TWI608005B

TWI608005B - 唑烷－２－酮－嘧啶衍生物

Info

Publication number: TWI608005B
Application number: TW102140929A
Authority: TW
Inventors: 羅賓艾拉克菲哈斯特; 派斯可佛瑞特; 法蘭克史戴芬卡爾梭夫; 安德瑞斯勒希納; 亨利克魯伊格
Original assignee: 諾華公司
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2017-12-11
Also published as: EA027987B1; JP2015536974A; EA029714B1; TN2015000120A1; HUE034492T2; AU2013343022A1; EP3199158B1; CN104718204A; BR112015010136A2; DK2922848T5; IL238239A; LT2922848T; HRP20171425T1; KR102153763B1; CL2015001202A1; DK2922848T3; RS56336B1; CU20150050A7; AU2013343022B2; AP2015008347A0

Description

唑烷-2-酮-嘧啶衍生物

本發明係關於充當PI3K(磷脂醯肌醇-3-激酶)抑制劑之經唑烷-2-酮取代之嘧啶化合物，以及其醫藥組合物，製造其之方法及用於治療與PI3激酶有關之病狀、疾病及病症的用途。

磷脂醯肌醇-3-激酶超家族包含4種不同的PI3K相關脂質或蛋白激酶。I類、II類及III類為其受質特異性不同的脂質激酶，而IV類PI3K為蛋白激酶，亦稱為PI3激酶相關蛋白激酶(PIKK)。I類PI3K包含脂質激酶家族，其催化磷酸酯轉移至肌醇脂質之D-3'位置而產生磷酸肌醇-3-磷酸酯(PIP)、磷酸肌醇-3,4-二磷酸酯(PIP₂)及磷酸肌醇-3,4,5-三磷酸酯(PIP₃)，此等磷酸酯又在信號傳導級聯中充當第二信使，從而使含有普列克受質蛋白(pleckstrin)同源性FYVE、Phox及其他磷脂結合域之蛋白質對接至通常位於質膜上之多種信號傳導複合物中(Vanhaesebroeck等人，Annu.Rev.Biochem 70：535(2001))。通常經由活化AKT激酶而增加存活率及增殖之PI3K調節異常為人類癌症之最盛行事件之一且已證實可在多個層面發生(Liu等人，Nat Rev Drug Discov 8：627-644(2009))。舉例而言，已描述PIK3CA中之活化下游信號傳導路徑之體細胞誤義突變在多種人類癌症中以顯著頻率發生(Huang等人，Science 318：1744-1748(2007),Zhao & Vogt,Oncogene 27：5486-5496(2008))。使磷酸肌醇在肌醇環之3'位置去磷酸化且藉此拮抗 PI3K活性的腫瘤抑制基因PTEN在多種腫瘤中已發生功能上的突變或缺失(Keniry & Parsons,Oncogene 27：5477-5485(2008))。一些研究表明，PTEN之表現失敗可介導信號傳導依賴性由PI3Kα轉變為β-同功異型物(Wee等人，Porc Natl Acad Sci USA 105：13057-13062(2008))。因此，抑制I類PI3Kα與β-同功異型物對於缺乏PTEN磷酸酶之癌症而言可為特別有利的。

已公開之國際專利申請案WO2007/084786描述抑制PI3K之經取代之嘧啶分子。

已明確確定，活化Akt可刺激哺乳動物雷帕黴素標靶(mammalian target of rapamycin；mTOR)之激酶活性。mTOR為蛋白激酶且為IV類PI3K之成員。在哺乳動物細胞中，在稱為mTORC1及mTORC2之兩種不同的蛋白質複合物中發現mTOR。mTORC1活化依賴於活性PI3K及Akt激酶。mTORC2活化之調節更複雜。mTORC2導致Akt激酶活性經由絲胺酸殘基473磷酸化而增強(Sarbassov等人，Science 307：1098-1101(2005),Bayascas & Alessi,Mol Cell 18(2)：143-145(2005))。因此I類PI3K同功異型物之催化性抑制伴隨mTOR之抑制可代表額外益處，從而潛在地對PI3K-Akt路徑引入較強影響。

皮膚鱗狀細胞癌(SCC)代表第二種最常發生的人類皮膚癌，在其之前通常發生光化性角化病(AK)。AK及皮膚SCC之發病機制與一種嚴重危險因素，即長期UV曝露有關(Salasche,J Am Acad Dermatol 42：4-7(2000))。先前研究中已表明PI3K/Akt/mTOR路徑之活性增強(Chen等人，Br J Dermatol；160(2)：442-445(2009))。已證實活體外長期UV-B輻射可導致人類角化細胞中mRNA及蛋白質層面上之PTEN表現下調，促進其存活及生長(Ming等人，Oncogene；29(4)：492-502(2010))。根據最新文獻，長期UV輻射與PTEN下調之間存在因果關係(Darido等人，Cancer Cell；20(5)：635-648(2011))。因此，皮膚SCC及 AK及慢性太陽損傷皮膚皆與導致PI3K/Akt/mTOR信號傳導路徑活化之PTEN表現缺乏有關。

本發明係關於式(I)之經唑烷-2-酮取代之嘧啶化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，

其中，R¹為甲基、乙基或羥甲基；R²為苯基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基，或吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基，或含有2至3個選自N、O或S之雜原子的5員單環雜芳基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代；及R³為H或甲基。

除非另有說明，否則術語「本發明之化合物」係指式(I)及其子式之化合物、該等化合物之鹽、該等化合物及/或鹽之水合物或溶劑合物以及所有立體異構體(包括非對映異構體及對映異構體)、互變異構體及同位素標記化合物(包括氘取代)。本發明之化合物進一步包含式(I)(或其子式)之化合物及其鹽之多晶型物。在提及式(I)化合物的情況下，此意謂亦包括式(I)化合物之互變異構體及N-氧化物。

認為式(I)化合物適用於治療與PI3激酶有關之疾病。認為式(I)化合物適用於例如治療與I類PI3激酶有關或與I類PI3激酶及mTOR有關之疾病。

參考以下說明(包括以下術語集及結論性實例)可更充分地瞭解本發明。如本文中所用，術語「包括」、「含有」及「包含」在本文中係以其開放性、非限制性含義使用。

除非另有說明，否則上文中及下文中所用之一般性術語較佳在本發明之上下文中具有以下含義：如本文中所用，術語「烷氧基」係指經由-O-連接基團連接至分子之其餘部分之完全飽和分支鏈(包括單分支鏈或多分支鏈)或未分支烴部分。除非另有規定，否則烷氧基係指具有1至16個碳原子、1至10個碳原子、1至7個碳原子或1至4個碳原子之部分。烷氧基實例包括(但不限於)甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第二丁氧基、異丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、新戊氧基、正己氧基。

如本文中所用，術語「吡啶基」係指2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基。間位或對位之取代基連接至吡啶基之碳原子。代表性實例為3-吡啶基。

如本文中所用，含有2至3個選自N、O或S之雜原子之5員單環雜芳基上的取代基連接至該雜芳基之碳原子。含有2至3個選自N、O或S之5員單環雜芳基之實例包括(但不限於)噻唑基、唑基、1,2,4-二唑基、1,3,4-二唑基及1,3,4-噻二唑基。代表性實例為噻唑基。

本文中描述本發明之多種實施例。應瞭解，各實施例中所說明之特徵可與所說明之其他特徵組合以提供本發明之其他實施例。

在一個實施例中，本發明提供式(I)化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其選自式(Ia)化合物

其中R¹及R²係如上文關於式(I)化合物所定義。

在一個實施例中，本發明提供式(I)化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其選自式(Ib)化合物

其中R¹及R²係如上文關於式(I)化合物所定義。

在一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R²為苯基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R²為吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R²為含有2至3個選自N、O或S之雜原子的5員單環雜芳基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R²為苯基、3-甲氧基-苯基、4-甲氧基-苯基、4-(3-羥丙基)-苯基、4-(2-羥基乙氧基)-苯基或4-(2-甲氧基乙氧基)-苯基。

在另一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R²為3-吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R²為3-吡啶基。

在另一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R²為噻唑基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在另一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R²為2-噻唑基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在另一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R²為2-噻唑基。

在一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為甲基。

在另一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基。

在另一個實施例中，本發明提供式(I)、(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基。

在一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中 R¹為甲基；R²為苯基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為甲基；R²為吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為甲基；R²為含有2至3個選自N、O或S之雜原子的5員單環雜芳基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為甲基；R²為苯基、3-甲氧基-苯基、4-甲氧基-苯基、4-(3-羥丙基)-苯基、4-(2-羥基乙氧基)-苯基或4-(2-甲氧基乙氧基)-苯基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為甲基；R²為3-吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為甲基；R²為3-吡啶基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為甲基；R²為噻唑基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為甲基；R²為2-噻唑基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為甲基；R²為2-噻唑基。

在一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基；R²為苯基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基；R²為吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基；R²為含有2至3個選自N、O或S之雜原子的5員單環雜芳基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基；R²為苯基、3-甲氧基-苯基、4-甲氧基-苯基、4-(3-羥丙基)-苯基、4-(2-羥基乙氧基)-苯基或4-(2-甲氧基乙氧基)-苯基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基；R²為3-吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基；R²為3-吡啶基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基；R²為噻唑基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基；R²為2-噻唑基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為乙基；R²為2-噻唑基。

在一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基；R²為苯基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基；R²為吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基；R²為含有2至3個選自N、O或S之雜原子的5員單環雜芳基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基；R²為苯基、3-甲氧基-苯基、4-甲氧基-苯基、4-(3-羥丙基)-苯基、4-(2-羥基乙氧基)-苯基或4-(2-甲氧基乙氧基)-苯基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基；R²為3-吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，對於間位而言，該等取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且對於對位而言，該等取代基獨立地選自D、F、甲氧基、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基； R²為3-吡啶基。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基；R²為噻唑基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基；R²為2-噻唑基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。

在另一個實施例中，本發明提供式(Ia)或(Ib)之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R¹為羥甲基；R²為2-噻唑基。

在另一個實施例中，本發明提供選自以下之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物：3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基-唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-苯基唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-甲基-5- 苯基唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(3-甲氧基苯基)唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(噻唑-2-基)唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-乙基-5-吡啶-3-基-唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-吡啶-3-基-唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-羥甲基-5-苯基-唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基-唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-5-(4-(2-羥基乙氧基)苯基)-4-(羥甲基)唑烷-2-酮，或3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-(3-羥丙基)苯基)唑烷-2-酮。在另一個實施例中，本發明提供選自以下之化合物及/或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物：(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基-唑烷-2-酮，(4S*,5S*)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4- (羥甲基)-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮，(4S*,5R*)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-苯基唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-甲基-5-苯基唑烷-2-酮，(4R*,5R*)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(3-甲氧基苯基)唑烷-2-酮，(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(噻唑-2-基)唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-乙基-5-吡啶-3-基-唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-吡啶-3-基-唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-羥甲基-5-苯基-唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基-唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-5-(4-(2-羥基乙氧基)苯基)-4-(羥甲基)唑烷-2-酮，或(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-(3-羥丙基)苯基)唑烷-2-酮。

藉由本文所述之特定例示性化合物提供特定實施例。

如本文中所用，術語「光學異構體」或「立體異構體」係指可因本發明之指定化合物而存在之各種立體異構組態中之任一者，且包括幾何異構體。應理解取代基可在碳原子之對掌性中心處相連。術語「對掌性」係指具有不重疊於其鏡像搭配物上之性質之分子，而術語「非對掌性」係指可重疊於其鏡像搭配物上之分子。因此，本發明包括化合物之對映異構體、非對映體或外消旋體。「對映異構體」為一對彼此呈不重疊鏡像之立體異構體。一對對映異構體之1：1混合物為「外消旋」混合物。該術語用於在合適時定義外消旋混合物。

「非對映體」為具有至少兩個不對稱原子，但其彼此不為鏡像之立體異構體。根據Cahn-lngold-Prelog R-S系統指定絕對立體化學。當化合物為純對映異構體時，各對掌性碳處之立體化學可由R或S指定。絕對組態未知之解析化合物可視其在鈉D線之波長下使平面偏振光旋轉之方向(右旋或左旋)指定為(+)或(-)。本文所述之某些化合物含有一或多個不對稱中心或不對稱軸，且可由此產生可在絕對立體化學方面定義為(R)-或(S)-的對映異構體、非對映異構體及其他立體異構形式。

視起始物質及程序之選擇而定，化合物可以一種可能異構體或其混合物形式存在，例如視不對稱碳原子數目而定，呈純光學異構體或異構體混合物(諸如外消旋體及非對映異構體混合物)形式。本發明意欲包括所有該等可能異構體，包括外消旋混合物、非對映異構混合物及光學純形式。可使用對掌性合成組元或對掌性試劑製備或使用習知技術解析光學活性(R)-及(S)-異構體。若化合物含有雙鍵，則取代基可為E或Z組態。若化合物含有經雙取代之環烷基，則環烷基取代可具有順式或反式組態。亦意欲包括所有互變異構形式。

如本文中所用，術語「鹽」係指本發明化合物之酸加成鹽或鹼加成鹽。「鹽」特定言之包括「醫藥學上可接受之鹽」。術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留本發明化合物之生物有效性及性質且通常在生物學上或其他方面合乎需要之鹽。在許多情況下，本發明之化合物由於存在胺基及/或羧基或其類似基團而能夠形成酸式鹽及/或鹼式鹽。

醫藥學上可接受之酸加成鹽可用無機酸及有機酸形成，例如乙酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼鹽、檸檬酸鹽、乙烷二磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘甲酸鹽、萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、磺基水楊酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽及三氟乙酸鹽。

可用於製備鹽之無機酸包括(例如)鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似酸。

可用於製備鹽之有機酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、杏仁酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、磺基水楊酸及其類似酸。可用無機及有機鹼形成醫藥學上可接受之鹼加成鹽。

可用於製備鹽之無機鹼包括例如銨鹽及來自週期表之第I行至第XII行之金屬。在某些實施例中，鹽係來源於鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅及銅；特定言之適合鹽包括銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽及鎂鹽。

可用於製備鹽之有機鹼包括例如一級胺、二級胺及三級胺；經取代之胺，包括天然存在之經取代之胺；環胺；鹼離子交換樹脂及其類似物。某些有機胺包括異丙胺、苯甲星(benzathine)、膽茶鹼 (cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、離胺酸、葡甲胺(meglumine)、哌嗪及緩血酸胺(tromethamine)。

