EA033572B1 - Бензимидазольные соединения в качестве ингибиторов jak1 - Google Patents
Бензимидазольные соединения в качестве ингибиторов jak1 Download PDFInfo
- Publication number
- EA033572B1 EA033572B1 EA201792676A EA201792676A EA033572B1 EA 033572 B1 EA033572 B1 EA 033572B1 EA 201792676 A EA201792676 A EA 201792676A EA 201792676 A EA201792676 A EA 201792676A EA 033572 B1 EA033572 B1 EA 033572B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- compound
- cancer
- cells
- amino
- jak1
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/4164—1,3-Diazoles
- A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
- C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
- C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к некоторым бензимидазольным соединениям или их фармацевтически приемлемым солям, которые ингибируют Янус-киназу 1 (JAK1), к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, и к способам применения указанных соединений для лечения некоторых типов рака.
Description
Настоящее изобретение относится к некоторым бензимидазольным соединениям или их фармацевтически приемлемым солям, которые ингибируют Янус-киназу 1 (JAK1), к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, и к способам применения указанных соединений для лечения некоторых типов рака.
Киназы JAK представляют собой семейство тирозинкиназ, которые регулируют фосфорилирование тирозина различных эффекторов и инициируют активацию нисходящих сигнальных путей. JAK1 является членом указанного семейства, который опосредует активацию сигнального трансдуктора и активатора транскрипции 3, STAT3. Постоянная активация STAT3 вызывает образование опухолей и промотирует выживание и пролиферацию раковых клеток. Было показано, что аберрации в активации STAT3 разрушают иммунный надзор опухоли в микроокружении опухоли. Следовательно, ингибирование JAK1 может блокировать активацию STAT3, что приводит к подавлению роста опухоли и иммунного надзора опухоли. Кроме того, активация мутаций JAK1 идентифицирована при остром лимфобластном лейкозе клеток Т-линии и при гепатоцеллюлярной карциноме жителей Азии, и была показана ее онкогенность. Полученные результаты позволяют предположить, что JAK1 является возможной онкологической мишенью.
Известно, что JAK2 образует гомодимеры, которые опосредуют передачу сигналов на пути от рецепторов ЕРО и ТРО к STAT5, который регулирует выработку красных кровяных клеток и тромбоцитов. Ингибирование JAK2 может приводить к анемии и тромбоцитопении. Однако JAK1 не проявляет подобной активности и, следовательно, можно предположить, что соединения, которые селективно ингибируют JAK1, могут обладать улучшенным профилем гематотоксичности и/или иммуногенности, чем соединения, которые селективно ингибируют JAK2, или двойные ингибиторы JAK1/2.
Соединения-ингибиторы киназ JAK описаны в литературных источниках. Например, в US 2015/0203455 описаны некоторые бензимидазольные соединения, которые являются ингибиторами JAK.
Сохраняется потребность в обеспечении альтернативных ингибиторов JAK1 для лечения рака. Кроме того, сохраняется потребность в обеспечении селективных ингибиторов JAK1, которые уменьшают или не допускают ингибирование JAK2. Соответственно, в настоящем изобретении предложены некоторые ингибиторы JAK1, которые могут быть применимы для лечения рака. Кроме того, в настоящем изобретении предложены некоторые селективные ингибиторы JAK1, которые могут снижать ингибирование JAK2.
В настоящем изобретении предложено соединение формулы I
F3C он ^NH
СНз или его фармацевтически приемлемая соль.
Предпочтительно в настоящем изобретении предложено соединение, выбранное из группы, состоящей из (2S)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1H-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6ил}окси) циклогексил] амино }-1,1,1 -трифторпропан-2 -ола
сн3 или его фармацевтически приемлемой соли и (2И)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси) циклогексил] амино }-1,1,1 -трифторпропан-2-ола
- 1 033572
или его фармацевтически приемлемой соли.
Предпочтительно в настоящем изобретении предложено соединение, представляющее собой (2S)-3{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил] амино }-1,1,1 -трифторпропан-2 -ол
СН3 или его фармацевтически приемлемая соль.
Более предпочтительно в настоящем изобретении предложено соединение, представляющее собой (2R)-3-{ [цис-4-({4-[( 1,5-диметил-1Н-пиразол-3 -ил)амино] -1 -метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил] амино }-1,1,1 -трифторпропан-2-ол
или его фармацевтически приемлемая соль.
В качестве конкретного варианта реализации в настоящем изобретении предложено соединение, представляющее собой (2R)-3-{ [цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино }-1,1,1 -трифторпропан-2-ол.
В качестве конкретного варианта реализации в настоящем изобретении предложено также соединение, представляющее собой (2S)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1H-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Нбензимидазол-6 -ил}окси)циклогексил] амино }-1,1,1 -трифторпропан-2-ол.
В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая (2К)-3-{|цис-4({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}1,1,1-трифторпропан-2-ол или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая (2R)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил
- 2 033572
1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил] амино}-1,1,1-трифторпропан-2-ол и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества (2И)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3ил)амино] -1 -метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1 -трифторпропан-2-ола или его фармацевтически приемлемой соли. В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества (2И)-3-{[цис-4-({4-[(1,5диметил-1Н-пиразол-3 -ил)амино] -1 -метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1трифторпропан-2-ола.
В настоящем изобретении предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии. В настоящем изобретении предложен (2И)-3-{[цис-4-({4-[(1,5диметил-1Н-пиразол-3 -ил)амино] -1 -метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1трифторпропан-2-ол или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии. В настоящем изобретении предложен (2R)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1-трифторпропан-2-ол или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении рака.
В настоящем изобретении предложено соединение формулы I для применения в терапии. В настоящем изобретении также предложен (2R)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1-трифторпропан-2-ол для применения в терапии. В настоящем изобретении предложен (2R)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3ил)амино] -1 -метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1 -трифторпропан-2-ол для применения при лечении рака.
В настоящем изобретении предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в производстве лекарственного средства для лечения рака. В настоящем изобретении предложено применение (2R)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Нбензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1-трифторпропан-2-ола или его фармацевтически приемлемой соли в производстве лекарственного средства для лечения рака. В настоящем изобретении также предложено применение (2R)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Нбензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1-трифторпропан-2-ола в производстве лекарственного средства для лечения рака.
В настоящем изобретении предложено свободное основание (2R)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Нпиразол-3 -ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1 -трифторпропан-2ола в кристаллической форме. В настоящем изобретении также предложено свободное основание (2R)-3{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил] амино}-1,1,1-трифторпропан-2-ола в кристаллической форме, характеризующееся диаграммой рентгеновской порошковой дифракции, имеющей характеристические пики, выраженные в градусах 2θ±0,2, при 19,5° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 11,9°, 15,4° и 17,6°.
