WO2020091070A1 - オルタナティブオートファジー誘導剤を含む紫外線起因性炎症抑制剤 - Google Patents

オルタナティブオートファジー誘導剤を含む紫外線起因性炎症抑制剤 Download PDF

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優哉 中島
雅史 宮井
重臣 清水
真也 本田
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Definitions

  • the present invention relates to an agent for suppressing ultraviolet ray-induced inflammation, which contains, as an active ingredient, a drug that induces alternative autophagy.
  • the present invention also relates to an alternative autophagy inducer, and a screening method for an ultraviolet-induced inflammation inhibitor, which uses the alternative autophagy activity as an index, and a method for evaluating resistance to ultraviolet-induced inflammation in human skin.
  • cytoplasmic components organelles, cytoplasmic proteins, etc.
  • autophagy which is in principle non-selective and is called bulk degradation system.
  • Autophagy also known as autophagy, surrounds the cytoplasmic components used for degradation by a bilayer membrane (separation membrane), then closes the isolation membrane and fuses it with lysosomes to decompose the cytosolic components that are the contents. be able to.
  • Autophagy contributes to the metabolism of cells in normal times, and also contributes to the degradation of excessively made proteins and abnormal proteins in the cytoplasm when exposed to certain stress.
  • neuropathic diseases as diseases associated with autophagy, cancer, neuropathic diseases (amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, etc.), hepatitis (acute hepatitis, chronic hepatitis), cirrhosis, infection, immunity Abnormalities and the like have been reported, and pharmaceuticals that are expected to have a therapeutic effect on such diseases by controlling the autophagy function, such as anticancer agents, anti-dementia agents and therapeutic agents for neurodegenerative diseases, are being developed.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Such autophagy is a conventional Atg5 / Atg7-dependent autophagy (simply, It is also called alternative autophagy or Atg5 / Atg7 independent autophagy.
  • Alternative autophagy is regulated by Ulk1 and Beclin1, which are associated with conventional Atg5 / Atg7-dependent autophagy, as well as Rab9, which is only involved in alternative autophagy. Since alternative autophagy is induced by cell stress, it is thought that failure of this mechanism induces cancer and the like, and an anticancer agent utilizing alternative autophagy has been developed (Patent Document 1). In addition, studies using Atg5-knockout mice involved in Atg5-dependent autophagy pathway have shown that the Atg5-dependent autophagy pathway improves the onset of atherosclerosis, which is one of the inflammatory diseases. There is.
  • Non-Patent Document 4 in non-patent document 4, in keratinocytes knocked down with Atg5, when inflammation is induced by MALP-2, inflammatory cytokines TNF- ⁇ and IL-6 are compared with a control (Atg5 non-knockdown). It shows that it increased significantly.
  • Atg5-dependent autophagy which is a conventional autophagy
  • inflammation has been partially clarified, but the relationship between alternative autophagy and inflammation has not been clarified yet. ..
  • ultraviolet rays are electromagnetic waves having wavelengths in the ultraviolet region, and include long-wavelength ultraviolet rays (UV-A) longer than about 320 nm, medium-wavelength ultraviolet rays (UV-B) of about 320 to about 280 nm, and about 280 nm. It is classified as shorter short wavelength ultraviolet (UV-C). Of these, UV-C is absorbed by the ozone layer, so it is not normally included in sunlight reaching the ground, and UV-A occupies about 95% of the ultraviolet rays reaching the ground, and about 5% is UV-B. is occupying.
  • UV-A long-wavelength ultraviolet rays
  • UV-B medium-wavelength ultraviolet rays
  • UV-C shorter short wavelength ultraviolet
  • UV damage can be mainly divided into acute damage and chronic damage.
  • Acute damage includes sunburn (sunburn, suntan), UV keratitis, and decreased immune function.
  • Chronic damage includes wrinkles, spots, and skin. Examples include cancer and cataract.
  • the inflammation caused by ultraviolet rays is one of the causes of such acute and chronic disorders, and suppressing inflammation caused by ultraviolet rays is important for the prevention and treatment of ultraviolet disorders. It is required to elucidate the inflammation mechanism caused by ultraviolet rays, and a method for searching for a substance that suppresses inflammation along with the thus-clarified inflammation mechanism caused by ultraviolet rays is desired.
  • the present invention has been made in view of the problems in the prior art, and it is an object of the present invention to elucidate a part of the mechanism of ultraviolet-induced inflammation and to provide an inhibitor of the ultraviolet-induced inflammation.
  • Atg5 / Atg7-independent autophagy selectively contributes to the reduction of inflammation caused by ultraviolet rays, which is one of the causes of skin inflammation.
  • ultraviolet rays which is one of the causes of skin inflammation.
  • Further research on the relationship between this UV-induced inflammation and autophagy revealed that the typical pathway of autophagy, Atg5 / Atg7-independent autophagy, was altered by UV light by Atg5 / Atg7-independent autophagy.
  • the inventors have found that the skin irritation that occurs can be reduced, and have reached the present invention. Therefore, the present invention relates to the following inventions.
  • An ultraviolet-induced inflammation suppressant containing an alternative autophagy inducer as an active ingredient [2] The inhibitor according to Item 1, wherein the ultraviolet ray-induced inflammation is ultraviolet ray-induced skin inflammation. [3] The inhibitor according to Item 2, wherein the inhibitor is a skin external preparation. [4] The alternative autophagy-inducing agent is selected from the group consisting of Trillium edulis extract, Odori Kosou extract, oat extract, peony extract, camellia seed extract, Bulgarian rose water, sunflower oil, mangosteen extract, moringa extract, and Yukinoshita extract. Item 4. The inhibitor according to any one of Items 1 to 3, which is at least 1.
  • a method for suppressing or treating ultraviolet-induced inflammation which comprises administering an effective amount of an alternative autophagy inducer to a subject in need of ultraviolet-induced inflammation.
  • the method according to item 16 wherein the ultraviolet ray-induced inflammation is ultraviolet ray-induced skin inflammation.
  • the alternative autophagy inducer is transdermally administered.
  • the alternative autophagy-inducing agent is selected from the group consisting of Trillium edulis extract, Odori Kosou extract, oat extract, peony extract, camellia seed extract, Bulgarian rose water, sunflower oil, mangosteen extract, moringa extract, and Yukinoshita extract. 19. The method according to any one of items 16 to 18, which is at least 1. [20] The method according to any one of items 16 to 18, wherein the alternative autophagy inducer can selectively induce alternative autophagy. [21] The method according to Item 20, wherein the alternative autophagy-inducing agent is Triticum arvense extract. [22] An alternative autophagy inducer for use in suppressing or treating ultraviolet ray-induced inflammation.
  • the alternative autophagy-inducing agent is selected from the group consisting of Trillium vulgaris extract, Odorikosou extract, oat extract, peony extract, camellia seed extract, Bulgarian rose water, sunflower oil, mangosteen extract, moringa extract, and Yukinoshita extract.
  • the alternative autophagy-inducing agent is selected from the group consisting of Trillium edulis extract, Odori Kosou extract, oat extract, peony extract, camellia seed extract, Bulgarian rose water, sunflower oil, mangosteen extract, moringa extract, and Yukinoshita extract.
  • Use according to any one of items 29-31, comprising at least one [33] The use according to any one of items 29 to 31, wherein the alternative autophagy inducer can selectively induce alternative autophagy.
  • the use according to Item 33, wherein the alternative autophagy-inducing agent is neem extract.
  • UV-induced inflammation is one of the causes of acute disorders and chronic disorders, and reducing UV-induced inflammation leads to reduction of UV disorders.
  • alternative autophagy since alternative autophagy is involved in the reduction of UV-induced inflammation, by using alternative autophagy activity as an index, screening for inhibitors of UV-induced inflammation and evaluation of resistance to UV-induced inflammation are performed. It also becomes possible.
  • FIG. 1A is a graph showing that addition of the autophagy inhibitor 3-MA increases UV-induced IL-1 ⁇ production.
  • FIG. 1B is a graph showing that UV-induced IL-1 ⁇ production is suppressed by the addition of rapamycin, which is an autophagy inducer.
  • FIG. 2A is a graph showing that expression of Atg5 was suppressed by introducing siRNA against Atg5 into cells.
  • FIG. 2B is a graph showing that expression of Atg7 was suppressed by introducing siRNA against Atg7 into cells.
  • FIG. 2C is a graph showing that the expression of Beclin1 was suppressed by introducing siRNA against Beclin1 into cells.
  • FIG. 1A is a graph showing that addition of the autophagy inhibitor 3-MA increases UV-induced IL-1 ⁇ production.
  • FIG. 1B is a graph showing that UV-induced IL-1 ⁇ production is suppressed by the addition of rapamycin, which is an autophagy inducer.
  • FIG. 2A is a graph
  • FIG. 3A is a graph showing that UV-induced IL-1 ⁇ production was not changed in cells into which siRNA against Atg5 was introduced.
  • FIG. 3B is a graph showing that UV-induced IL-1 ⁇ production was not changed in cells into which siRNA against Atg7 was introduced.
  • FIG. 3C is a graph showing that UV-induced IL-1 ⁇ production was significantly increased in cells transfected with siRNA against Beclin1.
  • the inhibitor of ultraviolet light-induced inflammation of the present invention includes an alternative autophagy inducer.
