JPWO2020091070A1

JPWO2020091070A1 - オルタナティブオートファジー誘導剤を含む紫外線起因性炎症抑制剤

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Publication number: JPWO2020091070A1
Application number: JP2020554992A
Authority: JP
Inventors: 長谷川　達也; 達也長谷川; 優哉中島; 雅史宮井; 重臣清水; 真也本田
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2021-09-30
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Abstract

紫外線起因性炎症の抑制剤を提供することを課題とする。オルタナティブオートファジー（Ａｔｇ５/Ａｔｇ７非依存的オートファジー）が、紫外線起因性炎症の抑制に関与することを見出したことに基づいており、オルタナティブオートファジー誘導剤を提供することにより課題が解決される。

Description

本発明は、オルタナティブオートファジーを誘導する薬剤を有効成分として含む紫外線起因性炎症の抑制剤に関する。また、本発明はオルタナティブオートファジー誘導剤、及びオルタナティブオートファジー活性を指標とした、紫外線起因性炎症抑制剤のスクリーニング方法、及びヒト皮膚における紫外線起因性炎症に対する抵抗性の評価方法にも関する。

細胞における細胞質成分（オルガネラ、細胞質タンパク質等）の分解・再生機構には、選択的なタンパク質分解を担うユビキチン・プロテアソーム系と、原則として非選択的でバルク分解系と称されるオートファジーによる機構が存在する。オートファジーは自食作用とも呼ばれ、二重膜（隔離膜）によって分解に供する細胞質成分を取り囲み、次いで隔離膜を閉鎖した上でリソソームと融合することにより、内容物である細胞質成分を分解することができる。オートファジーは、正常時の細胞の新陳代謝に寄与している他、ある種のストレスに晒された場合に細胞質内に過剰に作られたタンパク質や異常タンパク質を分解することに寄与しており、様々な生理機能を有することが判明している。例えば、オートファジーが関連するとされる疾患としては、癌、神経障害疾患（筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等）、肝炎（急性肝炎、慢性肝炎）、肝硬変、感染症、免疫異常等などが報告されており、オートファジー機能を調節することによりかかる疾患に対する治療効果を期待した医薬品、例えば、抗癌剤、抗痴呆薬及び神経変性疾患治療薬等の開発が進められている。

オートファジーの分子機構についての研究が進むことで、３０余りのオートファジーに関する分子が同定されており、これらの分子の中で、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７、ＬＣ３等がオートファジーの実行に必須と考えられてきた。ＬＣ３は、細胞質で合成された後にＡｔｇ７等によりプロセッシングを受け、Ａｔｇ５等により構成される複合体を介して隔離膜に結合すると考えられている。しかしながら、近年の研究により、これらの分子を必要としないオートファジーの存在が報告されており（非特許文献１）、このようなオートファジーを、慣用型のＡｔｇ５／Ａｔｇ７依存的のオートファジー（単にＡｔｇ５依存的オートファジーと呼ぶこともある）と区別してオルタナティブオートファジー又はＡｔｇ５／Ａｔｇ７非依存的オートファジーと呼ばれている。オルタナティブオートファジーは、慣用型のＡｔｇ５／Ａｔｇ７依存的のオートファジーに関連するＵｌｋ１及びＢｅｃｌｉｎ１に加えて、オルタナティブオートファジーにのみ関与するＲａｂ９により制御される。オルタナティブオートファジーは細胞ストレスによって誘導されることから、この機構が破綻すると、癌などを誘発すると考えられており、オルタナティブオートファジーを利用する抗癌剤が開発されている（特許文献１）。また、Ａｔｇ５依存的オートファジー経路に関わるＡｔｇ５をノックアウトしたマウスを用いた研究により、Ａｔｇ５依存的オートファジー経路が、炎症疾患の一つであるアテローム動脈硬化症の発症を改善することが示されている。一方で、Ｂｅｃｌｉｎ１をヘテロ接合体欠損させた場合にはアテローム性動脈硬化症の発症に変化しないが、Ａｔｇ５のノックアウトでは炎症が促進されたことが報告されている（非特許文献２）。また、慣用型のオートファジーが、ケラチノサイトの炎症を抑制することが報告されている（非特許文献４）。非特許文献４では、Ａｔｇ５をノックダウンされたケラチノサイトにおいて、ＭＡＬＰ−２により炎症を誘導した場合に、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α及びＩＬ−６が対照（Ａｔｇ５非ノックダウン）に比較して大幅に増大したことを示している。このように、慣用型のオートファジーであるＡｔｇ５依存的オートファジーと炎症との関わりは一部明らかになってきているが、オルタナティブオートファジーと、炎症との関連については未だ明らかにされていなかった。

