ES2641820T3 - Derivados de oxazolidin-2-ona-pirimidina - Google Patents

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ES2641820T3 ES13795867.4T ES13795867T ES2641820T3 ES 2641820 T3 ES2641820 T3 ES 2641820T3 ES 13795867 T ES13795867 T ES 13795867T ES 2641820 T3 ES2641820 T3 ES 2641820T3
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Robin Alec Fairhurst
Pascal Furet
Frank Stephan Dr. Kalthoff
Andreas Lerchner
Heinrich Rueeger
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Abstract

Un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o solvato del mismo, **(Ver fórmula)** en donde, R1 es metilo, etilo o hidroximetilo; R2 es fenilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posición meta y a partir de D, F, C1- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posición para, o piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posición meta y a partir de D, F, C1- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxi para la posición para, o un heteroarilo monocíclico de 5 miembros, que contiene 2 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O, o S, que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F; y R3 es H o metilo.

Description

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DESCRIPCION
Derivados de oxazolidin-2-ona-pirimidina Campo de la invencion
La presente invencion se relaciona con compuestos de pirimidina oxazolidin-2-ona sustituidos que actuan como inhibidores de la PI3K (fosfatidilinositol-3-cinasa), asi como tambien composiciones farmaceuticas de los mismos, metodos para su fabricacion y usos para el tratamiento de condiciones, enfermedades y trastornos dependientes de cinasas PI3K.
Antecedentes de la invencion
La superfamilia de fosfatidilinositol- 3- cinasas comprende cuatro diferentes cinasas de lipido o cinasas de proteina relacionadas con la PI3K. La clase I, II y III son cinasas de lipidos que difieren de sus especificidades de sustrato mientras que la PI3K clase IV tambien llamada cinasa de proteina relacionada con PI3-cinasa (PIKK) son cinasas de proteina. Las fosfatidilinositol- 3- cinasas Clase I constituyen una familia de cinasas de Kpido que catalizan la transferencia de fosfato a la posicion D- 3' de los lipidos de inositol para producir fosfoinositol- 3- fosfato (PIP), fosfoinositol- 3,4- difosfato (PIP2) y fosfoinositol- 3,4,5- trifosfato (PIP3) que, a su vez, actuan como segundos mensajeros en las cascadas de senalizacion mediante proteinas de anclaje que contienen dominios de homologia de pleckstrin, FYVE, Phox y otros dominios de union a fosfolipidos en una variedad de complejos de senalizacion a menudo en la membrana plasmatica (Vanhaesebroeck, Annu Rev. Biochem 70:535 (2001)). La regulacion aberrante de la PI3K, que a menudo aumenta la supervivencia y la proliferation a traves de la activation de AKT cinasa es uno de los eventos mas prevalentes en el cancer humano y se ha demostrado que se produce en multiples niveles (Liu et al., Nat. Rev. Drug Discov 8:627-644 (2009)). Por ejemplo, las mutaciones somaticas de cambio de sentido en PIK3CA que activan vias de senalizacion aguas abajo se han descrito en frecuencias significativas en una amplia diversidad de canceres humanos (Huang et al., Science 318:1744-1748 (2007), Zhao y Vogt, Oncogene 27:5486 -5496 (2008)). El gen supresor tumoral PTEN, que desfosforila fosfoinositidos en la posicion 3' del anillo de inositol y al hacerlo antagoniza la actividad de PI3K, es funcionalmente mutado o suprimido en una variedad de tumores (Kenury & Parson, Oncogene 27:5477-5485(2008)). Algunos estudios indican que la falla de expresar PTEN puede mediar un cambio de dependencia de senalizacion desde la PI3Ka a la isoforma p (Wee et al, Proc Natl Acad Sci USA 105:13057-13062 (2008)). Por lo tanto, la inhibition de ambas isoformas a y p PI3K de clase I pueden ser particularmente ventajosas en los canceres que son deficientes en la fosfatasa PTEN.
La solicitud de patente internacional publicada WO2007/084786 describe moleculas de pirimidina sustituidas que inhiben PI3K.
Esta bien establecido que la activacion de Akt resulta en la estimulacion de la actividad de la cinasa del blanco de rapamicina en mamiferos (mTOR). mTOR es una proteina cinasa y un miembro de la PI3K clase IV. En celulas mamiferas, mTOR se encuentra formando complejos de dos entidades distintas denominadas mTORC1 y mTORC2. La activacion de mTORC1 depende de las cinasas PI3K y Akt activas. La regulacion de la activacion de mTORC2 es mas compleja. mTORC2 es responsable de la mejora de la actividad de Akt cinasa a traves de fosforilacion del residuo de serina 473 (Sarbassov et al., Science 307:1098-1101 (2005), Bayascas y Alessi, Mol Cell 18 (2) :143-145 (2005)). Por lo tanto, la inhibicion catalitica de las isoformas PI3K clase I simultaneamente con la inhibicion de mTOR podria representar un beneficio adicional, introduciendo potencialmente un efecto mas fuerte sobre la via PI3K-Akt.
Carcinoma de celulas escamosas cutaneo (SCC) representa el segundo cancer mas frecuente con la piel humana, comunmente precedido por la queratosis actinica (AK). La patogenesis de la AK y SCC cutaneo se ha asociado con la exposition UV cronica como un factor de riesgo importante (Salasche, J Am Acad Dermatol 42:4-7 (2000)). Un aumento de la actividad de la ruta PI3K/Akt/mTOR se ha sugerido en un estudio previo (Chenet, Br J Dermatol; 160 (2) :442-445 (2009)). Se ha demostrado que la irradiation UV-B prolongada provoca una regulacion a la baja de la expresion de PTEN en el ARNm y nivel proteico en queratinocitos humanos in vitro, promoviendo su supervivencia y crecimiento (Minget otros, Oncogene;. 29 (4) :492-502 (2010 )). Basado en la literatura reciente, existe una relation de causalidad entre la irradiacion UV cronica y la regulacion a la baja de PTEN (Daridoet al, Cancer Cell,. 20 (5): 635648 (2011)). Por lo tanto, SCC cutaneo y AK y la piel danada cronicamente por el sol todo puede estar asociado con una deficiencia de la expresion de PTEN que conduce a una activacion de la via de senalizacion PI3K/Akt/mTOR.
Resumen de la invencion
La invencion se refiere a compuestos de pirimidina oxazolidin-2-ona sustituidos de la formula (I) y/o sales farmaceuticamente aceptables y/o solvatos de los mismos,
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en donde,
R1 es metilo, etilo o hidroximetilo;
R2 es fenilo, que esta sin sustituir o sustituido en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes seleccionados independientemente a partir de D, F o metoxi para la posicion meta y a partir de D, F, metoxi, Ci-C5-alcoxilo, hidroxi- C2-C4-alcoxilo o Ci-C2-alcoxi-C2-C4-alcoxilo para la posicion para,
o
piridilo, que esta sin sustituir o sustituido en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes seleccionados independientemente a partir de D, F o metoxi para la posicion meta y a partir de D, F, metoxi, Ci-C5-alcoxilo, hidroxi- C2-C4-alcoxilo o Ci-C2-alcoxi-C2-C4-alcoxilo para la posicion para,
o
un heteroarilo monoclclico de 5 miembros, que contiene de 2 a 3 heteroatomos seleccionados de N, O, o S, que esta no sustituido o sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente a partir de D o F;
y
R3 es H o metilo.
A menos que se especifique lo contrario, el termino "compuestos de la presente invencion" se refiere a compuestos de la formula (I) y subformulas de los mismos; sales del compuesto, hidratos o solvatos de los compuestos y/o sales; as! como tambien todos los estereoisomeros (incluyendo diaestereoisomeros), tautomeros y compuestos isotopicamente marcados (incluyendo sustituciones de deuterio). Los compuestos de la presente invencion comprenden ademas polimorfos de los compuestos de la formula (I) (o subformulas de los mismos) y sus sales. Cuando se mencionan compuestos de formula (I), esta se entiende que incluye tambien los tautomeros y N-oxidos de los compuestos de formula (I).
Los compuestos de la formula (I) se consideran adecuados para ser utilizados en el tratamiento de enfermedades dependientes de cinasas de PI3. Los compuestos de formula (I) se consideran adecuados, por ejemplo, para ser utilizados en el tratamiento de enfermedades dependientes de la cinasa PI3 clase I o dependientes de la cinasa P I3 clase I y mTOR.
Description detallada de la invencion
La invencion puede ser completamente apreciada como referencia a la siguiente descripcion incluyendo el siguiente glosario de terminos y los ejemplos finales. Como se utilizan en la presente, los terminos "que incluye", "que contiene" y "que comprende" se utilizan en la presente en su sentido abierto no limitativo.
Los terminos generales usados anteriormente y en adelante tienen preferiblemente dentro del contexto de esta descripcion los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario:
Como se usa en este documento, el termino "alcoxilo" se refiere a una fraccion de alquilo totalmente saturado ramificado, que incluye una fraccion de hidrocarburo simple o multiple, o fraccion de hidrocarburo no ramificado unido al resto de la molecula a traves de un grupo de union -O-. A menos se disponga otra cosa, alcoxilo se refiere a fracciones que tienen 1 a 16 atomos de carbono, de 1 a 10 atomos de carbono, 1 a 7 atomos de carbono, o 1 a 4 5 atomos de carbono. Ejemplos de alcoxilo incluyen, pero no se limitan a, metoxilo, etoxilo, n-propoxilo, iso-propoxilo, n- butoxilo, sec-butoxilo, iso-butoxilo, ter-butoxilo, n-pentoxilo, isopentoxilo, neopentilo, n-hexiloxilo.
Como se utiliza en la presente, el termino “piridilo” se refiere a 2-piridilo, 3-piridilo o 4-piridilo. Sustituyentes en la posicion meta o para estan fijado a un atomo de carbono del piridilo. Un ejemplo representativo es 3-piridilo
Como se usa en este documento, para los sustituyentes en heteroarilo monoclclico de 5 miembros, que contiene de 2 10 a 3 heteroatomos seleccionados de N, O, o S estan unidos a un atomo de carbono del heteroarilo. Ejemplos de heteroarilo monoclclico de 5 miembros, que contienen 2 a 3 heteroatomos seleccionados a partir de N, O, o S incluyen, pero no se limitan a tiazolilo, oxazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo y 1,3,4-tiadiazolilo. Un ejemplo representativo es tiazolilo.
Varias realizaciones de la invencion se describen en la presente. Se reconocera que las caracterlsticas especificadas 15 en cada realizacion pueden combinarse con otras caracterlsticas especificadas para proporcionar realizaciones adicionales de la presente invencion.
En una realizacion, la invencion proporciona un compuesto de la formula (I) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la formula (la)
imagen2
2 0 en donde R1 y R2 son como se definen para un compuesto de la formula (I) anterior.
En una realizacion, la invencion proporciona un compuesto de la formula (I) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la formula (lb)
imagen3
en donde R1 y R2 son como se definen para un compuesto de la formula (I) anterior.
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R2 es fenilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes
independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, Ci-
C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o Ci- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R2 es piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes
independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, Ci-
C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o Ci- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R2 es un heteroarilo monoclclico de 5 miembros, que contiene 2 a 3 heteroatomos seleccionados a partir de N, O, o S, que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
En una realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R2 es fenilo, 3- metoxi-fenilo, 4-metoxi-fenilo, 4- (3- hidroxipropoxi)- fenilo, 4- (2- hidroxietoxi)- fenilo o 4- (2- metoxiloetoxi)- fenilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R2 es 3- piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, C1- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R2 es 3- piridilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R2 es tiazolilo, que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R2 es 2- tiazolilo que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R2 es 2- tiazolilo.
En una realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es metilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (I), (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es etilo.
R1 es hidroximetilo.
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R1 es metilo;
R2 es fenilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes
independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, Ci-
C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o Ci- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es metilo;
R2 es piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes
independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, C1-
C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es metilo;
R2 es un heteroarilo monoclclico de 5 miembros, que contiene 2 a 3 heteroatomos seleccionados a partir de N, O, o S, que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F;.
En una realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es metilo;
R2 es fenilo, 3- metoxi-fenilo, 4-metoxi-fenilo, 4- (3- hidroxipropoxi)- fenilo, 4- (2- hidroxietoxi)- fenilo o 4- (2- metoxiloetoxi)- fenilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es metilo;
R2 es 3- piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, C1- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxi para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es metilo;
R2 es 3- piridilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es metilo;
R2 es tiazolilo, que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es metilo;
R2 es 2- tiazolilo que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F;.
R1 es metilo;
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R2 es 2- tiazolilo.
R1 es etilo;
R2 es fenilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes
independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, Ci-
C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o Ci- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es etilo;
R2 es piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes
independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, C1-
C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es etilo;
R2 es un heteroarilo monoclclico de 5 miembros, que contiene 2 a 3 heteroatomos seleccionados a partir de N, O, o S, que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
En una realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es etilo;
R2 es fenilo, 3- metoxi-fenilo, 4-metoxi-fenilo, 4- (3- hidroxipropoxi)- fenilo, 4- (2- hidroxietoxi)- fenilo o 4- (2- metoxietoxi)- fenilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es etilo;
R2 es 3- piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, C1- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es etilo;
R2 es 3- piridilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es etilo;
R2 es tiazolilo, que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es etilo;
R2 es 2- tiazolilo que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
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R1 es etilo;
R2 es 2- tiazolilo.
En una realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es hidroximetilo;
R2 es fenilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes
independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, Ci-
C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o Ci- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxi para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es hidroximetilo;
R2 es piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes
independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, C1-
C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es hidroximetilo;
R2 es un heteroarilo monoclclico de 5 miembros, que contiene 2 a 3 heteroatomos seleccionados a partir de N, O, o S, que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
En una realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (la) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es hidroximetilo;
R2 es fenilo, 3- metoxi-fenilo, 4-metoxi-fenilo, 4- (3- hidroxipropoxi)- fenilo, 4- (2- hidroxietoxi)- fenilo o 4- (2- metoxiloetoxi)- fenilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es hidroximetilo;
R2 es 3- piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, metoxilo, C1- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es hidroximetilo;
R2 es 3- piridilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es hidroximetilo;
R2 es tiazolilo, que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde
R1 es hidroximetilo;
R2 es 2- tiazolilo que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de las formulas (Ia) o (Ib) y/o una sal farmaceuticamente
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aceptable y/o un solvato del mismo, en donde R1 es hidroximetilo;
R2 es 2- tiazolilo.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de
3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil-5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil-5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil-5- feniloxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- metil-5- feniloxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- (3- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- (tiazol- 2- il)oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- etil- 5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil-5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- hidroximetil-5- fenil- oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil-5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- (2- metoxiloetoxi)fenil)oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 5- (4- (2- hidroxietoxi)fenil)- 4- (hidroximetil)oxazolidin- 2- ona o
3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- (3- hidroxipropoxi)fenil)oxazolidin- 2- ona.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de
(4S,5R)- 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil-5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona,
(4S*,5S*)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona,
(45.55) - 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona,
(4S*,5R*)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- feniloxazolidin- 2- ona,
(45.55) - 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- metil-5- feniloxazolidin- 2- ona,
(4R*,5R*)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- (3- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona,
(4S,5R)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- (tiazol- 2- il)oxazolidin- 2- ona, 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- etil- 5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona,
3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil-5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona,
(45.55) - 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- hidroximetil-5- fenil- oxazolidin- 2- ona,
(45.55) - 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil-[4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil-5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona,
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(45.55) - 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- (2- metoxiloetoxi)fenil)oxazolidin- 2- ona,
(45.55) - 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 5- (4- (2- hidroxietoxi)fenil)- 4- (hidroximetil)oxazolidin- 2- ona o
(45.55) - 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- (3- hidroxipropoxi)fenil)oxazolidin- 2- ona.
Realizaciones especlficas estan proporcionadas por compuestos ejemplificados especlficos.
Como se utiliza en la presente, el termino “un isomero optico” o “un estereoisomero” se refiere a cualquiera de las diferentes configuraciones estereoisomericas que pueden existir para un compuesto dado de la presente invencion e incluye isomeros geometricos. Se entiende que un sustituyente sera fijado a un centro quiral de un atomo de carbono. El termino "quiral" se refiere a moleculas que tienen la propiedad de no poder ser superpuestas sobre su imagen especular, mientras que el termino "aquiral" se refiere a las moleculas que son superpuestas sobre su imagen especular. Por lo tanto, la invencion incluye enantiomeros, diastereoisomeros o racematos del compuesto. Los “enantiomeros” son un par de estereoisomeros que son imagenes especulares que no pueden ser superpuestas entre si. Una mezcla 1:1 de un par de enantiomeros es una mezcla "racemica”. El termino se utiliza para designar una mezcla racemica donde sea apropiado.
Los "diaestereoisomeros” son estereoisomeros que tienen al menos dos atomos asimetricos, pero los cuales no son imagenes especulares entre si. La estereoqulmica absoluta es especificada de acuerdo con el sistema R-S de Cahn- lngold- Prelog. Cuando un compuesto es un enantiomero puro la estereoqulmica de cada carbono quiral puede especificarse por cualquiera R o S. Compuestos resueltos cuya configuracion absoluta se desconoce pueden designarse (+) o (-) dependiendo de la direccion (dextro- o levorotatoria) que rotan el plano de luz polarizada de acuerdo con la longitud de onda de la llnea D del sodio. Ciertos compuestos descritos la presente contienen uno o mas centros asimetricos o ejes y pueden as! dar origen a enantiomeros, diastereoisomeros, y otras formas estereoisomericas que seran definidas, en terminos de la estereoqulmica absoluta, como (R)- o (S)-.
Dependiendo de la eleccion de los materiales de inicio y los procedimientos, los compuestos pueden estar presentes en la forma de uno de los posibles isomeros o como mezclas de los mismos, por ejemplo, como isomeros opticos puros, o como mezclas de isomeros, tales como racematos y mezclas de diastereoisomeros, en funcion del numero de atomos de carbono asimetricos. La presente invencion se entiende incluye todos los isomeros posibles, incluyendo mezclas racemicas, mezclas diasteriomericas y formas opticamente puras. Isomeros opticamente activos (R)- y (S)- pueden prepararse utilizando sintones quirales o reactivos quirales, o resolverse utilizando tecnicas convencionales. Si el compuesto contiene un enlace doble, el sustituyente puede ser de configuracion E o Z. Si el compuesto contiene un cicloalquilo disustituido, el sustituyente cicloalquilo puede tener una configuracion cis- o - trans. Todas las formas tautomericas tambien son incluidas.
Como se utiliza en la presente, los terminos “sal” o “sales” se refieren a una sal de adicion de acido o adicion de alcali de un compuesto de la invencion. "Sales" incluyen en particular "sales farmaceuticamente aceptables". El termino “sales farmaceuticamente aceptables” se refiere a sales que retienen la efectividad biologica y propiedades de los compuestos de esta invencion y, que tlpicamente son biologicamente o de otra manera deseables. En muchos casos, los compuestos de la presente invencion son capaces de formar sales acidas y/o alcalinas en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares de los mismos.
Sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables pueden formarse con acidos inorganicos y acidos organicos, por ejemplo, acetato, aspartato, benzoato, besilato, bromuro/bromhidrato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, alcanforsulfornato, cloruro/chclorhidrato, clorteofilonato, citrato, etanodisulfonato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hipurato, yodhidrato/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metilsulfato, naftoato, napsilato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/fosfato acido/fosfato diacido, poligalacturonato, propionato, estearato, succinato, sulfosalicilato, tartrato, tosilato y sales de trifluoroacetato.
Acidos inorganicos a partir de los cuales las sales pueden derivarse incluyen, por ejemplo, acido clorhldrico, acido bromhldrico, acido sulfurico, acido nltrico, acido fosforico, y similares.
Acidos organicos de tales sales pueden derivarse incluyendo, por ejemplo, acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido oxalico, acido maleico, acido malonico, acido succlnico, acido fumarico, acido tartarico, acido cltrico, acido benzoico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido toluensulfonico, acido sulfosalicllico, y similares. Las sales de adicion de alcali farmaceuticamente aceptables pueden formarse con bases inorganicas y organicas.
Bases inorganicas a partir de las cuales las sales pueden derivarse incluyen, por ejemplo, sales y metales de amonio de las columnas I a XII de la Tabla Periodica. En ciertas realizaciones, las sales se derivan a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, hierro, plata, zinc, y cobre; sales particularmente apropiadas incluyen sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio.
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Bases organicas a partir de las cuales pueden derivarse las sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas de ocurrencia natural, aminas dclicas, resinas de intercambio de iones alcalinos, y similares. Ciertas aminas organicas incluyen isopropilamina, benzatina, colinato, dietanolamina, dietilamina, lisina, meglumina, piperazina y trometamina.
