CN108026076B

CN108026076B - 4-(3-吡唑基氨基)-苯并咪唑化合物和其作为jak1抑制剂的用途

Info

Publication number: CN108026076B
Application number: CN201680045255.7A
Authority: CN
Inventors: J.R.克莱顿
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2036-07-28
Also published as: BR112017028240A2; EA201792676A1; TW201718555A; US20170037034A1; AR105400A1; JP6470869B2; AU2016302748B2; JP2018524384A; MA44383B1; AU2016302748A1; DK3331873T3; US9556153B1; SI3331873T1; KR20180022966A; KR102032792B1; RS58974B1; CA2990471A1; ME03451B; PT3331873T; ES2743499T3

Abstract

本发明涉及抑制Janus激酶1(JAK1)的某些式I的苯并咪唑化合物或其药学上可接受的盐、包含该化合物的药物组合物和使用该化合物治疗某些类型癌症的方法

Description

4-(3-吡唑基氨基)-苯并咪唑化合物和其作为JAK1抑制剂的用途

本发明涉及抑制Janus激酶1(JAK1)的某些苯并咪唑化合物或其药学上可接受的盐、包含该化合物的药物组合物和使用该化合物治疗某些类型癌症的方法。

JAK激酶为调节各种效应物的酪氨酸磷酸化和起始下游信号通路的活化的酪氨酸激酶家族。JAK1为介导信号传导与转录激活因子3, STAT3的活化的此家族成员之一。持久的STAT3活化为致癌的且促进癌细胞存活和增殖。STAT3活化中的畸变也示出会妨碍肿瘤微环境中的肿瘤免疫监视。因此，抑制JAK1可阻断STAT3活化，造成肿瘤生长抑制和肿瘤免疫监视。另外，已在T系急性淋巴母细胞性白血病和亚洲肝细胞癌中辨识出活化JAK1突变且已证实其为致癌的。这些结果表明JAK1为可用的肿瘤学目标。

已知JAK2形成介导EPO和TPO受体信号至STAT5通路的同源二聚体，其调节红血球及血小板的产生。抑制JAK2可造成贫血及血小板减少。然而，JAK1并不呈现此类活性，且由此表明选择性地抑制JAK1的化合物可具有比选择性地抑制JAK2或JAK1/2双抑制剂的化合物更好的血液毒性和/或免疫原性特征。

JAK激酶抑制剂化合物在文献中已知。例如，US 2015/0203455公开了为JAK抑制剂的某些苯并咪唑化合物。

仍需要提供用于治疗癌症的替代性的JAK1抑制剂。此外，仍需要提供减轻或避免JAK2抑制的选择性的JAK1抑制剂。因此，本发明提供可用于治疗癌症的某些JAK1的抑制剂。另外，本发明提供可减轻JAK2抑制的某些选择性的JAK1抑制剂。

本发明提供式I化合物：

式I,

或其药学上可接受的盐。

优选地，本发明提供化合物，其选自(2S)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇：

,

或其药学上可接受的盐，和

(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇：

,

或其药学上可接受的盐。

优选地，本发明提供化合物，其为(2S)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇：

,

或其药学上可接受的盐。更优选地，本发明提供化合物，其为(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇：

,

或其药学上可接受的盐。

作为具体实施方案，本发明提供化合物，其为(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇。

作为具体实施方案，本发明还提供化合物，其为(2S)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇。

本发明提供药物组合物，其包含(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明提供药物组合物，其包含(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明提供用于治疗癌症的方法，其包括向需要其的患者给予有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。本发明提供用于治疗癌症的方法，其包括向需要其的患者给予有效量的(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇或其药学上可接受的盐。本发明提供用于治疗癌症的方法，其包括向需要其的患者给予有效量的(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇。

本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗。本发明提供 (2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇或其药学上可接受的盐，其用于治疗。本发明提供(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇或其药学上可接受的盐，其用于治疗癌症。

本发明提供式I化合物，其用于治疗。本发明还提供(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇，其用于治疗。本发明提供(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇，其用于治疗癌症。

本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。本发明提供(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。本发明还提供(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。

本发明提供结晶形式的(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇的游离碱。本发明还提供结晶形式的(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇的游离碱，特征在于具有以2θ± 0.2计在19.5°和选自11.9°、15.4°和17.6°的一个或多个峰处的特征峰的X射线粉末衍射图。

本发明提供结晶形式的(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇的二甲磺酸盐。本发明还提供结晶形式的(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇的二甲磺酸盐，特征在于具有以2θ ± 0.2计在21.7°和选自21.2°、18.0°和15.7°的一个或多个峰处的特征峰的X射线粉末衍射图。

此外，本发明提供本文中所述的方法和用途的优选实施方案，其中癌症选自肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌和肺腺癌、腺癌、肝细胞癌包括亚洲肝细胞癌、结肠直肠癌、乳癌、淋巴瘤和白血病包括急性淋巴细胞性白血病和T系急性淋巴母细胞性白血病。优选的癌症为肺癌包括非小细胞肺癌和肺腺癌、腺癌、肝细胞癌包括亚洲肝细胞癌、结肠直肠癌、乳癌和白血病包括急性淋巴细胞性白血病。更优选的癌症为非小细胞肺癌、肺腺癌、乳癌和亚洲肝细胞癌。

如上文所使用地，和在整篇发明说明书中，以下术语，除非另外指明，否则应该理解为具有以下含义：

“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”为用于递送生物活性剂至哺乳动物例如人类的领域中通常接受的介质。

“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机的盐。

“有效量”是指由研究者、兽医、医师或其他临床医生寻求的对组织、系统、动物、哺乳动物或人类引起生物或药物反应或期望的治疗效果的本发明的化合物或其药学上可接受的盐或本发明的包含化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的量。

术语“治疗”是指包括缓解或逆转病症的进展。该术语还包括缓解、改善、减弱、消除或减轻病症或病况的一个或多个症状，即使实际上没有消除所述病症或病况并且即使所述病症或病况的进展本身没有缓解或逆转。

本发明化合物能够例如与一定量的无机和有机酸反应以形成药学上可接受的盐。此类药学上可接受的盐和制备它们的常规方法是本领域熟知的。参见例如P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., “Pharmaceutical Salts, “ Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, 1977年1月。

本发明化合物优选使用药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂配制成药物组合物并通过各种途径给药。优选地，此类组合物口服给药。此类药物组合物和制备它们的方法为本领域中熟知的。参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A.Gennaro, et al., 编, 第21版, Mack Publishing Co., 2005)。

本发明的化合物实际给药量将在包括待处理病况、所选给药途径、所给予的本发明的实际化合物、年龄、体重及个别病患的响应及病患的症状强度的相关情况下由医师确定。每天的剂量通常在每天约50 mg至1000 mg、优选每天80 mg至600 mg、最优选每天300mg的范围内。在一些情况下，低于前述范围下限的剂量水平可以超过足量，而在其他情况下仍可采用更大剂量。可通过本领域技术人员来确定剂量水平。

可通过本领域已知的多种程序以及如下文中于制备例和实施例中所述的那些来制备本发明化合物或其药学上可接受的盐。可以不同方式将所描述的各途径的特定合成步骤组合以制备本发明的化合物或其药学上可接受的盐。

所述试剂及起始物质通常为本领域普通技术人员轻易获得的。其他可通过本领域普通技术人员已知的有机及杂环化学技术的标准技术及描述于以下实施例中的程序（包括任何新颖程序）制备。以下制备例和实施例进一步示例本发明。除非相反地指出，否则使用IUPACNAME ACDLABS来命名及编号本文中所示例的化合物。

