ES2639793T3 - Inhibidores de CDC7 - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
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DESCRIPCION
Inhibidores de CDC7
La presente invencion se refiere a compuestos de isoindolinona, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, que inhiben CDC7 y pueden ser utiles para tratar cancer.
CDC7 es una serina/treonina quinasa que desempena un papel clave en el inicio de la replicacion y regulacion del ADN del punto de control del ciclo celular en fase S. La sobrerregulacion de CDC7 se ha observado en numerosas lmeas celulares tumorales. Ademas, la inhibicion de CDC7 en dichas lmeas celulares ha dado lugar a la detencion del ciclo celular. Por lo tanto, la inhibicion de CDC7 puede ser util para la terapia del cancer.
Los inhibidores de CDC7 son conocidos en la tecnica. Los compuestos de isoindolinona tambien se conocen en la tecnica. El documento WO 2005/100351 describe ciertos compuestos de isoindolinona como compuestos reactivos al receptor nicotmico de acetilcolina.
Sigue existiendo la necesidad de proporcionar inhibidores de CDC7 alternativos para el tratamiento del cancer. Por consiguiente, la presente invencion proporciona inhibidores de CDC7 que pueden ser utiles para tratar el cancer.
La presente invencion proporciona un compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin- 1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
La presente invencion proporciona un compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin- 1-ona, isomero 2, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
La presente invencion proporciona un compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin- 1-ona, isomero 1, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
Como una realizacion particular, la presente invencion proporciona el compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona. Como otra realizacion particular, la presente invencion proporciona el compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2. Como una realizacion particular adicional, la presente invencion proporciona el compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1.
La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, y un vetuculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, y un vetuculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, o una sal
farmaceuticamente aceptable de la misma, y un vehfculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion proporciona adicionalmente una composicion farmaceutica que comprende 3-(5-fluoropirimidin-4- il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, y un vehfculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, y un vehfculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion proporciona adicionalmente una composicion farmaceutica que comprende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, isomero 1, y un vehfculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
La presente invencion proporciona un procedimiento para tratar cancer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma. La presente invencion proporciona un procedimiento para tratar cancer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona. La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para tratar cancer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma. La presente invencion proporciona adicionalmente un procedimiento para tratar cancer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2. La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para tratar cancer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma. La presente invencion proporciona adicionalmente un procedimiento para tratar cancer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de
3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1.
La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en terapia. La presente invencion proporciona 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma,
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para su uso en el tratamiento de cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona para su uso en terapia. La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica la 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-
4-il)isoindolin-1-ona.
La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en terapia. La presente invencion proporciona 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica 3-(5-
fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, para su uso en terapia. La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1- ona, isomero 2, para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica 3-(5-
fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2.
La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en terapia. La presente invencion proporciona 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1, para su uso en terapia. La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1- ona, isomero 1, para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1.
La presente invencion proporciona el uso de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. La presente invencion tambien proporciona el uso de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1- ona en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer.
La presente invencion proporciona el uso de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. La presente invencion tambien proporciona el uso de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
La presente invencion proporciona el uso de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. La presente invencion tambien proporciona el uso de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 1, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
La presente invencion proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, hidrato en forma cristalina. La presente invencion tambien proporciona 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol- 4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, hidrato en una forma cristalina caracterizada por un patron de difraccion de rayos X de polvos que tiene picos caractensticos, en 20 ± 0,2, que se producen a 22,27 y uno o mas de 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 y 23,13.
La presente invencion proporciona un compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-
1-ona, isomero 2, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, que se identifica alternativamente como (3R)-
3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
La presente invencion proporciona un compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin- 1-ona, isomero 1, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, que se identifica alternativamente como (3S)- 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
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Como una realizacion particular, la presente invencion proporciona el compuesto que es (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4- il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona. Como una realizacion particular adicional, la presente invencion proporciona el compuesto que es (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona.
La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende (3R)-3-(5-fluoropirimidin-
4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, y un vehnculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion proporciona adicionalmente una composicion farmaceutica que comprende (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona y un vehnculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, y un vehnculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion proporciona adicionalmente una composicion farmaceutica que comprende (3S)-3- (5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(lH-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona y un vehnculo, diluyente o excipiente
farmaceuticamente aceptable.
La presente invencion proporciona (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en terapia. La presente invencion proporciona (3R)-3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil- 6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
La presente invencion proporciona (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona para su uso en terapia. La presente invencion proporciona (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1- ona para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona.
La presente invencion proporciona (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en terapia. La presente invencion proporciona (3S)-3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
La presente invencion proporciona (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona para su uso en terapia. La presente invencion proporciona (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1- ona para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento del cancer, comprendiendo la composicion farmaceutica (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona.
La presente invencion proporciona el uso de (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. La presente invencion tambien proporciona el uso de (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
La presente invencion proporciona el uso de (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. La presente invencion tambien proporciona el uso de (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
La presente invencion proporciona (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, hidrato en forma cristalina. La presente invencion tambien proporciona (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, hidrato en una forma cristalina caracterizada por un patron de difraccion de rayos X de polvos que tiene picos caractensticos, en 20 ± 0,2, que se producen a 22,27 y uno o mas de 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 y 23,13.
Ademas, la presente invencion proporciona realizaciones preferidas de los procedimientos y usos descritos en la presente memoria, en los que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de mama triple negativo, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer colorrectal, cancer hematologico, y leucemia.
Como se ha utilizado anteriormente, y a lo largo de la descripcion de la invencion, se entendera que los siguientes terminos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:
Un "vehnculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable" es un medio generalmente aceptado en la tecnica para el suministro de agentes biologicamente activos a mairnferos, por ejemplo, seres humanos.
"Sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a las sales inorganicas y organicas relativamente no toxicas de los compuestos de la presente invencion.
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"Cantidad efectiva" significa la cantidad del compuesto, o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de la presente invencion o composicion farmaceutica que contiene un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de la presente invencion que inducira la respuesta biologica o medica o el efecto terapeutico deseado en un tejido, sistema, animal, mairnfero o humano que esta siendo buscado por el investigador, veterinario, medico u otro especialista.
Los terminos "tratamiento", "tratar", "que trata", y similares, se entiende que incluyen la desaceleracion o la inversion de la progresion de un trastorno. Estos terminos incluyen tambien aliviar, mejorar, atenuar, eliminar o reducir uno o mas smtomas de un trastorno o condicion, incluso si el trastorno o condicion no se elimina realmente e incluso si la progresion del trastorno o condicion no se desacelera o invierte.
Los compuestos de la presente invencion son capaces de reaccion, por ejemplo, con una serie de acidos inorganicos y organicos para formar sales farmaceuticamente aceptables. Tales sales farmaceuticamente aceptables y metodologfa comun para prepararlas son bien conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 66, No. 1, enero de 1977.