  • the inflammation suppressed in the present invention is an ultraviolet-induced inflammation, and more preferably an ultraviolet-induced skin inflammation.
  • Inflammation is a symptom characterized by redness, heat, swelling, and pain.Inflammation is caused by external invasion such as microbial infection, invasion of foreign substances, exposure to heavy metals, and UV irradiation, as well as internal release from necrotic cells. It is also caused by a stimulant. Inflammation is a symptom that can occur in any tissue of the living body, and its cause and inflammatory mechanism differ depending on the tissue. Particularly, the skin tissue is exposed to the outside of the living body and acts as a barrier that forms a boundary between the outside world and the living body. It has been known that when the barrier function of the skin is deteriorated, various external insults cause percutaneous sensitization, which causes skin inflammation such as dermatitis and allergic diseases.
  • Filaggrin expressed in keratinocytes is known to play an important role in the formation of the skin barrier. It has been reported that mutations in filaggrin are involved in the development of atopic dermatitis, which is one of the inflammatory diseases. As described above, skin inflammation has a characteristic mechanism different from inflammation in tissues in the living body.
  • the present inventors have found that the alternative autophagy pathway of the present invention acts suppressively in inflammation, particularly in ultraviolet-induced inflammation (Example, FIGS. 1 and 3). On the other hand, the present inventors have also found that the Atg5-dependent autophagy pathway, which was previously said to contribute to tissue inflammation, is not involved in UV-induced inflammation (Example, FIG. 3). ).
  • Non-Patent Document 4 shows that Atg5-dependent autophagy acts suppressively on skin inflammation induced by MALP-2. Therefore, the Atg5-dependent autophagy pathway in UV-induced inflammation is Not involved is not predictable. Although skin inflammation and UV-induced inflammation are common in that they are ultimately accompanied by production of inflammatory cytokines, it is well known that their mechanisms of occurrence are different. The experiments by the present inventors have for the first time suggested that skin inflammation and UV-induced inflammation are different in terms of the control mechanism.
  • the ultraviolet rays may be any of UV-A, UV-B and UV-C, but from the viewpoint of reaching the ground and causing skin inflammation, UV-A and UV- It is preferred to refer to B. Both UV-A and UV-B are known to cause inflammation, but only UV-B, which has a high contribution to inflammation, may be referred to.
  • Symptoms of inflammation caused by ultraviolet rays include erythema and blisters, and in severe cases, eczema may occur. Eczema takes morphological changes such as erythema, papules, vesicles, pustules, erosions, crusts, and desquamation in the acute phase and heals, but when acute eczema becomes chronic without healing, lichenification occurs and pigmentation occurs. May occur.
  • Skin diseases caused by inflammation caused by ultraviolet rays include sunburn dermatitis, photolabial cheilitis, photocontact dermatitis, chronic photosensitivity dermatitis, Bellrock dermatitis, photosensitivity, photosensitivity drug eruption, and sunbathing.
  • the inhibitor of ultraviolet light-induced inflammation or the alternative autophagy inducer of the present invention can treat, reduce, suppress, and prevent the above-mentioned skin diseases and eye diseases caused by inflammation, and these skin diseases and It can also be said to be a therapeutic agent, an alleviator, an inhibitor and a preventive agent for eye diseases.
  • the inflammation caused on the skin promotes the secretion of melanocyte-stimulating hormone, thereby contributing to the browning of the skin and the formation of spots, and promoting the aging by chronic inflammation. Therefore, the inhibitor of ultraviolet light-induced inflammation or the alternative autophagy inducer of the present invention can also be referred to as a sunburn inhibitor, a whitening agent, and a skin aging agent.
  • the subject using the ultraviolet-induced inflammation inhibitor of the present invention is a subject that requires reduction of ultraviolet-induced inflammation.
  • the inhibitor of ultraviolet light-induced inflammation of the invention can be administered.
  • the alternative autophagy inducer is administered to a subject with reduced alternative autophagy activity.
  • the inhibitor of the ultraviolet light-induced inflammation of the present invention is IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL whose secretion is increased in keratinocytes by ultraviolet irradiation. It is possible to suppress the production of one or more inflammatory cytokines selected from -18, TSLP, GM-CSF, chemokines such as CCL2 and CXCL10, and inflammatory mediators such as PGE 2 . Therefore, the inhibitor of ultraviolet-induced inflammation or the alternative autophagy inducer can also be referred to as an inflammatory cytokine inhibitor or an inflammatory mediator inhibitor.
  • Alternative autophagy refers to an intracellular purification mechanism in which autophagosomes are formed without using the autophagy-related molecule Atg5, and further lysosomes are fused to decompose intracellular components taken into the autophagosomes. means. Therefore, alternative autophagy can also be referred to as Atg5 and / or Atg7 independent autophagy. Without intending to be limited to theory, it is considered that the cause of inflammation is eliminated by degrading abnormal proteins denatured by the influence of ultraviolet rays and induced proinflammatory substances by the action of alternative autophagy. Be done. In the present specification, from the viewpoint of distinguishing from alternative autophagy, conventional autophagy, that is, Atg5 and / or Atg7-dependent autophagy is referred to as conventional autophagy.
  • the alternative autophagy inducer may be any substance as long as it is a substance capable of enhancing the activity of alternative autophagy.
  • a substance that can selectively enhance alternative autophagy is preferable, but a substance that non-selectively enhances other autophagy may also be used.
  • the alternative autophagy inducer may comprise a conventional autophagy inducer, or in another embodiment may exclude a conventional autophagy inducer.
  • An inducer that can induce both autophagy other than alternative autophagy (eg, conventional autophagy) and alternative autophagy is called alternative autophagy non-selective inducer, and an inducer that mainly induces alternative autophagy. It can be called an autophagy selective inducer.
  • alternative autophagy selective inducers examples include benzothiophene compounds shown in Patent Document 1 and Francisella tularensis shown in Non-Patent Document 3. Further, the screening method of the present invention showed that Trillium edulis extract is also a substance that acts as an alternative autophagy selective inducer.
  • Non-selective inducers of alternative autophagy include rapamycin, verapamil, clonidine and the like.
  • Triticum arvense extract, Pleurotus cornucopia extract, oat extract, peony extract, camellia seed extract, Bulgarian rose water, sunflower oil, mangosteen extract, moringa extract, Yukinoshita extract are alternative autophagy non-selective inducers. It was shown to be a substance that acts as. However, the autophagy inducer is not intended to be limited to these specific compounds, fungi and extracts.
  • the inhibitor of the alternative autophagy inducer of the present invention or the ultraviolet ray-induced inflammation containing the inducer can be blended as an active ingredient in functionally labeled foods, cosmetics and pharmaceuticals for the purpose of reducing the ultraviolet ray-induced inflammation.
  • cosmetics to be blended include sunscreen, lotion, beauty essence, beauty cream, aftercare lotion, sun oil, etc., but any cosmetic that is applied to the skin can be blended.
  • the drug include an external anti-inflammatory agent for skin and an oral anti-inflammatory agent.
  • the alternative autophagy inducer since the alternative autophagy inducer was found to be effective against ultraviolet ray-induced inflammation, it is preferable that it is blended as a skin external preparation that can be directly applied to the skin.
  • the alternative autophagy inducer or the skin inflammation inhibitor containing the inducer can be appropriately blended with optional components used in cosmetics, pharmaceuticals and the like, as long as the effects thereof are not impaired.
  • the optional components include oils, surfactants, powders, coloring materials, water, alcohols, thickeners, chelating agents, silicones, antioxidants, ultraviolet absorbers, humectants, fragrances, and various medicinal effects.
  • Ingredients, preservatives, pH adjusters, neutralizing agents and the like can be mentioned.
  • an anti-inflammatory component, a whitening component, etc. may be contained.
  • the present invention also relates to a method for screening an ultraviolet-induced inflammation suppressive agent using alternative autophagy activity as an index.
  • This screening method includes the steps of adding a candidate drug to cultured cells and measuring the alternative autophagy activity in the cultured cells. If the alternative autophagy activity is increased compared to the control, the candidate agent can be selected as a UV-induced anti-inflammatory agent or an alternative autophagy inducer.
  • the candidate drug to be used may be any substance, but for example, a substance in the drug candidate compound library or the cosmetic material library can be used, and not only the compound but also a mixture or an extract can be used. ..
  • any cells can be used, and cell lines, primary cultured cells separated from tissue and cultured, or subcultured cells may be used.
  • cells that are affected by ultraviolet rays in a living body such as skin cells and eye cells, can be used.
  • the skin cells may be, for example, keratinocytes, pigment cells or dermal fibroblasts
  • the eye cells may be, for example, corneal epithelial cells or retinal epithelial cells.
  • a three-dimensional cultured skin model in which cultured skin cells are subjected to multilayer culture can be used.
  • a conventional autophagy factor-non-expressing strain that does not express at least one conventional autophagy factor can be used as the cultured cells used in the screening method.
  • a cell line may be a gene knockout cell line created by point mutation, homologous recombination, genome editing such as the Crysper-Cas9 system, or the gene expression is suppressed by introducing siRNA. Knockdown cell line.
  • Beclin1 and Ulk1 are involved in both alternative autophagy and conventional autophagy, and therefore, the gene expression level or protein level of these conventional autophagy factor non-expressing strains should be used as an index of autophagy activity.