可通过例如选择性结晶技术或手性层析法的方法在化合物合成中任何方便点由本领域普通技术人员将个别异构体、对映异构体或非对映异构体分离或拆分（参见例如Enantiomers, Racemates, and Resolutions (J. Jacques, et al., John Wiley andSons, Inc., 1981)）。

技术人员会理解，本发明化合物含有至少一个手性中心。本发明涵盖所有个别对映异构体或非对映异构体，以及所述化合物的对映异构体及非对映异构体的混合物，包括外消旋体。本发明化合物优选以单一对映异构体或非对映异构体存在。可以手性试剂开始或通过立体选择性或立体特异性合成技术制备单一对映异构体或非对映异构体。或者，可通过标准手性层析或结晶技术从混合物分离单一对映异构体或非对映异构体。

可根据本领域中所熟知及了解的合成方法来制备本发明化合物。这些反应步骤的合适反应条件在本领域中熟知，且溶剂及辅助试剂的适合替代在本技术领域内。同样地，本领域技术人员会理解，可通过所需或所要的各种熟知技术分离和/或纯化合成中间体，且通常各种中间体将可少许或不纯化直接使用在后续合成步骤中。此外，技术人员理解，在一些情况下所引入部分的顺序并不重要。如熟练的化学家所了解，产生本发明化合物所需步骤的特定顺序取决于待合成的特定化合物、起始化合物和被取代部分的相对可靠性。所有取代基（除非另有指示）都如先前定义且所有试剂均为本领域中所熟知及了解。

本文中使用的以下术语具有所指示的含义：“ATP”是指5'-三磷酸腺苷；“BSA”是指牛血清白蛋白；“DMSO”是指二甲亚砜；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“EGTA”是指乙二醇四乙酸；“FBS”是指胎牛血清；“GFP”是指绿色荧光蛋白；“HEPES”是指4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸；“HWB”是指人体全血；“IC₅₀”是指降低给定响应（配体结合或酶反应）50%的化合物浓度；“IC₅₀相对”是指提供化合物最大响应一半的相对浓度；“IVTI”是指体内靶抑制；“JAK” 是指Janus激酶；“MS”是指质谱；“NMR”是指核磁共振；“NSCLC”是指非小细胞肺癌；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“RNase”是指核糖核酸酶；“RT”是指室温；“SCLC”是指小细胞肺癌；“STAT”是指信号传导与转录激活因子；“TED”是指阈值有效剂量； “TR-FRET”是指时间分辨荧光共振能量转移。

制备例1

(2R)-2-(三氟甲基)氧杂环丙烷

将乙酸(0.89 mL, 0.052 eq)添加至(1S,2S)-(+)-1,2-环己烷二氨基-N,N'-双(3,5-二叔丁基水杨叉基)钴(II) (0.90 g, 0.0050 eq)在甲苯(16.65 mL)中的溶液。在室温下搅拌30分钟。在真空下除去溶剂。添加甲苯(20 mL)并在真空下浓缩。冷却至0℃并添加2-(三氟甲基)氧杂环丙烷 (37.00 g, 330 mmol; 80.0% ee, (2R)为主对映异构体)。搅拌5分钟并滴加水(0.80 mL, 0.15 eq)。使其缓慢温热至室温并搅拌过夜。在室温下减压蒸馏，将浅黄色油形式的标题化合物收集在冷却的烧瓶中(28.10 g, 76%; 99.8% ee)。¹HNMR (CDCl3) δ 2.92-2.94 (m, 1H), 2.98-3.01 (m, 1H), 3.41-3.46 (m, 1H)。

合并标题化合物(0.13 g, 1.16 mmol)和甲醇(1.3 mL)。冷却至0^°C并添加三乙胺(0.17 mL, 1.10 eq)和苯硫酚(0.12 mL, 1.05 eq)。搅拌30分钟。小份的GCMS示出形成1,1,1-三氟-3-苯基硫烷基-丙-2-醇(获自标题化合物的开环); m/z = 222。手性LC-MS示出99.8% ee, (2S)-1,1,1-三氟-3-苯基硫烷基-丙-2-醇为主对映异构体。

制备例2

1-溴-3,5-二氟-2-硝基苯

在0^°C下将硝酸(发烟, 20 mL)滴加至1-溴-3,5-二氟苯 (35.00 mL, 304 mmol)在硫酸(50 mL)中的溶液。使其缓慢温热至室温并搅拌过夜。将反应混合物倾倒至冰和水的混合物(600 mL)中。使其缓慢温热至室温。添加乙酸乙酯(200 mL)和己烷(100 mL)。搅拌直到全部固体溶解。分离各层。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机物，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩以提供黄色油形式的标题化合物(57.37 g, 79%)。GCMS m/z = 237,239(Br)。

制备例3

3-溴-5-氟-N-甲基-2-硝基苯胺

将2 M单甲胺/四氢呋喃(92 mL, 2.00 eq)添加至1-溴-3,5-二氟-2-硝基苯(21.90 g, 92 mmol)在1,4-二氧六环(92 mL)中的溶液。在室温下搅拌45分钟。添加水并用乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机物，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过正相层析法纯化，用20-40%二氯甲烷/己烷梯度洗脱，以提供橙色固体形式的标题化合物(16.95 g, 74%)。MS (ES) m/z = (⁷⁹Br/⁸¹Br) 249/251 (M+H)。

制备例4

{顺式-4-[3-溴-5-(甲基氨基)-4-硝基苯氧基]环己基}氨基甲酸叔丁酯

合并3-溴-5-氟-N-甲基-2-硝基苯胺 (75.04 g, 301 mmol)、(顺式-4-羟基环己基)氨基甲酸叔丁酯 (89.52 g, 1.38 eq)和四(正丁基)硫酸氢铵(15.58 g, 0.15 eq)/二氯甲烷(975 mL)和5 M氢氧化钠水溶液(241 mL)。在37^°C下在氮气下快速搅拌5天。冷却至室温。用二氯甲烷(200 mL)和水(400 mL)稀释。分离各层。用二氯甲烷(3 x 100 mL)萃取水溶液。用饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机物，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过正相层析法纯化，用0-40%乙酸乙酯/己烷梯度洗脱，以提供橙色固体形式的标题化合物(68.57 g, 51%)。MS (ES) m/z = (⁷⁹Br/⁸¹Br) 442/444 (M-H)。

制备例5

{顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基甲酸叔丁酯

在Parr反应器中将{顺式-4-[3-溴-5-(甲基氨基)-4-硝基苯氧基]环己基}氨基甲酸叔丁酯 (76.92 g, 173 mmol)和铂5%/碳(硫化的, 3.85 g)合并在四氢呋喃(923 mL)中。在414 kPa氢气下在室温下搅拌三天。通过硅藻土过滤。用四氢呋喃洗涤。添加原甲酸三甲酯(165 mL, 8.70 eq)至合并的四氢呋喃滤液。在63^°C下搅拌22小时。在真空下浓缩大部分反应混合物。用水(400 mL)和乙酸乙酯(400 mL)稀释。用碳酸钠水溶液碱化以调节pH至9。分离各层。用乙酸乙酯(2 x 200 mL)萃取水溶液。经无水硫酸钠干燥合并的有机物，过滤并在真空下浓缩。用甲基叔丁基醚(400 mL)稀释并超声处理30分钟。过滤，用甲基叔丁基醚洗涤并在真空下干燥以提供浅棕色固体形式的标题化合物(52.02 g, 71%)。MS (ES) m/z= (⁷⁹Br/⁸¹Br) 424/426 (M+H)。

