DE60110802T2

DE60110802T2 - Heterozyklische-hydroximino-fluorene und ihre verwendung zur inhibierung von proteinkinasen

Info

Publication number: DE60110802T2
Application number: DE60110802T
Authority: DE
Inventors: Kwan Wesley CHONG; Kumar Rohit DUVADIE
Original assignee: Agouron Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Agouron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2021-08-01
Also published as: JP2004506720A; EP1309563B1; US6462060B2; BR0113258A; SV2003000603A; GT200100170A; PE20020289A1; WO2002016326A1; EP1309563A1; AR032891A1; AU2001279090A1; MXPA03001452A; US20020049238A1; CA2411924A1; ATE295354T1; ES2238463T3; DE60110802D1; PA8525701A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung ist auf Verbindungen mit heterocyclischen-Hydroxyimino-Fluorenkernen, die die Wirkung von bestimmten Proteinkinasen vermitteln und/oder inhibieren, und auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Verbindungen enthalten, gerichtet. Die Erfindung ist ebenso auf die therapeutische oder prophylaktische Verwendung von solchen Verbindungen und Zusammensetzungen und auf Verfahren zur Behandlung von Krebs sowie anderen Krankheitszuständen, die mit nicht gewünschter Angiogenese und/oder Zellproliferation verbunden sind, durch die Verabreichung wirksamer Mengen solcher Verbindungen, gerichtet.
Hintergrund der Erfindung
Proteinkinasen sind eine Familie von Enzymen, die die Phosphorylierung der Hydroxylgruppe von speziellen Tyrosin-, Serin- oder Threoninresten in Proteinen katalysieren. Typischerweise verändert eine solche Phosphorylierung dramatisch die Funktion des Proteins und daher sind Proteinkinasen bei der Regulierung einer breiten Vielzahl an Zellverfahren, einschließlich Stoffwechsel, Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Zellüberleben, entscheidend. Von den vielen unterschiedlichen Zellfunktionen, bei denen die Wirkung von Proteinkinasen bekanntermaßen erforderlich ist, stellen einige Verfahren attraktive Targets zur therapeutischen Intervention für bestimmte Krankheitszustände dar. Zwei Beispiele sind Zellzykluskontrolle und Angiogenese, bei denen Proteinkinasen eine entscheidende Rolle spielen. Diese Verfahren sind für das Wachstum von festen Tumoren sowie anderen Krankheiten wesentlich.
Die unkontrollierte Zellproliferation ist das Zeichen für Krebs. Die Zellproliferation wird als Antwort auf verschiedene Reize durch eine Deregulierung des Zellteilungszyklus, das Verfahren, durch das sich Zellen vermehren und teilen, manifestiert. Tumorzellen weisen typischerweise Schäden an den Genen auf, die direkt oder indirekt die Progression während des Zellteilungszyklus regulieren.
Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) sind Serin-Threonin-Proteinkinasen, die bei der Regulierung der Übergänge zwischen unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus, wie die Progression von einer latenten Phase in G₁ (die Lücke zwischen Mitose und dem Beginn der DNA-Replikation für eine neue Runde der Zellteilung) bis S (die Periode der aktiven DNA-Synthese) oder die Progression von G₂- bis M-Phase, in der die aktiv Mitose und Zellteilung stattfindet, kritische Rollen spielen. Siehe beispielsweise die Artikel, zusammengestellt in Science, 274, 1643–1677 (1996) und Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 13, 261–291 (1997). CDK-Komplexe werden durch die Verbindung einer regelnden Cyclinuntereinheit (beispielsweise Cyclin A, B1, B2, D1, D2, D3 und E) und einer katalytischen Kinaseuntereinheit (beispielsweise cdc2 (CDK1), CDK2, CDK4, CDK5 und CDK6) gebildet. Wie der Name andeutet, zeigen die CDKs eine absolute Abhängigkeit von der Cyclinuntereinheit, um ihre Zielsubstrate zu phosphorylieren, und unterschiedliche Kinase/Cyclin-Paarfunktion, um die Progression durch spezielle Phasen des Zellzyklus zu regulieren.
Die Progression von der G1- bis S-Phase, erreicht durch die Wirkung von CDK4/Cyclin D und CDK2/Cyclin E, unterliegt einer Vielzahl von Wachstumsregulatormechanismen, sowohl negativ als auch positiv. Wachstumsreize, wie Mitogene, verursachen erhöhte Synthese von Cyclin D1 und daher erhöhtes funktionelles CDK4. Im Gegensatz dazu kann das Zellwachstum als Antwort auf die DNA-Schädigung oder negative Wachstumsreize durch die Induktion von endogenen Inhibitorproteinen herunter geregelt werden. Die natürlich auftretenden Proteininhibitoren umfassen p21^WAF1/CIP1-, p27^KIP1- und die p16^INK4-Familie, wobei die letztere davon nur CDK4 inhibiert (siehe Harper, Cancer Surv., 29, 91–107 (1997)). Abweichungen in diesem Kontrollsystem, insbesondere die, die die Funktion von CDK4 und CDK2 beeinflussen, sind bei dem Wachstum von Zellen auf den stark proliferativen Zustand, der für Malignitäten, insbesondere Familienmelanome, Ösophaguskarzinome und Pankreaskarzinome charakteristisch ist, verwickelt. Siehe beispielsweise Hall et al., Adv. Cancer Res., 68, 67–108 (1996); Kamb, Trends in Genetics, 11, 136–140 (1995); Kamb et al., Science, 264, 436–440 (1994).
Die Überexpression von Cyclin D1 ist mit Ösophagus-, Brust- und Plattenepithelkarzinomen verbunden (siehe beispielsweise DelSal et al., Critical Rev. Oncogenesis, 71, 127–142 (1996)). Gene, die die CDK4-spezifischen Inhibitoren der p16-Familie kodieren, weisen häu fig Deletionen und Mutationen in Familienmelanomen, Glioma, Leukämie, Sarkom und pankreatischen, nicht kleinzelligen Lungen- und Kopf- und Halskarzinomen auf (siehe Nobori et al., Nature, 368, 753–756 (1994)). Die Amplifikation und/oder Überexpression von Cyclin E ist ebenso in einer breiten Vielzahl von festen Tumoren beobachtet worden, und erhöhte Cyclin-E-Niveaus stehen mit schlechter Prognose in Wechselbeziehung. Außerdem sind die Zellniveaus des CDK-Inhibitors p27, der sowohl als ein Substrat als auch ein Inhibitor von CDK2/Cyclin E fungiert, bei Brust-, Kolon- und Prostatakrebsen abnormal niedrig, und die Expressionsniveaus von p27 korrelieren umgekehrt mit der Krankheitsphase (siehe Loda et al., Nature Medicine, 3, 231–234 (1997)). Kürzlich ist nachgewiesen worden, daß CDK4/Cyclin D p27 sequestrieren kann, wie in Sherr et al., Genes Dev., 13, 1501–1512 (1999) geprüft. Die p21-Proteine scheinen ebenso das p53-Tumor-Suppressionssignal zu den CDKs zu übertragen (siehe El-Deiry et al., Cell, 75, 817–825 (1993)); daher kann die Mutation von p53 in ungefähr 50% von allen menschlichen Krebsarten indirekt zur Deregulierung der CDK-Wirkung führen.
Die Verwendung von Verbindungen als antiproliferative Therapeutika, die die Proteinkinaseaktivität inhibieren, ist der Gegenstand von mehreren Patenten und Veröffentlichungen. Beispielsweise offenbart die internationale WIPO Veröffentlichung Nr. WO 97/45397 bestimmte Alkyloxyamino-substituierte Fluorenone, die die Proteinkinase-C-Aktivität (beispielsweise CDC2-Kinaseaktivität) bei Säugern kontrollieren. Die internationale WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 99/21845 offenbart 4-Aminothiazole als CDK-Inhibitoren. Isothiazolderivate, die als krebsvorbeugende Mittel nützlich sind, werden in der internationalen WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 99/62890 offenbart. US-Patent Nr. 5,621,082 von Xiong et al. offenbart Nukleinsäurederivate, die die Inhibitoren von CDK6 codieren. Peptide und peptidomimetische Inhibitoren, einschließlich Substratstellenantagonisten werden in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 666 270 A2, Bandara et al., Nature Biotechnology, 15, 896–901 (1997) und Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96, 4325–4329 (1999) beschrieben. Peptidaptamere werden in Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95, 14272–14277 (1998) identifiziert. Andere kleine Moleküle sind als CDK-Inhibitoren identifiziert worden (für neue Überblicke, siehe Webster, Exp. Opin. Invest. Drugs, 7, 865–887 (1998), Stover et al., Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2, 274–285 (1999) und Rosania et al., Exp. Opin. Ther. Patents, 10, 215–230 (2000). Das Flavonflavopiridol zeigt zurückhaltende Selektivität zur Inhibierung von CDKs gegenüber anderen Kinasen, aber in hibiert CDK4, CDK2 und CDK1 äquipotent mit IC₅₀-Werten im Bereich von 0,1 bis 0,3 μM. Flavopiridol ist zur Zeit in klinischen Versuchen der Phase II als ein Onkologiechemotherapeutikum (Stadler et al., J. Clin. Oncol., 18, 371–375 (2000) und Sedlacek et al., Int. J. Oncol., 9, 1143–1168 (1996)). Analoga von Flavopiridol sind der Gegenstand von anderen Veröffentlichungen, beispielsweise US-Patent Nr. 5,733,920 von Mansuri et al. (internationale WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 97/16447) und internationalen WIPO-Veröffentlichungen WO 97/42949 und WO 98/17662. Die Ergebnisse der Inhibierung von CDKs mit Purin-basierenden Derivaten werden in Schow et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 7, 2697–2702 (1997); Grant et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 39, Abst. 1207 (1998); Legraverend et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 793–798 (1998); Legraverend et al., J. Med. Chem, 43, 1282–1292 (2000); Gray et al., Science, 281, 533–538 (1998); Chang et al., Chemistry & Biology, 6, 361–375 (1999) und den internationalen WIPO-Veröffentlichungen Nr. WO 99/02162, WO 99/43675 und WO 99/43676 beschrieben.
Außerdem offenbaren die folgenden Veröffentlichungen bestimmte Pyrimidine, die Cyclinabhängige Kinasen und Wachstumsfaktor-vermittelte Kinasen inhibieren: internationale WIPO-Veröffentlichungen Nr. WO 00/12485, WO 00/12486 und WO 98/33798; Ruetz et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 39, Abst. 3796 (1998); und Meyer et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 39, Abst. 3794 (1998). Benzolsulfonamide, die die Zellen in G1 blockieren, sind in der Entwicklung von Eisai, siehe Owa et al., J. Med. Chem., 42, 3789–3799 (1999). Ein Oxindol-CDK-Inhibitor ist in der Entwicklung von Glaxo-Wellcome, siehe Luzzio et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., Abst. 4102 (1999) und die internationale WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 99/15500. Paullone wurden gemeinsam mit NCI gefunden, Schultz et al., J. Med. Chem, 2909–2019 (1999) und Kunick et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 567–569 (2000). Indenpyrazole werden in den internationalen WIPO-Veröffentlichungen Nr. WO 99/17769 und WO 99/54308 beschrieben. Von Pyrazolo-pyridinen wird in der internationalen WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 99/30710 berichtet. Ebenso sind die Fluorenderivate bekannt, die nachstehend in den Vergleichsbeispielen 1 und 2 gezeigt werden; siehe ebenso Pan et al., Chem. & Ind., 240–241 (1969), die Vergleichsbeispiel 2(a) und andere 9-Oxofluorenoxime offenbaren:
Es besteht jedoch eine Notwendigkeit für andere Verbindungen mit kleinen Molekülen, die ohne weiteres synthetisiert werden können und wirksame Inhibitoren von einem oder mehreren CDKs oder CDK/Cyclin-Komplexen sind. Siehe Gray et al., Curr. Med. Chem., 6, 859–875 (1999) und Sielecki et al., J. Med. Chem., 43, 1–18 (2000). Da CDK4 als ein allgemeiner Aktivator der Zellteilung in den meisten Zellen dienen kann, und da Komplexe von CDK4/Cyclin D und CDK2/Cyclin E die frühe G₁-Phase des Zellzyklus regulieren, besteht eine Notwendigkeit für effektive und spezifische Inhibitoren von CDK4 und/oder CDK2 zur Behandlung von ein oder mehreren Tumortypen. Ebenso bieten die entscheidenden Rollen von Cylcin E/CDK2- und Cyclin B/CDK1-Kinasen in der G₁/S-Phase bzw. G₂/M-Übergängen zusätzliche Targets zur therapeutischen Intervention bei der Unterdrückung deregulierter Zellzyklusprogression bei Krebs.
