KR20220070111A - 돌외의 식물세포 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돌외의 식물세포 배양물 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 엑소좀을 함유하는 피부 개선용 외용제 조성물; 및 상기 외용제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 돌외의 식물세포배양물, 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 엑소좀은 자외선에 의한 세포 보호, 피부 보습, 항노화, 피부 장벽 강화, 가려움증 완화, 항스트레스에 의한 세포 손상 보호, 항주름, 창상치유에 의한 항노화, 모공 축소, 피지 억제, 세포 에너지 증진 및 여드름 억제 효과 등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 돌외의 식물세포배양물, 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 엑소좀을 함유하는 외용제 조성물은 피부 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돌외의 식물세포 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물 {External Composition Comprising the Plant Cell Culture of Gynostemma pentaphyllum for Improving Skin}

본 발명은 돌외의 식물세포 배양물 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 피부 장벽 강화, 가려움 개선, 모공 축소, 피지 억제, 여드름 억제 또는 개선, 또는 피부 세포 손상 보호용 외용제 조성물; 및 상기 피부 개선용 외용제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

피부는 무게를 기준으로 몸에서 가장 큰 기관이며 각질화된 바깥쪽 표피와 혈관이 풍부하게 발단된 내부 결합조직인 진피, 그리고 가장 안쪽의 피하조직의 3 층으로 되어 있으며, 피부와 연관된 여러 부속기구 (털, 손발톱, 감각수용기, 분비샘)와 함께 피부계 (integumentary　system)를 이룬다. 피부는 몸 안의 여러 기관의 주요한 기능 수행을 위해 몸의 안과 밖의 경계를 이룬다.

피부는 항상성 (homeostasis) 유지에 필수적이며 보호기능 외에도 체온조절, 수분손실 억제, 감각수용기 함유, 다양한 생화학물질 합성 및 소량의 노폐물 배출 등 다양한 기능을 수행하는 중요한 기관이다.

그러나 다른 기관과 비교하여 피부는 외부로부터의 자극이나 여러 병원체와 직접 접촉하는 기회가 많으며, 특히 피부에 자외선이 흡수될 경우 광화학 반응을 일으킴으로써 피부 병변을 야기하게 된다. 뿐만 아니라 정신적인 스트레스, 비만, 술, 담배 등 현대사회에서 일반적으로 발생하는 요소들에 의한 피부질환 환자가 급격히 늘고 있는 추세이다.

이에 따라 피부 손상을 억제하고 피부세포를 보호하기 위한 다양한 피부 보호제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있으나, 개발된 피부 보호제는 주로 합성 화합물을 유효성분으로 하고 있어,　피부에 손상을 유발시키거나 가려움 및 반점 등 부작용이 발생한다는 단점이 있다. 따라서,　피부에　부작용이 없으면서도 피부 손상 억제 및 피부 강화 기능이 우수한 새로운 천연물 소재의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 돌외 (Gynostemma pentaphyllum)는 박목 박과의 쌍떡잎식물로, 여러해살이 덩굴식물이다. 한국에서는 주로 제주도 및 울릉도의 산이나 들의 숲속에서 자란다. 예로부터 강장강정, 이뇨, 소염 및 건위 효과가 있는 약용식물 로 알려져 있으며 그 성분 및 효능 연구가 활발하게 진행되어, 항산화작용 및 혈관내피세포 보호 작용, 심혈관 기능 개선 작용 및 콜레스테롤 저하 작용 등을 가지는 것으로 보고되고 있다.

이러한 돌외 추출물을 이용한 다양한 화장료 조성물 연구가 진행되고 있으나, 식물에서 추출한 추출물을 이용할 경우 그 양이 한정되어 제품생산을 위한 응용이 제한될 수 밖에 없는 실정이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 피부 개선에 유용한 천연 유래 소재를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 돌외 식물세포 배양물 또는 그 추출물, 또는 상기한 돌외 식물세포 유래 엑소좀이 피부 개선 효과를 나타내며 식물세포배양기술을 이용한 대량생산이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2019-0086085호

본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 예시적 목적은 돌외의 식물세포배양물, 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 외용제 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 돌외의 식물세포 배양물, 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 상기 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "돌외 (Gynostemma pentaphyllum)"는 박목 박과의 쌍떡잎식물로, 항산화작용 및 혈관내피세포 보호 작용, 심혈관 기능 개선 작용 및 콜레스테롤 저하 작용 등을 가지는 것으로 보고되고 있다.

본 발명의 용어 "식물세포배양물"은 식물체에서 잘라낸 조직을 배지에서 배양하여 생기는 세포 덩어리를 포함한 배양 결과물을 말하며, 넓은 의미로 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 응력을 잃은 세포덩어리인 캘러스 또는 아그로박테리움 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직의 배양물을 포함한다.

본 발명에 있어서, 돌외의 식물세포배양물은 돌외 식물체의 일부, 예를 들어 잎, 줄기, 뿌리 등 또는 그 일부를 유도배지에서 배양을 통해 얻어지는 것으로서, 돌외 식물체의 일부를 배양한 배양액을 포함한다.

