TWI622396B

TWI622396B - Ｃｄｃ７抑制劑

Info

Publication number: TWI622396B
Application number: TW103107546A
Authority: TW
Inventors: 羅伯狄恩達利; Robert Dean Dally; 提摩西安德魯伍茲; Timothy Andrew WOODS
Original assignee: 美國禮來大藥廠; Eli Lilly And Company
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2018-05-01
Also published as: ME02805B; SI2970221T1; PE20151654A1; US9156824B2; RS56122B1; AU2014228374B2; US20140275121A1; AU2014228374A1; JP6064079B2; TN2015000349A1; ES2639793T3; MY188145A; CN105008351A; CL2015002530A1; JP2016512498A; TW201521726A; BR112015020466B1; PL2970221T3; PH12015502091B1; WO2014143601A1

Abstract

本發明提供異吲哚啉酮化合物或其醫藥上可接受之鹽，其抑制CDC7且因此可用於治療癌症。

Description

CDC7抑制劑

本發明係關於異吲哚啉酮化合物或其醫藥上可接受之鹽，其抑制CDC7且可用於治療癌症。

CDC7係絲胺酸/蘇胺酸激酶，其在抑制DNA複製及調節S期細胞週期檢查點中起關鍵作用。已在許多腫瘤細胞系中觀察到CDC7之上調。而且，抑制該等細胞系中之CDC7導致細胞週期停滯。因此，CDC7抑制可用於癌症療法。

CDC7抑制劑在此項技術中係已知的。異吲哚啉酮化合物在此項技術中亦係已知的。WO 2005/100351揭示某些異吲哚啉酮化合物作為菸鹼乙醯膽鹼受體反應性化合物。

業內仍需要提供用於治療癌症之替代CDC7抑制劑。因此，本發明提供CDC7之抑制劑，其可用於治療癌症。

本發明提供化合物，其為3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。

本發明提供化合物，其為3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2或其醫藥上可接受之鹽。

本發明提供化合物，其為3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1或其醫藥上可接受之鹽。

作為特定實施例，本發明提供化合物，其為3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮。作為另一特定實施例，本發明提供化合物，其為3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2。作為額外的特定實施例，本發明提供化合物，其為3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1。

本發明提供醫藥組合物，其包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮、或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明提供醫藥組合物，其包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦提供醫藥組合物，其包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2、或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦另外提供醫藥組合物，其包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦提供醫藥組合物，其包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1、或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦另外提供醫藥組合物，其包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

本發明提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。本發明提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮。本發明亦提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2或其醫藥上可接受之鹽。本發明亦另外提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2。本發明亦提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1或其醫藥上可接受之鹽。本發明亦另外提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1。

本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法中。本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。

本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，其用於療法中。本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮。

本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法中。本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2或其醫藥上可接受之鹽，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2或其醫藥上可接受之鹽。

本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2，其用於療法中。本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含3-(5- 氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2。

本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法中。本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1或其醫藥上可接受之鹽，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1或其醫藥上可接受之鹽。

本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1，其用於療法中。本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1。

本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於癌症治療之醫藥。本發明亦提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮之用途，其用於製造用於癌症治療之醫藥。

本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於癌症治療之醫藥。本發明亦提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2之用途，其用於製造用於癌症治療之醫藥。

本發明提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於癌症治療之醫藥。本發明亦提供3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1之用途，其用於製造用於癌症治療之醫藥。

本發明提供呈結晶形式之3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2水合物。本發明亦提供呈結晶形式之3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2水合物，其特徵在於X-射線粉末繞射圖案具有在22.27及13.46、16.54、16.66、18.10及23.13中之一或多處出現之特徵峰(以2θ±0.2計)。

本發明提供化合物，其為3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2或其醫藥上可接受之鹽，其另外識別為(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。

本發明提供化合物，其為3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體1或其醫藥上可接受之鹽，其另外識別為(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。

作為特定實施例，本發明提供化合物，其為(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮。作為額外的特定實施例，本發明提供化合物，其為(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮。

本發明亦提供醫藥組合物，其包含(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦另外提供醫藥組合物，其包含(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦提供醫藥組合物，其包含(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦另外提供醫藥組合物，其包含(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3- 甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

本發明提供(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法中。本發明提供(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。

本發明提供(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，其用於療法中。本發明提供(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮。

本發明提供(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法中。本發明提供(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。

本發明提供(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，其用於療法中。本發明提供(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，其用於癌症治療中。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮。

本發明提供之用途(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽，其用於製造用於癌症治療之醫藥。本發明亦提供之用途(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，其用於製造用於癌症治療之醫藥。

本發明提供之用途(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其醫藥上可接受之鹽，其用於製造用於癌症治療之醫藥。本發明亦提供之用途(3S)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮，其用於製造用於癌症治療之醫藥。

本發明提供呈結晶形式之(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮水合物。本發明亦提供呈結晶形式之(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮水合物，其特徵在於X-射線粉末繞射圖案具有在22.27及13.46、16.54、16.66、18.10及23.13中之一或多處出現之特徵峰(以2θ±0.2計)。

此外，本發明提供本文所述之方法及用途之較佳實施例，其中癌症係選自由以下組成之群：乳癌、三陰乳癌、卵巢癌、肺癌、結腸直腸癌、血液癌及白血病。

除非另有說明，否則如上文及整個本發明說明書所用中所用，以下術語應瞭解具有以下含義：

「醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑」係此項技術中普遍接受之用於將生物活性劑遞送至哺乳動物(例如人類)之媒劑。

