JP2004501083A - プロテインキナーゼを阻害するためのピラゾール - Google Patents
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Abstract
プロテインキナーゼの活性を調節および／または阻害する、式（Ｉ）のアミノ−ピラゾール化合物。これらの化合物およびこれらを含む薬学的組成物は、サイクリン依存性キナーゼの活性を仲介および／または阻害することができ、それにより好ましくない細胞増殖を調節および／または阻害することができる。本発明はまた、有効量のそのような化合物を投与することによる、そのような化合物を含む薬学的組成物の治療的または予防的な使用に向けられ、かつ癌ならびに好ましくない脈管形成および／または細胞増殖に関連する、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、慢性関節リウマチ、および乾癬などの他の疾患状態を治療する方法に向けられる。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６などのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）；ＶＥＧＦ；ならびにＣＨＫ１などのプロテインキナーゼの活性を仲介および／または阻害するアミノ−ピラゾール化合物、そのような化合物および組成物を含む薬学的組成物、ならびにそのような化合物の有効な量を投与することによる、癌ならびに好ましくない脈管形成および／または細胞増殖に関連する他の疾患状態の治療法に向けられる。
【０００２】
発明の背景
制御されていない細胞増殖は癌のしるしである。様々な刺激に応答しての細胞増殖は、それによって細胞が増殖および分裂する過程である、細胞分裂周期の脱調節によって現れる。腫瘍細胞は一般的に、細胞分裂周期の全般にわたって直接または間接的に進行を調節する遺伝子に損傷を有する。
【０００３】
プロテインキナーゼはタンパク質の特定のチロシン、セリン、またはスレオニン残基の水酸基のリン酸化を触媒する酵素ファミリーである。一般的には、そのようなリン酸化はタンパク質の機能を劇的に混乱させるため、プロテインキナーゼは、代謝、細胞増殖、細胞分化、および細胞生存を含む様々な細胞過程の調節において重要である。プロテインキナーゼの活性が必要であると判明している多くの異なる細胞機能のうち、いくつかの過程は一定の疾患状態に対する治療的介入のための興味深い標的である。二つの例として細胞周期制御および脈管形成が挙げられ、プロテインキナーゼが重要な役割を果たしている。これらの過程は固形腫瘍の増殖ならびに他の疾患にとって必須である。
【０００４】
ＣＤＫは、Ｇ１期の静止期（有糸分裂と新しい細胞分裂サイクルのためのＤＮＡ複製開始との間）からＳ期（活発なＤＮＡ合成期）への進行、またはＧ２期から活発な有糸分裂および細胞分裂が起こるＭ期への進行などの、細胞周期における異なる期への移行の調節において重要な役割を果たす、酵素クラスを構成する。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７４巻、１６４３〜１６７７ページ（１９９６）；およびＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｖ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２６１〜２９１ページ（１９９７）に掲載されている論文を参照されたい。ＣＤＫ複合体は調節サイクリンサブユニット（例えば、サイクリンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＥ）と触媒キナーゼサブユニット（例えば、ｃｄｃ２（ＣＤＫ１）、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、およびＣＤＫ６）との結合によって形成される。名前が示すとおり、ＣＤＫはそれらの標的基質をリン酸化するためにサイクリンサブユニットへの絶対的依存を示し、異なるキナーゼ／サイクリンの対は細胞周期の特定の部分を通じて進行を調節するよう機能する。
【０００５】
Ｄサイクリンは細胞外増殖シグナルに感受性で、細胞周期のＧ１期にマイトジェンに応答して活性化される。ＣＤＫ４／サイクリンＤは網膜芽腫タンパク質（Ｒｂ）をリン酸化し、それによってこのタンパク質を不活化することにより、細胞周期進行において重要な役割を果たす。低リン酸化Ｒｂは転写制御因子ファミリーに結合するが、ＣＤＫ４／サイクリンＤによるＲｂの過リン酸化によってこれらの転写因子が放出され、その産物がＳ期進行を担う遺伝子を活性化する。ＣＤＫ４／サイクリンＤによるＲｂのリン酸化および不活化によって、細胞がＧ１期の制限点を通過できるようになり、この制限点で細胞外増殖または阻害シグナルに対する感受性が失われて、細胞は細胞分裂に入る。Ｇ１後期に、ＲｂはＣＤＫ２／サイクリンＥによってもリン酸化および不活化され、最近、ＣＤＫ２／サイクリンＥがＲｂリン酸化とは無関係の類似の経路によりＳ期への進行も調節しうるという証拠が得られている（ルカス（Ｌｕｋａｓ）ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．、第１１巻、１４７９〜１４９２ページ（１９９７）参照）。
【０００６】
ＣＤＫ４／サイクリンＤおよびＣＤＫ２／サイクリンＥの作用によって達成されるＧ１期からＳ期への進行は、正と負両方の様々な増殖調節機構に供される。マイトジェンなどの増殖刺激は、サイクリンＤ１の合成増大、およびしたがって機能的ＣＤＫ４の増加を引き起こす。これに対して、細胞増殖は内因性阻害タンパク質の誘導により、ＤＮＡ損傷または負の増殖刺激に応答して「抑制」されうる。これらの天然のタンパク質阻害剤には、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ、ｐ２７ＫＩＰＩ、およびｐ１６ＩＮＫ４ファミリーが含まれ、後者はＣＤＫ４をもっぱら阻害する（ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．、第２９巻、９１〜１０７ページ（１９９７）参照）。この制御システムにおける異常、特にＣＤＫ４およびＣＤＫ２の機能に影響する異常は、家族性黒色腫、食道癌、および膵臓癌などの悪性腫瘍に特徴的な高度増殖状態への細胞の進行に関係している（例えば、ホール（Ｈａｌｌ）ら、Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６８巻、６７〜１０８ページ（１９９６）；およびカム（Ｋａｍｂ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６４巻、４３６〜４４０ページ（１９９４）参照）。サイクリンＤ１の過剰発現は食道癌、乳癌、および扁平上皮癌につながる（例えば、デルサル（ＤｅｌＳａｌ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ、第７１巻、１２７〜１４２ページ（１９９６）参照）。ｐ１６ファミリーのＣＤＫ４特異的阻害剤をコードする遺伝子は、家族性黒色腫、神経膠腫、白血病、肉腫、膵臓癌、非小細胞肺癌、および頭頸部癌において欠失および突然変異を有することが多い（ノボリ（Ｎｏｂｏｒｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３６８巻、７５３〜７５ページ（１９９４）参照）。サイクリンＥの増幅および／または過剰発現も様々な固形腫瘍で観察されており、サイクリンＥレベルの上昇は予後不良と相関づけられている。加えて、ＣＤＫ２／サイクリンＥの基質および阻害剤の両方としてはたらくＣＤＫ阻害剤ｐ２７の細胞レベルは、乳癌、大腸癌、および前立腺癌で異常に低く、ｐ２７の発現レベルは疾患の病期に逆相関している（ローダ（Ｌｏｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第３巻、２３１〜２３４ページ（１９９７）参照）。最近、シェール（Ｓｈｅｒｒ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、第１３巻、１５０１〜１５１２ページ（１９９９）で概説されているとおり、ＣＤＫ４／サイクリンＤがｐ２７を抑制する可能性があるとの証拠が得られている。ｐ２１タンパク質もｐ５３腫瘍抑制シグナルをＣＤＫに伝達するようである。したがって、すべてのヒト癌の約５０％におけるｐ５３の突然変異は、間接的にＣＤＫ活性の脱調節をもたらすと考えられる。
【０００７】
現れつつあるデータより、抗増殖治療薬として、ＣＤＫ、特にＣＤＫ４およびＣＤＫ２を阻害する化合物を使用することの有効性が強力に確認される。特定の生物分子がこの目的のために推奨されている。例えば、ション（Ｘｉｏｎｇ）らの米国特許第５，６２１，０８２号は、ＣＤＫ６の阻害剤をコードする核酸を開示しており；ＷＩＰＯ国際公開公報第９９／０６５４０号は、ＣＤＫの阻害剤をコードする核酸を開示している。ペプチドおよびペプチド様阻害剤が、欧州特許公開０６６６２７０Ａ２号、バンダラ（Ｂａｎｄａｒａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、８９６〜９０１ページ（１９９７）、およびチェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ、第９６巻、４３２５〜４３２９ページ（１９９９）に記載されている。コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ、第９５巻、１４２７２〜１４２７７ページ（１９９８）において、ペプチドアパタマーがスクリーニングから同定された。いくつかの小分子がＣＤＫ阻害剤として同定されている（最近の総説については、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）、Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ、第７巻、８６５〜８８７ページ（１９９８）、およびストーバー（Ｓｔｏｖｅｒ）ら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．、第２巻、２７４〜２８５ページ（１９９９）参照）。フラボンのフラボピリドールは、他のキナーゼに比べてＣＤＫの阻害に対し、わずかに選択性を示すが、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、およびＣＤＫ１を等能力で阻害し、ＩＣ５０は０．１〜０．３μＭの範囲である。フラボピリドールは現在、腫瘍化学療法剤として第ＩＩ相臨床試験中である（セドラセク（Ｓｅｄｌａｃｅｋ）ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．、第９巻、１１４３〜１１６８ページ（１９９６））。フラボピリドールの類縁体は他の刊行物、例えば、マンスリ（Ｍａｎｓｕｒｉ）らの米国特許第５，７３３，９２０号（ＷＩＰＯ国際公開公報第９７／１６４４７号）およびＷＩＰＯ国際公開公報第９７／４２９４９号および第９８／１７６６２号でも主題とされている。プリンを基本とする誘導体がショウ（Ｓｃｈｏｗ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、第７巻、２６９７〜２７０２ページ（１９９７）；グラント（Ｇｒａｎｔ）ら、Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第３９巻、要旨１２０７（１９９８）；レグラベンド（Ｌｅｇｒａｖｅｎｄ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、第８巻、７９３〜７９８ページ（１９９８）；グレイ（Ｇｒａｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８１巻、５３３〜５３８ページ（１９９８）；チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３６１〜３７５ページ（１９９９）；ならびにＷＩＰＯ国際公開公報第９９／０２１６２号、第９９／４３６７５号、および第／９９／４３６７６号に記載されている。加えて、下記の刊行物はサイクリン依存性キナーゼおよび増殖因子仲介性キナーゼを阻害する一定のピリミジンを開示している：ＷＩＰＯ国際公開公報第９８／３３７９８号；ルエツ（Ｒｕｅｔｚ）ら、Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第３９巻、要旨３７９６（１９９８）；およびメイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第３９巻、要旨３７９４（１９９８）。
【０００８】
Ｇ１における細胞を阻止するベンゼンスルホンアミドが、エーザイ（Ｅｉｓａｉ Ｉｎｃ．）（ニュージャージー州ティーネック）によって開発中である。例えば、オワ（Ｏｗａ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、第４２巻、３７８９〜３７９９（１９９９）を参照されたい。オキシインドールＣＤＫ阻害剤が、グラクソ・ウェルカム（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）によって開発中で、ルジオ（Ｌｕｚｚｉｏ）ら、Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、巻、要旨４１０２（１９９９）およびＷＩＰＯ国際公開公報第９９／１５５００号を参照されたい。パウロン（Ｐａｕｌｌｏｎｅｓ）は、米国立がん研究所、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、第４２（１５）巻、２９０９〜２９１９ページ（１９９９）との共同研究によって見いだされた。インデノピラゾールがＷＩＰＯ国際公開公報第９９／１７７６９号およびセイツ（Ｓｅｉｔｚ）ら、第２１８回 ＡＣＳ Ｎａｔｌ． Ｍｔｇ．要旨ＭＥＤＩ３１６（１９９９年８月２２〜２６日、ニューオーリンズ）によって記載されている。アミノチアゾールがＷＩＰＯ国際公開公報第９９／２４４１６号および第９９／２１８４５号に記載されている。イソチアゾール誘導体がＷＩＰＯ国際公開公報第９９／６２８０号に記載されている。プロテインキナーゼのピラゾール阻害剤がＷＩＰＯ国際公開公報第９６／１４８４３号に記載されている。ピラゾール−４−オン類縁体がＷＩＰＯ国際公開公報第９９／５４３０８号に記載されている。タンパク質チロシンキナーゼｐ５６１ｃｋの阻害剤としての５−アミノピラゾールがＷＩＰＯ国際公開公報第９７／４００１９号に記載されている。
【０００９】
ＣＨＫ１はもう一つのプロテインキナーゼである。ＣＨＫ１は細胞周期進行におけるチェックポイントとして重要な役割を果たす。チェックポイントはサイクリン依存性キナーゼの生成、活性化およびその後の不活化に影響をおよぼすことにより細胞周期進行を調整する制御システムである。チェックポイントは不適当な時期の細胞周期進行を防止し、細胞が停止している間の細胞の代謝バランスを維持し、場合により、チェックポイントの要求が満たされないときにはアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導することもできる。例えば、オコナー（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ、第２９巻、１５１〜１８２ページ（１９９７）；ナース（Ｎｕｒｓｅ）、Ｃｅｌｌ、第９１巻、８６５〜８６７ページ（１９９７）；ハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６６巻、１８２１〜１８２８ページ（１９９４）；ハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、６２９〜６３４ページ（１９８９）を参照されたい。
【００１０】
一連のチェックポイントはゲノムの完全性をモニターし、ＤＮＡ損傷を感知すると、これらの「ＤＮＡ損傷チェックポイント」は細胞周期進行をＧ１およびＧ２期で阻止し、Ｓ期全般で進行を遅延させる。オコナー（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ、第２９巻、１５１〜１８２ページ（１９９７）；ハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６６巻、１８２１〜１８２８ページ（１９９４）。この作用により、ゲノムの複製前にＤＮＡ修復過程がその役割を完了することができ、続いてこの遺伝物質の新しい娘細胞への分離が起こる。重要なことに、ヒト癌において最も一般に突然変異している遺伝子、すなわちｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子は、ＤＮＡ損傷後にＧ１期において細胞周期を阻止し、かつ／またはアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導する、ＤＮＡ損傷チェックポイントタンパク質を産生する。ハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６６巻、１８２１〜１８２８ページ（１９９４）。ｐ５３腫瘍サプレッサーは、細胞周期のＧ２期においてＤＮＡ損傷チェックポイントの作用を強化することも明らかにされている。例えば、バンズ（Ｂｕｎｚ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８巻、１４９７〜１５０１ページ（１９９８）；ウィンターズ（Ｗｉｎｔｅｒｓ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１７巻、６７３〜６８４ページ（１９９８）；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１５巻、３０２５〜３０３５ページ（１９９７）を参照されたい。
【００１１】
ヒト癌におけるｐ５３腫瘍サプレッサー経路の中心的性質を考慮して、ｐ５３欠損癌における脆弱性を活用する治療的介入が積極的に探索されている。一つの明らかになりつつある脆弱性は、ｐ５３欠損癌細胞におけるＧ２チェックポイントの操作にある。癌細胞は、Ｇ１チェックポイントの制御を欠いているため、ＤＮＡ損傷物質であるＧ２チェックポイントの癌死滅効果から細胞を防護する、最後に残っているバリアの排除に対して特に脆弱である。Ｇ２チェックポイントは酵母からヒトまで保存されている制御系によって調節される。この保存された系において重要であるのは、ＤＮＡ損傷知覚複合体からシグナルを変換して、有糸分裂への進行を促進するサイクリンＢ／Ｃｄｃ２キナーゼの活性化を阻害する、キナーゼＣＨＫ１である。例えば、ペン（Ｐｅｎｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、１５０１〜１５０５ページ（１９９７）；サンチェス（Ｓａｎｃｈｅｚ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、１４９７〜１５０１ページ（１９９７）を参照されたい。ＣＨＫ１の不活化によって、抗癌剤により加えられたＤＮＡ損傷または内因性のＤＮＡ損傷によって誘導されたＧ２停止が排除され、同時にその結果生じるチェックポイント欠損細胞の優先的死滅が起こることが明らかにされている。例えば、ナース（Ｎｕｒｓｅ）、Ｃｅｌｌ、第９１巻、８６５〜８６７ページ（１９９７）；ウェイナート（Ｗｅｉｎｅｒｔ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、１４５０〜１４５１ページ（１９９７）；ウォルワース（Ｗａｌｗｏｒｔｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３６３巻、３６８〜３７１ページ（１９９３）；およびアルコデイリー（Ａｌ−Ｋｈｏｄａｉｒｙ）ら、Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ、第５巻、１４７〜１６０ページ（１９９４）を参照されたい。
【００１２】
癌細胞においてチェックポイント制御を選択的に操作することで、癌化学療法および放射線療法において広範に利用することができ、さらに、癌細胞破壊のための選択的基準として利用するためのヒト癌の「ゲノムの不安定性」の一般的特徴を示すこともできる。いくつかの因子によって、ＣＨＫ１はＤＮＡ損傷チェックポイント制御における重要な標的となる。Ｓ期の進行調節においてＣＨＫ１と協力することが最近判明したキナーゼＣＤＳ１／ＣＨＫ２（ゼン（Ｚｅｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９５巻、５０７〜５１０ページ（１９９８）；マツオカ（Ｍａｔｓｕｏｋａ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８２巻、１８９３〜１８９７ページ（１９９８）参照）などの、この機能的に関連するキナーゼの阻害剤を解明することで、癌治療のための有用で新しい治療法が提供されると考えられる。
【００１３】
もう一つのキナーゼ群はチロシンキナーゼである。チロシンキナーゼは受容体型（細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを有する）または非受容体型（完全に細胞内）でありうる。非受容体タンパク質チロシンキナーゼの少なくとも一つ、すなわちＬＣＫは、Ｔ細胞において細胞表面タンパク質（Ｃｄ４）と架橋抗Ｃｄ４抗体との相互作用からのシグナルの変換を仲介すると考えられる。非受容体チロシンキナーゼのより詳細な考察は、参照として本明細書に組み入れられる、ボーレン（Ｂｏｌｅｎ）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第８巻、２０２５〜２０３１ページ（１９９３）に記載されている。
【００１４】
細胞周期制御におけるその役割に加えて、プロテインキナーゼは、既存の血管から新しい毛細血管が形成される機構である、脈管形成においても重要な役割を果たしている。必要があれば、血管系は、組織および臓器の適当な機能を維持するために、新しい毛細管網を形成する能力を有する。しかし、成人では、脈管形成はかなり限定されており、創傷治癒および月経中の子宮内膜の血管新生の過程においてのみ起こる。メレンミーズ Ｊ．（Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ， Ｊ．）、パラダ Ｌ．Ｆ．（Ｐａｒａｄａ， Ｌ．Ｆ．）、ヘンケマイヤー Ｍ．（Ｈｅｎｋｅｍｅｙｅｒ， Ｍ．）、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、第８巻、３〜１０ページ（１９９７）参照。一方、好ましくない脈管形成は、網膜症、乾癬、慢性関節リウマチ、加齢黄斑変性症、および癌（固形腫瘍）などのいくつかの疾患の特徴である。フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、第１巻、２７〜３１ページ（１９９５）。脈管形成過程に関与することが知られているプロテインキナーゼには、増殖因子受容体チロシンキナーゼファミリーの３つのメンバーが含まれる：ＶＥＧＦ−Ｒ２（血管内皮増殖因子受容体２、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）およびＦＬＫ−１としても知られている）；ＦＧＦ−Ｒ（繊維芽細胞増殖因子受容体）；およびＴＥＫ（Ｔｉｅ−２としても知られている）。
【００１５】
内皮細胞上でのみ発現されるＶＥＧＦ−Ｒ２は、強力な脈管形成増殖因子ＶＥＧＦに結合し、その細胞内キナーゼ活性の活性化により、その後のシグナル変換を仲介する。したがって、シグナル変換を仲介することができないＶＥＧＦ−Ｒ２の突然変異体で示されているとおり、ＶＥＧＦ−Ｒ２のキナーゼ活性を直接阻害することで、外因性ＶＥＧＦ存在下でも脈管形成の低下をまねくことが予想される（ストローン（Ｓｔｒａｗｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５６巻、３５４０〜３５４５ページ（１９９６）参照）。ミラウアー（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５６巻、１６１５〜１６２０ページ（１９９６）。さらに、ＶＥＧＦ−Ｒ２は、ＶＥＧＦの脈管形成活性を仲介する以外に、成人では機能を持たないようである。したがって、ＶＥＧＦ−Ｒ２のキナーゼ活性の選択的阻害剤は、ほとんど毒性を示さないことが予想される。
【００１６】
同様に、ＦＧＦ−Ｒは脈管形成増殖因子ａＦＧＦおよびｂＦＧＦに結合し、その後の細胞内シグナル変換を仲介する。最近、ｂＦＧＦなどの増殖因子は、一定のサイズに到達している固形腫瘍の脈管形成誘導において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。ヨシジ（Ｙｏｓｈｉｊｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５７巻、３９２４〜３９２８ページ（１９９７）。しかし、ＶＥＧＦ−Ｒ２とは異なり、ＦＧＦ−Ｒは体中のいくつかの異なる細胞型で発現され、成人の他の正常な生理的過程において重要な役割を果たすこともあれば、果たしていないこともある。それにも関わらず、ＦＧＦ−Ｒのキナーゼ活性の小分子阻害剤をマウスに全身投与すると、明らかな毒性を示すことなく、ｂＦＧＦが誘導する脈管形成を阻害することが報告されている。モハマド（Ｍｏｈａｍｍａｄ）ら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第１７巻、５９９６〜５９０４ページ（１９９８）。
【００１７】
ＴＥＫ（Ｔｉｅ−２としても知られている）は内皮細胞上でのみ発現されるもう一つの受容体チロシンキナーゼで、脈管形成において重要な役割を果たすことが明らかにされている。因子アンジオポエチン−１の結合により、ＴＥＫのキナーゼドメインの自己リン酸化が起こり、かつ内皮細胞と内皮周辺支持細胞との相互作用を仲介すると思われるシグナル変換過程が起こり、それにより新しく形成された血管の成熟が促進される。一方、因子アンジオポエチン−２は、アンジオポエチン−１のＴＥＫに対する作用に拮抗すると思われ、脈管形成を破壊する。メゾンピエール（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、５５〜６０ページ（１９９７）。
【００１８】
前述の開発の結果、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＦＧＦ−Ｒ、および／またはＴＥＫのキナーゼ活性を阻害する化合物の使用により、脈管形成を治療することが提唱されている。例えば、ＷＩＰＯ国際公開公報第９７／３４８７６号はＶＥＧＦ−Ｒ２の阻害剤である一定のシノリン誘導体を開示しており、癌、糖尿病、乾癬、慢性関節リウマチ、カポジ肉腫、血管腫、急性および慢性腎症、粥腫、動脈再狭窄、自己免疫疾患、急性炎症、ならびに網膜の血管増殖を伴う眼疾患などの、異常な脈管形成および／または血管透過性増大に関連する疾患状態の治療に用いることができる。
【００１９】
前述のプロテインキナーゼに加えて、多くの他のプロテインキナーゼが治療標的であると考えられており、下記の文献に概説されているとおり、多くの刊行物がキナーゼ活性の阻害剤を開示している：マクマホン（ＭｃＭａｈｏｎ）ら、「薬物の発見および開発における、現行の見解（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、第１巻、１３１〜１４６ページ（１９９８）；ストローンら、Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ、第７巻、５５３〜５７３ページ（１９９８）。
【００２０】
しかし、容易に合成することができ、ＣＨＫ１、ＶＥＧＦ、およびＣＤＫまたはＣＤＫ／サイクリン複合体などの一つまたは複数のプロテインキナーゼの強力な阻害剤である、他の小分子化合物がさらに必要とされている。ＣＤＫ４はほとんどの細胞で細胞分裂の一般的活性化物質としてはたらきうるため、また、ＣＤＫ４／サイクリンＤおよびＣＤＫ２／サイクリンＥの複合体は、細胞周期のＧ１期初期を支配するため、一つまたは複数の種類の腫瘍を治療するために、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ２の有効かつ特異的阻害剤が必要とされている。
【００２１】
発明の概要
したがって、本発明の一つの目的は、ＶＥＧＦ、ＣＨＫ１ならびに／またはＣＤＫ２、ＣＤＫ４、および／もしくはＣＤＫ６などのＣＤＫ、またはそれらのサイクリン複合体などの、一つまたは複数のプロテインキナーゼの活性を阻害する化合物および薬物組成物を得ることである。そのような化合物および組成物は、哺乳類キナーゼ／サイクリンキナーゼ、昆虫キナーゼ、および真菌キナーゼを阻害するために用いることができる。
【００２２】
さらなる目的は、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ４／Ｄ型サイクリン複合体および／またはＣＤＫ２もしくはＣＤＫ２／Ｅ型サイクリン複合体の阻害などのキナーゼ阻害により、癌の適応を治療する有効な方法を提供することである。もう一つの目的は、癌細胞の増殖期への移行を阻止するのに有効な、下記の化合物を含む薬学的組成物を得ることである。
【化２９】
本発明のこれらの、および他の目的ならびに利点は、下記の詳細な説明に鑑みて明らかになると考えられるが、以下に記載する本発明の細胞周期制御剤の使用によって達成される。
【００２３】
一つの一般的局面に従い、本発明は式Ｉの化合物に向けられる：
式中：