  • conventional autophagy factor-non-expressing strains include Atg5 and / or Atg7 gene knockout strains and Atg5 and / or Atg7 gene knockdown strains.
  • autophagy vesicles existing in cells can also be used as an index of autophagy activity.
  • Autophagy vesicles are also called autophagosomes. Autophagosomes can be observed under a microscope, and can be identified by using LC or the like as a marker, for example.
  • the following plant extracts Phytophthora extract, Odorikosou extract, oat extract, peony extract, camellia seeds
  • the extract Bulgarian rose water, sunflower oil, mangosteen extract, moringa extract, and Yukinoshita extract could be selected. Therefore, in one embodiment of the present invention, it is selected from the group consisting of Crassulaceae extract, Pleurotus cornucopia extract, oats extract, peony extract, camellia seed extract, Bulgarian rose water, sunflower oil, mangosteen extract, moringa extract, and Yukinoshita extract.
  • an ultraviolet-induced inflammation inhibitor or an alternative autophagy inducer which comprises at least one plant extract.
  • These extracts may have conventional autophagy-inducing activity.
  • the nematode extract has no conventional autophagy-inducing activity, but exhibits strong alternative autophagy-inducing activity on the other hand, and thus can be referred to as an alternative autophagy selective inducer.
  • each plant used in the present invention various parts of each plant (flowers, spikes, pericarps, fruits, stems, leaves, branches, branches, leaves, stems, bark, rhizomes, root bark, roots , Seeds or whole grass) as they are or after they have been dried and then pulverized into a dry powder, or as they are or after drying and pulverizing, they have been extracted with a solvent.
  • the extraction site may be a leaf, root, stem, or flower, but the extraction site is not limited to these.
  • the extraction solvent used for extraction may be any solvent that is usually used for extraction, such as alcohols such as methanol, ethanol or 1,3-butylene glycol, hydrous alcohols, acetone, ethyl acetate, etc.
  • Organic solvents can be used alone or in combination, of which alcohols and hydrous alcohols are particularly preferable, and methanol, ethanol, 1,3-butylene glycol, hydrous ethanol and hydrous 1,3-butylene glycol are particularly preferable.
  • the solvent is preferably used at a temperature between room temperature and the boiling point of the solvent or lower.
  • the water-containing 1,3-butylene glycol contains 20 to 80% by mass, preferably 30 to 70% by mass, and more preferably 40 to 60% by mass of 1,3-butylene glycol.
  • a 50 mass% 1,3-butylene glycol aqueous solution can be used as the extraction solvent.
  • the extraction method is not particularly limited, but usually from room temperature to the boiling point of the solvent under normal pressure, after extraction, using a filtration or ion exchange resin, adsorption, decolorization, purification and solution It may be in the form of paste, paste, gel or powder. In many cases, it can be used as it is, but if necessary, further purification treatment such as deodorization and decolorization may be added within a range that does not affect the effect, and as a purification treatment means such as deodorization and decolorization. It suffices to use an activated carbon column or the like, and any ordinary means generally applied depending on the extraction substance may be arbitrarily selected.
  • the extracts used in the present invention are all commercially available as cosmetic materials, and the production method may differ depending on the vendor.
  • Trillium trifoliatum extract is an extract obtained by extracting whole plants of Triturium trifolium L. by the above-mentioned extraction solvent.
  • the nematode extract can be obtained by extracting a dried product of whole herbs of the herb commercially available as a crude drug with water, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, a mixed solution thereof or the like. It is used as a folk medicine in Japan, as it is called Trichophyllum japonicum. Its main medicinal properties are known to be moisturizing, promoting blood circulation, astringent, antibacterial action and the like, and it is also used as a bitter stomachic drug.
  • Odorichosou (Scientific name: Lamium album Linne) is a Japanese plant belonging to the Lamiaceae family and native to a wide range such as Hokkaido, Honshu, Shikoku, Kyushu, Korean Peninsula, and China.
  • the White Nettle Extract is an extract obtained by extracting from the flower, stem or leaf of the Strawberry by the above-mentioned extraction solvent. As an example, it can be obtained by extracting from flowers, stems, and leaves of Pleurotus cornucopiae with water, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, or a mixture thereof.
  • Oat grass is a plant of the genus Oatus, which belongs to the family Gramineae, and originates from Europe to West Asia, but wild and cultivated species exist in a wide area.
  • Oat (scientific name: Avena fatua) is often found as a wild species, while cultivated oat (scientific name: Avena sativa) can also be used as a raw material for the extract.
  • the oat extract is an extract obtained by extracting the stem, leaf, seed, and grain with the above-mentioned extraction solvent. As an example, it can be obtained by extracting the grain of oats with water, propylene glycol, 1,3-butylene glycol or a mixture thereof.
  • Peony is a perennial plant of the family Peony and is said to be native to the northeastern part of the Asian continent.
  • examples of the species used for the peony extract include peony (Paeonia lactiflora Pallas (Paeonia albiflora Pallas var.trichocarpa Bunge)) and other closely related plants (Paeoniaceae).
  • It is an extract obtained by extracting the peony plant with the above-mentioned extraction solvent. As an example, it is obtained by extracting peony roots with water, propylene glycol, 1,3-butylene glycol or a mixture thereof.
  • Camellia japonica (Camellia japonica) is an evergreen tree of the Camellia genus Camellia and is a plant native to Japan. It grows naturally in Honshu, Shikoku, Kyushu, and the Nansei Islands, and also in the southern part of the Korean Peninsula and Taiwan.
  • the camellia seed extract is an extract obtained by extracting camellia seeds with the above-mentioned extraction solvent. As an example, it is obtained by extracting from camellia seed powder or dry powder with water, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, or a mixture thereof.
  • Rosa is a generic name for the genus Rosa in the Rosaceae family, and is a plant that grows widely in the temperate zone of the northern hemisphere.
  • roses there are various kinds of roses, and rose water is extracted from a rose of any kind by steam distillation.
  • Damascusena is suitable as a raw material for rose water because of its excellent aroma.
  • Rose water obtained from Bulgarian Damask rose is sometimes called Bulgarian rose water and is commercially available as a cosmetic material.
  • Florasan 90 is a type of sunflower oil and is marketed as a cosmetic material.
  • Sunflower (scientific name: Helianthus annuus) is an annual plant of the Asteraceae family and is native to North America. Sunflower seeds are rich in fats and oils, and sunflower oil can be obtained by squeezing oil. Sunflower oil differs in the type of unsaturated fatty acid contained depending on the variety, and particularly sunflower oil having a high oleic acid content is particularly preferable.
  • Mangosteen (scientific name: Garcinia mangostana) is a plant of the genus Asteraceae, genus Fukugi, which originates in Southeast Asia.
  • the mangosteen extract is an extract obtained by extracting mangosteen fruit ears, fruit skins, fruits, stems, leaves, branches, branches and leaves, stems, bark, rhizomes, root bark, roots, seeds or whole plants with the above-mentioned extraction solvent.
  • it is obtained by extracting mangosteen pericarp with water, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, or a mixed solution thereof.
  • Moringa is a plant belonging to the genus Wasabi, and grows naturally in the tropical and subtropical regions of Africa and South Asia. In particular, a lot of Wasabi tree (scientific name: Moringa oleifera Lam) is cultivated.
  • the moringa extract is an extract obtained by extracting from leaves, flowers, bark, fruits, seeds, and roots with the above-mentioned extraction solvent. As an example, it is obtained by extracting from leaves or roots of Japanese horseradish with water, propylene glycol, 1,3-butylene glycol or a mixture thereof.
  • Saxifraga stolonifera is a plant of the genus Yukinoshita, which is a perennial that grows naturally in Japan and China.
  • the Yukinoshita extract is an extract obtained by extracting the whole grass, leaves, stems, roots, flowers, and seeds with the above-mentioned extraction solvent. As an example, it is obtained by extracting from leaves of Yukinoshita with water, propylene glycol, 1,3-butylene glycol or a mixture thereof.
  • Another aspect of the present invention also relates to a method for evaluating resistance to skin inflammation using alternative autophagy activity as an index.
  • the resistance to skin inflammation can be evaluated by measuring the alternative autophagy activity in the skin sample of the subject.
  • a cosmetic depending on the evaluated resistance to skin inflammation. For example, for a subject evaluated to have low alternative autophagy activity, a hypoallergenic cosmetic that is less likely to cause skin inflammation can be promoted.
  • stronger sunscreen and cosmetics such as aftercare lotion may be recommended to subjects evaluated as having low alternative autophagy activity. Yes, and functional foods, cosmetics, and pharmaceuticals containing alternative autophagy inducers can be recommended.
  • Alternative autophagy activity can be determined using the expression or activity of factors contributing to alternative autophagy as an index.
  • factors contributing to alternative autophagy include Beclin1, Ulk1, and Rab9.
  • changes in gene / protein expression of these factors such as Beclin1, Ulk1, and Rab9 can be detected or visualized using a technique such as immunostaining. You may.
  • Rab9 which is considered not to be involved in conventional autophagy.
  • alternative autophagy activity may be detected in intracellular organs or substances involved in alternative autophagy, such as lysosomes, autophagosomes, or lysosomes or autophagosome-derived proteins.