「醫藥上可接受之鹽」係指本發明化合物之相對無毒的無機及有機鹽。

「有效量」意指研究員、獸醫、醫師或其他臨床醫師所尋求的本發明之化合物或其醫藥上可接受之鹽或含有本發明之化合物或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物將引起組織、系統、動物、哺乳動物或人類之生物或醫療反應或對其之期望治療效應之量。

術語「治療(treatment,treat,treating)」及諸如此類意欲包括減緩或逆轉病症之進展。該等術語亦包括緩解、改善、減弱、消除或減少病症或病狀之一或多種症狀，即使該病症或病狀並未實際上消除且即使該病症或病狀之進展自身並未減緩或逆轉。

本發明化合物能夠與(例如)若干無機及有機酸反應以形成醫藥上可接受之鹽。該等醫藥上可接受之鹽及其一般製備方法為業內已知。例如，參見P.Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS：PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2002)；S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts,」Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，第1期，1977年1月。

本發明化合物較佳使用醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑調配成醫藥組合物並藉由各種途徑投與。較佳地，該等組合物係經口投與。該等醫藥組合物及其製備方法已為此項技術熟知。參見(例如)Remington：The Science and Practice of Pharmacy(A.Gennaro等人編輯，第21版，Mack Publishing公司，2005)。

本發明化合物之實際投與量將由內科醫師根據包含下列之相關情況確定：欲治療之病狀、所選之投與途徑、實際投與之本發明化合物、個體患者之年齡、體重及反應及患者症狀之嚴重程度。每天之劑量通常在約1mg至約1000mg之範圍內。在一些情況中，低於上述範圍之下限的劑量量可能超足量，而在其他情況中可採用仍更大之劑量。劑量量可由熟悉此項技術者確定。

本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽可藉由此項技術已知以及彼等在下文製備及實例中所闡述者之多種程序製備。所述路徑之每一者的特定合成步驟可以任何方式組合以製備本發明之化合物或其醫藥上可接受之鹽。

試劑及起始材料通常可由熟習此項技術者容易地獲得。其他可藉由有機及雜環化學之標準技術(該等技術為熟習此項技術者已知)及下文實例中所闡述之程序(包括任何新穎程序)來製得。以下製備及實例進一步說明本發明。本文所說明之化合物係使用Symyx Draw Version 3.2、Symyx Draw Version 4.0或IUPACNAME ACDLABS來命名及編號。

個別同分異構體、對映異構體或非對映異構體可由熟悉此項技術者在合成化合物中之任一方便點處藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析等方法來分離或拆分(參見例如Enantiomers,Racemates,and Resolutions(J.Jacques等人，John Wiley and Sons公司，1981))。名稱「同分異構體1」係指自對掌性層析首先溶析出之化合物。名稱「同分異構體2」係指自對掌性層析第二溶析出之化合物。

如本文所用，以下術語具有所指示之含義：「ADP」係指二磷酸腺苷；「ATP」係指三磷酸腺苷；「Balb/c」係指白化病；「BCA」係指二金雞鈉酸(bicinchoninic acid)；「DMSO」係指二甲基亞碸；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「ee」係指對映異構過量；「Ex」係指實例；「FBS」係指胎牛血清；「FP」係指螢光偏振；「GAPDH」係指甘油醛3-磷酸去氫酶；「HEC」係指羥乙基纖維素；「HEPES」係指4-(2-羥乙基)-1-六氫吡啶乙磺酸；「hr」係指小時(hour,hours)；「IC₅₀」係指試劑產生50%該試劑可能之最大抑制反應之濃度；「IVTI」係指活體內靶標抑制；「MCM2」係指袖珍染色體維持蛋白；「min」係指分鐘(minute,minutes)；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「P.O.」係指經口投與；「Prep」係指製備型；「PVDF」係指聚二氟亞乙烯；「RPMI」係指羅斯韋爾公園紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)；「RNase」係指核糖核酸酶；「RuPhos」係指2-二環己基膦基-2’,6’二異丙氧基聯苯；「R_t」係指保留時間；「SDS-Page」係指十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；「SCX」係指強陽離子交換；「SFC」係指超臨界流體層析法；且「THF」係指四氫呋喃。

製備1

5-溴-2-碘苯甲酸甲基酯

將5-溴-2-碘苯甲酸(1998g,6.11mol)逐份添加到於甲醇(13L)中之20℃硫酸溶液(100mL)。將懸浮液加熱至回流達24小時，然後冷卻至20℃並在減壓下移除溶劑。將殘餘物傾倒於甲基-第三丁基醚及冰水之1：1混合物(20L)中並分離各相。水相用甲基-第三丁基醚(1.5L)萃取，合併有機相並用0.2M NaOH水溶液(5L)洗滌，用飽和氯化鈉水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下蒸發。將粗製產物溶於40-45℃石油醚(10L)中，藉助矽藻土墊過濾並在減壓下蒸發。將殘餘物溶於石油醚(5L)中並冷卻至-50℃，過濾第一收穫固體，將該固體用冰冷的石油醚洗滌。將母液蒸發，將固體重新溶於石油醚(1L)中，冷卻至-50℃並過濾第二收穫物。將第一及第二收穫物合併並露天乾燥，以提供呈黃色固體之標題化合物(1880g,90%)。