Ｒ１は置換または無置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ２は置換または無置換ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、かつ
Ｒ３は水素、ハロゲン、（フッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素）または置換もしくは無置換Ｃ１−８アルキルであるか、または
Ｒ２およびＲ３が共に置換または無置換５員環アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルを形成している。
【００２４】
本発明は、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩にも向けられる。本発明はさらに、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグに向けられる。加えて、本発明は式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、およびそのような代謝産物の薬学的に許容される塩に向けられる。
【００２５】
もう一つの一般的局面において、本発明はそれぞれが以下を含む、薬学的組成物に向けられる：
（ａ）式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、およびそのような代謝産物の薬学的に許容される塩から選択される、細胞周期制御剤；ならびに
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【００２６】
本発明のもう一つの一般的局面に従い、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ２の阻害によって仲介されるもののような、プロテインキナーゼ阻害によって仲介される疾患または障害を治療するための細胞周期制御剤として、式Ｉの化合物を用いる方法であって、それを必要とする患者に、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を投与することによる方法がさらに提供される。
【００２７】
本発明は、悪性腫瘍を治療する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩の、有効量を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【００２８】
本発明は、癌を治療する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩の、有効量を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【００２９】
本発明は、好ましくない脈管形成および／または細胞増殖に関連する疾患状態を治療する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩の、有効量を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【００３０】
本発明は、真菌感染を治療する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩の、有効量を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【００３１】
本発明は、プロテインキナーゼ複合体のキナーゼ活性を調節および／または阻害する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与することによる方法をさらに提供する。
【００３２】
本発明に従い、投与によって増殖、分化および／またはアポトーシスを制御するための、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物の治療的使用も提供される。
【００３３】
本発明に従い、癌、ならびに好ましくない脈管形成および／または細胞増殖に関連する、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、慢性関節リウマチ、および乾癬などの他の疾患状態などの、キナーゼ活性によって仲介される疾患を治療する際の、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物の治療的使用も提供される。
【００３４】
本発明の他の局面、利点、および特徴は、下記の詳細な説明から明らかになると考えられる。
【００３５】
発明の詳細な説明および好ましい態様
前述の式Ｉの本発明の化合物は、プロテインキナーゼ、例えば、ＣＨＫ１、ＶＥＧＦ、および細胞周期のＧ０またはＧ１期において活性であるもの（例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、および／またはＣＤＫ６複合体）などのＣＤＫ／サイクリン複合体の活性を仲介および／または阻害するのに有用である。本発明の化合物は、哺乳類キナーゼ／サイクリン複合体、昆虫キナーゼ、または真菌キナーゼ複合体の阻害剤として有用である。より詳細には、化合物は増殖、分化、および／またはアポトーシスを制御するために有用な細胞周期制御剤として有用であり、したがって癌またはプロテインキナーゼによって仲介される細胞増殖に関連する他の疾患の治療を提供する。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、「アルキル」という用語は、１個から１２個の炭素原子を有する直鎖および分枝鎖アルキルを含む。任意の適当なアルキルはＲ１として用いることができる。典型的なアルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルなどが含まれる。アルキルは置換されていても、無置換でもよい。適当な置換アルキルには、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２−フルオロメチル、３−フルオロプロピル、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピルなどが含まれる。「低級アルキル」という用語は、１個から８個の炭素原子を有するアルキル（例えば、Ｃ１−８アルキル）を示す。任意の適当なアルキルをＲ３として用いることができる。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキル基を含む。実例にはメトキシ、エトキシ、プロポキシなどが含まれる。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「ハロゲン」という用語は、塩素、フッ素、ヨウ素、または臭素を含む。「ハロ」という用語は、クロロ、フルオロ、ヨード、またはブロモを意味する。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「カルボキシアミド」という用語は、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ２基を含む。アミド基（ＮＨ２）は置換されていても、無置換でもよい。
【００４０】
「シクロアルキル」という用語は、二環式および三環式シクロアルキル構造を含む、３個から１２個の炭素原子を有する飽和炭素環を含む。適当なシクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが含まれる。
【００４１】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、炭素原子、好ましくは４個または５個の環炭素原子、ならびに窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含み、かつ不飽和を持たない、単環式の基を含む。典型的なヘテロシクロアルキルには、ピロリジニル、ピペリジニル、チアジニル、およびモルホリニルが含まれる。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、「アリール」（Ａｒ）および「ヘテロアリール」という用語は、単環式および多環式不飽和芳香環構造を含み、「アリール」は炭素環のものを意味し、「ヘテロアリール」は複素環のものを意味する。芳香環構造の例には、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フリル、チエニル、ピロリル、ピリジル、ピリジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、１，２，３−トリアジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１−Ｈ−テトラゾル−５−イル、インドリル、キノリニル、ベンゾチオフェニル（チアナフテニル）、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリニル、アクリジニル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニルなどが含まれる。いかなる適当な縮合または非縮合、単環式または多環式のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルもＲ１として用いることができる。任意の適当な縮合または非縮合、単環式または多環式のヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルもＲ２として用いることができる。任意の適当な５員環のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルをＲ２およびＲ３から形成することができる。
【００４３】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３基は無置換でも、任意の適当な置換基で置換されていてもよい。適当な置換基の例は、下記の典型的な化合物中に見いだされるもの、ならびに以下である：ハロゲン（クロロ、ヨード、ブロモ、またはフルオロ）；Ｃ１−６アルキル；Ｃ１−６アルケニル；Ｃ１−６アルキニル；ヒドロキシル；Ｃ１−６アルコキシル；アミノ；ニトロ；チオール；チオエーテル；イミン；シアノ；アミド；ホスホナト；ホスフィン；カルボキシル；チオカルボニル；スルホニル；スルホンアミド；ケトン；アルデヒド；エステル；酸素（＝Ｏ）；ハロアルキル（例えばトリフルオロメチル）；単環式または縮合もしくは非縮合多環式であってもよいシクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシル）、あるいは単環式または縮合もしくは非縮合の多環式であってもよいヘテロシクロアルキル（例えば、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、またはチアジニル）；シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル、単環式または縮合もしくは非縮合の多環式アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ピロリル、インドリル、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、キノリニル、イソキノリニル、アクリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチオフェニル、またはベンゾフラニル）；アミノ（一級、二級、または三級）；ニトロ；チオール；チオエーテル；Ｏ−低級アルキル；Ｏ−アリール、Ｓ−アリール、アリール；アリール−低級アルキル；ＣＯ２ＣＨ３；ＣＯＮＨ２；ＯＣＨ２ＣＯＮＨ２；ＮＨ２；ＳＯ２ＮＨ２；ＯＣＨＦ２；ＣＦ３；ＯＣＦ３など。そのような部分は縮合環構造または架橋、例えばＯＣＨ２−Ｏで選択的に置換されていてもよい。これらの置換基はそのような基から選択される置換基で、選択的にさらに置換されていてもよい。
【００４４】
好ましい態様において、Ｒ１は置換または無置換フェニルである。好ましい置換基には、水酸基およびアルコキシ基、ならびにＳＯ２ＮＨ２および選択的に置換されたカルボキサミドなどの電子吸引基が含まれる。
【００４５】
好ましい態様において、Ｒ２は置換または無置換ヘテロアリール基である。特に好ましいＲ２基は、ピリジン、チオフェン、ベンゾチオフェン、インドール、またはベンズイミダゾールなどの、実施例の化合物中に見いだされる。Ｒ２基の特に好ましい置換基には、塩素、臭素、フッ素、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、アルキル、Ｓ−アルキル、Ｏ−アリール、アルコキシ基、−Ｓ−アリール、およびシクロアルキル基、ならびに下記の典型的な化合物中の置換基が含まれる。
【００４６】
一つの好ましい態様において、Ｒ３は水素である。もう一つの好ましい態様において、Ｒ２およびＲ３は５員環炭素環を形成する。
【００４７】
好ましい態様において、Ｒ１およびＲ２は下記の基から独立に選択される：
Ｒ１：
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
および
【化３５】
Ｒ２：
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
および
【化４２】
式中：
Ａｒはアリールであり；
Ｒ５は水素、Ｒ７、ＯＲ７、ＮＲ７Ｒ７、チオアルキル、またはチオアリールであり；かつ
Ｒ６は水素またはＲ７であり；かつ
Ｒ７は置換または無置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルである。
【００４８】
本発明の好ましい化合物には以下が含まれる：
【化４３】
【化４４】
【化４５】
【化４６】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【化５０】
【化５１】
【化５２】
【化５３】
【化５４】
【化５５】
【化５６】
【化５７】
【化５８】
【化５９】
【化６０】
【化６１】
【化６２】
【化６３】
【化６４】
【化６５】
および
【化６６】
【００４９】
式Ｉの化合物は互変異性の現象を示すこともあるが、本明細書中の式の図は可能な互変位型の一つだけを特に示していることが理解される。したがって、式は図示された化合物の任意の互変異型を表すことが意図され、式の図によって示された特定の互変異型に単純に限定されないことが理解されるべきである。
【００５０】
本発明の化合物のいくつかは、単一の立体異性体（すなわち、本質的に他の立体異性体を含まない）、ラセミ体、ならびに／または鏡像異性体および／もしくはジアステレオマーの混合物として存在しうることも理解される。そのような単一の立体異性体、ラセミ体、およびそれらの混合物はすべて、本発明の範囲内であることが意図される。好ましくは、光学的に活性な本発明の化合物は光学的に純粋な形で用いる。
【００５１】
当業者には一般に理解されているとおり、一つのキラル中心（すなわち、一つの不斉炭素原子）を有する光学的に純粋な化合物は、基本的に二つの可能な鏡像異性体の一つからなるものであり（すなわち、鏡像異性体として純粋であり）、かつ複数のキラル中心を有する光学的に純粋な化合物は、ジアステレオマーおよび鏡像異性体のいずれとしても純粋なものである。好ましくは、本発明の化合物は、光学的に少なくとも９０％純粋な形、すなわち単一の異性体を少なくとも９０％含む形（８０％の鏡像体過剰（「ｅ．ｅ．」）またはジアステレオマー過剰（「ｄ．ｅ．」））で用い、より好ましくは少なくとも９５％（９０％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％（９５％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、および最も好ましくは少なくとも９９％（９８％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）で用いる。
【００５２】
加えて、式は同定された構造の溶媒和ならびに非溶媒和型を含むことが意図される。例えば、式Ｉは示された構造の化合物を、水和および非水和型の両方で含む。溶媒和化合物の他の例は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、またはエタノールアミンとの組み合わせの構造を含む。
【００５３】
本発明の化合物は、式Ｉの化合物ならびにそのような化合物の薬学的に許容される塩、そのような化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、そのような化合物の薬学的に活性な代謝産物、およびそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を含む。
【００５４】
「薬学的に許容される塩」は、特定の化合物の遊離酸および塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物学的にまたはそれ以外で有害ではない塩を意味することが意図される。本発明の化合物は、十分に酸性、十分に塩基性、または両方の官能基を有していてもよく、したがって、任意のいくつかの無機または有機塩基、ならびに無機および有機酸と反応して、薬学的に許容される塩を生成することができる。典型的な薬学的に許容される塩には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、およびマンデル酸塩を含む塩などの、本発明の化合物と鉱酸もしくは有機酸または無機塩基との反応によって調製される塩が含まれる。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容されるプロドラッグ」という用語は、生理的条件下、または加溶媒分解によって特定の化合物またはそのような化合物の薬学的に許容される塩に変換されうる、薬学的に許容される化合物を意味する。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される活性代謝産物」という用語は、特定の化合物またはその塩の体内での代謝により産生される薬理学的に活性な産物を意味する。化合物のプロドラッグおよび活性代謝産物は、当技術分野において公知の日常的技術を用いて同定することができる。例えば、ベルトリーニ Ｇ．（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ， Ｇ．）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、第４０巻、２０１１〜２０１６ページ（１９９７）；シャン Ｄ．（Ｓｈａｎ， Ｄ．）ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．第８６巻（７）、７６５〜７６７ページ；バグシャウエ Ｋ．（Ｂａｇｓｈａｗｅ Ｋ．）、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ．、第３４巻、２２０〜２３０ページ（１９９５）；ボーダー Ｎ．（Ｂｏｒｄｏｒ， Ｎ．）、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．、第１３巻、２２４〜３３１ページ（１９８４）；バンガード Ｈ．（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｈ．）編、「プロドラッグの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８５）；ラーセン Ｉ．Ｋ．（Ｌａｒｓｅｎ， Ｉ． Ｋ．）、「第５章−プロドラッグの設計および応用（Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」、「薬物の設計および開発（Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、クロッグスガード−ラーセン（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｓｅｎ）ら編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、スイス（１９９１）を参照されたい。式Ｉの化合物のプロドラッグ、代謝産物、および代謝産物の薬学的塩の活性は、本明細書に記載されているような試験を用いて調べることができる。
【００５６】
本発明の化合物が塩基である場合、所望の薬学的に許容される塩は、当技術分野において利用可能な任意の適当な方法、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピロビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、グルクロン酸もしくはガラクツロン酸などのピラノシジル酸、クエン酸もしくは酒石酸などのアルファ−ヒドロキシ酸、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのアミノ酸、安息香酸塩もしくはケイヒ酸などの芳香族酸、ｐ−トルエンスルホン酸もしくはエタンスルホン酸などのスルホン酸などの有機酸を用いた、遊離塩基の処理によって調製することができる。
【００５７】
本発明の化合物が酸である場合、所望の薬学的に許容される塩は、任意の適当な方法、例えば、アミン（一級、二級または三級）、アルカリ金属水酸化物、またはアルカリ土類金属水酸化物などの無機または有機塩基を用いた、遊離酸の処理によって調製することができる。適当な塩の実例には、グリシンおよびアルギニンなどのアミノ酸、アンモニア、一級、二級および三級アミン、ならびにピペリジン、モルホリンおよびピペラジンなどの環状アミン由来の有機塩と、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウムおよびリチウム由来の無機塩とが含まれる。
【００５８】
固体物質の場合には、当業者であれば、本発明の化合物および塩は異なる結晶または多形の形で存在してもよく、これらはすべて本発明および明記された式の範囲内であることが意図される。
【００５９】
本発明の薬学的組成物は、式Ｉの化合物の代わりに、またはそれに加えて、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物のプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物またはそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を活性成分として含むこともできる。そのような化合物、塩、プロドラッグ、および代謝産物は、本明細書において総称して「細胞周期制御剤」と呼ばれることもある。
【００６０】
本発明の細胞周期制御剤は、哺乳類、特にヒトにおいて、内在組織の好ましくない増殖によって特徴付けられる、増殖性障害を治療するための医薬品として有用である。式Ｉの化合物は、過度の細胞増殖に関連する障害、例えば、癌、乾癬、白血球の好ましくない増殖を含む免疫障害、ならびに再狭窄および他の平滑筋障害を有する被験者を治療するために用いることができる。さらに、そのような化合物は有糸分裂後組織および／または細胞の脱分化を防止するために用いることもできる。
【００６１】
本発明の薬学的組成物または調製物は、薬学的に許容される担体、および少なくとも一つの細胞周期制御剤の有効量を含む。治療または阻害の効果を得るために投与される細胞周期制御剤の特定の用量は、例えば、投与される特定の物質、投与経路、治療される状態、および治療される被験者または宿主を含む、状況を取り巻く特定の環境に従い、当技術分野において公知の様式で決定される。細胞周期制御剤の典型的な１日の総用量は、一回または複数回で投与してもよいが、体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇから約５０ｍｇの用量を含む。
【００６２】
本発明の細胞周期制御剤は、経口、直腸内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、または鼻腔内などの、様々な適当な経路のいずれによって投与してもよい。細胞周期制御剤は、好ましくは、投与前に所望の経路に適した組成物に調剤される。
【００６３】
本発明の薬学的組成物または調製物は、細胞周期制御剤の有効量、およびこの物質のための希釈剤または賦形剤などの薬学的に許容される担体とを含む。担体が希釈剤としてはたらく場合、これは一つまたは複数の活性成分のための媒体、賦形剤、または媒質としてはたらく固体、半固体、または液体材料でありうる。本発明の組成物は、一つまたは複数の活性成分を担体と混合する、もしくは活性成分を担体で希釈する、または活性成分をカプセル、サシェ、紙容器などの形でありうる担体中に封入もしくはカプセル化することによって製造することができる。一つまたは複数の細胞周期制御剤および任意の他の活性成分以外の、典型的な成分には、アビセル（微結晶性セルロース）、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム二水和物、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、落花生油、オリーブ油、モノステアリン酸グリセリン、トゥイーン８０（ポリソルベート８０）、１，３−ブタンジオール、カカオ脂、蜜ろう、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、および水が含まれる。
【００６４】
組成物は、所望の投与様式に適した任意の様々な形状で調製することができる。例えば、薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾル（固体として、または液体媒質中で）、軟膏（例えば、１０％重量までの細胞周期制御剤を含む）、軟ゲルおよび硬ゲルカプセル剤、坐剤、滅菌注射用溶液、滅菌包装粉末などの形に調製することができる。
【００６５】
同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの当技術分野において公知の遅延型または持効性材料を、単独またはろう、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸メチルなどと共に含むこともできる。
【００６６】
様々な薬学的剤形を用いることができる。したがって、固体担体を用いる場合、調製物は錠剤化するか、粉末もしくはペレットの形で硬ゼラチンカプセルに入れるか、またはトローチもしくはロゼンジの形とすることもできる。固体担体の量は変動しうるが、一般には約２５ｍｇから約１ｇまでと考えられる。液体担体を用いる場合、調製物はシロップ、乳剤、軟ゼラチンカプセル、アンプルもしくはバイアル中の滅菌注射用溶液もしくは懸濁液、または非水性懸濁液の形でありうる。
【００６７】
安定な水溶性剤形を得るために、本発明の物質の薬学的に許容される塩を、コハク酸またはクエン酸の０．３Ｍ溶液などの、有機酸または無機酸の水溶液に溶解する。溶解性の塩の形が利用不可能な場合、物質を適当な共溶媒または複数の共溶媒の組み合わせに溶解してもよい。適当な共溶媒の例には、全体積の０〜６０％の範囲の濃度での、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリソルベート８０、グリセリンなどが含まれるが、これらに限定されない。例えば、式Ｉの化合物はＤＭＳＯに溶解し、水で希釈することができる。組成物は、水または等張食塩もしくはデキストロース溶液などの適当な水性媒体中で、活性成分の塩の溶液の形であってもよい。
【００６８】
本発明の組成物は、薬学的組成物を調製するための一般に公知の様式で、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥などの通常の技術を用いて製造することができる。
【００６９】
薬学的組成物は、活性化合物を薬学的に用いることができる調製物へ加工するのを容易にする、賦形剤および補助剤から選択することができる、一つまたは複数の生理的に許容される担体を用いる通常の様式で調剤することができる。
【００７０】
適当な調剤は、選択された投与経路に応じて異なる。注射のためには、本発明の物質は水溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液、または生理食塩緩衝液などの生理的に適合する緩衝液に調剤することができる。経粘膜投与のためには、透過すべき障壁に適した浸透剤を製剤中で用いる。そのような浸透剤は当技術分野において公知である。
【００７１】
経口投与のためには、化合物は、活性化合物を当技術分野において公知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に調剤することができる。そのような担体は、本発明の化合物を、治療される患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして調剤することを可能にする。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤を活性成分（物質）との混合物で用い、得られた混合物を選択的に粉砕し、かつ、錠剤または糖衣錠の中心を得るために、望まれる場合には適当な補助剤を加えた後に顆粒混合物を加工することによって得ることができる。適当な賦形剤には次のものが含まれる：乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの充填剤；およびセルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）。望まれる場合には、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの崩壊剤を加えてもよい。
