EA027987B1 - Оксазолидин-2-онпиримидиновые производные - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к оксазолидин-2-оновым замещенным пиримидиновым соединениям формулы (I)и/или их фармацевтически приемлемым солям, где Rи Rтакие, как указано в формуле изобретения, которые действуют в качестве ингибиторов PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназы), а также их фармацевтическим композициям, способам их получения и применению в лечении состояний, заболеваний и расстройств, зависящих от PI3K.

Description

Изобретение относится к оксазолидин-2-оновым замещенным пиримидиновым соединениям, которые действуют как ингибиторы ΡΣ3Κ (фосфатидилинозитол-3-киназы), а также их фармацевтическим композициям, способам их получения и применению в лечении состояний, заболеваний и расстройств, зависящих от ΡΙ3 киназ.

Уровень техники изобретения

Суперсемейство фосфатидилинозитол-3-киназ включает 4 различных родственных ΡΙ3Κ липидных или протеинкиназ. Классы I, II и III представляют собой липидные киназы, которые отличаются по их субстратной специфичности, тогда как ΡΕ3Κ класса IV, также называемые родственными РВ-киназе протеинкиназы (ΡΓΚΚ), представляют собой протеинкиназы. ΡΕ3Κ класса I включают семейство липидных киназ, которые катализируют перенос фосфата в И-3'-положение инозитоллипидов, давая фосфоинозитол-3-фосфат (ΡΓΡ), фосфоинозитол-3,4-дифосфат (Ρ№₂) и фосфоинозитол-3,4,5-трифосфат (ΡΓΡ₃), которые, в свою очередь, действуют как вторичные мессенджеры в сигнальных каскадах стыковкой с белками, содержащими плекстриновую гомологию, ΡΥνΕ, ΡΙιοχ и другие связывающие фосфолипиды домены, в ряде сигнальных комплексов, часто в плазматической мембране (АапЬаекеЬгоеск с1 а1., Аппи. Кеу. ВюсЬет. 70:535 (2001)). Нарушенная регуляция ΡΕ3Κ. которая часто улучшает выживаемость и пролиферацию за счет активации АКТ киназы, представляет собой одно из самых распространенных событий при человеческом раке и показано, что она возникает на множестве уровней (Ыи е1 а1., ΝαΙ. Кеу. Эгид И15соу. 8:627-644 (2009)). Например, соматические миссенс-мутации в ΡIΚ3СА, которые активируют последующие сигнальные пути, описаны при значительных частотах для широкого разнообразия раковых заболеваний человека (Ниапд е1 а1., 8с1епсе 318: 1744-1748 (2007), 2Ьао & νο§1, Опсодепе 27:54865496 (2008)). Ген-супрессор опухолевого роста ΡΤΕΝ, который дефосфорилирует фосфоинозитиды в 3'-положении инозитольного кольца и, таким образом, вызывает антагонизм активности ΡΟΚ, функционально мутирован или делетирован при ряде опухолей (1<ешгу & Ρа^8οη8, Опсодепе 27:5477-5485 (2008)). Некоторые исследования показывают, что неспособность экспрессировать ΡΤΕΝ может содействовать сдвигу сигнальной зависимости с ΡΟΚα к β-изоформе (Аее е1 а1., Ρο^е Ν;·ιΟ. Асай. 8сТ И8А 105:1305713062 (2008)). Следовательно, ингибирование и ΡΟΚα и β-изоформ I класса может быть особенно полезным при раковых заболеваниях, которые лишены ΡΤΕΝ фосфатазы.

Опубликованная международная патентная заявка АО 2007/084786 описывает замещенные пиримидиновые молекулы, которые ингибируют ΡΕ3Κ.

Точно установлено, что активация Ак1 приводит в результате к стимуляции киназной активности мишени рапамицина в клетках (тТОК). тТОК представляет собой протеинкиназу и член ΡΕ3Κ IV класса. В клетках млекопитающих, тТОК обнаруживают в двух отличных белковых комплексах, называемых тТОКС1 и тТОКС2. Активация тТОКС1 зависит от активных ΡΕ3Κ и Ак! киназ. Регуляция тТОКС2 активации является более сложной. тТОКС2 отвечает за усиление киназной активности Ак! за счет фосфорилирования серинового остатка 473 (8атЬаккоу е! а1., 8аепсе 307:1098-1101 (2005), Вауаксак & А1е881, Мо1 Се11 18(2):143-145 (2005)). Каталитическое ингибирование изоформ ΡΕ3Κ I класса, одновременно с ингибированием тТОК может, следовательно, давать дополнительную пользу, потенциально оказывая более сильный эффект на ΡΠΚ-Ак! путь.

Плоскоклеточный рак кожи (8СС) представляет собой второй самый частый тип рака кожи человека, которому обычно предшествует актинический кератоз (АК). Патогенез АИ и кожного 8СС связан с постоянным воздействием УФ в качестве одного из основных факторов риска (8а1аксЬе, Г Ат. Асай. ЭегтаЮк 42: 4-7 (2000)). Повышенную активность ΡI3Κ/Ак!/тΤОК пути рассматривали в предыдущем исследовании (СЬеп е! а1., Вг. Г Иегта!о1.; 160 (2):442-445 (2009)). Было показано, что длительное облучение УФ-В вызывает снижение ΡΓΕΝ экспрессии на уровне мРНК и белка в кератиноцитах человека ш уйго, способствуя их выживаемости и росту (Мшд е! а1., Опсодепе; 29(4):492-502 (2010)). На основе недавней литературы имеется причинная связь между постоянным УФ-облучением и снижением ΡΒΕΝ (Иапйо е! а1., Сапсег Се11; 20(5):635-648 (2011)). Следовательно, все кожные 8СС и АК и постоянные повреждения кожи, вызванные солнечными лучами, связаны с недостатком ΡΒΕΝ экспрессии, приводя в результате к активации ΡI3Κ/Ак!/тΤОК сигнального пути.

- 1 027987

Сущность изобретения

Изобретение относится к оксазолидин-2-оновым замещенным пиримидиновым соединениям формулы (I) и/или их фармацевтически приемлемым солям:

где К¹ представляет собой метил, этил или гидроксиметил;

К² представляет собой фенил, который является незамещенным или замещенным в мета- и/или пара-положениях 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из метокси для мета-положения и из С₁-С₅-алкокси, гидрокси-С₂-С₄-алкокси или С₁-С₂-алкокси-С₂-С₄-алкокси для пара-положения, или пиридил, или

5-членный моноциклический гетероарил, содержащий 2-3 гетероатома, выбранные из Ν, О или 8.

Если не указано иначе, термин соединения настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I) и ее подформул, солям соединения, а также всем стереоизомерам (включая диастереоизомеры и энантиомеры).

Соединения формулы (I) считают подходящими для применения в лечении заболеваний, зависящих от ΡΙ3 киназ. Соединения формулы (I) считают подходящими, например, для применения в лечении заболеваний, зависящих от ΡΒ киназы I класса или зависящих от ΡΒ киназы I класса и тТОК.

Подробное описание изобретения

Изобретение можно более полно понять, ссылаясь на следующее описание, включая следующий словарь терминов и заключительные примеры. Как применяют в настоящем изобретении, термины включающий, содержащий и состоящий применяют в настоящем изобретении в их открытом, неограничивающем смысле.

Общие термины, применяемые в настоящем изобретении выше и ниже, предпочтительно имеют в контексте настоящего описания следующие значения, если не указано иначе.

Как применяют в настоящем изобретении, термин алкокси относится к полностью насыщенной разветвленной, содержащей одно или несколько разветвлений, или неразветвленной углеводородной группе, присоединенной к остатку молекулы через -О- линкерную группу. Если не указано иначе, алкокси относится к группам, содержащим 1-16 атомов углерода, 1-10 атомов углерода, 1-7 атомов углерода или 1-4 атома углерода. Примеры алкокси включают, но не ограничиваются, метокси, этокси, нпропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, изобутокси, трет-бутокси, н-пентокси, изопентокси, неопентокси, н-гексилокси.

Как применяют в настоящем изобретении, термин пиридил относится к 2-пиридилу, 3-пиридилу или 4-пиридилу. Заместители в мета- и пара-положении присоединены к атому углерода пиридила. Репрезентативный пример представляет собой 3-пиридил.

Как применяют в настоящем изобретении, заместители в 5-членном моноциклическом гетероариле, содержащем 2-3 гетероатома, выбранные из Ν, О или 8, присоединены к атому углерода гетероарила. Примеры 5-членного моноциклического гетероарила, содержащего 2-3 гетероатома, выбранные из Ν, О или 8, включают, но не ограничиваются, тиазолил, оксазолил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил и 1,3,4-тиадиазолил. Репрезентативный пример представляет собой тиазолил.

Различные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем изобретении. Ясно, что признаки, указанные в каждом варианте осуществления, можно комбинировать с другими указанными признаками, получая дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения.

- 2 027987

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) и/или его фармацевтически приемлемой соли, выбранному из соединения формулы (ГЬ)

где К¹ и К² такие же, как определено для соединения формулы (I) выше.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (ГЬ), и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К² представляет собой фенил, который является незамещенным или замещенным в мета- и/или пара-положениях 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из метокси для мета-положения и из С₁-С₅-алкокси, гидрокси-С₂-С₄-алкокси или С₁-С₂-алкокси-С₂-С₄-алкокси для пара-положения.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (ГЬ) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К² представляет собой пиридил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (ТЬ) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К² представляет собой 5-членный моноциклический гетероарил, содержащий 2-3 гетероатома, выбранные из Ν, О или 8.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (ХЬ) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К² представляет собой фенил, 3-метоксифенил, 4-метоксифенил, 4-(3-гидроксипропокси)фенил, 4(2-гидроксиэтокси)фенил или 4-(2-метоксиэтокси)фенил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (ВЬ) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К² представляет собой 3-пиридил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или ^Ь) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К² представляет собой 2-тиазолил.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (Σό) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой метил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (ΖΕ) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой этил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или ^Ь) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой гидроксиметил.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или ^Ь) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой метил;

К² представляет собой фенил, который является незамещенным или замещенным в мета- и/или пара-положениях 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из метокси для мета-положения и из С1С₅-алкокси, гидрокси-С₂-С₄-алкокси или С₁-С₂-алкокси-С₂-С₄-алкокси для пара-положения.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или ^Ь) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой метил;

К² представляет собой пиридил, который является незамещенным или замещенным в мета- и/или пара-положениях 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из метокси для мета-положения и из С₁-С₅-алкокси, гидрокси-С₂-С₄-алкокси или С₁-С₂-алкокси-С₂-С₄-алкокси для пара-положения.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (!Ь), и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой метил;

К² представляет собой 5-членный моноциклический гетероарил, содержащий 2-3 гетероатома, выбранные из Ν, О или 8.

- 3 027987

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (1Ь) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой метил;

К² представляет собой фенил, 3-метоксифенил, 4-метоксифенил, 4-(3-гидроксипропокси)фенил, 4-(2-гидроксиэтокси)фенил или 4-(2-метоксиэтокси)фенил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (1Ь) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой метил;

К² представляет собой 3 -пиридил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (1Ь), и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой метил;

К² представляет собой 2-тиазолил.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (1Ь), и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой этил;

К² представляет собой фенил, который является незамещенным или замещенным в мета- и/или пара-положениях 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из метокси для мета-положения и из метокси, С₁-С₅-алкокси, гидрокси-С₂-С₄-алкокси или С₁-С₂-алкокси-С₂-С₄-алкокси для пара-положения.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (ГЬ) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой этил;

К² представляет собой пиридил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (Ш) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой этил;

К² представляет собой 5-членный моноциклический гетероарил, содержащий 2-3 гетероатома, выбранные из Ν, О или 8.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (Ш), и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой этил;

К² представляет собой фенил, 3-метоксифенил, 4-метоксифенил, 4-(3-гидроксипропокси)фенил, 4-(2-гидроксиэтокси)фенил или 4-(2-метоксиэтокси)фенил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (Ш) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой этил;

К² представляет собой 3-пиридил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (Ш) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой этил;

К² представляет собой 2-тиазолил.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (Ш) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой гидроксиметил;

К² представляет собой фенил, который является незамещенным или замещенным в мета- и/или пара-положениях 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из метокси для мета-положения и из С₁-С₅-алкокси, гидрокси-С₂-С₄-алкокси или С₁-С₂-алкокси-С₂-С₄-алкокси для пара-положения.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (Ш) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой гидроксиметил;

К² представляет собой фенил, 3-метоксифенил, 4-метоксифенил, 4-(3-гидроксипропокси)фенил, 4-(2-гидроксиэтокси)фенил или 4-(2-метоксиэтокси)фенил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (Ш) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой гидроксиметил;

К² представляет собой 3-пиридил.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению формул (I) или (Ш) и/или его фармацевтически приемлемой соли, где

К¹ представляет собой гидроксиметил;

К² представляет собой 2-тиазолил.

- 4 027987

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению и/или его фармацевтически приемлемой соли, выбранному из

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2она,

3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-6-ил)-4-ЭТИЛ-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она,

3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-6-ил)-4-(гидроксиметил)-5-(4метоксифенил)оксазолидин-2-она,

3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-6-ил)-4-этил-5-фенилоксазолидин-2-она,

3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-6-ил)-4-метил-5-фенилоксазолидин-2-она,

3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-6-ил)-4-ЭТИЛ-5-(3-метоксифенил)оксазолидин-2-она,

3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-6-ил)-4-ЭТИЛ-5-(тиазол-2-ил)оксазолидин-2-она,

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-этил-5-пиридин-3-илоксазолидин-2она,

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метил-5-пиридин-3-илоксазолидин-2она,

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-фенилоксазолидин-2она,

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2она,

3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-6-ил)-4-(гидроксиметил)-5-(4-(2метоксиэтокси)фенил)оксазолидин-2-она,

3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-6-ил)-5-(4-(2-гидроксиэтокси)фенил)-4(гидроксиметил)оксазолидин-2-она или

3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-6-ил)-4-(гидроксиметил)-5-(4-(3гидроксипропокси)фенил)оксазолидин-2-она.

- 5 027987

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению, и/или его фармацевтически приемлемой соли, выбранному из (45,5К)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-б-ил)-4-метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2она, (45*,55*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-б-ил)-4-ЭТИЛ-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она, (45.55) -3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-б-ил)-4-(гидроксиметил)-5-(4метоксифенил)оксазолидин-2-она, (45*,5К*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-б-ил)-4-этил-5-фенилоксазолидин-2-она, (43.55) —3—(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-б-ил)-4-метил-5-фенилоксазолидин-2-она, (4К*,5К*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-б-ил)-4-ЭТИЛ-5-(3-метоксифенил)оксазолидин-2-она, (45,5К)-3-(2 '-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-б-ил)-4-ЭТИЛ-5-(тиазол-2-ил)оксазолидин-2-она,

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-б-ил)-4-этил-5-пиридин-3-илоксазолидин-2она,

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-б-ил)-4-метил-5-пиридин-3-илоксазолидин-2она, (45.55) -3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-б-ил)-4-гидроксиметил-5-фенилоксазолидин-2она, (45.55) —3—(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-б-ил)-4-метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2она, (45.55) —3—(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-б-ил)-4-(гидроксиметил)-5-(4-(2метоксиэтокси)фенил)оксазолидин-2-она, (45.55) -3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-б-ил)-5-(4-(2-гидроксиэтокси)фенил)-4(гидроксиметил)оксазолидин-2-она или (45,55)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'бипиримидин]-б-ил)-4-(гидроксиметил)-5-(4-(3гидроксипропокси)фенил)оксазолидин-2-она.

Конкретные варианты осуществления обеспечивают конкретными примерными соединениями, описанными в настоящем изобретении.

Как применяют в настоящем изобретении, термин оптический изомер или стереоизомер относится к любому из различных стереоизомерных конфигураций, которые могут существовать для указанного соединения настоящего изобретения, и они включают геометрические изомеры. Ясно, что заместитель может быть присоединен к хиральному центру атома углерода. Термин хиральный относится к молекулам, которые обладают свойством неналожимости на партнера, являющегося их зеркальным отображением, тогда как термин ахиральный относится к молекулам, которые являются наложимыми на партнера, являющегося их зеркальным отображением. Следовательно, настоящее изобретение включает энантиомеры, диастереомеры или рацематы соединения. Энантиомеры представляют собой пару стереоизомеров, которые являются неналожимыми зеркальными отображениями друг друга. Смесь 1:1 пары энантиомеров представляет собой рацемическую смесь. Термин применяют для обозначения рацемической смеси, при необходимости.

- 6 027987

Диастереоизомеры представляют собой стереоизомеры, которые содержат по меньшей мере два асимметрических атома, но которые не являются зеркальными отображениями друг друга. Абсолютная стереохимия указана согласно К-8-системе Кана-Ингольда-Прелога. Когда соединение представляет собой чистый энантиомер, стереохимию при каждом хиральном центре можно указать или как К, или как 8. Выделенные соединения, чья абсолютная конфигурация является неизвестной, можно обозначить (+) или (-), в зависимости от направления (право- или левовращающее), в котором они вращают плоскополяризованный свет при длине волны линии Ό натрия. Определенные соединения, описанные в настоящем изобретении, содержат один или более асимметрических центров или осей и могут, таким образом, давать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные формы, которые можно определить в терминах абсолютной стереохимии как (К)- или (8)-.

В зависимости от выбора исходных соединений и способов соединения могут присутствовать в виде одного из возможных изомеров или в виде их смесей, например в виде чистых оптических изомеров или в виде изомерных смесей, таких как рацематы и диастереоизомерные смеси, в зависимости от количества асимметрических атомов углерода. Предполагается, что настоящее изобретение включает все данные возможные изомеры, включая рацемические смеси, диастереомерные смеси и оптически чистые формы. Оптически активные (К)- и (8)-изомеры можно получить, применяя хиральные синтоны или хиральные реагенты, или разделять, применяя общепринятые способы. Если соединение содержит двойную связь, заместитель может иметь Е- или Ζ-конфигурацию. Если соединение содержит дизамещенный циклоаклил, циклоалкильный заместитель может иметь цис- или транс-конфигурацию. Все таутомерные формы также предполагаются включенными.

Как применяют в настоящем изобретении, термины соль или соли относится к соли присоединения кислоты или основания соединения настоящего изобретения. Соли включают, в частности, фармацевтически приемлемые соли. Термин фармацевтически приемлемые соли относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений настоящего изобретения и которые обычно не являются биологически или иначе нежелательными. Во многих случаях соединения настоящего изобретения способны образовывать кислые и/или основные соли за счет наличия аминои/или карбоксильной групп или аналогичных им групп.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты можно получить с неорганическими и органическими кислотами, например ацетатную, аспартатную, бензоатную, безилатную, бромидную/гидробромидную, бикарбонатную/карбонатную, бисульфатную/сульфатную, камфорсульфонатную, хлоридную/гидрохлоридную, хлортеофиллонатную, цитратную, этандисульфонатную, фумаратную, глюцептатную, глюконатную, глюкуронатную, гиппуратную, гидроиодидную/иодидную, изотионатную, лактатную, лактобионатную, лаурилсульфатную, малатную, малеатную, малонатную, манделатную, мезилатную, метилсульфатную, нафтоатную, напсилатную, никотинатную, нитратную, октадеканоатную, олеатную, оксалатную, пальмитатную, памоатную, фосфатную/гидрофосфатную/дигидрофосфатную, полигалактуронатную, пропионатную, стеаратную, сукцинатную, сульфосалицилата, тартратную, тозилатную и трифторацетаную соли.

Неорганические кислоты, из которых можно получить соли, включают, например, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные.

Органические кислоты, из которых можно получить соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, сульфосалициловую кислоту и подобные. Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания можно получить с неорганическими и органическими основаниями.

Неорганические основания, из которых можно получить соли, включают, например, аммониевые соли и соли металлов из групп Ι-ΧΙΙ Периодической таблицы. В некоторых вариантах осуществления соли получают из натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, серебра, цинка и меди; в частности подходящие соли включают соли аммония, калия, натрия, кальция и магния.