본 발명의 용어 "추출물"은 상기 돌외의 식물세포배양물의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출물을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명의 용어 "엑소좀"은 세포에서 유래한 30-100 nm 크기의 소포 (vesicle)로서, 다세포 진핵 생명체의 혈액 및 오줌 등의 체액과 진핵세포를 배양한 배양액에서 관찰할 수 있다. 엑소좀은 기원한 세포에서 유래한 단백질과 핵산 등 다양한 생체 분자들을 함유하고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 돌외의 식물세포배양물로부터 유래한 엑소좀을 말한다.

본 발명에 있어서, "피부 개선"이란 본 발명의 돌외식물세포배양물 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 엑소좀을 사용하여 피부가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 상기 피부 개선은 일 예시로, 자외선 조사에 대한 피부 보호, 피부 보습, 항노화, 피부 장벽 강화, 가려움증 완화, 항스트레스에 의한 세포 손상 보호, 항주름, 창상치유에 의한 항노화, 모공 축소, 피지 억제, 세포 에너지 증진 및 여드름 개선을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "피부 보습"은 피부에 수분감을 증가시켜주고 촉촉한 상태를 유지시키는 것을 의미한다. 피부 보습 효과를 높일 경우 피부의 주름 개선, 탄력도 증가에도 이로운 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 용어 "자외선 조사에 대한 피부 보호"은 피부가 자외선에 노출됨에 따라 발생하는 손상 또는 증상, 예를 들어 자외선에 의한 주름 생성, 피부 탄력 저하, 광노화 또는 피부 각화에 대한 방지 또는 개선을 말한다.

본 발명의 용어 "피부 장벽 강화"는 각질세포로 이루어진 피부 장벽에서 각질형성세포의 분화를 촉진하여 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 것을 말한다.

본 발명의 용어 "가려움(증) 개선"이란 피부를 긁거나 문지르고 싶은 충동을 일으키는 피부 증상의 완화를 의미하는 것으로, 가려움증을 유발하는 유전자의 발현을 감소함으로써 가려움증이 완화되는 것을 포함하는 개념이다.

본 발명의 용어 "모공 축소"는 피부 표면에 존재하는 털이 자라나는 구멍의 크기를 감소시키는 것을 의미한다. 모공이 커지면 노폐물과 세균이 신체 안으로 쉽게 침투하여 세균감염 및 여드름 생성이 쉽게 일어날 수 있으므로, 모공을 축소함으로써 깨끗한 피부 상태의 유지 및 세균 감염으로부터 보호 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 용어 "피부 노화"는 내인성/외인성 노화를 모두 포함하는 개념이다. 이러한 피부 노화는 주름 개선, 주름 예방, 탄력 개선 등은 각종 피부노화로부터 발생하는 현상에 대한 개선, 예방, 방지를 또한 포함한다.

본 발명의 용어 "피지 억제"는 피부에서 스며나오는 기름의 분비량을 감소시키는 것을 말한다. 피지가 지나치게 분비될 경우 피부 표면에 염증 및 여드름이 발생하므로, 피지 분비를 억제함으로써 피부의 건강 상태를 향상시키고 산뜻한 피부 상태를 유지할 수 있다.

본 발명의 용어 "여드름 억제 또는 개선"은 피지 분비 과다와 모공 폐쇄로 인해 발생하는 여드름의 발생을 감소시키거나, 발생한 여드름이 가라앉는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "피부 세포 손상 보호"란 피부 세포가 손상될 수 있는 원인을 차단함으로써 세포 손상으로부터 보호하는 것을 의미하며, 예를 들어 피부 세포를 손상시키는 원인 중 하나인 스트레스에 대한 내성이 증가하는 유전자의 발현이 증가하는 것을 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예컨대, 각종 환경 스트레스로부터 피부 노화를 억제하거나, 피부를 보호하는 것을 의미하며, 이러한 환경 스트레스로는 자외선, 공해, 바람, 또는 온도 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "유효성분으로 포함하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 상기와 같은 다양한 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 포함하는 것을 말한다.