Eine andere Proteinkinase, CHK-1, spielt eine wichtige Rolle als ein Kontrollpunkt bei der Zellzyklusprogression. Kontrollpunkte sind Kontrollsysteme, die die Zellzyklusprogression durch Beeinflussung der Bildung, Aktivierung und anschließenden Inaktivierung der Cyclin-abhängigen Kinasen koordinieren. Kontrollpunkte verhindern die Zellzyklusprogression zu ungünstigen Zeiten, halten die Stoffwechselbilanz von Zellen aufrecht, während die Zelle stillsteht, und kann in einigen Fällen Apoptose (programmierten Zelltod) auslösen, wenn die Erfordernisse für den Kontrollpunkt nicht erfüllt worden sind. Siehe beispielsweise Chen et al., Cell, 100, 681–692 (2000); O' Connor, Cancer Surveys, 29, 151–182 (1997); Nurse, Cell, 91, 865–867 (1997); Hartwell et al., Science, 266, 1821–1828 (1994) und Hartwell et al., Science, 246, 629–634 (1989).
Eine Reihe von Kontrollpunkten überwacht die Integrität des Genoms, und beim Abtasten der DNA-Schädigungen blockieren diese „DNA-Schadenskontrollpunkte" die Zellzyklusprogression in den G₁- und G₂-Phasen und langsame Progression durch die S-Phase. O'Connor, Cancer Surveys, 29, 151–182 (1997); Hartwell et al., Science, 266, 1821–1828 (1994). Diese Wirkung ermöglicht den DNA-Wiederherstellungsverfahren, ihre Aufgabe vor der Replikation des Genoms zu beenden, und die anschließende Trennung von diesem genetischen Material in neue Tochterzellen findet statt. Im wesentlichen stellt das am meisten allgemein mutierte Gen in Menschenkrebs, das p53-Tumorsuppressorgen, ein DNA-Schadenskontrollpunktprotein dar, das die Zellzyklusprogression in der G₁-Phase blockiert und/oder Apoptose (programmierten Zelltod) nach der DNA-Schädigung auslöst. Hartwell et al., Science, 266, 1821–1828 (1994). Es ist ebenso gezeigt worden, daß der p53-Tumorsuppressor die Wirkung eines DNA-Schadenskontrollpunktes in der G₂-Phase des Zellzyklus verstärkt. Siehe beispielsweise Bunz et al., Science, 28, 1497–1501 (1998); Winters et al., Oncogene, 17, 673–684 (1998); Thompson, Oncogene, 15, 3025–3035 (1997).
In Anbetracht der Hauptwesensart der p53-Tumorsuppressorleitungsbahn bei Menschenkrebs, sind therapeutische Interventionen, die die Vulnerabilität bei p53-defektem Krebs verwerten, aktiv angestrebt worden. Eine heraustretende Vulnerabilität liegt in der Operation des G₂-Kontrollpunktes in p53-defekten Krebszellen. Krebszellen sind, da es ihnen an der G₁-Kontrollpunktkontrolle fehlt, besonders vulnerabel für die Aufhebung der letzten verbleibenden Barriere, die sie vor der krebstötenden Wirkung von DNA-Schadstoffen schützen: der G₂-Kontrollpunkt. Der G₂-Kontrollpunkt wird durch ein Kontrollsystem reguliert, das aus Hefe für Menschen konserviert worden ist. Wichtig ist in dem konservierten System eine Kinase, CHK-1, welche Signale von dem DNA-Schadenssinneskomplex transduziert, um die Aktivierung der Cyclin B/Cdc2-Kinase, die den Mitoseeintritt beschleunigt, zu inhibieren. Siehe beispielsweise Peng et al., Science, 277, 1501–1505 (1997); Sanchez et al., Science, 277, 1497–1501 (1997). Es ist gezeigt worden, daß die Inaktivierung von CHK-1 sowohl den G₂-Stillstand aufhebt, der durch die DNA-Schädigung induziert wurde, welche entweder durch krebsvorbeugende Mittel oder endogene DNA-Schädigung zugefügt wurde, als auch zum bevorzugten Abtöten der resultierenden defekten Kontrollpunktzellen führt. Siehe beispielsweise Suganuma et al., Cancer Res., 59, 5887–5891 (1999); Nurse, Cell, 91, 865–867 (1997); Weinert, Science, 277, 1450–1451 (1997); Walworth et al., Nature, 363, 368–371 (1993) und Al-Khodairy et al., Molec. Biol. Cell, 5, 147–160 (1994).
Selektive Manipulation der Kontrollpunktkontrolle in Krebszellen könnte eine breite Nutzung in Krebschemotherapeutika und Radiotherapieregimen gewährleisten und kann außerdem ein allgemeines Zeichen der Menschenkrebs-„Genominstabilität" bieten, die als die selektive Grundlage für die Abtötung der Krebszellen verwertet werden soll. Eine Vielzahl von Faktoren setzen CHK-1 als ein entscheidendes Target in die DNA-Schadenskontrollpunktkontrolle ein. Die Erforschung von diesen und funktionell verwandten Kinasen, wie CDS1/CHK-2, eine Kinase, von der kürzlich entdeckt wurde, daß sie mit CHK-1 bei der Regulierung der S-Phasen-Progression kooperiert (siehe Zeng et al., Nature, 395, 507–510 (1998); Matsuoka, Sience, 282, 1893–1897 (1998); Carr, Science, 287, 1765–1766 (2000) und Hirao et al., Science, 287, 1824–1827 (2000)), könnte wertvolle neue therapeutische Objekte für die Behandlung von Krebs bereitstellen.
Tyrosinkinasen können vom Rezeptoriyp (mit extrazellulären, transmembranen und intrazellulären Domänen) oder Nicht-Rezeptortyp (der vollkommen intrazellulär ist) sein. Es wird angenommen, daß mindestens eine der Nicht-Rezeptor-Proteintyrosinkinasen, nämlich LCK, die Tansduktion in T-Zellen eines Signals aus der Interaktion eines Zelloberflächenproteins (Cd4) mit einem vernetzten Anti-Cd4-Antikörper überträgt. Eine ausführlichere Erläuterung der Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen wird in Bolen, Oncogene, 8, 2025–2031 (1993) bereitgestellt, welches hierin als Verweis aufgenommen wird.
Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Zellzykluskontrolle spielen Proteinkinasen ebenso eine entscheidende Rolle bei der Angiogenese, die der Mechanismus ist, durch den neue Kapillaren aus bestehenden Gefäßen gebildet werden. Wenn erforderlich, weist das Gefäßsystem das Potential auf, neue Kapillarnetzwerke zu erzeugen, um die genaue Funktion von Geweben und Organen aufrechtzuerhalten. Bei einem Erwachsenen ist die Angiogenese jedoch ziemlich eingeschränkt, wobei sie nur in dem Prozeß der Wundheilung und Gefäßneubildung der Gebärmutterschleimhaut während der Menstruation auftritt. Siehe Merenmies et al., Cell Growth & Differentiation, 8, 3–10 (1997). Andererseits ist die ungewollte Angiogenese ein Zeichen für mehrere Krankheiten, wie Retinopathy, Schuppenflechte, Rheumatoidarthritis, altersverbundene Makuladegeneration und Krebs (feste Tumore). Siehe Folkman, Nature Med., 1, 27–31 (1995). Proteinkinasen, von denen gezeigt worden ist, daß sie in das angiogene Verfahren involviert sind, umfassen drei Mitglieder der Wachstumfaktor-Rezeptor- Tyrosinkinase-Familie: VEGF-R2 (vaskulärer Endothelwachstumsfaktorrezeptor 2, ebenso bekannt als KDR (Kinaseinsertdomänenrezeptor) und als FLK-1; FGF-R (Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor) und TEK (ebenso bekannt als Tie-2).
VEGF-R2, das nur auf Endothelzellen exprimiert wird, bindet den wirksamen angiogenen Wachstumsfaktor VEGF und vermittelt die anschließende Signaltransduktion durch die Aktivierung seiner intrazellulären Kinaseaktivität. Daher wird es erwartet, daß die direkte Inhibierung der Kinaseaktivität von VEGF-R2 zur Verringerung der Angiogenese selbst in Gegenwart von exogenem VEGF führt (siehe Strawn et al., Cancer Research, 56, 3540–3545 (1996)), wie mit Mutanten von VEGF-R2, die die Signaltransduktion nicht vermitteln, gezeigt. Millauer et al., Cancer Research, 56, 1615–1620 (1996). Außerdem scheint VEGF-R2 keine Funktion bei einem Erwachsenen aufzuweisen, außer der Vermittelung der angiogenen Aktivität von VEGF. Deshalb wird erwartet, daß ein selektiver Inhibitor der Kinaseaktivität von VEGF-R2 wenig Toxizität zeigt.
Ebenso bindet FGF-R die angiogenen Wachstumsfaktoren aFGF und bFGF und vermittelt anschließende intrazelluläre Signaltransduktion. Kürzlich ist angedeutet worden, daß Wachstumsfaktoren, wie bFGF, eine kritische Rolle beim Auslösen von Angiogenese in festen Tumoren, die eine bestimmte Größe erreicht haben, spielen. Siehe Yoshiji et al., Cancer Research, 57, 3924–3928 (1997). Wie VEGF-R2 wird jedoch FGF-R in einer Anzahl von unterschiedlichen Zelltypen durch den Körper exprimiert und kann oder kann keine wichtige Rolle bei anderen normalen physiologischen Verfahren bei Erwachsenen spielen. Trotzdem ist berichtet worden, daß die systemische Verabreichung eines Kleinmolekül-Inhibitors der Kinaseaktivität von FGF-R die bFGF-induzierte Angiogenese bei Mäusen ohne scheinbare Toxizität blockiert. Siehe beispielsweise Mohammadi et al., EMBO Journal, 17, 5896–5904 (1998).
TEK (ebenso bekannt als Tie-2) ist eine andere Rezeptortyrosinkinase, die nur auf Endothelzellen exprimiert wird, die eine wichtige Rolle bei der Angiogenese spielt. Die Bindung des Faktors Angiopoietin-1 führt zur Autophosphorylierung der Kinasedomäne von TEK und führt zu einem Signaltransduktionsverfahren, welches scheinbar die Interaktion der Endothelzellen mit peri-Endothelträgerzellen vermittelt, wodurch die Reifung von neu gebildeten Blutgefäßen erleichtert wird. Der Faktor Angiopoietin-2 scheint andererseits der Wirkung von Angiopoietin-1 auf TEK entgegenzuwirken und unterbricht die Angiogenese. Siehe Maisonpierre et al., Science, 277, 55–60 (1997).
Als Folge der oben beschriebenen Entwicklungen ist vorgeschlagen worden, die Angiogenese durch die Verwendung von Verbindungen, die die Kinaseaktivität von VEGF-R2, FGF-R und/oder TEK inhibiert, zu behandeln. Beispielsweise offenbart die internationale WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 97/34876 bestimmte Cinnolinderivate, die Inhibitoren für VEGF-R2 sind, die zur Behandlung von Krankheitszuständen verwendet werden können, die mit abnormaler Angiogenese und/oder erhöhter Gefäßdurchlässigkeit, wie Krebs, Diabetes, Schuppenflechte, Rheumatoidarthritis, Kaposi-Sarkom, Hämangiom, akuten und chronischen Nephropathien, Atherom, Arterienrestinose, Autoimmunkrankheiten, akuten Entzündungen und Augenkrankheiten mit Netzhautgefäßproliferation verbunden sind.
Zusätzlich zu den oben identifizierten Proteinkinasen sind viele andere Proteinkinasen als therapeutische Ziele betrachtet worden, und zahlreiche Veröffentlichungen offenbaren Inhibitoren der Kinaseaktivität, wie im folgenden besprochen: McMahon et al., Oncologist, 5, 3–10 (2000); Garcia-Echeverria et al., Med. Res. Rev., 20, 28–57 (2000); Holash et al., Oncogene, 18, 5356–5362 (1999); Stover et al., Curr. Opin. Drug Disc. Dev., 2, 274–285 (1999); Toledo et al., Curr Med. Chem., 6, 775–805 (1999); Thomas et al., J. Biol. Chem., 274, 36684–36692 (1992); Cohen, Curr. Op. Chem. Biol., 10, 544–549 (1999); Adams et al., Curr. Opin. Drug Disc. Dev., 2, 96–109 (1999); McMahon et al., Curr. Opin. Drug Disc. Dev., 1, 131–146 (1998) und Strawn et al., Exp. Opin. Invest. Drugs, 7, 553–573 (1998).
Es besteht jedoch noch ein Bedarf an effektiven Inhibitoren von Proteinkinasen. Außerdem ist es, wie ein Fachmann verstehen wird, wünschenswert, daß die Kinaseinhibitoren sowohl hohe Affinität für die Zielkinase als auch hohe Selektivität gegen andere Proteinkinasen besitzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Folglich ist ein Gegenstand der Erfindung, wirksame Inhibitoren von Proteinkinasen zu entdecken. Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist, effektive Kinaseinhibitoren mit einer starken und selektiven Affinität für eine spezielle Kinase zu entdecken.