一方で、紫外線は、紫外域の波長を有する電磁波であり、約３２０ｎｍより長い長波長域紫外線（ＵＶ−Ａ）と、約３２０〜約２８０ｎｍの中波長域紫外線（ＵＶ−Ｂ）と、約２８０ｎｍより短い短波長域紫外線（ＵＶ−Ｃ）とに分類される。このうちＵＶ−Ｃはオゾン層に吸収されるので地上に達する太陽光には通常含まれず、地上に到達する紫外線の約９５％をＵＶ−Ａが占めており、約５％をＵＶ−Ｂが占めている。紫外線は、生体に対し、メラニン色素の産生、ＤＮＡの損傷、コラーゲンやエラスチンなどの真皮層における弾性線維の変性、活性酸素の産生など様々な悪影響を及ぼすことが知られており、美容面では、シミ、シワ、たるみ、肌の褐色化、皮膚老化など様々な悪影響を及ぼすことは周知である。紫外線障害は、主に急性障害と慢性障害に分けることができ、急性障害としては、日焼け（サンバーン、サンタン）、紫外線角膜炎、免疫機能の低下などが挙げられ、慢性障害としてシワ、シミ、皮膚癌、白内障などが挙げられる。紫外線により生じる炎症が、こうした急性障害や慢性障害の原因の一つとなっており、紫外線に起因する炎症を抑制することが、紫外線障害の予防及び治療に重要となっている。紫外線に起因する炎症メカニズムを解明することが求められており、そのようにして解明された紫外線に起因する炎症メカニズムに沿って炎症を抑制する物質の探索する方法が望まれている。

上述したように、オルタナティブオートファジーは、近年新たに発見されたオートファジー経路であり、その生理機構への影響や、疾患への関与について研究が行われているところであるが、未だ十分な知見は得られていない。特に紫外線起因性の炎症との関連性は全く明らかにされていない。

国際公開第２０１３／１１８８４２号

Yuya Nishida, et al., Nature 461, 654-658 Babak Razani et al., Cell Metabolism 2012, 15(4), 534-544 Shaun Steele et al., PLOS Pathog 2013, vol.9, Issue 8, e1003562 Hye-Mi Lee et al., The Journal of Immunology (2011) 186(2), 1248-58

本発明は従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、紫外線起因性炎症メカニズムの一端を解明すると共に、その紫外線起因性炎症の抑制剤を提供することを目的としている。

本発明者らが、皮膚炎症メカニズムについて鋭意研究を行った結果、皮膚炎症の一因である紫外線により生じる炎症の軽減にＡｔｇ５／Ａｔｇ７非依存的オートファジーが選択的に寄与していることを初めて見出した。具体的に、皮膚培養細胞において、オートファジーを誘導することにより、紫外線により生じる皮膚炎症を軽減することができたことを見出した。この紫外線起因性の炎症とオートファジーとの関係についてさらに研究を進めたところ、オートファジーの代表的経路であるＡｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジーではなく、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７非依存的オートファジーによって、紫外線により生じる皮膚炎症を軽減できることを突き止め、本発明に至った。したがって、本発明は以下の発明に関する。

［１］オルタナティブオートファジー誘導剤を有効成分とする紫外線起因性炎症の抑制剤。
［２］前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目１に記載の抑制剤。
［３］前記抑制剤が、皮膚外用剤である、項目２に記載の抑制剤。
［４］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１である項目１〜３のいずれか一項に記載の抑制剤。
［５］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、項目１〜３のいずれか一項に記載の抑制剤。
［６］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキスである、項目５に記載の抑制剤。
［７］オルタナティブオートファジー活性を指標とした紫外線起因性炎症の抑制剤のスクリーニング方法。
［８］オルタナティブオートファジー活性が、Ｒａｂ９の遺伝子発現量又はタンパク質量により測定される項目７に記載のスクリーニング方法。
［９］慣用型オートファジー因子非発現株において、オートファジー活性を測定することによる、項目７に記載のスクリーニング方法。
［１０］オートファジー活性の測定が、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、及びＲａｂ９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される項目９に記載の評価方法。
［１１］オートファジー活性の測定が、オートファジー小胞の検出による、項目９に記載のスクリーニング方法。
［１２］皮膚におけるオルタナティブオートファジー活性を指標とした、紫外線障害に対する抵抗性の評価方法。
［１３］オルタナティブオートファジー活性が、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、及びＲａｂ９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される項目１２に記載の評価方法。
［１４］オルタナティブオートファジー活性が、Ｒａｂ９の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される項目１３に記載の評価方法。
［１５］前記紫外線障害が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目１２〜１４のいずれか一項に記載の評価方法。
［１６］オルタナティブオートファジー誘導剤の有効量を、紫外線起因性炎症を必要とする対象に投与することを含む、紫外線起因性炎症の抑制又は治療方法。
［１７］前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目１６に記載の方法。
［１８］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が経皮投与される、項目１７に記載の方法。
［１９］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１である項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
［２０］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
［２１］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキスである、項目２０に記載の方法。
［２２］紫外線起因性炎症の抑制又は治療において使用するための、オルタナティブオートファジー誘導剤。
［２３］前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目２２に記載のオルタナティブオートファジー誘導剤。
［２４］皮膚外用で使用される、項目２３に記載のオルタナティブオートファジー誘導剤。
［２５］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１である、項目２２〜２４のいずれか一項に記載のオルタナティブオートファジー誘導剤。
［２６］前記オルタナティブオートファジーが、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、項目２２〜２４のいずれか一項に記載のオルタナティブオートファジー誘導剤。
［２７］オルタナティブオートファジーを誘導することを介して、紫外線起因性炎症の抑制又は治療において使用するための、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１のエキス。
［２８］オルタナティブオートファジーを選択的に誘導することを介して、紫外線起因性炎症の抑制又は治療において使用するための、エンメイソウエキス。
［２９］紫外線起因性炎症の治療又は抑制剤の製造のための、オルタナティブオートファジー誘導剤の使用。
［３０］前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目２９に記載の使用。
［３１］前記抑制剤が、皮膚外用剤である、項目３０に記載の使用。
［３２］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１を含む、項目２９〜３１のいずれか一項に記載の使用。
［３３］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、項目２９〜３１のいずれか一項に記載の使用。
［３４］前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキスである、項目３３に記載の使用。

