ES2274449T3 - Uso de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol para terapia anticancerigena. - Google Patents

Abstract

Uso de derivados de 7-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazol de fórmula general (I), en la que: R1 se elige del grupo constituido por alquilo lineal, ramificado o cíclico, con hasta 12 átomos de carbono, alquenilo lineal, ramificado o cíclico con hasta 12 átomos de carbono, alquinilo lineal, ramificado o cíclico con hasta 12 átomos de carbono, un átomo de hidrógeno de R1 se sustituye opcionalmente por un grupo elegido del grupo constituido por OR2, NO2, NR2R3, en los que R2 y R3 se eligen de forma independiente del grupo constituido por H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico, con hasta 12 átomos de carbono, y en la que dicho grupo S-R1 no es un buen grupo saliente, para preparar un medicamento que inhibe la GST para el tratamiento de formas de cáncer.

Description

Uso de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol para terapia anticancerígena.

La presente invención se refiere al uso de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol para terapia anticancerígena. De forma más específica, la invención se refiere al uso de derivados del compuesto heterocíclico conocido como 7-nitrobenzofurazano o 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol, como agentes que tienen una fuerte actividad inhibidora frente a la gran familia de glutatión-S-transferasas (GSTs), que son altamente expresadas en células cancerígenas y hacen que estas células sean particularmente resistentes a muchos factores de estrés. Por lo tanto, estos compuestos son útiles en la producción de fármacos para terapia anticancerígena y se pueden usar solos o combinados con otros agentes quimioterapéuticos.

Como se sabe, la mayoría de los fármacos anticancerígenos usados en el tratamiento oncológico en el siglo XX consisten en moléculas que no son selectivas para las células cancerígenas, y por lo tanto son muy tóxicos para el cuerpo. Los fármacos anticancerígenos típicos incluyen como miembros más extendidos los agentes alquilantes, que pueden modificar el ADN y ARN de forma no selectiva, y los antimetabolitos que mimetizando las bases del ADN y de otras moléculas naturales, interfieren con la síntesis de ácidos nucleicos, proteínas y otros procesos metabólicos vitales, actuando como antagonistas e inhibidores.

La investigación oncológica siempre ha intentado encontrar fármacos que pudieran inhibir de la forma más selectiva posible el crecimiento de células cancerígenas sin interferir en las células normales. Por esta razón, la investigación oncológica se ha centrado, por ejemplo, en las moléculas que inhiben enzimas clave para la supervivencia de las células transformadas.

Estas moléculas incluyen los inhibidores de telomerasa, una enzima cuya actividad permite que las células cancerígenas sigan dividiéndose durante un periodo de tiempo mayor comparado con el periodo de supervivencia de las células normales, y así las hace "inmortales". Otras enzimas diana importantes son la tirosina-cinasa, implicada en la aparición del cáncer y de otras enfermedades proliferativas tales como la psoriasis y la aterosclerosis. Otra línea de investigación importante se centra en el desarrollo de inhibidores específicos de la farnesil-transferasa, una enzima esencial para desencadenar la proteína p21, que está implicada en la proliferación celular y en la transformación neoplásica.

Otra enzima clave en la transducción de señales es la proteína-cinasa C (PKC), que está implicada directamente en los procesos de proliferación y diferenciación y en la regulación del fenotipo MDR. Se conocen diferentes inhibidores naturales de la PKC, y son la base del desarrollo de fármacos nuevos.

Otra clase de enzimas diana concierne a las enzimas que regulan el ciclo celular, en particular las cinasas dependientes de ciclina (CDK), cuyos inhibidores producen un bloqueo del ciclo celular en muchas líneas de células cancerígenas y por lo tanto se pueden usar como citostáticos y como citotoxinas.

Una enzima que ha suscitado mucho interés en los últimos años en el campo oncológico es la glutatión-S-transferasa (GST, EC 2.5.1.18). Esta es realmente una familia de isoenzimas que se encuentran ampliamente en la naturaleza y que catalizan el ataque nucleófilo del átomo de azufre del glutatión (GSH) a grupos electrófilos de las moléculas sustrato. Como es sabido, el glutatión es un tripéptido compuesto de ácido glutámico, cisteína y glicina, y es el compuesto de bajo peso molecular más importante que se encuentra en las células animales y vegetales, que contiene el grupo tiol. Las glutatión-S-transferasa catalizan la conjugación del glutatión con muchos tipos diferentes de xenobióticos, reduciendo de esta manera notablemente su reactividad y haciendo que estos compuestos sean más hidrosolubles, para favorecer así su eliminación.

Basándose en este mecanismo, se ha considerado que la actividad de la GST es uno de los factores responsables del fenómeno de resistencia a fármacos observado en células cancerígenas, ya que muchos compuestos anticancerígenos son reconocidos como sustratos por estas enzimas (Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25, (1990), 47-70; Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 30, (1995), 445-600; Cancer Cells Mon. Rev. 2, (1990), 15-22; Cancer Res. 54, 4313-4320; Eur. J. Cancer 32A, (1996), 967-978). La GST es altamente expresada en muchos cánceres humanos y tiene una función principal en la detoxificación de diferentes fármacos anticancerígenos o sus metabolitos usados en el tratamiento oncológico. La enzima realiza la conjugación con el glutatión de los fármacos anticancerígenos tales como las mostazas nitrogenadas, clorambucil, ciclofosfamida, mitoxantrona y antraquinona, y podría detoxificar otros fármacos actuando no directamente en las moléculas si no en uno de sus metabolitos.

Las GST constituyen una familia multigénica de isoenzimas que se han subdividido de acuerdo con su inmunogenicidad y estructura primaria, en al menos diez clases, incluyendo Alfa, Pi y Mu. La clase enzimática hiperexpresada en mayores cantidades en cánceres es la Pi (GST-Pi), como se ha observado en diferentes cánceres y tejidos precancerosos humanos (Mol. Pharmacol. 50, (1996), 149-159). Este aumento de la expresión enzimática se ha encontrado tanto en líneas celulares resistentes a agentes alquilantes (Cancer Res. 49, (1989), 6185-6192; Br. J. Cancer, 74, (1996), S93-S98), como en líneas celulares cancerígenas resistentes a la doxorrubicina y al cisplatino (Cancer Res. 49, (1989), 7020-7025; Cancer 78,1996, 416-421; J. Biol. Chem. 261, (1986), 15544-15549), y también ha sugerido el uso de la enzima GST de clase Pi como un marcador cancerígeno para su diagnóstico temprano.

Además, muchos estudios muestran claramente que la hiperexpresión de la GST en tumores convierte a los fármacos anticancerígenos en resistentes no sólo por la conjugación con el glutatión, si no también por otros mecanismos que todavía no se han aclarado completamente. Recientemente se ha encontrado una correlación entre la cantidad de GST de clase Pi transferida en el núcleo de las células cancerígenas y la resistencia que ganan estas células frente a fármacos tales como la doxorrubicina y el cisplatino, y se ha sugerido que la GST de clase Pi en el núcleo protege al ADN del daño producido por la quimioterapia. (Faseb J. 15, (2001), 2702-2714).

Muchas pruebas muestran que las GST también tienen una función activa en el control del proceso de muerte celular programada (apoptosis). En condiciones de estrés celular, tal como después de tratamiento con radiación UV o agentes oxidantes, se activa la proteína-cinasa N-terminal de c-Jun (JNK), la cual está implicada en la respuesta celular al estrés en mamíferos mediante la regulación del ciclo celular, reparación del ADN o inducción de apoptosis. Recientemente, se ha purificado un inhibidor de proteína de JNK, identificado como GST de clase Pi (J. Biol. Chem. 276, (2001), 20999-21003). Esta proteína se une por la región que comprende los restos 194-201, a la parte C-terminal de la proteína-cinasa JNK, y se sabe que factores que producen estrés celular implican la disociación del complejo GST Pi/JNK y por lo tanto la activación de la cinasa.

