BR112017028240B1 - 4-(3-pirazolilamino)-benzimidazol, seu uso, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

COMPOSTOS 4-(3-PIRAZOLILAMINO)-BENZIMIDAZOL E SEU USO COMO INIBIDORES DE JAK1. A presente invenção refere-se a certos compostos benzimidazol de Fórmula I ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, que inibem Janus cinase 1 (JAK1), composições farmacêuticas compreendendo os compostos e métodos de uso dos compostos para tratar certos tipos de câncer.

Description

[0001] A presente invenção se refere a certos compostos benzimi- dazol, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, que inibem Janus cinase 1 (JAK1), composições farmacêuticas compreendendo os compostos e métodos de uso dos compostos para tratar certos tipos de câncer.

[0002] As JAK cinases são uma família tirosina cinase que regula a fosforilação de tirosina de vários efetores e inicia ativação de vias de sinalização a jusante. JAK1 é um membro desta família que faz a mediação de ativação de transdutor de sinal e ativador de transcrição 3, STAT3. Ativação de STAT3 persistente é tumorigênica e promove sobrevivência e proliferação de célula de câncer. Aberrações em ativação de STAT3 foram também mostradas romper a vigilância imune de tumor no microambiente de tumor. Desta maneira, inibição de JAK1 pode bloquear ativação de STAT3 resultando em inibição de crescimento de tumor e vigilância imune do tumor. Ainda, ativação de mutações de JAK1 foi identificada em ambas leucemia linfoblástica aguda de linhagem T e carcinoma hepatocelular asiático e foi demonstrada como oncogênica. Esses resultados sugerem que JAK1 é um alvo para oncologia viável.

[0003] JAK2 é conhecida por formar homodímeros que fazem a mediação de sinalização de receptor de EPO e TPO para a via de STAT5, que regula produção de células vermelhas do sangue e plaqueta. Inibição de JAK2 pode resultar em anemia e trombocitopenia. JAK1, no entanto, não exibe essas atividades e, desta maneira, sugere que compostos que inibem seletivamente JAK1 podem ter um perfil melhor de hematotoxidez e/ou imunogenicidade do que compostos que inibem seletivamente JAK2 e/ou inibidores duplos de JAK1/2.

[0004] Compostos inibidores de JAK cinase são conhecidos na literatura. Por exemplo, a US 2015/0203455 revela certos compostos benzimidazol que são inibidores de JAK.

[0005] Permanece uma necessidade de prover inibidores de JAK1 alternativos para tratamento de câncer. Também, permanece uma necessidade de prover inibidores de JAK1 seletivos que reduzem ou evitam inibição de JAK2. Desta maneira, a presente invenção provê certos inibidores de JAK1 que podem ser úteis para tratamento de câncer. Ainda, a presente invenção provê certos inibidores de JAK1 seletivos que podem reduzir inibição de JAK2.

[0006] A presente invenção provê um composto de Fórmula I:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0007] Preferivelmente, a presente invenção provê um composto que é selecionado do grupo consistindo em (2S)-3-{[cis-4-({4-[(1,5- dimetil-1H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo- hexil]amino}-1,1,1-trifluoropropan-2-ol:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e

[0008] (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil- 1 H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluoropropan-2-ol:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0009] Preferivelmente, a presente invenção provê um composto que é (2S)-3-{[cis-4-({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H- benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluorpropan-2-ol:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Mais preferivelmente, a presente invenção provê um composto que é (2R)-3-{[ cis -4- ({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi) ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluorpropan-2-ol:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Mais preferivelmente, a presente invenção provê um composto que é (2R)-3-{[ cis -4- ({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi) ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluorpropan-2-ol:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0010] Como uma modalidade particular, a presente invenção provê um composto que é (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-dimetil-1H-pirazol-3-il) amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluor- propan-2-ol.

[0011] Como uma modalidade particular, a presente invenção também provê um composto que é (2S)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-dimetil-1H- pirazol-3-il)amino]-1-metil-1H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}- 1,1,1-trifluorpropan-2-ol.

[0012] A presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo (2R)-3-{[ cis-4-({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]- 1 -metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluorpropan- 2-ol, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo (2R)-3-{[ cis - 4-({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6- il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0013] A presente invenção provê um método para tratamento de câncer compreendendo administrar a um paciente com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção provê um método para tratamento de câncer compreendendo administrar a um paciente com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzi- midazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção provê um método para tratamento de câncer compreendendo administrar a um paciente com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzi- midazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluorpropan-2-ol.

[0014] A presente invenção provê um composto de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em terapia. A presente invenção provê (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-dimetil-1H-pirazol-3-il) amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluor- propan-2-ol, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em terapia. A presente invenção provê (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-di- metil-1H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil] amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol, ou um sal farmaceuticamente aceitá-vel do mesmo, para uso no tratamento de câncer.

[0015] A presente invenção provê um composto de Fórmula I para uso em terapia. A presente invenção também provê (2R)-3-{[ cis -4-({4- [(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1 -metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi) ciclo -hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol para uso em terapia. A presente invenção provê (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-dimetil-1H-pirazol-3-il) amino]-1- metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2- ol para uso no tratamento de câncer.

[0016] A presente invenção provê o uso de um composto de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. A presente invenção provê o uso de (2R)-3-{[cis-4-({4-[(1,5-dimetil-1H-pirazol-3-il) amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluor- propan-2-ol, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. A presente invenção também provê o uso de (2R)-3-{[cis-4-({4-[(1,5-dimetil-1H- pirazol-3-il)amino]-1-metil-1H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil] amino}- 1,1,1-trifluorpropan-2-ol na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0017] A presente invenção provê a base livre de (2R)-3-{[ cis -4- ({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi) ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol em uma forma cristalina. A presente invenção também provê a base livre de (2R)-3-{[cis-4-({4- [(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi) ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol em uma forma cristalina caracterizada por um padrão de difração de raio X tendo picos característicos, em 20 ± 0,2, ocorrendo a 19,5° em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 11,9°, 15,4° e 17,6°.

[0018] A presente invenção provê o sal do ácido dimetano sulfôni- co de (2R)-3-{[cis-4-({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H- benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluorpropan-2-ol em uma forma cristalina. A presente invenção também provê o sal do ácido dimetano sulfônico de (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-dimetil-1H-pirazol-3-il) amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluor- propan-2-ol em uma forma cristalina caracterizada por um padrão de difração de raio X em pó tendo picos característicos, em 20 ± 0,2°, ocorrendo a 21,7°, em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 21,2°, 18,0° e 15,7°.

[0019] Ainda, a presente invenção provê modalidades preferidas dos métodos e usos como aqui descrito, em que câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de pulmão de célula pequena e adenocarcinoma de pulmão, adenocarcinoma, carcinoma hepatocelu- lar, incluindo carcinoma hepatocelular asiático, câncer colorretal, câncer de mama, linfoma e leucemia, incluindo leucemia linfocítica aguda e leucemia linfoblástica aguda de linhagem T. Cânceres preferidos são câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de célula não pequena e adenocarcinoma de pulmão, adenocarcinoma, carcinoma hepatoce- lular, incluindo carcinoma hepatocelular asiático, câncer colorretal, câncer de mama e leucemia, incluindo leucemia linfocítica aguda. Cânceres mais preferidos são câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma de pulmão, câncer de mama e carcinoma hepato- celular asiático.

[0020] Como usado acima, e na descrição da invenção, os termos que seguem, a menos que de outro modo indicado, devem ser compreendidos ter os significados que seguem:um "veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável" é um meio geralmente aceito na técnica para a administração de agentes biologicamente ativos a mamíferos, por exemplo, seres hu- manos.

[0021] "Sais farmaceuticamente aceitáveis" ou um "sal farmaceuti- camente aceitável" se refere ao sal ou sais relativamente não tóxicos, inorgânicos e orgânicos de um composto da presente invenção.

[0022] "Quantidade eficaz" significa a quantidade de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, da presente invenção ou uma composição farmacêutica contendo um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, da presente invenção que elicitará a resposta biológica ou médica de um efeito terapêutico desejado sobre um tecido, sistema, animal, mamífero ou humano que está sendo acompanhado pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico.

[0023] Os termos "tratamento", "tratar", "tratando" e similar pretendem incluir deixar mais lenta ou reverter a progressão de um distúrbio. Esses termos incluem também alívio, melhora, atenuação, eliminação ou redução de um ou mais sintomas de um distúrbio ou condição, mesmo se o distúrbio ou condição não for realmente eliminado e ainda se a progressão do distúrbio ou condição não for em si deixada mais lenta ou revertida.

[0024] Um composto da presente invenção é capaz de reação, por exemplo, com vários ácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais farmaceuticamente aceitáveis. Tais sais farmaceuticamente aceitáveis e metodologia comum para preparação dos mesmos são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, P. Stahl e outros, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wilei-VCH, 2002); S.M. Berge e outros, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, janeiro 1977.

[0025] Um composto da presente invenção é preferivelmente formulado como uma composição farmacêutica usando um veículo, dilu- ente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e administrado através de uma variedade de vias. Preferivelmente, tais composições são para administração por via oral. Tais composições farmacêuticas e processos para preparação das mesmas são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro e outros, eds., 21a ed., Mack Publishing Co., 2005).

[0026] A quantidade de um composto da presente invenção atualmente administrada será determinada por um médico sob as circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real da presente invenção administrado, a idade, peso e resposta do paciente individual e a severidade dos sintomas do paciente. Dosagens por dia normalmente se encaixam na faixa de cerca de 50 a 1000 mg por dia, preferivelmente 80 a 600 mg por dia, sobretudo preferivelmente 300 mg por dia. Em alguns casos, níveis de dosagem abaixo do limite inferior da dita faixa mencionada acima podem ser mais do que adequados, enquanto em outros casos doses ainda maiores podem ser empregadas. Os níveis de dosagem podem ser determinados por um versado na técnica.

