BR112015020466B1

BR112015020466B1 - Inibidores de cdc7, seus usos, e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112015020466B1
Application number: BR112015020466-0A
Authority: BR
Inventors: Robert Dean Dally; Timothy Andrew Woods
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2022-07-26
Also published as: EP2970221A1; TWI622396B; GT201500263A; PL2970221T3; WO2014143601A1; LT2970221T; ES2639793T3; IL240962B; CL2015002530A1; EP2970221B1; CN105008351A; HUE033482T2; EA027012B1; BR112015020466A2; PH12015502091A1; DK2970221T3; PH12015502091B1; AU2014228374A1; IL240962A0; UA116125C2

Abstract

INIBIDORES DE CDC7, SEUS USOS, E COM- POSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se a compostos de isoindolinona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que inibe CDC7 e, portanto, pode ser útil no tratamento do câncer.

Description

[0001] A presente invenção se refere a compostos de isoindolino- na, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, que inibem CDC7 e podem ser úteis no tratamento de câncer.

[0002] O CDC7 é uma serina/treonina quinase que desempenha um papel-chave na iniciação da replicação e regulação de DNA do ponto de controle do ciclo celular da fase S. O aumento da produção de CDC7 foi observado em múltiplas linhagens celulares de tumor. Além disso, a inibição de CDC7 em tais linhagens celulares resultou em parada do ciclo celular. Portanto, a inibição de CDC7 pode ser útil para terapia de câncer.

[0003] Os inibidores de CDC7 são conhecidos na técnica. Os compostos de isoindolinona também são conhecidos na técnica. O documento WO 2005/100351 revela certos compostos de isoindolinona como compostos reativos ao receptor nicotínico acetilcolina.

[0004] Permanece uma necessidade de fornecer inibidores de CDC7 alternativos para o tratamento de câncer. Consequentemente, a presente invenção fornece inibidores de CDC7 que podem ser úteis no tratamento de câncer.

[0005] A presente invenção fornece um composto que é 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0006] A presente invenção fornece um composto que é 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0007] A presente invenção fornece um composto que é 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0008] Como uma modalidade particular, a presente invenção forne ce um composto que é 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona. Como uma outra modalidade particular, a presente invenção fornece um composto que é 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2. Como uma modalidade particular adicional, a presente invenção fornece um composto que é 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1.

[0009] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece também uma composição farmacêutica que compreende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0010] A presente invenção fornece adicionalmente uma composi ção farmacêutica que compreende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece também uma composição farmacêutica que compreende 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo, di- luente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece adicionalmente uma composição farmacêutica que compreende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0011] A presente invenção fornece um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um paciente, que necessite do mesmo, uma quantidade eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil- 6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um paciente, que necessite do mesmo, uma quantidade eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4- il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona. A presente invenção fornece também um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um paciente, que necessite do mesmo, uma quantidade eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, isômero 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece adicionalmente um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um paciente, que necessite do mesmo, uma quantidade eficaz de 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2. A presente invenção fornece também um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um paciente, que necessite do mesmo, uma quantidade eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil- 6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1, ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece adicionalmente um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um paciente, que necessite do mesmo, uma quantidade eficaz de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1- ona, isômero 1.

[0012] A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em terapia. A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso no trata- mento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0013] A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona para uso em terapia. A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona.

[0014] A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo, para uso em terapia. A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, isômero 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0015] A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, para uso em terapia. A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, isômero 2.

[0016] A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1, ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo, para uso em terapia. A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, isômero 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0017] A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1, para uso em terapia. A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1, para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, isômero 1.

[0018] A presente invenção fornece o uso de 3-(5-fluoropirimidin-4- il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. A presente invenção fornece também o uso de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0019] A presente invenção fornece o uso de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)- 3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. A presente invenção fornece também o uso de 3- (5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0020] A presente invenção fornece o uso de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)- 3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1, ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. A presente invenção também fornece o uso de 3- (5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0021] A presente invenção fornece 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil- 6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, hidrato em uma forma cristalina. A presente invenção fornece também 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, hidrato em uma forma cristalina caracterizado por um padrão de difração de raios X por pó que tem picos característicos, em 2θ ± 0,2, que ocorrem em 22,27 e um ou mais de 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 e 23,13.

[0022] A presente invenção fornece um composto que é 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que é alternativamente identificado como (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0023] A presente invenção fornece um composto que é 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, isômero 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que é alternativamente identificado como (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0024] Como uma modalidade particular, a presente invenção for nece um composto que é (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona. Como uma modalidade particular adicional, a presente invenção fornece um composto que é (3S)-3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona.

[0025] A presente invenção fornece também uma composição farmacêutica que compreende (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece adicionalmente uma composição farmacêutica que compreende (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona e um veículo, diluente ou exci- piente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece também uma composição farmacêutica que compreende (3S)-3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece adicionalmente uma composição farmacêutica que compreende (3S)- 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0026] A presente invenção fornece (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)- 3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo, para uso em terapia. A presente invenção fornece (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin- 1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0027] A presente invenção fornece (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)- 3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona para uso em terapia. A presente invenção fornece (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin- 1-ona.

[0028] A presente invenção fornece (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)- 3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo, para uso em terapia. A presente invenção fornece (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin- 1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6- (1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0029] A presente invenção fornece (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)- 3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona para uso em terapia. A presente invenção fornece (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H- pirazol-4-il)isoindolin-1-ona para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, sendo que a composição farmacêutica compreende (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin- 1-ona.

[0030] A presente invenção fornece o uso de (3R)-3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. A presente invenção também fornece o uso de (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0031] A presente invenção fornece o uso de (3S)-3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. A presente invenção também fornece o uso de (3S)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0032] A presente invenção fornece (3R)-3-(5-fluoropirimidin-4- il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, hidrato em uma forma cristalina. A presente invenção fornece também (3R)-3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, hidrato em uma forma cristalina caracterizado por um padrão de difração de raios X por pó que tem picos característicos, em 2θ ± 0,2, que ocorrem em 22,27 e um ou mais de 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 e 23,13.

[0033] Além disso, a presente invenção fornece modalidades preferenciais dos métodos e usos, conforme descrito na presente invenção, nas quais o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de mama triplo negativo, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer hematológico e leucemia.

[0034] Conforme usado acima, e no decorrer da descrição da in venção, os termos a seguir, a menos que de outra maneira indicado, devem ser compreendidos como tendo os seguintes significados:

[0035] Um "veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável" é um meio aceito, em geral, na técnica para a liberação de agentes biologicamente ativos em mamíferos, por exemplo, humanos.

[0036] Os "sais farmaceuticamente aceitáveis" se referem aos sais inorgânicos e orgânicos relativamente não tóxicos de compostos da presente invenção.