De acuerdo con estos resultados, también se ha descubierto que los inhibidores específicos de la GST Pi, tales como los peptidomiméticos de glutatión TER-117 [Terrapin 117: \gamma-L-glutamil-S-(bencil)-L-cisteinil-R-(-)-fenilglicina] y TER-293, desencadenan la proteína-cinasa JNK porque favorecen la disociación de la GST Pi del complejo de GST Pi/JNK (EMBO J. 18, 1999, 1321-1334; J. Biol. Chem. 276, (2001), 20999-21003).

También se ha observado que la GSTM1-1, una glutatión-S-transferasa que pertenece a la clase Mu, se une con la parte N-terminal de otra cinasa que regula la señal apoptótica, llamada ASK-1 (cinasa reguladora de la señal de apoptosis) inhibiendo su actividad. Se ha demostrado que un choque térmico, que produce la disociación del complejo de GSTM1-1/ASK1, permite el desencadenamiento de ASK1. A su vez esta cinasa está implicada en una cascada de reacciones de activación de otras proteínas y fosforila JNK y la cinasa p38, que son mediadores conocidos de la respuesta
celular a los factores de estrés (J. Biol. Chem. 276, 2001, 12749-12755; J. Biol. Chem. 277, (2002), 30792-30797).

Como conclusión, parece que una de las funciones principales de la GST es la reducción de la cascada de señales ligada a JNK por múltiples mecanismos: la enzima GST Mu actúa en la cinasa ASK1 y de esta forma indirectamente en JNK, mientras que la enzima GST Pi actúa directamente en JNK.

Las observaciones mencionadas muestran que la hiperexpresión de GST en células cancerígenas representa un mecanismo de protección para estas últimas frente a factores de estrés de tipo endógeno y a los producidos por fármacos anticancerígenos. Por lo tanto, las células cancerígenas pueden adquirir resistencia a estos fármacos y pueden no seguir respondiendo a los estímulos apoptóticos.

En vista de lo anterior, la búsqueda de inhibidores de GST eficaces se ha convertido en uno de los objetivos principales con el fin de modular la resistencia de las células cancerígenas a los fármacos anticancerígenos.

Uno de los primeros inhibidores de las GST usados fue el ácido etacrínico, un ingrediente activo usado durante mucho tiempo como un diurético (que recientemente se ha sustituido por la furosemida para esta indicación), que sensibiliza las células cancerígenas al efecto citotóxico de los agentes alquilantes. Aunque se ha reconocido como un sustrato de algunas isoenzimas de la GST, el ácido etacrínico también se comporta como un inhibidor de estas enzimas. En este contexto, se han obtenido resultados apreciables usando ácido etacrínico para reducir la resistencia de las células cancerígenas al melfalán, carmustina, mitomicina C, doxorrubicina, y en menor medida al clorambucil en pacientes afectados por leucemia linfoblástica crónica (Advanced Drug Delivery Reviews 26, (1997), 91-104).

La falta de especificidad en lo que se refiere a las isoformas de GST hiperexpresadas en células malignas, así como una cierta cantidad de efectos secundarios considerables, tales como una diuresis notable, han desaconsejado el uso del ácido etacrínico en la práctica clínica, y como alternativa se han introducido algunos inhibidores selectivos para clases de GST enzimática específicas (Advanced Drug Delivery Reviews, citado antes).

Estos son los peptidomiméticos de glutatión mencionados, incluidos, por ejemplo, TER 199 [éster dietílico de la \gamma-glutamil-S-(bencil)-cisteinil-R(-)-fenilglicina] que entra rápidamente en las células, y siendo un profármaco, es activado por esterasas intracelulares. En la forma activa, el fármaco TER-117 mencionado, inhibe selectivamente las GST de clase Pi, potenciando el efecto de las mostazas nitrogenadas y en general de los agentes alquilantes en diferentes líneas celulares de cáncer tales como las HT29 de colon y las de carcinoma de ovario SKOV-3, que hiperexpresan la isoenzima GST Pi (Cancer Chemother. Pharmacol. 37, (1996), 363-370).

Tanto en el ácido etacrínico como en el TER 199, la acción observada consiste en potenciar el efecto de otros agentes citotóxicos (agentes alquilantes) en células cancerígenas resistentes. Una clase diferente de agentes citotóxicos basados en sustancias análogas al glutatión (Advanced Drug Delivery Reviews, citado antes) consiste en moléculas que no inhiben la GST si no que aprovechan su poder catalítico con el fin de ser activados. Estos profármacos difieren en su selectividad hacia las diferentes isoenzimas y en los diferentes agentes activados que derivan de ellos. Un ejemplo es TER 286, cuya estructura tiene la capacidad de unión de GST de una sustancia peptidomimética de GSH y la citotoxicidad de una mostaza nitrogenada alquilante. Cuando es activada por las isoenzimas de las clases Pi y Alfa, la citotoxina latente de TER 286 libera un análogo de ciclofosfamida con actividad citotóxica inherente.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al campo de investigación de nuevos inhibidores selectivos para las clases enzimáticas de glutatión-S-transferasa hiperexpresadas en células cancerígenas, con el fin de proporcionar derivados activos como agentes anticancerígenos, tanto por su poder citotóxico intrínseco como por su capacidad para inhibir la actividad de detoxificación de la GST frente a otros agentes quimioterapéuticos.

Como se ha indicado previamente, algunas clases de GST son hiperexpresadas en muchas clases de células, hasta tal punto que algunas isoformas, tales como la GSTP1-1, que pertenece a la clase Pi de GST, se pueden usar como marcadores tumorales. Esta hiperexpresión enzimática, documentada para la mayoría de los cánceres, hace que las células cancerosas sean resistentes a los fármacos no sólo por la actividad de detoxificación que catalizan estas enzimas, si no también por la actividad antiapoptótica que muestran, que interfiere en los mecanismos de transducción de señales que regulan la apoptosis.

En los estudios que condujeron a la presente invención, se encontró que algunos derivados específicos del 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol muestran, en diferentes líneas celulares de cáncer, una considerable inhibición selectiva hacia las isoformas de GST consideradas, así como un alto poder citotóxico. Estas moléculas se unen selectivamente al sitio hidrofóbico de las GST (donde se une el cosustrato que se debe conjugar con el glutatión) e inhiben fuertemente la actividad de estas isoenzimas.

Los derivados del 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol que se han considerado de acuerdo con la presente invención, se pueden preparar fácilmente a partir del 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol, una molécula fluorogénica conocida en bioquímica, usada para marcar compuestos de tipo tiol y amina (FEBS Lett. 6, (1970), 346-348; Eur. J. Biochem. 54, (1975), 117-126; Eur. J. Biochem. 54, (1975), 127-133). El 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol se ha reconocido como un cosustrato para la GST de clase Alfa, pero también lo usan como sustrato las GST de clase Pi y Mu, generando el producto, es decir el (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)glutatión (Anal. Biochem. 218, (1994), 463-465; J. Biol. Chem. 271, (1996), 16193-16198). Esta última molécula es un buen inhibidor de GST, pero entra con dificultad en las células y es expulsado rápidamente de las mismas.