Органические основания, из которых можно получить соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, включая природные замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы и подобные. Некоторые органические амины включают изопропиламин, бензатин, холинат, диэтаноламин, диэтиламин, лизин, пиперазин, меглумин и трометамин.

Фармацевтически приемлемые соли настоящего изобретения можно получить из основной или кислой группы общепринятыми химическими способами. Обычно данные соли можно получить реакцией свободных кислых форм данных соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания (такого как гидроксид, карбонат, бикарбонат Ыа, Са, Мд или К или подобные), или реакцией свободных основных форм данных соединений со стехиометрическим количеством подходящей кислоты. Данные реакции обычно проводят в воде или в органическом растворителе, или в смеси двух. Обычно применение неводной среды, подобной эфиру, этилацетату, этанолу, изопропанолу или ацетонитрилу, является желательным, при наличии возможности. Список дополнительных подходящих солей можно найти,

- 7 027987 например, в Кеттд1оп'з Рйагтасеийса1 8аепсез, 201Н ей., Маек РиЪИзЫпд Сотрапу, Еаз1оп, Ра., (1985); и в НапйЪоок оГ РЬагтасеийса1 8а11з: Ргорегйез, 8е1есйоп, апй Изе Ъу 81аЫ апй ХУегтШк (^йеу-УСН, Уешйеш, Сегтапу, 2002).

Если не указано иначе, предполагается, что любая формула, указанная в настоящем изобретении, также представляет немеченые формы, а также изотопно-меченные формы соединений. Изотопномеченные соединения имеют структуры, изображенные формулами, указанными в настоящем изобретении, за исключением того, что один или более атомов замещены атомом, имеющим указанную атомную массу или массовое число. Примеры изотопов, которые можно вводить в соединения настоящего изобретения, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора и хлора, такие как ²Н, ³Н, ¹¹С, ¹³С, ¹⁴С, ¹⁵Ν, ¹⁸Р, ³¹Р, ³²Р, ³⁵8 , ³⁶С1, I соответственно. Настоящее изобретение включает различные изотопно-меченные соединения, как определено в настоящем изобретении, например, изотопномеченные соединения, в которых присутствуют радиоактивные изотопы, такие как ³Н и ¹⁴С, или изотопно-меченные соединения, в которых присутствуют нерадиоактивные изотопы, такие как ²Н и ¹³С. Данные изотопно-меченные соединения являются пригодными в исследованиях метаболизма (с ¹⁴С), исследованиях кинетики реакций (например, с ²Н или ³Н), способах детекции или получения изображения, таких как позитронно-эмиссионная томография (РЕТ) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (8РЕСТ), включая анализы распределения лекарственных средств или субстратов в тканях, или в радиоактивном лечении пациентов. В частности, ¹⁸Р-меченное соединение может быть особенно желательным для РЕТ или 8РЕСТ исследований. Изотопно-меченные соединения формулы (I) можно обычно получить общепринятыми способами, известными специалистам в данной области техники, или способами, аналогичными способам, описанным в сопроводительных примерах и способах получения, применяя подходящие изотопно-меченные реагенты вместо ранее применяемых немеченых реагентов.

Кроме того, замещение более тяжелыми изотопами, в частности дейтерием (т.е. ²Н или Ό) может давать определенные терапевтические преимущества, являющиеся результатом большей метаболической стабильности, например повышенный период полураспада ш угуо или сниженные требуемые дозы или улучшение терапевтического индекса. Ясно, что дейтерий в данном контексте считают заместителем соединения формулы (I). Концентрацию данного более тяжелого изотопа, особенно дейтерия, можно определить коэффициентом изотопного обогащения. Термин коэффициент изотопного обогащения, как применяют в настоящем изобретении, обозначает отношение между распространенностью изотопа и распространенностью изотопа в природе указанного изотопа. Если заместитель в соединении настоящего изобретения обозначен как дейтерий, данное соединение имеет коэффициент изотопного обогащения для каждого указанного атома дейтерия по меньшей мере 3500 (52,5% включение дейтерия для каждого указанного атома дейтерия), по меньшей мере 4000 (60% включение дейтерия), по меньшей мере 4500 (67,5% включение дейтерия), по меньшей мере 5000 (75% включение дейтерия), по меньшей мере 5500 (82,5% включение дейтерия), по меньшей мере 6000 (90% включение дейтерия), по меньшей мере 6333,3 (95% включение дейтерия), по меньшей мере 6466,7 (97% включение дейтерия), по меньшей мере 6600 (99% включение дейтерия) или по меньшей мере 6633,3 (99,5% включение дейтерия).

Как применяют в настоящем изобретении, термин фармацевтически приемлемый носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты, замедляющие поглощение, соли, консерванты, стабилизаторы, лекарственные вещества, связующие, наполнители, разрыхлители, смазывающие вещества, подсластители, ароматизаторы, красители и подобные, и их комбинации, как известно специалистам в данной области техники (смотрите, например, Кетт§1оп'з РЬагтасеийса1 8с1епсез, 181Н Ей. Маск Рйпйпд Сотрапу, 1990, рр. 1289-1329). За исключение случаев, когда любой общепринятый носитель является несовместимым с активным ингредиентом, предполагается его применение в терапевтических или фармацевтических композициях.

Термин терапевтически эффективное количество соединения настоящего изобретения относится к количеству соединения настоящего изобретения, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ у субъекта, например снижение или ингибирование активности фермента или белка, или облегчение симптомов, облегчение заболеваний, замедление или задержку развития заболевания, или предотвращение заболевания и т.д. В одном неограничивающем варианте осуществления термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения настоящего изобретения, которое, при введении субъекту, является эффективным для (1), по меньшей мере, частичного облегчения, ингибирования, предотвращения и/или улучшения состояния или расстройства или заболевания, (ί) опосредованного РШ киназой класса I или (ίί) связанного с активностью РШ киназы класса I, или (ίίί) характеризующегося активностью (нормальной или нарушенной) РШ киназы класса I; или (2) снижения или ингибирования активности РШ киназы класса I. В другом неограничивающем варианте осуществления термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения настоящего изобретения, которое, при введении в клетку или ткань, или неклеточный биологический материал, или среду, является эффективным для, по меньшей мере, частичного снижения или ингибирования активности РШ киназы класса I.

- 8 027987

В другом варианте осуществления термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения настоящего изобретения, которое, при введении субъекту, является эффективным для (1), по меньшей мере, частичного облегчения, ингибирования, предотвращения и/или улучшения состояния или расстройства или заболевания, (ί) опосредованного ΡΙ3 киназой класса I и шТОК или (ίί) связанного с активностью ΡΙ3 киназы класса I и тТОК, или (ίίί) характеризующегося активностью (нормальной или нарушенной) ΡΙ3 киназы класса I и тТОК; или (2) снижения или ингибирования активности ΡΙ3 киназы класса I и тТОК. В другом неограничивающем варианте осуществления термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения настоящего изобретения, которое при введении в клетку, или ткань, или неклеточный биологический материал, или среду, является эффективным для, по меньшей мере, частичного снижения или ингибирования активности Ρ^ киназы класса I и тТОК.

Как применяют в настоящем изобретении, термин субъект относится к животному. Обычно животное представляет собой млекопитающее. Субъект также относится, например, к приматам (например, людям мужского или женского пола), коровам, овцам, козам, лошадям, собакам, кошкам, кроликам, крысам, мышам, рыбам, птицам и подобным. В определенных вариантах осуществления субъект представляет собой примата. В еще других вариантах осуществления субъект представляет собой человека.

Как применяют в настоящем изобретении, термин ингибировать или ингибирование относится к снижению или подавлению указанного состояния, симптома или расстройства, или заболевания, или значительному снижению исходной активности биологической активности или процесса.

Как применяют в настоящем изобретении, термин лечить или лечение любого заболевания или расстройства относится в одном варианте осуществления к облегчению заболевания или расстройства (т.е. замедлению или остановке или ослаблению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления лечить или лечение относится к облегчению или ослаблению по меньшей мере одного физического параметра, включая параметры, которые могут быть незаметны пациенту. В еще другом варианте осуществления лечить или лечение относится к регулированию заболевания или расстройства, или физически (например, стабилизация видимого симптома), физиологически (например, стабилизация физического параметра), или обоими. В еще другом варианте осуществления лечить или лечение относится к предотвращению или задержке возникновения или развития или прогрессирования заболевания или расстройства.

Как применяют в настоящем изобретении, субъект является нуждающимся в лечении, если субъект будет получать пользу биологически, медицински или в качестве жизни из данного лечения.

Как применяют в настоящем изобретении, термины, упоминаемые в единственном числе, применяемые в контексте настоящего изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), подразумевают включение и единичных и множественных форм, если не указано иначе в настоящем изобретении или явно не противоречит контексту.

Все способы, описанные в настоящем изобретении, можно осуществлять в подходящем порядке, если не указано иначе в настоящем изобретении или явно не противоречит контексту. Применение любого и всех примеров или языка примеров (например такой как), относящихся к настоящему изобретению, предполагается единственно с целью лучшего освещения настоящего изобретения и не накладывает ограничения на иначе заявленный объем настоящего изобретения.

Любой асимметрический атом (например, углерод или подобный) соединения (соединений) настоящего изобретения может присутствовать в рацемической или энантиомерно обогащенной, например (К)-, (§)- или (К,8)-конфигурации. В определенных вариантах осуществления каждый асимметрический атом имеет по меньшей мере 50% энантиомерный избыток, по меньшей мере 60% энантиомерный избыток, по меньшей мере 70% энантиомерный избыток, по меньшей мере 80% энантиомерный избыток, по меньшей мере 90% энантиомерный избыток, по меньшей мере 95% энантиомерный избыток или по меньшей мере 99% энантиомерный избыток (К) - или (З)-конфигурации. Заместители при атомах с ненасыщенными двойными связями могут, при возможности, присутствовать в цис- (Ζ)- или транс- (Е)форме.

Соответственно, как применяют в настоящем изобретении, соединение настоящего изобретения может быть в виде одного из возможных изомеров, ротамеров, атропизомеров, таутомеров или их смесей, например, в виде, по существу, чистых геометрических (цис- или транс-) изомеров, диастереомеров, оптических изомеров (антиподов), рацематов или их смесей.

Любые полученные в результате смеси изомеров можно разделить на основе физико-химических различий составляющих, на чистые или по существу чистые геометрические или оптические изомеры, диастереомеры, рацематы, например, хроматографией и/или фракционной кристаллизацией.

Любые полученные в результате рацематы конечных продуктов или промежуточных соединений можно разделить на оптические антиподы известными способами, например разделением их диастереомерных солей, полученных с оптически активной кислотой или основанием, и высвобождением оптически активного кислого или основного соединения. В частности, основную группу можно, таким образом, применять для разделения соединений настоящего изобретения на их оптические антиподы, например фракционной кристаллизацией соли, полученной с оптически активной кислотой, например, винной ки- 9 027987 слотой, дибензоилвинной кислотой, диацетилвинной кислотой, ди-О,О'-п-толуолвинной кислотой, миндальной кислотой, яблочной кислотой или камфор-10-сульфокислотой. Рацемические продукты можно также разделить хиральной хроматографией, например жидкостной хроматографией высокого давления (ВЭЖХ), применяя хиральный адсорбент.

Соединения настоящего изобретения можно получить синтетическими способами, которые включают способы, аналогичные способам, хорошо известным в химической области техники, в частности в свете описания, содержащегося в настоящем изобретении. Исходные соединения обычно являются доступными из коммерческих источников, или их легко получить, применяя способы, хорошо известные специалистам в данной области техники (например, полученные способами, описанными, в общем, в Ьош5 Р. Р1езег апй Магу Р1езег, РеадеШз Гог Огдашс Зуп1йез18, тома 1-19, ^йеу, Νβν Уогк (1967-1999 ей.), или ВеЙ81е1П8 НапйЬисй йег огдашзсйеп Сйеш1е, 4, Аий. ей. Зрппдег-Уейад, ВегНп, включая вспомогательные материалы (также доступные через электронную систему базы данных Бельштейна)).

Для иллюстративных целей схема реакций, показанная ниже, обеспечивает потенциальные пути получения соединений настоящего изобретения, а также ключевых промежуточных соединений. Что касается более подробного описания отдельных реакционных стадий, см. параграф примеров ниже. Специалистам в данной области техники ясно, что другие способы получения можно применять для получения соединений настоящего изобретения. Хотя конкретные исходные соединения и реагенты показаны на схемах и обсуждаются ниже, их можно легко заменять на другие исходные соединения и реагенты, обеспечивая ряд производных и/или реакционных условий. Кроме того, многие соединения, полученные способами, известными ниже, можно дополнительно модифицировать в свете данного описания, применяя общепринятую химию, хорошо известную специалистам в данной области техники.

При получении соединений настоящего изобретения может требоваться защита вынесенных функциональных группировок (например, гидроксильных групп) промежуточных соединений. Необходимость в данной защите будет изменяться в зависимости от свойств вынесенных функциональных группировок и условий способов получения. Подходящие защитные группы для гидроксила включают триалкилсилильные эфиры, в которых одну или две алкильные группы можно заменять на фенил. Специалист в данной области техники легко определит необходимость в данной защите. Что касается общего описания защитных групп и их применения, см. Т.^.Огеепе, Рго1есйуе Огоирз ΐπ Огдашс Зуп1йе818, 1ойп А|1еу & Зопз, Νλυ Уогк, 1991.

Обычно соединения формулы (I) можно получить согласно способам, приведенным ниже.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы (I), включающему стадии а и Ь.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы (I) (способ А), включающему стадию а, с последующей стадией Ь.

- 10 027987

Соединение формулы (I) получают на стадии а) конденсацией соединения формулы (А) с соединением формулы (В), где К¹ и К² такие же, как определено для соединения формулы (I) выше

получая соединение формулы (С), где К¹ и К² такие же, как определено для соединения формулы (I) выше

С последующей стадией Ь) конденсации соединения формулы (С) с соединением формулы (Ό), где -В(ОК')₂ представляет собой циклическую или ациклическую бороновую кислоту или производное бороновой кислоты, такое как пинаколато-бор

В случаях, когда присутствует защитная группа, добавляют стадию деблокирования для превращения защищенного соединения формулы (I) в соединение формулы (I).

Стадию а) осуществляют в присутствии основания, такого как ΝαΗ. Реакцию осуществляют в присутствии органического растворителя, такого как ДМФА, при температурах 0-80°С в течение 20-30 мин. Альтернативно, реакцию можно осуществлять в стандартных условиях Бухвальда-Хартвига, применяя лиганд, такой как ХапфЬоз, Х-РБо§ или 2-ди-трет-бутилфосфино-2'-(Н^диметиламино)бифенил, с палладиевым катализатором, таким как Рб₂(бЬа)₃ или Рб₂(бЬа)₃-СНС1₃ или Рб(ОАе)₂, предпочтительно Рб₂(бЬа)₃ с Хап1рБо§, в присутствии основания, такого как предпочтительно С§₂СО₃ или трет-ВиО№, в органическом растворителе, таком как эфир, предпочтительно диоксан или ТГФ. Реакцию предпочтительно перемешивают при температуре приблизительно 80-120°С. Реакцию предпочтительно осуществляют в атмосфере инертного газа, такого как азот или аргон. Стандартные условия реакции, известные в области реакций Бухвальда-Хартвига, можно применять в настоящем способе.

Стадию Ь) осуществляют в присутствии катализатора, такого как Рб(0) катализатор, например РбС1₂(брр£)-СН₂С1₂, необязательно в присутствии одного или более вспомогательных веществ для реакции, таких как основание, например водное основание, такое как водный №₂СО₃, необязательно в присутствии одного или более разбавителей, в частности полярных растворителей, например ΌΜΕ. Реакцию перемешивают при температуре приблизительно 80-120°С. Реакцию можно осуществлять в атмосфере инертного газа, такого как азот или аргон. Стандартные условия реакции, известные в области реакций Сузуки, можно применять в настоящем способе.

Альтернативно, соединения формулы (I) можно также получить, осуществляя стадию Ь), с последующей стадией а) (способ В).

Настоящее изобретение дополнительно включает любой вариант настоящих способов, в которых промежуточный продукт, получаемый на любой его стадии, применяют в качестве исходного соединения, и осуществляют оставшиеся стадии, или в которых исходные соединения образуются ΐη δίΐιι в условиях реакции, или в которых компоненты реакции применяют в виде их солей или оптически чистого материала.

- 11 027987

Соединения настоящего изобретения и промежуточные соединения можно также превращать друг в друга согласно способам, обычно известным специалистам в данной области техники.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение настоящего изобретения, или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтическую композицию можно формулировать для конкретных путей введения, таких как местное введение; энтеральное введение, такое как, например, пероральное или ректальное введение; и парентеральное введение, такое как, например, внутривенное, внутримышечное или подкожное введение. Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения можно получить в твердой форме (включая без ограничения капсулы, таблетки, пилюли, гранулы, порошки или суппозитории) или в жидкой форме (включая без ограничения растворы, суспензии или эмульсии). Фармацевтические композиции можно получить согласно способам, известным в данной области техники. Фармацевтические композиции можно подвергать общепринятым фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или они могут содержать общепринятые инертные разбавители, смазывающие агенты или буферы, а также адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы и буферы, и т.д.

Подходящие композиции для местного применения, например на коже и глазах, включают водные растворы, суспензии, мази, кремы, гели, порошки, масла или распыляемые составы, например для доставки аэрозолем или подобным. Данные местные системы доставки будут, в частности, подходить для кожного применения, например для применения в кремах, лосьонах, спреях и подобных. Таким образом, они являются особенно подходящими для применения в местных, включая косметические, составах, хорошо известных в данной области техники. Данные составы могут содержать агенты, способствующие растворению, стабилизаторы, агенты, регулирующие тоничность, буферы и консерванты, и т.д.

Как применяют в настоящем изобретении, местное применение может также относиться к ингаляции или к интраназальному применению, например респираторной системе. Их можно удобно доставлять в виде сухого порошка (или отдельно, в виде смеси, например сухой смеси с лактозой, или в виде частиц смешанных компонентов, например с фосфолипидами) из порошкового ингалятора или в виде спрей-аэрозоля из контейнера под давлением, насоса, распылителя, аэрозольного ингалятора или небулайзера, с или без применения подходящего пропеллента.

В контексте настоящего изобретения нанесение предпочтительно относится к местному нанесению, такому как накожному нанесению в подходящей композиции, содержащей соединение настоящего изобретения или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически дерматологически приемлемый носитель. Подходящие композиции для накожного нанесения могут включать все фармацевтические формы, обычно применяемые для данного пути введения, и они являются хорошо известными в данной области техники, включая растворы, гели, лосьоны, суспензии, крема, порошки, масла, мази, пены, муссы, эмульсии, микроэмульсии, молочко, сыворотки, аэрозоли, спреи, дисперсии, микрокапсулы, везикулы и их микрочастицы. Данные составы формулируют согласно общепринятым способам.

Как применяют в настоящем изобретении, термин дерматологически приемлемый носитель представляет собой носитель, который является пригодным для местного применения на ороговевшей ткани, обладает хорошими эстетическими свойствами, является совместимым с активными агентами настоящего изобретения и любыми другими компонентами и не будет вызывать любых нежелательных проблем, связанных с безопасностью или токсичностью.

Дерматологически приемлемый носитель может иметь большое разнообразие форм. Например, в настоящем изобретении являются пригодными носители для эмульсии, включающие, но не ограничивающиеся, эмульсии масла в воде, воды в масле, воды в масле в воде и масла в воде в силиконе. Как ясно специалисту в данной области техники, указанный компонент будет распределяться в основном или в водной или масляной/силиконовой фазе, в зависимости от растворимости/способности диспергироваться в воде компонента в композиции.

