eter)-N,N,N'N'-tetraoctene kiseline (EGTA), 2 % (vol./vol.) dimetil-sulfoksida, te 0,03-0,2 µCi [32P]ATP-a. Supstrat (0,3-0,5 µg) je fragment pročišćenog rekombinantnog retinoblastom-proteina (Rb) (ostaci 386-928 nativnog retinoblastom-proteina; 62,3 kDa, koji sadrži glavninu fosforilacijska mjesta nađenih u nativnom 106-kDa proteinu, kao i biljeg od 6 histidinskih ostataka radi lakšeg pročišćavanja). Reakcije su započete s CDK2 (150 nM kompleks CDK2/ciklin A) ili CDK4 (50 nM kompleks CDK4/ciklin D3), inkubirane na 30°C, te prekinute nakon 20 minuta (min.) dodavanjem etilendiamintetraoctene kiseline (EDTA) u 250 mM. Fosforilirani supstrat se zatim uhvati na nitroceluloznu membranu, uz upotrebu s 96 jažica uređaj za višestruku filtraciju, a neugrađenu radioaktivnost se ukloni opetovanim ispiranjem 0,85 % fosfornom kiselinom. Radioaktivnost se kvantificira izlaganjem osušenih nitroceluloznih membrana sustavu Phosphorimager. Očigledne vrijednosti Ki izmjeri ispitivanjem enzimske aktivnosti u prisutnosti različitih koncentracija spoja, uz oduzimanje pozadinske radioaktivnosti izmjerene u odsutnosti enzima. Kinetičke parametre (kcat, Km za ATP) izmjeri se za svaki enzim u uobičajenim uvjetima ispitivanja određivanjem ovisnosti početnih brzina o koncentraciji ATP-a. Podaci su uvršteni u jednadžbu za kompetitivnu inhibiciju, uz upotrebu Kaleidagraph-a (Synergy Software), ili su uvršteni u jednadžbu za kompetitivnu inhibiciju čvrstog vezanja, uz upotrebu softvera KineTic (BioKin, Ltd.). Izmjerene vrijednosti Ki za poznate inhibitore protiv CDK4 i CDK2 slažu se s objavljenim vrijednostima IC50. Specifična aktivnost CDK4 je ista bez obzira radi li se o kompleksu s ciklinom D3 pune duljine ili skraćenim ciklinom D3 kao konstruktom; oba kompleksa također daju vrlo slične vrijednosti Ki za odabrane inhibitore.
FAK Ispitivanje
FAK HTS upotrebljava sustav ispitivanje fluorescencijske polarizacije nabavljen od strane firme LJL Biosystems. Kinazna reakcijska smjesa sadrži: 100 mM Hepes pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM ATP, te 1 mg/ml poli-Glu-Tyr (4:1). Reakciju se započne dodavanjem 5 nM FAKcd409. Reakciju se prekine dodavanjem EDTA, a zatim se doda fluorom obilježeni peptid i protufosfotirozinsko protutijelo, oba nabavljena od strane firme LJL Biosystems. Rezultate inhibicije očite se na detektoru Analyst (LJL).
Spektrofotometrijsko ispitivanje TIE-2
Nastajanje ADP iz ATP katalizirano kinazama, koje prati prijenos fosforila na nasumični kopolimer poli(Glu4Tyr), spregnuto s oksidacijom NADH djelovanjem piruvat-kinaze (PK) i laktat-dehidrogenaze (LDH). Prevođenje NADH u NAD+ prati se pomoću smanjenja apsorbancije na 340 nm (� = 6,22 cm–1mM–1), uz upotrebu spektrofotometra Beckman DU650. Tipične reakcijske otopine sadrže 1 mM fosfoenolpiruvat, 0,24 mM NADH, 40 mM MgCl2, 5 mM DTT, 2,9 mg/ml poli(Glu4Tyr), 0,5 mM ATP, 15 jedinica/ml PK, 15 jedinica/ml LDH u 100 mM HEPES-u, pH 7,5. Ispitivanja su započeta dodavanjem 4-12 nM fosforiliranog Tie-2 (aminokiseline 775-1122). Postotak inhibicije odredi se u triplikatu, uz razinu inhibitora od 1 µM.
Ispitivanje TIE-2DELFIA
Nastajanje fosfotirozina prati se uz upotrebu biotiniliranog p34cdc2 (aa6-20 = KVEKIGEGTYGVVYK) peptida kao supstrata. Biotinilirani peptid imobilizira se na mikrotitarskoj ploči s 96 jažica obloženoj s NeutrAvidin�-om, uz naknadnu detekciju uz upotrebu protufosfotirozinskog protutijela (PY20) konjugiranog s europijevim N1 kelatom. Tipične otopine za ispitivanje sadrže: 1 µM biotinilirani p34cdc2 peptid, 150 µM ATP, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,01 % BSA, 5 % glicerol, 2 % DMSO, 25 mM HEPES pH 7,5. Ispitivanje se započne na NeutrAvidin-skoj ploči s 50 nM unutarstanične domene TIE2. Kinaznu reakciju prekine se s 50 mM EDTA. Ploče se zatim ispere, te doda protutijelo obilježeno europijem. Nakon inkubacije ponovno ih se ispere, te se doda DELFIA� otopina za pojačanje. Ploče se očita uz standardne vremenski razlučene parametre za europij (pobuda 340 nm, emisija 615 nm, kašnjenje 400 µs, prozor 400 (µs)). Postotak inhibicije izračuna se uz referencu na jažice na istoj ploči u koje je dodan DMSO umjesto spoja u DMSO-u, gdje se pozadinu oduzme i od eksperimentalnih podataka i od kontrole, uz referencu na jažicu na istoj ploči u koju se doda EDTA prije dodavanja enzima.