구체적으로, 본 발명의 실험예에서는 돌외의 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀이 자외선 조사에 대한 피부 세포 보호 효과를 가짐을 확인하였다. 또한 돌외의 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 처리하여 보습 효과를 나타내는 AQP3 유전자의 발현량이 증가함을 확인하였으며, 항노화 관련 유전자인 TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) 유전자의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 돌외의 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀 처리 시 피부장벽기능을 강화하는 Filaggrin 유전자의 발현이 증가함을 확인하였으며, 가려움증을 유발하는 유전자인 IL-4, TSLP 및 IL-33 유전자의 발현이 감소함을 확인하였다. 또한 발현 정도가 높을수록 스트레스에 대한 내성이 증가하는 LEA 단백질의 발현량 증가에 의해 세포손상보호 효과를 확인하였으며, 프로콜라겐 생합성량 증가에 의한 항주름 효과를 확인하였다. 또한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물에 대하여 창상치유 항노화 효과를 확인하였다. 이와 더불어, 돌외의 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 처리한 경우 헤모글로빈의 침전에 의한 모공 축소 효과, 피지 억제 효과 및 ATP 농도 증가에 따른 세포 에너지 증진 효과를 확인하였다. 또한, 돌외의 식물세포배양물 유래 추출물을 함유한 화장수를 바른 피시험자에게서 여드름 개선 효과가 나타남을 확인하였다. 이러한 시험예를 바탕으로 본 발명의 외용제 조성물은 자외선에 의한 세포 보호, 피부 보습, 항노화, 피부 장벽 강화, 가려움증 완화, 항스트레스에 의한 세포 손상 보호, 항주름, 창상치유에 의한 항노화, 흉터개선, 모공 축소, 피지 억제, 세포 에너지 증진 및 여드름 억제 효과가 있어 피부 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 돌외의 식물세포배양물, 그로부터 얻어지는 추출물 및 엑소좀은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성 물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발 명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위 (얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물 또는 조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림 (수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액 (무수 및 수계), 무수 생성물 (오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형 (리포좀), 비이온형의 소낭 분산 제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말 (foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산 화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충 전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또 는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 자외선에 의한 세포 보호, 피부 보습, 항노화, 피부 장벽 강화, 가려움증 완화, 항스트레스에 의한 세포 손상 보호, 항주름, 창상치유에 의한 항노화, 모공 축소, 피지 억제, 세포 에너지 증진 및 여드름 억제 효과를 가진 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 상태 개선을 위한 약제학적 조성물, 예를 들어, 창상 치유, 흉터 개선, 가려움증 완화 등으로써 기능할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 '대한민국약전'을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비자연적 담체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상기 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.

(a) 돌외 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 식물 세포로 배양하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계에서 얻은 식물세포배양물 또는 그 추출물 또는 상기 식물세포로부터 얻은 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물을 제조하는 단계.

본 발명의 상기 배양을 위하여 적절한 배지를 사용할 수 있으며, 본 발명의 기술분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면 제한 없이 사용가능하다.

일 실시예로, 본 발명의 식물세포 배양을 위해 MS 배지를 사용할 수 있다. 상기 MS 배지는 6-Benzylaminopurine, Sucrose 및 agar를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1 mg/L 6-Benzylaminopurine, 3% Sucrose 및 8g/L agar를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 추출은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 냉침 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 용출법, 압착법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등이 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

일 실시예로, 본 발명의 추출 단계는 열수추출에 의한 것일 수 있다. 바람직하게는 70 ℃ 내지 140 ℃에서 36시간 내지 52시간 열수추출하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 90 ℃ 내지 120 ℃에서 48시간 열수추출하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 적절한 용매를 이용하여 돌외 식물세포배양물로부터 추출한 것이며, 예를 들어 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성 용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다. 상기 추출물을 제조하기 위해 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 프로필알콜, 부틸알콜 등의 탄소수 1 내지 4 저급 알콜; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매;　또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 또한, 상기 용매를 사용하여 1회 이상 추출하여 용매 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 mesh로 여과하여 고형분을 제거하고 사용하거나, 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조시켜 사용될 수 있다. 또한, 상기 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 거칠 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.

본 발명에 따른 돌외의 식물세포배양물, 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 엑소좀은 자외선에 의한 세포 보호, 피부 보습, 항노화, 피부 장벽 강화, 가려움증 완화, 항스트레스에 의한 세포 손상 보호, 항주름, 창상치유에 의한 항노화, 모공 축소, 피지 억제, 세포 에너지 증진 및 여드름 억제 효과 등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 돌외의 식물세포배양물, 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물은 피부 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 돌외 식물세포 배양물을 준비하는 단계이다.
도 2는 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 엑소좀의 제조를 확인한 결과로, 돌외 식물세포 유래 엑소좀을 TEM (transmitted electron microscopy)으로 촬영한 사진이다.
도 3은 돌외 식물세포 유래 엑소좀의 크기와 농도를 NS300 (Malvern Panalytical사)을 이용한 나노입자트래킹 (NTA; Nanoparticle tracking analysis)으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양추출물의 창상치유에 의한 항노화 효과를 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명에 따른 조성물 제조

1-1. 돌외 식물세포 배양

본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물을 준비하기 위하여, 돌외잎을 MS배지 (Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 배양하였다.

구체적으로, 도 1에 나타난 바와 같이, 돌외잎 (입수처: 경북 울릉군 울릉읍)을 70 % 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 다시 소독액 (30 % 락스 + Tween 20)으로 20분 소독한 후 멸균수로 3회 수세하였다. 이후 돌외잎을 날카로운 칼을 이용하여 단번에 상처를 내어 1 mg/L 6-Benzylaminopurine, 3% Sucrose 및 agar 8g/L 가 포함된 기본 MS배지에서 25 ℃, 습도 70% 의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 돌외 식물세포를 유도하였다. 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 고체상태에서 2주간 계대배양을 진행하였고, 이후 온도조건 23±2 ℃, 습도 70 % 조건에서 20 L 생물반응기 (Bioreactor) ((주)삼성과학)에 공기공급량 0.1 vvm로 5주간 액상 배양하여 돌외 식물세포 및 돌외 식물세포 배양액을 준비하였다.