Композиция, подходящая для накожного нанесения, при необходимости, может содержать различные известные добавки, такие как наполнители, связующие вещества, смазочные вещества и разрыхлители. При необходимости, она может также содержать маслянистые вещества, такие как различные жиры, масла, воски, углеводороды, жирные кислоты, высшие спирты, эфирные масла, металлосодержащие мыла, животные или растительные экстракты, гидрофильные или липофильные гелеобразующие агенты, гидрофильные или липофильные активные агенты, другие компоненты, такие как витамины, аминокислоты, поверхностно-активные вещества, красители, краски, пигменты, ароматизаторы, поглотители запаха, антисептики, консерванты, бактерицидные агенты, увлажняющие агенты, загустители, растворители, наполнители, антиоксиданты, комплексообразующие агенты, солнцезащитные вещества, и подобные, и их комбинации, как известно специалистам в данной области техники, при условии, что они являются совместимыми с активным ингредиентом.

Примеры подходящих масел включают минеральные масла, растительные масла, такие как кокосовое масло, кунжутное масло, соевое масло, сафлоровое масло, подсолнечное масло, животные масла, такие как ланолин или пергидросквален, синтетические масла, такие как пурцеллиновое масла, силико- 12 027987 новые масла, такие как циклометиком среди других. Жирные спирты, жирные кислоты, такие как стеариновая кислота, и воски, такие как парафиновый воск, карнаубский воск или пчелиный воск, также можно применять в качестве жиров.

Композиция может также содержать эмульгаторы, растворители, гидрофильные гелеобразующие агенты, липофильные гелеобразующие агенты, соли металлов и жирных кислот, гидрофильные активные агенты или липофильные активные агенты.

Соединения формулы (I) в свободной форме или в виде соли обладают ценными фармакологически свойствами, например свойствами, регулирующими И3 киназу, такими как свойства, регулирующие И3 киназу I класса (И3К I класса), или свойствами, регулирующими И3, в сочетании со свойствами, регулирующими тТОК, например, как показано в испытаниях ίη νίίτο и ίη νίνο, как приведено в экспериментальной части, и, следовательно, они показаны для терапии или для применения в качестве химических соединений для исследований, например, в качестве соединений, являющихся инструментами.

Соединения формулы (I) в свободной форме или солевой форме являются пригодными в лечении заболеваний, зависящих от И3 киназы I класса, особенно заболеваний, зависящих от И3К α I класса и βизоформ, а также заболеваний, зависящих от И3 киназ I класса, особенно заболеваний, зависящих от И3К I класса α- и β-изоформ, в сочетании с тТОК.

Соединения, которые ингибируют активность И3К I класса α- и β-изоформ, в частности соединения, которые являются, по существу, равноэффективными относительно И3К I класса α- и β-изоформ и необязательно также ингибируют активность тТОК, считают предпочтительными, поскольку считают, что данные соединения обладают способностью избегать адаптационные механизмы, связанные с путем, осуществляемым через другие изоформы, по сравнению с соединениями с уникальной специфичностью, например, специфичностью к одному члену семейства И3К I класса. Под равноэффективными подразумевают то, что соединения ингибируют несколько изоформ со сравнимой степенью, например, как измерено в ферментативном или клеточном анализе, описанном в настоящем изобретении.

Требуется, чтобы соединения формулы (I) обладали достаточной светостабильностью для того, чтобы обеспечить и достичь максимальной активности соединений формулы (I) при введении накожно, минимизируя потенциальное раздражение и побочные эффекты, связанные с образующимися продуктами разрушения. Соединения с превосходной светостабильностью будут облегчать техническую разработку и обеспечение, благодаря минимальным рискам разрушения на свету. Требуется, чтобы соединения формулы (I) обладали хорошей активностью в клеточных анализах, применяя линии человеческих клеток, полученные из плоскоклеточного рака кожи. Предпочтительные соединения должны обладать способностью хорошо проникать в кожу.

Соединения настоящего изобретения могут быть пригодными в лечении заболеваний, выбранных из, но не ограничиваясь, немеланомного рака кожи, такого как базальная клеточная карцинома и плоскоклеточный рак; их предраковых стадий, таких как светочувствительный кератоз, солнечный кератоз и хроническое повреждение кожи солнцем; и других гиперпролиферативных расстройств кожи, вызванных нарушением регуляции фибробластов кожи, таких как фиброз кожи, склеродермия, гипертрофированные рубцы или келоиды. Соединения настоящего изобретения могут быть в частности пригодными в лечении заболеваний, выбранных из, но не ограничиваясь, немеланомного рака кожи.

Все способы, описанные в настоящем изобретении, можно осуществлять в любом порядке, если не указано иначе в настоящем изобретении или явно не противоречит контексту. Применение любого и всех примеров или примерного языка (например такой как), относящихся к настоящему изобретению, предполагается только для лучшей иллюстрации настоящего изобретения и не накладывает ограничение на объем иначе заявленного настоящего изобретения.

В определенных случаях может быть предпочтительно вводить соединение настоящего изобретения в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным фармацевтическим (или терапевтическим) агентом (например, антипролиферативным или противораковым агентом или вспомогательной терапией, обычно применяемой при химиотерапии). Соединение настоящего изобретения можно вводить или одновременно с, или перед, или после одного или более других терапевтических агентов. Альтернативно, соединение настоящего изобретения можно вводить отдельно, тем же или отличным путем введения, или вместе в одной фармацевтической композиции, как другой агент (агенты).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к продукту, содержащему соединение формулы (I) и по меньшей мере один другой терапевтический агент в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии. В одном варианте осуществления терапия представляет собой лечение заболевания или состояния, зависящего от И3 киназ. Продукты, обеспечиваемые в виде комбинированного препарата, включают композицию, содержащую соединение формулы (I) и другой терапевтический агент (агенты) вместе в одной фармацевтической композиции, или соединение формулы (I) и другой терапевтический агент (агенты) в раздельном виде, например, в виде набора.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) и другой терапевтический агент (агенты). Необязательно,

- 13 027987 фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель, как описано выше.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему две или более отдельных фармацевтических композиций, по меньшей мере одна из которых содержит соединение формулы (I). В одном варианте осуществления набор содержит средство раздельного хранения указанных композиций, такое как контейнер, раздельная бутылка или разделенный пакет из фольги. Пример данного набора представляет собой блистерную упаковку, как обычно применяют для упаковки таблеток, капсул и подобных.

Набор настоящего изобретения можно применять для введения различных лекарственных форм, например пероральных и парентеральных, для введения отдельных композиций через различные интервалы дозирования, или для титрования отдельных композиций относительно друг друга. Для того чтобы способствовать соблюдению режима терапии, набор настоящего изобретения обычно содержит указания по введению.

Соответственно, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) для лечения заболевания или состояния, опосредованного ΡΚ киназами, где лекарственное средство получают для введения с другим терапевтическим агентом. Настоящее изобретение также относится к применению другого терапевтического агента для лечения заболевания или состояния, опосредованного Ρ^ киназами, где лекарственное средство вводят с соединением формулы (I).

Настоящее изобретение также относится к соединению формулы (I) для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного Ρ^ киназой I класса или опосредованного Ρ^ киназой I класса и тТОК, где соединение формулы (I) получают для введения с другим терапевтическим агентом. Настоящее изобретение также относится к другому терапевтическому агенту для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного Ρ^ киназой I класса или опосредованного Ρ^ киназой I класса и тТОК, где другой терапевтический агент получают для введения с соединением формулы (I). Настоящее изобретение также относится к соединению формулы (I) для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного Ρ^ киназой I класса или опосредованного Ρ^ киназой I класса и тТОК, где соединение формулы (I) вводят с другим терапевтическим агентом. Настоящее изобретение также относится к другому терапевтическому агенту для применения в способе лечения заболевания или состояния, опосредованного Ρ^ киназой I класса или опосредованного ΡΚ киназой I класса и тТОК, где другой терапевтический агент вводят с соединением формулы (I).

Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) для лечения заболевания или состояния, опосредованного ΡΚ киназой I класса или опосредованного ΡΚ киназой I класса и тТОК, где пациент ранее подвергался лечению (например, в пределах 24 ч) другим терапевтическим агентом. Настоящее изобретение также относится к применению другого терапевтического агента для лечения заболевания или состояния, опосредованного Ρ^ киназой I класса или опосредованного ΡΚ киназой I класса и тТОК, где пациент ранее подвергался лечению (например, в пределах 24 ч) соединением формулы (I).

В одном варианте осуществления другой терапевтический агент выбран из терапевтических агентов, подходящих для лечения немеланомного рака кожи, такого как базальная клеточная карцинома и плоскоклеточный рак; их предраковых стадий, таких как светочувствительный кератоз, солнечный кератоз и хроническое повреждение кожи солнцем. Соответственно, данные другие терапевтические агенты можно выбрать из иммуностимулирующих соединений, например агонистов То11-подобного рецептора, таких как имиквимод (А1йага®), или из противовоспалительных агентов, таких как диклофенак (8о1ага/е®).

Фармацевтическая композиция или комбинация настоящего изобретения может быть в виде единичного дозирования от приблизительно 1 до приблизительно 1000 мг активного ингредиента (ингредиентов) для субъекта от приблизительно 50 до приблизительно 70 кг, или от приблизительно 1 до приблизительно 500 мг, или от приблизительно 1 до приблизительно 250 мг, или от приблизительно 1 до приблизительно 150 мг, или от приблизительно 0,5 до приблизительно 100 мг, или от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг активных ингредиентов. Единичная доза может также составлять от приблизительно 50 до приблизительно 1000 мг активного ингредиента (ингредиентов) для субъекта от приблизительно 50 до приблизительно 70 кг или от приблизительно 50 до приблизительно 500 мг, или от приблизительно 50 до приблизительно 250 мг, или от приблизительно 50 до приблизительно 150 мг, или от приблизительно 50 до приблизительно 100 мг активных ингредиентов. Доза может зависеть от конкретной лекарственной формы, применяемой для доставки активного ингредиента (ингредиентов). В общем, терапевтически эффективная доза соединения, фармацевтической композиции или их комбинаций зависит от вида субъекта, веса тела, возраста и индивидуального состояния, расстройства или заболевания, которое будут лечить, или его тяжести. Доза может также зависеть от биодоступности активного ингредиента в видах, которые будут подвергать лечению. Лечащий врач, фармацевт, клиницист или ветеринар может легко определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для предотвращения, лечения или ингибирования развития расстройства или заболевания.

- 14 027987

Приведенные выше свойства доз можно продемонстрировать ΐη νίίΓΟ и ΐη νίνο испытаниями, применяя предпочтительно животных, например мышей, крыс, собак, обезьян, свиней, карликовых свиней, или выделенные органы, ткани и их препараты. Соединения настоящего изобретения можно применять ΐη νίίΓΟ в виде растворов, например водных растворов, полученных, например, из 10 мМ ДМСО исходного раствора, и ΐη νίνο или энтерально, парентерально, предпочтительно внутривенно или местно, например в виде суспензии, в виде водного раствора или других растворов, таких как, например, в виде раствора на основе пропиленгликоля. Доза ΐη νότο может изменяться от приблизительно 10^-3 до приблизительно 10^-9 молярных концентраций. Терапевтически эффективное количество ΐη νίνο может изменяться в зависимости от пути введения от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 мг/кг или от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг/кг.

Примеры

Следующие примеры предполагаются для иллюстрации настоящего изобретения и не предполагаются ограничивающими его. Температуры приведены в градусах Цельсия. Если не указано иначе, все упаривания проводят при пониженном давлении, обычно от приблизительно 15 до 100 мм рт.ст. (20-133 мбар). Структуру конечных продуктов, промежуточных соединений и исходных соединений подтверждали стандартными аналитическими способами, например микроанализом и спектроскопическим характеристиками, например МС, ИК, ЯМР. Применяемые сокращения представляют собой сокращения, стандартные в данной области техники.

Все исходные соединения, составные элементы, реагенты, кислоты, основания, дегидратирующие агенты, растворители и катализаторы, применяемые в получении соединений изобретения, являются или имеющимися в продаже, или их можно получить методами органического синтеза, известными специалисту в данной области техники (I Ιοη0οιι-4ουΙ 4ίΠ Еб. 1952, МебюсК οί Огдашс δγηί^δΐδ, ТЫеше, Уо1ише 21). Кроме того, соединения настоящего изобретения можно получить методами органического синтеза, известными специалистам в данной области техники, как показано в следующих примерах.

Если не указано иначе, исходные соединения являются обычно доступными из коммерческих источников, таких как А1бпсЬ СИепнсаЕ Οο. (МПшшкее, 4ίν), ЕапсаАет Вуп1Нез1'з, 1пс. (ЧшбИат, Ν.Η.), Асю Огдашсз (ΕαϊτΙα^η, Ν.Ι.), МауЪпбде СИепчса! Сοтρаηу, Εί6. (Οοτη^αΙΙ, Еηд1аηб), Тудег ВаенбЛс (РгшсеЮщ Ν.Ι.), СИет-1трех ИЧепциюнак 1пс. (4οο6 Г)а1е, ΙΕ) и Аδί^аΖеηеса РИаппасеиПсаЕ (Εοη6οη, Еηд1аηб).

Сокращения.

Сокращения, применяемые в следующих примерах, имеют соответствующие значения, перечисленные ниже.

АсОН	уксусная кислота
ВОДН .	ВОДНЫЙ
ах	аксиальный
Вос	трет-бутоксикарбонил
соляной раствор	насыщенный (при комна
	раствор хлорида натрия
ушир.с	уширенный синглет
ΟϋΟ13	дейтерированный хлороформ
снс13-а	дейтерированный хлороформ
СН2С12	дихлорметан
СНзСЫ	ацетонитрил
конц.	концентрированный
СзГ	фторид цезия
СиЗО4	сульфат меди

температуре,

- 15 027987

д	дублет
ШРЕА	диизопропилэтиламин
ΏΜΕ	диметоксиэтан
ДМФА	Ν,Ν-диметилформамид
ДМСО	диметилсульфоксид
ДМСО-Дб	дейтерированный диметилсульфоксид
άρρ£	1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен
ед	экваториальный
Е31-МС	электроспрей масс-спектрометрия
ЕД2О	диэтиловый эфир
ЕДОН	этанол
ЕДОАс	этилацетат
ч	час (часы)
НуДДо	НуД1о Зирег Се1®
Ш-ЯМР	протонный ядерный магнитный резонанс
КОАс	ацетат калия
КНЗО4	гидросульфат калия
К2СОз	карбонат калия
ЖХ/МС	жидкостная хроматография-масс-спектрометрия
1ГОА	литийдиизопропиламин
МеОН	метанол
МдЗО4	сульфат магния
М	молярный
м	мультиплет
МС	масс-спектрометрия
мин	минута (минуты)
мл	миллилитр (миллилитры)
Т.пл.	температура плавления
МдЗО4	сульфат магния
МГц	мегагерц
н.	нормальный
ЫаНМОЗ	гексаметилдисилазан натрия
ЯМР	ядерный магнитный резонанс
ЫЕДз	триэтиламин
ЫагЗгОз	тиосульфат натрия

- 16 027987

Ыа2ЗО4	сульфнат натрия
Ρά2 (бЬа) з	трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0)
РбС12(άρρ£)	дихлорид 1,1'-бис(дифенилфосфино)феррон палладия(II)
РбС12 (άρρ£) -СН2С12	дихлорметановый комплекс дихлорида 1, бис(дифенилфосфино)ферроцен-палладия(II)
РРЬз	трифенилфосфин
РсНРРЬз) 4	тетракис(трифенилфосфин)палладий
Ρά	палладий
квинт.	квинтет
Капеу-Νί	никель Ренея
НТ	комнатная температура
Н£	фактор удерживания на ТСХ
КЕ	время удерживания
с	синглет
ЗЮ2	силикагель
т	триплет
ТВАЕ	фторид тетрабутиламмония
ТВОРЗС1	трет-бутилдифенилсилилхлорид
ТВМЕ	трет-бутилметиловый эфир
ТЕА	трифторуксусная кислота
ТГФ	тетрагидрофуран
ТСХ	тонкослойная хроматография
Ек	время удерживания
УФ	ультрафиолетовый
СЭЖХ	сверхэффективная жидкостная хроматография

Общие способы.

¹Н-ЯМР измерения осуществляли на спектрометре Вгикег ЦИтазЫеМ™ 400 (400 МГц), Вгикег ШгазЫеМ™ 600 (600 МГц) или 500 ΜΗζ ΌΚΧ Вгикег СгуоРгоЬе (500 МГц), применяя или не применяя триметилсилан в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги (δ-величины) приводили в м.д. в сторону слабого поля от тетраметилсилана, константы связывания (I) указаны в Гц, структура расщепления спектра обозначена как синглет (с), дублет (д), дублет дублетов (дд), триплет (т), квадруплет (кв), мультиплет или более перекрывающиеся сигналы (м), уширенный сиглет (ушир.). Растворители указаны в скобках.

ТСХ проводили с предварительно покрытыми силикагелем 60 Т₂₅₄ стеклянными пластинками (Мегск, Г)апп81аск, Сегшапу), применяя соответственно названные системы растворителей. Визуализацию обычно осуществляют в УФ свете (254 нм).

ЖХ/МС.

ЖХ/МС-способ 1.

Колонка: Асциту Ηδδ Т3, 1,8 мкм, 2,1x50 мм;

элюент: вода (+0,05% муравьиная кислота +3,75 мМ ацетат аммония):ацетонитрил (+0,04% муравьиная кислота), от 95:5 до 2:98 в течение 1,4 мин, выдерживание 98% в течение 0,75 мин;

скорость потока/температура: 1,0 мл/мин при 60°С.

ЖХ/МС-способ 2.

Колонка: Асцийу Ηδδ Т3, 1,8 мкм, 2,1x50 мм;

элюент: вода (+0,05% муравьиная кислота + 3,75 мМ ацетат аммония):ацетонитрил (+0,04% муравьиная кислота), от 98:2 до 2:98 в течение 1,4 мин, выдерживание 98% в течение 0,75 мин;

скорость потока/температура: 1,2 мл/мин при 50°С.

СЭЖХ 1.

Колонка: АсциНу СЭЖХ Ηδδ Т3 С18, 1,7 мкм 2,1x50 мм, поток: 1,0 мл/мин; градиент: 5-100% В в течение 1,5 мин, 100% В в течение 1 мин, А = вода + 0,1% ТТА, В = ацетонитрил + 0,1% ТТА;

детекция: 218 нм или 254 нм.

- 17 027987

Получение промежуточного боронового эфира.

Промежуточный бороновый эфир, применяемый в получении соединений настоящего изобретения, является или имеющимся в продаже, или его можно получить, как описано в литературе или аналогичным способом, или его можно получить, как описано в настоящем изобретении ниже или аналогичным способом.

Промежуточное соединение 1. 5-(4,4,5,5-Тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-4трифторметил)пиримидин-2-амин

a) 5-Бром-4-трифторметил-пиримидин-2-иламин.

К раствору 2-амино-4-трифторметилпиримидина (25 г, 0,15 моль) в СΗ₃СN (600 мл) добавляли в темноте раствор Ν-бромсукцинимида (34,8 г, 195 ммоль) в ацетонитриле (200 мл) в течение 2,5 ч. Реакционную смесь перемешивали в течение 4,5 ч при комнатной температуре и затем упаривали. Остаток растворяли в ЕЮЛс и Н₂О, органические растворители отделяли, промывали Н₂О и соляным раствором, сушили над Nа₂8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮЛс в гексане от 10 до 40%, получая указанное в заголовке соединение в виде бежевого твердого остатка (31,2 г, 85%). ЖХ/МС: К, 0,82 мин; (ЖХ/МС способ 2).

b) 5-(4,4,5,5-Тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-4-(трифторметил)пиримидин-2-амин.