Los compuestos de la presente invencion se formulan preferiblemente como composiciones farmaceuticas que utilizan un vehmulo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable y se administran por una variedad de vfas. Preferentemente, dichas composiciones son para administracion oral. Tales composiciones farmaceuticas y procedimientos para prepararlas son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro et al., eds., vigesima primera ed., Mack Publishing Co., 2005).
La cantidad del compuesto de la presente invencion realmente administrada sera determinada por un medico bajo las circunstancias relevantes, incluyendo la condicion a tratar, la via de administracion elegida, el compuesto o compuestos reales administrados de la presente invencion, la edad, peso y la respuesta del paciente individual, y la severidad de los smtomas del paciente. Las dosis por dfa normalmente caen dentro del intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 mg. En algunos casos, los niveles de dosificacion por debajo del limite inferior del intervalo antes mencionado pueden ser mas que adecuados, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis aun mayores. Los niveles de dosificacion pueden ser determinados por un experto en la tecnica.
Los compuestos de la presente invencion, o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, pueden prepararse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica, asf como los descritos en las Preparaciones y Ejemplos a continuacion. Las etapas espedficas de smtesis para cada una de las rutas descritas pueden combinarse de diferentes maneras para preparar los componentes de la invencion, o de sus sales farmaceuticamente aceptables.
Los reactivos y materiales de partida se encuentran generalmente facilmente disponibles para un experto en la tecnica. Otros pueden fabricarse mediante tecnicas estandar de qmmica organica y heterodclica, tecnicas conocidas por los expertos en la materia y los procedimientos descritos en los ejemplos que se presentan a continuacion, incluyendo cualquier procedimiento nuevo. Las siguientes Preparaciones y Ejemplos ilustran adicionalmente la invencion. Los compuestos ilustrados en la presente memoria se nombran y numeran usando Symyx Draw Version 3.2, Symyx Draw Version 4.0, o IUPACNAmE ACDLABS.
Los isomeros, enantiomeros o diastereoisomeros individuales pueden ser separados o resueltos por un experto en la tecnica en cualquier punto conveniente en la smtesis de compuestos por procedimientos tales como tecnicas de cristalizacion selectiva o cromatograffa quiral (vease, por ejemplo, Enantiomers, Racemates, and Resolutions (J. Jacques, et al., John Wiley and Sons, Inc., 1981)). La designacion "isomero 1" se refiere al compuesto que eluye primero a partir de la cromatograffa quiral. La designacion "isomero 2" se refiere al compuesto que eluye despues a partir de la cromatograffa quiral.
Tal como se usa en la presente memoria, los siguientes terminos tienen los significados indicados: "ADP" se refiere a difosfato de adenosina; "ATP" se refiere a trifosfato de adenosina; "Balb/c" se refiere a albino; "BCA" se refiere a acido bicinconmico; "DMSO" se refiere a dimetilsulfoxido; "DTT" se refiere a ditiotreitol; "EDTA" se refiere a acido etilendiaminotetraacetico; "ee" se refiere a exceso enantiomerico; "Ex" se refiere a ejemplo; "FBS" se refiere a suero fetal bovino, "FP" se refiere a la polarizacion de fluorescencia, "GAPDH" se refiere a gliceraldetffdo 3-fosfato deshidrogenasa; "HEC" se refiere a hidroxietilcelulosa; "HEPES" se refiere a acido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazin- etanosulfonico; "h" se refiere a hora u horas; "IC50" se refiere a la concentracion de un agente que produce el 50 % de la respuesta inhibitoria maxima posible para ese agente; "IVTI" se refiere a la inhibicion objetivo in vivo; "MCM2" se refiere a la protema de mantenimiento del minicromosoma; "min" se refiere a minuto o minutos; "PBS" se refiere a solucion salina tamponada con fosfato; "P.O." se refiere a la administracion oral; "Prep" se refiere a la preparacion; "PVDF" se refiere a difluoruro de polivinilidina; "RPMI" se refiere al Roswell Park Memorial Institute; "RNasa" se refiere a ribonucleasa; "RuPhos" se refiere a 2-diciclohexilfosfino-2',6'-diisopropoxibifenilo; "Rt" se refiere al tiempo de retencion; "SDS-Page" se refiere a electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio; "SCX" se refiere a intercambio cationico fuerte; "SFC" se refiere a cromatograffa de fluidos supercnticos; y "THF" se refiere a tetrahidrofurano.
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Preparation 1
5-bromo-2-yodobenzoato de metilo
Se anade acido 5-bromo-2-yodobenzoico (1.998 g, 6,11 mol) en porciones a una solution a 20 °C de acido sulfurico (100 ml) en metanol (13 l). Se calienta la suspension a reflujo durante 24 horas, luego se enfria a 20 °C y se elimina el disolvente a presion reducida. Se vierte el residuo en una mezcla 1:1 del eter metil-terc-butflico y agua enfriada con hielo (20 l) y se separan las fases. Se extrae la fase acuosa con eter metil-terc-butflico (1,5 l), se combinan las fases organicas y se lava con NaOH 0,2 M acuoso (5 l), se lava con cloruro de sodio acuoso saturado, se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y evapora bajo presion reducida. Se disuelve el producto crudo en eter de petroleo a 40-45 °C (10 l), se filtra a traves de una almohadilla de tierra de diatomeas y se evapora a presion reducida. Se disuelve el residuo en eter de petroleo (5 l) y se enfria a-50°C, se filtran los primeros solidos cosechados, se lava el solido con eter de petroleo frio. Se evapora el licor madre, se disuelve de nuevo el solido en eter de petroleo (1 l), se enfria a- 50°C y se filtra una segunda cosecha. Se combinan la primera y segunda cosechas y se secan al aire libre para proporcionar el compuesto del tftulo como un solido amarillo (1880 g, 90 %).
Preparacion 2
5-bromo-2-etilbenzoato de metilo
Se anaden dietil-zinc (3.050 ml, 3,05 moles, hexano 1 M) durante 3 horas a una solucion a 5 °C de 5-bromo-2- yodobenzoato de metilo (1.876 g, 5,50 moles) y cloruro de (1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno)paladio (II) (40 g, 0,05 mol). Se calienta la mezcla a 60-65 °C durante 2 horas y se agita durante 2 horas adicionales, luego se enfria a 1015 °C y se vierte en HCl acuoso 1 M enfriado con hielo (10 l). Se separan las fases, se extrae la capa acuosa con eter metil-terc-butflico (2 x 10 l), se combinan las fases organicas, se lavan con cloruro de sodio acuoso saturado, se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se evaporan a presion reducida. Se disuelve en acetato de etilo (400 ml) y se anade eter de petroleo (8 l), luego se deja reposar a 15-20°C durante 16 horas y se filtra a traves de una almohadilla de gel de silice, se lava con acetato de etilo/eter de petroleo (1:20, 8 l) y se evapora el filtrado a presion reducida para proporcionar el compuesto del tftulo como un aceite amarillo palido (1.306 g, 96 %). ES/MS m/e: (79Br/ 81Br) 243/245 (M+H).
