JP2006515589A - 眼疾患の治療に有用なプロテインキナーゼ阻害剤としての２−（１ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）−ベンズアミド化合物 - Google Patents

眼疾患の治療に有用なプロテインキナーゼ阻害剤としての２−（１ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）−ベンズアミド化合物 Download PDF

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Abstract

眼疾患とある種のプロテインキナーゼの活性を変調させる、および／または阻害するインダゾール化合物について記載する。これらの化合物とそれらを含有する医薬組成物は、チロシンキナーゼのシグナル伝達に仲介することが可能であり、それによって望まれない細胞増殖を変調させる、および／または阻害する。本発明はまた、こうした化合物を含有する医薬組成物の療法または予防上の使用と、こうした化合物の有効量を投与することによって、糖尿病性網膜症、血管新生性緑内障、慢性関節リウマチ、および乾癬のような、望まれない血管新生および／または細胞増殖と関連した、眼疾患および癌と他の疾患状態を治療する方法へ向けられる。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、２００２年１２月１９日に出願された、米国仮特許出願第６０／４３４，９０２号の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、眼疾患とある種のプロテインキナーゼの活性に仲介および／または阻害するインダゾール化合物と、こうした化合物を含有する医薬組成物へ向けられる。本発明はまた、こうした化合物および組成物の療法または予防上の使用と、こうした化合物の有効量を投与することによって、望まれない血管新生および／または細胞増殖と関連した眼疾患と癌、並びに他の疾患状態を治療する方法へ向けられる。
背景技術
眼の後部域のいくつかの疾患および状態は、視覚の脅威となる。加齢関連黄斑変性（ＡＲＭＤまたはＡＭＤ）、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）、網膜症（例、糖尿病性網膜症、硝子体網膜症、または未熟児網膜症）、網膜炎（例、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜症）、ブドウ膜炎、黄斑浮腫、および緑内障がいくつかの例である。
加齢関連黄斑変性（ＡＲＭＤまたはＡＭＤ）は、高齢者の失明の主因である。ＡＲＭＤは、視覚の中心を攻撃し、それを曇らせて、読書、運転、そして他の細かい作業を困難または不可能にさせる。米国だけで毎年約２００，０００の新たな症例のＡＲＭＤが発生する。現行の推計値から見ると、７５歳を超える人口のほぼ４０パーセント、そして６０歳を超える人口のほぼ２０パーセントがある度合いの黄斑変性に罹っている。「湿性」ＡＲＭＤは、大部分がしばしば失明を起すＡＲＭＤの種類である。湿性ＡＲＭＤでは、新たに形成される脈絡膜の血管（脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ））が体液を漏出し、網膜に対して進行性の損傷を引き起こす。ＡＲＭＤにおけるＣＮＶの特別な症例では、２つの主要な治療法、（ａ）光凝固術、および（ｂ）血管新生阻害剤の使用が現在開発されている。
しかしながら、光凝固術は、網膜に対して有害である場合があり、ＣＮＶが眼窩の近傍にあるときは実行し得ない。さらに、光凝固術は、しばしば、経時的に再発性ＣＮＶをもたらす。抗血管新生化合物の経口投与もＡＲＭＤの全身治療法として試験されている。しかしながら、薬物特異的な代謝制限により、全身投与は、通常、眼に対しては治療域以下の薬物レベルをもたらす。故に、有効な眼内薬物濃度を達成するには、受容し得ないほどに高い用量か、または反復的な慣用の用量が必要とされる。様々なインプラントも抗血管新生化合物の眼への局所送達用に開発されてきた。そうしたインプラントの例は、Ｗｏｎｇへの米国特許第５，８２４，０７２号、Ｇｗｏｎら，への米国特許第５，４７６，５１１号、およびＡｓｈｔｏｎら，への米国特許第５，７７３，０１９号に開示され、このいずれも、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
眼の血管新生疾患
上記のように、本発明はまた、例えば、角膜新血管形成、血管新生性緑内障、増殖性の糖尿病性網膜症、水晶体後線維芽細胞増殖症、および黄斑変性が含まれる、眼の血管新生疾患を治療する方法を提供する。
簡潔に言えば、前部域への損傷の結果としての角膜新血管形成は、視力の低下および失明の重要な原因であり、角膜同種移植片の拒絶の主要な危険因子である。すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｕｒｇｅｒら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．４８：１６９−１８０，１９８３に記載されるように、角膜新血管形成には、血管新生前潜伏期、新血管形成活動期、および血管の成熟および退縮期という３つの相が関与する。白血球、血小板、サイトカイン、およびエイコサノイドのような、炎症応答の要素が含まれる様々な血管新生因子、または未同定の血漿構成因子の同定および機序は、まだ明らかになっていない。
現行では、角膜新血管形成の阻害や既存の角膜新血管の退縮のための臨床的に満足できる療法は存在しない。局所コルチコステロイドには、おそらくは基質の炎症を限定することによって、いくらかの臨床有用性があるらしい。
このように、本発明の方法の１つの側面では、角膜新血管形成（角膜移植片の新血管形成が含まれる）のような眼の血管新生疾患を治療するための方法が提供され、該方法は、血管の形成が阻害されるように、角膜への治療有効量の抗血管新生組成物（上記のような）を患者へ投与する工程を含んでなる。簡潔に言えば、角膜は、正常には血管を欠く組織である。しかしながら、ある種の病理学的状態では、角膜周囲の縁の脈管叢から角膜へ毛細管が伸びる場合がある。角膜が血管形成状態になると、それはまた曇った状態になり、患者の視力低下をもたらす。角膜が完全に混濁化すれば、完全に失明する可能性がある。
血管は、新血管形成を刺激するプロセスに依存して、多様な様式および深度で角膜に入ることができる。これらの様式は、伝統的に眼科専門医により以下の種類に定義されてきた：トラコーマ性パンヌス、らい性パンヌス、フリクテン性パンヌス、変性パンヌス、および緑内障性パンヌス。角膜基質はまた、前毛様体動脈の分岐により侵入される場合があり（間質性新血管形成と呼ばれる）、それは、末端ループ、「刷毛様」パターン、ウンベル（ｕｍｂｅｌ）型、格子型、間質弧（強膜上血管に由来する）、および異常で不規則な血管といった、いくつかの明瞭な臨床病変を引き起こす。
例えば、角膜感染症（例、トラコーマ、単純ヘルペス性角膜炎、リーシュマニア症、およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセス（例、移植片拒絶、およびスチーブンス−ジョンソン症候群）、アルカリ熱傷、外傷、炎症（あらゆる原因の）、有毒および栄養不足状態、およびコンタクトレンズ装着の合併症が含まれる、多種多様な障害が角膜新血管形成をもたらす場合がある。
角膜新血管形成の原因は多様であり得るが、その傷害と後続の血管内方成長に対する角膜の応答は、その原因に拘らず類似している。簡潔に言えば、角膜縁の臨界距離内に位置する病変だけが血管新生応答を刺激するので、損傷の部位が重要であるようだ。このことは、血管侵入を誘発する原因となる血管新生因子がその効果を発揮するには、病変の部位で創出されて、最も近い血管（角膜縁）の部位へ拡散しなければならないという事実によるのかもしれない。角膜縁からのある距離を過ぎてしまうとこのことはもはや可能ではなく、縁内皮は、角膜中へ増殖するように誘導されない。いくつかの血管新生因子がこのプロセスに関与している可能性があり、その多くは炎症応答の産物である。実際、角膜新血管形成は、炎症細胞の浸潤と関連してのみ起こるようであり、血管新生の度合いは、炎症反応の程度に比例する。さらに、角膜浮腫は、角膜の基質骨格を緩めて、毛細管がそれを通して成長し得る「最小抵抗」の経路を提供することによって、血管の内方成長を促進する。
最初の炎症応答に続いて、角膜への毛細管成長は、他の組織でそれが起こるのと同じやり方で進行する。角膜縁の毛細管および細静脈の正常ならば静止している内皮細胞が、分裂して移動するように刺激される。内皮細胞はその起源の血管より放出され、周囲の基底膜とそれが移動する組織を消化して、血管新生刺激の源の方へ移動する。この行先不明の血管芽は管腔を獲得してから、一緒に吻合して、毛細管ループを形成する。最終結果は、角膜基質内での脈管叢の確立である。
本発明の抗血管新生因子および組成物は、血管新生プロモーターの刺激効果を妨げること、内皮細胞の分裂を抑制すること、内皮細胞の移動を低下させること、そして内皮により分泌されるタンパク分解酵素の活性を減損させることによって有用である。
発明の要約
本発明の特に好ましい態様では、抗血管新生因子を局所投与用に生理食塩水において（眼の調製物に通常使用される保存剤および抗菌剤のいずれとも組み合わせて）調製して、点眼形式で投与可能である。抗血管新生因子の溶液剤または懸濁液剤は、その純粋型で調製可能であり、１日数回投与することが可能である。あるいは、上記に記載のように調製する抗血管新生組成物は、角膜へ直接投与してもよい。
好ましい態様では、角膜へ結合する粘液付着性ポリマーで抗血管新生組成物を調製する。さらなる態様では、抗血管新生因子または抗血管新生組成物を慣用のステロイド療法への補助薬として利用可能である。
局所療法はまた、血管新生応答を誘発する高い確率を有することが知られている角膜病変（化学熱傷のような）において予防的に有用であるかもしれない。これらの事例では、おそらくはステロイドと組み合わせた治療を即座に開始して、後続の合併症を防ぐのに役立つ場合がある。
他の態様では、眼科医によって顕微鏡のガイダンス下に、上記に記載の抗血管新生組成物を角膜基質へ直接注射可能である。注射の好ましい部位は、個々の病変の形態に応じて変動する場合があるが、投与の目標は、本組成物を脈管構造の前進フロントに置くことであろう（即ち、血管と正常角膜の間に分散させる）。ほとんどの症例において、このことは、前進する血管より角膜を「保護する」ための角膜周縁への注射を伴うことだろう。この方法は、角膜新血管形成を予防的に妨げるために角膜傷害の直後に利用してもよい。この状況において、角膜病変とその望まれない潜在的な周縁の血液供給部分の間に分散した角膜周縁に本材料を注射可能である。こうした方法はまた、移植角膜の毛細管侵入を防ぐのと同じやり方で利用可能である。持続放出型では、年に２〜３回しか注射が必要とされないかもしれない。注射それ自体より生じる炎症を抑えるために、注射溶液へステロイドを加えてもよい。
本発明の別の側面では、血管の形成を阻害するように、眼への抗血管新生組成物の治療有効量を患者へ投与する工程を含んでなる、血管新生性緑内障を治療する方法が提供される。
簡潔に言えば、血管新生性緑内障は、新たな毛細管が眼の虹彩に発生する病理学的状態である。この血管新生は、通常、瞳孔縁に位置する血管より発生して、虹彩の付け根を横断して、小柱網の中へ進む。線維芽細胞や他の結合組織要素がこの毛細管成長と関連していて、虹彩の前面を横断して広がる線維血管性の膜が発達する。最終的に、この組織が前房角へ達し、そこで虹彩癒着を形成する。これらの癒着は、やがて合体し、瘢痕形成し、萎縮して最終的に前房角から離れて閉鎖する。瘢痕形成により、前房角から小柱網への水性体液の十分な排液が妨げられ、失明をもたらす可能性のある眼内圧の増加を生じる。
一般に、血管新生性緑内障は、網膜虚血が支配的である疾患の合併症として発生する。特に、この障害のある患者の約１／３は糖尿病性網膜症を有し、２８％は網膜中心静脈閉塞症を有する。他の原因には、慢性網膜剥離、終末期緑内障、頚動脈閉塞疾患、水晶体後線維芽細胞増殖症、鎌状赤血球貧血、眼内腫瘍、および頚動脈海綿体洞瘻が含まれる。その初期段階において、血管新生性緑内障は、高倍率の細隙灯生体顕微鏡によって診断可能であり、それにより虹彩の表面に小さな拡張性の無秩序な毛細管（フルオレセインを漏出させる）が明らかにされる。後の隅角鏡検査により、前房角の線維血管帯による進行性の遮断が証明される。前房角がまだ開いている間は保存療法が役立つかもしれないが、前房角が閉じてしまうと、眼圧を緩和するには、外科的な介入が必要になる。
故に、本発明の１つの態様では、血管新生性緑内障の初期形態を治療するために、抗血管新生因子を（単独で、または上記のような抗血管新生組成物において）眼へ局所的に投与可能である。
本発明の他の態様では、抗血管新生組成物を、前房角の領域への該組成物の注射により埋め込むことが可能である。このことは、抗血管新生因子の持続的な局在増加をもたらし、その域への血管成長を妨げる。虹彩の前進する毛細管と前房角の間に置かれる、埋め込まれたかまたは注射された抗血管新生組成物は、開いた前房角を新血管形成より「防御する」ことができる。抗血管新生組成物の有意な半径内では毛細管が成長しないので、前房角の開存性が維持可能である。他の態様では、抗血管新生因子が水性体液中へ連続的に放出されるように、抗血管新生組成物をどの位置に配置してもよい。このことにより、体液内の抗血管新生因子濃度が増加して、虹彩の表面とその異常な毛細管がそれに浸されることによって、医薬品を送達する別の機序が提供される。上記の療法モダリティは、予防的に、そして既存の治療法との組合せにおいて有用であり得る。
本発明の別の側面では、血管の形成を阻害するように、眼への抗血管新生組成物の治療有効量を患者へ投与する工程を含んでなる、増殖性の糖尿病性網膜症を治療する方法が提供される。
簡潔に言えば、糖尿病性網膜症の病理は、血管新生性緑内障について上記に記載したものに類似していると考えられる。特に、バックグラウンド糖尿病性網膜症は、網膜低酸素症の影響下で増殖性の糖尿病性網膜症へ変換すると考えられている。一般に、血管新生性組織は、視神経（通常、先端の１０ｍｍ以内）と、組織灌流が乏しい領域にある網膜の表面より発生する。はじめ、毛細管は、網膜の内限界膜と硝子体の後面の間で成長する。最後にこの血管は、硝子体の中へ、そして内限界膜を貫通して成長する。硝子体が萎縮するとき、この血管へ牽引を適用すると、しばしば出血による血管の剪断と硝子体の失明をもたらす。網膜中の瘢痕形成からの線維牽引も、網膜剥離をもたらす場合がある。
最上の慣用療法は、網膜組織を減らすための汎網膜性の光凝固術であり、それによって網膜の酸素需要を低下させる。はじめは有効であるが、新たな病変が網膜の他の部分に形成されるにつれて、再発率が高くなる。この療法の合併症には、５０％までの患者での末梢視覚の低下、角膜の機械的な剥離、レーザー起因性の白内障形成、急性緑内障、および網膜下の血管新生増殖の刺激が含まれる（これは、視覚喪失をもたらす場合がある）。結果として、この手技を実施するのは、いくつかの危険因子が存在して、リスク／利益比が明らかに介入に有利であるときだけである。
故に、本発明の特に好ましい態様では、抗血管新生因子の網膜における局所濃度を高めるための、抗血管新生因子（または抗血管新生組成物）の水性体液または硝子体への注射によって、増殖性の糖尿病性網膜症が治療可能である。好ましくは、この治療は、光凝固術を必要とする重篤な疾患の獲得に先立って開始すべきである。本発明の他の態様では、血管新生病変に栄養補給する動脈に塞栓形成させることができる（上記のような抗血管新生組成物を利用する）。
本発明の別の側面では、血管の形成を阻害するように、眼への抗血管新生因子（または抗血管新生組成物）の治療有効量を患者へ投与する工程を含んでなる、水晶体後線維芽細胞増殖症を治療する方法が提供される。
簡潔に言えば、水晶体後線維芽細胞増殖症は、酸素療法を受ける早産児で起こる状態である。末梢網膜の脈管構造が、特に側頭側で、胎児期の終わりまでに完全に形成されていない。過剰の酸素（終端では生理学的であるレベルであっても）や酸素フリーラジカルの形成が、未熟な網膜の血管への損傷を引き起こすことによって重要であると考えられている。これらの血管は、狭窄して、酸素への曝露時に構造的に除去される。結果として、末梢網膜は血管形成することができず、網膜虚血が後続する。この虚血に応答して、正常網膜と虚血網膜の連結部で新血管形成が誘発される。
この症例の７５％では、これらの血管が自然と退縮する。しかしながら、残る２５％では、継続した毛細管成長、線維血管成分の萎縮、および血管と網膜の両方での牽引がある。このことは、失明につながる可能性がある硝子体出血および／または網膜剥離をもたらす。血管新生性の隅角閉塞緑内障もこの状態の合併症である。
どの症例が自発的に解消されて、どの症例が重症度において進行するかを判定することはしばしば不可能であるので、一般に、慣用の治療法（即ち、外科手術）は、疾患が確定して病理が十分進行した患者でのみ開始される。この「待機」アプローチは、初期の介入を回避して、複雑な経過をたどる先の２５％において疾患の進行を許容する。故に、本発明の１つの態様では、この状態を発症するリスクが高い幼児で水晶体後線維芽細胞増殖症の進行の発生を抑える試みにおいて、抗血管新生因子（または、上記のような抗血管新生組成物）の局所投与が達成可能である。他の態様では、抗血管新生組成物の硝子体内注射剤および／または眼内インプラントが利用可能である。こうした方法は、外科手術の必要性を抑えるために、確定した疾患の症例において特に好ましい。
プロテインキナーゼ
プロテインキナーゼは、タンパク質中の特定のチロシン、セリン、またはスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化を触媒する酵素のファミリーである。典型的には、そうしたリン酸化はそのタンパク質の機能を劇的に変化させるので、プロテインキナーゼは、代謝、細胞増殖、細胞分化、および細胞生存が含まれる多種多様な細胞プロセスの調節に必須である。プロテインキナーゼの活性が必要であることが知られている多くの様々な細胞機能の中で、いくつかのプロセスは、ある種の疾患状態への治療介入に魅力的な標的となる。２つの例は、血管新生と細胞周期制御であり、ここではプロテインキナーゼが必須の役割を担うが、これらのプロセスは、固形腫瘍の増殖だけでなく他の疾患にも不可欠である。
血管新生は、新たな毛細管が既存の血管より形成される機序である。血管系には、必要とされるとき、組織および臓器の適切な機能を維持するために、新たな毛細管ネットワークを産生する潜在能力がある。しかしながら、成体において、血管新生はかなり制限されていて、創傷治癒や月経期における子宮内膜の新血管形成のプロセスでのみ起こる。すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓら，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，８，３−１０（１９９７）を参照のこと。一方、望まれない血管新生は、網膜症、乾癬、慢性関節リウマチ、加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）、および癌（固形腫瘍）のようないくつかの疾患の特徴である。すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，１，２７−３１（１９９５）。血管新生プロセスに関与していることが示されたプロテインキナーゼには、増殖因子受容体チロシンキナーゼファミリーの３つのメンバー：ＶＥＧＦ−Ｒ２（血管内皮増殖因子受容体−２、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）およびＦＬＫ−１としても知られる）；ＦＧＦ−Ｒ（線維芽細胞増殖因子受容体）；およびＴＥＫ（Ｔｉｅ−２としても知られる）が含まれる。
ＶＥＧＦ−Ｒ２は、内皮細胞上でのみ発現されて、強力な血管新生増殖因子のＶＥＧＦと結合して、その細胞内キナーゼ活性の活性化を介して、後続のシグナル伝達に仲介する。従って、ＶＥＧＲ−Ｒ２のキナーゼ活性の直接阻害は、シグナル伝達に仲介することができないＶＥＧＦ−Ｒ２の突然変異体について示されたように（Ｍｉｌｌａｕｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，１６１５−１６２０（１９９６））、外因性ＶＥＧＦの存在時でも血管新生の抑制をもたらすと期待されている（Ｓｔｒａｗｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，３５４０−３５４５（１９９６）を参照のこと）。さらに、ＶＥＧＦ−Ｒ２は、成体においてＶＥＧＦの血管新生活性に仲介する機能以外は機能を有さないようである。故に、ＶＥＧＦ−Ｒ２のキナーゼ活性の選択阻害剤は、ほとんど毒性を明示しないと予測される。
同様に、ＦＧＦ−Ｒは、血管新生増殖因子のａＦＧＦおよびｂＦＧＦと結合して、後続の細胞内シグナル伝達に仲介する。最近、ある大きさに達した固形腫瘍において血管新生を誘発することにｂＦＧＦのような増殖因子がきわめて重要な役割を担う可能性があることが示唆された。Ｙｏｓｈｉｊｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，３９２４−３９２８（１９９７）。しかしながら、ＶＥＧＦ−Ｒ２とは異なり、ＦＧＦ−Ｒは、身体全体のいくつかの異なる細胞種で発現され、成体において他の正常な生理学的プロセスに重要な役割を担っているともいないとも言える。それでも、ＦＧＦ−Ｒのキナーゼ活性の低分子阻害剤の全身投与は、マウスにおいて明瞭な毒性なしにｂＦＧＦ起因性の血管新生を阻止することが報告されている。Ｍｏｈａｍｍａｄら，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１７，５９９６−５９０４（１９９８）。
ＴＥＫ（Ｔｉｅ−２としても知られる）は、内皮細胞でのみ発現される別の受容体チロシンキナーゼであり、血管新生においてある役割を担うことが示されている。アンジオポエチン−１因子の結合は、ＴＥＫのキナーゼドメインの自己リン酸化をもたらし、内皮周辺の支持細胞と内皮細胞の相互作用に仲介するように見えるシグナル伝達経路をもたらし、それにより新たに形成される血管の成熟化を促進する。一方、アンジオポエチン−２因子は、アンジオポエチン−１のＴＥＫに対する作用に拮抗するようであり、血管新生を妨害する。Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，５５−６０（１９９７）。
上記の研究開発の結果として、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＦＧＦ−Ｒ、および／またはＴＥＫのキナーゼ活性を阻害する化合物の使用により血管新生を治療することが提唱されている。例えば、ＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９７／３４８７６は、ＶＥＧＦ−Ｒ２の阻害剤である特定のシンノリン誘導体を開示して、これは、癌、糖尿病、乾癬、慢性関節リウマチ、カポシ肉腫、血管腫、急性および慢性腎症、アテローム、動脈再狭窄、自己免疫疾患、急性炎症、および網膜血管増殖を伴う眼疾患といった、異常な血管新生および／または増加した血管透過性と関連した疾患状態の治療に使用可能である。
ホスホリラーゼキナーゼはグリコゲンホスホリラーゼを活性化して、それによりグリコゲン分解と肝臓のグルコース放出を高める。２型糖尿病では肝臓のグルコース産生が異常調節されて、抵抗性高血糖の主因となり、これがこれら患者の罹患する二次合併症の多くをもたらす。従って、肝臓からのグルコース放出の抑制は、上昇した血漿グルコースレベルを低下させるだろう。故に、ホスホリラーゼキナーゼの阻害剤は、ホスホリラーゼ活性とグリコゲン分解を弱めて、患者の高血糖症を抑えるはずである。
ＶＥＧＦに対する別の生理学的応答は血管透過性亢進であり、これは血管新生の初期段階においてある役割を担うことが提唱されている。卒中犠牲者の脳中に生じるような虚血組織においては、低酸素症がＶＥＧＦ発現の引き金になり、血管透過性の増加と、最終的には周辺組織における浮腫をもたらす。ラットの卒中モデルでは、ｖａｎ Ｂｒｕｇｇｅｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４，１６１３−２０（１９９９）により、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体の投与により梗塞容量が低下することが示された。従って、ＶＥＧＦＲの阻害剤は、卒中の治療に有用であることが期待される。
血管新生における役割に加えて、プロテインキナーゼは、細胞周期の制御にも重要な役割を担っている。無制御の細胞増殖は、癌のしるしである。様々な刺激に応答する細胞増殖は、細胞が増殖して分裂するプロセスである細胞分裂周期の脱調節によって顕現される。腫瘍細胞は、典型的には、細胞分裂周期を介した進行を直接的または間接的に調節する遺伝子への傷害を有する。
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の様々な期の間の移行を調節することにきわめて重要な役割を担うセリン−スレオニンプロテインキナーゼである。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１６４３−１６７７（１９９６）に編集された論文を参照のこと。ＣＤＫ複合体は、調節性サイクリンサブユニット（例、サイクリンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＥ）と触媒キナーゼサブユニット（例、ｃｄｃ２（ＣＤＫ１）、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、およびＣＤＫ６）の会合を介して形成される。この名称が示唆するように、ＣＤＫは、その標的基質をリン酸化するのにサイクリンサブユニットに対する絶対的な依存性を表示して、様々なキナーゼ／サイクリンの対が細胞周期の特定期を通して進行を調節するように機能する。
安定または静止の段階から細胞が細胞分裂へ方向付けられる段階へ細胞分裂周期を始動させるのにきわめて重要な役割を果たすのは、Ｄサイクリンへ複合したＣＤＫ４である。この進行は、負と正の両方の多様な増殖調節機序に依存する。この制御系における異常、特にＣＤＫ４の機能に影響を及ぼすものは、悪性腫瘍、特に家族性黒色腫、食道癌、および膵臓癌に特徴的な高増殖状態へ細胞が進むことに関連があると示唆されている。例えば、Ｋａｍｂ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，１３６−１４０（１９９５）；Ｋａｍｂら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，４３６−４４０（１９９４）を参照のこと。