  • aggregation of the lysosomal-derived proteins LAMP1 and LAMP2 in cells in which Atg5 and / or Atg7 is knocked down or knocked out may be visualized using a technique such as immunostaining.
  • siRNAs Small interfering RNAs
  • siRNAs Small interfering RNAs
  • NHEK cells 8.0 ⁇ 10 5 cells
  • Amaxa Human Keratinocyte Nucleofector Kit Lionza
  • the knockdown efficiency was confirmed from the mRNA expression levels of Atg5, Atg7 and Beclin1 using the RT-PCR method (FIGS. 2A, B and C).
  • the RT-PCR primers used were those from Sigma-Aldrich, and the expression level was standardized using GAPDH (Sigma-Aldrich) as an internal standard. The sequences of these primers are shown in Table 2.
  • NHEK cells treated with siRNA were seeded in a 6-well plate and cultured for 24 hours. After that, the medium was discarded, and the medium was replaced with PBS and irradiated with ultraviolet rays (290-315 nm) at an irradiation intensity of 15 mJ / cm 2 . After irradiation with ultraviolet rays, the medium was replaced again and the medium was cultured for 48 hours to obtain a culture supernatant. The concentration of IL-1 ⁇ in the obtained culture supernatant was evaluated using the Quantikine Human IL-1 ⁇ ELISA Kit (manufactured by R & D) (FIGS. 3A, B and C). Student's t-test was used for the statistically significant difference test.
  • Atg5 and Atg7 are considered to be essential proteins for Atg5 / Atg7-dependent autophagy
  • Beclin1 is considered to be an essential protein for autophagy including both Atg5 / Atg7-dependent autophagy and alternative autophagy pathways.
  • Normal 293T cells and Atg5-deficient 293T cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / well in DMEM + 10% FBS medium and cultured for 2 days. After culturing, the medium was replaced with a medium containing a test substance, and an autophagy monitor dye (Dojindo Kagaku) was added at a concentration of 1 ⁇ M to examine the autophagy activity. Of the 212 test substances, 20 test substances induced the same autophagy activity in both normal 293T cells and Atg5-deficient 293T cells.
  • autophagy activity in normal human epidermal keratinocyte (Hacat) cells was measured for 20 selected test substances.
  • the siRNA for Atg5 knockdown described above was treated to obtain Atg5 knockdown Hacat cells.
  • Normal Hacat cells and Atg5 knockdown Hacat cells were seeded in DMEM + 10% FBS medium at 1 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 2 days. After culturing, the medium was replaced with a medium containing a test substance, and an autophagy monitor dye (Dojindo Kagaku) was added at a concentration of 1 ⁇ M to examine the autophagy activity.
  • 10 types of test substances induced equivalent autophagy activity in both normal Hacat cells and Atg5 knockdown Hacat cells. This demonstrated that these 10 types of test substances were able to induce Atg-independent autophagy in epidermal keratinocytes.
  • test substances were measured for their ability to induce conventional autophagy activity and alternative autophagy (Atg5 / Atg7-independent autophagy) activity.
  • normal Hacat cells were cultured in a medium supplemented with the above-mentioned test substance, and immunostained with an anti-LC3-II antibody (Cosmo bio). Observation with a fluorescence microscope was performed, and changes in fluorescence intensity in the entire visual field were recorded as compared with the control group to which the test substance was not added. Since LC3-II serves as an index of conventional autophagy, the inducibility of conventional autophagy activity was determined when the fluorescence intensity was increased as compared with the control group to which the test substance was not added.
  • Atg5 knockdown Hacat cells were cultured in a medium to which the above-mentioned test substance was added, and immunostaining was performed using an anti-Lamp1 antibody (Abcam). Observation with a fluorescence microscope was performed, and changes in fluorescence intensity in the entire visual field were recorded as compared with the control group to which the test substance was not added. Since Lamp1 serves as an index of autophagy, the inducibility of Atg-independent autophagy activity was determined when the fluorescence intensity was increased as compared with the control group to which the test substance was not added. The results are shown in the table below.
  • test substance 29 was able to induce only alternative autophagy activity while not inducing conventional autophagy.

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Abstract

紫外線起因性炎症の抑制剤を提供することを課題とする。オルタナティブオートファジー（Ａｔｇ５/Ａｔｇ７非依存的オートファジー）が、紫外線起因性炎症の抑制に関与することを見出したことに基づいており、オルタナティブオートファジー誘導剤を提供することにより課題が解決される。

Description

オルタナティブオートファジー誘導剤を含む紫外線起因性炎症抑制剤
　本発明は、オルタナティブオートファジーを誘導する薬剤を有効成分として含む紫外線起因性炎症の抑制剤に関する。また、本発明はオルタナティブオートファジー誘導剤、及びオルタナティブオートファジー活性を指標とした、紫外線起因性炎症抑制剤のスクリーニング方法、及びヒト皮膚における紫外線起因性炎症に対する抵抗性の評価方法にも関する。
　細胞における細胞質成分（オルガネラ、細胞質タンパク質等）の分解・再生機構には、選択的なタンパク質分解を担うユビキチン・プロテアソーム系と、原則として非選択的でバルク分解系と称されるオートファジーによる機構が存在する。オートファジーは自食作用とも呼ばれ、二重膜（隔離膜）によって分解に供する細胞質成分を取り囲み、次いで隔離膜を閉鎖した上でリソソームと融合することにより、内容物である細胞質成分を分解することができる。オートファジーは、正常時の細胞の新陳代謝に寄与している他、ある種のストレスに晒された場合に細胞質内に過剰に作られたタンパク質や異常タンパク質を分解することに寄与しており、様々な生理機能を有することが判明している。例えば、オートファジーが関連するとされる疾患としては、癌、神経障害疾患（筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等）、肝炎（急性肝炎、慢性肝炎）、肝硬変、感染症、免疫異常等などが報告されており、オートファジー機能を調節することによりかかる疾患に対する治療効果を期待した医薬品、例えば、抗癌剤、抗痴呆薬及び神経変性疾患治療薬等の開発が進められている。