В настоящем изобретении предложена соль (2R)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-диметил-1H-пиразол-3ил)амино] -1 -метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1 -трифторпропан-2-ола с диметансульфоновой кислотой в кристаллической форме. В настоящем изобретении также предложена соль (2R)-3-{ [цис-4-({4-[( 1,5-диметил-1Н-пиразол-3 -ил)амино] -1 -метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1-трифторпропан-2-ола с диметансульфоновой кислотой в кристаллической форме, характеризующаяся диаграммой рентгеновской порошковой дифракции, имеющей характеристические пики, выраженные в градусах 2θ±0,2°, при 21,7° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 21,2°, 18,0° и 15,7°.
Кроме того, в настоящем изобретении предложены предпочтительные варианты реализации способов и применений, описанных в настоящем документе, в которых рак выбран из группы, состоящей из рака легкого, включая немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и аденокарциному легкого, аденокарциномы, гепатоцеллюлярной карциномы, включая гепатоцеллюлярную карциному жителей Азии, колоректального рака, рака молочной железы, лимфомы и лейкоза, включая острый лимфоцитарный лейкоз и острый лимфобластный лейкоз клеток Т-линии. Предпочтительные виды рака представляют собой рак легкого, включая немелкоклеточный рак легкого и аденокарциному легкого, аденокарциному, гепатоцеллюлярную карциному, включая гепатоцеллюлярную карциному жителей Азии, колоректальный рак, рак молочной железы и лейкоз, включая острый лимфоцитарный лейкоз. Более предпочтительные виды рака представляют собой немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, рак молочной железы и гепатоцеллюлярную карциному жителей Азии.
Следует понимать, что следующие термины, упомянутые выше и по всему тексту настоящего изобретения, если не указано иное, имеют следующие значения.
- 3 033572
Фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество представляет собой среду, общепринятую в данной области техники, для доставки биологически активных агентов млекопитающим, например людям.
Фармацевтически приемлемые соли или фармацевтически приемлемая соль относится к относительно нетоксичной неорганической и органической соли или солям соединения согласно настоящему изобретению.
Эффективное количество означает количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно настоящему изобретению, которое вызывает биологический или медицинский ответ или требуемый терапевтический эффект в ткани, системе, организме животного, млекопитающего или человека, наблюдаемый исследователем, ветеринаром, врачом или иным клиницистом.
Термины лечение, лечить, лечащий и т.п. включают замедление или реверсирование развития расстройства. Указанные термины включают также облегчение, улучшение, снижение, исключение или ослабление одного или более симптомов расстройства или патологического состояния, даже если указанное расстройство или патологическое состояние фактически не устранено и даже если прогрессирование расстройства или патологического состояния само по себе не замедлено или не реверсировано.
Соединение согласно настоящему изобретению может вступать в реакцию, например, с многочисленными неорганическими и органическими кислотами с образованием фармацевтически приемлемых солей. Такие фармацевтически приемлемые соли и общие методики их получения известны в данной области техники. См., например, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, т. 66, № 1, январь 1977.
Соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно составляют в виде фармацевтической композиции, используя фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество, и вводят различными способами. Предпочтительно указанные композиции предназначены для перорального введения. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., ред., 21-е изд., Mack Publishing Co., 2005).
Фактически вводимое количество соединения согласно настоящему изобретению определяет врач с учетом релевантных обстоятельств, включая патологическое состояние, подлежащее лечению, выбранный способ введения, фактическое вводимое соединение согласно настоящему изобретению, возраст, массу тела и реакцию индивидуального пациента, а также тяжесть симптомов пациента. Суточные дозы обычно входят в диапазон от около 50 до 1000 мг в сутки, предпочтительно от 80 до 600 мг в сутки, наиболее предпочтительно 300 мг в сутки. В некоторых случаях могут быть более подходящими уровни доз, которые меньше нижнего предела вышеуказанного диапазона, а в других случаях могут быть использованы более высокие дозы. Уровни доз могут быть определены специалистом в данной области техники.
Соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль могут быть получены посредством многочисленных способов, известных в данной области техники, а также способов, описанных ниже в разделе Способы получения и примеры. Конкретные стадии синтеза каждого из описанных способов могут быть различным образом комбинированы с получением соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.
Реагенты и исходные материалы обычно легкодоступны для специалистов в данной области техники. Другие реактивы могут быть получены по стандартным методикам органической и гетероциклической химии, методикам, известным специалистам в данной области техники, и способам, описанным ниже в разделе Примеры, включая все новые способы. Настоящее изобретение дополнительно иллюстрировано далее в разделе Способы получения и примеры. Если не указано иное, то названия и нумерация соединений, представленных в настоящем документе, были получены с помощью IUPACNAME ACDLABS.
Отдельные изомеры, энантиомеры или диастереомеры могут быть выделены или разделены специалистами в данной области техники в любой удобной точке синтеза соединений при помощи таких способов, как технология селективной кристаллизации или хиральная хроматография (см., например, Enantiomers, Racemates, and Resolutions (J. Jacques, et al., John Wiley and Sons, Inc., 1981)).
Специалистам в данной области техники понятно, что соединение согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один хиральный центр. Настоящее изобретение включает все отдельные энантиомеры или диастереомеры, а также смеси энантиомеров и диастереомеров указанных соединений, включая рацематы. Предпочтительно, что соединение согласно настоящему изобретению существует в виде одного энантиомера или диастереомера. Отдельный энантиомер или диастереомер может быть получен исходя из хиральных реагентов или технологиями стереоселективного или стереоспецифического синтеза. Альтернативно, отдельный энантиомер или диастереомер может быть выделен из смесей стандартными технологиями хиральной хроматографии или кристаллизации.
Соединение согласно настоящему изобретению может быть получено в соответствии со способами
- 4 033572 синтеза, хорошо известными и принятыми в данной области техники. Подходящие условия реакций для стадий указанных реакций хорошо известны в данной области техники, и подходящие замены растворителей и совместных реагентов известны специалистам в данной области техники. Таким же образом, специалистам в данной области техники понятно, что синтетические промежуточные соединения, при необходимости или желании, могут быть выделены и/или очищены различными общеизвестными технологиями, и что зачастую можно использовать различные промежуточные соединения непосредственно на следующих стадиях синтеза с незначительной очисткой или без очистки. Кроме того, опытным специалистам понятно, что в некоторых случаях порядок введения фрагментов не критичен. Конкретный порядок стадий, необходимых для получения соединения согласно настоящему изобретению, зависит от конкретного синтезируемого соединения, исходного соединения и относительной подвижности замещенных фрагментов, что понятно опытным химикам. Все заместители, если не указано иное, являются такими, как определено ранее, и все реагенты являются общеизвестными и принятыми в данной области техники.