オートファジーの中で、特にオルタナティブオートファジーを誘導することで、紫外線起因性炎症を抑制することが可能となる。紫外線起因性炎症は、急性障害や慢性障害の原因の一つであり、紫外線起因性炎症を軽減することで、紫外線障害の軽減につながる。また、紫外線起因性炎症の軽減にオルタナティブオートファジーが関与することから、オルタナティブオートファジー活性を指標とすることで、紫外線起因性炎症の抑制剤のスクリーニングや、紫外線起因性炎症に対する抵抗性を評価することも可能になる。

図１Ａは、オートファジー阻害剤である３−ＭＡの添加により、紫外線誘導性のＩＬ−１β産生が増加することを示すグラフである。図１Ｂは、オートファジー誘導剤であるラパマイシンの添加により、紫外線誘導性のＩＬ−１β産生が抑制されることを示すグラフである。図２Ａは、Ａｔｇ５に対するｓｉＲＮＡを細胞に導入することにより、Ａｔｇ５の発現が抑制されたことを示すグラフである。図２Ｂは、Ａｔｇ７に対するｓｉＲＮＡを細胞に導入することにより、Ａｔｇ７の発現が抑制されたことを示すグラフである。図２Ｃは、Ｂｅｃｌｉｎ１に対するｓｉＲＮＡを細胞に導入することにより、Ｂｅｃｌｉｎ１の発現が抑制されたことを示すグラフである。図３Ａは、Ａｔｇ５に対するｓｉＲＮＡが導入された細胞において、紫外線誘導性のＩＬ−１β産生が変化しなかったことを示すグラフである。図３Ｂは、Ａｔｇ７に対するｓｉＲＮＡが導入された細胞において、紫外線誘導性のＩＬ−１β産生が変化しなかったことを示すグラフである。図３Ｃは、Ｂｅｃｌｉｎ１に対するｓｉＲＮＡが導入された細胞において、紫外線誘導性のＩＬ−１β産生が有意に増加したことを示すグラフである。

本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤は、オルタナティブオートファジー誘導剤を含む。本発明において抑制される炎症は、紫外線により引き起こされる炎症であり、より好ましくは、紫外線起因性皮膚炎症である。

炎症は、発赤、熱感、腫脹、及び疼痛を特徴とする症候であり、微生物感染、異物侵入、重金属暴露、紫外線照射などの外的侵襲により引き起こされる他に、壊死細胞などから放出される内的刺激物質によっても引き起こされる。炎症は、生体のあらゆる組織において生じうる症候であり、組織に応じて、その原因や炎症機序は異なる。特に皮膚組織は、生体の外部に露出しており、外界と生体の境界をなすバリアとして働いている。皮膚のバリア機能が低下すると、様々な外的侵襲により経皮感作を招くことになり、それが皮膚炎やアレルギー疾患などの皮膚炎症の原因となることが分かってきている。皮膚バリアの形成には、角化細胞に発現しているフィラグリンが重要な役割を担っていることが知られている。フィラグリンの変異が炎症性疾患の一つであるアトピー性皮膚炎の発症にも関わっていることが報告されている。このように、皮膚炎症は、生体内における組織における炎症とは異なる特徴的なメカニズムを有している。本発明者らは、本発明のオルタナティブオートファジー経路が、炎症のなかでも特に紫外線起因性炎症において、抑制的に働くことを見出した（実施例、図１及び３）。その一方で、本発明者らは、組織炎症に寄与していると従来言われていたＡｔｇ５依存的オートファジー経路が紫外線起因性炎症には関与していないことも見出した（実施例、図３）。非特許文献４において、ＭＡＬＰ−２により誘導された皮膚炎症に対し、Ａｔｇ５依存的オートファジーが抑制的に作用することが示されていることから、紫外線起因性炎症においてＡｔｇ５依存的オートファジー経路が関与していないことは予測しうるものではない。皮膚炎症と、紫外線起因性炎症とは、最終的に炎症性サイトカインの産生を伴っているという点では共通するものの、その発生メカニズムが異なることは周知のことである。皮膚炎症と、紫外線起因性炎症とが、制御メカニズムについても異なっていることが本発明者らの実験により初めて示唆された。

本発明において紫外線は、ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂ、及びＵＶ−Ｃのいずれを指してもよいが、地上に到達して皮膚に対して炎症を起こさせる観点から、特にＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂを指すことが好ましい。ＵＶ−ＡもＵＶ−Ｂも炎症を引き起こすことが知られているが、炎症への寄与が高いＵＶ−Ｂのみを指してもよい。