　オートファジーの分子機構についての研究が進むことで、３０余りのオートファジーに関する分子が同定されており、これらの分子の中で、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７、ＬＣ３等がオートファジーの実行に必須と考えられてきた。ＬＣ３は、細胞質で合成された後にＡｔｇ７等によりプロセッシングを受け、Ａｔｇ５等により構成される複合体を介して隔離膜に結合すると考えられている。しかしながら、近年の研究により、これらの分子を必要としないオートファジーの存在が報告されており（非特許文献１）、このようなオートファジーを、慣用型のＡｔｇ５／Ａｔｇ７依存的のオートファジー（単にＡｔｇ５依存的オートファジーと呼ぶこともある）と区別してオルタナティブオートファジー又はＡｔｇ５／Ａｔｇ７非依存的オートファジーと呼ばれている。オルタナティブオートファジーは、慣用型のＡｔｇ５／Ａｔｇ７依存的のオートファジーに関連するＵｌｋ１及びＢｅｃｌｉｎ１に加えて、オルタナティブオートファジーにのみ関与するＲａｂ９により制御される。オルタナティブオートファジーは細胞ストレスによって誘導されることから、この機構が破綻すると、癌などを誘発すると考えられており、オルタナティブオートファジーを利用する抗癌剤が開発されている（特許文献１）。また、Ａｔｇ５依存的オートファジー経路に関わるＡｔｇ５をノックアウトしたマウスを用いた研究により、Ａｔｇ５依存的オートファジー経路が、炎症疾患の一つであるアテローム動脈硬化症の発症を改善することが示されている。一方で、Ｂｅｃｌｉｎ１をヘテロ接合体欠損させた場合にはアテローム性動脈硬化症の発症に変化しないが、Ａｔｇ５のノックアウトでは炎症が促進されたことが報告されている（非特許文献２）。また、慣用型のオートファジーが、ケラチノサイトの炎症を抑制することが報告されている（非特許文献４）。非特許文献４では、Ａｔｇ５をノックダウンされたケラチノサイトにおいて、ＭＡＬＰ－２により炎症を誘導した場合に、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α及びＩＬ－６が対照（Ａｔｇ５非ノックダウン）に比較して大幅に増大したことを示している。このように、慣用型のオートファジーであるＡｔｇ５依存的オートファジーと炎症との関わりは一部明らかになってきているが、オルタナティブオートファジーと、炎症との関連については未だ明らかにされていなかった。
　一方で、紫外線は、紫外域の波長を有する電磁波であり、約３２０ｎｍより長い長波長域紫外線（ＵＶ－Ａ）と、約３２０～約２８０ｎｍの中波長域紫外線（ＵＶ－Ｂ）と、約２８０ｎｍより短い短波長域紫外線（ＵＶ－Ｃ）とに分類される。このうちＵＶ－Ｃはオゾン層に吸収されるので地上に達する太陽光には通常含まれず、地上に到達する紫外線の約９５％をＵＶ－Ａが占めており、約５％をＵＶ－Ｂが占めている。紫外線は、生体に対し、メラニン色素の産生、ＤＮＡの損傷、コラーゲンやエラスチンなどの真皮層における弾性線維の変性、活性酸素の産生など様々な悪影響を及ぼすことが知られており、美容面では、シミ、シワ、たるみ、肌の褐色化、皮膚老化など様々な悪影響を及ぼすことは周知である。紫外線障害は、主に急性障害と慢性障害に分けることができ、急性障害としては、日焼け（サンバーン、サンタン）、紫外線角膜炎、免疫機能の低下などが挙げられ、慢性障害としてシワ、シミ、皮膚癌、白内障などが挙げられる。紫外線により生じる炎症が、こうした急性障害や慢性障害の原因の一つとなっており、紫外線に起因する炎症を抑制することが、紫外線障害の予防及び治療に重要となっている。紫外線に起因する炎症メカニズムを解明することが求められており、そのようにして解明された紫外線に起因する炎症メカニズムに沿って炎症を抑制する物質の探索する方法が望まれている。
　上述したように、オルタナティブオートファジーは、近年新たに発見されたオートファジー経路であり、その生理機構への影響や、疾患への関与について研究が行われているところであるが、未だ十分な知見は得られていない。特に紫外線起因性の炎症との関連性は全く明らかにされていない。
国際公開第２０１３／１１８８４２号
Yuya Nishida, et al., Nature 461, 654-658 Babak Razani et al., Cell Metabolism 2012, 15(4), 534-544 Shaun Steele et al., PLOS Pathog 2013, vol.9, Issue 8, e1003562 Hye-Mi Lee et al., The Journal of Immunology (2011) 186(2), 1248-58
　本発明は従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、紫外線起因性炎症メカニズムの一端を解明すると共に、その紫外線起因性炎症の抑制剤を提供することを目的としている。
　本発明者らが、皮膚炎症メカニズムについて鋭意研究を行った結果、皮膚炎症の一因である紫外線により生じる炎症の軽減にＡｔｇ５／Ａｔｇ７非依存的オートファジーが選択的に寄与していることを初めて見出した。具体的に、皮膚培養細胞において、オートファジーを誘導することにより、紫外線により生じる皮膚炎症を軽減することができたことを見出した。この紫外線起因性の炎症とオートファジーとの関係についてさらに研究を進めたところ、オートファジーの代表的経路であるＡｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジーではなく、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７非依存的オートファジーによって、紫外線により生じる皮膚炎症を軽減できることを突き止め、本発明に至った。したがって、本発明は以下の発明に関する。
［１］　オルタナティブオートファジー誘導剤を有効成分とする紫外線起因性炎症の抑制剤。
［２］　前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目１に記載の抑制剤。
［３］　前記抑制剤が、皮膚外用剤である、項目２に記載の抑制剤。
［４］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１である項目１～３のいずれか一項に記載の抑制剤。
［５］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、項目１～３のいずれか一項に記載の抑制剤。
［６］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキスである、項目５に記載の抑制剤。
［７］　オルタナティブオートファジー活性を指標とした紫外線起因性炎症の抑制剤のスクリーニング方法。
［８］　オルタナティブオートファジー活性が、Ｒａｂ９の遺伝子発現量又はタンパク質量により測定される項目７に記載のスクリーニング方法。
［９］　慣用型オートファジー因子非発現株において、オートファジー活性を測定することによる、項目７に記載のスクリーニング方法。
［１０］　オートファジー活性の測定が、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、及びＲａｂ９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される項目９に記載の評価方法。
［１１］　オートファジー活性の測定が、オートファジー小胞の検出による、項目９に記載のスクリーニング方法。
［１２］　皮膚におけるオルタナティブオートファジー活性を指標とした、紫外線障害に対する抵抗性の評価方法。
［１３］　オルタナティブオートファジー活性が、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、及びＲａｂ９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される項目１２に記載の評価方法。
［１４］　オルタナティブオートファジー活性が、Ｒａｂ９の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される項目１３に記載の評価方法。
［１５］　前記紫外線障害が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目１２～１４のいずれか一項に記載の評価方法。
［１６］　オルタナティブオートファジー誘導剤の有効量を、紫外線起因性炎症を必要とする対象に投与することを含む、紫外線起因性炎症の抑制又は治療方法。
［１７］　前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目１６に記載の方法。
［１８］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が経皮投与される、項目１７に記載の方法。
［１９］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１である項目１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
［２０］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、項目１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
［２１］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキスである、項目２０に記載の方法。
［２２］　紫外線起因性炎症の抑制又は治療において使用するための、オルタナティブオートファジー誘導剤。
［２３］　前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目２２に記載のオルタナティブオートファジー誘導剤。
［２４］　皮膚外用で使用される、項目２３に記載のオルタナティブオートファジー誘導剤。
［２５］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１である、項目２２～２４のいずれか一項に記載のオルタナティブオートファジー誘導剤。
［２６］　前記オルタナティブオートファジーが、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、項目２２～２４のいずれか一項に記載のオルタナティブオートファジー誘導剤。
［２７］　オルタナティブオートファジーを誘導することを介して、紫外線起因性炎症の抑制又は治療において使用するための、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１のエキス。
［２８］　オルタナティブオートファジーを選択的に誘導することを介して、紫外線起因性炎症の抑制又は治療において使用するための、エンメイソウエキス。
［２９］　紫外線起因性炎症の治療又は抑制剤の製造のための、オルタナティブオートファジー誘導剤の使用。
［３０］　前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、項目２９に記載の使用。
［３１］　前記抑制剤が、皮膚外用剤である、項目３０に記載の使用。
［３２］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１を含む、項目２９～３１のいずれか一項に記載の使用。
［３３］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、項目２９～３１のいずれか一項に記載の使用。
［３４］　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキスである、項目３３に記載の使用。
　オートファジーの中で、特にオルタナティブオートファジーを誘導することで、紫外線起因性炎症を抑制することが可能となる。紫外線起因性炎症は、急性障害や慢性障害の原因の一つであり、紫外線起因性炎症を軽減することで、紫外線障害の軽減につながる。また、紫外線起因性炎症の軽減にオルタナティブオートファジーが関与することから、オルタナティブオートファジー活性を指標とすることで、紫外線起因性炎症の抑制剤のスクリーニングや、紫外線起因性炎症に対する抵抗性を評価することも可能になる。