1-2. 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 제조

돌외 식물세포배양물 유래 추출물을 제조하기 위하여, 상기 1-1에서 준비된 배양액을 건조 및 열수추출 후 여과하였다.

구체적으로, 상기 1-1에서 얻은 돌외 식물세포를 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60 ℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 돌외 식물세포 분말 2 g을 용기에 담고, 1 L의 정제수를 넣은 후 90 ~ 120 ℃에서 48시간 열수추출하였다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 여과하여 돌외 식물세포를 제조하였다.

1-3. 돌외 식물세포배양물 유래 엑소좀 제조

돌외 식물세포배양물 유래 엑소좀을 제조하기 위하여, 상기 1-1에서 준비된 배양액을 여과 후 접선흐름여과장치 (Tangentical Flow Filtration: TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.

구체적으로, 1-1에서 얻어진 돌외 식물세포 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액으로부터, 접선흐름여과장치 (Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 돌외 식물세포 유래의 엑소좀을 분리, 농축하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 돌외 식물세포 유래 엑소좀을 제조하였다. 또한 도 3의 좌측에 나타난 바와 같이 제조한 돌외 식물세포 유래 엑소좀의 크기와 농도를 확인하였으며, 도 3의 우측에 나타난 바와 같이 돌외 식물세포 유래 엑소좀의 Zeta potential을 확인하였다.

실험예 1: 피부세포 독성 확인

실시예 1에서 제조한 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀이 피부에 독성이 없는지 여부를 확인하기 위하여, HaCaT 세포 (human keratinocyte, 각질형성세포) 및 Detroit 세포 (human fibroblast, 섬유아세포, Detroit 551, 5116)에 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 처리한 후 MTT assay를 진행하여 세포 독성율을 측정하였다. 대조군으로는 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 군을 사용하였다.

구체적으로, HaCaT 세포 및 Detroit 세포를 10 % FBS (Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM (Dubelcco's Modified Eagle's Medium) 배지와 함께 96-well plate에 분주하고 5% CO₂, 37 ℃의 조건인 항온기에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 최종 0.5, 1 및 5 %인 농도가 되도록 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 5 mg/mL MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 용액을 각 well에 4 μL씩 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 용액 100 μL씩 첨가하여 세포를 용해시킨 후, spectrophotometer를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀은 대조군과 비교하여 세포 독성율에 큰 차이가 없어, 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 물질임을 확인하였다.

	처리농도(%)	세포 독성율 % (Cytotoxicity)
		Human Keratinocyte	Human Fibroblast
	대조군	100	100
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	102	105
	1.0	110	108
	5.0	120	115
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	100	103
	1.0	105	109
	5.0	115	108

실험예 2: 자외선 조사로부터의 피부 세포 보호 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀이 자외선 조사 환경 하에서 각질형성세포를 보호하는지 확인하기 위하여, HaCaT 세포를 배양하여 자외선을 조사한 후 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 처리하였다. 이후 MTT assay를 진행하여 세포 생존율을 측정하였다. 대조군으로는 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 군을 사용하였다.

구체적으로, 피부각질형성세포인 HaCaT 세포를 1x10⁵ cells/ml 농도로 24-well plate에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 인산완충액으로 세척하였다. 인산완충액을 500 μL 첨가한 다음 자외선을 10 mJ/cm²로 조사하였으며, 자외선 조사에 사용할 광원으로는 302 nm 파장의 자외선을 방출하는 ultraviolet crosslinker CL-1000 (Ultra-Violet Products, CA)을 사용하였다. 이후 FBS를 포함하지 않은 신선한 세포배양배지로 교체하고 본 발명에 의한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 0.5%, 1% 및 5%인 농도가 되도록 처리한 다음 24시간 추가배양하였다. 여기에, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 5 mg/ml를 첨가한 후 배양기에서 3시간 배양한 후 형성된 fomazan을 DMSO로 녹이고, 96well plate로 옮긴 후 595 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 자외선 조사 후 시료를 처리하지 않은 대조군과 세포생존율을 비교하였다.

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀은 대조군과 비교하여 자외선 조사에 의한 세포 보호 효과가 현저히 우수함을 확인할 수 있었다.

구분	자외선 조사 여부	처리농도(%)	자외선 조사에 의한 세포 보호 효과 ( % of Control )
대조군	-	-	100
대조군	+	-	51
돌외 식물세포 배양 추출물	+	0.5	58
		1.0	75
		5.0	82
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀		0.5	50
		1.0	72
		5.0	79

추가적으로, HaCaT세포를 자외선 조사 20 mJ/cm²에 노출시킨 뒤 24시간 추가 배양한 후 세포생존율을 확인할 수 있는 MTT assay를 수행한 결과, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀 처리 농도가 증가함에 따라 대조군과 비교하여 세포 생존율(Cell Vialbility)이 증가함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 자외선조사에 의한 피부세포 보호효과를 확인할 수 있었다.