Las sales farmaceuticamente aceptables de la presente invencion pueden sintetizarse a partir de una fraccion alcalina o acida, mediante metodos quimicos convencionales. Generalmente, tales sales pueden prepararse al reaccionar formas acidas libres de estos compuestos con una cantidad estequiometrica de la base apropiada (tales como hidroxido, carbonato, bicarbonato de Na, Ca, Mg, o K o similares), o al reaccionar formas alcalinas libres de estos compuestos con una cantidad estequiometrica del acido apropiado. Tipicamente, tales reacciones se realizan en agua o en un solvente organico, o en una mezcla de los dos. Generalmente, el uso de medios no acuosos tipo eter, acetato de etilo, etanol, isopropanol, o acetonitrilo es deseable, donde pueda realizarse. Listas de sales apropiadas adicionales pueden encontrarse, por ejemplo, en “Remington's Farmaceutical Sciences", 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); y en “Handbook of Farmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" de Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002).
A menos que se indique lo contrario, cualquiera formula dada en la presente tambien tiene el proposito de representar formas no marcadas asi como tambien formas isotopicamente marcadas de los compuestos. Los compuestos isotopicamente marcados tienen estructuras representadas por las formulas dadas en la presente excepto que uno o mas atomos son reemplazados por un atomo que tiene un numero de masa o masa atomica seleccionados. Ejemplos de isotopos que pueden incorporarse en compuestos de la invencion incluyen isotopos de hidrogeno, carbono, nitrogeno, oxigeno, fosforo, fluor, y cloro, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F 31P, 32P, 35S, 36Cl, 125I respectivamente. La invencion incluye diferentes compuestos isotopicamente marcados como se definen en la presente, por ejemplo aquellos en los cuales isotopos radioactivos, tales como 3H, y 14C , o aquellos en los cuales isotopos no radioactivos, tales como 2H y 13C estan presentes. Tales compuestos marcados isotopicamente son utiles en estudios metabolicos (con 14C), estudios cineticos de reaccion (con, por ejemplo 2H o 3H), tecnicas de deteccion o visualizacion, tales como tomografia de emision de positrones (PET) o tomografia computarizada de emision de fotones individuales (SPECT) incluyen ensayo de distribucion tisular de sustratos o farmacos, o tratamientos radioactivos de pacientes. En particular, un 18F o un compuesto marcado pueden ser particularmente deseados para estudios PET o SPECT. Los compuestos isotopicamente marcados de la formula (I) pueden generalmente prepararse mediante tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica o mediante procesos analogos a aquellos descritos en los Ejemplos y Preparaciones anexos utilizando un reactivo isotopicamente marcado apropiado en cambio del reactivo no marcado previamente empleado.
Ademas, la sustitucion con isotopos mas pesados, particularmente deuterio (es decir,., 2H o D) puede proporcionar ciertas ventajas terapeuticas que resultan a partir de la mayor estabilidad metabolica, por ejemplo vida media in vivo aumentada o requerimientos de dosificacion reducidos o una mejora en el indice terapeutico. Se entiende que deuterio en este contexto es considerado como un sustituyente de un compuesto de la formula (I). La concentracion de tal isotopo mas pesado, especificamente deuterio, sera definida por el factor de enriquecimiento isotopico. El termino "factor de enriquecimiento isotopico" como se utiliza en la presente se refiere a la relacion entre la abundancia isotopica y la abundancia natural de un isotopo especifico. Si un sustituyente en un compuesto de esta invencion se denota deuterio, tal compuesto tiene un factor de enriquecimiento isotopico para cada atomo de deuterio designado de al menos 3500 (52.5% de incorporation de deuterio en cada atomo de deuterio designado), al menos 4000 (60% de incorporation de deuterio), al menos 4500 (67.5% de incorporacion de deuterio), al menos 5000 (75% de incorporacion de deuterio), al menos 5500 (82.5% de incorporacion de deuterio), al menos 6000 (90% de incorporacion de deuterio), al menos 6333.3 (95% de incorporacion de deuterio), al menos 6466.7 (97% de incorporacion de deuterio), al menos 6600 (99% de incorporacion de deuterio), o al menos 6633.3 (99.5% de incorporacion de deuterio).
Solvatos farmaceuticamente aceptables de acuerdo con la invencion incluyen aquellos en donde el solvente de cristalizacion puede sustituirse isotopicamente, por ejemplo D2O, d6-acetona, d6-DMSO.
Los compuestos de la invencion, es decir, los compuestos de la formula (I) que contienen grupos capaces de actuar como donantes y/o aceptores de enlaces de hidrogeno pueden ser capaces de formar co-cristales con formadores de co-cristales adecuados. Estos co-cristales pueden prepararse de compuestos de la formula (I) mediante procedimientos de formation de cocristales conocidos. Tales procedimientos incluyen trituration, calentamiento, co- sublimacion, co-fundicion, o poner en contacto en solution compuestos de la formula (I) con el formador de co-cristales bajo condiciones de cristalizacion y aislamiento de co-cristales asi formados. Formadores de co-cristales apropiados incluyen aquellos descritos en WO 2004/078163. Por lo tanto la invencion ademas proporciona co-cristales que comprenden un compuesto de la formula (I).
Como se utiliza en la presente, el termino " vehiculo farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes tensoactivos, antioxidantes, conservadores (ej., agentes antibacterianos , agentes antimicoticos), agentes isotonicos, agentes retardantes de absorcion, sales, conservadores, estabilizadores de farmaco, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegracion, lubricantes, edulcorantes, agentes saborizantes, colorantes, y similares y combinaciones de los mismos, como se conocera por aquellos con experiencia en el estado de la tecnica (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289- 1329). Excepto en lo que respecta a cualquier vehiculo convencional incompatible con el ingrediente
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activo, su uso es contemplado en las composiciones terapeuticas o farmaceuticas.
El termino "una cantidad terapeuticamente efectiva" de un compuesto de la presente invencion se refiere a una cantidad del compuesto de la presente invencion que producira la respuesta biologica o medica de un sujeto, por ejemplo, reduccion o inhibicion de una enzima o una actividad proteica, o mejorar slntomas, aliviar condiciones, retardar la progresion de la enfermedad, o prevenir una enfermedad, etc. En una realizacion no limitante, el termino “una cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invencion que, cuando se administra a un sujeto, es efectiva para (1) al menos parcialmente aliviar, inhibir, prevenir y/o mejorar una condicion, o un trastorno o una enfermedad (i) mediada por la cinasa IP3 clase I, o (ii) asociada con actividad de la cinasa PI3 clase I, o (iii) caracterizada por actividad (normal o anormal) de la cinasa PI3 clase I; o (2) reducir o inhibir la actividad de la cinasa PI-3 clase I . En otra realizacion no limitante, el termino "una cantidad terapeuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invencion que, cuando se administra a una celula, tejido, o un material biologico no celular, o un medio, es eficaz, al menos parcialmente para reducir o inhibir la actividad de la cinasa PI3 clase I.
En otra realizacion, el termino "una cantidad terapeuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invencion que, cuando se administra a un sujeto, es eficaz para (1) al menos parcialmente aliviar, inhibir, prevenir y/o mejorar una condicion, o un trastorno o una enfermedad (i) mediada por la cinasa PI3 clase I y mTOR y, o (ii) asociado con la cinasa PI3 clase I y la actividad de mTOR, o (iii) que se caracteriza por la actividad (normal o anormal) de la cinasa PI3 clase I y mTOR, o (2) reducir o inhibir la actividad de la cinasa PI3 clase I y mTOR. En otra realizacion no limitante, el termino "una cantidad terapeuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invencion que, cuando se administra a una celula o tejido, o un material biologico no celular, o un medio, es eficaz al menos parcialmente, para reducir o inhibir la actividad de la cinasa PI3K Clase I y/o mTOR.
Como se utiliza en la presente, el termino “sujeto” se refiere a un animal. Tlpicamente el animal es un mamlfero. Un sujeto tambien se refiere a por ejemplo, primates (ej., humanos, hombres o mujeres), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces, aves y similares. En ciertas realizaciones, el sujeto es un primate. En aun otras realizaciones, el sujeto es un humano.
Como se utiliza en la presente, el termino "inhibir" o "inhibicion" se refiere a la reduccion o supresion de una condicion, slntoma, o trastorno, o enfermedad dada, o una disminucion significativa en la actividad inicial de una actividad o proceso biologico.
Como se utiliza en la presente, el termino “tratar”, o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se refiere en una realizacion, a mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, retardar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los slntomas cllnicos de la misma). En otra realizacion “tratar” o “tratamiento” se refiere a aliviar o mejorar al menos un parametro flsico incluyendo aquellos los cuales pueden ser no discernibles por el paciente. En aun otra realizacion, “tratar” o “tratamiento” se refiere a modular la enfermedad o trastorno, bien sea flsicamente, (ej., estabilizacion de un slntoma discernible), fisiologicamente (ej., estabilizacion de un parametro flsico), o ambos. En aun otra realizacion, “tratar” o “tratamiento” se refiere a prevenir o retardar el comienzo o desarrollo o progresion de la enfermedad o trastorno.
Como se utiliza en la presente, un sujeto esta “en necesidad de” un tratamiento si tal sujeto se beneficia biologicamente, medicamente o mejora su calidad de vida a partir de tal tratamiento.
Como se utiliza en la presente, el termino "un,” "una,” "el”, “los” y terminos similares se utilizan en el contexto de la presente invencion (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) para cubrir formas tanto singulares como plurales a menos que se indique lo contrario o claramente sea contradicho por el contexto.
Todos los metodos descritos en la presente pueden realizarse en cualquier orden apropiado a menos que se indique lo contrario en la presente o de otra manera sea contradicho claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los Ejemplos, o terminologla de ejemplo (ej., "tal como”) proporcionada en la presente pretende solamente ilustrar mejor la invencion y no implica limitacion sobre el alcance de la invencion de otra manera reivindicado.
Cualquier atomo asimetrico (ej., carbono o similares) de los compuestos de la presente invencion puede presentarse en la configuracion racemica o enantiomericamente enriquecida, por ejemplo la configuracion (R)-, (S)- o (R,S)-. En ciertas realizaciones, cada atomo asimetrico tiene al menos 50% de exceso enantiomerico, al menos 60 % de exceso enantiomerico, al menos 70 % de exceso enantiomerico, al menos 80 % de exceso enantiomerico, al menos 90 % de exceso enantiomerico, al menos 95 % de exceso enantiomerico, o al menos 99 % de exceso enantiomerico en la configuracion (R)- o (S)-. Los sustituyentes en atomos con enlaces no saturados pueden, si es posible, estar presentes en la forma cis- (Z)- o trans- (E)-.
En consecuencia, como se utiliza en la presente un compuesto de la presente invencion puede estar en la forma de uno de los posibles isomeros, rotameros, atropisomeros, tautomeros o mezclas de los mismos, por ejemplo, como isomeros geometricos sustancialmente puros (cis o trans), diastereomeros, isomeros opticos (antlpodos), racematos o mezclas de los mismos.
Cualquier mezcla resultante de isomeros puede ser separada sobre la base de las diferencias fisicoqulmicas de los
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constituyentes, en isomeros geometricos u opticos puros o sustancialmente puros, diastereoisomeros, racematos, por ejemplo, mediante cromatografla y/o cristalizacion fraccional.
Cualesquier racematos resultantes de los productos finales o intermediarios pueden ser resueltos en los antlpodos opticos mediante metodos conocidos, por ejemplo, mediante separacion de las sales diastereoisomericas de los mismos, obtenidas con un acido o base optimamente activos, y liberando el compuesto acido o alcalino opticamente activo. En particular, una fraccion alcalina puede emplearse para separar los compuestos de la presente invencion en sus antlpodos opticos, por ejemplo, mediante cristalizacion fraccional de una sal formada con un acido opticamente activo, por ejemplo, acido tartarico, acido dibenzoil tartarico, acido diacetil tartarico, acido di-O,O'-p-toluoil tartarico, acido mandelico, acido malico o acido alcanfor-10-sulfonico. Los productos racemicos tambien pueden separarse mediante cromatografla quiral, por ejemplo, cromatografla llquida de alta presion (HPLC) utilizando un absorbente quiral.
Ademas, los compuestos de la presente invencion, incluyendo sus sales, tambien pueden obtenerse en la forma de sus hidratos, o incluir otros solvatos utilizados para su cristalizacion. Los compuestos de la presente invencion pueden inherentemente o por diseno formar solvatos con solvatos farmaceuticamente aceptables (incluyendo agua); por lo tanto, se pretende que la invencion incluya formas tanto solvatadas como no solvatadas. El termino "solvato" se refiere a un complejo molecular de un compuesto de la presente invencion (incluyendo sales farmaceuticamente aceptables de los mismos) con una o mas moleculas solventes. Tales moleculas solventes son aquellas comunmente utilizadas en el estado de la tecnica farmaceutica, las cuales son conocidas por ser inocuas para el receptor, por ejemplo, agua, etanol, y similares. El termino "hidrato" se refiere al complejo donde la molecula solvente es agua.
Los compuestos de la presente invencion, incluyendo sales, hidratos y solvatos de los mismos, pueden inherentemente o por diseno formar polimorfos.
Los compuestos de la presente invencion pueden sintetizarse mediante rutas sinteticas que incluyen procesos analogos a aquellos bien conocidos en las artes qulmicas, particularmente a la luz de la descripcion contenida en la presente. Los materiales de inicio generalmente estan disponibles de fuentes comerciales o se pueden preparar facilmente utilizando metodos bien conocidos por aquellos con experiencia en el estado de la tecnica (ej., preparados mediante metodos generalmente descritos en Louis F. Fieser y Mary Fieser, Reactivos para Slntesis Organica, v. 119, Wiley, New York (1967-1999 ed.), o Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin, que incluyen suplementos (tambien disponibles via la base de datos Beilstein en llnea)).
Para propositos ilustrativos, el esquema de reaccion ilustrado a continuation proporciona rutas potenciales para sintetizar los compuestos de la presente invencion as! como tambien intermediarios claves. Para una descripcion mas detallada de los pasos de reaccion individuales, ver la section de Ejemplos a continuacion. Aquellos con experiencia en el estado de la tecnica apreciaran que otras rutas sinteticas pueden utilizarse para sintetizar los compuestos novedosos. Aunque se ilustran materiales de inicio especlficos y reactivos en los esquemas y se discuten a continuacion, otros materiales y reactivos de inicio pueden facilmente sustituirse para proporcionar una variedad de derivados y/o condiciones de reaccion. Ademas, muchos de los compuestos preparados mediante los metodos descritos a continuacion pueden ademas modificarse a la luz de esta divulgation usando qulmica convencional bien conocida por aquellos con experiencia en el estado de la tecnica.
En la preparation de los compuestos de la presente invencion, la protection de la funcionalidad remota (ej., grupos hidroxilo) de intermediarios puede ser necesaria. La necesidad para tal proteccion variara dependiendo de la naturaleza de la funcionalidad remota y las condiciones de los metodos de preparacion. Grupos protectores de hidroxilo adecuados incluyen eteres de trialquilsililo donde uno o dos de los grupos alquilo puede ser sustituidos con fenilo. La necesidad de tal proteccion se determina facilmente por un experto en la tecnica. Para una descripcion general de grupos protectores y su uso, vease TW Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991.
Tlpicamente, los compuestos de la formula (I) pueden prepararse de acuerdo con los metodos proporcionados a continuacion.
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En una realizacion, la invention se refiere a un proceso para la fabrication de un compuesto de formula (I) que comprende los pasos a y b.
En una realizacion, la invencion se refiere a un proceso para la fabricacion de un compuesto de formula (I) (Metodo 5 A) que comprende los pasos a y b.
El compuesto de la formula (I) se obtiene a traves del paso a) de acoplamiento del compuesto de formula (A), en la que R3 es como se define para un compuesto de la formula (I) anterior
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con un compuesto de la formula (B), en la que R1 y R2 son como se definen para un compuesto de la formula (I) 10 anterior,
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para formar un compuesto de la formula (C), en la que R1, R2 y R3 son como se definen para un compuesto de la formula (I) anterior,
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seguido del paso b) de acoplamiento del compuesto de la formula (C) con un compuesto de la formula (D), en donde -B (OR')2 representa un acido boronico clclico o aclclico o derivado de acido boronico, tal como pinacolato-boro,
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En casos en que un grupo protector esta presente, se anade un paso de desproteccion para convertir el compuesto 10 protegido de la formula (I) en el compuesto de la formula (I).
El paso a) se realiza en presencia de una base tal como NaH. La reaccion se lleva a cabo en presencia de un disolvente organico tal como DMF a temperaturas de 0 a 80 ° C durante 20 a 30 min. Alternativamente, la reaccion puede llevarse a cabo bajo condiciones habituales de Buchwald-Hartwig utilizando un ligando tal como Xantphos, X-Phos o 2-di-t- butilfosfino-2'-(N, N-dimetilamino) bifenilo con un catalizador de paladio tal como Pd2 (dba)3 o Pd2 (dba) 3 • CHCl3 o 15 Pd (OAc)2, preferentemente Pd2 (dba)3 con Xantphos, en presencia de una base tal como Cs2CO3 o preferiblemente ter-BuONa, en un disolvente organico tal como un eter, preferiblemente dioxano o THF. La reaccion se agita preferiblemente un una temperatura de aproximadamente 80 a 120 ° C. La reaccion se lleva a cabo preferiblemente bajo un gas inerte tal como nitrogeno o argon. Las condiciones tlpicas de reaccion conocidas en el campo para las reacciones de Buchwald-Hartwig se pueden aplicar al presente proceso.
2 0 El paso b) se lleva a cabo en presencia de un catalizador, tal como un catalizador de Pd(0), por ejemplo, PdCl2 (dppf)-
CH2Cl2, opcionalmente en la presencia de una o mas ayudas de reaccion, tales como una base, por ejemplo, una
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base acuosa, tal como Na2CO3 acuoso, opcionalmente en presencia de uno o mas diluyentes, solventes polares, en particular, por ejemplo, DME. La reaccion se agita a una temperatura de 80-120 °C aproximadamente. La reaccion puede llevarse a cabo bajo un gas inerte tal como nitrogeno o argon. Las condiciones tlpicas de reaccion conocidas en el campo para las reacciones de Suzuki se pueden aplicar al presente proceso.
Alternativamente, los compuestos de la formula (I) tambien se pueden sintetizar mediante la realizacion del paso b), seguida del paso a) (Metodo B).
La invencion tambien incluye cualquier variante de estos procesos, en los cuales un producto intermediario obtenible en cualquier paso de los mismos se utiliza como material de partida y el resto de pasos se llevan a cabo, o en los que los materiales de partida se forman in situ bajo condiciones de reaccion, o en los cuales los componentes de reaccion se utilizan en la forma de sus sales o material opticamente puro.
Los compuestos de la invencion y los intermediarios tambien se pueden convertir unos a otros de acuerdo con metodos generalmente conocidos por expertos en el estado de la tecnica.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la presente invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
La composicion farmaceutica se puede formular para determinadas rutas de administracion tales como administracion topica; administracion enteral, tales como por ejemplo oral o rectal, y administracion parenteral, tal como por ejemplo intravenosa, intramuscular o subcutanea. Ademas, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden ser hechas en una forma solida (incluyendo sin limitacion capsulas, tabletas, pastillas, granulos, polvos o supositorios), o en forma llquida (incluyendo, sin limitacion, soluciones, suspensiones o emulsiones). Las composiciones farmaceuticas pueden preparse de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica. Las composiciones farmaceuticas pueden someterse a operaciones farmaceuticas convencionales tales como esterilizacion y/o pueden contener diluyentes inertes convencionales, agentes lubricantes, o agentes amortiguadores, as! como tambien adyuvantes, tales como conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, emulsificadores y amortiguadores, etc.
Composiciones apropiadas para aplicacion topica, por ejemplo, a la piel y ojos, incluyen soluciones acuosas, suspensiones, unguentos, cremas, geles, povos, aceites o formulaciones en atomizador, por ejemplo, para liberacion mediante aerosol o similares. Tales sistemas de suministro topico seran en particular apropiados para aplicacion dermica, por ejemplo, para su uso en cremas, lociones, aerosoles y similares. Por lo tanto son particularmente apropiados para utilizar en formulaciones topicas incluyendo formulaciones cosmeticas bien conocidas en el estado de la tecnica. Tales pueden contener solubilizantes, estabilizadores, agentes mejoradores de tonicidad, amortiguadores y conservadores.
Como se utiliza en la presente una aplicacion topica tambien se refiere a una inhalacion o a una aplicacion intranasal por ejemplo al sistema respiratorio. Estas pueden ser convenientemente liberadas en la forma de un polvo seco (bien sea solo, como una mezcla, por ejemplo una mezcla seca con lactosa, o como partlculas de componentes mixtos, por ejemplo con fosfollpidos) a partir de un inhalador de polvo seco o una presentacion de aerosol a partir de un recipiente presurizado, bomba, atomizador, atomizador o nebulizador, con o sin el uso de un propulsor apropiado.
