JP2018528236A - 真皮障害を治療または予防するための新規組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2015年9月24日に出願された米国仮特許出願第62/232,228号に基づく優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国立老化研究所(National Institute of Aging)/米国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された助成金番号AG039799の下で政府の支援によりなされたものである。米政府は本発明に一定の権利を有する。
皮膚の老化は、内因性の老化プロセス、紫外線への曝露などの、複数の要因によって引き起こされる、老化の過程の最も目立った特徴である。加齢に関連した(加齢性)真皮障害には、例えば、真皮萎縮、光線性角化症、偽瘢痕、黒子、真皮肥厚の病巣領域、および粗いシワが含まれる。
本発明は、一局面では、本発明の組成物および方法を用いて、加齢に関連した真皮障害、例えば、限定するものではないが、真皮萎縮、脂漏性角化症、光線性角化症、偽瘢痕、黒子、真皮肥厚の病巣領域、および粗いシワを治療または予防することができる、という予期せぬ発見に関する。特定の態様では、本発明の組成物および方法は、それを必要とする対象における真皮萎縮を治療または予防するのに有用である。他の態様では、本発明の組成物は、治療有効量の少なくとも1種のmTORC1阻害剤を含有する。さらに他の態様では、本発明の組成物は、mTORC1阻害剤を、加齢に関連した真皮障害に有効である唯一の成分として含有する。さらに他の態様では、mTORC1阻害剤はmTORC2阻害剤でもある。
本明細書で使用する場合、以下の用語の各々は、このセクションおいてその用語に関連した意味を有する。
本発明の組成物は、治療有効量のmTORC1阻害剤、またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを含む。特定の態様では、mTORC1阻害剤は、BEZ235、ラパマイシン、エベロリムス、AZD8055、テムシロリムス、KU-0063794、PI-103、トルキニブ、タクロリムス、リダフォロリムス、INK-128、ボクスタリシブ、Torin-1、オミパリシブ、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ、GSK1059615、WYE-354、ジェダトリシブ、AZD-2014、Torin-2、WYE-125132、BGT226、Palomid-529、PP121、WYE-687、CH5132799、Way-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、およびゾタロリムスからなる群より選択される少なくとも1種である。
一局面において、本発明は、哺乳類の線維芽細胞の寿命を延ばす方法を提供する。別の局面では、本発明は、哺乳類の線維芽細胞における細胞組織化を保存する方法を提供する。さらに別の局面では、本発明は、哺乳類の線維芽細胞の老化を予防するまたは最小限に抑える方法を提供する。さらに別の局面では、本発明は、哺乳類対象における、真皮萎縮、偽瘢痕、脂漏性または光線性角化症、黒子、真皮肥厚の病巣領域、および粗いシワを含む、加齢性の真皮障害を治療または予防する方法を提供する。
本発明の薬学的組成物中の活性成分、皮膚科学的に許容される担体、および任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の個性、サイズおよび状態に応じて変化する。一例として、該組成物は約0.001%〜約1%(w/w)のmTORC1阻害剤を含み得る。他の態様では、該組成物中のmTORC1阻害剤の重量による治療有効量は、約0.002%〜約0.75%、約0.005%〜約0.5%、約0.008%〜約0.25%、約0.01%〜約0.2%、約0.02%〜約0.15%、または約0.03%〜約0.1%の範囲である。
医薬品の局所投与に対する障害物は、表皮の角質層である。角質層は、タンパク質、コレステロール、スフィンゴ脂質、遊離脂肪酸および種々の他の脂質から構成される高度に抵抗性の層であり、角化細胞と生存細胞を含む。角質層を通る化合物の浸透速度(フラックス)を制限する要因の1つは、皮膚表面に負荷または適用することができる活性物質の量である。皮膚の単位面積あたりに適用される活性物質の量が多いほど、皮膚表面と皮膚の下層との間の濃度勾配が大きくなり、ひいては皮膚を通る活性物質の拡散力が大きくなる。したがって、より高濃度の活性物質を含有する製剤は、より低濃度の活性物質を含有し、他の全てのものが等しい製剤と比較して、より一貫した速度での、より多くの活性物質の皮膚への浸透をもたらす可能性が高い。