制备例6

顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己胺

在0^°C下通过加料漏斗将三氟乙酸(666 mL)缓慢添加至{顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基甲酸叔丁酯(222 g, 497 mmol)在二氯甲烷(1110mL)中的溶液。使其缓慢温热至室温并搅拌过夜。在真空下浓缩反应混合物。添加水(250mL)并用50%氢氧化钠水溶液碱化以调节pH至10。添加水(250 mL)。用20%甲醇/二氯甲烷(1500 mL，然后500 mL，然后250 mL)萃取。用2 M氢氧化钠水溶液洗涤合并的有机物，经无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩以提供棕色固体形式的标题化合物(155 g, 91%)。MS (ES) m/z= (⁷⁹Br/⁸¹Br) 324/326 (M+H)。

制备例7

(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇

将(2R)-2-(三氟甲基)氧杂环丙烷(73.29 g, 1.50 eq)添加至顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己胺(150.4 g, 436 mmol)在甲醇(1053 mL)中的溶液。在室温下搅拌过夜。在真空下浓缩反应混合物。通过正相层析法纯化，用0-10%乙醇/二氯甲烷梯度洗脱，以提供灰白色固体形式的标题化合物(98.10 g, 52%)。MS (ES) m/z = (⁷⁹Br/⁸¹Br) 436/438 (M+H)。

制备例8

3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇

将2-(三氟甲基)氧杂环丙烷 (2.13 mL, 1.02 eq; 80.0% ee, (2R)为主对映异构体)添加至 顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己胺(7.90 g, 24.37mmol)在异丙醇(130 mL)中的溶液。在70^°C下加热过夜。在真空下浓缩反应混合物。通过正相层析法纯化，用100%乙酸乙酯至2.5%至5%至7.5%至10%甲醇/乙酸乙酯的阶梯式梯度洗脱，以提供标题化合物(7.86 g, 74%)。MS (ES) m/z = (⁷⁹Br/⁸¹Br) 436/438 (M+H)。

制备例9

(5S)-3-{顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}-5-(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-2-酮

将3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇 (3.34 g, 7.66 mmol; 80.0% ee, (2R)为主对映异构体)、1,1’-羰基二咪唑(2.48 g, 2.00 eq)和4-二甲基氨基吡啶(0.094 g, 0.10 eq)合并在二氯甲烷(38.3 mL)中。在室温下在氮气下搅拌过夜。在真空下浓缩反应混合物。通过正相层析法纯化，用0-5%甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，以提供3-{顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}-5-(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-2-酮(3.28 g; 80.0% ee, (5R)为主对映异构体)。

采用以下的手性层析条件分离上文所得物以提供标题化合物(0.32 g, 9%)。MS(ES) m/z = (⁷⁹Br/⁸¹Br) 462/464 (M+H): 对映异构体1, >99% ee, 75%/25% CO₂/MeOH, 5mL/min, 4.6 x 150 mm, Chiralpak AD-H。

制备例10

(2S)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇

将(5S)-3-{顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}-5-(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-2-酮(0.32 g, 0.69 mmol)和三甲基硅醇钾(0.36 g, 4.00 eq)合并在四氢呋喃(7 mL)中。在室温下在氮气下搅拌6天。用水稀释。过滤，用水洗涤，并在真空下干燥以提供白色固体形式的标题化合物(0.22 g, 73%)。MS (ES) m/z = (⁷⁹Br/⁸¹Br) 436/438 (M+H)。

实施例1

(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇

将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(0.20 g, 0.46 mmol)、1,5-二甲基吡唑-3-胺(0.056 g, 1.1 eq)、碳酸钾(0.158 g, 2.5 eq)、2-(二叔丁基膦)-2',4',6'-三异丙基-3,6-二甲氧基-1,1'-联苯(0.046 g, 0.20 eq)、三(二苄叉丙酮)二钯(0) (0.042 g, 0.10 eq)和乙酸(0.01 mL)合并在叔丁醇(5 mL)中。用卷拉盖(crimp cap)密封。在120^°C下在微波反应器中加热45分钟。在真空下浓缩反应混合物。通过正相层析法纯化，用100%乙酸乙酯至1%至2.5%至5%甲醇/乙酸乙酯的阶梯式梯度洗脱，以提供标题化合物(0.071 g, 33%)。MS (ES) m/z = 467 (M+H)。

替代实施例1

将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(50 g, 115 mmol)、1,5-二甲基吡唑-3-胺(18.25 g, 1.43 eq)和碳酸钾(50 g, 3.16 eq)合并在2-甲基丁-2-醇(400 mL)中。搅拌并用鼓泡氮气管脱气15分钟。添加2-(二环己基膦)3,6-二甲氧基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′联苯(2.20 g, 0.034 eq)和三(二苄叉丙酮)二钯(0) (1.60 g, 0.015 eq)。搅拌并用鼓泡氮气管脱气5分钟。添加乙酸(3mL)。在回流下在氮气下加热20小时。添加2-(二环己基膦)3,6-二甲氧基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯(1.10 g, 0.017 eq)和三(二苄叉丙酮)二钯(0) (0.80 g, 0.0075 eq)。在回流下在氮气下加热3小时。在真空下浓缩反应混合物。用水(500 mL)稀释。用35%盐酸水溶液酸化以调节pH至1。添加乙酸乙酯(100 mL)并搅拌5分钟。用活性炭(5 g)处理搅拌混合物并通过硅藻土过滤。分离各层并丢弃有机物。采用30% w/w氢氧化铵水溶液碱化水层以调节pH至10。过滤以获得固体。通过正相层析法纯化，用二氯甲烷中的10% 2 M氨/甲醇洗脱，以提供标题化合物(52 g, 95%)。MS (ES) m/z = 467 (M+H)。

第二替代实施例1

(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇，晶型I

A：将替代实施例1(1.60 g)的一部分正相层析产物溶解在9:1丙酮:水(45 mL)中。在室温下搅拌15分钟并添加SiliaBond® DMT (0.42 g)。在5小时后在室温下过滤。浓缩滤液以除去全部丙酮，然后用水(10 mL)稀释。过滤并在真空下干燥以提供结晶物质(1.37g)。MS (ES) m/z = 467 (M+H)。

B：将替代实施例1(47.0 g)的正相层析产物在异丙醇(1.15 L)中制浆。加热该混合物以回流从而获得溶液。添加玻璃碳(6 g)。在回流1小时之后，通过硅藻土过滤。用异丙醇(50 mL)洗涤并用上文直接提供的子部分A中的结晶物质(0.20 g, 逐份)播种滤液。搅拌并经2小时使其冷却至室温。过滤并在真空下干燥以提供结晶物质(37.8 g)。MS (ES) m/z= 467 (M+H)。

实施例2

(2S)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇

(2S)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇 (0.077 g, 0.18 mmol)、1,5-二甲基吡唑-3-胺(0.030 g, 1.45 eq)、碳酸钾(0.060 g, 2.46 eq)、2-(二叔丁基膦)-2',4',6'-三异丙基-3,6-二甲氧基-1,1'-联苯(0.022 g, 0.25 eq)、三(二苄叉基丙酮)二钯(0) (0.0080 g, 0.050 eq)和乙酸(0.01mL)合并在叔丁醇(2.5 mL)中。用卷拉盖密封。在95^°C下加热过夜。用乙酸乙酯稀释并通过硅藻土过滤。在真空下浓缩滤液。通过正向层析法纯化，用5-100% B梯度(A：二氯甲烷；B：15% 0.75 M氨化的甲醇/二氯甲烷)洗脱。通过反相层析法进一步纯化，用5-100% B梯度(A：10 nM碳酸氢铵水溶液，含10%甲醇；B：乙腈)洗脱。从乙醇浓缩干净的级分，然后从二氯甲烷再次浓缩，以提供标题化合物(0.054 g, 65%)。MS (ES) m/z = 467 (M+H)。