Los derivados del 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (también llamado 4-nitrobenzofurazano) ya se tuvieron en cuenta en el pasado por sus posibles aplicaciones clínicas como fármacos anticancerígenos. Los estudios iniciales de los compuestos de esta familia datan de finales de los años 60, destacando algunas publicaciones su potencial actividad antileucémica (Biochemical Pharmacology 17, (1968), 158-161; J. Med. Chem. 11, (1968), 305-311). Estas publicaciones se refieren a un número limitado de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol, y describen su actividad de inhibición de la incorporación de uridina-5-^{3}H en el ARN de linfocitos de ovejas in vitro, es decir, inhibición del metabolismo de los linfocitos. Estudios posteriores encontraron que el 7-feniltio- y 7-purin-6-tio-4-nitrobenzofurazano son potentes inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas en algunas líneas celulares de cáncer de mamíferos (Chem. Biol. Interactions 42, (1982), 195-207). Los resultados globales obtenidos en estos trabajos son contradictorios, y parece que no se ha seguido con esta línea de investigación.

Por otra parte, la presente invención propone el uso, como inhibidores de GST y agentes anticancerígenos, de derivados específicos del 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol que no se mencionan como posibles agentes anticancerígenos en estudios previos.

Los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol que son el objetivo de la presente invención se caracterizan por la presencia de un puente tioéter en la posición 4 y por la presencia de un grupo alifático con características de un mal grupo saliente conectado al mismo. Este último también contiene, preferiblemente, al menos un grupo -OH. Dichos derivados tienen la capacidad de entrar rápidamente en las células cancerosas, en las que llevan a cabo una notable actividad citotóxica. Esta acción se debe probablemente a la inhibición de la actividad detoxificante (como demuestra la prueba experimental específica obtenida in vitro en isoenzimas purificadas) y la actividad antiapoptótica de las GST, en particular de la isoforma GSTP1-1 que es hiperexpresada en líneas celulares de cáncer. Por lo tanto, el uso de los derivados de acuerdo con la presente invención permite llevar a cabo un tratamiento dirigido a la obtención de un efecto citotóxico en células cancerosas, las dianas principales de estos compuestos altamente selectivos, que interfiere de forma menos eficaz en la fisiología de las células normales.

Respecto a la estructura química de los compuestos de acuerdo con la presente invención, se debe indicar que la naturaleza de los grupos salientes presentes en su cadena principal dan como resultado reacciones de intercambio lentas o nulas con tioles endógenos tales como el glutatión, y la formación de un aducto \sigma estable con GSH, como se muestra en la sección experimental del presente documento. Las reacciones de intercambio con tioles endógenos es un fenómeno documentado en el caso de otros derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol estudiados en la línea de investigación previa mencionada. En el transcurso de los experimentos previos mencionados se ensayaron algunos de los derivados de -O-, -NR- y -S- del 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol, y en particular entre los derivados de -S- se ensayaron los compuestos en los que el grupo que se une al azufre en la posición 4 es alternativamente un grupo fenilo, bencilo, acetilo o ciano. Los resultados modestos y contradictorios descritos deben asignarse a la presencia de buenos grupos salientes en estos compuestos, tales como cloro, tiocianato, fenoxi, feniltio y benciltio. Estos grupos favorecen las reacciones de intercambio con el glutatión, conduciendo a la formación de aductos con este último. Estos aductos preferiblemente son expulsados por las células a través de glicoproteínas específicas de la membrana que pertenecen a la familia de las proteínas implicadas en el proceso de resistencia a fármacos a varios agentes (proteína de resistencia a múltiples fármacos, MRP) (Free Rad. Biol. Med. 27, (1999), 985-991).

Además, como ya se ha indicado, algunos de los compuestos descritos en la bibliografía citada presentan problemas considerables de solubilidad que comprometen la posibilidad de la administración in vivo. Por otra parte, en los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de acuerdo con la presente invención, la presencia de al menos un grupo -OH contribuye a proporcionar una buena solubilidad en un medio acuoso a estos compuestos, mientras que todavía mantienen un grado de apolaridad que permite la interacción con el sitio de unión hidrófobo del sustrato de la GST, y permite expresar su fuerte actividad de inhibición enzimática.

Fuera del campo oncológico ya se conocen algunas aplicaciones de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol funcionalizados en 4 con un puente tioéter, por ejemplo, como reactivos fluorescentes en el estudio del metabolismo de algunos inhibidores de tiol en la conversión de la angiotensina I en angiotensina II (patentes de EE.UU. 4395556 y nº 4469870), y en general como sondas fluorescentes para marcar ácidos nucleicos o proteínas. Se describen otros derivados 4-S- del 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol en la solicitud de patente de EE.UU. nº 2002/0189032 y documento EP-A-1261591, en los que se proponen para usar como colorantes de fibras de queratina y en particular para el pelo.

Por lo tanto, la presente invención proporciona específicamente el uso de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de fórmula general (I),

1

en la que:

R_{1} se elige del grupo constituido por alquilo lineal, ramificado o cíclico, con hasta 12 átomos de carbono, alquenilo lineal, ramificado o cíclico con hasta 12 átomos de carbono, alquinilo lineal, ramificado o cíclico con hasta 12 átomos de carbono, y un átomo de hidrógeno de R_{1} se sustituye opcionalmente por un grupo elegido de los grupos constituidos por OR_{2}, NO_{2}, NR_{2}R_{3},

en los que R_{2} y R_{3} se eligen de forma independiente del grupo constituido por H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico, con hasta 12 átomos de carbono,

y en la que dicho grupo S-R_{1} no es un buen grupo saliente,

para preparar un medicamento que inhibe la GST para el tratamiento de formas de cáncer. De acuerdo con la presente invención, los inhibidores selectivos de GST anteriores se pueden usar ventajosamente en terapias antineoplásicas, administrándolos solos como agentes citotóxicos o combinados con otros agentes quimioterapéuticos con el fin de potenciar su efecto terapéutico por reducción del efecto de resistencia a fármacos.

De acuerdo con algunas de sus realizaciones específicas, la presente invención se refiere al uso de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de fórmula general (1), en la que R_{1} es un hidroxialquilo lineal o ramificado con hasta 12 átomos de carbono, y se elige preferiblemente de 4-hidroxibutilo y 6-hidroxihexilo.

Los ingredientes activos preferidos para el uso propuesto de acuerdo con la presente invención corresponden a uno de los siguientes:

4-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)butanol

6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol.

De acuerdo con uno de sus aspectos adicionales, la presente invención se refiere más específicamente al uso de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de fórmula general (I) para el tratamiento de diferentes formas de cáncer, y en particular de las formas caracterizadas por una hiperexpresión de GST. Las isoformas enzimáticas mencionadas, que son hiperexpresadas en tumores sólidos, linfomas y en leucemias, pueden pertenecer a las clases GST Pi, GST Mu y GST Alfa de la glutatión-S-transferasa, y más específicamente pueden ser las isoformas GSTP1-1, GSTM2-2 y GSTA1-1.

Un objetivo específico adicional de la presente invención es una composición farmacéutica para tratar el cáncer, que incluye como ingrediente activo, al menos uno de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de fórmula general (I), junto con uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacológicamente aceptables.

Las preparaciones farmacéuticas adecuadas para la administración terapéutica de inhibidores de la GST, de acuerdo con la presente invención, se pueden formular basándose en las técnicas convencionales que conocen los expertos en la materia, usando excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables, con el fin de obtener preparaciones adecuadas para inyección parenteral (inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea), para administración oral en forma sólida o líquida, para administración transdérmica, intravaginal o local, por ejemplo, en las membranas mucosas del tracto oronasal y similares.