Preparacion 3
5-bromo-2-(1-bromoetil)benzoato de metilo
Se anaden N-bromosuccinimida (1.090 g, 6,12 moles) y 2,2'-azo-bis-isobutironitrilo (11,4 g, 0,069 moles) a una solucion a 20 °C de 5-bromo-2-etilbenzoato de metilo (1.296 g, 5,33 mol) en tetracloruro de carbono (7 l). Se calienta a reflujo durante 4 horas, se enfria a 20-30 °C y se lava con agua (10 l), se extrae la fase acuosa con diclorometano (5 l), se combinan las capas organicas y se lavan con agua (10 l), Na2SO3 (5 l) y cloruro de sodio acuoso saturado. Se seca con sulfato de sodio, se filtra y se evapora a presion reducida para producir el compuesto del tftulo como un solido amarillo palido (1.791 g, 104 % en crudo). ES/Ms m/z: 241 (M-HBr).
Preparacion 4
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Se anaden 5-bromo-2-(1-bromoetil)benzoato de metilo solido (1.724 g, 5,35 mol) a una solucion de (R)-1-(4- metoxifenil)etanamina disponible comercialmente (BePharm, WZG111219-071; 974 g, 6,44 mol) y trietilamina (1.710 ml, 12,26 moles) en metanol (12 l). Se calienta la mezcla durante 10 horas a 67°C y luego se evapora a sequedad bajo presion reducida. Se divide el residuo con acetato de etilo (5 l) y HCl acuoso 1 N (10 l), se separan las fases, se lava la fase organica de nuevo con HCl 1 N acuoso (5 l), bicarbonato de sodio saturado, cloruro de sodio acuoso saturado, luego se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se evapora a presion reducida. Se disuelve el aceite rojo oscuro en eter metil-terc-butflico (750 ml) y se anade eter de petroleo (3 l) con agitacion vigorosa. Se filtran los solidos, se lava con eter metil-terc-butflico/eter de petroleo (1:8), eter de petroleo, se seca al aire libre para producir el compuesto del titulo como un solido blanquecino (1.014 g, 52 %). ES/EM m/z: 360 (M+H).
Preparation 5
2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1-tetrahidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1-ona
o-
Se combinan 6-bromo-2[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metilisoindolin-1-ona (64 g, 177 mmol), 1-(tetrahidro-2H-pirano-
2- il)-1H-pirazol (67 g, 295 mmol), carbonato de potasio (70 g, 506 mmoles), cloruro de (1,1'-bis(difenilfosfino) ferroceno)paladio (II) (9 g, 11 mmol), dioxano (800 ml) y agua (212 ml) bajo atmosfera de nitrogeno y se calienta a 70-75 °C durante 16 horas. Se anaden 1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H- pirazol (15 g, 54 mmol) y se calienta a 80-85°C durante 2 horas. Se concentra a presion reducida hasta 200 ml, se anade acetato de etilo (500 ml) y agua (500 ml), se agita durante 30 minutos y se filtran los solidos. Se combinan los solidos y la capa organica y se evaporan a presion reducida. Se disuelve el residuo en diclorometano y se filtra a traves de una almohadilla de gel de sflice. Se lava la almohadilla de gel de sflice con diclorometano/acetato de etilo (1:0) y despues (2:1) y se evapora a sequedad bajo presion reducida. Se suspende el solido en una mezcla 2:1 de eter de petroleo/acetato de etilo (600 ml) durante 30 minutos a 25-30°C y se filtra para recoger el solido para producir el compuesto del titulo en forma de un solido blanquecino (68 g, 89 %). ES/MS m/z: 432 (M+H).
Preparacion 6
3- (6-Cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1-tetrahidropiran-2-4-il)isoindolin-1-ona
Se anaden bis(trimetilsilil) amida de sodio (210 ml, 210 mmol, THF 1 M) gota a gota durante 60 minutos a una suspension enfriada con hielo de 2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1-tetrahidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1- ona (62 g, 144 mmol) y 4,6-dicloro-5-fluoropirimidina (31 g, 186 mmol) en tetrahidrofurano (620 ml). Se agita la solucion durante 60 minutos a 0 °C y despues se diluye la mezcla con acetato de etilo (1 l) y agua (1 l). Se lava la fase organica con cloruro de sodio acuoso saturado y se evapora a presion reducida. Se disuelve el residuo en eter de petroleo/acetato de etilo 1:1, se filtra a traves de una almohadilla de gel de sflice y se evapora para producir el compuesto del titulo en forma de una espuma amarilla (83 g, 103 %). ES/EM m/z: 562 (M+H).
Preparacion 7
Se anaden trietilamina (40 ml, 287 mmol) e hidroxido de paladio al 20 % sobre carbono (14 g) a una solution de 3- (6-cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil) etil]-3-metil-6-(1-tetrahidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1-ona (80 g, 142 mmol) en acetato de etilo (2,1 l) y se hidrogena con gas hidrogeno (30 psi) a 20-25°C durante 16 horas. 5 Se repiten las condiciones de reaction con 5 gramos de 3-(6-cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil) etil]-3-metil-6-(1-tetrahidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1-ona. Se combinan ambas reacciones y se filtra a traves de tierra de diatomeas y se evapora para producir el compuesto del titulo en forma de una espuma amarilla (77 g, 102 %). ES/EM m/z: 528 (M+H).
Preparation 8
10 6-Bromo-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-isoindolin-1-ona
Se disolvio 6-bromo-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil) etil]-3-metil-isoindolin-1-ona (2,814 mmol, 1,014 g) en tetrahidrofurano (28 ml). Se anade 4-cloro-5-fluoro-pirimidina (5,628 mmol, 518 ^L) y se enfria a 0 °C. Se anaden hexametildisilazida de potasio (4,502 mmol, 9 ml, 0,5 M en tolueno) durante 7 minutos y se agita durante 1 hora, luego se calienta a 15 temperatura ambiente y se agita durante 90 minutos. Se vierte en eter metil-terc-butilico y HCl 1 M acuoso, se anade agua y se separan las capas. Se lava con HCl acuoso 1 N, se filtra, se lava con cloruro de sodio acuoso saturado, se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra a traves de una almohadilla de 2 cm de gel de silice y se evapora a presion reducida para proporcionar un aceite. Se purifica sobre gel de silice con acetato de etilo/hexano al 20-40 % para producir el compuesto del trtulo como una espuma (547 mg, 43 %). ES/MS m/z: 456 (M+H).