Ispitivanje proliferacije HUVEC
U ovom ispitivanju određuje se sposobnost ispitivanog spoja da inhibira proliferaciju stanica endotela ljudske pupčane vene ("HUVEC") stimuliranu čimbenikom rasta. HUVEC stanice (pasaža 3-4, Clonetics, Corp.) se odmrzne u EGM2 mediju za uzgoj (Clonetics, Corp.) u T75 tikvicama. Nakon 24 sata u tikvice se doda svježi EGM2 medij. 4 ili 5 dana kasnije stanice se izloži još jednom mediju za uzgoj (F12K medij, uz dodatak 10 % fetalnog goveđeg seruma (FBS), 60 µg/ml suplementa za rast endotelnih stanica (ECGS), te 0,1 mg/ml heparina). U daljnjem eksperimentu upotrebljava se HUVEC stanice u eksponencijalnoj fazi rasta. 10.000-12.000 HUVEC stanica nasadi se u posude s 96 jažica u 100 µl obogaćenog medija za uzgoj (kao što je opisano gore). Stanice se ostavi neka se vežu 24 sata u ovom mediju. Medij se zatim ukloni aspiracijom, te se u svaku jažicu doda po 105 µl medija za izgladnjivanje (F12K + 1 % FBS). Nakon 24 sata se u svaku jažicu za tretman doda po 15 µl ispitivanog sredstva otopljenog u 1 % DMSO u mediju za izgladnjivanje ili ovaj vehikulum sam; konačna koncentracija DMSO-a je 0,1 %. 1 sat kasnije u sve jažice doda se po 30 µl VEGF-a (30 ng/ml) u mediju za izgladnjivanje, osim u one koje sadrže netretirane kontrole; konačna koncentracija VEGF-a je 6 ng/ml. Staničnu proliferaciju kvantificira se nakon 72 sata redukcijom bojila MTT, kada se stanice izloži MTT-u (Promega Corp.) u trajanju od 4 sata. Redukciju bojila zaustavi se dodavanjem otopine za zaustavljanje (Promega Corp.), a apsorbanciju na � = 595 odredi se na čitaču spektrofotometarskih ploča s 96 jažica.
Vrijednosti IC50 izračuna se generiranjem krivulja za A595 kao odgovor na različite koncentracije ispitivanog sredstva; u pravilu, upotrebljava se 7 koncentracija razdvojenih za 0,5 log, uz triplikatne jažice za svaku koncentraciju. Na bibliotečnim pločama za pregled spojeva upotrebljava se 1 ili 2 koncentracije (1 jažica po koncentraciji), a % inhibicija izračuna se sljedećom formulom:
% inhibicije = (kontrola - test) ÷ (kontrola – izgladnjivanje),
gdje
kontrola = A595 u prisutnosti VEGF-a bez ispitivanog sredstva
ispitivanje = A595 u prisutnosti VEGF-a uz ispitivano sredstvo
izgladnjivanje = A595 kada su odsutni i VEGF i ispitivano sredstvo.
Ispitivanje mišjeg PK
Farmakokinetiku (npr. apsorpcija i eliminacija) lijekova kod miševa analizira se u sljedećem eksperimentu. Ispitivane spojeve formulira se kao otopinu ili suspenziju u 30:70 vehikulumu (PEG 400:zakiseljena H2O) ili kao suspenziju u 0,5 % CMC-u. To se primjenjuje oralno (p.o.) i intraperitonalno (i.p.) u varijabilnim dozama kod dvije različite skupine (n = 4) ženki miševa B6. Uzorke krvi prikupi se orbitalnim krvarenjem u sljedećim vremenskim točkama: 0 sati (prije doziranja), 0,5 sati, 1,0 sati, 2,0 sati, 4,0 sati, te 7,0 sati nakon doziranja. Iz svakog uzorka plazmu se dobije centrifugiranjem na 2500 okretaja u minuti, u trajanju od 5 minuta. Ispitivani spoj ekstrahira se iz plazme postupkom organskog taloženja proteina. Svaki put iskrvari se 50 µl plazme, te pomiješa s 1,0 ml acetonitrila, vorticira 2 minute, te centrifugira na 4000 okretaja u minuti, u trajanju od 15 minuta, kako bi se istaložilo protein, te izekstrahira ispitivani spoj. Zatim se acetonitrilni supernatant (ekstrakt koji sadrži ispitivani spoj) izlije u nove epruvete za ispitivanje, te otpari na vruæoj ploči (25°C) u struji plinovitog N2. U svaku epruvetu koja sadrži osušeni ekstrakt ispitivanog spoja doda se 125 µl pokretne faze (60:40, 0,025 M NH4H2PO4 +2,5 ml/l TEA:acetonitril). Ispitivani spoj resuspendira se u pokretnoj fazi vorticiranjem, zatim se centrifugiranjem na 4000 okretaja u minuti, u trajanju od 5 minuta, ukloni još proteina. Svaki uzorak izlije se u bočicu za HPLC radi analize ispitivanog spoja na Hewlett Packard 1100 seriji HPLC s UV detekcijom. Od svakog uzorka injicira se po 95 µl na Phenomenex-Prodigy C-18, 150 × 3,2 mm stupac s reverznom fazom, te eluira gradijentom acetonitrila od 45-50 %, u trajanju od 10 minuta. Koncentracije ispitivanog spoja u plazmi (µg/ml) odredi se usporedbom sa standardnom krivuljom (površina pika ovisno o konc. µg/ml), uz upotrebu poznatih koncentracija ispitivanog spoja ekstrahiranog iz uzoraka plazme na način kao što je opisano gore. Uz standarde i nepoznanice upotrebljava se tri skupine (n = 4) za kontrolu kvalitete (0,25 µg/ml, 15 µg/ml i 7,5 µg/ml) kako bi se osiguralo konzistentnost analize. Standardna krivulja ima R2 > 0,99, a kontrole kvalitete su sve unutar 10 % od odgovarajućih očekivanih vrijednosti. Kvantificirani ispitivani uzorci grafički su prikazani radi vizualizacije uz upotrebu softvera Kaleidagraph, a odgovarajuće farmakokinetičke parametre odredi se uz upotrebu softvera WIN NONLIN. Primjer 1(a) daje sljedeće rezultate: 0,69 (miš: pK, AUC, i.p., µg-h/ml); 0,33 (miš: pK, AUC, p.o., µg-h/ml).