El porcentaje de ingrediente activo en la composición y el procedimiento de tratamiento anticancerígeno pueden variar con el fin de obtener una dosificación óptima. La dosis que se va a administrar tiene en cuenta los siguientes factores: la vía de administración, la duración del tratamiento, el peso y afección del paciente, la actividad del ingrediente activo y el grado de reacción del paciente.

Una vez determinada la dosificación adecuada del ingrediente activo, se puede hacer la elección de la formulación y los excipientes y adyuvantes adecuados para cada necesidad basándose en el conocimiento común del campo.

A continuación se describen como ejemplos algunos resultados experimentales obtenidos en el marco de la presente invención, incluyendo los datos relativos a la actividad biológica y características, como inhibidores de GST, de algunos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol, de los cuales también se describe la síntesis. Algunos de dichos resultados experimentales también se muestran en las gráficas de los dibujos que acompañan, en los que:

La Figura 1 muestra una representación gráfica de Scatchard para la unión del derivado de 7-nitrobenzofurazano denominado nº 2 en lo sucesivo (6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol) a GSTP1-1; en la gráfica \nu es la relación entre el cambio de fluorescencia observado con una concentración de ligando dada y el cambio de fluorescencia observado con la concentración de saturación de ligando; L es la concentración de ligando libre;

La Figura 2 muestra el espectro del derivado de 7-nitrobenzofurazano 15 \muM nº 2 en tampón de fosfato K 0,1 M, pH 6,5 (paneles A y B, líneas continuas), y el espectro de 7-nitrobenzofurazano 15 \muM nº 2 unido a cantidades estequiométricas de GSTP1-1, en presencia de GSH 1 mM (Panel A, línea de trazos) o S-metilglutatión 1 mM (Panel B, línea de trazos);

La Figura 3 muestra la actividad de la caspasa 3 en las líneas celulares CEM1.3 y K562 después de tratamiento con el derivado de 7-nitrobenzofurazano nº 2 (\blacksquare) y la actividad de la caspasa 3 en células de control (\bullet); el porcentaje de apoptosis en las líneas celulares CEM1.3 y K562 después de tratamiento con el derivado de 7-nitrobenzofurazano nº 2 (\Box) y en células de control (\circ); la actividad se expresó como el cambio de fluorescencia observado por minuto por número de células; la apoptosis se determinó analizando la fragmentación nuclear después de la tinción celular con tinte Hoechst 33342;

La Figura 4 muestra los resultados de los análisis de citometría de flujo realizados en las líneas celulares K562 y CEM1.3 tratadas con el derivado nº 2 10 \muM y 2 \muM respectivamente; después de 12 y 24 h de tratamiento, las células se lavaron y tiñeron tanto con anexina V-FITC como con PI, que permite la discriminación de las células intactas, las apoptóticas tempranas y apoptóticas tardías o células necróticas;

La Figura 5 (A, B y C) muestra los análisis de transferencia Western de las líneas celulares K562 y CEM1.3 tratadas con el derivado nº 2 10 \muM y 2 \muM respectivamente; GSTP1-1, c-Jun, JNK y las isoformas c-Jun fosfoactivada y JNK se detectaron por anticuerpos específicos; se usó \beta-actina como control de carga (Paneles A y C); la disociación del complejo de GST/JNK se evaluó por análisis de inmunoprecipitación; los lisados se inmunoprecipitaron usando el anticuerpo policlonal anti-JNK y después se sometieron a análisis de transferencia Western; GST y JNK se detectaron mediante anticuerpos específicos (Panel B); y

La Figura 6 muestra las variaciones de peso de ratones en un ensayo de toxicidad aguda in vivo comparando el efecto de la administración parenteral de diferentes dosificaciones del compuesto de ensayo nº 2 de la invención, comparado con los controles que recibían solución fisiológica o vehículo solo.

Respecto a la síntesis, como ya se ha indicado antes, los derivados que forman el objeto de la presente invención, así como los compuestos usados para comparar, se pueden preparar partiendo de un compuesto inicial fácilmente disponible, el 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals), sin descartar procedimientos de síntesis alternativos.

Ejemplo 1 4-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)butanol

Una solución mezclada de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) y 4-mercapto-1-butanol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (2 mmoles) se hizo reaccionar en 20 ml de etanol:tampón de fosfato potásico 1:1, a pH 7,0 durante 6 horas en un vaso de precipitados cerrado, a 25ºC. El pH se controló continuamente para mantenerlo neutro por adición de pequeñas cantidades de KOH. Al final de la reacción, el exceso de 4-mercapto-1-butanol se hizo reaccionar con 1,5 mmoles de 3-bromopiruvato.

El producto de reacción, el 4-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)butanol, es un compuesto insoluble amarillo oscuro, que se recoge por filtración y se lava dos veces con 15 ml de agua destilada fría. Por análisis de HPLC se observa que el producto final es 98% puro.

El peso molecular del compuesto determinado por espectrometría de masas es 269 Da.

El espectro de UV visible en agua se caracteriza por un pico de absorción máximo a 431 nm (\varepsilon = 15 mM-1.cm-1) y el espectro de fluorescencia en agua muestra un pico de emisión máximo a 525 nm.

Ejemplo 2 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol

Una solución mezclada de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) y 6-mercapto-1-hexanol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (2 mmoles) se hizo reaccionar en 20 ml de etanol:tampón de fosfato potásico 1:1, a pH 7,0 durante 6 horas en un vaso de precipitados cerrado, a 25ºC. El pH se controló continuamente para mantenerlo neutro por adición de pequeñas cantidades de KOH. Al final de la reacción, el exceso de 6-mercapto-1-hexanol se hizo reaccionar con 1,5 mmoles de 3-bromopiruvato.

El producto de reacción, el 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol, es un compuesto insoluble amarillo oscuro que se recoge por filtración y se lava dos veces con 15 ml de agua destilada fría.

Por análisis de HPLC se observa que el producto final es 98% puro. El peso molecular del compuesto determinado por espectrometría de masas es 298 Da.

El espectro de UV visible se caracteriza por un pico de absorción máximo a 432 nm (\varepsilon = 15 mM-1.cm-1) y el espectro de fluorescencia muestra un pico de emisión máximo a 525 nm.

Ejemplo comparativo 3

2-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)imidazol

Una solución de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) y 2-mercaptoimidazol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (1 mmol) se hizo reaccionar en 6 ml de etanol:agua 0,3:1, que contenía 2,5 mmoles de piridina (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals). Después de 1 hora de incubación a 25ºC, la solución se filtró, se lavó dos veces con 10 ml de agua destilada fría y se secó a vacío.

El producto insoluble, el 2-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)imidazol, es de color naranja y por análisis de HPLC es 98% puro. El peso molecular del compuesto determinado por espectrometría de masas es 264 Da.

El compuesto tiene un espectro de UV visible caracterizado por un pico de absorción máximo a 401 nm (\varepsilon = 11.5 mM^{-1}.cm^{-1}) y no tiene un espectro de emisión de fluorescencia.

Ejemplo comparativo 4

2-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)fenol

Una solución mezclada de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) y 4-mercaptofenol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (2 mmoles) se hizo reaccionar en 20 ml de etanol:tampón de fosfato potásico 1:1, a pH 7,0 durante 6 horas en un vaso de precipitados cerrado, a 25ºC. El pH se mantuvo neutro por adición de pequeñas cantidades de KOH. Al final de la reacción, el exceso de 4-mercaptofenol se hizo reaccionar con 1,5 mmoles de 3-bromopiruvato.