[0027] Um composto da presente invenção, ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo, pode ser preparado através de uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, bem como aqueles descritos nas Preparações e Exemplos abaixo. As etapas sintéticas específicas para cada uma das vias descritas podem ser combinadas de maneiras diferentes para preparar um composto da invenção ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0028] Os reagentes e materiais de partida estão geralmente prontamente disponíveis a um versado comum na técnica. Outros podem ser feitos através de técnicas padrão de química orgânica e heterocí- clica, técnicas que são conhecidas de um versado comum na arte e os procedimentos descritos nos Exemplos que seguem incluindo quaisquer procedimentos novos. As Preparações e Exemplos que seguem ilustram mais a invenção. A menos que de outro modo mencionado, os compostos ilustrados aqui são nomeados e numerados usando IUPACNAME ACDLABS.

[0029] Isômeros, enantiômeros ou diastereômeros individuais podem ser separados ou resolvidos por um versado comum na técnica em qualquer ponto conveniente na síntese de compostos através de métodos tais como técnicas de cristalização seletiva ou cromatografia quiral (vide, por exemplo, Enantiomers, Racemates, and Resolutions (J. Jacques e outros, John Wiley and Sons, Inc., 1981)).

[0030] O versado na técnica compreenderá que um composto da presente invenção contém pelo menos um centro quiral. A presente invenção compreende todos os enantiômeros e diastereômeros individuais, bem como misturas dos enantiômeros e diastereômeros dos ditos compostos incluindo racematos. É preferido que um composto da presente invenção exista como um enantiômero ou diastereômero único. O enantiômero ou diastereômero único pode ser preparado começando com reagentes quirais ou através de técnicas sintéticas estere- osseletivas ou estereoespecíficas. Alternativamente, o enantiômero ou diastereômero único pode ser isolado de misturas através de técnicas cromatográficas ou de cristalização quirais padrão.

[0031] Um composto da presente invenção pode ser preparado de acordo com métodos sintéticos bem conhecidos e compreendidos na técnica. Condições de reação adequadas para as etapas dessas reações são bem conhecidas na técnica e substituições apropriadas de solventes e co-reagentes estão dentro da habilidade da técnica. Da mesma maneira, será compreendido por aqueles versados na técnica que intermediários sintéticos podem ser isolados e/ou purificados através de várias técnicas bem conhecidas conforme necessário ou desejado e que, frequentemente, será possível usar vários intermediários diretamente em etapas sintéticas subsequentes com pouca ou ne nhuma purificação. Ainda, o versado na técnica compreenderá que em algumas circunstâncias, a ordem na qual porções são introduzidas não é crítica. A ordem de etapas particular requerida para produzir um composto da presente invenção é dependente do composto particular sendo sintetizado, do composto de partida e da relativa susceptibilidade das porções substituídas, como é bem compreendido pelo químico versado. Todos os substituintes, a menos que de outro modo indicado, são como anteriormente definido, e todos os reagentes são bem conhecidos e compreendidos na técnica.

[0032] Como aqui usado, os termos que seguem têm os significados indicados: "ATP" se refere a 5’-trifosfato de adenosina; "BSA" se refere à albumina de soro bovino; "DMSO" se refere a sulfóxido de di- metila; "EDTA" se refere a ácido etilenodiaminotetraacético; "EGTA" se refere a ácido etileno glicol tetraacético; "FBS" se refere a soro bovino fetal; "GFP" se refere à proteína verde fluorescente; "HEPES" se refere a ácido 4-(2-hidroxietil)piperazino-1-etanossulfônico; "HWB" se refere a sangue integral humano; "IC50" se refere à concentração de composto que reduz uma dada resposta (ligação de ligante ou resposta de enzima) em 50%; "relativo a IC50" se refere à concentração relativa dando metade da resposta máxima do composto; "IVTI" se refere à inibição de alvo in vivo; "JAK" se refere à Janus Cinase; "MS" se refere à es- pectroscopia de massa; "NMR" se refere à ressonância magnética nuclear; "NSCLC" se refere a câncer de pulmão de célula não pequena; "PBS" se refere à solução salina tamponada com fosfato; "RNase" se refere à ribonuclease; "RT" se refere à temperatura ambiente; "SCLC" se refere a câncer de pulmão de célula pequena; "STAT" se refere a transdutores de sinal e ativadores de transcrição; "TED" se refere à dose eficaz limiar; "TR-FRET" se refere à transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvida no tempo. Preparação 1 (2R)-2-(T rifluormetil)oxirano

[0033] Adicionar ácido acético (0,89 mL, 0,052 eq.) a uma solução de (1 S,2S)-(+)-1,2-ciclo-hexanodiamino-N,N'-bis(3,5-di-t-butilsalicili- deno)cobalto (II) (0,90 g, 0,0050 eq) em tolueno (16,65 mL). Agitar em temperatura ambiente por 30 minutos. Remover o solvente a vácuo. Adicionar tolueno (20 mL) e concentrar a vácuo. Esfriar para 0°C e adicionar 2-(trifluormetil)oxirano (37,00 g, 330 mmol; 80,0% ee, (2R) é o enantiômero principal). Agitar por cinco minutos e adicionar água (0,80 mL, 0,15 eq.) em gotas. Permitir que aqueça lentamente para a temperatura ambiente e agitar de um dia para o outro. Destilar a vácuo em temperatura ambiente, coletar o composto do título em um frasco resfriado como um óleo amarelo claro (28,10 g, 76%; 99,8% ee). 1H NMR (CDCl3) δ 2,92-2,94 (m, 1H), 2,98-3,01 (m, 1H), 3,41-3,46 (m, 1H).

[0034] Combinar o composto do título (0,13 g, 1,16 mmol) e metanol (1,3 mL). Esfriar para 0oC e adicionar trietilamina (0,17 mL, 1,10 eq.) e tiofenol (0,12 mL, 1,05 eq.). Agitar por 30 minutos. GCMS de uma alíquota mostra formação de 1,1,1-triflúor-3-fenilsulfanil-propan-2- ol (de abertura de anel do composto do título); m/z = 222. LC-MS quiral mostra 99,8% ee, (2S)-1,1,1-triflúor-3-fenilsulfanil-propan-2-ol é o enantiômero principal.Preparação 2 1-Bromo-3,5-difluor-2-nitrobenzeno

[0035] Adicionar ácido nítrico (fumegante, 20 mL) em gotas a uma solução de 1-bromo-3,5-difluorbenzeno (35,00 mL, 304 mmol) em ácido sulfúrico (50 mL) a 0oC. Deixar aquecer lentamente para a tempera tura ambiente e agitar de um dia para o outro. Despejar a mistura de reação em um misturador de gelo e água (600 mL). Deixar aquecer lentamente para a temperatura ambiente. Adicionar acetato de etila (200 mL) e hexanos (100 mL). Agitar até que todos os sólidos dissolvam. Separar as camadas. Lavar os orgânicos com cloreto de sódio aquoso saturado, secar em sulfato de sódio anidro, filtrar e concentrar a vácuo para fornecer o composto do título como um óleo amarelo (57,37 g, 79%). GCMS m/z = 237,239 (Br).Preparação 3 3-Bromo-5-flúor-N-metil-2-nitroanilina

[0036] Adicionar monometilamina 2M em tetra-hidrofurano (92 mL, 2,00 eq.) a uma solução de 1-bromo-3,5-difluor-2-nitrobenzeno (21,90 g, 92 mmol) em 1,4-dioxana (92 mL). Agitar em temperatura ambiente por 45 minutos. Adicionar água e extrair com acetato de etila. Lavar os orgânicos com cloreto de sódio aquoso saturado, secar em sulfato de sódio anidro, filtrar e concentrar a vácuo. Purificar através de cromato- grafia de fase normal, eluindo com um gradiente de cloreto de metileno 20-40% em hexanos, para fornecer o composto do título como um sólido laranja (16,95 g, 74%). MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 249/251 (M+H). Preparação 4 {cis -4-[3-bromo-5-(metilamino)-4-nitrofenóxi]ciclo-hexil}carbamato de terc- butila

[0037] Combinar 3-bromo-5-flúor-N-metil-2-nitroanilina (75,04 g, 301 mmol), (cis-4-hidroxiciclo-hexil) carbamato de terc- butila (89,52 g, 1,38 eq.) e bissulfato de tetra(n-butil)amônio (15,58 g, 0,15 eq.) em diclorometano (975 mL) e hidróxido de sódio aquoso 5M (241 mL). Agitar rapidamente a 37OC sob nitrogênio por cinco dias. Esfriar para a temperatura ambiente. Diluir com diclorometano (200 mL) e água (400 mL). Separar as camadas. Extrair a aquosa com diclorometano (3 x 100 mL). Lavar os orgânicos combinados com cloreto de sódio aquoso saturado, secar em sulfato de sódio anidro, filtrar e concentrar a vácuo. Purificar através de cromatografia de fase normal, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0-40% em hexanos, para fornecer o com-posto do título como um sólido laranja (68,57 g, 51%). MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 442/444 (M-H).Preparação 5 {cis -4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)óxi]ciclo-hexil}carbamato de terc- butila