本発明の薬学的組成物の制御放出または持続放出製剤は、従来の技術を用いて製造することができる。いくつかの場合には、使用される剤形は、その剤形中の1種以上の活性成分の徐放または制御放出として提供され、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア、またはそれらの組み合わせを用いて、様々な割合で所望の放出特性をもたらすことができる。当業者に知られている適切な制御放出製剤は、本明細書に記載のものを含めて、本発明の薬学的組成物と共に使用するために容易に選択することができる。したがって、局所投与に適した単一ユニット剤形、例えば、制御放出に適しているリニメント剤、ローション剤、水中油型または油中水型エマルジョン、例えばクリーム剤、軟膏剤もしくはペースト剤、経皮パッチ剤、および溶液剤または懸濁液剤は、本発明に包含される。
特に明記しない限り、全ての細胞株、出発材料、試薬および細胞株は、商業的供給業者から入手し、さらなる操作なしで使用した。
NRTIを利用した細胞培養実験は、以下の設計の下に実施した。ヒト肺または心臓線維芽細胞の培養物を、これらの細胞の標準的な培養プロトコルに従って培養した(Cristofalo, et al., Journal of Tissue Culture Methods 1980, 6:117-121)。並列セットの培養物を、標準増殖培地または1nMのラパマイシンを添加した標準増殖培地中に維持した。NRTIへの曝露前に2週間、培養物を1nMのラパマイシン(Enzo Biologicals社)で維持した。細胞培養物を、個々の実験で示された濃度(一般的には10〜20μg/ml)のNRTIに7日間曝露し、4日目に新鮮なNRTIおよび培地に変えた。ミトコンドリア測定、バイオアナライザ測定、タンパク質発現とリン酸化状態についてのイムノブロッティング、および老化についてのアッセイは、この7日間の最後に実施した。
細胞タンパク質抽出物は、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich社)、ホスファターゼ阻害剤、NaFおよびオルトバナジン酸ナトリウムを含有する放射免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液で抽出することによって調製した。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(Pierce Biotechnology社)を用いてタンパク質濃度を定量した。ウェスタンブロット分析は、15〜30μgのタンパク質抽出物を用いて、SDS-PAGE上で泳動し、ニトロセルロース(Biorad社)膜上に移行させて行った。ブロットを、メーカーの指示に従って、以下の物質に特異的な抗体とインキュベートした:β-アクチン(Sigma-Aldrich社)、TFAm、パーキン、p16、ホスホ(S82)HSP27、HSP27 (Santa Cruz Biotechnologies社)、p53、p21、カタラーゼ、MDM2 (EMD Millipore社)、VDAC、ホスホ(S235/236)-リボソームタンパク質S6、リボソームタンパク質S6、ホスホ(S166)-MDM2、ホスホ(S473)-AKT、AKT、β-チューブリン(Cell Signaling社)、p62 (Enzo Biologicals社)、IL-6 (NeoBiolab社)、ラミンB1、PINK1、およびMitoprofile Total OXPHOS Cocktail (複合体I-NDUFB8サブユニット、CII-SDHBサブユニット、CIII-UQCRC2サブユニット、およびCIV-ミトコンドリアCOX1サブユニット)(Abcam社)。ウェスタンブロットは、LI-COR OdysseyでLI-COR Odysseyソフトウェアバージョン3.0 (LI-COR Biosciences社)を使用して、IRDye 680および800 LI-COR二次抗体により可視化した。共免疫沈降のために、細胞タンパク質抽出物を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するHNTG緩衝液中に調製し、BCAアッセイを用いて定量した。0.5mgの濃度のタンパク質抽出物をプロテインA/Gビーズ(Santa Cruz Biologicals社)で30分間予め清澄化した。2,000rpm、4℃で5分間遠心分離した後、上清をメーカー推奨濃度の一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。IgG抗体(Cell Signaling社)を非特異的対照として用いた。免疫複合体を100μlのプロテインA/Gビーズを用いて4℃で一晩沈降させた。ビーズに結合した免疫複合体を2000rpm、4℃で5分間遠心分離し、HNTG緩衝液を用いて3回洗浄した。2Xサンプル緩衝液を添加し、100℃で沸騰させた後、タンパク質サンプルをウェスタンブロッティングに使用した。