無数の公表文献が多様な治療標的に対して有用な多様な化学化合物について記載している。例えば、ＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９９／２３０７７およびＷＯ９９／２３０７６は、インダゾールのカテコールへの生物等量式（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）置換により生成される、ホスホジエステラーゼＩＶ型阻害活性を有するインダゾール含有化合物について記載する。米国特許第５，７６０，０２８号は、αｖβ３インテグリンと関連の細胞表面吸着分子受容体のアンタゴニストとして有用である、３−［１−［３−（イミダゾリン−２−イルアミノ）プロピル］インダゾール−５−イルカルボニルアミノ］−２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピオン酸が含まれる複素環を開示する。ＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９８／０９９６１は、特定のインダゾール誘導体と、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ型または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の哺乳動物における産生の阻害剤としてのその使用を開示する。既知の化合物のバーチャル・ライブラリーに対する最新の追加物には、ＣＤＫを阻害する抗増殖性治療剤であるとして記載されるものが含まれる。例えば、Ｘｉｏｎｇら，への米国特許第５，６２１，０８２号は、ＣＤＫ６の阻害剤をコードする核酸を開示して、ヨーロッパ特許公開公報番号０ ６６６ ２７０ Ａ２は、ＣＤＫ１およびＣＤＫ２の阻害剤として作用するペプチドおよびペプチド模擬体について記載する。ＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９７／１６４４７は、サイクリン依存性キナーゼ、特にＣＤＫ４／サイクリンＤ１のようなＣＤＫ／サイクリン複合体の阻害剤であり、過剰または異常な細胞増殖を阻害すること、そしてそれ故に癌を治療することに使用可能である、特定のクロモン類似体を開示する。ＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９９／２１８４５は、ＣＤＫ阻害剤として有用である４−アミノチアゾール誘導体について記載する。上記に収載した特許および／または出願のそれぞれは、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
しかしながら、容易に合成可能であり、１以上のＣＤＫまたはＣＤＫ／サイクリン複合体を阻害するのに有効である低分子化合物へのニーズが依然としてある。ＣＤＫ４がほとんどの細胞において細胞分裂の全般アクチベーターとして機能し得て、ＣＤＫ４およびＤ型サイクリンの複合体が細胞周期の初期Ｇ１期を支配するので、１以上の種類の腫瘍を治療するための、ＣＤＫ４と、そのＤ型サイクリン複合体の有効な阻害剤へのニーズがある。また、サイクリンＥ／ＣＤＫ２およびサイクリンＢ／ＣＤＫ１キナーゼのそれぞれＧ１／Ｓ期およびＧ２／Ｍ移行期における中心的な役割は、癌の脱調節した細胞周期進行を抑制することにおいて、治療介入のための追加標的を提供する。
別のプロテインキナーゼ、ＣＨＫ１は、細胞周期の進行におけるチェックポイントとして重要な役割を果たす。チェックポイントとは、サイクリン依存性キナーゼの形成、活性化、および後続の不活性化に影響を及ぼすことによって細胞周期の進行を調整する制御系である。チェックポイントは、細胞周期の不適切な時間での進行を妨げ、細胞が分裂停止している間の細胞の代謝バランスを維持し、そして場合によっては、チェックポイントの要求が満たされないときは、アポトーシス（プログラムされた細胞死）を引き起こすことができる。例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ，２９，１５１−１８２（１９９７）；Ｎｕｒｓｅ，Ｃｅｌｌ，９１，８６５−８６７（１９９７）；Ｈａｒｔｗｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，１８２１−１８２８（１９９４）；Ｈａｒｔｗｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，６２９−６３４（１９８９）を参照のこと。
１系列のチェックポイントは、ゲノムの完全性を監視して、ＤＮＡ傷害を感知するとすぐに、これらの「ＤＮＡ傷害チェックポイント」は、Ｇ１およびＧ２期における細胞周期の進行を阻止して、Ｓ期を通過する進行を遅らせる。Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ，２９，１５１−１８２（１９９７）；Ｈａｒｔｗｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，１８２１−１８２８（１９９４）。この作用は、ゲノムの複製とこの遺伝物質の新たな娘細胞への後続の分離が起こる前に、ＤＮＡ収縮プロセスがその作業を完了することを可能にする。重要にも、ヒト癌において最も一般的に突然変異する遺伝子であるｐ５３腫瘍抑制遺伝子は、Ｇ１期において細胞周期の進行を阻止するＤＮＡ傷害チェックポイントタンパク質を産生する、および／またはＤＮＡ傷害に続いてアポトーシス（プログラムされた細胞死）を引き起こす。Ｈａｒｔｗｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，１８２１−１８２８（１９９４）。ｐ５３腫瘍サプレッサーはまた、細胞周期のＧ２期におけるＤＮＡ傷害チェックポイントの作用を強めることが示された。例えば、Ｂｕｎｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８，１４９７−１５０１（１９８８）；Ｗｉｎｔｅｒｓら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７，６７３−６８４（１９９８）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１５，３０２５−３０３５（１９９７）を参照のこと。
ｐ５３腫瘍サプレッサー経路のヒト癌における重要性を仮定して、ｐ５３欠損癌における易損性を活用する治療介入が活発に求められてきた。１つの新生の易損性は、ｐ５３欠損癌細胞におけるＧ２チェックポイントの機能にある。癌細胞は、Ｇ１チェックポイント制御を欠くので、ＤＮＡ傷害剤の癌殺傷効果よりそれらを保護する最後に残る障壁である、Ｇ２チェックポイントの排除を特に受けやすい。Ｇ２チェックポイントは、酵母からヒトまで保存されている制御系により調節されている。この保存された系において重要であるのはキナーゼのＣＨＫ１であり、これは、ＤＮＡ傷害感知複合体からのシグナルを伝達して、有糸分裂エントリーを促進するサイクリンＢ／Ｃｄｃ２キナーゼの活性化を阻害する。例えば、Ｐｅｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１５０１−１５０５（１９９７）；Ｓａｎｃｈｅｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４９７−１５０１（１９９７）を参照のこと。ＣＨＫ１の不活性化は、抗癌剤または内因性ＤＮＡ傷害のいずれかにより誘発されるＤＮＡ傷害によって引き起こされるＧ２停止を排除するだけでなく、生じるチェックポイント欠損細胞の選好的な殺傷をもたらすことが示された。例えば、Ｎｕｒｓｅ，Ｃｅｌｌ，９１，８６５−８６７（１９９７）；Ｗｅｉｎｅｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５０−１４５１（１９９７）；Ｗａｌｗｏｒｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ，３６３，３６８−３７１（１９９３）；およびＡｌ−Ｋｈｏｄａｉｒｙら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，５，１４７−１６０（１９９４）を参照のこと。
癌細胞におけるチェックポイント制御の選択操作は、癌の化学療法および放射線療法の方式において広汎な活用を提供可能であり、さらに、癌細胞の破壊のための選択基盤として利用すべきヒト癌の「ゲノム不安定性」という共通の特徴を提供可能である。いくつかの因子により、ＤＮＡ傷害チェックポイント制御における重要な標的としてＣＨＫ１が位置づけられている。これと、Ｃｄｓ１／ＣＨＫ２のような機能的に関連したキナーゼ（Ｓ期進行を調節するときにＣＨＫ１と共同することが最近発見されたキナーゼ）（Ｚｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３９５，５０７−５１０（１９９８）；Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，１８９３−１８９７（１９９８）を参照のこと）の阻害剤の解明は、癌の治療のために貴重な新しい治療実体を提供可能である。
インテグリン受容体のＥＣＭへの結合は、細胞移動、細胞増殖、および生存に関与しているＦＡＫ（焦点接着キナーゼ）により仲介される細胞内シグナルを始動させる。ヒト癌において、ＦＡＫ過剰発現は、インテグリン仲介性シグナル伝達経路におけるその役割を介した腫瘍形成および転移ポテンシャルとの関連が示唆されている。
チロシンキナーゼは、受容体型（細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインを有する）であるか、または非受容体型（全部細胞内にある）であり得る。非受容体タンパク質チロシンキナーゼの少なくとも１つ、即ち、ＬＣＫは、細胞表面タンパク質（Ｃｄ４）の架橋結合性抗Ｃｄ４抗体との相互作用からのシグナルのＴ細胞における伝達に仲介すると考えられている。非受容体チロシンキナーゼに関するより詳細な考察は、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｌｅｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８，２０２５−２０３１（１９９３）に提供される。
上記に特定したプロテインキナーゼに加えて、多くの他のプロテインキナーゼが治療標的になるとみなされて、数多くの公表文献が以下に概説されるように、キナーゼ活性の阻害剤を開示する：米国特許第６，５３４，５２４号（２００３年３月１８日発行）、米国特許第６，５３１，４９１号（２００３年３月１１日発行）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ００／３８６６５（２００１年７月６日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ９７／４９６８８（１９９７年１２月３１日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ９８／２３６１３（１９９８年６月４日公開）、米国特許第６，０７１，９３５号（２０００年６月６日発行）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ９６／３０３４７（１９９６年１０月３日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ９６／４０１４２（１９９６年１２月１９日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ９７／１３７７１（１９９７年４月１７日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ９５／２３１４１（１９９５年８月３１日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ０３／００６０５９（２００３年１月２３日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ０３／０３５０４７（２００３年５月１日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ０２／０６４１７０（２００２年８月２２日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ０２／４１８８２（２００２年５月３０日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ０２／３０４５３（２００２年４月１８日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ０１／８５７９６（２００１年１１月１５日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ０１／７４３６０（２００１年１０月１１日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ０１／７４２９６（２００１年１０月１１日公開）、ＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ０１／７０２６８（２００１年９月２７日公開）、ヨーロッパ特許出願公開公報番号ＥＰ１０８６７０５（２００１年３月２８日公開）、およびＰＣＴ国際特許出願公開公報番号ＷＯ９８／５１３４４（１９９８年１１月１９日公開）。上記の特許および出願は、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる。
しかしながら、プロテインキナーゼの有効な阻害剤へのニーズが依然としてある。さらに、当業者により理解されているように、キナーゼ阻害剤は、標的の単数または複数のキナーゼへの高いアフィニティーだけでなく、他のプロテインキナーゼに対する高い選択性を保有することが望ましい。
従って、本発明の目的は、加齢関連黄斑変性（ＡＲＭＤ）、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）、網膜症（例、糖尿病性網膜症、硝子体網膜症、未熟児網膜症）、網膜炎（例、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜症）、ブドウ膜炎、黄斑浮腫、および緑内障のような眼疾患の治療用の強力な薬剤を発見することである。
本発明の別の目的は、プロテインキナーゼの強力な阻害剤を発見することである。
本発明の別の目的は、１以上の特別なキナーゼへの強くて選択的なアフィニティーを有する有効なキナーゼ阻害剤を発見することである。
以下の記載より明らかになる、本発明の上記および他の目的を、プロテインキナーゼの活性を変調させる、および／または阻害する、以下に記載のインダゾール化合物、その医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、および医薬的に許容される塩（こうした化合物、プロドラッグ、代謝産物、および塩をまとめて「薬剤」と呼ぶ）の発見によって達成した。こうした薬剤を含有する医薬組成物は、癌のような、キナーゼ活性により仲介される疾患、並びに、糖尿病性網膜症、血管新生性緑内障、慢性関節リウマチ、および乾癬のような、望まれない血管新生および／または細胞増殖と関連した他の疾患状態を治療するのに有用である。さらに、本薬剤は、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、ＣＤＫ複合体、ＣＨＫ１、ＬＣＫ、ＴＥＫ、ＦＡＫ、および／またはホスホリラーゼキナーゼと関連したキナーゼ活性の変調および／または阻害に関して有利な特性を有する。
全体的な側面において、本発明は、以下の構造：
Figure 2006515589
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Figure 2006515589
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を有する化合物に関する。
本発明はまた、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物、またはその医薬的に許容される塩、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩を投与することによって、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、ＣＤＫ複合体、ＣＨＫ１、ＬＣＫ、ＴＥＫ、ＦＡＫ、および／またはホスホリラーゼキナーゼのキナーゼ活性を変調させる、および／または阻害する方法に関する。選択的なキナーゼ活性を有する本発明の好ましい化合物、即ち、それらは、１以上の異なるキナーゼに対してはより少ないかまたは最小の活性を保有する一方で、１以上の特定キナーゼに対して顕著な活性を保有する。本発明の１つの好ましい態様において、本発明の化合物は、ＦＧＲ−Ｇ１受容体チロシンキナーゼに対するよりもＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼに対して実質的により高い効力を保有する、式Ｉの化合物である。本発明はまた、ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を有意に変調させずにＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を変調させる方法へ向けられる。
本発明の化合物は、有利にも、他の既知の治療薬剤との組合せにおいて使用可能である。例えば、抗血管新生活性を保有する、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物は、亢進した抗腫瘍効果をもたらすために、タキソール、タキソテレ、ビンブラスチン、シスプラチン、ドキソルビシン、アドリアマイシン、等のような細胞傷害性の化学療法剤と同時投与してよい。治療効果の相加または相乗亢進も、コンブレタスタチンＡ−４、エンドスタチン、プリノマスタット、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ＥＭＤ１２１９７４、ＩＭ８６２、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、および抗ＫＤＲモノクローナル抗体のような他の抗血管新生剤と、抗血管新生活性を保有する式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物の同時投与により入手可能である。追加の組合せは、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、１９９９年１２月２２日にすべて同時に出願された、ＷＯ００３８７１６、ＷＯ００３８７１７１、ＷＯ００３８７１５、ＷＯ００３８７３０、ＷＯ００３８７１８、ＷＯ００３８６６５、ＷＯ００３７１０７、ＷＯ００３８７８６、ＷＯ００３８７１９に例示される。
本発明はまた、式Ｉの化合物とその医薬的に許容される塩、医薬的に活性な代謝産物、および医薬的に許容されるプロドラッグより選択される薬剤の有効量とそうした薬剤の医薬的に許容される担体または運搬体をそれぞれ含んでなる医薬組成物に関する。さらに本発明は、そうした薬剤の有効量をそうした治療の必要な患者へ投与することを含んでなる、望まれない血管新生および／または細胞増殖と関連した、眼疾患／状態と癌、並びに他の疾患状態を治療する方法を提供する。
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの本発明の化合物は、眼疾患を治療することとプロテインキナーゼの活性に仲介することに有用である。より特別には、本化合物は、抗血管新生剤として、そしてプロテインキナーゼの活性を変調させる、および／または阻害する薬剤として有用であり、それによってプロテインキナーゼにより仲介される細胞増殖と関連した眼疾患および癌や他の疾患の治療法を提供する。
本明細書に使用する用語「アルキル」は、１〜１２の炭素原子を有する直鎖および分岐鎖のアルキル基を意味する。例示のアルキル基には、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、等が含まれる。用語「低級アルキル」は、１〜８の炭素原子を有するアルキル（Ｃ１−８アルキル）を意味する。好適な置換アルキルには、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２−フルオロエチル、３−フルオロプロピル、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、等が含まれる。
用語「アルキリデン」は、１〜１２の炭素原子を有する２価の残基を意味する。例示のアルキリデン基には、ＣＨ２、ＣＨＣＨ３、（ＣＨ３）２、等が含まれる。
用語「アルケニル」は、２〜１２の炭素原子を有する直鎖および分岐鎖のアルケニル基を意味する。例示のアルケニル基には、プロプ−２−エニル、ブト−２−エニル、ブト−３−エニル、２−メチルプロプ−２−エニル、ヘクス−２−エニル、等が含まれる。
用語「アルキニル」は、２〜１２の炭素原子を有する直鎖および分岐鎖のアルキニル基を意味する。
用語「シクロアルキル」は、３〜１２の炭素原子を有する飽和または一部不飽和の炭素環を意味し、二環系および三環系のシクロアルキル構造が含まれる。好適なシクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、等が含まれる。
「ヘテロシクロアルキル」基は、炭素原子、好ましくは４または５の環炭素原子と、窒素、酸素、およびイオウより選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する飽和または一部不飽和の単環式残基を意味するものとする。
用語「アリール」および「ヘテロアリール」は、単環式および多環式の不飽和または芳香族の環構造を意味し、「アリール」は炭素環であるものを意味して、「ヘテロアリール」は複素環であるものを意味する。芳香族の環構造の例には、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フリル、チエニル、ピロリル、ピリジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、１，２，３−トリアジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１Ｈ−テトラゾール−５−イル、インドリル、キノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル（チアナフテニル）、等が含まれる。こうした部分は、縮合環構造または架橋、例えばＯＣＨ２−Ｏによって随意に置換可能である。
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル残基を意味するものとする。代表例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、等が含まれる。
用語「アリールオキシ」は、−Ｏ−アリールを表し、ここでアリールは上記に定義される。
用語「シクロアルコキシ」は、−Ｏ−シクロアルキルを表し、ここでシクロアルキルは上記に定義される。
用語「ハロゲン」は塩素、フッ素、臭素またはヨウ素を表す。用語「ハロ」は、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨードを表す。
一般に、本式中の可変基についての様々な部分または官能基は、１以上の好適な置換基により随意に置換可能である。例示の置換基には、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）、低級アルキル、−ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｏ−低級アルキル、−アリール、−アリール−低級アルキル、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＯＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ２、ハロアルキル（例、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３）、−Ｏ−ハロアルキル（例、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２）、等が含まれる。
用語「含んでなる」および「含まれる」は、広義の、非限定的な意味で使用する。
式Ｉの化合物は互変異性の現象を表示する場合があるが、本明細書内の式図は、この可能な互変異性型の１つだけを特に図示すると理解される。故に、本発明では、式が図示される化合物のあらゆる互変異性型を表すものとされ、式図により図示される特定の互変異性型だけに限定されないと理解されたい。
本発明の化合物の中には、単一の立体異性体（即ち、本質的に他の立体異性体を含まない）、ラセミ化合物、および／またはエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物として存在し得るものがある。こうした単一の立体異性体、ラセミ化合物、およびその混合物がすべて本発明の範囲内にあるものとする。好ましくは、光学的に活性である本発明の化合物は、光学的に純粋な形態で使用する。
当業者により概ね理解されるように、１つのキラル中心を有する光学的に純粋な化合物は、２つの可能なエナンチオマーの１つから本質的にはなるものであり（即ち、鏡像異性的に純粋である）、そして１以上のキラル中心を有する光学的に純粋な化合物は、ジアステレオ異性的に純粋で、鏡像異性的にも純粋であるものである。好ましくは、本発明の化合物は、少なくとも９０％は光学的に純粋である形態、即ち、少なくとも９０％（８０％のエナンチオマー過剰（「ｅ．ｅ．」）またはジアステレオマー過剰（「ｄ．ｅ．」）、より好ましくは少なくとも９５％（９０％ ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、なおより好ましくは少なくとも９７．５％（９５％ ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、そして最も好ましくは少なくとも９９％（９８％ ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）の単一異性体を含有する形態で使用する。
さらに、本発明の式には、同定される構造の溶媒和型並びに非溶媒和型が含まれるものとする。例えば、式Ｉには、指定構造の水和型と非水和型の両方の化合物が含まれる。溶媒和物の他の例には、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、またはエタノールアミンとの組合せの構造が含まれる。
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの化合物に加えて、本発明には、そうした化合物の医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、および医薬的に許容される塩が含まれる。
「医薬的に許容されるプロドラッグ」は、生理学的条件下かまたは加溶媒分解により、特定の化合物またはそうした化合物の医薬的に許容される塩へ変換可能である化合物である。
「医薬的に活性な代謝産物」は、特定の化合物またはその塩の体内での代謝により産生される薬理学的に活性な産物を意味するものとする。化合物の代謝産物は、当該技術分野で知られている定型技術を使用して同定可能であり、その活性は、本明細書に記載のような試験を使用して定量可能である。
化合物のプロドラッグおよび活性代謝産物は、当該技術分野で知られている定型技術を使用して同定可能である。例えば、Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４０，２０１１−２０１６（１９９７）；Ｓｈａｎ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８６（７），７６５−７６７；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，３４，２２０−２３０（１９９５）；Ｂｏｄｏｒ，Ｎ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１３，２２４−３３１（１９８４）；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．，「プロドラッグの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」（エルセヴィア・プレス １９８５）；および、Ｌａｒｓｅｎ，Ｉ．Ｋ．「プロドラッグの設計および応用、医薬品の設計および開発（Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎら，監修、ハーウッド・アカデミック・パブリッシャーズ、１９９１）を参照のこと。