К суспензии 5-бром-4-трифторметилпиримидин-2-иламина (16,2 г, 66,3 ммоль), биспинаколатодибора (18,5 г, 72,9 ммоль) и КОАс (19,5 г, 199 ммоль) в диоксане (300 мл) в атмосфере аргона добавляли аддукт РйС1₂ (йрр£)-СН₂С1₂ (2,44 г, 2,98 ммоль) и смесь перемешивали в течение 4 ч при 115°С. Реакционную смесь охлаждали до 50°С и обрабатывали ЕЮАс. Полученную в результате суспензию фильтровали через НуДо и промывали ЕЮАс. Объединенный фильтрат концентрировали. Остаток суспендировали в 2 М \а(О Н перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин и затем добавляли Е1₂О и Н₂О. Двойную смесь снова фильтровали через НуГ1о и фазы разделяли. рН полученного в результате водного слоя доводили до 5-6 4 М водной НС1 и продукт экстрагировали ЕЮАс. Объединенные экстракты промывали Н₂О и соляным раствором, сушили над №₂8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток растирали в смеси Е1₂О/гексан, отфильтровывали и сушили, получая указанное в заголовке соединение в виде светло-желтого твердого остатка (8,33 г, 42%).

ЖХ/МС: [М+Н] 290,2; К₄=1,00 мин; (ЖХ/МС способ 2).

Получение оксазолидиноновых промежуточных соединений.

Промежуточное соединение 2. (48*,58*)-4-Этил-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-он

О

a) (18*,28*)-1 -(4-Метоксифенил)-2-нитробутан-1 -ол.

К раствору 1.1.ЛП Д (2 Μ в ТГФ) (1,84 мл, 3,67 ммоль) в сухом ТГФ (100 мл), который перемешивали в течение 30 мин при 0°С, добавляли 1-нитропропан (16,3 мл, 184 ммоль) в атмосфере аргона. Через 30 мин добавляли одной порцией 4-метоксибензальдегид (4,45 мл, 36,7 ммоль). Смесь перемешивали в течение 6 ч при 0°С и 18 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили НС1 (1 М в Н₂О) и экстрагировали СН₂С1₂. Органические слои промывали соляным раствором, сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя СН₂С1₂ в гексане от 0% до 100%, получая указанное в заголовке соединение (1,4 г, 34%).

¹Н-ЯМР (600 МГц, ДМСО-й₆): δ 7,35 (д, 2Н), 6,94 (д, 2Н), 5,94 (д, 1Н), 4,80 (дд, 1Н), 4,68-4,52 (м, 1Н), 3,76 (с, 3Н), 1,75-1,69 (м, 1Н), 1,25-1,20 (м, 1н), 0,74 (т, 3Н).

b) (18*,28 *)-2-Амино-1 -(4-метоксифенил)бутан- 1-ол.

Раствор (18*,28*)-1-(4-метоксифенил)-2-нитробутан-1-ола (1,0 г, 4,44 ммоль) в этаноле (20 мл) продували аргоном и добавляли при комнатной температуре Рй/С (100 мг, 0,094 ммоль). Затем герметичный сосуд продували и заполняли Н₂ и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Реакционную смесь фильтровали через целит, промывали этанолом и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя СН₂С1₂/МеОН/ (КН₄ОН в Н₂О) от 100:0:0 до 80:20:1, получая указанное в заголовке соединение в виде белого твердого остатка (450 мг, 51,4%). ЖХ/МС: [М+Н] 196,1; К, 0,44 мин; (ЖХ/МС способ 2).

- 18 027987

с) (43*,53*)-4-Этил-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-он.

К раствору (13*,23*)-2-амино-1-(4-метоксифенил)бутан-1-ола (440 мг, 2,25 ммоль) в СН₂С1₂ (15 мл) добавляли в атмосфере аргона ΝΕΐ₃ (0,78 мл, 5,63 ммоль) при 0°С. Затем добавляли дифосген в течение 5 мин и температуру поддерживали равной 0°С в течение 30 мин. Реакционную смесь гасили ледяной водой и 2 М водным раствором №-ьСО₃. экстрагировали СН₂С1₂, сушили над Ν;·ι₂δΟ₄. фильтровали и концентрировали. Остаток растирали с ТВМЕ, фильтровали и сушили, получая промежуточное соединение 2, [(43*,53*)-4-этил-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-он], в виде белого порошка (220 мг, 44%).

ЖХ/МС: [М+Н] 222,2; К,=0,77 мин; (ЖХ/МС способ 2).

’Н-ЯМР (600 МГц, ДМСО-й₆): δ 7,94 (ушир.с, 1Н), 7,32 (д, 2Н), 6,96 (д, 2Н), 5,06 (д, 1Н), 3,74 (с, 3Н), 3,51 (кв., 1Н), 1,53 (кв.т, 2Н), 0,85 (т, 3Н).

Промежуточное соединение 3. (43*,53*)-4-Этил-5-(3-метоксифенил)оксазолидин-2-он

Указанное в заголовке соединение получали согласно способу, описанному для промежуточного соединения 2, [(4К*,5К*)-4-этил-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она], получая промежуточное соединение 3 в виде бесцветного масла.

ЖХ/МС: [М+Н] 222,1; К=0,79 мин; (ЖХ/МС способ 2).

’Н-ЯМР (600 МГц, ДМСО-й₆): δ 7,98 (ушир.с, 1Н), 7,35-7,29 (м, 1Н), 6,83-6,96 (м, 3Н), 5,10 (д, 1Н), 3,72-3,78 (м, 3Н), 3,36-3,29 (м, 1Н), 1,49-1,63 (м, 2Н), 0,88 (т, 3Н).

Промежуточное соединение 4. (43*,5К*)-4-Этил-5-фенилоксазолидин-2-он

Указанное в заголовке соединение получали согласно способу, описанному для промежуточного соединения 2, [(4К*,5К*)-4-этил-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она], получая промежуточное соединение 4 в виде белого твердого остатка.

ЖХ/МС: [М+Н] 192,1; К=0,77 мин; (ЖХ/МС способ 2).

Промежуточное соединение 5. (43,53)-4-Метил-5-фенилоксазолидин-2-он

К раствору (13,23)-(+)-норпсевдоэфедрина (2,00 г, 13,2 ммоль) в СН₂С1₂ (60 мл) добавляли в атмосфере аргона Εΐ₃Ν (4,61 мл, 33,1 ммоль) при 0°С. Затем медленно добавляли трифосген (1,57 г, 5,29 ммоль), растворенный в 20 мл СН₂С1₂ и температуру повышали от 0°С до комнатной температуры. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь гасили добавлением водного ИН₄С1. Органические слои отделяли, сушили над МдЗО₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гептане от 0 до 100% для того, чтобы получить требуемый продукт (2,10 г, 89%).

ЖХ/МС: [М+Н] 178,1; К=0,67 мин; (ЖХ/МС способ 2).

’Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆) 7,88 (ушир.с, 1Н), 7,50-7,32 (м, 5Н), 5,09 (д, 1Н), 3,78-3,62 (м, 1Н), 1,26 (д, 3Н).

Промежуточное соединение 6. (43,5К)-4-Этил-5-(тиазол-2-ил)оксазолидин-2-он

а) (3)-2-(((Бензилокси)карбонил)амино)бутановая кислота.

К раствору (3)-2-аминобутановой кислоты (11,2 г, 109 ммоль) в ТГФ (200 мл) и 2М водного раствора карбоната натрия (65,2 мл, 130 ммоль) добавляли по каплям при 0°С бензилхлорформиат (17,06 мл, 119 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 16 ч, реакционную смесь экстрагировали Н₂О/ТВМЕ, водный слой подкисляли НС1 (2М в Н₂О) до рН 2 и экстрагировали ЕЮАс. Ор- 19 027987 ганический слой сушили над Να₂8Ο₄, фильтровали и фильтрат концентрировали, получая указанное в заголовке соединение (22,8 г, 77%) в виде бесцветного масла. Продукт применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.

ЖХ/МС: [М-Н] 236,2; К₃=0,76 мин; (ЖХ/МС способ 1).

b) (8)-Метил-2-(((бензилокси)карбонил)амино)бутаноат.

К раствору (8)-2-(((бензилокси)карбонил)амино)бутановой кислоты (10,0 г, 42,1 ммоль) в метаноле (100 мл) и толуоле (300 мл) добавляли по каплям при комнатной температуре в атмосфере аргона триметилсилилдиазометан (23,2 мл, 46,4 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение ч реакционную смесь концентрировали и остаток экстрагировали раствором ЕЮАс и соляным раствором. Объединенные органические слои сушили над Να₂8Ο₄. фильтровали и фильтрат концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (120 г 8ίΟ₂), применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 30% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (5,2 г, 48%) в виде бесцветного масла.

ЖХ/МС: [М+Н] 252,1; К=0,93 мин; (ЖХ/МС способ 1).

c) (8)-Бензил-( 1 -оксобутан-2-ил)карбамат.

К раствору (8)-метил-2-(((бензилокси)карбонил)амино)бутаноата (2,0 г, 7,96 ммоль) в толуоле (50 мл) добавляли по каплям при -78°С в атмосфере аргона ΌΙΒΑΕ-Η (1 М в толуоле) (15,9 мл, 15,9 ммоль) в течение 20 мин и реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 1 ч. Реакционную смесь гасили при -78°С водным 1,5 М раствором тартрата калия (20 мл) и температуру повышали до комнатной температуры. Реакционную смесь экстрагировали раствором ЕЮАс и соляным раствором. Объединенные органические слои сушили над №₂8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (24 г 8ίΟ₂), применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 30% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (1,18 г, 64%) в виде бесцветного масла.

ЖХ/МС: [М+Н] 222,2; Κ_ί=1,01 мин; (ЖХ/МС способ 1).

’Н-ЯМР (400 МГц, СНС1₃-й): δ 9,61 (с, 1Н), 7,27-7,43 (м, 5Н), 5,39 (ушир.с, 1Н), 5,15 (м, 2Н), 4,15 (кв., 1Н), 1,96-2,11 (м, 1Н), 1,64-1,82 (м, 1Н), 1,01-0,79 (м, 3Н).

ά) Бензил-((1К,28)-1-гидрокси-1-(тиазол-2-ил)бутан-2-ил)карбамат.

К раствору (8)-бензил-(1-оксобутан-2-ил)карбамата (1,1 г, 4,97 ммоль) в дихлорметане (30 мл) добавляли по каплям при -30°С в атмосфере аргона 2-(триметилсилил)тиазол (939 мкл, 5,97 ммоль) в течение 10 мин. Затем реакционную смесь перемешивали при -30°С в течение 20 мин, нагревали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем реакционную смесь упаривали при 30°С и растворяли в ТГФ (30 мл). Добавляли при 0°С в атмосфере аргона ТВАЕ (1 М в ТГФ) (5,97 мл, 5,97 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение

ч. Реакционную смесь концентрировали и остаток экстрагировали ЕЮАс. Объединенные органические слои промывали водным карбонатом натрия, водой и соляным раствором, сушили над №₂8О₄, фильтровали и фильтрат концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (24 г 8ίΟ₂), применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 30% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (1,18 г, 64%) в виде бесцветного масла. Остаток очищали колоночной хроматографией (24 г 8ίΟ₂), применяя МеОН в СН₂С1₂ гексан от 0 до 4% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (340 мг, 43%) в виде бесцветного масла.

ЖХ/МС: [М+Н] 307,5; 1++86 мин; (ЖХ/МС способ 1). е) (1К,28)-2-Амино-1-(тиазол-2-ил)бутан-1 -ол.

К раствору бензил-((1К,28)-1-гидрокси-1-(тиазол-2-ил)бутан-2-ил)карбамата (330 мг, 1,077 ммоль) в ацетонитриле (25 мл) при 0°С в атмосфере аргона добавляли пиперидин (0,213 мл, 2,154 ммоль) и по каплям йодтриметилсилан (293 мкл, 2,15 ммоль) в течение 5 мин. Затем температуру реакционной смеси повышали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. К реакционной смеси добавляли при 0°С тиосульфат натрия (500 мг), с последующим добавлением воды (0,5 мл) и реакционную смесь энергично перемешивали при 0°С в течение 15 мин. Добавляли дополнительные 500 мг тиосульфата натрия и смесь разбавляли ЕЮАс (50 мл), сушили над Να₂8Ο₄, фильтровали и концентрировали. Остаток растирали ЕЮАс, фильтровали и фильтрат концентрировали, получая указанное в заголовке соединение (250 мг, 67%) в виде желтого масла.

ί) (48,5К)-4-Этил-5-(тиазол-2-ил)оксазолидин-2-он.

Указанное в заголовке соединение получали из (1К,28)-2-амино-1-(тиазол-2-ил)бутан-1-ола согласно способу, описанному для промежуточного соединения 2, получая промежуточное соединение 6 (410 мг, 95%) в виде коричневого масла. Данный продукт применяли на следующей реакционной стадии без дополнительной очистки.

Промежуточное соединение 7. 4-Этил-5-пиридин-3-илоксазолидин-2-он

- 20 027987

a) 2-Нитро-1 -пиридин-3 -илбутан-1 -ол.

К раствору ЫЛ1Н₄ (2М в ТГФ) (0,93 мл, 1,87 ммоль) в сухом ТГФ (80 мл) при 0°С медленно добавляли 1-нитропропан (8,30 мл, 93 ммоль) в атмосфере аргона. Через 60 мин добавляли одной порцией никотинальдегид (2,00 г, 18,7 ммоль). Смесь перемешивали в течение 16 ч, повышая температуру от 0°С до комнатной температуры. Реакционную смесь гасили добавлением 1 мл 2М водной НС1, с последующим добавлением 4 г Ыа₂8О₄. Полученную в результате суспензию перемешивали в течение 15 мин и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (40 г 8ίΟ₂), применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 100% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде белого твердого остатка (2,6 г, 71%) в виде смеси диастереоизомеров А и В.

ЖХ/МС: [М+Н] 197,1; Е=0,52 мин; (ЖХ/МС способ 1).

A) ^!Н-ЯМР (400 МГц, СНС1₃-й): δ 8,70-8,60 (м, 2Н), 7,80-7,74 (м, 1Н), 7,42-7,32 (м, 1Н), 5,28 (дд, 1Н), 4,70-4,58 (м, 1Н), 2,97 (д, 1Н), 2,29-2,12 (м, 1Н), 1,65-1,42 (м, 1Н), 0,99 (т, 3Н).

B) ^!Н-ЯМР (400 МГц, СНС1₃-ф: δ 8,70-8,60 (м, 2Н), 7,80-7,74 (м, 1Н), 7,42-7,32 (м, 1Н), 5,15 (дд, 1Н), 4,70-4,58 (м, 1Н), 2,81 (д, 1Н), 1,99-1,85 (м, 1Н), 1,65-1,42 (м, 1Н), 0,94 (т, 3Н).

b) 2-Амино-1 -пиридин-3 -илбутан-1 -ол.

Раствор 2-нитро-1-пиридин-3-илбутан-1-ола (1,0 г, 4,44 ммоль) в этаноле (20 мл) продували аргоном и добавляли при комнатной температуре 100 мг никеля Ренея. Реакционную смесь три раза вакуумировали и заполняли водородом. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем никель Ренея отфильтровывали через Нуйо и Нуйо промывали ЕЮН. Затем фильтрат упаривали. Остаток очищали колоночной хроматографией (40 г 8ίΟ₂), применяя МеОН в СН₂С1₂ от 0 до 100% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде желтого масла (180 мг, 21%).

ЖХ/МС: [М+Н] 167,1; ^=0,21 мин; (ЖХ/МС способ 1).

c) 4-Этил-5 -пиридин-3 -илоксазолидин-2 -он.

К раствору 2-амино-1-пиридин-3-илбутан-1-ола (150 мг, 0,90 ммоль) в СН₂С1₂ (5 мл) добавляли в атмосфере аргона ΝΉΐ₃ (314 мкл, 5,63 ммоль) при 0°С. Затем добавляли в течение 5 мин дифосген и температуру повышали от 0°С до комнатной температуры в течение 2 ч. Реакционную смесь гасили ледяной водой и 2М раствором Ыа₂СО₃, экстрагировали СН₂С1₂, сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гептане от 0 до 100% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (100 мг, 58%) в виде смеси диастереоизомеров А и В.

ЖХ/МС: [М+Н] 193,1; ^=0,43 мин; (ЖХ/МС способ 1).

A) ^!Н-ЯМР (400 МГц, СНС1₃-й): δ 8,70-8,62 (м, 1Н), 8,60-8,56 (м, 1Н), 7,76-7,71 (м, 1Н), 7,42-7,35 (м, 1Н), 5,78 (д, 1Н), 4,08-3,98 (м, 1Н), 1,21-1,05 (м, 2Н), 0,84 (т, 3Н).

B) ^!Н-ЯМР (400 МГц, СНС1₃-й): δ 8,70-8,62 (м, 2Н), 7,80-7,76 (м, 1Н), 7,42-7,35 (м, 1Н), 5,21 (д, 1Н), 3,75-3,68 (м, 1Н), 1,89-1,69 (м, 2Н), 1,05 (т, 3Н).

Промежуточное соединение 8. 4-Метил-5-пиридин-3-илоксазолидин-2-он

К раствору ЫА1Н₄ (2М в ТГФ) (1,4 мл, 2,8 ммоль) в сухом ТГФ (110 мл) при 0°С медленно добавляли 1-нитроэтан (2,00 мл, 28 ммоль) в атмосфере аргона. Через 20 мин при 0°С добавляли одной порцией никотинальдегид (2,64 мл, 28 ммоль). Смесь перемешивали в течение 16 ч, повышая температуру от 0°С до комнатной температуры. Реакционную смесь гасили добавлением 5 мл 1 М НС1 с последующим добавлением СН₂С1₂ и Ыа₂8О₄. Полученную в результате суспензию перемешивали в течение 15 мин и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали. Затем остаток очищали колоночной хроматографией (40 г 8Ю₂), применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 100% для того, чтобы получить продукт в виде масла (3,2 г, 63%) в виде смеси диастереоизомеров.

ЖХ/МС: [М+Н] 183,4; К_е=0,41 мин; (ЖХ/МС способ 1).

A) ^!Н-ЯМР (400 МГц, СНС1₃-й): δ 8,58-8,48 (м, 2Н), 7,68 (д, 1Н) 7,33-7,23 (м, 1Н) 5,42-5,38 (м, 1Н),

4,70-4,60 (м, 1Н), 3,30-2,90 (ушир.с, 1Н), 1,46 (д, 3Н).

B) ^!Н-ЯМР (400 МГц, СНС1₃-й): δ 8,58-8,48 (м, 2Н), 7,68 (д, 1Н) 7,33-7,23 (м, 1Н) 5,04 (д, 1Н), 4,764,69 (м, 1Н), 3,30-2,90 (ушир.с, 1Н), 1,31 (д, 3Н).

Ь) 4-Метил-5-пиридин-3-илоксазолидин-2-он.

Раствор 2-нитро-1-пиридин-3-илбутан-1-ола (3,20 г, 17,6 ммоль) в этаноле (90 мл) продували аргоном и добавляли при комнатной температуре 200 мг никеля Ренея. Реакционную смесь три раза вакуумировали и заполняли водородом. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч в атмосфере Н₂ при комнатной температуре. Затем никель Ренея отфильтровывали через Нуйо и Нуйо промывали ЕЮН. Затем фильтрат упаривали для того, чтобы получить 2-амино-1-пиридин-3-ил-пропан-1-ол в качестве продукта (2,35 г, 88%), который применяли на следующей реакционной стадии без очистки. К раствору

- 21 027987

2-амино-1-пиридин-3-ил-пропан-1-ола (700 мг, 4,60 ммоль) в СН₂С1₂ (20 мл) добавляли в атмосфере аргона Εί₃Ν (1,60 мл, 11,5 ммоль) при 0°С с последующим добавлением трифосгена (819 мг, 2,76 ммоль, растворенные в 5 мл СН₂С1₂). Реакционную температуру повышали от 0°С до комнатной температуры в течение одного часа. Затем реакционную смесь гасили ледяной водой и 2М раствором Ж₂СО₃, экстрагировали СН₂С1₂, сушили над МдЗО₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 100% для того, чтобы получить продукт (160 мг, 20%). ЖХ/МС: [М+Н] 179,1; К₄=0,31 мин; (ЖХ/МС способ 1).