ミトコンドリア膜電位は、細胞を25nM TMRE (Molecular Probes社)とインキュベートすることによって検出した。ミトコンドリア質量は、細胞を100nMのMitotracker Green FM (Molecular Probes社)とインキュベートすることによって評価した。ミトコンドリアのスーパーオキシドアニオンレベルは、細胞を5μMのMitoSox Red (Molecular Probes社)とインキュベートすることによって検出した。ROSの総細胞レベルは、細胞を1%ウシ胎仔血清補充MEM中で10μMの2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート(DCF-DA; Sigma-Aldrich社)とインキュベートし、インキュベーション期間後にクレブス・リンゲルリン酸グルコース緩衝液(145mM NaCl, 5.7mM NaH2P04, 4.86mM KCl, 0.54mM CaCl2, 1.22mM MgS04および5.5mMグルコース)で2回洗浄して検出した。上記の評価のために、インキュベーションを5%CO2中37℃で30分間行い、血清含有培地を用いて2.5%トリプシン-EDTA中に細胞を採取した。細胞は、Guava Express Plusプログラム(Guava Technologies社)を利用したGuava EasyCyte Miniを用いて、直ちに分析した。
ミトコンドリアの機能は、Seahorse XF24バイオアナライザ(Seahorse Bioscience社)でXF細胞ミトストレス試験キットを用いて測定した。細胞を、XF24マイクロプレートにウェルあたり15,000個の密度で播種した。取得後、該当する場合は、Guava EasyCyte Mini (Millipore社)を用いて計数した106個の細胞に基づいて、結果を正規化した。オリゴマイシン、カルボニルシアニドp-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)、およびロテノン/アンチマイシンAを含有するセンサーカートリッジが最初から組み込まれている該バイオアナライザにプレートを入れた。オリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/アンチマイシンAの逐次添加の前と後に、酸素消費を3つ組で測定した。呼吸速度およびプロトンリークは、公表された方法(Hill, et al., Biological chemistry 2012, 393: 1485-1512)に概説される通りに評価した。ミトコンドリア呼吸は、少なくとも4つ組で播種した細胞からの酸素消費速度の3つ組での測定値に基づいて算出した。基礎呼吸は初期の酸素消費速度測定値を表し、最大呼吸はFCCP添加後の酸素消費速度測定値を表す。ATP関連呼吸は、基礎酸素消費速度に対するオリゴマイシン感受性酸素変化として表される。プロトンリークは、オリゴマイシン非感受性酸素消費速度を表す。ロテノン/アンチマイシンA非感受性酸素消費速度測定値に対して正規化することにより、酸素消費の非ミトコンドリア源を差し引いた。全てのデータは、ミトコンドリア評価の完了時に各ウェルの細胞を計数することにより、細胞数に対して正規化した。
SA-β-gal活性の評価は、高密度培養で起こることが知られている偽陽性染色を防ぐために、低密度(0.5×104/cm2)でそれぞれの処理後に細胞のプレーティングを行って実施した。NRTIで1週間処理した後にSA-β-gal染色のために播種を行い、播種の24時間後に染色を行った。細胞をPBSで洗浄し、2%ホルムアルデヒド-0.2%グルタルアルデヒドで室温にて5分間固定し、PBSでもう1回洗浄して、50mg/ml X-gal、100mMフェリシアン化カリウム、100mMフェロシアン化カリウム、5M NaCl、1M MgCl2、および0.2Mクエン酸/リン酸緩衝液(pH6.0)を含有する染色溶液中で37℃にて一晩インキュベートした。インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、少なくとも500個の細胞を各サンプルについて3つ組でカウントした。陽性細胞(青色細胞)を総細胞数に占める割合として表した。