20 Ejemplo 1
3-(5-Fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona
Se disuelve 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1 -tetrahidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin- 1-ona (65 g, 123 mmol) en acido trifluoroacetico (600 ml) y se calienta a 75-80 °C durante 16 horas. Se evapora a 25 presion reducida y se diluye con acetato de etilo (500 ml) y agua (500 ml). Se ajusta el pH de la capa acuosa a 8-9 con NaOH 6 N acuoso, se extrae la capa acuosa con acetato de etilo (3 x 500 ml), se combinan las capas organicas, se lava con cloruro de sodio acuoso saturado, se seca con sulfato de sodio, se filtra, y se evapora bajo presion reducida. Se somete a cromatograffa el producto crudo sobre gel de sflice con acetato de etilo/eter de petroleo al 50100 %. Se combinan las fracciones del producto y se evaporan a presion reducida para producir una espuma 30 amarilla (33 g, 87 % de crudo). Se repiten las condiciones de reaccion con 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4- metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1-tetrahidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1-ona y se combinan los productos (10 g, 18,9 mmol). Se disuelven los productos combinados en metanol y se agita con tiol SiliaBond® (tiol SiliaMetS®) a 15-20°C durante 20 horas, se filtra y evapora bajo presion reducida para producir el compuesto del titulo con 77 % de ee (38 g, 87 %).
35 Ejemplo 2
Se separan el enantiomero principal (isomero 2) de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona (38 g, 123 mmol ) del enantiomero menor (isomero 1) de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin- 1-ona por HPLC quiral preparativa. Cromatografia de fluido supercritico (SFC) (columna: Chiralpak OJ-H (5 m), 30 x 5 250 cm, eluyente: isopropanol al 15 % en CO2, flujo 120 g/min a UV 214 nm). El segundo isomero que eluye
(isomero 2) es el compuesto del trtulo (17 g, 45 %, > 98 % ee). Analisis quiral (columna: Chiralpak OJ-H (5 ^m) 4,6 x 250 mm, eluyente: isopropanol al 20 % en CO2, flujo: 3 ml/min a UV 214 nm, Rt = 5,78 minutos. ES/MS m/z 310 (M+H).
Ejemplo 3
10 3-(5-Fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona
Se combina cloruro de fenetilamina RuPhos paladio (II) (60 ^mol, 43 mg), dioxano (0,5 ml) y terc-butoxido de potasio (tetrahidrofurano 1 M, 60 ^mol, 60 ^L) bajo atmosfera de nitrogeno, se somete a ultrasonido la mezcla durante 0,5 minutos. Se anade la mezcla de catalizadores RuPhos a un recipiente de reaccion bajo atmosfera de nitrogeno que 15 contiene 6-bromo-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metilisoindol-1-ona (544 mg, 1,192 mmol),
4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)pirazol-1-carboxilato de terc-butilo (1,79 mmol, 526 mg), 1,4-dioxano (6 ml), carbonato de sodio (3,6 mmol, 2,4 ml 1,5 M acuoso) y se calienta en un microondas a 150 °C durante 30 minutos. Se diluye la mezcla con acetato de etilo, se lava con carbonato de sodio acuoso 1,5 M, se lava con cloruro de sodio acuoso saturado, se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra a traves de tierra de diatomeas y se evapora 20 hasta un residuo amarillo claro. Se disuelve el residuo en anisol (1 ml) y acido trifluoroacetico (7 ml) y se calienta a 80 °C durante 4 horas, luego se calienta a 70 °C durante 18 horas. Se evapora la mezcla a presion reducida, se disuelve en metanol, se carga sobre una columna SCX de 10 g, se lava con metanol (100 ml), se eluye con amoniaco 2 M en metanol y se evapora. Se purifica sobre 40 g de gel de sflice con un gradiente de metanol/ diclorometano al 1-8 % para producir el compuesto del titulo en forma de una espuma blanca (279 mg, 76 %). 25 ES/EM m/z: 310 (M+H).
Ejemplo 4
3-(5-Fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2, Hidrato
Se suspende (5-fluoropirimidin 4 il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isomero 2 (9,6 g, 0,03 moles) en 30 acetona al 2 % en agua (50 ml) y se agita la mezcla a 50 °C durante 1,5 horas. Se anade acetona (1 ml) y se calienta la mezcla a 65 °C durante 1 hora antes de enfriar lentamente a temperatura ambiente durante 12 horas. Se filtran los solidos y se enjuaga con cuatro volumenes de agua. Se seca el solido al vado a 50 °C durante 6 horas para producir el compuesto del titulo (8,6 g, 90 %).
Difraccion de rayos X de polvos
35 Los patrones de XRD de solidos cristalinos se obtienen en un difractometro de rayos X de polvos Bruker D4 Endeavor, equipado con una fuente CuKa (A = 1,54060 A) y un detector Vantec, que funciona a 35 kV y 50 mA. La muestra se escanea entre 4 y 40° en 20, con un tamano de paso de 0,0087° en 20 y una velocidad de barrido de 0,5 segundos/paso, y con divergencia de 0,6 mm, 5,28 mm de antidispersion fija y ranuras de detector de 9,5 mm. El polvo seco se empaca en un soporte de muestras de cuarzo y se obtiene una superficie lisa usando un portaobjetos 40 de vidrio. Es bien conocido en la tecnica de cristalografia que, para cualquier forma cristalina dada, las intensidades
relativas de los picos de difraccion pueden variar debido a la orientacion preferida resultante de factores tales como la morfologfa y el habito del cristal. Cuando estan presentes los efectos de la orientacion preferida, las intensidades de los picos se alteran, pero las posiciones de los picos caractensticos del polimorfo no cambian. Ademas, tambien es bien conocido en la tecnica de cristalografia que, para cualquier forma cristalina dada, las posiciones de los picos 5 angulares pueden variar ligeramente. Por ejemplo, las posiciones de los picos pueden cambiar debido a una variacion en la temperatura o la humedad a la que se analiza la muestra, el desplazamiento de la muestra o la presencia o ausencia de un patron interno. En el presente caso, una variabilidad de la posicion del pico de ± 0,2 en 20 tendra en cuenta estas variaciones potenciales sin obstaculizar la identification inequfvoca de la forma cristalina indicada. La confirmation de una forma cristalina puede hacerse con base en cualquier combination unica de picos 10 distintivos (en unidades de ° 20), tfpicamente los picos mas prominentes. Los patrones de difraccion de la forma cristalina, recogidos a temperatura ambiente y humedad relativa, se ajustan con base en los picos estandar NIST 675 a 8,85 y 26,77 grados 2-theta.
Una muestra preparada del Ejemplo 4 se caracteriza por un patron de XRD usando radiation CuKa con picos de difraccion (valores 2-teta) como se describe en la Tabla 1 a continuation. Espedficamente, el patron contiene un 15 pico a 22,27 en combinacion con uno o mas de los picos seleccionados del grupo que consiste en 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 y 23,13 con una tolerancia para los angulos de difraccion de 0,2 grados.