Ispitivanje KDR (VEGFR2) fosforilacije u PAE-KDR stanicama
U ovom ispitivanju određuje se sposobnost ispitivanog spoja da inhibira autofosforilaciju KDR u (PAE)-KDR stanicama endotela svinjske aorte. U ovom ispitivanju upotrebljava se PAE stanice koje hipereksprimiraju ljudski KDR. Te stanice se uzgaja u Hamovom mediju F12, uz dodatak 10 % fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 400 µg/ml G418. 30.000 stanica nasadi se u svaku jažicu na ploči s 96 jažica u 75 µl medija za uzgoj, te ostavi 6 sati na 37°C da se vežu na podlogu. Stanice se zatim16 sati izloži mediju za izgladnjivanje (Hamov medij F12, uz dodatak 0,1 % FBS-a). Nakon što je period izgladnjivanja gotov, u jažice za ispitivanje doda se po 10 µl ispitivanog sredstva u 5 % DMSO-u u mediju za izgladnjivanje, a u kontrolne jažice se doda po 10 µl vehikuluma (5 % DMSO u mediju izgladnjivanje). Konačna koncentracija DMSO-a u svakoj jažici je 0,5 %. Ploče se inkubira 1 sat na 37 °C, a stanice se zatim 8 minuta stimulira s 500 ng/ml VEGF (dostupan na tržištu od strane firme R & D System) u prisutnosti 2 mM Na3VO4. Te stanice 1 × se ispere s 1 mm Na3VO4 u HBSS-u, te lizira dodavanjem 50 µl pufera za liziranje po jažici. Zatim se doda 100 µl pufera za razrjeđivanje po jažici, te se razrijeđeni stanični lizat prebaci na ploču s 96 jažica, obloženu kozjim protukunićjim protutijelom (dostupno na tržištu od strane firme Pierce), prethodno obloženu kunićjim protuljudskim anti-flk-1 C-20 protutijelom (dostupno na tržištu od strane firme Santa Cruz). Ploče se inkubira 2 sata na sobnoj temperaturi, te ispere 7 × s 1 % Tween 20 u PBS-u. HRP-PY20 (dostupan na tržištu od strane firme Santa Cruz) razrijedi se, te doda na ploču za 30-minutnu inkubaciju. Ploče se zatim ponovno ispere, te se doda TMB kao supstrat za peroksidazu (dostupan na tržištu od strane firme Kirkegaard & Perry) za 10-minutnu inkubaciju. U svaku jažicu na pločama s 96 jažica doda se po 100 µl 0,09 N H2SO4 kako bi se zaustavilo reakciju. Fosforilacijski status procijeni se spektrofotometarskim očitanjem na 450 nm. Vrijednosti IC50 izračuna se generiranjem krivulja, u analizi s 4 parametra.
Ispitivanje PAE-PDGFR� fosforilacije u PAE-PDGFR� stanicama
U ovom ispitivanju određuje se sposobnost ispitivanog spoja da inhibira autofosforilaciju PDGFR� u (PAE)-PDGFR� stanicama endotela svinjske aorte. U ovom ispitivanju upotrebljava se PAE stanice koje hipereksprimiraju ljudski PDGFR�. Te stanice se uzgaja u Hamovom mediju F12, uz dodatak 10 % fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 400 µg/ml G418. 20.000 stanica nasadi se u svaku jažicu na ploči s 96 jažica u 50 µl medija za uzgoj, te ostavi 6 sati na 37 °C da se vežu na podlogu. Stanice se zatim 16 sati izloži mediju za izgladnjivanje (Hamov medij F12, uz dodatak 0,1 % FBS-a). Nakon što je period izgladnjivanja gotov, u jažice za ispitivanje doda se po 10 µl ispitivanog sredstva u 5 % DMSO-u u mediju za izgladnjivanje, a u kontrolne jažice se doda po 10 µl vehikuluma (5 % DMSO u mediju izgladnjivanje). Konačna koncentracija DMSO-a u svakoj jažici je 0,5 %. Ploče se inkubira 1 sat na 37°C, a stanice se zatim 8 minuta stimulira s 1µg/ml PDGF-BB (R & D System) u prisutnosti 2 mM Na3VO4. Te stanice 1 × se ispere s 1 mm Na3VO4 u HBSS-u, te lizira dodavanjem 50 µl pufera za liziranje po jažici. Zatim se doda 100 µl pufera za razrjeđivanje po jažici, te se razrijeđeni stanični lizat prebaci na ploču s 96 jažica, obloženu kozjim protukunićjim protutijelom (Pierce), prethodno obloženu kunićjim protutijelom protiv ljudskog PDGFR� (Santa Cruz). Ploče se inkubira 2 sata na sobnoj temperaturi, te ispere 7 × s 1 % Tween 20 u PBS-u. HRP-PY20 (Santa Cruz) se razrijedi, te doda na ploču za 30-minutnu inkubaciju. Ploče se zatim ponovno ispere, te se doda TMB kao supstrat za peroksidazu (Kirkegaard & Perry) za 10-minutnu inkubaciju. U svaku jažicu na ploči s 96 jažica doda se po 100 µl 0,09 N H2SO4 kako bi se zaustavilo reakciju. Fosforilacijski status procijeni se spektrofotometarskim očitanjem na 450 nm. Vrijednosti IC50 izračuna se generiranjem krivulja, u analizi s 4 parametra.