El producto de reacción, el 4-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)fenol, se recogió por filtración, se lavó dos veces con 15 ml de agua destilada fría y se secó a vacío. El producto final es un compuesto insoluble marrón y por análisis de HPLC se observa que es 98% puro. El peso molecular del compuesto determinado por espectrometría de masas es 289 Da.

El compuesto tiene un espectro de UV visible en agua que se caracteriza por un pico de absorción máximo a 428 nm (\varepsilon = 11,5 mM-1 cm-1) y no tiene un espectro de fluorescencia de emisión.

Ejemplo comparativo 5

Ácido 3-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)-propiónico

Una solución de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) y ácido 3-mercaptopropiónico (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (1 mmol) se hizo reaccionar en 6 ml de alcohol etílico:agua 0,3:1 que contenía 2,5 mmoles de piridina.

Después de 1 hora de incubación a 25ºC, la solución se filtró, se lavó dos veces con 10 ml de agua destilada fría y después se secó a vacío. El producto de reacción insoluble, el ácido 3-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)propiónico, es de color amarillo oscuro y por análisis de HPLC se observa que es 98% puro. El peso molecular es
270 Da.

El compuesto tiene un espectro de UV visible en agua caracterizado por un pico de absorción máximo a 428 nm (\varepsilon = 12 mM-1.cm-1) y el espectro de fluorescencia muestra un pico de emisión máximo a 525 nm.

Estudio de la actividad biológica de inhibición de la glutatión-S-transferasa por los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol

Procedimiento experimental - Se usaron los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de los Ejemplos 1 y 2, preparados de acuerdo con los procedimientos descritos en dichos ejemplos. Para comparación, también se evaluó el rendimiento de los siguientes compuestos:

- Los compuestos de los Ejemplos 3 y 4, caracterizados por grupos salientes moderados;

- El compuesto del Ejemplo 5, caracterizado por un grupo saliente básicamente malo modificado por la sustitución de un hidrógeno por un grupo COOH;

- El derivado 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol, en el que el S se sustituye por NH en la fórmula, en el que el grupo NHR1 no es un grupo saliente.

Este último actuaba como un control para asegurar que la citotoxicidad está ligada a la inhibición de GST. El 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol se obtuvo haciendo reaccionar 1 mmol de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol con 1 mmol de 6-amino-1-hexanol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) en 6 ml de alcohol etílico:agua 0,3:1 que contiene 2,5 mmoles de piridina.

Estos compuestos se ensayaron como inhibidores de la actividad de las isoenzimas GSTP1-1,GSTA1-1 y GSTM2-2 que pertenecen a las clases de GST más representativas: las clases Pi, Mu y Alfa.

Se purificaron GSTA1-1, M2-2 y P1-1, expresados en Escherichia coli, usando un paso cromatográfico en una resina de afinidad capaz de retener la GST selectivamente (J. Biol. Chem. 270, (1995), 1249-1253).

Se ensayó la actividad de la GST a 25ºC con un tampón de fosfato potásico 0,1 M, a pH 6,5, en presencia de los sustratos, es decir del glutatión (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) con una concentración 1 mM (Methods Enzymol. 77, 1981, 398-405).

Durante el ensayo para determinar la CI_{50} (concentración inhibidora a la que se observa una inhibición de la actividad enzimática del 50%) la mezcla de actividad se añadió a diferentes cantidades de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol que se iban a ensayar.

La actividad enzimática se evaluó por espectrofotometría a 340 nm, una longitud de onda a la que absorbe el producto de reacción S-(2,4-dinitrobenceno)-glutatión (GS-DNB) (\varepsilon= 9,6 mM^{-1}.cm^{-1}).

Resultados - Los valores de CI_{50} (\muM) de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol se dan en la siguiente Tabla 1. La tabla muestra los valores de CI_{50} para diferentes inhibidores ensayados respecto a las tres isoenzimas representativas de cada clase de GST.

Cada compuesto en la tabla se da con un número que corresponde al ejemplo de síntesis relativo, mientras que el derivado de amina comparativo se da con el número 6.

TABLA 1

2

Como ya se ha indicado, también se ensayó la capacidad de inhibición frente a las diferentes isoenzimas de GST del derivado 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol. El átomo de azufre en esta última fórmula se sustituye por un grupo amina con el fin de evaluar si la citotoxicidad está ligada a la inhibición de la GST.

El análisis de estos datos iniciales muestra que el compuesto ha perdido prácticamente su capacidad para inhibir la GSTP1-1 (CI50 \geq 100 \muM) pero mantiene una mayor capacidad de inhibición respecto a GSTM2-2 con una CI50 de 1,8 \muM.

Para el inhibidor análogo cuya fórmula incluye azufre, hay una CI50 mucho menor (mayor capacidad de inhibición) respecto al control, y concretamente 0,80 \muM para GSTP1-1 y 0,01 \muM para GSTM2-2.

Mecanismo de interacción entre derivados de 7-nitro-benzofurazano y las GST Unión de derivados de 7-nitro-benzofurazano a las GST

Procedimiento experimental - Se obtuvo la afinidad de derivados de 7-nitro-benzofurazano por las GST humanas midiendo la atenuación de la fluorescencia intrínseca de la proteína que se produce después de la unión de los inhibidores (la excitación era a 295 nm y la emisión se registró a 340 nm). La fluorescencia intrínseca se midió en un espectrofluorímetro de recuento de fotón simple (Fluoro-max, S.A. Instruments, Paris, Francia). En un experimento típico se registró la fluorescencia a 340 nm antes y después de la adición de cantidades variables de un inhibidor seleccionado, a GST 4 \muM en tampón de fosfato K 0,1 M pH 6,5, que contenía GSH 1 mM.

Resultados - En la representación gráfica de Scatchard en la Figura 1 se presentan los datos representativos obtenidos con GSTP1-1 y el derivado de 7-nitrobenzofurazano nº 2 (síntesis del ejemplo 2). La constante de disociación obtenida para el complejo inhibidor-GSTP1-1 es K_{D} = 0,8 \muM, que se sobrepone al valor de CI_{50} obtenido cinéticamente y descrito en la Tabla 1. Hay que destacar que el GSH es esencial para una buena afinidad entre el derivado de 7-nitrobenzofurazano y GST: de hecho, en ausencia de GSH la afinidad disminuye aproximadamente dos órdenes de magnitud.

Prueba espectroscópica de la formación del aducto \sigma en el sitio activo

Procedimiento experimental - El espectro UV-visible del derivado de 7-nitrobenzofurazano 15 \muM nº 2 en presencia de cantidades estequiométricas de GSTP1-1 y GSH 1 mM se obtuvo a 25ºC en tampón de fosfato K 0,1 M
pH 6,5.

Resultados - En presencia de GSTP1-1 y GSH se observa la desaparición inmediata de la banda a 432 nm, típica del derivado de 7-nitrobenzofurazano, y un aumento paralelo de una banda centrada a 348 nm (Figura 2, Panel A). El grupo tiol del GSH es esencial para obtener este cambio espectral. De hecho, no se observa cambio en el espectro UV-visible cuando el derivado de 7-nitrobenzofurazano (50 \muM) se incuba con cantidades estequiométricas de GSTP1-1 y S-metilglutatión 1 mM (Figura 2, Panel B).

Este comportamiento se puede explicar por las publicaciones previas que muestran que los 7-nitrobenzofurazanos son excelentes electrófilos, que forman fácilmente aductos \sigma con muchos nucleófilos (J. Chem. Soc., Perkin Trans 2, (2002)257-261). El comportamiento habitual observado es un ataque cinéticamente preferido del nucleófilo a la posición 6 del anillo de 7-nitrobenzofurazano, seguido de una lenta isomerización hacia el aducto 4 más estable que absorbe entre 300 y 400 nm. En las condiciones experimentales anteriores el aducto \sigma se puede formar por una interacción covalente entre el derivado de 7-nitrobenzofurazano y el grupo tiol de GSH unido al sitio activo de GSTP1-1, como se publica en el Esquema A.