Tabla 1
- Picos de difraccion de rayos X de polvos del Ejemplo 4
- Pico
- Angulo (2-Theta °) Intensidad ( %)
- 1
- 7,16 14
- 2
- 13,46 51
- 3
- 14,82 19
- 4
- 16,54 32
- 5
- 16,66 32
- 6
- 16,96 14
- 7
- 18,10 27
- 8
- 18,84 15
- 9
- 19,33 15
- 10
- 21,78 15
- 11
- 22,27 100
- 12
- 23,13 30
- 13
- 23,51 15
- 14
- 23,86 13
- 15
- 25,99 18
- 16
- 27,21 14
Ejemplo 5
20 (3R)-3-(5-Fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, diclorhidrato, solvato de acetonitrilo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Se anade HCl 0,25 M (1 ml) a 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona (Ejemplo 3, 0,084 mg, 0,27 mmol) y se somete a ultrasonido la muestra. Todo el material es soluble. Se evapora la mezcla a sequedad, dando como resultado un residuo aceitoso. Se anade acetonitrilo (2 ml) y la solucion se vuelve amarilla y comienzan a formarse cristales. Se afslan cristales individuales para obtener la difraccion de rayos X de un solo cristal. Se determina que la muestra es un solvato de acetonitrilo de una sal de dihidrocloruro. Los atomos de cloro proporcionan una dispersion anomala suficiente para permitir determinar la estereoqmmica absoluta de la molecula por difraccion de rayos X de un solo cristal.
Para el analisis cristalografico por rayos X se utiliza un especimen incoloro transparente de tipo prisma de CisHi7Cl2FN6O, dimensiones aproximadas 0,180 mm x 0,200 mm x 0,220 mm. Se recogen un total de 3.318 estructuras. El tiempo total de exposicion es de 1,84 horas. Las estructuras se integran con el paquete de software Bruker SAINT utilizando un algoritmo de estructura estrecha. La integracion de los datos utilizando una celula unitaria ortorrombica produjo un total de 13.411 reflejos a un angulo 0 maximo de 66,30° (resolucion de 0,84 A), de los cuales 3.304 son independientes (redundancia promedio 4,059, completitud = 97.8 %, Rn = 7,25 %, Rsig = 6,30 %) y 2.885 (87,32 %) fueron mayores que 2a (F2). Las constantes finales de celda de a = 8,0583 (2) A, b = 36,3803 (9) A, c = 6,96840 (10) A, volumen = 2.042,88 (8) A3, se basan en el refinamiento de los centroides de XYZ de 6.295 reflexiones por encima de 20 a (I) con 11,24 ° <20 < 132,0°. Los datos se corrigen por los efectos de absorcion utilizando el procedimiento de barrido multiple (SADABS). La relacion de transmision aparente minima a maxima es de 0,761. Los coeficientes de transmision mmimo y maximo calculados (basados en el tamano del cristal) son 0,5466 y 0,6033.
La estructura se resuelve y se refina usando el paquete de software Bruker SHELXTLMR, usando el grupo espacial P 21 21 2, con Z = 4 para la unidad de la formula, C-ieH-i/C^F^O. El refinamiento anisotropo final de mmimos cuadrados de toda la matriz en F2 con 255 variables convergio en R1 = 4,27 %, para los datos observados y wR2 = 10,80 % para todos los datos. La bondad del ajuste es de 1,066. El pico mas grande en la smtesis de densidad electronica de la diferencia final es de 0,295 e"/A3 y el agujero mas grande es -0,204 e"/A3 con una desviacion de RMS de 0,056 e"/A3. Con base en el modelo final, la densidad calculada es 1,376 g/cm3 y F(000), 872 e". El parametro de estructura absoluta se refina a 0,0(0), indicando que la estructura absoluta de la molecula es consistente con el compuesto del tttulo. La molecula de disolvente de acetonitrilo esta algo desordenada y por consiguiente se refina isotropicamente, mientras que la (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona y los iones cloruro se refinan anisotropicamente. Este resultado para el Ejemplo 5 establece la estereoqmmica absoluta de la molecula como el enantiomero R, estableciendo asf tambien la estereoqmmica del Ejemplo 3, a partir de la cual se deriva el Ejemplo 5.
Adicionalmente, los Ejemplos 2 y 3 se someten a analisis mediante cromatograffa de fluido supercntico HPLC quiral (SFC) usando las mismas condiciones para determinar el enantiomero presente para cada Ejemplo. (Columna: Chiralcel OJ-H 4,6 mm x 150 mm, isopropanol al 20 % en CO2, 5 ml/min, UV 225 nm). Para el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3, el isomero 1 eluye a 1,53' y el isomero 2 eluye a 1,81-1,84'. En este analisis, el Ejemplo 2 tiene 100 % de ee y el Ejemplo 3 tiene 96,4 % de ee. Estos resultados demuestran que el enantiomero presente tanto para el Ejemplo 2 como para el Ejemplo 3 es el isomero 2. Dado que la estereoqmmica absoluta para el Ejemplo 3 es el enantiomero R, como se menciono anteriormente, y los Ejemplos 2 y 3 se identifican ambos por HPLC quiral SFC como el isomero 2, la estereoqmmica absoluta para el Ejemplo 2 es, por lo tanto, tambien el enantiomero R. Ademas, dado que el Ejemplo 2 se utiliza para preparar el Ejemplo 4, la estereoqmmica absoluta para el Ejemplo 4 es el enantiomero R.
Ensayo de formacion de imagenes Acumen® para la deteccion de MCM2 fosforilado en celulas H1299
El Acumen® eX3 se utiliza para determinar el efecto de los compuestos sobre la formacion de MCM2 endogeno fosforilado en Serina 53 (pMCM2-S53). La fosforilacion de MCM2 por CDC7 se determina usando anticuerpo anti- pMCM2-S53 espedfico y se cuantifica con anticuerpos secundarios etiquetados en forma fluorescente mediante Acumen® eX3 para controlar la actividad de CDC7 en las celulas. Se sabe que la fosforilacion de MCM2 en Serina 53 esta correlacionada con la inhibicion de CDC7.
Se mantienen celulas H1299 (ATCC # CRL-5803) en medio de cultivo RPMI-1640 (Hyclone SH30809.01) complementado con FBS al 10 %. Las celulas se recogen utilizando procedimientos estandar de cultivo de celulas y despues se cuentan utilizando el analizador de viabilidad de celulas Vi-Cell XR (Contador de Beckman). Se siembran en placa 3.000-6.000 celulas H1299 en 100 pl de medio de cultivo en cada pozo de las placas negra/clara Biocoat Poli-D-Lisina de 96 pozos con placas de cultivo de celulas fondo plano BioCoatMR de multiples pozos (Becton Dickinson) ref. 356640 y se incuban durante la noche a 37°C, 5 % de CO2.