【００７２】
糖衣錠の中心は適当なコーティングと共に提供される。この目的のために、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒もしくは溶媒混合物を選択的に含んでいてもよい、濃縮糖溶液を用いることができる。識別のため、または活性物質の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに加えることもできる。
【００７３】
経口で用いることができる薬学的調製物には、ゼラチン製のプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセルと同様、ゼラチンならびにグリセロールおよびソルビトールなどの可塑剤製の密封軟カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、活性成分を、乳糖などの充填剤、澱粉などの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ならびに選択的に安定化剤との混合物で含むことができる。軟カプセル中では、活性物質は、脂肪油、流動パラフィン、または液状ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁されていてもよい。加えて、安定化剤も加えることができる。経口投与のためのすべての製剤は、そのような投与に適した剤形であるべきである。口腔内投与のためには、組成物は通常の様式で調剤された錠剤またはロゼンジの形を取ることもできる。
【００７４】
鼻腔内または吸入による投与のために、本発明に従って用いるための化合物は、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いて、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾル噴霧の形で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は測定した量を送達するための弁を用いることによって定量することができる。吸入器または注入器などで用いるためのゼラチンのカプセルまたはカートリッジは、化合物および乳糖またはデンプンなどの適当な粉末基剤の混合粉末を含んで調剤することができる。
【００７５】
化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために調剤することもできる。注射用製剤は、保存剤を加えた単位用量剤形、例えばアンプルで、または複数用量容器で提供することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液または乳濁液などの形をとることもでき、また懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤を含むこともできる。
【００７６】
非経口投与のための薬学的製剤には、水溶性の活性化合物の水溶液が含まれる。加えて、適当な油性注射懸濁剤として、活性化合物の懸濁液も調製することができる。適当な親油性溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁剤の粘性を高める物質を含むことができる。選択的に、懸濁剤は適当な安定化剤または化合物の溶解性を高めて高濃度溶液の調製を可能にする物質も含むことができる。
【００７７】
眼への投与のために、式Ｉの化合物は、化合物を角膜ならびに、例えば、前房、後房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網膜および強膜を含む、眼の内部領域に浸透させるのに十分な時間、眼球表面に接触し続けさせるような、薬学的に許容される眼用媒体中で送達される。薬学的に許容される眼用媒体は、軟膏、植物油、またはカプセル化材料でありうる。本発明の化合物は、硝子体液および房水中に直接注射することもできる。
【００７８】
または、活性成分は適当な媒体、例えば、使用前に発熱原を含まない滅菌水と、構成するための粉末の形であってもよい。化合物は、坐剤または保持浣腸などの直腸組成物、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含む組成物に調剤することもできる。
【００７９】
前述の製剤に加えて、化合物はデポー調製物として調剤することもできる。そのような長期作用製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与してもよい。したがって、例えば、化合物は適当な重合体もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体、例えば、難溶性の塩として調剤することもできる。
【００８０】
疎水性化合物のための薬学的担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機重合体、および水相を含む共溶媒系である。共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖ非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００の、無水エタノールで体積を合わせた溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、５％デキストロース水溶液で１：１に希釈したＶＰＤを含む。この共溶媒系は、疎水性化合物をよく溶解し、それ自体は全身投与した場合に低毒性である。もちろん、共溶媒系の比率は、その溶解性および毒性を破壊することなく、大幅に変動しうる。さらに、共溶媒成分の同一性も変動しうる：例えば、他の低毒性で非極性の界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ；ポリエチレングリコールの比率の大きさが変動してもよく；他の生物適合性重合体、例えば、ポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ；他の糖類または多糖をデキストロースの代わりに用いることができる。
【００８１】
または、疎水性の薬学的化合物の他の送達系を用いることもできる。リポソームおよび乳濁液は、疎水性薬物の送達媒体または担体の公知の例である。ジメチルスルホキシドなどの一定の有機溶媒も用いることができるが、通常は毒性がより高いという犠牲が伴う。加えて、化合物は、治療物質を含む固体疎水性重合体の半透過性マトリックスなどの、持続放出系を用いて送達することもできる。様々な持続放出材料が確立されており、当業者には公知である。持続放出性カプセルは、その化学的性質に応じて、化合物を数週間から１００日以上にわたって放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のための他の戦略を用いることもできる。
【００８２】
薬学的組成物は、適当な固相もしくはゲル相担体または賦形剤を含むこともできる。そのような担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどの重合体が含まれる。
【００８３】
本発明の化合物のいくつかは、薬学的に適合性の対イオンとの塩として提供されてもよい。薬学的に適合性の塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む多くの酸と形成されうる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基型よりも溶解性が高い傾向にある。
【００８４】
本発明の薬学的組成物は、細胞周期制御剤および、選択的に、細胞周期制御剤と適合性で、かつ治療される適応症に適した公知の抗増殖剤などの、一つまたは複数の他の活性成分を含む。
【００８５】
化合物は抗脈管形成剤として、ならびにプロテインキナーゼの活性を調節および／または阻害するための薬剤として有用であり、したがって、癌またはプロテインキナーゼによって仲介される細胞増殖に関連する他の疾患の治療を提供する。
【００８６】
本発明の物質の治療上有効量を、プロテインキナーゼの調節または制御によって仲介される疾患を治療するために用いることができる。「有効量」とは、物質がそのような治療を必要とする哺乳類に投与される場合、一つまたは複数のプロテインキナーゼの活性によって仲介される疾患の治療を行うのに十分な物質の量を意味することが意図される。したがって、例えば、式Ｉの化合物、その塩、活性代謝産物、またはプロドラッグの治療上有効量は、一つまたは複数のプロテインキナーゼの活性を、その活性によって仲介される疾患状態が軽減または緩和されるように、調節、制御または阻害するのに十分な量である。
【００８７】
そのような量に対応すると考えられる所与の物質の量は、特定の化合物、疾患状態およびその重症度、治療を必要とする哺乳類の同一性（例えば体重）などの因子に応じて変動すると考えられるが、それにも関わらず、当業者により日常的に決定することができる。「治療」とは、一つまたは複数のプロテインキナーゼの活性によって、少なくとも部分的に影響を受けている、ヒトなどの哺乳類における疾患状態の、少なくとも軽減を意味することが意図され、以下を含む：特に哺乳類が疾患状態の素因を有することが判明しているが、その疾患状態を有すると診断されていない場合に、その哺乳類において疾患状態が起こるのを予防する段階；疾患状態を調節および／もしくは阻害する段階；ならびに／または疾患状態を緩和する段階。
【００８８】
本発明の物質は、本明細書に記載の反応経路および合成方式を用い、当技術分野において利用可能な技術を用い、かつ容易に入手可能な出発物質を用いて調製することができる。本発明の好ましい化合物の調製は、下記の実施例に詳細に記載されているが、当業者であれば記載されている化学反応は、本発明のいくつかの他のプロテインキナーゼ阻害剤を調製するために容易に適応させうることを理解すると考えられる。例えば、本発明の例示されていない化合物の合成は、当業者には明らかな改変によって、例えば、妨害基を適当に保護することにより、他の当技術分野において公知の適当な試薬に変更することにより、または反応条件の日常的改変を行うことにより、首尾よく実施することができる。または、本明細書に開示されているか、または当技術分野において公知の他の反応は、本発明の他の化合物を調製するための適用可能性を有することが理解されると考えられる。
【００８９】
本発明の物質を調製する際に用いるための典型的な反応経路および合成方式を以下に示す。
【００９０】
「保護基」とは、一つまたは複数の固有の官能基を時期尚早の反応から保護する基を意味する。適当な保護基は、化合物を構築するために用いられる官能基および特定の化学反応を考慮して、当業者であれば日常的に選択することができる。適当な保護基の例は、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびウッツ（Ｗｕｔｚ）、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１）に記載されている。ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）などにおける本発明の実施において有用な典型的保護基。
【００９１】
実施例
下記の実施例において、特に記載のない限り、温度はすべて摂氏温度で示し、割合％は重量によるものである。試薬はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）またはランカスター・シンセシス（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｌｔｄ．）などの商業的供給会社から購入し、特に記載のない限り、それ以上の精製をせずに用いた。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から確かな密封瓶入りを購入し、受け取ったままで用いた。溶媒はすべて、当業者には容易に明らかとなる標準法を用いて精製した。
【００９２】
下記の反応は一般には、窒素、アルゴンまたは乾燥チューブ付きの陽圧下、室温（特に記載のない限り）、無水溶媒中で実施し、反応フラスコにはシリンジから基質および試薬を導入するためのゴム膜を取りつけた。ガラス器具は乾燥器乾燥および／または熱乾燥した。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、裏がガラスのＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（０．２５ｍｍ）で行い、適当な溶媒比（ｖ／ｖ）で溶出し、場合に即して示している。反応はＴＬＣ、ＮＭＲまたはＨＰＬＣで分析し、出発物質の消費により判断して停止した。
【００９３】
ＴＬＣプレートの可視化は、ＵＶランプ、ヨウ素、またはｐ−アニスアルデヒド噴霧試薬もしくはリンモリブデン酸試薬（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、２０％重量エタノール溶液）および加熱しての活性化により行った。後処理は一般的には、反応物の体積を反応溶媒または抽出溶媒で二倍にし、次いで、特に記載のない限り抽出体積の２５％体積で、記載の水性溶液を用いて洗浄することにより実施した。生成物溶液は無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、ろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで減圧下に蒸発させ、溶媒を減圧除去したものとして記した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（スティル（Ｓｔｉｌｌ）ら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、４３、２９２３（１９７８））は、特に記載のない限り、Ｍｅｒｃｋ ＥＭフラッシュシリカゲル（４７〜６１μｍ）を、シリカゲル：粗生成物の比約２０：１〜５０：１で用いて行った。水素化分解は実施例中に示された圧または大気圧で行った。
【００９４】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒの機器を３００ＭＨｚで操作して記録し、１３Ｃ−ＮＭＲは７５ＭＨｚで操作して記録した。ＮＭＲスペクトル（ｐｐｍで報告）はＣＤＣｌ３溶液で、標準としてクロロホルム（７．２５ｐｐｍおよび７７．００ｐｐｍ）もしくはＣＤ３ＯＤ（３．４および４．８ｐｐｍならびに４９．３ｐｐｍ）、またはしかるべき場合には内部標準のテトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）を用いて記録した。他のＮＭＲ溶媒も必要に応じて用いた。ピークの多重度を報告する場合には、下記の略語を用いる：ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ（幅広）、ｄｄ（二重線の二重線）、ｄｔ（三重線の二重線）。カップリング定数を示す場合は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告する。
【００９５】
赤外（ＩＲ）スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＦＴ−ＩＲ分光器で、ニートオイル、ＫＢｒ錠、またはＣＤＣｌ３溶液として記録し、波数（ｃｍ−１）で報告する。質量分析スペクトルは、ＬＳＩＭＳまたはエレクトロスプレーを用いて記録した。融点（ｍｐ）はすべて未補正である。
【００９６】
特に記載のない限り、出発物質は市販されているか、または当技術分野において公知の一般的技術を用いて得ることができる。
【００９７】
典型的化合物
実施例１（ａ）：フェニル−（５−チオフェン−２−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−アミン（化合物Ａ）
【化６７】
２−アセチルチオフェン（０．９３ｍＬ、８．６ｍｍｏｌ）およびイソチオシアン酸フェニル（１．０３ｍＬ、８．６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（６ｍＬ）中、０℃で撹拌した。水素化ナトリウム（３８０ｍｇ、９．５ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を加え、反応混合物を室温で１．５時間（すべてのガス発生が止まるまで）撹拌した。ヨードメタン（５９０μＬ、９．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１時間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣をエーテル（６０ｍＬ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）および食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、濃縮して黄色オイルを得た。
【００９８】
この粗Ｎ，Ｓ−アセタールをエタノール（１５ｍＬ）に溶解した。ヒドラジン水和物（６２５μＬ、１２．９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１６時間撹拌還流させた。次いでこれを減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＨ／Ｈｅｘ）で精製した。ＣＨＣｌ３／ヘキサン２：１からの沈殿物をろ取して、７２０ｍｇ（収率３５％）の化合物Ａを白色固体で得た。
関連する方法については、参照として本明細書に組み入れられる、ビシュワカルマ（Ｖｉｓｈｗａｋａｒｍａ）ら、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｃｈｅｍ、第２４Ｂ巻、４７２〜４７６ページ（１９８５）を参照されたい。
【００９９】
実施例１（ｂ）：（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−フェニル−アミン（化合物Ｂ）
【化６８】
実施例１（ａ）の方法と同様に、３−アセチルベンゾ［ｂ］チオフェンおよびイソチオシアン酸フェニルから３５％の収率で調製した。
【０１００】
実施例１（ｃ）：フェニル−（５−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−アミン（化合物Ｃ）
【化６９】
実施例１（ａ）の方法と同様に、３−アセチルピリジンおよびイソチオシアン酸フェニルから４６％の収率で調製した。
【０１０１】
実施例１（ｄ）：（１，８−ジヒドロ−インデノ［２，１−ｃ］ピラゾル−３−イル）−フェニル−アミン（化合物Ｄ）
【化７０】
実施例１（ａ）の方法と同様に、新しく蒸留した２−インダノンおよびイソチオシアン酸フェニルから２６％の収率で調製した。
【０１０２】
実施例１（ｅ）：［５−（４−ブロモ−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン（化合物Ｅ）
【化７１】
実施例１（ａ）の方法と同様に、４−アセチル−３−ブロモ−チオフェンおよびイソチオシアン酸フェニルから４３％の収率で調製した。
【０１０３】
４−アセチル−３−ブロモ−チオフェン
【化７２】
３，４−ジブロモ−チオフェン（１．５ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ）を無水エーテル（３０ｍＬ）中、−７８℃、アルゴン雰囲気下で撹拌した。ｎ−ブチルリチウム（６．０ｍＬ、２．５Ｍヘキサン溶液、１４．９ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を２０分間撹拌し、エーテル（２ｍＬ）中のＮ−メトキシ−Ｎ−メチル−アセトアミド（１．６６ｍＬ、１６．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を−７８℃で３０分間、次いで室温まで加温しながら３０分間撹拌した。有機層を１Ｎ ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ３、および食塩水（各１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（２０％から３０％ＥｔＡｃ／ヘキサン）により精製して１．６９ｇ（６１％）の４−アセチル−３−ブロモ−チオフェンを淡黄色オイルで得た。
【０１０４】
実施例１（ｆ）：フェニル−［５−（４−トランス−スチリル−チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−アミン（化合物Ｆ）
【化７３】
実施例１（ａ）の方法と同様に、３−アセチル−４−トランス−スチリル−チオフェンおよびイソチオシアン酸フェニルから５１％の収率で調製した。
【０１０５】
３−アセチル−４−（トランス−スチリル）−チオフェン
【化７４】
４−アセチル−３−ブロモ−チオフェンの調製法と同様に、３−ブロモ−４−（トランス−スチリル）−チオフェン（ムンロ（Ｍｕｎｒｏ）ら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ． Ｔｒａｎｓ．、第１巻、１７１８〜１７２３ページ（１９８０）を参照されたく、この開示は参照として本明細書に組み入れられる）から５１％の収率で調製した。
【０１０６】
実施例１（ｇ）：［５−（４−シクロヘキサ−１−エニル−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン（化合物Ｇ）
【化７５】
実施例１（ａ）の方法と同様に、３−アセチル−４−シクロヘキサ−１−エニル−チオフェンおよびイソチオシアン酸フェニルから２８％の収率で調製した。
【０１０７】
３−アセチル−４−シクロヘキサ−１−エニル−チオフェン
【化７６】
４−アセチル−３−ブロモ−チオフェンの調製法と同様に、３−ブロモ−４−シクロヘキサ−１−エニル−チオフェン（参照として本明細書に組み入れられる、マクドウェル（ＭａｃＤｏｗｅｌｌ）；ジェフリーズ（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ）Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、１９７０、３５、８７１〜８７５を参照）から３１％の収率で調製した。
【０１０８】
実施例１（ｈ）：［５−（４−シクロヘキシル−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン（化合物Ｈ）
【化７７】
［５−（４−シクロヘキサ−１−エニル−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニルアミン（５０ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）の水素添加を、メタノール（５ｍＬ）および酢酸（０．５ｍＬ）中、１０％パラジウム／活性炭（約２０ｍｇ）を用い、水素風船下で実施した。１６時間撹拌後、反応混合物をセライトろ過した。ろ液をエーテル（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２×２５ｍＬ）および食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して２９ｍｇ（５８％）の［５−（４−シクロヘキシル−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニルアミンを白色固体で得た。
【０１０９】
実施例１（ｉ）：フェニル−［５−（４−フェニルスルファニル−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−アミン（化合物Ｉ）
【化７８】
実施例１（ａ）の方法と同様に、３−アセチル−４−フェニルスルファニル−チオフェンおよびイソチオシアン酸フェニルから３５％の収率で調製した。
【０１１０】
３−ブロモ−４−フェニルスルファニル−チオフェン
【化７９】
ｎ−ブチルリチウム（５．０ｍＬ、２．５Ｍヘキサン溶液、１２．５ｍｍｏｌ）を無水エーテル（１２ｍＬ）中、−７８℃、アルゴン雰囲気下で撹拌した。エーテル（１ｍＬ）中の３，４−ジブロモ−チオフェン（１．２５ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ）を滴加し、反応混合物を２５分間撹拌した。エーテル（１５ｍＬ）中の二硫化フェニル（２．７３ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、反応混合物を−７８℃で１時間、次いで０℃で２時間撹拌した。反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１５ｍＬ）で停止させ、有機層を抽出し、食塩水（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させて、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（１％〜１０％エーテル／ヘキサン）により精製して２．５７ｇ（８４％）の３−ブロモ−４−フェニルスルファニル−チオフェンを透明なオイルで得た。
【０１１１】
４−アセチル−３−フェニルスルファニル−チオフェン
【化８０】
４−アセチル−３−ブロモ−チオフェンの調製法と同様に、３−ブロモ−４−フェニルスルファニル−チオフェンから６６％の収率で調製した。
【０１１２】
［５−（Ｎ−ＢＯＣ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン
【化８１】
ビス（トリメチルシリル）アミドリチウム（２．７１ｍＬ、１．０Ｍ／ＴＨＦ、２．７１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）中、−７８℃、アルゴン雰囲気下で撹拌した。ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮ−ＢＯＣ−３−アセチル−インドール（参照として本明細書に組み入れられる、ダンヘイザーＲ．Ｌ．（Ｄａｎｈｅｉｓｅｒ， Ｒ．Ｌ．）；ブリスボイスＲ．Ｇ．（Ｂｒｉｓｂｏｉｓ， Ｒ．Ｇ．）；コワルクジークＪ．Ｊ（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ， Ｊ．Ｊ）；ミラーＲ．Ｆ．（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｒ．Ｆ．）Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１１２巻、３０９３〜３１００ページ（１９９０）を参照）（５８６ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴加し、反応混合物を３０分間撹拌した。イソチオシアン酸フェニル（３２５μＬ、２．７１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで加温しながら１時間撹拌した。橙色の溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（３０ｍＬ）に注ぎ、エーテル（２×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧濃縮した。
【０１１３】
この粗チオアミドをエタノール（２０ｍＬ）に溶解した。ヒドラジン水和物（１８０μＬ、２．１ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｃ（５滴）を加え、反応混合物を還流させながら２時間撹拌した後、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（３０％〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して４９９ｍｇ（５９％）の［５−（Ｎ−ＢＯＣ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミンを淡黄色の泡で得た。
【０１１４】
実施例１（ｊ）：［５−（１Ｈ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン（化合物Ｊ）
【化８２】
［５−（Ｎ−ＢＯＣ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン（３３２ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）を５０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）中、室温で１時間撹拌し、この時点で材料は沈殿し、固体の塊となった。溶媒を減圧除去し、固体をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）および食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（５０％〜７０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して１８２ｍｇ（７５％）の［５−（１Ｈ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミンを白色固体で得た。
【０１１５】
実施例２（ａ）：（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−４−（メトキシ−フェニル）−アミン（化合物Ｋ）
【化８３】
実施例１（ａ）の方法に従い、３−アセチルベンゾチオフェンおよびイソチオシアン酸４−メトキシ−フェニルから４７％の収率で調製した。