Ispitivanje na mikrosomima ljudske jetre (HLM)
Metabolizam spojeva u mikrosomima ljudske jetre izmjeri se sljedećim LC-MS postupcima analitičkog ispitivanja. Najprije se mikrosome ljudske jetre (HLM) odmrzne, te razrijedi do 5 mg/ml hladnim 100 mM kalij-fosfatnim (KPO4) puferom. Odgovarajuće količine KPO4 pufera, otopine za regeneriranje NADPH (koja sadrži B-NADP, glukoza-6-fosfat, glukoza-6-fosfat-dehidrogenazu i MgCl2), te HLM predinkubira se 10 minuta u 13 × 100 mm staklenih epruveta na 37 °C. (3 epruvete po ispitivanom spoju; triplikat). U svaku epruvetu se doda ispitivani spoj (konačna koncentracija 5 µM) kako bi se započelo reakciju, te pomiješa blagim vorticiranjem, te inkubira na 37 °C. U vrijeme t = 0, 2 sata, iz svake inkubacijske epruvete uzme se po 250 µl uzorka u 12 odvojenih 75 mm staklenih epruveta, koje sadrže po 1 ml ledeno hladnog acetonitrila s 0,05 nM rezerpinom. Uzorke se centrifugira na 4000 okretaja u minuti, u trajanju od 20 minuta, kako bi se istaložilo proteine i soli (Beckman Allegra 6KR, S/N ALK98D06, #634). Supernatant se prebaci u 12 novih 75 mm staklenih epruveta, te otpari u centrifugalnom vakuumskom otparivaču Speed-Vac. Uzorke se rekonstituira u 200 µl smjese 0,1 % mravlja kiselina/acetonitril (90/10), te snažno vorticira kako bi ih se otopilo. Uzorke se zatim prebaci u odvojene polipropilenske epruvete za mikrocentrifugu, te 10 minuta centrifugira na 14.000 × g. (Fisher Micro 14, S/N M0017580). Za svaki replikat (#1-3) za svaku vremensku točku (0 i 2 sata) pomiješa se alikvotne uzorke svakog ispitivanog spoja u istu bočicu za HPLC (ukupno 6 uzoraka), radi LC-MS analize, kao što je opisano niže.
Pomiješani uzorci spojeva injicirani su u LC-MS sustav, kojeg čine HPLC Hewlett-Packard HP1100 s diodnim čipom i trostruko-četverostruki spektrometar masa Micromis Quattro II, koji radi u pozitivni elektrosprej SIR modu (programiran za Specifično skeniranje molekulskih iona svakog ispitivanog spoja). Pik za svaki ispitivani spoj integrira se za svaku vremensku točku. Za svaki spoj, izračuna se prosječna površina pika za svaku vremensku točku (n = 3), a ovu srednju vrijednost površine pika za 2 sata podijeli se s prosječnom površinom pika na za vrijeme 0. sata kako bi se dobilo % ispitivanog spoja preostalog nakon 2 sata.
Rezultati ispitivanja spojeva u različitim ispitivanjima sažeto su prikazani u Tablici, niže, gdje oznaka "% kod" ukazuje na % inhibicije za navedenu koncentraciju, vrijednosti "*" predstavljaju Ki (nM) odnosno % inhibicije uz koncentraciju spoja od 1 µM za *, odnosno 50 nM za **, ukoliko se drugačije ne naznači. "NI" ukazuje da nema značajne inhibicije, odnosno "nije ispitano".
Tablica 1
[image]
In vivo ispitivanje razvoja krvnih žila mrežnice kod novorođenih štakora
Krvne žile mrežnice kod štakora razvijaju se od 1. dana poslije poroda do 14. dana poslije poroda (P1-P14). Ovaj proces ovisi o aktivnosti VEGF (J. Stone i suradnici: J. Neurosci., 15, 4738, (1995.)). U ranijem rada opaženo je da VEGF također djeluje kao čimbenik preživljenja krvnih žila mrežnice u ranom razvoju krvnih žila (Alon i suradnici: Nat. Med., 1, 1024, (1995.)). Kako bi se procijenilo sposobnost specifičnih spojeva da inhibiraju aktivnost VEGF in vivo, spojevi su formulirani u odgovarajući vehikulum, obično 50 % polietilen-glikol, prosječne molekulske težine 400 Da, i 50 % otopina 300 mM saharoze u deioniziranoj vodi. U pravilu, dvije mikrolitre (2 µl) otopine lijeka injicira se u središnju staklovinu oka mladunčadi štakora, 8. ili 9. dana poslije poroda. 6 dana nakon intravitrealne injekcije životinje se žrtvuje, a mrežnice izreže iz preostalog očnog tkiva. Izolirane mrežnice se zatim podvrgne protokolu histokemijskog bojanja, čime se Specifično oboje stanice endotela (Lutty i McLeod: Arch. Ophthalmol., 110, 267, (1992.)), čime se otkriva razinu vaskularizacije unutar uzorku tkiva. Pojedine mrežnice se zatim izravna i pričvrsti na staklene predmetnice, te ispita kako bi se odredilo razinu vaskularizacije. Djelotvorni spojevi inhibiraju daljnji razvoj vaskulature mrežnice, te dovode do povlačenja svih krvnih žila u mrežnici, osim najvećih. Za procjenjivanje relativne potentnosti spojeva nakon primjene in vivo upotrebljava se opseg povlačenja krvnih žila. Povlačenje krvnih žila ocjenjuje se na subjektivnoj ljestvici s 1-3 plusa, gdje 1 plus znači opazivo povlačenje, za koje se procjenjuje da je približno 25 % ili manje, procjenjuje se da je 2 plusa povlačenje od približno 25-75 %, a tri plusa se daje za mrežnice s gotovo potpunim povlačenjem (približno 75 % ili veće).
Za kvantitativniju analizu povlačenja digitalnim fotoaparatom učvršćenim na disekcijski mikroskop su snimljene slike ADPazno obojenih fiksiranih mrežnica. Slike mrežnica su zatim prebačene u softver za analizu slika (Image Pro Plus 4,0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Ovaj softver upotrebljava se za određivanje postotka površine mrežnice s obojenim krvnim žilama. Ova vrijednost za eksperimentalno oko uspoređena je s onom izmjerenom za kontralateralno oko iste životinje, u koje je injiciran vehikulum. Smanjenje površine s krvnim žilama opaženo u oku koje je primilo spoj, u usporedbi s okom u koje je injiciran vehikulum se zatim zabilježi kao "% povlačenja" za taj uzorak. Izračunata je prosječna vrijednost postotaka povlačenja za skupine 5-8 životinja.