Las celulas se tratan con el compuesto de prueba (50 pL/pozo) diluido en medio que contiene DMSO al 0, 6 % y se incuba durante 4 horas a 37°C. A cada pozo se le anade formaldetudo al 7,4 % (150 pL) diluido con PBS a partir de un patron de formaldehido al 37 % y se incuban las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se elimina el formaldetudo y se anade metanol fno (100 pl). Las placas se incuban durante 20 minutos a 4°C para permeabilizar las celulas. Las placas se lavan 3 veces con 100 pl/pozo de PBS. Las placas se incuban con 50 pL/pozo de anticuerpo anti pMCM2-S53 diluido 1:1.000 (generado usando NP_004517.2 (vease la base de datos de secuencias PubMed), conjugacion con hemocianina de lapa de ojo de cerradura usando activacion de maleimida, a traves del
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protocolo estandar de inmunizacion de conejo de 90 d^as para la produccion de anticuerpos policlonales de conejo (anticuerpos Thermo Scientific Pierce, Thermo Fisher Scientific)) en PBS complementado con BSA al 2 % durante la noche a 4 °C. Las placas se lavan con PBS (4 x 100 pL/pozo) y se incuban en 100 pL/pozo de anticuerpo secundario anti-IgG de conejo Alexa Fluor 488 de cabra diluido 1:1000 (Invitrogen CA1l304s) en PBS durante 1 hora a temperature ambiente. Las placas se lavan con PBS (4 x 100 pL/pozo). Se anaden PBS (50 pL/pozo) que contiene RNasa (50 pg/ml) y yoduro de propidio (15 pM) y se incuban las placas a temperature ambiente durante 30 minutos. Las placas se sellan con sello negro y se leen en el Acumen® eX3 (TTP LABTECH) utilizando un filtro optico de 500530 nanometros y 575-640 nanometros para Alexa Fluor 488 y yoduro de propidio, respectivamente. El numero de celulas positivas a pMCM2-S53 se normaliza para el numero de celulas totales por cada pozo y se calculan como porcentaje de inhibicion con respecto a los controles en placa. Se genera el porcentaje de inhibicion de los datos de concentracion de compuesto de diez puntos para una ecuacion logfstica de cuatro parametros para derivar el valor de IC50.
Los compuestos dentro del ambito de la invencion se analizan en este ensayo sustancialmente como se ha descrito anteriormente. Se determina que el compuesto del Ejemplo 2 tiene una IC50 de 0,261 pM ± 0,004 (n = 2). Se determina que el compuesto del Ejemplo 3 tiene una IC50 de 0,29 pM. Se determina que el compuesto del Ejemplo 4 tiene una 1C50 de 0,29 pM ± 0,0813 (n = 2). Estos resultados muestran que los Ejemplos 2, 3 y 4 inhiben pMCM2- S53 en el ensayo de celulas H1299 y, por tanto, son inhibidores de CDC7.
Ensayo de enzimas CDC7/DBF4 in vitro
El ensayo de la quinasa ADP-FP TranscreenerMR se usa para determinar los valores de IC50 del compuesto frente a la quinasa CDC7/DBF4. El ensayo de la quinasa ADP-FP evalua la actividad de CDC7/DBF4 en presencia de inhibidores compuestos midiendo la concentracion de ADP formada en una reaccion de quinasa. La reaccion de la quinasa se realiza usando un volumen de reaccion de 25 microlitros en una placa de ensayo de 96 pozos. Para el ensayo de ADP-FP, se anaden los reactivos para obtener las condiciones de reaccion finales de HEPES (25 mM) a pH 7,5, Triton® X-100 al 0,03 %, cloruro de magnesio (10 mM), DTT (1 mM), MCM2 (400 nM) (aminoacido 1-209, un sustrato fisiologico de CDC7/DBF4), espermina (4 mM), CDC7/DBF4 (2,640 ng/ml) (CDC7/DBF4 humana recombinante expresada en celulas de insecto), dimetilsulfoxido al 4 % y diluciones en serie del compuesto (diluido 1:3 a partir de 20.000 nM a 1 nM). Se anaden la enzima y el sustrato al compuesto seguido de ATP a 5 pM para iniciar la reaccion. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 60 minutos.
Para el formato de ADP-FP, se anaden 25 microlitros de un reactivo de deteccion de la inactivacion que contiene HEPES (52 mM) a pH 7,5, EDTA (20 mM), cloruro de sodio (0,4 M), polioxietilenglicol dodecil eter (0,02 %) (BRIJ- 35mr), anticuerpo anti-ADP (10 pg/ml) y aDp (4 nM) trazador Transcreener® ADP Alexa fluor® 633 para inactivar la reaccion. Las placas se incuban durante 1 hora, y despues se leen en un lector de multiples marcadores Wallac EnVisionMR 2104 (PerkinElmer) en el modo de polarizacion de fluorescencia usando filtros de polarizacion de longitud de onda Ex620nm y Em688nm. Los datos sin procesar de milipolarizacion (mP) se convierten en ADP micromolar usando una curva patron de ADP/ATP preparada comenzando con una dilucion en serie de ADP 5 pM 1:1 en tampon de reaccion a 0,0025 pM de ADP. El valor de IC50 para cada compuesto se obtiene usando los datos de inhibicion en porcentaje calculados a partir de los datos de la reaccion de ADP en pM con relacion a los controles en placa (controles de la enzima inhibida con DMSO frente a EDTA 100 mM). El porcentaje de inhibicion y los datos de concentracion del compuesto en diez puntos se ajustan a una ecuacion logfstica de cuatro parametros.
Los compuestos dentro del ambito de la invencion se prueban en este ensayo sustancialmente como se ha descrito anteriormente. Se determina que el compuesto del Ejemplo 2 tiene una IC50 de 3,7 nM. Se determina que el compuesto del Ejemplo 3 tiene una IC50 de 4,5 nM. Se determina que el compuesto del Ejemplo 4 tiene una IC50 de 3,3 nM ± 0,634 (n = 2). Los resultados muestran que los Ejemplos 2, 3 y 4 inhiben la produccion de ADP en el ensayo enzimatico in vitro y, por tanto, son inhibidores de CDC7.
Ensayo antiproliferativo in vitro
La actividad antiproliferativa in vitro del Ejemplo 2 se determina mediante ensayos de recuento del numero de celulas contra un panel de 114 lrneas celulares de cancer de origen colorrectal, de mama, de pulmon y de sangre (leucemia) obtenidas de ATCC, HSRRB, RIKEN o ECACC. Las celulas se cultivan y se mantienen en medios segun las instrucciones del proveedor. Se determina el tiempo de duplicacion del numero de celulas de cada lmea celular y todas las lrneas celulares estan libres de contaminacion por micoplasma. Las celulas se cultivan durante la noche en placas de 96 pozos antes de la adicion del compuesto para los ensayos de actividad anti-proliferativa. La densidad optima de siembra celular se evalua cuidadosamente para cada una de las lrneas de celulas sembrando el cultivo celular con 4 densidades de celulas diferentes en 100 pL de medio y teniendo en consideracion su tiempo de duplicacion y tamano de las celulas. A continuacion, se selecciona la densidad de siembra que proporciono alrededor del 90 % de confluencia al final de dos tiempos de duplicacion para la prueba del compuesto. La estaurosporina se usa en una dilucion 1:3 como referencia. El Ejemplo 2 se prepara como un patron de DMSO 4 mM y se diluye en medio de cultivo en una relacion 1:2. Se anaden 50 pl del medio que contiene el compuesto a cada pozo del cultivo de 96 pozos durante la noche para producir las concentraciones finales deseadas de 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,312; 0,156; 0,078 pM y control de DMSO. Cada concentracion de tratamiento tiene pozos duplicados. Las celulas se cultivan adicionalmente durante dos tiempos de duplicacion en presencia del compuesto. Al final del
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tiempo de tratamiento, las celulas se examinan en primer lugar bajo un microscopio para observar los cambios morfologicos, tal como la muerte celular o el aumento evidente del tamano de la celula. Las celulas en cada pozo duplicado se recogen por separado. Se recogen primero las celulas adherentes mediante tripsinizacion. Las celulas recogidas se resuspenden en medio de cultivo y se cuentan utilizando un contador de celulas.