製備2

5-溴-2-乙基苯甲酸甲基酯

將二乙基鋅(3050mL,3.05mol,1M己烷)經3小時添加至5-溴-2-碘苯甲酸甲基酯(1876g,5.50mol)及(1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵)氯化鈀(II)(40g,0.05mol)之5℃溶液。經2小時將混合物加熱至60-65℃並額外攪拌2小時，然後冷卻至10-15℃並傾倒於冰冷的1M HCl水溶液 (10L)中。分離各相，水層用甲基-第三丁基醚(2×10L)萃取，合併有機相，用飽和氯化鈉水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下蒸發。溶解於乙酸乙酯(400mL)中並添加石油醚(8L)，然後使其於15-20℃下靜置16小時並藉助矽膠墊過濾，用乙酸乙酯/石油醚(1：20,8L)洗滌並在減壓下蒸發濾液，以提供呈淡黃色油狀物之標題化合物(1306g,96%)。ES/MS m/e：(⁷⁹Br/⁸¹Br)243/245(M+H)。

製備3

5-溴-2-(1-溴乙基)苯甲酸甲基酯

將N-溴琥珀醯亞胺(1090g,6.12mol)及2,2'-偶氮-雙-異丁腈(11.4g,0.069mol)添加於5-溴-2-乙基苯甲酸甲基酯(1296g,5.33mol)於四氯化碳(7L)中之20℃溶液。加熱回流4小時，冷卻至20-30℃並用(10L)洗滌水，水相用二氯甲烷(5L)萃取，將有機層合併，並用水(10L)、Na₂SO₃(5L)及飽和氯化鈉水溶液洗滌。用硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下蒸發，獲得呈淡黃色固體之標題化合物(1791g,104%粗製品)。ES/MS(m/z)：241(M-HBr)。

製備4

6-溴-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-異吲哚啉-1-酮

將固體5-溴-2-(1-溴乙基)苯甲酸甲基酯(1724g,5.35mol)添加於市售(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙胺(BePharm,WZG111219-071；974g,6.44mol)及三乙胺(1710mL,12.26mol)於甲醇(12L)中之溶液中。將混合物於67℃下加熱10小時，然後在減壓下蒸發至乾燥。殘餘物利用乙酸乙酯(5L)及1N HCl水溶液(10L)進行分配，分離各相，將有機相再次用1N HCl水溶液(5L)、飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉水溶液洗滌，然後經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下蒸發。將深紅色油狀物溶於甲基-第三丁基醚(750mL)中並添加石油醚(3L)，同時劇烈攪拌。將固體過濾，用甲基-第三丁基醚/石油醚(1：8)、石油醚洗滌，露天乾燥，以獲得呈灰白色固體之標題化合物(1014g,52%)。ES/MS m/z：360(M+H)。

製備5

2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-(1-四氫吡喃-2-基吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮

在氮下將6-溴-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-異吲哚啉-1-酮(64g,177mmol)、1-(四氫-2H-吡喃-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼-2-基)-1H-吡唑(67g,295mmol)、碳酸鉀(70g,506mmol)、(1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵)氯化鈀(II)(9g,11mmol)、二噁烷(800mL)及水(212mL)合併並加熱至70-75℃達16小時。添加1-(四氫-2H-吡喃-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼-2-基)-1H-吡唑(15g,54mmol)並加熱至80-85℃達2小時。在減壓下濃縮至200mL，添加乙酸乙酯(500mL)及水(500mL)，攪拌30分鐘，並將固體過濾。將固體與有機層合併並在減壓下蒸發。將殘餘物溶於二氯甲烷中並藉助矽膠墊過濾。用二氯甲烷/乙酸乙酯(1：0)且然後(2：1)洗滌矽膠墊並在減壓下蒸發至乾燥。於25-30℃下將固體於石油醚/乙酸乙酯(600 mL)之2：1混合物中漿化30分鐘並過濾以收集固體，獲得呈灰白色固體之標題化合物(68g,89%)。ES/MS m/z：432(M+H)。

製備6

3-(6-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-(1-四氫吡喃-2-基吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮

將雙(三甲基矽烷基)醯胺鈉(210mL,210mmol,1M THF)經60分鐘逐滴添加於2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-(1-四氫吡喃-2-基吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮(62g,144mmol)及4,6-二氯-5-氟嘧啶(31g,186mmol)於四氫呋喃(620mL)中之冰冷的懸浮液中。將溶液於0℃下攪拌60分鐘且然後將混合物用乙酸乙酯(1L)及水(1L)稀釋。將有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌並在減壓下蒸發。將殘餘物溶於1：1石油醚/乙酸乙酯中，藉助矽膠墊過濾並蒸發，以獲得呈黃色泡沫狀之標題化合物(83g,103%)。ES/MS m/z：562(M+H)。

製備7

3-(5-氟嘧啶-4-基)-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-(1-四氫吡喃-2-基吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮

將三乙胺(40mL,287mmol)及20%碳上氫氧化鈀(14g)添加於3- (6-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-(1-四氫吡喃-2-基吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮(80g,142mmol)於乙酸乙酯(2.1L)中之溶液中並利用氫氣(30psi)於20-25℃下氫化16小時。利用5克3-(6-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-(1-四氫吡喃-2-基吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮重複反應條件。將兩個反應合併並藉助矽藻土過濾並蒸發，以獲得呈黃色泡沫狀之標題化合物(77g,102%)。ES/MS m/z：528(M+H)。