可藉由習知化學方法自鹼性或酸性部分合成本發明之醫藥學上可接受之鹽。一般而言，該等鹽可藉由使該等化合物之游離酸形式與化學計量之量的適當鹼(諸如Na、Ca、Mg或K之氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或其類似物)反應或藉由使該等化合物之游離鹼形式與化學計量之量的適當酸反應來製備。該等反應通常在水中或在有機溶劑中或在二者之混合物中進行。一般而言，在可實行時，需要使用非水性介質，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。其他適合的鹽之清單可見於例如以下文獻中：「Remington's Pharmaceutical Sciences」，第20版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1985)；及「Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use」,Stahl及Wermuth(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)。

除非另有說明，否則本文中所指定之任何式亦意欲表示化合物之未標記形式以及同位素標記形式。除了一或多個原子經具有所選原子質量或質量數之原子置換以外，同位素標記化合物具有本文中所指定之式所描繪之結構。可併入本發明化合物中之同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟及氯之同位素，分別諸如²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁶F、³¹P、³²P、³⁵S、³⁶Cl、¹²⁵I。本發明包括如本文定義之多種同位素標記化合物，例如其中存在諸如³H及¹⁴C之放射性同位素的化合物，或其中存在諸如²H及¹³C之非放射性同位素之化合物。該等經同位素標記之化合物適用於代謝研究(使用¹⁴C)；反應動力學研究(使用例如²H或³H)；偵測或成像技術，諸如正電子發射斷層攝影法(PET)或單光子發射電腦斷層攝影法(SPECT)，包括藥物或受質組織分佈分析法；或患者之放射性治療。特定言之，¹⁸F或標記化合物可能特別合乎PET或SPECT研究之需要。同位素標記之式(I)化合物通常可藉由熟習此項技術者已知之習知技術，或藉由與隨附實例及製備方法中所述之類似方法，使用適當同位素標記試劑代替上文採用之未標記試劑來製備。

此外，以重同位素，尤其氘(亦即²H或D)進行之取代可產生由較高代謝穩定性引起的某些治療優點，例如活體內半衰期增加或所需劑量減少或治療指數改良。應理解，在此情形下，氘視為式(I)化合物之取代基。該種重同位素，詳言之氘之濃度可由同位素增濃因數定義。如本文中所用之術語「同位素增濃因素」意謂指定同位素之同位素豐度與天然豐度之間的比率。若本發明化合物中之取代基表示為氘，則該化合物中各指定氘原子的同位素增濃因數為至少3500(各指定氘原子上52.5%氘併入)、至少4000(60%氘併入)、至少4500(67.5%氘併入)、至少5000(75%氘併入)、至少5500(82.5%氘併入)、至少6000(90%氘併入)、至少6333.3(95%氘併入)、至少6466.7(97%氘併入)、至少6600(99%氘併入)或至少6633.3(99.5%氘併入)。

本發明之醫藥學上可接受之溶劑合物包括其中結晶化溶劑可經同位素(例如D₂O、d₆-丙酮、d₆-DMSO)取代的溶劑合物。

本發明化合物，亦即含有能夠充當氫鍵之供體及/或受體之基團的式(I)化合物，能夠與適合的共晶體形成劑來形成共晶體。該等共晶體可藉由已知共晶體形成程序由式(I)化合物來製備。該等程序包括在溶液中將式(I)化合物與共晶體形成物一起在結晶條件下研磨、加熱、共昇華、共熔融或接觸及分離藉此形成之共晶體。適合的共晶體形成劑包括WO 2004/078163中所述之共晶體形成劑。因此，本發明進一步提供包含式(I)化合物之共晶體。

如本文中所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」包括如為熟習此項技術者所知之任何及所有溶劑、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物穩定劑、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料及其類似物及其組合(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company,1990，第1289頁至第1329頁)。除了在任何習知載劑與活性成分不相容之情況下以外，涵蓋其在治療或醫藥組合物中之用途。

術語本發明化合物之「治療有效量」係指本發明化合物引發個體中之生物或醫學反應(例如酶或蛋白質活性之降低或抑制)或改善症狀、緩解病狀、延緩或延遲疾病進程或預防疾病等的量。在一個非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指本發明化合物在投與個體時有效達成以下目標的量：(1)至少部分緩解、抑制、預防及/或改善(i)由I類PI3激酶介導或(ii)與I類PI3激酶活性有關或(iii)由I類PI3激酶活性(正常或異常)表徵之病狀，或病症或疾病；或(2)減少或抑制I類PI3激酶活性。在另一個非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指本發明化合物在投與細胞或組織或非細胞生物材料或培養基時有效地至少部分降低或抑制I類PI3激酶活性的量。

在另一個實施例中，術語「治療有效量」係指本發明化合物在投與個體時有效達成以下目標的量：(1)至少部分緩解、抑制、預防及/或改善(i)由I類PI3激酶及mTOR介導或(ii)與I類PI3激酶及mTOR活性有關或(iii)由I類PI3激酶及mTOR活性(正常或異常)表徵之病狀，或病症或疾病；或(2)減少或抑制I類PI3激酶及mTOR活性。在另一個非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指本發明化合物在投與細胞或組織或非細胞生物材料或培養基時有效地至少部分降低或抑制I類PI3激酶及mTOR活性的量。

如本文中所用，術語「個體」係指動物。動物通常為哺乳動物。個體亦指例如靈長類動物(例如人類，男性或女性)、母牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠、魚類、鳥類及其類似物。在某些實施例中，個體為靈長類動物。在其他實施例中，個體為人類。

如本文中所用，術語「抑制(inhibit/inhibition/inhibiting)」係指減輕或遏止既定病狀、症狀或病症或疾病，或顯著降低生物活性或過程之基線活性。

如本文中所用，在一個實施例中，術語「治療」任何疾病或病症係指緩解疾病或病症(亦即減緩或阻滯或減慢疾病或其至少一種臨床症狀之發展)。在另一個實施例中，「治療」係指緩解或改善至少一種身體參數，包括患者無法辨識之參數。在另一個實施例中，「治療」係指在身體上(例如穩定可辨別之症狀)、生理上(例如穩定身體參數)或兩方面調節疾病或病症。在另一個實施例中，「治療」係指預防或延遲疾病或病症的發作或發展或進程。

如本文中所用，若個體在生物學、醫學或生活品質上將受益於治療，則該個體「需要」該治療。

除非本文中另有說明或與上下文明顯矛盾，否則如本文中所用，本發明之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)所用之術語「一」、「該」及類似術語應解釋為涵蓋單數及複數。

除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法皆可以任何適合順序進行。使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲更好地說明本發明，且不對另外所主張之本發明之範疇造成限制。

本發明化合物之任何不對稱原子(例如碳或其類似物)可呈外消旋或對映異構增濃形式，例如(R)-、(S)-或(R,S)-組態。在某些實施例中，各不對稱原子的(R)-或(S)-組態具有至少50%對映異構過量、至少60%對映異構過量、至少70%對映異構過量、至少80%對映異構過量、至少90%對映異構過量、至少95%對映異構過量或至少99%對映異構過量。若可能，則原子處具有不飽和雙鍵之取代基可以順式(Z)或反式(E)形式存在。

因此，如本文中所用，本發明化合物可呈可能異構體、旋轉異構體、滯轉異構體、互變異構體或其混合物中之一種形式，例如呈實質上純幾何異構(順式或反式)異構體、非對映異構體、光學異構體(對映體)、外消旋物或其混合物形式。

基於成分之物理化學差異，例如藉由層析法及/或分步結晶，可將任何所得之異構體之混合物分離為純的或實質上純的幾何異構體或光學異構體、非對映異構體、外消旋體。

任何所得之終產物或中間物之外消旋體皆可藉由已知方法解析為光學對映體，例如藉由分離用光學活性酸或鹼獲得之其非對映鹽及釋放光學活性酸性或鹼性化合物。詳言之，鹼性部分可因此用於將本發明化合物解析為其光學對映體，例如藉由由光學活性酸(例如酒石酸、二苯甲醯基酒石酸、二乙醯基酒石酸、二-O,O'-對甲苯甲醯基酒石酸、杏仁酸、蘋果酸或樟腦-10-磺酸)形成之鹽的分步結晶。亦可藉由對掌性層析法，例如使用對掌性吸附劑之高壓液相層析法(HPLC)解析外消旋產物。

此外，本發明之化合物(包括其鹽)亦可以其水合物形式獲得或包括其結晶所用之其他溶劑。本發明之化合物可固有地或有意地與醫藥學上可接受之溶劑(包括水)形成溶劑合物；因此，本發明意欲涵蓋溶合形式及非溶合形式。術語「溶劑合物」係指本發明之化合物(包括其醫藥學上可接受之鹽)與一或多個溶劑分子之分子複合物。此等溶劑分子為醫藥技術中常用之溶劑分子，已知其對於接受者無害，例如為水、乙醇及其類似物。術語「水合物」係指溶劑分子為水之複合物。

本發明之化合物(包括其鹽、水合物及溶劑合物)可固有地或有意地形成多晶型物。

本發明之化合物可藉由包括與化學技術中熟知之過程類似之過程的合成途徑，特定言之根據本文中含有之描述加以合成。起始物質通常得自商業來源或容易使用熟習此項技術者熟知之方法製備(例如藉由以下文獻中一般性描述之方法製備：Louis F.Fieser and Mary Fieser,Reagents for Organic Synthesis，第1-19卷，Wiley,New York(1967-1999年編)，或Beilsteins Handbuch der organischen Chemie,4,Aufl.Springer-Verlag編，Berlin，包括增刊(亦經由Beilstein線上資料庫獲得))。

出於說明性目的，下述反應流程提供合成本發明之化合物以及關鍵中間物之可能途徑。關於個別反應步驟之更詳細描述，參見以下實例章節。熟習此項技術者將瞭解其他合成途徑可用於合成本發明之化合物。儘管流程中描述且下文論述特定起始物質及試劑，但可容易地替代性使用其他起始物質及試劑以提供多種衍生物及/或反應條件。此外，藉由下述方法製備之許多化合物可使用熟習此項技術者熟知之習知化學方法根據本發明來進一步改質。

製備本發明化合物時，可能需要保護中間物之遠端官能基(例如羥基)。對此保護之需要將視遠端官能基之性質及製備方法之條件而變化。合適的羥基保護基包括三烷基矽烷基醚，其中一或兩個烷基可經苯基置換。對此保護之需要易於由熟習此項技術者確定。對於保護基及其使用之一般性描述，參見T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,New York,1991。

通常，式(I)化合物可根據下文所提供之方法製備。

流程1

在一個實施例中，本發明係關於一種製造式(I)化合物的方法，其包含步驟a及b。

在一個實施例中，本發明係關於一種製造式(I)化合物的方法(方法A)，其包含步驟a及隨後之步驟b。

式(I)化合物係經由以下步驟獲得：步驟a)：式(A)化合物(其中R³如上文關於式(I)化合物所定義)

與式(B)化合物(其中R¹及R²如上文關於式(I)化合物所定義)偶合

形成式(C)化合物，其中R¹、R²及R³如上文關於式(I)化合物所定義，隨後為步驟b)：式(C)化合物與式(D)化合物偶合，其中-B(OR')₂表示環狀或非環狀酸或酸衍生物，諸如頻哪醇根基-硼(pinacolato-boron)，

在存在保護基的情況下，添加脫除保護基步驟以使經保護之式(I)化合物轉化成式(I)化合物。

步驟a)係在諸如NaH之鹼存在下進行。反應係在有機溶劑(諸如DMF)存在下、在0℃至80℃之溫度下進行20至30分鐘。或者，反應可使用配位體(諸如Xantphos、X-Phos或2-二-第三丁基膦基-2'-(N,N-二甲基胺基)聯苯與鈀催化劑，諸如Pd₂(dba)₃或Pd₂(dba)₃．CHCl₃或Pd(OAc)₂，較佳為Pd₂(dba)₃與Xantphos)、在有機溶劑(諸如醚，較佳為二烷或THF)中、在鹼(諸如較佳為Cs₂CO₃或tert-BuONa)存在下、在常用布-哈氏條件(Buchwald-Hartwig conditions)下進行。反應物較佳在約80℃至120℃之溫度下攪拌。反應較佳在惰性氣體(諸如氮氣或氬氣)中進行。可將此領域中已知的用於布-哈氏反應之典型反應條件應用於本發明之方法。

步驟b)係在催化劑(諸如Pd(0)催化劑，例如PdCl₂(dppf)-CH₂Cl₂)存在下、視情況在一或多種反應助劑(諸如鹼，例如鹼水溶液，諸如Na₂CO₃水溶液)存在下、視情況在一或多種稀釋劑(尤其極性溶劑，例如DME)存在下進行。反應物在約80℃至120℃之溫度下攪拌。反應可在惰性氣體(諸如氮氣或氬氣)中進行。可將此領域中已知的用於鈴木反應(Suzuki reaction)之典型反應條件應用於本發明之方法。

或者，亦可藉由執行步驟b)、隨後執行步驟a)(方法B)來合成式(I)化合物。

本發明另外包括本發明之方法之任何變型，其中將可於其任何階段獲得之中間產物用作起始材料且進行其餘步驟，或其中該等起始材料係在反應條件下當場形成，或其中該等反應組分係以其鹽或光學純物質形式使用。

本發明化合物及中間物亦可根據熟習此項技術者通常已知的方法彼此轉化。

在另一個態樣中，本發明提供一種包含本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。

醫藥組合物可針對特定投藥途徑調配，諸如局部投藥；經腸投藥，諸如經口或直腸投藥；及非經腸投藥，諸如靜脈內、肌肉內或皮下投藥。另外，本發明之醫藥組合物可呈固體形式(包括(但不限於)膠囊、錠劑、丸劑、顆粒、粉劑或栓劑)或液體形式(包括(但不限於)溶液、懸浮液或乳液)組成。醫藥組合物可根據此項技術中已知之方法製備。醫藥組合物可經歷習知醫藥操作，諸如滅菌，且/或可含有習知惰性稀釋劑、潤滑劑或緩衝劑以及佐劑，諸如防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑及緩衝劑等。