В данном контексте следующие термины имеют указанные значения: АТФ относится к аденозин5'-трифосфату; BSA относится к альбумину бычьей сыворотки; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; ЭДТК относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; ЭГТК относится к этиленгликольтетрауксусной кислоте; FBS относится к эмбриональной бычьей сыворотке; GFP относится к зеленому флуоресцентному белку; HEPES относится к 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоте; HWB относится к цельной крови человека; IC50 относится к концентрации соединения, которая снижает данный ответ (связывание лиганда или ответ фермента) на 50%; относительная IC50 относится к относительной концентрации, обеспечивающей половину от максимального ответа на соединение; IVTI относится к ингибированию мишени in vivo; JAK относится к Янус-киназе; МС относится к масс-спектроскопии; ЯМР относится к ядерному магнитному резонансу; NSCLC относится к немелкоклеточному раку легкого; PBS относится к фосфатно-солевому буферному раствору; РНКаза относится к рибонуклеазе; комн. т-ра относится к комнатной температуре; SCLC относится к мелкоклеточному раку легкого; STAT относится к сигнальным трансдукторам и активаторам транскрипции; TED относится к пороговой эффективной дозе; TR-FRET относится к резонансному переносу энергии флюоресценции с временным разрешением.
Подготовительный синтез 1. (2R)-2-(Трифторметил)оксиран
О ^СРз
Добавляли уксусную кислоту (0,89 мл, 0,052 экв.) к раствору (Щ^)-(+)-1,2-циклогександиамино^^-бис(3,5-ди-трет-бутилсалицилиден)кобальта(П) (0,90 г, 0,0050 экв.) в толуоле (16,65 мл). Перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворитель удаляли in vacuo. Добавляли толуол (20 мл) и концентрировали in vacuo. Охлаждали до 0°С и добавляли 2-(трифторметил)оксиран (37,00 г, 330 ммоль; э.и. 80,0%, (2R) является основным энантиомером). Перемешивали в течение 5 мин и по каплям добавляли воду (0,80 мл, 0,15 экв.). Оставляли медленно нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Перегоняли под вакуумом при комнатной температуре, собирая указанное в заголовке соединение в охлажденную колбу в виде светло-желтого маслянистого вещества (28,10 г, 76%; э.и. 99,8%).
1H ЯМР (CDCl3) δ 2,92-2,94 (м, 1H), 2,98-3,01 (м, 1H), 3,41-3,46 (м, 1H).
Смешивали указанное в заголовке соединение (0,13 г, 1,16 ммоль) и метанол (1,3 мл). Охлаждали до 0°С и добавляли триэтиламин (0,17 мл, 1,10 экв.) и тиофенол (0,12 мл, 1,05 экв.). Перемешивали в течение 30 мин. ГХ-МС аликвоты показал образование 1,1,1-трифтор-3-фенилсульфанилпропан-2-ола (в результате раскрытия кольца указанного в заголовке соединения); m/z = 222. Хиральная ЖХ-МС показала э.и. 99,8%, (2S)-1,1,1-трифтор-3-фенилсульфанилпропан-2-ол является основным энантиомером.
Подготовительный синтез 2. 1-Бром-3,5-дифтор-2-нитробензол
Вг
По каплям добавляли азотную кислоту (дымящую, 20 мл) к раствору 1-бром-3,5-дифторбензола (35,00 мл, 304 ммоль) в серной кислоте (50 мл) при 0°С. Оставляли медленно нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Выливали реакционную смесь в смесь льда и воды (600 мл). Оставляли медленно нагреваться до комнатной температуры. Добавляли этилацетат (200 мл) и гексаны (100 мл). Перемешивали до полного растворения твердого вещества. Разделяли слои. Промывали органический слой насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого маслянистого вещества (57,37 г, 79%). ГХ-МС m/z = 237,239 (Br).
Подготовительный синтез 3. 3-Бром-5-фтор-№метил-2-нитроанилин
- 5 033572
сн3
NH no2
Br
Добавляли 2М раствор монометиламина в тетрагидрофуране (92 мл, 2,00 экв.) к раствору 1-бром3,5-дифтор-2-нитробензола (21,90 г, 92 ммоль) в 1,4-диоксане (92 мл). Перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин. Добавляли воду и экстрагировали этилацетатом. Промывали органический слой насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Очищали нормально-фазовой хроматографией, элюируя градиентом 20-40% метиленхлорида в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде оранжевого твердого вещества (16,95 г, 74%). МС (ЭР) m/z = (79Br/81Br) 249/251 (М+Н).
Подготовительный синтез 4. трет-Бутил-{цис-4-[3-бром-5-(метиламино)-4-нитрофенокси]циклогексил}карбамат
Смешивали 3-бром-5-фтор-Ы-метил-2-нитроанилин (75,04 г, 301 ммоль), трет-бутил-(цис-4гидроксициклогексил)карбамат (89,52 г, 1,38 экв.) и тетра(н-бутил)аммония бисульфат (15,58 г, 0,15 экв.) в дихлорметане (975 мл) и 5М водном растворе гидроксида натрия (241 мл). Быстро перемешивали при 37°С в атмосфере азота в течение пяти дней. Охлаждали до комнатной температуры. Разбавляли дихлорметаном (200 мл) и водой (400 мл). Разделяли слои. Водный слой экстрагировали дихлорметаном (3x100 мл). Промывали объединенные органические слои насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Очищали нормальнофазовой хроматографией, элюируя градиентом 0-40% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде оранжевого твердого вещества (68,57 г, 51%). МС (ЭР) m/z = (79Br/81Br) 442/444 (М-Н).
Подготовительный синтез 5. трет-Бутил-{цис-4-[(4-бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексил} карбамат
Смешивали трет-бутил-{цис-4-[3-бром-5-(метиламино)-4-нитрофенокси]циклогексил}карбамат (76,92 г, 173 ммоль) и 5% платину на углероде (сульфидированный, 3,85 г) в тетрагидрофуране (923 мл) в реакторе Парра. Перемешивали при комнатной температуре при давлении водорода 414 кПа в течение трех дней. Фильтровали через диатомовую землю. Промывали тетрагидрофураном. К объединенным тетрагидрофурановым фильтратам добавляли триметилортоформиат (165 мл, 8,70 экв.). Перемешивали в течение 22 ч при 63°С. Концентрировали основную часть реакционной смеси in vacuo. Разбавляли водой (400 мл) и этилацетатом (400 мл). Подщелачивали водным раствором карбоната натрия до рН 9. Разделяли слои. Водный слой экстрагировали этилацетатом (2x200 мл). Сушили объединенные органические слои над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Разбавляли метилтрет-бутиловым эфиром (400 мл) и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин. Фильтровали, промывали метил-трет-бутиловым эфиром и сушили под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения в виде светло-коричневого твердого вещества (52,02 г, 71%). МС (ЭР) m/z = (79Br/81Br) 424/426 (М+Н).