[0037] Uma "quantidade eficaz" significa a quantidade de um com posto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, da presente invenção ou composição farmacêutica que contém um composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, da presente invenção que irá obter a resposta biológica ou médica ou efeito terapêutico desejado em um tecido, sistema, animal, mamífero ou humano que está sendo procurado pelo pesquisador, veterinário, doutor de medicina ou outro clínico.

[0038] Os termos "tratamento," "tratar," "tratando" e semelhantes são destinados a incluir diminuir ou reverter a progressão de um distúrbio. Os termos também incluem aliviar, melhorar, atenuar, eliminar ou reduzir um ou mais sintomas de um distúrbio ou condição, mesmo que o distúrbio ou condição não seja eliminado de fato e mesmo que a progressão do distúrbio ou condição não seja em si diminuída ou revertida.

[0039] Os compostos da presente invenção são capazes de reagir, por exemplo, com uma quantidade de ácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais farmaceuticamente aceitáveis. Tais sais farmaceuti- camente aceitáveis e a metodologia comum para o preparo dos mesmos é bem conhecida na técnica. Consultar, por exemplo, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, no 1, janeiro de 1977.

[0040] Os compostos da presente invenção são preferencial mente formulados como composições farmacêuticas com o uso de um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e administrados por uma variedade de rotas. De preferência, tais composições são para a administração oral. Tais composições farmacêuticas e processos para o preparo das mesmas são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21a edição, Mack Publishing Co., 2005).

[0041] A quantidade do composto da presente invenção de fato administrado será determinada por um médico sob as circunstâncias relevantes, que incluem a condição a ser tratada, a rota de administração escolhida, o composto ou compostos da presente invenção de fato administrados, a idade, peso e resposta do indivíduo em particular, e a severidade dos sintomas do paciente. As dosagens por dia normalmente se encontram dentro da faixa de cerca de 1 a cerca de 1.000 mg. Em alguns casos, níveis de dosagem abaixo do limite inferior da faixa mencionada podem ser mais do que adequados, enquanto que em outros casos doses ainda maiores podem ser empregadas. Os níveis de dosagem podem ser determinados por um indivíduo versado na técnica.

[0042] Os compostos da presente invenção, ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos, podem ser preparados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, assim como aqueles descritos nas preparações e exemplos abaixo. As etapas de sintetização específicas para cada uma das rotas descritas podem ser combinadas de diferentes maneiras para preparar os compostos da invenção, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[0043] Os reagentes e materiais de partida estão, geralmente, prontamente disponíveis para um indivíduo de habilidade comum na técnica. Outros podem ser produzidos a partir de técnicas-padrão de química orgânica e heterocíclica, técnicas que são conhecidas por um indivíduo de habilidade comum na técnica e os procedimentos descritos nos exemplos a seguir, incluindo quaisquer procedimentos novos. As preparações e exemplos a seguir ilustram adicionalmente a invenção. Os compostos ilustrados no presente documento são nomeados e numerados com o uso do Symyx Draw Version 3.2, Symyx Draw Version 4.0 ou IUPACNAME ACDLABS.

[0044] Isômeros, enantiômeros ou diastereômeros individuais po- dem ser separados ou resolvidos por um indivíduo de habilidade comum na técnica em qualquer ponto conveniente da síntese de compostos por métodos tais como técnicas de cristalização seletiva ou cromatografia quiral (consultar, por exemplo, Enantiomers, Racemates, and Resolutions (J. Jacques, et al., John Wiley and Sons, Inc., 1981)). A designação "isômero 1" se refere ao composto que é eluído, em primeiro lugar, da cromatografia quiral. A designação "isômero 2" se refere ao composto que é eluído, em segundo lugar, da cromato- grafia quiral.

[0045] Conforme usado no presente documento, os termos a se guir têm os significados indicados: "ADP" se refere a adenosina difos- fato; "ATP" se refere a adenosina trifosfato; "Balb/c’ se refere a albino; "BCA" se refere a ácido bicinconínico; "DMSO" se refere a dimetilsul- fóxido; "DTT" se refere a ditiotreitol; "EDTA" se refere a ácido etileno- diaminotetracético; "ee" se refere a excesso enantiomérico; "Ex" se refere a exemplo; "FBS" se refere a soro bovino fetal; "FP" se refere a polarização fluorescente; "GAPDH " se refere a gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase; "HEC" se refere a hidroxi etil celulose; "HEPES" se refere a ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfônico; "hr" se refere a hora ou horas; "IC50" se refere a concentração de um agente que produz 50% da resposta inibitória máxima para esse agente; "IVTI" se refere a inibição alvo in vivo; "MCM2" se refere a proteína de manutenção de minicromossomo; "min" se refere a minuto ou minutos; "PBS" se refere a solução salina tamponada com fosfato; "P.O." se refere a administração oral; "Prep" se refere a preparação; "PVDF" se refere a difluoreto de polivinilidina; "RPMI" se refere a Instituto Roswell Park Memorial; "RNase" se refere a ribonuclease; "RuPhos" se refere a 2-dicicloexilfosfino-2’,6’-diisopropoxibifenil; "Rt" se refere a tempo de retenção; "SDS-Page" se refere a eletroforese de gel de dodecil-sulfato de sódio de poliacrilamida; "SCX" se refere a troca ca- tiônica forte; "SFC" se refere a cromatografia de fluido supercrítico; e "THF" se refere a tetraidrofurano. PREPARAÇÃO 1 Metil 5-bromo-2-iodobenzoato

[0046] Adicionar ácido 5-bromo-2-iodobenzóico (1.998 g, 6,11 mol), de modo parcelado, a uma solução de ácido sulfúrico (100 mL) a 20 °C em metanol (13 l). Aquecer a suspensão ao refluxo por 24 horas, então, resfriar a 20 °C e remover o solvente sob pressão reduzida. Verter o resíduo em uma mistura 1:1 de éter metil-terc- butílico e água gelada (20 l) e separar as fases. Extrair a fase aquosa com o éter metil-terc-butílico (1.5 l), combinar as fases orgânicas e lavar com NaOH (5 l) a 0,2 M aquoso, lavar com cloreto de sódio aquoso saturado, secar sobre sulfato de sódio, filtrar e evaporar sob pressão reduzida. Dissolver o produto cru em éter de petróleo a 40 a 45 °C (10 l), filtrar através de um coxim de terra diatomácea e evaporar sob pressão reduzida. Dissolver o resíduo em éter de petróleo (5 l) e resfriar a -50 °C, filtrar os sólidos da primeira coleta, lavar o sólido com éter de petróleo gelado. Evaporar o licor-mãe, redissolver o sólido em éter de petróleo (1 l), resfriar para -50 °C, e filtrar a segunda coleta. Combinar a primeira e a segunda coletas e secar ao ar livre para fornecer o composto titular na forma de um sólido amarelo (1.880 g, 90%). PREPARAÇÃO 2 Metil 5-bromo-2-etilbenzoato