紫外線により引き起こされる炎症による症状としては、紅斑や水疱が挙げられ、重症化した場合には、湿疹を生じさせることがある。湿疹は、急性期に紅斑、丘疹、小水疱、膿疱、びらん、痂皮、落屑という形態的変化をとり、治癒するものの、急性湿疹が治癒せずに慢性化すると、苔癬化が生じ色素沈着が起こることもある。紫外線により引き起こされる炎症に起因する皮膚疾患としては、日光皮膚炎、光線口唇炎、光接触皮膚炎、慢性光線過敏性皮膚炎、ベルロック皮膚炎、光線過敏症、光線過敏性薬疹、日光蕁麻疹、色素性乾皮症、皮膚筋炎、ポルフィリン症、ペラグラ、慢性光線皮膚症、多形日光疹、エリテマトーデスなどの疾患が引き起こされる。また、紫外線は、目にも炎症を引き起こし、紫外線角膜炎が生じ、このような炎症に起因して、白内障も生じうる。したがって、本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤は、炎症に起因する上記の皮膚疾患及び眼疾患の治療、軽減、抑制、及び予防することができ、これらの皮膚疾患及び眼疾患の治療剤、軽減剤、抑制剤及び予防剤ということもできる。また、皮膚に生じた炎症は、メラノサイト刺激ホルモンの分泌を促進し、それにより皮膚の褐色化やシミの形成にも関与することや、慢性炎症により老化を助長することが知られている。したがって、本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤は、日焼け抑制剤、美白剤、皮膚老化剤ということもできる。

本発明の紫外線起因性炎症抑制剤を使用する対象は、紫外線起因性炎症の低減を必要とする対象である。通常の健常人をはじめ、屋外で活動する運動選手や作業員、美容上又は健康上日焼けを避けることが必要とされる人、並びに上述の紫外線障害に伴う疾患を患っている患者に対し、本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤を投与することができる。また、オルタナティブオートファジー誘導剤は、オルタナティブオートファジー活性が低下している対象に対して投与される。

本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤は、紫外線照射によりケラチノサイトにて分泌が高まるＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＳＬＰ、ＧＭ−ＣＳＦなどから選ばれる１又は複数の炎症性サイトカインや、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１０などのケモカインやＰＧＥ_２などの炎症性メディエーターの産生を抑制することができる。したがって、紫外線起因性炎症の抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤は、炎症性サイトカイン抑制剤又は炎症性メディエーター抑制剤ということもできる。

オルタナティブオートファジーとは、オートファジー関連分子Ａｔｇ５を用いることなく、オートファゴソームが形成され、さらにリソソームが融合することにより、該オートファゴソームに取り込まれた細胞内成分が分解される、細胞内浄化機構を意味する。したがって、オルタナティブオートファジーは、Ａｔｇ５及び／又はＡｔｇ７非依存的オートファジーということもできる。理論に限定されることを意図するものではないが、紫外線の影響で変性された異常タンパク質や誘発された炎症誘発物質をオルタナティブオートファジーの作用により分解することで、炎症の原因を取り除くものと考えられる。本明細書において、オルタナティブオートファジーと区別する観点から、従来型のオートファジー、すなわちＡｔｇ５及び／又はＡｔｇ７依存的オートファジーを、慣用型オートファジーと呼ぶものとする。

オルタナティブオートファジー誘導剤とは、オルタナティブオートファジーの活性を亢進できる物質であれば任意の物質であってもよい。オルタナティブオートファジーを選択的に亢進できる物質が好ましいが、非選択的に他のオートファジーをも亢進する物質であってもよい。したがって、オルタナティブオートファジー誘導剤は、慣用型オートファジー誘導剤を含んでもよいし、別の態様では慣用型オートファジーの誘導剤を除いてもよい。オルタナティブオートファジー以外のオートファジー（例えば慣用型オートファジー）と、オルタナティブオートファジーをともに誘導可能な誘導剤をオルタナティブオートファジー非選択的誘導剤とよび、オルタナティブオートファジーを主に誘導する誘導剤をオルタナティブオートファジー選択的誘導剤とよぶことができる。オルタナティブオートファジー選択的誘導剤としては、特許文献１で示されるベンゾチオフェン化合物や、非特許文献３で示された野兎病菌（Francisella tularensis）が挙げられる。また、本発明のスクリーニング方法により、エンメイソウエキスも、オルタナティブオートファジー選択的誘導剤として作用する物質であることが示された。オルタナティブオートファジーの非選択的誘導剤としては、ラパマイシン、ベラパミル、クロニジンなどが挙げられる。本発明のスクリーニング方法により、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、ユキノシタエキスが、オルタナティブオートファジー非選択的誘導剤として作用する物質であることが示された。しかしながら、オートファジー誘導剤は、これらの具体的化合物や菌、エキスに限定されることを意図するものではない。