製備8

6-溴-3-(5-氟嘧啶-4-基)-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-異吲哚啉-1-酮

將6-溴-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-異吲哚啉-1-酮(2.814mmol,1.014g)溶解於四氫呋喃(28mL)中。添加4-氯-5-氟-嘧啶(5.628mmol,518μL)並冷卻至0℃。經7分鐘添加六甲基二矽胺化鉀(4.502mmol,9mL,0.5M於甲苯中)並攪拌1小時，然後升溫至環境溫度並攪拌90分鐘。傾倒於甲基-第三丁基醚及1M HCl水溶液中，添加水並分離各層。用1N HCl水溶液洗滌，過濾，用飽和氯化鈉水溶液洗滌，經硫酸鎂乾燥，藉助2cm矽膠墊過濾，並在減壓下蒸發以獲得油狀物。在矽膠上利用20-40%乙酸乙酯/己烷純化，以獲得呈泡沫狀之標題化合物(547mg,43%)。ES/MS m/z：456(M+H)。

實例1

3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮

將3-(5-氟嘧啶-4-基)-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-(1-四氫吡喃-2-基吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮(65g,123mmol)溶於三氟乙酸(600mL)中並加熱至75-80℃達16小時。在減壓下蒸發並用乙酸乙酯(500mL)及水(500mL)稀釋。利用6N NaOH水溶液將水層之pH調整至8-9，水層用乙酸乙酯(3×500mL)萃取，將有機層合併，用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下蒸發。將粗製產物於矽膠上利用50-100%乙酸乙酯/石油醚進行層析。將產物部分合併並在減壓下蒸發，獲得黃色泡沫狀物(33g,87%粗製品)。利用3-(5-氟嘧啶-4-基)-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-(1-四氫吡喃-2-基吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮重複反應條件併合併產物(10g,18.9mmol)。將合併之產物溶於甲醇中並與SiliaBond®硫醇(Silia MetS®硫醇)一起於15-20℃下攪拌20小時，過濾並在減壓下蒸發，以77% ee獲得標題化合物(38g,87%)。

實例2

3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2

藉由製備型對掌性HPLC超臨界流體層析法(SFC)(管柱：Chiralpak OJ-H(5μ),30×250cm；溶析液：於CO₂中之15%異丙醇，流速120g/min，於UV 214nm下)將3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H- 吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮(38g,123mmol)之主要對映異構體(同分異構體2)與3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮之次要對映異構體(同分異構體1)分離。第二溶析同分異構體(同分異構體2)係標題化合物(17g,45%,>98% ee)。對掌性分析(管柱：Chiralpak OJ-H(5μm)4.6×250mm，溶析液：於CO₂中之20%異丙醇，流速：3mL/min，於UV 214nm下，R_t=5.78分鐘。ES/MS m/z：310(M+H)。

實例3

3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮

在氮下將RuPhos苯乙胺氯化鈀(II)(60μmol,43mg)、二噁烷(0.5mL)及第三丁醇鉀(1M四氫呋喃，60μmol,60μL)合併，將混合物音波處理0.5分鐘。在氮下將Ruphos觸媒混合物添加於含有6-溴-3-(5-氟嘧啶-4-基)-2-[(1R)-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-異吲哚啉-1-酮(544mg,1.192mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼-2-基)吡唑-1-甲酸第三丁基酯(1.79mmol,526mg)、1,4-二噁烷(6mL)、碳酸鈉(3.6mmol,2.4mL 1.5M水溶液)之反應容器中並在微波中於150℃下加熱30分鐘。將混合物用稀釋乙酸乙酯，用1.5M碳酸鈉水溶液洗滌，用飽和氯化鈉水溶液洗滌，經硫酸鎂乾燥，藉助矽藻土過濾並蒸發成淺黃色殘餘物。將殘餘物溶於苯甲醚(1mL)及三氟乙酸(7mL)中並加熱至80℃持續4小時，然後加熱至70℃持續18小時。將混合物在減壓下蒸發，溶於甲醇中，加載於10g SCX管柱上，用甲醇(100mL)洗滌，用2M甲醇中之氨溶析並蒸發。在40g矽膠上利用1-8%甲醇/二氯甲烷之梯度純化，獲得呈白色泡沫狀之標題化合物(279mg,76%)。ES/MS m/z：310(M+H)。

實例4

3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2水合物

將3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮同分異構體2(9.6g,0.03mol)懸浮於2%於水中之丙酮(50mL)並將混合物於50℃下攪拌1.5小時。添加丙酮(1mL)並將混合物加熱至65℃持續1小時，然後經12小時緩慢冷卻至室溫。將固體過濾並用四體積之水沖洗。將固體在真空下於50℃下乾燥6小時，以獲得標題化合物(8.6g,90%)。