図１Ａは、オートファジー阻害剤である３－ＭＡの添加により、紫外線誘導性のＩＬ－１β産生が増加することを示すグラフである。図１Ｂは、オートファジー誘導剤であるラパマイシンの添加により、紫外線誘導性のＩＬ－１β産生が抑制されることを示すグラフである。 図２Ａは、Ａｔｇ５に対するｓｉＲＮＡを細胞に導入することにより、Ａｔｇ５の発現が抑制されたことを示すグラフである。図２Ｂは、Ａｔｇ７に対するｓｉＲＮＡを細胞に導入することにより、Ａｔｇ７の発現が抑制されたことを示すグラフである。図２Ｃは、Ｂｅｃｌｉｎ１に対するｓｉＲＮＡを細胞に導入することにより、Ｂｅｃｌｉｎ１の発現が抑制されたことを示すグラフである。 図３Ａは、Ａｔｇ５に対するｓｉＲＮＡが導入された細胞において、紫外線誘導性のＩＬ－１β産生が変化しなかったことを示すグラフである。図３Ｂは、Ａｔｇ７に対するｓｉＲＮＡが導入された細胞において、紫外線誘導性のＩＬ－１β産生が変化しなかったことを示すグラフである。図３Ｃは、Ｂｅｃｌｉｎ１に対するｓｉＲＮＡが導入された細胞において、紫外線誘導性のＩＬ－１β産生が有意に増加したことを示すグラフである。
　本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤は、オルタナティブオートファジー誘導剤を含む。本発明において抑制される炎症は、紫外線により引き起こされる炎症であり、より好ましくは、紫外線起因性皮膚炎症である。
　炎症は、発赤、熱感、腫脹、及び疼痛 を特徴とする症候であり、微生物感染、異物侵入、重金属暴露、紫外線照射などの外的侵襲により引き起こされる他に、壊死細胞などから放出される内的刺激物質によっても引き起こされる。炎症は、生体のあらゆる組織において生じうる症候であり、組織に応じて、その原因や炎症機序は異なる。特に皮膚組織は、生体の外部に露出しており、外界と生体の境界をなすバリアとして働いている。皮膚のバリア機能が低下すると、様々な外的侵襲により経皮感作を招くことになり、それが皮膚炎やアレルギー疾患などの皮膚炎症の原因となることが分かってきている。皮膚バリアの形成には、角化細胞に発現しているフィラグリンが重要な役割を担っていることが知られている。フィラグリンの変異が炎症性疾患の一つであるアトピー性皮膚炎の発症にも関わっていることが報告されている。このように、皮膚炎症は、生体内における組織における炎症とは異なる特徴的なメカニズムを有している。本発明者らは、本発明のオルタナティブオートファジー経路が、炎症のなかでも特に紫外線起因性炎症において、抑制的に働くことを見出した（実施例、図１及び３）。その一方で、本発明者らは、組織炎症に寄与していると従来言われていたＡｔｇ５依存的オートファジー経路が紫外線起因性炎症には関与していないことも見出した（実施例、図３）。非特許文献４において、ＭＡＬＰ－２により誘導された皮膚炎症に対し、Ａｔｇ５依存的オートファジーが抑制的に作用することが示されていることから、紫外線起因性炎症においてＡｔｇ５依存的オートファジー経路が関与していないことは予測しうるものではない。皮膚炎症と、紫外線起因性炎症とは、最終的に炎症性サイトカインの産生を伴っているという点では共通するものの、その発生メカニズムが異なることは周知のことである。皮膚炎症と、紫外線起因性炎症とが、制御メカニズムについても異なっていることが本発明者らの実験により初めて示唆された。
　本発明において紫外線は、ＵＶ－Ａ、ＵＶ－Ｂ、及びＵＶ－Ｃのいずれを指してもよいが、地上に到達して皮膚に対して炎症を起こさせる観点から、特にＵＶ－Ａ及びＵＶ－Ｂを指すことが好ましい。ＵＶ－ＡもＵＶ－Ｂも炎症を引き起こすことが知られているが、炎症への寄与が高いＵＶ－Ｂのみを指してもよい。
　紫外線により引き起こされる炎症による症状としては、紅斑や水疱が挙げられ、重症化した場合には、湿疹を生じさせることがある。湿疹は、急性期に紅斑、丘疹、小水疱、膿疱、びらん、痂皮、落屑という形態的変化をとり、治癒するものの、急性湿疹が治癒せずに慢性化すると、苔癬化が生じ色素沈着が起こることもある。紫外線により引き起こされる炎症に起因する皮膚疾患としては、日光皮膚炎、光線口唇炎、光接触皮膚炎、慢性光線過敏性皮膚炎、ベルロック皮膚炎、光線過敏症、光線過敏性薬疹、日光蕁麻疹、色素性乾皮症、皮膚筋炎、ポルフィリン症、ペラグラ、慢性光線皮膚症、多形日光疹、エリテマトーデスなどの疾患が引き起こされる。また、紫外線は、目にも炎症を引き起こし、紫外線角膜炎が生じ、このような炎症に起因して、白内障も生じうる。したがって、本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤は、炎症に起因する上記の皮膚疾患及び眼疾患の治療、軽減、抑制、及び予防することができ、これらの皮膚疾患及び眼疾患の治療剤、軽減剤、抑制剤及び予防剤ということもできる。また、皮膚に生じた炎症は、メラノサイト刺激ホルモンの分泌を促進し、それにより皮膚の褐色化やシミの形成にも関与することや、慢性炎症により老化を助長することが知られている。したがって、本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤は、日焼け抑制剤、美白剤、皮膚老化剤ということもできる。
　本発明の紫外線起因性炎症抑制剤を使用する対象は、紫外線起因性炎症の低減を必要とする対象である。通常の健常人をはじめ、屋外で活動する運動選手や作業員、美容上又は健康上日焼けを避けることが必要とされる人、並びに上述の紫外線障害に伴う疾患を患っている患者に対し、本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤を投与することができる。また、オルタナティブオートファジー誘導剤は、オルタナティブオートファジー活性が低下している対象に対して投与される。
　本発明の紫外線起因性炎症の抑制剤は、紫外線照射によりケラチノサイトにて分泌が高まるＩＬ－１β、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦなどから選ばれる１又は複数の炎症性サイトカインや、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１０などのケモカインやＰＧＥ２などの炎症性メディエーターの産生を抑制することができる。したがって、紫外線起因性炎症の抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤は、炎症性サイトカイン抑制剤又は炎症性メディエーター抑制剤ということもできる。
　オルタナティブオートファジーとは、オートファジー関連分子Ａｔｇ５を用いることなく、オートファゴソームが形成され、さらにリソソームが融合することにより、該オートファゴソームに取り込まれた細胞内成分が分解される、細胞内浄化機構を意味する。したがって、オルタナティブオートファジーは、Ａｔｇ５及び／又はＡｔｇ７非依存的オートファジーということもできる。理論に限定されることを意図するものではないが、紫外線の影響で変性された異常タンパク質や誘発された炎症誘発物質をオルタナティブオートファジーの作用により分解することで、炎症の原因を取り除くものと考えられる。本明細書において、オルタナティブオートファジーと区別する観点から、従来型のオートファジー、すなわちＡｔｇ５及び／又はＡｔｇ７依存的オートファジーを、慣用型オートファジーと呼ぶものとする。
　オルタナティブオートファジー誘導剤とは、オルタナティブオートファジーの活性を亢進できる物質であれば任意の物質であってもよい。オルタナティブオートファジーを選択的に亢進できる物質が好ましいが、非選択的に他のオートファジーをも亢進する物質であってもよい。したがって、オルタナティブオートファジー誘導剤は、慣用型オートファジー誘導剤を含んでもよいし、別の態様では慣用型オートファジーの誘導剤を除いてもよい。オルタナティブオートファジー以外のオートファジー（例えば慣用型オートファジー）と、オルタナティブオートファジーをともに誘導可能な誘導剤をオルタナティブオートファジー非選択的誘導剤とよび、オルタナティブオートファジーを主に誘導する誘導剤をオルタナティブオートファジー選択的誘導剤とよぶことができる。オルタナティブオートファジー選択的誘導剤としては、特許文献１で示されるベンゾチオフェン化合物や、非特許文献３で示された野兎病菌（Francisella tularensis）が挙げられる。また、本発明のスクリーニング方法により、エンメイソウエキスも、オルタナティブオートファジー選択的誘導剤として作用する物質であることが示された。オルタナティブオートファジーの非選択的誘導剤としては、ラパマイシン、ベラパミル、クロニジンなどが挙げられる。本発明のスクリーニング方法により、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、ユキノシタエキスが、オルタナティブオートファジー非選択的誘導剤として作用する物質であることが示された。しかしながら、オートファジー誘導剤は、これらの具体的化合物や菌、エキスに限定されることを意図するものではない。
　本発明のオルタナティブオートファジー誘導剤又は当該誘導剤を含む紫外線起因性炎症の抑制剤は、紫外線起因性炎症を軽減する目的で、有効成分として機能性表示食品、化粧品や医薬品に配合することができる。配合される化粧品としては、日焼け止め、化粧水、美容液、美容クリーム、アフターケアローション、サンオイルなどが挙げられるが、皮膚に適用されるものであれば任意の化粧料に配合することができる。医薬品としては、抗炎症用の皮膚外用剤、抗炎症用の経口薬剤などが挙げられる。また、オルタナティブオートファジー誘導剤が、紫外線起因性炎症に有効であることを見出したことから、皮膚に直接適用することができる皮膚外用剤として配合されることが好ましい。また、オルタナティブオートファジー誘導剤を、紫外線障害軽減抑制の目的で使用する観点では、白内障などの予防のため点眼薬に配合することもできる。オルタナティブオートファジー誘導剤又は当該誘導剤を含む皮膚炎症の抑制剤は、その効果を損なわない範囲で、化粧品や医薬品等に用いられる任意配合成分を、必要に応じて適宜配合することができる。前記任意配合成分としては、例えば、油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤などが挙げられる。他の薬効成分として、例えば抗炎症成分、美白成分などが含まれていても良い。
　本発明はまた、オルタナティブオートファジー活性を指標とした紫外線起因性炎症抑制剤のスクリーニング方法にも関する。このスクリーニング方法は、培養細胞に対し、候補薬剤を添加する工程と、培養細胞においてオルタナティブオートファジー活性を測定する工程を含む。対照と比較してオルタナティブオートファジー活性が増加していた場合、候補薬剤を、紫外線起因性炎症抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤として選択することができる。使用される候補薬剤は、任意の物質であってよいが、例えば医薬品候補化合物ライブラリーや化粧品素材ライブラリーの物質を用いることができ、化合物のみならず、混合物や抽出物などを用いることもできる。