[0047] Adicionar dietil zinco (3.050 mL, 3,05 mol, 1 M de hexano) ao longo de 3 horas a uma solução a 5 °C de metil 5-bromo-2- iodobenzoato (1.876 g, 5,50 mol) e cloreto de 1,1'- bis(difenilfosfino)ferroceno)paládio(II) (40 g, 0,05 mol). Aquecer a mistura para 60 a 65 °C ao longo de 2 horas e agitar por 2 horas adicionais, então, resfriar para 10 a 15 °C e verter em solução aquosa gelada de HCl (10 l) a 1 M. Separar as fases, extrair a camada aquosa com éter metil-terc-butílico (2 x 10 |), combinar as fases orgânicas, lavar com cloreto de sódio aquoso saturado, secar sobre sulfato de sódio, filtrar e evaporar sob pressão reduzida. Dissolver em acetato de etila (400 mL) e adicionar éter de petróleo (8 l), então, deixar repousar a 15 a 20 °C por 16 horas e filtrar através de um coxim de gel de sílica, lavar com acetato de etila/éter de petróleo (1:20, 8 l) e evaporar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer um composto título na forma de um óleo amarelo pálido (1.306 g, 96%). ES/MS m/e: (79Br/81Br) 243/245 (M+H). PREPARAÇÃO 3 Metil 5-bromo-2-(1-bromoetil)benzoato

[0048] Adicionar N-bromosuccinimida (1.090 g, 6,12 mol) e 2,2'- azo-bis-isobutironitrila (11,4 g, 0,069 mol) a uma solução a 20 °C de metil 5-bromo-2-etilbenzoato (1.296 g, 5,33 mol) em tetracloreto de carbono (7 l). Aquecer ao refluxo por 4 horas, resfriar para 20 a 30 °C e lavar com água (10 l), extrair a fase aquosa com diclorometano (5 l), combinar as fases orgânicas e lavar com água (10 l), Na2SO3 (5 l) e cloreto de sódio aquoso saturado. Secar com sulfato de sódio, filtrar e evaporar sob pressão reduzida para render o composto título na forma de um sólido amarelo pálido (1.791 g, 104% bruto). ES/MS m/e: 241 (M-HBr). PREPARAÇÃO 4 6-Bromo-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-isoindolin-1-ona

[0049] Adicionar metil 5-bromo-2-(1-bromoetil)benzoato (1.724 g, 5,35 mol) sólido a uma solução de (R)-1-(4-metoxifenil)etanamina disponível para comercialização (BePharm, WZG111219-071; 974 g, 6,44 mol) e trietilamina (1.710 mL, 12,26 mol) em metanol (12 l). Aquecer a mistura por 10 horas a 67 °C, então, evaporar até secar sob pressão reduzida. Particionar o resíduo com acetato de etila (5 l) e HCl (10 l) aquoso a 1 N, separar as fases, lavar a fase orgânica novamente com HCl (5 l) aquoso a 1 N, bicarbonato de sódio satu-rado, cloreto de sódio aquoso saturado, então, secar sobre sulfato de sódio, filtrar e evaporar sob pressão reduzida. Dissolver o óleo vermelho escuro em éter metil-terc-butílico (750 mL) e adicionar éter de petróleo (3 l) sob agitação vigorosa. Filtrar os sólidos, lavar com éter metil-terc-butílico/éter de petróleo (1:8), éter de petróleo, secar ao ar livre para render o composto título na forma de um sólido branco-sujo (1.014 g, 52%). ES/MS m/z: 360 (M+H) PREPARAÇÃO 5 2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1-tetraidropiran-2-ilpirazol-4- il)isoindolin-1-ona

[0050] Combinar 6-bromo-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil- isoindolin-1-ona (64 g, 177 mmol), 1-(tetraidro-2H-piran-2-il)-4- (4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-pirazola (67g, 295 mmol), carbonato de potássio (70 g, 506 mmol), cloreto de 1,1'- bis(difenilfosfino)ferroceno)paládio(II) (9 g, 11 mmol), dioxano (800 mL) e água (212 mL) sob nitrogênio e aquecer para 70 a 75 °C por 16 horas. Adicionar 1-(tetraidro-2H-piran-2-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-pirazola (15 g, 54 mmol) e aquecer para 80 a 85 °C por 2 horas. Concentrar sob pressão reduzida em 200 mL, adicionar acetato de etila (500 mL) e água (500 mL), agitar por 30 minutos e filtrar os sólidos. Combinar os sólidos e a camada orgânica e evaporar sob pressão reduzida. Dissolver o resíduo em di- clorometano e filtrar através de um coxim de gel de sílica. Lavar o coxim de gel de sílica com diclorometano/acetato de etila (1:0) e, então, (2:1), e evaporar até secar sob pressão reduzida. Formar uma pasta fluida do sólido em uma mistura 2:1 de éter de petró- leo/acetato de etila (600 mL) por 30 minutos a 25 a 30 °C e filtrar para coletar o sólido a fim de render o composto título na forma de um sólido branco-sujo (68 g, 89%). ES/MS m/z: 432 (M+H). PREPARAÇÃO 6 3-(6-cloro-5-fluoro-primidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-6- (1-tetraidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1-ona

[0051] Adicionar sódio bis(trimetilsilil)amida (210 mL, 210 mmol, 1 M de THF), a gotas, ao longo de 60 minutos, a uma suspensão gelada de 2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1-tetraidropiran-2- ilpirazol-4-il)isoindolin-1-ona (62 g, 144 mmol) e 4,6-dicloro-5- fluoropirimidina (31 g, 186 mmol) em tetraidrofurano (620 mL). Agitar a solução por 60 minutos a 0 °C e, então, diluir a mistura com acetato de etila (1 l) e água (1 l). Lavar a fase orgânica com cloreto de sódio aquoso saturado e evaporar sob pressão reduzida. Dissolver o resíduo em éter de petróleo/acetato de etila 1:1, filtrar através de um coxim de gel de sílica e evaporar para render o composto título na forma de uma espuma amarela (83 g, 103%). ES/MS m/z: 562 (M+H) PREPARAÇÃO 7 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1- tetraidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1-ona

[0052] Adicionar trietilamina (40 mL, 287 mmol) e 20% de hidróxido de paládio em carbono (14 g) a uma solução de 3-(6-cloro-5- fluoro-pirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1- tetraidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1-ona (80 g, 142 mmol) em acetato de etila (2,1 l) e hidrogenar com gás hidrogênio (206,8 kPa (30 psi)) a 20 a 25 °C por 16 horas. Repetir as condições de reação com 5 gramas de 3-(6-cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4- metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1-tetraidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1- ona. Combinar ambas as reações e filtrar através de terra diatomá- cea e evaporar para render o composto título como espuma amarela (77 g, 102%). ES/MS m/z: 528 (M+H) PREPARAÇÃO 8 6-bromo-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil- isoindolin-1-ona