「医薬的に許容される塩」は、特定化合物の遊離酸および塩基の生物学的有効性を保持し、生物学的にも、あるいは他の点でも望ましくなくはない塩を意味するものとする。本発明の化合物は、十分に酸性である、十分に塩基性である、または両方の官能基を保有して、それ故に、いくつかの無機または有機塩基、そして無機および有機酸のいずれとも反応して、医薬的に許容される塩を生じる場合がある。例示の医薬的に許容される塩には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベル酸塩、セバク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、およびマンデル酸塩が含まれる塩のような、鉱酸または有機酸または無機塩基と本発明の化合物の反応により製造される塩が含まれる。
本発明の化合物が塩基であれば、望ましい医薬的に許容される塩は、当該技術分野で利用可能なあらゆる好適な方法、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、等のような無機酸で、または酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、グルクロン酸若しくはガラクツロン酸のようなピラノシジル酸、クエン酸若しくは酒石酸のようなα−ヒドロキシ酸、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸のようなアミノ酸、安息香酸若しくはケイ皮酸のような芳香族酸、ｐ−トルエンスルホン酸若しくはエタンスルホン酸のようなスルホン酸、等のような有機酸でのこの遊離塩基の処理によって製造可能である。
本発明の化合物が酸であれば、望ましい医薬的に許容される塩は、あらゆる好適な方法、例えば、アミン（一級、二級または三級）、水酸化アルカリ金属または水酸化アルカリ土類金属、等のような無機または有機塩基でのこの遊離酸の処理によって製造可能である。好適な塩の代表例には、グリシンおよびアルギニンのようなアミノ酸、アンモニア、一級、二級、および三級アミン、並びに、ピペリジン、モルホリンおよびピペラジンのような環式アミンより派生する有機塩と、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウムおよびリチウムより派生する無機塩が含まれる。
固体である薬剤の場合、本発明の化合物および塩は、異なる結晶または多型の形態で存在する場合があり、このすべてが本発明および特定式の範囲内にあるものとすると当業者により理解される。
本発明の薬剤の治療有効量は、プロテインキナーゼの変調または調節により仲介される疾患を治療するために使用可能である。「有効量」は、そうした治療の必要な哺乳動物へ投与されるときに、チロシンキナーゼのような１以上のプロテインキナーゼの活性により仲介される疾患の治療をもたらすのに十分である薬剤の量を意味するものとする。このように、例えば、式Ｉの化合物、その塩、活性代謝産物またはプロドラッグの治療有効量は、１以上のプロテインキナーゼの活性により仲介される疾患状態が抑制または軽減されるように、その活性を変調、調節、または阻害するのに十分な量である。
そうした量に対応する所与の薬剤の量は、特別な化合物、疾患状態とその重篤性、治療の必要な哺乳動物のアイデンティティー（例、体重）といった要因に依存して変動するものであるが、それでも、当業者により定型的に決定可能である。「治療すること」は、チロシンキナーゼのような１以上のプロテインキナーゼの活性によって少なくとも一部影響を受ける、ヒトのような哺乳動物における疾患状態の少なくとも緩和を意味するものとし、特に、哺乳動物にその疾患状態を有する素因があることがわかっているものの、それを有しているとまだ診断されていないときに、その疾患状態が哺乳動物に発生するのを予防すること；疾患状態を変調させる、および／または阻害すること；および／または疾患状態を軽減することが含まれる。
本薬剤は、容易に利用可能である出発材料を使用して、当該技術分野で入手可能な技術を利用して、以下に記載の反応経路および合成スキームを使用して製造可能である。
１つの概略の合成法において、式Ｉの化合物は、以下の反応スキームに従って製造する：
Figure 2006515589
好ましくはジオキサンとの水性／有機混合物において、６−ニトロインダゾール（化合物Ｖ）をヨウ素および塩基、例えばＮａＯＨで処理する。この混合物を酸性化して、生成物を濾過により単離する。生じる３−ヨード−６−ニトロインダゾールへジクロロメタン−５０％ ＫＯＨ水溶液において０℃で保護基（「Ｐｇ」）試薬（ここで、Ｘ＝ハロである）、好ましくは塩化トリメチルシリルエトキシメチル（ＳＥＭ−Ｃｌ）と、相転移触媒、例えば臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢｒ）を加える。１〜４時間後、この２相を希釈し、有機物を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、濃縮する。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、式ＶＩの化合物を得る。好適な有機溶媒中の式ＶＩの化合物を水性塩基、例えば炭酸ナトリウムと好適な触媒、好ましくはＰｄ（ＰＰｈ３）４の存在下に好適なＲ１−有機金属試薬、好ましくはＲ１−ボロン酸で処理して、抽出後処理とシリカゲルクロマトグラフィーの後で、式ＶＩＩの化合物を得る。Ｒ１置換基は、式ＶＩＩの化合物またはこのスキーム全体のその後の中間体の中で酸化的切断（例、オゾン分解）によって交換可能であり、生じるアルデヒド官能基への付加をウィッティッヒまたは縮合変換で続けてよい（実施例４２（ａ〜ｅ）に代表される）。式ＶＩＩの化合物の還元剤、好ましくはＳｎＣｌ２での処理により、慣用の水系の後処理と精製の後で、式ＶＩＩＩの化合物を得る。Ｙ＝ＮＨまたはＮ−低級アルキルである誘導体の系列では、式ＶＩＩＩの化合物を、塩基、好ましくはＣｓ２ＣＯ３と触媒、好ましくはＰｄ−ＢＩＮＡＰの存在下に、アリールまたはヘテロアリールの塩化物、臭化物、ヨウ化物、またはトリフレートで処理して（そして、Ｙ＝Ｎ−低級アルキルである場合、後続のアルキル化工程で）、式Ｘの化合物を得ることができる。他のＹ連結を生成するには、冷却した標準の水系酸性条件下で式ＶＩＩＩの化合物へ亜硝酸ナトリウムを加え、ヨウ化カリウムの添加と穏和な加温を続ける。標準の後処理および精製手順により、式ＩＸのヨウ化化合物を得る。
式ＩＸの化合物の有機金属試薬、例えばブチルリチウムでの処理は、リチウムハロゲン交換を促進する。次いで、この中間体を、追加の金属および触媒、好ましくは塩化亜鉛およびＰｄ（ＰＰｈ３）４の可能な仲介により、Ｒ２親電子体、例えばカルボニルまたはトリフレートと反応させて、式Ｘの化合物を得る。あるいは、触媒、例えばＰｄ（ＰＰｈ３）４の存在下、一酸化炭素の雰囲気下に有機ボロン酸のような有機金属試薬で式ＩＸの化合物を処理して、式Ｘの化合物を得てもよい。あるいは、Ｙ＝ＮＨまたはＳである誘導体では、塩基、好ましくはＣｓ２ＣＯ３またはＫ３ＰＯ４と触媒、好ましくはＰｄ−ＢＩＮＡＰまたはＰｄ−（ビス−シクロヘキシル）ビフェニルホスフィンの存在下に適切なアミンまたはチオールで式ＩＸの化合物を処理して、式Ｘの化合物を得てもよい。次いで、酸化、還元、アルキル化、アシル化、縮合、および脱保護のような慣用の官能基相互交換を利用してこの系列をさらに誘導化して、式Ｉの最終化合物を得る。
本発明の式Ｉの化合物は、以下のスキームに示す一般的な手順に従っても製造可能である：
Figure 2006515589
好ましくはジオキサンとの水性／有機混合物において、６−ヨードインダゾール（ＸＩ）をヨウ素および塩基、例えばＮａＯＨで処理する。この混合物を酸性化して、生成物ＸＩＩを濾過により単離する。生じる３，６−ジヨード−インダゾールへジクロロメタン−５０％ ＫＯＨ水溶液において０℃で保護基試薬、好ましくはＳＥＭ−Ｃｌと、相転移触媒、例えばＴＢＡＢｒを加える。この２相を希釈し、有機物を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、濃縮する。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、式ＸＩＩＩの化合物を得る。好適な有機溶媒中の式ＸＩＩＩの化合物を好適なＲ２−有機金属試薬、例えばＲ２−ＺｎＣｌまたはホウ素Ｒ２−ホウ素試薬と好適な触媒、好ましくはＰｄ（ＰＰｈ３）４で処理すると、抽出後処理とシリカゲルクロマトグラフィーの後で、式ＸＩＶの化合物を得る。好適な有機溶媒中の式ＸＩＶの化合物を、水性塩基、炭酸ナトリウムと好適な触媒、好ましくはＰｄ（ＰＰｈ３）４の存在下に、好適なＲ１−有機金属試薬（例、ホウ素Ｒ１−ホウ素試薬またはＲ１−ＺｎＣｌ）で処理すると、抽出後処理とシリカゲルクロマトグラフィーの後で、式ＸＶの化合物を得る。次いで、酸化、還元、アルキル化、アシル化、縮合、および脱保護のような慣用の官能基相互交換を利用してこの系列をさらに誘導化して、式Ｉの最終化合物を得る。
あるいは、Ｒ２が置換または未置換のＹ−Ａｒである（ここでＹは、ＯまたはＳである）式Ｉの化合物は、以下の一般スキームに従って製造可能である：
Figure 2006515589
３−クロロ−シクロへクス−２−エノン（ＸＶ）、Ｈ−Ｒ２、および無水炭酸カリウムの撹拌アセトン溶液を１５〜２４時間還流させ、冷やして、濾過する。この濾液を濃縮して、シリカゲルでクロマトグラフ処理して、３−Ｒ２−シクロヘクス−２−エノン（ＸＶＩ）を得る。
式ＸＶＩのケトンは、好適な塩基（Ｍ−Ｂ）、好ましくはリチウムビス（トリメチルシリル）アミドと反応させ、Ｒ１−ＣＯ−Ｘ（ここでＸ＝ハロゲンである）と反応させてよく、標準の酸後処理および精製の後で、式ＸＶＩＩの化合物を得る。この生成物を、ＨＯＡｃ／ＥｔＯＨにおいて、ヒドラジン一水和物と組み合わせて、好適な温度で好適な時間の間、好ましくは６０〜８０℃で２〜４時間加熱する。冷却後、この混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液へ注ぎ、有機溶媒で抽出し、濃縮して、シリカゲルで精製して、式ＸＶＩＩＩの化合物を得る。式ＸＶＩＩＩの化合物は、多様な既知の方法を使用して酸化可能であり、式Ｉの化合物を得る。
Figure 2006515589
本発明の化合物を合成する代わりの方法を以下に続ける：
これによる、工程ａ）〜ｉ）の条件は、以下の通りである：
ａ）ＮａＮＯ２、Ｂｒ２、ＨＢｒ、０℃−５℃；収率４８％；
ｂ）Ｐｄ（ＯＡｃ）２、Ｐｄ（ｏ−トリル）３、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ＤＭＦ、Ｈ２Ｏ、脱気、マイクロ波、１１０℃、１時間；収率６８％；
ｃ）鉄粉、飽和ＮＨ４ＯＨ水溶液、ＥｔＯＨ、４５℃；収率７２％；
ｄ）２-ブロモ安息香酸メチル、Ｒ−ＢＩＮＡＰ、Ｐｄ２（ｄｂａ）３、Ｃｓ２ＣＯ３、トルエン、脱気、１１０℃、一晩；収率７４％；
ｅ）ＫＯＨ，ＭｅＯＨ：ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（３：１：１）、７０℃、２〜３時間；定量的；
ｆ）保護化アミン、ＨＡＴＵ、ＮＥｔ３、ＤＭＦ、室温、２時間；収率８０％；
ｇ）ＴｓＯＨ（ＨＯＡｃ中１２％ ＴｓＯＨ）、ＥｔＯＨ（水分１０％）；収率４４％；
ｈ）トリブチルビニルスズ、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、トルエン、脱気、１０５℃；収率３１％；
ｉ）Ｐｄ（ＯＡｃ）２、Ｐｄ（ｏ−トリル）３、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、脱気、１００℃；収率ほぼ７０％。
式Ｉの他の化合物は、上記に記載する一般手順または本明細書の実施例に記載する詳細な手順に類似したやり方で製造可能である。本発明の化合物の受容体へのアフィニティーは、好ましくは担体部分により提供される骨格部分を使用して、リガンドの多数のコピーをきわめて接近して提供することによって増強可能である。この部分間に最適の間隔取りがあるこうした多価化合物の提供により受容体への結合が劇的に向上することが示されている。例えば、Ｌｅｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３，４２５５（１９８４）を参照のこと。この多価性と間隔取りは、好適な担体部分またはリンカー単位の選択により制御可能である。こうした部分には、本発明の化合物と関連した官能基と反応可能である多数の官能基を含有する分子支持体が含まれる。当然ながら、多様な担体が使用可能であり、ＢＳＡまたはＨＡＳのようなタンパク質、例えば、ペンタペプチド、デカペプチド、ペンタデカペプチド、等が含まれる多数のペプチドが含まれる。このペプチドまたはタンパク質は、フリーアミノ基を有する望ましい数のアミノ酸残基をその側鎖に含有してよいが、安定した連結を得るために、スルフヒドリル基またはヒドロキシル基のような他の官能基も使用可能である。
受容体ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＣＤＫ複合体、ＴＥＫ、ＣＨＫ１、ＬＣＫ、ＦＡＫ、およびホスホリラーゼキナーゼと関連したプロテインキナーゼ活性をとりわけ強力に調節する、変調させる、または阻害して、血管新生および／または細胞増殖を阻害する化合物が望ましく、本発明の１つの好ましい態様である。さらに本発明は、例えば哺乳動物組織において、本発明の薬剤を投与することによってプロテインキナーゼ活性を変調させるかまたは阻害する方法へ向けられる。キナーゼの活性のようなプロテインキナーゼ活性の変調剤としての本発明の化合物の活性は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが含まれる、当業者に利用可能などの方法によっても測定可能である。活性測定に適したアッセイの例には、Ｐａｒａｓｔ，Ｃ．ら，ＢｉｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１６７８８−１６８０１（１９９８）；Ｊｅｆｆｒｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３１３−３２０（１９９５）；ＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９７／３４８７６；および、ＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９６／１４８４３に記載のものが含まれる。上記の特性は、例えば、以下の実施例において説明する生物学的試験法の１以上を使用することによって評価可能である。
本発明の活性剤は、以下に記載のように医薬組成物へ製剤化可能である。本発明の医薬組成物は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物の有効に変調、調節、または阻害する量と医薬的に許容される不活性な担体または希釈剤を含む。医薬組成物の１つの態様において、本発明の薬剤の有効レベルは、プロテインキナーゼの変調に伴う治療利益をもたらすように提供される。「有効レベル」は、プロテインキナーゼの効果が少なくとも調節されるレベルを意味する。上記の組成物は、投与、例えば非経口または経口投与の形式に適した単位剤形で調製される。
本発明の薬剤は、有効成分としての薬剤（例、式Ｉの化合物）の治療有効量を適切な医薬担体または希釈剤と慣用の手順に従って組み合わせることによって調製される慣用の剤形において投与する。これらの手順は、所望の調製物に適するように、これらの成分を混合、造粒、並びに圧縮または溶解することを伴う場合がある。
利用する医薬担体は、固体でも液体でもよい。固体担体の例は、乳糖、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、等である。液体担体の例は、シロップ、落花生油、オリーブ油、水、等である。同様に、担体または希釈剤には、単独またはワックスとのモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレート、等のような当該技術分野で知られた時間遅延または時間放出材料を含めてよい。
多様な医薬剤形が利用可能である。従って、固体担体を使用するならば、調製物は、錠剤化しても、散剤またはペレット剤の形態かまたはトローチ剤または甘味入り錠剤の形態で硬ゼラチンカプセル剤へ入れてもよい。固体担体の量は変動してよいが、一般的には、約２５ｍｇ〜約１ｇであろう。液体担体を使用するならば、調製物は、シロップ剤、乳剤、点眼剤、軟ゼラチンカプセル剤、アンプルまたはバイアル中の無菌の注射可能な溶液剤または懸濁液剤、または非水性の液体懸濁液剤の形態であろう。
安定な水溶性の剤形を得るには、本発明の薬剤の医薬的に許容される塩をコハク酸またはクエン酸の０．３Ｍ溶液のような、有機酸または無機酸の水溶液に溶かす。可溶性の塩型が利用可能でなければ、本薬剤を好適な共溶媒または共溶媒の組合せに溶かしてよい。好適な共溶媒の例には、限定されないが、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリソルベート８０、グリセリン、等が全容量の０〜６０％に及ぶ濃度で含まれる。例示の態様において、式Ｉの化合物をＤＭＳＯに溶かし、水で希釈する。組成物は、水または等張生理食塩水またはデキストロース溶液のような好適な水性担体中の有効成分の塩型の溶液の形態であってもよい。
本発明の組成物に使用する薬剤の実際の投与量は、使用する特別な複合体、製剤化される特別な組成物、投与の形式と特別な部位、治療される宿主および疾患に従って変動するものである。所与の条件のセットに最適な投与量は、薬剤の実験データに照らした慣用の投与量決定試験を使用して、当業者により確定可能である。経口投与では、一般的に利用される例示の１日用量は、体重ｋｇにつき約０．００１〜約１０００ｍｇであり、より好ましくは体重ｋｇにつき約０．００１〜約５０ｍｇであり、治療の経過に伴って適切な間隔で繰り返す。プロドラッグの投与は、典型的には、完全活性型の重量レベルと化学的に同等である重量レベルで投薬される。
本発明の組成物は、医薬組成物を調製することについて一般的に知られたやり方で製造可能であり、例えば混合、溶解、造粒、糖剤作製、水ひ、乳化、被包化、捕捉または凍結乾燥のような慣用技術を使用する。医薬組成物は、医薬的に使用可能である調製物へ活性化合物を加工処理することを容易にする賦形剤および助剤より選択可能である、１以上の生理学的に許容される担体を使用する慣用の手段で製剤化可能である。
適切な製剤は、選択する投与経路に依存する。注射では、本発明の薬剤を水溶液剤へ、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合可能な緩衝液において製剤化可能である。経粘膜投与では、透過すべき障壁に適した浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られている。
経口投与では、当該技術分野において知られた医薬的に許容される担体と本活性化合物を組み合わせることによって容易に製剤化可能である。そうした担体は、治療される患者による経口摂取用の、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤、等として本発明の化合物を製剤化することを可能にする。経口使用のための医薬調製物は、有効成分（薬剤）と混合して固体賦形剤を使用し、生じる混合物を随意に粉砕し、所望されるならば、錠剤または糖剤の芯を得るために、好適な助剤を追加した後で顆粒の混合物を加工処理して、入手可能である。好適な賦形剤には、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールが含まれる糖；並びに、セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような充填剤が含まれる。所望されるならば、架橋性ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を加えてよい。
糖剤の芯は、好適なコーティング剤で提供される。この目的には、濃縮糖溶液が使用可能であり、これは、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、Ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに好適な有機溶媒または溶媒混合物を随意に含有してよい。識別のためかまたは異なる活性薬剤の組合せを特徴付けるために、錠剤または糖剤のコーティング剤へ染料または色素を加えてよい。
経口で使用可能である医薬調製物には、ゼラチン製のプッシュフィット式カプセル剤、並びにゼラチン製の密封された軟カプセル剤と、グリセロールまたはソルビトールのような可塑剤が含まれる。プッシュフィット式カプセル剤は、乳糖のような充填剤、デンプンのような結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、並びに、随意に安定化剤と混合して有効成分を含有してよい。軟カプセル剤では、脂肪オイル、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような好適な液体に活性薬剤を溶かしても懸濁させてもよい。さらに、安定化剤を加えてよい。経口投与用の製剤は、いずれもそのような投与に適した剤形であるべきである。頬内投与では、組成物は、慣用のやり方で製剤化される錠剤または甘味入り錠剤の形態をとってよい。
鼻腔内または吸入による投与では、本発明による使用の化合物は、好便にも、好適な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスの使用により、加圧パックまたはネブライザーからエアゾールスプレー表出の形態で送達される。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、目盛量を送達するバルブを提供することによって決定可能である。吸入器または通気器、等に使用のゼラチンのカプセル剤およびカートリッジ剤は、本化合物と乳糖またはデンプンのような好適な粉末基剤との粉末混合物を含有して製剤化可能である。
本化合物は、注射による、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に製剤化可能である。注射用の製剤は、単位剤形において、例えば、アンプルまたは多用量容器において、添加の保存剤と一緒に提示可能である。本組成物は、油性または水性の担体中の懸濁液剤、溶液剤または乳剤のような形態をとってよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような製剤用の薬剤を含有してよい。
非経口投与用の医薬製剤には、水溶型の活性化合物の水溶液剤が含まれる。さらに、活性薬剤の懸濁液剤も好適な油性の注射懸濁液剤として調製可能である。好適な親油性の溶媒または担体には、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。水性の注射懸濁液剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液剤の粘度を高める物質を含有してよい。随意に、懸濁液剤は、化合物の溶解度を高めて高濃度の溶液剤の調製を可能にする好適な安定化剤または薬剤を含有してもよい。
眼への投与では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物が、例えば前眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網膜、および強膜が含まれる、眼の角膜および／または強膜および内部領域に化合物が浸透することを可能にするのに十分な時間の間、眼の表面と接触した状態で維持されるように、医薬的に許容される眼科用の担体において該化合物を送達する。医薬的に許容される眼科用の担体は、軟膏、植物油、または被包材料であってよい。本発明の化合物はまた、硝子体液および房水へ直に注射してもよい。
さらに、眼腱下または結膜下注射剤のような、よく知られた許容される方法によって化合物を投与してもよい。眼科系の技術分野でよく知られるように、黄斑は、主に網膜錐状体からなり、網膜中で最大の視力の領域である。テノン嚢またはテノン膜は、強膜上に配置している。結膜３６は、角膜縁の後部にある眼球の短い領域（球状結膜）を覆い、上に畳む（上結膜嚢）かまたは下に畳んで（下結膜嚢）、それぞれ上眼瞼および下眼瞼の内部領域を覆う。結膜は、テノン嚢の上面に配置している。
強膜とテノン嚢は、眼球の外面を規定する。ＡＲＭＤ、ＣＮＶ、網膜症、網膜炎、ブドウ膜炎、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、緑内障、および眼の後部セグメントの他の疾患または状態の治療では、眼科的に許容される医薬活性剤の特定量のデポー製剤を強膜の外面とテノン嚢の下へ直接配置させることが好ましい。さらに、ＡＲＭＤおよびＣＭＥの症例では、このデポー製剤を強膜の外面、テノン嚢の下、そして全体的に黄斑の上に直接配置することが最も好ましい。ニュージーランド白色ウサギを使用した試験では、４，９(１１)−プレグナジエン−１７α，２１−ジオール−３，２０−ジオン−２１−アセテート（ニューハンプシャー州ウィルトンのＳｔｅｒａｌｏｉｄ社より入手可能な血管安定性ステロイド）のデポー薬物をウサギ眼の強膜の外面、テノン嚢の下、そして赤道のやや後方に直接配置した。こうしたデポー薬物は、網膜全体にわたって平均化したある濃度の血管安定性ステロイドをもたらし、注射後の日に測定すると、ウサギ眼の結膜下であるがテノン嚢の上に配置したデポー製剤により送達される同様の濃度より約１０倍高かった。ニュージーランド白色ウサギのテノン嚢がきわめて薄いという事実からすれば、上記の有益な結果は、きわめて予想外である。ヒトの眼のテノン嚢もきわめて薄いことに注目することは重要である。４，９(１１)−プレグナジエン−１７α，２１−ジオール−３，２０−ジオン−２１−アセテートとその関連化合物、４，９(１１)−プレグナジエン−１７α，２１−ジオール−３，２０−ジオンについては、そのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，５９２および５，６７９，６６６号により完全に記載されている。
あるいは、有効成分は、使用前に好適な担体、例えば、発熱物質を含まない滅菌水で構成するための粉末型であってよい。本化合物はまた、例えばココア脂または他のグリセリドのような慣用の坐剤基剤を含有する、坐剤または停留浣腸剤のような直腸用組成物にも製剤化可能である。
上記の製剤に加えて、本化合物は、デポー調製物としても製剤化可能である。そうした長期作用性の製剤は、埋込み（例えば、皮下または筋肉内）筋内注射によるか、または上記の眼腱下または硝子体内の注射により投与可能である。
本発明の特に好ましい態様では、本化合物を生理食塩水（眼科用調製物に通常使用される保存剤および抗菌剤のいずれとも組み合わせた）において局所投与のために調製してよく、点眼型で投与してよい。抗血管新生因子の溶液剤または懸濁液剤は、その純粋型で調製可能であり、１日数回投与可能である。あるいは、上記のように調製する抗血管新生組成物は、角膜へ直接投与してもよい。
好ましい態様では、角膜へ結合する粘膜吸着性ポリマーとともに組成物を調製する。このように、例えば、本化合物は、好適な高分子または疎水性の材料（例えば、許容されるオイル中の乳剤として）またはイオン交換樹脂とともに、または、ほとんど溶けない誘導体として、例えばほとんど溶けない塩として製剤化可能である。さらなる態様では、抗血管新生因子または抗血管新生組成物を慣用のステロイド療法への付加物として利用可能である。