Подготовительный синтез 6. цис-4-[(4-Бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексанамин
- 6 033572
Через капельную воронку медленно добавляли трифторуксусную кислоту (666 мл) к раствору третбутил-{цис-4-[(4-бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексил}карбамата (222 г, 497 ммоль) в дихлорметане (1110 мл) при 0°С. Оставляли медленно нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Концентрировали реакционную смесь in vacuo. Добавляли воду (250 мл) и подщелачивали 50% водным раствором гидроксида натрия до рН 10. Добавляли воду (250 мл). Экстрагировали 20% раствором метанола в дихлорметане (1500 мл, затем 500 мл, затем 250 мл). Промывали объединенные органические слои 2М водным раствором гидроксида натрия, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде коричневого твердого вещества (155 г, 91%). МС (ЭР) m/z = (79Br/81Br) 324/326 (М+Н).
Подготовительный синтез 7. (2R)-3-({цис-4-[(4-Бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексил}амино)-1,1,1 -трифторпропан-2-ол
Добавляли (2R)-2-(трифторметил)оксиран (73,29 г, 1,50 экв.) к раствору цис-4-[(4-бром-1-метил-1Нбензимидазол-6-ил)окси]циклогексанамина (150,4 г, 436 ммоль) в метаноле (1053 мл). Перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Концентрировали реакционную смесь in vacuo. Очищали нормально-фазовой хроматографией, элюируя градиентом 0-10% этанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения в виде грязновато-белого твердого вещества (98,10 г, 52%). МС (ЭР) m/z = (79Br/81Br) 436/438 (М+Н).
Подготовительный синтез 8. 3-({цис-4-[(4-Бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексил}амино)-1,1,1 -трифторпропан-2-ол
Добавляли 2-(трифторметил)оксиран (2,13 мл, 1,02 экв.; э.и. 80,0%, (2R) является основным энантиомером) к раствору цис-4-[(4-бром-1-метил-1H-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексанамина (7,90 г, 24,37 ммоль) в изопропаноле (130 мл). Нагревали при 70°С в течение ночи. Концентрировали реакционную смесь in vacuo. Очищали нормально-фазовой хроматографией, элюируя пошаговым градиентом от 100% этилацетата до 2,5%, до 5%, до 7,5%, до 10% метанола в этилацетате, с получением указанного в заголовке соединения (7,86 г, 74%). МС (ЭР) m/z = (79Br/81Br) 436/438 (М+Н).
Подготовительный синтез 9. (5Б)-3-{цис-4-[(4-Бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексил}-5-(трифторметил)-1,3-оксазолидин-2-он
- 7 033572
Смешивали 3-({цис-4-[(4-бром-1-метил-1Н-бензимид азол-6-ил)окси]циклогексил}амино)-1,1,1трифторпропан-2-ол (3,34 г, 7,66 ммоль; э.и. 80,0%, (2R) является основным энантиомером), 1,1'карбонилдиимидазол (2,48 г, 2,00 экв.) и 4-диметиламинопиридин (0,094 г, 0,10 экв.) в дихлорметане (38,3 мл). Перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Концентрировали реакционную смесь in vacuo. Очищали нормально-фазовой хроматографией, элюируя градиентом 05% метанола в дихлорметане, с получением 3-{цис-4-[(4-бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6ил)окси]циклогексил}-5-(трифторметил)-1,3-оксазолидин-2-она (3,28 г; э.и. 80,0%, (5R) является основным энантиомером).
Разделяли полученный выше продукт в следующих условиях хиральной хроматографии с получением указанного в заголовке соединения (0,32 г, 9%). МС (ЭР) m/z = (79Br/81Br) 462/464 (М+Н): Энантиомер 1, э.и. >99%, 75%/25% СО2/МеОН, 5 мл/мин, 4,6x150 мм, Chiralpak AD-H.
Подготовительный синтез 10. (2Б)-3-({цис-4-[(4-Бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексил}амино)-1,1,1 -трифторпропан-2-ол
Смешивали (5Б)-3-{цис-4-[(4-бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексил}-5-(трифторметил)-1,3-оксазолидин-2-он (0,32 г, 0,69 ммоль) и триметилсиланолат калия (0,36 г, 4,00 экв.) в тетрагидрофуране (7 мл). Перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение шести дней. Разбавляли водой. Фильтровали, промывали водой и сушили под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (0,22 г, 73%). МС (ЭР) m/z = (79Br/81Br) 436/438 (М+Н).
Пример 1. (2R)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-Диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6ил}окси)циклогексил] амино }-1,1,1 -трифторпропан-2 -ол
Смешивали (2К)-3-({цис-4-[(4-бром-1-метил-1Н-бензимид азол-6-ил)окси]циклогексил}амино)-
1,1,1-трифторпропан-2-ол (0,20 г, 0,46 ммоль), 1,5-диметилпиразол-3-амин (0,056 г, 1,1 экв.), карбонат калия (0,158 г, 2,5 экв.), 2-(ди-трет-бутилфосфино)-2',4',6'-триизопропил-3,6-диметокси-1,1'-бифенил (0,046 г, 0,20 экв.), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,042 г, 0,10 экв.) и уксусную кислоту (0,01 мл) в трет-бутиловом спирте (5 мл). Закрывали винтовой крышкой. Нагревали в микроволновом реакторе при 120°С в течение 45 мин. Концентрировали реакционную смесь in vacuo. Очищали нормальнофазовой хроматографией, элюируя пошаговым градиентом от 100% этилацетата до 1%, до 2,5%, до 5% метанола в этилацетате, с получением указанного в заголовке соединения (0,071 г, 33%). МС (ЭР) m/z =
- 8 033572
467 (М+Н).
Альтернативный пример 1. (2К)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-Диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Нбензимидазол-6 -ил}окси)циклогексил] амино }-1,1,1 -трифторпропан-2-ол
HN
ТУсн,
СН3
Смешивали (2И)-3-({цис-4-[(4-бром-1-метил-1Н-бензимид азол-6-ил)окси]циклогексил}амино)-
1,1,1-трифторпропан-2-ол (50 г, 115 ммоль), 1,5-диметилпиразол-3-амин (18,25 г, 1,43 экв.) и карбонат калия (50 г, 3,16 экв.) в 2-метилбутан-2-оле (400 мл). Перемешивали и дегазировали с помощью линии барботирования азота в течение 15 мин. Добавляли 2-(дициклогексилфосфино)-3,6-диметокси-2',4',6'триизопропил-1,1'-бифенил (2,20 г, 0,034 экв.) и трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (1,60 г, 0,015 экв.). Перемешивали и дегазировали с помощью линии барботирования азота в течение 5 мин. Добавляли уксусную кислоту (3 мл). Нагревали до кипения с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 20 ч. Добавляли 2-(дициклогексилфосфино)-3,6-диметокси-2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил (1,10 г, 0,017 экв.) и трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,80 г, 0,0075 экв.). Нагревали до кипения с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 3 ч. Концентрировали реакционную смесь in vacuo. Разбавляли водой (500 мл). Подкисляли 35% водным раствором хлористоводородной кислоты до рН 1. Добавляли этилацетат (100 мл) и перемешивали в течение 5 мин. Обрабатывали перемешиваемую смесь активированным древесным углем (5 г) и фильтровали через диатомовую землю. Разделяли слои и отбрасывали органический слой. Водный слой подщелачивали 30% мас./мас. водным раствором гидроксида аммония до рН 10. Фильтровали с получением твердого вещества. Очищали нормально-фазовой хроматографией, элюируя 10% смесью 2М раствора аммиака в метаноле в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения (52 г, 95%). МС (ЭР) m/z = 467 (М+Н).