En el contexto de la presente invencion, la aplicacion se refiere preferiblemente a aplicacion topica tal como la aplicacion epicutanea en una composicion adecuada que comprende un compuesto de la presente invencion, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un vehlculo farmaceuticamente y dermatologicamente aceptable. Las composiciones adecuadas para la aplicacion epicutanea pueden comprender todas las formas farmaceuticas normalmente utilizadas para esta ruta de administracion y son bien conocidas en la tecnica, incluyendo soluciones, geles, lociones, suspensiones, cremas, polvos, aceites, unguentos, espumas, espumas, emulsiones, microemulsiones, leches, sueros, aerosoles, pulverizaciones, dispersiones, microcapsulas, veslculas y micropartlculas de los mismos. Estas composiciones son formuladas de acuerdo con tecnicas convencionales.
Como se usa en este documento, el termino "vehlculo dermatologicamente aceptable", es un vehlculo que es adecuado para aplicacion topica en el tejido queratinoso, tiene buenas propiedades esteticas, es compatible con los agentes activos de la presente invencion y cualquier otro componente, y no causara ninguna seguridad desfavorable o problemas de toxicidad.
El vehlculo dermatologicamente aceptable puede estar en una amplia variedad de formas. Por ejemplo, los vehlculos de emulsion, incluyendo, pero no limitado a, aceite-en-agua, agua-en-aceite, agua-en-aceite-en-agua, y emulsiones de aceite-en-agua-en-silicio, son utiles en la presente. Como se entendera por el experto en la materia, un componente dado se distribuira principalmente en la fase de agua o de aceite/silicona, dependiendo de la solubilidad en agua/dispersabilidad del componente en la composicion.
La composicion adecuada para la aplicacion epicutanea, si se desea, puede contener varios aditivos conocidos, tales como excipientes, aglutinantes, lubricantes, y disgregantes. Si se desea, tambien puede contener materiales oleosos tales como diversas grasas, aceites, ceras, hidrocarburos, acidos grasos, alcoholes superiores, aceites de esteres, jabones metalicos, extractos animales o vegetales, agentes gelificantes hidrofilos o lipofilos, agentes activos hidrofilos o lipofilos, otros componentes tales como vitaminas, aminoacidos, agentes tensioactivos, colorantes, tintes, pigmentos,
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perfumes, absorbentes de olor, antisepticos, bactericidas, conservantes, humectantes, espesantes, solventes, cargas, antioxidantes, agentes secuestrantes, filtros solares, y similares, y combinaciones de los mismos, como serla conocido por los expertos en la tecnica, siempre y cuando sean compatibles con el ingrediente activo.
Ejemplos de aceites adecuados incluyen aceites minerales, aceites vegetales tales como aceite de cacahuate, aceite de sesamo, aceite de soya, aceite de cartamo, aceite de girasol, aceites animales tales como lanolina o perhidroescualeno, aceites sinteticos tales como aceite de Purcellin, aceites de silicona tales como ciclometicona entre otros. Alcoholes grasos, acidos grasos tales como acido estearico y ceras tales como cera de parafina, cera de carnauba o cera de abejas tambien se pueden usar como grasas.
La composition tambien puede contener agentes emulsionantes, solventes, agentes gelificantes hidrofilos, agentes gelificantes lipofilos, sales metalicas de acidos grasos, agentes activos hidrofilos o agentes activos lipofilos.
Los compuestos de la formula (I) en forma libre o en forma de sal, exhiben propiedades farmacologicas valiosas, por ejemplo, propiedades moduladoras de la cinasa PI3 tales como propiedades moduladoras de la cinasa PI3 clase I (Pl3K clase I) o propiedades moduladoras de PI3K en combination con las propiedades moduladoras de mTOR, por ejemplo, como se indica en pruebas in vitro e in vivo como las previstas en la section experimental, y por lo tanto se indican para la terapia o para su uso como productos qulmicos de investigation, por ejemplo, como compuestos herramienta.
Los compuestos de la formula (I) en forma libre o en forma de sal, son utiles en el tratamiento de enfermedades dependientes de la cinasa PI3 clase I, especialmente enfermedades que dependen de las isoformas a y p de la PI3K clase I, as! como enfermedades que dependen de las cinasas PI3 clase I, especialmente enfermedades que dependen de las isoformas a y p de la PI3K clase I, en conjuncion con la mTOR.
Los compuestos que inhiben la actividad de las isoformas a y p de la PI3K clase I, en particular compuestos que son sustancialmente equipotentes de las isoformas a y p PI3K clase I y opcionalmente inhiben tambien la actividad de mTOR, se considera que son de beneficio debido a que tales compuestos se considera tienen la capacidad de evitar los mecanismos de adaptation debido a recableado de via a traves de las otras isoformas, en comparacion con compuestos con especificidad unica, por ejemplo, especificidad para un miembro de la familia PI3K clase I. Por "equipotente", se entiende que los compuestos inhiben varias isoformas a un grado comparable, por ejemplo, tal como se mide en un ensayo enzimatico o celular descrito en este documento.
Adecuadamente, los compuestos de la formula (I) muestran fotoestabilidad suficiente con el fin de asegurar y maximizar la actividad de los compuestos de la formula (I) cuando se administra de manera epicutanea para reducir al mlnimo el potencial de irritation y los efectos secundarios debido a los productos de degradation generados. Los compuestos con fotoestabilidad superior simplificaran el desarrollo tecnico y el suministro debido a los riesgos minimizados de fotodegradacion. Adecuadamente, los compuestos de formula (I) muestran una buena potencia en ensayos celulares utilizando llneas de celulas humanas derivadas de carcinoma de celulas escamosas cutaneas. Los compuestos preferidos deben demostrar la capacidad de penetrar en la piel.
Los compuestos de la invention pueden ser utiles en el tratamiento de una indication seleccionada de, pero no limitado a los canceres de piel no melanoma, como el carcinoma de celulas basales y el carcinoma de celulas escamosas; sus etapas pre-malignas, tales como la queratosis actlnica, queratosis solar y piel cronicamente danada por el sol, y otros trastornos hiperproliferativos de la piel causadas por la desregulacion de los fibroblastos de la piel, tales como fibrosis de la piel, escleroderma, cicatrices hipertroficas o queloides. Los compuestos de la invencion pueden ser particularmente utiles en el tratamiento de una indicacion seleccionada de, pero no limitada a los canceres de piel no melanoma.
Todos los metodos descritos en la presente pueden realizarse en cualquier orden apropiado a menos que se indique lo contrario en la presente o de otra manera sea contradicho claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los Ejemplos, o terminologla de ejemplo (ej., "tal como”) proporcionada en la presente pretende solamente ilustrar mejor la invencion y no implica limitation sobre el alcance de la invencion de otra manera reivindicado.
En ciertos casos, puede ser ventajoso administrar el compuesto de la presente invencion en combinacion con al menos un agente farmaceutico adicional (o terapeutico) (por ejemplo, un agente anti-proliferativo o anti-cancer o terapia adjunta tlpicamente usado en la quimioterapia). El compuesto de la presente invencion se puede administrar ya sea simultaneamente con, o antes o despues de, uno o mas de otros agentes terapeutico (s). Alternativamente, el compuesto de la presente invencion puede administrarse de manera separada, mediante la ruta de administration igual o diferente, o juntas en la misma composicion farmaceutica que los otros agentes.
En una realization, la invencion proporciona un producto que comprende un compuesto de la formula (I) y al menos otro agente terapeutico como una preparation combinada para uso simultaneo, separado o secuencial en terapia. En una realizacion, la terapia es el tratamiento de una enfermedad o condition dependiente de cinasas PI3. Los productos proporcionados como una preparacion combinada incluyen una composicion que comprende el compuesto de la formula (I) y los otros agentes terapeuticos en la misma composicion farmaceutica, o el compuesto de la formula (I) y los otros agentes terapeuticos en forma separada, por ejemplo, en forma de un kit.
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En una realizacion, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la formula (I) y otros agentes terapeuticos. Opcionalmente, la composicion farmaceutica puede comprender un excipiente farmaceuticamente aceptable, como se describio anteriormente.
En una realizacion, la invencion proporciona un kit que comprende dos o mas composiciones farmaceuticas separadas, al menos una de las cuales contiene un compuesto de la formula (I). En una realizacion, el kit comprende medios para retener de manera separada dichas composiciones, tales como un recipiente, botella dividida, o empaque dividido en aluminio. Un ejemplo de tal kit es paquete de burbujas, como el que tlpicamente se utiliza para empacar tabletas, capsulas y similares.
El kit de la invencion puede utilizarse para administrar diferentes formas de dosificacion, por ejemplo, oral y parenteral, para administrar las composiciones separadas a diferentes intervalos de dosificacion, o para titular las diferentes composiciones entre si. Para ayudar en el cumplimiento terapeutico, el kit de la invencion tlpicamente comprende pautas para administracion.
Por consiguiente, la invencion proporciona el uso de un compuesto de la formula (I) para tratar una enfermedad o condition mediada por las cinasas PI3, en donde el medicamento es preparado para administracion con otro agente terapeutico. La invencion tambien proporciona el uso de otro agente terapeutico para tratar una enfermedad o condicion mediada por las cinasas PI3, en donde el medicamento se administra con un compuesto de la Formula (I).
La invencion tambien proporciona un compuesto de la formula (I) para utilizar en un metodo de tratar una enfermedad o condicion mediada por la cinasa PI3 clase I o mediada por la cinasa PI3 clase I y mTOR, en donde el compuesto de la formula (I) se prepara para administracion con otro agente terapeutico. La invencion tambien proporciona otro agente terapeutico para utilizar en un metodo de tratar una enfermedad o condicion mediada por la cinasa PI3 clase I o mediada por la cinasa PI3 clase I y mTOR, en donde el otro agente terapeutico se prepara para administracion con un compuesto de la formula (I). La invencion tambien proporciona un compuesto de la formula (I) para utilizar en un metodo de tratar una enfermedad o condicion mediada por la cinasa PI3 clase I o mediada por la cinasa PI3 clase I y mTOR, en donde el compuesto de la formula (I) se administra con otro agente terapeutico. La invencion tambien proporciona otro agente terapeutico para utilizar en un metodo de tratar una enfermedad o condicion mediada por la cinasa PI3 clase I o mediada por la cinasa PI3 clase I y mTOR, en donde el otro agente terapeutico se administra con un compuesto de la formula (I).
La invencion tambien proporciona el uso de un compuesto de la Formula (I) para tratar una enfermedad o condicion mediada por la cinasa PI3 clase I o mediada por la cinasa PI3 clase I y mTOR en donde el paciente se ha tratado previamente (ej., dentro de las 24 horas) con otro agente terapeutico. La invencion tambien proporciona el uso de otro agente terapeutico para tratar una enfermedad o condicion mediada por la cinasa PI3 clase I o mediada por la cinasa PI3 clase I y mTOR en donde el paciente se ha tratado previamente (ej., dentro de las 24 horas) con un compuesto de la formula (I).
En una realizacion, el otro agente terapeutico se selecciona de agentes terapeuticos adecuados para el tratamiento de canceres de piel no melanoma, como el carcinoma de celulas basales y el carcinoma de celulas escamosas; sus etapas pre-malignas, tales como la queratosis actlnica, queratosis solar y la piel cronicamente danada por el sol. Adecuadamente, estos otros agentes terapeuticos pueden ser seleccionados a partir de compuestos inmunoestimulantes por ejemplo agonistas de los receptores tipo Toll, tales como imiquimod (Aldara ®), o de agentes anti-inflamatorios como el diclofenaco (Solaraze ®).
La composicion farmaceutica o combination de la presente invencion pueden ser tlpicamente en dosificacion unitaria de 1- 1000 mg aproximadamente de ingrediente activo para un sujeto de 50-70 kg aproximadamente, o 1-500 mg aproximadamente o 1-250 mg aproximadamente o 1-150 mg aproximadamente o 0.5-100 mg aproximadamente, o 150 mg aproximadamente de ingredientes activos. La dosificacion unitaria tambien puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 mg de ingrediente activo para un sujeto de 50 a 70 kg aproximadamente, o de 50 a 500 mg aproximadamente o de 50 a 250 mg aproximadamente o de 50 a 150 mg aproximadamente o de 50 a 100 mg aproximadamente de ingredientes activos. La dosificacion puede depender de la forma de dosificacion particular utilizada para suministrar el ingrediente activo. En general, la dosis terapeuticamente eficaz de un compuesto, la composicion farmaceutica, o las combinaciones de los mismos, es dependiente de la especie del sujeto, el peso corporal, la edad y condicion individual, el trastorno o la enfermedad o la gravedad de la misma que se esta tratando. La dosificacion tambien puede depender de la biodisponibilidad del ingrediente activo en la especie siendo tratada. Un medico, farmaceuta, medico cllnico o veterinario de experiencia comun puede determinar facilmente la cantidad efectiva de cada uno de los ingredientes activos necesarios para prevenir, tratar o inhibir el progreso del trastorno o enfermedad.
Las propiedades de dosificacion antes citadas son demostrables en pruebas in vitro y in vivo utilizando de manera ventajosa mamlferos, por ejemplo, ratones, ratas, perros, monos u organos aislados, tejidos y preparaciones de los mismos. Los compuestos de la presente invencion se pueden aplicar in vitro en la forma de soluciones, por ejemplo soluciones acuosas preparadas a partir de, por ejemplo, solution concentrada de DMSO 10 mM, e in vivo ya sea por via enteral, parenteral, ventajosamente por via intravenosa o por via topica, por ejemplo, como una suspension, en solucion acuosa o en otras soluciones, tales como por ejemplo, en solucion a base de glicol propileno. La dosificacion
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in vitro puede estar en el rango entre concentraciones 10'3 molar y 10'9 molar aproximadamente. Una cantidad terapeuticamente efectiva in vivo puede estar en el rango dependiendo de la ruta de administracion, entre 0.1 y 500 mg/kg aproximadamente, o entre 1 y 100 mg/kg aproximadamente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos tienen el proposito de ilustrar la invencion y no deben interpretarse como limitaciones de la misma. Las temperaturas son dadas en grados centigrados. Si no se menciona lo contrario, todas las evaporaciones son realizadas bajo presion reducida, preferiblemente entre 15 mm Hg y 100 mm Hg aproximadamente (=20-133 mbar). La estructura de los productos finales, intermediarios y materiales de inicio es confirmada por metodos anallticos estandar, por ejemplo, microanalisis y caracterlsticas espectroscopicas, por ejemplo, MS, iR, RMN. Las abreviaturas utilizadas son las convencionales en la tecnica.
Todos los materiales de inicio, componentes fundamentales (materia prima), reactivos, acidos, bases, agentes deshidratantes, solventes y catalizadores utilizados para sintetizar los compuestos de la presente invencion estan comercialmente disponibles o pueden producirse mediante metodos de slntesis organica conocidos por alguien con habilidad comun en el estado de la tecnica (Houben- Weyl 4th Ed. 1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volume 21). Ademas, los compuetos de la presente invencion pueden producirse mediante metodos de slntesis organica conocidos por un experto en el estado de la tecnica como se muestra en los siguientes ejemplos.
A menos que se especifique lo contrario, los materiales de inicio generalmente estan disponibles de fuentes comerciales tales como Aldrich Chemicals Co. (Milwaukee, Wis.), Lancaster Synthesis, Inc. (Windham, N.H.), Acros Organics (Fairlawn, N.J.), Maybridge Chemical Company, Ltd. (Cornwall, England), Tyger Scientific (Princeton, N.J.), y AstraZeneca Pharmaceuticals (London, England).
Abreviaturas
Las abreviaturas utilizadas en los siguientes Ejemplos tienen los correspondientes significados listados a continuacion.
AcOH acido acetico
Aq acuoso
Ax axial
Boc ter- butoxicarbonilo
Salmuera Solucion de cloruro de sodio saturado (a temperatura ambiente)
Br s singulete amplio
CDCl3 cloroformo deuterado
CHCb-d cloroformo deuterado
CH2O2 diclorometano
CH3CN acetonitrilo
conc. concentrado
CsF fluoruro de cesio
CuSO4 Sulfato de cobre
d doblete
DIPEA di- isopropiletil- amina
DME dimetoxietano
DMF N,N-dimetilformamida
DMSO dimetilsulfoxido
DMSO-d6 dimetilsulfoxido deuterado
dppf 1,1 '- bis (difenilfosfino) ferroceno
eq ecuatorial
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ESI-MS
Espectrometrla de masas por electroatomizacion
Et2O
eter dietllico
EtOH
etanol
EtOAc
acetato de etilo
h
horas
Hyflo
Hyflo Super Cel®
1HRMN
resonancia magnetica nuclear protonica
KO
Acacetato de potasio
KHSO4
sulfato acido de potasio
K2CO3
carbonato de potasio
LC-MS
cromatografla de llquidos- espectrometrla de masas
LDA
diisopropilamina de litio
MeOH
metanol
MgSO4
sulfato de magnesio
M
molar
m
multiplo
MS
espectrometrla de masas
min
minutos
mL
mililitros
m.p.
punto de fusion
MgSO4
sulfato de magnesio
MHz
megahertz
N
normal
NaHMDS
Hexametildisilazano de sodio
NMR
resonancia magnetica nuclear
NEt3
trietilamina
Na2S2O3
tiosulfato de sodio
Na2SO4
sulfato sodico
Pd2(dba)3
tris(dibencilidenoacetona)dipaladio (0)
PdCh(dppf)
dicloruro de 1,1 '- bis(difenilfosfino) ferroceno paladio (II)
PdCl2(dppf).CH2Cl2 Complejo de dicloruro 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno-paladio(II) - diclorometano
PPh3
trifenilfosfina
Pd(PPh3)4
tetrakis(trifenilfosfina)paladio
Pd
paladio
qt
quinteto
Raney-Ni
nlquel de Raney
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temperatura ambiente
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Rt
S
SiO2
t
TBAF
TBDPSCI
TBME
TFA
THF
TLC
tR
UV
UPLC:
Factor de retencion (TLC)
tiempo de retencion
singulete
gel de sllice
triplete
fluoruro de tetrabutilamonio Cloruro de ter-butildifenilsililo ter-butilmetileter acido trifluoroacetico tetrahidrofurano cromatografla de capa delgada tiempo de retencion ultravioleta
Cromatografla de llquidos de ultra desempeno
Metodos generales
Las mediciones 1H-RMN se realizaron en un espectrometro Bruker UltrashieldTM 400 (400 MHz), Bruker Ultrashield™ 600 (600 MHz) o Bruker DRX 500 MHz CryoProbe (500 MHz) con o sin tetrametilsilano como patron interno. Los desplazamientos qulmicos (valores d) se presentan en ppm campo abajo de tetrametilsilano, constantes de acoplamiento (J) se dan en Hz, los patrones de particion espectros se designan como singulete (s), doblete (d), doblete de doblete (dd), triplete (t ), cuadruplete (q), multiplete o mas senales solapadas (m) y senal amplia (br). Los solventes se dan en parentesis.
TLC se realizo con placas de vidrio previamente recubiertas con gel de sllice 60 F254 (Merck, Darmstadt, Alemania) utilizando los respectivos sistemas solventes nombrados. La visualizacion generalmente se hizo por luz UV (254 nm).
LC- MS
LC- MS- Metodo 1:
Columna: Acquity HSS T3, 1.8 pm, 2.1 x 50 mm;
Eluyente: Agua (+ acido formico al 0.05% + acetato de amonio 3.75 mM): acetonitrilo (acido formico + 0.04%), de 95:5 a 2:98 en 1.4 min, se mantuvo 98% durante 0.75 min;
Tasa de flujo/temperatura: 1.0 mL/min a 60°C
LC- MS- Metodo 2:
Columna: Acquity HSS T3, 1.8 pm, 2.1 x 50 mm;
Eluyente: Agua (+ acido formico al 0.05% + acetato de amonio 3.75 mM) : acetonitrilo (acido formico + 0.04%), de 98:2 a 2:98 en 1.4 min, se mantuvo 98% durante 0.75 min;
Tasa de flujo/temperatura: 1.2 mL/min a 50°C
UPLC 1
Columna: Acquity UPLC HSS T3 C18, 1.7 pm 2.1 x 50 mm, Flujo: 1.0 mL/min. Gradiente: 5% a 100% B en 1.5 min, 100% B durante 1 min, A = agua + TFA al 0.1%, B = acetonitrilo + TFA al 0.1%
Deteccion: 218 nm o 254 nm
Slntesis de intermediarios de ester borico
Los intermediarios de ester borico utilizados en la preparacion de los compuestos de la presente invencion estan comercialmente disponibles o pueden prepararse como se describe en la literatura, o de una manera analoga, o
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pueden prepararse como se describe a continuacion, o de una manera analoga.