疎水性化合物のための医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性の有機高分子、および水相を含んでなる共溶媒系である。共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であってよい。ＶＰＤは、３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコール、８％（ｗ／ｖ）の非極性界面活性剤、ポリソルベート８０、および６５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３００の溶液であり、無水エタノールで容量調整する。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、５％デキストロース水溶液で１：１希釈したＶＰＤを含有する。この共溶媒系は、疎水性化合物も溶かし、それ自体は、全身投与時に低毒性を生じる。当然ながら、この共溶媒系の比率は、その溶解度および毒性の特徴を壊すことなく、かなり変化させてよい。さらに、共溶媒成分のアイデンティティーを変化させてよく、例えば、ポリソルベート８０の代わりに、他の低毒性の非極性界面活性剤が使用可能であり；ポリエチレングリコールの分画サイズを変化させてよく；ポリエチレングリコールを他の生体適合性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンに置き換えてよく；デキストロースを他の糖または多糖で代用してよい。
あるいは、疎水性医薬化合物の他の送達系も利用可能である。リポソームと乳剤は、疎水性薬物の送達運搬体または担体の既知例である。ジメチルスルホキシドのようなある種の有機溶媒も利用可能であるが、通常は、より大きな毒性の代償がある。さらに、本化合物は、治療薬剤を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過マトリックスのような、持続放出系を使用して送達可能である。様々な持続放出材料が確立され、当業者に知られている。持続放出カプセル剤は、その化学的性質に依存して、数週間〜１００日を越えるまでの間化合物を放出することができる。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化の追加戦略が利用可能である。
本医薬組成物はまた、好適な固相またはゲル相の担体または賦形剤を含んでよい。そうした担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが含まれる。
本発明の化合物のいくつかは、医薬適合性の対イオンとの塩として提供可能である。医薬適合性の塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、等が含まれる、多くの酸とともに形成可能である。塩は、水性溶媒や他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型より溶けやすい傾向がある。
本発明の好ましい化合物の製造について以下の実施例に詳しく記載するが、当業者は、記載される化学反応が本発明のいくつかの他のプロテインキナーゼ阻害剤を製造するのに容易に適用可能であることがわかるだろう。例えば、本発明による非例示の化合物の合成は、当業者に明らかな修飾によって、例えば、干渉性の基を適切に保護すること、当該技術分野で知られた他の好適な試薬へ変更すること、または反応条件の定型的な修飾をすることによって成功裡に実施可能である。あるいは、本明細書に開示するかまたは当該技術分野で知られている他の反応も、本発明の他の化合物を製造するための適用可能性を有するものとして認識されよう。
発明と好ましい態様の詳細な説明
実施例
以下に記載の実施例において、他に特定しなければ、温度はいずれも摂氏（℃）で示し、分量とパーセンテージはすべて重量による。試薬は、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーまたはランカスター・シンセシス社といった市販供給業者より購入し、他に特定しなければ、さらに精製せずに使用した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、トルエン、およびジオキサンは、アルドリッチより密封ボトルで購入し、受領時に使用した。どの溶媒も、他に特定しなければ、当業者によく知られた標準法を使用して精製した。
以下に示す反応は、一般に、アルゴンまたは窒素の陽圧下かまたは乾燥管を用いて、周囲温度で（他に述べなければ）、無水溶媒において行って、反応フラスコには基質および試薬のシリンジを介した導入のためのゴム栓を取り付けた。ガラス容器は、オーブン乾燥、および／または加熱乾燥させた。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、裏面ガラスのシリカゲル６０Ｆ２５４プレート、Ａｎａｌｔｅｃｈ（０．２５ｍｍ）で実施し、適切な溶媒比（ｖ／ｖ）で溶出させ、適宜表示する。反応はＴＬＣにより検定し、出発材料の消費により判定して止めた。
ＴＬＣプレートの可視化は、ｐ−アニスアルデヒドのスプレー試薬またはホスホモリブデン酸試薬（アルドリッチ・ケミカル、エタノール中２０重量％）で行って、加熱して活性化した。後処理は、典型的には、反応溶媒または抽出溶媒で反応容量を倍にしてから、他に特定しなければ、抽出容量の２５容量％を使用して指定の水溶液で洗浄することによって行った。生成物の溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後で濾過し、減圧下にロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させて、溶媒と認められるものを真空で除去した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｔｉｌｌら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４３，２９２３（１９７８））は、他に特定しなければ、Ｂａｋｅｒグレードのフラッシュシリカゲル（４７〜６１μｍ）と約２０：１〜５０：１のシリカゲル：粗製材料比を使用して行った。水素化分解は、実施例に示す気圧かまたは周囲圧で行なった。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚで作動するＢｒｕｋｅｒ機器で記録して、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、７５ＭＨｚで作動する同機器で記録した。ＮＭＲスペクトルは、参照標準（７．２５ｐｐｍおよび７７．００ｐｐｍ）としてのクロロホルムまたはＣＤ３ＯＤ（３．４および４．８ｐｐｍと４９．３ｐｐｍ）、または内部にはテトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）を適宜使用して、ＣＤＣｌ３溶液として入手した（ｐｐｍで報告する）。他のＮＭＲ溶媒も必要に応じて使用した。ピーク多重度を報告する場合、以下の略号を使用する：ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｍ（多重項）、ｂｒ（広がっている）、ｄｄ（二重項の二重項）、ｄｔ（三重項の二重項）。カップリング定数は、示す場合、ヘルツ（Ｈｚ）で報告する。
赤外線（ＩＲ）スペクトルはパーキン・エルマーＦＴ−ＩＲ分光計で、純オイル、ＫＢｒペレットとして、またはＣＤＣｌ３溶液として報告し、示す場合、波数（ｃｍ−１）で報告する。質量スペクトルは、ＬＳＩＭＳまたはエレクトロスプレーを使用して入手した。どの融点（ｍｐ）も、補正していない。
実施例１（ａ）２−（４−クロロ−２−ニトロ−フェニル）−マロン酸ジメチルエステル
Figure 2006515589
ＮａＨ（３６．０ｇ，１５００ミリモル）のＮＭＰ（１．０Ｌ）撹拌スラリーへマロン酸ジメチル（１３７．４ｍＬ，１２００ミリモル）を滴下した。この反応物を必要に応じて冷やし、内部温度を３０℃未満に維持した。ガスの発生が止んだ後で、この反応物へ２，４−ジクロロニトロベンゼン（１９２ｇ，１０００ミリモル）を加えた。これを注意深く６５℃まで加熱すると、ＨＰＬＣにより判定されるように、反応が完了した。この反応物を室温へ冷やしてから、１５０ｍＬの濃ＨＣｌと混合した５００ｍＬの氷へ注いだ。１Ｎ ＮａＯＨを使用して、水層のｐＨを中性へ調整した。粗フリットフィルターを通して濾過することによって固形物を取り出し、水（３Ｌ）で濯いだ。この黄色の固形物を一晩乾燥させた。収量２６１．５ｇ，９１％。
実施例１（ｂ）（４−クロロ−２−ニトロ−フェニル）−酢酸メチルエステル
Figure 2006515589
２−（４−クロロ−２−ニトロ−フェニル）−マロン酸ジメチルエステル（１９５ｇ，６７９．４ミリモル）の水（１００ｍＬ）およびＮＭＰ（１０００ｍＬ）溶液を加熱して３．５時間還流させた。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去してオイルとした。このオイルをＥｔＯＡｃに溶かしてから、水（５ｘ３００ｍＬ）で洗浄した。次いで、水層をＥｔＯＡｃ（４ｘ３００ｍＬ）で抽出した。この有機物を水で洗浄した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。固形物を濾過により除去した後で、溶媒を蒸発させて、所望の生成物（１６０．０ｇ，９５％）を橙色／茶褐色の固形物として得た。
実施例１（ｃ）（２−アセチルアミノ−４−クロロ−フェニル）−酢酸メチルエステル
Figure 2006515589
アルゴン充填フラスコに（４−クロロ−２−ニトロ−フェニル）−酢酸メチルエステル（４０ｇ，１７５ミリモル）、１０％ Ｐｄ／Ｃ（２．５ｇ）、無水酢酸（６４ｍＬ，６７７ミリモル）、水（９ｍＬ）、および酢酸（１５０ｍＬ）を入れた。このフラスコに３０ＰＳＩで水素ガスを真空通過させ、激しく振り混ぜた。２時間後、さらに１０％ Ｐｄ／Ｃ（２ｇ）を加え、全部で４時間の反応時間の後で反応を完了した。１０％ Ｐｄ／Ｃを濾過により除去し、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去した。
実施例１（ｄ）６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル
Figure 2006515589
９０℃で撹拌する（２−アセチルアミノ−４−クロロ−フェニル）−酢酸メチルエステル（３２．０ｇ，１３３ミリモル）の酢酸（２００ｍＬ）溶液へ亜硝酸ｔｅｒｔ−ブチル（２０．５ｍＬ，１７２．３ミリモル）を１時間にわたり加えた。この反応物を水（１．４Ｌ）へ注ぎ、固形物を濾過により回収した。この黄色の沈殿をＥｔＯＡｃに溶かしてから、飽和ＮａＣｌで洗浄した。この有機物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して固形物とした。この固形物をヘキサンで摩砕し、濾過して、所望の材料（２１．６３ｇ，７７％）を得た。
実施例１（ｅ）６−クロロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル
Figure 2006515589
６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（８．３ｇ，３９．５ミリモル）のＭｅＣＮ（２００ｍＬ）スラリーへ３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（５．４ｍＬ，５９．３ミリモル）とｐ−トルエンスルホン酸（２３７ｍｇ，１．２５ミリモル）を加えた。この反応物を１０分間撹拌させた後で、飽和ＮａＨＣＯ３（１ｍＬ）を加え、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去して１００ｍＬの容量とした。この混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水（５０ｍＬ）に次いで飽和ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。固形物を濾過により除去した後で、有機層をロータリーエバポレーションにより濃縮してオイルとした。ヘキサンを使用してこのオイルより生成物を沈殿させて、所望の生成物（７．６６７ｇ，収率６６％）を得た。
実施例１（ｆ）６−（２−メトキシカルボニル−フェニルアミノ）−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル
Figure 2006515589
６−クロロ−１−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（２．９４ｇ，１０．０ミリモル）の１，２−ジメトキシエタン（３０ｍＬ）溶液へＫ３ＰＯ４（５．３２ｇ，２５．０ミリモル）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（４５９ｍｇ，０．０５ミリモル）、２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）ビフェニル（７０１ｍｇ，２．０ミリモル）、およびアントラニル酸メチル（２．５９ｍＬ，２０．０ミリモル）を加えた。この溶液にアルゴンを３回真空通過させた後で、８０℃まで１８時間加熱した。この反応物を室温へ冷やし、固形物を濾過により取り出した。この固形物を酢酸エチルで洗浄後、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残留オイルをクロマトグラフ処理（１５０ｇシリカゲル、１０〜３０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）して、１．２３ｇ（５１％）の所望の生成物を得た。
実施例１（ｇ）６−（２−メトキシカルボニル−フェニルアミノ）−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸
Figure 2006515589
６−（２−メトキシカルボニル−フェニルアミノ）−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（２．０５ｇ，５ミリモル）のメタノール（１８ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（８ｍＬ）溶液へ水酸化ナトリウム（０．３０ｇ，７．５ミリモル）の水（２．７ｍＬ）溶液を加えた。この反応物を室温で３時間撹拌してから、１Ｎ ＨＣｌで１のｐＨへ中和した。この混合物をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）と水（２５ｍＬ）で希釈した。層を分離させた後で、水層をＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ２５ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機抽出物を飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）で洗浄してから、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。固形物を濾過し、液体を濃縮してオイルとした。生成物をＥｔＯＡｃおよびヘキサンより結晶させて、所望の生成物（１．６１６ｇ，８２％）を得た。
実施例１（ｈ）２−［３−メチルカルバモイル−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル
Figure 2006515589
６−（２−メトキシカルボニル−フェニルアミノ）−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（０．５０ｇ，１．２７ミリモル）のＤＭＦ溶液へトリエチルアミン（０．４２ｍＬ，３．０４ミリモル）、メチルアミン（１．９ｍＬ，３．８１ミリモル）、およびＨＡＴＵ（０．５７８ｇ，１．５２ミリモル）を加えた。この反応物を３時間撹拌してから、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗製オイルをクロマトグラフ処理（５０ｇシリカゲル、２５〜５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）して、所望の生成物（２１４ｍｇ，４２％）を得た。
実施例１（ｉ）２−［３−メチルカルバモイル−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸
Figure 2006515589
２−［３−メチルカルバモイル−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル（０．２０ｇ，０．４９ミリモル）のメタノール（１．４ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（０．６ｍＬ）溶液へ水酸化ナトリウム（５９ｍｇ，１．４７ミリモル）の水（０．３ｍＬ）溶液を加えた。この反応物を６０℃まで１時間加熱してから、室温へ冷やした。ｐＨを２Ｎ ＨＣｌで２のｐＨへ調整した。ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）を加え、層を分離させた。水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ２０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせた。水（１５ｍＬ）で洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。固形物を濾過して除き、有機物を蒸発させて、黄色の固形物（１９３ｍｇ，１００％）を得た。
実施例１（ｊ）６−（２−プロプ−２−イニルカルバモイル−フェニルアミノ）−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルアミド
Figure 2006515589
２−［３−メチルカルバモイル−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（１５０ｍｇ，０．３８１ミリモル）のＤＭＦ（３．６ｍＬ）溶液へプロパルジルアミン（０．０５２ｍＬ，０．７６１ミリモル）、ＴＥＡ（０．２６４ｍＬ，１．９０ミリモル）、およびＨＡＴＵ（２１７ｍｇ、０．５７１ミリモル）を加えた。この反応物を４時間撹拌してから、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）で希釈した。層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を飽和ＮａＣｌ（１５ｍＬ）で洗浄してから、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。固形物を濾過により除去し、液体をロータリーエバポレーションにより濃縮して黄色のオイル（１６４ｍｇ，１００％）とした。
実施例１（ｋ）６−（２−プロプ−２−イニルカルバモイル−フェニルアミノ）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルアミド
Figure 2006515589
６−（２−プロプ−２−イニルカルバモイル−フェニルアミノ）−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルアミド（３０ｍｇ）を１．５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２：ＴＦＡ：トリエチルシランの９０：１０：１混合物に溶かし、加熱して２時間還流させた。この溶液をトルエン（４０ｍＬ）で希釈し、ロータリーエバポレーションにより濃縮してオイルとした。このオイルをＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、０．２ミクロンのシリンジフィルターを使用して濾過した。分取用ＨＰＬＣを使用して、所望の化合物（１２ｍｇ，５０％）を単離した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ１９Ｈ１７Ｎ５Ｏ２・１．０ＭｅＯＨ・０．１ＴＦＡの計算値：Ｃ，６２．０８；Ｈ，５．４４；Ｎ，１７．９２。実測値：Ｃ，６１．７８；Ｈ，５．４５；Ｎ，１８．０４。
実施例２（ａ）［６−クロロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−メタノール
Figure 2006515589
−７８℃へ冷やした６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（２．９４ｇ，１０．０ミリモル）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）溶液へＤＩＢＡＬ−Ｈ（３．５６ｍＬ，２０．０ミリモル）をゆっくり加えた。この添加が完了した後で、反応物を室温まで温めると、ＨＰＬＣは１０％の出発材料が残っていることを示した。次いで、さらにＤＩＢＡＬ−Ｈ（０．３５ｍＬ）を加え、１０分間撹拌した。この反応物をＥｔＯＡｃ（１０００ｍＬ）で希釈し、１Ｎ ＨＣｌ（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。これをさらに１Ｎ ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）と、次いで飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）で洗浄した。有機物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過してから、濃縮して白色の固形物（２．６５ｇ，９９．５％）とした。
実施例２（ｂ）６−クロロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルバルデヒド
Figure 2006515589
［６−クロロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−メタノール（１．７５ｇ，６．５８ミリモル）、ＩＢＸ（２．７６ｇ，９．８７ミリモル）、およびＤＭＳＯ（２７ｍＬ）の溶液を一晩撹拌した。この反応物をＥｔＯＡｃと水で希釈した。層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ１００ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）で洗浄した。この有機物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過してから、濃縮して固形物とした。この固形物をＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、濾過した。この有機物を蒸発させて、所望の生成物（１．７０７ｇ，９２％）を得た。
実施例２（ｃ）１−（６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−エタノール
Figure 2006515589
４−エチル−２−メチルピリジン（０．４５８ｇ，３．７９ミリモル）のＴＨＦ（４ｍＬ）撹拌溶液へ−５０℃でブチルリチウム（１．５ｍＬ，２．５Ｍ，３．７９ミリモル）をゆっくり加え、１０分間撹拌する。この反応物へ６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルバルデヒド（０．５ｇ，１．８９ミリモル）のＴＨＦ（４ｍＬ）溶液をゆっくり加える。１０分間撹拌後、この反応物を１Ｎクエン酸（１０ｍＬ）で失活させた。この混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）、および飽和ＮａＣｌ（１０ｍＬ）で希釈した。層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ１５ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、飽和ＮａＣｌ（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後、固形物を濾過により除去し、液体をロータリーエバポレーションにより濃縮してオイルとした。クロマトグラフィー（４０ｇシリカゲル、６０〜１００％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、所望の生成物（１４２ｍｇ，３２％）を得て、６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルバルデヒド（３４８ｍｇ）を回収した。
実施例２（ｄ）６−クロロ−３−［２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール
Figure 2006515589
１−（６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−エタノール（２３２ｍｇ、０．６０ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２撹拌溶液へＴＥＡ（０．２５ｍＬ，１．８１ミリモル）と塩化メシル（０．０７０ｍＬ，０．９０ミリモル）を加えた。この反応物を３０分間撹拌してから、ＤＢＵ（２ｍＬ）を加えた。この反応物を１８時間還流させてから、４０ｍＬの１Ｎクエン酸で失活させた。層を分離させ、水層を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。クロマトグラフィー（１２ｇシリカゲル、５０〜７０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による精製によって、所望の化合物（１３５ｍｇ，７１％）を得た。
実施例２（ｅ）２−｛３−［２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−安息香酸メチルエステル
Figure 2006515589
１，２−ジメトキシメタン（２ｍＬ）を６−クロロ−３−［２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール（１３０ｍｇ，０．３５４ミリモル）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（１６ｍｇ，０．０１８ミリモル）、−（ジシクロヘキシルホスフィノ）ビフェニル（２５ｍｇ，０．０７１ミリモル）、Ｋ３ＰＯ４（０．１８８ｇ，０．８８５ミリモル）、およびアントラニル酸メチル（０．０９２ｍＬ，０．７１ミリモル）へ加えた。この反応物にアルゴン（４ｘ）を真空通過させてから、８０℃まで１９時間加熱した。この反応物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、シリカゲルプラグに通して濾過した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で洗浄後、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。粗製オイルをクロマトグラフィー（４０ｇシリカゲル、３０〜４０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、所望の生成物（５４ｍｇ，３２％）を得た。
実施例２（ｆ）２−｛３−［２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−安息香酸
Figure 2006515589