Diese und andere Gegenstände der Erfindung, die aus der folgenden Beschreibung offensichtlich werden, sind durch die Entdeckung der heterocyclischen-Hydroxyimino-Fluorenkern-Verbindungen, Solvate und pharmazeutisch akzeptablen Salze davon (diese Verbindungen, Solvate und Salze werden gemeinsam als „Mittel" bezeichnet), die nachstehend beschrieben werden, erreicht worden, welche die Aktivität von Proteinkinasen modulieren und/oder inhibieren. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Mittel enthalten, sind zur Behandlung von Krankheiten, die durch Kinaseaktivität vermittelt werden, wie Krebs, sowie anderen Krankheitszuständen, die mit ungewollter Angiogenese und/oder Zellproliferation verbunden sind, wie diabetische Retinopathie, Glaukom, Rheumatoidarthritis, Restinose und Schuppenflechte, nützlich. Außerdem weisen die Mittel vorteilhafte Eigenschaften auf, die sich auf die Modulation und/oder Inhibierung der Kinaseaktivität, die mit CDK-Komplexen, CHK-1, CDS1, LCK, VEGF-R und/oder FGF-R verbunden sind, beziehen.
In einem allgemeinen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen der Formel I:
worin
R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₁-C₈-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, Acyl, Thio(C₁-C₁₂)alkyl, Sulfonyl oder Sulfoxyl sind; und
X C-Y oder N ist, wobei Y Wasserstoff, Halogen, NH₂, NO₂ oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₂-Alkyl, C₃-C₁₂-Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, C₁-C₁₂-Alkoxy, C₂-C₁₂-Alkenyl, Aryl, Heteroaryl, Aryloxy, C₁-C₁₂-Alkylamino, Di(C₁-C₁₂)alkylamino, Thio(C₁-C₁₂)alkyl, Acyl, Sulfonyl, Sulfoxid oder Thioaryl ist.
Die Erfindung ist ebenso auf Solvate und pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindungen der Formel I gerichtet. Vorteilhafte Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I werden ebenso beschrieben.
In einer bevorzugten allgemeinen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen mit der Formel I, worin: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₈-Alkyl sind; und X C-Y oder N ist, wobei Y Wasserstoff, Halogen, NH₂, NO₂ oder ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Aryl ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen mit der Formel I, worin: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder Halogen sind; X C-Y oder N ist, wobei Y Wasserstoff, NH₂ oder NO₂ ist.
In einem anderen allgemeinen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen der Formel II:
worin:
R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₁-C₈-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, Acyl, Thioalkyl, Sulfonyl oder Sulfoxyl sind; und
W O oder S ist.
Die Erfindung ist ebenso auf pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindungen von Formel II gereichtet. Vorteilhafte Verfahren zur Herstellung der Verbindungen von Formel II werden ebenso beschrieben.
In einer bevorzugten allgemeinen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen mit der Formel II; worin: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₈-Alkyl sind; und W O oder S ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen mit der Formel II, worin: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder Halogen sind; und W O oder S ist.
Die Erfindung bezieht sich ebenso auf ein Verfahren zur Modulation und/oder Inhibierung der Kinaseaktivität eines CDK-Komplexes, VEGF-R, FGF-R, CHK-1, CDS 1 und/oder LCK, durch die Verabreichung einer Verbindung der Formel I oder II oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz von dieser Verbindung. Vorzugsweise weisen Verbindungen der vorliegenden Erfindung selektive Kinaseaktivität auf – d. h. sie besitzen signifikante Aktivität gegenüber einer speziellen Kinase, während sie wenig oder minimale Aktivität gegenüber einer anderen Kinase besitzen.
Die Erfindung bezieht sich ebenso auf pharmazeutische Zusammensetzungen, wobei jede eine effektive Menge eines Mittels, ausgewählt aus Verbindungen der Formel I und II und pharmazeutisch akzeptablen Salzen von diesen Verbindungen, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Vehikel für dieses Mittel umfaßt. Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Behandlung von Krebs sowie anderen Krankheitszuständen, die mit ungewollter Angiogenese und/oder Zellproliferation verbunden sind, bereit, umfassend das Verabreichen effektiver Mengen von einem oder mehreren dieser Mittel einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung und bevorzugten Ausführungsformen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen von Formel I und II sind zur Modulation der Aktivität von Proteinkinasen nützlich. Spezieller sind die Verbindungen als Antiangiogenesemittel und als Mittel zur Modulation und/oder Inhibierung der Aktivität von Proteinkinasen nützlich, wodurch die Behandlungen von Krebs oder anderen Krankheiten, die mit der Zellproliferation verbunden sind, die durch Proteinkinasen vermittelt werden, bereitgestellt wird.
Die Ausdrücke „umfassend" und „einschließlich" werden hierin in ihrem offenen, nichteinschränkenden Sinne verwendet.
Der Ausdruck „Alkyl", wie hierin verwendet, bezieht sich auf gerad- und verzweigtkettige Alkylgruppen mit einem bis zwölf Kohlenstoffatomen. Beispielhafte Alkylgruppen umfassen Methyl (Me), Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl (tBu), Pentyl, Isopentyl, tert-Pentyl, Hexyl, Isohexyl und dergleichen. Der Ausdruck „Niederalkyl" bedeutet ein Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen (ein C_1-8-Alkyl). Beispielhafte substituierte Alkyle umfassen Fluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, 2-Fluorethyl, 3-Fluorpropyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, 3-Hydroxypropyl und dergleichen.
Der Ausdruck „Alkenyl" bezieht sich auf gerad- und verzweigtkettige Alkenylgruppen mit zwei bis zwölf Kohlenstoffatomen. Veranschaulichende Alkenylgruppen umfassen Prop-2-enyl, But-2-enyl, But-3-enyl, 2-Methylprop-2-enyl, Hex-2-enyl und dergleichen.
Der Ausdruck „Cycloalkyl" bezieht sich auf gesättigte carbocyclische Verbindungen mit drei bis zwölf Kohlenstoffatomen, einschließlich bicyclischen und tricyclischen Cycloalkylstrukturen. Beispielhafte Cyclalkyle umfassen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl und dergleichen.
Eine „Heterocycloalkylgruppe" bezieht sich auf einen monocyclischen Rest, enthaltend Kohlenstoffatome, vorzugsweise 4 oder 5 Ringkohlenstoffatome, und mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, und ohne Ungesättigtheit.
Die Ausdrücke „Aryl" (Ar) und „Heteroaryl" beziehen sich auf monocyclische und polycyclische ungesättigte oder aromatische Ringstrukturen, wobei sich „Aryl" auf die bezieht, die carbocyclische Verbindungen sind, und sich „Heteroaryl" auf die bezieht, die heterocyclische Verbindungen sind. Beispiele von aromatischen Ringstrukturen umfassen Phenyl, Naphthyl, 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl, Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Pyridyl, Pyridinyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl, 1,2,3-Triazinyl, 1,2,4-Oxadiazolyl, 1,3,4-Oxadiazolyl, 1-H-Tetrazol-5-yl, Indolyl, Chinolinyl, Benzofuranyl, Benzothiophenyl(thianaphthenyl) und dergleichen. Solche Komponenten können gegebenenfalls durch ein oder mehrere geeignete Substituenten substituiert sein, beispielsweise einen Substituenten, ausgewählt aus Halogen (F, Cl, Br oder I); Niederalkyl; OH; NO₂; CN; CO₂H; O-Niederalkyl; Aryl; Aryl-Niederalkyl; CO₂CH₃; CONH₂; OCH₂CONH₂; NH₂; SO₂NH₂; OCHF₂; CF₃; OCF₃ und dergleichen. Solche Komponenten können ebenso gegebenenfalls durch eine kondensierte Ringstruktur oder Brücke, beispielsweise OCH₂-O, subsituiert sein.
Der Ausdruck „Alkoxy" bezieht sich auf den Rest -O-Alkyl. Veranschaulichende Beispiele umfassen Methoxy, Ethoxy, Propoxy und dergleichen.
Der Ausdruck „Aryloxy" stellt -O-Aryl dar, wobei Aryl oben definiert wird.
Der Ausdruck Halogen stellt Chlor, Fluor, Brom oder Jod dar. Der Ausdruck „Halogen" stellt Chlor, Fluor, Brom oder Jod dar.
Der Ausdruck „Alkylamino" stellt -NHR dar, wobei R eine Alkylgruppe ist, wie oben definiert.
Der Ausdruck „Dialkylamino" stellt -NHR_aR_b dar, wobei R_aR_b jeweils unabhängig eine Alkylgruppe sind, wie oben definiert.
Der Ausdruck „Thioalkyl" bezieht sich auf den Rest -SR, wobei R eine Alkylgruppe ist, wie oben definiert.
Der Ausdruck „Acyl" stellt -C(O)H, -C(O)OH, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH₂, -C(O)NHR und -C(O)NHR_aR_b dar, wobei R und R_aR_b wie oben definiert sind.
Der Ausdruck „Thioaryl" bezieht sich auf den Rest -SAr, wobei Ar eine Arylgruppe ist, wie oben definiert.
Der Ausdruck „Sulfonyl" stellt den Rest -SO₂R oder -SO₂Ar dar, wobei R eine Alkylgruppe ist und Ar eine Arylgruppe ist, wie oben definiert.
Der Ausdruck „Sulfoxy" stellt den Rest -SOR oder -SOAr dar, wobei R eine Alkylgruppe ist und Ar eine Arylgruppe ist, wie oben definiert.
Wie angegeben, können die verschiedenen Komponenten oder funktionellen Gruppen für die Variablen in den Formeln gegebenenfalls durch ein oder mehrere geeignete Substituenten substituiert sein. Beispielhafte Substituenten umfassen ein Halogen (F, Cl, Br oder I), Niederalkyl, -OH, -NO₂, -CN, -CO₂H, -O-Niederalkyl, -Aryl, -Aryl-Niederalkyl, -CO₂CH₃, -CONH₂, -OCH₂CONH₂, -NH₂, -SO₂NH₂, Halogenalkyl (beispielsweise -CF₃, -CH₂CF₃), -O-Halogenalkyl (beispielsweise -OCF₃, -OCHF₂) und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können das Phänomen des Tautomerismus zeigen. Während die Formeln I und II nicht ausdrücklich alle tautomeren Formen darstellen können, ist es selbstverständlich, daß Formel I und II jede tautomere Form der gezeigten Verbindung darstellen sollen, und nicht nur auf eine spezielle Verbindungsform, die durch die Formelzeichnungen gezeigt wird, beschränkt sein sollen. Beispielsweise kann Formel I die folgende Struktur tautomerisieren:
Es ist ebenso verständlich, daß eine Verbindung von Formel I oder II als ein „E" oder „Z" Konfigurationsisomer oder ein Gemisch aus E- und Z-Isomeren bestehen kann. Beispielsweise existiert ein E-Isomer, wenn der Hydroxysubstituent (-OH) des Oxims an der entgegengesetzten Seite des heterocyclischen Teils einer Verbindung, die in Formel I dargestellt wird, liegt, wobei ein Z-Isomer existiert, wenn der Hydroxysubstituent (-OH) an derselben Seite wie der heterocyclische Teil einer Verbindung liegt, wie ausdrücklich in Formel I dargestellt. Ein Gemisch aus E- und Z-Isomeren wird durch eine wellige Bindung zwischen dem Stickstoffatom und dem Hydroxysubstituenten angegeben, wie ausdrücklich in den Beispielen A bis F dargestellt. Es ist daher zu verstehen, daß Formel I und II irgendeine Konfigurationsform der dargestellten Verbindung darstellen sollen, und nicht nur auf eine spezielle Verbindungsform, die durch die Formelzeichnungen dargestellt wird, beschränkt sind.
Einige der erfindungsgemäßen Verbindungen können als einzelne Stereoisomere (d. h. im wesentlichen frei von anderen Stereoisomeren), Racemate und/oder Gemische aus Enantiomeren und/oder Diastereomeren bestehen. All diese einzelnen Stereoisomere, Racematen und Gemische davon sollen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Verbindungen, die optisch aktiv sind, in optisch reiner Form verwendet.
Wie einem Fachmann allgemein verständlich, ist eine optisch reine Verbindung mit einem Chiralitätszentrum (d. h. einem asymmetrischen Kohlenstoffatom) eine, die im wesentlichen aus einem der zwei möglichen Enantiomeren (d. h. ist enantiomerenrein) besteht, und eine optisch reine Verbindung mit mehr als einem Chiralitätszentrum ist eine, die sowohl diastereomerenrein als auch enantiomerenrein ist. Vorzugsweise werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer Form verwendet, die mindestens zu 90% optisch rein ist, das heißt, eine Form, die mindestens 90% eines einzelnen Isomers (80% Enantiomerenüberschuß („e. e.") oder Diastereomerenüberschuß („d. e.")), stärker bevorzugt mindestens 95% (90% e. e. oder d. e.), noch stärker bevorzugt mindestens 97,5% (95% e. e. oder d. e.) und am stärksten bevorzugt mindestens 99% (98% e. e. oder d. e.) enthält.