【０１１６】
実施例２（ｂ）：４−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−フェノール（化合物Ｌ）
【化８４】
［５−（３−ベンゾ［ｂ］チオフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−４−メトキシ−フェニルアミン（４００ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中、−７８℃で撹拌した。三臭化ホウ素（２．５９ｍＬ、１．０Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液、２．５９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで加温しながら１６時間撹拌した。反応を０．１Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）で停止させ、１５分間撹拌した。次いで、飽和ＮａＨＣＯ３で中和し、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（６０％ＥｔＡｃ／ヘキサン）により精製して１２１ｍｇ（３２％）の４−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−フェノールを白色固体で得た。
【０１１７】
実施例２（ｃ）：（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−３−（メトキシ−フェニル）−アミン（化合物Ｍ）
【化８５】
実施例１（ａ）の方法と同様に、３−アセチルベンゾ［ｂ］チオフェンおよびイソチオシアン酸３−メトキシ−フェニルから４０％の収率で調製した。
【０１１８】
実施例２（ｄ）：３−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−フェノール（化合物Ｎ）
【化８６】
４−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−フェノール［実施例２（ｂ）］の方法と同様に、（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−３−（メトキシ−フェニル）−アミンから２６％の収率で調製した。
【０１１９】
実施例２（ｅ）：４−（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｏ）
【化８７】
３−アセチルベンゾ［ｂ］チオフェン（４００ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）および４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミド（７４０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１２ｍＬ）中、０℃で撹拌した。水素化ナトリウム（１９０ｍｇ、鉱油中６０％、４．７５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１．５時間撹拌し、この時点ですべてのガス発生は止まっていた。反応混合物を０．１Ｎ ＨＣｌ（３０ｍＬ）に注ぎ、エーテル（２×３５ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（３５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧濃縮して黄色固体を得た。
【０１２０】
この粗チオアミドをエタノール（２０ｍＬ）に溶解した。ヒドラジン水和物（１００δＬ、２．１ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｃ（５滴）を加え、反応混合物を還流させながら２時間撹拌した。次いで、これを減圧濃縮し、残渣をエーテル（４０ｍＬ）に取った。黄色固体をろ取し、次いでメタノールから再結晶させて２６５ｍｇ（３２％）の４−（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−ベンゼンスルホンアミドを白色固体で得た。
【０１２１】
４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミド
【化８８】
４−イソチオシアナト−ベンゼンスルホンアミド（７５０ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）および塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（５２８ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中、０℃で撹拌した。水素化ナトリウム（２１０ｍｇ、鉱油中６０％、５．２５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１時間撹拌した後、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）に注ぎ、エーテル（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して９２０ｍｇ（８０％）の４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミドを白色固体で得た。
【０１２２】
実施例３（ａ）：４−［５−（７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｐ）
【化８９】
４−（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−ベンゼンスルホンアミド［実施例２（ｅ）］の方法と同様に、３−アセチル−７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェンおよび４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミドから４１％の収率で調製した。
【０１２３】
３−アセチル−７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン
【化９０】
７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン（参照として本明細書に組み入れられる、アミン（Ａｍｉｎ）ら、Ｊ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．、第２巻、１４８９〜１４９２ページ（１９８２）を参照）（２．４９ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）をベンゼン（２５ｍＬ）中、無水酢酸（３．３１ｍＬ、３５．１ｍｍｏｌ）と共に、アルゴン雰囲気下で撹拌した。ベンゼン（１５ｍＬ）中の塩化スズＩＶ（４．１ｍＬ、３５．１ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、反応混合物をアルゴン雰囲気下で還流させながら２時間撹拌した。赤色溶液を放冷し、氷水（６０ｍＬ）に注いだ。エーテル（１００ｍＬ）を加え、有機層を分離し、水（５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）、食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させて、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（１０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して１．９２ｇ（６４％）の３−アセチル−７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェンを白色固体で得た。
さらに、４９０ｍｇ（１６％）の高極性２−アセチル−７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェンを単離した。
【０１２４】
実施例３（ｂ）：４−｛５−［７−（３−メトキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｑ）
【化９１】
４−（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−ベンゼンスルホンアミド［実施例２（ｅ）］の方法と同様に、３−アセチル−７−（３−メトキシ）−ベンジル−ベンゾ［ｂ］チオフェンおよび４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミドから４１％の収率で調製した。
【０１２５】
３−アセチル−７−（３−メトキシ）−フェニル−ベンゾ［ｂ］チオフェン
【化９２】
アルゴンでパージしたフラスコ内で、３−アセチル−７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン（８８０ｍｇ、３．４５ｍｍｏｌ）、３−メトキシ−フェニルボロン酸（５７８ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）、および炭酸ナトリウム（４０３ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）を、ベンゼン（２０ｍＬ）、メタノール（４ｍＬ）、およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）中で撹拌した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をアルゴン雰囲気下で還流させながら９時間撹拌した。冷却した反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）および食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させて、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（１０％から２０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して７２６ｍｇ（７５％）の３−アセチル−７−（３−メトキシ）−フェニル−ベンゾ［ｂ］チオフェンを淡黄色固体で得た。
【０１２６】
実施例３（ｃ）：４−｛５−［７−（３−ヒドロキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｒ）
【化９３】
４−｛５−［７−（３−メトキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（１３０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および塩化ピリジニウム（１．３ｇ）を密封容器内で合わせ、１８０℃で２時間加熱した。反応混合物を冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で反応を停止させて固体の塊をくずし、ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して８６ｍｇ（６８％）の４−｛５−［７−（３−ヒドロキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミドを白色固体で得た。
【０１２７】
実施例３（ｄ）：４−｛５−［７−（４−メトキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｓ）
【化９４】
ビス（トリメチルシリル）アミドリチウム（２．４８ｍＬ、ＴＨＦ中１．０Ｍ、２．４８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中、−７８℃、アルゴン雰囲気下で撹拌した。ＴＨＦ（８ｍＬ）中の３−アセチル−７−（４−メトキシ）−フェニル−ベンゾ［ｂ］チオフェン（６３６ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、反応混合物を３０分間撹拌した。この間に、別のフラスコで、４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミド（７７５ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）中、−７８℃で撹拌し、ビス（トリメチルシリル）アミドリチウム（２．５８ｍＬ、２．５８ｍｍｏｌ）を滴加した。これを１０分間撹拌した後、カニューレからケトンを含むフラスコに加え、反応混合物を室温まで加温しながら１．５時間撹拌した。得られた橙色の材料を０．１Ｎ ＨＣｌ（４０ｍＬ）に注ぎ、エーテル（２×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧濃縮して、黄色の泡を得た。
【０１２８】
この粗チオアミドをエタノール（２０ｍＬ）に溶解した。ヒドラジン水和物（１００μＬ、２．１ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｃ（５滴）を加え、反応混合物を還流させながら２時間撹拌した。次いで、これを減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（６０％ＴＨＦ／ヘキサン）により精製した。ＭｅＯＨから沈殿させ、ろ取して３８６ｍｇ（３６％）の４−｛５−［７−（４−メトキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミドを白色固体で得た。
【０１２９】
実施例３（ｅ）：４−｛５−［７−（４−ヒドロキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｔ）
【化９５】
４−｛５−［７−（３−ヒドロキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド［実施例３（ｃ）］のための方法と同様に、４−｛５−［７−（４−メトキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミドから６３％の収率で調製した。
【０１３０】
実施例３（ｆ）：｛５−［３−（５−ブロモ）−ベンゾ［ｂ］チオフェニル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イル｝−フェニルアミン−４−スルホンアミド（化合物Ｕ）
【化９６】
４−（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−ベンゼンスルホンアミド［実施例２（ｅ）］のための方法と同様に、３−アセチル−５−ブロモ−ベンゾチオフェンおよび４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミドから２６％の収率で調製した。
【０１３１】
３−アセチル−５−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン
【化９７】
３−アセチル−７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェンの調製法と同様に、５−ブロモベンゾ［ｂ］チオフェン（参照として本明細書に組み入れられる、プレＰ．Ａ．（Ｐｌｅ， Ｐ．Ａ．）；マーネットＬ．Ｊ．（Ｍａｒｎｅｔｔ， Ｌ．Ｊ．）Ｊ． Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ． Ｃｈｅｍ．、第２５巻、１２７１〜１２７２ページ（１９８８）を参照）から７０％の収率で調製した。
【０１３２】
実施例３（ｇ）：４−［５−（６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｖ）
【化９８】
４−｛５−［７−（４−メトキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド［実施例３（ｄ）］のための方法と同様に、３−アセチル−６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェンおよび４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミドから３４％の収率で調製した。
【０１３３】
６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸メトキシ−メチルアミド
【化９９】
６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸（参照として本明細書に組み入れられる、タイタスＲ．Ｌ．（Ｔｉｔｕｓ， Ｒ．Ｌ．）；タイタスＣ．Ｆ． Ｊ． Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ． Ｃｈｅｍ．、１９７３、１０、６７９〜６８１を参照）（１．２ｇ、５．７７ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（６２０ｍｇ、６．３５ｍｍｏｌ）と共に撹拌した。ＨＯＢＴ（１．５４ｇ、８．０８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１．５４ｇ、８．０８ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２．１６ｍＬ、１２．１１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物をＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ、１Ｎ ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ３、および食塩水（各２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（３０％から５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、９５２ｍｇ（６６％）の６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸メトキシ−メチルアミドを透明なオイルで得た。
【０１３４】
３−アセチル−６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン
【化１００】
６−メトキシベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸メトキシメチルアミド（８００ｍｇ、３．１９ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中、アルゴン雰囲気下、−７８℃、アルゴン雰囲気下で撹拌した。メチルリチウム（５．０ｍＬ、ヘキサン中１．５Ｍ、２．３５ｍｍｏｌ）を滴加し、反応混合物を−７８℃で１時間、次いで−２０℃まで温度を上げながら１時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（４０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（各２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、２３４ｍｇ（３６％）の３−アセチル−６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェンを橙色固体で得た。
【０１３５】
実施例３（ｈ）：４−［５−（６−ヒドロキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｗ）
【化１０１】
４−｛５−［７−（３−ヒドロキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド［実施例３（ｃ）］のための方法と同様に、４−［５−（６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミドから２９％の収率で調製した。
【０１３６】
実施例３（ｉ）：４−［５−（１Ｈ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｘ）
【化１０２】
［５−（１Ｈ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン［実施例１（Ｊ）］の調製法と同様に、４−［５−（Ｎ−ＢＯＣ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミドから８８％の収率で調製した。
【０１３７】
４−［５−（Ｎ−ＢＯＣ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド
【化１０３】
３−アセチル−Ｎ−ＢＯＣ−インドール（参照として本明細書に組み入れられる、マクドウェル；ジェフリーズ Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、１９７０、３５、８７１〜８７５を参照）、および［５−｛３−［７−（４−メトキシ）−フェニル］−ベンゾチオフェニル｝−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニルアミン−４−スルホンアミド［実施例３（ｄ）］のための方法と同様に４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミドから、６６％の収率で調製した。
【０１３８】
生化学および生物学的評価：
前述の典型的化合物を、その活性に関して下記のとおり試験することができる。プロテインキナーゼ阻害剤の、増殖因子によって誘導される細胞増殖を阻止する能力は、受容体自己リン酸化を阻止するその能力と直接相関している。化合物のプロテインキナーゼ阻害活性を測定するために、下記の構築物を考案した。
【０１３９】
サイクリン依存性キナーゼ活性を、［３２Ｐ］ＡＴＰまたは［３３Ｐ］ＡＴＰからの放射性リン酸塩のタンパク質基質への、酵素により触媒された時間依存性の取り込みを定量することにより測定した。特に記載のない限り、アッセイは９６穴プレートで、一反応あたり１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５μＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１ｍｇ／ｍＬオバルブミン、５μｇ／ｍＬロイペプチン、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭベータ−グリセロリン酸、０．１ｍＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフッ化ナトリウム、２．５ｍＭエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド、および０．０３〜０．４μＣｉ［３２／３３Ｐ］ＡＴＰ存在下、合計量５０μＬで実施した。反応は酵素により開始し、３０℃でインキュベートし、２０分後にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を２５０ｍＭまで加えることによって停止した。次いで、リン酸化基質をニトロセルロースまたはホスホセルロース膜上に９６穴ろ過マニホールドを用いて捕捉し、取り込まれていない放射能を０．８５％リン酸で繰り返し洗浄することにより除去した。乾燥させた膜をホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）に曝露することによって放射能を定量した。
【０１４０】
見かけのＫｉ値を、異なる濃度の阻害剤化合物存在下で酵素活性をアッセイし、酵素非存在下で測定したバックグラウンド放射能を減じることによって測定した。阻害データを、カレイダグラフ（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ）（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて競合的阻害のための式にあてはめるか、またはキネティック（ＫｉｎｅＴｉｃ）ソフトウェア（ＢｉｏＫｉｎ， Ｌｔｄ．）を用いて競合的強結合阻害のための式にあてはめた。
【０１４１】
ＣＤＫ４ ／サイクリン Ｄ 網膜芽細胞腫キナーゼ活性の阻害：
ヒトＣＤＫ４およびサイクリンＤ３の複合体、またはヒトＣＤＫ４および遺伝子操作によって短縮された（１〜２６４）サイクリンＤ３の複合体を、対応するバキュロウイルス発現ベクターに同時感染している昆虫細胞から、伝統的な生化学クロマトグラフィー法を用いて精製した（例えば、メイジャー（Ｍｅｉｊｅｒ）およびキム（Ｋｉｍ）、「サイクリン依存性キナーゼの化学的阻害（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｙ、第２８３巻、１１３〜１２８ページ（１９９７）参照）。酵素複合体（５ｎＭまたは５０ｎＭ）を、０．３μｇ〜０．５μｇの精製組換え網膜芽細胞腫タンパク質断片（Ｒｂ）を基質としてアッセイした。操作されたＲｂ断片（天然網膜芽細胞腫タンパク質の３８６〜９２８残基；６２．３ｋＤａ）は、天然の１０６ｋＤａのタンパク質中に見いだされるリン酸化部位の大部分、ならびに精製を容易にするためのヒスチジン６残基のタグを含んでいる。リン酸化Ｒｂ基質を微細ろ過によりニトロセルロース膜上に捕捉し、前述のとおりホスホイメージャーを用いて定量した。強力な結合阻害剤の測定のためには、酵素複合体濃度を５ｎＭに下げ、アッセイ時間を６０分間に延長したが、その間、生成物形成の時間依存性は直線的であった。
【０１４２】
ＣＤＫ２ ／サイクリン Ａ 網膜芽細胞腫キナーゼ活性の阻害：
ＣＤＫ２を公表されている方法（ローゼンブラット（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ）ら、「ヒトサイクリン依存性キナーゼ２の精製および結晶化（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌｉｎａｓｅ ２）」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第２３０巻、１３１７〜１３１９ページ（１９９３））を用いて、バキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞から精製した。サイクリンＡは全長組換えサイクリンＡを発現する大腸菌細胞から精製し、短縮したサイクリンＡ構築物を限定的タンパク質分解により生成し、以前に記載されているとおりに精製した（ジェフリー（Ｊｅｆｆｒｅｙ）ら、「サイクリンＡ−ＣＤＫ２複合体の構造によって明らかにされるＣＤＫ活性化の機構（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＣＤＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｃｙｃｌｉｎ Ａ−ＣＤＫ２ ｃｏｍｐｌｅｘ）」、Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、３１３〜３２０ページ（１９９５年７月２７日）。ＣＤＫ２およびタンパク質分解されたサイクリンＡの複合体を調製し、ゲルろ過によって精製した。このアッセイ法の基質はＣＤＫ４アッセイ法に用いたものと同じＲｂ基質断片で、ＣＤＫ２／サイクリンＡおよびＣＤＫ４／サイクリンＤ３のアッセイ法は、ＣＤＫ２を１５０ｎＭまたは５ｎＭとした以外は、基本的に同じであった。Ｋｉ値を前述のとおりに測定した。
【０１４３】
ＶＥＧＦその他などの増殖因子による細胞増殖の刺激は、それらの各受容体のチロシンキナーゼの自己リン酸化誘導に依存している。したがって、これらの増殖因子により誘導される細胞増殖を阻止するプロテインキナーゼ阻害剤の能力は、受容体自己リン酸化を阻止する能力に直接相関している。化合物のプロテインキナーゼ阻害活性を測定するために、以下の構築物を用いた。
【０１４４】
アッセイのための ＶＥＧＦ−Ｒ２ 構築物
この構築物は試験化合物のチロシンキナーゼ活性を阻害する能力を調べるものである。ヒト血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）の、キナーゼ挿入ドメインの６８残基の５０の中心残基を欠く、細胞質ゾルドメインの構築物（ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０）を、バキュロウイルス／昆虫細胞系において発現させた。この構築物はマクティーグ（ＭｃＴｉｇｕｅ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第７巻、３１９〜３３０ページ（１９９９）および１９９９年９月７日に出願された同時係属中の米国特許出願第０９／３９０，３２６号に記載されている。全長ＶＥＧＦ−Ｒ２の１３５６残基のうち、ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０は野生型ＶＥＧＦ−Ｒ２に比べて、８０６〜９３９残基および９９０〜１１７１残基を含み、またキナーゼ挿入ドメイン内に一つの点突然変異（Ｅ９９０Ｖ）を含む。精製構築物の自己リン酸化は、酵素を４μＭの濃度で、５％グリセロールおよび５ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中、３ｍＭ ＡＴＰおよび４０ｍＭ ＭｇＣｌ２存在下、４℃で２時間インキュベートすることにより実施した。自己リン酸化後、この構築物は野生型の自己リン酸化されたキナーゼドメイン構築物と基本的に等しい触媒活性を有することが明らかにされた。パラスト（Ｐａｒａｓｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、１６７８８〜１６８０１ページ（１９９８）参照。