本発明のオルタナティブオートファジー誘導剤又は当該誘導剤を含む紫外線起因性炎症の抑制剤は、紫外線起因性炎症を軽減する目的で、有効成分として機能性表示食品、化粧品や医薬品に配合することができる。配合される化粧品としては、日焼け止め、化粧水、美容液、美容クリーム、アフターケアローション、サンオイルなどが挙げられるが、皮膚に適用されるものであれば任意の化粧料に配合することができる。医薬品としては、抗炎症用の皮膚外用剤、抗炎症用の経口薬剤などが挙げられる。また、オルタナティブオートファジー誘導剤が、紫外線起因性炎症に有効であることを見出したことから、皮膚に直接適用することができる皮膚外用剤として配合されることが好ましい。また、オルタナティブオートファジー誘導剤を、紫外線障害軽減抑制の目的で使用する観点では、白内障などの予防のため点眼薬に配合することもできる。オルタナティブオートファジー誘導剤又は当該誘導剤を含む皮膚炎症の抑制剤は、その効果を損なわない範囲で、化粧品や医薬品等に用いられる任意配合成分を、必要に応じて適宜配合することができる。前記任意配合成分としては、例えば、油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤などが挙げられる。他の薬効成分として、例えば抗炎症成分、美白成分などが含まれていても良い。

本発明はまた、オルタナティブオートファジー活性を指標とした紫外線起因性炎症抑制剤のスクリーニング方法にも関する。このスクリーニング方法は、培養細胞に対し、候補薬剤を添加する工程と、培養細胞においてオルタナティブオートファジー活性を測定する工程を含む。対照と比較してオルタナティブオートファジー活性が増加していた場合、候補薬剤を、紫外線起因性炎症抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤として選択することができる。使用される候補薬剤は、任意の物質であってよいが、例えば医薬品候補化合物ライブラリーや化粧品素材ライブラリーの物質を用いることができ、化合物のみならず、混合物や抽出物などを用いることもできる。

使用される培養細胞としては、任意の細胞を用いることができ、株化細胞や、組織から分離され培養された初代培養細胞、継代培養細胞が用いられてもよい。紫外線の影響を評価する観点から、生体において紫外線の影響を受ける細胞、例えば皮膚細胞や眼細胞を用いることができる。皮膚細胞としては、例えば角化細胞、色素細胞や真皮線維芽細胞などであってもよいし、眼細胞としては、例えば角膜上皮細胞や網膜上皮細胞などであってもよい。また、皮膚培養細胞を重層培養した３次元培養皮膚モデルを用いることもできる。さらに別の態様では、スクリーニング方法に用いられる培養細胞として、慣用型オートファジー因子の少なくとも１つを発現しない、慣用型オートファジー因子非発現株を用いることができる。このような細胞株は、ポイントミューテーション、相同組換え、Ｃｒｙｓｐｅｒ−Ｃａｓ９システムなどのゲノム編集により作成された遺伝子ノックアウト細胞株であってもよいし、ｓｉＲＮＡを導入することで、遺伝子発現を抑制されたノックダウン細胞株であってもよい。慣用型オートファジー因子非発現株を用いることで、オルタナティブオートファジーに特異的ではなく、慣用型オートファジーも検出する指標を用いた場合にも、オルタナティブオートファジーの活性誘導剤をスクリーニングすることができる。一例として、Ｂｅｃｌｉｎ１やＵｌｋ１は、オルタナティブオートファジーと慣用型オートファジーの両方に関与することから、慣用型オートファジー因子非発現株においてこれらの遺伝子発現量又はタンパク質量をオートファジー活性の指標とすることで、オルタナティブオートファジーを誘導する薬剤のスクリーニングが可能になる。慣用型オートファジー因子非発現株としては、一例としてＡｔｇ５及び／又はＡｔｇ７遺伝子ノックアウト株、Ａｔｇ５及び／又はＡｔｇ７遺伝子ノックダウン株などが挙げられる。遺伝子発現量又はタンパク質量を指標とする代わりに、細胞内に存在するオートファジー小胞をオートファジー活性の指標とすることもできる。オートファジー小胞は、オートファゴソームとも呼ばれる。オートファゴソームは、顕微鏡下で観察することができ、一例としてＬＣなどをマーカーとして利用することで特定することができる。

本発明のスクリーニング方法により、紫外線起因性炎症抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤として、化粧品素材ライブラリーのなかから、下記の植物エキス：エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、ユキノシタエキスを選択することができた。したがって、本発明の１の態様では、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１の植物エキスを含む、紫外線起因性炎症抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤に関する。これらのエキスは、従来型のオートファジー誘導活性を有する場合もある。その一方で、エンメイソウエキスについては従来型オートファジー誘導活性を有しておらず、その一方で強いオルタナティブオートファジー誘導活性を示すことから、オルタナティブオートファジー選択的誘導剤ということができる。

本発明で使用する各植物の植物体又はその抽出物は、各々の植物体の各種部位（花、花穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草など）をそのまま又は乾燥したものを粉砕して乾燥粉末としたもの、あるいはそのまま又は乾燥・粉砕後、溶媒で抽出したものである。抽出部位として、葉、根、茎、花が考えられるが、抽出部位はこれらに限定されない。

エキスの場合、抽出に用いられる抽出溶媒は通常抽出に用いられる溶媒であれば何でもよく、特にメタノール、エタノールあるいは１，３−ブチレングリコール等のアルコール類、含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル等の有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができ、このうち特に、アルコール類、含水アルコール類が好ましく、特にメタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、含水エタノールまたは含水１，３−ブチレングリコールが好ましい。また前記溶媒は、室温〜溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。含水１，３−ブチレングリコールは、１，３−ブチレングリコールを、２０〜８０質量％、好ましくは３０〜７０質量％、さらに好ましくは４０〜６０質量％含む。一例として、抽出溶媒として５０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液を使用することができる。

抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から、常圧下での溶媒の沸点の範囲であれば良く、抽出後は濾過又はイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすれば良い。更に多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラム等を用いれば良く、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えば良い。本発明で用いられるエキスは全て化粧品素材として市販されており、その製法は販売元に応じて異なってもよい。

エンメイソウ（学名：Isodon japonicus）は、シソ科ヤマハッカ属の日本原産の植物であり、本州、四国、九州に自生する。エンメイソウエキスは、エンメイソウの全草を上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、エンメイソウエキスは、生薬として市販されているエンメイソウの全草の乾燥物を、水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又は、これらの混液等により抽出することにより得ることができる。エンメイソウ（延命草）と呼ばれるように、日本では民間薬として利用されている。おもな薬効として保湿、血行促進、収れん、抗菌作用などが知られており、苦味健胃薬としても利用されている。

オドリコソウ（学名：Lamium album Linne）は、シソ科の日本原産の植物であり、北海道、本州、四国、九州、朝鮮半島、及び中国など広い範囲に自生する。オドリコソウエキス (White Nettle Extract)は、オドリコソウの花、茎、又は葉から上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、オドリコソウの花、茎、葉から水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。

カラスムギは、イネ科カラスムギ属の植物であり、ヨーロッパから西アジアの地域が原産とされるが、広い地域で野生種と栽培種が存在している。野生種としてはカラスムギ（学名：Avena fatua）がよくみられる一方で、栽培種のエンバク（学名：Avena sativa）もエキスの原材料として使用されうる。カラスムギエキスは、茎、葉、種子、穀粒から上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、カラスムギの穀粒から水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。

シャクヤクはボタン科の多年草であり、アジア大陸北東部の原産とされている。シャクヤクエキスに用いられる種としては、シャクヤク（Paeonia lactiflora Pallas (Paeonia albiflora Pallas var.trichocarpa Bunge))又はその他近縁植物(Paeoniaceae)が挙げあられる。シャクヤクの植物体から、上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、シャクヤクの根から水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。

ツバキ（学名：Camellia japonica）は、ツバキ科ツバキ属の常緑樹であり、日本原産の植物である。本州、四国、九州、南西諸島に自生し、また朝鮮半島南部と台湾にも自生する。ツバキ種子エキスは、ツバキの種子を上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、ツバキの種子の粉末又は乾燥粉末から水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。

バラは、バラ科バラ属の総称であり、北半球の温帯域に広く自生する植物である。バラには多様な種類が存在しており、任意の種のバラの花から水蒸気蒸留によりローズウォーターが抽出される。特にダマスクローズ（Rosa damascena）という品種は、その香りが優れていることからローズウォーターの原材料として適している。ブルガリア産のダマスクローズから得られたローズウォーターを特に、ブルガリアローズウォーターと呼ぶこともあり、化粧品素材として市販されている。

フローラサン９０は、ひまわり油の一種であり、化粧品素材として市販されている。ひまわり（学名：Helianthus annuus）はキク科の一年草であり、北アメリカ原産である。ひまわりの種子は、油脂に富み、搾油することでひまわり油を得ることができる。ひまわり油は、品種により含まれる不飽和脂肪酸の種類が異なり、特にオレイン酸含有量の高いひまわり油が特に好ましい。

マンゴスチン（学名：Garcinia mangostana）はオトギリソウ科フクギ属の植物であり、東南アジアを原産とする。マンゴスチンエキスは、マンゴスチンの果穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草を上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、マンゴスチンの果皮から水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。

モリンガは、ワサビノキ属に属する植物であり、アフリカから南アジアの熱帯から亜熱帯にかけて自生する。特にワサビノキ（学名：Moringa oleifera Lam）が多く栽培されている。モリンガエキスは、葉、花、樹皮、果実、種子、根から上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、ワサビノキの葉や根から水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。

ユキノシタ（Saxifraga stolonifera）は、ユキノシタ属の植物であり、日本、中国などに自生する多年草である。ユキノシタエキスは、全草、葉、茎、根、花、種子から上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、ユキノシタの葉から水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。

本発明の別の態様では、オルタナティブオートファジー活性を指標とした皮膚炎症に対する抵抗性の評価方法にも関する。この方法によると、被験者の皮膚サンプルにおいて、オルタナティブオートファジー活性を測定することにより、皮膚炎症に対する抵抗性を評価することができる。評価された皮膚炎症に対する抵抗性に応じて、化粧料を選択することが可能である。例えば、オルタナティブオートファジー活性が低いと評価された被験者に対しては、皮膚炎症を生じさせにくい低刺激性の化粧料を進めることができる。また、皮膚炎症として紫外線起因性炎症に対する抵抗性に着目した場合、オルタナティブオートファジー活性が低いと評価された被験者に対してはより強力な日焼け止めや、アフターケアローションなどの化粧料を勧めることができるし、またオルタナティブオートファジー誘導剤を含む、機能性食品、化粧品、及び医薬品を勧めることができる。