[0038] Combinar {cis -4-[3-bromo-5-(metilamino)-4-nitrofenóxi]ciclo- hexil}carbamato de terc- butila (76,92 g, 173 mmol) e platina 5% sobre carbono (sulfidado, 3,85 g) em tetra-hidrofurano (923 mL) em um reator Parr. Agitar em temperatura ambiente sob 414 WPa de hidrogênio por três dias. Filtrar em terra diatomácea. Lavar com tetra-hidrofurano. Adicionar trimetilortoformato (165 mL, 8,70 eq.) aos filtrados de tetra- hidrofurano combinados. Agitar por 22 horas a 63OC. Concentrar a maior parte da mistura de reação a vácuo. Diluir com água (400 mL) e acetato de etila (400 mL). Basificar com carbonato de sódio aquoso para ajustar o pH para 9. Separar as camadas. Extrair a aquosa com acetato de etila (2 x 200 mL). Secar os orgânicos combinados em sul fato de sódio anidro, filtrar e concentrar a vácuo. Diluir com terc- butil éter (400 mL) e sonificar por 30 minutos. Filtrar, lavar com terc- butil metil éter e secar sob vácuo para fornecer o composto do título como um sólido marrom claro (52,02 g, 71%). MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 424/426 (M+H).Preparação 6 cis -4-[(4-Bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)óxi]ciclo-hexanamida

[0039] Adicionar ácido trifluoracético (666 mL) lentamente através de funil de adição a uma solução de {cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H- benzimidazol-6-il)óxi]ciclo-hexil}carbamate de terc-butila (222 g, 497 mmol) em diclorometano (1110 mL) a 0°C. Deixar aquecer lentamente para a temperatura ambiente e agitar de um dia para o outro. Concentrar a mistura de reação a vácuo. Adicionar água (250 mL) e basificar com hidróxido de sódio aquoso 50% para ajustar o pH para 10. Adicionar água (250 mL). Extrair com metanol 20% em diclorometano (1500 mL, então 500 mL, então 250 mL). Lavar os orgânicos combinados com hidróxido de sódio aquoso 2M, secar em sulfato de magnésio anidro, filtrar e concentrar para fornecer o composto do título como um sólido marrom (155 g, 91%). MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 324/326 (M+H). Preparação 7(2R)-3-({ cis -4-[(4-Bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)óxi]ciclo-hexil} amino)-1,1,1-trifluorpropan-2-ol

[0040] Adicionar (2R)-2-(trifluormetill)oxirano (73,29 g, 1,50 eq) a uma solução de cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)óxi]ciclo- hexanamina (150,4 g, 436 mmol) em metanol (1053 mL). Agitar em temperatura ambiente de um dia para o outro. Concentrar a mistura de reação a vácuo. Purificar através de cromatografia de fase normal, elu- indo com gradiente de etanol 0-10% em diclorometano, para fornecer o composto do título como um sólido esbranquiçado (98,10 g, 52%). MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 436/438 (M+H).Preparação 8 3-({ cis -4-[(4-Bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)óxi]ciclo-hexil}amino)- 1,1,1 -trifluorpropan-2-ol

[0041] Adicionar 2-(trifluormetil)oxirano (2,13 mL, 1,02 eq; 80,0% ee, (2R) é o enantiômero principal) a uma solução de cis -4-[(4-bromo- 1-metil-1H-benzimidazol-6-il)óxi]ciclo-hexanamina (7,90 g, 24,37 mmol) em isopropanol (130 mL). Aquecer a 70OC de um dia para o outro. Concentrar a mistura de reação a vácuo. Purificar através de cromato- grafia de fase normal, eluindo com um gradiente em etapas de a partir de acetato de etila 100% a metanol 2,5% a 5% a 7,5% a 10% em acetato de etila, para fornecer o composto do título (7,86 g, 74%). MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 436/438 (M+H). Preparação 9 (5S)-3-{ cis -4-[(4-Bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)óxi]ciclo-hexil}-5- (trifluormetil)-1,3-oxazolidin-2-ona

[0042] Combinar 3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il) óxi] ciclo-hexil}amino)-1,1,1-trifluorpropan-2-ol (3,34 g, 7,66 mmol;80,0% ee, (2R) é o enantiômero principal), 1,1’-carbonildiimidazol (2,48 g, 2,00 eq) e 4-dimetilaminopiridina (0,094 g, 0,10 eq) em diclorometano (38,3 mL). Agitar em temperatura ambiente sob nitrogênio de um dia para o outro. Concentrar a mistura de reação a vácuo. Purificar através de cromatografia de fase normal, eluindo com gradiente de metanol 0-5% em diclorometano, para fornecer 3-{cis-4-[(4-bromo-1- metil-1H-benzimidazol-6-il)óxi]ciclo-hexil}-5-(trifluormetil)-1,3-oxazolidin -2-ona (3,28 g; 80,0% ee, (5R) é o enantiômero principal).

[0043] Separar o acima com as condições de cromatografia quiral que seguem para fornecer o composto do título (0,32 g, 9%). MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 462/464 (M+H): Enantiômero 1, >99% ee, 75%/25% CO2/MeOH, 5 mL/min, 4,6 x 150 mm, Chiralpak AD-H.Preparação 10 (2S)-3-({ cis -4-[(4-Bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)óxi]ciclo-hexil} amino)-1,1,1-trifluorpropan-2-ol

[0044] Combinar (5S)-3-{cis-4-[(4-bromo-1-metil-1 H-benzimidazol- 6-il)óxi]ciclo-hexil}-5-(trifluormetil)-1,3-oxazolidin-2-ona (0,32 g, 0,69 mmol) e trimetilsilanolato de potássio (0,36 g, 4,00 eq) em tetra- hidrofurano (7 mL). Agitar em temperatura ambiente sob nitrogênio por seis dias. Diluir com água. Filtrar, lavar com água e secar sob vácuo para fornecer o composto do título como um sólido branco (0,22, 73%). MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 436/438 (M+H). Exemplo 1 (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-Dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzi- midazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol

[0045] Combinar (2R)-3-({ cis -4-[(4-bromo-1-metil-1 H-benzimidazol- 6-il)óxi]ciclo-hexil}amino)-1,1,1-trifluorpropan-2-ol (0,20 g, 0,46 mmol), 1,5-dimetilpirazol-3-amina (0,056 g, 1,1 eq), carbonato de potássio (0,158 g, 2,5 eq), 2-(di-terc-butilfosfino)-2',4',6'-tri-isopropil-3,6-dimetóxi -1,1'-bifenila (0,046 g, 0,20 eq), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0) (0,042 g, 0,10 eq) e ácido acético (0,01 mL) em álcool de terc- butila (5 mL). Vedar com uma tampa de crimpagem. Aquecer em um reator de micro-ondas a 120oC por 45 minutos. Concentrar a mistura de reação a vácuo. Purificar através de cromatografia de fase normal, eluindo com um gradiente em etapas de acetato de etila 100% a metanol 1% a 2,5% a 5% em acetato de etila, para fornecer o composto do título (0,071 g, 33%). MS (ES) m/z = 467 (M+H). Exemplo Alternativo 1 (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-Dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzi- midazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol

[0046] Combinar (2R)-3-({ cis -4-[(4-bromo-1-metil-1 H-benzimidazol- 6-il)óxi]ciclo-hexil}amino)-1,1,1-trifluorpropan-2-ol (50 g, 115 mmol), 1,5-dimetilpirazol-3-amina (18,25 g, 1,43 eq) e carbonato de potássio (50 g, 3,16 eq) em 2-metilbutan-2-ol (400 mL). Agitar e desgaseificar com uma linha de nitrogênio borbulhante por 15 minutos. Adicionar 2- (diciclo-hexilfosfino)-3,6-dimetóxi-2',4',6'-tri-isopropil-1, 1 ’-bifenila (2,20 g, 0,034 eq) e tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0) (1,60 g, 0,015 eq). Agitar e desgaseificar com uma linha de nitrogênio borbulhante por cinco minutos. Adicionar ácido acético (3 mL). Aquecer em refluxo sob nitrogênio por vinte horas. Adicionar 2-(diciclo-hexilfosfino)3,6-dimetóxi -2',4',6'-tri-isopropil-1,1'-bifenila (1,10 g, 0,017 eq) e tris(dibenzilidenoa- cetona)dipaládio(0) (0,80 g, 0,0075 eq). Aquecer em refluxo sob nitro-gênio por três horas. Concentrar a mistura de reação a vácuo. Diluir com água (500 mL). Acidificar com ácido clorídrico aquoso 35% para ajustar o pH para 1. Adicionar acetato de etila (100 mL) e agitar por cinco minutos. Tratar a mistura de reação com carvão ativado (5 g) e filtrar em terra diatomácea. Separar as camadas e descartar os orgânicos. Basificar a camada aquosa com hidróxido de amónio aquoso 30% p/p para ajustar o pH para 10. Filtrar para obter um sólido. Purificar através de cromatografia de fase normal, eluindo com amónia 2M/metanol 10% em diclorometano, para fornecer o composto do título (52 g, 95%). MS (ES) m/z = 467 (M+H). Segundo Exemplo Alternativo 1 (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-Dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzi- midazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol, Forma Cris-talina I

[0047] A: dissolver uma porção do produto de cromatografia de fase normal do Exemplo Alternativo 1 (1,60 g) em acetona:água 9:1 (45 mL). Agitar em temperatura ambiente por 15 minutos e adicionar Silia- Bond® DMT (0,42 g). Filtrar após cinco horas em temperatura ambiente. Concentrar o filtrado para remover toda a acetona, então diluir com água (10 mL). Filtrar e secar sob vácuo para fornecer material cristalino (1,37 g). MS (ES) m/z = 467 (M+H).