3

Esta hipótesis está de acuerdo con el enfoque de acoplamiento realizado para predecir la orientación del ligando en el sitio de unión de la GST. La comparación entre las energías de unión para el aducto \sigma en la posición 6 y en la posición 4 pone de manifiesto una estabilización de dos órdenes de magnitud del compuesto sustituido en 4.

A partir de los datos anteriores es evidente que la especie inhibidora real que inhibe la GSTP1-1 es el aducto \sigma formado entre el derivado de 7-nitrobenzofurazano y el GSH. Las GST son muy eficaces en la catálisis de la formación del aducto \sigma entre los derivados de 7-nitrobenzofurazano y el GSH. Los grupos salientes malos tales como los grupos alquiltio pueden estabilizar el aducto \sigma previniendo la formación del derivado 4-glutationil-7-nitro monosustituido. Además, estos aductos \sigma se caracterizan por una carga negativa localizada en el grupo 7-nitro, que la enzima puede estabilizar específicamente. De hecho, en ausencia de GSTP1-1, se obtienen cantidades detectables de aducto \sigma en solución sólo con concentraciones de GSH mayores que 5 mM, y la constante de equilibrio calculada para esta reacción es K = 20 mM. Basándose en esta constante de equilibrio, la cantidad de aducto \sigma formada con GSH 1 mM (concentración de GSH usada en los experimentos de los autores de la invención) y en ausencia de GSTP1-1 es aproximadamente 5% de la concentración de 7-nitrobenzofurazano. Por lo tanto, la afinidad de GSTP1-1 hacia la especie inhibidora real se convierte en 4 x 10^{-8} M. Esta fuerte afinidad indica que GSTP1-1 es una diana muy selectiva para esta molécula dentro de la célula.

Ensayos en líneas celulares de la actividad anticancerígena de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol

Procedimiento experimental - Se usaron cuatro líneas celulares de cáncer para ensayar la actividad anticancerígena de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol: K562 (leucemia mieloide humana), HepG2 (carcinoma hepático humano), CEM1.3 (leucemia linfoblástica de células T humana) y GLC-4 (carcinoma humano de pulmón de células pequeñas).

Las líneas celulares de cáncer humanas se mantuvieron en RPMI 1640 (que contenía L-glutamina 2 mM y penicilina G/sulfato de estreptomicina 0,1 g/l) enriquecido con suero bovino fetal (FBS) al 5%, a 37ºC, CO_{2} al 5% y 98% de humedad.

Las células se pusieron en placas de 96 pocillos con una densidad de 15.00 células por pocillo, en un volumen de medio de cultivo de 100 \mul. Después de 24 horas, se añadió al medio de cultivo cada uno de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol que se iban a ensayar, con la concentración requerida. Al mismo tiempo, se dispusieron algunos ensayos de control por adición a los pocillos del disolvente en el que se había disuelto el compuesto (% en v/v de DMSO en PBS). Todas las mediciones se llevaron a cabo por cuadruplicado.

Las células se incubaron durante 48 horas a 37ºC, con CO_{2} al 5%.

A fin de obtener un perfil de dosis-respuesta para cada derivado de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol que se estudiaba, se usó un procedimiento de evaluación basado en el procedimiento descrito por Shekan y col (J. Natl. Cancer. Inst. 82, (1990), 1107-1112).

Después de la incubación, se evaluó el porcentaje de crecimiento celular por un procedimiento de fijación de células in situ, seguido de un ensayo de SRB usando un procedimiento de coloración con sulfo-rodamina B que puede unirse específicamente a proteínas. Después el producto coloreado se solubilizó y cuantificó por espectrofotometría para determinar el crecimiento de las células tratadas con el compuesto que se estudiaba respecto a las tratadas sólo con disolvente.

Con el fin de medir también la actividad de las GST endógenas presentes en las células usadas, se usaron las mismas líneas celulares de cáncer: K562, HepG2, CEM1.3 y GLC-4. En este caso, las células del cultivo se tripsinizaron según fuera necesario, se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces en PBS. Después las células se volvieron a suspender en dos volúmenes de PBS y se lisaron por sonicación. El lisado celular se centrifugó a 15.000 g durante 15 minutos. El líquido sobrenadante se recogió y se usó para el ensayo enzimático de las GST descritas en el ejemplo previo.

Una unidad de GST se define como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 \mumol de producto (GS-DNB) por minuto a 25ºC.

La concentración de proteína se determinó usando el procedimiento del ácido bicinconínico (Pierce).

Resultados - En la Tabla 2 se dan los valores de CI_{50} (la concentración del compuesto a la que se observa 50% de inhibición del crecimiento celular respecto a las células no tratadas) expresados en \muM, de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol.

A los compuestos listados en la Tabla 2 se les ha dado la misma secuencia de numeración que los usados en la experimentación descrita antes. Como en la experimentación previa, los compuestos (3)-(6) se presentan para comparar con los compuestos (1) y (2) reivindicados.

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TABLA 2

4

Basándose en el ensayo de SRB, los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de acuerdo con la fórmula (1) muestran una excelente actividad citotóxica. Los valores de CI_{50} obtenidos en las líneas celulares son de la misma magnitud que los valores de CI_{50} obtenidos con la isoforma enzimática GSTP1-1 purificada.

Para apoyar esta correspondencia, se ensayó el compuesto 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)-hexanol en las diferentes líneas celulares y se observó que no tenía actividad inhibidora respecto a la isoforma enzimática GSTP1-1, pero mostró una CI_{50} de aproximadamente 2 \muM para la isoforma enzimática GSTM2-2. Este compuesto consigue penetrar en las células fácilmente, como puede deducirse de la intensa fluorescencia registrada después de 6 horas de incubación con diferentes concentraciones de 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol. Todas las líneas celulares de cáncer ensayadas todavía eran viables después de 48 horas de incubación con 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol 50 \muM.

La Tabla 3 da los valores de la actividad específica para GST (unidad de proteína/mg) calculada en las líneas celulares usadas en el ensayo de citotoxicidad.

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TABLA 3

5

La línea celular de cáncer que mostró más resistencia al tratamiento con los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol es la del carcinoma hepático HepG2. Esta línea celular de cáncer también presenta la actividad específica de GST más baja, como puede verse en la Tabla 3, así como un carácter isoenzimático de GST que es diferente del de las otras líneas celulares de cáncer.

De hecho, los estudios de caracterización llevados a cabo en un gran número de líneas celulares confirman que GSTP1-1 es la isoforma enzimática dominante en la mayoría de las líneas celulares de cáncer (1-30 \mug/mg de proteína) y que los niveles altos de expresión de esta isoenzima parece que se correlacionan con la capacidad proliferativa y la inmortalización de estas líneas celulares de cáncer (Mol. Pharmacol. 50, 1996, 149-159).

En cambio, en la línea celular de cáncer HepG2, la concentración de GSTP1-1 es muy baja y la isoforma enzimática dominante es GSTA1-1, cuya concentración en términos absolutos es todavía aproximadamente 1% de la concentración de GSTP1-1 encontrada en la mayoría de las líneas celulares de cáncer (Biochim Biophys Acta 1225, 1994, 223-230).