Второй альтернативный пример 1. (2И)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-Диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1метил-1Н-бензимидазол-6-ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1 -трифторпропан-2-ол, кристаллическая форма I.
А. Растворяли часть продукта, полученного нормально-фазовой хроматографией в альтернативном примере 1 (1,60 г), в смеси 9:1 ацетона:воды (45 мл). Перемешивали при комнатной температуре в тече ние 15 мин и добавляли SiliaBond® DMT (0,42 г). Фильтровали через 5 ч при комнатной температуре. Концентрировали фильтрат для удаления всего ацетона, затем разбавляли водой (10 мл). Фильтровали и сушили под вакуумом с получением кристаллического вещества (1,37 г). МС (ЭР) m/z = 467 (М+Н).
В. Суспендировали продукт, полученный нормально-фазовой хроматографией в альтернативном примере 1 (47,0 г), в изопропаноле (1,15 л). Нагревали смесь до кипения с обратным холодильником с получением раствора. Добавляли стекловидный углерод (6 г). Через 1 ч кипячения с обратным холодильником фильтровали через диатомовую землю. Промывали изопропанолом (50 мл) и вносили в фильтрат затравку кристаллического вещества, полученного в подразделе А, приведенном непосредственно выше (0,20 г, по частям). Перемешивали и оставляли остывать до комнатной температуры в течение 2 ч. Фильтровали и сушили под вакуумом с получением кристаллического вещества (37,8 г). МС (ЭР) m/z = 467 (М+Н).
Пример 2. ^)-3-{[цис-4-({4-[(1,5-Диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1-метил-1Н-бензимидазол-6ил}окси)циклогексил]амино }-1,1,1 -трифторпропан-2-ол
- 9 033572
Смешивали (2Б)-3-({цис-4-[(4-бром-1-метил-1Н-бензимидазол-6-ил)окси]циклогексил}амино)-
1,1,1-трифторпропан-2-ол (0,077 г, 0,18 ммоль), 1,5-диметилпиразол-3-амин (0,030 г, 1,45 экв.), карбонат калия (0,060 г, 2,46 экв.), 2-(ди-трет-бутилфосфино)-2',4',6'-триизопропил-3,6-диметокси-1,1'-бифенил (0,022 г, 0,25 экв.), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,0080 г, 0,050 экв.) и уксусную кислоту (0,01 мл) в трет-бутиловом спирте (2,5 мл). Закрывали винтовой крышкой. Нагревали при 95°С в течение ночи. Разбавляли этилацетатом и фильтровали через диатомовую землю. Концентрировали фильтрат in vacuo. Очищали нормально-фазовой хроматографией, элюируя градиентом 5-100% В (А: дихлорметан; В: 15% смесь 0,75М раствора аммиака в метаноле в дихлорметане). Дополнительно очищали обращеннофазовой хроматографией, элюируя градиентом 5-100% В (А: 10 нМ водный раствор бикарбоната аммония с 10% метанола; В: ацетонитрил). Концентрировали чистые фракции от этанола, затем снова концентрировали от дихлорметана с получением указанного в заголовке соединения (0,054 г, 65%). МС (ЭР) m/z = 467 (М+Н).
Пример 3. (2R)-3-{ [цис-4-({4-[( 1,5-Диметил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-1 -метил-1Н-бензимидазол-6ил}окси)циклогексил] амино }-1,1,1 -трифторпропан-2-ол; диметансульфоновая кислота
Смешивали (2R)-3 -{[цис-4-({4-[( 1,5-диметил-1Н-пиразол-3 -ил)амино] -1 -метил-1Н-бензимидазол-6ил}окси)циклогексил]амино}-1,1,1-трифторпропан-2-ол (1,00 г, 2,15 ммоль) и ацетон (35 мл). Нагревали при 51°С и по каплям добавляли раствор метансульфоновой кислоты (0,30 мл, 2,10 экв.) в ацетоне (5 мл). Перемешивали при 51 °С в течение 1 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры. Фильтровали полученное твердое вещество и сушили в вакуумной печи при 70°С в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (1,25 г, 88%).
Рентгеновская порошковая дифракция.
Диаграммы РПД кристаллических твердых веществ получали на рентгеновском порошковом дифрактометре Bruker D4 Endeavor, оснащенном источником CuKa (λ = 1,54060 А) и детектором Vantec, работающем при 35 кВ и 50 мА. Образец сканировали от 4 до 40° 2Θ с шагом 0,009° 2Θ и скоростью сканирования 0,5 с/шаг и с дивергенцией 0,6 мм, с неподвижной 5,28 мм антирассеивающей и 9,5 мм детекторной щелями. Сухой порошок упаковывали в кварцевый держатель образца и обеспечивали гладкую поверхность с помощью предметного стекла. Диаграммы дифракции кристаллической формы получали при температуре и относительной влажности окружающей среды. В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы относительные интенсивности пиков дифракции могут варьироваться из-за предпочтительной ориентации, обусловленной такими факторами, как морфология и форма кристалла. При наличии эффекта предпочтительной ориентации, интенсивности пиков являются переменными, но положения характеристических пиков полиморфа не меняются. См., например, фармакопею США № 23, национальный формуляр № 18, стр. 1843-1844, 1995. Кроме того, в области кристаллографии также хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы угловые положения пиков могут незначительно варьироваться. Например, положения пиков могут смещаться
- 10 033572 вследствие изменения температуры или влажности, при которых анализируют образец, вследствие смещения образца или наличия или отсутствия внутреннего стандарта. В представленном случае вариабельность положения пика, составляющая ± 0,2° 2θ, учитывает указанные возможные отклонения, не препятствуя точному определению указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы может быть основано на любой уникальной комбинации характеристических пиков (в единицах ° 2θ), как правило, более выраженных пиков. Диаграммы дифракции кристаллической формы, полученные при температуре и относительной влажности окружающей среды, корректировали в соответствии со стандартными пиками NIST 675 при 8,853° и 26,774° 2θ.
Характеристики полученного образца соединения из второго альтернативного примера 1 получали с помощью диаграммы РПД, используя излучение CuKa, имеющей пики дифракции (значения 2θ), представленные ниже в табл. 1, и, в частности, имеющей пики при 19,5° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 11,9°, 15,4° и 17,6°; с допуском углов дифракции 0,2°.