オルタナティブオートファジー活性は、オルタナティブオートファジーに寄与する因子の発現又は活性を指標に決定することができる。オルタナティブオートファジーに寄与する因子として、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、Ｒａｂ９などが挙げられ、例えばこれらＢｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、Ｒａｂ９などの因子の遺伝子・タンパク質発現の変化を検出したり、免疫染色などの手法を用いて可視化してもよい。オルタナティブオートファジーを特異的に測定する観点から、慣用型オートファジーには関与しないと考えられるＲａｂ９を用いることが好ましい。さらに別の態様では、オルタナティブオートファジー活性を、オルタナティブオートファジーに関与する細胞内器官又は物質、例えばリソソームや、オートファゴソーム、あるいはリソソーム又はオートファゴソーム由来タンパク質を検出してもよい。例えば、Ａｔｇ５及び／又はＡｔｇ７をノックダウンもしくはノックアウトした細胞でのリソソーム由来タンパク質ＬＡＭＰ１やＬＡＭＰ２の凝集を免疫染色などの手法を用いて可視化してもよい。

紫外線誘導性炎症に対するオートファジー阻害剤及び誘導剤の影響
正常ヒト表皮角化細胞 (ＮＨＥＫ)（クラボウ社製）を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントになるまで表皮角化細胞増殖用培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２；GIBCO社製）で培養した。その後、オートファジー阻害剤として知られている３−メチルアデニン（３−ＭＡ）（Ｒ＆Ｄ社製；最終濃度１ｍＭ）を含んだ培地、及びオートファジー誘導剤として知られているラパマイシン（Enzo life science社製；最終濃度０．５μＭ）を含んだ培地にそれぞれ交換し、３時間培養した。培養後、培地を捨て、ＰＢＳを添加し、紫外線（２９０−３１５ｎｍ）を２０ｍＪ／ｃｍ²の照射強度で照射した。紫外線照射後、３−ＭＡもしくはラパマイシンを含んだ上記培地条件下で再び培養を続け、４８時間後、それぞれの培養上清を得た。得られた培養上清中のＩＬ−１βの濃度をQuantikine Human IL-1β ELISA Kit (R&D 社製)を用いて評価した（図１Ａ及びＢ）。統計的有意差検定には、ステューデントもしくはウェルチのｔ検定を用いた。

紫外線照射によりＩＬ−１βの濃度が増加することから、炎症が誘導されていることが示された。そしてオートファジー阻害剤である３−メチルアデニンを添加した場合、紫外線照射後のＩＬ−１βの濃度が約３倍に増加した。一方で、オートファジーの誘導剤として知られているラパマイシンを添加した場合、紫外線照射後のＩＬ−１βが有意に低下した。これらの結果から、オートファジーを誘導することで、紫外線誘導性の炎症を軽減できることが示された。

紫外線誘導性炎症の軽減に寄与するオートファジーの種類の特定
Ａｔｇ５、Ａｔｇ７およびＢｅｃｌｉｎ１に対するsmall interfering RNA (ｓｉＲＮＡ)をInvitrogen社から購入した。それぞれの配列は表１の通りである。

ＮＨＥＫ細胞(８．０ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ)にAmaxa Human Keratinocyte Nucleofector Kit (Lonza社製)を用いて、ｓｉＲＮＡの最終濃度が２００ｎＭになるようにトランスフェクションした。ノックダウン効率は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７およびＢｅｃｌｉｎ１のｍＲＮＡ発現量より確認した（図２Ａ、ＢおよびＣ）。使用したＲＴ−ＰＣＲのプライマーは、Sigma-Aldrich社製のプライマーを用い、また、内部標準としてＧＡＰＤＨ（Sigma-Aldrich社製）を使用して発現量を標準化した。これらのプライマーの配列を表２に示す。

ｓｉＲＮＡ処置したＮＨＥＫ細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。その後、培地を捨て、ＰＢＳに置換し、紫外線（２９０−３１５ｎｍ）を１５ｍＪ／ｃｍ²の照射強度で照射した。紫外線照射後、培地に再置換して４８時間培養し、培養上清を得た。得られた培養上清中のＩＬ−１βの濃度をQuantikine Human IL-1β ELISA Kit（Ｒ＆Ｄ社製）を用いて評価した（図３Ａ、ＢおよびＣ）。統計的有意差検定には、ステューデントのｔ検定を用いた。

Ａｔｇ５、Ａｔｇ７およびＢｅｃｌｉｎ１に対するｓｉＲＮＡを用いることで、これらの遺伝子発現を抑制することができることが示された（図２Ａ、ＢおよびＣ）。Ａｔｇ５、Ａｔｇ７は、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジーに必須のタンパク質と考えられており、Ｂｅｃｌｉｎ１は、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジー及びオルタナティブオートファジーの両経路を含めたオートファジーに必須のタンパク質と考えられている。したがって、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７の遺伝子発現をそれぞれ抑制された細胞では、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジーのみが働いていない一方で、Ｂｅｃｌｉｎ１の遺伝子発現を抑制された細胞では、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジー及びオルタナティブオートファジーを含めたオートファジー経路自体が働いていないと考えられる。

Ａｔｇ５およびＡｔｇ７の発現を抑制された角化細胞では、紫外線を照射後のＩＬ−１βの濃度に変化がなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。一方で、Ｂｅｃｌｉｎ１の発現を抑制された角化細胞では、紫外線照射後にＩＬ−１βの濃度が有意に増加した（図３Ｃ）。これにより、紫外線により生じる炎症の軽減には、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジーは何ら関与していない一方で、紫外線により生じる炎症の軽減に、オルタナティブオートファジーが寄与していることが示された。