[0053] Dissolver 6-bromo-2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil- isoindolin-1-ona (2,814 mmol, 1,014 g) em tetraidrofurano (28 mL). Adicionar 4-cloro-5-fluoro-pirimidina (5,628 mmol, 518 μL) e resfriar para 0 °C. Adicionar hexametil disilazida de potássio (4,502 mmol, 9 mL, 0,5 M em tolueno) ao longo de 7 minutos e agitar por 1 hora, então, aquecer para a temperatura ambiente e agitar por 90 minutos. Verter em éter metil-terc-butílico e HCl a 1 M aquoso, adicionar água e separar as camadas. Lavar com HCl a 1 N aquoso, filtrar, lavar com cloreto de sódio aquoso saturado, secar sobre sulfato de magnésio, filtrar através de um coxim de gel de sílica de 2 cm e evaporar sob pressão reduzida para fornecer um óleo. Purificar em gel de sílica com 20 a 40% de acetato de etila/hexano para render o composto título em forma de uma espuma (547 mg, 43%). ES/MS m/z: 456 (M+H) EXEMPLO 1 3-(5-Fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona

[0054] Dissolver 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4- metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1-tetraidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1- ona (65 g, 123 mmol) em ácido trifluoroacético (600 mL) e aquecer entre 75 e 80 °C por 16 horas. Evaporar sob pressão reduzida e diluir com acetato de etila (500 mL) e água (500 mL). Ajustar o pH da camada aquosa entre 8 e 9 com 6 N de NaOH aquoso, extrair a camada aquosa com acetato de etila (3 x 500 mL), combinar as camadas orgânicas, lavar com cloreto de sódio aquoso saturado, secar com sulfato de sódio, filtrar e evaporar sob pressão reduzida. Cromatografar o produto cru em gel de sílica com 50 a 100% de acetato de etila/éter de petróleo. Combinar as frações do produto e evaporar sob pressão reduzida para render uma espuma amarela (33 g, 87% cru). Repetir as condições de reação com 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-2-[(1R)-1-(4- metoxifenil)etil]-3-metil-6-(1-tetraidropiran-2-ilpirazol-4-il)isoindolin-1- ona e combinar os produtos (10 g, 18,9 mmol). Dissolver os produtos combinados em metanol e agitar com SiliaBond® Thiol (Silia MetS® Thiol) entre 15 e 20 °C por 20 horas, filtrar e evaporar sob pressão reduzida para render o composto titular com 77% ee (38 g, 87%). EXEMPLO 2 3-(5-Fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, Isômero 2

[0055] Separar o maior enantiômero (Isômero 2) de 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona (38 g, 123 mmol) do menor enantiômero (Isômero 1) de 3-(5-fluoropirimidin-4-il)- 3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona por quiral preparativo HPLC cromatografia de fluidos supercríticos (SFC) (Coluna: Chiralpak OJ- H(5 μ), 30 x 250 cm; eluente: 15% de isopropanol em CO2, fluxo 120 g/min a UV 214 nm). O segundo isômero de eluição (Isômero 2) é o composto titular (17 g, 45%, >98% ee). Análise de quiral (Coluna: Chi- ralpak OJ-H(5 μ), 4,6 x 250 mm; eluente: 20% isopropanol em CO2, fluxo: 3 mL.min a UV 214 nm, Rt = 5,78 minutos. ES/MS m/z: 310 (M+H). EXEMPLO 3 3-(5-Fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona

[0056] Combinar RuPhos Palladium(II) cloreto de fenetilamina (60 μmol, 43 mg), dioxano (0,5 mL) e potássio terc- butóxido (1 M de tetrai- drofurano, 60 μmol, 60 μL) sobre nitrogênio, sonicar a mistura por 0,5 minuto. Adicionar a mistura catalisadora Ruphos a um recipiente de reação sobre nitrogênio que contém 6-bromo-3-(5-fluoropirimidin-4-il)- 2-[(1R)-1-(4-metoxifenil)etil]-3-metil-isoindolin-1-ona (544 mg, 1,192 mmol), terc-butil 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)pirazola-1- carboxilato (1,79 mmol, 526 mg), 1,4-dioxano (6 mL), carbonato de sódio (3,6 mmol, 2,4 mL 1,5 M aquoso) e aquecer em um micro-ondas a 150 °C por 30 minutos. Diluir a mistura com acetato de etila, lavar com 1,5 M de carbonato de sódio aquoso, lavar com cloreto de sódio aquoso saturado, secar sobre sulfato de magnésio, filtrar através de diato- mito e evaporar a um resíduo amarelo leve. Dissolver o resíduo um anisol (1 mL) e ácido trifluoroacético (7 mL) e aquecer a 80 °C por 4 horas, depois aquecer a 70 °C por 18 horas. Evaporar a mistura sob pressão reduzida, dissolver em metanol, carregar em uma coluna de 10 g SCX, lavar com metanol (100 mL), eluir com 2 M de amônia em metanol e evaporar. Purificar em 40 g de gel de sílica com um gradiente de 1 a 8% de metanol/diclorometano para render o composto titular como uma espuma branca (279 mg, 76%). ES/MS m/z: 310 (M+H). EXEMPLO 4 3-(5-Fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, Isômero 2, Hidrato

[0057] Suspender 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, isômero 2 (9,6 g, 0,03 mol) em 2% de acetona em água (50 mL) e agitar a mistura a 50 °C por 1,5 horas. Adicionar acetona (1 mL) e aquecer a mistura a 65 °C por 1 hora antes de resfriar lentamente à temperatura ambiente durante 12 horas. Filtrar os sólidos e enxaguar com quatro volumes de água. Secar o sólido sobre vácuo a 50 °C por 6 horas para render o composto titular (8,6g, 90%). DIFRAÇÃO DE PÓ DE RAIOS-X