Intermediario 1: 5 - (4,4,5,5- tetrametil- 1, 3,2- dioxaborolan- 2- il)- 4- trifluorometil) pirimidin- 2- amina
a) 5- Bromo- 4- trifluorometil- pirimidin-
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2- ilamina
A una solucion de 2- amino- 4- trifluorometilpirimidina (25 g, 0.15 moles) en CH3CN (600 ml) se anadio una solucion en la oscuridad de N- bromosuccinimida (34.8 g, 195 milimoles) en acetonitrilo (200 ml) durante un perlodo de 2.5 h. La mezcla de reaccion se agito durante 4.5 h a temperatura ambiente y luego se concentro. El residuo se disolvio en EtOAc y H2O, los solventes organicos se separaron, se lavaron con H2O y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purifico por cromatografla en columna utilizando EtOAc en hexano del 10% a 40% para proporcionar el compuesto del tltulo como un solido de color beige (31.2 g, 85%). LC- MS: Rt 0.82 min; (LCMS Metodo 2).
b) 5 - (4,4,5,5- tetrametil- 1, 3,2- dioxaborolan- 2- il) - 4 - (trifluorometil) pirimidin- 2- amina
A una suspension de 5- bromo- 4- trifluorometil- pirimidin- 2- ilamina (16.2 g, 66.3 milimoles), bis- pinacolatodiboron (18.5 g, 72.9 milimoles) y KOAc (19.5 g, 199 milimoles) en dioxano (300 ml) en atmosfera de argon se anadio aducto PdCl2(dppf)CH2Cl2 (2.44 g, 2.98 milimoles) y la mezcla se agito durante 4 horas a 115 °C. La mezcla de reaccion se enfrio a 50 °C y se trato con EtOAc. La suspension resultante se filtro a traves de Hyflo y se lavo con EtOAc. El filtrado combinado se concentro. El residuo se suspendio en NaOH 2 M, se agito a temperatura ambiente durante 5 min y despues se anadio Et2O y H2O. La mezcla binaria se filtro de nuevo a traves de Hyflo y se separaron las fases. El pH de la capa acuosa resultante se ajusto a 5- 6 con HCl 4 M acuosa, y el producto se extrajo con EtOAc. Los extractos combinados se lavaron con H2O y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se trituro en Et2O/hexano, se filtro y se seco para proporcionar el compuesto del tltulo como un solido de color amarillo claro (8.33 g, 42%). LC- MS: [M+H] 290.2; Rt 1.00 min; (LCMS Metodo 2).
Slntesis de los intermediarios de oxazolidinona
Intermediario 2: (4S *, 5S *)- 4- etil- 5- (4- metoxifenil) oxazolidin- 2- ona
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a) (1S *, 2S *) - 1 - (4- metoxifenil)- 2- nitrobutan- 1- ol
A una solucion de LiAlH4 (2 M en THF) (1.84 ml, 3.67 milimoles) en THF seco (100 ml), que se habla agitado durante 30 min a 0 °C, se anadio 1- nitropropano (16.3 ml, 184 milimoles) en atmosfera de argon. Despues de 30 min, se anadio el 4- metoxi- benzaldehldo (4.45 ml, 36.7 milimoles) en una porcion. La mezcla se agito durante 6 horas a 0 °C y 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se apago con HCl (1 M en H2O) y se extrajo con CH2O2. Las capas organicas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna usando CH2O2 en hexano de 0% a 100% para proporcionar el compuesto del tltulo (1.4 g, 34%). 1H RMN (600 MHz, DMSO- d6): 7.35 (d, 2H), 6.94 (d, 2H), 5.94 (d, 1 H), 4.80 (dd, 1H), 4.684.52 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 1.75- 1.69 (m, 1H), 1.25- 1.20 (m, 1H), 0.74 (t, 3H).
b) (1S *, 2S *)- 2- amino- 1- (4- metoxifenil) butan- 1- ol
Una solucion de (1S *, 2S *) - 1 - (4- metoxifenil)- 2- nitrobutan- 1- ol (1.0 g, 4.44 milimoles) en etanol (20 ml) se purgo
con argon, y se anadio Pd/C (100 mg, 0.094 milimoles) a temperatura ambiente. El recipiente sellado se purgo y se volvio a llenar con H2 y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reaccion se filtro sobre celite, se lavo con etanol y se concentro. El residuo se purifico por cromatografla en columna utilizando CH2Cl2/MeOH/(NH4OH en H2O) de 100:0:0 a 80:20:1 para proporcionar el compuesto del tltulo como un solido blanco 5 (450 mg, 51.4%). LC- MS: [M+H] 196.1; Rt 0.44 min; (LCMS Metodo 2).
c) (4S *, 5S *)- 4- etil- 5- (4- metoxi- fenil) oxazolidin- 2- ona
A una solucion de (1S *, 2S *)- 2- amino- 1- (4- metoxifenil) butan- 1- ol (440 mg, 2.25 milimoles) en CH2O2 (15 ml) se anadio en atmosfera de argon NEt3 (0.78 ml, 5.63 milimoles) a 0 °C. Luego se anadio difosgeno durante un perlodo de 5 minutos y la temperatura se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos. La mezcla de reaccion se apago con agua 10 helada y una solucion acuosa 2 M de Na2CO3, se extrajo con CH2Cl2, se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro. El residuo se trituro con TBME, se filtro y se seco para proporcionar el intermediario 2 [(4S *, 5S *)- 4- etil- 5- (4- metoxifenil) oxazolidin- 2- ona] como un polvo blanco (220 mg, 44%). LC- MS: [M+H] 222.2; Rt 0.77 min; (LCMS Metodo 2). 1H RMN (600 MHz, DMSO- d6): 7.94 (br s, 1H), 7.32 (d, 2H), 6.96 (d, 2H), 5.06 (d, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.51 (q , 1H), 1.53 (qt, 2H), 0.85 (t, 3H).
15 Intermediario 3: (4S *, 5S *)- 4- etil- 5- (3- metoxifenil) oxazolidin- 2- ona
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El compuesto del tltulo se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito para el intermediario 2 [(4R *, 5R *)- 4- etil- 5- (4- metoxi- fenil) oxazolidin- 2- ona] para proporcionar el intermediario 3 como un aceite incoloro. LC- MS: [M+H] 222.1; Rt 0.79 min; (LCMS Metodo 2). 1H RMN (600 MHz, DMSO- d6): 7.98 (br s, 1H), 7.35- 7.29 (m, 1H), 6.83- 6.96 20 (m, 3H), 5.10 (d, 1H), 3.72- 3.78 (m, 3H), 3.36- 3.29 (m, 1H), 1.49- 1.63 (m, 2H), 0.88 (t, 3H).
Intermediario 4: (4S *, 5R *)- 4- etil- 5- feniloxazolidin- 2- ona
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El compuesto del tltulo se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito para el intermediario 2 [(4R *, 5R *)- 4- etil- 5- (4- metoxi- fenil) oxazolidin- 2- ona] para proporcionar el intermediario 4 como un solido blanco. LC- MS: [M+H] 25 192.1; Rt 0.77 min; (LCMS Metodo 2)
Intermediario 5: (4S, 5S)- 4- metil- 5- feniloxazolidin- 2- ona
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en 20 ml de CH2CI2, y la temperatura se dejo calentar desde 0 °C a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se agito durante 4 horas a temperatura ambiente. Luego la mezcla de reaccion se apago mediante la adicion de NH4Cl acuoso. Las capas organicas se separaron, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna usando EtOAc en heptano del 0% a l0o% con el fin de proporcionar el producto deseado (2.10 g, 89%). LC- MS: [M+H] 178.1; Rt 0.67 min; (LCMS Metodo 2). 1H RMN (400 MHz, DMSO- da) 7.88 (br s, 1H), 7.50- 7.32 (m, 5H), 5.09 (d, 1H), 3.78- 3.62 (m, 1H), 1.26 (d, 3H).
Intermediario 6: (4S, 5R)- 4- etil- 5- (tiazol- 2- il) oxazolidin- 2- ona
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a) acido (S)- 2- (((benciloxi) carbonil) - 2) amino) butanoico
A una solucion de (S)- 2- aminobutanoico (11.2 g, 109 milimoles) en THF (200 ml) y una solucion de carbonato de sodio 2 M acuoso (65.2 ml, 130 milimoles) se anadio por goteo a 0 °C clorocarbonato de bencilo (17.06 ml, 119 milimoles). Despues de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, la mezcla de reaccion se extrajo con H2O/TBME, la capa acuosa se acidifico con HCl (2 M en H2O) hasta pH = 2 y se extrajo con EtOAc. La capa organica se seco sobre Na2SO4, se filtro y el filtrado se concentro para proporcionar el compuesto del tltulo (22.8 g, 77%) como un aceite incoloro. El producto se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion adicional. LC- MS: [M- H] 236.2; Rt 0.76 min; (LCMS Metodo 1).
b) 2 - (((benciloxi) carbonil) amino) butanoato de (S)- metilo
A una solucion de acido (S) - 2 - (((benciloxi) carbonil) amino)butanoico (10.0 g, 42.1 milimoles) en metanol (100 ml) y tolueno (300 ml) se anadio por goteo a temperatura ambiente en atmosfera de argon trimetilsilildiazometano (23.2 ml, 46.4 milimoles). Despues de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, la mezcla de reaccion se concentro y el residuo se extrajo con una solucion de EtOAc y salmuera. Las capas organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el filtrado se concentro. El residuo se purifico por cromatografla en columna (120 g de SiO2) usando EtOAc en hexano de 0% a 30% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo (5.2 g, 48%) como un aceite incoloro. LC- MS: [M+H] 252.1; Rt 0.93 min; (LCMS Metodo 1).
c) (S)-(1- oxobutan- 2- il) carbamato de bencilo
A una solucion de 2 - (((benciloxi) carbonil) amino) butanoato de (S)- metilo (2.0 g, 7.96 milimoles) en tolueno (50 ml) se anadio por goteo a - 78 °C en atmosfera de argon DIBAL- H (1 M en tolueno) (15.9 ml, 15.9 milimoles) durante un perlodo de 20 minutos y la mezcla de reaccion se agito a - 78 °C durante 1 hora. La mezcla de reaccion se apago a - 78 °C con una solucion acuosa 1.5 M de tartrato de sodio y potasio (20 ml), y se dejo calentar a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se extrajo con una solucion de EtOAc y salmuera. Las capas organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna (24 g de SiO2) usando EtOAc en hexano de 0% a 30% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo (1.18 g, 64%) como un aceite incoloro. LC- MS: [M+H] 222.2; Rt 1.01 min; (LCMS Metodo 1). 1H RMN (400 MHz, CHCla- d): 9.61 (s, 1H), 7.27- 7.43 (m, 5H), 5.39 (br s, 1H), 5.15 (m, 2H), 4.15 (q, 1H), 1.96 - 2.11 (m, 1H), 1.64- 1.82 (m, 1H), 1.01- 0.79 (m, 3H).
d) ((1R, 2S)- 1- hidroxi- 1- (tiazol- 2- il) butan- 2- il) carbamato de bencilo
A una solucion de (1- oxobutan- 2- il)carbamato de (S)- bencilo (1.1 g, 4.97 milimoles) en diclorometano (30 ml) se anadio por goteo a - 30 °C en atmosfera de argon 2 - (trimetilsilil) tiazol (939 pl, 5.97 milimoles) durante un perlodo de 10 min. Luego, la mezcla de reaccion se agito a - 30 °C durante 20 minutos, se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se concentro a 30 °C y se disolvio en THF (30 ml). Se anadio TBAF (1M en THF) (5.97 ml, 5.97 milimoles) a 0 °C en atmosfera de argon y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se concentro, y el residuo se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con carbonato sodico acuoso, agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el filtrado se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna (24 g de SiO2) usando EtOAc en hexano de 0% a 30% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo (1.18 g, 64%) como un aceite incoloro. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna (24 g de SiO2) usando MeOH en CH2O2 hexano de 0% a 4% para proporcionar el compuesto del tltulo (340 mg, 43%) como un aceite incoloro. LC- MS: [M+H] 307.5; Rt 0.86 min; (LCMS Metodo 1).
e) (1R, 2S)- 2- amino- 1- (tiazol- 2- il) butan- 1- ol
A una solucion de ((1R, 2S)- 1- hidroxi- 1- (tiazol- 2- il) butan- 2- il) carbamato de bencilo (330 mg, 1.077 milimoles) en acetonitrilo (25 ml) a 0 °C bajo argon, se anadio piperidina (0.213 ml, 2.154 milimoles) y por goteo yodotrimetilsilano (293 pl, 2.15 milimoles) durante un perlodo de 5 minutos. Luego, la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. A la mezcla de reaccion se anadio a 0 °C a tiosulfato de 5 sodio (500 mg), seguido de agua (0.5 ml), y la mezcla de reaccion se agito vigorosamente a 0 °C durante 15 minutos. Se anadio mas 500 mg de tiosulfato de sodio, y la mezcla se diluyo con EtOAc (50 ml), se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro. El residuo se trituro con EtOAc, se filtro, y el filtrado se concentro para proporcionar el compuesto del tltulo (250 mg, 67%) como un aceite de color amarillo.
f) (4S, 5R)- 4- etil- 5- (tiazol- 2- il) oxazolidin- 2- ona
10 El compuesto del tltulo se preparo a partir de (1R, 2S)- 2- amino- 1- (tiazol- 2- il) butan- 1- ol de acuerdo con el procedimiento descrito para intermediario 2 para proporcionar el intermediario 6 (410 mg, 95%) como un aceite de color marron. Este producto se uso en la siguiente etapa de reaccion sin purificacion adicional.
Intermediario 7: 4- etil- 5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona
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15 a) 2- Nitro- 1- piridin-3-il- butan-1-ol
A una solucion de LiAlH (2M en THF) (0.93 ml, 1.87 milimoles) en THF seco (80 ml) a 0 °C, se anadio lentamente 1- nitropropano (8.30 ml, 93 milimoles) en atmosfera de argon. Despues de 60 min, se anadio en una porcion nicotinaldehldo (2.00 g, 18.7 milimoles). La mezcla se agito durante 16 horas, al tiempo que permitio que la temperatura suba de 0 °C a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se apago mediante la adicion de 1 ml de HCl acuoso 2
2 0 M, seguido de la adicion de 4 gramos de Na2SO4. La suspension resultante se agito durante 15 minutos y despues se
filtro. El filtrado se concentro. El residuo se purifico medainte cromatografla en columna (40 g de SiO2) usando EtOAc en hexano de 0% a 100% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo como un solido blanco (2.6 g, 71%) como una mezcla de diastereoisomeros A y B. La CL - MS: [M+H] 197.1; Rt 0.52 min; (LCMS metodo 1). A) 1H RMN (400 MHz, CHCla- d): 8.70- 8.60 (m, 2H), 7.80- 7.74 (m, 1H), 7.42- 7.32 (m, 1H), 5.28 (dd, 1H), 4.70- 4.58 (m, 1H), 2.97 (d, 25 1H), 2.29- 2.12 (m, 1H), 1.65- 1.42 (m, 1H), 0.99 (t, 3H). B) 1H RMN (400 MHz, CHCla- d): 8.70- 8.60 (m, 2H), 7.80
7.74 (m, 1H), 7.42- 7.32 (m, 1H), 5.15 (dd, 1H), 4.70- 4.58 (m, 1H), 2.81 (d, 1H), 1.99- 1.85 (m, 1H), 1.65- 1.42 (m, 1H), 0.94 (t, 3H).
b) 2- amino- 1- piridin- 3- il- butan- 1- ol
Una solucion de 2- nitro- 1- piridin- 3- butan- 1- il- ol (1.0 g, 4.44 milimoles) en etanol (20 ml) se purgo con argon, y se
3 0 anadio 100 mg de niquel Raney a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se evacuo tres veces y volvio a llenar
de nuevo con hidrogeno. La reaccion se agito durante 16 horas a temperatura ambiente. Luego niquel Raney se filtro a traves de Hyflo, y el Hyflo se lavo con EtOH. Luego el filtrado se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna (40 g de SiO2) usando MeOH en CH2O2 del 0% a100% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo como un aceite de color amarillo (180 mg, 21%). LC- MS: [M+H] 167.1; Rt 0.21 min; (LCMS
3 5 Metodo 1).
c) 4- etil- 5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona
A una solucion de 2- amino- 1- piridin- 3- butan- 1- il- ol (150 mg, 0.90 milimoles) en CH2O2 (5 ml) se anadio en atmosfera de argon NEt3 (314 pl, 5.63 milimoles) a 0 °C. Luego, se anadio difosgeno durante un periodo de 5 minutos y la temperatura se dejo calentar desde 0 °C a temperatura ambiente en 2 horas. La mezcla de reaccion se apago con
4 0 agua helada y una solucion 2 M de Na2CO3, se extrajo con CH2O2, se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro. El
residuo se purifico mediante cromatografla en columna usando EtOAc en heptano del 0% a 100% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo (100 mg, 58%) como una mezcla de diastereoisomeros A y B. La LC- MS: [M+H] 193.1; Rt 0.43 min; (LCMS metodo 1). A) 1H RMN (400 MHz, CHCla- d): 8.70- 8.62 (m, 1H), 8.60- 8.56 (m, 1H), 7.767.71 (m, 1H), 7.42- 7.35 (m, 1H), 5.78 (d, 1H), 4.08- 3.98 (m, 1H), 1.21 a 1.5 (m, 2H), 0.84 (t, 3H). B) 1H RMN (400 45 MHz, CHCb- d): 8.70- 8.62 (m, 2H), 7.80- 7.76 (m, 1H), 7.42- 7.35 (m, 1H), 5.21 (d, 1H), 3.75- 3.68 (m, 1H), 1.89- 1.69 (m, 2H), 1.05 (t, 3H).
Intermediario 8: 4- metil- 5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona
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a) 2- Nitro- 1- piridin- 3-il- propan- 1- ol
A una solucion de LiAlH (2M en THF) (1.4 ml, 2.8 milimoles) en THF seco (110 ml) a 0 °C, se anadio lentamente 1- nitroetano (2.00 ml, 28 milimoles) en atmosfera de argon. Despues de 20 min a 0 °C, se anadio nicotinaldehldo (2.64 ml, 28 milimoles) en una porcion. La mezcla se agito durante 16 horas, al tiempo que permite que la temperatura suba de 0 °C a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se apago mediante la adicion de 5 ml de HCl 1 M, seguido de la adicion de CH2O2 y Na2SO4. La suspension resultante se agito durante 15 minutos y despues se filtro. El filtrado se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna (40 g de SiO2) usando EtOAc en hexano de 0% a 100% con el fin de proporcionar el producto como un aceite (3.2 g, 63%) como una mezcla de diastereoisomeros. LC- MS: [M+H] 183.4; Rt 0.41 min; (LCMS Metodo 1). A) 1H RMN (400 MHz, CHCb- d): 8.58- 8.48 (m, 2H), 7.68 (d, 1H), 7.33- 7.23 (m, 1H), 5.42- 5.38 (m, 1H), 4.70- 4.60 (m , 1H), 3.30- 2.90 (br s, 1H), 1.46 (d, 3H). B) 1H RMN (400 MHz, CHCla- d): 8.58- 8.48 (m, 2H), 7.68 (d, 1H), 7.33- 7.23 (m, 1H), 5.04 (d, 1H), 4.76- 4.69 (m, 1H ), 3.30- 2.90 (br s, 1H), 1.31 (d, 3H).
b) 4- metil- 5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona
Una solucion de 2- nitro- 1- piridin- 3- butan- 1- il- ol (3.20 g, 17.6 milimoles) en etanol (90 ml) se purgo con argon, y se anadio 200 mg de nlquel Raney a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se evacua tres veces y se lleno nuevamente con hidrogeno. La reaccion se agito durante 16 horas en atmosfera de H2 a temperatura ambiente. Luego, nlquel Raney se filtro a traves de Hyflo, y el Hyflo se lavo con EtOH. Luego el filtrado se concentro con el fin de proporcionar 2- amino- 1- piridin- 3-il- propan- 1- ol como un producto (2.35 g, 88%), que se utilizo en la siguiente etapa de reaccion sin purificacion. A una solucion de 2- amino- 1- piridin- 3-il- propan- 1- ol (700 mg, 4.60 milimoles) en CH2O2 (20 ml) se anadio en atmosfera de argon Et3N (1.60 ml, 11.5 milimoles) a 0 °C, seguido de trifosgeno (819 mg, 2.76 milimoles, disuelto en 5 ml de CH2O2). La temperatura de reaccion se dejo calentar desde 0 °C a temperatura ambiente en una hora. La mezcla de reaccion se apago con agua helada y una solucion 2 M de Na2CO3, se extrajo con CH2O2, se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna utilizando EtOAc en hexano de 0% a 100% con el fin de proporcionar el producto (160 mg, 20%). LC- MS: [M+H] 179.1; Rt 0.31 min; (LCMS Metodo 1).