[0048] B: transformar em pasta fluida o produto de cromatografia de fase normal do Exemplo Alternativo 1 (47,0 g) em isopropanol (1,15 L). Aquecer a mistura para refluxo para obter uma solução. Adicionar carbono vítreo (6 g). Após uma hora em refluxo, filtrar em terra diato- mácea. Lavar com isopropanol (50 mL) e semear o filtrado com material cristalino da Subseção A conforme provido diretamente acima (0,20 g, em porções). Agitar e deixar esfriar para a temperatura ambiente durante duas horas. Filtrar e secar a vácuo para fornecer material cristalino (37,8 g). MS (ES) m/z = 467 (M+H).Exemplo 2 (2S)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-Dimetil-1 H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1 H-benzi- midazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol

[0049] Combinar (2S)-3-({cis-4-[(4-Bromo-1-metil-1 H-benzimidazol -6-il)óxi]ciclo-hexil}amino)-1,1,1-trifluorpropan-2-ol (0,077 g, 0,18 mmol), 1,5-dimetilpirazol-3-amina (0,030 g, 1,45 eq), carbonato de potássio (0,060 g, 2,46 eq), 2-(di-terc- butilfosfino)-2',4',6'-tri-isopropil-3,6- dimetóxi-1,1'-bifenila (0,022 g, 0,25 eq), tris(dibenzilidenoacetona) di- paládio(0) (0,0080 g, 0,050 eq) e ácido acético (0,01 mL) em álcool de terc- butila (2,5 mL). Vedar com uma tampa de crimpagem. Aquecer a 95OC de um dia para o outro. Diluir com acetato de etila e filtrar em terra diatomácea. Concentrar o filtrado a vácuo. Purificar através de cro- matografia de fase normal, eluindo com gradiente B 5-100% (A: diclo- rometano; B: metanol amoniado 0,75 M 15% em diclorometano). Purificar mais através de cromatografia de fase reversa, eluindo com um gradiente de B 5-100% (A: bicarbonato de amónio aquoso 10 nM com metanol 10%; B: acetonitrila). Concentrar as frações limpas de etanol, então novamente de diclorometano, para fornecer o composto do título (0,054 g, 65%). MS (ES) m/z = 467 (M+H).Exemplo 3 (2R)-3-{[ cis-4-({4-[(1,5-Dimetil-1H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1H-benzimi- dazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1-trifluorpropan-2-ol; ácido dimetano sulfónico

[0050] Combinar (2R)-3-{[ cis -4-({4-[(1,5-dimetil-1 H-pirazol-3-il) amino]-1-metil-1 H-benzimidazol-6-il}óxi)ciclo-hexil]amino}-1,1,1 -trifluor- propan-2-ol (1,00 g, 2,15 mmol) e acetona (35 mL). Aquecer a 51°C e adicionar uma solução de ácido metanossulfônico (0,30 mL, 2,10 eq.) em acetona (5 mL) em gotas. Agitar a 510C por uma hora e então esfriar para a temperatura ambiente. Filtrar o sólido resultante e secar em um forno a vácuo a 700C de um dia para o outro para fornecer o composto do título (1,25 g, 88%).

Difração de Raio X em Pó

[0051] Obter os padrões de XRD de sólidos cristalinos em um di- fractrômetro de raio X em pó Bruker D4 Endeavour, equipado com uma fonte de CuKa À = 1,54060 A) e um detector Vantec, operando a 35 kV e 50 mA. Varrer as amostras entre 4 e 40o em 20, com um tamanho de passo de 0,009o em 20 e uma taxa de varredura de 0,5 se- gundo/etapa e com uma divergência de 0,6 mm, fendas antidifração fixas 5,28 e detectoras 9,5 mm. Empacotar o pó seco em um porta- amostra de quartzo e obter uma superfície lisa usando uma lâmina de vidro. Coletar os padrões de difração de forma de cristal em temperatura ambiente e umidade relativa. É bem conhecido na técnica de cristalografia que, para uma dada forma de cristal, as intensidades relativas dos picos de difração podem variar devido à orientação preferida resultante de fatores tais como morfologia de cristal e habitat. Onde os efeitos de orientação preferida estão presentes, intensidades de pico são alteradas, mas as posições de pico características do polimorfo são não modificadas. Vide, por exemplo, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary No. 18, páginas 1843-1844, 1995. Ainda, é também bem conhecido na técnica de cristalografia que para qualquer dada forma de cristal as posições de pico angular podem variar ligeiramente. Por exemplo, posições de pico podem mudar devido a uma variação na temperatura e umidade nas quais uma amostra é analisada, deslocamento de amostra ou a presença ou ausência de um padrão interno. No presente caso, uma variabilidade da posição de pico de ± 0,2o em 20 levará em conta essas variações de potencial sem entravar a identificação clara da forma de cristal indicada. Confirmação de uma forma de cristal pode ser feita com base em uma combinação única de picos de distinção (em unidades de o 20), tipicamente os picos mais proeminentes. Ajustar os padrões de difração de forma de cristal, coletados em temperatura ambiente e umidade relativa, com base em picos padrão NIST 675 a 8,853o e 26,774o C 20.

[0052] Caracterizar uma amostra preparada do composto do Segundo Exemplo Alternativo 1 através de um padrão de XRD usando radiação CuKa como tendo picos de difração (valores 20) como descrito na Tabela 1 abaixo e em particular tendo picos a 19,5° em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 11,9o, 15,4o e i7,>o; com uma tolerância do ângulo de difração de 0,2o.Tabela 1: picos de difração de raio X em pó do Segundo Exemplo Al-ternativo 1.

[0053] Caracterizar uma amostra preparada do composto do Exemplo 3 através de um padrão de XRD usando radiação CuKa co mo tendo picos de difração (valores 20) como descrito na Tabela 2 abaixo e, em particular, tendo picos a 21,7o em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 21,2o, 18,0° e 15,70; com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2o.Tabela 2: picos de difração de raio X em pó do Exemplo 3

Ensaios de enzima in vitro JAK1, JAK2 e JAK3

[0054] O JAK LanthaScreen® Kinase Assay (Invitrogen) é usado para determinar a habilidade de compostos de teste em inibir atividade de cinase JAK1, JAK2 e JAK3. Esses são formatos de ensaio TR- FRET que usam anticorpo marcado com térbio de tempo de vida longo como a espécie doadora e GFP-STAT1 como a espécie aceptora. Usar a razão TR-FRET para monitorar atividade de JAK cinase onde um aumento em fosforilação do GFP-STAT1 resulta em um aumento na razão TF-FRET. Realizar a reação de cinase usando um volume de reação de 12,5 μl em Proxiplate de 384 cavidades preta rasa. Adicionar reagentes para obter condições de reação finais de HEPES 50 mL pH, Triton X-100 1,76 mM, ensaios de enzima ATP (20,0 μM para JAK1 e JAK3 ou 5 μM para JAK2), MgCh 10,0 mM, EGTA 1 mM e Brij- 35, GFP-STAT1 0,05 mM, enzima JAK1 14 nM para ensaios de enzima JAK1, 1,0 nM para JAK2 ou 2,5 nM para JAK3 e DMSO 4% e diluições seriais de composto de teste (diluído 1:3 de 20.000 a 1 nM). Seguindo adição de ATP/GFP-STAT1, centrifugar as placas de ensaio por 1 minuto a 1000 revoluções por minuto (RPM). Permitir que as placas incubem em RT por 60 minutos e então adicionar 12,5 μL de um tampão de parada contendo EDTA 20 mM, Anticorpo para Transdutores de Sinal antifosforilados por Térbio e Ativadores de Transcrição [aminoácido Tirosina 701 de fosforilação) Anticorpo (Tb-anti-pSTAT1 [pTyr701], cloridrato de tris(hidroximetil)aminoetano 0,67 mM (Trizma®) pH 7,5, NaN3 0,02% e nonilfenolpolietileno glicol 0,01% (Nonidet® P40). Incubar em RT por 90 minutos e ler em uma leitora de placa Envision com filtro de excitação de comprimento de onda de 340 nm e filtros de emissão de comprimentos de onda de 520 nm e 495 nm. Derivar a razão do comprimento de onda de emissão para o GFP-STAT1 que é medido a 520 nm versus a emissão a 495 nm para o (Tb-anti- pSTAT1[pTyr701]. Derivar o valor de IC50 para cada composto usando dados de inibição percentual que são calculados a partir dos dados de reação em relação a controles na placa (enzima ativa versus enzima inibida a 2,0 mM com tofacitinibe). Usar ACTIVITYBASE 4.0 para ajustar os dados de inibição percentual e concentração de composto de dez pontos a uma equação logística de quatro parâmetros.

[0055] Um composto dentro do escopo da invenção é testado neste ensaio substancialmente como acima descrito. O composto do Exemplo 1 mostra uma IC50 de JAK1 de 4,0 ± 0,8 nM (n=6), uma IC50 de JAK2 de 557 ± 337 nM (n=6) e uma IC50 de JAK3 de 1910 ± 786 nM (n=6). Os resultados mostram que o composto do Exemplo 1 inibe enzima JAK1 in vitro. Esses resultados também mostram que o composto do Exemplo 1 é um inibidor mais potente de enzima JAK1 e seletivo em relação à JAK2 e JAK3 in vitro.

Ensaio de Proliferação de Clone 12 de JAK-1 Mutante BaF3 (S729C)

[0056] O propósito deste ensaio é determinar a atividade inibidora de inibidores específicos para JAK-1 usando o ensaio de proliferação de Clone 12 de JAK-1 mutante BaF3 (S729C).

[0057] A linhagem de célula expressando mtJAK1 (S729C) é criada através da transdução de células Ba/F3 (pro-células B de murino) com um retrovirus expressando mtJAK1 humana (S729C)-DNA de vetor pQCXIN. Clonagem de célula única é realizada para selecionar células Ba/F3 expressando os níveis mais altos de mtJAK1 (S729C) através de diluição serial. Células em suspensão JAK-1 mutante BaF3 (S729C) são culturadas e mantidas (RPMI Gibco 1640 No. cat. A10491-01) contendo Hi-FBS 10% (No. Cat. Hyclone 10082-047), 1 μg/mL de bicloridrato de puromicina (No. cat. Sigma 9620), 1,0 mg/mL de sulfato G418 (No. Ref. Corning 30-234-CI), referido como R10+ a partir de agora.