Промежуточное соединение 9. (4З,5З)-4-((трет-Бутилдифенилсилилокси)метил)-5фенилоксазолидин-2-он

a) (4З,5З)-4-Гидроксиметил-5-фенилоксазолидин-2-он.

(1З,2З)-2-Амино-1-фенилпропан-1,3-диол (20,0 г, 120 ммоль), диэтилкарбонат (29,7 мл, 245 ммоль) и К₂СО₃ (1,65 г, 12,0 ммоль) загружали в колбу с магнитной мешалкой и колонкой вигре. Данную суспензию нагревали в масляной бане при 135°С, получая желтый раствор. Накопленный ЕЮН отгоняли через колонку вигре. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч, до того как нельзя было отогнать ЕЮН. Затем реакционную смесь охлаждали до 50°С, разбавляли ЕЮАс и водным ΝαΙ ЮО₃. Органические слои отделяли, промывали соляным раствором, сушили над МдЗО₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (550 г ЗЮ₂), применяя ЕЮАс в гептане от 33 до 100% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде бежевого масла (7,50 г, 33%).

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСОЧ): δ 7,87 (ушир.с, 1Н), 7,50-7,30 (м, 5Н), 5,37 (д, 1Н), 5,23-5,17 (м, 1Н),

3,70-3,60 (м, 1Н), 3,60-3,50 (м, 2Н).

b) (4З,5З)-4-((трет-Бутилдифенилсилилокси)метил)-5-фенилоксазолидин-2-он.

К раствору (4З,5З)-4-гидроксиметил-5-фенилоксазолидин-2-она (3,50 г, 17,2 ммоль), ΝΉί₃ (4,80 мл, 34,4 ммоль) и ΌΜΑΡ (105 мг, 8 61 мкмоль) в ДМФА (20 мл) добавляли по каплям ТΒ^ΡЗС1 (4,86 мл, 18,9 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь упаривали и разбавляли ТВМЕ, Органические слои отделяли, промывали водным №НСО₃ и соляным раствором, сушили над МдЗО₄ и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (120 г З1О₂), применяя ЕЮАс в гептане от 0 до 60% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде белого твердого остатка (4,28 г, 57%).

ЖХ/МС: [М+Н] 432,2; К₄=1,36 мин; (ЖХ/МС способ 2).

Промежуточное соединение 10. (4З,5З)-4-(((трет-Бутилдифенилсилил)окси)метил)-5-(4метоксифенил)оксазолидин-2-он

К раствору (4З,5З)-4-(гидроксиметил)-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она [545435-91-4] (0,68 г, 3,05 ммоль) и имидазола (0,249 г, 3,66 ммоль) в ДМФА (10 мл) добавляли по каплям ТΒ^ΡЗС1 (0,97 мл, 3,66 ммоль) при 0-5°С. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали и оставшееся масло растворяли в ТВМЕ и промывали 10% водным КНЗО₄, Н₂О, насыщенным раствором ЖНСО₃ и соляным раствором, сушили над МдЗО₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гептане от 5 до 50% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде белой пены (1,62 г, 55%).

ТСХ (гептан/ЕЮАс 1:1) 1+0,14;

ЖХ/МС: [М+Н] 462; К₄=1,36 мин; (ЖХ/МС способ 2).

¹Н-ЯМР (400 МГц, ОСЕ): δ 7,65 (д, 4Н), 7,35-7,60 (м, 6Н), 7,24 (д, 2Н), 6,92 (д, 2Н), 5,24 (д, 1Н),

5,20 (ушир.с, 1Н), 3,84 (м, 4Н), 3,77 (м, 2Н), 1,09 (с, 9Н).

- 22 027987

Промежуточное соединение 11. (48,58)-4-(((трет-Бутилдиметилсилил)окси)метил)-5-(4-(2-

a) (К)-Метил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-этоксиэтокси)фенил)пропаноат.

К суспензии (К)-метил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-гидроксифенил)пропаноата (4,43 г, 15,00 ммоль), К₂СО₃ (4,15 г, 30,0 ммоль) и йодида натрия (112 мг, 750 мкмоль) в ацетонитриле (100 мл) добавляли 1-бром-2-метоксиэтан (5,64 мл, 60,0 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 2 дней. Реакционную смесь разбавляли ТВМЕ и промывали Н₂О и соляным раствором. Объединенные экстракты сушили над Μ§δΟ₄, фильтровали и концентрировали, получая указанное в заголовке соединение в виде желтого масла (5,3 г, 95%).

ТСХ (толуол/ТВМЕ 2:1) Ку=0,44; 0=1,084 мин (СЭЖХ 1);

ЖХ/МС: [М+Н] 354; Кд1,02 мин; (ЖХ/МС способ 2).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,05 (д, 2Н), 6,88 (д, 2Н), 4,96 (Ьг ά, 1Н), 4,58 (м, 1Н), 4,12 (дд, 2Н), 3,76 (дд, 2Н), 3,73 (с, 3Н), 3,47 (с, 3Н), 3,05 (м, 2Н), 1,44 (с, 9Н).

b) (4К,58)-Метил-5-(4-(2-метоксиэтокси)фенил)-2-оксооксазолидин-4-карбоксилат.

К раствору (К)-метил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-гидроксифенил)пропаноата (5,34 г, 14,35 ммоль) в ацетонитриле (260 мл) добавляли в атмосфере аргона раствор персульфата калия (7,76 г, 28,7 ммоль) в Н₂О (190 мл) и раствор Си8О₄ (0,458 г, 2,87 ммоль), растворенного в Н₂О (70 мл). Полученную в результате смесь перемешивали в течение 3 ч при 70°С. Реакционную смесь экстрагировали ЕЮАс. Объединенные экстракты промывали соляным раствором, сушили над ΜμδΟ₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гептане от 20 до 100% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде желтого масла (2,33 г, 52%).

ТСХ (гептан/ЕЮАс 1:2) Ку=0,19; 0=0, 680 мин (СЭЖХ 1);

ЖХ/МС: [М+Н] 296; К_г=0,68 мин; (ЖХ/МС способ 2).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,36 (д, 2Н), 6,99 (д, 2Н), 5,86 (ушир.д, 1Н), 5,62 (д, 1Н), 4,30 (д, 1Н), 4,16 (дд, 2Н), 3,88 (с, 3Н), 3,79 (дд, 2Н), 3,48 (с, 3Н).

c) (48,58)-4-(Гидроксиметил)-5-(4-(2-метоксиэтокси)фенил)оксазолидин-2-он.

К суспензии (4К,58)-метил-5-(4-(2-метоксиэтокси)фенил)-2-оксооксазолидин-4-карбоксилата (2,30 г, 7,79 ммоль) в ΕΐΟΗ (45 мл) добавляли порциями при 0-5°С боргидрид натрия (648 мг, 17,1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 0,5 ч при комнатной температуре и затем подкисляли 4М водной НС1 (10 мл) при 0-5°С. Реакционную смесь концентрировали и продукт экстрагировали ЕЮАс. Объединенные экстракты промывали соляным раствором, сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали, получая указанное в заголовке соединение в виде бежевой пены (1,80 г, 81%).

0=0,498 мин (СЭЖХ 1);

ЖХ/МС: [М+Н] 268; К<=0,55 мин; (ЖХ/МС способ 2).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,31 (д, 2Н), 6,96 (д, 2Н), 6,45 (ушир.с, 1Н), 5,33 (д, 1Н), 5,30 (ушир.с, 1Н), 3,75-4,30 (м, 7Н), 3,47 (с, 3Н).

ά) (48,58)-4-(((трет-Бутилдиметилсилил)окси)метил)-5-(4-(2-метоксиэтокси)фенил)оксазолидин-2он.

Указанное в заголовке соединение получали аналогично способу, описанному для промежуточного соединения 10, [(48,58)-4-(((трет-бутилдифенилсилил)окси)метил)-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2она], из (48,58)-4-(гидроксиметил)-5-(4-(2-метоксиэтокси)фенил)оксазолидин-2-она и ТВЭМ8-С1, получая после очистки колоночной хроматографией (применяя ЕЮАс в гептане от 5 до 50%) промежуточное соединение 11 в виде светло-желтого масла.

ТСХ (гептан/ЕЮАс 1:1) Ку=0,26; 0=1,28 мин (СЭЖХ 1);

ЖХ/МС: [М+Н] 382,2; К=1,17 мин; (ЖХ/МС способ 2).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,30 (д, 2Н), 6,97 (д, 2Н), 5,44 (ушир.с, 1Н), 5,23 (д, 1Н), 4,18 (дд, 2Н),

3,70-3,85 (м, 5Н), 3,48 (с, 3Н), 0,91 (с, 9Н), 0,11 (с, 6Н).

- 23 027987

Промежуточное соединение 12. (45,55)-5-(4-(2-((трет-Бутилдиметилсилил)окси)этокси)фенил)-4(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)оксазолидин-2-он

Указанное в заголовке соединение получали аналогично способу, описанному для промежуточного соединения 11, исходя из (К)-метил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-гидроксифенил)пропаноата и (2-бромэтокси)(трет-бутил)диметилсилана.

ТСХ (гептан/ЕЮАс 1:1) К^0,51; 1_К=1,764 мин (СЭЖХ 1);

ЖХ/МС: [М+Н] 482; Κ_ΐ=1,57 мин; (ЖХ/МС способ 1).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,31 (д, 2Н), 6,96 (д, 2Н), 5,26 (ушир.с, 1Н), 5,22 (д, 1Н), 4,13 (м, 2Н), 4,00 (м, 2Н), 3,79 (м, 1н), 3,67 (м, 2Н), 0,93 (с, 9Н), 0,92 (с, 9Н), 0,11 (м, 12Н).

Промежуточное соединение 13. (45,55)-4-(((трет-Бутилдиметилсилил)окси)метил)-5-(4-(3-((третбутилдиметилсилил)окси)пропокси)фенил)оксазолидин-2-он

Указанное в заголовке соединение получали аналогично способу, описанному для промежуточного соединения 12, исходя из (К)-метил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-гидроксифенил)пропаноата и (3-бромпропокси)(трет-бутил)диметилсилана.

ТСХ (гептан/БЮЛс 1:1) Щ=0,49; ί_κ=1,832 мин (СЭЖХ 1);

ЖХ/МС: [М+Н] 496; Κ_ί=1,62 мин (ЖХ/МС способ 1).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,30 (д, 2Н), 6,95 (д, 2Н), 5,27 (ушир.с, 1Н), 5,22 (д, 1Н), 4,13 (дд, 2Н), 4,00 (м, 2Н), 3,80 (м, 3Н), 3,74 (м, 2Н), 2,01 (м, 2Н), 0,93 (с, 9н), 0,91 (с, 9Н), 0,10 (с, 6Н), 0,06 (с, 6Н).

Промежуточное соединение 14. (45,5К)-4-Метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2-он

a) трет-Бутиловый эфир (2-гидрокси-1-метил-2-тиазол-2-ил-этил)карбаминовой кислоты.

Вос-Б-аланаль (9,99 г, 57,7 ммоль) растворяли в 200 мл СН₂С1₂. Добавляли к реакционной смеси при -20°С в атмосфере аргона 2-(триметилсилил)тиазол (9,90 г, 62,9 ммоль), растворенный в 70 мл СН₂С1₂. Через 21 ч при -20°С реакционную смесь концентрировали. Затем остаток растворяли в 180 мл ТГФ при добавлении ТВЛБ (1 М в ТГФ, 63,4 мл, 63,4 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь упаривали. Остаток очищали колоночной хроматографией (120 г 5Ю₂), применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 100% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде диастереомерной смеси (14,0 г, 93%).

ЖХ/МС: [М+Н] 259,2; Κ_ί=0,78 мин; (ЖХ/МС способ 1).

b) 2-Амино-1 -тиазол-2-ил-пропан-1 -ол.

трет-Бутиловый эфир 2-гидрокси-1-метил-2-тиазол-2-илэтил)карбаминовой кислоты (13,8 г, 53,4 ммоль) растворяли в 50 мл диоксана. Добавляли 134 мл (534 ммоль) 4М НС1 в диоксане и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь упаривали и остаток разбавляли диэтиловым эфиром и фильтровали для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде белой соли в виде диастереомерной смеси (11,5 г, 92%).

ЖХ/МС: [М+Н] 159,1; Щ=0,22 мин; (ЖХ/МС способ 1).

c) (45,5К)-4-Метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2-он.

Смесь диастереоизомеров 2-амино-1-тиазол-2-илпропан-1-ола (4,20 г, 18,2 ммоль) растворяли в 160 мл СН2С12. Добавляли при 0°С диизопропилэтиламин (11,1 мл, 63,6 ммоль) с последующим добавлением трифосгена (2,70 г, 9,09 ммоль), растворенного в 40 мл СН2С12. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и затем разбавляли СН2С12. Органические растворители отделяли, промывали водным ЫаНСО₃ и соляным раствором, сушили над Мд5О₄, фильтровали и концентри- 24 027987 ровали. Остаток очищали колоночной хроматографией (80 г 8Ю₂), применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 100% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде одного энантиомера (2,16 г, 64%).

ЖХ/МС: [М+Н] 185,3; К,=0,45 мин; (ЖХ/МС способ 1).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СНС1₃-й): δ 7,75 (д, 1Н), 7,35 (д, 1Н), 5,60 (ушир.с, 1Н), 5,32 (д, 1Н), 4,18-4,09 (м, 1Н), 1,45 (д, 3Н).

Промежуточное соединение 15. (48, 58)-4-Метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2-он

К смеси (18,28)-2-амино-1-тиазол-2-илпропан-1-ола и (1К,28)-2-амино-1-тиазол-2-илпропан-1-ола (2,9 г, 12,5 ммоль) в СН₂С1₂ (40 мл) добавляли в атмосфере аргона N1Л₃ (10,5 мл, 75 ммоль) при 0°С. Затем медленно добавляли трифосген (1,86 г, 6,27 ммоль), растворенный в 40 мл СН₂С1₂ и температуру повышали от 0°С до комнатной температуры. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь гасили добавлением водного №НСО₃. Органические слои отделяли, сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гептане от 0 до 100% для того, чтобы получить требуемый продукт (330 мг, 13%).

ЖХ/МС: [М+Н] 185,0; К,=0,48 мин; (ЖХ/МС способ 1).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СНС13-Й): δ 7,79 (д, 1Н), 7,34 (д, 1Н), 5,91 (д, 1Н), 5,71 (ушир.с, 1Н), 4,48-4,38 (м, 1Н), 0,89 (д, 3Н).

Получение примерных соединений.

Пример 1. (48,5К)-3-(2'-Амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил-[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2-он

a) (48,5К)-3-(6-Хлор-2-морфолин-4-ил-пиримидин-4-ил)-4-метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2-он.

(48,5К)-4-Метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2-он (промежуточное соединение 14) (4,70 г,

20.1 ммоль) растворяли в 70 мл ДМФА и охлаждали до 0°С. Добавляли в атмосфере аргона МП (964 мг, 60% в масле, 24,1 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°С. Добавляли 4(4,6-дихлорпиримидин-2-ил)морфолин (3,70 г, 20,1 ммоль), растворенный в 30 мл ДМФА и реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при 0°С с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем реакцию гасили добавлением водного ХН₄С1 с последующим разбавлением ЕЮАс; органические растворители разделяли, промывали соляным раствором, сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (80 г 8Ю₂), применяя ЕЮАс в гексане от 0% до 100% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (3,64 г, 48%).

ЖХ/МС: [М+Н] 382,2, 384,1; К=1,10 мин; (ЖХ/МС способ 1).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СНС13-Й): δ 7,77 (д, 1Н), 7,38-7,33 (м, 2Н), 5,39 (д, 1Н), 5,07-4,98 (м, 1Н), 3,753,55 (м, 8Н), 1,64 (д, 3Н).

b) (48,5К)-3-(2'-Амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил-[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метил-5тиазол-2-илоксазолидин-2-он.

К раствору (48,5К)-3-(6-хлор-2-морфолин-4-ил-пиримидин-4-ил)-4-метил-5-тиазол-2илоксазолидин-2-она, полученного на стадии а) (1,30 г, 3,40 ммоль), в 20 мл диметоксиэтана добавляли в атмосфере аргона 5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-4-(трифторметил)пиримидин-2-амин (1,08 г, 3,7 5 ммоль), РйС1₂(йрр1)-СН₂С1₂ (214 мг, 262 мкмоль) и 2М водным карбонат натрия (5,11 мл,

10.2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 80°С в течение 30 мин. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли 80 мл ЕЮАс, органические растворители промывали водным ХН₄С1 и соляным раствором, сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (80 г 8Ю₂), применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 100% для того, чтобы получить пример 1 в виде аморфного твердого остатка (1,20 г, 69%).

ЖХ/МС: [М+Н] 509,0; К,=0,99 мин; (ЖХ/МС способ 1).

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆): δ 8,58 (с, 1Н), 7,92 (д, 1Н), 7,87 (д, 1Н), 7,64 (ушир.с, 2Н), 7,41 (с,

- 25 027987

1Н), 5,89 (д, 1Н), 5,10-5,04 (м, 1Н), 3,75-3,55 (м, 8Н), 1,62 (д, 3Н).

Пример 2. (43*,53*)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-этил5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-он

a) (43*,53*)-3-(6-Хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-4-этил-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-он.

К раствору (4К*,5К*)-4-этил-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она (промежуточное соединение 2) (217 мг, 0,98 ммоль) в ДМФА (2 мл) добавляли при комнатной температуре в атмосфере аргона ΝαΗ (51,4 мг, 1,18 ммоль). Через 20 мин добавляли суспензию 4-(4,6-дихлорпиримидин-2-ил)морфолина (230 мг, 0,98 ммоль в ДМФА (1 мл) и реакционную смесь перемешивали при 85°С в течение 20 мин. Раствор гасили при 0°С водным ΝΗ₄ϋί, экстрагировали этилацетатом и органические слои сушили над Να₂3Ο₄, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 20% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде белого твердого остатка (375 мг, 91%).

ЖХ/МС: [М+Н] 419,1; К₁=1,26 мин; (ЖХ/МС способ 1).

b) (43*,53*)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-этил-5-(4метоксифенил)оксазолидин-2-он.

К раствору (4К*,5К*)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-4-этил-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она, полученного на стадии а), в БМЕ (2 мл) добавляли при комнатной температуре в атмосфере аргона 5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-4-(трифторметил)пиримидин-2-амин (76 мг, 0,26 ммоль), раствор 2М водного №₂С(О (0,36 мл, 0,72 ммоль) и тетракис(трифенилфосфин)палладий (27,6 мг, 24 мкмоль). Смесь перемешивали при 80°С в течение 1 ч, охлаждали до комнатной температуры и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гексане от 0 до 20% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (125 мг, 95%) в виде желтого масла.

ЖХ/МС: [М+Н] 546,2; К<=1,17 мин; (ЖХ/МС способ 1).

Н-ЯМР (400 МГц, СНС1₃-4): δ 8,63 (с, 1Н), 7,68 (с, 1Н), 7,31 (д, 2Н), 6,96 (д, 2Н), 5,49 (ушир.с, 2Н), 5,27 (д, 1Н), 4,66-4,61 (м, 1Н), 3,84 (с, 3Н), 3,80-3,73 (м, 8Н), 2,30-2,00 (м, 2Н), 1,08 (т, 3Н).

Пример 3. (43,53)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4(гидроксиметил)-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-он

a) (43,53)-4-(((трет-Бутилдифенилсилил)окси)метил)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-5-(4метоксифенил)оксазолидин-2-он.