２−｛３−［２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−安息香酸メチルエステル（５０ｍｇ，０．１０４ミリモル）のメタノール（０．４２ｍＬ）およびＴＨＦ（０．１０ｍＬ）溶液へ水酸化ナトリウム（１２ｍｇ，０．３１１ミリモル）の水（０．０５ｍＬ）溶液を加えた。この溶液を６０℃まで３．５時間加熱してから、飽和ＮＨ４Ｃｌで中和した。この反応物を水（２０ｍＬ）で希釈してから、ＥｔＯＡｃ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物をはじめにＮａ２ＳＯ４で乾燥させてから、固形物を濾過により除去した。溶媒を除去するロータリーエバポレーションの後で所望の生成物（４８．７ｍｇ，１００％）を回収した。
実施例２（ｇ）２−｛３−［２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−プロプ−２−イニル−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−｛３−［２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−安息香酸（４９ｍｇ，０．１０５ミリモル）へ２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２：ＴＦＡ：ＴＥＳの９０：１０：１混合物を加えた。この反応物を還流で１時間撹拌してから、トルエン（２０ｍＬ）で希釈した。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去して、濃厚なオイルを得た。このオイルをＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、この溶液へＴＥＡ（０．０７２ｍＬ，０．５２ミリモル）、プロパルジルアミン（０．０１４ｍＬ，０．２０８ミリモル）、およびＨＡＴＵ（５９ｍｇ，０．１５６ミリモル）を加えた。この反応物を３時間撹拌してから、分取用ＨＰＬＣにより精製して、所望の生成物（２９ｍｇ，６６％）を得た。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２６Ｈ２３Ｎ５Ｏ・０．３Ｈ２Ｏ・１．２ＴＦＡの計算値：Ｃ，６０．５１；Ｈ，４．４３；Ｎ，１２．４２。実測値：Ｃ，６０．３８；Ｈ，４．７３；Ｎ，１２．４４。
実施例２（ｈ）Ｎ−シクロプロピル−２−｛３−［（Ｅ）−２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンズアミド
Figure 2006515589
表題化合物は、１−（６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−エタノールを製造する工程において４−エチル−２−メチル−ピリジンの代わりに２，４−ジメチル−ピリジンを用いて、そしてこの順序の最終工程においてプロパルジルアミンの代わりにシクロプロピルアミンを用いて、上記の２−｛３−［２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−プロプ−２−イニル−ベンズアミドと同様に製造した。
Figure 2006515589
実施例３（ａ）Ｎ−メトキシ−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、塩酸Ｏ−メチル−ヒドロキシルアミン（１５ｍｇ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．４２ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、２１．６ｍｇ（６７％）の表題化合物を黄色の固形物として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｂ）Ｎ−アリルオキシ−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、塩酸Ｏ−アリル−ヒドロキシルアミン（１８．３ｍｇ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．４２ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、２５．５ｍｇ（７４％）の表題化合物を黄色の固形物として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｃ）Ｎ−イソプロピル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、塩酸Ｏ−イソプロピル−ヒドロキシルアミン（１８．７ｍｇ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．４２ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、１７．４ｍｇ（５０％）の表題化合物を黄色の固形物として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｄ）Ｎ−シクロプロピル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、シクロプロピルアミン（１１．６μＬ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．２５ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、１１．７ｍｇ（３５％）の表題化合物を黄色の固形物として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｆ）１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸Ｎ’−（１−｛２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−フェニル｝−メタノイル）−ヒドラジド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸ヒドラジド（２３．３ｍｇ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．４２ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、１６．１ｍｇ（４０％）の表題化合物を黄色の固形物として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｇ）Ｎ−ベンジル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、ベンジルアミン（１８．２μＬ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．４２ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、４５．２ｍｇ（７６％）の表題化合物をＴＦＡ塩（１．５Ｈ２Ｏ，２．１ＴＦＡ，有効分子量＝７１１．９８）として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｈ）Ｎ−（２−メトキシ−ベンジル）−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、ｏ−メトキシベンジルアミン（２１．８μＬ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．４２ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、４６ｍｇ（８１％）の表題化合物をＴＦＡ塩（１．５Ｈ２Ｏ，１．５ＴＦＡ，有効分子量＝６７３．５９）として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｉ）Ｎ−フラン−２−イルメチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、Ｃ−フラン−２−イル−メチルアミン（１９μＬ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．４２ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、４５ｍｇ（８５％）の表題化合物をＴＦＡ塩（１．５Ｈ２Ｏ，１．５ＴＦＡ，有効分子量＝６３３．５２）として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｊ）Ｎ−シクロブチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、シクロブチルアミン（１８．２μＬ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．４２ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、４３．２ｍｇ（９２％）の表題化合物をＴＦＡ塩（１．５Ｈ２Ｏ，１．１ＴＦＡ，有効分子量＝５６１．９２）として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｋ）Ｎ−（２−メチル−アリル）−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）に溶かした２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（５０．０ｍｇ，０．０８４ミリモル）、２−メチル−アリルアミン（１６．４μＬ，０．１７ミリモル）、トリエチルアミン（５８μｌ，０．４２ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（４８ｍｇ，０．１３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、４５ｍｇ（９１％）の表題化合物をＴＦＡ塩（１．６Ｈ２Ｏ，１．３ＴＦＡ，有効分子量＝５８６．５３）として得た。
Figure 2006515589
実施例３（ｌ）６−ニトロ−３−ピリジン−２−イルエチニル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール
Figure 2006515589
３−ヨード−６−ニトロ−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール（８３８ｍｇ，２．０ミリモル）、２−エチニル−ピリジン（２４２μＬ，２．４ミリモル）、およびトリエチルアミン（６．０ｍＬ）の混合物を脱気し、アルゴンを通過させてから、ＣｕＩ（８ｍｇ，０．０４２ミリモル）とＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１６ｍｇ，０．０２３ミリモル）で処理した。生じる混合物を室温で一晩撹拌すると、この時点でＨＰＬＣは、すべての出発材料が消費されたことを示した。この混合物を、揮発物質の高真空でのストリッピングにより精製してから、次いで酢酸エチルで溶出させるシリカのプラグに通した。生じる生成物をさらに精製せずに次の工程に使用した。ＥＳＩＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）：３９５．１。
実施例３（ｍ）３−ピリジン−２−イルエチニル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミン
Figure 2006515589
６−ニトロ−３−ピリジン−２−イルエチニル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール（２ミリモル）、ＳｎＣｌ２（１．３７ｇ，６．０ミリモル）、水（０．５ｍＬ）、およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）の混合物を６０℃の油浴に３０分間撹拌すると、この時点でＨＰＬＣは、完全な還元を示した。生じる混合物からメタノールを取り除き、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に懸濁させて、１Ｍ ＮａＯＨ（１８ｍＬ）で希釈した。生じるエマルジョンをＥｔＯＡｃ（１０ｘ２５ｍＬ）で穏やかに抽出した。合わせた有機物を１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、ＥｔＯＡｃで溶出させるシリカのパッドに通して濾過した。粗生成物の収量は、２工程で７０１ｍｇであり、９６重量％の回収であった。ＥＳＩＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）：３６５．１。
実施例３（ｎ）２−［３−ピリジン−２−イルエチニル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル
Figure 2006515589
３−ピリジン−２−イルエチニル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミン（５６０ｍｇ，１．５４ミリモル）、安息香酸２−ブロモメチル（６４７．５μＬ，４．６１ミリモル）、ビフェニル−２−イル−ジシクロヘキシル−ホスファン（１０７．８ｍｇ，０．３０８ミリモル）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（７０．５ｍｇ，０．０７６８ミリモル）、Ｋ３ＰＯ４（８１６ｍｇ，３．８４４ミリモル）、およびジメトキシエタン（１．７ｍｌ）の混合物に窒素を真空通過させてから、７０℃の油浴で２４時間加熱した。この黒色の混合物を塩化メチレンで希釈し、濾過し、濃縮して、クロマトグラフ処理（２０％〜４０％酢酸エチル／ヘキサン）した。黄色／橙色のオイルの収量は２６０ｍｇで、３回の工程で３５％であった。
実施例３（ｏ）２−［３−ピリジン−２−イルエチニル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸
Figure 2006515589
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）、ＭｅＯＨ（２．２５ｍＬ）、および水（０．５ｍＬ）に溶かしたＮａＯＨ（６２ｍｇ，１．５５ミリモル）の溶液へ２−［３−ピリジン−２−イルエチニル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル（２５３ｍｇ，０．５１７ミリモル）を加えた。この反応物を室温で１時間撹拌すると、この時点でＨＰＬＣは、すべての出発材料が消費されたことを示した。この反応物を１Ｎ ＨＣｌで中和し、酢酸エチルで抽出し、次いでこれを塩水で洗浄して、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。真空で濃縮後、２４９ｍｇの黄色の固形物を得た（９９重量％の回収）。この材料をさらに精製せずに使用した。ＥＳＩＭＳ（Ｍ−Ｈ−）：４８３．０。
実施例３（ｐ）２−［３−ピリジン−２−イルエチニル−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸
Figure 2006515589
２−［３−ピリジン−２−イルエチニル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（２３１ｍｇ，０．４７７ミリモル）、ＴＨＦ中１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウム（３．８ｍＬ，３．８１６ミリモル）、およびエチレンジアミン（１２７μＬ，１．９０８ミリモル）の溶液を８０℃の油浴で６時間撹拌した。この反応物を酢酸（２１８μＬ，３．８１６ミリモル）で失活させ、水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（１０ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。濃縮後、固形物が生じ、これをＣＨ２Ｃｌ２で摩砕して、生成物（１２４ｍｇ，７３％）を黄色の粉末として得た。ＥＳＩＭＳ（Ｍ−Ｈ−）：３５３．０。
実施例３（ｑ）Ｎ−プロプ−２−イニル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶かした２−（３−ピリジン−２−イルエチニル−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）−安息香酸（４１ｍｇ，０．１１７ミリモル）、プロパルジルアミン（２４μＬ，０．３５ミリモル）、トリエチルアミン（８１μＬ，０．５８ミリモル）の溶液をＨＡＴＵ（８９ｍｇ，０．２３３ミリモル）で処理した。この混合物を一晩撹拌してから、逆相ＨＰＬＣにより精製して、２７ｍｇ（５９％）の表題化合物を黄色の固形物として得た。
Figure 2006515589
実施例４（ａ）：２−ブロモ−４，６−ジメチル−ピリジン
Figure 2006515589
４８％ ＨＢｒ（水）溶液（アルドリッチ、６５ｍＬ，１．２モル、１０当量）を−５℃へ冷やし、４，６−ジメチル−ピリジン−２−イルアミン（アルドリッチ、１５．０ｇ，０．１２モル、１．０当量）で処理した。この濃白色の塩混合物を機械撹拌子で撹拌しながら、臭素（アルドリッチ、１９．７ｍＬ，０．３８モル、３．１当量）を滴下した。生じる赤色の混合物をＮａＮＯ２（アルドリッチ、２２．１ｇ，０．３２モル、２．６当量）の水溶液（３２ｍＬ Ｈ２Ｏ）で１時間にわたり処理した。温度をこの亜硝酸塩添加の間５℃未満に維持してから、２時間にわたり徐々に２０℃へ温めた。この反応混合物をＮａＯＨ（水溶液）でｐＨ１４へ調整し、ＭＴＢＥで抽出した。この有機抽出物を水、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して、減圧で濃縮した。この粗生成物（２９ｇの赤色オイル）をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、３５０ｇ）によって精製し、２〜７％酢酸エチル／シクロヘキサンで溶出させて、橙色のオイル（１１．０ｇ，４８％）を得た。
Figure 2006515589
実施例４（ｂ）：３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−６−ニトロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール
Figure 2006515589
２−ブロモ−４，６−ジメチル−ピリジン（２．４２ｇ、１３ミリモル）、３−ビニル−６−ニトロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール（２．３７ｇ，８．６７ミリモル）、酢酸パラジウム（０．１４５ｇ，０．６５ミリモル）、トリ−オルト−トリルホスフィン（０．７９１ｇ，２．６ミリモル）、およびジイソプロピルエチルアミン（２．４ｍＬ，１３．８ミリモル）の水性ＤＭＦ（８５％，３４．５ｍＬ）懸濁液をアルゴンの泡立てで５分間脱気することに続いて５分間音波処理し、その後でマイクロ波装置（３００ワット、１０％の出力）において１１０℃で４０分間加熱した。冷却後、この混合物を冷水中へ滴下した。生じる黄色の沈殿を濾過により採取した。この固形物を酢酸エチルに溶かし、乾燥（硫酸ナトリウム）させて、減圧で濃縮した。クロロホルムおよびヘキサン（１：１）の混合物中の０〜２０％酢酸エチルの勾配液を溶出液として使用するシリカゲルで残渣を精製した。クロマトグラフィーからの生成物をＭＴＢＥ／ヘキサンで摩砕して、きれいな生成物を黄色の固形物として得た。母液を同じやり方でシリカゲルにより再精製し、摩砕を続けて、よりきれいな生成物を収率６８％で得た。
Figure 2006515589
実施例５：３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミン
Figure 2006515589
２５ｍｌのエタノール中の３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−６−ニトロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール（４．２２ｇ，１１．６ミリモル）、鉄粉（２．７１ｇ，４８．５１ミリモル）および飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２５ｍｌ）の懸濁液を４５℃で１８時間加熱した。この反応物を冷やし、濾紙を通して濾過し、メタノールで洗浄した。溶媒を減圧で除去し、水層をＥｔＯＡｃ（２ｘ）で抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧で濃縮して、４．０２ｇ（定量的）の錆び色の固形物を得て、さらに精製せずに使用した。
Figure 2006515589
実施例６：２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル
Figure 2006515589
３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミン（８７０ｍｇ，２．５ミリモル）、２−ブロモ−安息香酸メチルエステル（０．４４ｍｌ，３．１２ミリモル）、Ｒ−ＢＩＮＡＰ（７８ｍｇ，０．１２５ミリモル）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（２９ｍｇ，０．０３ミリモル）、および炭酸セシウム（１．２２ｇ，３．７５ミリモル）のトルエン（６ｍｌ）撹拌懸濁液を脱気して、１００℃で１８時間加熱した。この反応混合物を冷やし、飽和ＮａＨＣＯ３へ注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２ｘ）で抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させて、減圧で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２中５〜１０％ ＥｔＯＡｃの勾配液で溶出させるシリカゲルでフラッシュクロマトグラフ処理して、９６４ｍｇ（８０％）の黄色のフォームを得た。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２９Ｈ３０Ｎ４Ｏ３・０．１５ＥｔＯＡｃの計算値：Ｃ，７１．７１；Ｈ，６．３４；Ｎ，１１．３０。実測値：Ｃ，７１．６０；Ｈ，６．１４；Ｎ，１１．３７。
実施例７：２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−（１−テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル（１．９８ｇ，４．１１ミリモル）のＴＨＦ：ＭｅＯＨ（１２ｍｌ，３：１）撹拌溶液へＨ２Ｏ（３ｍｌ）に溶かした水酸化カリウム（１．１５ｇ，２０．５ミリモル）を加えた。この反応物を７０℃で２時間加熱し、冷やし、約５ｍｌまで減圧で濃縮して、より多くの水で希釈した。この溶液を２Ｎ ＨＣｌで中和し、沈殿を濾過により採取し、水で洗浄して、２．００ｇ（定量的）の明黄色の固形物を得た。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２８Ｈ２８Ｎ４Ｏ３・０．５ＫＯＨの計算値：Ｃ，６７．７２；Ｈ，５．７９；Ｎ，１１．２８。実測値：Ｃ，６７．６５；Ｈ，５．８８；Ｎ，１１．０７。
実施例８：２−｛３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−安息香酸ｐ−トルエンスルホネート
Figure 2006515589
水性メタノール（９０％，２０ｍＬ）中の２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸（２ミリモル）およびｐ−トルエンスルホン酸（１０ミリモル）の混合物を７０℃で１８時間撹拌した。冷却後、生じる濃厚な黄色のスラリーを濾過し、固形物をメタノールで洗浄して、トシラート塩としての２−｛３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−安息香酸を収率８５％で薄黄色の固形物として得た。
Figure 2006515589
実施例９：Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニルアミンと２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸を使用すること以外は、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号０９／６０９，３３５（２０００年６月３０日出願）中の実施例３３（ａ）工程（ｖ）の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ３８Ｈ４７Ｎ５Ｏ３Ｓｉ・０．７Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ，６８．８９；Ｈ，７．３６；Ｎ，１０．５７。実測値：Ｃ，６８．９９；Ｈ，７．３６；Ｎ，１０．２１。
実施例１０：２−｛３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド（７３７ｍｇ，１．１３ミリモル）およびｐ−トルエン−スルホン酸（８．２ｍｌ，ＨＯＡｃ中１２％）の撹拌溶液を７０℃で２時間加熱した。この反応物を冷やし、飽和ＮａＨＣＯ３へ慎重に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２ｘ）で抽出した。合わせた有機層を塩水（２ｘ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させて、減圧で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（１：１：０．１）で溶出させるシリカゲルでフラッシュクロマトグラフ処理して、２２５ｍｇ（４４％）の白色の固形物を得た。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２７Ｈ２５Ｎ５Ｏ２・１．１Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ，６８．８０；Ｈ，５．８２；Ｎ，１４．８６。実測値：Ｃ，６８．７２；Ｈ，５．８１；Ｎ，１４．６５。
実施例１１：４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニルアミン
Figure 2006515589
既知の４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イン−１−オール（３．１４ｇ，１５．７ミリモル）のＴＨＦ（５０ｍｌ）氷冷、撹拌溶液へＤＢＵ（２．６ｍｌ，１７．４ミリモル）とＤＰＰＡ（３．８ｍｌ，１７．７ミリモル）を加えた。この溶液を室温へ温め、不活性気体下に一晩撹拌した。この反応物を飽和ＮａＨＣＯ３へ注ぎ、層を分離させた。水層をＥｔＯＡｃ（２ｘ）で再抽出し、合わせた有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、真空で濃縮した。ＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶かしたこの粗製アジドへトリフェニルホスフィン（４．６１ｇ，１７．６ミリモル）を加え、Ｈ２Ｏ（０．４４ｍｌ）の添加を続けた。生じる溶液を室温で一晩撹拌し、減圧で濃縮し、残渣をＥｔ２Ｏ／石油エーテルの１：１混合物にスラリーとした。固形物を除去し、濾液を濃縮して、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１９：１）で溶出させるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、琥珀色のオイルを得た。