[0058] Os padrões XRD de sólidos cristalinos são obtidos em um difractômero de pó de raios-X Bruker D4 Endeavor equipado com uma fonte CuKa (À = 1,54060 Â) e um detector Vantec que opera a 35 kV e 50 mA. A amostra é varrida entre 4 e 40° em 2θ com um tamanho de etapa de 0,0087° em 2θ e uma taxa de varredura de 0,5 segun- dos/etapa e com divergência de 0,6 mm, antidispersante de 5,28 e fendas de detector de 9,5 mm. O pó seco é embalado em um suporte para amostra de quartzo e uma superfície lisa obtida através do uso de uma lâmina de vidro. É bem conhecido na técnica de cristalografia que, para qualquer forma de cristal dada, as intensidades relativas dos picos de difração podem variar devido à orientação preferencial que resulta de fatores, tais como, morfologia e hábito de cristal. Quando os efeitos de orientação preferencial estão presentes, intensidades de pico são alteradas, porém as posições de pico características do polimorfo não são mudadas. Adicionalmente, é bem conhecido na técnica de cristalografia que para qualquer forma de cristal gerada, as posi- ções de pico angular podem variar ligeiramente. Por exemplo, as posições de pico podem mudar devido à variação na temperatura ou umidade nas quais uma amostra é analisada, ao deslocamento de amostra ou à presença ou ausência de um padrão interno. No caso presente, uma variabilidade de posição de pico ± 0,2 em 2θ levará em consideração essas potenciais variações sem atrapalhar a identificação inequívoca da forma de cristal indicada. A confirmação de uma forma de cristal pode ser feita com base em qualquer combinação única de picos distinguíveis (em unidades de ° 2θ), tipicamente os picos mais proeminentes. Os padrões de difração de forma de cristal coletados a temperatura ambiente e umidade relativa são ajustados com base nos picos padrão NIST 675 a 8,85 e 26,77 graus 2-teta.

[0059] Uma amostra preparada do Exemplo 4 é caracterizada por um padrão XRD que usa radiação CuKa e tem picos de difração (valores 2-teta) conforme descrito na Tabela 1 abaixo. Especificamente, o padrão contém um pico em 22,27 em combinação com um ou mais dos picos selecionados a partir do grupo que consiste em 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 e 23,13 com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 graus.

EXEMPLO 5 (3R)-3-(5-Fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1- ona, diidrocloreto, solvato de acetonitrila

[0060] Adicionar 0,25 M de HCl (1 mL) a 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3- metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona (Exemplo 3, 0,084 mg, 0,27 mmol) e sonicar a amostra. Todo o material é solúvel. Evaporar a mistura até secar, o que resulta em um resíduo oleoso. Adicionar acetoni- trila (2 mL) e a solução se torna amarela e cristais começam a se formar. Cristais únicos são isolados para uma única difração de raios-X de cristal único. A amostra é determinada para ser um solvato de ace- tonitrila de um sal de diidrocloreto. Os átomos de cloro fornecem dis- persão anômala suficiente para permitir que a estereoquímica absoluta da molécula seja determinada por difração de raios-X de cristal único.

[0061] Um espécime similar a prisma incolor claro de C18H17Cl2FN6O, dimensões aproximadas 0,180 mm x 0,200 mm x 0,220 mm é usado para a análise cristalográfica de raios-X. Um total de 3.318 quadros são coletados. O tempo de exposição total é 1,84 hora. Os quadros foram integrados com o pacote do software Bruker SAINT através do uso de um algoritmo de integração de quadro estreito. A integração dos dados através do uso de uma célula de unidade ortorrômbica rendeu um total de 13.411 reflexões com um ângulo θ máximo de 66,30° (resolução 0,84 A), dos quais 3.304 são independentes (redundância média 4.059, completude = 97,8%, Rint = 7,25%, Rsig = 6,30%) e 2.885 (87,32%) foram maiores do que 2α(F2). As constantes de célula finas de a = 8,0583(2) A, b = 36,3803(9) A, c = 6,96840(10) A, volume = 2042,88(8) A3 se baseiam no refinamento dos centróides XYZ de 6.295 reflexões acima de 20 α(I) com 11,24° < 2θ < 132,0°. Os dados são corrigidos para efeitos de absorção com o uso do método semiempírico (SADABS). A razão de transmissão aparente de mínimo para máximo é 0,761. Os coeficientes de transmissão mínimo e máximo calculados (com base em tamanho de cristal) são 0,5466 e 0,6033.

[0062] A estrutura é solucionada e refinada com o uso do pacote de software Bruker SHELXTL™ que usa o grupo de espaço P 21 21 2, com Z = 4 para a unidade de fórmula C18H17Cl2FN6O. O refinamento de mínimos quadrados com matriz completa anisotrópicos final em F2 com 255 variáveis convergentes em R1 = 4,27%, para os dados observados e wR2 = 10,80% para todos os dados. O grau de ajuste é 1,066. O maior pico na síntese de densidade de elétron de diferença final é 0,295 e-/A3 e o orifício mais largo é -0,204 e-/A3 com um desvio de RMS de 0,056 e-/A3. Com base no modelo final, a densidade calculada é 1.376 g/cm3 e F(000), 872 e-. O parâmetro de estrutura absoluta é refinado para 0.0(0), o que indica que a estrutura absoluta da molécula é consistente com o composto titular. A molécula solvente de acetonitrila é, de algum modo, desordenada e, portanto, é refinada de modo isotrópico, enquanto (3R)- 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona e os íons de cloro são refinado de modo anisotrópico. O resultado para o Exemplo 5 estabelece a estereoquímica absoluta da molécula como sendo o enantiômero R, portanto, estabelece também a estereoquímica do Exemplo 3 do qual o Exemplo 5 é derivado.

[0063] Adicionalmente, os Exemplos 2 e 3 são submetidos a análi ses através de cromatografia de fluido supercrítico (SFC) de HPLC quiral com o uso das mesmas condições a fim de determinar o enanti- ômero presente para cada Exemplo. (Coluna: Chiralcel OJ-H 4,6 mm X 150 mm, 20% de isopropanol em CO2, 5 mL/min, UV 225 nm). Para o Exemplo 2 e Exemplo 3, Isômero 1 elui a 1,53’ e Isômero 2 elui entre 1,81 e 1,84’. Nessa análise, o Exemplo 2 tem 100% ee e o Exemplo 3 tem 96,4% ee. Esses resultados demonstram que o enantiômero presente para ambos os Exemplo 2 e Exemplo 3 é o Isômero 2. Já que a estereoquímica absoluta para o Exemplo 3 é o enantiômero R, conforme fornecido acima, e os Exemplos 2 e 3 são ambas identificadas como SFC HPLC quiral como Isômero 2, a estereoquímica absoluta para o Exemplo 2 é, portanto, também o enantiômero R. Além disso, visto que o Exemplo 2 é usado para fazer o Exemplo 4, a estereoquí- mica absoluta para o Exemplo 4 é o enantiômero R. ENSAIO DE IMAGEAMENTO ACUMEN® PARA DETECÇÃO DE MCM2 FOSFORILADO EM CÉLULAS H1299

[0064] O Acumen® eX3 é usado para determinar o efeito dos com- postos na formação de MCM2 fosforilado endógeno na Serina53 (pMCM2-S53). A fosforilação de MCM2 por CDC7 é determinada pelo uso de anticorpo anti-pMCM2-S53 específico e quantificada com anti- corpos secundários com etiqueta fluorescentes por Acumen® eX3 para monitorar atividade de CDC7 nas células. A fosforilação de MCM2 na Serina 53 é conhecida por se correlacionar com a inibição de CDC7.