К раствору (43,53)-4-(((трет-бутилдифенилсилил)окси)метил)-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2она (промежуточное соединение 10) (1,65 г, 3,57 ммоль), 4-(4,6-дихлорпиримидин-2-ил)морфолина (920 мг, 3,93 ммоль) и С§₂СО₃ (1,75 г, 5,36 ммоль) в диоксане (20 мл) добавляли после продувания аргоном 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен (145 мг, 250 мкмоль) и Рб₂(бЬа)₃ (65 мг, 0,071 ммоль) и реакционную смесь нагревали в течение 5 ч при 100°С. Реакционную смесь добавляли к 10% водному раствору ΝαΙ 1СО₃ и экстрагировали ЕЮАс. Объединенные экстракты промывали соляным раствором, сушили над Мд3О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гептане от 0 до 50% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде белого твердого остатка (2,33 г, 94%).

ТСХ (гептан/ЕЮАс 1:1) Ю=0,52;

ЖХ/МС: [М+Н] 659,661; К,=1,58 мин; (ЖХ/МС способ 2).

Н-ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,64 (м, 4Н), 7,54 (с, 1Н), 7,55-7,35 (м, 6Н), 7,26 (м, 2Н), 6,95 (д, 2Н),

5,21 (д, 1Н), 4,56 (м, 1Н), 4,22 (дд, 1Н), 3,96 (дд, 1Н), 3,84 (с, 3Н), 3,60-3,40 (м, 8Н), 1,09 (с, 9Н).

b) (43,53)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-(((третбутилдифенилсилил)окси)метил)-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-он.

Раствор (43,53)-4-(((трет-бутилдифенилсилил)окси)метил)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4ил)-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она, полученного на стадии а) (150 мг, 228 мкмоль), 5-(4,4,5,5тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-4-(трифторметил)пиримидин-2-амина (108 мг, 364 мкмоль), 20%

- 26 027987 водного №-ьСО₃, (0,24 мл, 2,28 ммоль) и РбС1₂(бррР)-СН₂С1₂ (18,6 мг, 23 мкмоль) в ΌΜΕ (2 мл) в атмосфере аргона перемешивали при 80°С в течение 8 ч. Реакционную смесь разбавляли ЕЮАс и промывали насыщенным раствором NаНСОз, Н₂О и соляным раствором, сушили над М§8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией, применяя ЕЮАс в гептане от 0 до 33% для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение в виде светло-желтой пены (68 мг, 28%).

ТСХ (гептан/ЕЮАс 1:1) К(=0,32; 1_К=1,663 мин (СЭЖХ 1);

ЖХ/МС: [М+Н] 786; К=1,48 мин; (ЖХ/МС способ 2).

с) (48,58)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-(гидроксиметил)-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-он.

К раствору (48,58)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-(((третбутилдифенилсилил)окси)метил)-5-(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она, полученного на стадии Ь) (68 мг, 65 мкмоль), в ТГФ (2 мл) добавляли по каплям при 0°С 1 М ТВАР в ТГФ (0,05 мл, 0,05 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°С и в течение 1 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали колоночной хроматографией, применяя соотношение гексан/СН₂С1₂/МеОН от 100:100:5 до 0:100:5 с последующей препаративной ВЭЖХ (^а1ег8 8ип Иге С18, 30x100 мм, 5 мкм; 0,1% ТРА-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрила 3050% в течение 20 мин), получая указанное в заголовке соединение в виде белого твердого остатка (18 мг, 50%); ТСХ (СН₂С1₂/МеОН 19:1) К(=0,40; 1_К=0,998 мин (СЭЖХ 1); ЖХ/МС: [М+Н] 548; К=0,96 мин; (ЖХ/МС способ 2).

Ή-ЯМР (600 МГц, ДМСО-б₆): δ 8,60 (с, 1Н), 7,64 (ушир.с, 2Н), 7,53 (с, 1Н), 7,34 (д, 2Н), 7,00 (д, 2Н), 5,58 (д, 1Н), 5,32 (т, 1Н), 4,59 (м, 1Н), 4,00 (м, 1Н), 3,82 (м, 1Н), 3,76 (с, 3Н), 3,75-3,55 (м, 8Н).

Примеры 4-14.

Примеры 4-14 в табл. 1 ниже можно получить, применяя способы, аналогичные способам, описанным в примерах 1-3, применяя подходящее промежуточное соединение, являющееся бороновым эфиром и оксазолидинон.

- 27 027987

Таблица 1

Номер примера	Структура и название	Щ-ЯМР	ЖХ/МС
	ύ	Щ-ЯМР (400 МГц, СНС1з-0) : δ
	ΡΑΡ ρΑν с'	8,64 (с, 1Н) , 7,69 (с, 1Н) ,
	7,39-7,50 (м, 5Н), 5,82 (д,	ЖХ/МС (способ 2):
4	аУлУ^ η2ν^νχ ΰ	1Н) , 5,46 (ушир.с, 2Н) , 5,02-4,96 (м, 1Н), 3,87-3,73	время удерживания: 1,19 мин;
		(м, 8Н) , 1, 84-1,72 (м, 1Н) ,	масс [М+Н]: 516,2
	(43* , 5Κ*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-	1,59-1, 66 (м, 1Н) , 0,52 (т,
	(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-	ЗН)
	4-этил-5-фенилоксазолидин-2-он
	О N	Щ-ЯМР (60 0 МГц, ДМСО-бб) : δ
	8,61 (с, 1Н) , 7,64 (ушир.с,	ЖХ/МС (способ 2):
	Nν Α /*	2Н) , 7,51-7,35 (м, 6Н) , 5,45	время удерживания:
5	А I >о? Η2Ν^Ν О	(д, 1Н), 4,73-4,52 (м, 1Н),	1,11 мин;
		3,78-3,54 (м, 8Н), 1,61 (д,	масс (ЕЗ+): 502,2
	(43,53)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-	ЗН)
	(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-
	4-метил-5-фенилоксазолидин-2-он
	ύ N	Щ-ЯМР (400 МГц, СНС1з-б) : δ
	ΜχΡ ν^Ν	8,62 (с, 1Н) , 7,67 (с, 1Н) ,
	1 С И 1 /=%	7,32-7,40 (τ, 1Н), 7,01-6,86	ЖХ/МС (способ 2) :
6	N »№ η2ν^ν^ о 0 о	(м, ЗН), 5,50 (ушир.с, 2Н), 5,29 (д, 1Н) , 4, 60-4, 64 (м,	время удерживания: 1,18 мин;
	(4К*,5К*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-	1Н) , 3,85 (с, ЗН) , 3,76 (м,	масс [М+Н]: 546,2
	(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-	8Н) , 2,30-2,00 (м, 2Н) , 1,11
	4-этил-5-(3-метоксифенил)оксазолидин-2-	(т, ЗН)
	он
	р о Хр мЧ з		ЖХ/МС (способ 1) :
	Ν ν А ζ А АА		время удерживания:
7		1,06 мин;
Η2Ν ν О
		масс [М+Н]: 523,1
	(43,5К)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-
	(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-
	4-ЭТИЛ-5-(тиазол-2-ил)оксазолидин-2-он Λ
	Р У У Г		ЖХ/МС (способ 1) :
	хУУУУ η2ν^νχ С/		время удерживания:
8		0,96 мин ;
			масс [М+Н]: 517,5
	3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-
	трифторметил-[4,5']бипиримидинил-6-ил)-
	4-этил-5-пиридин-3-илоксазолидин-2-он

- 28 027987

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'трифторметил-[4,5']бипиримидинил-б-ил)4-метил-5-пиридин-3-илоксазолидин-2-он

Η,Ν

N (43,53)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'трифторметил-[4,5']бипиримидинил-б-ил)4-гидроксиметил-5-фенилоксазолидин-2-он

(43,53)—3—(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4' трифторметил-[4,5']бипиримидинил-б-ил) 4-метил-5-тиазол-2-илоксазолидин-2-он

(43,53)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-б-ил) 4-(гидроксиметил)-5-(4-(2метоксиэтокси)фенил)оксазолидин-2-он

Η₂Ν 1\1 О' (43,53)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-б-ил) 5-(4-(2-гидроксиэтокси)фенил)-4(гидроксиметил)оксазолидин-2-он

Смесь цис- и трансдиастереомеров в соотношении к 1:

цис-диастереоизомер: ¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-бе) : δ 8,788,58 (м, ЗН) , 7,96-7, 88 (м,

1Н), 7,62 (ушир.с, 2Н), 7,54-7,48 (м, 2Н) , 6,05 (д,

1Н), 5,27-5,20 (м, 1Н), 3,78-3, 62 (м, 8Н) , 0,95 (д,

ЗН) ;

транс-диастереоизомер: ¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-бе) : δ 8,788,58 (м, ЗН) , 7,96-7, 88 (м,

1Н), 7,62 (ушир.с, 2Н), 7,54-7,48 (м, 1Н), 7,45 (с,

1Н), 5,53 (д, 1Н), 4,77-4,70 (м, 1Н), 3,78-3,62 (м, 8Н), 1,62 (д, ЗН)

Щ-ЯМР (400 МГц, ДМСО-бб) : δ 8,61 (с, 1Н), 7,61 (ушир.с,

2Н), 7,53 (с, 1Н) , 7,50-7,31 (м, 5Н) , 5,65 (д, 1Н) , 5,34 (τ, 1Н) , 4, 66-4,59 (м, 1Н) , 4,08-3,96 (м, 1Н), 3,92-3,83 (м, 1Н), 3,73-3,57 (м, 8Н) !Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-ά): δ

(с,	1Н) ,	7,98	(Д, 1Н)
(д,	1Н) ,	7, 64	(ушир.с
7,44	(ю	1Н) ,	6,28 (д

2Н)

1Н), 5,30-5,20 (м, 1Н), 3,78-3,61 (м, 8Н), 1,05 (д,

ЗН) ¹Н-ЯМР (600 МГц, ДМСО-бб) : δ

8,53	(с,	1Н) ,	7, 64	(ушир.с,
2Н) ,	7,53	(с,	1Н) ,	7,32 (д,
2Н) ,	7,00	(д,	2Н) ,	5,58 (д,
1Н) ,	5, 32	(т,	1Н) ,	4,60 (м,
1Н) ,	4,09	(м,	2Н) ,	3,99 (м,
1Н) ,	3, 82	(м,	1Н) ,	3,55-3,75

(м, ЮН); 3,34 (с, ЗН)

ЖХ/МС (способ 1): время удерживания:

0,91 мин; масс [М+Н]: 503,2

ЖХ/МС (способ 2): время удерживания:

0,97 мин; масс [М+Н]: 518,1

ЖХ/МС (способ 1): время удерживания:

1,01 мин; масс [М+Н]: 509,2

ЖХ/МС (способ 2): время удерживания:

0,93 мин; масс [М+Н]: 592,1

Щ-ЯМР (400 МГц, ДМСО-бб) : δ	ЖХ/МС	(способ 1):
8,61 (с, 1Н) ,	7,63 (ушир.с,
2Н)	, 7,54	(с,	1Н)	, 7,33 (д,
2Н)	, 7,02	(д,	2Н)	, 5,58 (д,	время	удерживания:
1Н)	, 5, 31	(Ю	1Н)	, 4,87 (т,	0	,7 9 мин;
1Н) ,	, 4,61	(м,	1Н) ,	, 4,10-3,90	масс	[М+Н]: 578,2
(м,	ЗН) , 3	, 82	(м,	1Н), 3,75-

3,55

ЮН)

- 29 027987

Активность соединения согласно настоящему изобретению можно оценить следующими способами ιη уйго и 1П У1Уо.

Получение разбавлений соединений (384-луночные).

Испытуемые соединения растворяли в ДМСО (10 мМ) и переносили в 1,4-мл стандартные калибровочные кюветы с плоским дном или клинообразные стандартные калибровочные кюветы, содержащие уникальный двухмерный матриксный чип индивидуальными хабами соединений компании Новартис. Количество данных чипов четко связано с №уагйз Рйагша МппЬегз. Исходные растворы хранили при -20°С, если не применяли непосредственно. Для способа испытания пробирки размораживали и идентифицировали сканером, посредством этого генерируя рабочий лист, который направлял последующие рабочие стадии.

Соединения или разбавляли вручную в ДМСО для отдельных экспериментов (96-луночные, обеспечивающие 10 соединений при 8 (одноточечные) концентрациях), как описано, или получали, как описано ниже, при испытании в 384-луночных. Данный формат обеспечивает максимум 40 отдельных испытуемых соединений при 8 концентрациях (одноточечные), включая 4 эталонных соединения. Протокол разбавления включал получение планшетов предварительного разбавления, эталонных планшетов и аналитических планшетов.

Планшеты предварительного разбавления: полипропиленовые 96-луночные планшеты применяли в качестве планшетов предразбавления. Суммарно получали 4 планшета предварительного разбавления, содержащие 10 испытуемых соединений, каждое с положениями на планшете А1-А10, одно стандартное соединение в А11 и один контроль ДМСО в А12. Схема стадий разбавления суммирована в табл. 2. Программы записаны, чтобы проводить данные стадии отбора пипеткой на роботах Наш111оп8ТАК.

Таблица 2

Схема разбавления для планшетов предварительного разбавления

с	Объем (мкл)	Концентрация, (мкМ)		Объем (мкл) ДМСО		Объем (мкл)	Концентрация, (мкМ)	Степень разбавления	Конечная концентрация (мкМ)
А	30	10000	+	135	-л	165	1820	1:5,5	10
В	50	1820	+	116	-л	166	546	1:3,33	3
С	50	546	+	100	—>	150	182	1: 3	1
Ό	50	182	+	116	-л	166	54, 6	1:3,33	0, 3
Е	50	54,6	+	100	-/>	150	18,2	1: 3	0,1
Е	50	18,2	+	116		166	5,46	1:3,33	0, 03
С	50	5, 46	+	100	-л	150	1,82	1: 3	0, 01
Н	50	1, 82	+	116	-л	166	0,546	1:3,33	0, 003

ДМСО насыщали Н₂О до концентрации 10%.

Эталонные планшеты: 100 мкл разбавления отдельных соединений, включая стандартное соединение и контроли 4 планшетов предразбавления, переносили в 384-луночный эталонный планшет, содержащий следующие концентрации 1820, 564, 182, 54,6, 18,2, 5,46, 1,82 и 0,546 мкМ, соответственно, в 90% ДМСО.

Аналитические планшеты: затем идентичные аналитические планшеты получали отбором пипеткой 50 нл каждого из разбавлений соединения эталонных планшетов в 384-луночные аналитические планшеты. Соединения смешивали с 4,5 мкл компонентов для анализа плюс 4,5 мкл фермента, соответствующие 1:181 разбавлению, обеспечивая конечную концентрацию 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 и 0,003 мкМ соответственно. Приготовление эталонных планшетов осуществляли роботом Ма1п.х Р1а!еМа1е Р1из и репликацию аналитических планшетов роботом НишштдВпй.

- 30 027987

Способ получения экспрессионных конструктов.

Каталитически активные человеческие РОКа, РОКЗ, РНКБ и тТОК клонировали, экспрессировали и очищали, как описано (Мана 8.М., 81аиГГег Р., Вгиеддеп 1.. Риге! Р., 8сЬпе11 С., РгЪксЬ С., ВгасЬтапп 8., СЬепе Р., йе Роуег А., 8сЬоетакег К., РаЬЬго Ό., ОаЬпе1 Ό., 81топеп М., МигрЬу Ь., Ртап Р., 8е11егк У., Оагта-ЕсЬеуета С. (2008), Мо1. Сапсег ТЬег. 7:1851-63 и Мата 8.М., РессЬ 8., Вгиеддеп 1., НиЬ К., 8сЬпе11 С., РгйксЬ С., №де1 Т., У1ектапп М., ВгасЬтапп 8., ЭогксЬ М., СЬепе Р., 8сЬоетакег К., Эе Роуег А., Мепе/ек Ό., РаЬЬго Ό., 8е11егк У., Сапла-ЕсЬеуегпа С., УоЬуа СР (2011), Мо1. Сапсег ТЬег. принята в печать).

Биохимические анализы для РОКа, РОКЗ.

АТФ агент для детекции на основе люминесценции К1пакеО1о получали у Рготеда (каталожный №У6714, партия №236161) через Са1а1ук, ХУаШкеПеп, 8\\Ь/ег1апй (Ь-а-фосфатидилинозитол (РИ, Ьтег, Воуте) получали у АуапЬ Ро1аг ЫрЛ (каталожный №840042С, партия №^РI-274), фосфатидилинозитол4,5-бисфосфат ^№(4,5)2 (АуапЬ, каталожный №840046Х) или Ь-а-фосфатидилинозитол (РЦ получали у ЛуапЬ Ро1аг ПрИ (каталожный №840042С, партия №ЬР!-274). Ь-а-Фосфатидилсерин (Р8) получали у ЛуапЬ Ро1аг ЫрИ (каталожный №840032С), н-октилгликозид у АуапЬ Ро1аг ПрИ (каталожный №10634425001). Люминесценция представляет собой хорошо разработанный способ получения данных, определяя концентрации АТФ, его можно, таким образом, применять для отслеживания активности многих киназ, независимо от их субстрата. К1паке С1о Ьцттексей К1паке Аккау (Рготеда, МаШкоп/ХУЬ И8А) представляет собой гомогенный НТ8 способ измерения киназной активности оценкой количества АТФ, оставшегося в растворе после киназной реакции.

нл разбавлений соединений распределяли на черные 384-луночные мелкообъемные несвязывающие стирольные (№8) планшеты (Сок!аг каталожный №№8#3676), как описано в параграфе 8.2. Ьα-Фосфатидилинозитол (РИ, обеспечиваемый в виде 10 мг/мл раствора в метаноле, переносили в стеклянную пробирку и сушили в потоке азота. Затем его повторно суспендировали в 3% октилглюкозиде перемешиванием и хранили при 4°С. Добавляли 5 мкл смеси РЬОО с подтипами РЫК/. и РЫ<(У Киназные реакции начинали добавлением 5 мкл АТФ-смеси, содержащей конечный объем 10 мкл 10 мМ ТМ8НС1 рН 7,5, 3 мМ МдС1₂, 50 мМ №С1, 0,05% СНАР8, 1 мМ ОТТ и 1 мкМ АТФ и осуществляли при комнатной температуре. Реакции прекращали 10 мкл К1пакеО1о и планшеты считывали через 10 мин в ридере 8упегду2, применяя время интегрирования 0,1 с на лунку. 2,5 мкМ NVР-ВСТ226 (стандарт) добавляли к аналитическим планшетам, вызывая 100% ингибирование киназной реакции и 0% ингибирование получали в случае растворителя (90% ДМСО в воде). NVР-ВΟТ226 применяли в качестве эталонного соединения и включали во все анализы в виде 16 точек разбавления в двух экземплярах.

Величины ингибирования [СХ. в процентах каждого соединения при 8 концентрациях (обычно 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,030, 0,010 и 0,003 мкМ) п=2 получали подгонкой сигмоидальной кривой зависимости ответа от дозы к графику данных анализа относительно концентрации ингибитора, как описано. Все приближения осуществляли программой ХЬГЬ4 (Ю Виктекк 8о1иЬопк, ОшШогй, ИК).

Биохимические анализы для РО^, РЫК/.

Универсальный набор реактивов для киназных реакций ТК-РКЕТ Айар1а™ приобретали у [пуЦгодеп СогрогаЬоп (Саг1кЬай/СА, И8А) (каталожный №РУ5099). Набор содержит следующие реагенты: Айар1а Еи-анти-АДФ антитело (меченное европием анти-АДФ антитело в забуференном НЕРЕ8 соляном растворе, каталожный №РУ5097), А1еха Р1иог® 647-меченная АДФ метка (А1еха Р1иог® 647-меченная АДФ метка в забуференном НЕРЕ8 соляном растворе, каталожный №РУ5098), запатентованный ТК-РКЕТ буфер для разбавления рН 7,5 (каталожный №РУ3574).

Субстрат ЬЮСВ, фосфатидилинозитол, получали у [пуЦгодеп (везикулы, состоящие из 2 мМ РI в 50 мМ НЕРЕ8 рН 7,5; каталожный №РУ5371). Субстрат РЖ3СО, фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (Р11Р(4,5)2, получали у НуНгодеп (ИР2:Р8 большие однослойные везикулы, состоящие из 1 мМ РР2: 19 мМ Р8 в 50 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 3 мМ МдС1₂, 1 мМ ЕОТА; каталожный №РУ5100).