实施例3

(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇；二甲磺酸

合并(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇 (1.00 g, 2.15 mmol)和丙酮(35mL)。在51^°C下加热并滴加甲磺酸(0.30 mL, 2.10 eq)在丙酮(5 mL)中的溶液。在51℃下搅拌1小时，然后冷却至室温。过滤所得固体并在真空炉中在70^°C下干燥过夜以提供标题化合物(1.25 g, 88%)。

X-射线粉末衍射

在配备有CuKa源(λ = 1.54060 Å)及Vantec检测器，在35 kV和50 mA操作的Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪上获得结晶固体的XRD图。样本以2θ在4至40^°之间扫描，2θ的步长为0.009^°且扫描速率为0.5秒/步，且发散度为0.6 mm，固定防散射性为5.28，且检测器狭缝为9.5 mm。将干粉装填于石英样本固持器上，且使用载玻片获得光滑表面。在环境温度及相对湿度下收集晶型衍射图。结晶学技术中已熟知，对于任何特定晶型，衍射峰的相对强度可能由于例如晶体形态及习性的因素所产生的优选定向而变化。如果存在优选的定向效应，峰强度改变，但多晶型物的特征峰位置不变。参见例如The UnitedStates Pharmacopeia #23, National Formulary #18, 第1843-1844页, 1995。此外，在结晶学技术中也熟知，对于任何特定晶型，角峰位置可能略微变化。例如，峰位置可能由于分析样本时的温度或湿度变化、样本移位或内标存在或不存在而位移。在本发明的情况下，2θ的± 0.2^°的峰位置变化会考虑这些潜在变化而不妨碍明确鉴定指定晶型。晶型可基于区别峰（以°2θ为单位）、通常更显著峰的任何独特组合而鉴定。基于在8.853°和26.774° 2θ的NIST 675标准峰，调整在环境温度及相对湿度下所收集的晶型衍射图。

第二替代实施例1的化合物的制备样本通过使用CuKa辐射的XRD图来表征，具有如下表1所述的衍射峰(2θ值)且尤其具有在19.5^°的峰与一个或多个选自11.9^°、15.4^°和17.6^°的峰组合；具有0.2^°的衍射角公差。

表1：第二替代实施例1的X射线粉末衍射峰

峰	角(°2-θ) +/- 0.2°	相对强度(最强峰%)
			1	6.4	17.0%
2	11.9	46.6%
			3	14.7	11.7%
4	15.4	41.9%
			5	16.2	27.5%
6	16.9	24.9%
			7	17.6	40.1%
8	19.5	100.0%
			9	20.8	32.1%
10	21.5	19.6%

通过使用具有下表2所述的衍射峰(2θ值)及尤其具有与选自21.2^°、18.0^°和15.7^°的峰的一个或多个组合的在21.7^°下的峰的CuKa辐射的XRD图来表征实施例3的化合物的制备样本；具有0.2^°的衍射角公差。

表2：实施例3的X射线粉末衍射峰

峰	角(°2-θ) +/- 0.2<sup>°</sup>	相对强度(最强峰%)
			1	5.6	26.2%
2	10.0	25.7%
			3	13.1	28.7%
4	15.7	70.0%
			5	18.0	90.5%
6	19.6	64.5%
			7	20.6	41.8%
8	21.2	99.3%
			9	21.7	100.0%
10	22.3	59.9%

JAK1、JAK2和JAK3体外酶分析

JAK LanthaScreen™激酶分析(Invitrogen)用于测定测试化合物抑制JAK1、JAK2及JAK3激酶活性的能力。这些为使用长寿命铽标记抗体作为供体物质及GFP-STAT1作为受体物质的TR-FRET分析形式。在GFP-STAT1的磷酸化增加导致TR-FRET率上升的情况下使用TR-FRET率监视JAK激酶活性。使用浅黑色384孔Proxiplate中的12.5 μl反应容积进行激酶反应。添加试剂以获得最终反应条件：50 ml HEPES pH、1.76 mM Triton X-100、ATP (用于JAK1和JAK3的20.0 µM或用于JAK2的5 µM)酶测定、10.0 mM MgCl₂、1 mM EGTA及0.01%Brij-35、0.05 mM GFP-STAT1、用于JAK1的14 nM JAK1酶、用于JAK2的1.0 nM或用于JAK3的2.5 nM酶分析及4% DMSO及测试化合物的连续稀释液(从20,000至1 nM以1:3稀释)。在添加ATP/GFP-STAT1之后，以每分钟1000转(RPM)将板离心1分钟。使分析板于RT下孵育60分钟并然后添加12.5 µl停止缓冲液，该缓冲液含有：20 mM EDTA\2 nM 铽-抗-磷酸化信号传导及转录活化因子[磷酸化酪氨酸701氨基酸]抗体(Tb-抗-pSTAT1[pTyr701]、0.67 mM 三(羟甲基)氨基乙烷盐酸盐(Trizma®) pH 7.5、0.02 % NaN₃和0.01 %壬基苯基聚乙二醇(Nonidet ® P40)。在RT下孵育90 min并在具有340 nm波长激发滤光片及520 nm和495 nm波长的发射滤光片的EnVision板读取器中读取。从针对GFP-STAT1在520 nm处所测量的发射波长与对Tb-抗-pSTAT1[pTyr701]在495 nm处的发射相比而导出比率。使用从相对于板上对照物（活性酶与用托法替尼在2.0 mM处抑制的酶相比）的反应数据所计算的%抑制数据导出每一化合物的IC₅₀值。使用ACTIVITYBASE 4.0来拟合抑制百分比及十点化合物浓度数据至四参数逻辑斯谛方程式。

基本上如上所述在这个分析中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物示出4.0 ± 0.8 nM (n=6)的JAK1 IC₅₀、557 ± 337 nM (n=6)的JAK2 IC₅₀和1910 ± 786nM (n=6)的JAK3 IC₅₀。结果示出实施例1的化合物在体外抑制JAK1酶。这些结果也示出实施例1的化合物为JAK1酶的更加强力抑制剂且在体外选择性优于JAK2及JAK3。

BaF3突变的JAK-1 (S729C)克隆12增殖分析

这个分析的目的在于使用BaF3突变的JAK-1 (S729C) Clone 12增殖分析来测定JAK-1特异性抑制剂的抑制活性。

通过用表达人体mtJAK1 (S729C)-pQCXIN载体DNA的逆转录病毒转导Ba/F3细胞(鼠类原-B-细胞)来制造表达细胞系的mtJAK1 (S729C)。进行单细胞克隆以通过连续稀释选择表达最高水平的mtJAK1 (S729C)的Ba/F3细胞。培养Ba/F3突变的JAK1 (S729C)悬浮液细胞并保持在含有10% Hi-FBS (Hyclone cat# 10082-047)、1 µg/ml嘌呤霉素二盐酸盐(Sigma cat# 9620)、1.0 mg/mL G418硫酸盐(Corning ref# 30-234-CI)（后被称作R10+）的(Gibco RPMI 1640 cat# A10491-01)中。