Un compuesto dentro del ambito de la invencion se analiza en este ensayo sustancialmente como se ha descrito anteriormente. Como se presenta en la Tabla 2 a continuacion, el compuesto del Ejemplo 2 demuestra una actividad antiproliferativa significativa contra la mayona de las 114 lmeas celulares de cancer ensayadas a concentraciones farmacologicamente relevantes (< 8 |jM). Ademas, aproximadamente el 10 % de las lmeas celulares de cancer muestran una sensibilidad particular al compuesto, como se demuestra por la muerte masiva de las celulas que ocurre para estas celulas cancerosas dentro de 2 penodos de tiempo de tratamiento de duplicacion. La mayona de estas lmeas celulares de cancer particularmente sensibles se derivan de cancer colorrectal y leucemico. La sensibilidad se confirma ademas in vivo en los modelos de tumor de xenoinjerto, tales como Colo-205 y SW620 (veanse los detalles a continuacion). Estos datos demuestran que el Ejemplo 2 tiene amplia actividad antiproliferativa in vitro en las lmeas celulares ensayadas.
Tabla 2: Actividad anticancerosa in vitro de amplio espectro del compuesto del Ejemplo 2
- Lmeas celulares cancerosas
- Numero de lmeas celulares Numero de lmeas celulares Numero de lmeas celulares que mueren rapidamente
- (IC50 < 8 mM)
- (IC50 > 8 mM)
- Colorrectal
- 29 18 11 4
- Pulmon
- 39 29 10 2
- Mama
- 17 10 7 0
- Leucemia
- 23 18 5 5
- Otros
- 6 4 2 1
- Total
- 114 79 35 12
Inhibicion objetivo in vivo (IVTI) de CDC7 sobre la fosforilacion de MCM2-S40/41 (pMCM2-S40/41) con el modelo del tumor de xenoinjerto Colo-205
Se mantienen celulas cancerosas colorrectales colo-205 humanas (ATCC # CCL-222) en medio RPMI 1640 que contiene FBS al 10 %. Se recogen las celulas en crecimiento en fase logantmica, se lavan y se resuspenden en una mezcla 1:1 de medio libre de suero y MatrigelMR (Becton Dickinson). Se inyectan subcutaneamente a razon de 5 x 106 celulas/animal/sitio en el flanco trasero como modelos de xenoinjerto de tumor subcutaneo en ratones hembra Balb/c (nu/nu) (6-8 semanas de edad con un peso corporal de 20 a 25 gramos/raton). A los animales se les asigna al azar a un volumen tumoral medio de ratones de 150 a 250 mm3, (v = 1 x w x 0,536 donde 1 = mayor del diametro medido y w = menor del diametro perpendicular). El compuesto es administrado por P.O. en una formulacion estandar al 1 % de HEC p/v, P80 al 0,25 % v/v, antiespumante 1510-US al 0,05 % v/v. Los tumores se recogen 4 horas despues de la dosificacion y se rompen mediante homogeneizacion en tampon de lisis (Invitrogen) que contiene inhibidor de proteasa (Roche) e inhibidor de fosfatasa (Roche o Sigma). La concentracion de protema a partir de lisados tumorales se determina mediante el ensayo BCA (Thermo Scientific) y se separan 5 a 10 jg de protema mediante SDS-PAGE estandar (gel CriterionMR de BioRad) o (gel ePageMR de Invitrogen). Las protemas se transfieren luego a membrana de PVDF o nitrocelulosa y se prueban con anticuerpos contra pMCM2-S40/41 (Bethyl Laboratories # A300-788A) o GAPDH (Fitzgerald 10R-G109A o Abcam ab9485) segun el fabricante y el protocolo estandar de transferencias Western. Se determinan los niveles de pMCM2-S40/41 y se cuantifican ya sea por los generadores de imagenes Licor o FUJI y se normalizan al nivel total de GAPDH. La inhibicion del porcentaje de cambio de la intensidad de la banda de pMCM2-S40/41 se calcula utilizando la intensidad media de los tumores de control tratados con vehmulo normalizados a la GAPDH como la senal maxima. La siguiente formula se utiliza para calcular el porcentaje de inhibicion de la senal en los grupos de tumores tratados: Porcentaje de inhibicion = (datos normalizados - max normalizado) / (cero - max normalizado)*100. El valor de TED70 relaciona la dosis precisa del compuesto necesario para inhibir al 70 %, la fosforilacion promedio mediada por CDC7/DBF4 de pMCM2 normalizado a GAPDH ( % de inhibicion objetivo) en un experimento de xenoinjerto in vivo a las 4 horas despues de una dosis oral. La TEC70 relaciona la concentracion precisa en plasma del compuesto necesaria para inhibir al 70 % la fosforilacion promedio mediada por CDC7/DBF4 de pMCM2 normalizada a GAPDH ( % de inhibicion objetivo) en un experimento de xenoinjerto in vivo a las 4 horas despues de una dosis oral.
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Se prueba un compuesto dentro del ambito de la invencion en este ensayo, sustancialmente como se ha descrito anteriormente. La TED70 se genera a partir de un grafico de dosis y % de inhibicion de pMCM2 y para el Ejemplo 3 es de 2,6 mg/kg. La TEC70 se genera utilizando la dosis, el % de inhibicion de pMCM2 y la concentracion en plasma al 70 % de inhibicion. La TEC70 para el Ejemplo 3 es de 1,8 pM. Estos datos demuestran que un compuesto dentro del ambito de la presente invencion inhibe la fosforilacion mediada por CDC7/DBF4 de pMCM2 en un experimento de xenoinjerto de raton in vivo 4 horas despues de una dosis oral en ratones.