Таблица 1
Пики рентгеновской порошковой дифракции второго альтернативного примера 1
Пик | Угол (°2-тета) +/- 0,2° | Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика) |
1 | 6,4 | 17,0% |
2 | П,9 | 46,6% |
3 | 14,7 | 11,7% |
4 | 15,4 | 41,9% |
5 | 16,2 | 27,5% |
6 | 16,9 | 24,9% |
7 | 17,6 | 40,1% |
8 | 19,5 | 100,0% |
9 | 20,8 | 32,1% |
10 | 21,5 | 19,6% |
Характеристики полученного образца соединения из примера 3 получали с помощью диаграммы РПД, используя излучение CuKa, имеющей пики дифракции (значения 2θ), представленные ниже в табл. 2, и, в частности, имеющей пики при 21,7° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 21,2°, 18,0° и 15,7°; с допуском углов дифракции 0,2°.
Таблица 2 Пики порошковой рентгеновской дифракции примера 3
Пик | Угол (с’2-тета) +/- 0,2° | Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика) |
1 | 5,6 | 26,2% |
2 | 10,0 | 25,7% |
3 | 13,1 | 28,7% |
4 | 15,7 | 70,0% |
5 | 18,0 | 90,5% |
6 | 19,6 | 64,5% |
7 | 20,6 | 41,8?ώ |
8 | 21,2 | 99,3?/« |
9 | 21,7 | 100,0% |
10 | 22,3 | 59,9% |
Ферментные анализы JAK1, JAK2 и JAK3 in vitro.
Для определения способности исследуемых соединений ингибировать активность киназ JAK1, JAK2 и JAK3 использовали анализ киназ JAK LanthaScreen™ (Invitrogen). В указанных форматах анализа TR-FRET используют антитело, меченное изотопом тербия с большим периодом полураспада, в качестве донорных частиц, и GFP-STAT1 в качестве акцепторных частиц. Для контролирования активности кина
- 11 033572 зы JAK использовали отношение TR-FRET, где увеличение фосфорилирования GFP-STAT1 приводит к повышению отношения TR-FRET. Реакцию киназы проводили в реакционном объеме 12,5 мкл на мелком черном 384-луночном планшете Proxiplate. Для получения конечных реакционных условий добавляли реагенты 50 мл HEPES с рН, 1,76 мМ Triton Х-100, АТФ (20,0 мкМ для ферментных анализов JAK1 и JAK3 или 5 мкМ для ферментных анализов JAK2), 10,0 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТК и 0,01% Brij-35, 0,05 мМ GFP-STAT1, 14 нМ фермента JAK1 для ферментных анализов JAK1, 1,0 нМ для ферментных анализов JAK2 или 2,5 нМ для ферментных анализов JAK3 и 4% ДМСО и использовали серийные разбавления исследуемых соединений (разбавленные 1:3 от 20000 до 1 нМ). После добавления АТФ/GFP-STAT1 центрифугировали аналитические планшеты в течение 1 мин при скорости 1000 об/мин. Оставляли планшеты инкубироваться при комнатной температуре в течение 60 мин, а затем добавляли 12,5 мкл останавливающего буфера, содержащего 20 мМ ЭДТК, 2 нМ меченого тербием антитела против фосфорилированных сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции [фосфорилированная аминокислота тирозин 701] (Tb-анти-pSTAT1) [pTyr701], 0,67 мМ трис(гидроксиметил)аминоэтана гидрохлорида (Trizma®) с рН 7,5, 0,02% NaN3 и 0,01% нонилфенилполиэтиленгликоля (Nonidet® P40). Инкубировали при комнатной температуре в течение 90 мин и считывали на планшет-ридере EnVision с фильтром длины волны возбуждения 340 нм и фильтрами длины волны излучения 520 и 495 нм. Определяли отношение по длине волны излучения для GFP-STAT1, которую измеряли при 520 нм, относительно излучения при 495 нм для (Tb-анти-pSTAT1) [pTyr701]. Для каждого соединения определяли значение IC50, используя данные процентного ингибирования, которые рассчитывали по данным реакции относительно контрольных образцов на планшете (активный фермент относительно фермента, ингибированного тофацитинибом в концентрации 2,0 мМ). Для аппроксимации данных процентного ингибирования при десяти концентрациях соединения к четырехпараметрическому логистическому уравнению использовали ACTIVITYBASE 4.0.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение из примера 1 демонстрировало значение IC50 в отношении JAK1 4,0±0,8 нМ (n=6), IC50 в отношении JAK2 557±337 нМ (n=6), и IC50 в отношении JAK3 1910±786 нМ (n=6). Полученные результаты демонстрируют, что соединение примера 1 ингибирует фермент JAK1 in vitro. Полученные результаты также демонстрируют, что соединение примера 1 является более эффективным ингибитором фермента JAK1 и селективным по сравнению с JAK2 и JAK3 in vitro.
Анализ пролиферации клона 12 BaF3 с мутантной JAK-1 (S729C).
Цель данного анализа заключалась в определении ингибирующей активности специфических ингибиторов JAK-1 с применением анализа пролиферации клона 12 BaF3 с мутантной JAK-1 (S729C).
Клеточную линию, экспрессирующую mtJAK1 (S729C), создавали посредством трансдукции клеток Ba/F3 (мышиных про-В-клеток) ретровирусом, экспрессирующим векторную ДНК человеческой mtJAK1 (S729C)-pQCXIN. Проводили одно клонирование клеток для отбора клеток Ba/F3, экспрессирующих максимальные концентрации mtJAK1 (S729C), посредством серийного разбавления. Клеточную суспензию BaF3 с мутантной JAK-1 (S729C) выращивали и поддерживали в среде (Gibco RPMI1640, кат. № А10491-01), содержащей 10% Hi-FBS (Hyclone, кат. № 10082-047), 1 мкг/мл пуромицина дигидрохлорида (Sigma, кат. № 9620), 1,0 мг/мл G418 сульфата (Corning, ссыл. № 30-234-CI), здесь и далее упоминаемой как R10+.