用於局部施用(例如用於皮膚及眼腈)之合適組合物包括水溶液、懸浮液、軟膏、乳霜、凝膠、粉劑、油劑或(例如)藉由氣霧劑或其類似物遞送之可噴灑調配物。該等局部遞送系統尤其適於皮膚施用，例如用於乳霜、洗液、噴液及其類似物。其因此特別適用於此項技術中熟知之局部(包括化妝品)調配物。該等調配物可含有增溶劑、穩定劑、張力增強劑、緩衝劑及防腐劑等。

如本文中所用，局部施用法亦可涉及吸入劑或涉及鼻內施用法，例如施用至呼吸系統。其宜呈乾粉形式(單獨、成為混合物(例如與乳糖之乾式摻合物)或混合組分粒子(例如與磷脂混合))，從乾粉吸入器遞送，或呈氣霧劑噴霧遞形式，從使用或不使用合適推進劑之加壓容器、泵、噴灑器、霧化器或噴霧器遞送。

在本發明之上下文中，較佳施用法係指以包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上與皮膚醫學上可接受之載劑之合適組合物進行之局部施用法，諸如表皮施用法。適用於表皮施用法之組合物可包含常用於此投藥途徑且此項技術中已熟知之所有醫藥形式，包括其溶液、凝膠劑、洗液、懸浮液、乳霜、粉劑、油劑、軟膏、起泡劑、慕斯(mousses)、乳液、微乳液、乳劑、精華液、氣溶膠、噴液、分散液、微膠囊、囊泡及微顆粒。該等組合物係根據習知技術調配。

如本文中所用，術語「皮膚醫學上可接受之載劑」為適於局部施用於角質組織的載劑，其具有良好美觀特性，與本發明之活性劑及任何其他組分相容且不會引起任何不良的安全或毒性影響。

皮膚醫學上可接受之載劑可呈多種形式。舉例而言，包括(但不限於)水包油、油包水、水包油包水及矽包水包油型乳液之乳液載劑在本文中為適用的。如熟習此項技術者所理解，視組分在組合物中之水溶性/分散性而定，所指定組分主要分佈於水或油/矽相中。

適於表皮施用之組合物可視需要含有多種已知添加劑，諸如賦形劑、黏合劑、滑潤劑及崩解劑。如熟習此項技術者所知，其亦可視需要含有油性物質，諸如多種脂肪、油類、蠟、烴、脂肪酸、高碳醇、酯油、金屬皂、動物或植物萃取物、親水性或親脂性膠凝劑、親水性或親脂性活性劑、其他組分(諸如維生素、胺基酸)、界面活性劑、著色劑、染料、色素、香料、氣味吸收劑、抗菌劑、防腐劑、殺細菌劑、保濕劑、增稠劑、溶劑、填充劑、抗氧化劑、螯合劑、防曬霜及其類似物及其組合，只要該等物質與活性成分相容即可。

合適油類之實例尤其包括礦物油、植物油(諸如花生油、芝麻油、大豆油、紅花油、向日葵油)、動物油(諸如羊毛脂或全氫角鯊烯)、合成油(諸如萬能生物油(purcellin oil))、聚矽氧油(諸如矽靈(cyclomethicome))。脂肪醇、脂肪酸(諸如硬脂酸)及蠟(諸如石蠟)、巴西棕櫚蠟或蜂蠟亦可用作脂肪。

組合物亦可含有乳化劑、溶劑、親水性膠凝劑、親脂性膠凝劑、脂肪酸金屬鹽、親水性作用劑或親脂性活性劑。

呈游離形式或呈鹽形式之式(I)化合物呈現有價值的藥理學特性，例如PI3激酶調節特性，諸如I類PI3激酶(I類PI3K)調節特性或PI3K調節特性與mTOR調節特性，例如實驗章節中所提供之活體外及活體內測試中所顯示，且因此指定用於療法或用作研究化學物質，例如工具化合物。

呈游離形式或呈鹽形式之式(I)化合物適用於治療I類PI3激酶相關性疾病，尤其與I類PI3Kα及β同功異型物有關之疾病，以及與I類PI3激酶有關之疾病，尤其與I類PI3Kα及β同功異型物以及mTOR有關之疾病。

認為抑制I類PI3Kα及β同功異型物活性之化合物，尤其對I類PI3Kα及β同功異型物具有實質上相等功效且視情況亦抑制mTOR活性的化合物係有益的，因為與具有獨特特異性(例如對I類PI3K家族之一成員具有特異性)之化合物相比，認為該等化合物因路徑經由其他同功異型物而再改變而能夠避免順應機制。「相等功效」意謂化合物抑制若干同功異型物的程度類似，例如本文所述之酶或細胞分析法中所量測。

式(I)化合物宜顯示足夠的光穩定性，以便當以表皮方式投與時確保及最佳化式(I)化合物之活性，從而最小化因產生降解產物所致的潛在刺激及副作用。具有優良光穩定性之化合物因光降解風險最小化而使技術開發及供應簡化。式(I)化合物在使用來源於皮膚鱗狀細胞癌之人類細胞株的細胞分析法中宜顯示良好效能。較佳化合物應顯示能夠良好穿透至皮膚中。

本發明之化合物可適用於治療選自(但不限於)以下之適應症：非黑色素瘤皮膚癌，諸如基底細胞癌及鱗狀細胞癌；其惡性病變前階段，諸如光化性角化病、日光性角化病及慢性太陽損傷皮膚；及因皮膚纖維母細胞調節異常所致之其他增生性皮膚病症，諸如皮膚纖維化、硬皮病、肥厚性瘢痕或瘢痕瘤。本發明化合物可特別適用於治療選自(但不限於)非黑色素瘤皮膚癌之適應症。

除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法皆可以任何合適順序進行。使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲更好地說明本發明，且不對另外所主張之本發明之範疇造成限制。

在某些情況下，本發明化合物與至少一種其他醫藥劑(或治療劑)(例如抗增殖或抗癌症藥劑或化學療法中通常使用之輔助療法)組合投與可為有利的。本發明化合物可與一或多種其他治療劑同時或在其之前或之後投與。或者，本發明化合物可藉由相同或不同投藥途徑單獨投與，或與其他藥劑於同一醫藥組合物中一起投與。

在一個實施例中，本發明提供一種產品，其包含式(I)化合物及至少一種其他治療劑作為組合製劑以在療法中同時、單獨或連續使用。在一個實施例中，療法為治療與PI3激酶有關之疾病或病狀。以組合製劑形式提供之產品包括組合物，其包含式(I)化合物及共同存在於同一醫藥組合物中之其他治療劑，或式(I)化合物及各別形式(例如呈套組形式)之其他治療劑。

在一個實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含式(I)化合物及另一治療劑。醫藥組合物視情況可包含如上所述之醫藥學上可接受之載劑。

在一個實施例中，本發明提供一種套組，其包含兩種或兩種以上各別醫藥組合物，其中至少一種醫藥組合物含有式(I)化合物。在一個實施例中，套組包含用於單獨保留該等組合物之構件，諸如容器、分隔之小瓶或分隔之鋁箔封包。該套組之實例為通常用於封裝錠劑、膠囊及其類似物之泡殼包裝。

本發明之套組可用於例如經口及非經腸投與不同劑型，以不同劑量間隔投與各別組合物，或相對於彼此滴定各別組合物。為了有助於順應性，本發明套組通常包含投藥指導。

因此，本發明提供式(I)化合物用於治療由PI3激酶介導之疾病或病狀的用途，其中藥劑經製備可與另一種治療劑一起投與。本發明亦提供另一種治療劑用於治療由PI3激酶介導之疾病或病狀的用途，其中藥劑係與式(I)化合物一起投與。

本發明亦提供式(I)化合物用於治療由I類PI3激酶介導或由I類PI3激酶及mTOR介導之疾病或病狀的方法中，其中式(I)化合物經製備可與另一種治療劑一起投與。本發明亦提供另一種治療劑用於治療由I類PI3激酶介導或由I類PI3激酶及mTOR介導之疾病或病狀的方法中，其中該另一種治療劑經製備可與式(I)化合物一起投與。本發明亦提供式(I)化合物用於治療由I類PI3激酶介導或由I類PI3激酶及mTOR介導之疾病或病狀的方法中，其中式(I)化合物係與另一種治療劑一起投與。本發明亦提供另一種治療劑用於治療由I類PI3激酶介導或由I類PI3激酶及mTOR介導之疾病或病狀的方法中，其中該另一種治療劑係與式(I)化合物一起投與。

本發明亦提供式(I)化合物用於治療由I類PI3激酶介導或由I類PI3激酶及mTOR介導之疾病或病狀的用途，其中患者先前(例如24小時內)已經另一種治療劑治療。本發明亦提供另一種治療劑用於治療由I類PI3激酶介導或由I類PI3激酶及mTOR介導之疾病或病狀的用途，其中患者先前(例如24小時內)已經式(I)化合物治療。

在一個實施例中，另一種治療劑係選自適於治療非黑色素瘤皮膚癌(諸如基底細胞癌及鱗狀細胞癌)、其惡性病變前階段(諸如光化性角化病、日光性角化病及慢性太陽損傷皮膚)之治療劑。此等其他治療劑宜選自免疫刺激性化合物，例如Toll樣受體促效劑，諸如咪喹莫特(imiquimod)(Aldara®)，或選自消炎劑，諸如雙氯芬酸(diclofenac)(Solaraze®)。

本發明之醫藥組合物或組合的單位劑量對於約50至約70kg之個體而言可為約1至約1000mg活性成分，或約1至約500mg或約1至約250mg或約1至約150mg或約0.5至約100mg或約1至約50mg活性成分。對於約50至約70kg個體而言，單位劑量亦可具有約50至約1000mg活性成分，或約50至約500mg或約50至約250mg或約50至約150mg或約50至約100mg活性成分。劑量可視用於遞送活性成分之特定劑型而定。一般而言，化合物、醫藥組合物或其組合之治療有效劑量視個體之物種、體重、年齡及所治療之個別病狀、病症或疾病或其嚴重性而定。劑量亦可視活性成分在所治療之物種中之生物可用性而定。一般熟練之醫師、臨床醫生或獸醫可容易地確定預防、治療或抑制病症或疾病進程所必需之各活性成分的有效量。

上述劑量特性宜使用哺乳動物(例如小鼠、大鼠、狗、猴、豬、小型豬或分離器官、組織及其製劑)活體外及活體內測試加以證明。本發明之化合物可以溶液形式(例如由例如10mM DMSO儲備溶液製備之水溶液)活體外施用，及經腸、非經腸(宜靜脈內)或局部(例如懸浮液、水溶液或其他溶液，諸如基於丙二醇之溶液)活體內施用。活體外劑量範圍可介於約10^-3莫耳濃度與約10^-9莫耳濃度之間。視投藥途徑而定，活體內治療有效量範圍可介於約0.1至約500mg/kg之間，或介於約1至約100mg/kg之間。

實例

下列實例意欲說明本發明且不應解釋為對其造成限制。溫度以攝氏度表示。若未另外提及，則所有蒸發均在減壓下進行，通常在約15mm Hg與100mm Hg(=20-133毫巴)之間。終產物、中間物及起始物質之結構係藉由標準分析方法證實，例如微量分析及光譜特徵(例如MS、IR、NMR)。所用之縮寫為此項技術中習知之縮寫。

所有用於合成本發明之化合物的起始物質、構築嵌段、試劑、酸、鹼、脫水劑、溶劑及催化劑均為市售或可藉由一般熟習此項技術者已知之有機合成方法(Houben-Weyl第4版.1952,Methods of Organic Synthesis,Thieme，第21卷)製備。此外，本發明之化合物可藉由一般熟習此項技術者已知之如以下實例中所示之有機合成方法製備。

除非另有說明，否則起始物質通常購自商業來源，諸如Aldrich Chemicals Co.(Milwaukee,Wis.)、Lancaster Synthesis,Inc.(Windham,N.H.)、Acros Organics(Fairlawn,N.J.)、Maybridge Chemical Company,Ltd.(Cornwall,England)、Tyger Scientific(Princeton,N.J.)、Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,IL)及AstraZeneca Pharmaceuticals(London,England)。

縮寫

以下實例中所用之縮寫具有下列相應含義。

AcOH 乙酸

aq 水性

ax 軸向

Boc 第三丁氧基羰基

Brine 飽和氯化鈉溶液(在室溫下)

br s 寬單峰

CDCl₃ 氘化氯仿

CHCl₃-d 氘化氯仿

CH₂Cl₂ 二氯甲烷

CH₃CN 乙腈

conc. 濃縮

CsF 氟化銫

CuSO₄ 硫酸銅

d 二重峰

DIPEA 二異丙基乙胺

DME 二甲氧基乙烷

DMF N,N-二甲基甲醯胺

DMSO 二甲亞碸

DMSO-d₆ 氘化二甲亞碸

dppf 1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵

eq 赤道

ESI-MS 電噴霧質譜分析

Et₂O 乙醚

EtOH 乙醇

EtOAc 乙酸乙酯

h 小時

Hyflo Hyflo Super Cel®

¹HNMR 質子核磁共振

KOAc 乙酸鉀

KHSO₄ 硫酸氫鉀

K₂CO₃ 碳酸鉀

LC-MS 液相層析-質譜分析

LDA 二異丙胺鋰

MeOH 甲醇

MgSO₄ 硫酸鎂

M 莫耳

m 多重峰

MS 質譜分析

min 分鐘

mL 毫升

m.p. 熔點

MgSO₄ 硫酸鎂

MHz 兆赫

N 標準

NaHMDS 六甲基二矽氮烷鈉

NMR 核磁共振

NEt₃ 三乙胺

Na₂S₂O₃ 硫代硫酸鈉

Na₂SO₄ 硫酸鈉

Pd₂(dba)₃ 參(二苯亞甲基丙酮)二鈀(0)

PdCl₂(dppf) 二氯化1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵-鈀(II)

PdCl₂(dppf)-CH₂Cl₂ 二氯化1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵-鈀(II)二氯甲烷錯合物

PPh₃ 三苯基膦

Pd(PPh₃)₄ 肆(三苯基膦)鈀

Pd 鈀

qt 五重峰

Raney-Ni 阮尼鎳(Raney-nickel)