Finalmente, es interesante observar que la citotoxicidad más alta de los compuestos anticancerígenos ensayados se encontró para las líneas celulares de leucemia CEM1.3 y K562, que evidentemente son más sensibles a este tipo de intervención respecto a las líneas de cánceres sólidos.

La capacidad de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol para aumentar la citotoxicidad de los fármacos anticancerígenos en células resistentes

En células cancerosas la resistencia a muchos fármacos anticancerígenos a menudo se asocia con una expresión alta de glicoproteína P, una proteína de membrana que pertenece a la familia global de transportadores ABC (caja unida a ATP). Este experimento prevé ensayar el efecto del 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol en la toxicidad del fármaco vinblastina para CEMVBL 100, una línea de leucemia resistente a la vinblastina (que hiperexpresa la glicoproteína P).

Procedimiento experimental - Las células se pusieron en tiras de 96 pocillos con una densidad de 15.000 células por pocillo, con un volumen de medio de cultivo de 100 \mul. Después de 24 horas, se añadió al medio de cultivo una concentración adecuada de vinblastina entre 25 mM y 1000 mM. El ensayo se llevó a cabo tanto en ausencia como en presencia de diferentes concentraciones de 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol en el intervalo entre 0,1 \muM y 1 \muM. Al mismo tiempo, se dispusieron algunos ensayos de control por adición a los pocillos del disolvente en el que se había disuelto el compuesto (% en v/v de DMSO en PBS). Todas las mediciones se llevaron a cabo por cuadruplicado. Después de 48 horas de incubación, se obtuvo un perfil de respuesta a la dosificación usando el ensayo SRB (J. Natl. Cancer. Inst. 82, (1990), 1107-1112, citando antes). También se evaluó la toxicidad del 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol solo para la línea de leucemia resistente CEM VBL100.

Resultados - Como se muestra en la Tabla 4, el 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol (0,5 \muM) produce un notable aumento de la sensibilidad en las células de leucemia al fármaco vinblastina.

TABLA 4

6

También hay que indicar que la línea celular CEM VBL100 no muestra un notable aumento de la resistencia, en términos de CI_{50}, respecto a otras líneas celulares que no expresan altamente la glicoproteína P. Estos descubrimientos sugieren que la hiperexpresión de la glicoproteína P no interfiere con la acción citotóxica de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol.

Análisis de la apoptosis en las líneas celulares K562 y CEM1.3

La inducción de la apoptosis en células con el derivado de 7-nitro-benzofurazano nº 2 se determinó midiendo la activación de la caspasa 3 tanto por análisis morfológico como por citometría de flujo.

Activación de la caspasa 3

Procedimiento experimental - La activación de la caspasa 3 tiene una función crítica en el inicio de la fase activa de la apoptosis que da como resultado la muerte celular. Por lo tanto, la actividad de la proteasa caspasa 3 se puede usar para seguir la apoptosis.

Se suspendieron sedimentos celulares con diferentes tiempos de incubación con el derivado de 7-nitrobenzofurazano nº 2 (10 \muM y 2 \muM con K562 y CEM1.3, respectivamente) con tampón de lisis (Hepes 100 mM, pH 7,6, Chaps al 0,1%, EDTA 1 mM, fluoruro de fenil-metil-sulfonilo 1 mM y DTT 10 mM) durante 20 min en hielo, y las células se rompieron mediante 10 s de sonicación. Los lisados después de la centrifugación se usaron para medir la actividad de caspasa 3. El sustrato usado era el péptido fluorescente modelo Ac-DEVD-AFC (Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluorometil-cumarina) que se proteolizó mediante caspasa 3 dando como resultado una emisión de fluorescencia a 505 nm (excitación a 400 nm). Como control se incubaron lisados 30 min a 30ºC con el inhibidor de caspasa DEVD-CHO antes de evaluar la actividad enzimática. La actividad de caspasa se expresó como cambio de fluorescencia observada por minuto por número de células.

Resultados - La incubación con el derivado de 7-nitro-benzofurazano nº 2 provoca la activación de la caspasa 3 en líneas celulares tanto CEM1.3 como en K562. Como se muestra en la Figura 3, se observó un fuerte aumento de caspasa 3 en K562 después de 24 h de tratamiento con derivado nº 2. Se obtuvo un resultado similar con las células CEM1.3.

Análisis morfológico

Procedimiento experimental - Se trataron las líneas celulares K562 y CEM1.3 durante 24 h con derivado nº 2 10 \muM y 2 \muM, respectivamente. Las células apoptóticas se detectaron con el microscopio de fluorescencia analizando la fragmentación nuclear después de teñir con el colorante Hoechst 33342 (Calbiochem-Novabiochem).

Resultados - Los datos representativos con células K562 muestran la condensación de cromatina y la fragmentación nuclear, que representan las etapas finales de la apoptosis.

Análisis por citometría de flujo

Procedimiento experimental - Las células se lavaron en PBS, y se tiñeron con yoduro de propidio y con el tinte impermeable anexina V-FITC (Bender MedSystems, Viena, Austria). Las células teñidas se analizaron usando un citómetro de flujo FAC-Scan (Becton-Dickinson, CA). Se registraron los datos y se analizaron estadísticamente con el software WinMDI versión 2.8. La tinción simultánea de células con anexina V-FITC y PI permite la discriminación entre células intactas, células apoptóticas tempranas y apoptóticas tardías o necróticas.

Resultados - La Figura 4 muestra los resultados de los análisis de citometría de flujo llevados a cabo en las líneas celulares tanto K562 como CEM1.3. Se observó un aumento progresivo de las células apoptóticas hasta las 24 h de tiempo de incubación. El tratamiento de 12 h con el derivado nº 2 induce 30% y 34% de apoptosis en líneas celulares K562 y CEM1.3 respectivamente, mientras que después de 24 h, la apoptosis aumenta a 41% y 47% en las líneas celulares K562 y CEM1.3 respectivamente.

Como conclusión, los resultados obtenidos con tres enfoques experimentales distintos muestran claramente la capacidad proapoptótica del derivado de 7-nitrobenzofurazano en las líneas celulares de leucemia CEM y K562.

Definición del mecanismo intracelular

El mecanismo por el cual el inhibidor de la GST induce la apoptosis se describe parcialmente a continuación, en donde se describe la interacción del derivado nº 2 con la ruta mediada por JNK intracelular en CEM linfoblatoide y en líneas celulares de leucemia K562 mielógenas.

Análisis de transferencia Western y experimento de inmunoprecipitación

Procedimiento experimental - Se lavaron las células con PBS y se recogieron por centrifugación. Los sedimentos celulares se volvieron a suspender en tampón de lisis que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, NaCl 150 mM, IGEPAL CA-630 al 0,5%, e inhibidores de proteasa (Sigma Co.). Después de 30 min de incubación en hielo, las células se rompieron mediante 10 s de sonicación. Después los lisados se centrifugaron y los líquidos sobrenadantes se cargaron en un gel de poliacrilamida al 12% y se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. Como anticuerpos primarios se usaron anti-GSTP1-1 policlonal (1:1000); anti c-Jun y anti-JNK (1:200) o las isoformas anti-c-Jun y JNK fosfoactivadas (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); y \beta-actina (1:5000; Sigma Co.). La \beta-actina se usó como control de carga.