細胞を、指定された処理の後、酸洗浄したカバースリップ上に標準密度で播種した。24時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.1%Triton-PBSを用いて透過処理し、適切な動物血清でブロックした。ミトコンドリアを視覚化するためにシトクロムC抗体(EMD Millipore社)を用いて免疫蛍光を行い、FRAP抗体(Santa Cruz社)で共染色した。ミトコンドリアはまた、ミトコンドリアタグ付けされたGFP (mitochondrialtagged GFP)のレンチウイルス形質導入(Vector Core、ピッツバーグ大学)を用いて視覚化し、ピューロマイシンを用いて選択した。適切な実験的処理に続いて、Raptor抗体(Bethyl Laboratories社)を用いてミトコンドリア発現細胞で免疫蛍光を行った。一次抗体インキュベーション後、Alexa-Flour二次抗体(LICOR Biosciences社)および核染色剤としてのDAPI (10ng/ml)を用いて染色を行い、VectaShield封入剤(Fisher Scientific社)で保存した。細胞は、共局在化事象の定量のために、デコンボリューションまたは共焦点顕微鏡法を用いて画像化した。
結果は少なくとも3つの独立した実験を代表しており、対応のない両側スチューデントt検定を用いて統計的有意性を判定した。データの正規分布を検証するために、データセットを正規性検定にかけた。Bonferroni post-hoc分析を用いた一元配置分散分析は、必要に応じて、対照、NRTI、ラパマイシン、およびラパマイシンNRTIを含む多重比較群で実施した。
本発明の例示的かつ非限定的なエマルジョン製剤(以下、「製剤R」と呼ぶ)は、約0.001%〜約1%(w/w)のラパマイシン、約4〜6%のパルミテート、約6〜8%のグリセリン、および残部の水を含む。
本発明の組成物を投与するために、真皮萎縮、脂漏性角化症、光線性角化症、黒子、老人性偽瘢痕、または粗いシワの診断がついた来院患者を選択した。真皮の厚みは、0.001mmまでの認定精度を有するMitoutoyoデジタルキャリパーを用いて測定した。病変(光線性角化症、偽瘢痕、粗いシワ)は、重症度についての検査者評価格付けスケールを利用して評価した。最初の2週間1日1〜2回投与に関する指示と共に、製剤Rを患者に提供した。適用領域に有害反応の兆候があった場合には、製剤Rの適用を中止するように患者に忠告した。2週間の適用期間の後、真皮の厚みおよび病変の重症度を週1回の頻度で検査した。
TDFとFTC(単純化のためにNRTIと呼ぶ)による併用療法の影響を、抗レトロウィルス療法を受けている患者での血清レベルに関係した濃度で、ヒト心臓線維芽細胞とヒト肺線維芽細胞の両方におけるミトコンドリアについて調べた。並列培養物を、1nMのラパマイシンのさらなる存在下で増殖させた。ラパマイシンのこの濃度は、ヒト線維芽細胞の複製寿命を延ばし、かつミトコンドリアのプロファイルを改善することが判明した。NRTIへの7日間の曝露は、ヒト心臓線維芽細胞におけるミトコンドリア膜電位、ミトコンドリアROS生成、およびミトコンドリア質量の有意な増加をもたらした(図1A〜1C)。同様の結果がヒト肺線維芽細胞でも観察された。さらに、総細胞ROSは、両方の線維芽細胞集団においてNRTIへの曝露後に有意に増加した(図1D)。ラパマイシンの存在下で増殖させた培養物は、NRTIへの曝露後に、ミトコンドリア膜電位、ミトコンドリアROS、または総細胞ROSの同レベルの増加を示さなかった。
電子伝達系タンパク質のサブセットの定常状態レベルに対するNRTI曝露の影響を調べた。複合体IのNADHデヒドロゲナーゼ(ユビキノン)1βサブ複合体8 (NDUFB8)、複合体IIのコハク酸デヒドロゲナーゼ(ユビキノン)鉄硫黄サブユニット(SDHB)、複合体IIIのユビキノール-シトクロムcレダクターゼコアタンパク質II (UQCRC2)、および複合体IVのシトクロムcオキシダーゼサブユニットI (mt-CO1)のレベルは全て、NRTIへの曝露後に増加した(図2A)。同様に、外膜電位依存性チャネル(VDAC)の定常状態レベルはNRTIに曝露した細胞において増加したのに対して、ATPシンターゼαサブユニット1 (ATP5A)の定常状態レベルは変化しなかった(図2A)。