RT 室溫

Rf TLC滯留因子

Rt 滯留時間

s 單峰

SiO₂ 矽膠

t 三重峰

TBAF 氟化四丁基銨

TBDPSCl 氯化第三丁基二苯基矽烷基

TBME 第三丁基甲基醚

TFA 三氟乙酸

THF 四氫呋喃

TLC 薄層層析

t_R 滯留時間

UV 紫外線

UPLC 超高效液相層析

一般方法

使用或不使用三甲基矽烷作為內標物，在Bruker Ultrashield^TM 400(400MHz)、Bruker Ultrashield^TM 600(600MHz)或500MHz DRX Bruker CryoProbe(500MHz)光譜儀上進行¹ H-NMR量測。化學位移(d值)以四甲基矽烷低場ppm報導，耦合常數(J)以Hz示出，光譜分裂圖指定為單峰(s)、二重峰(d)、雙二重峰(dd)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰或更多重峰重疊信號(m)、寬信號(br)。溶劑示於括弧中。

使用個別指定溶劑系統，用預塗之矽膠60 F₂₅₄玻璃板(Merck,Darmstadt,Germany)進行TLC。通常利用紫外光(254nm)進行目測。

LC-MS： LC-MS方法1

管柱：Acquity HSS T3，1.8μm，2.1×50mm；

溶離劑：水(+0.05%甲酸+3.75mM乙酸銨)：乙腈(+0.04%甲酸)，1.4min內95：5至2：98，98%維持0.75min；

流動速率/溫度：1.0mL/min，60℃

LC-MS方法2

管柱：Acquity HSS T3，1.8μm，2.1×50mm；

溶離劑：水(+0.05%甲酸+3.75mM乙酸銨)：乙腈(+0.04%甲酸)，1.4min內98：2至2：98，98%維持0.75min；

流動速率/溫度：1.2mL/min，50℃

UPLC 1

管柱：Acquity UPLC HSS T3 C18，1.7μm2.1×50mm，流動速率：1.0mL/min.，梯度：1.5min內5%至100% B，100% B維持1min，A=水+0.1% TFA，B=乙腈+0.1% TFA

偵測：218nm或254nm

合成 酸酯中間物

用於製備本發明之化合物之酸酯中間物可商購或可如文獻中所述或以類似方式製備，或可如下文中所述或以類似方式製備。

中間物1：5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼 -2-基)-4-三氟甲基)嘧啶-2-胺

a)5-溴-4-三氟甲基-嘧啶-2-基胺

在黑暗中，在2.5小時期間內，向2-胺基-4-三氟甲基嘧啶(25g，0.15mol)於CH₃CN(600mL)中之溶液中添加N-溴丁二醯亞胺(34.8g，195mmol)於乙腈(200mL)中之溶液。反應混合物在室溫下攪拌4.5小時且接著濃縮。殘餘物溶解於EtOAc及H₂O中，分離有機溶劑，用H₂O及鹽水洗滌，經Na₂SO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之己烷(10%至40%)藉由管柱層析純化，得到呈灰褐色固體狀之標題化合物(31.2g，85%)。LC-MS：Rt 0.82min；(LCMS方法2)。

b)5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼 -2-基)-4-(三氟甲基)嘧啶-2-胺

在氬氣下，向5-溴-4-三氟甲基-嘧啶-2-基胺(16.2g，66.3mmol)、雙頻哪醇根基二硼(18.5g，72.9mmol)及KOAc(19.5g，199mmol)於二烷(300mL)中之懸浮液中添加PdCl₂(dppf)．CH₂Cl₂加合物(2.44g，2.98mmol)且混合物在115℃攪拌4小時。反應混合物冷卻至50℃且用EtOAc處理。所得懸浮液經Hyflo過濾且用EtOAc洗滌。濃縮合併之濾液。殘餘物懸浮於2M NaOH中，在室溫下攪拌5分鐘且接著添加Et₂O及H₂O。二元混合物再次經Hyflo過濾且分離各相。所得水層之pH值用4M HCl水溶液調節至5至6，且產物用EtOAc萃取。合併之萃取物用H₂O及鹽水洗滌，經Na₂SO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物於 Et₂O/己烷中濕磨，過濾且乾燥，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物(8.33g，42%)。LC-MS：[M+H]290.2；Rt 1.00min；(LCMS方法2)。

合成 唑烷酮中間物 中間物2：(4S*,5S*)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

a)(1S*,2S*)-1-(4-甲氧基苯基)-2-硝基丁-1-醇

在氬氣下，向已在0℃下攪拌30分鐘之LiAlH₄(2M於THF中)(1.84mL，3.67mmol)於無水THF(100mL)中之溶液中添加1-硝基丙烷(16.3mL，184mmol)。30分鐘後，一次性添加4-甲氧基苯甲醛(4.45mL，36.7mmol)。混合物在0℃攪拌6小時且在室溫下攪拌18小時。反應混合物用HCl(1M於H₂O中)淬滅且用CH₂Cl₂萃取。合併之有機層用鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含CH₂Cl₂之己烷(0%至100%)藉由管柱層析純化，得到標題化合物(1.4g，34%)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)：7.35(d,2H),6.94(d,2H),5.94(d,1H),4.80(dd,1H),4.68-4.52(m,1H),3.76(s,3H),1.75-1.69(m,1H),1.25-1.20(m,1H),0.74(t,3H)。

b)(1S*,2S*)-2-胺基-1-(4-甲氧基苯基)丁-1-醇

(1S*,2S*)-1-(4-甲氧基苯基)-2-硝基丁-1-醇(1.0g，4.44mmol)於乙醇(20mL)中之溶液用氬氣淨化，且在室溫下添加Pd/C(100mg，0.094mmol)。接著淨化密封容器且用H₂回填且反應混合物在室溫下攪拌18小時。反應混合物經矽藻土過濾，用乙醇洗滌且濃縮。殘餘物使用100：0：0至80：20：1之CH₂Cl₂/MeOH/(NH₄OH/H₂O)藉由管柱層析純化，產生呈白色固體狀之標題化合物(450mg，51.4%)。LC-MS：[M+H]196.1；Rt 0.44min；(LCMS方法2)。

c)(4S*,5S*)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

在氬氣下，在0℃下向(1S*,2S*)-2-胺基-1-(4-甲氧基苯基)丁-1-醇(440mg，2.25mmol)於CH₂Cl₂(15mL)中之溶液中添加NEt₃(0.78mL，5.63mmol)。接著在5分鐘期間內添加雙光氣且在將溫度保持為0℃歷時30分鐘。反應混合物用冰冷的水及2M Na₂CO₃水溶液淬滅，用CH₂Cl₂萃取，經Na₂SO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物用TBME濕磨，過濾且乾燥，得到呈白色粉末狀之中間物2[(4S*,5S*)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮](220mg，44%)。LC-MS：[M+H]222.2；Rt 0.77min；(LCMS方法2)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)：7.94(br s,1H),7.32(d,2H),6.96(d,2H),5.06(d,1H),3.74(s,3H),3.51(q,1H),1.53(qt,2H),0.85(t,3H)。

中間物3：(4S*,5S*)-4-乙基-5-(3-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

根據針對中間物2[(4R*,5R*)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮]所述之程序製備標題化合物，產生呈無色油狀之中間物3。LC-MS：[M+H]222.1；Rt 0.79min；(LCMS方法2)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)：7.98(br s,1H),7.35-7.29(m,1H),6.83-6.96(m,3H),5.10(d,1H),3.72-3.78(m,3H),3.36-3.29(m,1H),1.49-1.63(m,2H),0.88(t,3H)。

中間物4：(4S*,5R*)-4-乙基-5-苯基 唑烷-2-酮

根據針對中間物2[(4R*,5R*)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮]所述之程序製備標題化合物，產生呈白色固體狀之中間物4。LC-MS：[M+H]192.1；Rt 0.77min；(LCMS方法2)

中間物5：(4S,5S)-4-甲基-5-苯基 唑烷-2-酮

在氬氣下，在0℃下向(1S,2S)-(+)-去甲偽麻黃鹼(2.00g，13.2mmol)於CH₂Cl₂(60mL)中之溶液中添加Et₃N(4.61mL，33.1mmol)。接著，緩慢添加溶解於20mL CH₂Cl₂中之三光氣(1.57g，5.29mmol)，且使溫度自0℃溫熱至室溫。反應混合物在室溫下攪拌4小時。接著藉由添加NH₄Cl水溶液淬滅反應混合物。分離有機層，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之庚烷(0%至100%)藉由管柱層析純化，得到所需產物(2.10g，89%)。LC-MS：[M+H]178.1；Rt 0.67min；(LCMS方法2)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)7.88(br s,1H),7.50-7.32(m,5H),5.09(d,1H),3.78-3.62(m,1H),1.26(d,3H)。

中間物6：(4S,5R)-4-乙基-5-(噻唑-2-基) 唑烷-2-酮

a)(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)丁酸

在0℃下，向(S)-2-胺基丁酸(11.2g，109mmol)於THF(200mL)及2M碳酸鈉水溶液(65.2ml，130mmol)中之溶液中逐滴添加氯甲酸苯甲酯(17.06mL，119mmol)。在室溫下攪拌16小時後，反應混合物用H₂O/TBME萃取，水層用HCl(2M於H₂O中)酸化直至pH=2且用EtOAc萃取。有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且濃縮濾液，得到呈無色油狀之標題化合物(22.8g，77%)。產物未經進一步純化即用於下一步驟中。LC-MS：[M-H]236.2；Rt 0.76min；(LCMS方法1)。

b)(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)丁酸甲酯

在室溫下，在氬氣下，向(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)丁酸(10.0g，42.1mmol)於甲醇(100mL)及甲苯(300mL)中之溶液中逐滴添加三甲基矽烷基重氮甲烷(23.2mL，46.4mmol)。在室溫下攪拌1小時後，濃縮反應混合物且殘餘物用EtOAc及鹽水之溶液萃取。合併之有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且濃縮濾液。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至30%)藉由管柱層析(120g SiO₂)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(5.2g，48%)。LC-MS：[M+H]252.1；Rt 0.93min；(LCMS方法1)。

c)(S)-(1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸苯甲酯

在氬氣下，在-78℃下，在20分鐘期間內，向(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)丁酸甲酯(2.0g，7.96mmol)於甲苯(50mL)中之溶液中逐滴添加DIBAL-H(1M於甲苯中)(15.9mL，15.9mmol)，且反應混合物在-78℃下攪拌1小時。反應混合物在-78℃下用1.5M酒石酸鉀鈉水溶液(20mL)淬滅，且溫熱至室溫。反應混合物用EtOAc與鹽水之溶液萃取。合併之有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至30%)藉由管柱層析(24g SiO₂)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(1.18g，64%)。LC-MS：[M+H]222.2；Rt 1.01min；(LCMS方法1)。¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：9.61(s,1H),7.27-7.43(m,5H),5.39(br s,1H),5.15(m,2H),4.15(q,1H),1.96-2.11(m,1H), 1.64-1.82(m,1H),1.01-0.79(m,3H)。

d)((1R,2S)-1-羥基-1-(噻唑-2-基)丁-2-基)胺基甲酸苯甲酯

在-30℃下，在氬氣下，在10分鐘期間內，向(S)-(1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸苯甲酯(1.1g，4.97mmol)於二氯甲烷(30mL)中之溶液中逐滴添加2-(三甲基矽烷基)噻唑(939μL，5.97mmol)。接著，反應混合物在-30℃下攪拌20分鐘，溫熱至室溫且在室溫下攪拌2小時。接著反應混合物在30℃下濃縮且溶解於THF(30mL)中。在0℃下，在氬氣下添加TBAF(1M於THF中)(5.97mL，5.97mmol)且反應混合物在室溫下攪拌2小時。濃縮反應混合物，且殘餘物用EtOAc萃取。合併之有機層用碳酸鈉水溶液、水及鹽水洗滌，經Na₂SO₄乾燥，過濾且濃縮濾液。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至30%)藉由管柱層析(24g SiO₂)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(1.18g，64%)。殘餘物使用含MeOH之CH₂Cl₂己烷(0%至4%)藉由管柱層析(24g SiO₂)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(340mg，43%)。LC-MS：[M+H]307.5；Rt 0.86min；(LCMS方法1)。

e)(1R,2S)-2-胺基-1-(噻唑-2-基)丁-1-醇

在0℃下，在氬氣下，在5分鐘期間內，向((1R,2S)-1-羥基-1-(噻唑-2-基)丁-2-基)胺基甲酸苯甲酯(330mg，1.077mmol)於乙腈(25mL)中之溶液中添加哌啶(0.213mL，2.154mmol)及逐滴添加碘三甲基矽烷(293μL，2.15mmol)。接著，反應混合物溫熱至室溫且在室溫下攪拌2小時。在0℃下向反應混合物中添加硫代硫酸鈉(500mg)，隨後添加水(0.5mL)，且反應混合物在0℃下劇烈攪拌15分鐘。再添加500mg硫代硫酸鈉，且混合物用EtOAc(50mL)稀釋，經Na₂SO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物用EtOAc濕磨，過濾且濃縮濾液，得到呈黃色油狀之標題化合物(250mg，67%)。

f)(4S,5R)-4-乙基-5-(噻唑-2-基) 唑烷-2-酮

根據針對中間物2所述之程序，由(1R,2S)-2-胺基-1-(噻唑-2-基)丁-1-醇製備標題化合物，產生呈褐色油狀之中間物6(410mg，95%)。此產物未經進一步純化即用於下一個反應步驟中。