在不选择的情况下在培养基中进行增殖分析且之后将被称作(R10-)。简言之，将经培养的细胞倾倒、离心并在10 mL的R10-中复水且使用Beckman Coulter Vi-Cell计数。在R10-中进一步将细胞稀释至2e4/mL并以每孔1x10³个细胞(50 µl)铺板在96孔白色不透光分析板 (Costar cat# 3610)中。在相对应的96孔聚丙烯板中，在100% DMSO中稀释测试化合物，随后在R10-中另外稀释以得到2X测试化合物范本。将经稀释的测试化合物添加至相对应的孔板以得到20 µM至0.001 µM的CRC。最小及最大对照物包括在每一板上。星形孢菌素（最终1 µM）用于最小对照物且含有与CRC等量的DMSO水平的R10-用作最大对照物。用水填充的Microcline蒸发盖(cat# LLS-0310)将板覆盖并在37^°C下，5% CO₂中孵育3天。在孵育3天之后，从孵育器取出板并使其冷却至环境温度。一旦冷却，板通过添加100 µL的CellTiter Glo (Promega cat# G7571)，在板混合机上混合2分钟并在室温下孵育额外10分钟而成长。接着使用在0.1秒下的发光的预设程式在Perkin Elmer Victor2上读取发光。使用内部STATS TMAG程式及GraphPad Prism版本4.03生成IC₅₀曲线。

基本上如上文所述在此分析中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物示出956 nM ± 217 nM (n=4)的IC₅₀。此结果表明实施例1的化合物对抗在Ba/F3细胞中表达的mtJAK1 (S729C)为活性的。

AlphaScreen SureFire Protocol p-STAT3-(p-Tyr705)-IL6-TF-1-JAK1基于细胞的分析

下述的JAK1基于细胞的分析用于测定测试化合物的JAK1细胞效能。

细胞制备：

在37℃下使具有0.5% 26400 (FBS)及1X Pen/Strep的DMEM培养基中的TF-1细胞饥饿。在具有透明底部的BD 96孔黑色板中每孔铺放100K细胞。将该板在RT下维持30分钟至60分钟，随后在37℃和5% CO₂下整夜孵育。使用Vi-Cell计数器计数细胞，其中使用在100个细胞/毫升下且以100 L/孔铺板在Beckman Dickinson Biocoat板中(Catalog # 354640)的细胞悬浮液。

测试化合物制备及处理：

制备化合物在DMSO中的1:3连续稀释液并进一步稀释在培养基中。测试化合物在20,000至1 nM的10个点浓度范围内。添加经稀释的化合物至对应的细胞板。在37℃下孵育该板20 min。添加在最终浓度30 ng/mL下的IL6溶液至对应的细胞板并继续在37℃下孵育30 min。移除培养基并向各孔添加50 μL 1x裂解缓冲液。

pSTAT3检测：

按顺序执行如下步骤：制备受体混合物（活性缓冲液/反应缓冲液/受体珠粒）；从96孔板转移4 μL裂解液至384孔Proxiplate；向一个或多个384 Proxiplate板添加5 μL受体混合物并用铝箔纸密封板；在板摇动器上摇晃1分钟至2分钟；随着轻柔摇晃在RT下培育板2小时；制备供体混合物（供体珠粒在稀释缓冲液中）；向分析板添加2 μL供体混合物；用铝箔纸密封板；在板摇动器上摇晃1分钟至2分钟；随着轻柔摇晃在RT下孵育2小时；用Envision读取板；拟定AlphaScreen Surefire 384。

基本上如上所述在此分析中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物示出87 nM ± 75 (n=10)的IC₅₀。此结果示出实施例1的化合物在基于细胞的分析中抑制JAK1酶。

磷酸化-STAT3 (Tyr705) ACUMEN Protocol –H1975-JAK1基于细胞的分析

H1975-JAK1细胞分析用于确定NSCLC细胞中的测试化合物的效能，其中STAT3通路通过自分泌IL-6环活化。

细胞制备：

按顺序进行如下步骤：在显微镜下检查细胞；用无菌真空驱动移液管将培养基抽离细胞；用大致5 mL PBS洗涤细胞；用无菌真空驱动移液管抽离PBS；向150 cm²烧瓶添加5mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA；轻柔摇晃烧瓶以用胰蛋白酶覆盖细胞并静置通风橱中3分钟或将烧瓶放置在孵育器内3分钟以使细胞从烧瓶松离；搅动烧瓶几次以确保细胞松散；向烧瓶添加10 mL的生长培养基；轻柔地在烧瓶的细胞生长侧上方分配悬浮液并上下吸移以研磨细胞；旋转(1300 rpm 5 min)，再悬浮于10 mL生长培养基中；菌株穿过细胞过滤器(BDFalcon 352350, 70µm细胞过滤器)；将细胞收集在无菌50 mL无菌锥形管中；利用Vi-Cell计数器计数细胞(0.5 mL细胞)。

第1天：在具有透明底部的BD 96孔黑色板中每孔铺放300000个细胞。使用Vi-Cell计数器计数细胞，使用300000个细胞/mL的细胞悬浮液且以100 μL/孔铺板于BeckmanDickinson Biocoat板(Catalog # 354640)。使板在RT下维持30分钟至60分钟，随后放入孵育器中。接在37℃及5% CO₂下整夜孵育。

化合物制备及处理：

用0.6% DMSO制备含有不具有FBS的1 mL培养基的深孔板，接着添加2 μL的化合物(10mM DMSO溶液)，制成20 μM储备液板。在稀释板中用0.6% DMSO于不具有FBS的培养基中进行化合物的1:3连续稀释。测试化合物在20 μM至1 nM的10个点浓度范围内。从具有细胞的分析板移除培养基。从稀释板转移100 μL的化合物至含有粘着100 μL培养基的细胞的分析板(Beckman Dickinson Biocoat板Catalog # 356440)，并使用TEMO程式：SAMPLETRANSFER CELL BASED ASSAY(从3797 slow dispense.gem)。接着在37℃下孵育细胞4小时。

pSTAT3检测：

在第一天，按顺序进行如下步骤：移除培养基；添加100 μL的3.7%多聚甲醛；在暗处孵育30分钟；用100 μL PBS洗涤；添加100 μL冷甲醇；在暗处孵育15分钟；用100 μL PBS洗涤两次；添加100 μL阻断溶液（PBS中的1% BSA）；在暗处孵育30分钟；添加50 μL初级抗体pSTAT3 1:500（在阻断溶液中：1% BSA；小鼠抗- 磷酸化-STAT3(Tyr705)）；用铝箔纸密封板并随着轻柔摇晃在4℃下整夜孵育。

在第二天，按顺序进行如下步骤：用100 μL的PBS洗涤两次；添加50 μL的二次抗体（1:1000；Ab2º山羊抗-小鼠IgG）；在暗处RT下孵育1小时；用100 μL的PBS洗涤两次；添加100μL的含有RNAse（PBS中的50 μg/mL）的碘化丙啶（自商购溶液的PBS中的1:1000）；用透明膜密封板并在读取前在RT下孵育2小时；在Acumen Explorer（基于阳性和阴性孔设定参数）上读取。镭射（扫描1）488nm。

数据处理：

通过Activity Base处理数据并使用4参数非线性逻辑斯蒂方程（四参数逻辑斯蒂浓度-响应曲线）分析：

Y = 底部值 + [(顶部值-底部值)/1+(x/IC50)斜率]

其中Y = %抑制，X = 浓度产生y%抑制度，底部值 = 由曲线获得的y的最小值，顶部值 = 由曲线获得的y的最大值和斜率 = IC50曲线的倾斜度。

%Inh = [(中值Max- x/ 中值Max – 中值Min)] ∙ 100。

基本上如上所述在此分析中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物示出297 nM (n=1)的IC₅₀。此结果示出实施例1的化合物在NSCLC细胞中抗JAK1为活性的，其中通过自分泌IL-6环活化STAT3路径。