Außerdem sollen die Formeln solvatisierte sowie nicht solvatisierte Formen der identifizierten Strukturen abdecken. Beispielsweise umfaßt Formel I Verbindungen der angegebenen Struktur in sowohl hydratisierten als auch nicht-hydratisierten Formen. Andere Beispiele von Solvaten umfassen die Strukturen in Kombination mit Isopropanol, Ethanol, Methanol, DMSO, Ethylacetat, Essigsäure oder Ethanolamin.
Zusätzlich zu den Verbindungen der Formel I und II umfaßt die Erfindung Solvate und pharmazeutisch akzeptable Salze solcher Verbindungen.
Unter „einem pharmazeutisch akzeptablen Salz" ist ein Salz zu verstehen, das die biologische Wirksamkeit der freien Säuren und Basen der spezifizierten Verbindungen erhält, und das nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht ist. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann eine ausreichend saure, eine ausreichend basische funktionelle Gruppe oder beides besitzen, und reagiert folglich mit irgendeiner Anzahl von anorganischen oder organischen Basen und anorganischen und organischen Säuren unter Bildung eines pharmazeutisch akzeptables Salzes. Beispielhafte pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen die Salze, die durch die Umsetzung der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer Mineral- oder organischen Säure oder einer anorganischen Base hergestellt werden, wie Salze, einschließlich Sulfate, Pyrosulfate, Bisulfate, Sulfate, Bisulfite, Phosphate, Monohydrogenphosphate, Dihydrogenphosphate, Metaphosphate, Pyrophosphate, Chloride, Bromide, Iodide, Acetate, Propionate, Decanoate, Caprylate, Acrylate, Formiate, Isobutyrate, Caproate, Heptanoate, Propiolate, Oxalate, Malonate, Succinate, Suberate, Sebacate, Fumarate, Maleate, Butin-1,4-dioate, Hexin-1,6-dioate, Benzoate, Chlorbenzoate, Methylbenzoate, Dinitrobenzoate, Hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, Phthalate, Sulfonate, Xylolsulfonate, Phenylacetate, Phenylpropionate, Phenylbutyrate, Zitrate, Lactate, γ-Hydroxyburyrate, Glykolate, Tartrate, Methansulfonate, Propansulfonate, Naphthalin-1-sulfonate, Naphthalin-2-sulfonate und Mandelate.
Wenn die erfindungsgemäße Verbindung eine Base ist, kann das gewünschte pharmazeutisch akzeptable Salz durch irgendein in der Technik verfügbares bekanntes Verfahren hergestellt werden, beispielsweise Behandlung der freien Base mit einer anorganischen Säure, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dergleichen, oder mit einer organischen Säure, wie Essigsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Mandelsäure, Fumarsäure, Malonsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Glykolsäure, Salicylsäure, eine Pyranosidylsäure, wie Glucuronsäure oder Galacturonsäure, eine alpha-Hydroxysäure, wie Zitronensäure oder Weinsäure, eine Aminosäure, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure, eine aromatische Säure, wie Benzoesäure oder Zimtsäure, eine Sulfonsäure, wie p-Toluolsulfonsäure oder Ethansulfonsäure, oder dergleichen.
Wenn die erfindungsgemäße Verbindung eine Säure ist, kann das gewünschte pharmazeutisch akzeptable Salz durch irgendein geeignetes Verfahren hergestellt werden, beispielsweise Behandlung der freien Säure mit einer anorganischen oder organischen Base, wie einem Amin (primär, sekundär oder tertiär), einem Alkalimetallhydroxid oder Erdalkalimetallhydroxid oder dergleichen. Veranschaulichende Beispiele von geeigneten Salzen umfassen organische Salze, abgeleitet von Aminosäuren, wie Glycin und Arginin, Ammoniak, primäre, sekundäre und tertiäre Amine und cyclische Amine, wie Piperidin, Morpholin und Piperazin, und anorganische Salze, abgeleitet von Natrium, Calcium, Kalium, Magnesium, Mangan, Eisen, Kupfer, Zink, Aluminium und Lithium.
Bei Mitteln, die Feststoffe sind, ist einem Fachmann verständlich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen und Salze in unterschiedlichen Kristall- und polymorphen Formen existieren können, wobei alle innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung und den spezifizierten Formeln liegen sollen.
Therapeutisch wirksame Mengen von Mitteln der Erfindung können verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die durch die Modulation oder Regulation von Proteinkinasen vermittelt wurden. Unter einer „wirksamen Menge" ist zu verstehen, daß die Menge eines Mittels, wenn es einem Säuger, der einer solchen Behandlung bedarf, verabreicht werden soll, ausreichend ist, die Behandlung für eine Krankheit, die durch die Aktivität von einer oder mehreren Proteinkinasen, wie Tryosinkinasen, vermittelt wurde, zu bewirken. Daher ist beispielsweise eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder eines Salzes davon eine Menge, die ausreicht, um die Aktivität von einer oder mehreren Proteinkinasen zu modulieren, zu regulieren oder zu inhibieren, so daß ein Krankheitszustand, der durch diese Aktivität vermittelt wird, verringert oder abgeschwächt wird.
Die Menge eines gegebenen Mittels, die einer derartigen Menge entsprechen wird, wird in Abhängigkeit von Faktoren, wie der speziellen Verbindung, dem Krankheitszustand und seine Schwere, der Identität (beispielsweise dem Gewicht) des Säugers, der einer solchen Behandlung bedarf, variieren, kann aber trotzdem durch einen Fachmann routinemäßig bestimmt werden. Unter „Behandeln" ist mindestens die Milderung eines Krankheitszustandes bei einem Säuger, wie einem Menschen, zu verstehen, der mindestens teilweise von der Aktivität von einer oder mehreren Proteinkinasen, wie Tyrosinkinasen, betroffen ist, und umfaßt: Verhindern des Auftretens des Krankheitszustandes bei einem Säuger, speziell wenn festgestellt wird, daß der Säuger für den Krankheitszustand empfänglich ist, aber es bis jetzt noch nicht diagnostiziert worden ist; Modulation und/oder Inhibierung des Krankheitszustandes; und/oder Abschwächen des Krankheitszustandes.
Die Affinität der erfindungsgemäßen Verbindungen für einen Rezeptor kann durch Bereitstellen mehrerer Kopien des Liganden in nächster Nähe vorzugsweise unter Verwendung eines Gerüsts, bereitgestellt durch eine Trägerkomponente, verbessert werden. Es ist gezeigt worden, daß die Bereitstellung von solchen mehrwertigen Verbindungen mit optimalem Zwischenraum zwischen den Komponenten die Bindung an einen Rezeptor dramatisch verbessert. Siehe beispielsweise Lee et al., Biochemistry, 23, 4255 (1984). Die Mehrwertigkeit und der Zwischenraum können durch die Auswahl einer geeigneten Trägerkomponente oder Linkereinheiten kontrolliert werden. Derartige Komponenten umfassen molekulare Träger, die eine Vielzahl an funktionellen Gruppen enthalten, die mit den funktionellen Gruppen, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen verbunden sind, umgesetzt werden können. Natürlich kann eine Vielzahl von Trägern verwendet werden, einschließlich Proteine, wie BSA (Rinderserumalbumin) oder HSA (Menschenserumalbumin), verschiedene Peptide, einschließlich beispielsweise Pentapeptide, Decapeptide und Pentadecapeptide, und dergleichen. Die Peptide oder Proteine können die gewünschte Anzahl an Aminosäureresten mit der freien Amino gruppe in ihren Seitenketten enthalten; jedoch können andere funktionelle Gruppen, wie Sulfhydrylgruppen oder Hydroxylgruppen, ebenso verwendet werden, um stabile Verknüpfungen zu erhalten.
Mittel, die die Proteinkinaseaktivität, die unter anderem mit Rezeptor-CDK-Komplexen, VEGF, FGF, CHK-1, CDS1 und LCK verbunden sind, wirksam regulieren, modulieren oder inhibieren, und die die Angiogenese und/oder Zellproliferation inhibieren, sind bevorzugt. Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf Verfahren zur Modulation oder Inhibierung der Proteinkinaseaktivität beispielsweise in Säugergewebe durch Verabreichen eines erfinderischen Mittels gerichtet. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Mittel als Modulatoren der Proteinkinaseaktivität, wie der Aktivität von Kinasen, kann durch irgendeines der dem Fachmann verfügbaren Verfahren, einschließlich in vivo- und/oder in vitro-Assays, gemessen werden. Beispiele von geeigneten Assays für Aktivitätsmessungen umfassen die, die in der internationalen WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 99/21845; Parast et al., Biochemistry, 37, 16788–16801 (1998); Jeffrey et al., Nature, 376, 313–320 (1995); der internationalen WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 97/34876 und der internationalen WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 96/14843 beschrieben werden. Diese Eigenschaften können beispielsweise unter Verwendung von einem oder mehreren biologischen Testverfahren, die in den Beispielen nachstehend dargestellt werden, bewertet werden.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, wie nachstehend beschrieben. Pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Erfindung umfassen eine wirksame modulierende, regulierende oder inhibierende Menge einer Verbindung der Formel I oder Formel II und einen inerten, pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel. In einer Ausführungsform der pharmazeutischen Zusammensetzungen werden wirksame Niveaus der erfindungsgemäßen Mittel bereitgestellt, um so therapeutische Vorteile, einschließlich Modulation von Proteinkinasen, bereitzustellen. Unter „wirksamen Niveaus" sind Niveaus zu verstehen, bei denen die Wirkungen von Proteinkinasen auf ein Minimum reguliert werden. Diese Zusammensetzungen werden in Einheitsdosierform hergestellt, die für die Verabreichungsweise, beispielsweise parenterale oder orale Verabreichung, geeignet ist.
Ein erfindungsgemäßes Mittel kann in konventioneller Arzneiform, die durch Kombinieren einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels (beispielsweise einer Verbindung der Formel I) als ein Wirkstoff mit geeigneten pharmazeutischen Trägern oder Verdünnungsmitteln gemäß der konventionellen Verfahren hergestellt wird, verabreicht werden. Diese Verfahren können das Mischen, Granulieren und Komprimieren oder Lösen der Bestandteile, wenn geeignet zu dem gewünschten Präparat, umfassen.
Der eingesetzte pharmazeutische Träger kann entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Beispiele von festen Trägern sind Laktose, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Akazie, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Beispiele von flüssigen Trägern sind Sirup, Erdnußöl, Olivenöl, Wasser und dergleichen. Ebenso kann der Träger oder das Verdünnungsmittel Zeitverzögerungs- oder Zeitauslösungsmaterial, das in der Technik bekannt ist, umfassen, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat allein oder mit Wachs, Ethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylmethacrylat und dergleichen.
Eine Vielzahl von pharmazeutischen Formen kann eingesetzt werden. Daher kann, wenn ein fester Träger verwendet wird, das Präparat tablettiert, in eine harte Gelatinekapsel in Pulver- oder Pelletform oder in Form einer Pastille oder Tablette gegeben werden. Die Menge an festem Träger kann variieren, aber wird im allgemeinen etwa 25 mg bis etwa 1 g betragen. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, wird das Präparat in Form von Sirup, Emulsion, weicher Gelatinekapsel, steriler Injektionslösung oder Suspension in einer Ampulle oder Phiole oder nicht-wässerigen flüssigen Suspension vorliegen.
Um eine stabile, wasserlösliche Dosierungsform zu erhalten, wird ein pharmazeutisch akzeptables Salz eines erfindungsgemäßen Mittels in einer wässerigen Lösung aus einer organischen oder anorganischen Säure, wie einer 0,3 M Lösung aus Bernsteinsäure oder Zitronensäure, gelöst. Wenn eine lösliche Salzform nicht verfügbar ist, kann das Mittel in einem geeigneten Co-Lösungsmittel oder in Kombinationen von Co-Lösungsmitteln gelöst werden. Beispiele von geeigneten Co-Lösungsmitteln umfassen Alkohol, Propylenglykol, Polyethylenglykol 300, Polysorbat 80, Glycerin und dergleichen in Konzentrationen zwischen 0 und 60% des Gesamtvolumens, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer beispielhaften Ausführungsform wird eine Verbindung von Formel I in DMSO gelöst und mit Wasser verdünnt.
Die Zusammensetzung kann ebenso in Form einer Lösung aus einer Salzform des Wirkstoffes in einem geeigneten wässerigen Vehikel, wie Wasser oder isotonische Salzlösung oder Dextroselösung, vorliegen.