X-射線粉末繞射

結晶固體之XRD圖案係在配備有CuKa源(λ=1.54060Å)及Vantec檢測器且於35kV及50mA下操作之Bruker D4 Endeavor X-射線粉末繞射計上獲得。在4°與40° 2θ之間掃描樣品，其中步長為0.0087° 2θ且掃描速率為0.5秒/步，且發散狹縫為0.6mm，固定防散射狹縫為5.28mm，且檢測器狹縫為9.5mm。將乾燥粉末堆積於石英樣品架上並使用載玻片獲得光滑表面。在晶體學領域中已熟知，對於任一給定晶體形式，繞射峰之相對強度可由於由諸如晶體形態及習性等因素產生之較佳定向而變化。在存在較佳定向之影響的情況下，峰強度會改變，但多晶型之特徵峰位置不改變。此外，在晶體學領域中亦已熟知，對於任一給定晶體形式，角峰位置可輕微改變。例如，峰位置可由於分析樣品時之溫度或濕度之變化(即，樣品位移)或存在或不存在內標而發生移位。在本發明情況中，±0.2 2θ之峰位置變化性將考慮到該等潛在變化，此並不妨礙所指定晶體形式之明確識別。晶體形式之確認可基於有區別的峰(以° 2θ為單位)、通常更突出的峰之任一獨特組合來實施。在8.85°及26.77° 2θ下基於NIST 675標準峰調整於環境溫度及相對濕度下收集之晶體形式繞射圖案。

實例4之所製備樣品之特徵在於使用CuKa輻射之XRD圖案具有如下表1中所述之繞射峰(2θ值)。特定而言，該圖案含有在22.27處之峰以及選自由13.46、16.54、16.66、18.10及23.13組成之群之峰中之一或多者，其中繞射角公差為0.2度。

實例5

(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮二鹽酸鹽乙腈溶劑合物

將0.25M HCl(1mL)添加於3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮(實例3,0.084mg,0.27mmol)中並音波處理樣品。所有材料均係可溶的。將混合物蒸發至乾燥，獲得油狀殘餘物。添加乙腈(2mL)且溶液變黃並開始形成晶體。將單晶分離用於單晶X-射線繞射。經測定樣品為二鹽酸鹽之乙腈溶劑合物。氯原子提供足夠的異常散射以允許藉由X-射線繞射單晶測定分子之絕對立體化學。

使用尺寸大約0.180mm×0.200mm×0.220mm之C₁₈H₁₇Cl₂FN₆O之透明無色稜柱狀樣本用於X-射線結晶學分析。收集總共3318個圖框。總暴露時間為1.84小時。利用Bruker SAINT軟體包使用狹窄圖框演算法將該等圖框進行整合。使用獲得總共13411個反射至最大θ角度66.30°(0.84Å解析度)之斜方單位晶胞整合數據，其中3304個反射係獨立地(平均冗餘度4.059，完整度=97.8%，R_int=7.25%，R_sig=6.30%)且2885個(87.32%)大於2σ(F²)。最終晶胞常數a=8.0583(2)Å、b=36.3803(9)Å、c=6.96840(10)Å、體積=2042.88(8)Å³係基於高於20σ(I)之6295個反射之XYZ-質心的精修，其中11.24°<2θ<132.0°。使用多層掃描方法(SADABS)校正吸收效應之數據。最小對最大表觀透射率之比率為0.761。經計算，最小及最大透射係數(基於晶體大小)為0.5466及0.6033。

使用Bruker SHELXTL^TM軟體包使用空間群P 21 21 2以Z=4對式單位C₁₈H₁₇Cl₂FN₆O的結構進行解釋並進行精修。利用255個變量對F²進行之最終各向異性全矩陣最小二乘方精修在R1=4.27%處(對於所觀察之數據)且wR2=10.80%處(對於所有數據)收斂。擬合優度為1.066。最終差值電子密度合成中之最大峰為0.295e^-/Å³且最大洞為-0.204e^-/Å³，其中RMS偏差為0.056e^-/Å³。基於最終模型，經計算密度為1.376g/cm³且F(000),872e^-。將絕對結構參數精修至0.0(0)，其指示分子之絕對結構與標題化合物一致。乙腈溶劑分子略嫌混亂且因此以各向同性方式進行精修，而(3R)-3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮及氯離子係以各向異性方式進行精修。實例5之此結構確立分子之絕對立體化學為R對映異構體，由此亦確立自實例5所衍生之實例3的立體化學。

另外，實例2及3經由對掌性HPLC超臨界流體層析法(SFC)使用相同條件進行分析以測定每一實例中存在對映異構體。(管柱：Chiralcel OJ-H 4.6mm×150mm，於CO₂中之20%異丙醇，5mL/min,UV 225nm)。對於實例2及實例3，同分異構體1在1.53’處溶析出且同分異構體2在1.81-1.84’處溶析出。在此分析中，實例2具有100% ee且實例3具有96.4% ee。該等結果證實，實例2及實例3二者存在之對映異構體係同分異構體2。由於如上文所提供實例3之絕對立體化學為R對映異構體，且實例2及3二者均由對掌性HPLC SFC識別為同分異構體2，因此實例2之絕對立體化學亦為R對映異構體。此外，由於實例2用於製備實例4，因此實例4之絕對立體化學為R對映異構體。

Acumen®成像分析用於檢測H1299細胞中之磷酸化MCM2

使用Acumen® eX3來測定化合物對在絲胺酸53處形成內源性磷酸化MCM2(pMCM2-S53)之效應。MCM2藉由CDC7之磷酸化係使用特異性抗-pMCM2-S53抗體來測定且藉由Acumen® eX3量化螢光標記之二級抗體以監測CDC7在細胞中之活性。已知MCM2在絲胺酸53處之磷酸化與CDC7抑制相關聯。