AlphaScreen SureFire Protocol p-STAT5 (p-Tyr694/699)-EPO-JAK2基于细胞的分析

通过细胞分析测定JAK1相对于JAK2的测试化合物的成倍的选择性倍数，其中EPO用于活化JAK2-STAT5通路且pSTAT5用作示值读数。

细胞制备：

UT-7细胞在具有0.5% 1600 (FBS)和1X Pen/Strep的DMEM培养基中在37℃ (无GM-CSF) 饥饿整夜。在具有透明底部的BD 96孔黑色板中（在无FBS及GM-CSF的培养基中）每孔铺放50000个细胞。使板在RT下维持30分钟至60分钟，随后在37℃及5% CO₂下孵育过夜。使用Vi-Cell计数器计数细胞，使用500000个细胞/mL的细胞悬浮液且以100 μL/孔铺板于Beckman Dickinson Biocoat板Catalog # 354640中。

化合物稀释及处理：

测试化合物在20,000至1 nM范围内的10个点浓度范围内。以在DMSO中的1:3连续稀释液准备化合物并进一步稀释于培养基中。向对应的细胞板添加经稀释的化合物并在37℃下孵育20 min，接着向对应的细胞板添加20 μL EPO (295 ng/mL，最终浓度45 ng /mL)，继续在37℃下孵育30分钟。

裂解细胞：

（小心地）倒出培养基并添加50 μL 1x裂解缓冲液至各孔（其上为冻结裂解液）（裂解缓冲液：5X；以水稀释至1X的最终浓度）。

p-STAT5检测：

按顺序进行如下步骤：制备受体混合物（活性缓冲液/反应缓冲液/受体珠粒）；自96孔板将4 μL裂解液转移至384孔Proxiplate；用多滴组合向一个或多个384孔Proxiplate板添加5 μL受体混合物；用铝箔纸密封板；在板摇动器上摇晃1分钟至2分钟；随着轻柔摇晃在RT下孵育板2小时；制备供体混合物（供体珠粒在稀释缓冲液中）；用多滴组合向分析板添加2 μl供体混合物；用铝箔纸密封板；在板摇动器上摇晃1分钟至2分钟；随着轻柔摇晃在RT下孵育2小时；用Envision读板；拟定AlphaScreen Surefire 384。

基本上如上所述在此分析中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物呈现11.8 µM± 5.4 (n=5)的IC₅₀。此结果示出实施例1的化合物在细胞分析中JAK1选择性优于JAK2，其中EPO用于活化JAK2-STAT5通路。

人全血分析：在淋巴球及单核球中测定pSTAT3 (JAK1)和pSTAT5 (JAK2)

研究并证实人全血(HWB)分析以测定测试化合物的JAK1和JAK2选择性。

以10个点将测试化合物在DMSO 100%中稀释(1:3)，并在PBS + 0.1% BSA中稀释低一阶度。使用托法替尼作为各板中的参考化合物，以及作为最大信号（经刺激的孔）及最小信号（无刺激的孔）以标准化数据。从4个不同的健康供体获得HWB池。使用Tecan Evo 96w将血液铺板于96孔板中并用测试化合物在RT下孵育1小时。在此次孵育之后，用IL6 (206-IL,R&D System)和GM-CSF (PHC2015, Life Technologies)二者刺激HWB大于15分钟。使用Tecan Evo 96w (5xmix)添加活性染料(65-0865, eBiosicience) (1:1000)。

分析中的最终浓度如下：用于化合物的100 µM、用于托法替尼的50 µM、0.1µg/mLIL6、0.038 µg/mL GM-CSF及1% DMSO。通过使用Tecan Evo 96w (混合10x高速)添加900 μL裂解缓冲液来使用裂解/修复缓冲液(Lyse/fix buffer)(558049, Becton Dickinson)裂解且修复HWB。在37℃下于液浴中孵育HWB 10分钟。以500G离心HWB 8 min，并舍弃清液层。使用Tecan Exo 96w添加冷甲醇以渗透细胞。在冰中孵育血球30 min。之后，使用染色缓冲液(554656, Becton Dickinson)洗涤细胞2x、以3000 rpm旋转2分钟、舍弃清液层并添加如下抗体：抗人体CD4 PE, 1:100 (12-0048, eBioscience)、抗人体CD33 eFluor® 450、1:50 (48-0337, eBioscience)、磷酸化-STAT5 (Tyr694) (C71E5) Rabbit mAb、1:100(Alexa Fluor® 488 Conjugate)(3939, Cell Signalling)及磷酸化-STAT3 (Tyr705)(D3A7) XP™ Rabbit mAb 1:200, (Alexa Fluor® 647 Conjugate)(4324, CellSignalling)。于室温下在暗处孵育抗体1小时，接着洗涤细胞2x并在Cytometer Macsquant(Miltenyi Biotec)上读取。在CD4+ (淋巴球)和CD4Low CD33Hi (单核球)上闸控数据以分别测量自表达pSTAT3和pSTAT5的细胞的荧光。使用FlowJo v_10分析数据并标准化与最大与最低信号相比的荧光的中值以测定IC₅₀。使用Graph Pad prism 5表示剂量反应曲线。

基本上如上所述在此分析中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物示出用于JAK1的2.40 ± 0.64 µM (n=3)的IC₅₀及用于JAK2的13.0 ± 3.2 µM (n=3)的IC₅₀。这些结果表明实施例1的化合物示出在人全血分析中的JAK1优于JAK2近似5X多效能。

pSTAT3小鼠IVTI (JAK1)分析

此分析的目的在于测量测试化合物抑制H1975异种移植小鼠模型中STAT3的磷酸化(STAT3活化)的能力。根据可供使用的最低可能传代数目下的ATCC规范生长H1975细胞。在补充有10% FBS的RPMI-1640中培养及维持细胞，并在37 ^°C、5% CO₂下孵育。通过标准技术采集细胞并与BD Biosciences基底膜基质(MATRIGEL®)混合成细胞悬浮液以实现1:1细胞/基质比率，其产生含有5e6细胞的0.2 mL细胞/基质悬浮液的接种容积。在整个接种过程中于冰上保存细胞悬浮液并在细胞培养采集之后一小时内开始植入。于在从Harlan获得的雌性Athymic Nude小鼠的右后侧腹皮下给予所有植入。随意喂饲所有小鼠Harlan Teklad# 2920X并通过凝胶包装提供水。使所植入肿瘤细胞生长为实体瘤并在植入后5天至9天开始一周测量两次（连同体重）。使用计算：0.536*L*W^2测定肿瘤体积。在肿瘤体积达到大致200-250 mm³后，使用多任务分块随机化工具随机化动物并置放入含有6只至10只动物的媒介物组及每组含有6只动物的多处理组中。在含有0.25% Tween 80及0.05%的含1.1摩尔当量甲磺酸的防沫剂的1%HEC媒介物中配制测试化合物以形成原位盐。不向媒介物对照组添加酸。基于最新组平均体重计算剂量。针对剂量响应及时程研究二者通过口服管饲给予化合物。剂量响应研究为在肿瘤移除、处理及冻结前单剂量给药2小时。时程研究为在从剂量响应研究测定的TED₇₀处的单剂量给药。