Анализы пролиферации проводили в культуральной среде без отбора, которая здесь и далее упомянута как (R10-). Вкратце, выращенные клетки декантировали, центрифугировали и восстанавливали в 10 мл R10-, считывали с помощью прибора Beckman Coulter Vi-Cell. Клетки дополнительно разбавляли до 2е4/мл в R10- и помещали на 96-луночные белые матовые аналитические планшеты (Costar, кат. № 3610) в концентрации 1х103 клеток (50 мкл) на лунку. В соответствующих 96-луночных полипропиленовых планшетах разбавляли исследуемые соединения в 100% ДМСО, затем дополнительно разбавляли в R10с получением 2Х матрицы исследуемого соединения. Разбавленные исследуемые соединения добавляли в соответствующий клеточный планшет с получением CRC от 20 до 0,001 мкМ. В каждый планшет включали минимальные и максимальные контрольные образцы. В качестве минимального контроля использовали стауроспорин (конечная концентрация 1 мкМ), а в качестве максимального контроля использовали ДМСО, содержащий R10- в таком же количестве, как CRC. Планшеты покрывали заполненными водой испарительными крышками Microcline (кат. № LLS-0310) и инкубировали при 37°С в 5% CO2 в течение 3 дней. Через 3 дня инкубации планшеты вынимали из инкубатора и оставляли остывать до комнатной температуры. После охлаждения планшеты проявляли посредством добавления 100 мкл Cell Titer Glo (Promega, кат. № G7571), перемешивали в течение 2 мин на смесителе для планшетов и инкубировали еще 10 мин при комнатной температуре. Затем считывали люминесценцию на приборе Perkin Elmer Victor2, используя введенную в память программу для считывания люминесценции с 0,1 с. Кривые IC50 строили с помощью внутренней программы STATS TMAG и GraphPad Prism версии 4.03.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрировало значение IC50 956±217
- 12 033572 нМ (n=4). Полученный результат демонстрирует, что соединение примера 1 активно против mtJAKl (S729C), экспрессируемой в клетках Ba/F3.
Клеточный анализ p-STAT3-(p-Tyr705)-IL6-TF-1-JAK1 по протоколу AlphaScreen SureFire.
Клеточный анализ JAK1, описанный ниже, использовали для определения эффективности исследуемых соединений в отношении JAK1 в клетках.
Получение клеток.
Выдерживали клетки TF-1 в среде DMEM с 0,5% 26400 (FBS) и 1X Pen/Strep при 37°С. Помещали 100 тыс. клеток на лунку в 96-луночные черные планшеты BD с прозрачным дном. Выдерживали планшеты при комнатной температуре в течение 30-60 мин, затем инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% CO2. Подсчитывали клетки с помощью счетчика Vi-Cell, используя клеточную суспензию с концентрацией 100 клеток/мл, и помещали 100 мкл на лунку в планшеты Beckman Dickinson Biocoat (кат. № 354640).
Получение исследуемого соединения и обработка.
Получали серийные разбавления соединений 1:3 в ДМСО и дополнительно разбавляли в указанной среде. Исследовали соединения в диапазоне 10 точек концентрации от 20000 до 1 нМ. Добавляли разбавленное соединение в соответствующие клеточные планшеты. Инкубировали планшеты при 37°С в течение 20 мин. В соответствующие клеточные планшеты добавляли раствор IL6 в конечной концентрации 30 нг/мл и продолжали инкубировать при 37°С в течение 30 мин. Удаляли среду и добавляли 50 мкл 1х лизисного буфера в каждую лунку.
Обнаружение pSTAT3.
Последовательно выполняли следующие стадии: получали акцепторную смесь (активирующий буфер/реакционный буфер/акцепторные гранулы): переносили 4 мкл лизата из 96-луночных планшетов в 384-луночные планшеты Proxiplate; добавляли 5 мкл акцепторной смеси в 384-луночный планшет(ы) Proxiplate и закрывали планшеты алюминиевой крышкой; встряхивали 1-2 мин на встряхивателе для планшетов; инкубировали планшет при комнатной температуре в течение 2 ч при осторожном встряхивании; получали донорную смесь (донорные гранулы в буфере для разбавления); добавляли 2 мкл донорной смеси в аналитические планшеты; закрывали планшеты алюминиевой крышкой; встряхивали 1-2 мин на встряхивателе для планшетов; инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч при осторожном встряхивании; считывали планшеты с помощью Envision; протокол AlphaScreen Surefire 384.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрировало значение IC50 87 нМ ± 75 (n=10). Полученный результат демонстрирует, что соединение примера 1 ингибирует фермент JAK1 в клеточном анализе.
Клеточный анализ H1975-JAK1 по протоколу ACUMEN для фосфо-STAT3 (Tyr705).
Клеточный анализ H1975-JAK1 использовали для подтверждения эффективности исследуемых соединений в клетках NSCLC, в которых путь STAT3 активирован аутокринной петлей IL-6.
Получение клеток.
Последовательно выполняли следующие стадии: изучали клетки под микроскопом; аспирировали среду из клеток с помощью стерильной вакуумной пипетки; промывали клетки, используя примерно 5 мл PBS; аспирировали PBS с помощью стерильной вакуумной пипетки; добавляли 5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТК в колбу объемом 150 см2; осторожно покачивали колбу, чтобы покрыть клетки трипсином, и оставляли стоять под вытяжкой в течение 3 мин или устанавливали колбу в инкубатор на 3 мин для отделения клеток от колбы; несколько раз встряхивали колбу, чтобы отделить клетки; добавляли в колбу 10 мл питательной среды, осторожно распределяли суспензию на той стороне колбы, где происходил рост клеток, и перемешивали в пипетке для измельчения клеток; центрифугировали (1300 об/мин в течение 5 мин), повторно суспендировали в 10 мл питательной среды; фильтровали через клеточный фильтр (BD Falcon 352350, клеточный фильтр 70 мкм); собирали клетки в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл; подсчитывали клетки с помощью счетчика Vi-Cell (0,5 мл клеток).
День 1. Помещали 30000 клеток на лунку в 96-луночные черные планшеты BD с прозрачным дном. Подсчитывали клетки с помощью счетчика Vi-Cell, использовали клеточную суспензию с концентрацией 300000 клеток/мл и помещали 100 мкл/лунку на планшеты Beckman Dickinson Biocoat, кат. № 354640. Поддерживали планшеты при комнатной температуре в течение 30-60 мин, затем устанавливали их в инкубатор. Затем инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% CO2.
Получение соединения и обработка.
Подготавливали планшет с глубокими лунками, содержащий 1 мл среды без FBS с 0,6% ДМСО, затем добавляли 2 мкл соединения (10 мМ раствор в ДМСО) с получением планшета с исходным 20 мкМ раствором. Проводили серийные разбавления 1:3 соединений в среде без FBS с 0,6% ДМСО на планшетах для разбавления. Исследовали соединения в диапазоне 10 точек концентрации от 20 мкМ до 1 нМ. Удаляли среду из аналитических планшетов с клетками. Переносили 100 мкл соединений из планшета для разбавления в аналитические планшеты (планшеты Beckman Dickinson Biocoat, кат. № 356440), содержащие клетки, связанные с 100 мкл среды, и использовали программу ТЕМО: клеточный анализ пе
- 13 033572 реноса образца с помощью медленного дозатора Gem 3797. Затем инкубировали клетки в течение 4 ч при 37°С.
Обнаружение pSTAT3.