Figure 2006515589
実施例１２：２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−Ｎ−プロプ−２−イニル−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸とプロパルジルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ３１Ｈ３１Ｎ５Ｏ２・１．１Ｈ２Ｏ・０．３ＴＢＭＥの計算値：Ｃ，７０．７３；Ｈ，６．７２；Ｎ，１２．６９。実測値：Ｃ，７０．５６；Ｈ，６．４５；Ｎ，１２．４９。
実施例１３：Ｎ−（プロプ−２−イニル）−２−｛３−［（Ｅ）−２−（２，４−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりにＮ−（３−シクロプロピル−プロプ−２−イニル）−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例１４：２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−Ｎ−（２−メチル−アリル）−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸と２−メチル−アリルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ３２Ｈ３５Ｎ５Ｏ２・１．０９Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ，７１．００；Ｈ，６．９２；Ｎ，１２．９４。実測値：Ｃ，７１．４０；Ｈ，６．８９；Ｎ，１２．５４。
実施例１５：２−｛３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−（２−メチル−アリル）−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりにＮ−（２−メチル−アリル）−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
代わりの合成法
Figure 2006515589
実施例１６（ａ）：シクロプロピル−プロプ−２−イン−１−オール
Figure 2006515589
−１０℃の氷浴に冷やした７０ｍＬの無水ＴＨＦを含有する丸底フラスコへ６５．６ｍＬのヘキサン中１．６Ｍ ＢｕＬｉ（１０５ミリモル）を加えた。温度を−１０〜０℃に維持しながら、５−クロロ−ペント−１−イン（５．１３ｇ，５０ミリモル）をゆっくり導入した。この混合物をアルゴン下に０℃で２時間撹拌した。パラホルムアルデヒド（３ｇ，１００ミリモル）を固形物として加えた。この混合物を室温までゆっくり温めて、アルゴン下に一晩撹拌した。翌日、水を加え、約５０ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ水溶液を加えた。この混合物を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して、濃縮した。この粗生成物をヘキサン中２０％ Ｅｔ２Ｏで溶出させるカラムにより精製して、３ｇ（収率６２％）の３−シクロプロピル−プロプ−２−イン−１−オールをオイルとして得た。
Figure 2006515589
実施例１６（ｂ）：３−シクロプロピル−プロプ−２−イニルアジド
Figure 2006515589
３−シクロプロピル−プロプ−２−イン−１−オール（３．２８ｇ，３４．１ミリモル）を４０ｍＬのトルエンに溶かし、温度を水浴で維持しながら、ＤＰＰＡ（１１．２６ｇ，４０．９ミリモル）に続いてＤＢＵ（６．２４ｇ，４０．９ミリモル）を加えた。この混合物を室温で１時間撹拌し、１００ｍＬのヘキサンと１５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。この混合物を水で４回、塩水で１回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して、冷水浴付きの回転蒸発で濃縮して、ほとんどの有機溶媒を除去し、いくらかのトルエン（揮発生成物）を残した。この残留オイルを次の工程に使用した。
Figure 2006515589
実施例１６（ｃ）：３−シクロプロピル−プロプ−２−イニルアミン
Figure 2006515589
３−シクロプロピル−プロプ−２−イニルアジド（約３４ミリモル）を１００ｍＬのＴＨＦに溶かし、１ｍＬの水を加え、温度を水浴で維持しながら、固形物としてのＰＰｈ３（１３．３７ｇ，５１ミリモル）の添加を続けた。この混合物を室温で１時間撹拌した。この混合物へ１５０ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ水溶液を加えた。この混合物を塩化メチレンで３回洗浄した。水層を５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１０〜１２へ塩基性にした。この混合物を酢酸エチルで抽出した。水層をＴＬＣ染色で検査して、アミンの有機相への抽出の進捗をモニタリングした。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、１．６２ｇの所望の生成物（揮発生成物、残留ＥｔＯＡｃ溶媒を含有する）（２回の工程で収率５０％）を得た。
Figure 2006515589
実施例１７：Ｎ−（３−シクロプロピル−プロプ−２−イニル）−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸と３−シクロプロピル−プロプ−２−イニルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例１８：Ｎ−（３−シクロプロプ−２−イニル）−２−｛３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりに２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−Ｎ−プロプ−２−イニル−ベンズアミドを使用すること以外は、上記の実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例１９（ａ）：２−ブチン−１，４−ジオール、モノアセテート
Figure 2006515589
ブチン−１，４−ジオール（５ｇ，５８ミリモル）の乾燥ＴＨＦ溶液へ室温で水素化ナトリウム（オイル中６０％分散液、２．３２ｇ，５８ミリモル）を少しずつ加えた。４．３時間後、塩化アセチル（４．１２ｍＬ，５８ミリモル）を加えた。室温で２２時間撹拌後、この混合物を減圧で濃縮した。残渣をトルエンより２回濃縮した後で、酢酸エチル／ジクロロメタン（１：３）を溶出液として使用するシリカゲルでの精製によって、２−ブチン−１，４−ジオール、モノアセテートをオイルとして収率４９％で得た。
Figure 2006515589
実施例１９（ｂ）：酢酸４−アミノ−ブト−２−イニルエステル
Figure 2006515589
４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イン−１−オールの代わりに２−ブチン−１，４−ジオール、モノアセテートを使用すること以外は、実施例８の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例２０：酢酸４−（２−｛３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンゾイルアミノ）−ブト−２−イニルエステル
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸ｐ−トルエンスルホネートと酢酸４−アミノ−ブト−２−イニルエステルを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例２１：２−［３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ニコチン酸メチルエステル
Figure 2006515589
２−ブロモ安息香酸メチルエステルの代わりに２−ブロモ−ニコチン酸メチルエステルを使用すること以外は、上記の実施例３の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例２２：２−［３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ニコチン酸
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステルの代わりに２−［３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ニコチン酸メチルエステルを使用すること以外は、実施例４の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例２３：２−｛３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−ニコチンアミド
Figure 2006515589
上記の実施例６の記載に類似したやり方で、２−［３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ニコチン酸および４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニルアミンより、Ｎ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ニコチンアミドおよびＮ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ニコチンアミドの粗製混合物を製造し、引き続き、Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりにＮ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ニコチンアミドおよびＮ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ニコチンアミドの混合物を使用すること以外は実施例７の記載に類似したやり方で、２−｛３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−ニコチンアミドへ変換した。
Figure 2006515589
実施例２４：２−｛３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ニコチン酸ｐ−トルエンスルホネート
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸の代わりに２−［３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ニコチン酸を使用すること以外は、実施例５の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例２５：Ｎ−（３−シクロプロピル−プロプ−２−イニル）−２−｛３−［（Ｅ）−２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ニコチンアミド
Figure 2006515589
２−｛３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ニコチン酸ｐ−トルエンスルホネートと３−シクロプロピル−プロプ−２−イニルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例２６：４−メチル−２−ビニル−ピリジン
Figure 2006515589
トルエン（１００ｍＬ）中の２−ブロモ−４−メチル−ピリジン（アルドリッチ、５．２ｇ，３０．５ミリモル、１．０当量）、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（アルドリッチ、６７ｍｇ，０．３ミリモル、１モル％）、トリブチル−ビニル−スタンナン（アルドリッチ、２６．８ｍＬ，９１．５ミリモル、３．０当量）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｓｔｒｅｍ，１．８ｇ，１．５ミリモル、５モル％）の黄色の混合物を脱気し、アルゴンでパージした。この混合物を１００℃まで温めた後で、琥珀色の溶液を得た。１８時間後に１．０Ｍ ＨＣｌの添加によりこの反応混合物を失活させた。この酸性抽出物をエーテルで洗浄し、固体の重炭酸ナトリウムでｐＨ９へ調整して、酢酸エチルで抽出した。この有機抽出物を塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して、減圧で濃縮した。この粗生成物（３．７ｇの茶褐色オイル）をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ）により精製し、０〜５％酢酸エチル−ジクロロメタンで溶出させて、澄明なオイル（１．９ｇ，５３％）を得た。
Figure 2006515589
実施例２７：３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−６−ニトロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール
Figure 2006515589
４−メチル−２−ビニル−ピリジン（実施例２３）（１．９ｇ，１５．９７ミリモル）、６−ニトロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−３−ビニル−１Ｈ−インダゾール（４．９６ｇ，１３．３ミリモル）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（１４９ｍｇ，０．６６ミリモル）、Ｐ（ｏ−トリル）３、およびＤＩＥＡ（３．５ｍｌ，１９．９６ミリモル）の脱気ＤＭＦ（５０ｍｌ）懸濁液をアルゴン下に１００℃で１８時間加熱した。この反応混合物を冷やし、固形物を濾過により除去して、ＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液をＥｔＯＡｃで希釈し、塩水（２ｘ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧で濃縮した。残渣をヘキサン：ＥｔＯＡｃ（３：１）で溶出させるシリカゲルでクロマトグラフ処理して、３．４０ｇ（７０％）の明黄色の固形物を得た。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２０Ｈ２０Ｎ４Ｏ３の計算値：Ｃ，６５．９２；Ｈ，５．５３；Ｎ，１５．３８。実測値：Ｃ，６５．８０；Ｈ，５．５２；Ｎ，１５．１５。
実施例２８：３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミン
Figure 2006515589
３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−６−ニトロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾールの代わりに［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−６−ニトロ−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール（実施例２４）を使用すること以外は、実施例２の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例２９：２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル
Figure 2006515589
３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミンの代わりに３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミンを使用すること以外は、実施例３の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例３０：２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル（実施例３）の代わりに２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステルを使用すること以外は、上記の実施例４の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例３１：２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−Ｎ−プロプ−２−イニル−ベンズアミド
Figure 2006515589
プロパルジルアミンと２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸を使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ３０Ｈ２９Ｎ５Ｏ２・０．２５ＴＢＭＥの計算値：Ｃ，７３．０７；Ｈ，６．２８；Ｎ，１３．６４。実測値：Ｃ，７２．９５；Ｈ，６．３０；Ｎ，１３．６４。
実施例３２：２−｛３−［（Ｅ）−２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−プロプ−２−イニル−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりに２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−Ｎ−プロプ−２−イニル−ベンズアミドを使用すること以外は、実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２５Ｈ２１Ｎ５Ｏ・０．３５ＣＨ２Ｃｌ２の計算値：Ｃ，６９．６４；Ｈ，５．００；Ｎ，１６．０２。実測値：Ｃ，６９．６５；Ｈ，５．１５；Ｎ，１５．８０。
実施例３３：Ｎ−（２−メチル−アリル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−メチル−アリルアミンと２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸を使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ３１Ｈ３３Ｎ５Ｏ２・０．８０ＴＢＭＥの計算値：Ｃ，７２．７１；Ｈ，７．４３；Ｎ，１２．１１。実測値：Ｃ，７２．４３；Ｈ，７．５７；Ｎ，１２．０２。
実施例３４：Ｎ−（２−メチル−アリル）−２−｛［（Ｅ）−２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりにＮ−（２−メチル−アリル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２６Ｈ２５Ｎ５Ｏ・０．２０Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ，７３．１１；Ｈ，５．９９；Ｎ，１６．４０。実測値：Ｃ，７３．１３；Ｈ，６．０３；Ｎ，１６．１３。
実施例３５：Ｎ−（３−シクロプロピル−プロプ−２−イニル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸と３−シクロプロピル−プロプ−２−イニルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例３６：Ｎ−（３−シクロプロプ−２−イニル）−２−｛３−［（Ｅ）−２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりにＮ−（３−シクロプロプ−２−イニル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、上記の実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例３７：２−｛３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−ピリジン−２−イルメチル−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸とＣ−ピリジン−２−イルメチルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６および実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２８Ｈ２４Ｎ６Ｏｘ０．３ＭＴＢＥの計算値：Ｃ，７２．７１；Ｈ，５．７７；Ｎ，１７．２５。実測値：Ｃ，７２．３８；Ｈ，５．８０；Ｎ，１６．８８。
実施例３８：２−｛３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−ピリジン−４−イルメチル−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸とＣ−ピリジン−４−イルメチルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６および実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２８Ｈ２４Ｎ６Ｏｘ０．４Ｈ２Ｏｘ０．７ＭＴＢＥの計算値：Ｃ，７１．３６；Ｈ，６．４５；Ｎ，１５．８５。実測値：Ｃ，７１．２７；Ｈ，６．２９；Ｎ，１５．５３。
実施例３９：Ｎ−（６−メチル−ピリジン−２−イルメチル）−２−｛３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸とＣ−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−メチルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６および実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２９Ｈ２６Ｎ６Ｏｘ０．４ＤＣＭの計算値：Ｃ，６８．９８；Ｈ，５．２９；Ｎ，１６．３９。実測値：Ｃ，６８．８４；Ｈ，５．４２；Ｎ，１６．２０。
実施例４０：Ｎ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルメチル）−２−［（Ｅ）−３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸とＣ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−メチルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例４１：Ｎ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルメチル）−２−｛３−［（Ｅ）−２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりにＮ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルメチル）−２−［（Ｅ）−３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例４２：１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−カルバルデヒドオキシム
Figure 2006515589
１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−カルバルデヒド（９８０ｍｇ，６．６１ミリモル）のＨ２Ｏ（１０ｍｌ）撹拌懸濁液へ１０ｍｌのＨ２Ｏ中の酢酸ナトリウム（３．２５ｇ，３９．６８ミリモル）および塩酸ヒドロキシルアミン（１．３８ｇ，１９．８４ミリモル）の溶液を加えた。この反応物を室温で２時間撹拌し、濃厚な沈殿を濾過により採取し、水で洗浄し、真空で乾燥させて、１．０２ｇ（９４％）の白色の固形物を得た。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ９Ｈ９Ｎ３Ｏの計算値：Ｃ，６１．７０；Ｈ，５．１８；Ｎ，２３．９９。実測値：Ｃ，６１．８０；Ｈ，５．２３；Ｎ，２３．９８。
実施例４３：Ｃ−（１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−メチルアミン二塩酸塩
Figure 2006515589
Ｐａｒｒ圧力ボトルに１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−カルバルデヒドオキシムＭ（２６７ｍｇ，１．６ミリモル）、１０％パラジウム担持カーボン（７５ｍｇ）、濃ＨＣｌ（２滴）およびＥｔＯＨ（２５ｍｌ）を入れた。この反応混合物を４５ｐｓｉ Ｈ２で２時間振り混ぜた後で、触媒を濾過により除去した。濾液を減圧で濃縮し、残渣をＥｔ２Ｏで摩砕して、３４０ｍｇ（９０％）の白色の固形物を二塩酸塩として得て、さらに精製せずに使用した。
Figure 2006515589
実施例４４：Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルメチル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｃ−（１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−メチルアミン塩酸塩と２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸を使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ３６Ｈ３５Ｎ７Ｏ２・０．６５ヘキサンの計算値：Ｃ，７３．３１；Ｈ，６．８０；Ｎ，１５．００。実測値：Ｃ，７２．９２；Ｈ，６．９０；Ｎ，１４．７１。
実施例４５：Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルメチル）−２−｛３−［（Ｅ）−２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりにＮ−（１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルメチル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ３１Ｈ２７Ｎ７Ｏ・１．８０Ｈ２Ｏ・０．４０ＣＨ２Ｃｌ２の計算値：Ｃ，６５．０２；Ｈ，５．４６；Ｎ，１６．９１。実測値：Ｃ，６４．９７；Ｈ，５．８２；Ｎ，１７．０９。
実施例４６：１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルバルデヒドオキシム
Figure 2006515589
１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−カルバルデヒドの代わりに１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルバルデヒドを使用すること以外は、実施例３９の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ５Ｈ７Ｎ３Ｏの計算値：Ｃ，４７．９９；Ｈ，５．６４；Ｎ，３３．５８。実測値：Ｃ，４８．２２；Ｈ，５．５８；Ｎ，３３．４５。
実施例４７：Ｃ−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−メチルアミン二塩酸塩
Figure 2006515589