Es wird eingeschätzt, daß die tatsächlichen Dosierungen der Mittel, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden, gemäß dem speziellen Komplex, der verwendet wird, der speziellen formulierten Zusammensetzung, der Verabreichungsweise und der speziellen Stelle, dem Wirt und der Krankheit, die behandelt wird, variieren werden. Optimale Dosierungen für eine Gruppe von Zuständen kann durch den Fachmann unter Verwendung konventioneller Dosierungsbestimmungstests im Hinblick auf die experimentellen Daten für ein Mittel ermittelt werden. Zur oralen Verabreichung beträgt eine beispielhafte tägliche Dosis, die im allgemeinen eingesetzt wird, etwa 0,001 bis etwa 1000 mg/kg Körpergewicht, wobei die Verläufe der Behandlung bei entsprechenden Intervallen wiederholt werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in allgemein bekannten Weisen zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung konventioneller Techniken, wie Mischen, Lösen, Granulieren, Drageeherstellung, Zerreiben, Emulgieren, Einkapseln, Einschließen oder Lyophilisieren. Pharmazeutische Zusammensetzungen können in einer konventionellen Weise unter Verwendung von ein oder mehreren physiologisch akzeptablen Trägern formuliert werden, die aus Trägerstoffen und Hilfsmitteln, welche das Verarbeiten der aktiven Verbindungen zu Präparaten, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern, ausgewählt werden können.
Die richtige Formulierung hängt von der ausgewählten Verabreichungsweise ab. Für die Injektion können die erfindungsgemäßen Mittel zu wässerigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch verträgliche Puffer, wie Hank-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologische Kochsalzlösungspuffer, formuliert werden. Zur transmukosalen Verabreichung werden Eindringmedien, die geeignet sind, die Barriere zu durchdringen, in der Formulierung verwendet. Derartige Eindringmedien sind im allgemeinen in der Technik bekannt.
Zur oralen Verabreichung können Verbindungen ohne weiteres durch Vereinigen der aktiven Verbindungen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, die in der Technik bekannt sind, formuliert werden. Derartige Träger ermöglichen es, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, halbflüssige Suspen sionen, Suspensionen und dergleichen zur oralen Nahrungsaufnahme durch einen Patienten, der behandelt werden soll, formuliert werden können. Pharmazeutische Präparate zur oralen Verwendung können unter Verwendung eines festen Trägerstoffes in Beimischung mit dem Wirkstoff (Mittel), gegebenenfalls Zermahlen des resultierenden Gemisches und Verarbeiten des Gemisches aus Körnchen nach der Zugabe von geeigneten Hilfsmitteln, wenn gewünscht, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten, erhalten werden. Geeignete Trägerstoffe umfassen: Füllstoffe, wie Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol; und Cellulosepräparate, beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Gummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose oder Polyvinylpynolidon (PVP). Wenn gewünscht, können Lösungsvermittler zugegeben werden, wie vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen bereitgestellt. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Polyvinylpynolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageeüberzügen zur Identifizierung oder zur Charakterisierung unterschiedlicher Kombinationen von Wirkstoffen zugegeben werden.
Pharmazeutische Präparate, die oral verwendet werden können, umfassen Eindrückkapseln aus Gelatine sowie weiche, verschlossene Kapseln aus Gelatine und einen Weichmacher, wie Glycerol oder Sorbitol. Die Eindrückkapseln können die Wirkstoffe in Beimischung mit Füllstoffen, wie Laktose, Bindemitteln, wie Stärken, und/oder Schmiermitteln, wie Talk oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die Wirkstoffe in geeigneten Flüssigkeiten, wie Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglykolen, gelöst oder suspendiert werden. Außerdem können Stabilisatoren zugegeben werden. Alle Formulierungen zur oralen Verabreichung sollten in Dosierungen vorliegen, die für diese Verabreichung geeignet sind. Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen, die in konventioneller Weise formuliert wurden, annehmen.
Zur Verabreichung intranasal oder durch Inhalation werden die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung günstigerweise in Form eines Aerosolspraypräparats aus Druckbehältern oder einem Vernebler unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, beispielsweise Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder eines anderen geeigneten Gases, zugeführt werden. Bei einem Druckaerosol kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils bestimmt werden, um eine abgemessene Menge zuzuführen. Kapseln und Patronen aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator und dergleichen können formuliert werden, enthaltend eine Pulvermischung der Verbindung und eine geeignete Pulvergrundlage, wie Laktose oder Stärke.
Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung durch Injektion, beispielsweise Bolusinjektion oder Dauerinfusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Einheitsdosierform, beispielsweise in Ampullen, oder in Behältern mit mehreren Dosierungen, mit einem zugegebenen Konservierungsmittel dargestellt werden. Die Zusammensetzungen können derartige Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässerigen Vehikeln annehmen und können Formulierungsmittel, wie Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel, enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässerige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Außerdem können Suspensionen der Wirkstoffe als entsprechende ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Fettöle, wie Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposome. Wässerige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension ebenso geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von hoch konzentrierten Lösungen zu ermöglichen.
Zur Verabreichung in das Auge wird eine Verbindung von Formel I oder Formel II in einem pharmazeutisch akzeptablen ophthalmischen Vehikel zugeführt, so daß die Verbindung mit der Augenoberfläche für einen ausreichenden Zeitraum in Kontakt gehalten wird, wodurch die Verbindung die Hornhaut und die inneren Bereiche des Auges durchdringen kann, einschließlich beispielsweise die vordere Augenkammer, hintere Augenkammer, den Glaskörper, das Augenkammerwasser, die Glaskörperflüssigkeit, die Augenhornhaut, Iris/Wimpern, Augenlinsen, Aderhaut/Augennetzhaut und Scelera. Das pharmazeutisch akzeptable ophthalmische Vehikel kann eine Salbe, Pflanzenöl oder ein eingekapseltes Material sein. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann ebenso direkt in die Glaskörperflüssigkeit und das Augenkammerwasser injiziert werden.
Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, beispielsweise sterilem Pyrogen-freiem Wasser, vor der Verwendung vorliegen. Die Verbindungen können ebenso zu rektalen Zusammensetzungen, wie Zäpfchen oder Retentionseinläufen, beispielsweise enthaltend konventionelle Zäpfchengrundlagen, wie Kakaobutter oder andere Glyderide, formuliert werden.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen ebenso als ein Depotpräparat formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Daher können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (beispielsweise als eine Emulsion in einem akzeptablen Öl) oder Ionenaustauschharze oder als schwerlösliche Derivate, beispielsweise als schwerlösliches Salz, formuliert werden.
Ein beispielhafter pharmazeutischer Träger für hydrophobe Verbindungen ist ein Co-Lösungsmittelsystem, das Benzylalkohol, ein nicht-polares oberflächenaktives Mittel, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wässerige Phase umfaßt. Das Co-Lösungsmittelsystem kann ein VPD-Co-Lösungsmittelsystem sein. VPD ist eine Lösung aus 3% Gewicht/Volumen Benzylalkohol, 8% Gewicht/Volumen des nicht-polaren oberflächenaktiven Mittels Polysorbat 80 und 65% Gewicht/Volumen Polyethylenglykol 300, welche das Volumen in absolutem Ethanol ausmachen. Das VPD-Co-Lösungsmittelsystem (VPD : 5W) enthält VPD, verdünnt 1 : 1 mit einer 5% Dextrose-in-Wasser-Lösung. Dieses Co-Lösungsmittelsystem löst die hydrophoben Verbindungen gut, und produziert selbst wenig Toxizität bei der systemischen Verabreichung. Natürlich können die Anteile eines Co-Lösungsmittelsystems beträchtlich variiert werden, ohne ihrer Löslichkeits- und Toxizitätsmerkmale zu zerstören. Außerdem kann die Identität der Co-Lösungsmittelkompenten variiert werden: beispielsweise andere nicht-polare oberflächenaktive Mittel mit geringer Toxizität können anstelle von Polysorbat 80 verwendet werden; die Fraktionsgröße von Polyethylenglykol kann verändert werden; andere bioverträgliche Polymere können Polyethylenglykol ersetzen, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon; und Dextrose kann durch andere Zucker oder Polysaccharide ersetzt werden.
Alternativ können andere Zufuhrsysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen eingesetzt werden. Liposome und Emulsionen sind bekannte Beispiele für Abgabevehikel oder -träger für hydrophobe Arzneimittel. Bestimmte organische Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, können ebenso eingesetzt werden, obwohl es normalerweise auf Kosten höherer Toxizität geht. Außerdem können die Verbindungen unter Verwendung eines Depotfreisetzungssystems, wie semipermeablen Matrizes von festen hydrophoben Polymeren, enthaltend das Therapeutikum, zugeführt werden. Verschiedene Depotfreisetzungsmaterialien sind hergestellt worden und sind dem Fachmann bekannt. Depotfreisetzungskapseln können in Abhängigkeit ihrer chemischen Beschaffenheit die Verbindungen für wenige Wochen bis zu 100 Tagen freisetzen. In Abhängigkeit der chemischen Beschaffenheit und der biologischen Stabilität des Therapeutikums können zusätzlich Strategien zur Proteinstabilisierung eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenso geeignete Fest- oder Gelphasen-Träger oder -trägerstoffe umfassen. Beispiele von derartigen Trägern oder Trägerstoffen umfassen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie Polyethylenglykole.
Einige der erfindungsgemäßen Verbindungen können als Salze mit pharmazeutisch verträglichen Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze können mit vielen Säuren, einschließlich Salz-, Schwefel-, Essig-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Bernsteinsäure usw., gebildet werden. Salze sind in wässerigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln gewöhnlich löslicher als es die entsprechenden Formen der freien Basen sind.
Die erfindungsgemäßen Mittel können unter Verwendung der Reaktionswege und Syntheseschemen, wie nachstehend beschrieben, unter Einsatz der allgemein bekannten Techniken unter Verwendung von Ausgangsmaterialien, die ohne weiteres erhältlich sind, hergestellt werden. Die Herstellung von bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird in den folgenden Beispielen ausführlich beschrieben, aber der Fachmann wird erkennen, daß die beschriebenen chemischen Reaktionen ohne weiteres angepaßt werden können, um eine Vielzahl von anderen Proteinkinaseinhibitoren der Erfindung herzustellen. Beispielsweise kann die Synthese von nicht veranschaulichten Verbindungen gemäß der Erfindung erfolgreich durch Modifikationen, die dem Fachmann offensichtlich sind, durchgeführt werden, beispielsweise durch entsprechendes Schützen von störenden Gruppen, durch Wechseln zu anderen geeigneten Reagenzien, die in der Technik bekannt sind, oder mittels Durchführung von Routinemodifikationen von Reaktionsbedingungen. Alternativ ist erkannt worden, daß andere Reaktionen, die hierin offenbart werden oder in der Technik allgemein bekannt sind, Anwendbarkeit zur Herstellung anderer Verbindungen der Erfindung aufweisen.
Beispiele
In den nachstehend beschriebenen Beispielen werden, wenn nicht anders angegeben, alle Temperaturangaben in Grad Celsius dargestellt, und alle Teile und Prozente beziehen sich auf das Gewicht. Die Reagenzien wurden von kommerziellen Lieferanten, wie Aldrich Chemical Company oder Lancaster Synthesist Ltd. gekauft, und wurden ohne weitere Reinigung verwendet, wenn nicht anders angegeben. Tetrahydrofuran (THF) und N,N-Dimethylformamid (DMF) wurden von Aldrich in sicher verschlossenen Flaschen gekauft und wie erhalten verwendet. Alle Lösungsmittel wurden unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt, wenn nicht anders angegeben.
Die nachstehend dargestellten Reaktionen wurden im allgemeinen unter einem positiven Druck von Argon bei Umgebungstemperatur (wenn nicht anders angegeben) in wasserfreiem Lösungsmitteln durchgeführt, und die Reaktionskolben wurden mit Kautschuksepta zur Einführung von Substraten und Reagenzien mittels einer Spritze ausgestattet. Glasware wurde ofengetrocknet und/oder wärmegetrocknet. Analytische Dünnschichtchromatographie (DC) wurde auf Glasrücken-Silicagel 60 F 254-Platten von Analtech (0,25 mm) durchgeführt, mit den entsprechenden Lösungsmittelverhältnissen (Volumen/Volumen) eluiert und gekennzeichnet, wo geeignet. Die Reaktionen wurden durch DC analysiert und mittels Einschätzung des Verbrauchs von Ausgangsmaterial beendet.