Kod uzoraka kod kojih opažanje kroz mikroskop ukazuje na gotovo potpuno povlačenje rutinski je izmjeren vrijednost % povlačenja od 65-70 %. To je zbog naslaga boje u naborima mrežnice, uzrokovanim vehikulumom upotrijebljenim za injiciranje lijeka. Softver za analizu slika interpretira ove nabore s bojom kao krvne žile. Ove nabore nije se pokušalo ispraviti, jer se razlikuju od oka do oka. Prema tome, treba primijetiti da su zabilježene vrijednosti % povlačenja rezultat konzervativnog mjerenja, koje precizno rangira spojeve, no potcjenjuje njihovu apsolutnu potentnost.
In vivo ispitivanje razvoja krvnih žila mrežnice kod novorođenih štakora kao modela retinopatije u mlađoj dobi
Za procjenu aktivnosti ovog niza spojeva upotrijebljen je drugi model VEGF-ovisne neovaskularizacije mrežnice. U ovom modelu (Penn i suradnici: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 2063, (1995.)), mladunčad štakora (n = 16) i njihovu majku stavi se u kompkuterski kontroliranu komora u kojoj se regulira koncentracija kisika. Životinje se 24 sata izlaže koncentraciji od 50 % kisika, te 24 sata koncentraciji od 10 % kisika. Ovaj alternirajući ciklus hiperoksije i hipoksije ponavlja se 7 ×, nakon čega se životinje izvadi na sobni zrak (P14). Spojeve se primijeni intravitrealnom injekcijom prilikom vađenja na sobni zrak, a životinje se žrtvuje 6 dana kasnije (P20). Zatim se izolirane mrežnice izdvoji, oboji i fiksira, te analizira kao što je detaljno opisano gore, u razvojnom modelu. Djelotvornost se također ocjenjuje kao što je opisano za razvojni model.
Primjere spojeva opisanih gore može se formulirati u farmaceutske pripravke dane sljedećim općim primjerima.
Primjer 1
Parenteralni pripravak
Kako bi se načinilo parenteralni farmaceutski pripravak pogodan za primjenu injekcijom, 100 mg soli spoja Formule I topive u vodi otopi se u DMSO-u, te pomiješa s 10 ml 0,9 % sterilne fiziološke otopine. Smjesu se uvrsti u oblik jedinice doziranja pogodan za primjenu injekcijom.
Primjer 2
Oralni pripravak
Kako bi se načinilo farmaceutski pripravak za oralni unos, 100 mg spoja Formule I pomiješa se s 750 mg laktoze. Smjesu se uvrsti u oralnu jedinicu doziranja, poput tvrde želatinske kapsule, pogodnu za oralnu primjenu.
Primjer 3
Intraokularni pripravak
Kako bi se načinilo farmaceutski pripravak s produljenim otpuštanjem za intraokularni unos, spoj Formule I se suspendira u neutralnoj, izotoničnoj otopini hijaluronske kiseline (1,5 % konc.) u fosfatnom puferu (pH 7,4) kako bi se dobilo 1 % suspenziju.
Treba imati uvidu da prethodni opis daje primjere i pojašnjenja, te treba ilustrirati ovaj izum i njegove poželjne izvedbe. U rutinskim eksperimentima stručnjak u ovom području tehnike može prepoznati očigledne modifikacije i varijacije koje su moguće bez udaljavanja od duha ovog izuma. Prema tome, ovaj izum ne bi trebao definirati prethodni opis, nego sljedeći patentni zahtjevi i njihovi ekvivalenti.

Claims (15)

1. Spoj, farmaceutski prihvatljivi predlijek, farmaceutski aktivni metabolit ili farmaceutski prihvatljiva sol, naznačen time što ga se bira iz skupine koju čine: [image] [image] [image] [image]
2. Spoj, naznačen time što je prikazan formulom [image] ili njegov farmaceutski prihvatljivi predlijek, farmaceutski aktivni metabolit ili farmaceutski prihvatljiva sol.
3. Postupak upotrebe terapijski djelotvorne količine spoja, farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli kao što je definirano u patentnom zahtjevu 1 ili 2, naznačen time što je namijenjen liječenju makularne degeneracije povezane sa starenjem kod sisavaca.
4. Postupak upotrebe terapijski djelotvorne količine spoja, farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli kao što je definirano u patentnom zahtjevu 1 ili 2, naznačen time što je namijenjen liječenju neovaskularizacije mrežnice kod sisavaca.
5. Postupak upotrebe terapijski djelotvorne količine spoja, farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli kao što je definirano u patentnom zahtjevu 1 ili 2, naznačen time što je namijenjen liječenju retinopatije kod sisavaca.
6. Postupak prema patentnom zahtjevu 5, naznačen time što retinopatija je dijabetična retinopatija, vitreoretinopatija ili retinopatija u mlađoj dobi.
7. Postupak upotrebe terapijski djelotvorne količine spoja, farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli kao što je definirano u patentnom zahtjevu 1 ili 2, naznačen time što je namijenjen liječenju retinitisa kod sisavaca.
8. Postupak prema patentnom zahtjevu 7, naznačen time što retinitis je citomegalovirusni retinitis.
9. Postupak upotrebe terapijski djelotvorne količine spoja, farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli kao što je definirano u patentnom zahtjevu 1 ili 2, naznačen time što je namijenjen liječenju makularni edem kod sisavaca.
10. Postupak upotrebe terapijski djelotvorne količine spoja, farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli kao što je definirano u patentnom zahtjevu 1 ili 2, naznačen time što je namijenjen liječenju očne bolesti kod sisavaca.