　使用される培養細胞としては、任意の細胞を用いることができ、株化細胞や、組織から分離され培養された初代培養細胞、継代培養細胞が用いられてもよい。紫外線の影響を評価する観点から、生体において紫外線の影響を受ける細胞、例えば皮膚細胞や眼細胞を用いることができる。皮膚細胞としては、例えば角化細胞、色素細胞や真皮線維芽細胞などであってもよいし、眼細胞としては、例えば角膜上皮細胞や網膜上皮細胞などであってもよい。また、皮膚培養細胞を重層培養した３次元培養皮膚モデルを用いることもできる。さらに別の態様では、スクリーニング方法に用いられる培養細胞として、慣用型オートファジー因子の少なくとも１つを発現しない、慣用型オートファジー因子非発現株を用いることができる。このような細胞株は、ポイントミューテーション、相同組換え、Ｃｒｙｓｐｅｒ－Ｃａｓ９システムなどのゲノム編集により作成された遺伝子ノックアウト細胞株であってもよいし、ｓｉＲＮＡを導入することで、遺伝子発現を抑制されたノックダウン細胞株であってもよい。慣用型オートファジー因子非発現株を用いることで、オルタナティブオートファジーに特異的ではなく、慣用型オートファジーも検出する指標を用いた場合にも、オルタナティブオートファジーの活性誘導剤をスクリーニングすることができる。一例として、Ｂｅｃｌｉｎ１やＵｌｋ１は、オルタナティブオートファジーと慣用型オートファジーの両方に関与することから、慣用型オートファジー因子非発現株においてこれらの遺伝子発現量又はタンパク質量をオートファジー活性の指標とすることで、オルタナティブオートファジーを誘導する薬剤のスクリーニングが可能になる。慣用型オートファジー因子非発現株としては、一例としてＡｔｇ５及び／又はＡｔｇ７遺伝子ノックアウト株、Ａｔｇ５及び／又はＡｔｇ７遺伝子ノックダウン株などが挙げられる。遺伝子発現量又はタンパク質量を指標とする代わりに、細胞内に存在するオートファジー小胞をオートファジー活性の指標とすることもできる。オートファジー小胞は、オートファゴソームとも呼ばれる。オートファゴソームは、顕微鏡下で観察することができ、一例としてＬＣなどをマーカーとして利用することで特定することができる。
　本発明のスクリーニング方法により、紫外線起因性炎症抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤として、化粧品素材ライブラリーのなかから、下記の植物エキス：エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、ユキノシタエキスを選択することができた。したがって、本発明の１の態様では、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１の植物エキスを含む、紫外線起因性炎症抑制剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤に関する。これらのエキスは、従来型のオートファジー誘導活性を有する場合もある。その一方で、エンメイソウエキスについては従来型オートファジー誘導活性を有しておらず、その一方で強いオルタナティブオートファジー誘導活性を示すことから、オルタナティブオートファジー選択的誘導剤ということができる。
　本発明で使用する各植物の植物体又はその抽出物は、各々の植物体の各種部位（花、花穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草など）をそのまま又は乾燥したものを粉砕して乾燥粉末としたもの、あるいはそのまま又は乾燥・粉砕後、溶媒で抽出したものである。抽出部位として、葉、根、茎、花が考えられるが、抽出部位はこれらに限定されない。
　エキスの場合、抽出に用いられる抽出溶媒は通常抽出に用いられる溶媒であれば何でもよく、特にメタノール、エタノールあるいは１，３－ブチレングリコール等のアルコール類、含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル等の有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができ、このうち特に、アルコール類、含水アルコール類が好ましく、特にメタノール、エタノール、１，３－ブチレングリコール、含水エタノールまたは含水１，３－ブチレングリコールが好ましい。また前記溶媒は、室温～溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。含水１，３－ブチレングリコールは、１，３－ブチレングリコールを、２０～８０質量％、好ましくは３０～７０質量％、さらに好ましくは４０～６０質量％含む。一例として、抽出溶媒として５０質量％の１，３－ブチレングリコール水溶液を使用することができる。
  抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から、常圧下での溶媒の沸点の範囲であれば良く、抽出後は濾過又はイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすれば良い。更に多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラム等を用いれば良く、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えば良い。本発明で用いられるエキスは全て化粧品素材として市販されており、その製法は販売元に応じて異なってもよい。
　エンメイソウ（学名：Isodon japonicus）は、シソ科ヤマハッカ属の日本原産の植物であり、本州、四国、九州に自生する。エンメイソウエキスは、エンメイソウの全草を上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、エンメイソウエキスは、生薬として市販されているエンメイソウの全草の乾燥物を、水、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール又は、これらの混液等により抽出することにより得ることができる。エンメイソウ（延命草）と呼ばれるように、日本では民間薬として利用されている。おもな薬効として保湿、血行促進、収れん、抗菌作用などが知られており、苦味健胃薬としても利用されている。
　オドリコソウ（学名：Lamium album Linne）は、シソ科の日本原産の植物であり、北海道、本州、四国、九州、朝鮮半島、及び中国など広い範囲に自生する。オドリコソウエキス (White Nettle Extract)は、オドリコソウの花、茎、又は葉から上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、オドリコソウの花、茎、葉から水、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。
　カラスムギは、イネ科カラスムギ属の植物であり、ヨーロッパから西アジアの地域が原産とされるが、広い地域で野生種と栽培種が存在している。野生種としてはカラスムギ（学名：Avena fatua）がよくみられる一方で、栽培種のエンバク（学名：Avena sativa）もエキスの原材料として使用されうる。カラスムギエキスは、茎、葉、種子、穀粒から上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、カラスムギの穀粒から水、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。
　シャクヤクはボタン科の多年草であり、アジア大陸北東部の原産とされている。シャクヤクエキスに用いられる種としては、シャクヤク（Paeonia  lactiflora  Pallas  (Paeonia  albiflora  Pallas  var.trichocarpa  Bunge))又はその他近縁植物(Paeoniaceae)が挙げあられる。シャクヤクの植物体から、上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、シャクヤクの根から水、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。
　ツバキ（学名：Camellia japonica）は、ツバキ科ツバキ属の常緑樹であり、日本原産の植物である。本州、四国、九州、南西諸島に自生し、また朝鮮半島南部と台湾にも自生する。ツバキ種子エキスは、ツバキの種子を上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、ツバキの種子の粉末又は乾燥粉末から水、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。
　バラは、バラ科バラ属の総称であり、北半球の温帯域に広く自生する植物である。バラには多様な種類が存在しており、任意の種のバラの花から水蒸気蒸留によりローズウォーターが抽出される。特にダマスクローズ（Rosa damascena）という品種は、その香りが優れていることからローズウォーターの原材料として適している。ブルガリア産のダマスクローズから得られたローズウォーターを特に、ブルガリアローズウォーターと呼ぶこともあり、化粧品素材として市販されている。
　フローラサン９０は、ひまわり油の一種であり、化粧品素材として市販されている。ひまわり（学名：Helianthus annuus）はキク科の一年草であり、北アメリカ原産である。ひまわりの種子は、油脂に富み、搾油することでひまわり油を得ることができる。ひまわり油は、品種により含まれる不飽和脂肪酸の種類が異なり、特にオレイン酸含有量の高いひまわり油が特に好ましい。
  マンゴスチン（学名：Garcinia mangostana）はオトギリソウ科フクギ属の植物であり、東南アジアを原産とする。マンゴスチンエキスは、マンゴスチンの果穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草を上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、マンゴスチンの果皮から水、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。
　モリンガは、ワサビノキ属に属する植物であり、アフリカから南アジアの熱帯から亜熱帯にかけて自生する。特にワサビノキ（学名：Moringa oleifera Lam）が多く栽培されている。モリンガエキスは、葉、花、樹皮、果実、種子、根から上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、ワサビノキの葉や根から水、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。
　ユキノシタ（Saxifraga stolonifera）は、ユキノシタ属の植物であり、日本、中国などに自生する多年草である。ユキノシタエキスは、全草、葉、茎、根、花、種子から上述の抽出溶媒により抽出して得られるエキスである。一例として、ユキノシタの葉から水、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール又はこれらの混液により抽出して得られる。
　本発明の別の態様では、オルタナティブオートファジー活性を指標とした皮膚炎症に対する抵抗性の評価方法にも関する。この方法によると、被験者の皮膚サンプルにおいて、オルタナティブオートファジー活性を測定することにより、皮膚炎症に対する抵抗性を評価することができる。評価された皮膚炎症に対する抵抗性に応じて、化粧料を選択することが可能である。例えば、オルタナティブオートファジー活性が低いと評価された被験者に対しては、皮膚炎症を生じさせにくい低刺激性の化粧料を進めることができる。また、皮膚炎症として紫外線起因性炎症に対する抵抗性に着目した場合、オルタナティブオートファジー活性が低いと評価された被験者に対してはより強力な日焼け止めや、アフターケアローションなどの化粧料を勧めることができるし、またオルタナティブオートファジー誘導剤を含む、機能性食品、化粧品、及び医薬品を勧めることができる。
　オルタナティブオートファジー活性は、オルタナティブオートファジーに寄与する因子の発現又は活性を指標に決定することができる。オルタナティブオートファジーに寄与する因子として、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、Ｒａｂ９などが挙げられ、例えばこれらＢｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、Ｒａｂ９などの因子の遺伝子・タンパク質発現の変化を検出したり、免疫染色などの手法を用いて可視化してもよい。オルタナティブオートファジーを特異的に測定する観点から、慣用型オートファジーには関与しないと考えられるＲａｂ９を用いることが好ましい。さらに別の態様では、オルタナティブオートファジー活性を、オルタナティブオートファジーに関与する細胞内器官又は物質、例えばリソソームや、オートファゴソーム、あるいはリソソーム又はオートファゴソーム由来タンパク質を検出してもよい。例えば、Ａｔｇ５及び／又はＡｔｇ７をノックダウンもしくはノックアウトした細胞でのリソソーム由来タンパク質ＬＡＭＰ１やＬＡＭＰ２の凝集を免疫染色などの手法を用いて可視化してもよい。