【０１４５】
アッセイのための ＣＨＫ１ 構築物
Ｃ末端にＨｉｓタグを有する全長ヒトＣＨＫ１（ＦＬ−ＣＨＫ１）を、バキュロウイルス／昆虫細胞系を用いて発現させた。これは４７６アミノ酸のヒトＣＨＫ１のＣ末端に６個のヒスチジン残基（６×Ｈｉｓタグ）を含む。タンパク質は通常のクロマトグラフィー法によって精製した。
【０１４６】
ＶＥＧＦ−Ｒ２ アッセイ法
連結分光光度（ ＦＬＶＫ−Ｐ ）アッセイ法
リン酸基転移を伴うＡＴＰからＡＤＰの生成を、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）ならびにピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を有する系を用いるＮＡＤＨの酸化と連結させた。ＮＡＤＨの酸化を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６５０分光光度計を用い、３４０ｎｍ（ｅ３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の吸光度の低下を追跡することによってモニターした。リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（下記の表ではＦＬＶＫ−Ｐと示している）のアッセイ条件は次のとおりであった：２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中、１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；１ｍＬあたり５０単位のＬＤＨ；１ｍＬあたり２０単位のＰＫ；５ｍＭ ＤＴＴ；５．１ｍＭポリ（Ｅ４Ｙ１）；１ｍＭ ＡＴＰ；および２５ｍＭ ＭｇＣｌ２。非リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（表ではＦＬＶＫと示している）のアッセイ条件は次のとおりであった：２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中、１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；１ｍＬあたり５０単位のＬＤＨ；１ｍＬあたり２０単位のＰＫ；５ｍＭ ＤＴＴ；２０ｍＭポリ（Ｅ４Ｙ１）；３ｍＭ ＡＴＰ；ならびに６０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２ｍＭ ＭｎＣｌ２。アッセイは５ｎＭから４０ｎＭの酵素で開始した。Ｋｉ値を様々な濃度の試験化合物存在下、酵素活性を測定することによって求めた。データはエンザイムキネティックおよびカレイダグラフソフトウェアを用いて解析した。
【０１４７】
ＥＬＩＳＡ アッセイ法
ホスホガストリンの生成をビオチン化ガストリンペプチド（１〜１７）を基質に用いてモニターした。ビオチン化ホスホガストリンをストレプトアビジンでコーティングした９６穴マイクロタイタープレートを用いて固定化した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した抗ホスホチロシン抗体を用いて検出した。セイヨウワサビペルオキシダーゼの活性を２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンザチアゾリンスルホネート（６）］２アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を用いてモニターした。典型的アッセイ溶液には以下が含まれていた：２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中、２μＭビオチン化ガストリンペプチド；５ｍＭ ＤＴＴ；２０μＭ ＡＴＰ；２６ｍＭ ＭｇＣｌ２；および２ｍＭ ＭｎＣｌ２。アッセイは０．８ｎＭのリン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０で開始した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ活性は１０ｍＭのＡＢＴＳを用いてアッセイした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ反応を酸（Ｈ２ＳＯ４）の添加により停止し、その後４０５ｎｍの吸光度を読み取った。Ｋｉ値を様々な濃度の試験化合物存在下、酵素活性を測定することによって求めた。データはエンザイムキネティックおよびカレイダグラフソフトウェアを用いて解析した。
【０１４８】
ＣＨＫ１ アッセイ法
合成基質ペプチドＳｙｎｔｉｄｅ−２（ＰＬＡＲＴＬＳＶＡＧＬＰＧＫＫ）へのリン酸基転移を伴うＡＴＰからＡＤＰの生成を、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を用いたピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の作用によるＮＡＤＨの酸化と連結させた。ＮＡＤＨの酸化を、ＨＰ８４５２分光光度計を用い、３４０ｎｍ（∈３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の吸光度の低下を追跡することによってモニターした。典型的反応溶液には以下のものが含まれていた：５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）中、４ｍＭ ＰＥＰ；０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ；１ｍＬあたり２８単位のＬＤＨ；１ｍＬあたり１６単位のＰＫ；３ｍＭ ＤＴＴ；０．１２５ｍＭ Ｓｙｎｔｉｄｅ−２；０．１５ｍＭ ＡＴＰ；２５ｍＭ ＭｇＣｌ２；および４００ｍＭ ＮａＣｌ。アッセイは１０ｎＭのＦＬ−ＣＨＫ１で開始した。Ｋｉ値を様々な濃度の試験化合物存在下、初期酵素活性を測定することによって求めた。データはエンザイムキネティックおよびカレイダグラフソフトウェアを用いて解析した。
【０１４９】
前述の特定の実施例を含む、化合物に対して行ったアッセイの結果を下記の表１に示している。特定の項目で特に記載のない限り、用いた単位およびアッセイは表の該当する欄に示したとおりである。
【０１５０】
【表１】ＣＤＫのＫｉ
【０１５１】
細胞増殖の阻害：細胞毒性の評価：
細胞増殖の阻害を、生存細胞の臭化３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−［２Ｈ］−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）をホルマザンに還元する能力に基づく、テトラゾリウム塩アッセイ法（モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第６５巻、５５〜５８ページ（１９８３））を用いて測定した。次いで、水不溶性の紫色のホルマザン生成物を分光光度分析によって検出した。ＨＣＴ１１６細胞系統を９６穴プレートで培養した。細胞をマッコイの５Ａ培地中１３５μｌ／穴の量で適当な培地中に播種した。プレートを４時間インキュベートした後、阻害剤化合物を加えた。異なる濃度の阻害剤化合物を０．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（１５μＬ／穴）に加え、細胞を３７℃（５％ＣＯ２）で４日から６日間（細胞型に応じて）インキュベートした。インキュベーション終了時に、ＭＴＴを最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるまで加え、細胞を３７℃でさらに４時間インキュベートした。プレートを遠心沈降し、培地を除去した後、ホルマザン（ジメチルスルホキシドに可溶化）の吸光度を５４０ｎｍで測定した。増殖の５０％阻害を引き起こす阻害剤化合物の濃度を、阻害剤濃度と阻害割合％の片対数プロットの直線部分から求めた。すべての結果を０．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドだけで処理した対照細胞と比較した。
【０１５２】
【表２】
【０１５３】
上記の実施例は、式Ｉによる化合物、および様々なキナーゼ複合体に対するそれらの活性レベルを求めるために、容易に実施できるアッセイ法を例示している。選択された標的に対し、望ましいレベルの活性を有する阻害剤を選択するために、そのようなアッセイ法、または当技術分野において公知の他の適当なアッセイ法を用いうることは明らかであると考えられる。
【０１５４】
前述の典型的化合物は、下記の一般的実施例に従い、薬学的組成物に調剤することができる。
【０１５５】
実施例 １ ：非経口組成物
注射による投与に適した非経口薬学的組成物を調製するために、式Ｉの化合物の水溶性塩１００ｍｇをＤＭＳＯに溶解し、次いで０．９％滅菌食塩水１０ｍＬと混合する。混合物を注射による投与に適した単位剤形に取り込む。
【０１５６】
実施例 ２ ：経口組成物
経口送達のための薬学的組成物を調製するために、式Ｉの化合物１００ｍｇを乳糖７５０ｍｇと混合する。混合物を、経口投与に適した、硬ゼラチンカプセルなどの経口単位剤形に取り込む。
【０１５７】
本発明を特定の好ましい態様に関して示してきたが、当業者であれば、通常の実験および本発明の実施を通じて変更および改変が可能であることを認識すると考えられる。したがって、本発明は前述の記載によって限定されることが意図されるものではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらと同等のものによって規定されることが意図される。
発明の分野
本発明は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６などのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）；ＶＥＧＦ；ならびにＣＨＫ１などのプロテインキナーゼの活性を仲介および／または阻害するアミノ−ピラゾール化合物、そのような化合物および組成物を含む薬学的組成物、ならびにそのような化合物の有効な量を投与することによる、癌ならびに好ましくない脈管形成および／または細胞増殖に関連する他の疾患状態の治療法に向けられる。
【０００２】
発明の背景
制御されていない細胞増殖は癌のしるしである。様々な刺激に応答しての細胞増殖は、それによって細胞が増殖および分裂する過程である、細胞分裂周期の脱調節によって現れる。腫瘍細胞は一般的に、細胞分裂周期の全般にわたって直接または間接的に進行を調節する遺伝子に損傷を有する。
【０００３】
プロテインキナーゼはタンパク質の特定のチロシン、セリン、またはスレオニン残基の水酸基のリン酸化を触媒する酵素ファミリーである。一般的には、そのようなリン酸化はタンパク質の機能を劇的に混乱させるため、プロテインキナーゼは、代謝、細胞増殖、細胞分化、および細胞生存を含む様々な細胞過程の調節において重要である。プロテインキナーゼの活性が必要であると判明している多くの異なる細胞機能のうち、いくつかの過程は一定の疾患状態に対する治療的介入のための興味深い標的である。二つの例として細胞周期制御および脈管形成が挙げられ、プロテインキナーゼが重要な役割を果たしている。これらの過程は固形腫瘍の増殖ならびに他の疾患にとって必須である。
【０００４】
ＣＤＫは、Ｇ１期の静止期（有糸分裂と新しい細胞分裂サイクルのためのＤＮＡ複製開始との間）からＳ期（活発なＤＮＡ合成期）への進行、またはＧ２期から活発な有糸分裂および細胞分裂が起こるＭ期への進行などの、細胞周期における異なる期への移行の調節において重要な役割を果たす、酵素クラスを構成する。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７４巻、１６４３〜１６７７ページ（１９９６）；およびＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｖ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２６１〜２９１ページ（１９９７）に掲載されている論文を参照されたい。ＣＤＫ複合体は調節サイクリンサブユニット（例えば、サイクリンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＥ）と触媒キナーゼサブユニット（例えば、ｃｄｃ２（ＣＤＫ１）、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、およびＣＤＫ６）との結合によって形成される。名前が示すとおり、ＣＤＫはそれらの標的基質をリン酸化するためにサイクリンサブユニットへの絶対的依存を示し、異なるキナーゼ／サイクリンの対は細胞周期の特定の部分を通じて進行を調節するよう機能する。
【０００５】
Ｄサイクリンは細胞外増殖シグナルに感受性で、細胞周期のＧ１期にマイトジェンに応答して活性化される。ＣＤＫ４／サイクリンＤは網膜芽腫タンパク質（Ｒｂ）をリン酸化し、それによってこのタンパク質を不活化することにより、細胞周期進行において重要な役割を果たす。低リン酸化Ｒｂは転写制御因子ファミリーに結合するが、ＣＤＫ４／サイクリンＤによるＲｂの過リン酸化によってこれらの転写因子が放出され、その産物がＳ期進行を担う遺伝子を活性化する。ＣＤＫ４／サイクリンＤによるＲｂのリン酸化および不活化によって、細胞がＧ１期の制限点を通過できるようになり、この制限点で細胞外増殖または阻害シグナルに対する感受性が失われて、細胞は細胞分裂に入る。Ｇ１後期に、ＲｂはＣＤＫ２／サイクリンＥによってもリン酸化および不活化され、最近、ＣＤＫ２／サイクリンＥがＲｂリン酸化とは無関係の類似の経路によりＳ期への進行も調節しうるという証拠が得られている（ルカス（Ｌｕｋａｓ）ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．、第１１巻、１４７９〜１４９２ページ（１９９７）参照）。
【０００６】
ＣＤＫ４／サイクリンＤおよびＣＤＫ２／サイクリンＥの作用によって達成されるＧ１期からＳ期への進行は、正と負両方の様々な増殖調節機構に供される。マイトジェンなどの増殖刺激は、サイクリンＤ１の合成増大、およびしたがって機能的ＣＤＫ４の増加を引き起こす。これに対して、細胞増殖は内因性阻害タンパク質の誘導により、ＤＮＡ損傷または負の増殖刺激に応答して「抑制」されうる。これらの天然のタンパク質阻害剤には、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ、ｐ２７ＫＩＰＩ、およびｐ１６ＩＮＫ４ファミリーが含まれ、後者はＣＤＫ４をもっぱら阻害する（ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．、第２９巻、９１〜１０７ページ（１９９７）参照）。この制御システムにおける異常、特にＣＤＫ４およびＣＤＫ２の機能に影響する異常は、家族性黒色腫、食道癌、および膵臓癌などの悪性腫瘍に特徴的な高度増殖状態への細胞の進行に関係している（例えば、ホール（Ｈａｌｌ）ら、Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６８巻、６７〜１０８ページ（１９９６）；およびカム（Ｋａｍｂ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６４巻、４３６〜４４０ページ（１９９４）参照）。サイクリンＤ１の過剰発現は食道癌、乳癌、および扁平上皮癌につながる（例えば、デルサル（ＤｅｌＳａｌ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ、第７１巻、１２７〜１４２ページ（１９９６）参照）。ｐ１６ファミリーのＣＤＫ４特異的阻害剤をコードする遺伝子は、家族性黒色腫、神経膠腫、白血病、肉腫、膵臓癌、非小細胞肺癌、および頭頸部癌において欠失および突然変異を有することが多い（ノボリ（Ｎｏｂｏｒｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３６８巻、７５３〜７５ページ（１９９４）参照）。サイクリンＥの増幅および／または過剰発現も様々な固形腫瘍で観察されており、サイクリンＥレベルの上昇は予後不良と相関づけられている。加えて、ＣＤＫ２／サイクリンＥの基質および阻害剤の両方としてはたらくＣＤＫ阻害剤ｐ２７の細胞レベルは、乳癌、大腸癌、および前立腺癌で異常に低く、ｐ２７の発現レベルは疾患の病期に逆相関している（ローダ（Ｌｏｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第３巻、２３１〜２３４ページ（１９９７）参照）。最近、シェール（Ｓｈｅｒｒ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、第１３巻、１５０１〜１５１２ページ（１９９９）で概説されているとおり、ＣＤＫ４／サイクリンＤがｐ２７を抑制する可能性があるとの証拠が得られている。ｐ２１タンパク質もｐ５３腫瘍抑制シグナルをＣＤＫに伝達するようである。したがって、すべてのヒト癌の約５０％におけるｐ５３の突然変異は、間接的にＣＤＫ活性の脱調節をもたらすと考えられる。
【０００７】
現れつつあるデータより、抗増殖治療薬として、ＣＤＫ、特にＣＤＫ４およびＣＤＫ２を阻害する化合物を使用することの有効性が強力に確認される。特定の生物分子がこの目的のために推奨されている。例えば、ション（Ｘｉｏｎｇ）らの米国特許第５，６２１，０８２号は、ＣＤＫ６の阻害剤をコードする核酸を開示しており；ＷＩＰＯ国際公開公報第９９／０６５４０号は、ＣＤＫの阻害剤をコードする核酸を開示している。ペプチドおよびペプチド様阻害剤が、欧州特許公開０６６６２７０Ａ２号、バンダラ（Ｂａｎｄａｒａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、８９６〜９０１ページ（１９９７）、およびチェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ、第９６巻、４３２５〜４３２９ページ（１９９９）に記載されている。コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ、第９５巻、１４２７２〜１４２７７ページ（１９９８）において、ペプチドアパタマーがスクリーニングから同定された。いくつかの小分子がＣＤＫ阻害剤として同定されている（最近の総説については、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）、Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ、第７巻、８６５〜８８７ページ（１９９８）、およびストーバー（Ｓｔｏｖｅｒ）ら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．、第２巻、２７４〜２８５ページ（１９９９）参照）。フラボンのフラボピリドールは、他のキナーゼに比べてＣＤＫの阻害に対し、わずかに選択性を示すが、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、およびＣＤＫ１を等能力で阻害し、ＩＣ５０は０．１〜０．３μＭの範囲である。フラボピリドールは現在、腫瘍化学療法剤として第ＩＩ相臨床試験中である（セドラセク（Ｓｅｄｌａｃｅｋ）ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．、第９巻、１１４３〜１１６８ページ（１９９６））。フラボピリドールの類縁体は他の刊行物、例えば、マンスリ（Ｍａｎｓｕｒｉ）らの米国特許第５，７３３，９２０号（ＷＩＰＯ国際公開公報第９７／１６４４７号）およびＷＩＰＯ国際公開公報第９７／４２９４９号および第９８／１７６６２号でも主題とされている。プリンを基本とする誘導体がショウ（Ｓｃｈｏｗ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、第７巻、２６９７〜２７０２ページ（１９９７）；グラント（Ｇｒａｎｔ）ら、Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第３９巻、要旨１２０７（１９９８）；レグラベンド（Ｌｅｇｒａｖｅｎｄ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、第８巻、７９３〜７９８ページ（１９９８）；グレイ（Ｇｒａｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８１巻、５３３〜５３８ページ（１９９８）；チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３６１〜３７５ページ（１９９９）；ならびにＷＩＰＯ国際公開公報第９９／０２１６２号、第９９／４３６７５号、および第／９９／４３６７６号に記載されている。加えて、下記の刊行物はサイクリン依存性キナーゼおよび増殖因子仲介性キナーゼを阻害する一定のピリミジンを開示している：ＷＩＰＯ国際公開公報第９８／３３７９８号；ルエツ（Ｒｕｅｔｚ）ら、Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第３９巻、要旨３７９６（１９９８）；およびメイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第３９巻、要旨３７９４（１９９８）。
【０００８】
Ｇ１における細胞を阻止するベンゼンスルホンアミドが、エーザイ（Ｅｉｓａｉ Ｉｎｃ．）（ニュージャージー州ティーネック）によって開発中である。例えば、オワ（Ｏｗａ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、第４２巻、３７８９〜３７９９（１９９９）を参照されたい。オキシインドールＣＤＫ阻害剤が、グラクソ・ウェルカム（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）によって開発中で、ルジオ（Ｌｕｚｚｉｏ）ら、Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、巻、要旨４１０２（１９９９）およびＷＩＰＯ国際公開公報第９９／１５５００号を参照されたい。パウロン（Ｐａｕｌｌｏｎｅｓ）は、米国立がん研究所、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、第４２（１５）巻、２９０９〜２９１９ページ（１９９９）との共同研究によって見いだされた。インデノピラゾールがＷＩＰＯ国際公開公報第９９／１７７６９号およびセイツ（Ｓｅｉｔｚ）ら、第２１８回 ＡＣＳ Ｎａｔｌ． Ｍｔｇ．要旨ＭＥＤＩ３１６（１９９９年８月２２〜２６日、ニューオーリンズ）によって記載されている。アミノチアゾールがＷＩＰＯ国際公開公報第９９／２４４１６号および第９９／２１８４５号に記載されている。イソチアゾール誘導体がＷＩＰＯ国際公開公報第９９／６２８０号に記載されている。プロテインキナーゼのピラゾール阻害剤がＷＩＰＯ国際公開公報第９６／１４８４３号に記載されている。ピラゾール−４−オン類縁体がＷＩＰＯ国際公開公報第９９／５４３０８号に記載されている。タンパク質チロシンキナーゼｐ５６１ｃｋの阻害剤としての５−アミノピラゾールがＷＩＰＯ国際公開公報第９７／４００１９号に記載されている。
【０００９】
ＣＨＫ１はもう一つのプロテインキナーゼである。ＣＨＫ１は細胞周期進行におけるチェックポイントとして重要な役割を果たす。チェックポイントはサイクリン依存性キナーゼの生成、活性化およびその後の不活化に影響をおよぼすことにより細胞周期進行を調整する制御システムである。チェックポイントは不適当な時期の細胞周期進行を防止し、細胞が停止している間の細胞の代謝バランスを維持し、場合により、チェックポイントの要求が満たされないときにはアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導することもできる。例えば、オコナー（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ、第２９巻、１５１〜１８２ページ（１９９７）；ナース（Ｎｕｒｓｅ）、Ｃｅｌｌ、第９１巻、８６５〜８６７ページ（１９９７）；ハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６６巻、１８２１〜１８２８ページ（１９９４）；ハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、６２９〜６３４ページ（１９８９）を参照されたい。
【００１０】
一連のチェックポイントはゲノムの完全性をモニターし、ＤＮＡ損傷を感知すると、これらの「ＤＮＡ損傷チェックポイント」は細胞周期進行をＧ１およびＧ２期で阻止し、Ｓ期全般で進行を遅延させる。オコナー（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ、第２９巻、１５１〜１８２ページ（１９９７）；ハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６６巻、１８２１〜１８２８ページ（１９９４）。この作用により、ゲノムの複製前にＤＮＡ修復過程がその役割を完了することができ、続いてこの遺伝物質の新しい娘細胞への分離が起こる。重要なことに、ヒト癌において最も一般に突然変異している遺伝子、すなわちｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子は、ＤＮＡ損傷後にＧ１期において細胞周期を阻止し、かつ／またはアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導する、ＤＮＡ損傷チェックポイントタンパク質を産生する。ハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６６巻、１８２１〜１８２８ページ（１９９４）。ｐ５３腫瘍サプレッサーは、細胞周期のＧ２期においてＤＮＡ損傷チェックポイントの作用を強化することも明らかにされている。例えば、バンズ（Ｂｕｎｚ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８巻、１４９７〜１５０１ページ（１９９８）；ウィンターズ（Ｗｉｎｔｅｒｓ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１７巻、６７３〜６８４ページ（１９９８）；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１５巻、３０２５〜３０３５ページ（１９９７）を参照されたい。
【００１１】
ヒト癌におけるｐ５３腫瘍サプレッサー経路の中心的性質を考慮して、ｐ５３欠損癌における脆弱性を活用する治療的介入が積極的に探索されている。一つの明らかになりつつある脆弱性は、ｐ５３欠損癌細胞におけるＧ２チェックポイントの操作にある。癌細胞は、Ｇ１チェックポイントの制御を欠いているため、ＤＮＡ損傷物質であるＧ２チェックポイントの癌死滅効果から細胞を防護する、最後に残っているバリアの排除に対して特に脆弱である。Ｇ２チェックポイントは酵母からヒトまで保存されている制御系によって調節される。この保存された系において重要であるのは、ＤＮＡ損傷知覚複合体からシグナルを変換して、有糸分裂への進行を促進するサイクリンＢ／Ｃｄｃ２キナーゼの活性化を阻害する、キナーゼＣＨＫ１である。例えば、ペン（Ｐｅｎｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、１５０１〜１５０５ページ（１９９７）；サンチェス（Ｓａｎｃｈｅｚ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、１４９７〜１５０１ページ（１９９７）を参照されたい。ＣＨＫ１の不活化によって、抗癌剤により加えられたＤＮＡ損傷または内因性のＤＮＡ損傷によって誘導されたＧ２停止が排除され、同時にその結果生じるチェックポイント欠損細胞の優先的死滅が起こることが明らかにされている。例えば、ナース（Ｎｕｒｓｅ）、Ｃｅｌｌ、第９１巻、８６５〜８６７ページ（１９９７）；ウェイナート（Ｗｅｉｎｅｒｔ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、１４５０〜１４５１ページ（１９９７）；ウォルワース（Ｗａｌｗｏｒｔｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３６３巻、３６８〜３７１ページ（１９９３）；およびアルコデイリー（Ａｌ−Ｋｈｏｄａｉｒｙ）ら、Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ、第５巻、１４７〜１６０ページ（１９９４）を参照されたい。
【００１２】
癌細胞においてチェックポイント制御を選択的に操作することで、癌化学療法および放射線療法において広範に利用することができ、さらに、癌細胞破壊のための選択的基準として利用するためのヒト癌の「ゲノムの不安定性」の一般的特徴を示すこともできる。いくつかの因子によって、ＣＨＫ１はＤＮＡ損傷チェックポイント制御における重要な標的となる。Ｓ期の進行調節においてＣＨＫ１と協力することが最近判明したキナーゼＣＤＳ１／ＣＨＫ２（ゼン（Ｚｅｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９５巻、５０７〜５１０ページ（１９９８）；マツオカ（Ｍａｔｓｕｏｋａ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８２巻、１８９３〜１８９７ページ（１９９８）参照）などの、この機能的に関連するキナーゼの阻害剤を解明することで、癌治療のための有用で新しい治療法が提供されると考えられる。