Резонансный перенос энергии флуоресценции с временным разрешением (ТК-РКЕТ) представляет собой способ, основанный на переносе энергии между двумя соседними красителями, от возбужденного электрона в одном красителе (донор) на электрон в соседнем красителе (акцептор) посредством резонанса, затем высвобождаемой в виде фотона. Данный перенос энергии обнаруживают увеличением флуоресценции акцептора и снижением флуоресценции донора. В ТК-РКЕТ анализах для протеинкиназ применяют долгоживущие лантанидные хелаты тербия или европия в качестве доноров, которые преодолевают помехи, связанные с автофлуоресценцией соединения или рассеянием света осажденным соединением, введением задержки после возбуждения источником возбуждения импульсной лампы. Результаты часто выражают в виде отношения интенсивностей флуорофоров акцептора и донора. Логометрический характер данной величины вводит поправку на различия анализируемых объемов между лунками, а также вводит поправку на эффекты тушения окрашенными соединениями. Айар1а™ анализ можно разделить на две фазы: фаза киназной реакции и фаза АЦФ детекции. В фазе киназной реакции все компоненты киназной реакции добавляют в лунку и реакционную смесь выдерживают в течение установленного периода времени, конкретного для каждой киназы. После реакции раствор для детекции Еи-меченного ан- 31 027987 ти-АДФ антитела, А1еха Ркюг® 647-меченной ДЦФ метки и ЭДТА (для прекращения киназной реакции) добавляют к лунке для анализа. АДФ, образовавшийся в результате киназной реакции, будет замещать А1еха ΡΙπογ® 647-меченную АДФ метку из антитела, приводя в результате к снижению ТК-РКЕТ сигнала. В присутствии ингибитора, количество АДФ, образовавшееся в результате киназной реакции, снижается и полученное в результате интактное взаимодействие антитела с меткой сохраняет сильный ТКРКЕТ сигнал. В Α6πρίπ™ анализе донор (европий-анти-АДФ антитело) возбуждается при 340 нм и будет переносить свою энергию к акцептору (А1еха РРюг® 647-меченная АДФ метка). Излучение А1еха РРюг® 647 можно отслеживать фильтром с центром при 665 нм, поскольку оно располагается между пиками излучения донора, который измеряют при 615/620 нм.

нл разбавлений соединений наносили на белый 384-луночный малообъемный полистирольный планшет, как описано в параграфе 2.2. Затем 5 мкл Р13Кд и ΡΙ3Κ6 и липидного субстрата (ΡΙ или РГР2:Р§), с последующими 5 мкл АТФ (конечный объем для анализа 10 мкл), выдерживали при комнатной температуре. Стандартный реакционный буфер для Α6Ηρίπ™ ТК-РКЕТ анализа содержал 10 мМ ТпзНС1 рН 7,5, 3 мМ МдС1₂, 50 мМ №С1, 1 мМ ЭТТ, 0,05% СНАРЗ. Реакции прекращали 5 мкл смеси ЭДТА, содержащего Еи-меченное анти-АДФ антитело и А1еха РРюг® 647-меченную АДФ метку, в ТК-РКЕТ буфере для разбавления (собственность 1УС). Планшеты считывали через 15-60 мин в §уиегду2 ридере, применяя время интегрирования 0,4 с и задержку 0,05 с. Контроль для 100% ингибирования киназной реакции осуществляли заменой ΡΙ3Κ стандартным реакционным буфером. Контроль для 0% ингибирования получали с помощью плацебо соединений (90% ДМСО в Н₂О). Стандартное соединение ЦУР-ВСТ226 применяли в качестве эталонного соединения и выдерживали во всех планшетах для анализа в виде 16 точек разбавления в двух экземплярах.

Данные анализировали, применяя программное обеспечение для аппроксимации Ехсе1 или Сгаркраб Рпзт. Величины ЕС₅₀ получали подгонкой сигмоидальной кривой зависимости эффекта от дозы к графику результатов анализа относительно концентрации ингибитора. Подгонку осуществляли программой ХЬГй4 (ГО Визтезз δοϊιιΐίοηδ. Сийб&гб, ИК). Определение ЕС₅₀ величин процентного ингибирования для каждого соединения при 8 концентрациях (обычно 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,030, 0,010 и 0,003 мкМ) и=2 осуществляли подгонкой сигмоидальной кривой зависимости эффекта от дозы к графику результатов анализа относительно концентрации ингибитора. Подгонку осуществляли программой ХЬЫТ (ГО Визтезз δοΜοηδ, ΟιιίΗΓοιΑ ИК).

Биохимический анализ для тТОК.

В ТК-РКЕТ анализах для протеинкиназ применяют долгоживущие лантанидные тербиевые или европиевые хелаты в качестве доноров, которые преодолевают помехи, вязанные с автофлуоресценцией соединения или рассеянием света осажденным соединением, введением задержки после возбуждения источником возбуждения импульсной лампы. Результаты часто выражают в виде отношения интенсивностей флуорофоров акцептора и донора. Логометрический характер данной величины вводит поправку на различия анализируемых объемов между лунками, а также вводит поправку на эффекты тушения окрашенными соединениями.

Анализы на связывание основаны на связывании и вытеснении А1еха РРюг® 647-меченных, АТФконкурентных киназных ингибиторов исследуемой киназы. Киназные метки компании Iиν^ί^οдеи разработаны, чтобы соответствовать широкому диапазону киназных мишеней и основаны на АТФконкурентных киназных ингибиторах, делающих их пригодными для детекции любых соединений, которые связываются с АТФ сайтом или с аллостерическим сайтом, изменяющим конформацию АТФ сайта. Ингибиторы, которые связываются с АТФ сайтом, включают и киназные ингибиторы Ι типа, которые связываются только с АТФ сайтом и ингибиторы ΙΙ типа (например, С1ееνес®/иматиниб, сорафениб, ВГКВ-796), которые связываются и с АТФ сайтом и с гидрофобным сайтом, экспонированным в ЭРС-аут (неактивной) конформации. Ингибиторы ΙΙΙ типа представляют собой соединения, которые не конкурируют с АТФ, расплывчато называемые аллостерическими ингибиторами. Исследование 15 различных ингибиторов ΙΙΙ типа показало, что все, кроме одного соединения, детектировали в анализе на связывание с эффективностью, эквивалентной анализам на активность. Одним исключением было конкурирующее за субстрат соединение и, таким образом, оно не являлось настоящим аллостерическим ингибитором.

В отличие от большинства анализов киназной активности, основанных на флуоресценции, РаШкаЗстеем® Еи³⁺ анализы на киназное связывание можно отслеживать непрерывно, что облегчает оценку соединений с медленной кинетикой связывания. Кроме того, в отличие от большинства анализов на активность, анализы на связывание можно осуществлять, применяя или активные или неактивированные киназные препараты, которые обеспечивают получение характеристик соединений, которые связываются предпочтительно с неактивированными киназами, таких как С1ееνес®/иматиниб и некоторые аллостерические ингибиторы.

В анализе на связывание киназы ^аиίЬазс^ееи™ донор (Еи³⁺-анти-С8Т антитело) возбуждают при 340 нм, и оно будет передавать свою энергию акцептору (А1еха ΡΙπογ® 647-меченный АТФконкурентный киназный ингибитор = Тгасег-314). Излучение Тгасег-314 (ингибитор А1еха ΡΙηογ® 647) можно отслеживать фильтром с центром при 665 нм, поскольку оно расположено между пиками излуче- 32 027987 ния донора, который измеряют при 615/620 нм. Связывание и Тгасег-314 и Еи³+-анти-О8Т антитела с киназой приводит в результате к высокой степени РКЕТ от Еи³+-донорного флуорофора к А1еха-Р1иог® 647-акцепторному флуорофору на Тгасег-314. Связывание ингибитора с киназой конкурирует за связывание с меткой, приводя в результате к потере РКЕТ.

нл разбавлений соединений наносили на белый 384-луночный мелкообъемный полистирольный планшет, как описано в параграфе 2.2. Затем 5 мкл О8Т-тТОК и европий-анти-О8Т антитела, с последующими 5 мкл Тгасег-314 (конечный объем для анализа 10 мкл) выдерживали при комнатной температуре. Стандартный реакционный буфер для ЬайЬаксгееп™ анализа на связывание киназы содержал 50 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 5 мМ МдС1₂, 1 мМ ЕОТА, 0,01% Р1иготс Р-127. Планшеты считывали через 60 мин в 8упегду2 ридере, применяя время интегрирования 0,2 мкс и задержку 0,1 мкс.

Для расчета излучательного соотношения сигнал, испускаемый при 665 нм акцептором (А1еха Р1иог® 647-меченная Тгасег-314), делят на сигнал, испускаемый при 620 нм донором (Еи³+анти-О8Т антитело).

Контроль для 0% ингибирования обеспечивает плацебо соединений (90% ДМСО в Н2О). Контроль для относительного 100% ингибирования осуществляют добавлением 10 мкМ в смеси, содержащей О8ТтТОК и европий анти-О8Т антитело. Дополнительный контроль для абсолютного 0% ингибирования обеспечивают Еи³+анти-О8Т антителом без О8Т-тТОК.

Клеточные анализы для РI3Кα, -β и -δ.

А1рйа8сгееп (гомогенный анализ, усиленной за счет эффекта близости люминесценции, АЛЬФА, Регкт Е1тег) представляет собой нерадиоактивный способ анализа близости, основанный на изучении цепочек гранул, для исследования биомолекулярных взаимодействий в формате гомогенного микротитрационного планшета. Торговое название 8игеРие обозначает А1рЬа8сгееп анализы, которые приспособлены для количественной оценки фосфорилирования эндогенных клеточных белков в клеточных лизатах, применяя подобранные пары антител, которые состоят из антифосфокиназного и антикиназного антитела. Анализ обеспечивает получение характеристик киназной сигнализации в клетках, а также измерение эффектов киназных ингибиторов. А1рЬа8сгееп способ обеспечивает несколько преимуществ по сравнению со стандартными способами анализа, такими как ЕЫ8А, поскольку он избегает требующих много времени процедур промывки и облегчает обработку планшета. Кроме того, его можно миниатюризировать по меньшей мере до 384-луночного формата и обеспечить чувствительность до фемтомолярного диапазона в зависимости от сродства антител, включенных в отдельный А1рйа8сгееп 8игеР1ге набор для анализа. Высокую чувствительность достигают внутренним амплификационным механизмом, который включает получение молекул синглетного кислорода. 8игеР1ге наборы для анализа являются имеющимися в продаже для конкретных мишеней и включают пары проверенных антител (Регк1пЕ1тег). Данное сообщение описывает общие способы, применяемые для А1рйа8сгееп 8игеРие анализов и соответствующие полуавтоматизированные стадии для стандартного анализа киназных ингибиторов в клеточных анализах.

Клеточные линии Ка!-1, стабильно сверхэкспрессирующие активированные изоформы РОК класса I Ка!-1 рВАВЕриго Муг-НА-Ьр110 δ (Ка1-1_И3К5) и Ка!-1 рВАВЕриго М\г-НЛ-Нр110а (^1-^3^) и Ка!-1 рВАВЕриго Муг-НА-Ьр110 β (Каΐ-1_РI3β) получали, как описано (Мака 8.М., 81апГГег Р., Вгиеддеп I., Риге! Р., 8сЬпе11 С., РгЬксЬ С., ВгасЬтапп 8., СЬепе Р., бе Ромег А., 8сЬоетакег К., РаЬЬго И., ОаЬпе1 И., 8таопеп М., МигрЬу Ь., Ршап Р., 8е11егв Оагаа-ЕсЬемегпа С. (2008), Мо1. Сапсег ТЬег. 7:1851-63 и

Мата 8.М., РессИ 8., Вгиеддеп I., НиЬ К., 8сЬпе11 С., РгЬксЬ С., №де1 Т., ^ектапп М., ВгасЬтапп 8., ИогксЬ М., СЬепе Р., 8сЬоетакег К., Ое Ромег А., Мепе/ек И., РаЬЬго И., 8е11егк Оагаа-ЕсЬеуета С., УоЬма С.Р. (2011), Мо1. Сапсег ТЬег., принято в печать). Все клеточные линии выращивали в готовой питательной среде (ЭМЕМ с большим содержанием глюкозы, 10% (об./об.) фетальная бычья сыворотка, 1% (об./об.) МЕМ №АА, 10 мМ НЕРЕ8, 2 мМ Ь-глутамин, пиромицин (10 мкг/мл для КаЫ-РИ^ и КаМ-РО^, 4 мкг/мл для Ра1-1_Р!3 β), 1% (об./об.) пенициллин/стрептомицин) до 90% конфлюентности при 37°С/5% СО₂/90% влажности во влажной СО₂ камере и разделяли дважды в неделю.

Следующие материалы применяли для р-АКТ(8473) детекции в клеточных лизатах Ка!-1: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (ИМЕМ) с высоким содержанием глюкозы (О1Ьсо !пу|1годеп, Ваке1, 8\Уй/ег1апб, каталожный №41965), фетальная бычья сыворотка, инактивированная нагреванием, ОнайПеб (НЛ РВ8; ОЛсо [пуйгодеп, Ваке1, 8\Уй/ег1апб, партия №16140), МЕМ заменимые аминокислоты (№АА; ОЛсо [пуйгодеп, Ваке1, 8\Уй/ег1апб, каталожный №11140), НЕРЕ8 (О1Ьсо [пуйгодеп, Ваке1, 8\Уй/ег1апб, каталожный №15630), пенициллин/стрептомицин (Реп/81гер, 100х; ОЛсо Iην^ί^οдеη, Ваке1, 8\Уй/ег1апб, каталожный №15140-122), Ь-глутамин (О1Ьсо Iην^ΐ^οдеη, Ваке1, 8\Уй/ег1апб, каталожный №25030), пиромицин (81дта А1бпсЬ, ВисЬк, 8\Уй/ег1апб, каталожный №Р9620), ДМСО (МЕКСК, И1еЬкоп, 8\Уй/ег1апб, каталожный №8,02912,2500), Н₂О, МбЬр-Н₂О, если не указано иначе (МШиРОРЕ ООЛРОООЫ, МбЬроге, 2ид, 8\Уй/ег1апб), бычий сывороточный альбумин (В8А; 81дта А1бпсЬ, ВисЬк, 8\\б/ег1апб каталожный №А8412), 8игеР1ге р-Ак! 1/2 (8ег473) набор для анализа (РегкшЕ1тег, 8сЬ\уег/епЬасЬ, 8\Уй/ег1апб, каталожный №ТОКА850К).

- 33 027987

В р-Ак1(З473) ЗигеИге анализе измеряют фосфорилирование эндогенного клеточного Ак1 1/2 по Зег473 в клеточных лизатах. Применяя клетки Ка1-1. стабильно экспрессирующие туг-НА-меченные варианты изоформ р110 каталитической субъединицы человеческих ΡΠΚδ, ΡΠΚα или ΡΠΚβ, анализ разрабатывали в виде способа с двумя планшетами в 384-луночном формате.

Для испытания соединений клетки высевали при плотности 4000 (Каΐ-1_ΡI3Κδ), 7500 (Каΐ-1_ΡI3Κα) или 6200 (Каΐ-1_ΡI3Κβ) клеток в 20 мкл готовой питательной среды в 384-луночных планшетах, обработанных клеточными культурами и выращивали при 37°С/5% СО₂/90% влажности в течение 24 ч. Незадолго до переноса соединений готовую среду удаляли, добавляли 30 мкл буфера для анализа (ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 1х МЕМ №АА, 10 мМ НЕΡЕЗ, 2 мМ Ь-глутамин, 0,1% (мас./об.) ВЗА) и 10 мкл предварительных разбавлений соединений переносили к клеткам. Для испытания после февраля 2010 г. готовую питательную среду заменяли на буфер для анализа, который показал аналогичные результаты (данные не показаны). После обработки соединением в течение 1 ч клетки лизировали добавлением 20 мкл лизисного буфера, дополненного 0,24% (мас./об.) ВЗА. Детекцию р-АКТ(Зег473) осуществляли ЗигеРне р-Ак1 1/2 (Зег473) набором для анализа согласно инструкциям производителя, применяя 5 мкл клеточного лизата в суммарном объеме детекции 12 мкл.

Величины ингибирования Κ.'₅₀ в процентах для каждого соединения при 8 концентрациях (обычно 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,030, 0,010 и 0,003 мкМ) п=2 получали подгонкой сигмоидальной кривой зависимости эффекта от дозы к графику результатов анализа относительно концентрации ингибитора, как описано. Все приближения осуществляли программой ХЬй14 (Ю Викшекк Зо1ийопк, СшИГогб, ИК).

Клеточный анализ для тТОК.

Клеточный анализ (384-луночный формат) разрабатывали для определения эффектов соединений на клеточную активность тТОК в МЕР (фибробласты эмбриона мыши) клетках, полученных из мышей, не содержащих ТЗС1 (комплекс туберозного склероза 1), эффективного супрессора активности тТОК. Изза отсутствия ТЗС1, тТОК констуитивно активируется, приводя в результате к постоянному фосфорилированию ТЬг 389 З6 киназы 1 (З6К1), которая является одной из последующих мишеней тТОК.

Применяя набор ЗигеРше, который позволяет определить фосфорилирование ТЬг389 в З6К1, анализ разрабатывали, проверяли и осуществляли в А1рка-Зсгееп формате, который обеспечивает количественное определение фосфо-Т389 З6К1 в клеточных лизатах. Обработка МЕР ТЗС1-/- клеток тТОК специфическими (или специфическими для тТОК пути) ингибиторами зависящим от дозы способом снижала концентрации фосфо-Т389 в З6К1, позволяя рассчитать величины ^₅₀. Это согласовывалось с величинами, полученными биохимическим тТОК АТФ-связывающим анализом, обеспечивая количественное сравнение эффективности тТОК ингибиторов.

ТЗС1-/- МЕР клетки (К\у1а1ко\укк1 Ό.Ε, Ζ1ι;·ιη§ Н., Вапбига ЕЬ., НеШегдег К.М., С1одаиег М., е1НаккетНе Ν. и Опба Н. (2002) Нит. Мо1. Сепек 11, 525-534) выращивали в среде ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% РВЗ Цпуйгодеп), 2 мМ глутамином и 1% (мас./об.) пенициллином/стрептомицином, при 37°С, 5% СО₂.

Набор ЗигеРйе для определения фосфорилирования Ρ70З6 киназы приобретали у йегк|п Е1тег (р70З6К р-Т389, #ТСК70З50К) и анализ осуществляли согласно инструкции поставщика и согласно общему способу для ЗигеРне анализов. Вкратце, 5 мкл клеточного лизата на лунку переносили в 384луночные белые проксипланшеты (для получения данных по люминесценции) и смешивали с 7 мкл А и 5 мкл В (конечный объем: 12 мкл). После 3-часового выдерживания в темноте при комнатной температуре люминесценцию регистрировали Епущюп ридером (Гегкт Е1тег). Необработанные клетки применяли в качестве контроля (верхний контроль) и в качестве нижнего контроля применяли клетки, обработанные 3 мкМ ВЕΖ235. Аналитическое окно между сигналами, полученными для верхнего и нижнего контролей, определяли как 100% и эффекты соединений выражали в виде ингибирования в процентах. Величины 1С, рассчитывали из кривых зависимости эффекта от дозы графическим экстраполированием.

Результаты, полученные применяя описанные выше анализы, приведены в следующих таблицах.