中間物7：4-乙基-5-吡啶-3-基- 唑烷-2-酮

a)2-硝基-1-吡啶-3-基-丁-1-醇

在0℃下，在氬氣下，向LiAlH₄(2M於THF中)(0.93mL，1.87mmol)於無水THF(80mL)中之溶液中緩慢添加1-硝基丙烷(8.30mL，93mmol)。60分鐘後，一次性添加菸鹼醛(2.00g，18.7mmol)。將混合物攪拌16小時，同時使溫度自0℃上升至室溫。藉由添加1mL 2M HCl水溶液，隨後添加4公克Na₂SO₄來淬滅反應混合物。攪拌所得懸浮液15分鐘且接著過濾。濃縮濾液。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至100%)藉由管柱層析(40g SiO₂)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(2.6g，71%)，其為非對映異構體A與B之混合物。LC-MS：[M+H]197.1；Rt 0.52min；(LCMS方法1)。A)¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：8.70-8.60(m,2H),7.80-7.74(m,1H),7.42-7.32(m,1H),5.28(dd,1H),4.70-4.58(m,1H),2.97(d,1H),2.29-2.12(m,1H),1.65-1.42(m,1H),0.99(t,3H)。B)¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：8.70-8.60(m,2H),7.80-7.74(m,1H),7.42-7.32(m,1H),5.15(dd,1H),4.70-4.58(m,1H),2.81(d,1H),1.99-1.85(m,1H),1.65-1.42(m,1H),0.94(t,3H)。

b)2-胺基-1-吡啶-3-基-丁-1-醇

2-硝基-1-吡啶-3-基-丁-1-醇(1.0g，4.44mmol)於乙醇(20mL)中之溶液用氬氣淨化，且在室溫下添加100mg阮尼鎳。將反應混合物抽真空三次且用氫氣回填。反應物在室溫下攪拌16小時。阮尼鎳接著經Hyflo過濾，且Hyflo用EtOH洗滌。接著濃縮濾液。殘餘物使用含MeOH之CH₂Cl₂(0%至100%)藉由管柱層析(40g SiO₂)純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(180mg，21%)。LC-MS：[M+H]167.1；Rt 0.21min；(LCMS方法1)。

c)4-乙基-5-吡啶-3-基- 唑烷-2-酮

在氬氣下，在0℃下，向2-胺基-1-吡啶-3-基-丁-1-醇(150mg，0.90mmol)於CH₂Cl₂(5mL)之中溶液中添加NEt₃(314μL，5.63mmol)。接著，在5分鐘期間內添加雙光氣且使溫度在2小時內自0℃上升至室溫。反應混合物用冰冷的水及2M Na₂CO₃溶液淬滅，用CH₂Cl₂萃取，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之庚烷(0%至100%)藉由管柱層析純化，得到標題化合物(100mg，58%)，其為非對映異構體A與B之混合物。LC-MS：[M+H]193.1；Rt 0.43min；(LCMS方法1)。A)¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：8.70-8.62(m,1H),8.60-8.56(m,1H),7.76-7.71(m,1H),7.42-7.35(m,1H),5.78(d,1H),4.08-3.98(m,1H),1.21-1.05(m,2H),0.84(t,3H)。B)¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：8.70-8.62(m,2H),7.80-7.76(m,1H),7.42-7.35(m,1H),5.21(d,1H),3.75-3.68(m,1H),1.89-1.69(m,2H),1.05(t,3H)。

中間物8：4-甲基-5-吡啶-3-基- 唑烷-2-酮

a)2-硝基-1-吡啶-3-基-丙-1-醇

在氬氣下，在0℃下，向LiAlH₄(2M於THF中)(1.4mL，2.8 mmol)於無水THF(110mL)中之溶液中緩慢添加1-硝基乙烷(2.00mL，28mmol)。在0℃下歷時20分鐘後，一次性添加菸鹼醛(2.64mL，28mmol)。將混合物攪拌16小時，同時使溫度自0℃上升至室溫。藉由添加5mL 1M HCl，隨後添加CH₂Cl₂及Na₂SO₄來淬滅反應混合物。將所得懸浮液攪拌15分鐘且接著過濾。濃縮濾液。殘餘物接著使用含EtOAc之己烷(0%至100%)藉由管柱層析(40g SiO₂)純化，得到油狀產物(3.2g，63%)，其為非對映異構體混合物。LC-MS：[M+H]183.4；Rt 0.41min；(LCMS方法1)。A)¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：8.58-8.48(m,2H),7.68(d,1H)7.33-7.23(m,1H)5.42-5.38(m,1H),4.70-4.60(m,1H),3.30-2.90(brs,1H),1.46(d,3H)。B)¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：8.58-8.48(m,2H),7.68(d,1H)7.33-7.23(m,1H)5.04(d,1H),4.76-4.69(m,1H),3.30-2.90(brs,1H),1.31(d,3H)。

b)4-甲基-5-吡啶-3-基- 唑烷-2-酮

2-硝基-1-吡啶-3-基-丁-1-醇(3.20g，17.6mmol)於乙醇(90mL)中之溶液用氬氣淨化，且在室溫下添加200mg阮尼鎳。將反應混合物抽真空三次且用氫氣回填。將反應物在室溫下、在H₂下攪拌16小時。阮尼鎳接著經Hyflo過濾，且Hyflo用EtOH洗滌。接著濃縮濾液，得到2-胺基-1-吡啶-3-基-丙-1-醇作為產物(2.35g，88%)，其未經純化即用於下一反應步驟中。在氬氣下，在0℃下，向2-胺基-1-吡啶-3-基-丙-1-醇(700mg，4.60mmol)於CH₂Cl₂(20mL)中之溶液中添加Et₃N(1.60mL，11.5mmol)，隨後添加三光氣(819mg，2.76mmol，溶解於5mL CH₂Cl₂中)。反應溫度在一個小時內自0℃上升至室溫。反應混合物接著用冰冷的水及2M Na₂CO₃溶液淬滅，用CH₂Cl₂萃取，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至100%)藉由管柱層析純化，得到產物(160mg，20%)。LC-MS：[M+H]179.1；Rt 0.31min；(LCMS方法1)。

中間物9：(4S,5S)-4-((第三丁基二苯基矽烷基氧基)甲基)-5-苯基 唑烷-2-酮

a)(4S,5S)-4-羥甲基-5-苯基- 唑烷-2-酮

將(1S,2S)-2-胺基-1-苯基丙烷-1,3-二醇(20.0g，120mmol)、碳酸二乙酯(29.7mL，245mmol)及K₂CO₃(1.65g，12.0mmol)裝入具有機械攪拌器及vigreux管柱之燒瓶中。此懸浮液於135℃油浴中加熱，得到黃色溶液。產生之EtOH經vigreux管柱餾出。反應物在3小時期間內攪拌，直至不再有EtOH餾出。反應混合物接著冷卻至50℃，用EtOAc及NaHCO₃水溶液稀釋。分離有機層，用鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之庚烷(33%至100%)藉由管柱層析(550g SiO₂)純化，得到呈灰褐色油狀之標題化合物(7.50g，33%)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)：7.87(br s,1H),7.50-7.30(m,5H),5.37(d,1H),5.23-5.17(m,1H),3.70-3.60(m,1H),3.60-3.50(m,2H)。

b)(4S,5S)-4-((第三丁基二苯基矽烷基氧基)甲基)-5-苯基 唑烷-2-酮

在室溫下，向(4S,5S)-4-羥甲基-5-苯基-唑烷-2-酮(3.50g，17.2mmol)、NEt₃(4.80mL，34.4mmol)及DMAP(105mg，861μmol)於DMF(20mL)中之溶液中逐滴添加TBDPSCl(4.86mL，18.9mmol)。將反應物在室溫下攪拌3小時。接著濃縮反應混合物且用TBME稀釋，分離有機層，用NaHCO₃水溶液及鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之庚烷(0%至60%)藉由管柱層析(120g SiO₂)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(4.28g，57%)。LC-MS： [M+H]432.2；Rt 1.36min；(LCMS方法2)。

中間物10：(4S,5S)-4-(((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)甲基)-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

在0℃-5℃下，向(4S,5S)-4-(羥甲基)-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮[545435-91-4](0.68g，3.05mmol)及咪唑(0.249g，3.66mmol)於DMF(10mL)中之溶液中逐滴添加TBDPSCl(0.97mL，3.66mmol)。使反應混合物溫熱至室溫且在室溫下攪拌隔夜。濃縮反應混合物且將殘餘油狀物溶解於TBME中且用10% KHSO₄水溶液、H₂O、飽和NaHCO₃溶液及鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之庚烷(5%至50%)藉由管柱層析純化，得到呈白色泡沫狀之標題化合物(1.62g，55%)。TLC(庚烷/EtOAc 1：1)R_f=0.44；LC-MS：[M+H]462；Rt 1.36min；(LCMS方法2)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：7.65(d,4H),7.35-7.60(m,6H),7.24(d,2H),6.92(d,2H),5.24(d,1H),5.20(br s,1H),3.84(m,4H),3.77(m,2H),1.09(s,9H)。

中間物11：(4S,5S)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-5-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基) 唑烷-2-酮

a)(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-乙氧基乙氧基)苯基)丙酸甲 酯

向(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-羥基苯基)丙酸甲酯(4.43g，15.00mmol)、K₂CO₃(4.15g，30.0mmol)及碘化鈉(112mg，750μmol)於乙腈(100mL)中之懸浮液中添加1-溴-2-甲氧基乙烷(5.64mL，60.0mmol)且將所得混合物在回流下攪拌2天。反應混合物用TBME稀釋且用H₂O及鹽水洗滌。合併之萃取物經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮，得到呈黃色油狀之標題化合物(5.3g，95%)。TLC(甲苯/TBME 2：1)R_f=0.44；t_R=1.084min(UPLC 1)；LC-MS：[M+H]354；Rt 1.02min；(LCMS方法2)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ 7.05(d,2H),6.88(d,2H),4.96(br d,1H),4.58(m,1H),4.12(dd,2H),3.76(dd,2H),3.73(s,3H),3.47(s,3H),3.05(m,2H),1.44(s,9H)。

b)(4R,5S)-5-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-2-側氧基 唑烷-4-甲酸甲酯

在氬氣下，向(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-羥基苯基)丙酸甲酯(5.34g，14.35mmol)於乙腈(260mL)中之溶液中添加過硫酸鉀(7.76g，28.7mmol)於H₂O(190mL)中之溶液及CuSO₄(0.458g，2.87mmol)溶於H₂O(70mL)中之溶液。將所得混合物在70℃下攪拌3小時。反應混合物用EtOAc萃取。合併之萃取物用鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之庚烷(20%至100%)藉由管柱層析純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(2.33g，52%)。TLC(庚烷/EtOAc 1：2)R_f=0.19；t_R=0.680min(UPLC 1)；LC-MS：[M+H]296；Rt 0.68min；(LCMS方法2)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：7.36(d,2H),6.99(d,2H),5.86(br d,1H),5.62(d,1H),4.30(d,1H),4.16(dd,2H),3.88(s,3H),3.79(dd,2H),3.48(s,3H)。

c)(4S,5S)-4-(羥甲基)-5-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基) 唑烷-2-酮

在0℃-5℃下，向(4R,5S)-5-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-2-側氧基唑烷-4-甲酸甲酯(2.30g，7.79mmol)於EtOH(45mL)中之懸浮液中分多份添加硼氫化鈉(648mg，17.1mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌0.5小時且接著在0℃-5℃下用4M HCl水溶液(10mL)酸化。濃縮反應混合物，且產物用EtOAc萃取。合併之萃取物用鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮，得到呈灰褐色泡沫狀之標題化合物(1.80g，81%)。t_R=0.498min(UPLC 1)；LC-MS：[M+H]268；Rt 0.55min；(LCMS方法2)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：7.31(d,2H),6.96(d,2H),6.45(br s,1H),5.33(d,1H),5.30(br s,1H),3.75-4.30(m,7H),3.47(s,3H)。

d)(4S,5S)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-5-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基) 唑烷-2-酮

類似於針對中間物10[(4S,5S)-4-(((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)甲基)-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮]所述之程序、由(4S,5S)-4-(羥甲基)-5-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)唑烷-2-酮及TBDMS-Cl製備標題化合物，藉由管柱層析(使用含EtOAc之庚烷(5%至50%))純化後，得到呈淺黃色油狀之中間物11。TLC(庚烷/EtOAc 1：1)R_f=0.26；t_R=1.28min(UPLC 1)；LC-MS：[M+H]382.2；Rt 1.17min；(LCMS方法2)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：7.30(d,2H),6.97(d,2H),5.44(br s,1H),5.23(d,1H),4.18(dd,2H),3.70-3.85(m,5H),3.48(s,3H),0.91(s,9H),0.11(s,6H)。

中間物12：(4S,5S)-5-(4-(2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)乙氧基)苯基)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基) 唑烷-2-酮

類似於針對中間物11所述之程序、以(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-羥基苯基)丙酸甲酯及(2-溴乙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷為起始物來製備標題化合物。TLC(庚烷/EtOAc 1：1)R_f=0.51；t_R=1.764min(UPLC 1)；LC-MS：[M+H]482；Rt 1.57min；(LCMS方法1)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：7.31(d,2H),6.96(d,2H),5.26(br s,1H),5.22(d,1H),4.13(m,2H),4.00(m,2H),3.79(m,1H),3.67(m,2H),0.93(s,9H),0.92(s,9H),0.11(m,12H)。

中間物13：(4S,5S)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-5-(4-(3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙氧基)苯基) 唑烷-2-酮

類似於針對中間物12所述之程序、以(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-羥基苯基)丙酸甲酯及(3-溴丙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷為起始物來製備標題化合物。TLC(庚烷/EtOAc 1：1)R_f=0.49；t_R=1.832min(UPLC 1)；LC-MS：[M+H]496；Rt 1.62min(LC-MS方法1)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：7.30(d,2H),6.95(d,2H),5.27(br s,1H),5.22(d,1H),4.13(dd,2H),4.00(m,2H),3.80(m,3H),3.74(m,2H),2.01(m,2H),0.93(s,9H),0.91(s,9H),0.10(s,6H),0.06(s,6H)。

中間物14：(4S,5R)-4-甲基-5-噻唑-2-基- 唑烷-2-酮

a)(2-羥基-1-甲基-2-噻唑-2-基-乙基)-胺基甲酸第三丁酯

將Boc-L-丙胺酸(9.99g，57.7mmol)溶解於200mL CH₂Cl₂中。在氬氣下，在-20℃下，向反應混合物中添加溶解於70mL CH₂Cl₂中之2-(三甲基矽烷基)-噻唑(9.90g，62.9mmol)。在-20℃下歷時21小時後，濃縮反應混合物。接著將殘餘物溶解於180mL THF中，添加TBAF(1M於THF中，63.4mL，63.4mmol)，且將反應混合物在室溫下攪拌4小時。接著濃縮反應混合物。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至100%)藉由管柱層析(120g SiO₂)純化，得到標題化合物(14.0g，93%)，其為非對映異構體混合物。LC-MS：[M+H]259.2；Rt 0.78min；(LCMS方法1)。

b)2-胺基-1-噻唑-2-基-丙-1-醇

將2-羥基-1-甲基-2-噻唑-2-基-乙基)-胺基甲酸第三丁酯(13.8g，53.4mmol)溶解於50mL二烷中。添加134mL(534mmol)含4M HCl之二烷，且將反應混合物在室溫下攪拌4小時。接著濃縮反應混合物，且殘餘物用乙醚稀釋且過濾，獲得呈白色鹽狀之標題化合物(11.5g，92%)，其為非對映異構體混合物。LC-MS：[M+H]159.1；Rt 0.22min；(LCMS方法1)。

c)(4S,5R)-4-甲基-5-噻唑-2-基- 唑烷-2-酮

將2-胺基-1-噻唑-2-基-丙-1-醇之非對映異構體之混合物(4.20g，18.2mmol)溶解於160mL CH₂Cl₂中。在0℃下添加二異丙基乙胺(11.1mL，63.6mmol)，隨後將三光氣(2.70g，9.09mmol)溶解於40mL CH₂Cl₂中。將反應混合物在室溫下攪拌2小時且接著用CH₂Cl₂稀釋。分離有機溶劑，用NaHCO₃水溶液及鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至100%)藉由管柱層析(80g SiO₂)純化，得到標題化合物(2.16g，64%)，其為單一對映異構體。LC-MS：[M+H]185.3；Rt 0.45min；(LCMS方法1)。¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：7.75(d,1H),7.35(d,1H),5.60(br s,1H),5.32(d,1H),4.18-4.09(m,1H),1.45(d,3H)。