Intermediario 9: (4S, 5S) - 4 - ((ter- butildifenilsililoxi) metil)- 5- feniloxazolidin- 2- ona
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a) (4S, 5S)- 4- hidroximetil- 5- fenil- oxazolidin- 2- ona
(1S, 2S)- 2- amino- 1- fenil- propano- 1 ,3- diol (20.0 g, 120 milimoles), carbonato de dietilo (29.7 ml, 245 milimoles), y K2CO3 (1.65 g, 12.0 milimoles) se cargaron en un matraz con agitador mecanico y una columna de Vigreux. Esta suspension se calento en un bano de aceite a 135 °C, para proporcionar una solucion de color amarillo. El EtOH acumulado se separo por destilacion sobre una columna de Vigreux. La reaccion se agito durante un perlodo de 3 h, hasta que no se pudo destilar mas EtOH. La mezcla de reaccion se enfrio a 50 °C, se diluyo con EtOAc y NaHCO3 acuoso. Las capas organicas se separaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna (550 g de SiO2) usando EtOAc en heptano del 33% a 100% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo como un aceite de color beige (7.50 g, 33%). 1H RMN (400 MHz, DMSO- d6): 7.87 (br s, 1H), 7.50- 7.30 (m, 5H), 5.37 (d, 1H), 5.23- 5.17 (m, 1H), 3.70- 3.60 (m, 1H), 3.60- 3.50 (m, 2H).
b) (4S, 5S) - 4 - ((ter- butildifenilsililoxi) metil)- 5- feniloxazolidin- 2- ona
A una solucion de (4S, 5S)- 4- hidroximetil- 5- fenil- oxazolidin- 2- ona (3.50 g, 17.2 milimoles), NEt3 (4.80 ml, 34.4 milimoles), y DMAP (105 mg, 861 milimoles) en DMF (20 ml) se anadio por goteo TBDPSCl (4.86 ml, 18.9 milimoles)
a temperatura ambiente. La reaccion se agito durante 3 horas a temperatura ambiente. Luego, la mezcla de reaccion se concentro y se diluyo con TBME, las capas organicas se separaron, se lavaron con NaHCO3 acuoso y salmuera, se secaron sobre MgSO4, y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna (120 g de SiO2) usando EtOAc en heptano del 0% a 60% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo como un solido blanco 5 (4.28 g, 57%). LC- MS: [M+H] 432.2; Rt 1.36 min; (LCMS Metodo 2).
Intermediario 10: (4S, 5S) - 4 - (((ter- butildifenilsilil) oxi) metil) - 5 - (4- metoxifenil) oxazolidin- 2- ona
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A una solucion de (4S, 5S) - 4 - (hidroximetil) - 5 - (4- metoxifenil) oxazolidin- 2- ona [545435- 91- 4] (0.68 g, 3.05 milimoles) e imidazol (0.249 g, 3.66 milimoles ) en DMF (10 ml) se anadio por goteo TBDPSCl (0.97 ml, 3.66 milimoles) 10 a 0- 5 °C. La mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se concentro y el aceite residual se disolvio en TBME y se lavo con una solucion acuosa de KHSO4, H2O, solucion al 10% saturada de NaHCO3 y salmuera, se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna usando EtOAc en heptano del 5% al 50% para proporcionar el compuesto del tltulo como una espuma blanca (1.62 g, 55%). TLC (heptano/EtOAc 1:1) Rf = 0.44; LC- 15 MS: [M+H] 462; Rt 1.36 min; (LCMS metodo 2) 1H RMN (400 MHz, CDCla): 7.65 (d, 4H), 7.35- 7.60 (m, 6H), 7.24 (d, 2H), 6.92 (d, 2H), 5.24 (d, 1H), 5.20 (br s, 1H), 3.84 (m, 4H), 3.77 (m, 2H ), 1.09 (s, 9H).
Intermediario 11: (4S, 5S) - 4 - (((ter- butildimetilsilil) oxi) metil) - 5 - (4 - (2- metoxietoxi) fenil) oxazolidin- 2- ona
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a) (R)-2 - ((ter- butoxicarbonil) amino) - 3 - (4 - (2- etoxietoxi) fenil)propanoato de metilo
2 0 A una suspension de (R)-2 - ((ter- butoxicarbonil) amino) - 3 - (4- hidroxifenil) propanoato de metilo (4.43 g, 15.00
milimoles), K2CO3 (4.15 g, 30.0 milimoles) y yoduro de sodio (112 mg, 750 milimoles) en acetonitrilo (100 ml) se anadio 1- bromo- 2- metoxietano (5.64 ml, 60.0 milimoles) y la mezcla resultante se agito a reflujo durante 2 dlas. La mezcla de reaccion se diluyo con TBME y se lavo con H2O y salmuera. Los extractos combinados se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar el compuesto del tltulo como un aceite amarillo (5.3 g, 95%). TLC 25 (tolueno/TBME 2:1) Rf = 0.44; tR = 1.084 min (UPLC 1); LC- MS: [M+H] 354; Rt 1.02 min; (LCMS Metodo 2); 1H RMN (400 MHz, CDCla ): 5 7.05 (d, 2H), 6.88 (d, 2H), 4.96 (br d, 1H), 4.58 (m, 1H), 4.12 (dd, 2H), 3.76 (dd, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.47 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
b) (4R, 5S)- 5 - (4 - (2- metoxietoxi) fenil)- 2- oxooxazolidin- 4- carboxilato de metilo
A una solucion de (R)- 2 - ((ter- butoxicarbonil) amino) - 3 - (4- hidroxifenil)propanoato de metilo (5.34 g, 14.35
3 0 milimoles) en acetonitrilo (260 ml) se anadio en atmosfera de argon una solucion de persulfato de potasio (7.76 g, 28.7
milimoles) en H2O (190 ml) y una solucion de CuSO4 (0.458 g, 2.87 milimoles) disuelto en H2O (70 ml). La mezcla resultante se agito durante 3 horas a 70 °C. La mezcla de reaccion se extrajo con EtOAc. Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna usando EtOAc en heptano del 20% a100% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo 35 como un aceite de color amarillo (2.33 g, 52%). TLC (heptano/EtOAc 1:2) Rf = 0.19; tR = 0.680 min (UpLC 1); LC- MS: [M+H] 296; Rt 0.68 min; (LCMS Metodo 2); 1H RMN (400 MHz, CDCl3 ): 7.36 (d, 2H), 6.99 (d, 2H), 5.86 (br d, 1H), 5.62 (d, 1H), 4.30 (d, 1H), 4.16 (dd, 2H), 3.88 (s, 3H ), 3.79 (dd, 2H), 3.48 (s, 3H).
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c) (4S, 5S) - 4 - (hidroximetil) - 5 - (4 - (2- metoxietoxi) fenil) oxazolidin- 2- ona
A una suspension de (4R, 5S)- 5 - (4 - (2- metoxietoxi) fenil)- 2- oxooxazolidin- 4- carboxilato de metilo (2.30 g, 7.79 milimoles) en EtOH (45 ml) se anadio en porciones a 0 - 5 °C borohidruro de sodio (648 mg, 17.1 milimoles). La mezcla de reaccion se agito durante 0.5 h a temperatura ambiente y despues se acidifico con HCl acuoso 4 M (10 ml) a 0- 5 °C. La mezcla de reaccion se concentro y el producto se extrajo con EtOAc. Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar el compuesto del tltulo como una espuma beige (1.80 g, 81%) tR = 0.498 min (UPLC 1); LC- MS: [M+H] 268; Rt 0.55 min; (LCMS Metodo 2); 1H RMN (400 MHz, CDCb): 7.31 (d, 2H), 6.96 (d, 2H), 6.45 (br s, 1H), 5.33 (d, 1H), 5.30 (br s, 1H), 3.75- 4.30 (m, 7H), 3.47 (s, 3H).
d) (4S, 5S) - 4 - (((ter- butildimetilsilil) oxi) metil) - 5 - (4 - (2- metoxietoxi) fenil) oxazolidin- 2- ona
El compuesto del tltulo se preparo de forma analoga al procedimiento descrito para el compuesto intermediario 10 [(4S, 5S) - 4 - (((ter- butildifenilsililo) oxi) metil) - 5 - (4- metoxifenil) oxazolidin- 2- ona] a partir de ( 4S, 5S) - 4 - (hidroximetil) - 5 - (4 - (2- metoxietoxi) fenil) oxazolidin- 2- ona y TBDMS- Cl, para proporcionar despues de la purificacion mediante cromatografla en columna (utilizando EtOAc en heptano de 5% a 50% ) intermediario 11 como un aceite de color amarillo claro. TLC (heptano/EtOAc 1:1) Rf = 0.26; tR = 1.28 min (UPLC 1); LC- MS: [M+H] 382.2; Rt 1.17 min; (LCMS Metodo 2); 1H RMN (400 MHz, CDCb ): 7.30 (d, 2H), 6.97 (d, 2H), 5.44 (br s, 1H), 5.23 (d, 1H), 4.18 (dd, 2H), 3.70- 3.85 (m, 5H), 3.48 (s , 3H), 0.91 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).
Intermediario 12: (4S,5S)- 5- (4- (2- ((ter- butildimetilsilil)oxi)etoxi)fenil)- 4- (((ter- butildimetilsilil)oxi)metil)oxazolidin- 2- ona
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El compuesto del tltulo se preparo de forma analoga al procedimiento descrito para el intermediario 11 comenzando con (R)- 2 - ((ter- butoxicarbonil) amino) - 3 - (4- hidroxifenil) propanoato de metilo y (2- bromoetoxi) (ter- butil ) dimetilsilano. TLC (heptano/EtOAc 1:1) Rf = 0.51; tR = 1.764 min (UPLC 1); LC- MS: [M+H] 482; Rt 1.57 min; (LCMS Metodo 1); 1H RMN (400 MHz, CDCb ): 7.31 (d, 2H), 6.96 (d, 2H), 5.26 (br s, 1H), 5.22 (d, 1H), 4.13 (m, 2H), 4.00 (m, 2H), 3.79 (m, 1H ), 3.67 (m, 2H), 0.93 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 0.11 (m, 12H).
Intermediario 13: (4S,5S)- 4- (((ter- butildimetilsilil)oxi)metil)- 5- (4- (3- ((ter- butildimetilsilil)oxi)propoxi)fenil)oxazolidin- 2- ona
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El compuesto del tltulo se preparo de forma analoga al procedimiento descrito para el intermediario 12 comenzando con (R)-2 - ((ter- butoxicarbonil) amino) - 3 - (4- hidroxifenil) propanoato de metilo y (3- bromopropoxi) (ter- butil ) dimetilsilano. TLC (heptano/EtOAc 1:1) Rf = 0.49; tR = 1.832 min (UPLC 1); LC- MS: [M+H] 496; Rt 1.62 min (Metodo LC- MS 1); 1H RMN (400 MHz, CDCb): 7.30 (d, 2H), 6.95 (d, 2H), 5.27 (br s, 1H), 5.22 (d, 1H), 4.13 (dd, 2H), 4.00 (m, 2H), 3.80 (m, 3H), 3.74 (m, 2H), 2.01 (m, 2H), 0.93 (s, 9H), 0.91 (s, 9H), 0.10 (s, 6H), 0.06 (s, 6H).
Intermediario 14: (4S, 5R)- 4- metil- 5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona
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a)
ester ter- butliico
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Se disolvio Boc- L- aianai (9.99 g, 57.7 miiimoies) 200 mi de CH2CI2. Se anadio 2 - (trimetilsilil)- tiazoi (9.90 g, 62.9 miiimoies) disueito en 70 mi de CH2O2 a la mezcia de reaccion a - 20 °C en atmosfera de argon. Despues de 21 horas a - 20 °C, la mezcia de reaccion se concentro. Luego el residuo se disolvio en 180 mi de THF, cuando se anadio TBAF (1M en THF, 63.4 mi, 63.4 miiimoies), y la mezcia de reaccion se agito durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcia de reaccion se concentro. El residuo se purifico medainte cromatografla en coiumna (120 g de SiO2) usando EtOAc en hexano de 0% a 100% con el fin de proporcionar el compuesto del tltuio como una mezcia de diastereoisomeros (14.0 g, 93%). LC- MS: [M+H] 259.2; Rt 0.78 min; (LCMS Metodo 1).
b) 2- amino- 1- tiazoi- 2- ii- propan- 1- oi
Ester ter- butliico del acido 2- hidroxi- 1- metii- 2- tiazoi- 2- ii- etil)- carbamico (13.8 g, 53.4 miiimoies) se disolvio en 50 mi de dioxano. Se anadio 134 mi (534 miiimoies) de HCl 4 M en dioxano, y la mezcia de reaccion se agito durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcia de reaccion se concentro, y el residuo se diluyo con eter dietliico y se filtro con el fin de obtener el compuesto del tltuio como una sal bianca como una mezcia de diastereoisomeros (11.5 g, 92%). LC- MS: [M+H] 159.1; Rt 0.22 min; (LCMS Metodo 1).
c) (4S, 5R)- 4- metii- 5- tiazoi- 2- ii- oxazoiidin- 2- ona
Una mezcia de diastereoisomeros de 2- amino- 1- tiazoi- 2- ii- propan- 1- oi (4.20 g, 18.2 miiimoies) se disolvio en 160 mi de CH2CU. Se anadio diisopropiietiiamina (11.1 mi, 63.6 miiimoies) se anadio a 0 °C, seguido de trifosgeno (2.70 g, 9.09 miiimoies) disueito en 40 mi de CH2Cl2. La mezcia de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se diluyo con CH2O2. Los soiventes organicos se separaron, se iavaron con NaHCO3 acuoso y saimuera, se secaron sobre MgSO4, se fiitraron y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en coiumna (80 g de SiO2) usando EtOAc en hexano de 0% a 100% con el fin de proporcionar el compuesto del tltuio en forma de un unico enantiomero (2.16 g, 64%). LC- MS: [M+H] 185.3; Rt 0.45 min; (LCMS Metodo 1). 1H RMN (400 MHz, CHCia-
d): 7.75 (d, 1H), 7.35 (d, 1H), 5.60 (br s, 1H), 5.32 (d, 1H), 4.18- 4.9 (m, 1H), 1.45 (d, 3H).
Intermediario 15: (4S, 5S)- 4- metii- 5- tiazoi- 2- ii- oxazoiidin- 2- ona
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A una mezcia de (1S,2S)- 2- amino- 1- tiazoi- 2- ii- propan- 1- oi y (1R,2S)- 2- amino- 1- tiazoi- 2- ii- propan- 1- oi (2.9 g, 12.5 miiimoies) en CH2O2 (40 mi) se ie anadio en atmosfera de argon NEt3 (10.5 mi, 75 miiimoies) a 0 °C. Luego, se anadio ientamente trifosgeno (1.86 g, 6.27 miiimoies) disueito en 40 mi de CH2O2, y la temperatura se dejo caientar desde 0 °C a temperatura ambiente. La mezcia de reaccion se agito durante 16 horas a temperatura ambiente. Luego la mezcia de reaccion se apago mediante la adicion de NaHCO3 acuoso. Las capas organicas se separaron, se secaron sobre MgSO4, se fiitraron y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en coiumna usando EtOAc en heptano del 0% a 100% con el fin de proporcionar el producto deseado (330 mg, 13%). LC- MS: [M+H] 185.0; Rt 0.48 min; (LCMS Metodo 1). 1H RMN (400 MHz, CHCia- d): 7.79 (d, 1H), 7.34 (d, 1H), 5.91 (d, 1H), 5.71 (br
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s, 1H), 4.48- 4.38 (m, 1H), 0.89 (d, 3H).
Slntesis de los compuestos de Ejemplo
Ejemplo 1: (4S,5R)- 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil- [4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil- 5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona
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a) (4S, 5R) - 3 - (6- Cloro- 2- morfolin- 4- il- pirimidin- 4- il)- 4- metil- 5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona
(4S, 5R)- 4- metil- 5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona (intermediario 14) (4.70 g, 20.1 milimoles) se disolvio en 70 ml de DMF y se enfrio a 0 °C. NaH (964 mg, 60% en aceite, 24.1 milimoles) se anadio en atmosfera de argon, y la mezcla de reaccion se agito durante 30 minutos a 0 °C. 4 - (4,6- dicloropirimidin- 2- il) se anadio morfolina (3.70 g, 20.1 milimoles) disuelto en 30 ml de DMF, y la mezcla de reaccion se agito durante 3 horas a 0 °C, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego la reaccion se apago mediante la adicion de NH4Cl acuoso, seguido de dilucion con EtOAc, los solventes organicos se separaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna (80 g de SiO2) usando EtOAc en hexano de 0% a 100% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo (3.64 g, 48%). LC- MS: [M+H] 382.2, 384.1; Rt 1.10 min; (LCMS Metodo 1). 1H RMN (400 MHz, CHCla- d): 7.77 (d, 1H), 7.38- 7.33 (m, 2H), 5.39 (d, 1H), 5.07- 4.98 (m, 1H), 3.75- 3.55 (m, 8H ), 1.64 (d, 3H).
b) (4S,5R)- 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil- [4,5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil- 5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona
A una solucion de (4S, 5R) - 3 - (6- cloro- 2- morfolin- 4- il- pirimidin- 4- il)- 4- metil- 5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona obtenida en el paso a) (1.30 g, 3.40 milimoles) en 20 ml de dimetoxietano se anadio en atmosfera de argon 5 - (4,4,5,5- tetrametil- 1, 3,2- dioxaborolan- 2- il) - 4 - (trifluorometil ) pirimidin- 2- amina (1.08 g, 3.75 milimoles), PdCh (dppf)- CH2O2 (214 mg, 262 milimoles), y carbonato sodico acuoso 2 M (5.11 ml, 10.2 milimoles). La mezcla de reaccion se agito a 80 °C durante 30 minutos. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se diluyo con 80 ml de EtOAc, los solventes organicos se lavaron con NH4Cl acuoso y salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna (80 g de SiO2) usando EtOAc en hexano de 0% a 100% con el fin de proporcionar ejemplo 1 como un solido amorfo (1.20 g, 69%). LC- MS: [M+H] 509.0; Rt 0.99 min; (LCMS Metodo 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO- d6): 8.58 (s, 1H), 7.92 (d, 1H), 7.87 (d, 1H), 7.64 (br s, 2H), 7.41 (s, 1H), 5.89 (d , 1H), 5.10 - 5.4 (m, 1H), 3.75- 3.55 (m, 8H), 1.62 (d, 3H).
Ejemplo 2: (4S*,5S*)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona
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a) (4S *, 5S *) - 3 - (6- cloro- 2- morfolinopirimidin- 4- il)- 4- etil- 5- (4- metoxi- fenil) oxazolidin- 2- ona
A una solucion de (4R *, 5R *)- 4- etil- 5- (4- metoxi- fenil) oxazolidin- 2- ona (intermediario 2) (217 mg, 0.98 milimoles) en DMF (2 ml) se anadio a temperatura ambiente en atmosfera de argon NaH (51.4 mg, 1.18 milimoles). Despues de 20 minutos, se anadio una suspension de 4 - (4,6- dicloropirimidin- 2- il) morfolina (230 mg, 0.98 milimoles en DMF (1 ml), y la mezcla de reaccion se agito a 85 °C durante 20 minutos. La solucion se enfrio a 0 °C con NH4Cl acuoso, se extrajo con acetato de etilo, y las capas organicas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purifico mediante cromatografla en columna utilizando EtOAc en hexano de 0% a 20% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo en forma de un solido blanco (375 mg, 91%) LC- MS: [M+H] 419.1; Rt 1.26 min; (LCMS metodo 1).
b) (4S*,5S*)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona
A una solucion de (4R *, 5R *) - 3 - (6- cloro- 2- morfolinopirimidin- 4- il)- 4- etil- 5- (4- metoxi- fenil) oxazolidin- 2- ona obtenido en el paso a) en DME (2 ml) se anadio a temperatura ambiente en atmosfera de argon 5 - (4,4,5,5- tetrametil- 1, 3,2- dioxaborolan- 2- il) - 4 - (trifluorometil) pirimidin- 2- amina (76 mg , 0.26 milimoles), una solucion acuosa 2M de Na2CO3 (0.36 ml, 0.72 milimoles) y tetraquis(trifenilfosfina)paladio (27.6 mg, 24 milimoles). La mezcla se agito a 80 °C durante 1 hora, se enfrio a temperatura ambiente y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna utilizando EtOAc en hexano de 0% a 20% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo (125 mg, 95%) como un aceite de color amarillo. LC- MS: [M+H] 546.2; Rt 1.17 min; (LCMS Metodo 1). 1H RMN (400 MHz, CHCla- d): 8.63 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.31 (d, 2H), 6.96 (d, 2H), 5.49 (br s, 2H), 5.27 (d , 1H), 4.66- 4.61 (m, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.80- 3.73 (m, 8H), 2.30- 2.00 (m, 2H), 1.08 (t, 3H).