老化プログラムの分子マーカーをNRTIへの曝露後に調べた(図3A〜3F)。p53、p21およびp16のレベルはNRTIに曝露した線維芽細胞において増加したが、ラパマイシン処理細胞では、これらの老化関連タンパク質のレベルは増加しなかった(図3A)。さらに、老化に伴って減少することが知られているラミンB1のレベルは、NRTIに曝露した細胞において低下した。ラパマイシンはこの低下を防止した(図3A)。さらに、老化関連分泌プログラムの成分であるIL-6の細胞内レベルは、NRTIへの曝露後に上昇した。老化プログラムの阻止と一致して、ラパマイシン処理細胞は、NRTIへの曝露後のIL-6のレベル上昇を示さなかった(図3A)。NRTIに曝露した後、老化マーカーである老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)を発現する細胞集団の割合を調べた。SA-β-galを発現する心臓線維芽細胞の割合の用量依存的増加が観察された(対照細胞では9%であったのに対して、10または20μg/mlのNRTIに曝露した細胞では、それぞれ28%および48%であった;図3B)。対照的に、ラパマイシン処理培養物はSA-β-galの増加を示さなかった(図3B)。ナノストリングによるp21およびラミンB1のmRNAレベルの解析は、定常状態mRNAレベルがタンパク質レベルと並行して変化することを明らかにし、NRTIに応答してp21 mRNAは有意に増加したが、ラミンB1 mRNAレベルは有意に減少した(図3C〜3D);これは、複製老化の過程でのp21およびラミンB1の発現への影響と似ていた(図3E〜3F)。
p70S6Kによって媒介されるMDM2リン酸化はNRTIに対する細胞応答の構成要素である、という可能性について検討した。NRTIへの曝露は、p70S6K活性(リボソームS6タンパク質のリン酸化状態を調べることによる)とMDM2のリン酸化状態の両方を増加させることがまず確認された。リボソームS6タンパク質とMDM2の両方のリン酸化は、NRTIへの曝露後の心臓線維芽細胞において増加した(図5A)。老化の阻害と一致して、ラパマイシン処理培養物は、リボソームS6リン酸化の完全な欠如を示し、かつMDM2リン酸化の増加を示さなかった(図5A)。この設定でのMDM2リン酸化におけるp70S6Kの役割を、特異的p70S6K阻害剤PF-4708671を用いて調べた。NRTIに応答したMDM2のリン酸化はPF-4708671によって阻害され、該阻害剤の陽性対照としたリボソームS6タンパク質のリン酸化も同様であった(図5B)。
細胞をNRTIに曝露したときにmTORC1複合体とミトコンドリアとの会合が増強される可能性について、ミトコンドリア標的化配列に融合した緑色蛍光タンパク質(mt-GFP)を発現するヒト心臓線維芽細胞を用いて調べた。これらの細胞をNRTIに曝露し、mTORC1特異的構成因子Raptorを認識する抗体を用いる免疫蛍光のために固定した。NRTIに曝露した細胞では、Raptorが未処理の細胞よりも過度にミトコンドリアと会合していた(図8A〜8C)。
単一施設非盲検試験を行った。手に真皮萎縮および光線性角化症の領域がある患者への製剤Rの適用を評価した。同様の真皮厚みを有するが光線性角化症のない反対側の手を対照として使用した。患者に製剤Rを提供して、1日2回の適用を指示した。
Claims (20)
- それを必要とする哺乳類対象における加齢性真皮障害を治療または予防する方法であって、該対象に、治療有効量のmTORC1阻害剤またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを含む組成物を局所投与する工程を含んでなり、加齢性真皮障害が、真皮萎縮、脂漏性または光線性角化症、偽瘢痕、黒子、真皮肥厚の病巣領域、および粗いシワからなる群より選択される少なくとも1つである、方法。
- mTORC1阻害剤が、BEZ235、ラパマイシン、エベロリムス、AZD8055、テムシロリムス、KU-0063794、PI-103、トルキニブ(Torkinib)、タクロリムス、リダフォロリムス、INK-128、ボクスタリシブ(Voxtalisib)、Torin-1、オミパリシブ、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ、GSK1059615、WYE-354、ジェダトリシブ、AZD-2014、Torin-2、WYE-125132、BGT226、Palomid-529、PP121、WYE-687、CH5132799、Way-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、およびゾタロリムス、またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- mTORC1阻害剤が、ラパマイシン、リダフォロリムス、およびエベロリムス、またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- mTORC1阻害剤が、ラパマイシンまたはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が約0.001〜1重量%のmTORC1阻害剤またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを含む、請求項1に記載の方法。