肿瘤组织处理：

采集并切割肿瘤以得到大致150-250 mm³大小片段并立即滴入含有1 mL冰冷MSDTris Lysis缓冲液(Meso Scale Discovery cat# R60TX-2)和1X HALT (ThermoScientific产品# 1861281)的12X75 mm试管中。使用一次性Hard Tissue Omni Tip匀质器探头(Omni International cat# 3_750H)均匀化样本大约15秒并搁置在湿冰上额外15分钟至25分钟，随后转移至-60^°C冰箱整夜。从冰箱取出样本并使其置于RT下以开始融化。一旦样本开始融化，转移至湿冰并继续融化。在完成融化后，旋涡样本并转移至1.8 mL微量离心试管。在4 ^°C下以14,000Xg离心裂解液30分钟至60分钟。转移裂解液(200 μL)至96孔聚丙烯板(Costar cat#3879)。使用Pierce BCA Protein Assay试剂盒(cat# 23225)如下所指示测定蛋白质浓度。简言之，使用稀释于含有1X HALT的RIPA裂解缓冲液中的BSA标准品生成标准曲线以得到2,000 μg/mL至25 μg/mL的工作范围。所有裂解液以1:10稀释于含有1X HALT的RIPA裂解缓冲液中。吸取25 μL标准品及样本至96孔板(Falcon cat# 353072)中并添加200 μL工作试剂至各孔并在板摇动器上将板充分地混合30秒。覆盖板并在37 ^°C下培育30分钟。冷却板至RT并在Molecular Devices Spectra Max上的562 nm处或接近562nm处测量吸收率。使用SoftMax Pro 6.3软件程式测定用于每一样本的蛋白质浓度。在定量肿瘤样本后，在-80 ^°C下冻结96孔聚丙烯板中的裂解液并于稍后的日期分析。

pSTAT3测量：

进行pSTAT3 (Tyr705)分析如下。MSD pSTAT3分析试剂盒来自Meso ScaleDiscovery (Cat# K150DID-2)。100X HALT蛋白酶及磷酸酶抑制剂可基于易用性及效能经试剂盒磷酸酶及蛋白酶抑制剂替代。通过添加100X HALT蛋白酶及磷酸酶抑制剂至1X最终浓度（被称作MSD完全裂解缓冲液）来制备MSD Tris Lysis缓冲液。从-80 ℃冰箱取出肿瘤样本并使其置于RT下以开始融化。在样本融化期间，用150 μL阻断溶液（于室温下在板摇动器上剧烈摇晃(300-1000 rpm)最少1小时）阻断pSTAT3 Tyr705捕获板(cat# K150DID-2)。摇晃前用粘性板密封器将板密封。阻断溶液含有Blocker A (cat# R93BA-4) 600mgs: 20mL的1X MSD Tris洗涤缓冲液(cat# R61TX-2)的比率。一旦样本开始融化，将其转移至湿冰以继续融化。完成融化后，使用多沟道吸管通过上下吸移若干次小心地混合。在冰冷MSD完全裂解缓冲液中标准化样本至0.4 μg/μL X 100 μL的蛋白质浓度。在96孔聚丙烯板中的冰上维持所有经标准化的肿瘤样本直至将其添加至pSTAT3捕获板。在阻断pSTAT3捕获板后，使用Thermo Labsystems Multidrop 384板洗涤器用250-300 μl 1X MSD Tris洗涤缓冲液洗涤4X。在最终洗涤后，轻轻拍打板以移除任何残留洗涤缓冲液。添加经标准化的肿瘤裂解液每孔25 μL (10 μg)的总体积并在板摇动器上随着剧烈摇晃(300-1000 rpm)于室温下额外孵育2-3小时。在孵育期间，通过添加60 μL 的磺化-TAG抗磷酸化-STAT 3检测抗体至2.94 mL的抗体稀释缓冲液来稀释在抗体稀释缓冲液(1ml的阻断液与2 mL的1X MSD Tris洗涤缓冲液合并)中的试剂盒中所提供的磺化-TAG抗磷酸化-STAT 3检测抗体。在湿冰上保存此抗体溶液直至需要。孵育肿瘤裂解液后，用250-300 μL的1X MSD Tris洗涤缓冲液洗涤板4X。在最后洗涤后，拍打该板以移除任何残留洗涤缓冲液并添加25 μL/孔的磺化-TAG抗磷酸化-STAT 3检测抗体。在培育盘摇动器上随着剧烈摇晃(300-1000 rpm)于室温下孵育板额外1小时。在此孵育期间，用去离子水稀释具有表面活性剂(cat# R92TC-3)的4X MSDRead Buffer T至1X并于室温下保存。完成检测抗体孵育后，用250-300 μL 的1X MSD Tris洗涤缓冲液洗涤板4X。在最终洗涤后，轻轻拍打板以移除任何残留洗涤缓冲液并添加总体积150 μL/孔的具有表面活性剂的1X MSD Read Buffer T。在Meso Quick Plex SQ 120上读取板。如下所指示分析数据。

计算pSTAT3抑制百分比：

将从Meso Quick Plex SQ 120获得的原始板数据直接复制并粘贴至MicrosoftExcel版本2010工作表中。组织数据至合适的格式（剂量响应或时程），直接复制粘贴至JMP版本11中以供计算pSTAT3抑制百分比（参见如下公式）。

[1 – (处理样本信号/媒介物对照物的信号平均值)] * 100。

使用Dunnett’s通过将处理组平均值与媒介物对照物平均值对比来测定OnewayAnova。

TED计算：

从剂量反应研究测定TED₅₀和TEC₅₀值。分别地，TED₅₀为在2小时下实现50% pSTAT3抑制所必要的剂量，TEC₅₀为在2小时下实现50% pSTAT3抑制所需要的血浆浓度。

基本上如上所述在此分析中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物示出为35 mg/kg的TED₅₀及11.1 µM (n=1)的TEC₅₀。这些结果示出实施例1的化合物在口服给药后2小时在体内有效地抑制JAK1-STAT3信号（使用pSTAT3作为示值读数）。这些结果示出实施例1的化合物也表明与TEC₅₀的PK/PD相关的活性。

pSTAT3大鼠IVTI (JAK1)分析

此分析的目的在于测量测试化合物抑制H1975异种移植大鼠模型中的pSTAT3表达的能力。根据ATCC规范以最低可供使用的可能的传代数目生长H1975细胞。在补充有10%FBS的RPMI-1640中培养及维持细胞并在37 ℃、5% CO₂下孵育。通过标准技术采集细胞并与BD Biosciences基底膜基质(MATRIGEL®)混合以实现1:1细胞/基质比率，其产生含有2e6细胞的0.2 mL细胞/基质悬浮液的接种容积。在整个接种过程中于冰上保存细胞悬浮液并在细胞培养采集后一小时内开始植入。在从Taconic获得的雌性NIH Nude大鼠的右后侧腹皮下给予所有植入。随意喂饲所有大鼠Harlan Teklad Global Diets # 2920X并提供水瓶。使所植入的肿瘤细胞生长为实体瘤并一周测量两次（连同体重）。植入后5至9天开始测量体重及肿瘤体积。使用计算：0.536*L*W^2测定肿瘤体积。肿瘤体积达到大致350-400 mm³后，使用多任务分块随机化工具随机化动物并置放入含有6只动物的媒介物组且每组含有6只动物的多处理组中。在含有0.25% Tween 80和0.05%的具有1.1摩尔当量甲磺酸的防沫剂的1% HEC媒介物中配制化合物以形成原位盐（1.1 mL的1N甲磺酸/mg的化合物）。不向媒介物对照组添加酸。基于最新组平均体重来计算剂量。针对剂量响应及时程研究二者通过口服管饲给予所有化合物。剂量响应研究为肿瘤移除、处理和冻结前单剂量给药2小时。时程研究为在从剂量响应研究测定的TED₇₀处单剂量给药。在以下所述进行发生在多个时间点处的肿瘤移除、处理及冻结。