Ejemplo 3: (4S,5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona
imagen26
a) (4S,5S)- 4- (((ter- Butildifenilsilil)oxi)metil)- 3- (6- cloro- 2- morfolinopirimidin- 4- il)- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona
A una solucion de (4S, 5S) - 4 - (((ter- butildifenilsililo) oxi) metil) - 5 - (4- metoxifenil) oxazolidin- 2- ona (compuesto intermediario 10) (1.65 g, 3.57 milimoles), 4 - (4,6- dicloropirimidin- 2- il)morfolina (920 mg, 3.93 milimoles) y Cs2CO3 (1.75 g, 5.36 milimoles) en dioxano (20 ml) se anadio despues de la purga con argon 4,5- bis (difenilfosfino) - 9,9- dimetilxanteno (145 mg, 250 milimoles) y Pd2(dba)3 (65 mg, 0.071 milimoles), y la mezcla de reaccion se calento durante 5 horas a 100 °C. La mezcla de reaccion se anadio a solucion acuosa de NaHCO3 al 10% y se extrajo con EtOAc. Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna usando EtOAc en heptano del 0% al 50% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo como un solido blanco (2.33 g, 94%). TLC (heptano/EtOAc 1:1) Rf = 0.52; LCMS: [M+H] 659 661; Rt 1.58 min; (LCMS metodo 2). 1H RMN (400 MHz, CDCla): 7.64 (m, 4H), 7.54 (s, 1H), 7.55- 7.35 (m, 6H), 7.26 (m, 2H), 6.95 (d, 2H), 5.21 (d, 1H), 4.56 (m, 1H), 4.22 (dd, 1H), 3.96 (dd, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.60- 3.40 (m, 8H), 1.09 (s, 9H).
b) (4S,5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (((ter- butildifenilsilil)oxi)metil)- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona
Una solucion de (4S,5S)- 4- (((ter- butildifenilsilil)oxi)metil)- 3- (6- cloro- 2- morfolinopirimidin- 4- il)- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona obtenido en el paso a) (150 mg, 228 pmol), 5 - (4,4,5,5- tetrametil- 1, 3,2- dioxaborolan- 2- il) - 4 - (trifluorometil) pirimidin- 2- amina ( 108 mg, 364 pmol), 20% de Na2CO3 acuoso (0.24 ml, 2.28 milimoles), y PdCl2 (dppf)- CH2Cl2 (18.6 mg, 23 milimoles) en DME (2 ml) en atmosfera de argon se agito a 80 °C durante 8 h . La mezcla de reaccion se diluyo con EtOAc y se lavo con solucion saturada de NaHCO3, H2O y salmuera, se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatografla en columna usando EtOAc en heptano del 0% a 33% con el fin de proporcionar el compuesto del tltulo como una espuma de color amarillo claro (68 mg, 28%): TLC (heptano/EtOAc 1:1) Rf = 0.32; tR = 1.663 min (UPLC 1); LC- MS: [M+H] 786; Rt 1.48 min; (LCMS metodo 2).
c) (4S,5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona
A una solucion de (4S,5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4,5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (((ter- butildifenilsilil)oxi)metil)- 5- (4- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona obtenido en el paso b) (68 mg, 65 milimoles) en THF (2 5 ml) se anadio por goteo a 0 °C TBAF 1 M en THF (0.05 ml, 0.05 milimoles), y la mezcla resultante se agito durante 30 min a 0 °C y 1 h a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se concentro, y el residuo se purifico mediante cromatografla en columna usando una relacion de hexane/CH2Cl2/MeOH de 100:100:5 a 0:100:5, seguido por HPLC preparativa (Waters Sun Fire C18, 30 x 100 mm, 5 um; 0.1% TFA- agua/acetonitrilo; gradiente de acetonitrilo 30- 50% en 20 min) para proporcionar el compuesto del tltulo como un solido blanco (18 mg, 50%); TLC (CH2Ch/MeOH 19:1) 10 Rf = 0.40; tR = 0.998 min (UPLC 1); LC- MS: [M+H] 548; Rt 0.96 min; (LCMS metodo 2). 1H RMN (600 MHz, DMSO-
d6): 8.60 (s, 1H), 7.64 (br s, 2H), 7.53 (s, 1H), 7.34 (d, 2H), 7.00 (d, 2H), 5.58 (d , 1H), 5.32 (t, 1H), 4.59 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.75- 3.55 (m, 8H).
Ejemplos 4 a 14
Ejemplos 4 a 14 de la Tabla 1 a continuacion se pueden realizar utilizando procedimientos analogos a los descritos en 15 los ejemplos 1- 3, utilizando el intermediario apropiado de ester boronico y oxazolidinona.
Tabla 1
Ejemplo No.
Estructura y Nombre 1H RMN LC/MS
4
ft N F _ 1 Til / r\ H2NT N O (4S*.5R*)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4.5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- feniloxazolidin- 2- ona 1H RMN (400 MHz. CHCl3- d): 8.64 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.39- 7.50 (m, 5H), 5.82 (d, 1H), 5.46 (br s, 2H), 5.02- 4.96 (m, 1H), 3.87- 3.73 (m, 8H), 1.84- 1.72 (m, 1H), 1.59- 1.66 (m, 1H), 0.52 (t, 3H). LCMS (metodo 2): Tiempo de retencion: 1.19 min Masa [M+H]: 516.2
5
ft N Ft 1 F^F N^N m ^ iV^d-O HjN-^rr 0 0 (4S.5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4.5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- metil- 5- feniloxazolidin- 2- ona 1H RMN (600 MHz. DMSO- d6) 8.61 (s, 1H), 7.64 (br s, 2H), 7.51- 7.35 (m, 6H), 5.45 (d, 1H), 4.734.52 (m, 1H), 3.783.54 (m, 8H), 1.61 (d, 3H). LCMS (metodo 2): Tiempo de retencion: 1.11 min Masas (ES +): 502.2
Ejemplo No.
Estructura y Nombre 1H RMN LC/MS
6
C°) N FXF n^N I"" ^ X J J-0 h2n^n o y (4R*.5R*)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4.5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- (3- metoxifenil)oxazolidin- 2- ona 1H RMN (400 MHz. CHCla- d): 8.62 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.32- 7.40 (t, 1H), 7.01- 6.86 (m, 3H), 5.50 (br s, 2H), 5.29 (d, 1H), 4.60- 4.64 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.76 (m, 8H), 2.302.00 (m, 2H), 1.11 (t, 3H). LCMS (metodo 2): Tiempo de retencion: 1.18 min Masa [M+H]: 546.2
7
0 N F^F N^N X J N h2n^nx o (4S.5R)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4.5'- bipi rimidin]- 6- il)- 4- etil- 5- (tiazol- 2- il)oxazolidin- 2- ona LCMS (metodo 1): Tiempo de retencion: 1.06 min Masa [M+H]: 523.1
8
0 N F ^ 1 i ii r /-n Xxj X J >~o w cf 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil- [4.5']bipirimidinil- 6- il)- 4- etil- 5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona LCMS (metodo 1): Tiempo de retencion: 0.96 min Masa [M+H]: 517.5
Ejemplo No.
Estructura y Nombre 1H RMN LC/MS
9
0 F N^ F^F n^N . n H^N^ 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil- [4.5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil- 5- piridin- 3- il- oxazolidin- 2- ona Mezcla de diastereoisomeros cis y trans en una proporcion de 2 a 1: diastereoisomero cis: 1H RMN (400 MHz.DMSO- d6): 8.78- 8.58 (m, 3H), 7.96- 7.88 (m, 1H), 7.62 (s ancho. 2H), 7.54- 7.48 (m, 2H), 6.05 (d, 1H), 5.275.20 (m, 1H), 3.783.62 (m, 8H), 0.95 (d, 3H) diastereoisomero trans: 1H RMN (400 MHz. DMSO- d6): 8.78- 8.58 (m, 3H), 7.96- 7.88 (m, 1H), 7.62 (br s, 2H), 7.547.48 (m, 1H), 7.45 (s, 1H), 5.53 (d . 1H), 4.77- 4.70 (m, 1H), 3.78- 3.62 (m, 8H), 1.62 (d, 3H) LCMS (metodo 1): Tiempo de retencion: 0.91 min Masa [M+H]: 503.2
10
N F4-F N^N jT0H ___ h2n^n^ 0 0 (4S.5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil- [4.5']bipirimidinil- 6- il)- 4- hidroxi- metil- 5- fenil- oxazolidin- 2- ona 1H RMN (400 MHz. DMSO- d6): 8.61 (s, 1H), 7.61 (br s, 2H), 7.53 (s, 1H), 7.507.31 (m, 5H), 5.65 (d, 1H), 5.34 (t, 1H), 4.66- 4.59 (m, 1H), 4.08- 3.96 (m, 1H), 3.92- 3.83 (m, 1H), 3.73- 3.57 (m, 8H). LCMS (metodo 2): Tiempo de retencion: 0.97 min Masa [M+H]: 518.1
Ejemplo
Estructura y Nombre
1H RMN
LC/MS
No.
11
H,N
imagen27
1H RMN (400 MHz. DMSO- d): 8.60 (s,
1H), 7.98 (d, 1H), 7.89 (d, 1H), 7.64 (br s, 2H), 7.44 (s, 1H), 6.28 (d, 1H), 5.305.20 (m, 1H), 3.783.61 (m, 8H), 1.05 (d, 3H).
LCMS (metodo 1):
Tiempo de retencion: 1.01 min
Masa [M+H]:
509.2
(4S.5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolin- 4- il- 4'- trifluorometil- [4.5']bipirimidinil- 6- il)- 4- metil- 5- tiazol- 2- il- oxazolidin- 2- ona
12
H,N
imagen28
o
1H RMN (600 MHz. DMSO- d6): 8.53 (s
LCMS (metodo 2):
imagen29
1H), 7.64 (s ancho. 2H), 7.53 (s, 1H),
7.32 (d, 2H), 7.00 (d, 2H), 5.58 (d . 1H),
5.32 (t, 1H), 4.60 (m,
1H), 4.09 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 3.82 (m 1H), 3.55- 3.75 (m,
Tiempo de retencion: 0.93 min
Masa [M+H]:
592.1
10H); 3.34 (s, 3H).
(4S.5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4.5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- (2- metoxietoxi)fenil)oxazolidin- 2- ona
13
imagen30
"O
OH
O
1H RMN (400 MHz. DMSO- d6): 8.61 (s,
1H), 7.63 (br s, 2H), 7.54 (s, 1H), 7.33 (d, 2H), 7.02 (d, 2H),
5.58 (d . 1H), 5.31 (t,
1H), 4.87 (t, 1H), 4.61 (m, 1H), 4.10- 3.90 (m, 3H), 3.82 (m, 1H), 3.75- 3.55 (m, 10H ).
LCMS (metodo 1):
Tiempo de retencion: 0.79 min
Masa [M+H]:
578.2
(4S.5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4.5'- bipi rimidin]- 6- il)- 5- (4- (2- hidroxietoxi)fenil)- 4- (hidroximetil)oxazolidin- 2-
ona
Ejemplo No.
Estructura y Nombre 1H RMN LC/MS
14
l J HO \ F\F/F X HOv / h2n n cr (4S.5S)- 3- (2'- amino- 2- morfolino- 4'- (trifluorometil)- [4.5'- bipirimidin]- 6- il)- 4- (hidroximetil)- 5- (4- (3- hidroxipropoxi)fenil)oxazolidin- 2- ona 1H RMN (400 MHz. DMSO- d6): 8.60 (s, 1H), 7.62 (br s, 2H), 7.53 (s, 1H), 7.31 (d, 2H), 7.00 (d, 2H), 5.57 (d . 1H), 5.30 (t, 1H), 4.60 (m, 1H), 4.53 (t, 1H), 4.04 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 3.81 (m, 1 H),3.63 (m, 8H), 3.55 (m, 2H), 1.85 (m, 2H), LCMS (metodo 1): Tiempo de retencion: 0.84 min Masa [M+H]: 592.3
Actividad biologica
La actividad de un compuesto de acuerdo con la presente invencion se puede evaluar mediante los siguientes metodos in vitro y en in vivo
5 Preparacion de las diluciones del compuesto (384 pozos)
Los compuestos de ensayo se disolvieron en DMSO (10 mM) y se transfirieron a tubos en forma de V de fondo plano de 1.4 ml que llevan un chip unico de matriz 2D por cada juego de compuestos individuales de Novartis. El numero de estos chips fue vinculado claramente con los numeros de NovartisPharma. Las soluciones madre se almacenaron a -20 ° C cuando no fueron utilizadas inmediatamente. Para el procedimiento de prueba de los viales, se 10 descongelaron y se identificaron mediante un escaner gracias al cual se genero una hoja de trabajo que guio los siguientes pasos de trabajo.
Los compuestos se diluyeron ya sea manualmente en DMSO para experimentos individuales (96 pozos que permiten 10 compuestos a 8 concentraciones (puntos individuales)) como se describe, o fueron preparados como se describe a continuacion en caso de que la prueba se hiciera para perfilar en 384 pozos. Este formato permitio el ensayo de un 15 maximo de 40 compuestos de prueba individuales a 8 concentraciones (puntos individuales), incluyendo a 4 compuestos de referencia. El protocolo de dilucion incluye la produccion de "placas de pre-dilucion", "placas maestras" y "placas de ensayo".
Placas de Pre-dilucion: Se utilizaron placas de polipropileno de 96 pozos como placas de pre-dilucion. Se preparo un total de 4 placas de pre-dilucion incluyendo a los 10 compuestos de prueba cada uno en las posiciones de la placa 2 0 A1-A10, un compuesto estandar en A11 y un control de DMSO en Al2. El patron de las etapas de dilucion se resume
en la Tabla 1. Se han escrito programas para ejecutar estos pasos de pipeteado en los robots HamiltonSTAR.
Tabla 1 Patron de dilucion de las placas de pre-dilucion
c
Vol (Ml) Conc. (MM) Vol (Ml) DMSO Vol (Ml) Conc. (MM) Proporcion de dil. Concentracion final (MM)
A
30 10'000 + 135 165 1'820 1:5.5 10
B
50 1'820 + 116 166 546 1:3.33 3
C
50 546 + 100 150 182 1:3 1
D
50 182 + 116 166 54.6 1:3.33 0.3
E
50 54.6 + 100 150 18.2 1:3 0.1
F
50 18.2 + 116 166 5.46 1:3.33 0.03
5
10
15
20
25
30
35
40
45
c
Vol Conc. Vol (pl) Vol Conc. Proporcion de Concentracion final
(pl) (pM) DMSO (pl) (pM) dil. (pM)
G
50 5.46 + 100 150 1.82 1:3 0.01
H
50 1.82 + 116 166 0.546 1:3.33 0.003
El DMSO se saturo con H2O hasta una concentracion de 10%. Vol.: Volumen, Conc.: Concentracion, Proportion de Dil.: Relation de dilution, Concentracion final: concentracion final.
Placas Maestras:se transfirieron 100pL de las diluciones de los compuestos individuales, incluyendo al compuesto estandar y a los controles de las 4 "placas de pre-dilution" a una "placa principal" 384 incluyendo las siguientes concentraciones de 1 '820, 564, 182, 54.6, 18.2, 5.46, 1.82 y 0.546 pM, respectivamente, en DmSo al 90%.
Placas de ensayo: Se prepararon "Placas de ensayo" identicas mediante el pipeteo de 50nL de cada una de las diluciones de los compuestos de las "placas maestras" en "placas de ensayo" 384. Los compuestos se mezclaron con 4.5pL de los componentes de los ensayos mas 4.5pL de la enzima correspondiente a una dilucion 1:181 permitiendo la concentracion final de 10, 3.0, 1.0, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01 y 0.003 mM, respectivamente. La preparation de las "placas maestras" estuvo a cargo del robot Matriz PlateMate Plus y la repetition de las "placas de ensayo" por el robot HummingBird.
Metodo para generar las construcciones de expresion
Se clonaron, expresaron y purificaron a las PI3Ka, PI3Kp, PI3K5 y mTORhumanas activas catallticamente como se describe (Maira SM, Stauffer F, Brueggen J, Furet P, Schnell C, Fritsch C, Brachmann S, Chene P, de Pover A, Schoemaker K, Fabbro D, Gabriel D, Simonen M, Murphy L, Finan P, Sellers W, Garcla-Echeverrla C (2008), Mol CancerTher. 7:1851-63 and Maira SM, Pecchi S, Brueggen J, Huh K, Schnell C, Fritsch C, Nagel T, Wiesmann M, Brachmann S, Dorsch M, Chene P, Schoemaker K, De Pover A, Menezes D, Fabbro D, Sellers W, Garcla-Echeverrla C, Voliva CF (2011), Mol. Cancer Ther.accepted).
Ensayos bioqulmicos para PI3Kalfa, PI3Kbeta
El reactivo KinaseGlo para la prueba de luminiscencia basada en la detection de ATP se obtuvo de Promega, (N ° V6714, Lote N ° 236.161) a traves Catalys, Wallisellen, Suiza (L-alfa-fosfatidilinositol (PI), de hlgado, de bovino) se obtuvieron de Avanti Polar Lipid (Cat. N ° 840042C, Lote # LPI-274), el fosfatidilinositol-4 ,5-bisfosfato (PIP (4,5) 2 (Avanti, Cat. N ° 840046X) o el L-a-fosfatidilinositol (PI) se obtuvieron de Avanti Polar Lipid (Cat. N ° 840042C, Lote # LPI-274). El L-a-fosfatidilserina (PS) era de Avanti Polar Lipid (Cat. N ° 840032C), el llpido polar n-octil-glucosido Avanti (Cat. No. 10634425001). La luminiscencia es una lectura bien fundamentada para determinar las concentraciones de ATP y por lo tanto se puede utilizar para seguir la actividad de muchas cinasas independientemente de su sustrato. El ensayo de cinasa CinasaGloLuminescent (Promega, Madison/WI, EE.UU.) es un metodo HTS homogeneo de medir la actividad cinasa mediante la cuantificacion de la cantidad de ATP que permanece en solution despues de una reaccion de la cinasa.
Se distribuyeron 50nl de las diluciones del compuesto sobre placas negras de estireno no vinculantes de 384 pozos de bajo volumen (NBS) (Costar Cat. No. NBS # 3676) tal como se describe en la section 8.2. El L-a-fosfatidilinositol (PI), fue proporcionado como una solucion de 10 mg/ml en metanol, se transfirio a un tubo de vidrio y se seco al haz de nitrogeno. A continuation, se resuspendio en octilglucosido al 3% por agitation y se almaceno a 4 °C. Se anadieron 5 pl de una mezcla de PI/OG con los subtipos PI3Ka y Pi3Kb. Las reacciones de cinasa se iniciaron mediante la adicion de 5 pl de una mezcla de ATP que contiene un volumen final de 10 pl de TRIS-HCl10 mM, a pH de 7.5, MgCh 3 mM, NaCl 50 mM, CHAPS al 0.05%, DTT 1 mM y ATP1 mM, y se produjo a temperatura ambiente. Las reacciones se detuvieron con 10 pl de KinaseGlo y las placas fueron leldas 10 minutos mas tarde en un lector de Synergy2 usando un tiempo de integration de 0.1 segundos por pozo. se anadio NVP-BGT226 a una concentracion de 2.5 M (estandar) a las placas de ensayo para generar el 100% de inhibition de la reaction de la cinasa, y el 0% de inhibition fue dado por el vehlculo disolvente (90% de DMSO en agua). El NVP-BGT226 se utilizo como compuesto de referencia y se incluyo en todas las placas de ensayo en forma de una dilucion de 16 puntos por duplicado.
Los valores de IC50 de la inhibicion porcentual de cada compuesto a 8 concentraciones (por lo general 10, 3.0, 1.0, 0.3, 0.1, 0.030, 0.010 y 0.003 M) n = 2 se derivaron mediante una curva sigmoidal de ajuste de dosis-respuesta a una grafica de la lectura del ensayo sobre la concentracion del inhibidor como se describe. Todos los ajustes se realizaron con el programa XLfit4 (ID Business Solutions, Guildford, Reino Unido).
Ensayos bioqulmicos para PI3Kdelta, PI3Kgamma
El Kit de ensayo universal de cinasa TR-FRET Adapta ™ fue adquirido a Invitrogen Corporation (Carlsbad/CA, EE.UU.) (art. PV5099). El kit contiene los siguientes reactivos: Anticuerpo Adapta Eu-anti-ADP (Anticuerpo anti-ADP marcado
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
con europio en solucion salina amortiguadora de HEPES, Cat. No. PV5097), Alexa Fluor ® 647 marcado con un trazador de ADP (Alexa Fluor ® 647 marcada con trazador de ADP en solucion salina amortiguadora de HEPES, cat. No. PV5098), amortiguador de disolucion TR-FRET pH 7.5 patentado (art. PV3574).
El sustrato Fosfatidilinositol de PIK3CD se obtuvo de Invitrogen (veslculas que constan de PI 2 mM en HEPES 50 mM pH 7.5;. Cat. No. PV5371). El sustrato fosfatidilinositol-4 ,5-bifosfato de PlK3CG (PIP (4,5) 2 se obtuvo de Invitrogen (PIP2: PS veslculas grandes unilamelares que consisten en 1 mM PIP2: 19mM PS en HEPES 50 mM pH 7.5, MgCh 3 mM, EGTA 1 mM, cat. N ° PV5100).