11. Farmaceutski pripravak, naznačen time što sadrži: (a) terapijski djelotvornu količinu spoja, farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli prema patentnom zahtjevu 1 ili 2; i (b) odgovarajuću farmaceutski prihvatljivu podlogu, razrjeđivač ili vehikulum.
12. Postupak upotrebe terapijski djelotvorne količine spoja, farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli kao što je definirano u patentnom zahtjevu 1 ili 2, naznačen time što je namijenjen liječenju bolesnog stanja kod sisavca posredovanog aktivnošću proteinske kinaze.
13. Postupak prema patentnom zahtjevu 12, naznačen time što bolesno stanje kod sisavca je povezano s tumorskim rastom, staničnom proliferacijom ili angiogenezom.
14. Postupak moduliranja aktivnosti receptora/proteinske kinaze, naznačen time što se sastoji u stupanju u dodir receptora/kinaze s djelotvornom količinom spoja, farmaceutski prihvatljivog predlijeka, farmaceutski aktivnog metabolita ili farmaceutski prihvatljive soli kao što je definirano u patentnom zahtjevu 1 ili 2.
15. Postupak prema patentnom zahtjevu 14, naznačen time što receptor/proteinska kinaza je receptor VEGF.
HR20050559A 2002-12-19 2005-06-16 2-(1h-indazole-6-ylamino)-benzamide compounds as protein kinases inhibitors useful for the treatment of ophthalmic diseases HRP20050559A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43490202P 2002-12-19 2002-12-19
PCT/IB2003/005854 WO2004056806A1 (en) 2002-12-19 2003-12-08 2-(1h-indazol-6-ylamino)-benzamide compounds as protein kinases inhibitors useful for the treatment of ophtalmic diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20050559A2 true HRP20050559A2 (en) 2006-02-28

Family

ID=32682122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20050559A HRP20050559A2 (en) 2002-12-19 2005-06-16 2-(1h-indazole-6-ylamino)-benzamide compounds as protein kinases inhibitors useful for the treatment of ophthalmic diseases

Country Status (37)

Country Link
US (2) US7053107B2 (hr)
EP (1) EP1585743B1 (hr)
JP (1) JP3814285B2 (hr)
KR (1) KR100730267B1 (hr)
CN (1) CN1747950A (hr)
AP (1) AP2005003341A0 (hr)
AR (1) AR042510A1 (hr)
AT (1) ATE362928T1 (hr)
AU (1) AU2003286321A1 (hr)
BR (1) BR0317548A (hr)
CA (1) CA2510850A1 (hr)
CO (1) CO5580767A2 (hr)
CR (1) CR7882A (hr)
DE (1) DE60314013T2 (hr)
DK (1) DK1585743T3 (hr)
EA (1) EA008501B1 (hr)
EC (1) ECSP055858A (hr)
GT (1) GT200300294A (hr)
HR (1) HRP20050559A2 (hr)
IS (1) IS7859A (hr)
MA (1) MA27570A1 (hr)
MX (1) MXPA05006676A (hr)
NL (1) NL1025073C2 (hr)
NO (1) NO20053486L (hr)
NZ (1) NZ540340A (hr)
OA (1) OA12977A (hr)
PA (1) PA8592901A1 (hr)
PE (1) PE20041006A1 (hr)
PL (1) PL377713A1 (hr)
PT (1) PT1585743E (hr)
RS (1) RS20050430A (hr)
SI (1) SI1585743T1 (hr)
TN (1) TNSN05164A1 (hr)
TW (1) TW200424193A (hr)
UY (1) UY28130A1 (hr)
WO (1) WO2004056806A1 (hr)
ZA (1) ZA200504339B (hr)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA89035C2 (ru) 2003-12-03 2009-12-25 Лео Фарма А/С Эфиры гидроксамовых кислот и их фармацевтическое применение
WO2005094823A1 (ja) * 2004-03-30 2005-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｆｌｔ－３阻害剤
US20060182783A1 (en) * 2004-04-30 2006-08-17 Allergan, Inc. Sustained release intraocular drug delivery systems
WO2006043172A1 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Pfizer Inc. Pharmaceutical compositions and methods for sub-tenon delivery
AU2005300311A1 (en) * 2004-11-02 2006-05-11 Pfizer Inc. Methods for preparing indazole compounds
US20060160863A1 (en) * 2005-01-05 2006-07-20 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Polymorphic and amorphous forms of 2-{3-[(E)-2-(4,6-dimethyl-pyridin-2-yl)-vinyl]-1H-indazol-6-ylamino}-N-(4-hydroxy-but-2-ynyl)benzamide
WO2006117666A2 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 Pfizer Inc. Dosage forms, pharmaceutical compositions and methods for sub-tenon delivery
US8340944B2 (en) 2005-11-30 2012-12-25 The Invention Science Fund I, Llc Computational and/or control systems and methods related to nutraceutical agent selection and dosing
US10296720B2 (en) 2005-11-30 2019-05-21 Gearbox Llc Computational systems and methods related to nutraceuticals
US8000981B2 (en) 2005-11-30 2011-08-16 The Invention Science Fund I, Llc Methods and systems related to receiving nutraceutical associated information
US8297028B2 (en) 2006-06-14 2012-10-30 The Invention Science Fund I, Llc Individualized pharmaceutical selection and packaging
US20080103746A1 (en) * 2005-11-30 2008-05-01 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Systems and methods for pathogen detection and response
US7974856B2 (en) 2005-11-30 2011-07-05 The Invention Science Fund I, Llc Computational systems and methods related to nutraceuticals
US7827042B2 (en) 2005-11-30 2010-11-02 The Invention Science Fund I, Inc Methods and systems related to transmission of nutraceutical associated information
US7927787B2 (en) 2006-06-28 2011-04-19 The Invention Science Fund I, Llc Methods and systems for analysis of nutraceutical associated components
MX2008010193A (es) * 2006-02-10 2008-11-27 Summit Corp Plc Tratamiento de distrofia muscular de duchenne.