中間物15：(4S,5S)-4-甲基-5-噻唑-2-基- 唑烷-2-酮

在氬氣下，在0℃下向(1S,2S)-2-胺基-1-噻唑-2-基-丙-1-醇及(1R,2S)-2-胺基-1-噻唑-2-基-丙-1-醇(2.9g，12.5mmol)於CH₂Cl₂(40mL)中之混合物中添加NEt₃(10.5mL，75mmol)。接著，緩慢添加溶解於40mL CH₂Cl₂中之三光氣(1.86g，6.27mmol)，且使溫度自0℃上升至室溫。將反應混合物在室溫下攪拌16小時。接著藉由添加NaHCO₃水溶液來淬滅反應混合物。分離有機層，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之庚烷(0%至100%)藉由管柱層析純化，得到所需產物(330mg，13%)。LC-MS：[M+H]185.0；Rt 0.48min；(LCMS方法1)。¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：7.79(d,1H),7.34(d,1H),5.91(d,1H),5.71(br s,1H),4.48-4.38(m,1H),0.89(d,3H)。

合成實例化合物 實例1：(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基- 唑烷-2-酮

a)(4S,5R)-3-(6-氯-2-嗎啉-4-基-嘧啶-4-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基- 唑烷-2-酮

將(4S,5R)-4-甲基-5-噻唑-2-基-唑烷-2-酮(中間物14)(4.70g，20.1mmol)溶解於70mL DMF中且冷卻至0℃。在氬氣下添加NaH(964mg，60%於油中，24.1mmol)，且將反應混合物在0℃下攪拌30分鐘。添加溶解於30mL DMF中之4-(4,6-二氯嘧啶-2-基)嗎啉(3.70g，20.1mmol)，且將反應混合物在0℃下攪拌3小時，隨後在室溫下攪拌2小時。接著藉由添加NH₄Cl水溶液淬滅反應物，隨後用EtOAc稀釋；分離有機溶劑，用鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至100%)藉由管柱層析(80g SiO₂)純化，得到標題化合物(3.64g，48%)。LC-MS：[M+H]382.2,384.1；Rt 1.10min；(LCMS方法1)。¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：7.77(d,1H),7.38-7.33(m,2H),5.39(d,1H),5.07-4.98(m,1H),3.75-3.55(m,8H),1.64(d,3H)。

b)(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基- 唑烷-2-酮

在氬氣下，向(4S,5R)-3-(6-氯-2-嗎啉-4-基-嘧啶-4-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基-唑烷-2-酮(步驟a)中所得)(1.30g，3.40mmol)於20mL二甲氧基乙烷中之溶液中添加5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼-2-基)-4-(三氟甲基)嘧啶-2-胺(1.08g，3.75mmol)、PdCl₂(dppf)-CH₂Cl₂(214mg，262μmol)及2M碳酸鈉水溶液(5.11mL，10.2mmol)。將反應混合物在80℃下攪拌30分鐘。接著將反應混合物冷卻至室溫且用80mL EtOAc稀釋，有機溶劑用NH₄Cl水溶液及鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至100%)藉由管柱層析(80g SiO₂)純化，得到呈非晶形固體狀之實例1(1.20g，69%)。LC-MS：[M+H]509.0；Rt 0.99min；(LCMS方法1)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)：8.58(s,1H),7.92(d,1H),7.87(d,1H),7.64(br s,2H),7.41(s,1H),5.89(d,1H),5.10-5.04(m,1H),3.75-3.55(m,8H),1.62(d, 3H)。

實例2：(4S*,5S*)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

a)(4S*,5S*)-3-(6-氯-2-嗎啉基嘧啶-4-基)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

在室溫下，在氬氣下向(4R*,5R*)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮(中間物2)(217mg，0.98mmol)於DMF(2mL)中之溶液中添加NaH(51.4mg，1.18mmol)。20分鐘後，添加4-(4,6-二氯嘧啶-2-基)嗎啉(230mg，0.98mmol)於DMF(1mL)中之懸浮液，且將反應混合物在85℃下攪拌20分鐘。溶液在0℃下用NH₄Cl水溶液淬滅，用乙酸乙酯萃取，且有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且濃縮。粗產物使用含EtOAc之己烷溶液(0%至20%)藉由管柱層析純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(375mg，91%)。LC-MS：[M+H]419.1；Rt 1.26min；(LCMS方法1)。

b)(4S*,5S*)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

在室溫下，在氬氣下，向(4R*,5R*)-3-(6-氯-2-嗎啉基嘧啶-4-基)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮(步驟a)中所得)於DME(2mL)中之溶液中添加5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼-2-基)-4-(三氟甲基)嘧啶-2-胺(76mg，0.26mmol)、2M Na₂CO₃水溶液(0.36mL，0.72mmol)及肆(三苯基膦)鈀(27.6mg，24μmol)。將混合物在80℃下攪拌 1小時，冷卻至室溫且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之己烷(0%至20%)藉由管柱層析純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(125mg，95%)。LC-MS：[M+H]546.2；Rt 1.17min；(LCMS方法1)。¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)：8.63(s,1H),7.68(s,1H),7.31(d,2H),6.96(d,2H),5.49(br s,2H),5.27(d,1H),4.66-4.61(m,1H),3.84(s,3H),3.80-3.73(m,8H),2.30-2.00(m,2H),1.08(t,3H)。

實例3：(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

a)(4S,5S)-4-(((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)甲基)-3-(6-氯-2-嗎啉基嘧啶-4-基)-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

經氬氣淨化後，向(4S,5S)-4-(((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)甲基)-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮(中間物10)(1.65g，3.57mmol)、4-(4,6-二氯嘧啶-2-基)嗎啉(920mg，3.93mmol)及Cs₂CO₃(1.75g，5.36mmol)於二烷(20mL)中之溶液中添加4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基二苯并哌喃(145mg，250μmol)及Pd₂(dba)₃(65mg，0.071mmol)，且反應混合物在100℃下加熱5小時。反應混合物添加至10% NaHCO₃水溶液中且用EtOAc萃取。合併之萃取物用鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之庚烷(0%至50%)藉由管柱層析純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(2.33g，94%)。TLC(庚烷/EtOAc 1：1)R_f=0.52；LC-MS：[M+H]659,661；Rt 1.58min；(LCMS方法2)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：7.64(m,4H),7.54(s,1H),7.55- 7.35(m,6H),7.26(m,2H),6.95(d,2H),5.21(d,1H),4.56(m,1H),4.22(dd,1H),3.96(dd,1H),3.84(s,3H),3.60-3.40(m,8H),1.09(s,9H)。

b)(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)甲基)-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

將(4S,5S)-4-(((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)甲基)-3-(6-氯-2-嗎啉基嘧啶-4-基)-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮(步驟a)中所得)(150mg，228μmol)、5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼-2-基)-4-(三氟甲基)嘧啶-2-胺(108mg，364μmol)、20% Na₂CO₃水溶液(0.24mL，2.28mmol)及PdCl₂(dppf)-CH₂Cl₂(18.6mg，23μmol)於DME(2mL)中之溶液在氬氣下於80℃下攪拌8小時。反應混合物用EtOAc稀釋且用飽和NaHCO₃溶液、H₂O及鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且濃縮。殘餘物使用含EtOAc之庚烷(0%至33%)藉由管柱層析純化，得到呈淺黃色泡沫狀之標題化合物(68mg，28%)：TLC(庚烷/EtOAc 1：1)R_f=0.32；t_R=1.663min(UPLC 1)；LC-MS：[M+H]786；Rt 1.48min；(LCMS方法2)。

c)(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-甲氧基苯基) 唑烷-2-酮

在0℃下，向步驟b)中所得之(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)甲基)-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮(68mg，65μmol)於THF(2mL)中之溶液中逐滴添加含1M TBAF之THF(0.05ml，0.05mmol)，且將所得混合物在0℃下攪拌30分鐘且在室溫下攪拌1小時。濃縮反應混合物，且殘餘物藉由管柱層析(使用100：100：5至0：100：5比率之己烷/CH₂Cl₂/MeOH)、隨後藉由製備型HPLC(Waters Sun Fire C18,30×100mm,5μm；0.1% TFA-水/乙腈；20分鐘內30-50%乙腈梯度)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(18mg，50%)；TLC(CH₂Cl₂/MeOH 19：1)R_f=0.40；t_R=0.998min(UPLC 1)；LC-MS：[M+H]548；Rt 0.96min；(LCMS方法2)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)：8.60(s,1H),7.64(br s,2H),7.53(s,1H),7.34(d,2H),7.00(d,2H),5.58(d,1H),5.32(t,1H),4,59(m,1H),4.00(m,1H),3.82(m,1H),3.76(s,3H),3.75-3.55(m,8H)。

實例4至14

以下表1中之實例4至14可使用與實例1至3中所述類似之程序、使用適當酸酯中間物及唑烷酮製備。

生物活性

本發明之化合物之活性可藉由以下活體外及活體內方法評估。

製備化合物稀釋物(384孔)

將測試化合物溶解於DMSO(10mM)中且藉由個別Novartis混配中心轉移至具有獨特2D矩陣晶片之1.4mL平底或V形Matrix管中。此等晶片之編號有區別地與Novartis Pharma編號關聯。儲備溶液若不立即使用，則在-20℃下儲存。在測試程序中，將小瓶除霜且藉由掃描器鑑別，藉此產生指導隨後操作步驟的操作單。

若在384孔中測試概況，則如下文所述或如下文所述製備，將化合物在DMSO中人工稀釋以用於個別實驗(96個孔能夠使10種化合物以8種(單點)濃度操作)。此格式能夠對最多40種個別測試化合物(包括4種參考化合物)在8種濃度(單點)下進行分析。稀釋方案包括製備「預稀釋盤」、「主盤」及「分析盤」。

預稀釋盤：使用96孔聚丙烯盤作為預稀釋盤。製備總共4個預稀釋盤，包括10種各位於盤位置A1至A10上的測試化合物、一種位於A11之標準化合物及一種位於A12之DMSO對照物。稀釋步驟之模式概述於表1中。編寫程式以在HamiltonSTAR機器人上運行此等吸移步驟。

DMSO經H₂O飽和至濃度10%。Vol：體積；Conc：濃度；Dil.比率：稀釋比；Fin.c：最終濃度。

主盤：將100μL個別化合物稀釋物(包括標準化合物及4個「預稀釋盤」之對照物)轉移至384孔「主盤」中，包括以下濃度：1'820、564、182、54.6、18.2、5.46、1.82及0.546μM(分別於90% DMSO中)。

分析盤：接著藉由將「主盤」之50nL各化合物稀釋物吸移至384孔「分析盤」中來製備相同「分析盤」。將化合物與4.5μL分析組分及4.5μL酶混合(對應於1：181稀釋度)，從而能夠達成分別為10、3.0、1.0、0.3、0.1、0.03、0.01及0.003μM之最終濃度。藉由Matrix PlateMate Plus機器人操縱「主盤」之製備過程且藉由HummingBird機器人操縱「分析盤」之複製。

產生表現構築體之方法

如所描述來選殖、表現及純化人類催化活性PI3Kα、PI3Kβ、 PI3Kδ及mTOR(公認的Maira SM,Stauffer F,Brueggen J,Furet P,Schnell C,Fritsch C,Brachmann S,Chène P,de Pover A,Schoemaker K,Fabbro D,Gabriel D,Simonen M,Murphy L,Finan P,Sellers W,García-Echeverría C(2008),Mol Cancer Ther.7：1851-63及Maira SM,Pecchi S,Brueggen J,Huh K,Schnell C,Fritsch C,Nagel T,Wiesmann M,Brachmann S,Dorsch M,Chène P,Schoemaker K,De Pover A,Menezes D,Fabbro D,Sellers W,García-Echeverría C,Voliva CF(2011),Mol.Cancer Ther.)。

PI3Kα、PI3Kβ之生物化學分析法

基於螢光之ATP偵測試劑KinaseGlo獲自Promega(目錄號V6714，批號236161),Catalys,Wallisellen,Switzerland。(L-α-磷脂醯肌醇(PI)，肝臟，牛)獲自Avanti Polar Lipid(目錄號840042C，批號LPI-274)，磷脂醯肌醇-4,5-雙磷酸酯(PIP(4,5)2(Avanti，目錄號840046X)或L-α-磷脂醯肌醇(PI)獲自Avanti Polar Lipid(目錄號840042C，批號LPI-274)。L-α-磷脂醯絲胺酸(PS)獲自Avanti Polar Lipid(目錄號840032C)，正辛基葡萄糖苷獲自Avanti Polar Lipid(目錄號10634425001)。螢光為公認的用於測定ATP濃度之讀數且因此可用於追蹤許多激酶之活性而不考慮其受質。Kinase Glo螢光激酶分析(Promega,Madison/WI,USA)為藉由對激酶反應後保留於溶液中之ATP量進行定量來量測激酶活性的均相HTS方法。