[0058] Ensaios de proliferação são realizados em meio de cultura sem seleção e a partir de agora serão referidos como (R10-). Em suma, as células culturadas são decantadas, centrifugadas e reconstituídas em 10 mL de R10- e contadas usando um Beckman Coulter Vi- Cell. As células são diluídas mais para 2e4/mL em R10- e plaqueadas em placas de ensaio brancas opacas de 96 cavidades (No. Cat. Costar 3610) a 1x103 células (50 μl) por cavidade. Em placas de polipropileno de 96 cavidades correspondentes, os compostos de teste são diluídos em DMSO 100% seguido por uma diluição adicional em R10- para fornecer um modelo de composto de teste 2X. Os compostos de teste diluídos são adicionados à placa de célula correspondente para fornecer um CRC de 20 μM a 0,001 μM. Controles mínimo e máximo são incluídos em cada placa. Estaurosporina (final 1 μM) é usada para o controle mínimo e R10- contendo níveis de DMSO equivalentes como o CRC é usado como o controle máximo. As placas são cobertas com tampas de evaporação Microcline cheias de água (No. Cat. LLS-0310) e incubadas a 37OC em CO2 5% por 3 dias. Seguindo a incubação por 3 dias, as placas são removidas da incubadora e deixadas esfriar para temperatura ambiente. Uma vez esfriadas, as placas são desenvolvidas adicionando 100 μL de Cell Titer Glo (No. Cat. Promega G7571), misturando 2 minutos em um misturador de placa e incubando mais 10 min em temperatura ambiente. Luminescência é então lida em um Perkin Elmer Victor2 usando um programa de preajuste para luminescência a 0,1 segundo. Curvas de IC50 são geradas usando um programa STATS TMAG interno e GraphPad Prism versão 4.03.

[0059] Um composto dentro do escopo da invenção é testado neste ensaio substancialmente como descrito acima. O composto do Exemplo 1 mostra uma IC50 de 956 nM ± 217 nM (n=4). O resultado mostra que o composto do Exemplo 1 é ativo contra mtJAK1 (S729C) expressando em células Ba/F3.

Ensaio à base de célula p-STAT3-(p-Tyr705)-IL6-1-JAK1 Protocolo AlphaScreen SunFire

[0060] O ensaio à base de célula JAK1 descrito acima é usado para determinar a potência celular de JAK1 de compostos de teste. Preparação de célula:

[0061] Deixar células TF-1 em inanição em meio DMEM com 26400 0,5% (FBS) e 1X Pen/Strep a 37OC. Plaquear células 100K por cavidade em placas pretas de 96 cavidades com fundos transparentes. Manter as placas em RT por 30-60 minutos antes da incubação de um dia para o outro a 37OC e CO2 5%. Contar as células usando contador Vi-Cell, usando uma suspensão celular a 100 células/mL e plaquear 100 μL/cavidade em placas Beckman Dickinson Biocoat (No. catálogo 354640).

Preparação de composto de teste e tratamento:

[0062] Preparar os compostos em diluições seriais 1:3 em DMSO e diluir mais no meio. Testar os compostos em uma faixa de concen-trações de 10 pontos de 20.000 a 1 nM. Adicionar composto diluído a placas de célula correspondentes. Incubar as placas a 37OC por 20 min. Adicionar solução de IL6 na concentração final de 30 ng/mL a placas de célula correspondentes e continuar a incubar a 37OC por 30 min. Remover meio e adicionar 50 μL de tampão de lise 1x a cada cavidade.

Detecção de pSTAT3:

[0063] Realizar as etapas que seguem sequencialmente: fazer mistura aceptora (tampão de ativação/tampão de reação/contas acep- toras); transferir 4 μL de lisato das placas de 96 cavidades para Proxi- plates de 384 cavidades; adicionar 5 μL de mistura aceptora a placa(s) Proxilate 384 e vedar as placas com lacre de alumínio; agitar 1-2 minutos em um agitador de placa; incubar a placa em temperatura ambiente por 2 h com agitação suave; fazer a mistura doadora (contas doadoras em tampão de diluição); adicionar 2 μL de mistura doadora às placas de ensaio; vedar as placas com vedação de alumínio; agitar 1-2 minutos em agitador de placa; incubar em temperatura ambiente por 2 h com agitação suave; ler a placa com Envision; protocolo AlphaScreen Surefire 384.

[0064] Um composto dentro do escopo da invenção é testado neste ensaio substancialmente como acima descrito. O composto do Exemplo 1 mostra uma IC50 de 87 nM ± 75 (n=10). Este resultado mostra que o composto do Exemplo 1 inibe enzima JAK1 em um ensaio à base de célula.

Ensaio à base de célula H1975-JAK1 Protocolo ACUMEN Fosfo- STAT3 (Tyr705)

[0065] Um ensaio celular H1975-JAK1 é usado para confirmar a potência de compostos de teste em células NSCLC em que a via STAT3 é ativada por alça de IL-6 autócrina.

Preparação de célula:

[0066] Realizar as etapas que seguem sequencialmente: examinar as células sob o microscópio; aspirar meio das células com uma pipeta acionada por vácuo estéril; lavar as células com aproximadamente 5 mL de PBS; aspirar PBS com uma pipeta acionada por vácuo estéril; adicionar 5 mL de Tripsina 0,25%-EDTA a frasco de 150 cm2; agitar o frasco suavemente para cobrir as células com tripsina e deixar agitar em chaminé por 3 minuto ou pôr o frasco em incubadora por 3 minutos para soltar as células do frasco; agitar o frasco algumas vezes para assegurar que as células estejam soltas; adicionar 10 mL de meio de crescimento ao frasco, gentilmente despejar suspensão sobre o lado do crescimento de célula do frasco e pipetar para cima e para baixo para triturar as células; girar (1300 rpm 5 min), ressuspender em 10 mL de meio de crescimento; filtrar através de um filtro de célula (BD Falcon 352350, filtro de célula de 70 μm); coletar as células em um tubo cônico estéril de 50 mL; contar as células usando o contador Vi- Cell (0,5 mL de células).

[0067] Dia 1: plaquear 30000 células por cavidade em placas pretas de 96 cavidades DB com fundos transparentes. Contar as células usando contador Vi-Cell, usar uma suspensão de célula a 300000 cé- lulas/mL e plaqueada a 100 μL/cavidade em placas Beckman Dickinson Biocoat No. Catálogo 354640. Manter as placas em temperatura ambiente por 30-60 minutos antes de pô-las na incubadora. Então incubar de um dia para o outro a 37OC e CO2 5%.

Preparação de composto e tratamento:

[0068] Preparar uma placa de cavidade funda contendo 1 mL de meio sem FBS com DMSO 0,6%, então adicionar 2 μL de composto (solução DMSO 10 mM), fazendo uma placa de estoque de 20 μM. Realizar diluições seriais 1:3 dos compostos em meios sem FBS com DMSO 0,6% em placas de diluição. Testar os compostos em uma faixa de concentrações de 10 pontos de 20 μM a 1 nM. Remover meio das placas de ensaio com células. Transferir 100 μL de compostos da placa de diluição para as placas de ensaio (placas Beckman Dickinson Biocoat No. Catálogo 356440) contendo a célula ligada com 100 μL de meio e usar o programa TEMO: SAMPLE TRANSFER CELL BASED ASSAY de despejamento lento.gem 3797. Então incubar as células por 4 h a 37OC.

Detecção de pSTAT3:

[0069] No Dia 1, realizar as etapas que seguem sequencialmente: remover meio; adicionar 100 μL de paraformaldeido 3,7%; incubar por 30 minutos no escuro; lavar com 100 μL de PBS; e adicionar 100 μL de metanol frio; incubar 15 minutos no escuro; lavar 2 vezes com 100 μL de PBS; adicionar 100 μL de solução de bloqueio (BSA 1% em PBS); incubar por 30 minutos no escuro; adicionar 50 μL de anticorpo primário pSTAT3 1:500 (em solução de bloqueio: BSA 1%; Antifosfo- STAT3 de Camundongo (Tyr705)); vedar as placas com folha de alu- minio e incubar a 4OC com agitação suave de um dia para o outro.

[0070] No Dia 2, realizar as etapas que seguem sequencialmente: lavar 2 vezes com 100 μL de PBS; adicionar 50 μL de anticorpo secundário (1:1000; IgG anticamundongo de cabra Ab2o); incubar por 1 hora em RT no escuro; lavar 2 vezes com 100 μL de PBS; adicionar 100 μL de lodeto de Propidio (1:1000 em PBS de solução comercial) contendo RNAse (50 μg/mL em PBS); vedar as placas com pelicula transparente e incubar em RT por 2 horas antes da leitura; ler em Acumen Explorer (ajustar o parâmetro com base em cavidade positiva e negativa). Laser (Varredura 1) 488 nm. Processamento de Dados:

[0071] Processar dados através do Activity Base e analisar usando uma equação logistica não linear de 4 parâmetros (curva de concentração-resposta logistica de quatro parâmetros): Y = inf + [(sup-inf)/l+(x/IC5o)inclinação] onde Y = inibição %, X = concentração fornecendo inibição %y, Inferior = valor mínimo de y atingido pela curva, Superior = valor máximo de y atingido pela curva e Inclinação = passo de curva em IC50.%Inh = [(Max mediana-x/Max mediana - Mini mediana)] • 100

[0072] Um composto dentro do escopo da invenção é testado neste ensaio substancialmente como acima descrito. O composto do Exemplo 1 mostra uma IC50 de 297 nM (n=1). O resultado mostra que o composto do Exemplo 1 é ativo contra JAK1 em células NSCLC em que a via de STAT3 é ativada por alça de IL-6 autócrina.