將H1299細胞(ATCC編號CRL-5803)維持於補充有10% FBS之RPMI-1640(Hyclone SH30809.01)生長培養基中。使用標準細胞培養程序收穫細胞且然後使用Vi-Cell XR細胞活力分析儀(Beckman Counter)進行計數。將於100μL生長培養基中之3000-6000個H1299細胞平鋪於具有平坦底部之Biocoat聚-D-離胺酸96-孔黑色/透明板BioCoat^TM多孔(Becton Dickinson)細胞培養板356640之每一孔中並於37℃,5% CO₂下培育過夜。

將細胞用稀釋於含0.6% DMSO之培養基中之測試化合物(50μL/孔)處理並於37℃下培育4小時。向每一孔中添加自37%甲醛儲液用PBS稀釋之7.4%甲醛(150μL)並於室溫下培育30分鐘。移除甲醛並添加冷的甲醇(100μL)。將板於4℃下培育20分鐘以使細胞滲透。將板用100μL/孔PBS洗滌3次。將板以50μL/孔的補充有2% BSA之1：1000稀釋於PBS中之抗pMCM2-S53抗體(使用NP_004517.2(參見PubMed序列數據庫)經由用於兔多株抗體產生之標準90天兔免疫方案(Thermo Scientific Pierce Antibodies,Thermo Fisher Scientific)產生，其使用馬來醯亞胺活化偶聯至鑰孔血藍蛋白)一起於4℃下培育過夜。將板用PBS(4×100μL/孔)洗滌並於100μL/孔之1：1000稀釋於PBS中之山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488二級抗體(Invitrogen CA11304s)中於室溫下培育1小時。將板用PBS(4×100μL/孔)洗滌。添加含有RNase(50μg/ml)和碘化丙啶(15μM)之PBS(50μL/孔)並將板於室溫下培育30分鐘。將板用黑色密封件密封並在Acumen® eX3(TTP LABTECH)上對於Alexa Fluor 488及碘化丙啶分別使用濾光器500-530奈米及575-640奈米來讀取。將pMCM2-S53陽性細胞的數量正規化為每一孔之總細胞並計算為相對於板上(on-plate)對照之抑制%。根據四參數邏輯斯諦方程 (logistic equation)自十點化合物濃度數據生成抑制%以推導出IC₅₀值。

在此分析中實質上如上所述測試本發明範圍內之化合物。經測定，實例2之化合物具有0.261μM±0.004(n=2)之IC₅₀。經測定，實例3之化合物具有0.29μM之IC₅₀。經測定，實例4之化合物具有0.29μM±0.0813(n=2)之IC₅₀。該等結果顯示，實例2、3及4在H1299細胞分析中抑制pMCM2-S53且因此係CDC7抑制劑。

CDC7/DBF4活體外酶分析

使用Transcreener^TM激酶ADP-FP分析來測定化合物針對CDC7/DBF4激酶之IC₅₀值。激酶ADP-FP分析藉由量測在激酶反應中所形成之ADP之濃度來評價在化合物抑制劑之存在下CDC7/DBF4之活性。激酶反應係使用25微升反應體積於96孔分析板中實施。對於ADP-FP分析，添加試劑以獲得以下最終反應條件：HEPES(25mM)pH 7.5、0.03% Triton® X-100、氯化鎂(10mM)、DTT(1mM)、MCM2(400nM)(胺基酸1-209，CDC7/DBF4之生理性受質)、精胺(4mM)、CDC7/DBF4(2,640ng/mL)(於昆蟲細胞中表現之重組人類CDC7/DBF4)、4%二甲基亞碸及化合物之連續稀釋液(1：3稀釋，自20,000nM至1nM)。將酶及受質添加於化合物，隨後添加ATP至5μM以開始反應。將板於室溫下培育60分鐘。

對於ADP-FP型式，添加25微升淬滅檢測試劑以淬滅反應，所述淬滅檢測試劑含有HEPES(52mM)pH 7.5、EDTA(20mM)、氯化鈉(0.4M)、聚氧乙烯二醇十二烷基醚(0.02%)(BRIJ-35^TM)、抗ADP抗體(10μg/mL)及ADP(4nM)Transcreener® ADP Alexa fluor® 633示蹤劑。將板培育1小時，且然後在Wallac EnVision^TM 2104多標記讀取器(PerkinElmer)中以螢光偏振模式使用Ex_620nm及Em_688nm波長之偏光濾波器讀取。使用以5μM ADP開始1：1連續稀釋於反應緩衝液中至0.0025μM ADP製備之ADP/ATP標準曲線將毫偏光度(Millipolarization,mP) 原始數據轉換為微莫耳ADP。使用自μM ADP反應數據相對於板上對照計算之抑制%數據(DMSO對100mM EDTA抑制之酶對照)推導出每一化合物之IC₅₀值。然後將抑制%及十點化合物濃度數據擬合至四參數邏輯斯諦方程。

在此分析中實質上如上所述測試本發明範圍內之化合物。經測定，實例2之化合物具有3.7nM之IC₅₀。經測定，實例3之化合物具有4.5nM之IC₅₀。經測定，實例4之化合物具有3.3nM±0.634(n=2)之IC₅₀。該等結果顯示，實例2、3及4在中活體外酶分析中抑制ADP產生且因此係CDC7抑制劑。