실험예 3: 피부 보습 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 피부 보습 효과를 확인하기 위하여, HaCaT 세포를 배양한 후 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀를 처리하여 Real-time PCR에 의해 보습효과 관련 유전자인 AQP-3 (Aquaporin-3) 유전자의 발현 정도를 확인하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% Fatal bovine serum (FBS) 및 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO, Cat.# 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm² culture dish에서 37 ℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. HaCaT 세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80% 이상 도달 될 때까지 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 DMEM free 배지(without FBS)로 교환 후 본 발명에 의한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 0.5%, 1% 및 5%인 농도가 되도록 처리하였다. 이후 24시간동안 추가 배양한 뒤 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN Cat.# 216213)를 이용하여 배양액에서 RNA를 추출하였다. 즉, 배지를 제거한 세포를 FCW (cell wash buffer)로 세척하고, 50ul cell processing mixture (Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75 ℃에서 5분간 반응시켜 RNA를 추출하였다.

AQP3 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 상기에서 추출한 RNA를 template로 하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 Real-time PCR을 진행하였다. Primer는 Qiagen사의 QuantiTect®primerassays Aquaporin3 (Cat.# QT00212996)로 노멀라이제이션하였으며, Real-time PCR 조건은 표 3에 나타낸 바와 같다.

< Real-time cycler conditions > Step	Time	Temperature
Reverse transcription	30 min	50 ℃
PCR initial activation step	15 min	95 ℃
3-step cycling
Denaturation	15 s	94 ℃
Annealing	30 s	60 ℃
Extension	30 s	72 ℃
Number of cycles	45

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비교해 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀을 처리한 경우 처리 농도가 증가함에 따라 AQP-3의 발현양이 증가함을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 보습 효과를 확인하였다.

	처리농도(%)	AQP-3 발현양 ( % of control)
	대조군	100
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	104
	1.0	114
	5.0	123
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	105
	1.0	116
	5.0	128

실험예 4: 항노화 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 항노화 효과를 확인하기 위하여, HaCaT 세포를 배양한 후 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀를 처리하여 Real-time PCR에 의해 항노화 관련 유전자인 TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) 유전자의 발현 정도를 확인하였다.

구체적으로, HaCaT 세포배양 및 RNA 추출 과정은 실험예 3과 동일하며, TERT 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 상기에서 추출한 RNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 Real-time PCR을 진행하였다. Primer는 Qiagen사의 QuantiTect®primerassays Telomerase reverse transcriptase (TERT, Cat.# QT00073409)로 노멀라이제이션하였으며, Real-time PCR 조건은 표 3에 나타낸 바와 같다.

그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비교해 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀을 처리한 경우 처리 농도가 증가함에 따라 TERT의 발현양이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 항노화 효과를 확인하였다.

	처리농도(%)	TERT 유전자 발현율 (% of control)
	음성 대조군	100
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	114
	1.0	240
	5.0	320
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	135
	1.0	285
	5.0	410

실험예 5: 피부장벽기능 강화 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 피부장벽기능 강화 효과를 확인하기 위하여, HaCaT 세포를 배양한 후 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하여 Real-time PCR에 의해 피부장벽 기능 관련 유전자인 Filaggriin 유전자의 발현 정도를 확인하였다.

구체적으로, HaCaT 세포배양 및 RNA 추출 과정은 실험예 3과 동일하며, Filaggrin 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 상기에서 추출한 RNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 Real-time PCR을 진행하였다. Primer는 Qiagen사의 QuantiTect®primerassays Filaggrin (Cat. #QT01192646)로 노멀라이제이션하였으며, Real-time PCR 조건은 표 3에 나타낸 바와 같다.

그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비교해 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀을 처리한 경우 처리 농도가 증가함에 따라 Filaggrin의 발현양이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 피부장벽 강화 효과를 확인하였다.

	처리농도(%)	Filaggrin 유전자 발현율 (Relative Expression of Filaggrin)
	음성 대조군	1.00
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	1.14
	1.0	2.55
	5.0	3.76
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	1.35
	1.0	2.85
	5.0	3.10

실험예 6: 가려움 완화 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 가려움증 완화 효과를 확인하기 위하여, HaCaT 세포를 배양한 후 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 처리하여 Real-time PCR에 의해 가려움증을 유발하는 유전자인 IL-4, TSLP 및 IL-33 유전자의 발현 정도를 확인하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% Fatal bovine serum (FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO, Cat.# 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm² culture dish에서 37 ℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. HaCaT 세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달 될 때까지 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 DMEM free 배지(without FBS)로 교환 후 본 발명에 의한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 0.5%, 1% 및 5%인 농도가 되도록 처리하였다. 그 후 24시간동안 추가 배양한 뒤 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN Cat. # 216213)를 이용하여 배양액에서 RNA를 추출하였다. 즉, 배지를 제거한 세포를 FCW (cell wash buffer)로 세척하고, 50ul cell processing mixture (Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75 ℃에서 5분간 반응시켜 RNA를 추출하였다.