Eficacia antitumoral en el modelo de xenoinjerto de raton SW620 de carcinoma colorrectal humano
Se estudia la actividad anticancengena in vivo del Ejemplo 4 en el modelo de tumor de xenoinjerto de raton SW620 de lmea celular de adenocarcinoma colorrectal humano, que se preve que sea sensible con base en los datos del ensayo proliferativo de recuento de celulas in vitro descritos anteriormente. La lmea celular SW620 se obtiene de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultiva en medio l-15 de Leibovitz con suero bovino fetal al 10 % siguiendo las instrucciones de la ATCC. Se inyecta subcutaneamente una suspension de celulas SW620 (5,0 x 106/0,2 ml) al flanco derecho de cada raton Balb/c desnudo hembra artmico. Los ratones (5 a 6 semanas de edad a la llegada) se obtienen del Shanghai Sippr-bk Laboratory Animals Ltd. Tras la recepcion y durante todo el estudio, los animales se alojan a razon de 5 animales por jaula en jaulas de fondo solido de tamano apropiado en contacto con paja como lecho. Los animales se aclimatan durante 7 dfas antes de la implantacion de las celulas SW620. Los animales se alimentan con dieta para roedores certificada por Shanghai Laboratory Animal Center con un 23 % de protema sin restriccion y el agua del grifo esterilizada en autoclave se proporciona tambien sin restriccion. La habitacion para los animales se mantiene en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Cuando el volumen del tumor alcanza un promedio de 154,9 mm3 (9 dfas despues de la implantacion del tumor), los animales portadores de tumores se agrupan aleatoriamente en 9 grupos (8 animales/grupo) con volumen tumoral medio y peso corporal similares. El peso corporal medio de los ratones portadores de tumores era de 17,3 g. El compuesto se formula en HEC al 1 % p/v, P80 al 0,25 % v/v y antiespumante 1520-US al 0,025 % v/v en agua desionizada mediante sonicacion con sonda durante 15 minutos sobre hielo y la formulacion del compuesto se prepara diariamente para dosificacion de los animales. El compuesto formulado se administra en dosis de 10,4, 20,8 y 31,2 mg/kg (que contienen 10, 20 y 30 mg/kg de ingrediente farmaceutico activo API, respectivamente) dos veces al dfa (BID) por administracion oral forzada (0,1 ml/20 g) durante 2 semanas. La dosificacion BID se realiza aproximadamente con espaciamiento de 8 horas (aproximadamente 9 am y 5 pm cada dfa). El vehmulo tambien se administra BID como el brazo de control del estudio. El volumen del tumor y el peso corporal se miden 3 veces por semana de una manera ciega. El volumen tumoral se determina mediante mediciones del calibre (mm) y usando la formula para una esfera elipsoide: volumen tumoral (mm3) = longitud x anchura2/2, donde longitud y anchura se refieren a las dimensiones perpendiculares mayores y menores recogidas en cada medicion. El comportamiento del animal y la salud del animal se controlan dos veces al dfa durante el penodo de dosificacion. El estudio finaliza el dfa 28 despues de la iniciacion del tratamiento.
El analisis estadfstico de los datos del volumen del tumor comienza con una transformacion de los datos a una escala logantmica para igualar la varianza a traves del tiempo y de los grupos de tratamiento. Los datos logantmicos del volumen se analizan con un analisis de varianza de las medidas repetidas dos veces por tiempo y tratamiento usando los procedimientos MIXED en el software SAS (version 9.3). El modelo de correlacion para las medidas repetidas se eleva a una potencia que es la diferencia real en tiempos. Los grupos tratados se comparan con el grupo de control en cada punto de tiempo. El procedimiento MIXED tambien se utiliza por separado para cada grupo de tratamiento para calcular los valores ajustados y los errores estandar en cada punto de tiempo. Ambos analisis explican la autocorrelacion dentro de cada animal y la perdida de datos que ocurre cuando los animales con tumores grandes son removidos temprano del estudio. Los valores ajustados y los errores estandar se representan para cada grupo de tratamiento en funcion del tiempo. El analisis que compara los grupos tratados con los grupos de control en cada punto de tiempo usa los log en base 10 de los volumenes de los tumores y produce los valores p. Para la significancia estadfstica de los valores p mostrados, "***" = P <0,001.
Si T > T0, se utiliza el calculo del % Delta T/C, %. Si T < T0 la regresion, se utiliza el calculo del %:
Ecuaciones:
T = Volumen final del tumor en el grupo tratado
T0 = volumen basal del tumor en el grupo tratado (se supone que es igual que C0) C = Volumen final del tumor en el grupo de control
C0 = Volumen basal del tumor en el grupo de control (se supone que es igual a T0)
Delta T/C, % = 100 * (T - T0) / (C - C0) Regresion, %= 100 * (T - T0) / T0
Tabla 3: Actividad antitumoral dependiente de la dosis en el modelo tumoral de xenoinjerto de raton SW620
- Grupo
- Compuesto Tratamiento (BID x 14, en forma oral) %T/C dia 16
- 1
- Vetnculo
- 2
- Ejemplo 4 31,2 mg/kg 66,1***
- 3
- Ejemplo 4 20,8 mg/kg ^ Y***
- 4
- Ejemplo 4 10,4 mg/kg 26 1 ***
Un compuesto dentro del ambito de la invencion se prueba en este ensayo sustancialmente como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Tabla 3 anterior, el compuesto del Ejemplo 4 demuestra la actividad 5 anticancerosa in vivo sobre los tumores de xenoinjerto SW620 de una manera dependiente de la dosis cuando se administra BID continuamente durante 2 semanas. Los resultados para todas las dosis probadas son significativamente mas pequenos que para el vetnculo. Esta actividad es consistente con la actividad in vitro observada con la lmea celular cancerosa SW620. A la dosis maxima tolerada de 31,2 mg/kg, el compuesto provoca una regresion tumoral significativa, como se muestra por el valor negativo. Tampoco se observa un crecimiento 10 tumoral significativo durante 2 semanas despues de cesar la dosificacion. Estos datos demuestran que el Ejemplo 4 proporciona actividad antitumoral dependiente de la dosis en un modelo de tumor de xenoinjerto de raton SW620.
Claims (13)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Un compuesto que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo.
- 2. El compuesto segun la reivindicacion 1, que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona.
- 3. El compuesto segun la reivindicacion 1, que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, enantiomero R, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
- 4. El compuesto segun la reivindicacion 3, que es el enantiomero R de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol- 4-il)isoindolin-1-ona.
- 5. El compuesto segun la reivindicacion 1, que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, enantiomero S, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
- 6. El compuesto segun la reivindicacion 5, que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, enantiomero S.
- 7. El compuesto segun la reivindicacion 1, que es 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, o un hidrato del mismo.
- 8. El compuesto segun la reivindicacion 7, que es un hidrato en una forma cristalina caracterizado por un patron dedifraccion de rayos X de polvos que tiene picos caractensticos, en 20 ± 0,2, que ocurre a 22,27 y uno o mas de13,46, 16,54, 16,66, 18,10 y 23.13.
- 9. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto o sal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y un vehuculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
- 10. El compuesto o la sal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en terapia.
- 11. El compuesto o la sal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento de cancer.
- 12. El compuesto o la sal para su uso segun la reivindicacion 11, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de mama triple negativo, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer colorrectal, cancer hematologico y leucemia.
- 13. El compuesto o la sal para su uso segun la reivindicacion 12, en el que el cancer es cancer colorrectal.
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