La tecnologla de resonancia de fluorescencia de transferencia de energla resuelta en el tiempo (TR-FRET) es una tecnologla basada en la transferencia de energla entre dos colorantes adyacentes, a partir de un electron excitado lanzado como un foton a continuacion en un colorante (el donante) a un electron de un colorante adyacente (el aceptor) a traves de la resonancia, Esta transferencia de energla es detectada por un aumento en la emision de fluorescencia del aceptor, y por una disminucion en la emision de fluorescencia del donante. Los ensayos de TR-FRET para protelnas cinasas utilizan un lantanido de terbio de largo tiempo de vida o quelatos de europio como la especie donante que supera la interferencia de la autofluorescencia del compuesto o la dispersion de la luz a partir de los compuestos precipitados, mediante la introduccion de un retardo despues de la excitacion por una fuente de excitacion de la lampara de destellos. Los resultados se expresan a menudo como una relacion de las intensidades de los fluoroforos del aceptor y del donante. La naturaleza radiometrica de tal valor corrige las diferencias en los volumenes entre los pozos del ensayo, as! como corrige los efectos del enfriamiento debidos a los compuestos coloreados. El ensayo Adapta ™ se puede dividir en dos fases: una fase de reaccion de la cinasa y una fase de detection de ADP. En la fase de reaccion de la cinasa, se anaden todos los componentes de la reaccion cinasa al pozo y la reaccion se deja incubar durante un perlodo de tiempo especlfico para cada cinasa. Despues de la reaccion, una solucion de deteccion de un anticuerpo anti-ADP marcado con Eu, Alexa Fluor ® 647 marcada con untrazador de ADP, y EDTA (para detener la reaccion de la cinasa) se anaden a los pozos de ensayo. El ADP formado por la reaccion de la cinasa desplazara al Alexa Fluor ® 647 marcada con un trazador de ADP a partir del anticuerpo, lo que resulta en una disminucion de la senal TR-FRET. En presencia de un inhibidor, se reduce la cantidad de ADP formado por la reaccion de la cinasa, y la interaction intacta entre el anticuerpo-trazador resultante mantiene una senal alta de TR-FRET. En el ensayo Adapta ™, el donante (anticuerpo europio-anti-ADP) se excita a 340 nm y transfiere su energla al aceptor (Alexa Fluor ® 647 marcada con trazador de ADP). La emision del Alexa Fluor ® 647 se puede controlar con un filtro centrado a 665 nm, ya que se encuentra entre los picos de emision del donante, que se mide a 615/620 nm.
Se dispensaron 50 nl de las diluciones de los compuestos en placas blancas de poliestireno de pequeno volumen de 384 pozos, como se describe en el apartado 2.2. A continuacion, se incuban 5 pl de PI3Kg y PI3Kd y de sustrato lipldico (PI o PIP2: PS), seguido de 5 pl de ATP (volumen de ensayo final de 10 pl) a temperatura ambiente. El amortiguador de la reaccion estandar para el ensayo de TR-FRET Adapta ™ contenla Tris-HCl 10 mM pH 7.5, MgCl2 3 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, CHAPS al 0.05%. Las reacciones se detuvieron con 5 pl de una mezcla de EDTA que contiene el anticuerpo anti-ADP marcado con Eu y el Alexa Fluor ® 647 marcada con un trazador de ADP en un amortiguador de dilution de TR-FRET (propiedad de IVG). Se leen las placas 15 a 60 minutos mas tarde en un lector de Synergy2 usando un tiempo de integration de 0.4 segundos y un retraso de 0.05 segundos. El control para el 100% de inhibition de la reaccion de la cinasa se realizo mediante la sustitucion de la PI3K por el amortiguador de reaccion estandar. El control de la inhibicion del 0% fue dado por el vehlculo disolvente de los compuestos (90% DMSO en H2O). El compuesto estandar de NVP-BGT226 se utilizo como compuesto de referencia y se incluyo en todas las placas de ensayo en forma de una dilucion de 16 puntos por duplicado.
Los datos se analizaron utilizando el software de ajuste Excel o GraphpadPrism. Los valores de CE50 se derivaron mediante una curva sigmoidal de ajuste de dosis-respuesta a una grafica de la lectura del ensayo sobre la concentration del inhibidor Todos los ajustes se realizaron con el programa XLfit4 (ID Business Solutions, Guildford, Reino Unido). La determination de los valores de CE50 del porcentaje de inhibicion de cada compuesto a 8 concentraciones (por lo general 10, 3.0, 1.0, 0.3, 0.1, 0.030, 0.010 y 0.003 M) n = 2 se obtuvieron por una curva sigmoidal de ajuste dosis-respuesta a una grafica de lectura del ensayo sobre la concentracion del inhibidor. Todos los ajustes se realizaron con el programa XLfit4 (ID Business Solutions, Guildford, Reino Unido).
Ensayo bioqulmico para mTOR
Los ensayos TR-FRET para protelnas cinasas utilizan terbio, un lantanido de largo tiempo de vida o quelatos de europio como la especie donante que superan la interferencia por autofluorescencia del compuesto o por dispersion de la luz a partir de los compuestos precipitados, mediante la introduccion de un retardo despues de la excitacion por una fuente de excitacion de la lampara de destellos. Los resultados se expresan a menudo como una relacion de las intensidades de los fluoroforos del aceptor y del donante. La naturaleza radiometrica de tal valor corrige las diferencias en los volumenes entre los pozos de ensayo, as! como corrige los efectos del enfriamiento debido a los compuestos coloreados.
Los ensayos de union se basan en la union y el desplazamiento de inhibidores de cinasa etiquetados con Alexa Fluor® 647 ATP-competitivos, para la cinasa de interes. "Trazadores Cinasa" de Invitrogen se ha desarrollado para hacer frente a una amplia gama de objetivos cinasa y esta basada en inhibidores ATP-competitivos de cinasa, que los hace adecuados para la deteccion de cualquiera de los compuestos que se unen al sitio de ATP o a un sitio alosterico para
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alterar la conformacion del sitio del ATP. Los inhibidores que se unen al sitio del ATP incluyen tanto inhibidores de la cinasa Tipo I, que se unen exclusivamente al sitio del ATP, y los inhibidores de tipo II (por ejemplo, Gleevec ®/imatinib, sorafenib, BIRB-796), que se unen tanto al sitio del ATP y a un sitio hidrofobo expuesto en la conformacion DFG-out (no activo). Los inhibidores de tipo III son compuestos que no compiten con el ATP, se refiere vagamente a estos como inhibidores alostericos. Un estudio de 15 diversos inhibidores de tipo III demostro que todos menos un compuesto fue detectado en el ensayo de union con una potencia equivalente a la de los ensayos de actividad. La unica exception fue un compuesto sustrato-competitivo, y por lo tanto no se trata de un inhibidor alosterico verdadero.
En contraste con la mayorla de los ensayos de actividad cinasa basados en fluorescencia, los ensayos de union a cinasa LanthaScreen ® Eu3+ pueden ser leldos de forma continua, lo que facilita la evaluation de los compuestos con una cinetica de union lenta. Tambien, a diferencia de la mayorla de los ensayos de actividad, los ensayos de union pueden realizarse usando preparaciones ya sea activos o no activadas de cinasa, lo que permite la caracterizacion de los compuestos que se unen preferentemente a cinasas no activadas, tales como Gleevec ®/imatinib y algunos inhibidores alostericos.
En el ensayo de union a cinasa LanthaScreen ™, el donante (anticuerpo anti-GSTEu3+-) se excita a 340 nm y transfiere su energla al aceptor (inhibidor de cinasa ATP-competitivo marcado con Alexa Fluor® 647 = Trazador-314). La emision desde el trazador-314 (inhibidor Alexa Fluor ® 647) se puede controlar con un filtro centrado a 665 nm, ya que se encuentra entre los picos de emision del donante, que se mide a 615/620 nm. La union de ambos, el anticuerpo anti-GST-Eu3+ y el trazador-314, a la cinasa resulta en un alto grado de FRET del fluoroforo Eu3+-donante al fluoroforo aceptor Alexa-Fluor®647- en el trazador-314. La union de un inhibidor de la cinasa compite por la union con el trazador, lo que resulta en una perdida de FRET.
Se dispensaron 50 nl de las diluciones de los compuestos en placas de poliestireno de 384 pozos de pequeno volumen, como se describe en el apartado 2.2. A continuation, 5 |jl de GST-mTOR y el anticuerpo europio-anti-GST seguido de 5 jl de trazador-314 (volumen de ensayo final de 10 jl) se incuban a Temperatura Ambiente. El amortiguador de reaction estandar para el ensayo de union LanthaScreen ™ cinasa contenla HEPES 50 mM pH 7.5, MgCl2 5 mM, EGTA 1 mM, 0.01% de Pluronic F-127. Las placas se leen 60 minutos mas tarde en un lector Synergy2 con un tiempo de integration de 0.2 microsegundos y un retraso de 0.1 microsegundos.
Para calcular la relation de emision, la senal emitida a 665 nm desde el aceptor (Alexa Fluor ® 647-marcado con trazador -314) se divide por la senal emitida a 620 nm del donante (anticuerpo anti-GSTEu3+)
El control de la inhibition del 0% fue dado por el vehlculo disolvente de los compuestos (90% DMSO en H2O). el control de la inhibicion relativa del 100% se realizo mediante la adicion de 10 mM en la mezcla que contiene GST- mTOR y anticuerpo anti-GST con europio. Un control adicional para la inhibicion absoluta 0% esta dada por el anticuerpo anti-GST Eu3+ sin GST-mTOR.
Ensayos celulares para PI3Kalfa, beta y delta
La tecnologla AlphaScreen (Ensayo de luminosidad Amplificada de Proximidad Homogenea, ALPHA, Perkin Elmer) es una tecnologla de ensayo de proximidad basado en perlas no radiactivas para estudiar las interacciones biomoleculares en el formato de una placa de microtitulacion homogenea. El nombre de marca SureFire denota ensayos AlphaScreen que estan adaptados para cuantificar la fosforilacion de las protelnas celulares endogenas en los lisados celulares, mediante el uso de pares de anticuerpos apareados, que consisten de un anticuerpo anti-fosfo- cinasa y un anticuerpo anti-cinasa. El ensayo permite la caracterizacion de la serialization de cinasa en las celulas as! como la medicion de los efectos inhibidores de la cinasa. La tecnologla AlphaScreen proporciona varias ventajas sobre las tecnicas de ensayo convencionales tales como ELISA, ya que evita procedimientos de lavado que consumen mucho tiempo as! como reduce la manipulation de las placas. Ademas, es miniaturizable al menos a un formato de 384 pozos y proporciona una sensibilidad de hasta el rango femtomolar, lo que depende de la afinidad de los anticuerpos incluidos en el kit de ensayo individual SureFireAlphaScreen. La alta sensibilidad se alcanza por un mecanismo de amplification intrlnseca, que implica la production de moleculas de oxlgeno aisladas. Los kits de ensayo SureFire estan disponibles comercialmente para objetivos especlficos e incluyen pares de anticuerpos validados (PerkinElmer). Este informe describe los procedimientos comunes aplicados para los ensayos de SureFireAlphaScreen y sus respectivos pasos semi-automatizados para la rutina de perfilamiento de un inhibidor de cinasa en ensayos basados en celulas.
Las llneas celulares Rat-1 que sobreexpresan establemente a las isoformas de la PI3K activada de clase I Rat-1 pBabePuro Myr-HA-HP110 delta (Rat-1_PI3Kdelta); Rat-1 pBabePuro Myr-HA-hp110alpha (Rat-1_PI3Kalpha) y Rat- 1 pBabePuroMyr- HA-HP110 beta (Rat-1_PI3beta) se prepararon como se describe (Maira Sm, Stauffer F, Brueggen J, Furet P, Schnell C, Fritsch C, Brachmann S, Chene P, de Pover A, Schoemaker K, Fabbro D, Gabriel D, Simonen M, Murphy L, Finan P, Sellers W, Garcla-Echeverrla C (2008), Mol CancerTher. 7:1851-63 and Maira SM, Pecchi S, Brueggen J, Huh K, Schnell C, Fritsch C, Nagel T, Wiesmann M, Brachmann S, Dorsch M, Chene P, Schoemaker K, De Pover A, Menezes D, Fabbro D, Sellers W, Garcla-Echeverrla C, Voliva CF (2011), Mol. CancerTher., accepted). Todas las llneas celulares se cultivaron en medio de crecimiento completo (DMEM alto contenido de glucosa, 10% (v/v) de suero fetal bovino, 1% (v/v) MEM NEAA, HEPES10 mM L-glutamina, 2 mM, puromicina (10 mg/ml para Rata- 1_PI3Kdelta y Rata-1_PI3Kalpha, 4 ug/ml de Rata-1_PI3beta), 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina) a un 90% de
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Los siguientes materiales fueron utilizados para la detection de p-AKT (S473) en lisados de celulas Rat-1: medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), niveles altos de glucosa (Gibco Invitrogen, Basilea, Suiza, Cat. N ° 41965.), Suero fetal bovinoinactivado por calor, MEM aminoacidos no esenciales (NEAA; Gibco Invitrogen, Basilea, Suiza, art 11140) HEPES (Gibco Invitrogen, Basilea, Suiza, Lote No. 16140 HI FBS.), (Gibco Invitrogen, Basilea, Suiza, Cat. No. 15630), penicilina/estreptomicina (Pen/Strep, 100x, Gibco Invitrogen, Basilea, Suiza, art 15140-122), L-glutamina (Gibco Invitrogen, Basilea, Suiza, art 25030), puromicina (Sigma Aldrich, Buchs, Suiza, cat. No. p9620), DmSO (Merck, Dietikon, Suiza, cat. No. 8.02912.2500), H2O, H2O Milli-Q- a menos de que se indique lo contrario (Millipore QGARDOOR1, Millipore, Zug, Suiza), albumina de suero bovino (BSA;. Sigma Aldrich, Buchs, Suiza No. de Cat. A8412), Kit de ensayo SureFire p-Akt (Ser473) (Perkin Elmer, Schwerzenbach, Suiza, Cat. No. TGRAS50K).
El ensayop-Akt (S473) de SureFire mide la fosforilacion endogena celular de Akten en lisados celulares de Ser473. El uso de celulas Rat-1 que expresan de forma estable las versiones myr-HA-etiquetadas de las isoformas de las subunidades catallticas humanas p110PI3Kdelta, PI3Kalfa, o PI3Kbeta, el ensayo fue desarrollado como un protocolo de dos placas en un formato de 384 pozos.
Para ensayar los compuestos, se sembraron las celulas a una densidad de 4,000 celulas (Rata-1_PI3Kdelta), 7500 (Rata-1_PI3Kalpha), o 6200 (Rata-1_PI3Kbeta) en 20 pl de medio de crecimiento completo en placas de cultivo de 384 pozos tratadas y fueron cultivadas a 37 °C/CO2 al 5%/ 90% de humedad durante 24 h. Poco antes de la transferencia del compuesto, se retiro el medio completo, se anadieron 30 pl de amortiguador de ensayo (DMEM alto en glucosa, 1x MEM NeAA, HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, 0.1% (w/v) de BSA) y fueron transferidos 10 pl de las prediluciones de los compuestos a las celulas. Para la prueba realizada despues de febrero de 2010, se sustituyo el amortiguador de ensayo por un medio de crecimiento completo, que revelo resultados similares (datos no mostrados). Despues del tratamiento con el compuesto durante 1 h, las celulas se lisaron mediante la adicion de 20 pl de amortiguador de lisis suplementado con 0.24% (w/v) de BSA. La deteccion de p-AKT (Ser473) se realizo por medio del Kit de ensayo SureFirep-Akt1/2(Ser473) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando 5 pl de lisado de celulas en un volumen de deteccion total de 12 pl.
Los valores de IC50 de la inhibition porcentual de cada compuesto a 8 concentraciones (por lo general 10, 3.0, 1.0, 0.3, 0.1, 0.030, 0.010 y 0.003 M) n = 2 se derivaron mediante una curva sigmoidalde ajuste de dosis-respuesta a una grafica de la lectura del ensayo sobre la concentration del inhibidor como se describe. Todos los ajustes se realizaron con el programa XLfit4 (ID Business Solutions, Guildford, Reino Unido).
Ensayo celular para mTOR
Se desarrollo un ensayo basado en celulas (en un formato de 384 pozos) para la determination de los efectos del compuesto sobre la actividad de mTOR celular en MEF (fibrobrastos de embrion de raton) las celulas derivadas de ratones que carecen de TSC1 (Complejo 1 de Tuberosclerosis) un potente supresor de la actividad de mTOR. Debido a la falta de TSC1, el mTOR se activa constitutivamente lo que resulta en una fosforilacion permanente del Thr 389 de la cinasa S6 1 (S6K1), que es uno de los objetivos de corriente abajo de mTOR.
El uso de un kit SureFire permite determinar la fosforilacion del Thr389 enla S6K1 se desarrollo un ensayo, validado e implementado en el formato Alpha-Screen que permite la determinacion cuantitativa de fosfo-T389 de S6K1 en los lisados celulares. El tratamiento de las celulas MEF TSC1-/ con inhibidores especlficos de mTOR (o via mTOR-) reducen los niveles dosis-dependiente de fosfo-T389 de S6K1 que permita calcular los valores de IC50. Estos estaban de acuerdo con los valores obtenidos con el ensayo bioqulmico de union a ATP de mTOR que permite una comparacion cuantitativa de la potencia de los inhibidores de mTOR.
Las celulas TSC1-/- MEFs (Kwiatkowski, DJ, Zhang, H., Bandura, JL, Heiberger, KM, Glogauer, M., el-Hachemita, N., y Onda, H. (2002) Hum Mol Genet - TSC1-/... 11, 525-534) se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con FBS al 10% (Invitrogen), glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina al 1% (p/v) a 37 ° C, y CO2 al 5%.
El kit SureFire para la determinacion de la fosforilacion de la cinasa P70S6 se adquirio a Perkin Elmer (p70S6K p- T389, # TGR70S50K) y el ensayo se realizo de acuerdo a las instrucciones del proveedor y de acuerdo con el metodo generico para los ensayos SureFire. Poco, se transfirieron 5 pl de lisado celular por pozo a las placas blancas de 384 pozos (para la lectura luminiscente) y se mezclaron con 7 pl de A y 5 pl de B (volumen final: 12 pl.) Despues de 3 h de incubation en la oscuridad a temperatura ambiente, la luminiscencia se medira con un lector Envision (Perkin Elmer). Las celulas no tratadas se utilizaron como control (control alto) y las celulas tratadas con BEZ2353 mM se utilizaron como bajo control. La ventana de analisis entre las senales obtenidas por los controles alto y bajo se define como el 100% y los efectos del compuesto se expresaron como un porcentaje de inhibicion. Los valores de IC50 se calculan a partir de las curvas de respuesta a la dosis mediante extrapolation grafica.
Los resultados obtenidos con los ensayos anteriormente descritos se proporcionan en las siguientes tablas.
Ensayo Bioquimico PI3Kalfa
Ejemplo No.
PI3Ka/IC50 [umol I-1]
1
0.006
2
0.078
3
0.005
4
0.047
5
0.023
6
0.071
7
0.061
8
0.057
9
0.010
10
0.009
11
0.017
12
0.008
13
0.006
14
0.007
WO2007/084786 Ejemplo 17
0.094
WO2007/084786 Ejemplo 18
0.091
WO2007/084786 Ejemplo 85
0.016
WO2007/084786 Ejemplo 324
0.327
WO2007/084786 Ejemplo 343
0.015
Ensayo Bioquimico PI3Kbeta
Ejemplo No.
PI3Kb/IC50 [umol I-1]
1
0.009
2
0.096
3
0.007
4
0.159
5
0.031
6
0.460
7
0.110
8
0.067
9
0.015
10
0.005
11
0.010
Ejemplo No.
PI3Kb/IC50 [umol I-1]
12
0.007
13
0.011
14
0.006
WO2007/084786 Ejemplo 17
0.237
WO2007/084786 Ejemplo 18
0.236
WO2007/084786 Ejemplo 85
0.015
WO2007/084786 Ejemplo 324
1.067
WO2007/084786 Ejemplo 343
0.027
Ensayo Bioquimico PI3Kdelta
Ejemplo No.
PI3Kd/IC50 [umol I-1]
1
0.003
2
0.027
3
0.004
4
0.066
5
0.147
6
0.079
7
0.041
8
0.026
9
0.010
10
0.031
11
0.014
12
0.004
13
0.003
14
0.016
WO2007/084786 Ejemplo 17
0.848
WO2007/084786 Ejemplo 18
1.978
WO2007/084786 Ejemplo 85
0.024
WO2007/084786 Ejemplo 324
1.219
WO2007/084786 Ejemplo 343
0.110
Ensayo Bioquimico PI3Kgamma
Ejemplo No.