Ensaio à base de célula p-STAT (p-Tyr694/699)-EPO-JAK2 Protocolo AlphaScreen SureFire

[0073] A seletividade dobrada de compostos de teste para JAK1 em relação à JAK2 é determinada através de um ensaio celular, em que EPO é usado para ativar via de JAK2-STAT5 e psTAT5 é usado como a leitura.

Preparação de célula:

[0074] Deixar células UT-7 em inanição de um dia para o outro em meio DMEM com 1600 0,5% (FBS) e Pen/Strep 1X a 37OC (sem GM- CSF). Plaquear 50000 células por cavidade em placas pretas de 96 cavidades BD com fundos transparentes (em meio sem FBS e GM- CSF). Manter as placas em RT por 30-60 minutos antes da incubação de um dia para o outro a 37OC e CO2 5%. Contar as células usando contador Vi-Cell, usar uma suspensão celular a 500000 células/mL e plaquear 100 μL/cavidade em placas Beckman Dickinson Biocoat No. catálogo 354640.

Diluição de composto e tratamento:

[0075] Testar compostos em uma faixa de concentração de 10 pontos de 20.000 a 1 nM. Preparar compostos em diluições seriais 1:3 em DMSO e diluir mais no meio. Adicionar composto diluído a placas de célula correspondentes e incubar a 37OC por 20 min, então adicionar 20 μL de EPO (295 ng/mL. Concentração final 45 ng/mL) a placas de célula correspondentes, continuar a incubar a 37OC por 30 min.

Lise de células:

[0076] Descarregar meio (cuidadosamente) e adicionar 50 μL de tampão de lise 1x a cada cavidade (congelar lisato LIGADO). (tampão de lise: 5X. Diluído em água para uma concentração final de 1X).

Detecção de p-STAT5:

[0077] Seguir as etapas abaixo sequencialmente: fazer mistura aceptora (tampão de ativação/tampão de reação/contas aceptoras); transferir 4 μL de lisato das placas de 96 cavidades para placas de 384 cavidades Proxiplate; adicionar 5 μL de mistura aceptora a placa(s) Proxiplate 384 com combi multigotejamento; vedar as placas com lacre de alumínio; agitar 1-2 minutos em agitador de placa; incubar a placa em RT por 2 h com agitação suave; fazer a mistura doadora (contas doadoras em tampão de diluição); adicionar 2 μl de mistura doadora a placas de ensaio com combi multigotejamento; vedar as placas com lacre de alumínio; agitar 1-2 minutos em agitadora de placa; incubar em RT por 2 h com agitação suave; ler a placa com Envision; protocolo AlphaScreen Surefire 384.

[0078] Um composto dentro do escopo da invenção é testado neste ensaio substancialmente como acima descrito. O composto do Exemplo 1 é exibido em uma IC50 de 11,8 μM ± 5,4 (n=5). O resultado mostra que o composto do Exemplo 1 é seletivo para JAK1 em relação à JAK2 em um ensaio celular, em que EPO é usado para ativar a via de JAK2-STAT5.

Ensaios de Sangue Integral Humano: determinação de pSTAT3 (JAK1) e pSTAT5 (JAK2) em linfócitos e monócitos

[0079] Ensaios de sangue integral humano (HWB) foram desenvolvidos e validados para determinar a seletividade para JAK1 e JAK2 de compostos de teste.

[0080] Diluir os compostos de teste, 10 pontos, (1:3) em DMSO 100% e uma diminuição em PBS + BSA 0,1%. Usar tofacitinibe como um composto de referência em cada placa, bem como um sinal máximo (cavidades estimuladas) e um sinal mínimo (cavidades não estimuladas) a fim de normalizar os dados. Obter um grupo de HWB de 4 doadores saudáveis diferentes. Plaquear o sangue em uma placa de 96 cavidades usando um Tecan Evo 96w e incubar com compostos de teste por 1 h em RT. Após este tempo de incubação, estimular HWB com ambos IL6 (206-IL, R&D System) e GM-CSF (PHC2015, Life Technologies) por mais 15 minutos. Adicionar um corante de viabilidade (65-0865, eBioscience) (1:1000) usando um Tecan Evo 96w (mistu- ra5x).

[0081] As concentrações finais no ensaio são como segue: 100 μM para compostos, 50 μM para tofacitinibe, 0,1 μg/mL de IL6, 0,038 μg/mL GM-CSF e DMSO 1%. Lisar e fixar HWB usando um tampão de Lise/fixação (558049, Becton Dickinson) adicionando 900 μL de tampão de lise usando Tecan Evo 96w (mistura de velocidade alta 10x). Incubar HWB em banho a 37o C por 10 minutos. Centrifugar HWB a 500G, 8 min e descartar sobrenadante. Adicionar metanol frio usando um Tecan Exo 96w a fim de permeabilizar as células. Incubar as células do sangue em gelo durante 30 min. Depois disso, lavar as células 2x usando tampão de tingimento (554656, Becton Dickinson), girar a 3000 rpm, 2 min, descartar sobrenadante e adicionar os anticorpos que seguem: Anti-Humano CD4 PE, 1:100 (12-0048, eBioscience), Anti-Humano CD33 eFluorb 450,1:50 (48-0337, eBioscience), Phospho- STAT5 (Tyr694) (C71E5) mAb de coelho, 1:100 (Alexa Fluor® 488 Conjugate) (3939, Cell Signaling) e Phospho-STAT3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb 1:200, (Alexa Fluor® 647 Conjugate)(4324, Cell Signaling). Incubar os anticorpos por 1 h no escuro em temperatura ambi- ente, então lavar as células 2x e ler em Cytometer Macsquant (Miltenyi Biotec). Registrar dados em CD4+ (linfócitos) e CD4Low CD33Hi (mo- nócitos) para medir a fluorescência de células expressando pSTAT3 e pSTAT5, respectivamente. Analisar os dados usando FlowJo v_10 e então normalizar o meio de fluorescência versus sinal máximo e mínimo para determinar as IC5os. Usar GraphPad Prism 5 para representar as curvas de dose resposta.

[0082] Um composto dentro do escopo da invenção é testado neste ensaio substancialmente como acima descrito. O composto do Exemplo 1 mostra uma IC50 de 2,40 ± 0,64 μM (n=3) para JAK1 e uma IC50 de 13,0 ± 3,2 μM (n=3) para JAK2. Os resultados demonstram que o composto do Exemplo 1 mostra aproximadamente 5X mais potência para JAK1 em relação à JAK2 em um ensaio de sangue integral humano.

Ensaio de IVTI (JAK1) de Camundongo pSTAT3

[0083] O propósito deste ensaio é medir a habilidade de compostos de teste em inibir a fosforilação de STAT3 (ativação de STAT3) no modelo de camundongo de xenoenxerto H1975. Cultivar células H1975 de acordo com especificações ATCC no menor número de passagem possível disponível. Culturar e manter as células em RPMI- 1640 suplementado com FBS 10% e incubado a 37OC em CO2 5%. Coletar as células através de técnicas padrão e misturar com matriz de membrana de base BD Biosciences (MATRIGEL®) para suspensão celular atingir uma razão de célula/matriz 1:1 fornecendo um volume de inoculação de 0,2 mL célula/matriz de suspensão contendo células 5 e 6. Manter as suspensões de célula em gelo durante o procedimento de inoculação e iniciar implantes dentro de uma hora após coleta da cultura de célula. Administrar todos os implantes subcutaneamente no flanco traseiro direito de camundongos Atímicos Nus fêmeas obtidos da Harlan. Alimentar todos os camundongos com Harlan Teklad No.2920X ad libitum e prover água através de embalagens de gel. Permitir que as células de tumor implantadas cresçam como um tumor sólido e medir duas vezes por semana junto com peso do corpo, começando 59 dias pós-implante. Determinar volumes do tumor usando o cálculo: 0,536*L*WA2. Após o volume do tumor atingir aproximadamente 200250 mm3, aleatorizar os animais usando a ferramenta de aleatorização de bloco de multitarefa e pôr em um grupo de veículo contendo 6-10 animais e grupos de tratamento múltiplos contendo 6 animais cada um. Formular os compostos de teste em veículo HEC 1% contendo Tween 80 0,25% e antiespumante 0,05% com 1,1 equivalente molar de ácido metanossulfônico para formar um sal in situ. Não adicionar ácido ao grupo controle de veículo. Calcular doses com base no peso corporal médio mais recente. Administrar compostos através de gava- gem oral para ambos os estudos de dose resposta e curso de tempo. Estudos de dose resposta são uma dose única administrada por 2 horas antes da remoção, processamento e congelamento do tumor. Estudos de curso de tempo são uma dose única administrada no TED70 determinado a partir do estudo de dose resposta.