Die Sichtbarmachung der DC-Platten wurde mit Ioddampf, UV-Illumination, 2% Ce(NH₄)₄(SO₄)₄ in 20%iger wässeriger Schwefelsäure, oder p-Anisaldehydsprühreagens durchgeführt und mit Wärme aktiviert, wo geeignet. Aufarbeitungen wurden typischerweise durch Verdoppeln des Reaktionsvolumens mit dem Reaktionslösungsmittel oder Extraktionslösungsmittel und dann Waschen mit den angegebenen wässerigen Lösungen unter Verwendung von 25 Vol.-% des Extraktionsvolumens durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. Die Produktlösungen wurden über wasserfreiem Na₂SO₄ und/oder MgSO₄ getrocknet, bevor die Lösungsmittel unter vermindertem Druck auf einem Rotationsverdampfer filtriert und verdampft und als Lösungsmittel, die im Vakuum entfernt wurden, vermerkt wurden. Flashsäulenchromatographie (Still et al., J. Org. Chem., 43, 2923 (1978)) wurde unter Verwendung von Merck-Silicagel (47–61 μm) mit einem Silicagel-Rohmaterialverhältnis von etwa 20 : 1 bis 50 : 1, wenn nicht anders angegeben, durchgeführt. Die Hydrogenolyse wurde bei dem Druck, der in den Beispielen angegeben wird, oder bei Umgebungsdruck durchgeführt.
¹H-NMR-Spektren wurden auf einer Bruker- oder Varian-Vorrichtung, die bei 300 MHz betrieben wird, aufgezeichnet und die ¹³C-NMR-Spektren wurden, betrieben bei 75 MHz, aufgezeichnet. NMR-Spektren wurden als CDCl₃-Lösungen (angegeben in ppm) unter Verwendung von Chloroform als Referenzstandard (7,27 ppm und 77,00 ppm) oder CD₃OD (3,4 und 4,8 ppm und 49,3 ppm) oder internem Tetramethylsilan (0,00 ppm), wenn geeignet, erhalten. Andere NMR-Lösungsmittel wurden, wenn notwendig, verwendet. Wenn Peakmultiplizitäten angegeben werden, werden die folgenden Abkürzungen verwendet: s (Singulett), d (Duplett), t (Triplett), q (Quartett), m (Multiplett), br (verbreitert), dd (Duplett von Dupletts), dt (Duplett von Tripletts). Kopplungskonstanten, wenn angegeben, werden in Hertz (Hz) angegeben.
Infrarotspektren (IR) wurden auf einem Perkin-Elmer FT-IR-Spektrometer als Klauenöle, als KBr-Pellets oder als CDCl₃-Lösungen aufgezeichnet und werden, wenn angegeben, in Wellenzahlen (cm^–1) angegeben. Die Massenspektren wurden unter Verwendung von LSIMS, FAB oder Elektrospray erhalten. Alle Schmelzpunkte (mp) sind unkorrigiert.
Beispiel A: 9(E/Z)-Hydroxyimino-3H-fluoreno[2,3-d]imidazol

(1) 2,3-Diamino-fluoren-9-on das die Strukturformel
aufwies, wurde zunächst wie folgt hergestellt. Zu einer Lösung aus SnCl₂·2H₂O (749 mg, 3,32 mmol) in einem Gemisch aus konzentrierter HCl (1,2 ml) und Eisessig (2 ml) wurde 2-Amino-3-nitro-fluoren-9-on (200 mg, 0,83 mmol, erhalten von Aldrich) zugegeben. Die resultierende Suspension wurde unter Rückfluß 3 h erhitzt und konnte sich auf Umgebungstemperatur abkühlen. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit konzentrierter HCl und H₂O abgespült, bis das Filtrat violett war. Das Filtrat wurde auf einen pH von 9 mit 1 N NaOH basisch gemacht. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit H₂O gespült und unter Vakuum getrocknet, wodurch ein braunes Pulver erhalten wurde, 140 mg (80% Ausbeute), das mit dem vorherigen übereinstimmt, das von Eckert et al., Journal für Praktische Chemie, 118, 263–281 (1928) beschrieben wurde, und wurde ohne weitere Reinigung verwendet. FTIR (KBr) 3419, 3331, 1735, 1672, 1619, 1584, 1448, 1390 cm^–1; ¹H-NMR (CD₃OD) δ 7,26–7,39 (m, 4H), 7,12 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 6,92 (d, 2H), 6,79 (s, 2H).
(2) Um 2,3-Diamino-9(E/Z)-hydroxyimino-fluoren, das die Strukturformel
aufweist, herzustellen, folgte man einer Verfahrensweise von Pan et al., Chem & Ind., 240–241 (1969). Zu einer Lösung aus 2,3-Diamino-fluoren-9-on (von A(1); 200 mg, 0,95 mmol) in DMSO (1,5 ml) wurde eine Lösung aus Hydroxylaminhydrochlorid (72 mg, 1,0 mmol) in H₂O (250 μl) zugegeben. Die resultierende Lösung wurde bei 70°C für eine halbe Stunde erwärmt, konnte sich auf Umgebungstemperatur abkühlen und wurde mit H₂O (5 ml) verdünnt. Der resultierende Feststoff wurde abfiltriert, mit H₂O und Benzol gespült und unter Vakuum getrocknet, wodurch ein braunes Pulver erhalten wurde, 190 mg (89% Ausbeute), Smp. 145–47°C. FTIR (KBr) 3201, 3036, 2848, 1619, 1596, 1449, 1372, 1313 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,24 (d, 1 H, J = 7,5 Hz), 7,82 (d, 1H, J = 3,1 Hz), 7,45 (d, 1H, J = 6,9 Hz), 6,94–7,44 (m, 8H); MS (FAB) [M + Na⁺]: 248; HRMS (FAB) [MH⁺] Ber. 226,0980, Gefunden, 226,0987; Anal. ber. für C₁₃H₁₁N₃O·0,63 DMSO; C, 62,40; H, 5,43; N, 15,31. Gefunden; C, 62,15; H, 5,04; N, 15,52.
(3) Um die Titelverbindung herzustellen, wurde eine Suspension aus 2,3-Diamino-9(E/Z)-hydroxyimino-fluoren (von A(2); 100 mg, 0,44 mmol) in einem Gemisch aus Triethylorthoformiat (0,5 ml) und Eisessig (0,5 ml) unter Rückfluß 3 h erhitzt, auf Umgebungstemperatur abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde auf einen pH von 8 mit 1 N NaOH basisch gemacht, und der resultierende Feststoff wurde abfiltriert, mit H₂O gespült, unter Vakuum getrocknet und aus EtOH/CHCl₃ umkristallisiert, wodurch ein braunes Pulver erhalten wurde, 85 mg (82% Ausbeute), Smp. 262°C. FTIR (KBr) 3375, 3065, 2974, 2256, 1694, 1595, 1450, 1225 cm^–1; ¹H NMR (CD₃OD) δ 8,18 (d, 1H, J = 13,1 Hz), 7,94 (s, 1H), 7,88 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,65–7,81 (m, 2H), 7,20–7,48 (m, 3H); HRMS (FAB) Ber. für C₁₄H₁₀N₃O (MH⁺): 236,0824. Gefunden: 236,0834; Anal. ber. für C₁₄H₉N₃O·0,3 CHCl₃·0,5 EtOH; C, 62,49; H, 4,22; N, 14,29. Gefunden: C, 62,26; H, 4,17; N, 14,21.

Beispiel B: 2-Amino-9(E/Z)-hydroxyimino-3H-fluoreno[2,3-d]imidazol
Zu einer Suspension aus 2,3-Diamino-9(E/Z)-hydroxyimino-fluoren (aus Beispiel A(2); 100 mg, 0,44 mmol) in H₂O (1,5 ml) wurde BrCN (47 mg, 0,44 mmol) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur 24 h gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde auf einen pH von 8 mit 1 N NaOH basisch gemacht. Der resultierende Feststoff wurde abfiltriert, mit H₂O und kaltem CH₂Cl₂ gespült und unter Vakuum getrocknet, wodurch ein braunes Pulver erhalten wurde, 100 mg (91% Ausbeute), Smp. 240 bis 42°C. FTIR (KBr) 3470, 3344, 1588, 1497, 1385, 1319, 1248 cm^–1; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8,12 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 8,10 (s, 1H), 7,10–7,70 (m, 6H), 6,38 (s, 1H), 6,25 (s, 1H); HRMS (FAB) Ber. für C₁₄H₁₁N₄O [MH⁺]: 251,0933. Gefunden: 251,0945; Anal. ber. für C₁₄H₁₀N₄O·0,12 CH₂Cl₂: C, 65,45; H, 3,97; N, 21,65. Gefunden: C, 65,35; H, 4,23; N, 21,25.
Beispiel C: 9(E/Z)-Hydroxyimino-3H-fluoreno[2,3-d]-1,2,3-triazol
Zu einer Suspension aus 2,3-Diamino-9(E/Z)-hydroxyimino-fluoren (aus Beispiel A(2); 100 mg, 0,44 mmol) in H₂O (1,4 ml) bei 0°C wurden Eisessig (51 μl, 0,88 mmol) und eine Lösung aus NaNO₂ (33 mg, 0,48 mmol) in H₂O (0,6 ml) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei 70°C für eine halbe Stunde erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde auf einen pH von 9 mit 58%igem wässerigem NH₄OH basisch gemacht. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit H₂O und kaltem CHCl₃ gespült und unter Vakuum getrocknet, wodurch ein braunes Pulver erhalten wurde, 100 mg (96% Ausbeute), Smp. 222–24°C. FTIR (KBr) 3193, 3062, 2870, 1626, 1443, 1381, 1194 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,38 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 8,22 (s, 1H), 7,98–8,18 (m, 2H), 7,70 (d, 1H, J = 7,5 Hz), 7,30–7,58 (m, 3H); HRMS (FAB) Ber. für C₁₃H₉N₄O [MH⁺]: 237,0776. Gefunden: 237,0772; Anal. ber. für C₁ ₃H₈N₄O·0,24 CHCl₃: C, 60,14; H, 3,14; N, 21,15. Gefunden: C, 60,14; H, 3,49; N, 20,84.
Beispiel D: 9(E/Z)-Hydroxyimino-7-iod-3H-fluoreno[2,3-d]-1,2,3-triazol

(1) 2-Amino-7-iod-9H-fluoren, das die Strukturformel
aufwies, wurde zunächst in einer Weise analog zu 2,3-Diamino-fluoren-9-on für Beispiel A(1) hergestellt, außer daß 7-Iod-2-nitrofluoren (siehe Marhevka et al., J. Med. Chem., 28, 18–24 (1985); ebenso erhalten von Aldrich) anstelle von 2-Amino-3-nitro-fluoren-9-on verwendet wurde, wodurch ein weißes Pulver in 91%iger Ausbeute bereitgestellt wurde, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7,94 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,72 (dd, 2H, J = 10,3, 8,1 Hz), 7,45 (s, 1H), 7,62 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 3,98 (s, 2H).
(2) 2-Acetamido-7-iod-9H-fluore das die Strukturformel
aufwies, wurde als nächstes hergestellt. Eine Suspension aus 2-Amino-7-iod-9H-fluoren (1,50 g, 4,88 mmol) in Eisessig bei 80°C wurde mit Essigsäureanhydrid (3,23 ml, 34,2 mmol) tropfenweise über 5 min behandelt. Das resultierende Gemisch wurde bei 90°C für 2 h erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Der resultierende Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit H₂O gespült, unter Vakuum getrocknet, wodurch ein weißes Pulver erhalten wurde, 1,3 g (76% Ausbeute), das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 10,02 (s, 1H), 7,88 (s, 2H), 7,78 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,68 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 7,60 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 3,82 (s, 2H), 2,02 (s, 3H).
(3) 2-Acetamido-7-iod-3-nitro-9H-fluoren, das die Strukturformel
aufwies, wurde als nächstes hergestellt. Zu einer Suspension aus 2-Acetamindo-7-iod-9H-fluroen (2,37 g, 6,79 mmol) in Eisessig (245 ml) bei 95°C wurde tropfenweise über 3 min eine Lösung aus konzentrierter HNO₃ (730 μl, 11,5 mmol) in Eisessig (5 ml) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde auf 100°C 30 min erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und auf gestoßenes Eis gegossen. Der resultierende Feststoff wurde abfiltriert, mit H₂O gespült und unter Vakuum getrocknet, wodurch ein gelber Feststoff erhalten wurde, 1,8 g (67% Ausbeute), der ohne weitere Reinigung verwendet wurde, ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8,58 (s, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,84 (t, 2H, J = 8,1 Hz), 7,75 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 4,02 (s, 2H), 2,02 (s, 3H); Anal. ber. für C₁ ₅H₉N₂O₄·0,2 H₂O: C, 43,76; H, 2,30; N, 6,80. Gefunden: C, 43,41; H, 2,30; N, 6,56.