Para el análisis de inmunoprecipitación, los sedimentos celulares se volvieron a suspender en tampón de lisis, y las células se rompieron mediante 10 s de sonicación. Después los lisados se centrifugaron a 14.000 g durante 15 min a 4ºC. Las proteínas se incubaron en tampón de lisis con anticuerpo anti-JNK durante 2 h a 4ºC. Los inmunocomplejos se absorbieron con proteína A-sefarosa durante 30 min a 4ºC. Después de tres lavados con tampón de lisis, los inmunosedimentos se hirvieron en tampón de muestra SDS. Las proteínas se cargaron en gel de SDS-poliacrilamida al 15% y se transfirieron a la nitrocelulosa. Se detectaron GST, JNK y fosfo-JNK mediante anticuerpos específicos.

Resultados - La figura 5 (A, B y C) muestra los análisis de transferencia Western de las líneas celulares K562 y CEM1.3 tratadas con el derivado nº 2 10 \muM y 2 \muM, respectivamente.

El análisis de transferencia Western muestra las formas basal y fosforilada tanto de JNK como de c-Jun. En ambas líneas celulares fosfo-JNK aumenta claramente después de media hora de incubación con el derivado nº 2 y permanece con niveles altos hasta las 24 h. La tendencia de fosfoactivación de c-Jun en la línea celular K562 es similar a la activación de JNK; se detecta rápidamente después de media hora de incubación con el derivado nº 2, y permanece con niveles altos hasta las 12 horas (Panel A). La fosfoactivación de c-Jun en la línea celular CEM1.3 sigue una tendencia diferente; se observa un aumento rápido de fosfo-c-Jun después de media hora de la adición del derivado nº 2 pero disminuye rápidamente y alcance el nivel basal después de 12 h de tratamiento (Panel C).

Estos datos sugieren que la inducción de la apoptosis depende de la activación de la ruta de JNK/c-Jun incluso aunque la modalidad de respuesta celular parece que son distintas. En particular, se podría suponer una inducción de tipo dependiente de hysto de la ruta de la proteína cinasa activada por mitógeno (MAP).

Para evaluar si el tratamiento celular con el derivado nº 2 afecta a la cantidad de complejo de GST-JNK, se inmunoprecipitaron lisados de células K562 con un anticuerpo anti-JNK y se usaron para el análisis de transferencia Western. La Figura 5, panel B, muestra que la cantidad de GSTP1-1 que coprecipita con JNK disminuye rápidamente en las células tratadas con el derivado nº 2 y aumenta ligeramente sólo después de 3 h.

Por lo tanto, la activación de la ruta de JNK-c-Jun se produce por la disociación de GSTP1-1 del complejo de GST-JNK provocada por el derivado nº 2.

Lo anterior permite llegar a la siguiente conclusión. Como respuesta a una multitud de estímulos que inducen estrés oxidativo, incluyendo la irradiación UV y los fármacos anticancerígenos, es necesaria la activación de la familia de cinasas MAP para la activación de genes y modificación postraduccional de las proteínas necesarias para la inducción de la apoptosis. Además de la activación redox de esta ruta de señalización, la adición del compuesto peptidomimético GSH (TER117) y su éster dietílico (TER199), un inhibidor específico de la isoenzima GSTP1-1, produce una disociación del complejo de GSTP1-1-JNK que da como resultado una activación de JNK. La activación de JNK induce fosforilación del sustrato c-Jun que regula la transcripción de los genes implicados en la apoptosis celular (J. Pharmacol. Exp. Ther. 296, (2001) 1-6).

Igualmente, los derivados de 7-nitrobenzofurazano de la presente invención son inhibidores de la GST muy eficaces que pueden cebar la célula para la apoptosis induciendo la disociación de GSTP1-1 de JNK. Se ha mostrado que el derivado de 7-nitrobenzofurazano nº 2 se comporta como un sustrato suicida para las GST: se conjuga con GSH en el sitio activo de la GST, conduciendo a un aducto \sigma intermedio que inhibe fuertemente la enzima (K_{D} = 4 x 10^{-8} M con GSTP1-1). Esta peculiar interacción sugiere que GSTP1-1 es una diana muy selectiva para esta molécula. Dentro de la célula, el derivado de 7-nitro-benzofurazano nº 2 induce la disociación de GSTP1-1 de JNK que da como resultado la fosfoactivación tanto de JNK como de c-Jun. El derivado de 7-nitro-benzofurazano nº 2 provoca un proceso típico de apoptosis en células K562 y CEM1.3 que incluye el encogimiento de la célula, translocación del fosfolípido fosfatidil-serina a la superficie de la células, activación de caspasa y condensación de cromatina.

Ensayo de toxicidad aguda in vivo

El ensayo usaba 25 ratones de la cepa BDF1 hembras (18-20 g Charles River Lab, Lecco, Italia) divididos en 5 grupos de 5 ratones cada uno. Tres grupos se trataron con una sola administración, por inyección intraperitoneal (i.p.) con 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol con las siguientes concentraciones: a) 125 mg/kg, b) 25 mg/kg, c) 5 mg/kg. Los otros dos grupos restantes se usaron como controles y se previeron las siguientes administraciones: d) un vehículo de aceite de oliva que contenía DMSO al 2,5%, y e) una solución fisiológica.

Los ratones se siguieron durante hasta 15 días proporcionándoles alimento y agua abundantes y registrando las variaciones de peso de cada ratón. La tendencia del peso registrado se describe en el diagrama adjunto como Figura 6, que muestra que, incluso 15 días después de tratamiento, el ratón sólo presentaba variaciones de peso pequeñas. Además, se controló el peso del hígado y bazo de cada ratón para ver si permanecían dentro de lo normal, sugiriendo así la ausencia de toxicidad del 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol incluso a la concentración máxima usada (125 mg/kg).

Todos los datos obtenidos contribuyen a confirmar que la considerable actividad citotóxica de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol en las células cancerosas se debe a la inhibición de la actividad de detoxificación y antiapoptótica de GSTP1-1 y a que las células cancerosas son la diana principal de estos compuestos puesto que hiperexpresan la GSTP1-1.

Por lo tanto, los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de acuerdo con la presente invención tienen un posible uso prometedor como agentes anticancerígenos. Además, se pueden usar combinados con otros agentes terapéuticos para prevenir, reducir o eliminar el efecto de resistencia a fármacos mostrado en pacientes sometidos a quimioterapia anticancerígena.

Claims (7)

1. Uso de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de fórmula general (I),

7

en la que:

R_{1} se elige del grupo constituido por alquilo lineal, ramificado o cíclico, con hasta 12 átomos de carbono, alquenilo lineal, ramificado o cíclico con hasta 12 átomos de carbono, alquinilo lineal, ramificado o cíclico con hasta 12 átomos de carbono,

un átomo de hidrógeno de R_{1} se sustituye opcionalmente por un grupo elegido del grupo constituido por OR_{2}, NO_{2}, NR_{2}R_{3},

en los que R_{2} y R_{3} se eligen de forma independiente del grupo constituido por H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico, con hasta 12 átomos de carbono,

y en la que dicho grupo S-R_{1} no es un buen grupo saliente,

para preparar un medicamento que inhibe la GST para el tratamiento de formas de cáncer.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{1} es un hidroxialquilo lineal o ramificado con hasta 12 átomos de carbono.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que R_{1} se elige de 4-hidroxibutilo y 6-hidroxihexilo.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el derivado de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol corresponde a uno de los siguientes:

4-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)butanol

6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol.

5. Una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende como ingrediente activo al menos uno de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de fórmula general (I), junto con uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacológicamente aceptables.

6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende uno o más agentes quimioterapéuticos distintos combinados con al menos uno de dichos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol.

7. Una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, adecuado para prevenir, reducir o eliminar la resistencia a fármacos, que comprende como ingrediente activo al menos uno de los derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol de fórmula general (I), combinado con uno o más agentes quimioterapéuticos distintos.