[0065] As células H1299 (ATCC #CRL-5803) são mantidas em meio de crescimento RPMI-1640 (Hiclone SH30809.01) suplementado com 10% de FBS. As células são colhidas pelo uso de procedimentos de cultura de célula padrões e depois contadas pelo uso do Analisador de Viabilidade Celular Vi-Cell XR (Contador Beckman). Células H1299 de 3.000 a 6.000 em 100 μL de meio de crescimento são laminadas em cada poço da placa preta/clara de 96 poços com Poli-D-Lisina da Biocoat com placas de cultura de célula (Becton Dickinson) Multipoços da BioCoat™ de fundo plano 356640 e incubadas durante uma noite a 37°C, 5% CO2.

[0066] As células são tratadas com composto de teste (50 μL/po^o) diluído em um meio que contém 0,6% de DMSO e incubadas por 4 horas a 37 °C. Em cada poço é adicionado 7,4% de formaldeído (150 μL) diluído com PBS de 37% de estoque de formaldeído e as placas são incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos. O formaldeído é removido e metanol frio (100 μL) é adicionado. As placas são incubadas por 20 minutos a 4 °C para permeabilizar as células. As placas são lavadas 3 x com 100 μL/po^o de PBS. As placas são incubadas com 50 μL/po^o de 1:1000 de anticorpo anti pMCM2-S53 diluído (gerado pelo uso de NP_004517,2 - consulte PubMed Sequence Database), conjugação para hemocianina extraída de lapa californiana com o uso de ativação de ma- leimida, através do protocolo de imunização de coelho de 90 dias padrão para produção de anticorpos policlonais de coelho (Thermo Scientific Pierce Antibodies, Thermo Fisher Scientific) em PBS suplementado com 2% de BSA durante uma noite a 4 °C. As placas são lavadas com PBS (4 x 100 μL/poço) e incubadas em 100 μL/po^o de 1:1000 de anticorpo se-cundário Alexa Flúor 488 de IgG de cabra anti-coelho (Invitrogen CA11304s) em PBS por 1 hora à temperatura ambiente. As placas são lavadas com PBS (4 x 100 μL/po^o). PBS (50 μL/poço) contendo RNase (50 μg/mL) e iodeto de propídio (15 μM) são adicionados e as placas são incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos. As placas são vedadas com vedação preta e são lidas no Acumen® eX3 (TTP LABTECH) com o uso de filtro óptico de 500 a 530 nanômetros e de 575 a 640 na- nômetros para Alexa Flúor 488 e iodeto de propídio, respectivamente. O número de células positivas de pMCM2-S53 é normalizado para células totais para cada poço e são calculadas como inibição percentual relativa a controles na placa. A inibição percentual dos dados de concentração do composto de 10 pontos para uma equação logística de quatro parâmetros é gerada para derivar o valor de IC50.

[0067] Os compostos dentro do escopo da invenção são testados nesse ensaio substancialmente descrito acima. O composto do Exemplo 2 é determinado para ter um IC50 de 0,261 μM + 0,004 (n=2). O composto do Exemplo 3 é determinado para ter um IC50 de 0,29 μM. O composto do Exemplo 4 é determinado para ter um IC50 de 0,29 μM + 0,0813 (n=2). Esses resultados mostram que os Exemplos 2, 3 e 4 inibem pMCM2-S53 no ensaio da célula H1299 e, portanto, são inibidores de CDC7. ENSAIO DE ENZIMA IN VITRO DE CDC7/DBF4

[0068] O ensaio de Quinase ADP-FP Transcreener™ é usado para determinar os valores do composto IC50 contra a quinase CDC7/DBF4 . O ensaio de Quinase ADP-FP avalia a atividade de CDC7/DBF4 na presença de inibidores de composto pela medição da concentração de ADP formada em uma reação de quinase. A reação de quinase é realizada com o uso de volume de reação de 25 microlitros em uma placa de ensaio de 96 poços. Para o ensaio de ADP-FP, os reagentes são adicionados para obter as condições de reação finais de HEPES (25 mM) pH 7,5, 0,03% de Triton® X-100, cloreto de magnésio (10 mM), DTT (1 mM), MCM2 (400 nM) (aminoácido 1-209, um substrato fisiológico de CDC7/DBF4), espermina (4 mM), CDC7/DBF4 (2,640 ng/mL) (recombi- nante humano CDC7/DBF4 expresso em células de inseto), 4% de dime- tilsulfóxido e diluições seriais de composto (diluído 1:3 de 20.000 nM a 1 nM). Enzima e substrato são adicionados ao composto seguido de ATP com 5 μM para iniciar a reação. As placas são incubadas à temperatura ambiente por 60 minutos.

[0069] Para o formato ADP-FP adicionar 25 microlitros de um rea gente de detecção de extinção que contém HEPES (52 mM) pH 7,5, EDTA (20 mM), cloreto de sódio (0,4 M), polióxi etileno glicol dodecil éter (0,02%) (BRIJ-35™), anticorpo anti-ADP (10 μg/mL) e ADP (4 nM) Transcreener® ADP Alexa fluor® 633 investigador para extinguir a reação. As placas são incubadas por 1 hora e depois lidas por um Wallac EnVision™ 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) em modo de Polarização de Fluorescência com o uso de filtros polarizantes de comprimento de onda de Ex620nm e Em688nm . Dados puros de milipolarização (mP) são convertidos para ADP micromolar com o uso de uma curva padrão de ADP/ATP preparado que se inicia em diluição serial de 5 μM de ADP 1:1 em tampão de reação para 0,0025 μM de ADP. O valor de IC50 para cada composto é derivado pelo uso de dados de inibição percentuais calculados a partir dos dados de reação de μM ADP relativos a controles em placa (DMSO versus 100 mM EDTA controles de inibição enzimática). A inibi-ção percentual e dados de concentração do composto de dez pontos são, então, ajustados para uma equação de mínimos quadrados de quatro parâmetros.

[0070] Os compostos dentro do escopo da invenção são testados nesse ensaio substancialmente descrito acima. O composto do Exemplo 2 é determinado para ter um IC50 de 3,7 nM. O composto do Exemplo 3 é determinado para ter um IC50 de 4,5 nM. O composto do Exemplo 4 é determinado para ter um IC50 de 3,3 nM + 0, 634 (n=2). Os resultados mostram que os Exemplos 2, 3 e 4 inibem a produção de ADP no ensaio de enzima in vitro e, portanto, são inibidores de CDC7.