WO2008020606A1 (fr) * 2006-08-16 2008-02-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Agent anti-angiogénique
WO2008128538A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-30 Leo Pharma A/S Src family kinase inhibitors
JP5371953B2 (ja) 2007-04-20 2013-12-18 アキュセラ インコーポレイテッド 眼の疾患及び障害を治療するスチレニル誘導体化合物
US20090081277A1 (en) * 2007-09-21 2009-03-26 Allergan, Inc. Pharmaceutical formulations and methods for treating ocular conditions
KR20110045095A (ko) 2008-08-27 2011-05-03 레오 파마 에이/에스 Ｖｅｇｆｒ-2 수용체 및 단백질 티로신 키나아제 억제제인 피리딘 유도체
CN103804349A (zh) * 2012-11-01 2014-05-21 杨子娇 一类治疗青光眼的化合物及其用途
JO3425B1 (ar) 2013-07-15 2019-10-20 Novartis Ag مشتقات البابيريدينيل-اندول واستخدامها كعامل متمم لمثبطات b
EP3127900B1 (en) * 2014-03-31 2017-10-18 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Alkynyl indazole derivative and use thereof
CN104744338A (zh) * 2015-03-31 2015-07-01 天津维智精细化工有限公司 一种6-氯羟吲哚的合成方法
US10519133B2 (en) * 2015-08-07 2019-12-31 Medshine Discovery Inc. Vinyl compounds as FGFR and VEGFR inhibitors
CN109942544B (zh) * 2017-12-21 2021-06-11 中国科学院合肥物质科学研究院 一类新型吲唑类衍生物激酶抑制剂
WO2024032584A1 (zh) * 2022-08-08 2024-02-15 苏州必扬医药科技有限公司 一种蛋白酪氨酸激酶抑制剂及其医疗用途

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5178635A (en) 1992-05-04 1993-01-12 Allergan, Inc. Method for determining amount of medication in an implantable device
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
US5443505A (en) 1993-11-15 1995-08-22 Oculex Pharmaceuticals, Inc. Biocompatible ocular implants
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
CN1165482A (zh) 1994-11-10 1997-11-19 科西雷佩蒂斯公司 用作蛋白激酶抑制剂的吡唑药物组合物
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
DE69519751T2 (de) 1995-04-20 2001-04-19 Pfizer Arylsulfonamido-substituierte hydroxamsäure derivate als inhibitoren von mmp und tnf
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5773019A (en) 1995-09-27 1998-06-30 The University Of Kentucky Research Foundation Implantable controlled release device to deliver drugs directly to an internal portion of the body
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ATE225343T1 (de) 1995-12-20 2002-10-15 Hoffmann La Roche Matrix-metalloprotease inhibitoren
KR100489174B1 (ko) 1996-03-05 2005-09-30 제네카-파마 소시에떼아노님 4-아닐리노퀴나졸린유도체
DE69734149T2 (de) 1996-03-15 2006-07-06 Astrazeneca Ab Cinoline derivate und verwendung als heilmittel
EP0907649A1 (en) 1996-06-27 1999-04-14 Pfizer Inc. Derivatives of 2-(2-oxo-ethylidene)-imidazolidin-4-one and their use as farnesyl protein transferase inhibitors
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
AU3766897A (en) 1996-07-13 1998-02-09 Glaxo Group Limited Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
BR9710362A (pt) 1996-07-13 1999-08-17 Glaxo Group Ltd Composto formula-ao farmaceutica utiliza-ao de um composto processos de tratamento de um ser humano ou animal sofrendo de uma mediada por atividade anormal de cinase de proteina tirosina e para a prepara-ao de um composto
WO1998003516A1 (en) 1996-07-18 1998-01-29 Pfizer Inc. Phosphinate based inhibitors of matrix metalloproteases
SK21499A3 (en) 1996-08-23 2000-05-16 Pfizer Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
PT950059E (pt) 1997-01-06 2004-10-29 Pfizer Derivados de sulfona ciclicos
EP0977733B1 (en) 1997-02-03 2003-09-03 Pfizer Products Inc. Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
CA2279863A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
CN1247531A (zh) 1997-02-11 2000-03-15 辉瑞大药厂 芳基磺酰基异羟肟酸衍生物
ATE292623T1 (de) 1997-05-07 2005-04-15 Sugen Inc 2-indolinonderivate als modulatoren der proteinkinase-ativität
CA2291709A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
US6658447B2 (en) * 1997-07-08 2003-12-02 Intel Corporation Priority based simultaneous multi-threading
ID23668A (id) 1997-08-08 2000-05-11 Pfizer Prod Inc Turunan asam ariloksiarilsulfonilamino hidroksamat
DE69838172T2 (de) 1997-08-22 2008-04-10 Astrazeneca Ab Oxindolylchinazolinderivate als angiogenesehemmer
EP1017682A4 (en) 1997-09-26 2000-11-08 Merck & Co Inc NEW ANGIOGENESIS INHIBITORS
KR100446363B1 (ko) 1997-11-11 2004-09-01 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 항암제로 유용한 티에노피리미딘 및 티에노피리딘 유도체
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JPH11236333A (ja) 1997-12-30 1999-08-31 Pfizer Prod Inc 抗ガン剤として有用なイミダゾリン−４−オン誘導体
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
EP1082305A4 (en) 1998-05-29 2001-09-26 Sugen Inc PYRROL SUBSTITUTED 2-INDOLINONE EFFECTIVE AS A PROTEIN KINASE INHIBITOR
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
CA2341690C (en) 1998-08-27 2007-04-17 Pfizer Products Inc. Alkynyl-substituted quinolin-2-one derivatives useful as anticancer agents
ES2237125T3 (es) 1998-08-27 2005-07-16 Pfizer Products Inc. Derivados de quinolin-2-ona utiles como agentes anticancerigenos.