【００１３】
もう一つのキナーゼ群はチロシンキナーゼである。チロシンキナーゼは受容体型（細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを有する）または非受容体型（完全に細胞内）でありうる。非受容体タンパク質チロシンキナーゼの少なくとも一つ、すなわちＬＣＫは、Ｔ細胞において細胞表面タンパク質（Ｃｄ４）と架橋抗Ｃｄ４抗体との相互作用からのシグナルの変換を仲介すると考えられる。非受容体チロシンキナーゼのより詳細な考察は、参照として本明細書に組み入れられる、ボーレン（Ｂｏｌｅｎ）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第８巻、２０２５〜２０３１ページ（１９９３）に記載されている。
【００１４】
細胞周期制御におけるその役割に加えて、プロテインキナーゼは、既存の血管から新しい毛細血管が形成される機構である、脈管形成においても重要な役割を果たしている。必要があれば、血管系は、組織および臓器の適当な機能を維持するために、新しい毛細管網を形成する能力を有する。しかし、成人では、脈管形成はかなり限定されており、創傷治癒および月経中の子宮内膜の血管新生の過程においてのみ起こる。メレンミーズ Ｊ．（Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ， Ｊ．）、パラダ Ｌ．Ｆ．（Ｐａｒａｄａ， Ｌ．Ｆ．）、ヘンケマイヤー Ｍ．（Ｈｅｎｋｅｍｅｙｅｒ， Ｍ．）、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、第８巻、３〜１０ページ（１９９７）参照。一方、好ましくない脈管形成は、網膜症、乾癬、慢性関節リウマチ、加齢黄斑変性症、および癌（固形腫瘍）などのいくつかの疾患の特徴である。フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、第１巻、２７〜３１ページ（１９９５）。脈管形成過程に関与することが知られているプロテインキナーゼには、増殖因子受容体チロシンキナーゼファミリーの３つのメンバーが含まれる：ＶＥＧＦ−Ｒ２（血管内皮増殖因子受容体２、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）およびＦＬＫ−１としても知られている）；ＦＧＦ−Ｒ（繊維芽細胞増殖因子受容体）；およびＴＥＫ（Ｔｉｅ−２としても知られている）。
【００１５】
内皮細胞上でのみ発現されるＶＥＧＦ−Ｒ２は、強力な脈管形成増殖因子ＶＥＧＦに結合し、その細胞内キナーゼ活性の活性化により、その後のシグナル変換を仲介する。したがって、シグナル変換を仲介することができないＶＥＧＦ−Ｒ２の突然変異体で示されているとおり、ＶＥＧＦ−Ｒ２のキナーゼ活性を直接阻害することで、外因性ＶＥＧＦ存在下でも脈管形成の低下をまねくことが予想される（ストローン（Ｓｔｒａｗｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５６巻、３５４０〜３５４５ページ（１９９６）参照）。ミラウアー（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５６巻、１６１５〜１６２０ページ（１９９６）。さらに、ＶＥＧＦ−Ｒ２は、ＶＥＧＦの脈管形成活性を仲介する以外に、成人では機能を持たないようである。したがって、ＶＥＧＦ−Ｒ２のキナーゼ活性の選択的阻害剤は、ほとんど毒性を示さないことが予想される。
【００１６】
同様に、ＦＧＦ−Ｒは脈管形成増殖因子ａＦＧＦおよびｂＦＧＦに結合し、その後の細胞内シグナル変換を仲介する。最近、ｂＦＧＦなどの増殖因子は、一定のサイズに到達している固形腫瘍の脈管形成誘導において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。ヨシジ（Ｙｏｓｈｉｊｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５７巻、３９２４〜３９２８ページ（１９９７）。しかし、ＶＥＧＦ−Ｒ２とは異なり、ＦＧＦ−Ｒは体中のいくつかの異なる細胞型で発現され、成人の他の正常な生理的過程において重要な役割を果たすこともあれば、果たしていないこともある。それにも関わらず、ＦＧＦ−Ｒのキナーゼ活性の小分子阻害剤をマウスに全身投与すると、明らかな毒性を示すことなく、ｂＦＧＦが誘導する脈管形成を阻害することが報告されている。モハマド（Ｍｏｈａｍｍａｄ）ら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第１７巻、５９９６〜５９０４ページ（１９９８）。
【００１７】
ＴＥＫ（Ｔｉｅ−２としても知られている）は内皮細胞上でのみ発現されるもう一つの受容体チロシンキナーゼで、脈管形成において重要な役割を果たすことが明らかにされている。因子アンジオポエチン−１の結合により、ＴＥＫのキナーゼドメインの自己リン酸化が起こり、かつ内皮細胞と内皮周辺支持細胞との相互作用を仲介すると思われるシグナル変換過程が起こり、それにより新しく形成された血管の成熟が促進される。一方、因子アンジオポエチン−２は、アンジオポエチン−１のＴＥＫに対する作用に拮抗すると思われ、脈管形成を破壊する。メゾンピエール（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、５５〜６０ページ（１９９７）。
【００１８】
前述の開発の結果、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＦＧＦ−Ｒ、および／またはＴＥＫのキナーゼ活性を阻害する化合物の使用により、脈管形成を治療することが提唱されている。例えば、ＷＩＰＯ国際公開公報第９７／３４８７６号はＶＥＧＦ−Ｒ２の阻害剤である一定のシノリン誘導体を開示しており、癌、糖尿病、乾癬、慢性関節リウマチ、カポジ肉腫、血管腫、急性および慢性腎症、粥腫、動脈再狭窄、自己免疫疾患、急性炎症、ならびに網膜の血管増殖を伴う眼疾患などの、異常な脈管形成および／または血管透過性増大に関連する疾患状態の治療に用いることができる。
【００１９】
前述のプロテインキナーゼに加えて、多くの他のプロテインキナーゼが治療標的であると考えられており、下記の文献に概説されているとおり、多くの刊行物がキナーゼ活性の阻害剤を開示している：マクマホン（ＭｃＭａｈｏｎ）ら、「薬物の発見および開発における、現行の見解（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、第１巻、１３１〜１４６ページ（１９９８）；ストローンら、Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ、第７巻、５５３〜５７３ページ（１９９８）。
【００２０】
しかし、容易に合成することができ、ＣＨＫ１、ＶＥＧＦ、およびＣＤＫまたはＣＤＫ／サイクリン複合体などの一つまたは複数のプロテインキナーゼの強力な阻害剤である、他の小分子化合物がさらに必要とされている。ＣＤＫ４はほとんどの細胞で細胞分裂の一般的活性化物質としてはたらきうるため、また、ＣＤＫ４／サイクリンＤおよびＣＤＫ２／サイクリンＥの複合体は、細胞周期のＧ１期初期を支配するため、一つまたは複数の種類の腫瘍を治療するために、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ２の有効かつ特異的阻害剤が必要とされている。
【００２１】
発明の概要
したがって、本発明の一つの目的は、ＶＥＧＦ、ＣＨＫ１ならびに／またはＣＤＫ２、ＣＤＫ４、および／もしくはＣＤＫ６などのＣＤＫ、またはそれらのサイクリン複合体などの、一つまたは複数のプロテインキナーゼの活性を阻害する化合物および薬物組成物を得ることである。そのような化合物および組成物は、哺乳類キナーゼ／サイクリンキナーゼ、昆虫キナーゼ、および真菌キナーゼを阻害するために用いることができる。
【００２２】
さらなる目的は、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ４／Ｄ型サイクリン複合体および／またはＣＤＫ２もしくはＣＤＫ２／Ｅ型サイクリン複合体の阻害などのキナーゼ阻害により、癌の適応を治療する有効な方法を提供することである。もう一つの目的は、癌細胞の増殖期への移行を阻止するのに有効な、下記の化合物を含む薬学的組成物を得ることである。
【化２９】
【００２３】
一つの一般的局面に従い、本発明は式Ｉの化合物に向けられる：
式中：
Ｒ１は置換または無置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ２は置換または無置換ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、かつ
Ｒ３は水素、ハロゲン、（フッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素）または置換もしくは無置換Ｃ１−８アルキルであるか、または
Ｒ２およびＲ３が共に置換または無置換５員環アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルを形成している。
【００２４】
本発明は、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩にも向けられる。本発明はさらに、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグに向けられる。加えて、本発明は式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、およびそのような代謝産物の薬学的に許容される塩に向けられる。
【００２５】
もう一つの一般的局面において、本発明はそれぞれが以下を含む、薬学的組成物に向けられる：
（ａ）式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、およびそのような代謝産物の薬学的に許容される塩から選択される、細胞周期制御剤；ならびに
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【００２６】
本発明のもう一つの一般的局面に従い、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ２の阻害によって仲介されるもののような、プロテインキナーゼ阻害によって仲介される疾患または障害を治療するための細胞周期制御剤として、式Ｉの化合物を用いる方法であって、それを必要とする患者に、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を投与することによる方法がさらに提供される。
【００２７】
本発明は、悪性腫瘍を治療する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩の、有効量を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【００２８】
本発明は、癌を治療する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩の、有効量を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【００２９】
本発明は、好ましくない脈管形成および／または細胞増殖に関連する疾患状態を治療する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩の、有効量を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【００３０】
本発明は、真菌感染を治療する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩の、有効量を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【００３１】
本発明は、プロテインキナーゼ複合体のキナーゼ活性を調節および／または阻害する方法であって、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または式Ｉの化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与することによる方法をさらに提供する。
【００３２】
本発明に従い、投与によって増殖、分化および／またはアポトーシスを制御するための、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物の治療的使用も提供される。
【００３３】
本発明に従い、癌、ならびに好ましくない脈管形成および／または細胞増殖に関連する、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、慢性関節リウマチ、および乾癬などの他の疾患状態などの、キナーゼ活性によって仲介される疾患を治療する際の、式Ｉの化合物、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または化合物のそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物の治療的使用も提供される。
【００３４】
本発明の他の局面、利点、および特徴は、下記の詳細な説明から明らかになると考えられる。
【００３５】
発明の詳細な説明および好ましい態様
前述の式Ｉの本発明の化合物は、プロテインキナーゼ、例えば、ＣＨＫ１、ＶＥＧＦ、および細胞周期のＧ０またはＧ１期において活性であるもの（例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、および／またはＣＤＫ６複合体）などのＣＤＫ／サイクリン複合体の活性を仲介および／または阻害するのに有用である。本発明の化合物は、哺乳類キナーゼ／サイクリン複合体、昆虫キナーゼ、または真菌キナーゼ複合体の阻害剤として有用である。より詳細には、化合物は増殖、分化、および／またはアポトーシスを制御するために有用な細胞周期制御剤として有用であり、したがって癌またはプロテインキナーゼによって仲介される細胞増殖に関連する他の疾患の治療を提供する。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、「アルキル」という用語は、１個から１２個の炭素原子を有する直鎖および分枝鎖アルキルを含む。任意の適当なアルキルはＲ１として用いることができる。典型的なアルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルなどが含まれる。アルキルは置換されていても、無置換でもよい。適当な置換アルキルには、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２−フルオロメチル、３−フルオロプロピル、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピルなどが含まれる。「低級アルキル」という用語は、１個から８個の炭素原子を有するアルキル（例えば、Ｃ１−８アルキル）を示す。任意の適当なアルキルをＲ３として用いることができる。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキル基を含む。実例にはメトキシ、エトキシ、プロポキシなどが含まれる。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「ハロゲン」という用語は、塩素、フッ素、ヨウ素、または臭素を含む。「ハロ」という用語は、クロロ、フルオロ、ヨード、またはブロモを意味する。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「カルボキシアミド」という用語は、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ２基を含む。アミド基（ＮＨ２）は置換されていても、無置換でもよい。
【００４０】
「シクロアルキル」という用語は、二環式および三環式シクロアルキル構造を含む、３個から１２個の炭素原子を有する飽和炭素環を含む。適当なシクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが含まれる。
【００４１】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、炭素原子、好ましくは４個または５個の環炭素原子、ならびに窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含み、かつ不飽和を持たない、単環式の基を含む。典型的なヘテロシクロアルキルには、ピロリジニル、ピペリジニル、チアジニル、およびモルホリニルが含まれる。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、「アリール」（Ａｒ）および「ヘテロアリール」という用語は、単環式および多環式不飽和芳香環構造を含み、「アリール」は炭素環のものを意味し、「ヘテロアリール」は複素環のものを意味する。芳香環構造の例には、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フリル、チエニル、ピロリル、ピリジル、ピリジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、１，２，３−トリアジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１−Ｈ−テトラゾル−５−イル、インドリル、キノリニル、ベンゾチオフェニル（チアナフテニル）、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリニル、アクリジニル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニルなどが含まれる。いかなる適当な縮合または非縮合、単環式または多環式のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルもＲ１として用いることができる。任意の適当な縮合または非縮合、単環式または多環式のヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルもＲ２として用いることができる。任意の適当な５員環のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルをＲ２およびＲ３から形成することができる。
【００４３】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３基は無置換でも、任意の適当な置換基で置換されていてもよい。適当な置換基の例は、下記の典型的な化合物中に見いだされるもの、ならびに以下である：ハロゲン（クロロ、ヨード、ブロモ、またはフルオロ）；Ｃ１−６アルキル；Ｃ１−６アルケニル；Ｃ１−６アルキニル；ヒドロキシル；Ｃ１−６アルコキシル；アミノ；ニトロ；チオール；チオエーテル；イミン；シアノ；アミド；ホスホナト；ホスフィン；カルボキシル；チオカルボニル；スルホニル；スルホンアミド；ケトン；アルデヒド；エステル；酸素（＝Ｏ）；ハロアルキル（例えばトリフルオロメチル）；単環式または縮合もしくは非縮合多環式であってもよいシクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシル）、あるいは単環式または縮合もしくは非縮合の多環式であってもよいヘテロシクロアルキル（例えば、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、またはチアジニル）；シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル、単環式または縮合もしくは非縮合の多環式アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ピロリル、インドリル、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、キノリニル、イソキノリニル、アクリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチオフェニル、またはベンゾフラニル）；アミノ（一級、二級、または三級）；ニトロ；チオール；チオエーテル；Ｏ−低級アルキル；Ｏ−アリール、Ｓ−アリール、アリール；アリール−低級アルキル；ＣＯ２ＣＨ３；ＣＯＮＨ２；ＯＣＨ２ＣＯＮＨ２；ＮＨ２；ＳＯ２ＮＨ２；ＯＣＨＦ２；ＣＦ３；ＯＣＦ３など。そのような部分は縮合環構造または架橋、例えばＯＣＨ２−Ｏで選択的に置換されていてもよい。これらの置換基はそのような基から選択される置換基で、選択的にさらに置換されていてもよい。
【００４４】
好ましい態様において、Ｒ１は置換または無置換フェニルである。好ましい置換基には、水酸基およびアルコキシ基、ならびにＳＯ２ＮＨ２および選択的に置換されたカルボキサミドなどの電子吸引基が含まれる。
【００４５】
好ましい態様において、Ｒ２は置換または無置換ヘテロアリール基である。特に好ましいＲ２基は、ピリジン、チオフェン、ベンゾチオフェン、インドール、またはベンズイミダゾールなどの、実施例の化合物中に見いだされる。Ｒ２基の特に好ましい置換基には、塩素、臭素、フッ素、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、アルキル、Ｓ−アルキル、Ｏ−アリール、アルコキシ基、−Ｓ−アリール、およびシクロアルキル基、ならびに下記の典型的な化合物中の置換基が含まれる。
【００４６】
一つの好ましい態様において、Ｒ３は水素である。もう一つの好ましい態様において、Ｒ２およびＲ３は５員環炭素環を形成する。
【００４７】
好ましい態様において、Ｒ１およびＲ２は下記の基から独立に選択される：
Ｒ１：
【化３０】
【化３５】
【化３６】
【化４２】
Ａｒはアリールであり；
Ｒ５は水素、Ｒ７、ＯＲ７、ＮＲ７Ｒ７、チオアルキル、またはチオアリールであり；かつ
Ｒ６は水素またはＲ７であり；かつ
Ｒ７は置換または無置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルである。
【００４８】
本発明の好ましい化合物には以下が含まれる：
【化４３】
【化６６】
式Ｉの化合物は互変異性の現象を示すこともあるが、本明細書中の式の図は可能な互変位型の一つだけを特に示していることが理解される。したがって、式は図示された化合物の任意の互変異型を表すことが意図され、式の図によって示された特定の互変異型に単純に限定されないことが理解されるべきである。
【００５０】
本発明の化合物のいくつかは、単一の立体異性体（すなわち、本質的に他の立体異性体を含まない）、ラセミ体、ならびに／または鏡像異性体および／もしくはジアステレオマーの混合物として存在しうることも理解される。そのような単一の立体異性体、ラセミ体、およびそれらの混合物はすべて、本発明の範囲内であることが意図される。好ましくは、光学的に活性な本発明の化合物は光学的に純粋な形で用いる。
【００５１】
当業者には一般に理解されているとおり、一つのキラル中心（すなわち、一つの不斉炭素原子）を有する光学的に純粋な化合物は、基本的に二つの可能な鏡像異性体の一つからなるものであり（すなわち、鏡像異性体として純粋であり）、かつ複数のキラル中心を有する光学的に純粋な化合物は、ジアステレオマーおよび鏡像異性体のいずれとしても純粋なものである。好ましくは、本発明の化合物は、光学的に少なくとも９０％純粋な形、すなわち単一の異性体を少なくとも９０％含む形（８０％の鏡像体過剰（「ｅ．ｅ．」）またはジアステレオマー過剰（「ｄ．ｅ．」））で用い、より好ましくは少なくとも９５％（９０％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％（９５％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、および最も好ましくは少なくとも９９％（９８％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）で用いる。
【００５２】
加えて、式は同定された構造の溶媒和ならびに非溶媒和型を含むことが意図される。例えば、式Ｉは示された構造の化合物を、水和および非水和型の両方で含む。溶媒和化合物の他の例は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、またはエタノールアミンとの組み合わせの構造を含む。
【００５３】
本発明の化合物は、式Ｉの化合物ならびにそのような化合物の薬学的に許容される塩、そのような化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、そのような化合物の薬学的に活性な代謝産物、およびそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を含む。
【００５４】
「薬学的に許容される塩」は、特定の化合物の遊離酸および塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物学的にまたはそれ以外で有害ではない塩を意味することが意図される。本発明の化合物は、十分に酸性、十分に塩基性、または両方の官能基を有していてもよく、したがって、任意のいくつかの無機または有機塩基、ならびに無機および有機酸と反応して、薬学的に許容される塩を生成することができる。典型的な薬学的に許容される塩には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、およびマンデル酸塩を含む塩などの、本発明の化合物と鉱酸もしくは有機酸または無機塩基との反応によって調製される塩が含まれる。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容されるプロドラッグ」という用語は、生理的条件下、または加溶媒分解によって特定の化合物またはそのような化合物の薬学的に許容される塩に変換されうる、薬学的に許容される化合物を意味する。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される活性代謝産物」という用語は、特定の化合物またはその塩の体内での代謝により産生される薬理学的に活性な産物を意味する。化合物のプロドラッグおよび活性代謝産物は、当技術分野において公知の日常的技術を用いて同定することができる。例えば、ベルトリーニ Ｇ．（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ， Ｇ．）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、第４０巻、２０１１〜２０１６ページ（１９９７）；シャン Ｄ．（Ｓｈａｎ， Ｄ．）ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．第８６巻（７）、７６５〜７６７ページ；バグシャウエ Ｋ．（Ｂａｇｓｈａｗｅ Ｋ．）、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ．、第３４巻、２２０〜２３０ページ（１９９５）；ボーダー Ｎ．（Ｂｏｒｄｏｒ， Ｎ．）、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．、第１３巻、２２４〜３３１ページ（１９８４）；バンガード Ｈ．（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｈ．）編、「プロドラッグの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８５）；ラーセン Ｉ．Ｋ．（Ｌａｒｓｅｎ， Ｉ． Ｋ．）、「第５章−プロドラッグの設計および応用（Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」、「薬物の設計および開発（Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、クロッグスガード−ラーセン（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｓｅｎ）ら編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、スイス（１９９１）を参照されたい。式Ｉの化合物のプロドラッグ、代謝産物、および代謝産物の薬学的塩の活性は、本明細書に記載されているような試験を用いて調べることができる。
【００５６】
本発明の化合物が塩基である場合、所望の薬学的に許容される塩は、当技術分野において利用可能な任意の適当な方法、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピロビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、グルクロン酸もしくはガラクツロン酸などのピラノシジル酸、クエン酸もしくは酒石酸などのアルファ−ヒドロキシ酸、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのアミノ酸、安息香酸塩もしくはケイヒ酸などの芳香族酸、ｐ−トルエンスルホン酸もしくはエタンスルホン酸などのスルホン酸などの有機酸を用いた、遊離塩基の処理によって調製することができる。
【００５７】