ENSAIO ANTIPROLIFERATIVO IN VITRO

[0071] A atividade antiproliferativa In vitro do Exemplo 2 é determi nada por ensaio de contagem de número de célula contra um painel de 114 linhas de células cancerígenas de origem colorretal, mama, pulmão e sangue (leucemia) obtidas a partir de ATCC, HSRRB, RIKEN ou ECACC. As células são cultivadas e mantidas em meios por instruções do fornecedor. O tempo de duplicação de célula de cada linha de célula é determinado e todas as linhas de célula estão livres de contaminação com micoplasma. As células são cultivadas durante uma noite em placas de 96 poços antes da adição do composto para ensaios de atividade antiproliferativa. A densidade de semeadura de célula ideal é cuidadosamente avaliada para cada uma das linhas de células pela semeadura da cultura de célula com 4 densidades de célula diferentes em meio de 100 μL e levando em consideração o tempo de duplicação e tamanhos de célula das mesmas. A densidade de semeadura que rendeu cerca de 90% de confluência no final de dois tempos de duplicação é então selecionada para o teste de composto. Estau- rosporina é usada com diluição 1:3 como referência. O Exemplo 2 é preparado como um estoque de 4 mM de DMSO e diluído em um meio de cultura em uma razão de 1:2. 50 μL dos meios que contêm o composto, adicionado a cada poço da cultura de 96 poços de uma noite para produzir as concentrações finais desejadas de 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,312, 0,156, 0,078 μM e controle de DMSO. Cada con-centração de tratamento tem poços duplicados. As células são adicionalmente cultivadas para dois tempos de duplicação na presença do composto. Ao final do tempo de tratamento, as células são primeiro examinadas sobre um microscópio para mudanças morfológicas, tais como morte celular ou aumento aparente de tamanho de célula. As células em cada poço duplicado são coletadas separadamente. As células aderentes são colhidas primeiro por tripsinização. As células co- lhidas são ressuspensas em meio de crescimento e são contadas pelo uso de um contador de célula.

[0072] Um composto dentro do escopo da invenção é testado nes se ensaio substancialmente conforme descrito acima. Conforme fornecido na Tabela 2 abaixo, o composto do Exemplo 2 demonstra atividade antiproliferativa significativa contra a maioria das 114 linhas de células cancerígenas testadas em concentrações relevantes farmacolo- gicamente (<8 μM). Além disso, cerca de 10% das linhas de células cancerígenas mostram sensibilidade particular ao composto, conforme demonstrado pela morte celular em massa que ocorre para essas células cancerígenas dentro de 2 períodos de tratamento com tempo de duplicação. A maioria dessas linhas de células cancerígenas particularmente sensíveis são derivadas de câncer colorretal e leucemia. A sensibilidade é confirmada adicionalmente in vivo em modelos de tumor xenoenxerto, tais como Colo-205 e SW620 (ver detalhes abaixo). Esses dados demonstram que o Exemplo 2 tem ampla atividade anti- proliferativa in vitro nas linhas de células testadas.

[0073] TABELA 2: AMPLA ATIVIDADE ANTICANCERÍGENA IN VITRO DO COMPOSTO DO EXEMPLO 2

INIBIÇÃO ALVO IN VIVO (IVTI) DE CDC7 EM FOSFORILAÇÃO DE MCM2-S40/41 (PMCM2-S40/41) COM MODELO DE TUMOR DE XE- NOENXERTO COLO-205

[0074] Células cancerígenas colorretais colo-205 humanas (ATCC#CCL-222) são mantidas em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Células em crescimento de fase logarítmica são colhidas, lavadas e ressuspensas em uma mistura a 1:1 de meio sem soro e Ma- trigel™ (Becton Dickinson). As mesmas são injetadas de modo subcutâneo em 5 x 106 células/animal/sítio no flanco traseiro como modelos de xenoenxerto de subcutâneo em ratos fêmeas balb/c (nu/nu) (de 6 a 8 semanas com peso corporal de 20 a 25 gramas/rato). Animais são randomizados no volume de tumor médio de 150 a 250 mm3 de ratos, (v = 1 x w x 0,536 em que 1 = maior dos diâmetros medidos e w = menor dos diâmetros perpendiculares). O composto é administrado por P.O. em um padrão de formulação de 1% de HEC p/v, P80 0,25% v/v, Antiespumante 1510-US 0,05% v/v. Tumores são colhidos 4 horas depois da dosagem e interrompidos pela homogeneização em tampão de lise (Invitrogen) que contém inibidor de protease (Roche) e inibidor de fosfatase (Roche ou Sigma). A concentração de proteína de lisados de tumor é determinada por ensaio de BCA (Thermo Scientific) e de 5 a 10 μg de proteína é separada por padrão SDS-PAGE (BioRad Criterion™ gel) ou (Invitrogen ePage™ gel). Proteínas são, então, transferi- das para membrana de PVDF ou de Nitrocelulose e sondadas contra pMCM2-S40/41 (Betil Laboratories #A300-788A) ou GAPDH (Fitzgerald 10R-G109A ou Abcam ab9485) de acordo com o protocolo de western blot padrão ou do fabricante. Níveis de pMCM2-S40/41 são determinados e quantificados por imageadores Licor ou FUJI e normalizados para o nível de GAPDH total. A inibição de mudança percentual de intensidade de banda de pMCM2-S40/41 é calculada pelo uso da intensidade média de tumores controle tratados como veículo normalizados para o GAPDH como o sinal máximo. A fórmula seguinte é usada para calcular a inibição percentual de sinal nos grupos de tumor tratados: Inibição percentual = (dados normalizados - máximo normalizado) / (zero- máximo normalizado)*100. Os valores de TED70 indicam a dose precisa do composto necessária para inibir a 70% a média de fosforilação de pMCM2 mediado por CDC7/DBF4 normalizada para GAPDH (% inibição alvo) em um experimento de xenoenxerto in vivo em 4 horas seguidas de uma dose oral. O TEC70 indica a concentração plasmática precisa do composto necessária para inibir a 70% a média de fosforilação de pMCM2 mediado por CDC7/DBF4 normalizada para GAPDH (% inibição alvo) em um experimento com xenoenxerto in vivo por 4 horas seguidas de uma dose oral.

[0075] Um composto dentro do escopo da invenção é testado nes se ensaio substancialmente conforme descrito acima. O TED70 é gerado a partir de um lote de dose e inibição% de pMCM2 e o Exemplo 3 é 2,6 mg/kg. O TEC70 é gerado pelo uso da dose, inibição% de pMCM2 e concentração plasmática a inibição de 70%. O TEC70 por Exemplo 3 é 1,8 μM. Esses dados demonstram que um composto dentro do escopo da presente invenção inibe a fosforilação de pMCM2 mediada por CDC7/DBF4 em um rato em um experimento com xenoenxerto in vivo por 4 horas seguidas a uma dose oral em ratos.