(4) 2-Acetamido-7-iod-3-nitro-fluoren-9-on, das die Strukturformel
aufwies, wurde als nächstes hergestellt. Zu einer Suspension aus 2-Acetamido-7-iod-3-nitro-9H-fluoren (1,5 g, 3,81 mmol) in Eisessig (150 ml) wurde Kaliumdichromat (1,68 g, 5,71 mmol) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde unter Rückfluß 3 h erhitzt. Das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und auf H₂O gegossen. Der resultierende Feststoff wurde abfiltriert, mit H₂O gespült und aus siedendem THF umkristallisiert, wodurch ein pinkfarbenes Pulver erhalten wurde, 850 mg (55% Ausbeute), das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 10,42 (2, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,04 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 7,92 (s, 1H), 7,78 (dd, 2H, J = 7,8 7,2 Hz), 2,02 (s, 3H).
(5) 2-Amino-7-iod-3-nitro-fluoren-9-on, das die Strukturformel
aufwies, wurde als nächstes hergestellt. Zu einer Suspension aus N-(7-Iod-3-nitro-9-oxo-9H-fluoren-2-yl)-acetamid (450 mg, 1,10 mmol) in einem Gemisch aus n-Butanol und Ethanol (40 ml, 1 : 1) wurde 50%ige H₂SO₄ (5 ml) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde unter Rückfluß 3 h erhitzt. Das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und mit H₂O verdünnt. Der resultierende Feststoff wurde abfiltriert, mit H₂O gespült und unter Vakuum getrocknet, wodurch ein brauner Feststoff erhalten wurde, 400 mg (99% Ausbeute), der ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8,38 (s, 1H), 8,08 (s, 2H), 7,96 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 7,88 (s, 1H), 7,72 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 7,36 (s, 1H); MS (ESI) [MH⁺]: 367.
(6) 2,3-Diamino-7-iod-fluoren-9-on, das die Strukturformel
aufwies, wurde in einer Weise analog zu 2,3-Diamino-fluoren-9-on für Beispiel A(1) hergestellt, außer daß 2-Amino-7-iod-3-nitro-fluoren-9-on anstelle von 2-Amino-3-nitro-fluoren-9-on verwendet wurde, wodurch ein braunes Pulver in 75%iger Ausbeute bereitgestellt wurde, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7,92 (dd, 1H, J = 7,8, 1,6 Hz), 7,76 (d, 1H, J = 1,6 Hz), 7,48 (s, 1H), 7,44 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 7,09 (s, 1H); MS (ESI) [MH⁺]: 337; Anal. ber. für C₁₅H₉N₂O₄·1 HCl: C, 41,91; H, 2,71; N, 7,52. Gefunden: C, 42,09; H, 2,67; N, 7,34.
(7) 7-Iod-9-oxo-fluoreno[2,3-d]-1,2,3-triazol, das die Strukturformel
aufwies, wurde in einer Weise analog zu 7-Iod-9-oxo-3H-fluoren[2,3-d]-1,2,3-triazol in Beispiel C hergestellt, außer daß 2,3-Diamino-7-iod-fluoren-9-on anstelle von 2,3-Diamino-9(E/Z)-hydroxyimino-fluoren verwendet wurde, wodurch ein bräunlich-gelbes Pulver in 93%iger Ausbeute bereitgestellt wurde, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8,22 (bs, 1H), 8,03 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 7,90 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 7,83 (d, 1H, J = 6,9 Hz), 7,76 (s, 1H), 7,64 (dd, 1H, J = 7,8, 6,5 Hz); MS (ESI) [MH⁺]: 348; Anal. ber. für C₁₃H₆N₃O·0,6 H₂O: C, 43,62; H, 2,03; N, 11,74. Gefunden: C, 43,09; H, 2,05; N, 11,36.
(8) Die Titelverbindung wurde in einer Weise hergestellt, wie die, die für Beispiel A(2) beschrieben wird, außer daß 7-Iod-9-oxo-3H-fluoreno[2,3-d]-1,2,3-triazol anstelle von 2,3-Diamino-fluoren-9-on verwendet wurde, wodurch ein braunes Pulver in 65%iger Ausbeute erhalten wurde, Smp. 275–77°C; FTIR (KBr) 3194, 3061, 2912, 1626, 1588, 1439, 1377, 1194 cm^–1; ¹H NMR (CD₃OD) δ 8,80 (bs, 1H), 8,17 (bs, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,86 (d, 1H; J = 7,8 Hz), 7,62–7,78 (m, 2H); HRMS (FAB) Ber. für C₁₃H₈IN₄O [MH⁺]: 362,9743. Gefunden: 362,9755; Anal. ber. für C₁₃H₇IN₄O·0,5 CHCl₃: C, 39,35; H, 2,08; N, 13,02. Gefunden: C, 39,61; H, 2,48; N, 12,72.

Beispiel E: 7-Iod-2-oxa-9(E/Z)-oximino-1,3-diaza-cyclopenta[b]fluoren

(1) 7-Iod-2-oxa-1,3-diaza-cyclopenta[b]fluoren-9-on, das die Strukturformel
aufwies, wurde aus 2-Amino-7-iod-3-nitro-fluoren-9-on (Beispiel D(5)) gemäß einem Mehrschrittverfahren von Perera et al., J. Chem. Soc. (C), 1348–1354 (1971) hergestellt. Die Behandlung mit Natriumnitrit und wässeriger Salzsäure erzeugt ein Diazoniumderivat, welches durch Natriumazid verdrängt und in heißer Essigsäure zu der heterocyclischen Titelverbindung zersetzt wird.

Die Titelverbindung wird in einer Weise ähnlich der, die für Beispiel A(1) beschrieben wird, aus 7-Iod-2-oxa-1,3-diaza-cyclopenta[b]fluoren-9-on hergestellt.
Beispiel F: 7-Iod-9(E/Z)-oximino-1,3-diaza-2-thia-cyclopenta[b]fluoren

(1) 7-Iod-1,3-diaza-2-thia-cyclopenta[b]fluoren-9-on, das die Strukturformel
aufwies, wurde aus 2,3-Diamino-7-iod-fluoren-9-on (Beispiel D(6)) gemäß einer Verfahrensweise hergestellt, die von Matsumoto et al., Chem. Pharm. Bull., 47, 971–979 (1999) (bezogen auf Khaletski et al., Doklady Akad. Nauk S.S.S.R., 106, 88–91, Chem. Abstr., 50, 13885c (1956)) beschrieben wird. Die Reaktion mit Thionylchlorid und Triethylamin in Benzol unter Rückfluß stellt die heterocyclische Titelverbindung bereit.

Die Titelverbindung wird in einer Weise ähnlich der, die für Beispiel A(1) beschrieben wird, aus 7-Iod-1,3-diaza-2-thia-cyclopenta[b]fluoren-9-on hergestellt.
Biologische Tests; Enzymassays
Die Stimulation der Zellproliferation durch Wachstumsfaktoren, wie VEGF und andere, hängt von ihrer Induktion der Autophosphorylierung von jedem ihrer jeweiligen Rezeptortyrosinkinasen ab. Deshalb korreliert die Fähigkeit eines Proteinkinaseinhibitors, die Zellproliferation, die durch diese Wachstumsfaktoren ausgelöst wurde, zu blockieren, direkt mit seiner Fähigkeit, die Rezeptorautophosphorylierung zu blockieren. Um die Proteinkinaseinhibierungsaktivität der Verbindungen zu messen, wurden die folgenden Konstrukte erfunden.
VEGF-R2-Konstrukt für Assay: Ein Konstrukt (VEGF-R2Δ50) der Zytosoldomäne des menschlichen vaskuläreren Endothelwachstumsfaktorrezeptors 2 (VEGF-R2), dem es an den 50 zentralen Resten der 68 Reste der Kinaseinsertdomäne fehlt, wurde in einem Baculovirus/Insekten-Zellsystem exprimiert. Von den 1356 Resten des durchgehenden VEGF-R2 enthält VEGF-R2Δ50 die Reste 806–939 und 990–1171, und ebenso eine Punktmutation (E990 V) in der Kinaseinsertdomäne in Bezug auf den Wildtyp VEGF-R2. Siehe McTigue et al., Structure, 7, 319–330 (1999); US-Patentanmeldung Nr. 09/390,326, eingereicht am 7. September 1999. Die Autophosphorylierung des gereinigten Konstrukts wurde durch Inkubation des Enzyms bei einer Konzentration von 4 μM in Gegenwart von 3 mM ATP und 40 mM MgCl₂ in 100 mM Hepes, pH 7,5, enthaltend 5% Glycerol und 5 mM DTT, bei 4°C für 2 h durchgeführt. Nach der Autophosphorylierung ist gezeigt worden, daß dieses Konstrukt katalytische Aktivität zeigt, im wesentlichen äquivalent zu dem Wildtyp-autophosphorylierten Kinasedomänenkonstrukt. Siehe Parast et al., Biochemistry, 37, 16788–16801 (1998).
CHK-1-Konstrukte für Assay: C-terminal His-markiertes durchgehendes menschliches CHK-1 (FL-CHK-2) wurde unter Verwendung des Baculovirus/Insekten-Zellsystems exprimiert. Es enthält 6 Histidinreste (6 × His-Markierung) an dem C-Ende des 476-Aminosäure- Menschen-CHK-1. Das Protein wurde durch konventionelle Chromatographietechniken gereinigt.
CHK-1 KH289 enthält die Reste 1–289 von menschlichem CHK-1, einschließlich der Kinasedomäne. Es enthält 6 Histidinreste (6 × His-Markierung) an dem C-Ende des Restes 289. Das Protein wurde in einem Baculovirus/Insekten-Zellsystem exprimiert und durch konventionelle Chromatographietechniken gereinigt.
CDK2/Cyclin-A-Konstrukt für Assay: CDK2 wurde unter Verwendung der veröffentlichten Methodik (Rosenblatt et al., J. Mol. Biol., 230, 1317–1319 (1993)) aus Insektenzellen, die mit einem Baculovirusexpressionsvektor infiziert worden sind, aufbereitet. Cyclin A wurde aus E. coli-Zellen, die das durchgehende rekombinante Cyclin A exprimieren, aufbereitet, und ein abgestumpftes Cyclin-A-Konstrukt wurde durch eingeschränkte Proteolyse erzeugt und wie zuvor beschrieben gereinigt (Jeffrey et al., Natur, 376, 313–320 (1995)).
CDK4/Cyclin-D-Konstrukt für Assay: Ein Komplex aus menschlichem CDK4 und Cyclin D3 oder ein Komplex aus Cyclin D1 und einem Fusionsprotein von menschlichem CDK4 und Glutathion-S-transferase (GST-CDK4) wurde unter Verwendung traditioneller biochemischer Chromatographietechniken aus Insektenzellen, die mit den entsprechenden Baculovirusexpressionsvektoren co-infiziert worden sind, aufbereitet.
CDS1-Konstrukt für Assay: CDS1 CE4 enthält die Reste 209–502, einschließlich der Kinasedomäne von menschlichem CDS1/CHK-2 (Genbank Zugangsnummer AFO86904, Matsuoka et al., Science, 282, 1893–97 (1998)). Es enthält die Aminosäuresequenz: MGSSHHHHHHSSGLVPRSHM am N-Ende des Restes 209. (Das erste M liegt nicht in dem exprimierten Protein aufgrund der post-translationalen Verarbeitung des N-Endes vor.) Das Protein wurde in E. coli exprimiert und durch konventionelle Chromatographietechniken aufbereitet.
VEGF-R2-Assay
Gekoppelter spektrophotometrischer (FLVK-P) Assay
Die Herstellung von ADP aus ATP, das die Prosphorylübertragung begleitet, wurde an die Oxidation von NADH unter Verwendung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und einem System mit Pyruvatkinase (PK) und Lactatdehydrogenase (LDH) gekoppelt. Die Oxidation von NADH wurde nach der Verringerung der Extinktion bei 340 nm (e₃₄₀ = 6,22 cm^–1 mM^–1) unter Verwendung eines Beckmann DU 650 Spektrophotometers überwacht. Die Assaybedingungen für phosphoryliertes VEGF-R2Δ50 (angegeben als FLVK-P in den nachstehenden Tabellen) waren die folgenden: 1 mM PEP; 250 μM NADH; 50 Einheiten LDH/ml; 20 Einheiten PK/ml; 5 mM DTT; 5,1 mM Poly(E₄Y₁); 1 mM ATP und 25 mM MgCl₂ in 200 mM Hepes, pH 7,5. Die Assaybedingungen für nicht-phosphoryliertes VEGF-R2Δ50 (angegeben als FLVK in den Tabellen) waren die folgenden: 1 mM PEP; 250 μM NADH; 50 Einheiten LDH/ml; 20 Einheiten PK/ml; 5 mM DTT; 20 mM Poly(E₄Y₁); 3 mM ATP und 60 mM MgCl₂ und 2 mM MnCl₂ in 200 mM Hepes, pH 7,5. Die Assays wurden mit 5 bis 40 nM Enzym initiiert. Die K_i-Werte wurden durch Messen der Enzymaktivität in Gegenwart von variierenden Konzentrationen der Testverbindungen bestimmt. Die Daten wurden unter Verwendung der Enzyme Kinetic and Kaleidagraph Software analysiert.