紫外線誘導性炎症に対するオートファジー阻害剤及び誘導剤の影響
　正常ヒト表皮角化細胞 (ＮＨＥＫ)（クラボウ社製）を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントになるまで表皮角化細胞増殖用培地（ＥｐｉＬｉｆｅ－ＫＧ２；GIBCO社製）で培養した。その後、オートファジー阻害剤として知られている３－メチルアデニン（３－ＭＡ）（Ｒ＆Ｄ社製；最終濃度１ｍＭ）を含んだ培地、及びオートファジー誘導剤として知られているラパマイシン（Enzo life science社製；最終濃度０．５μＭ）を含んだ培地にそれぞれ交換し、３時間培養した。培養後、培地を捨て、ＰＢＳを添加し、紫外線（２９０－３１５ ｎｍ）を２０ｍＪ／ｃｍ2の照射強度で照射した。紫外線照射後、３－ＭＡもしくはラパマイシンを含んだ上記培地条件下で再び培養を続け、４８時間後、それぞれの培養上清を得た。得られた培養上清中のＩＬ－１βの濃度をQuantikine Human IL-1β ELISA Kit (R&D 社製)を用いて評価した（図１Ａ及びＢ）。統計的有意差検定には、ステューデントもしくはウェルチのｔ検定を用いた。
　紫外線照射によりＩＬ－１βの濃度が増加することから、炎症が誘導されていることが示された。そしてオートファジー阻害剤である３－メチルアデニンを添加した場合、紫外線照射後のＩＬ－１βの濃度が約３倍に増加した。一方で、オートファジーの誘導剤として知られているラパマイシンを添加した場合、紫外線照射後のＩＬ－１βが有意に低下した。これらの結果から、オートファジーを誘導することで、紫外線誘導性の炎症を軽減できることが示された。
紫外線誘導性炎症の軽減に寄与するオートファジーの種類の特定
　Ａｔｇ５、Ａｔｇ７およびＢｅｃｌｉｎ１に対するsmall interfering RNA (ｓｉＲＮＡ)をInvitrogen社から購入した。それぞれの配列は表１の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＮＨＥＫ細胞(８．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ)にAmaxa Human Keratinocyte Nucleofector Kit (Lonza社製)を用いて、ｓｉＲＮＡの最終濃度が２００ｎＭになるようにトランスフェクションした。ノックダウン効率は、ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７およびＢｅｃｌｉｎ１のｍＲＮＡ発現量より確認した（図２Ａ、ＢおよびＣ）。使用したＲＴ－ＰＣＲのプライマーは、Sigma-Aldrich社製のプライマーを用い、また、内部標準としてＧＡＰＤＨ（Sigma-Aldrich社製）を使用して発現量を標準化した。これらのプライマーの配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｓｉＲＮＡ処置したＮＨＥＫ細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。その後、培地を捨て、ＰＢＳに置換し、紫外線（２９０－３１５ ｎｍ）を１５ｍＪ／ｃｍ2の照射強度で照射した。紫外線照射後、培地に再置換して４８時間培養し、培養上清を得た。得られた培養上清中のＩＬ－１βの濃度をQuantikine Human IL-1β ELISA Kit（Ｒ＆Ｄ　社製）を用いて評価した（図３Ａ、ＢおよびＣ）。統計的有意差検定には、ステューデントのｔ検定を用いた。
　Ａｔｇ５、Ａｔｇ７およびＢｅｃｌｉｎ１に対するｓｉＲＮＡを用いることで、これらの遺伝子発現を抑制することができることが示された（図２Ａ、ＢおよびＣ）。Ａｔｇ５、Ａｔｇ７は、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジーに必須のタンパク質と考えられており、Ｂｅｃｌｉｎ１は、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジー及びオルタナティブオートファジーの両経路を含めたオートファジーに必須のタンパク質と考えられている。したがって、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７の遺伝子発現をそれぞれ抑制された細胞では、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジーのみが働いていない一方で、Ｂｅｃｌｉｎ１の遺伝子発現を抑制された細胞では、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジー及びオルタナティブオートファジーを含めたオートファジー経路自体が働いていないと考えられる。
　Ａｔｇ５およびＡｔｇ７の発現を抑制された角化細胞では、紫外線を照射後のＩＬ－１βの濃度に変化がなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。一方で、Ｂｅｃｌｉｎ１の発現を抑制された角化細胞では、紫外線照射後にＩＬ－１βの濃度が有意に増加した（図３Ｃ）。これにより、紫外線により生じる炎症の軽減には、Ａｔｇ５／Ａｔｇ７依存的オートファジーは何ら関与していない一方で、紫外線により生じる炎症の軽減に、オルタナティブオートファジーが寄与していることが示された。
オルタナティブオートファジー誘導剤のスクリーニング方法
　正常２９３Ｔ細胞及びＡｔｇ５欠損２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に、１ｘ１０4細胞／ウェルで播種し、２日間培養した。培養後、培地を、被験物質を含有する培地に置換し、オートファジーモニター色素（同仁化学）を１μＭ濃度で添加し、オートファジーの活性を調べた。２１２種類の被験物質のうち、２０種類の被験物質が、正常２９３Ｔ細胞とＡｔｇ５欠損２９３Ｔ細胞のいずれにおいても同等のオートファジー活性を誘導した。
　続いて、選択された２０の被験物質について、正常ヒト表皮角化細胞（Ｈａｃａｔ）細胞におけるオートファジー活性を測定した。上述のＡｔｇ５ノックダウン用のｓｉＲＮＡを処置して、Ａｔｇ５ノックダウンＨａｃａｔ細胞を取得した。正常Ｈａｃａｔ細胞と、Ａｔｇ５ノックダウンＨａｃａｔ細胞をそれぞれＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に、１×１０4細胞／ウェルで播種し、２日間培養した。培養後、培地を、被験物質を含有する培地に置換し、オートファジーモニター色素（同仁化学）を１μＭ濃度で添加し、オートファジーの活性を調べた。２０種類の被験物質のうち、１０種類の被験物質が正常Ｈａｃａｔ細胞とＡｔｇ５ノックダウンＨａｃａｔ細胞のいずれにおいても同等のオートファジー活性を誘導した。これにより、かかる１０種類の被験物質が、Ａｔｇ非依存的オートファジーを、表皮角化細胞において誘導することができることが示された。
　選択された１０種類の被験物質について、従来型オートファジー活性及びオルタナティブオートファジー（Ａｔｇ５／Ａｔｇ７非依存的オートファジー）活性の誘導能について測定した。具体的に、正常Ｈａｃａｔ細胞を、上記被験物質を添加した培地で培養し、抗ＬＣ３－ＩＩ抗体（Ｃｏｓｍｏ ｂｉｏ）を用いて免疫染色を行った。蛍光顕微鏡で観察し、被験物質非添加の対照群と比較して、全視野における蛍光輝度の変化を記録した。ＬＣ３－ＩＩは、従来型のオートファジーの指標となることから、被験物質非添加の対照群と比較して、蛍光輝度が増加した場合に、従来型オートファジー活性の誘導能を決定した。続いて、Ａｔｇ５ノックダウンＨａｃａｔ細胞を、上記被験物質を添加した培地で培養し、抗Ｌａｍｐ１抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて免疫染色を行った。蛍光顕微鏡で観察し、被験物質非添加の対照群と比較して、全視野における蛍光輝度の変化を記録した。Ｌａｍｐ１は、のオートファジーの指標となることから、被験物質非添加の対照群と比較して、蛍光輝度が増加した場合に、Ａｔｇ非依存的オートファジー活性の誘導能を決定した。結果を下記の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　２９：エンメイソウエキス、４５：オドリコソウエキス、６２：カラスムギ抽出液、９５：シャクヤクエキスＢＧ、１２９：ツバキ種子エキスＢＧ、１５６：ブルガリアローズウォーター、１５７：フローラサン９０、１７４：マンゴスチンエキスＢＧ、１７９：モリンガエキスＧ、１８３：ユキノシタエキスＢＧ
　被験物質番号２９、３４、１２９、及び１５６において、強いオルタナティブオートファジー誘導活性がみられた。また、被験物質２９は、従来型オートファジーを誘導しない一方で、オルタナティブオートファジー活性のみを誘導することができた。

Claims (15)

  1. 　オルタナティブオートファジー誘導剤を有効成分とする、紫外線起因性炎症の抑制剤。
  2. 　前記紫外線起因性炎症が、紫外線起因性皮膚炎症である、請求項１に記載の抑制剤。
  3. 　前記抑制剤が、皮膚外用剤である、請求項２に記載の抑制剤。
  4. 　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキス、オドリコソウエキス、カラスムギ抽出液、シャクヤクエキス、ツバキ種子エキス、ブルガリアローズウォーター、ひまわり油、マンゴスチンエキス、モリンガエキス、及びユキノシタエキスからなる群から選ばれる少なくとも１である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抑制剤。
  5. 　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、オルタナティブオートファジー選択的に誘導することができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抑制剤。
  6. 　前記オルタナティブオートファジー誘導剤が、エンメイソウエキスである、請求項５に記載の抑制剤。
  7. 　オルタナティブオートファジー活性を指標とした紫外線起因性炎症の抑制剤のスクリーニング方法。
  8. 　オルタナティブオートファジー活性が、Ｒａｂ９の遺伝子発現量又はタンパク質量により測定される請求項７に記載のスクリーニング方法。
  9. 　慣用型オートファジー因子非発現株において、オートファジー活性を測定することによる、請求項７に記載のスクリーニング方法。
  10. 　オートファジー活性の測定が、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、及びＲａｂ９なる群から選ばれる１以上の遺伝子発現量又はタンパク質量により測定される、請求項９に記載のスクリーニング方法。
  11. 　オートファジー活性の測定が、オートファジー小胞の検出による、請求項９に記載のスクリーニング方法。
  12. 　皮膚におけるオルタナティブオートファジー活性を指標とした、紫外線障害に対する抵抗性の評価方法。
  13. 　オルタナティブオートファジー活性が、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｕｌｋ１、及びＲａｂ９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される請求項１２に記載の評価方法。
  14. 　オルタナティブオートファジー活性が、Ｒａｂ９の遺伝子発現又はタンパク質量により測定される請求項１３に記載の評価方法。
  15. 　前記紫外線障害が、紫外線起因性皮膚炎症である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の評価方法。
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