オルタナティブオートファジー誘導剤のスクリーニング方法
正常２９３Ｔ細胞及びＡｔｇ５欠損２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に、１ｘ１０⁴細胞／ウェルで播種し、２日間培養した。培養後、培地を、被験物質を含有する培地に置換し、オートファジーモニター色素（同仁化学）を１μＭ濃度で添加し、オートファジーの活性を調べた。２１２種類の被験物質のうち、２０種類の被験物質が、正常２９３Ｔ細胞とＡｔｇ５欠損２９３Ｔ細胞のいずれにおいても同等のオートファジー活性を誘導した。

続いて、選択された２０の被験物質について、正常ヒト表皮角化細胞（Ｈａｃａｔ）細胞におけるオートファジー活性を測定した。上述のＡｔｇ５ノックダウン用のｓｉＲＮＡを処置して、Ａｔｇ５ノックダウンＨａｃａｔ細胞を取得した。正常Ｈａｃａｔ細胞と、Ａｔｇ５ノックダウンＨａｃａｔ細胞をそれぞれＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に、１×１０⁴細胞／ウェルで播種し、２日間培養した。培養後、培地を、被験物質を含有する培地に置換し、オートファジーモニター色素（同仁化学）を１μＭ濃度で添加し、オートファジーの活性を調べた。２０種類の被験物質のうち、１０種類の被験物質が正常Ｈａｃａｔ細胞とＡｔｇ５ノックダウンＨａｃａｔ細胞のいずれにおいても同等のオートファジー活性を誘導した。これにより、かかる１０種類の被験物質が、Ａｔｇ非依存的オートファジーを、表皮角化細胞において誘導することができることが示された。

選択された１０種類の被験物質について、従来型オートファジー活性及びオルタナティブオートファジー（Ａｔｇ５／Ａｔｇ７非依存的オートファジー）活性の誘導能について測定した。具体的に、正常Ｈａｃａｔ細胞を、上記被験物質を添加した培地で培養し、抗ＬＣ３−ＩＩ抗体（Ｃｏｓｍｏｂｉｏ）を用いて免疫染色を行った。蛍光顕微鏡で観察し、被験物質非添加の対照群と比較して、全視野における蛍光輝度の変化を記録した。ＬＣ３−ＩＩは、従来型のオートファジーの指標となることから、被験物質非添加の対照群と比較して、蛍光輝度が増加した場合に、従来型オートファジー活性の誘導能を決定した。続いて、Ａｔｇ５ノックダウンＨａｃａｔ細胞を、上記被験物質を添加した培地で培養し、抗Ｌａｍｐ１抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて免疫染色を行った。蛍光顕微鏡で観察し、被験物質非添加の対照群と比較して、全視野における蛍光輝度の変化を記録した。Ｌａｍｐ１は、のオートファジーの指標となることから、被験物質非添加の対照群と比較して、蛍光輝度が増加した場合に、Ａｔｇ非依存的オートファジー活性の誘導能を決定した。結果を下記の表に示す。

２９：エンメイソウエキス、４５：オドリコソウエキス、６２：カラスムギ抽出液、９５：シャクヤクエキスＢＧ、１２９：ツバキ種子エキスＢＧ、１５６：ブルガリアローズウォーター、１５７：フローラサン９０、１７４：マンゴスチンエキスＢＧ、１７９：モリンガエキスＧ、１８３：ユキノシタエキスＢＧ

被験物質番号２９、３４、１２９、及び１５６において、強いオルタナティブオートファジー誘導活性がみられた。また、被験物質２９は、従来型オートファジーを誘導しない一方で、オルタナティブオートファジー活性のみを誘導することができた。

Claims

オルタナティブオートファジー誘導剤を有効成分とする、紫外線起因性炎症の抑制剤。
前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、請求項１に記載の抑制剤。
前記抑制剤が、皮膚外用剤である、請求項２に記載の抑制剤。
前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抑制剤。
前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抑制剤。
前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキスである、請求項５に記載の抑制剤。
オルタナティブオートファジー活性を指標とした紫外線起因性炎症の抑制剤のスクリーニング方法。
オルタナティブオートファジー活性が、Ｒａｂ９の遺伝子発現量又はタンパク質量により測定される請求項７に記載のスクリーニング方法。
慣用型オートファジー因子非発現株において、オートファジー活性を測定することによる、請求項７に記載のスクリーニング方法。
オートファジー活性の測定が、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、及びＲａｂ９なる群から選ばれる１以上の遺伝子発現量又はタンパク質量により測定される、請求項９に記載のスクリーニング方法。
オートファジー活性の測定が、オートファジー小胞の検出による、請求項９に記載のスクリーニング方法。
皮膚におけるオルタナティブオートファジー活性を指標とした、紫外線障害に対する抵抗性の評価方法。
オルタナティブオートファジー活性が、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、及びＲａｂ９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される請求項１２に記載の評価方法。
オルタナティブオートファジー活性が、Ｒａｂ９の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される請求項１３に記載の評価方法。
前記紫外線障害が、紫外線起因性皮膚炎症である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の評価方法。