１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−カルバルデヒドオキシムの代わりに１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルバルデヒドオキシムを使用すること以外は、実施例４０の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例４８：Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｃ−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−メチルアミン塩酸塩と２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸を使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ３２Ｈ３３Ｎ７Ｏ２・０．８ＣＨ２Ｃｌ２の計算値：Ｃ，６３．９９；Ｈ，５．６７２；Ｎ，１５．９３。実測値：Ｃ，６３．９５；Ｈ，５．７２；Ｎ，１６．０１。
実施例４９：Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル）−２−｛３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりにＮ−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２７Ｈ２５Ｎ７Ｏ・０．３５ＣＨ２Ｃｌ２の計算値：Ｃ，６６．５９；Ｈ，５．２５；Ｎ，１９．８８。実測値：Ｃ，６６．４８；Ｈ，５．６５；Ｎ，１９．５６。
実施例５０：Ｎ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸と４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニルアミンを使用すること以外は、実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例５１：２−｛３−［（Ｅ）−２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ｝−Ｎ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４，６−ジメチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの代わりにＮ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドおよびＮ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−［２−（４−メチル−ピリジン−２−イル）−ビニル］−１−（テトラヒドロ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドの混合物を使用すること以外は、実施例７の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例５２：２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル
Figure 2006515589
６−ヨード−３−スチリル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾールの代わりに６−ニトロ−３−スチリル−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾールで出発すること以外は、上記の実施例２および３の記載に類似したやり方で製造した。この材料を生成物および２−アミノ−安息香酸メチルエステルの粗製混合物として次の工程に利用した。
実施例５３：２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸
Figure 2006515589
すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号０９／６０９，３３５（２０００年６月３０日出願）の実施例１１に類似した手順を使用して、Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドとＴＢＡＦの反応より副生成物として単離した。
Figure 2006515589
実施例５４：Ｎ−（３−シクロプロピル−プロプ−２−イニル）−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸と３−シクロプロピル−プロプ−２−イニルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例５５：Ｎ−（３−シクロプロピル−プロプ−２−イニル）−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−メチル−Ｎ−｛３−スチリル−１−［２−トリメチル−シラニル−エトキシメチル］−１Ｈ−インダゾール−６−イル｝−ベンゼン−１，３−ジアミンの代わりにＮ−（３−シクロプロピル−プロプ−２−イニル）−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号０９／６０９，３３５（２０００年６月３０日出願）の実施例１１の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６Ｏ・０．０５ヘキサン・０．３０Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ，７０．３１；Ｈ，５．４３；Ｎ，１９．４５。実測値：Ｃ，７０．６３；Ｈ，５．３８；Ｎ，１９．１８。
実施例５６：Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸と４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例５７：Ｎ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−メチル−Ｎ−｛３−スチリル−１−［２−トリメチル−シラニル−エトキシメチル］−１Ｈ−インダゾール−６−イル｝−ベンゼン−１，３−ジアミンの代わりにＮ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ブト−２−イニル］−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号０９／６０９，３３５（２０００年６月３０日出願）の実施例１１の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２３Ｈ２０Ｎ６Ｏ２・０．３５ヘキサン・０．２０Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ，６７．４５；Ｈ，５．８６；Ｎ，１８．８１。実測値：Ｃ，６７．７０；Ｈ，５．７３；Ｎ，１８．５６。
実施例５８：２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボニトリル
Figure 2006515589
Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ，ＭａｒｉａとＭｏｎｔｓｅｒｒａｔ，Ｌｌｉｎａｓ；ＪＣＳ Ｐｅｒｋｉｎｓ Ｔｒａｎｓ Ｉ（１９８５）１２０９−１２１５による１−メチル−ピラゾール−５−カルボニトリルについて公表された手順に従って、１，３−ジメチルピラゾール−５−カルボン酸エチルより２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボニトリルを製造した。
Figure 2006515589
実施例５９：Ｃ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−メチルアミン
Figure 2006515589
２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボニトリル（６５４ｍｇ，５．４ミリモル）および１０％パラジウム担持カーボン（２００ｍｇ）のエタノール（１５ｍＬ）懸濁液をＰａｒｒ水素化装置において４５ｐｓｉ Ｈ２で１７時間振り混ぜた。この混合物をセライトに通して濾過し、濾液を減圧で濃縮して、６０８ｍｇのオイルを得て、これをさらに精製せずに使用した。
Figure 2006515589
実施例６０：Ｎ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルメチル）−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸とＣ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−メチルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例６１：Ｎ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルメチル）−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
Ｎ−メチル−Ｎ−｛３−スチリル−１−［２−トリメチル−シラニル−エトキシメチル］−１Ｈ−インダゾール−６−イル｝−ベンゼン−１，３−ジアミンの代わりにＮ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルメチル）−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミドを使用すること以外は、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号０９／６０９，３３５（２０００年６月３０日出願）の実施例１１の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例６２：２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸
Figure 2006515589
Ｎ−メチル−Ｎ−｛３−スチリル−１−［２−トリメチル−シラニル−エトキシメチル］−１Ｈ−インダゾール−６−イル｝−ベンゼン−１，３−ジアミンの代わりに２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１−（２−トリメチルシラニル−エトキシメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸を使用すること以外は、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号０９／６０９，３３５（２０００年６月３０日出願）の実施例１１の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例６３：Ｎ−プロプ−２−イニル−２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−（ピロール−１−イルイミノメチル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸とプロパルジルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
元素分析 Ｃ２２Ｈ１８Ｎ６Ｏ・０．４０Ｈ２Ｏ・０．０５ヘキサンの計算値：Ｃ，６７．９７；Ｈ，５．０１；Ｎ，２１．３３。実測値：Ｃ，６７．９１；Ｈ，４．７８；Ｎ，２１．００。
実施例６４：Ｎ−（４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル）−２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸テトラブチルアンモニウムと４−アミノ−ブト−２−イン−１−オールを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
実施例６５：Ｎ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルメチル）−２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−ベンズアミド
Figure 2006515589
２−［３−（２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ］−安息香酸テトラブチルアンモニウムとＣ−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−メチルアミンを使用すること以外は、上記の実施例６の記載に類似したやり方で製造した。
Figure 2006515589
上記に記載の例示化合物について、以下に記載の試験を使用してその活性を検査することができる。
生物学的試験；酵素アッセイ
ＶＥＦＧ、ＦＧＦ、その他のような増殖因子による細胞増殖の刺激は、そのそれぞれの受容体のチロシンキナーゼがそれぞれを自己リン酸化することの誘導に依存する。故に、自己リン酸化を妨げるプロテインキナーゼ阻害剤の能力は、ペプチド基質の阻害によって測定可能である。化合物のプロテインキナーゼ阻害を測定するために、以下の構築体を設計した。
アッセイ用のＶＥＧＦ−Ｒ２構築体：この構築体は、チロシンキナーゼ活性を阻害する試験化合物の能力を決定する。キナーゼ挿入ドメインの６８残基の中央５０残基を欠く、ヒト血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）の細胞質ドメインの構築体（ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０）をバキュロウイルス／昆虫細胞系において発現した。全長ＶＥＧＦ−Ｒ２の１３５６残基のうち、ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０は、残基８０６〜９３９および９９０〜１１７１と、キナーゼ挿入ドメイン内に、野生型ＶＥＧＦ−Ｒ２に対する１つの点突然変異（Ｅ９９０Ｖ）も含有する。この精製構築体の自己リン酸化を、５％グリセロールおよび５ｍＭ ＤＴＴを含有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中３ｍＭ ＡＴＰおよび４０ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下、４μＭの濃度の酵素の４℃で２時間のインキュベーションにより実施した。自己リン酸化の後で、この構築体は、野生型の自己リン酸化されるキナーゼドメイン構築体に本質的に同等な触媒活性を保有することが示された。Ｐａｒａｓｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１６７８８−１６８０１（１９９８）を参照のこと。
アッセイ用のＦＧＦ−Ｒ１構築体：バキュロウイルスベクター発現系を使用して、ヒトＦＧＦ−Ｒ１の細胞内キナーゼドメインを、Ｍｏｈａｍｍａｄｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，９７７−９８９（１９９６）の残基番号付けシステムによる、内因性メチオニン残基４５６から出発してグルタミン酸７６６まで発現させた。さらに、この構築体はまた、以下の３つのアミノ酸置換を有する：Ｌ４５７Ｖ、Ｃ４８８Ａ、およびＣ５８４Ｓ。
アッセイ用のＬＣＫ構築体：昆虫細胞において、アミノ酸残基２２３から出発して残基５０９でのタンパク質の終わりまでのＮ−末端欠損体（以下の２つのアミノ酸置換がＮ末端にある：Ｐ２３３ＭおよびＣ２２４Ｄ）としてＬＣＫチロシンキナーゼを発現させた。
アッセイ用のＣＨＫ１構築体：バキュロウイルス／昆虫細胞系を使用して、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き全長ヒトＣＨＫ１（ＦＬ−ＣＨＫ１）を発現させた。これは、４７６アミノ酸のヒトＣＨＫ１のＣ末端に６つのヒスチジン残基（６ｘＨｉｓ−タグ）を含有する。このタンパク質を慣用のクロマトグラフィー技術によって精製した。
アッセイ用ＣＤＫ２／サイクリンＡ構築体：バキュロウイルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞より、公知の方法論（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３０，１３１７−１３１９（１９９３））を使用して、ＣＤＫ２を精製した。サイクリンＡは、全長組換えサイクリンＡを発現する大腸菌細胞より精製し、先端切断サイクリンＡ構築体は、限定したタンパク分解によって産生し、既報（Ｊｅｆｆｒｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３１３−３２０（１９９５））に記載のように精製した。
アッセイ用ＣＤＫ４／サイクリンＤ構築体：対応するバキュロウイルス発現ベクターで同時感染させた昆虫細胞より、従来の生化学のクロマトグラフィー技術を使用して、ヒトＣＤＫ４およびサイクリンＤ３の複合体、またはサイクリンＤ１とヒトＣＤＫ４およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−ＣＤＫ４）の融合タンパク質の複合体を精製した。
アッセイ用ＦＡＫ構築体：バキュロウイルスベクター発現系を使用して、ヒトＦＡＫ（ＦＡＫｃｄ４０９）の触媒ドメインを発現させた。発現された２８０のアミノ酸のドメインは、メチオニン４０９〜グルタミン酸６８９の残基を含む。Ｗｈｉｔｈｅｙ，Ｇ．Ｓ．ら，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９，８２３−３０（１９９３）により公表された配列評定番号Ｌ１３６１６に対して１つのアミノ酸置換（Ｐ４１０Ｔ）が存在する。模範的なクロマトグラフィー技術を使用して、このタンパク質を精製した。
アッセイ用ＴＩＥ−２（ＴＥＫ）構築体：
昆虫細胞において、アミノ酸残基７７４から出発して残基１１２４でのタンパク質の終わりまでのＮ−末端欠損体としてＴＩＥ−２チロシンキナーゼドメインを発現させた。この構築体は、Ｒ７７４Ｍ突然変異も担い、これは翻訳において開始メチオニン残基として役立つ。
ＶＥＧＦ−Ｒ２アッセイ
共役分光測定（ＦＬＶＫ−Ｐ）アッセイ
ホスホリル転移に伴うＡＤＰのＡＴＰからの産生に、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を有する系を使用する、ＮＡＤＨの酸化を共役した。ＮＡＤＨの酸化は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６５０分光光度計を使用して、３４０ｎｍでの吸光度（ｅ３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の減少を追跡することによってモニタリングした。リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（以下の表においてＦＬＶＫ−Ｐとして示す）のアッセイ条件は、以下の通りであった：２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；５０ユニットのＬＤＨ／ｍＬ；２０ユニットのＰＫ／ｍＬ；５ｍＭ ＤＴＴ；５．１ｍＭ ポリ（Ｅ４Ｙ１）；１ｍＭ ＡＴＰ；および２５ｍＭ ＭｇＣｌ２。非リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（表においてＦＬＶＫとして示す）のアッセイ条件は、以下の通りであった：２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；５０ユニットのＬＤＨ／ｍＬ；２０ユニットのＰＫ／ｍＬ；５ｍＭ ＤＴＴ；２０ｍＭ ポリ（Ｅ４Ｙ１）；３ｍＭ ＡＴＰ；および６０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２ｍＭ ＭｎＣｌ２。５〜４０ｎＭの酵素でアッセイを開始した。様々な濃度の試験化合物の存在下に酵素活性を測定することによって、Ｋｉ値を決定した。Ｅｎｚｙｍｅ ＫｉｎｅｔｉｃおよびＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈのソフトウェアを使用してデータを解析した。
ＥＬＩＳＡアッセイ
ビオチニル化ガストリンペプチド（１−１７）を基質として使用して、ホスホガストリンの形成をモニタリングした。ストレプトアビジン被覆９６ウェルマイクロタイタープレートを使用してビオチニル化ホスホガストリンを固定化して、西洋ワサビペルオキシダーゼへ共役した抗ホスホチロシン抗体を使用する検出を続けた。２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンザチアゾリンスルホネート（６）］ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼの活性をモニタリングした。典型的なアッセイ溶液は、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中２μＭビオチニル化ガストリンペプチド；５ｍＭ ＤＴＴ；２０μＭ ＡＴＰ；２６ｍＭ ＭｇＣｌ２；および２ｍＭ ＭｎＣｌ２を含有した。０．８ｎＭのリン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２△５０でアッセイを開始した。西洋ワサビペルオキシダーゼ活性は、ＡＢＴＳ，１０ｍＭを使用してアッセイした。酸（Ｈ２ＳＯ４）の添加により西洋ワサビペルオキシダーゼ反応を失活させ、４０５ｎｍでの吸光度読取りを続けた。様々な濃度の試験化合物の存在下に酵素活性を測定することによって、Ｋｉ値を決定した。Ｅｎｚｙｍｅ ＫｉｎｅｔｉｃおよびＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈのソフトウェアを使用してデータを解析した。
ＦＧＦ−Ｒアッセイ
ＶＥＧＦ−Ｒ２についての上記の記載のように分光測定アッセイを行なったが、但し、濃度を以下のように変更した：ＦＧＦ−Ｒ＝５０ｎＭ，ＡＴＰ＝２ｍＭ，およびポリ（Ｅ４Ｙ１）＝１５ｍＭ。
ＬＣＫアッセイ
ＶＥＧＦ−Ｒ２についての上記の記載のように分光測定アッセイを行なったが、但し、濃度を以下のように変更した：ＬＣＫ＝６０ｎＭ，ＭｇＣｌ２＝０ｍＭ，ポリ（Ｅ４Ｙ１）＝２０ｍＭ。
ＣＨＫ１アッセイ
合成基質ペプチドのＳｙｎｔｉｄｅ−２（ＰＬＡＲＴＬＳＶＡＧＬＰＧＫＫ）へのホスホリル転移に伴うＡＤＰのＡＴＰからの産生に、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）を使用する、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の作用を介したＮＡＤＨの酸化を共役した。ＮＡＤＨの酸化は、ＨＰ８４５２分光光度計を使用して、３４０ｎｍでの吸光度（ε３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の減少を追跡することによってモニタリングした。典型的な反応溶液は：５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）中４ｍＮ ＰＥＰ；０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ；２８ユニットのＬＤＨ／ｍＬ；１６ユニットのＰＫ／ｍＬ；３ｍＭ ＤＴＴ；０．１２５ｍＭ Ｓｙｎｔｉｄｅ−２；０．１５ｍＭ ＡＴＰ；２５ｍＭ ＭｇＣｌ２と４００ｍＬ ＮａＣｌを含有した。１０ｎＭのＦＬ−ＣＨＫ１でアッセイを開始した。様々な濃度の試験化合物の存在下に初期酵素活性を測定することによって、Ｋｉ値を決定した。Ｅｎｚｙｍｅ ＫｉｎｅｔｉｃおよびＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈのソフトウェアを使用してデータを解析した。
ＣＤＫ２／サイクリンＡおよびＣＤＫ４／サイクリンＤアッセイ
［３２Ｐ］ＡＴＰ由来放射活性リン酸の網膜芽腫タンパク質の組換え断片への酵素触媒性、時間依存的な取込みを定量することによって、サイクリン依存性キナーゼの活性を測定した。他に述べなければ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５μＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１ｍｇ／ｍＬ オバルブミン、５μｇ／ｍＬ ロイペプチン、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ β−グリセロリン酸、０．１ｍＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフッ化ナトリウム、２．５ｍＭエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド、および０．０３〜０．２μＣｉ［３２Ｐ］ＡＴＰの存在下、全量５０μＬにおいて９６ウェルプレートでアッセイを実施した。基質（０．３〜０．５μｇ）は、精製した組換え網膜芽腫タンパク質断片（Ｒｂ）（ネイティブ１０６ｋＤａタンパク質に見出されるリン酸化部位の大部分を含有する、ネイティブ網膜芽腫タンパク質の残基３８６〜９２８，６２．３ｋＤａ並びに精製を容易にするための６つのヒスチジン残基のタグ）であった。ＣＤＫ２（１５０ｎＭ ＣＤＫ２／サイクリンＡ複合体）またはＣＤＫ４（５０ｎＭ ＣＤＫ４／サイクリンＤ３複合体）で反応を開始し、３０℃でインキュベートし、２０分後にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の２５０ｍＭまでの添加により止めた。次いで、９６ウェル濾過マニホルドを使用して、リン酸化した基質をニトロセルロース膜に捕捉して、０．８５％リン酸での反復洗浄によって非取込み放射活性を除去した。乾燥させたニトロセルロース膜をリン造影器へ曝露することによって、放射活性を定量した。様々な化合物濃度の存在下に酵素活性をアッセイして、酵素の非存在下に測定したバックグラウンド放射活性を差し引くことによって、見かけのＫｉ値を測定した。ＡＴＰ濃度に対する初速度の依存性を決定することによって、通常のアッセイ条件下の各酵素について動力学的パラメーター（ｋｃａｔ，ＡＴＰについてのＫｍ）を測定した。データは、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して競合阻害の式に適合させるか、またはソフトウェアのＫｉｎｅＴｉｃ（ＢｉｏＫｉｎ社）を使用して競合性緊密結合阻害の式に適合させた。ＣＤＫ４およびＣＤＫ２に対する既知の阻害剤について測定したＫｉ値は、公知のＩＣ５０値に一致した。ＣＤＫ４の比活性は、全長サイクリンＤ３または先端切断サイクリンＤ３構築体のいずれへ複合しても同じであり、いずれの複合体も、選択した阻害剤について非常に似たＫｉ値をもたらした。
ＦＡＫアッセイ
ＦＡＫ ＨＴＳには、ＬＪＬ Ｂｉｏｓｙｅｔｅｍｓにより提供される蛍光偏光アッセイを利用した。キナーゼ反応物は、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、および１ｍｇ／ｍｌ ポリＧｌｕ−Ｔｙｒ（４：１）を含有した。５ｎＭ ＦＡＫｃｄ４０９の添加により反応を開始する。ＥＤＴＡの添加に続くフルオル標識ペプチドおよび抗ホスホチロシン抗体（いずれもＬＪＬ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより提供）の添加によって反応を止める。阻害結果をＡｎａｌｙｓｔ（ＬＪＬ）検出器で読み取る。
ＴＩＥ−２分光測光アッセイ