US6114361A (en) 1998-11-05 2000-09-05 Pfizer Inc. 5-oxo-pyrrolidine-2-carboxylic acid hydroxamide derivatives
EP1006113A1 (en) 1998-12-02 2000-06-07 Pfizer Products Inc. Derivatives of 2-(2-oxo-ethylidene)-imidazolidin-4-one and their use to inhibit abnormal cell growth
JP2002533416A (ja) 1998-12-23 2002-10-08 ジー．ディー．サール ＆ カンパニー 新形成の治療における組み合わせ治療としてのシクロオキシゲナーゼ−２インヒビターおよび一つまたはそれ以上の抗腫瘍薬の使用方法
US6649645B1 (en) 1998-12-23 2003-11-18 Pharmacia Corporation Combination therapy of radiation and a COX-2 inhibitor for treatment of neoplasia
US6682736B1 (en) 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
UA71945C2 (en) 1999-01-27 2005-01-17 Pfizer Prod Inc Substituted bicyclic derivatives being used as anticancer agents
JP3270834B2 (ja) 1999-01-27 2002-04-02 ファイザー・プロダクツ・インク 抗がん剤として有用なヘテロ芳香族二環式誘導体
CZ20012910A3 (cs) 1999-02-11 2002-02-13 Pfizer Products Inc. Heteroarylem-substituované chinolin-2-onové deriváty pouľitelné jako protinádorové prostředky
US6586447B1 (en) 1999-04-01 2003-07-01 Pfizer Inc 3,3-disubstituted-oxindole derivatives useful as anticancer agents
US6511993B1 (en) 1999-06-03 2003-01-28 Kevin Neil Dack Metalloprotease inhibitors
PE20010306A1 (es) * 1999-07-02 2001-03-29 Agouron Pharma Compuestos de indazol y composiciones farmaceuticas que los contienen utiles para la inhibicion de proteina kinasa
TWI262914B (en) 1999-07-02 2006-10-01 Agouron Pharma Compounds and pharmaceutical compositions for inhibiting protein kinases
EP1081137A1 (en) 1999-08-12 2001-03-07 Pfizer Products Inc. Selective inhibitors of aggrecanase in osteoarthritis treatment
JP2001121829A (ja) * 1999-10-26 2001-05-08 Sony Chem Corp 情報記録用シート
ES2212971T3 (es) 1999-11-30 2004-08-16 Pfizer Products Inc. Derivados de quinolina utiles para la inhibicion de la farnesil protein transferasa.
UA75055C2 (uk) 1999-11-30 2006-03-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні бензоімідазолу, що використовуються як антипроліферативний засіб, фармацевтична композиція на їх основі
YU54202A (sh) * 2000-01-18 2006-01-16 Agouron Pharmaceuticals Inc. Jedinjenja indazola, farmaceutske smeše i postupci za stimulisanje i inhibiranje ćelijske proliferacije
HN2000000266A (es) 2000-01-21 2001-05-21 Pfizer Prod Inc Compuesto anticanceroso y metodo de separacion de enantiomeros util para sintetizar dicho compuesto.
US6844357B2 (en) 2000-05-01 2005-01-18 Pfizer Inc. Substituted quinolin-2-one derivatives useful as antiproliferative agents
AR038957A1 (es) 2001-08-15 2005-02-02 Pharmacia Corp Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200504339B (en) 2006-07-26
PL377713A1 (pl) 2006-02-06
PT1585743E (pt) 2007-07-12
NO20053486L (no) 2005-07-18
PE20041006A1 (es) 2004-12-24
MXPA05006676A (es) 2005-08-16
AR042510A1 (es) 2005-06-22
OA12977A (en) 2006-10-13
KR20050084439A (ko) 2005-08-26
WO2004056806A1 (en) 2004-07-08
UY28130A1 (es) 2004-07-30
BR0317548A (pt) 2005-11-22
CA2510850A1 (en) 2004-07-08
AU2003286321A1 (en) 2004-07-14
DE60314013T2 (de) 2008-01-17
KR100730267B1 (ko) 2007-06-20
MA27570A1 (fr) 2005-10-03
PA8592901A1 (es) 2005-02-04
SI1585743T1 (sl) 2007-08-31
CR7882A (es) 2005-08-05
DE60314013D1 (de) 2007-07-05
US7053107B2 (en) 2006-05-30
EP1585743A1 (en) 2005-10-19
JP3814285B2 (ja) 2006-08-23
AP2005003341A0 (en) 2005-06-30
US20060160858A1 (en) 2006-07-20
ECSP055858A (es) 2005-09-20
NZ540340A (en) 2007-07-27
EA008501B1 (ru) 2007-06-29
ATE362928T1 (de) 2007-06-15
CO5580767A2 (es) 2005-11-30
EP1585743B1 (en) 2007-05-23
RS20050430A (en) 2007-08-03
JP2006515589A (ja) 2006-06-01
NL1025073C2 (nl) 2005-02-01
TW200424193A (en) 2004-11-16
GT200300294A (es) 2004-07-27
TNSN05164A1 (fr) 2007-05-14
DK1585743T3 (da) 2007-09-17
NL1025073A1 (nl) 2004-06-22
IS7859A (is) 2005-05-23
EA200500811A1 (ru) 2005-12-29
US20040192735A1 (en) 2004-09-30
CN1747950A (zh) 2006-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HRP20050559A2 (en) 2-(1h-indazole-6-ylamino)-benzamide compounds as protein kinases inhibitors useful for the treatment of ophthalmic diseases
US7141587B2 (en) Indazole compounds and pharmaceutical compositions for inhibiting protein kinases, and methods for their use
KR100529639B1 (ko) 단백질 키나아제 억제를 위한 인다졸 화합물과 약제학적조성물 및 그 제조방법
US7141581B2 (en) Indazole compounds and pharmaceutical compositions for inhibiting protein kinases, and methods for their use
US20020006952A1 (en) Compounds, pharmaceutical compositions, and methods for inhibiting protein kinases

Legal Events

Date Code Title Description
ARAI Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application
A1OB Publication of a patent application
ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20061023

Year of fee payment: 4

OBST Application withdrawn