ELISA-Assay
Die Bildung von Phosphogastrin wurde unter Verwendung von biotinyliertem Gastrinpeptid (1-17) als Substrat überwacht. Biotinyliertes Phosphogastrin wurde unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten 96-Loch-Mikrotiterplatten immobilisiert, gefolgt von der Detektion unter Verwendung des Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers, konjugiert an Meerrettichperoxidase. Die Aktivität der Meerrettichperoxidase wurde unter Verwendung von 2,2'-Azinobis[3-ethylbenzthiazolinsulfonat]diammoniumsalz (ABTS) überwacht. Typische Assaylösungen enthielten: 2 μM biotinyliertes Gastrinpeptid; 5 mM DTT; 20 μM ATP; 26 mM MgCl₂ und 2 mM MnCl₂ in 200 mM Hepes, pH 7,5. Der Assay wurde mit 0,8 nM phosphoryliertem VEGF-R2Δ50 initiiert. Die Meerrettichperoxidaseaktivität wurde unter Verwendung von ABTS, 10 mM, analysiert. Die Meerrettichperoxidasereaktion wurde durch Zugabe von Säure (H₂SO₄) gequencht, gefolgt von der Extinktionsablesung bei 405 nm. Die K_i-Werte wurden durch Messen der Enzymaktivität in Gegenwart von variierenden Konzentrationen der Test verbindungen bestimmt. Die Daten wurden unter Verwendung der Enzyme Kinetic and Kaleidagraph Software analysiert.
CHK-1-Assay
Die Herstellung von ADP aus ATP, das die Phosphorylübertragung zu dem synthetischen Substratpeptid Syntide-2 (PLARTLSVAGLPGKK) begleitet, wurde an die Oxidation von NADH unter Verwendung von Phosphoenolpyruvat (PEP) durch die Wirkungen der Pyruvatkinase (PK) und Lactatdehydrogenase (LDH) gekoppelt. Die Oxidation von NADH wurde nach der Verringerung der Extinktion bei 340 nm (e₃₄₀ = 6,22 cm^–1 mM^–1) unter Verwendung eines HP8452-Spektrophotometers überwacht. Typische Reaktionslösungen enthielten: 4 mM PEP; 0,15 mM NADH; 28 Einheiten LDH/ml; 16 Einheiten PK/ml; 3 mM DTT; 0,125 mM Syntide2Σ; 0,15 mM ATP; 25 mM MgCl₂ in 50 mM TRIS, pH 7,5, und 400 mM NaCl. Die Assays wurden mit 10 nM CHK-1 KH289 initiiert. Die K_i-Werte wurden durch Messen der anfänglichen Enzymaktivität in Gegenwart von variierenden Konzentrationen der Testverbindungen bestimmt. Die Daten wurden unter Verwendung der Enzyme Kinetic and Kaleidagraph Software analysiert.
CDS1-Assay
Der CDS1-Assay wurde unter identischen Bedingungen wie der CHK-1-Assay hergestellt, außer der Verwendung von 10 nM CDS1.
CDK2/Cyclin-A- und CDK4/Cylclin-D-Assays
Die Cyclin-abhängige Kinaseaktivität wurde durch Quantifizieren der Enzym-katalysierten, zeitabhängigen Aufnahme von radioaktivem Phosphat aus [³²P]ATP in ein rekombinantes Fragment des Retinoblastomproteins gemessen. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Assays in 96-Lochplatten in einem Gesamtvolumen von 50 μl in Gegenwart von 10 mM HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethanosulfonsäure]) (pH 7,4); 10 mM MgCl₂, 25 μM Adenosintriphosphat (ATP), 1 mg/ml Ovalbumin, 5 μg/ml Leupeptin, 1 mM Dithiothreitol, 10 mM β-Glycerophosphat, 0,1 mM Natriumvanadat, 1 mM Natriumfluorid, 2,5 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N'N'-tetraessigsäure (EGTA), 2% (Volu men/Volumen) Dimethylsulfoxid und 0,03 bis 0,2 μCi [³²P]ATP durchgeführt. Das Substrat (0,3 bis 0,5 μg) war gereinigtes rekombinantes Retinoblastomproteinfragment (Rb) (Reste 386–928 des nativen Retinoblastomproteins; 62,3 kDa, enthaltend die Mehrheit der Phosphorylierungsstellen, die in dem nativen 106 kDa Protein gefunden wurden, sowie eine Markierung von sechs Histidinresten zur leichten Reinigung). Die Reaktionen wurden mit CDK2 (150 nM CDK2/Cyclin-A-Komplex) oder CDK4 (50 nM CDK4/Cyclin-D3-Komplex) initiiert, bei 30°C inkubiert und nach 20 Minuten durch die Zugabe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) auf 250 mM beendet. Das phosphorylierte Substrat wurde dann auf einer Nitrocellulosemembran unter Verwendung eines 96-Loch-Filtrationsverteilers eingefangen, und die nicht aufgenommene Radioaktivität wurde durch wiederholtes Waschen mit 0,85% Phosphorsäure entfernt. Die Radioaktivität wurde durch Exponieren der getrockneten Nitrocellulosemembranen mit einem Phosphorabbildungsgerät quantifiziert. Die scheinbaren K_i-Werte wurden durch Analysieren der Enzymaktivität in Gegenwart von unterschiedlichen Verbindungskonzentrationen und Abziehen der Hintergrundradioaktivität, die in Abwesenheit des Enzyms gemessen wurde, gemessen. Die kinetischen Parameter (kkat, Km für ATP) wurden für jedes Enzym unter den üblichen Assaybedingungen durch Bestimmen der Abhängigkeit der anfänglichen Raten von der ATP-Konzentration gemessen. Die Daten wurden an eine Gleichung zur kompetitiven Hemmung unter Verwendung eines Kaleidagraph (Synergy Software) angepaßt, oder wurden an eine Gleichung zur kompetitiven Festbindungshemmung unter Verwendung der Software KineTic (BioKin, Ltd.) angepaßt. Die spezifische Aktivität von CDK4 war dieselbe, ob zu durchgehendem Cyclin D3 oder abgestumpftem Cyclin-D3-Konstrukt komplexiert; beide Komplexe ergaben ebenso sehr ähnliche K_i-Werte für ausgewählte Inhibitoren.
Inhibierung des Zellwachstums: Bewertung der Antiproliferation mit U2-OS-, SAOS2-, HCT116-Krebszellinien
Die Inhibierung des Zellwachstums wurde unter Verwendung des Tetrazoliumsalzassays gemessen, der auf der Fähigkeit von lebensfähigen Zellen, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-[2H]-diphenyltetrasoliumbromid (MTT) zu Formazan zu reduzieren, basiert, gemessen (Mossman, J. Immunological Methods, 65, 55–58 (1983)). Das wasserunlösliche purpurrote Formazanprodukt wurde dann spektrophotometrisch nachgewiesen. Die HCT 116-, U2-OS- bzw. SAOS2-Zellinien wuchsen jeweils in 96-Lochplatten. Die Zellen wurden in dem ent sprechenden Medium bei einem Volumen von 135 μl/Loch in McCoy's 5A Medium plattiert. Die Platten wurden 4 h vor der Zugabe von Inhibitorverbindungen inkubiert.
Unterschiedliche Konzentrationen von Inhibitorverbindungen wurden in 0,5% (Volumen/Volumen) Dimethylsulfoxid (μl/Loch) zugegeben und die Zellen wurden bei 37°C (5% CO₂) für vier bis sechs Tage (in Abhängigkeit des Zelltyps) inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde MTT zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml zugegeben und die Zellen wurden weitere 4 h bei 37°C inkubiert. Nach der Zentrifugation der Platten und Entfernung des Mediums wurde die Extinktion des Formazans (in Dimethylsulfoxid solubilisiert) bei 540 nm gemessen. Die Konzentration der Inhibitorverbindung, die 50% der Inhibierung des Wachstums verursacht, wurde aus dem linearen Teil einer halblogarithmischen Darstellung der Inhibitorkonzentration gegen die prozentuale Inhibierung bestimmt. Alle Ergebnisse wurden verglichen, um die Zellen, die nur mit 0,5% (Volumen/Volumen) Dimethylsulfoxid behandelt wurden, zu kontrollieren.
Die Ergebnisse der Tests der Verbindungen unter Verwendung verschiedener Assays werden in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt, wo eine Bezeichnung „%@" die prozentuale Inhibierung bei der angegebenen Konzentration angibt.
Die beispielhaften Verbindungen, die oben beschrieben werden, können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß den folgenden allgemeinen Beispielen formuliert werden.
Beispiel 1: Parenterale Zusammensetzung
Um eine parenterale pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Verabreichung durch Injektion geeignet ist, herzustellen, wurden 100 mg eines wasserlöslichen Salzes einer Verbindung der Formel I oder Formel II in DMSO gelöst und dann mit 10 ml 0,9%iger steriler Salzlösung gemischt. Das Gemisch wurde in eine Arzneiform, die zur Verabreichung durch Injektion geeignet ist, aufgenommen.
Beispiel 2: Orale Zusammensetzung
Um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur oralen Verabreichung herzustellen, wurden 100 mg einer Verbindung der Formel I oder Formel II mit 750 mg Laktose gemischt. Das Gemisch wurde in eine orale Dosierungseinheit, wie eine harte Gelatinekapsel, die zur oralen Verabreichung geeignet ist, aufgenommen.
Beispiel 3: Intraokulare Zusammensetzung
Um eine pharmazeutische Depotfreisetzungszusammensetzung zur intraokularen Verabreichung herzustellen, wurde eine Verbindung der Formel I oder Formel II in einer neutralen, isotonischen Lösung aus Hyaluronsäure (1,5% konz.) in Phosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert, um eine 1%ige Suspension zu bilden.

Claims

Verbindung der Formel I:
worin: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₁-C₈-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, Acyl, Thio(C₁-C₁₂)alkyl, Sulfonyl oder Sulfoxyl sind; und X C-Y oder N ist, wobei Y Wasserstoff, Halogen, NH₂, NO₂ oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₂-Alkyl, C₃-C₁₂-Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, C₁-C₁₂-Alkoxy, C₂-C₁₂-Alkenyl, Aryl, Heteroaryl, Aryloxy, C₁-C₁₂-Alkylamino, Di(C₁-C₁₂)alkylamino, Thio(C₁-C₁₂)alkyl, Acyl, Sulfonyl, Sulfoxid oder Thioaryl ist; oder ein Solvat der Verbindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der Verbindung.
Verbindung, Solvat oder Salz nach Anspruch 1, wobei: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₈-Alkyl sind; und X C-Y oder N ist, wobei Y Wasserstoff, Halogen, NH₂, NO₂ oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₂-Alkyl oder -Aryl ist.
Verbindung, Solvat oder Salz nach Anspruch 1, wobei: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder Halogen sind; und X C-Y oder N ist, wobei Y Wasserstoff, NH₂ oder NO₂ ist.
Verbindung der Formel II:
worin: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₁-C₈-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, Acyl, Thio(C₁-C₁₂)alkyl, Sulfonyl oder Sulfoxyl sind; und W O oder S ist; oder ein Solvat der Verbindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der Verbindung.
Verbindung, Solvat oder Salz nach Anspruch 4, wobei: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen oder ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₈-Alkyl sind; und W O oder S ist.
Verbindung, Solvat oder Salz nach Anspruch 4, wobei: R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder Halogen sind; und W O oder S ist.
Verwendung einer Verbindung, eines Solvats oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Krankheitszustandes bei Säugern, hervorgerufen durch Proteinkinaseaktivität.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Krankheitszustand mit Tumorwachstum, Zellproliferation oder Angiogenese in Verbindung steht.
Verwendung einer Verbindung, eines Solvats oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation oder Inhibierung der Aktivität eines Proteinkinaserezeptors.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Proteinkinaserezeptor ein CDK-Komplex, VEGF-R, FGF-1, CHK-1, CDS1 oder LCK ist.
Verwendung einer Verbindung, eines Solvats oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes wie in einem der Ansprüche 4 bis 6 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Krankheitszustandes bei Säugern, hervorgerufen durch Proteinkinaseaktivität.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Krankheitszustand mit Tumorwachstum, Zellproliferation oder Angiogenese in Verbindung steht.
Verwendung einer Verbindung, eines Solvats oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes wie in einem der Ansprüche 4 bis 6 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation oder Inhibierung der Aktivität eines Proteinkinaserezeptors.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Proteinkinaserezeptor ein CDK-Komplex, VEGF-R, FGF-1, CHK-1, CDS1 oder LCK ist.