EFICÁCIA ANTITUMORAL EM MODELO DE XENOENXERTO DE RATO SW620 PARA CARCINOMA COLORRETAL HUMANO

[0076] A atividade anticancerígena in vivo do Exemplo 4 é estuda da em tumor de xenoenxerto de rato SW620 para linhas de células de adenocarcinoma colorretais de humanos a qual se prevê que seja sensível com base nos dados de ensaio proliferativo de contagem de célula in vitro descritos acima. A linha de célula SW620 é obtida da American Type Culture Collection (ATCC) e é cultivada em Meio de Leibovitz's L-15 com 10% de soro fetal bovino seguindo instruções da ATCC. A suspensão de células SW620 (5,0 x 106/0,2 mL) é injetada de modo subcutâneo ao flanco direito de cada rato nu Balb/c atímico fêmea. Os ratos (entre 5 e 6 semanas de idade quando chegam) são obtidos a partir de Shanghai Sippr-bk Laboratory Animals Ltd. Ao receber e durante o estudo, os animais são alojados 5 por gaiola, em gaiolas de fundo sólido com tamanho apropriado com leito de contato. Os animais são aclimatados por 7 dias antes do implante das células SW620. Os animais são alimentados com dieta para roedores certificada por Shanghai Laboratory Animal Center com 23% de proteína ad libitum e água da torneira autoclavada é fornecida ad libitum. O quarto do animal é mantido em um ciclo de 12-horas de luz/escuridão. Quando o volume do tumor alcança uma média de 154,9 mm3 (9 dias após a implantação do tumor), os animais com o tumor são agrupados de modo randomizado em 9 grupos (8 animais/grupo) com similares volumes de tumor médio e peso corporal. O peso corporal médio dos ratos com tumor é 17,3 g. O composto é formulado em HEC 1% p/v, P80 0.25% v/v e antiespumante 1520-US 0,025% v/v em água deionizada por sonicação através de sonda por 15 minutos em uma formulação de composto e gelo é preparado diariamente para dosagem animal. O composto formulado é administrado em 10,4, 20,8 e 31,2 mg/kg doses (que contêm 10, 20 e 30 mg/kg de ingrediente farmacêuticos ativos API, respectivamente) duas vezes por dia (BID) através de alimenta ção por sonda esofágica (0,1 mL/20 g) por 2 semanas. A dosagem de BID é realizada com cerca de 8 horas de distância (aproximadamente 9 da manhã e 5 da tarde em cada dia). Ao veículo é dado também BID como o braço controle do estudo. O volume do tumor e o peso corporal são medidos 3 vezes por semana de uma maneira cega. O volume do tumor é determinado por medição de pinça (mm) e pelo uso da fórmula para uma esfera elipsoidal: volume do tumor (mm3) = comprimento x espessura2 / 2, em que o comprimento e a espessura se referem às dimensões perpendiculares maior e menor coletadas em cada medição. O comportamento do animal e a saúde do animal são moni-torados duas vezes por dia durante o período de dosagem. O estudo termina no dia 28 após o início do tratamento.

[0077] A análise estatística dos dados de volume do tumor com uma transformação de dados para uma escala logarítmica para equali- zar variância ao longo do tempo e grupos de tratamento. Os dados de volume logarítmico são analisados com uma análise de medidas de repetição de dois caminhos de variância por tempo e tratamento pelo uso de procedimentos MIXED em software SAS (Versão 9.3). O modelo de correlação para as medições repetidas em Spatial Power. Grupos tratados são comparados com o grupo de controle a cada ponto no tempo. O procedimento MIXED é usado também separadamente para cada grupo de tratamento para calcular meios ajustados e erros- padrão a cada ponto no tempo. Ambas as análises contam para a au- tocorrelação dentro de cada animal e para a perda de dados que ocorre quando os animais com tumores grandes são removidos do estudo cedo. Os meios ajustados e erros-padrão são plotados para cada um dos grupos de tratamento versus tempo. A análise em comparação dos grupos de tratamento com os grupos de controle a cada ponto no tempo usa o volume de tumor de logaritmo 10 e produz os valores p. Para significância estatística de valores p mostrados "***" = P<0,001.

[0078] Se T > T0, o Delta T/C, cálculo de% é usado. Se T > T0, o Delta T/C, cálculo de% é usado.

[0079] Equações:

[0080] T = Volume de tumor final no grupo tratado

[0081] T0 = Volume de tumor de linha de base no grupo tratado (assume-se ser o mesmo que C0)

[0082] C = Volume de tumor final no grupo de controle

[0083] C0 = Volume de tumor de linha de base no grupo de contro le (assume-se ser o mesmo que T0)

[0084] Delta T/C,% = 100 * (T - T0) / (C - C0)

[0085] Regressão,% = 100 * (T-T0) / T0 TABELA 3: ATIVIDADE ANTITUMORAL DOSE DEPENDENTE EM MODELOS DE TUMOR DE XENOENXERTO DE RATO SW620

[0086] Um composto dentro do escopo da invenção é testado nes se ensaio substancialmente conforme descrito acima. Conforme fornecido na Tabela 3 acima, o composto do Exemplo 4 demonstra atividade anticâncer in vivo nos tumores de xenoenxerto SW620 de uma maneira dose-dependente quando se dá BID continuamente por 2 semanas. Os resultados para todas as doses testadas são significativamente menores do que para o veículo. Essa atividade é consistente com a atividade in vitro observada com linhas de células cancerígenas SW620. Na dosagem máxima tolerada de 31,2 mg/kg, o composto causa significativa regressão do tumor, conforme mostrado no valor negativo. Além disso, nenhum crescimento de tumor significativo é observado por 2 semanas após a cessação da dosagem. Esses dados demonstram que o Exemplo 4 fornece atividade antitumoral dose- dependente em um modelo de tumor de xenoenxerto de rato SW620.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de que é 3-(5- fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4-il)isoindolin-1-ona, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, enantiômero R, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, enantiômero R.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, enantiômero S, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, enantiômero S.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 3-(5-fluoropirimidin-4-il)-3-metil-6-(1H-pirazol-4- il)isoindolin-1-ona, ou hidrato do mesmo.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é um hidrato em uma forma cristalina definida por um padrão de difração de pó de raios-X apresentando picos característicos, em 2θ ± 0,2, que ocorrem em 22,27 e um ou mais de 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 e 23,13.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto ou sal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuti- camente aceitável.

10. Uso de uma quantidade eficaz do composto ou sal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento do câncer em um paciente com necessidade do mesmo.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de mama triplo-negativo, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer hematológico e leucemia.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer colorretal.

13. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.

14. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.

15. Composto ou sal, de acordo com a reivindicação 14, ca-racterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de mama triplo-negativo, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer hematológico e leucemia.

16. Composto ou sal, de acordo com a reivindicação 15, ca-racterizado pelo fato de que o câncer é câncer colorretal.