IL-4, TSLP 및 IL-33 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 상기에서 추출한 RNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 Real-time PCR을 진행하였다. Primer는 Qiagen사의 QuantiTect®primerassays Interleukin 4 (IL-4) Cat.# QT00012565, Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) Cat.#QT00051464, Interleukin 33 (IL-33) Cat.#QT00041559) 및 GAPDH(Cat.# QT01192646)로 노멀라이제이션하였으며, Real-time PCR 조건은 표 7에 나타낸 바와 같다.

< Real-time cycler conditions > Step	Time	Temperature
Reverse transcription	30 min	50 ℃
PCR initial activation step	15 min	95 ℃
3-step cycling
Denaturation	15 s	94 ℃
Annealing	30 s	60 ℃

그 결과, 표 8 내지 표 10에 나타낸 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비교해 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀을 처리한 경우 처리 농도가 증가함에 따라 가려움증을 유발하는 IL-4, TSLP 및 IL-33의 발현양이 현저하게 감소함을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 가려움증 완화 효과를 확인하였다.

	처리농도(%)	IL-4 발현양 ( % of control)
	음성 대조군	100
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	101
	1.0	76
	5.0	67
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	98
	1.0	85
	5.0	80

	처리농도(%)	TSLP 발현양 ( % of control)
	음성 대조군	100
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	104
	1.0	70
	5.0	64
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	99
	1.0	85
	5.0	70

	처리농도(%)	IL-33 발현양 ( % of control)
	음성 대조군	100
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	98
	1.0	81
	5.0	72
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	89
	1.0	80
	5.0	70

실험예 7: 피부 항스트레스 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 항스트레스 효과를 확인하기 위하여, HaCaT 세포를 배양한 후 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 처리하여 Real-time PCR에 의해 스트레스 내성을 증가시키는 단백질인 LEA (Late embryogenesis abundant)의 발현 정도를 확인하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 6-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 0.5, 1, 5 %인 농도가 되도록 세포에 처리한 후 24시간 동안 세포를 추가 배양하였다. 이후 LEA 단백질 발현량을 측정하기 위해 In-Cell ELISA Colorimetric Detection kit를 사용하였다. 즉, 배양이 끝난 세포의 배지를 제거하고, 100 μL fixing solution으로 15분간 상온에서 배양하여 세포를 고정시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL의 Permeabilization solution을 넣고 15분간 상온에서 반응 시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL Quenching solution을 넣고 20분간 상온에서 반응 시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL Blocking solution을 넣고 30분간 상온에서 반응 시켰다. 용액을 제거하고 LEA 1차 항체 50 μL를 첨가하여 4 ℃에서 24시간 반응시켰다. 항체 제거 후 PBS로 세척하고, HRP conjugated 2차 항체 50 μL를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후 항체 제거하여 PBS로 세척을 한 뒤, 100 μL의 TMB substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표 11에 나타낸 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비교해 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀을 처리한 경우 처리 농도가 증가함에 따라 LEA 단백질 발현양이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 항스트레스 효과를 확인하였다.

	처리농도 (%)	LEA Protein content (%)
	음성 대조군	100
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	108
	1.0	125
	5.0	132
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	109
	1.0	118
	5.0	127

실험예 8: 항주름 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 항주름 효과를 확인하기 위하여, Detroit 세포를 배양한 후 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 처리하여 PIP assay에 의해 주름 개선과 관련된 콜라겐 합성 증진 효과를 확인하였다.

구체적으로, Detroit 세포를 48-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양추출물 및 돌외 식물세포배양액 유래 엑소좀을 각각 0.5, 1, 5 %인 농도가 되도록 세포에 처리한 후 24시간 동안 세포를 추가 배양하였다. 상기 과정을 통해 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 20 μL를 취해 PIP EIA kit (Takara, Cat. MK101) 내 PIP 표준물질 20 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 또한 각 well에 첨가하여, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 PIP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 PIP 양을 산정하였다.

그 결과, 표 12에 나타낸 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비교해 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀을 처리한 경우 처리 농도가 증가함에 따라 콜라겐의 생합성량이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 콜라겐 합성 증진에 의한 항주름 효과를 확인하였다.

	처리농도(%)	Procollagen 생합성량 ( % of control)
	음성대조군	100
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	103
	1.0	118
	5.0	134
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	110
	1.0	118
	5.0	127