活體外抗增殖分析

藉由針對一組114個自ATCC、HSRRB、RIKEN或ECACC獲得之結腸直腸、乳房、肺及血液(白血病)起源之癌細胞系之細胞數量計數分析測定實例2之活體外抗增殖活性。根據供應商說明書培養細胞並維持於培養基中。測定每一細胞系之細胞倍增時間且所有細胞系均無黴漿菌污染。將細胞於96孔板中培養過夜，然後添加化合物用於抗增殖活性分析。藉由以4個不同的細胞密度將細胞培養物接種於100μL培養基中並計及其倍增時間及細胞大小來仔細地評估每一細胞系之最佳細胞接種密度。然後選擇在兩個倍增時間結束時獲得約90%鋪滿之接種密度用於化合物測試。使用星形孢菌素(Staurosporine)之1：3稀釋液作為參照。將實例2製備成4mM DMSO儲液並以1：2比率稀釋於培養基中。將50μL含有化合物之培養基添加於每一孔之過夜96孔培養物中以產生期望之最終濃度20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.312μM、0.156μM、0.078μM及DMSO對照。每一處理濃度一式雙份在各孔中進行。將各孔在化合物存在下再培育兩個倍增時間。處理時間結束時，首先在顯微鏡下檢查細胞之形態變化，例如細胞死亡或明顯的細胞大小增加。單獨地收集每一一式雙份孔中之細胞。首先藉由胰蛋白酶化收穫黏附細胞。將所收穫之細胞重新懸浮於生長培養基中並使用細胞計數器進行計數。

在此分析中實質上如上所述測試本發明範圍內之化合物。如下表2中所提供，實例2之化合物在藥理學上相關濃度(<8μM)下對所測試114個癌細胞系中之大多數展示顯著之抗增殖活性。此外，約10%之癌細胞系顯示對化合物特別敏感，如由在2個倍增時間處理時期內該等癌症細胞出現大量細胞死亡所展示。該等特別敏感之癌細胞系中之大多數係來自結腸直腸癌及白血病癌。此敏感性進一步在活體內在異種移植物腫瘤模型(例如Colo-205及SW620)(參見下文詳述)中證實。此數據展示，實例2在活體外在所測試細胞系中具有寬抗增殖活性。

對Colo-205異種移植物腫瘤模型之MCM2-S40/41磷酸化(pMCM2-S40/41)之CDC7活體內靶標抑制(IVTI)

將人類colo-205結腸直腸癌細胞(ATCC編號CCL-222)維持於含有10% FBS之RPMI 1640培養基中。收穫對數期生長細胞，洗滌並重新懸浮於無血清培養基與Matrigel^TM(Becton Dickinson)之1：1混合物中。將其以5×10⁶個細胞/動物/位點皮下注射於後側腹部中作為balb/c (nu/nu)雌性小鼠(6-8周，體重為20至25克/小鼠)中之皮下腫瘤異種移植物模型。在平均腫瘤體積為150mm³至250mm³小鼠時將動物隨機化(v=l×w×0.536，其中l=較大的量測直徑且w=較小的垂直直徑)。化合物於標準1% HEC w/v、P80 0.25% v/v、消泡劑1510-US 0.05% v/v調配物中藉由P.O.投與。給藥後4小時收穫腫瘤並藉由於含有蛋白酶抑制劑(Roche)及磷酸酶抑制劑(Roche或Sigma)之裂解緩衝液(Invitrogen)中均質化來破壞。藉由BCA分析(Thermo Scientific)測定腫瘤裂解物之蛋白質濃度並藉由標準SDS-PAGE(BioRad Criterion^TM凝膠)或(Invitrogen ePage^TM凝膠)分離5μg至10μg蛋白。然後將蛋白質轉移至PVDF或硝化纖維素膜並根據製造商及標準西方墨點(western blot)方案用針對pMCM2-S40/41(Bethyl Laboratories編號A300-788A)或GAPDH(Fitzgerald 10R-G109A或Abcam ab9485)之抗體進行探測。測定pMCM2-S40/41之含量並藉由Licor或FUJI成像儀量化並正規化為總GAPDH含量。使用正規化為GAPDH之媒劑處理之對照腫瘤的平均密度作為最大信號計算pMCM2-S40/41譜帶密度之變化抑制%。使用以下公式計算經治療腫瘤組中之信號抑制%：抑制%=(正規化數據-正規化最大值)/(0-正規化最大值)*100。TED₇₀值係在活體內異種移植物實驗中在口服投藥4小時後抑制70%正規化為GAPDH之平均CDC7/DBF4-介導之pMCM2磷酸化(靶標抑制%)所需化合物之精確劑量。TEC₇₀係在活體內異種移植物實驗中在口服投藥4小時後抑制70%正規化為GAPDH之平均CDC7/DBF4-介導之pMCM2磷酸化(靶標抑制%)所需化合物之精確血漿濃度。

在此分析中實質上如上所述測試本發明範圍內之化合物。TED₇₀係自劑量曲線圖及pMCM2之%抑制生成且對於實例3為2.6mg/kg。TEC₇₀係使用該劑量、pMCM2之%抑制及70%抑制之血漿濃度生成。實例3之TEC₇₀為1.8μM。此數據展示，本發明範圍內之化合物在小鼠活體內異種移植物實驗中在小鼠口服投藥4小時後抑制CDC7/DBF4-介導之pMCM2磷酸化。