[0084] Processamento de T ecido de T umor:

[0085] Coletar e cortar de tumores para fornecer fragmentos de tamanho de aproximadamente 150-250 mm3 e imediatamente pôr em um tubo de 12x75 mm contendo 1 mL de tampão de lise MSD Tris gelado (No. Cat. Meso Scale Discovery R60TX-2) e HALT 1X (Produto Thermo Scientific No. 1861281). Homogeneizar as amostras por aproximadamente 15 segundos usando uma sonda homogeneizadora de ponta omni de tecido dura descartável (No. cat. Omni International 3_750H) e deixar assentar em gelo molhado por mais 15-25 minutos antes da transferência para um congelador a -60OC de um dia para o outro. Remover amostras do congelador e deixar assentar em temperatura ambiente para iniciar descongelamento. Uma vez as amostras tendo começado a descongelar, transferir para gelo molhado e continuar o descongelamento. Após descongelamento estar completo, vor- texar as amostras e transferir para um tubo microfuge de 1,8 mL. Centrifugar os lisatos a 14.000Xg por 30-60 minutos a 40C. Transferir os lisatos (200 μL) para uma placa de polipropileno de 96 cavidades (No. Cat. Costar 3879). Determinar as concentrações de proteína usando o Pierce BCA Protein Assay Kit (No. cat. 23225) como indicado abaixo. Em suma, uma curva-padrão é gerada usando um padrão BSA diluído em tampão de lise RIPA contendo HALT 1X para fornecer uma faixa de trabalho de 2.000 μg/mL a 25 μg/mL. Todos os lisatos são diluídos 1:10 em tampão de lise RIPA contendo HALT 1X. Pipetar 25 μL dos padrões e amostras em uma placa de 96 cavidades (No. Cat. Falcon 353072) e adicionar 200 μL do reagente de trabalho e cada cavidade e misturar a placa completamente em um agitador de placa por 30 segundos. Cobrir a placa e incubar a 370C por 30 minutos. Esfriar a placa para temperatura ambiente e medir a absorbância em ou próximo de 562 nm em Molecular Devices Spectra Max. As concentrações de proteína para cada amostra são determinadas usando o programa de software SoftMax Pro 6.3. Após as amostras de tumor serem quantificadas, congelar os lisatos a -800C na placa de polipropileno de 96 cavidades e ensaiar em uma data posterior.

Medição de pSTAT3:

[0086] Realizar o ensaio de pSTAT3 (Tyr705) como segue. O estojo de ensaio de MSD pSTAT3 é da Meso Scale Discovery (No. Cat. K150DID-2). O inibidor de protease e fosfatase HALT 100X pode substituir o estojo de inibidores de protease e fosfatase com base em facilidade de uso e desempenho. Preparar o tampão de lise de MSD Tris adicionando inibidor de protease e fosfatase HALT 100X para uma concentração final 1X, referido como tampão de lise completo de MSD. Remover amostras de tumor do congelador a -800C e deixar assentar em temperatura ambiente para iniciar descongelamento. Durante o descongelamento da amostra, bloquear a placa de captura pSTAT3 Tyr705 (No. cat. K150DID-2) com 150 μL de uma solução de bloqueio por um mínimo de 1 h em temperatura ambiente em um agitador de placa com agitação vigorosa (300-1000 rpm). Vedar as placas com um lacre de placa adesivo antes da agitação. A solução de bloqueio contém a razão de Bloqueador A (No. cat. R93BA-4) 600 mg:20 mL de tampão de lavagem de Tris MSD 1X (No. cat. R61TX-2). Uma vez as amostras tendo começado a descongelar, transferir para gelo molhado para continuar o descongelamento. Após o descongelamento estar completo, misturar cuidadosamente através de pipetagem para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta de multicanal. Normalizar as amostras em um tampão de lise completo MSD gelado para uma concentração de proteína de 0,4 μg/mL X 100 μL. Manter todas as amostras de tumor normalizadas em gelo em uma placa de polipropi- leno de 96 cavidades até que elas sejam adicionadas à placa de captura de pSTAT3. Após a placa de captura de pSTAT3 ser bloqueada, lavar 4X com 250-300 μl de tampão de lavagem MSD Tris 1X usando um lavador de placa Thermo Labsystems Multidrop 384. Após a lavagem final, dar leves batidas na placa para remover qualquer tampão de lavagem restante. Adicionar um volume total de 25 μl (10 μg) de lisato de tumor normalizado por cavidade e incubar mais 2-3 horas em temperatura ambiente em um agitador de placa com agitação vigorosa (300-1000 rpm). Durante esta incubação, diluir o anticorpo de detecção Sulfo-TAG anti-Fosfo-STAT 3 provido no estojo no tampão de diluição de anticorpo (1 mL de solução de bloqueio combinada com 2 mL de tampão de lavagem Tris MSX 1X) adicionando 60 μL de anticorpo de detecção Sulfo-TAG anti-Fosfo-STAT 3 a 2,94 mL de tampão de diluição de anticorpo. Manter esta solução de anticorpo em gelo molhado até necessário. Seguindo incubação de lisato de tumor, lavar a placa 4X com 250-300 μL de tampão de lavagem Tris MSD 1X. Após a última etapa, dar batidas na placa para remover qualquer tampão de lavagem restante e adicionar 25 μL/cavidade do anticorpo de detecção Sulfo-TAG anti-Fosfo-STAT 3. Incubar a placa mais uma hora em RT em um agitador de placa com agitação vigorosa (300-1000 rpm). Durante esta incubação, diluir o Tampão de Leitura T MSD 4X com ten- soativo (No. Cat. R92TC-3) para 1X com água deionizada e manter em temperatura ambiente. Após a incubação do anticorpo de detecção ser terminada, lavar a placa 4X com 250-300 μL de tampão de lavagem Tris. Após a lavagem final, bater na placa levemente para remover qualquer tampão de lavagem restante e adicionar um volume total de 150 μL/cavidade de Tampão de Leitura T MSD 1X com tensoativo. Ler a placa no Meso Quick Plex SQ 120. Analisar dados como indicado abaixo.

Cálculo de Inibição de pSTAT3 percentual:

[0087] Copiar e colar dados de placa brutos do Meso Quick Plex SQ 120 diretamente em uma folha de cálculo Microsoft Excel versão 2010. Organizar os dados no formato apropriado (Dose Resposta ou Curso de Tempo), copiados e coletados diretamente na versão JMP 11 para cálculos de inibição percentual de pSTAT3 (vide fórmula abaixo).[1 - (Sinal de Amostra de Tratamento/Sinal Médio de Controle de Veí-culo)]* 100

Determinar um Oneway Anova com média de grupo de tratamento comparado com média de controle veículo usando Dunnett. Cálculos de TED:

[0088] Determinar os valores de TED50 e TEC50 a partir de um es tudo de dose resposta. A TED50 é a dose necessária para atingir 50% de inibição de pSTAT3 e TEC50 é a concentração no plasma para atingir 50% de inibição de pSTAT3, respectivamente, em duas horas.

[0089] Um composto dentro do escopo da invenção é testado neste ensaio substancialmente como descrito acima. O composto do Exemplo 1 mostra uma TED50 de 35 mg/kg e uma TEC5O de 11,1 μM (n=1). Esses resultados mostram que o composto do Exemplo 1 inibe eficazmente sinalização de JAK1-STAT3 (usando pSTAT3 como uma leitura) in vivo em 2 horas após dosagem oral. Esses resultados mostram que o composto do Exemplo1 também demonstra atividade relacionada de PK/PD com TEC50.

Ensaio de IVTI (JAK1) de rato pSTAT3

[0090] O propósito deste ensaio é medir a habilidade de compostos de teste em inibir a expressão de pSTAT3 no modelo de rato de xenoenxerto H1975. Cultivar células H1975 de acordo com especificações ATCC no menor número de passagem possível disponível. Cultu- rar e manter as células em RMPI-1640 suplementado com FBS 10% e incubar a 37OC em CO2 5%. Coletar as células através de técnicas padrão e misturar com matriz de membrana de base BD Biosciences (MATRIGEL®) para obter uma razão de célula/matriz 1:1 fornecendo um volume de inoculação de 0,2 mL de suspensão de célula/matriz contendo células 2e6. Manter as suspensões de célula em gelo durante o procedimento de inoculação e começar os implantes dentro de uma hora após a coleta da cultura de célula. Administrar todos os implantes subcutaneamente no flanco traseiro direito de rato NIH Nu fêmea obtido da Taconic. Alimentar todos os ratos com Harlan Teklad Global Diets No. 2920X ad libitum e prover garrafas de água. Permitir que as células de tumor implantadas cresçam como um tumor sólido e medir duas vezes por semana junto com peso do corpo. Começar a medir o peso do corpo e volumes de tumor 5-9 dias após o implante. Determinar os volumes do tumor usando o cálculo: 0,536*L*WA2. Após o volume do tumor atingir aproximadamente 350-400 mm3, aleatorizar os animais usando a ferramenta de aleatorização de bloco de multita- refa e pôr em um grupo de veículo contendo 6 animais e grupos de tratamento múltiplos contendo 6 animais cada um. Formular os com-postos em veículo HEC 1% contendo Tween 80 0,25% e antiespuman- te 0,05% com 1,1 equivalente molar de ácido metanossulfônico para formar um sal in situ (1,1 mL de ácido metanossulfônico 1N por mg de composto). Não adicionar ácido ao grupo controle de veículo. Calcular doses com base no peso do corpo médio do grupo mais recente. Ad-ministrar todos os compostos através de gavagem oral para ambos os estudos de resposta de dose e curso de tempo. Estudos de resposta de dose são uma dose única administrada por 2 horas antes da remoção, processamento e congelamento do tumor. Estudos de curso de tempo são uma dose única administrada na TED70 determinada a partir do estudo de resposta de dose. Realizar remoção de tumor, processamento e congelamento ocorrem em pontos de tempo múltiplos mostrados abaixo.