將50nL化合物稀釋物分配於黑色384孔低容量非結合苯乙烯(NBS)盤(Costar，目錄號NBS#3676)上，如章節8.2中所述。將以在甲醇中之10mg/mL溶液形式提供的L-α-磷脂醯肌醇(PI)轉移至玻璃管中且在氮束下乾燥。其接著藉由渦旋而再懸浮於3%辛基葡萄糖苷中且在4℃下儲存。添加PI/OG與PI3Ka及Pi3Kb亞型之5μL混合物。藉由添加5μl ATP混合物來起始激酶反應，此混合物含有最終體積為10μL之 10mM TRIS-HCl pH 7.5、3mM MgCl₂、50mM NaCl、0.05% CHAPS、1mM DTT及1μM ATP，且激酶反應係在室溫下進行。使用10μl KinaseGlo停止反應且10分鐘後用Synergy2讀取器、使用每孔0.1秒之積分時間來讀盤。向分析盤中添加2.5μM NVP-BGT226(標準物)以對激酶反應產生100%抑制，且由溶劑媒劑(含90% DMSO之水)得到0%抑制。NVP-BGT226用作參考化合物且一式兩份、以16個稀釋點形式包括於所有分析盤中。

藉由將S形劑量反應曲線與分析讀數相對於抑制劑濃度之圖擬合來獲得各種化合物在8種濃度(通常為10、3.0、1.0、0.3、0.1、0.030、0.010及0.003μm)下之抑制百分比之IC₅₀值(n=2)。所有擬合皆使用程式XLfit4(ID Business Solutions,Guildford,UK)進行。

PI3Kδ、PI3Kγ之生物化學分析法

TR-FRET Adapta^TM通用激酶分析套組購自Invitrogen Corporation(Carlsbad/CA,USA)(目錄號PV5099)。套組含有以下試劑：Adapta Eu-抗ADP抗體(含銪標記之抗ADP抗體之HEPES緩衝鹽水，目錄號PV5097)、Alexa Fluor® 647標記之ADP示蹤劑(含Alexa Fluor®647標記之ADP示蹤劑之HEPES緩衝鹽水，目錄號PV5098)、專有TR-FRET稀釋緩衝液pH 7.5(目錄號PV3574)。

PIK3CD受質磷脂醯肌醇獲自Invitrogen(由含2mM PI之50mM HEPES pH7.5組成之囊泡；目錄號PV5371)。PIK3CG受質磷脂醯肌醇-4,5-雙磷酸酯(PIP(4,5)2獲自Invitrogen(大型PIP2：PS非層狀囊泡，由含1mM PIP2：19mM PS之50mM HEPES pH7.5、3mM MgCl₂、1mM EGTA組成；目錄號PV5100)。

時差式螢光共振能量轉移(TR-FRET)為一種以兩種相鄰染料之間的能量轉移(一種染料(供體)中之受激電子經由共振轉移至相鄰染料(受體)之電子，接著以光子形式釋放)為基礎的技術。此能量轉移係藉由受體之螢光發射增強及供體之螢光發射減弱來偵測。蛋白激酶之TR-FRET分析使用長壽命鑭系元素鋱或銪螯合物作為供體物質，其藉由閃光燈激發源引入激發後延遲來克服化合物自體螢光或所沈澱化合物之光散射之干擾。結果通常以受體與供體螢光團之強度比表示。針對各孔之間在分析體積上的差異且針對因著色化合物所致之淬滅效應而對此值之比率計量性質進行修正。Adapta^TM分析法可分成兩個階段：激酶反應階段及ADP偵測階段。在激酶反應階段，將所有激酶反應組分添加至孔中且將反應物培育對於各激酶所特有的一定時段。反應後，將Eu標記抗ADP抗體之偵測溶液、Alexa Fluor® 647標記之ADP示蹤劑及EDTA(停止激酶反應)添加至分析孔中。激酶反應所形成之ADP將經由抗體而置換Alexa Fluor® 647標記之ADP示蹤劑，引起TR-FRET信號降低。在抑制劑存在下，激酶反應所形成之ADP的量減少，且所得完整抗體-示蹤劑相互作用維持高TR-FRET信號。在Adapta^TM分析法中，供體(銪-抗ADP抗體)在340nm下受到激發且將其能量轉移至受體(Alexa Fluor® 647標記之ADP示蹤劑)。Alexa Fluor® 647之發射可利用集中於665nm之濾波器監測，因為665nm位於供體之發射峰之間，其係在615/620nm下量測。

將50nL化合物稀釋物分配至白色384孔小容量聚苯乙烯盤上，如章節2.2中所述。接著在室溫下培育5μL PI3Kg及PI3Kd及脂質受質(PI或PIP2：PS)，隨後5μL ATP(最終分析體積10μL)。用於Adapta^TM TR-FRET分析法之標準反應緩衝液含有10mM Tris-HCl pH 7.5、3mM MgCl₂、50mM NaCl、1mM DTT、0.05% CHAPS。用5μL含有Eu標記之抗ADP抗體及Alexa Fluor® 647標記之ADP示蹤劑之EDTA於TR-FRET稀釋緩衝液(IVG專有)中之混合物中止反應。在15至60分鐘後，使用0.4秒之積分時間及0.05秒之延遲、用Synergy2讀取器讀盤。藉由用標準反應緩衝液置換PI3K來進行激酶反應100%抑制之對照實驗。 0%抑制之對照係由化合物之溶劑媒劑(含90% DMSO之H₂O)得到。使用標準化合物NVP-BGT226作為參考化合物且一式兩份、以16個稀釋點形式包括於所有分析盤中。

使用Excel擬合軟體或Graphpad Prism分析資料。藉由將S形劑量反應曲線與分析讀數相對於抑制劑濃度之圖擬合來獲得EC₅₀值。所有擬合皆使用程式XLfit4(ID Business Solutions,Guildford,UK)進行。藉由將S形劑量反應曲線與分析讀數相對於抑制劑濃度之圖擬合來測定各種化合物在8種濃度(通常為10、3.0、1.0、0.3、0.1、0.030、0.010及0.003μm)下之抑制百分比之IC₅₀值(n=2)。所有擬合皆使用程式XLfit4(ID Business Solutions,Guildford,UK)進行。

mTOR之生物化學分析法

蛋白激酶之TR-FRET分析法使用長壽命鑭系元素鋱或銪螯合物作為供體物質，其藉由閃光燈激發源引入激發後延遲來克服化合物自體螢光或所沈澱化合物之光散射之干擾。結果通常以受體與供體螢光團之強度比表示。針對各孔之間在分析體積上的差異且針對因著色化合物所致之淬滅效應而對此值之比率計量性質進行修正。

結合分析法係以Alexa Fluor® 647標記之ATP競爭性激酶抑制劑結合於相關激酶且將其置換為基礎。Invitrogen已研發出可定址多種激酶目標的「激酶示蹤劑」且此等激酶示蹤劑係基於ATP競爭性激酶抑制劑，從而使其適於偵測結合於ATP位點或結合於改變ATP位點構形之異位的任何化合物。結合ATP位點之抑制劑包括I型激酶抑制劑及II型抑制劑(例如Gleevec®/伊馬替尼(Imatinib)、索拉非尼(Sorafenib)、BIRB-796)，I型激酶抑制劑僅結合於ATP位點，II型抑制劑結合於ATP位點及DFG-out(非活性)構形中所暴露之疏水性位點。III型抑制劑為不與ATP競爭的化合物，泛稱為異位抑制劑。對15種不同的III型抑制劑之研究表明，在利用與活性分析法等效之效能的結合分析法中偵測到除一種化合物外的所有化合物。唯一例外為受質競爭性化合物，且因此不為真正的異位抑制劑。

與大部分基於螢光之激酶活性分析法不同，LanthaScreen® Eu³⁺激酶結合分析法可連續讀取，此有利於利用緩慢結合動力學評估化合物。又，與大部分活性分析法不同，結合分析法可使用活性或非活化激酶製劑進行，從而能夠表徵優先結合於未活化激酶的化合物，諸如Gleevec®/伊馬替尼及一些異位抑制劑。

在Lanthascreen^TM激酶結合分析法中，供體(Eu³⁺-抗GST抗體)在340nm下激發且將其能量轉移至受體(Alexa Fluor® 647標記之ATP競爭性激酶抑制劑=示蹤劑-314)。示蹤劑-314(Alexa Fluor® 647抑制劑)之發射可利用集中於665nm之濾波器監測，因為665nm位於供體之發射峰之間，其係在615/620nm下量測。示蹤劑-314與Eu³⁺-抗GST抗體均結合於激酶可產生高度的自Eu³⁺-供體螢光團至示蹤劑-314上之Alexa-Fluor® 647-受體螢光團的FRET。抑制劑與激酶之結合係與示蹤劑之結合進行競爭，從而引起FRET損失。

將50nL化合物稀釋物分配至白色384孔小容量聚苯乙烯盤上，如章節2.2中所述。接著在室溫下培育5μL GST-mTOR及銪-抗GST抗體，隨後5μL示蹤劑-314(最終分析體積10μL)。用於Lanthascreen^TM激酶結合分析法之標準反應緩衝液含有50mM HEPES pH 7.5、5mM MgCl₂、1mM EGTA、0.01% Pluronic F-127。在60分鐘後，使用0.2微秒之積分時間及0.1微秒之延遲、用Synergy2讀取器讀盤。

為計算發射比，將受體(Alexa Fluor® 647標記之示蹤劑-314)在665nm下發射之信號除以供體(Eu³⁺抗GST抗體)在620nm下發射之信號。

0%抑制之對照係由化合物之溶劑媒劑(含90% DMSO之H₂O)得到。相對100%抑制之對照實驗係藉由添加10μM含有GST-mTOR及銪抗GST抗體之混合物來進行。絕對0%抑制之另一對照係由不含GST-mTOR之Eu³⁺抗GST抗體得到。

針對PI3Kα、β及δ之細胞分析法

AlphaScreen(擴增螢光近接均質分析ALPHA，Perkin Elmer)為一種以均質微量滴定盤形式研究生物分子相互作用的基於非放射性珠粒之近接分析法。商標SureFire意指AlphaScreen分析法，其經調適以藉由使用所匹配之抗體對來對溶胞物中之內源性細胞蛋白之磷酸化進行定量，抗體對係由抗磷酸化激酶及抗激酶抗體組成。該分析法可對細胞中之激酶信號傳導進行表徵及量測激酶抑制劑效應。與諸如ELISA之標準分析技術相比，AlphaScreen技術因其避免耗時的洗滌程序及減少培養盤操作而具有若干優勢。此外，視個別AlphaScreen SureFire分析套組中所包括之抗體之親和力而定，其至少可小型化至384孔形式且提供低至飛莫耳濃度範圍之靈敏度。高靈敏度係藉由內在的擴增機制達成，其涉及產生單線態氧分子。SureFire分析套組可根據特定目標而商購且包括經確認之抗體對(PerkinElmer)。此報導描述AlphaScreen SureFire分析法所應用之常見程序及基於細胞之分析法中用於常規激酶抑制劑概況分析之個別半自動化步驟。

如所描述來製備穩定過度表現活性I類PI3K同功異型物大鼠-1 pBABEpuro Myr-HA-hp110δ(大鼠-1_PI3Kδ)及大鼠-1pBABEpuro Myr-HA-hp110α(大鼠-1_PI3Kalpha)及大鼠-1pBABEpuro Myr-HA-hp110β(大鼠-1_PI3beta)之大鼠-1細胞株(公認的Maira SM,Stauffer F,Brueggen J,Furet P,Schnell C,Fritsch C,Brachmann S,Chène P,de Pover A,Schoemaker K,Fabbro D,Gabriel D,Simonen M,Murphy L,Finan P,Sellers W,García-Echeverría C(2008),Mol Cancer Ther.7：1851-63及Maira SM,Pecchi S,Brueggen J,Huh K,Schnell C,Fritsch C,Nagel T,Wiesmann M,Brachmann S,Dorsch M,Chène P, Schoemaker K,De Pover A,Menezes D,Fabbro D,Sellers W,García-Echeverría C,Voliva CF(2011),Mol.Cancer Ther.)。所有細胞株皆在完全生長培養基(高葡萄糖型DMEM、10%(v/v)胎牛血清、1%(v/v)MEM NEAA、10mM HEPES、2mM L-麩胺醯胺、嘌呤黴素(對於大鼠-1_PI3Kδ及大鼠-1_PI3Kα為10μg/mL，對於大鼠-1_PI3β為4μg/mL)、1%(v/v)Pen/Strep)中、在含濕氣CO₂培育箱中、在37℃/5% CO₂/90%濕度下培養至90%匯合且每週分裂兩次。

大鼠-1溶胞物中之p-AKT(S473)偵測使用以下物質：高葡萄糖型杜貝科氏改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium；DMEM)(Gibco Invitrogen,Basel,Switzerland，目錄號41965)、證明合格之熱不活化胎牛血清(HI FBS；Gibco Invitrogen,Basel,Switzerland，批號16140)、MEM非必需胺基酸(NEAA；Gibco Invitrogen,Basel,Switzerland，目錄號11140)、HEPES(Gibco Invitrogen,Basel,Switzerland，目錄號15630)、青黴素/鏈黴素(Penicillin/Streptomycin)(Pen/Strep，100x；Gibco Invitrogen,Basel,Switzerland，目錄號15140-122)、L-麩胺醯胺(Gibco Invitrogen,Basel,Switzerland，目錄號25030)、嘌呤黴素(Sigma Aldrich,Buchs,Switzerland，目錄號P9620)、DMSO(MERCK,Dietikon,Switzerland，目錄號8.02912.2500)、H₂O(除非另有說明，否則為MilliQ-H₂O)(MILLIPORE QGARDOOR1,Millipore,Zug,Switzerland)、牛血清白蛋白(BSA；Sigma Aldrich,Buchs,Switzerland，目錄號A8412)、SureFire p-Akt 1/2(Ser473)分析套組(PerkinElmer,Schwerzenbach,Switzerland，目錄號TGRAS50K)。

p-Akt(S473)SureFire分析法量測溶胞物中之內源性細胞Akt 1/2在Ser473處之磷酸化。使用穩定表現myr-HA標記型人類PI3Kδ、PI3Kα或PI3Kβ p110催化亞單元同功異型物的大鼠-1細胞，研發出384 孔形式之雙盤方案之分析法。