PI3Kg/IC50 [umol I-1]
1
0.092
2
5.8
3
0.110
4
4.5
5
3.5
6
7
7
3
8
0.580
9
0.230
10
0.343
11
0.102
12
0.135
13
0.100
14
0.027
WO2007/084786 Ejemplo 17
3.36
WO2007/084786 Ejemplo 18
7.35
WO2007/084786 Ejemplo 85
0.315
WO2007/084786 Ejemplo 324
4.46
WO2007/084786 Ejemplo 343
0.170
Ensayo de union mTor
Ejemplo No.
mTor/IC50 [umol I-1]
1
0.251
2
2.8
3
0.850
4
>9.7
5
2.25
6
4.7
7
2.7
8
0.960
9
10
1.01
11
0.870
Ejemplo No.
mTor/IC50 [umol I-1]
12
0.750
13
0.230
14
0.490
WO2007/084786 Ejemplo 17
5.06
WO2007/084786 Ejemplo 18
3.3
WO2007/084786 Ejemplo 85
2.35
WO2007/084786 Ejemplo 324
>9.55
WO2007/084786 Ejemplo 343
>10
Ensayo celular PI3Kalfa
Ejemplo No.
Rat1-PI3Ka/IC50 [umol I-1]
1
0.031
2
1.07
3
0.074
4
0.597
5
0.434
6
0.930
7
0.452
8
0.173
9
0.029
10
0.085
11
0.032
12
0.063
13
0.126
14
0.046
WO2007/084786 Ejemplo 17
0.369
WO2007/084786 Ejemplo 18
0.606
WO2007/084786 Ejemplo 85
0.127
WO2007/084786 Ejemplo 324
1.730
WO2007/084786 Ejemplo 343
>10
Ensayo celular PI3Kbeta
Ejemplo No.
Rat1-PI3Kb/IC50 [umol I-1]
1
0.020
Ejemplo No.
Rat1-PI3Kb/IC50 [umol I-1]
2
0.751
3
0.033
4
0.757
5
0.201
6
0.420
7
0.430
8
0.026
9
0.254
10
0.023
11
0.026
12
0.064
13
<0.003
14
0.007
WO2007/084786 Ejemplo 17
1.54
WO2007/084786 Ejemplo 18
1.58
WO2007/084786 Ejemplo 85
0.156
WO2007/084786 Ejemplo 324
5.31
WO2007/084786 Ejemplo 343
>10
Ensayo celular PI3Kdelta
Ejemplo No.
Rat1-PI3Kd/IC50 [umol I-1]
1
0.0113
2
0.105
3
0.006
4
0.298
5
0.119
6
0.144
7
0.123
8
0.028
9
0.011
10
0.022
11
0.020
12
0.004
13
<0.003
Ejemplo No.
Rat1-PI3Kd/IC50 [umol I-1]
14
0.004
WO2007/084786 Ejemplo 17
1.04
WO2007/084786 Ejemplo 18
1.47
WO2007/084786 Ejemplo 85
0.139
WO2007/084786 Ejemplo 324
6.54
WO2007/084786 Ejemplo 343
0.105
Ensayo celular mTOR
Ejemplo No.
mTOR S6K(T389) TSC1ko/IC50 [umol I-1]
1
0.243
2
>2.27
3
0.159
4
>2.27
5
0.371
6
>2.27
7
>2.27
8
>4.55
9
10
0.221
11
0.747
12
0.274
13
1.07
14
0.724
WO2007/084786 Ejemplo 17
2.12
WO2007/084786 Ejemplo 18
>2.27
WO2007/084786 Ejemplo 85
1.03
WO2007/084786 Ejemplo 324
>2.27
WO2007/084786 Ejemplo 343
>2.27
Fotoestabilidad
5 Las muestras analizadas para evaluar su estabilidad a la luz fueron tratadas en una camara de estabilidad a la luz (Atlas CPS +, Numero de serie 0704013). Se prepararon soluciones de 1.0mg/ml en etanol para cada molecula y se dispensaron allcuotas de 0.5 ml en micro tubos adecuados. Todas las mediciones se realizaron por duplicado y se compararon con una referencia envuelta en papel de aluminio durante la exposition a la luz. Las soluciones fueron expuestas a 19620kJ/m2 sobre las 13h. Las muestras se mantuvieron a 15 ° C durante el experimento. Despues del 10 tratamiento en la camara de la luz, las soluciones se analizaron por UPLC (UPLC 1, parte experimental) a 254 nm. Las areas de los picos se integraron automaticamente, y el porcentaje de degradation se calculo como la diferencia
5
10
15
20
25
30
Los datos obtenidos con este metodo se muestran en la tabla siguiente:
Ejemplo No.
% de degradation en el ensayo de fotoestabilidad (promedio)
1
8%
2
3%
3
3%
5
17%
6
0%
10
7%
12
12%
13
4%
14
8%
WO2007/084786 Ejemplo 17
82%
WO2007/084786 Ejemplo 18
81%
WO2007/084786 Ejemplo 85
40%
WO2007/084786 Ejemplo 324
54%
WO2007/084786 Ejemplo 343
31%
Inhibicion anti-proliferativa sobre la proliferacion de llneas celulares Celulas y cultivos celulares utilizados para la caracterizacion de compuestos
Las SCL-1 y SCC12B2 son llneas de celulas escamosas cutaneas humanas del carcinoma de celulas (SCC) derivadas de las de origen natural, y pobremente diferenciadas SCC. La llnea celular SCL-1 se establecio originalmente en el laboratorio de N. Fusenig en la Investigation en el Centro del Cancer en Heidelberg, y sus caracterlsticas de crecimiento in vitro en comparacion con los queratinocitos normales fueron descritas anteriormente (Neely et al 1991). La llnea celular SCC12B2 se establecio como se ha descrito previamente (Rheinwald y Beckett, 1981) a partir de la piel de la cara de un paciente con trasplante de sexo masculino que recibio la terapia inmunosupresora de 7 anos. La llnea celular humano SCC Detroit562 se obtuvo de American Tissue Culture Collection (ATCC). Detroit562 se conoce como Head&Neck carcinomas de celulas escamosas (CECC) y se deriva de un tumor SCC. La llnea celular Detroit562 desencadena la activation de la mutation H1047R del gen PIK3CA. Esta mutation es conocida como una de las mutaciones "punto caliente" de p110a- la cadena que representa a la isoforma de esta cinasa constitutivamente activa y la estimulacion de la via de Akt/mTOR independiente de la activacion del receptor del factor de crecimiento. Todas las llneas celulares SCC se mantuvieron y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, numero de catalogo: # 10938), que se complemento adicionalmente con 5% de FCS (Gibco, # 16000-044), 1o0pM de sodio-piruvato (Gibco; # 11360-039), 10 mM de HEPES (Gibco, # 91002-066), 50U/ml penicilina y estreptomicina mezcla de 50pg/ml (Gibco, # 15070-063), y 2 mM L-glutamina (Gibco, # 25030-024). Todas las concentraciones se dan como concentraciones definitivas. Las celulas se propagaron en frascos Corning Costar con tapas de ventilation, utilizando cualquiera de los dos tamanos de frasco con areas de crecimiento de75cm2 (Corning, # 430641), o 150cm2 (Corning, # 430825). Los cultivos celulares se mantuvieron rutinariamente a 37 ° C en una atmosfera que contiene 5% de CO2 y 80% de humedad relativa (tipo Heraeus).
Medida de la proliferacion celular
Las celulas de SCC o llneas de queratinocitos (Detroit562, SCC12B2, SCL1, HaCaT) se utilizaron para los ensayos de proliferacion cuando hablan alcanzado alrededor del 80% al 90% de confluencia. Las celulas fueron cosechadas despues de un desalojamiento de los frascos de cultivo mediadocon tripsina, se lavaron en un medio de cultivo que contiene 10% de FCS, se contaron en un hemocitometro y en medio de cultivo completo diluido con 5% de FCS para obtener una densidad celular de 5x104 celulas/ml. Fueron transferidos 100pl de esta suspension de celulas (por
ejemplo, 5000 celulas) en cada pozo de una placa blanca de cultivo de tejidos de 96 pozos (artlcuio Corning-Costar # 3917). Despues las celulas se dejaron sedimentar por su inclusion en el incubador de CO2 durante 45 a 60 minutos. Posteriormente, se anadio un volumen de 100pl de medio de cultivo que contiene el doble de la concentracion final deseada del compuesto de ensayo a cada pozo por pozos cuadruplicados. Un cuadruplicado recibio 100pl de medio 5 de cultivo sin el artlculo de prueba como de control (se indica en las figuras de datos con la abreviatura no cpd en el eje x). Los cultivos celulares se incubaron a continuacion en presencia o ausencia de los compuestos de ensayo para un total de 26 a 28 horas. La proliferacion celular se determino sobre la base de la incorporacion de bromodesoxi- uridin (BrdU) en el ADN celular utilizando el quimioluminiscente de proliferacion de celulas BrdU ELISA (artlculo de Roche # 11 669 915 001). En pocas palabras, el reactivo de BrdU se diluyo 1:100 con medio de cultivo completo para 10 obtener una concentracion de 100pM BrdU. A partir de esta solucion, se anadieron 20pl a cada pozo y el cultivo celular se incubo adicionalmente durante 16 a 18 horas a 37 ° C en 5% de CO2. El ensayo de proliferacion se detuvo despues de 44 a 46 horas con la eliminacion completa del medio de cultivo y la adicion de 200pl de solucion de fijacion (proporcionado con el kit de ELISA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las siguientes incubaciones, lavados y procedimientos de desarrollo de los ensayos se llevaron a cabo exactamente como se describe en el manual de 15 ensayo de ELISA proporcionado por el fabricante (Roche). La incorporacion de BrdU en el ADN se detecto mediante anticuerpos BrdU-especlficos y fueron cuantificados sobre la base de una luciferasa de generation de senal mediada por un anticuerpo acoplado. La emision de luminiscencia se midio en un contador de luminiscencia luz 1420 Victor, (Perkin Elmer) y se expreso como unidades relativas de luminiscencia (por ejemplo, puntos de datos dados como RLU/s) por segundo. Los puntos de datos de cada pozo se transfirieron a las hojas de calculo de Excel de Windows 2 0 ® para el calculo de los valores medios y la desviacion estandar. Estos valores fueron graficados utilizando la funcion
de curva sigmoidal de ajuste disponible en el software origin 7.5 ®.
Potencia anti-proliferativa de los compuestos medidos en las llneas celulares SCC Los datos obtenidos usando estas llneas celulares de queratinocitos y SCC se muestran en la siguiente tabla. Todos los valores que indican la potencia anti-proliferativa representan las concentraciones nanomolares de CI50 obtenidas en dos ensayos independientes 25 utilizando cualquiera de las llneas de celulas SCC SCL-1, SCC12B2, Detroit562 o la llnea celular de queratinocitosHaCaT:
Ejemplo No.
SCC12B2 SCL-1 Detroit562 HaCaT
medicion
# 1 # 2 # 1 # 2 # 1 # 2 # 1 # 2
Ejemplo 1
1289 703 351 268 598 440 282 298
WO2007/084786 Ejemplo 17
5823 4938 4891 3302 3084 4408 2796 3961
WO2007/084786 Ejemplo 18
5737 5250 4267 3267 2813 4550 1655 3078
WO2007/084786 Ejemplo 85
1645 1144 1025 636 1905 1448 1057 1017
WO2007/084786 Ejemplo 324
6296 6040 3304 3700
WO2007/084786 Ejemplo 343
4861 2471 2624 1683 2393 1371 1616 1490
Todos los valores estan en concentraciones nanomolares de IC50 Penetration de la piel
3 0 Las propiedades de penetracion/permeacion de la piel de un compuesto representativo de la presente invention fueron evaluadas de la siguiente manera:
Prueba in vitro para determinar la penetracion en la piel y las propiedades de permeation
El compuesto se aplica en forma de soluciones al 0.5% en propilenglicol mezclado con etanol o alcohol olelco a piel de cerdo montada en celdas de difusion estatica de tipo Franz. Al final de un tiempo de exposition de 48 horas, se 3 5 midieron las concentraciones de farmaco en la piel (despues de la eliminacion del estrato corneo) y en el receptor. La solucion del receptor es una mezcla de dos partes en volumen de amortiguador fosfato salino (PBS) y una parte en volumen de suero fetal de ternera (FCS).
Penetracion de la piel y permeacion in vitro
Ejemplo
Fuente de la piel (a) Formulacion Concentracion [%] de compuesto Concentracion de la piel [mg/g] Tasa de permeacion [ng/cm2/h]
1
Cerdo PG + etanol (7 3) (b) 0.5 10.8 ± 1.7 1.0 ± 0.3
1
Cerdo PG/OA (9 1) (c) 0.5 107.6 ± 31.4 301.1 ± 129.5
Las concentraciones de piel se dan como media ± desviacion estandar de las determinaciones por cuadruplicado.
(A) : la piel se obtiene a partir de cerdos de granja de 4 meses de edad (Landrace X DeutschesEdelschwein)
(B) : 7 partes en volumen de propilenoglicol (PG) se mezclan con de 3 partes en volumen de etanol
5 (C): 9 partes en volumen de PG mezclaron con 1 parte en volumen de alcohol olelco (OA)
El compuesto del ejemplo 1 penetra bien en la piel de cerdo in vitro, mientras que la tasa de permeacion a traves de piel de cerdo es baja, lo que indica una exposition sistemica baja. La piel de cerdo es similar a la piel humana con respecto a la funcion de barrera y a la arquitectura.
Prueba in vivo para determinar la penetration en la dermis de los cerdos tratados por via topica
10 Las areas pequenas de la piel (4cm2) en la parte posterior dorso lateral de cerdos domesticos jovenes fueron tratadas topicamente con soluciones o suspensiones al 0.5% en diferentes intervalos de tiempo (2 y 24 h) antes de la determination del nivel de los farmacos. En este experimento, 4 cerdos fueron tratados, y el compuesto administrado en la formulation respectiva en 4 sitios diferentes. Los colgajos de piel con los sitios tratados en el centro fueron disecados y eliminados. Los colgajos de piel se extendieron, en bloques de metal con calefaccion en los sitios de 15 ensayo durante 1 minuto para inducir la separation de la epidermis de la dermis. Despues del retiro de las laminas epidermicas aflojadas, se prepararon cortes dermicos del mm de espesor a partir de la piel tratada, la piel de- epidermizada con un dermatoma. A partir de estos cortes se recogieron y analizaron las muestras de perforation de 6 mm (6 mm de diametro) para la concentration de compuesto de ensayo mediante LC/MS. El procedimiento descrito se realiza con cuidado de evitar la contamination de las muestras dermicas con compuesto unido superficialmente a 2 0 la epidermis.
La siguiente tabla proporciona las concentraciones dermicas de compuesto del ejemplo 1 en la dermis de cerdo cuando se aplica epicutaneamente en las formulaciones identificadas. La tabla de datos proporciona la media ± el error estandar de la media de 8 determinaciones (por ejemplo, ocho muestras de piel analizadas con respecto a cada punto de tiempo).
2 5 PK de la piel en cerdos in vivo
Ejemplo
Formulacion composition de compuesto anadido al 0.5% Concentracion dermis [mg/g] medida despues de 2h Concentracion dermis [mg/g] medida despues de 24 horas
1
1% de Tween ® 80, 98% de agua, 1% de HPMC 0.95 ± 0.42 1.29 ± 0.54
1
10% OA, 89% de agua, 1% Sepineo 2.58 ± 0.48 0.37 ± 0.13
1
10% de EtOH, 89% de agua, 1% de HPMC 1.57 ± 0.52 0.66 ± 0.38
1
10% de EtOH, 10% de PG, 79% de agua, 1% de HPMC 0.68 ± 0.2 0.52 ± 0.24
Se da la Media ± el error estandar medio de ocho determinaciones Tween ® 80: monooleato de polioxietilensorbitan OA: Alcohol olelco
PG: propilenglicol EtOH: etanol
HPMC: hidroxipropilmetilcelulosa
El compuesto del ejemplo 1 penetra bien en la piel de cerdo al llegar a la dermis in vivo despues de una sola aplicacion.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de la formula (I) y/o una sal farmaceuticamente aceptable y/o solvato del mismo,
    imagen1
    en donde,
    5 R1 es metilo, etilo o hidroximetilo;
    R2 es fenilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, Ci- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o Ci- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para,
    o
    10 piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, C1- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxi para la posicion para,
    o
    un heteroarilo monoclclico de 5 miembros, que contiene 2 a 3 heteroatomos seleccionados a partir de N, O, o S, que 15 se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F;
    y
    R3 es H o metilo.
  2. 2.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, de la formula (Ib)
    imagen2
    2 0 3.- Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 o reivindicacion 2, en donde
    R2 es fenilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, Ci- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o C1- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
  3. 4. - Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 o reivindicacion 2, en donde
    R2 es piridilo, que se sustituye o no se sustituye en las posiciones meta y/o para con 1 o 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D, F o metoxilo para la posicion meta y a partir de D, F, Ci- C5- alcoxilo, hidroxi- C2- C4- alcoxilo o Ci- C2- alcoxi- C2- C4- alcoxilo para la posicion para.
  4. 5. - Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 o reivindicacion 2, en donde
    R2 es un heteroarilo monoclclico de 5 miembros, que contiene 2 a 3 heteroatomos seleccionados a partir de N, O, o
  5. 5. que se sustituye o no se sustituye con 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados a partir de D o F.
  6. 6. - Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde R1 es metilo.
  7. 7. - Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde R1 es etilo.
  8. 8. - Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde R1 es hidroximetilo.
  9. 9. - Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, seleccionado a partir de
    (4S,5R)-3-(2'-amino-2-morfolin--4-il-4'-trifliorfometil-[4,5']bipirimidinil-6-il)-4-metil-5-tiazol-2-il-oxazolidin-2-ona,
    (4S*,5S*)-3-(2'-amino-2-morfolin-o-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-4-etil-5-(4-metoxifenil)oxazolidin-2-ona,
    (45.55) -3-(2'-amino-2-morfolin-o-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-4-(hidroximetil)-5-(4-metoxifenil)oxazolidin-2- ona,
    (4S*,5R*)-3-(2'-amino-2-morfolin-o-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-4-etil-5-feniloxazolidin-2-ona,
    (45.55) -3-(2'-amino-2-morfolin-o-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-4-metil-5-feniloxazolidin-2-ona, (4R*,5R*)-3-(2'-amino-2-morfolin-o-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-4-etil-5-(3-metoxifenil)oxazolidin-2-ona, (4S,5R)-3-(2'-amino-2-morfolin-o-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-4-etil-5-(tiazol-2-il)oxazolidin-2-ona, 3-(2'-amino-2-morfolin--4-il-4'-trifliorfometil-[4,5']bipirimidinil-6-il)-4-etil-5-piridin-3-il-oxazolidin-2-ona, 3-(2'-amino-2-morfolin--4-il-4'-trifliorfometil-[4,5']bipirimidinil-6-il)-4-metil-5-piridin-3-il-oxazolidin-2-ona,
    (45.55) -3-(2'-amino-2-morfolin--4-il-4'-trifliorfometil-[4,5']bipirimidinil-6-il)-4-hidroximetil-5-fenil-oxazolidin-2-ona,
    (45.55) -3-(2'-amino-2-morfolin--4-il-4'-trifliorfometil-[4,5']bipirimidinil-6-il)-4-metil-5-tiazol-2-il-oxazolidin-2-ona,
    (45.55) -3-(2'-amino-2-morfolin-o-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-4-(hidroximetil)-5-(4-(2- metoxietoxi)fenil)oxazolidin-2-ona,
    (45.55) -3-(2'-amino-2-morfolin-o-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-5-(4-(2-hidroxietoxi)fenil)-4- (hidroximetil)oxazolidin-2-ona o
    (45.55) -3-(2'-amino-2-morfolin-o-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-4-(hidroximetil)-5-(4-(3- hidroxipropoxi)fenil)oxazolidin-2-ona.
  10. 10. Un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, que es (4S,5R)-3-(2'-amino-2-morfolin--4-il-4'-trifliorfometil-[4,5']bipirimidinil-6-il)-4-metil-5-tiazol-2-il-oxazolidin-2-ona
  11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y uno o mas vehlculos farmaceuticamente aceptables.
  12. 12. Una combinacion que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y uno o mas co-agentes
    terapeuticamente activos.
  13. 13. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para utilizar como un medicamento.
  14. 14. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una sal farmaceuticamente aceptable 5 del mismo, para su uso en el tratamiento de canceres de piel no melanoma o etapas pre-malignas de cancer de piel
    no melanoma.
  15. 15. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 14, en donde el cancer de piel no melanoma es el carcinoma de celulas escamosas y la etapa pre-maligna del cancer de piel no melanoma es la queratosis actlnica.
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