- mTORC1阻害剤が、ラパマイシンまたはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーである、請求項6に記載の方法。
- 前記組成物が、皮膚科学的に許容される担体をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 皮膚科学的に許容される担体が、溶媒、潤滑剤、皮膚軟化剤、乳化剤、保湿剤、増粘ワックス、柔軟剤、香料、防腐剤、および人工着色料からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項8に記載の方法。
- 皮膚科学的に許容される担体がペトロラタムを含む、請求項8に記載の方法。
- 哺乳類の線維芽細胞の寿命を延ばす方法であって、該線維芽細胞に、有効量のmTORC1阻害剤またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを含む組成物を接触させる工程を含んでなる、方法。
- 哺乳類の線維芽細胞の細胞組織化を保存する方法であって、該線維芽細胞に、有効量のmTORC1阻害剤またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを含む組成物を接触させる工程を含んでなる、方法。
- 哺乳類の線維芽細胞の老化を予防するかまたは最小限に抑える方法であって、該線維芽細胞に、有効量のmTORC1阻害剤またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを含む組成物を接触させる工程を含んでなる、方法。
- mTORC1阻害剤が、BEZ235、ラパマイシン、エベロリムス、AZD8055、テムシロリムス、KU-0063794、PI-103、トルキニブ、タクロリムス、リダフォロリムス、INK-128、ボクスタリシブ、Torin-1、オミパリシブ、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ、GSK1059615、WYE-354、ジェダトリシブ、AZD-2014、Torin-2、WYE-125132、BGT226、Palomid-529、PP121、WYE-687、CH5132799、Way-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、およびゾタロリムス、またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- mTORC1阻害剤が、ラパマイシンまたはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が真皮の線維芽細胞である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 真皮の線維芽細胞が、インビボかつ哺乳類対象の皮膚の一部である、請求項16に記載の方法。
- 前記組成物が前記対象の皮膚に局所的に適用される、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- それを必要とする哺乳類対象における加齢性真皮障害を治療または予防するためのキットであって、治療有効量のmTORC1阻害剤またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを含有する組成物、アプリケータ、および該対象に該組成物を局所投与するための説明書を含んでなり、該真皮障害が真皮萎縮、偽瘢痕、脂漏性または光線性角化症、黒子、真皮肥厚の病巣領域、および粗いシワからなる群より選択される少なくとも1つである、キット。
- mTORC1阻害剤が、ラパマイシンまたはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーである、請求項19に記載のキット。
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