肿瘤组织处理

采集并切割肿瘤以得到大致200-250 mm³ 大小片段并立即滴入含有1 mL 冰冷MSD Tris Lysis缓冲液(Meso Scale Discovery cat# R60TX-2)和1X HALT (ThermoScientific产品# 1861281)的12X75 mm试管中。使用一次性Hard Tissue Omni Tip匀质器探头(Omni International cat# 3_750H)均匀化样本大约15秒并搁置在湿冰上额外15-25分钟，随后转移至-60 ℃冰箱过夜。自冰箱取出样本并使其置于RT下以开始融化。一旦样本开始融化，转移至湿冰以继续融化。在完成融化后，旋涡样本并转移至1.8 mL微量离心试管。在4 ℃下以14,000Xg离心裂解液30-60分钟。转移裂解液(200 μL)至96孔聚丙烯板(Costar cat#3879)，其对应于96孔样板设计。使用Pierce BCA Protein Assay试剂盒(cat# 23225)如下所指示测定蛋白质浓度。简言之，使用经稀释于含有1X HALT的RIPA裂解缓冲液中的BSA标准品生成标准曲线以得到2,000 μg/ml至25 μg/mL的工作范围。所有裂解液以1:10稀释于含有1X HALT的RIPA裂解缓冲液中。吸取25 μL标准品和样本至96孔板(Falcon cat# 353072)中并添加200 μL工作试剂至各孔并在板摇动器上将板充分地混合30秒。覆盖板并在37 ℃下孵育30分钟。冷却板至RT并在Molecular Devices Spectra Max上在562 nm处或接近562 nm处测量吸收率。使用SoftMax Pro 6.3软件程式测定用于每一样本的蛋白质浓度。在定量肿瘤样本后，在-80 ℃下在96孔聚丙烯板中冻结并于稍后的日期分析。

pSTAT3测量：

进行pSTAT3 (Tyr705)分析如下。MSD pSTAT3分析试剂盒来自Meso ScaleDiscovery (Cat# K150DID-2)。100X HALT蛋白酶及磷酸酶抑制剂可基于易用性及效能经试剂盒磷酸酶及蛋白酶抑制剂替代。使用来自该试剂盒的全部其他试剂。通过添加100XHALT蛋白酶及磷酸酶抑制剂至1X最终浓度（被称作MSD完全裂解缓冲液）来制备MSD TrisLysis缓冲液。从-80 ^°C冰箱取出肿瘤样本并使其置于RT下以开始融化。在样本融化期间，用150 μL阻断溶液（于室温下在板摇动器上剧烈摇晃(300-1000 rpm)最少1小时）阻断pSTAT3 Tyr705捕获板 (cat# K150DID-2)。摇晃前用粘性板密封器将板密封。阻断溶液应该含有Blocker A (cat# R93BA-4) 600mg：20 mL的1X MSD Tris洗涤缓冲液(cat# R61TX-2)的比率。一旦样本开始融化，将其转移至湿冰以继续融化。完成融化后，使用多沟道吸管通过上下吸移若干次小心地混合。在冰冷MSD完全裂解缓冲液中标准化样本至0.4μg/μL X100 μL的蛋白质浓度。在96孔聚丙烯板中的冰上维持所有标准化的肿瘤样本直至将其添加至pSTAT3捕获板。在阻断pSTAT3捕获板后，使用Thermo Labsystems Multidrop 384板洗涤器用250-300 μL的1X MSD Tris洗涤缓冲液洗涤4X。在最后洗涤后，轻轻拍打以移除任何残留洗涤缓冲液。添加经标准化的肿瘤裂解液每孔25 μL (10 μg)的总体积并在板摇动器上随着剧烈摇晃(300-1000 rpm)于室温下额外孵育2小时至3小时。在孵育期间，通过添加60μL的磺化-TAG抗磷酸化-STAT 3检测抗体至2.94 mL 的抗体稀释缓冲液来稀释在抗体稀释缓冲液(1 mL的阻断液与2 mL的1X MSD Tris洗涤缓冲液合并)中的试剂盒中所提供的磺化-TAG抗磷酸化-STAT 3检测抗体。在湿冰上保存此抗体溶液直至需要。孵育肿瘤裂解液后，用250-300 μL的1X MSD Tris洗涤缓冲液洗涤板4X。在最后洗涤后，轻轻拍打以移除任何残留洗涤缓冲液并添加25 μL/孔的磺化-TAG抗磷酸化-STAT 3检测抗体。在板摇动器上随着剧烈摇晃(300-1000 rpm)于室温下培育板额外1小时。在此孵育期间，用去离子水稀释具有表面活性剂(cat# R92TC-3)的4X MSD Read Buffer T至1X并于室温下保存。完成检测抗体孵育后，用250-300 μL的1X MSD Tris洗涤缓冲液洗涤板4X。在最终洗涤后，轻轻拍打板以移除任何残留洗涤缓冲液并添加总体积150 μl/孔的具有表面活性剂的1X MSD ReadBuffer T。在Meso Quick Plex SQ 120上读板。如以下所指示分析数据。

计算pSTAT3抑制百分比：

从Meso Quick Plex SQ 120直接复制并粘贴原始板数据至Microsoft Excel版本2010工作表中。组织数据至合适的格式（剂量响应或时程），直接复制粘贴至JMP版本11中以计算pSTAT3抑制百分比（参见如下公式）。

[1 – (处理样本信号/媒介物对照物的信号平均值)] * 100。

TED计算：

从剂量响应研究测定TED₅₀和TEC₅₀值。分别地，TED₅₀为在2小时下实现50% pSTAT3抑制所必要的剂量，TEC₅₀为在2小时下实现50% pSTAT3抑制所需要的血浆浓度。

基本上如上所述在此分析中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物示出9mg/kg的TED₅₀及3.9 µM (n=1)的TEC₅₀。这些结果示出实施例1的化合物表明在大鼠H1975IVTI模型中的靶参与。

HCC827异种移植肿瘤模型中的功效研究

此分析的目的在于测量化合物在HCC827异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长的能力。根据ATCC规范以最低可用的可能传代数目生长HCC827细胞(ATCC# CRL-2868, Lot#59392891)。在补充有10% FBS 的RPMI-1640中培养及维持细胞并在37 ℃、5% CO₂下孵育。使用TryPLE自烧瓶收集细胞、在DPBS中冲洗两次、在HBSS中再悬浮并与BD Biosciences基底膜基质(MATRIGEL®)混合成细胞悬浮液以实现1:1细胞/基质比率，其产生含有5e⁶细胞的0.2 ml细胞/基质悬浮液的接种容积。在整个接种过程中于冰上维持细胞悬浮液并在细胞培养采集后一小时内开始植入。在自Harlan 获得的雌性CB17 SCID小鼠(18-20 g)右后侧腹皮下给予植入。随机喂饲小鼠Harlan Teklad Protein Extruded 2920X并采用机架式供水系统提供水。使所植入的肿瘤细胞生长为实体瘤并在植入后第七天开始一周测量两次（连同体重）。使用计算：0.536*L*W^2测定肿瘤体积。在肿瘤体积达到大致150-200 mm³后，随机化动物并放置至每一组含有5-8只动物的组中。在含0.25% Tween 80及0.05%的具有1.1摩尔当量甲磺酸的防沫剂的1% HEC媒介物中配制化合物以形成原位盐(1.1mL的1N甲磺酸/(插入分子量) mg的化合物)。于RT下储存测试化合物。每周一次配制化合物并于RT下储存。不向媒介物对照组添加酸。基于最新组平均体重来计算剂量。通过口服管饲视剂量BID或QD中二者之一给予化合物28天。

基本上如上所述在此分析中测试本发明范围内的化合物。实施例1的化合物示出在30 mg/kg BID 下的31%肿瘤生长抑制、在60 mg/kg BID下的22%肿瘤消退及在120 mg/kgQD 下的22%肿瘤消退。这些结果示出实施例1的化合物表明在HCC827异种移植肿瘤模型中的肿瘤消退。