실험예 9: 창상치유에 의한 항노화 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물의 항노화 효과를 확인하기 위하여, HaCaT 세포를 dish에서 배양한 후 스크레치를 내고 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물을 처리하여 Wound healing assay에 의해 창상치유 및 이로 인한 항노화 효과를 확인하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% Fatal bovine serum (FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO) 과 함께 100 mm/60.1 cm2 culture dish에서 37 ℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. HaCaT이 90%정도 confluence 될 때 100 mm/60.1 cm² dish에 1.5×10⁵ cells/12well plate로 분주한 후 24시간 배양하고, FBS를 포함하지 않는 배지로 교체한 후 각 well에 200P tip을 이용해 #모양으로 스크레치를 내고 본 발명에 의한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물을 1% 또는 5%로 처리하였다. 대조군으로는 상기 돌외 식물세포배양물 유래 추출물을 처리하지 않은 음성대조군 및 상처 회복 기능이 있는 것으로 알려진 EGF를 100ng/ml 농도로 처리한 양성대조군을 사용하였다. 처리 후 0시간대에 cell image를 현미경 사진으로 찍고 37 ℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 이후 18 내지 20 시간동안 추가배양 후 배지를 제거하고 fixing solution (4% paraformaldehyde)을 넣고 15분간 상온에서 incubation하고 PBS로 3번 washing하였다. Fixed cells은 4 ℃에서 한달 동안 보관이 가능하였다. 창상 치유된 정도는 현미경으로 사진을 찍어 Image J 프로그램을 이용하여 계산하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물을 5% 처리한 결과 음성대조군 및 양성대조군에 비해 피부세포의 증식 및 이동이 증가하여 healing area가 유의미하게 증가함을 확인할 수 있었다. 이에 따라 돌외 식물세포배양물 유래 추출물의 항노화 효과를 확인하였다.

실험예 10: 모공 축소 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 모공 축소 효과를 확인하기 위하여, 헤모글로빈에 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 첨가하여 나타난 헤모글로빈 침전에 의해 모공 축소 효과를 확인하였다. 일반적으로 헤모글로빈의 침전도가 높을수록 모공 수축 효과가 우수한 것으로 알려져 있다.

구체적으로, 0.9% Phosphate Buffer Saline (0.1mM, pH 7.4)으로 헤모글로빈 용액(0.05g/50ml)을 제조하여 헤모글로빈 용액 2 ml에 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 0.5, 1, 5 %인 농도가 되도록 세포에 2 ml 처리한 후, 30초 동안 진탕 혼합한 다음 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 그 상등액 1 ml에 정제수 2 ml을 가하여 407 nm에서 UV-Visible spectrum으로 헤모글로빈 침전을 측정하였다. 대조군으로는 PBS (Phosphate Buffer Saline) 2 ml을 가한 헤모글로빈 용액을 사용하였다.

그 결과, 표 13에 나타낸 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비교해 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀을 처리한 경우 처리 농도가 증가함에 따라 헤모글로빈의 침전이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 모공 축소 효과를 확인하였다.

	처리농도(%)	헤모글로빈의 침전 (%)
PBS (음성 대조군)	0	0.1
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	6
	1.0	20
	5.0	25
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	9
	1.0	23
	5.0	28

실험예 11: 피지 억제 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 피지 억제 효과를 확인하기 위하여, 피시험자에게 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 처리하여 피부 유분 측정기 (Sebum meter SM810)에 의해 피지분비량을 측정하였다. 대조군으로는 정제수를 사용하였다.

구체적으로, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 1% 또는 5%로 사용한 피시험자 10명에 대해 4주 후에 피부 유분 측정기 (Sebum meter SM810)를 이용하여 피부의 피지분비량을 측정하였다. 지성 피부인 경우 측정값 220 ㎍/cm₂이상 및 정상 피부인 경우 측정값 100~220 ㎍/cm²를 기준으로 하였다. 실험은 22±2 ℃, 40±5％ humidity에서 이루어졌다.

그 결과, 표 14에 나타낸 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비교해 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀을 처리한 경우 처리 농도가 증가함에 따라 피지분비량이 현저히 감소함을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 피지 억제 효과를 확인하였다.

	시료명	피지 억제효과
		0 일 (사용 전)	28 일 (사용 후)
1	대조군	230	223
2	1 % 돌외 식물세포 배양 추출물	230	173
3	5 % 돌외 식물세포 배양 추출물	232	151
4	1 % 돌외 식물세포 배양물유래 엑소좀	231	199
5	5 % 돌외 식물세포 배양물유래 엑소좀	230	181

실험예 12: 에너지 증진 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 에너지 증진 효과를 확인하기 위하여, Detroit 세포를 배양한 후 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 처리하여 ATP 활성 정도 측정에 의해 에너지 증진 효과를 확인하였다.

구체적으로, Detroit 세포를 12-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 각각 0.1, 1, 5 %인 농도가 되도록 세포에 처리하고, 이후 24시간 동안 세포를 추가 배양하였다. 상기 과정을 통해 배양한 세포의 용해물을 희석한 일부 50 μL를 취해 ATP assay kit (Abcam, Cat. ab83355) 내 ATP 표준물질 50 μL와 함께 각각 96-well plate에 넣고 50 μL의 ATP reaction mix 용액을 또한 각 well에 첨가하여 차광한 상태에서 30분간 실온 반응시켰다. 이후 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 ATP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 ATP 양을 산정하였다.

그 결과, 표 15에 나타난 바와 같이, 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비교해 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 또는 엑소좀을 처리한 경우 처리 농도가 증가함에 따라 ATP 양이 증가함을 확인하여, 이에 따라 본 발명의 돌외 식물세포배양물 유래 추출물 및 엑소좀의 에너지 증진 효과를 확인하였다.