對於化合物測試，細胞於20μl完全生長培養基中以4000(大鼠-1_PI3Kδ)、7500(大鼠-1_PI3Kα)或6200(大鼠-1_PI3Kβ)個細胞之密度接種於經細胞培養物處理之384孔盤中且在37℃/5% CO₂/90%濕度下生長24小時。移除完全培養基，添加30μl分析緩衝液(高葡萄糖型DMEM、1x MEM NEAA、10mM HEPES、2mM L-麩胺醯胺、0.1%(w/v)BSA)且將10μl化合物預稀釋物轉移至細胞中，隨後立即轉移化合物。對於2010年2月之後的測試，用分析緩衝液取代完全生長培養基，顯示類似結果(資料未圖示)。在用化合物處理1小時後，藉由添加20μl補充有0.24%(w/v)BSA之溶胞緩衝液來溶解細胞。使用5μl溶胞物、以12μl之總偵測體積、使用SureFire p-Akt 1/2(Ser473)分析套組根據製造商說明書偵測p-AKT(Ser473)。

如所描述，藉由將S形劑量反應曲線與分析讀數相對於抑制劑濃度之圖擬合來獲得各種化合物在8種濃度(通常為10、3.0、1.0、0.3、0.1、0.030、0.010及0.003μm)下之抑制百分比之IC₅₀值(n=2)。所有擬合皆使用程式XLfit4(ID Business Solutions,Guildford,UK)進行。

針對mTOR之細胞分析法

研發基於細胞之分析法(384孔形式)以用於測定化合物對來源於缺乏TSC1(囊腫性血管肌脂瘤複合物1)(mTOR活性之有效抑制劑)之小鼠之MEF(小鼠胚纖維母細胞)細胞中之細胞性mTOR活性的影響。由於缺乏TSC1，因此mTOR經歷組成性活化，引起S6激酶1(S6K1)之Thr 389發生永久性磷酸化，Thr 389為mTOR之下游目標之一。

使用能夠測定S6K1上之Thr389之磷酸化作用的SureFire套組，以Alpha-Screen形式研發、驗證及實施一種分析法，其能夠定量測定溶胞物中S6K1之磷酸化T389。用mTOR特異性(或mTOR路徑)抑制劑處理MEF TSC1-/-細胞可以劑量依賴性方式降低S6K1上之磷酸化T389含量，從而可計算IC₅₀值。此等值與生物化學mTOR ATP結合分析法所獲得的值一致，從而能夠對mTOR抑制劑之效能進行定量比較。

TSC1-/- MEF細胞(Kwiatkowski,D.J.,Zhang,H.,Bandura,J.L.,Heiberger,K.M.,Glogauer,M.,el-Hashemite,N.及Onda,H.(2002)Hum.Mol.Genet.11,525-534)在補充有10% FBS(Invitrogen)、2mM麩醯胺酸及1%(w/v)青黴素/鏈黴素之高葡萄糖型DMEM培養基中、在37℃、5% CO₂下培養。

用於測定P70S6激酶磷酸化作用之SureFire套組購自Perkin Elmer(p70S6K p-T389，#TGR70S50K)且根據供應商說明書及根據SureFire分析法之一般方法進行分析。簡言之，將每孔5μL溶胞物轉移至384孔白色代理盤(用於讀取螢光)中且與7μL A及5μL B(最終體積：12μL)混合。在室溫下在黑暗中培育3小時後，利用Envision讀取器(Perkin Elmer)讀取螢光。未經處理之細胞用作對照(高對照)且經3μM BEZ235處理之細胞用作低對照。將所獲得之高對照與低對照之信號之間的分析窗定義為100%且化合物作用係以抑制百分比表示。藉由圖形外推法，由劑量反應曲線計算IC₅₀值。

使用上述分析法獲得之結果提供於下表中。

生物化學PI3Kα

生物化學PI3Kβ

生物化學PI3Kδ

生物化學PI3Kγ

結合分析法mTor

細胞分析法PI3Kα

細胞分析法PI3Kβ

細胞分析法PI3Kδ

細胞分析法mTOR

光穩定性

針對光穩定性所研究之樣品於光穩定性腔室(Atlas CPS+，序號0704013)中處理。製備各分子於乙醇中之1.0mg/ml溶液且將0.5mL等分樣品分配於適合的微管中。所有量測皆重複進行兩次且與曝光期間鋁箔所包埋之參考物進行比較。溶液曝露於19620kJ/m² 13小時。樣品在實驗期間保持在15℃下。在光室中處理之後，藉由UPLC(UPLC 1，實驗部分)在254nm下分析溶液。自動求解峰面積積分，且降解百分比係由參考樣品之相應峰面積百分比與所曝露樣品之平均峰面積百分比之間的差值計算(重複兩次)。

使用此方法獲得之資料展示於下表中：

對細胞株增殖之抗增殖性抑制作用 化合物概況分析中所用之細胞及細胞培養物

SCL-1及SCC12B2為來源於天然存在之分化不良SCC的人類皮膚鱗狀細胞癌(SCC)細胞株。SCL-1細胞株最初產生於Caneer Reserach Center(Heidelberg)之N.Fusenig實驗室中，且先前已描述其活體外生長特徵(與正常角化細胞比較)(Neely等人，1991)。如先前所述(Rheinwald及Beckett 1981)，利用接受免疫抑制療法7年之男性移植患者之臉部皮膚產生SCC12B2細胞株。人類SCC細胞株Detroit562係自美國菌種保存中心(American Tissue Culture Collection；ATCC)獲得。Detroit562稱為頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)且來源於咽部SCC腫瘤。Detroit562細胞株具有PIK3CA基因之活化突變H1047R。已知此突變為 p110α鏈之「熱點」突變之一，致使此激酶同功異型物具有組成性活性且獨立於生長因子受體活化而刺激Akt/mTOR路徑。所有SCC細胞株均於杜貝科氏改良之伊格爾氏培養基(DMEM)(Gibco；目錄號：#10938)中維持且培養，此培養基進一步補充有5% FCS(Gibco；#16000-044)、100μM丙酮酸鈉(Gibco；#11360-039)、10mM HEPES(Gibco；#91002-066)、50U/ml青黴素及50μg/ml鏈黴素混合物(Gibco；#15070-063)及2mM L-麩胺醯胺(Gibco；#25030-024)。所有濃度均以最終濃度示出。細胞於具有通風帽之Corning Costar燒瓶中增殖，使用75cm²(Corning；#430641)或150cm²(Corning，#430825)尺寸之兩種燒瓶中之任一種。細胞培養物按慣例在含有5% CO₂之氛圍中，在37℃及80%相對濕度(Heraeus型)下維持。

量測細胞增殖

SCC或角化細胞株(Detroit562、SCC12B2、SCL1、HaCaT)之細胞在已達到80%至90%匯合時，用於增殖分析法。接著在胰蛋白酶介導之自培養瓶移位後收集細胞，於含有10% FCS之培養基中洗滌，用血球計計數且於具有5% FCS之完全培養基中稀釋以達到5×10⁴個細胞/毫升之細胞密度。將100μl此細胞懸浮液(例如5000個細胞)轉移至96孔白色器壁組織培養盤(Corning-Costar製品#3917)中之各孔中。接著藉由在CO₂培育箱中置放45至60分鐘來使細胞沈降。隨後，向四重複孔之各孔中添加體積為100μl之培養基，此培養基含有兩倍所需最終濃度之測試化合物。一個四重複孔接收100μl不含測試物之培養基作為對照(在資料圖中以X軸上之縮寫無化合物表示)。細胞培養物接著在存在或不存在測試化合物下培育總共26至28小時。使用化學發光BrdU細胞增殖ELISA(Roche製品#11 669 915 001)，根據併入細胞DNA中之溴脫氧尿核苷(BrdU)來測定細胞增殖。簡言之，BrdU試劑用完全培養基按1：100稀釋，達到100μM BrdU之濃度。向各孔中添加 20μl此溶液，且細胞培養物在37℃下、在5% CO₂下再培育16至18小時。在44至46小時後，藉由完全移除培養基及添加200μl固定溶液(使用ELISA套組提供)、在室溫下維持30分鐘來停止增殖分析。所有的其他培育、洗滌及分析法研發程序皆嚴格按照製造商(Roche)所提供之ELISA分析法手冊中所述進行。併入DNA中之BrdU係藉由BrdU特異性抗體偵測且根據抗體偶合螢光素酶介導之信號產生來定量。螢光發射係用Victor light 1420螢光計數器(Perkin Elmer)量測且以每秒之相對螢光單位(例如以RLU/s提供之資料點)量測。各孔之資料點轉移至Windows^® Excel試算表中用於計算平均值及標準差值。使用Origin 7.5^®軟體中可利用的S形曲線擬合函數對此等值作圖。

所量測之化合物於SCC細胞株中之抗增殖效能。使用此等SCC及角化細胞細胞株獲得的資料展示於下表中。表示抗增殖效能之所有值代表在兩個獨立分析法中使用SCC細胞株SCL-1、SCC12B2、Detroit562或HaCaT角化細胞細胞株所獲得的IC₅₀奈莫耳濃度：

所有值皆為IC₅₀奈莫耳濃度

皮膚滲透

按如下方式測試本發明之一種代表性化合物之皮膚滲透/透過性質：

測定皮膚滲透及透過性質之活體外測試

將化合物於丙二醇與乙醇或油醇混合物中的0.5%溶液塗覆於豬皮上，此豬皮安放於Franz型靜態擴散池中。在48小時曝露時間結束時，量測皮膚(移除角質層後)中及收集器中的藥物濃度。收集溶液為兩個體積份之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)與一個體積份之胎牛血清(FCS)之混合物。

活體外皮膚滲透及透過

皮膚濃度係以四次重複測定之平均值±標準差示出。

(a)：皮膚來源於4月齡養殖場豬(Landrace X Deutsches Edelschwein)

(b)：7個體積份之丙二醇(PG)與3個體積份之乙醇之混合物

(c)：9個體積份之PG與1個體積份之油醇(OA)之混合物

實例1之化合物活體外良好穿透至豬皮中，而穿透豬皮之透過速率較低，表示全身性暴露較低。在障壁功能及構造方法，豬皮與人類皮膚類似。

測定滲透至經局部處理豬之真皮中之活體內測試

在測定藥物含量之前的不同時間間隔(2小時及24小時)，在馴養幼豬之背側上，用0.5%溶液或懸浮液局部處理小面積皮膚(4cm²)。在此實驗中，處理4隻豬，且化合物於個別調配物中投與4個不同部位。解剖且移除所處理部位在中心處之皮瓣。展開皮瓣，且將經加熱之金屬塊置放於測試部位上1分鐘以誘導表皮與真皮分離。在移除鬆散的表皮薄片之後，利用皮刀，由經處理之去表皮化皮膚製備1mm厚皮膚薄片。自此等薄片收集6mm衝壓樣品(6mm )且藉由LC/MS分析測試化合物濃度。執行所述程序應小心避免真皮樣品被表面附著至表皮之化合物污染。

下表提供實例1之化合物於所鑑別之調配物中在表皮塗覆時於豬真皮中的真皮濃度。資料表提供8次測定(例如每個時點所分析之八個皮膚樣品)之平均值±標準平均誤差。

活體內豬皮PK

得到八次測定之平均值±標準平均誤差。

Tween®80：聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯

OA：油醇

PG：丙二醇

EtOH：乙醇

HPMC：羥丙基甲基纖維素

實例1之化合物在單次塗覆後活體內良好地滲透至豬皮中，到達真皮。

Claims

一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中，R¹為甲基、乙基或羥甲基；R²為苯基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，該間位之取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且該對位之取代基獨立地選自D、F、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基，或吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，該間位之取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且該對位之取代基獨立地選自D、F、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基，或含有2至3個選自N、O或S之雜原子的5員單環雜芳基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代；及R³為H或甲基。
如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其具有式(Ib)
如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R²為苯基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，該間位之取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且該對位之取代基獨立地選自D、F、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。
如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R²為吡啶基，其未經取代或在間位及/或對位經1或2個取代基取代，該間位之取代基獨立地選自D、F或甲氧基，且該對位之取代基獨立地選自D、F、C₁-C₅烷氧基、羥基-C₂-C₄烷氧基或C₁-C₂烷氧基-C₂-C₄烷氧基。
如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R²為含有2至3個選自N、O或S之雜原子的5員單環雜芳基，其未經取代或經1至2個獨立地選自D或F之取代基取代。
如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R¹為甲基。
如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R¹為乙基。
如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R¹為羥甲基。
如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係選自(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6- 基)-4-甲基-5-噻唑-2-基-唑烷-2-酮，(4S*,5S*)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-甲氧基苯基)唑烷-2-酮，(4S*,5R*)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-苯基唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-甲基-5-苯基唑烷-2-酮，(4R*,5R*)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(3-甲氧基苯基)唑烷-2-酮，(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-乙基-5-(噻唑-2-基)唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-乙基-5-吡啶-3-基-唑烷-2-酮，3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-吡啶-3-基-唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-羥甲基-5-苯基-唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基-唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)唑烷-2-酮，(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-5-(4-(2-羥基乙氧基)苯基)-4-(羥甲基)唑烷-2-酮或(4S,5S)-3-(2'-胺基-2-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-(4-(3-羥丙基)苯基)唑烷-2-酮。
如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-嗎啉-4-基-4'-三氟甲基-[4,5']聯嘧啶-6-基)-4-甲基-5-噻唑-2-基-唑烷-2-酮。
一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
一種組合，其包含治療有效量之如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種選自免疫刺激性化合物或消炎劑之治療活性輔劑。
如請求項1、2及10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用作藥劑。
如請求項1、2及10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療非黑色素瘤皮膚癌、非黑色素瘤皮膚癌之惡性病變前階段或由皮膚纖維母細胞調節異常所引起之其他增生性皮膚病症。
如請求項14之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該非黑色素瘤皮膚癌係鱗狀細胞癌，該非黑色素瘤皮膚癌之惡性病變前階段係光化性角化病，且該由皮膚纖維母細胞調節異常所引起之增生性皮膚病症係瘢痕瘤。
一種如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療非黑色素瘤皮膚癌、非黑色素瘤皮膚癌之惡性病變前階段或由皮膚纖維母細胞調節異常所引起之其他增生性皮膚病症的藥劑。
如請求項16之用途，其中該非黑色素瘤皮膚癌係鱗狀細胞癌，該非黑色素瘤皮膚癌之惡性病變前階段係光化性角化病，且該由皮膚纖維母細胞調節異常所引起之增生性皮膚病症係瘢痕瘤。