Processamento de Tecido de Tumor

[0091] Coletar e cortar tumores para fornecer fragmentos de apro-ximadamente 200-250 mm3 e imediatamente pôr em um tubo de 12x75 mm contendo 1 mL de tampão de Lise MSD Tris gelado (No. cat. Meso Scale Discovery R60TX-2) e HALT 1X (Produto Thermo Scientific 1861281). Homogeneizar as amostras por aproximadamente 15 segundos usando uma sonda homogeneizadora de ponta omni de tecido dura descartável (No. Cat. Omni International 3_750H) e permitir assentar em gelo molhado por mais 15-25 minutos antes da transferência para um congelador -60OC de um dia para o outro. Remover as amostras do congelador e permitir assentar em temperatura ambiente para iniciar o descongelamento. Uma vez tendo as amostras começado a descongelar, transferir para gelo molhado para continuar o descongelamento. Após descongelamento estar completo, vortexar as amostras e transferir para um tubo microfuge de 1,8 mL. Centrifugar os lisatos a 14.000Xg por 30-60 minutos a 40C. Transferir os lisatos (200 μL) para uma placa de polipropileno de 96 cavidades (No. cat. Costar 3879) correspondendo ao desenho do modelo de amostra de 96 cavi-dades. Determinar as concentrações de proteína usando o Pierce BCA Protein Assay kit (No. cat. 23225) como indicado abaixo. Em suma, uma curva-padrão é gerada usando um padrão BSA diluído em tampão de lise RIPA contendo HALT 1X para fornecer uma faixa de trabalho de 2.000 μg/mL a 25 μg/mL. Todos os lisatos são diluídos 1:10 em tampão de lise RIPA contendo HALT 1X. Pipetar 25 μL dos padrões e amostras em uma placa de 96 cavidades (No. cat. Falcon 353072) e adicionar 200 μL do reagente de trabalho a cada cavidade e misturar a placa completamente em um agitador de placa por 30 segundos. Cobrir a placa e incubar a 370C por 30 minutos. Esfriar a placa para temperatura ambiente e medir a absorbância em ou próximo de 562 nm em Molecular Devices Spectra Max. As concentrações de proteína para cada amostra são determinadas usando programa de software SoftMax Pro 6.3. Após as amostras de tumor serem quantificadas, congelar a -800C na placa de polipropileno de 96 cavidades e ensaiar em uma data posterior.

Medição de pSTAT3

[0092] O ensaio de pSTAT3 (Tyr705) é realizado como segue. O estojo de ensaio de MSD pSTAT3 é da Meso Scale Discovery (No. Cat. K150DID-2). O inibidor de protease e fosfatase HALT 100X pode substituir o estojo de inibidores de fosfatase e protease do estojo com base em facilidade de uso e desempenho. Utilizar todos os outros rea-gentes do estojo. Preparar o tampão de lise de MSD Tris adicionando inibidor de protease e fosfatase HALT 100X para uma concentração final 1X (referido como tampão de lise completo de MSD). Remover amostras de tumor do congelador -800C e deixar assentar em temperatura ambiente para iniciar descongelamento. Durante o descongela- mento da amostra, bloquear a placa de captura pSTAT3 Tyr705 (No. Cat. K150DID-2) com 150 μL de uma solução de bloqueio por um mínimo de 1 h em RT em um agitador de placa com agitação vigorosa (300-1000 rpm). Vedar as amostras com um lacre de placa adesivo antes da agitação. A solução de bloqueio deve conter a razão de Blo- queador A (No. cat. R93BA-4) 600 mg:20 mL de tampão de lavagem Tris MSD 1X (No. cat. R61TX-2). Uma vez as amostras tendo começado a descongelar, transferir para gelo molhado para continuar o descongelamento. Após o descongelamento estar completo, misturar cuidadosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta de multicanal. Normalizar as amostras em tampão de lise completo MSD gelado para uma concentração de proteína de 0,4 μg/μL X 100 μL. Manter todas as amostras de tumor normalizadas em gelo em uma placa de polipropileno de 96 cavidades até que elas sejam adicionadas à placa de captura de pSTAT3. Após a placa de captura de pSTAT3 ser bloqueada, lavar 4X com 250-300 μL de tampão de lavagem MSD Tris 1X usando um lavador de placa Thermo Labsystems Multidrop 384. Após a lavagem final, bater levemente para remover qualquer tampão de lavagem restante. Adicionar um volume total de 25 μL (10 μg) de lisato de tumor normalizado por cavidade e incubar mais 2-3 horas em temperatura ambiente em um agitador de placa com agitação vigorosa (300-1000 rpm). Durante esta incubação, diluir o anticorpo de detecção Sulfo-TAG anti-Fosfo-STAT 3 provido no estojo no tampão de diluição de anticorpo (1 mL de solução de bloqueio combinado com 2 mL de tampão de lavagem MSD Tris 1X) através da adição de 60 μL de anticorpo de detecção Sulfo-TAG anti-Fosfo-STAT 3 a 2,94 mL de tampão de diluição de anticorpo. Manter esta solução de anticorpo em gelo até necessário. Seguindo incubações de lisato de tumor, lavar a placa 4x com 250-300 μL de tampão de lavagem MSD Tris 1X. Após a última lavagem, bater levemente para remover qualquer tampão de lavagem restante e adicionar 25 μL/cavidade de anticorpo de detecção Sulfo-TAG anti-Fosfo-STAT 3. Incubar a placa mais 1 hora em RT em um agitador de placa com agitação vigorosa (300-1000 rpm). Durante esta incubação, diluir o Tampão de Leitura T com MSD 4X com tensoativo (No. cat. R92TC-3) para 1X com água deionizada e manter em RT. Após a incubação de anticorpo de detecção estar completa, lavar a placa 4X com 250-300 μL de tampão de lavagem Tris MSD 1X. Após a lavagem final, bater levemente para remover qualquer tampão de lavagem restante e adicionar um volume total de 150 μL/cavidade de Tampão de Leitura T MSD 1X com ten- soativo. Ler a placa no Meso Quick Plex SQ 120. Analisar os dados como indicado abaixo.

[0093] Cálculo de Inibição de pSTAT3 Percentual:

[0094] Copiar e colar dados brutos de placa do Meso Quick Plex SQ 120 diretamente em uma folha de cálculo Microsoft Excel versão 2010. Organizar os dados no formato apropriado (Resposta de Dose ou Curso de Tempo). Copiar e colar diretamente na versão JMP 11 para cálculos de inibição percentual de pSTAT3 (vide fórmula abaixo).[1 - (Sinal de Amostra de Tratamento/Sinal Médio de Controle de Veí-culo)]* 100

Determinar um Oneway Anova com média de grupo de tratamento comparado com média de controle veículo usando Dunnett. Cálculos de TED:

[0095] Os valores de TED50 e TEC50 são determinados a partir de um estudo de dose resposta. A TED50 é a dose necessária para atingir 50% de inibição de pSTAT3 e TEC50 é a concentração no plasma requerida para atingir 50% de inibição de pSTAT3, respectivamente, em duas horas.

[0096] Um composto dentro do escopo da invenção é testado neste ensaio substancialmente como descrito acima. O composto do

Exemplo 1 mostra uma TED50 de 9 mg/kg e uma TEC50 de 3,9 μM (n=1). Esses resultados mostram que o composto do Exemplo 1 demonstra atração no alvo em modelo de IVTI H1975 de rato. Estudo de eficácia em modelo de tumor de xenoenxerto HCC827

[0097] O propósito deste ensaio é medir a habilidade de compostos em inibir crescimento de tumor no modelo de camundongo de xenoenxerto HCC827. Cultivar células HCC827 (ATCC No. CRL-2868, No. Lote 59392891) de acordo com especificações ATCC no menor número de passagem possível disponível. Culturas as células e manter em RPMI-1640 suplementado com FBS 10% e incubar a 37OC em CO2 5%. Coletar as células de frascos usando TriPLE, enxaguar duas vezes em DPBS, ressuspender em HBSS e misturar com matriz de membrana de base BD Bioscience (MATRIGEL®) para suspensão celular atingir uma razão de célula/matriz 1:1 fornecendo um volume de inoculação de 0,2 mL de suspensão de célula/matriz contendo células 5e6. Manter as suspensões de célula em gelo durante o procedimento de inoculação e começar implantes dentro de uma hora após coleta da cultura de célula. Administrar os implantes subcutaneamente no flanco traseiro direito de camundongos SCID CB17 fêmeas obtidos da Harlan (18-20 g). Alimentar os camundongos com Proteína Harlan Teklad Ex- trudada 2920X ad libitum e prover água com o sistema de rega de estante. Permitir que as células de tumor implantadas cresçam como um tumor sólido e medir duas vezes por semana junto com peso do corpo começando no sétimo dia após o implante. Determinar os volumes do tumor usando o cálculo: 536*L*WA2. Após o volume do tumor atingir aproximadamente 150-200 mm3, aleatorizar os animais e pôr em um grupo contendo 5-8 animais cada um. Formular os compostos em veículo HEC 1% contendo Tween 80 0,25% e antiespumante 0,05% com equivalente molar 1.1 de ácido metanossulfônico para formar um sal in situ (1,1 mL de ácido metanossulfônico 1N por (peso molecular de in- serto) mg de composto). Armazenar o composto de teste em temperatura ambiente. Formular os compostos uma vez por semana e armazenar em temperatura ambiente. Não adicionar ácido ao grupo controle de veículo. Calcular dose com base no peso corporal médio do grupo mais recente. Administrar compostos através de gavagem oral por 28 dias ou BI ou QD dependendo da dosagem.

[0098] Um composto dentro do escopo da invenção é testado neste ensaio substancialmente como acima descrito. O composto do Exemplo 1 mostra 31% de inibição de crescimento de tumor a 30 mg/kg BID, 22% de regressão de tumor a 60 mg/kg BID e 22% de regressão de tumor a 120 mg/kg QD. Esses resultados mostram que o composto do Exemplo 1 demonstra regressão de tumor no modelo de tumor de xenoenxerto HCC827.

Claims (10)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula I:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do pelo fato de que -

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é

5. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

6. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medi-camento para o tratamento de câncer, sendo que o dito câncer é sele-cionado do grupo consistindo em câncer de pulmão, incluindo câncer de célula não pequena e adenocarcinoma de pulmão, adenocarcinoma, carcinoma hepatocelular, incluindo carcinoma hepatocelular asiático, câncer colorretal, câncer de mama e leucemia, incluindo leucemia linfocítica aguda.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão de célula não pequena.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer é adenocarcinoma de pulmão.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer é carcinoma hepatocelular asiático.