在人類結腸直腸癌SW620小鼠異種移植物模型中之抗腫瘤功效

在人類結腸直腸腺癌細胞系SW620小鼠異種移植物腫瘤模型中研究實例4之活體內抗癌活性，基於上述活體外細胞計數增殖分析數據預計該模型係敏感的。SW620細胞系係自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)獲得且根據ATCC使用說明在具有10%胎牛血清之Leibovitz's L-15培養基中培養。將SW620細胞懸浮液(5.0×10⁶/0.2mL)皮下注射於每一雌性無胸腺Balb/c裸小鼠之右側腹部。小鼠(運抵時5到6週齡)係自上海西普爾必凱實驗動物有限公司(Shanghai Sippr-bk Laboratory Animals)公司獲得。在收到時及整個研究中，動物以5只動物/籠容納於具有接觸墊料之適當大小實心底部籠中。在植入SW620細胞之前使動物適應7天。動物用上海實驗動物中心(Shanghai Laboratory Animal Center)認證之具有23%蛋白質之大鼠飼料隨意飼餵，並隨意提供高壓蒸汽滅菌之自來水。動物房間維持12小時明/暗循環。當腫瘤體積達到平均值154.9mm³(腫瘤抑制後9天)時，將具有腫瘤之動物隨機分為具有類似的平均腫瘤體積及體重之9組(8只動物/組)。具有腫瘤之動物之平均體重為17.3g。藉由在冰上探針式超音波振盪(probe sonication)15分鐘將化合物調配於存於去離子水中之HEC 1% w/v、P80 0.25% v/v及消泡劑1520-US 0.025% v/v中且每天製備化合物調配物用於動物投藥。將經調配化合物以10.4mg/kg、20.8mg/kg及31.2mg/kg劑量(分別含有10mg/kg、20mg/kg及30mg/kg活性醫藥成份API)一天兩次(BID)藉由經口管飼(0.1mL/20g)投與達2週。BID投藥係以約8小時間隔(每天大約9am及5pm)。媒劑以BID給予作為研究之對照組。以盲化方式一周3次量測腫瘤體積及體重。腫瘤體積係藉由卡尺量測值(mm)且使用關於橢圓球之公式來測定：腫瘤體積(mm³)=長度×寬度²/2，其中長度及寬度係指在每一測量處收集之較大及較小之垂直尺寸。在投藥期間一天兩次監測動物行為及動物健康。研究在治療開始後第28天終止。

腫瘤體積數據之統計學分析以數據轉換成對數尺度開始以平衡跨越時間與治療組之差異。使用SAS軟體(版本9.3)中之MIXED程序利用時間及治療之雙向重複量測變異數分析來分析對數體積數據。重複量測之相關模型係Spatial Power。在每一時間點將治療組與對照組相比較。MIXED程序亦單獨用於每一治療組以計算每一時間點處之經調整平均值及標準偏差。兩個分析均計及每一動物內之自相關及當具有大的腫瘤之動物在初期自研究移除發生之數據丟失。針對每一治療組將經調整平均值及標準偏差對時間繪圖。在每一時間點比較治療組與對照組之分析使用log10腫瘤體積且產生p-值。對於所示p-值之統計顯著性，「***」=P<0.001。

若T>T0，則使用△T/C,%計算。若T<T0，則使用回歸,%計算：

方程式：

T=治療組之最終腫瘤體積

T0=治療組之基線腫瘤體積(假定與C0相同)

C=對照組之最終腫瘤體積

C0=對照組之基線腫瘤體積(假定與T0相同)

△T/C,%=100 *(T-T0)/(C-C0)

回歸,%=100 *(T-T0)/T0

在此分析中實質上如上所述測試本發明範圍內之化合物。如上表3中所提供，實例4之化合物當連續BID給予達2週時以劑量依賴性方式展示對SW620異種移植物腫瘤之活體內抗癌活性。所測試所有劑量之結果均明顯小於媒劑之結果。此活性與利用SW620癌細胞系觀察到之活體外活性一致。在31.2mg/kg之最大耐受劑量處，化合物引起明顯的腫瘤消退，如由負值所展示。而且，在投藥停止後2週未觀察到明顯的腫瘤生長。此數據展示，實例4在SW620小鼠異種移植物腫瘤模型中提供劑量依賴性抗腫瘤活性。

Claims

一種化合物，其係3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮、或其醫藥上可接受之鹽或水合物。
如請求項1之化合物，其係3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮。
如請求項1之化合物，其係3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮R對映異構體或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項3之化合物，其係3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮R對映異構體。
如請求項1之化合物，其係3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮S對映異構體或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項5之化合物，其係3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮S對映異構體。
如請求項1之化合物，其係3-(5-氟嘧啶-4-基)-3-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)異吲哚啉-1-酮或其水合物。
如請求項1至7中任一項之化合物，其用於療法中。
如請求項1至7中任一項之化合物，其用於癌症治療中。
如請求項9之化合物，其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、肺癌、結腸直腸癌及血液癌。
如請求項10之化合物，其中該乳癌為三陰乳癌。
如請求項10之化合物，其中該血液癌為白血病。
如請求項10之化合物，其中該癌症係結腸直腸癌。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之化合物或鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。