- 34 027987

Биохимический ΡΙ3Κα

Пример №	ИЗКа/Юьо [мкмоль-л Ч
1	0,006
2	0,078
3	0,005
4	0,047
5	0,023
6	0,071
7	0,061
8	0,057
9	0,010
10	0, 009
11	0, 017
12	0, 008
13	0, 006
14	0, 007
№02007/084786 пример 17	0, 094
№02007/084786 пример 18	0, 091
№02007/084786 пример 8 5	0, 016
№02007/084786 пример 324	0,327
№02007/084786 пример 343	0, 015

Биохимический ΡΙ3Κβ

Пример №	Р13КЬ/1С5о [мкмоль-л-1]
1	0, 009
2	0, 096
3	0, 007
4	0, 159
5	0, 031
б	0,460
7	0, 110
8	0, 067
9	0, 015
10	0, 005
11	0, 010
12	0, 007
13	0, 011
14	0, 006
№02007/084786 пример 17	0,237
№02007/084786 пример 18	0,236
№02007/084786 пример 85	0, 015
№02007/084786 пример 324	1,067
№02007/084786 пример 343	0, 027

- 35 027987

Биохимический ΡΙ3Κδ

Пример №	ΡΙ3Κά/Ιθ50 [мкмоль-ж1]
1	0, 003
2	0, 027
3	0, 004
4	0, 066
5	0, 147
6	0, 079
7	0, 041
8	0, 026
9	0, 010
10	0, 031
11	0, 014
12	0, 004
13	0, 003
14	0, 016
ИО2007/084786 пример 17	0, 848
ИО2007/084786 пример 18	1,978
ИО2007/084786 Пример 85	0, 024
ИО2007/084786 пример 324	1,219
ИО2007/084786 пример 343	0, 110

- 36 027987

Биохимический ΡΙ3Κγ

Пример №	ИЗКд/Юьо [мкмоль-л Ч
1	0, 092
2	5,8
3	0, 110
4	4,5
5	3,5
б	7
7	3
8	0,580
9	0,230
10	0,343
11	0, 102
12	0, 135
13	0, 100
14	0, 027
«02007/084786 пример 17	3,36
«02007/084786 пример 18	7,35
«02007/084786 пример 85	0,315
«02007/084786 пример 324	4,46
«02007/084786 пример 343	0, 170

Анализ связывания тТог

Пример №	тТог/Юьо [мкмоль-л-1]
1	0,251
2	2,8
3	0, 850
4	>9,7
5	2,25
б	4,7
7	2,7
8	0, 960
9
10	1,01
11	0, 870
12	0, 750
13	0,230
14	0,490

- 37 027987

«02007/084786 пример 17	5, 06
«020 07/08478б пример 18	3,3
«02007/084786 пример 85	2,35
«02007/084786 пример 324	>9, 55
«02007/084786 пример 343	>10

Клеточный анализ РВКа

Пример №	НаП1-Р13Ка/1С5о [мкмоль-л^1]
1	0, 031
2	1,07
3	0, 074
4	0,597
5	0,434
6	0, 930
7	0,452
8	0, 173
9	0, 029
10	0, 085
11	0, 032
12	0, 063
13	0, 126
14	0, 046
«02007/084786 пример 17	0,369
«02007/084786 пример 18	0, 606
«02007/084786 пример 85	0, 127
«02007/084786 пример 324	1,730
«02007/084786 пример 343	>10

- 38 027987

Клеточный анализ ΡΙ3Κβ

Пример №	ΗβΠΙ-ΡΙβΚΝ/ΙΟδο [мкмоль-л Ч
1	0, 020
2	0,751
3	0, 033
4	0,757
5	0,201
6	0,420
7	0,430
8	0, 026
9	0,254
10	0, 023
11	0, 026
12	0, 064
13	<0,003
14	0, 007
№02007/084786 пример 17	1,54
№02007/084786 пример 18	1,58
№02007/084786 пример 85	0, 156
№02007/084786 пример 324	5, 31
№02007/084786 пример 343	>10

Клеточный анализ ΡΙ3Κδ

Пример №	ΗβΠΙ-ΡΙβΚά/ΙΟδο [мкмоль-л-1]
1	0,0113
2	0, 105
3	0, 006
4	0,298
5	0, 119
6	0, 144
7	0, 123
8	0, 028
9	0, 011
10	0, 022

- 39 027987

11	0, 020
12	0, 004
13	<0,003
14	0, 004
И02007/084786 пример 17	1,04
И02007/084786 пример 18	1,47
И02007/084786 пример 85	0, 139
ИО2007/084786 пример 324	6, 54
ИО2007/084786 пример 343	0, 105

Клеточный анализ тТОК

Пример №	тТОК 36К(Т389) ТЗС1ко/1С5о [мкмоль-л-1]
1	0, 243
2	>2,27
3	0, 159
4	>2,27
5	0,371
6	>2,27
7	>2,27
8	>4,55
9
10	0,221
11	0, 747
12	0. 274
13	1, 07
14	0,724
ИО2007/084786 пример 17	2,12
ИО2007/084786 пример 18	>2,27
ИО2007/084786 пример 85	1, 03
ИО2007/084786 пример 324	>2,27
ИО2007/084786 пример 343	>2,27

Светостабильность.

Образцы, исследуемые на стабильность к воздействию света, обрабатывали в камере для исследования светостабильности (АЙа§ СРЗ+, серийный номер 0704013). Растворы 1,0 мг/мл в этаноле получали для каждой молекулы и аликвоты 0,5 мл распределяли в подходящие микропробирки. Все измерения осуществляли в двух экземплярах и сравнивали со стандартом, обернутым в алюминиевую фольгу в процессе облучения светом. Растворы подвергали воздействию 19620 кДж/м² в течение 13 ч. Образцы выдерживали при 15°С в процессе эксперимента. После обработки в световой камере растворы анализировали СЭЖХ (СЭЖХ 1, экспериментальная часть) при 254 нм. Площади пиков автоматически интегрировали и процент разрушения рассчитывали в виде разницы площади соответствующего пика в процентах эталонного образца и средней площади пика в процентах образцов, подвергнутых воздействию света (в двух экземплярах).

- 40 027987

Данные, полученные, применяя данный способ, показаны в следующей таблице:

Антипролиферативное ингибирование пролиферации клеточных линий.

Клетки и клеточные культуры, применяемые для исследования соединений.

8С1.-1 и 8СС12В2 представляют собой клеточные линии плоскоклеточного рака кожи (8СС) человека, полученные из природных, плохо дифференцированных 8СС. Клеточная линия 8С1.-1 первоначально была разработана в лаборатории Ν. Ризешд в центре по исследованию рака в Гейдельберге и характеристики ее роста ΐη νϊίΓΟ по сравнению с нормальными кератиноцитами описаны ранее (№е1у е1 а1., 1991). Клеточная линия 8СС12В2 была разработана, как описано ранее (КЬешАаМ & ВескеД, 1981) и получена из кожи лица пациентов мужского пола с трансплантатами, которые проходили иммуносупрессивную терапию в течение 7 лет. Клеточную линию Р)е!гоН562 8СС человека получали в американской коллекции клеточных культур (АТСС). Р)е1гоН562 называют плоскоклеточным раком головы и шеи (Ί ΙΝ8('Ο и ее получали из фарингеальной 8СС опухоли. Клеточная линия Ое1го11562 содержит активирующую мутацию Н1047К Р1К3СА гена. Данная мутация известна как одна из горячих мутаций р110ацепи, делающая данную киназную изоформу констуитивно активной и стимулирующей Αкί/тТΟК путь, независимо от активации рецептора фактора роста. Все клеточные линии 8СС хранили и выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла (ИМЕМ) (СнЬсо; каталожный № #10938), которую дополнительно снабжали 5%ЕС8 (СФсо; #16000-044), 100 мкМ пируватом натрия (СФсо; #11360-039), 10 мМ НЕРЕ8 (СФсо; #91002-066), смесью 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (СФсо; #15070063) и 2 мМ Ь-глутамином (СФсо; #25030-024). Все концентрации указаны в виде конечных концентраций. Клетки размножали в колбах Согшпд СоЛаг с выпускными крышками, применяя один из двух размеров колбы, область наращивания 75 см² (Согшпд; #430641) или 150 см² (Согшпд, #430825). Клеточные культуры стандартно выдерживали при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂ и 80% относительной влажности (тип Негаеиз).

Измерение клеточной пролиферации.

Клетки 8СС или кератиноцитных линий (Ое1го11562, 8СС12В2, 8С1.1, НаСаТ) применяли для анализов пролиферации, когда они достигали приблизительно 80-90% конфлюентности. Затем клетки собирали после опосредованного трипсином выделения из колб для культур, промывали культуральной средой, содержащей 10% ЕС8, считали в гемоцитометре и разбавляли полной культуральной средой с 5% ЕС8, получая плотность клеток 5х10⁴ клеток/мл. 100 мкл данной клеточной суспензии (например, 5000 клеток) переносили в каждую лунку 96-луночного планшета для тканевых культур с белыми стенками (Со^η^ηд-Соδίа^ агйс1е #3917). Затем клеткам позволяли осесть, помещая их в СО₂ инкубатор на 45-60 мин. Затем объем 100 мкл культуральной среды, содержащей двукратную требуемую конечную концентрацию испытуемого соединения, добавляли к каждой лунки из четырех одинаковых лунок. В одну из четырех одинаковых лунок помещали 100 мкл культуральной среды без испытуемого соединения в качестве контроля (показано на фигурах с данными с сокращением по срс.1 на х-оси). Затем клеточные культуры выдерживали в присутствии или отсутствии испытуемых соединений в течение в сумме

- 41 027987

26-28 ч. Клеточную пролиферацию определяли на основе включения бромдезоксиуридина (ВгдИ) в клеточную ДНК, применяя хемилюминесцентный ВгдИ Се11 РгойГегайоп ЕЫ8А (Косйе агйс1е #11 669 915 001). Вкратце, ВгдИ реагент разбавляли 1:100 готовой культуральной средой, получая концентрацию 100 мкМ Вгаи. Из данного раствора 20 мкл добавляли к каждой лунке и клеточную культуру дополнительно выдерживали в течение 16-18 ч при 37°С при 5% СО₂. Анализ на пролиферацию прекращали через 44-46 ч полным удалением культуральной среды и добавлением 200 мкл раствора для фиксации (обеспечиваемым ЕЫ8А набором) в течение 30 мин при комнатной температуре. После дополнительного выдерживания, промывки и способы проявления осуществляли точно, как описано в руководстве для ЕЫ8А анализа, предоставляемом производителем (Косйе). Включение ВиШ в ДНК определяли ВгаН-специфическими антителами и количественно определяли на основе генерирования сигнала, опосредованного люциферазой, сопряженной с антителом. Испускание люминесценции измеряли в νίοΐΟΓ ΙίοΙιΙ 1420 люминесцентном счетчике (Регкт Е1тег) и выражали в виде относительных единиц люминесценции (например, экспериментальные точки, указанные как КЕИ/с) в секунду. Экспериментальные точки для каждой лунки переносили в ^ΐπάο^δ® Ехсе1 электронные таблицы для расчета средних величин и величин стандартного отклонения. По данным величинам строили графики, применяя функцию подгонки к сигмоидальной кривой, имеющуюся в Опдт 7.5® программном обеспечении.

Антипролиферативная активность соединений, измеренная на клеточных линиях 3СС.

Данные, полученные, применяя данные 3СС и кератиноцитные клеточные линии, показаны в следующей таблице. Все величины, указывающие на антипролиферативную активность, представляют собой наномолярные 1С₅₀ концентрации, полученные в двух независимых анализах, применяя или 3СС клеточные линии 3СЙ-1, 3СС12В2, Ое1го11562. или НаСаТ кератиноцитную клеточную линию.

Пример №	5СС12В2	5СЬ-1	Ое5гоЮ562	НаСаТ
измерение	#1	#2	#1	#2	#1	#2	#1	#2
пример 1	1289	703	351	268	598	440	282	298
И02007/08478 б пример 17	5823	4938	4891	3302	3084	4408	2796	3961
И02007/08478 б пример 18	5737	5250	4267	3267	2813	4550	1655	3078
И02007/08478 б пример 8 5	1645	1144	1025	636	1905	1448	1057	1017
И02007/08478 б пример 324	6296		6040		3304		3700
И02007/08478 б пример 343	4861	2471	2624	1683	2393	1371	1616	1490

Все величины представляют собой наномолярные концентрации 1С₅₀.

Проникновение через кожу.

Проникновение через кожу/проникающую способность одного репрезентативного соединения настоящего изобретения испытывали следующим способом.

Ιη уйго испытание для определения проникновения через кожу и проникающей способности. Соединение наносили в виде 0,5% растворов в пропиленгликоле, смешанном или с этанолом, или с олеиловым спиртом, на кожу свиньи, помещенную в статические диффузионные ячейки Франца. В конце 48-часового периода воздействия концентрации лекарственного средства измеряли в коже (после удаления рогового слоя) и в приемнике. Раствор приемника представляет собой смесь двух объемных частей физиологического раствора с фосфатным буфером (РВ3) и одной объемной части фетальной телячьей сыворотки (ЕС3).

Проникновение через кожу и проникновение ίη уйго

При мер	Источник кожи (а)	Состав	Концентрация [%]соединения	Концентрация в коже [мкг/г]	Скорость проникновения [нг/см2/ч]
1	свинья	РО + этанол (7+3) ф)	0,5	10,8+1,7	1,0+0,3
1	свинья	РО/ОА (9+1) (С)	0,5	107,6+31,4	301,1+129,5

- 42 027987

Концентрации в коже указаны в виде средней величины ± стандартное отклонение четырех определений.

(a) Кожу получали из 4-месячных фермерских свиней (Бапдгасе X ВеШзсНез ЫеБсНхует).

(b) 7 объемных частей пропиленгликоля (ΡΘ), смешанные с 3 объемными частями этанола.

(c) 9 объемных частей ΡΘ, смешанные с 1 объемной частью олеилового спирта (ОА).

Соединение примера 1 хорошо проникают в кожу свиньи ΐη νΐΐΓο, тогда как скорость проникновения через кожу свиньи является низкой, указывая на слабое системное воздействие. Кожа свиньи является аналогичной человеческой коже в отношении защитной функции и структуры.

Испытания ΐη νίνο для определения проникновения в дерму обработанных местно свиней.

Небольшие участки кожи (4 см²) на дорсолатеральной стороне молодых домашних свиней обрабатывали местно 0,5% растворами или суспензиями через различные интервалы времени (2 и 24 ч) перед определением количества лекарственного средства. В данном эксперименте обрабатывали 4 свиней и соединение вводили в соответствующей композиции в 4 различных места. Кожные лоскуты с обработанными местами в центре вырезали и удаляли. Кожные лоскуты расстилали и нагретые металлические блоки помещали на испытуемые места на 1 мин, вызывая отделение эпидермиса от дермы. После удаления отделенных эпидермальных слоев дермальные слои толщиной 1 мм получали из обработанной кожи с удаленным эпидермисом дерматомом. Из данных слоев собирали вырезанные 6 мм образцы (6 мм 0) и анализировали их на концентрацию испытуемого соединения ЖХ/МС. Описанный способ осуществляли, осторожно избегая загрязнения дермальных образцов соединением, присоединенным к поверхности эпидермиса.

В следующей таблице представлены дермальные концентрации соединения примера 1 в дермисе свиней при нанесении накожно в виде указанных составов. Данные в таблице приведены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения 8 определений (например, восемь образцов кожи анализировали для каждого момента времени).

Кожная РК ΐη νίνο у свиней

	Состав композиции с	Кожная концентрация	Кожная концентрация
Пример	соединением, добавленным	[мкг/г],	[мкг/г],
	до 0,5%	измеренная	измеренная
		через 2 часа	через 24 часа
1	1% Тмееп®80, 98% вода, 1% НРМС	0,95±0,42	1,29±0,54
1	10% ОА, 89% вода, 1% 5ер1пео	2,58±0,48	0,37±0,13
1	10% ЕПОН, 89% воды, 1% НРМС	1,57±0,52	0,бб±О,38
1	10% ЕПОН, 10% РС, 79% вода, 1% НРМС	0,68±О,2	0,52±0,24

Указано среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения восьми определений.

Т\уееи®80: моноолеат полиоксиэтиленсорбитана;

ОА: олеиловый спирт;

ΡΘ: пропиленгликоль;

ЕЮН: этанол;

НРМС: гидроксипропилметилцеллюлоза.

Соединение примера 1 хорошо проникает в кожу свиньи, достигая дермиса ΐη νίνο после единичного нанесения.

- 43 027987

Claims (17)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (I) и/или его фармацевтически приемлемая соль:

где К¹ представляет собой метил, этил или гидроксиметил;

К² представляет собой фенил, который является незамещенным или замещенным в мета- и/или пара-положениях 1 или

2 заместителями, независимо выбранными из метокси для мета-положения и из С₁С₅-алкокси, гидрокси-С2-С₄-алкокси или С1-С2-алкокси-С₂-С₄-алкокси для пара-положения, или пиридил, или 5-членный моноциклический гетероарил, содержащий 2 гетероатома, выбранных из N или 8.

замещенным в мета- и/или пара-положениях 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из метокси для мета-положения и из С1-С₅-алкокси, гидрокси-С₂-С₄-алкокси или С1-С₂-алкокси-С₂-С₄-алкокси для пара-положения.

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил-[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метил-5-пиридин-3илоксазолидин-2-она, (48.58) -3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил-[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4гидроксиметил-5-фенилоксазолидин-2-она, (48.58) -3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил-[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метил-5- 44 027987 тиазол-2-илоксазолидин-2-она, (48.58) -3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-(гидроксиметил)-5(4-(2-метоксиэтокси)фенил)оксазолидин-2-она, (48.58) -3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(4-(2гидроксиэтокси)фенил)-4-(гидроксиметил)оксазолидин-2-она или (48.58) -3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-(гидроксиметил)-5(4-(3-гидроксипропокси)фенил)оксазолидин-2-она.

3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил-[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-этил-5-пиридин-3илоксазолидин-2-она,

4. Соединение по п.1 или 2, где К² представляет собой пиридил.

5. Соединение по п.1 или 2, где

К² представляет собой 5-членный моноциклический гетероарил, содержащий 2 гетероатома, выбранных из N или 8.

6. Соединение по любому из пп.1-5, где К¹ представляет собой метил.

7. Соединение по любому из пп.1-5, где К¹ представляет собой этил.

8. Соединение по любому из пп.1-5, где К¹ представляет собой гидроксиметил.

9. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, выбранное из (48,5К)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил-[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метил-5тиазол-2-илоксазолидин-2-она, (48*,58*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-этил-5-(4метоксифенил)оксазолидин-2-она, (48.58) -3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-(гидроксиметил)-5(4-метоксифенил)оксазолидин-2-она, (48*,5К*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-этил-5фенилоксазолидин-2-она, (48.58) -3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-метил-5фенилоксазолидин-2-она, (4К*,5К*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-этил-5-(3метоксифенил)оксазолидин-2-она, (48,5К)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-этил-5-(тиазол-2ил)оксазолидин-2-она,

10. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль, которое представляет собой (48,5К)-3(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил-[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метил-5-тиазол-2илоксазолидин-2-он.

11. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью ингибировать фосфатидилинозитол3-киназу (РЮК), содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-10, или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемый носитель.

12. Способ лечения у субъекта заболеваний, зависящих от РЩ киназ, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-10.

13. Лекарственное средство для лечения заболеваний, зависящих от РГО киназ, представляющее собой соединение по любому из пп.1-10 или его фармацевтически приемлемую соль.

14. Применение соединения по любому из пп.1-10 или его фармацевтически приемлемой соли в лечении немеланомного рака кожи или предраковых стадий немеланомного рака кожи.

15. Применение по п.14, где немеланомный рак кожи представляет собой плоскоклеточный рак и предраковая стадия немеланомного рака кожи представляет собой актинический кератоз.

16. Применение соединения по любому из пп.1-10 или его фармацевтически приемлемой соли в получении лекарственного средства для лечения немеланомного рака кожи или предраковых стадий немеланомного рака кожи.

17. Применение по п.16, где немеланомный рак кожи представляет собой плоскоклеточный рак и предраковая стадия немеланомного рака кожи представляет собой актинический кератоз.