ランダム共重合体のポリ（Ｇｌｕ４Ｔｙｒ）へのホスホリル転移に伴うＡＤＰのＡＴＰからのキナーゼ触媒産生に、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の作用を介したＮＡＤＨの酸化を共役した。ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への変換は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６５０分光光度計を使用して、３４０ｎｍでの吸光度（ε＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の減少によってモニタリングした。典型的な反応溶液は：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中１ｍＭ ホスホエノールピルビン酸、０．２４ｍＭ ＮＡＤＨ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、２．９ｍｇ／ｍＬ ポリ（Ｇｌｕ４Ｔｙｒ）、０．５ｍＭ ＡＴＰ、１５ユニット／ｍＬ ＰＫ、１５ユニット／ｍＬ ＬＤＨを含有した。４〜１２ｎＭのリン酸化Ｔｉｅ−２（アミノ酸７７５〜１１２２）の添加でアッセイを開始した。１μＭレベルの阻害剤の同一３検体で阻害パーセントを決定した。
ＴＩＥ−２ ＤＥＬＦＩＡアッセイ
ビオチニル化ｐ３４ｃｄｃ２（アミノ酸６−２０＝ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ）ペプチドを基質として使用して、ホスホチロシンの形成をモニタリングした。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎＴＭ被覆９６ウェルマイクロタイタープレートを使用してビオチニル化ペプチドを固定して、ユウロピウムＮ１キレートへ共役した抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０）を使用する検出を続けた。典型的なアッセイ溶液は、１μＭビオチニル化ｐ３４ｃｄ２ペプチド、１５０μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ ＢＳＡ、５％グリセロール、２％ ＤＭＳＯ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含有した。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎプレートにおいて、５０ｎＭのＴＩＥ２細胞内ドメインでアッセイを開始した。５０ｍＭ ＥＤＴＡでこのキナーゼ反応を止めた。次いで、プレートを洗浄し、ユウロピウム抗体を加えた。インキュベーション後、それらを再び洗浄し、ＤＥＬＦＩＡＴＭ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた。標準ユウロピウム時間分割設定（ｅｘ３４０ｎｍ，ｅｍ６１５ｎｍ，遅れ４００μ秒、ウィンドウ５００μ秒）でプレートを読み取った。酵素の添加に先立ってＥＤＴＡを加えたプレート内ウェルに関して実験と対照の両方よりバックグラウンドを差し引いて、ＤＭＳＯ中の化合物ではなくＤＭＳＯを加えたプレート内ウェルに関して阻害パーセントを計算した。
ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ
このアッセイは、ヒト臍静脈内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）の増殖因子刺激増殖を阻害する試験化合物の能力を決定する。ＨＵＶＥＣ細胞（継代数３〜４、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）をＴ７５フラスコ中のＥＧＭ２培養基（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）へ融かした。２４時間後、このフラスコへ新鮮なＥＧＭ２培地を加えた。４〜５日後、細胞を別の培養基（１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、６０μｇ／ｍＬの内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）、および０．１ｍｇ／ｍＬ ヘパリンを補充したＦ１２Ｋ培地）へ曝露した。その後の実験では、指数増殖期のＨＵＶＥＣ細胞を使用した。１０，０００〜１２，０００個のＨＵＶＥＣ細胞を９６ウェル・ディッシュにおいて１００μｌの濃縮培養基（上記に記載）においてプレート培養した。この細胞を、この培地において２４時間付着させた。次いで、培地を吸引により除去し、１０５μｌの飢餓培地（Ｆ１２Ｋ＋１％ ＦＢＳ）を各ウェルへ加えた。２４時間後、飢餓培地中１％ ＤＭＳＯに溶かした１５μｌの試験薬剤かまたはこの担体単独をそれぞれの処理ウェルへ加えた；最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった。１時間後、飢餓培地中３０μｌのＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）を、未処理対照を含有するウェルを除くすべてのウェルへ加えた；最終ＶＥＧＦ濃度は６ｎｇ／ｍＬであった。７２時間後にＭＴＴ色素低下により細胞の増殖を定量したが、この時点で細胞をＭＴＴ（プロメガ社）へ４時間曝露した。停止溶液（プロメガ社）の添加により色素低下を止め、５９５λでの吸光度を９６ウェル分光光度計プレートリーダーで決定した。
様々な濃度の試験薬剤に対するＡ５９５の応答を曲線適合させることによってＩＣ５０値を計算した；典型的には、０．５対数により分割した７つの濃度（各濃度で同一３検体のウェル）を利用した。化合物ライブラリープレートをスクリーニングするために１または２の濃度（各濃度で１つのウェル）を利用し、以下の式によって阻害％を計算した：
阻害％＝（対照−試験）÷（対照−飢餓）
ここで、
対照＝試験薬剤なしでＶＥＧＦが存在するときのＡ５９５
試験＝試験薬剤があってＶＥＧＦが存在するときのＡ５９５
飢餓＝ＶＥＧＦと試験薬剤がともに非存在であるときのＡ５９５
マウスＰＫアッセイ
薬物のマウスにおける薬物動態（例、吸収と消失）について、以下の実験を使用して解析した。試験化合物は、３０：７０（ＰＥＧ４００：酸性化Ｈ２Ｏ）担体中の溶液剤または懸濁液剤として、または０．５％ ＣＭＣ中の懸濁液として製剤化した。これを、２つの別個群（ｎ＝４）のＢ６雌マウスへ可変用量で経口（ｐ．ｏ．）および腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。０時間（投薬前）、投薬後０．５時間、１．０時間、２．０時間、および４．０時間、および７．０時間の時点で眼窩出血により血液試料を採取した。各試料より、２５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって血漿を入手した。この血漿より有機タンパク質沈殿法によって試験化合物を抽出した。各時点の出血につき、５０μＬの血漿を１．０ｍＬのアセトニトリルと合わせ、２分間激しく振り混ぜてから、４０００ｒｐｍで１５分間スピンしてタンパク質を沈殿させ、試験化合物を抽出した。次いで、アセトニトリル上清（試験化合物を含有する抽出物）を新しい試験管へ注ぎ、Ｎ２ガスの蒸気下にホットプレート（２５℃）で蒸発させた。乾燥した試験化合物の抽出物を含有するそれぞれの試験管へ１２５μＬの移動相（６０：４０，０．０２５Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＋２．５ｍＬ／Ｌ ＴＥＡ：アセトニトリル）を加えた。激しく撹拌することによって、試験化合物をこの移動相に再懸濁させ、４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりさらにタンパク質を除去した。ＵＶ検出付きヒューレット・パッカード１１００シリーズＨＰＬＣでの試験化合物分析のために各試料をＨＰＬＣバイアルへ注いだ。各試料より９５μＬをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ−Ｐｒｏｄｉｇｙ逆相Ｃ−１８，１５０ｘ３．２ｍｍカラムへ注入し、１０分にわたる４５〜５０％アセトニトリル勾配で溶出させた。上記のやり方で血漿試料より抽出した既知濃度の試験化合物を使用して、標準曲線（ピーク面積ｘ濃度μｇ／ｍＬ）との比較により、試験化合物の血漿濃度（μｇ／ｍＬ）を決定した。標準品と未知検体と一緒に、３群（ｎ＝４）の品質コントロール（０．２５μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、および７．５μｇ／ｍＬ）を実施して、分析の一貫性を保証した。標準曲線はＲ２＞０．９９を有し、品質コントロールは、いずれもその予測値の１０％範囲内にあった。定量した試験試料について、Ｋａｌｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを使用して可視ディスプレイのためにプロットし、ＷＩＮ ＮＯＮＬＩＮソフトウェアを使用して、その薬物動態パラメータを決定した。実施例１（ａ）は、以下の結果をもたらした：０．６９（マウスｐＫ，ＡＵＣ，ｉｐ，μｇ−ｈ／ｍｌ）；０．３３（マウスｐＫ，ＡＵＣ，ｐｏ，μｇ−ｈ／ｍｌ）。
ＰＡＥ−ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ（ＶＥＧＦ−Ｒ２）リン酸化アッセイ
このアッセイは、ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）−ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲの自己リン酸化を阻害する試験化合物の能力を決定する。このアッセイでは、ヒトＫＤＲを過剰発現するＰＡＥ細胞を使用した。１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）および４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を補充したＨａｍ Ｆ１２培地においてこの細胞を培養した。９６ウェルプレートの各ウェルへ７５μＬの増殖培地に３万個の細胞をまき、３７℃で６時間付着させた。次いで、細胞を飢餓培地（０．１％ ＦＢＳを補充したＨａｍ Ｆ１２培地）へ１６時間曝露した。この飢餓期間が終わった後で、飢餓培地中５％ ＤＭＳＯ中の１０μＬの試験薬剤を試験ウェルへ加え、１０μＬの担体（飢餓培地中５％ ＤＭＳＯ）を対照ウェルへ加えた。各ウェル中の最終ＤＭＳＯ濃度は、０．５％であった。プレートを３７℃で１時間インキュベートしてから、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４の存在下に、細胞を５００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍより市販されている）で８分間刺激した。この細胞をＨＢＳＳ中１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４で１回洗浄し、各ウェルに５０μＬの溶解緩衝液を加えることによって溶解した。次いで、各ウェルへ１００μＬの希釈緩衝液を加え、希釈した細胞溶解液を、ウサギ抗ヒトＡｎｔｉ−ｆｌｋ−１ Ｃ−２０抗体（サンタクルスより市販されている）でプレコートした、９６ウェルのヤギ抗ウサギ抗体コートプレート（ピアスより市販されている）へ移した。このプレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で７回洗浄した。ＨＲＰ−ＰＹ２０（サンタクルスより市販されている）を希釈して、このプレートへ加えて３０分間インキュベートした。次いで、プレートを再び洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙより市販されている）を加えて１０分間インキュベートした。９６ウェルプレートの各ウェルへ１００μＬの０．０９Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を止めた。分光光度計の４５０ｎｍでの読取りによりリン酸化状態を評価した。４変数解析を使用する曲線適合によってＩＣ５０値を計算した。
ＰＡＥ−ＰＤＧＦＲβ細胞におけるＰＡＥ−ＰＤＧＦＲβリン酸化アッセイ
このアッセイは、ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）−ＰＤＧＦＲβ細胞におけるＰＤＧＦＲβの自己リン酸化を阻害する試験化合物の能力を決定する。このアッセイでは、ヒトＰＤＧＦＲβを過剰発現するＰＡＥ細胞を使用した。１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）および４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を補充したＨａｍ Ｆ１２培地においてこの細胞を培養した。９６ウェルプレートの各ウェルへ５０μＬの増殖培地に２万個の細胞をまき、３７℃で６時間付着させた。次いで、細胞を飢餓培地（０．１％ ＦＢＳを補充したＨａｍ Ｆ１２培地）へ１６時間曝露した。この飢餓期間が終わった後で、飢餓培地中５％ ＤＭＳＯ中の１０μＬの試験薬剤を試験ウェルへ加え、１０μＬの担体（飢餓培地中５％ ＤＭＳＯ）を対照ウェルへ加えた。各ウェル中の最終ＤＭＳＯ濃度は、０．５％であった。プレートを３７℃で１時間インキュベートしてから、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４の存在下に、細胞を１μｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）で８分間刺激した。この細胞をＨＢＳＳ中１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４で１回洗浄し、各ウェルに５０μＬの溶解緩衝液を加えることによって溶解した。次いで、各ウェルへ１００μＬの希釈緩衝液を加え、希釈した細胞溶解液を、ウサギ抗ヒトＰＤＧＦＲβ抗体（サンタクルス）でプレコートした、９６ウェルのヤギ抗ウサギ抗体コートプレート（ピアス）へ移した。このプレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で７回洗浄した。ＨＲＰ−ＰＹ２０（サンタクルス）を希釈して、このプレートへ加えて３０分間インキュベートした。次いで、プレートを再び洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ）を加えて１０分間インキュベートした。９６ウェルプレートの各ウェルへ１００μＬの０．０９Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を止めた。分光光度計の４５０ｎｍでの読取りによりリン酸化状態を評価した。４変数解析を使用する曲線適合によってＩＣ５０値を計算した。
ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）アッセイ
ヒト肝ミクロソームにおける化合物の代謝について、以下のようなＬＳ−ＭＳ分析アッセイ手順により測定した。はじめに、ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）を融かし、冷１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＯ４）緩衝液で５ｍｇ／ｍＬへ希釈した。適正量のＫＰＯ４緩衝液、ＮＡＤＰＨ再生溶液（Ｂ−ＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびＭｇＣｌ２を含有する）、およびＨＬＭを１３ｘ１００ｍｍのガラス試験管において３７℃で１０分間プレインキュベートした（試験化合物につき３つの試験管；同一３検体）。試験化合物（最終５μＭ）を各試験管へ加えて反応を開始させ、穏やかに振り混ぜて混合した後で、３７℃でインキュベートした。ｔ＝０および２時間で、各インキュベーション試験管より２５０μＬの試料を取り出し、１ｍＬの氷冷アセトニトリル（＋０．０５μＭレセルピン）を含有する分離用１２ｘ７５ｍｍガラス試験管へ移した。試料を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、タンパク質と塩を沈殿させた（ベックマン Ａｌｌｅｇｒａ ６ＫＲ，Ｓ／Ｎ ＡＬＫ９８Ｄ０６，＃６３４）。上清を新しい１２ｘ７５ｍｍガラス試験管へ移し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ遠心分離真空エバポレーターにより蒸発させた。２００μＬの０．１％ギ酸／アセトニトリル（９０／１０）中で試料を復元し、激しく撹拌して溶かした。次いで、この試料を分離用ポリプロピレンミクロ遠心分離管へ移し、１４０００ｘｇで１０分間遠心分離した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｍｉｃｒｏ １４，Ｓ／Ｎ Ｍ００１７５８０）。各時点（０および２時間）での各同一３検体（＃１〜３）について、各試験化合物のアリコート試料を、以下に記載する、ＬＣ−ＭＳ分析用の単回ＨＰＬＣバイアルインサート（全部で６つの試料）へ合わせた。
合わせた化合物試料を、ヒューレット・パッカード ＨＰ１１００ ダイオードアレイＨＰＬＣとポジティブエレクトロスプレーＳＩＲモードで作動するＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ三連四重極型質量分析計からなる（各試験化合物の分子イオンを特異的に走査するようにプログラムされている）、ＬＣ−ＭＳシステムへ注入した。各試験化合物のピークを各時点で積分した。各化合物について、各時点でのピーク面積（ｎ＝３）を平均化して、この２時間での平均ピーク面積を０時間の時点での平均ピーク面積で割って、２時間で残存する試験化合物のパーセントを得た。
様々なアッセイを使用する化合物の試験の結果を以下の表に要約する（ここで、「％＠」という表記は、明示濃度での阻害パーセントを示し、「＊」の値は、他に述べなければ、＊は１μＭ、＊＊は５０ｎＭの化合物濃度でのＫｉ（ｎＭ）または阻害％を表す。「ＮＴ」は、「有意な阻害なし」または「試験せず」を示す。
Figure 2006515589
Figure 2006515589
新生児ラットにおける網膜血管発達のｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
ラットにおける網膜血管の発達は、出生後１日目〜出生後１４日目（Ｐ１〜Ｐ１４）に起こる。このプロセスは、ＶＥＧＦの活性に依存している（Ｊ．Ｓｔｏｎｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５，４７３８（１９９５））。これまでの研究は、ＶＥＧＦが初期の血管発達の間に網膜の血管の生存因子としても作用することを証明した（Ａｌｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１，１０２４（１９９５））。ＶＥＧＦの活性をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する特定化合物の能力を評価するために、好適な担体、通常は５０％ポリエチレングリコール（平均分子量：４００ダルトン）と３００ｍＭショ糖の脱イオン水５０％溶液において化合物を製剤化した。典型的には、２マイクロリットル（２μｌ）の薬物溶液を出生後８または９日目の幼弱ラットの眼の硝子体中央へ注射した。この硝子体内注射から６日後、動物を犠牲にし、網膜を残る眼組織より解放して切除した。次いで、この単離網膜を、内皮細胞を特異的に染める組織化学染色プロトコールに処して（ＬｕｔｔｙとＭｃＬｅｏｄ，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１１０，２６７（１９９２））、組織試料内の血管形成の程度を明らかにした。つまり、個々の網膜をスライドガラス上に平らに載せて検査して、血管形成の程度を判定する。有効な化合物は、網膜の脈管構造のさらなる発達を阻害して、網膜内の最大血管を除くすべての退縮を引き起こす。この血管退縮の量を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後の化合物の相対強度を評価した。血管退縮を＋１〜＋３の主観尺度で等級付けする（＋１は、検出可能な退縮がほぼ２５パーセント以下であると判定されるものであり、＋２は、ほぼ２５〜７５％の退縮であると判定されるものであり、＋３は、ほとんど完全に退縮（ほぼ７５％以上）した網膜へ与える）。
より定量的な退縮の解析では、ＡＤＰアーゼ染色し、平載した網膜の映像を解剖用顕微鏡付きデジタルカメラで撮る。次いで、網膜像をイメージ解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ４．０，Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，メリーランド州シルバースプリング）へ移入した。このソフトウェアを利用して、染色された血管を含有する網膜の面積のパーセンテージを決定した。実験用の眼についての数値を、同じ動物の反対側の担体注入した眼について測定した数値と比較した。次いで、担体注入の目に比較した、化合物を受けた眼に認められる血管面積の低下をその試料の「退縮パーセント」として表した。退縮パーセント値は、５〜８匹の動物の群で平均化した。
顕微鏡による観察がほとんど完全な退縮を示した試料では、常に６５〜７０％の退縮パーセント値が測定された。これは、網膜のヒダ内の染料沈着によるものであり、ヒダは、薬物注射に使用する担体によって引き起こされたものである。イメージ解析ソフトウェアは、この染料を含有するヒダを血管として解釈した。これらのヒダは眼によって変動したので、それについて補正する試みはしなかった。従って、報告された退縮パーセント値は、化合物の順序を正確にランク付けるもののその絶対的な効力は過小評価する、控え目な測定に由来する。
未熟児網膜症の新生児ラットモデルにおける網膜血管発達のｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
ＶＥＧＦ依存性の網膜新血管形成の第二のモデルを利用して、この化合物群の活性を評価した。このモデル（Ｐｅｎｎら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ.，３６，２０６３，（１９９５））では、幼弱ラット（ｎ＝１６）をその母親と一緒に、酸素濃度が調節されるコンピュータ制御室に入れる。この動物を５０％濃度の酸素へ２４時間、続いて１０％濃度の酸素へ２４時間曝露する。この過酸素状態に続く低酸素状態の交替サイクルを７回繰り返した後で、動物を空気室へ移す（Ｐ１４）。空気室への移動後すぐに硝子体内注射により化合物を投与して、６日後（Ｐ２０）に動物を犠牲にする。次いで、先の発達モデルの記載のように、単離した網膜を単離して、染色し、搭載して、解析する。有効性も、発達モデルの記載のように等級付けた。
上記の例示化合物は、以下の一般例に従って医薬組成物へ製剤化可能である。
実施例１：非経口組成物
注射による投与に適した非経口医薬組成物を調製するには、式Ｉの化合物の水溶性塩の１００ｍｇをＤＭＳＯに溶かしてから、１０ｍＬの０．９％滅菌生理食塩水と混合する。この混合物を注射による投与に適した単位剤形へ組み込む。
実施例２：経口組成物
経口送達用の医薬組成物を調製するには、式Ｉの化合物の１００ｍｇを７５０ｍｇの乳糖と混合する。この混合物を、経口投与に適している、硬ゼラチンカプセル剤のような、経口剤形へ組み込む。
実施例３：眼内組成物
眼内送達用の持続放出医薬組成物を調製するには、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のヒアルロン酸（１．５％濃度）の中性、等張溶液に式Ｉの化合物を懸濁させて、１％懸濁液とする。
上記の記載は例示であって、本質的に説明のためのものであり、本発明とその好ましい態様を例示するものであることを理解されたい。当業者は、定型的な実験により、明らかな改良および変更が本発明の精神より逸脱することなくなし得ることを理解されよう。従って、本発明は、上記の記載によってではなく、以下の特許請求項とその同等物により規定されるものとする。

Claims (15)

  1. Figure 2006515589
    Figure 2006515589
    Figure 2006515589
    Figure 2006515589
     からなる群より選択される化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩。
  2. 式：
    Figure 2006515589
     により表される化合物、またはその医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩。
  3. 加齢関連黄斑変性を哺乳動物において治療するために、請求項１または２に記載の化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩の治療有効量を使用する方法。
  4. 脈絡膜新血管形成を哺乳動物において治療するために、請求項１または２に記載の化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩の治療有効量を使用する方法。
  5. 網膜症を哺乳動物において治療するために、請求項１または２に記載の化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩の治療有効量を使用する方法。
  6. 網膜症が糖尿病性網膜症、硝子体網膜症、または未熟児網膜症を含む、請求項５の方法。
  7. 網膜炎を哺乳動物において治療するために、請求項１または２に記載の化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩の治療有効量を使用する方法。
  8. 網膜炎がサイトメガロウイルス網膜炎を含む、請求項７の方法。
  9. 黄斑浮腫を哺乳動物において治療するために、請求項１または２に記載の化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩の治療有効量を使用する方法。
  10. 眼疾患を哺乳動物において治療するために、請求項１または２に記載の化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩の治療有効量を使用する方法。
  11. （ａ）請求項１または２の化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩の治療有効量；および
    （ｂ）そのための医薬的に許容される担体、希釈剤、または運搬体
    を含んでなる医薬組成物。
  12. プロテインキナーゼ活性により仲介される哺乳動物の疾患状態を治療するために、請求項１または２に記載の化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩の治療有効量を使用する方法。
  13. 哺乳動物の疾患状態が腫瘍増殖、細胞増殖、または血管新生と関連している、請求項１２に記載の方法。
  14. 請求項１または２に記載の化合物、医薬的に許容されるプロドラッグ、医薬的に活性な代謝産物、または医薬的に許容される塩の治療有効量とプロテインキナーゼ受容体を接触させることを含んでなる、該キナーゼ受容体の活性を変調させる方法。
  15. プロテインキナーゼ受容体がＶＥＧＦ受容体である、請求項１４に記載の方法。
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