本発明の化合物が酸である場合、所望の薬学的に許容される塩は、任意の適当な方法、例えば、アミン（一級、二級または三級）、アルカリ金属水酸化物、またはアルカリ土類金属水酸化物などの無機または有機塩基を用いた、遊離酸の処理によって調製することができる。適当な塩の実例には、グリシンおよびアルギニンなどのアミノ酸、アンモニア、一級、二級および三級アミン、ならびにピペリジン、モルホリンおよびピペラジンなどの環状アミン由来の有機塩と、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウムおよびリチウム由来の無機塩とが含まれる。
【００５８】
固体物質の場合には、当業者であれば、本発明の化合物および塩は異なる結晶または多形の形で存在してもよく、これらはすべて本発明および明記された式の範囲内であることが意図される。
【００５９】
本発明の薬学的組成物は、式Ｉの化合物の代わりに、またはそれに加えて、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩、式Ｉの化合物のプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物またはそのような代謝産物の薬学的に許容される塩を活性成分として含むこともできる。そのような化合物、塩、プロドラッグ、および代謝産物は、本明細書において総称して「細胞周期制御剤」と呼ばれることもある。
【００６０】
本発明の細胞周期制御剤は、哺乳類、特にヒトにおいて、内在組織の好ましくない増殖によって特徴付けられる、増殖性障害を治療するための医薬品として有用である。式Ｉの化合物は、過度の細胞増殖に関連する障害、例えば、癌、乾癬、白血球の好ましくない増殖を含む免疫障害、ならびに再狭窄および他の平滑筋障害を有する被験者を治療するために用いることができる。さらに、そのような化合物は有糸分裂後組織および／または細胞の脱分化を防止するために用いることもできる。
【００６１】
本発明の薬学的組成物または調製物は、薬学的に許容される担体、および少なくとも一つの細胞周期制御剤の有効量を含む。治療または阻害の効果を得るために投与される細胞周期制御剤の特定の用量は、例えば、投与される特定の物質、投与経路、治療される状態、および治療される被験者または宿主を含む、状況を取り巻く特定の環境に従い、当技術分野において公知の様式で決定される。細胞周期制御剤の典型的な１日の総用量は、一回または複数回で投与してもよいが、体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇから約５０ｍｇの用量を含む。
【００６２】
本発明の細胞周期制御剤は、経口、直腸内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、または鼻腔内などの、様々な適当な経路のいずれによって投与してもよい。細胞周期制御剤は、好ましくは、投与前に所望の経路に適した組成物に調剤される。
【００６３】
本発明の薬学的組成物または調製物は、細胞周期制御剤の有効量、およびこの物質のための希釈剤または賦形剤などの薬学的に許容される担体とを含む。担体が希釈剤としてはたらく場合、これは一つまたは複数の活性成分のための媒体、賦形剤、または媒質としてはたらく固体、半固体、または液体材料でありうる。本発明の組成物は、一つまたは複数の活性成分を担体と混合する、もしくは活性成分を担体で希釈する、または活性成分をカプセル、サシェ、紙容器などの形でありうる担体中に封入もしくはカプセル化することによって製造することができる。一つまたは複数の細胞周期制御剤および任意の他の活性成分以外の、典型的な成分には、アビセル（微結晶性セルロース）、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム二水和物、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、落花生油、オリーブ油、モノステアリン酸グリセリン、トゥイーン８０（ポリソルベート８０）、１，３−ブタンジオール、カカオ脂、蜜ろう、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、および水が含まれる。
【００６４】
組成物は、所望の投与様式に適した任意の様々な形状で調製することができる。例えば、薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾル（固体として、または液体媒質中で）、軟膏（例えば、１０％重量までの細胞周期制御剤を含む）、軟ゲルおよび硬ゲルカプセル剤、坐剤、滅菌注射用溶液、滅菌包装粉末などの形に調製することができる。
【００６５】
同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの当技術分野において公知の遅延型または持効性材料を、単独またはろう、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸メチルなどと共に含むこともできる。
【００６６】
様々な薬学的剤形を用いることができる。したがって、固体担体を用いる場合、調製物は錠剤化するか、粉末もしくはペレットの形で硬ゼラチンカプセルに入れるか、またはトローチもしくはロゼンジの形とすることもできる。固体担体の量は変動しうるが、一般には約２５ｍｇから約１ｇまでと考えられる。液体担体を用いる場合、調製物はシロップ、乳剤、軟ゼラチンカプセル、アンプルもしくはバイアル中の滅菌注射用溶液もしくは懸濁液、または非水性懸濁液の形でありうる。
【００６７】
安定な水溶性剤形を得るために、本発明の物質の薬学的に許容される塩を、コハク酸またはクエン酸の０．３Ｍ溶液などの、有機酸または無機酸の水溶液に溶解する。溶解性の塩の形が利用不可能な場合、物質を適当な共溶媒または複数の共溶媒の組み合わせに溶解してもよい。適当な共溶媒の例には、全体積の０〜６０％の範囲の濃度での、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリソルベート８０、グリセリンなどが含まれるが、これらに限定されない。例えば、式Ｉの化合物はＤＭＳＯに溶解し、水で希釈することができる。組成物は、水または等張食塩もしくはデキストロース溶液などの適当な水性媒体中で、活性成分の塩の溶液の形であってもよい。
【００６８】
本発明の組成物は、薬学的組成物を調製するための一般に公知の様式で、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥などの通常の技術を用いて製造することができる。
【００６９】
薬学的組成物は、活性化合物を薬学的に用いることができる調製物へ加工するのを容易にする、賦形剤および補助剤から選択することができる、一つまたは複数の生理的に許容される担体を用いる通常の様式で調剤することができる。
【００７０】
適当な調剤は、選択された投与経路に応じて異なる。注射のためには、本発明の物質は水溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液、または生理食塩緩衝液などの生理的に適合する緩衝液に調剤することができる。経粘膜投与のためには、透過すべき障壁に適した浸透剤を製剤中で用いる。そのような浸透剤は当技術分野において公知である。
【００７１】
経口投与のためには、化合物は、活性化合物を当技術分野において公知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に調剤することができる。そのような担体は、本発明の化合物を、治療される患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして調剤することを可能にする。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤を活性成分（物質）との混合物で用い、得られた混合物を選択的に粉砕し、かつ、錠剤または糖衣錠の中心を得るために、望まれる場合には適当な補助剤を加えた後に顆粒混合物を加工することによって得ることができる。適当な賦形剤には次のものが含まれる：乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの充填剤；およびセルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）。望まれる場合には、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの崩壊剤を加えてもよい。
【００７２】
糖衣錠の中心は適当なコーティングと共に提供される。この目的のために、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒もしくは溶媒混合物を選択的に含んでいてもよい、濃縮糖溶液を用いることができる。識別のため、または活性物質の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに加えることもできる。
【００７３】
経口で用いることができる薬学的調製物には、ゼラチン製のプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセルと同様、ゼラチンならびにグリセロールおよびソルビトールなどの可塑剤製の密封軟カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、活性成分を、乳糖などの充填剤、澱粉などの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ならびに選択的に安定化剤との混合物で含むことができる。軟カプセル中では、活性物質は、脂肪油、流動パラフィン、または液状ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁されていてもよい。加えて、安定化剤も加えることができる。経口投与のためのすべての製剤は、そのような投与に適した剤形であるべきである。口腔内投与のためには、組成物は通常の様式で調剤された錠剤またはロゼンジの形を取ることもできる。
【００７４】
鼻腔内または吸入による投与のために、本発明に従って用いるための化合物は、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いて、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾル噴霧の形で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は測定した量を送達するための弁を用いることによって定量することができる。吸入器または注入器などで用いるためのゼラチンのカプセルまたはカートリッジは、化合物および乳糖またはデンプンなどの適当な粉末基剤の混合粉末を含んで調剤することができる。
【００７５】
化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために調剤することもできる。注射用製剤は、保存剤を加えた単位用量剤形、例えばアンプルで、または複数用量容器で提供することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液または乳濁液などの形をとることもでき、また懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤を含むこともできる。
【００７６】
非経口投与のための薬学的製剤には、水溶性の活性化合物の水溶液が含まれる。加えて、適当な油性注射懸濁剤として、活性化合物の懸濁液も調製することができる。適当な親油性溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁剤の粘性を高める物質を含むことができる。選択的に、懸濁剤は適当な安定化剤または化合物の溶解性を高めて高濃度溶液の調製を可能にする物質も含むことができる。
【００７７】
眼への投与のために、式Ｉの化合物は、化合物を角膜ならびに、例えば、前房、後房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網膜および強膜を含む、眼の内部領域に浸透させるのに十分な時間、眼球表面に接触し続けさせるような、薬学的に許容される眼用媒体中で送達される。薬学的に許容される眼用媒体は、軟膏、植物油、またはカプセル化材料でありうる。本発明の化合物は、硝子体液および房水中に直接注射することもできる。
【００７８】
または、活性成分は適当な媒体、例えば、使用前に発熱原を含まない滅菌水と、構成するための粉末の形であってもよい。化合物は、坐剤または保持浣腸などの直腸組成物、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含む組成物に調剤することもできる。
【００７９】
前述の製剤に加えて、化合物はデポー調製物として調剤することもできる。そのような長期作用製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与してもよい。したがって、例えば、化合物は適当な重合体もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体、例えば、難溶性の塩として調剤することもできる。
【００８０】
疎水性化合物のための薬学的担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機重合体、および水相を含む共溶媒系である。共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖ非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００の、無水エタノールで体積を合わせた溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、５％デキストロース水溶液で１：１に希釈したＶＰＤを含む。この共溶媒系は、疎水性化合物をよく溶解し、それ自体は全身投与した場合に低毒性である。もちろん、共溶媒系の比率は、その溶解性および毒性を破壊することなく、大幅に変動しうる。さらに、共溶媒成分の同一性も変動しうる：例えば、他の低毒性で非極性の界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ；ポリエチレングリコールの比率の大きさが変動してもよく；他の生物適合性重合体、例えば、ポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ；他の糖類または多糖をデキストロースの代わりに用いることができる。
【００８１】
または、疎水性の薬学的化合物の他の送達系を用いることもできる。リポソームおよび乳濁液は、疎水性薬物の送達媒体または担体の公知の例である。ジメチルスルホキシドなどの一定の有機溶媒も用いることができるが、通常は毒性がより高いという犠牲が伴う。加えて、化合物は、治療物質を含む固体疎水性重合体の半透過性マトリックスなどの、持続放出系を用いて送達することもできる。様々な持続放出材料が確立されており、当業者には公知である。持続放出性カプセルは、その化学的性質に応じて、化合物を数週間から１００日以上にわたって放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のための他の戦略を用いることもできる。
【００８２】
薬学的組成物は、適当な固相もしくはゲル相担体または賦形剤を含むこともできる。そのような担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどの重合体が含まれる。
【００８３】
本発明の化合物のいくつかは、薬学的に適合性の対イオンとの塩として提供されてもよい。薬学的に適合性の塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む多くの酸と形成されうる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基型よりも溶解性が高い傾向にある。
【００８４】
本発明の薬学的組成物は、細胞周期制御剤および、選択的に、細胞周期制御剤と適合性で、かつ治療される適応症に適した公知の抗増殖剤などの、一つまたは複数の他の活性成分を含む。
【００８５】
化合物は抗脈管形成剤として、ならびにプロテインキナーゼの活性を調節および／または阻害するための薬剤として有用であり、したがって、癌またはプロテインキナーゼによって仲介される細胞増殖に関連する他の疾患の治療を提供する。
【００８６】
本発明の物質の治療上有効量を、プロテインキナーゼの調節または制御によって仲介される疾患を治療するために用いることができる。「有効量」とは、物質がそのような治療を必要とする哺乳類に投与される場合、一つまたは複数のプロテインキナーゼの活性によって仲介される疾患の治療を行うのに十分な物質の量を意味することが意図される。したがって、例えば、式Ｉの化合物、その塩、活性代謝産物、またはプロドラッグの治療上有効量は、一つまたは複数のプロテインキナーゼの活性を、その活性によって仲介される疾患状態が軽減または緩和されるように、調節、制御または阻害するのに十分な量である。
【００８７】
そのような量に対応すると考えられる所与の物質の量は、特定の化合物、疾患状態およびその重症度、治療を必要とする哺乳類の同一性（例えば体重）などの因子に応じて変動すると考えられるが、それにも関わらず、当業者により日常的に決定することができる。「治療」とは、一つまたは複数のプロテインキナーゼの活性によって、少なくとも部分的に影響を受けている、ヒトなどの哺乳類における疾患状態の、少なくとも軽減を意味することが意図され、以下を含む：特に哺乳類が疾患状態の素因を有することが判明しているが、その疾患状態を有すると診断されていない場合に、その哺乳類において疾患状態が起こるのを予防する段階；疾患状態を調節および／もしくは阻害する段階；ならびに／または疾患状態を緩和する段階。
【００８８】
本発明の物質は、本明細書に記載の反応経路および合成方式を用い、当技術分野において利用可能な技術を用い、かつ容易に入手可能な出発物質を用いて調製することができる。本発明の好ましい化合物の調製は、下記の実施例に詳細に記載されているが、当業者であれば記載されている化学反応は、本発明のいくつかの他のプロテインキナーゼ阻害剤を調製するために容易に適応させうることを理解すると考えられる。例えば、本発明の例示されていない化合物の合成は、当業者には明らかな改変によって、例えば、妨害基を適当に保護することにより、他の当技術分野において公知の適当な試薬に変更することにより、または反応条件の日常的改変を行うことにより、首尾よく実施することができる。または、本明細書に開示されているか、または当技術分野において公知の他の反応は、本発明の他の化合物を調製するための適用可能性を有することが理解されると考えられる。
【００８９】
本発明の物質を調製する際に用いるための典型的な反応経路および合成方式を以下に示す。
「保護基」とは、一つまたは複数の固有の官能基を時期尚早の反応から保護する基を意味する。適当な保護基は、化合物を構築するために用いられる官能基および特定の化学反応を考慮して、当業者であれば日常的に選択することができる。適当な保護基の例は、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびウッツ（Ｗｕｔｚ）、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１）に記載されている。ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）などにおける本発明の実施において有用な典型的保護基。
【００９１】
実施例
下記の実施例において、特に記載のない限り、温度はすべて摂氏温度で示し、割合％は重量によるものである。試薬はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）またはランカスター・シンセシス（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｌｔｄ．）などの商業的供給会社から購入し、特に記載のない限り、それ以上の精製をせずに用いた。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から確かな密封瓶入りを購入し、受け取ったままで用いた。溶媒はすべて、当業者には容易に明らかとなる標準法を用いて精製した。
【００９２】
下記の反応は一般には、窒素、アルゴンまたは乾燥チューブ付きの陽圧下、室温（特に記載のない限り）、無水溶媒中で実施し、反応フラスコにはシリンジから基質および試薬を導入するためのゴム膜を取りつけた。ガラス器具は乾燥器乾燥および／または熱乾燥した。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、裏がガラスのＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（０．２５ｍｍ）で行い、適当な溶媒比（ｖ／ｖ）で溶出し、場合に即して示している。反応はＴＬＣ、ＮＭＲまたはＨＰＬＣで分析し、出発物質の消費により判断して停止した。
【００９３】
ＴＬＣプレートの可視化は、ＵＶランプ、ヨウ素、またはｐ−アニスアルデヒド噴霧試薬もしくはリンモリブデン酸試薬（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、２０％重量エタノール溶液）および加熱しての活性化により行った。後処理は一般的には、反応物の体積を反応溶媒または抽出溶媒で二倍にし、次いで、特に記載のない限り抽出体積の２５％体積で、記載の水性溶液を用いて洗浄することにより実施した。生成物溶液は無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、ろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで減圧下に蒸発させ、溶媒を減圧除去したものとして記した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（スティル（Ｓｔｉｌｌ）ら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、４３、２９２３（１９７８））は、特に記載のない限り、Ｍｅｒｃｋ ＥＭフラッシュシリカゲル（４７〜６１μｍ）を、シリカゲル：粗生成物の比約２０：１〜５０：１で用いて行った。水素化分解は実施例中に示された圧または大気圧で行った。
【００９４】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒの機器を３００ＭＨｚで操作して記録し、１３Ｃ−ＮＭＲは７５ＭＨｚで操作して記録した。ＮＭＲスペクトル（ｐｐｍで報告）はＣＤＣｌ３溶液で、標準としてクロロホルム（７．２５ｐｐｍおよび７７．００ｐｐｍ）もしくはＣＤ３ＯＤ（３．４および４．８ｐｐｍならびに４９．３ｐｐｍ）、またはしかるべき場合には内部標準のテトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）を用いて記録した。他のＮＭＲ溶媒も必要に応じて用いた。ピークの多重度を報告する場合には、下記の略語を用いる：ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ（幅広）、ｄｄ（二重線の二重線）、ｄｔ（三重線の二重線）。カップリング定数を示す場合は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告する。
【００９５】
赤外（ＩＲ）スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＦＴ−ＩＲ分光器で、ニートオイル、ＫＢｒ錠、またはＣＤＣｌ３溶液として記録し、波数（ｃｍ−１）で報告する。質量分析スペクトルは、ＬＳＩＭＳまたはエレクトロスプレーを用いて記録した。融点（ｍｐ）はすべて未補正である。
【００９６】
特に記載のない限り、出発物質は市販されているか、または当技術分野において公知の一般的技術を用いて得ることができる。
【００９７】
典型的化合物
実施例１（ａ）：フェニル−（５−チオフェン−２−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−アミン（化合物Ａ）
【化６７】
【００９８】
この粗Ｎ，Ｓ−アセタールをエタノール（１５ｍＬ）に溶解した。ヒドラジン水和物（６２５μＬ、１２．９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１６時間撹拌還流させた。次いでこれを減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＨ／Ｈｅｘ）で精製した。ＣＨＣｌ３／ヘキサン２：１からの沈殿物をろ取して、７２０ｍｇ（収率３５％）の化合物Ａを白色固体で得た。
【００９９】
実施例１（ｂ）：（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−フェニル−アミン（化合物Ｂ）
【化６８】
実施例１（ｃ）：フェニル−（５−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−アミン（化合物Ｃ）
【化６９】
実施例１（ｄ）：（１，８−ジヒドロ−インデノ［２，１−ｃ］ピラゾル−３−イル）−フェニル−アミン（化合物Ｄ）
【化７０】
実施例１（ｅ）：［５−（４−ブロモ−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン（化合物Ｅ）
【化７１】
４−アセチル−３−ブロモ−チオフェン
【化７２】
実施例１（ｆ）：フェニル−［５−（４−トランス−スチリル−チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−アミン（化合物Ｆ）
【化７３】
３−アセチル−４−（トランス−スチリル）−チオフェン
【化７４】
実施例１（ｇ）：［５−（４−シクロヘキサ−１−エニル−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン（化合物Ｇ）
【化７５】
３−アセチル−４−シクロヘキサ−１−エニル−チオフェン
【化７６】
実施例１（ｈ）：［５−（４−シクロヘキシル−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン（化合物Ｈ）
【化７７】
実施例１（ｉ）：フェニル−［５−（４−フェニルスルファニル−チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−アミン（化合物Ｉ）
【化７８】
３−ブロモ−４−フェニルスルファニル−チオフェン
【化７９】
４−アセチル−３−フェニルスルファニル−チオフェン
【化８０】
［５−（Ｎ−ＢＯＣ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン
【化８１】
【０１１３】
この粗チオアミドをエタノール（２０ｍＬ）に溶解した。ヒドラジン水和物（１８０μＬ、２．１ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｃ（５滴）を加え、反応混合物を還流させながら２時間撹拌した後、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（３０％〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して４９９ｍｇ（５９％）の［５−（Ｎ−ＢＯＣ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミンを淡黄色の泡で得た。
実施例１（ｊ）：［５−（１Ｈ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］−フェニル−アミン（化合物Ｊ）
【化８２】
実施例２（ａ）：（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−４−（メトキシ−フェニル）−アミン（化合物Ｋ）
【化８３】
実施例２（ｂ）：４−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−フェノール（化合物Ｌ）
【化８４】
実施例２（ｃ）：（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−３−（メトキシ−フェニル）−アミン（化合物Ｍ）
【化８５】
実施例２（ｄ）：３−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−フェノール（化合物Ｎ）
【化８６】
実施例２（ｅ）：４−（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｏ）
【化８７】
【０１２０】
この粗チオアミドをエタノール（２０ｍＬ）に溶解した。ヒドラジン水和物（１００δＬ、２．１ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｃ（５滴）を加え、反応混合物を還流させながら２時間撹拌した。次いで、これを減圧濃縮し、残渣をエーテル（４０ｍＬ）に取った。黄色固体をろ取し、次いでメタノールから再結晶させて２６５ｍｇ（３２％）の４−（５−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル）−ベンゼンスルホンアミドを白色固体で得た。
４−イソチオシアナト−Ｎ−（ＴＢＤＭＳ）−ベンゼンスルホンアミド
【化８８】
実施例３（ａ）：４−［５−（７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｐ）
【化８９】