	처리농도 (%)	ATP Content (%)
대조군	-	100
돌외 식물세포 배양 추출물	0.5	98
	1.0	105
	5.0	113
돌외 식물세포 배양물 유래 엑소좀	0.5	109
	1.0	123
	5.0	128

실험예 13: 여드름 개선 효과 확인

실시예 1에서 제조한 돌외 식물세포배양물 유래 추출물의 여드름 개선 효과를 확인하기 위하여, 여드름이 발생한 피험자에게 돌외 식물세포배양물 유래 추출물이 함유된 화장수를 바르게 하여 여드름 치유 효과를 평가하였다.

구체적으로, 여드름이 발생한 남녀 10명으로 대상으로 5 % 농도의 돌외 식물세포 배양물 유래 추출물을 함유한 화장수를 아침, 저녁으로 4주간 얼굴 전체에 고르게 바르도록 하였다. 여드름 개선 효과의 판정은 실험에 참가한 본인이 느끼는 정도에 따라 표 16에서 나타낸 판정기준을 참고로 1-3점으로 시험전 상태를 평가한 뒤 여드름 치유 효과를 평가하도록 하였다.

그 결과, 표 16에서 나타낸 바와 같이, 2주 경과 후 피험자의 70%가 여드름 치유 효과가 있다고 판단하였고, 4주 경과 후 피험자의 90%가 여드름 치유 효과 있다고 판단하였다. 특히 4주 경과 후 여드름 치유 효과가 있다고 느낀 피험자의 과반수 이상이 상당한 효과가 있는 것으로 평가하였으며, 이에 따라 본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물의 여드름 개선 효과를 확인할 수 있었다.

피험자	시험전 상태	2주 경과후 효과	4주 경과 후 효과
피험자1	2	+	+
피험자2	1	+	++
피험자3	1	-	+
피험자4	2	-	-
피험자5	2	+	++
피험자6	2	+	+
피험자7	3	++	+++
피험자8	2	-	++
피험자9	3	+	+
피험자10	2	+	++

<시험전 상태의 평가>1 = 여드름 조금 있음 2 = 여드름 약간 있음 3 = 여드름 심함

<여드름 효과 판정>

- : 효과 거의 없음, + : 약간의 효과 있음, ++ : 많이 완화, +++: 완전히 치유됨

실시예 2: 피부 외용제 조성물 제조

본 발명에 따른 돌외 식물세포배양물 유래 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 제조하기 위하여, 표 17 내지 표 21의 조성비에 따라 화장수, 에센스, 로션, 크림 및 젤을 각각 제조하였다.

화장수 제조

원 료 명	중량 %(w/w)
글리세린	5.0
디프로필렌글리콜	3.0
히아루론산	0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
폴리에틸렌 올레일에틸	0.1
에탄올	5.0
방부제	0.15
항료	적량
착색료	적량
돌외 식물세포배양추출물	1.0
정제수	to 100

에센스 제조

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스쿠알란	5.0
이소세틸옥타노에이트	3.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	8.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	0.2
카르복시폴리머	0.22
트리에탄올아민	0.25
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
돌외 식물세포배양추출물	1.0
정제수	to 100

로션 제조

원료명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	0.8
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스테아린산	0.5
유동파라핀	7.0
스쿠알란	5.0
마카데미아오일	3.0
이소세틸옥타노에이트	2.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
카르복시폴리머	0.12
트리에탄올아민	0.15
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
돌외 식물세포배양추출물	1.0
정제수	to 100

크림 제조

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	3.0
자기유화형모노스테아린산	1.5
친유형모노스테아린산	1.5
밀납	0.5
유동파라핀	8.0
스쿠알란	7.0
이소세틸옥타노에이트	4.0
정제호호바유	4.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	6.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
산탄검	0.06
트리에탄올아민	0.10
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
돌외 식물세포배양추출물	1.0
정제수	to 100

젤 제조

원료명	중량 %(w/w)
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
에탄올	10
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.30
트리에탄올아민	0.30
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
돌외 식물세포배양추출물	1.0
정제수	to 100

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

1. 돌외의 식물세포 배양물, 또는 그로부터 얻어진 추출물 또는 상기 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 피부 보습인, 외용제 조성물
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 피부 장벽 강화인, 외용제 조성물
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 가려움 개선인, 외용제 조성물
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 모공 축소인, 외용제 조성물
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 피지 억제인, 외용제 조성물
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 여드름 억제 또는 개선인, 외용제 조성물
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 환경 스트레스로부터의 피부 보호인, 외용제 조성물
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 피부 노화 억제 또는 개선용인, 외용제 조성물.
   
10. 제1항에 있어서,
    상기 피부 개선은 피부 창상 치유, 또는 흉터 개선용인, 외용제 조성물.
11. 다음의 단계를 포함하는 제1항에 따른 외용제 조성물의 제조방법:
    (a) 돌외 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 식물 세포 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)단계에서 얻은 식물세포 배양물 또는 그 추출물 또는 상기 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물을 제조하는 단계;

Images