３−アセチル−７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン
【化９０】
実施例３（ｂ）：４−｛５−［７−（３−メトキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｑ）
【化９１】
３−アセチル−７−（３−メトキシ）−フェニル−ベンゾ［ｂ］チオフェン
【化９２】
実施例３（ｃ）：４−｛５−［７−（３−ヒドロキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｒ）
【化９３】
実施例３（ｄ）：４−｛５−［７−（４−メトキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｓ）
【化９４】
【０１２８】
この粗チオアミドをエタノール（２０ｍＬ）に溶解した。ヒドラジン水和物（１００μＬ、２．１ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｃ（５滴）を加え、反応混合物を還流させながら２時間撹拌した。次いで、これを減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（６０％ＴＨＦ／ヘキサン）により精製した。ＭｅＯＨから沈殿させ、ろ取して３８６ｍｇ（３６％）の４−｛５−［７−（４−メトキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミドを白色固体で得た。
実施例３（ｅ）：４−｛５−［７−（４−ヒドロキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｔ）
【化９５】
実施例３（ｆ）：｛５−［３−（５−ブロモ）−ベンゾ［ｂ］チオフェニル］−１Ｈ−ピラゾル−３−イル｝−フェニルアミン−４−スルホンアミド（化合物Ｕ）
【化９６】
３−アセチル−５−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン
【化９７】
実施例３（ｇ）：４−［５−（６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｖ）
【化９８】
６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸メトキシ−メチルアミド
【化９９】
３−アセチル−６−メトキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン
【化１００】
実施例３（ｈ）：４−［５−（６−ヒドロキシ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｗ）
【化１０１】
実施例３（ｉ）：４−［５−（１Ｈ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｘ）
【化１０２】
４−［５−（Ｎ−ＢＯＣ−インドル−３−イル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド
【化１０３】
生化学および生物学的評価：
前述の典型的化合物を、その活性に関して下記のとおり試験することができる。プロテインキナーゼ阻害剤の、増殖因子によって誘導される細胞増殖を阻止する能力は、受容体自己リン酸化を阻止するその能力と直接相関している。化合物のプロテインキナーゼ阻害活性を測定するために、下記の構築物を考案した。
【０１３９】
サイクリン依存性キナーゼ活性を、［３２Ｐ］ＡＴＰまたは［３３Ｐ］ＡＴＰからの放射性リン酸塩のタンパク質基質への、酵素により触媒された時間依存性の取り込みを定量することにより測定した。特に記載のない限り、アッセイは９６穴プレートで、一反応あたり１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５μＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１ｍｇ／ｍＬオバルブミン、５μｇ／ｍＬロイペプチン、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭベータ−グリセロリン酸、０．１ｍＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフッ化ナトリウム、２．５ｍＭエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド、および０．０３〜０．４μＣｉ［３２／３３Ｐ］ＡＴＰ存在下、合計量５０μＬで実施した。反応は酵素により開始し、３０℃でインキュベートし、２０分後にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を２５０ｍＭまで加えることによって停止した。次いで、リン酸化基質をニトロセルロースまたはホスホセルロース膜上に９６穴ろ過マニホールドを用いて捕捉し、取り込まれていない放射能を０．８５％リン酸で繰り返し洗浄することにより除去した。乾燥させた膜をホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）に曝露することによって放射能を定量した。
【０１４０】
見かけのＫｉ値を、異なる濃度の阻害剤化合物存在下で酵素活性をアッセイし、酵素非存在下で測定したバックグラウンド放射能を減じることによって測定した。阻害データを、カレイダグラフ（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ）（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて競合的阻害のための式にあてはめるか、またはキネティック（ＫｉｎｅＴｉｃ）ソフトウェア（ＢｉｏＫｉｎ， Ｌｔｄ．）を用いて競合的強結合阻害のための式にあてはめた。
【０１４１】
ＣＤＫ４ ／サイクリン Ｄ 網膜芽細胞腫キナーゼ活性の阻害：
ヒトＣＤＫ４およびサイクリンＤ３の複合体、またはヒトＣＤＫ４および遺伝子操作によって短縮された（１〜２６４）サイクリンＤ３の複合体を、対応するバキュロウイルス発現ベクターに同時感染している昆虫細胞から、伝統的な生化学クロマトグラフィー法を用いて精製した（例えば、メイジャー（Ｍｅｉｊｅｒ）およびキム（Ｋｉｍ）、「サイクリン依存性キナーゼの化学的阻害（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｙ、第２８３巻、１１３〜１２８ページ（１９９７）参照）。酵素複合体（５ｎＭまたは５０ｎＭ）を、０．３μｇ〜０．５μｇの精製組換え網膜芽細胞腫タンパク質断片（Ｒｂ）を基質としてアッセイした。操作されたＲｂ断片（天然網膜芽細胞腫タンパク質の３８６〜９２８残基；６２．３ｋＤａ）は、天然の１０６ｋＤａのタンパク質中に見いだされるリン酸化部位の大部分、ならびに精製を容易にするためのヒスチジン６残基のタグを含んでいる。リン酸化Ｒｂ基質を微細ろ過によりニトロセルロース膜上に捕捉し、前述のとおりホスホイメージャーを用いて定量した。強力な結合阻害剤の測定のためには、酵素複合体濃度を５ｎＭに下げ、アッセイ時間を６０分間に延長したが、その間、生成物形成の時間依存性は直線的であった。
【０１４２】
ＣＤＫ２ ／サイクリン Ａ 網膜芽細胞腫キナーゼ活性の阻害：
ＣＤＫ２を公表されている方法（ローゼンブラット（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ）ら、「ヒトサイクリン依存性キナーゼ２の精製および結晶化（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌｉｎａｓｅ ２）」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第２３０巻、１３１７〜１３１９ページ（１９９３））を用いて、バキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞から精製した。サイクリンＡは全長組換えサイクリンＡを発現する大腸菌細胞から精製し、短縮したサイクリンＡ構築物を限定的タンパク質分解により生成し、以前に記載されているとおりに精製した（ジェフリー（Ｊｅｆｆｒｅｙ）ら、「サイクリンＡ−ＣＤＫ２複合体の構造によって明らかにされるＣＤＫ活性化の機構（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＣＤＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｃｙｃｌｉｎ Ａ−ＣＤＫ２ ｃｏｍｐｌｅｘ）」、Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、３１３〜３２０ページ（１９９５年７月２７日）。ＣＤＫ２およびタンパク質分解されたサイクリンＡの複合体を調製し、ゲルろ過によって精製した。このアッセイ法の基質はＣＤＫ４アッセイ法に用いたものと同じＲｂ基質断片で、ＣＤＫ２／サイクリンＡおよびＣＤＫ４／サイクリンＤ３のアッセイ法は、ＣＤＫ２を１５０ｎＭまたは５ｎＭとした以外は、基本的に同じであった。Ｋｉ値を前述のとおりに測定した。
【０１４３】
ＶＥＧＦその他などの増殖因子による細胞増殖の刺激は、それらの各受容体のチロシンキナーゼの自己リン酸化誘導に依存している。したがって、これらの増殖因子により誘導される細胞増殖を阻止するプロテインキナーゼ阻害剤の能力は、受容体自己リン酸化を阻止する能力に直接相関している。化合物のプロテインキナーゼ阻害活性を測定するために、以下の構築物を用いた。
【０１４４】
アッセイのための ＶＥＧＦ−Ｒ２ 構築物
この構築物は試験化合物のチロシンキナーゼ活性を阻害する能力を調べるものである。ヒト血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）の、キナーゼ挿入ドメインの６８残基の５０の中心残基を欠く、細胞質ゾルドメインの構築物（ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０）を、バキュロウイルス／昆虫細胞系において発現させた。この構築物はマクティーグ（ＭｃＴｉｇｕｅ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第７巻、３１９〜３３０ページ（１９９９）および１９９９年９月７日に出願された同時係属中の米国特許出願第０９／３９０，３２６号に記載されている。全長ＶＥＧＦ−Ｒ２の１３５６残基のうち、ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０は野生型ＶＥＧＦ−Ｒ２に比べて、８０６〜９３９残基および９９０〜１１７１残基を含み、またキナーゼ挿入ドメイン内に一つの点突然変異（Ｅ９９０Ｖ）を含む。精製構築物の自己リン酸化は、酵素を４μＭの濃度で、５％グリセロールおよび５ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中、３ｍＭ ＡＴＰおよび４０ｍＭ ＭｇＣｌ２存在下、４℃で２時間インキュベートすることにより実施した。自己リン酸化後、この構築物は野生型の自己リン酸化されたキナーゼドメイン構築物と基本的に等しい触媒活性を有することが明らかにされた。パラスト（Ｐａｒａｓｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、１６７８８〜１６８０１ページ（１９９８）参照。
【０１４５】
アッセイのための ＣＨＫ１ 構築物
Ｃ末端にＨｉｓタグを有する全長ヒトＣＨＫ１（ＦＬ−ＣＨＫ１）を、バキュロウイルス／昆虫細胞系を用いて発現させた。これは４７６アミノ酸のヒトＣＨＫ１のＣ末端に６個のヒスチジン残基（６×Ｈｉｓタグ）を含む。タンパク質は通常のクロマトグラフィー法によって精製した。
【０１４６】
ＶＥＧＦ−Ｒ２ アッセイ法
連結分光光度（ ＦＬＶＫ−Ｐ ）アッセイ法
リン酸基転移を伴うＡＴＰからＡＤＰの生成を、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）ならびにピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を有する系を用いるＮＡＤＨの酸化と連結させた。ＮＡＤＨの酸化を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６５０分光光度計を用い、３４０ｎｍ（ｅ３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の吸光度の低下を追跡することによってモニターした。リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（下記の表ではＦＬＶＫ−Ｐと示している）のアッセイ条件は次のとおりであった：２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中、１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；１ｍＬあたり５０単位のＬＤＨ；１ｍＬあたり２０単位のＰＫ；５ｍＭ ＤＴＴ；５．１ｍＭポリ（Ｅ４Ｙ１）；１ｍＭ ＡＴＰ；および２５ｍＭ ＭｇＣｌ２。非リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（表ではＦＬＶＫと示している）のアッセイ条件は次のとおりであった：２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中、１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；１ｍＬあたり５０単位のＬＤＨ；１ｍＬあたり２０単位のＰＫ；５ｍＭ ＤＴＴ；２０ｍＭポリ（Ｅ４Ｙ１）；３ｍＭ ＡＴＰ；ならびに６０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２ｍＭ ＭｎＣｌ２。アッセイは５ｎＭから４０ｎＭの酵素で開始した。Ｋｉ値を様々な濃度の試験化合物存在下、酵素活性を測定することによって求めた。データはエンザイムキネティックおよびカレイダグラフソフトウェアを用いて解析した。
【０１４７】
ＥＬＩＳＡ アッセイ法
ホスホガストリンの生成をビオチン化ガストリンペプチド（１〜１７）を基質に用いてモニターした。ビオチン化ホスホガストリンをストレプトアビジンでコーティングした９６穴マイクロタイタープレートを用いて固定化した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した抗ホスホチロシン抗体を用いて検出した。セイヨウワサビペルオキシダーゼの活性を２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンザチアゾリンスルホネート（６）］２アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を用いてモニターした。典型的アッセイ溶液には以下が含まれていた：２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中、２μＭビオチン化ガストリンペプチド；５ｍＭ ＤＴＴ；２０μＭ ＡＴＰ；２６ｍＭ ＭｇＣｌ２；および２ｍＭ ＭｎＣｌ２。アッセイは０．８ｎＭのリン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０で開始した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ活性は１０ｍＭのＡＢＴＳを用いてアッセイした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ反応を酸（Ｈ２ＳＯ４）の添加により停止し、その後４０５ｎｍの吸光度を読み取った。Ｋｉ値を様々な濃度の試験化合物存在下、酵素活性を測定することによって求めた。データはエンザイムキネティックおよびカレイダグラフソフトウェアを用いて解析した。
【０１４８】
ＣＨＫ１ アッセイ法
合成基質ペプチドＳｙｎｔｉｄｅ−２（ＰＬＡＲＴＬＳＶＡＧＬＰＧＫＫ）へのリン酸基転移を伴うＡＴＰからＡＤＰの生成を、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を用いたピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の作用によるＮＡＤＨの酸化と連結させた。ＮＡＤＨの酸化を、ＨＰ８４５２分光光度計を用い、３４０ｎｍ（∈３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の吸光度の低下を追跡することによってモニターした。典型的反応溶液には以下のものが含まれていた：５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）中、４ｍＭ ＰＥＰ；０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ；１ｍＬあたり２８単位のＬＤＨ；１ｍＬあたり１６単位のＰＫ；３ｍＭ ＤＴＴ；０．１２５ｍＭ Ｓｙｎｔｉｄｅ−２；０．１５ｍＭ ＡＴＰ；２５ｍＭ ＭｇＣｌ２；および４００ｍＭ ＮａＣｌ。アッセイは１０ｎＭのＦＬ−ＣＨＫ１で開始した。Ｋｉ値を様々な濃度の試験化合物存在下、初期酵素活性を測定することによって求めた。データはエンザイムキネティックおよびカレイダグラフソフトウェアを用いて解析した。
【０１４９】
前述の特定の実施例を含む、化合物に対して行ったアッセイの結果を下記の表１に示している。特定の項目で特に記載のない限り、用いた単位およびアッセイは表の該当する欄に示したとおりである。
【０１５０】
【表１】ＣＤＫのＫｉ
細胞増殖の阻害：細胞毒性の評価：
細胞増殖の阻害を、生存細胞の臭化３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−［２Ｈ］−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）をホルマザンに還元する能力に基づく、テトラゾリウム塩アッセイ法（モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第６５巻、５５〜５８ページ（１９８３））を用いて測定した。次いで、水不溶性の紫色のホルマザン生成物を分光光度分析によって検出した。ＨＣＴ１１６細胞系統を９６穴プレートで培養した。細胞をマッコイの５Ａ培地中１３５μｌ／穴の量で適当な培地中に播種した。プレートを４時間インキュベートした後、阻害剤化合物を加えた。異なる濃度の阻害剤化合物を０．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（１５μＬ／穴）に加え、細胞を３７℃（５％ＣＯ２）で４日から６日間（細胞型に応じて）インキュベートした。インキュベーション終了時に、ＭＴＴを最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるまで加え、細胞を３７℃でさらに４時間インキュベートした。プレートを遠心沈降し、培地を除去した後、ホルマザン（ジメチルスルホキシドに可溶化）の吸光度を５４０ｎｍで測定した。増殖の５０％阻害を引き起こす阻害剤化合物の濃度を、阻害剤濃度と阻害割合％の片対数プロットの直線部分から求めた。すべての結果を０．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドだけで処理した対照細胞と比較した。
【０１５２】
【表２】
上記の実施例は、式Ｉによる化合物、および様々なキナーゼ複合体に対するそれらの活性レベルを求めるために、容易に実施できるアッセイ法を例示している。選択された標的に対し、望ましいレベルの活性を有する阻害剤を選択するために、そのようなアッセイ法、または当技術分野において公知の他の適当なアッセイ法を用いうることは明らかであると考えられる。
【０１５４】
前述の典型的化合物は、下記の一般的実施例に従い、薬学的組成物に調剤することができる。
【０１５５】
実施例 １ ：非経口組成物
注射による投与に適した非経口薬学的組成物を調製するために、式Ｉの化合物の水溶性塩１００ｍｇをＤＭＳＯに溶解し、次いで０．９％滅菌食塩水１０ｍＬと混合する。混合物を注射による投与に適した単位剤形に取り込む。
【０１５６】
実施例 ２ ：経口組成物
経口送達のための薬学的組成物を調製するために、式Ｉの化合物１００ｍｇを乳糖７５０ｍｇと混合する。混合物を、経口投与に適した、硬ゼラチンカプセルなどの経口単位剤形に取り込む。
【０１５７】
本発明を特定の好ましい態様に関して示してきたが、当業者であれば、通常の実験および本発明の実施を通じて変更および改変が可能であることを認識すると考えられる。したがって、本発明は前述の記載によって限定されることが意図されるものではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらと同等のものによって規定されることが意図される。
Claims (12)
- 式Ｉの化合物：
Ｒ１は置換または無置換アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ２は置換または無置換ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；かつ
Ｒ３は水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素または置換もしくは無置換Ｃ１−８アルキルであるか、または
Ｒ２およびＲ３が共に置換５員環の、アリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキル環を形成する）；
または式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩；または式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ；または式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物；または該代謝産物の薬学的に許容される塩。 - Ｒ１が無置換または置換フェニルであり、Ｒ２が置換または無置換ヘテロアリールであり、かつＲ３が水素である、請求項１に記載の化合物、薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、または薬学的に活性な代謝産物もしくは代謝産物の薬学的に許容される塩。
- Ｒ１が無置換フェニルまたは電子吸引基で置換されたフェニルであり、Ｒ２がヘテロ原子として少なくとも一つの硫黄または窒素を有する、置換または無置換ヘテロアリールであり、かつＲ３が水素である、請求項１に記載の化合物、薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、または薬学的に活性な代謝産物もしくは代謝産物の薬学的に許容される塩。
- Ｒ１が電子吸引基で置換されたフェニルであり、Ｒ２がヘテロ原子として少なくとも一つの硫黄を有する、置換または無置換ヘテロアリールであり、かつＲ３が水素である、請求項１に記載の、化合物、薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、または薬学的に活性な代謝産物もしくは代謝産物の薬学的に許容される塩。
- 以下からなる群より選択される化合物；
- 以下を含む薬学的組成物：
（ａ）細胞周期制御剤が式Ｉの化合物：
Ｒ１は置換または無置換アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり；
Ｒ２は置換または無置換ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；かつ
Ｒ３は水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素または置換もしくは無置換Ｃ１−８アルキルであるか；あるいは
Ｒ２およびＲ３が共に置換５員環アリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキル環を形成する）；または
式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩；または式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ；または式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物；または該代謝産物の薬学的に許容される塩である、ＣＤＫ４またはＣＤＫ４／サイクリン複合体を阻害するのに有効な量の細胞周期制御剤、ならびに
（ｂ）薬学的に許容される担体。 - ＣＤＫ４またはＣＤＫ４／サイクリン複合体の阻害によって仲介される疾患または障害を治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験者に、以下からなる群より選択される細胞周期制御剤を投与する段階を含む方法：式Ｉに従う化合物：
（式中：
Ｒ１は置換または無置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ２は置換または無置換ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；かつ
Ｒ３は水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素または置換もしくは無置換Ｃ１−８アルキルであるか；または
Ｒ２およびＲ３が共に置換または無置換５員環アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル環を形成する）；
式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩；
式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ；
式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物；および
該代謝産物の薬学的に許容される塩。 - 以下を含む薬学的組成物：
（ａ）治療上有効量の、請求項１に記載の化合物、薬学的に許容されるプロドラッグ、薬学的に活性な代謝産物、または薬学的に許容される塩；および
（ｂ）そのための薬学的に許容される担体、希釈剤、媒体または賦形剤。 - プロテインキナーゼ活性によって仲介される哺乳類の疾患状態を治療する方法であって、それを必要とする哺乳類に、以下の式Ｉに従う治療上有効量の化合物を投与する段階を含む方法：
Ｒ１は置換または無置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ２は置換または無置換ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；かつ
Ｒ３は水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素または置換もしくは無置換Ｃ１−８アルキルであるか；または
Ｒ２およびＲ３が共に置換または無置換の５員環アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル環を形成する）；
または式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩；または式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ；または式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物；または該代謝産物の薬学的に許容される塩。 - 哺乳類の疾患状態が腫瘍の成長、細胞増殖、または脈管形成に関連する、請求項９に記載の方法。
- プロテインキナーゼ受容体の活性を調節または阻害する方法であって、キナーゼ受容体を以下の式Ｉに従う有効量の化合物と接触させる段階を含む方法：
Ｒ１は置換または無置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ２は置換または無置換ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；かつ
Ｒ３は水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素または置換もしくは無置換Ｃ１−８アルキルであるか；または
Ｒ２およびＲ３が共に置換または無置換の５員環アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル環を形成する）；
または式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩；または式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ；または式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物；または該代謝産物の薬学的に許容される塩。 - 以下を含む薬学的組成物：
（ａ）ＣＤＫまたはＣＤＫ／サイクリン複合体を阻害するのに有効な量の、以下より選択される細胞周期制御剤：
（ｉ）請求項１に記載の式Ｉの化合物；
（ｉｉ）式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩；および
（ｉｉｉ）式Ｉの化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ、式Ｉの化合物の薬学的に活性な代謝産物、または該代謝産物の薬学的に許容される塩；ならびに
（ｂ）薬学的に許容される担体。
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