На 1 день последовательно проводили следующие стадии: удаляли среду; добавляли 100 мкл 3,7% параформальдегида; инкубировали в течение 30 мин в темноте; промывали с помощью 100 мкл PBS; добавляли 100 мкл холодного метанола; инкубировали в течение 15 мин в темноте; промывали 2 раза, используя 100 мкл PBS; добавляли 100 мкл блокирующего раствора (1% BSA в PBS); инкубировали в течение 30 мин в темноте; добавляли 50 мкл первичного антитела pSTAT3 1:500 (в блокирующем растворе: 1% BSA; мышиное антифосфо-STAT3(Tyr705)); закрывали планшеты алюминиевой фольгой и инкубировали при 4°С при осторожном встряхивании в течение ночи.
На 2 день последовательно проводили следующие стадии: 2 раза промывали с помощью 100 мкл PBS; добавляли 50 мкл вторичного антитела (1:1000; Ab2° козье антимышиное IgG); инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте; 2 раза промывали с помощью 100 мкл PBS; добавляли 100 мкл йодида пропидия (1:1000 в PBS из имеющегося в продаже раствора), содержащего РНКазу (50 мкг/мл в PBS); закрывали планшеты прозрачной пленкой и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч перед считыванием; считывали на приборе Acumen Explorer (параметры настраивали на основании положительной и отрицательной лунки). Лазер (1 сканирование) 488 нм.
Обработка данных.
Данные обрабатывали с помощью базы активностей и анализировали, используя 4-параметрическое нелинейное логистическое уравнение (четырехпараметрическую логистическую кривую зависимости ответа от концентрации)
Y = ниж. + [(ниж.-верх. )/1+(х/1С50)у гол] где Y = % ингибирования, X = концентрация, обеспечивающая у% ингибирование, ниж. = минимальное значение у на кривой, верх. = максимальное значение у на кривой, и угол = крутизна кривой при IC50.
%Инг. = [(среднее Мах- х/ среднее Мах - среднее Min)] 100
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрировало значение IC50 297 нМ (n=1). Полученный результат демонстрирует, что соединение примера 1 активно против JAK1 в клетках NSCLC, в которых путь STAT3 активирован аутокринной петлей IL-6.
Клеточный анализ P-STAT5 (p-Tyr694/699)-EPO-JAK2 по протоколу AlphaScreen SureFire.
Кратность селективности исследуемых соединений в отношении JAK1 по сравнению с JAK2 определяли с помощью клеточного анализа, в котором использовали ЕРО для активации пути JAK2-STAT5, и использовали pSTAT5 в качестве считываемого параметра.
Получение клеток.
Выдерживали клетки UT-7 в течение ночи в среде DMEM с 0,5% 1600 (FBS) и 1X Pen/Strep при 37°С (без GM-CSF). Помещали 50000 клеток на лунку на 96-луночные черные планшеты BD с прозрачным дном (в среде без FBS и GM-CSF). Выдерживали планшеты при комнатной температуре в течение 30-60 мин, затем инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% СО2. Подсчитывали клетки с помощью счетчика Vi-Cell, используя клеточную суспензию с концентрацией 500000 клеток/мл, и помещали 100 мкл на лунку в планшеты Beckman Dickinson Biocoat, кат. № 354640.
Разбавление соединения и обработка.
Исследовали соединения в диапазоне 10 точек концентрации от 20000 до 1 нМ. Получали серийные разбавления соединений 1:3 в ДМСО и дополнительно разбавляли в указанной среде. Добавляли разбавленное соединение в соответствующие клеточные планшеты и инкубировали при 37°С в течение 20 мин, затем добавляли 20 мкл ЕРО (295 нг/мл, конечная концентрация 45 нг/мл) в соответствующие клеточные планшеты, продолжали инкубировать при 37°С в течение 30 мин.
Лизис клеток.
Среду сливали (осторожно) и добавляли 50 мкл 1Х лизисного буфера в каждую лунку (лизат замораживали в течение ночи), (лизисный буфер: 5Х; разбавляли в воде до конечной концентрации 1X).
Обнаружение p-STAT5.
Последовательно выполняли следующие стадии: получали акцепторную смесь (активирующий буфер/реакционный буфер/акцепторные гранулы); переносили 4 мкл лизата из 96-луночных планшетов в 384-луночные планшеты Proxiplate; добавляли 5 мкл акцепторной смеси в 384-луночный планшет(ы) Proxiplate с помощью дозатора Multidrop Combi и закрывали планшеты алюминиевой крышкой; встряхивали 1-2 мин на встряхивателе для планшетов; инкубировали планшет при комнатной температуре в течение 2 ч при осторожном встряхивании; получали донорную смесь (донорные гранулы в буфере для разбавления); добавляли 2 мкл донорной смеси в аналитические планшеты с помощью дозатора Multidrop Combi; закрывали планшеты алюминиевой крышкой; встряхивали 1-2 мин на встряхивателе для планшетов; инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч при осторожном встряхивании; счи
- 14 033572 тывали планшеты с помощью Envision; протокол AlphaScreen Surefire 384.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрировало значение IC5u 11,8±5,4 мкМ (n=5). Полученный результат демонстрирует, что соединение примера 1 является селективным в отношении JAK1 по сравнению с JAK2 в клеточном анализе, в котором использовали ЕРО для активации пути JAK2-STAT5.
Анализы цельной крови человека.
Определение pSTAT3 (JAK1) и pSTAT5 (JAK2) в лимфоцитах и моноцитах.
Анализы цельной крови человека (HWB) разрабатывали и валидировали для определения селективности исследуемых соединений в отношении JAK1 и JAK2.
Разбавляли исследуемые соединения (1:3) в 100% ДМСО с получением 10 точек, а затем в PBS + 0,1% BSA. Тофацитиниб использовали в качестве эталонного соединения в каждом планшете, а также максимальный сигнал (стимулированные лунки) и минимальный сигнал (отсутствие стимулированных лунок) для нормирования данных. Получали пул HWB от 4 различных здоровых доноров. Помещали кровь в 96-луночный планшет с помощью Tecan Evo 96w и инкубировали с исследуемыми соединениями в течение 1 ч при комнатной температуре. По истечении указанного времени инкубации стимулировали HWB, используя IL6 (206-IL, R&D System) и GM-CSF (PHC2015, Life Technologies), в течение следующих 15 мин. Добавляли краситель для определения жизнеспособности (65-0865, eBiosicience) (1:1000) с помощью Tecan Evo 96w (5xmix).
Конечные концентрации в анализе были следующими: 100 мкМ соединений, 50 мкМ тофацитиниба, 0,1 мкг/мл IL6, 0,038 мкг/мл GM-CSF и 1% ДМСО. Лизировали и фиксировали HWB с помощью лизисного/фиксирующего буфера (558049, Becton Dickinson), добавляя 900 мкл лизисного буфера с помощью Tecan Evo 96w (смешивали 10х при высокой скорости). Инкубировали HWB на бане при 37°С в течение 10 мин. Центрифугировали HWB при 500G в течение 8 мин и отбрасывали надосадочный раствор. Добавляли холодный метанол с помощью Tecan Exo 96w для повышения проницаемости клеток. Инкубировали кровяные клетки на льду в течение 30 мин. После этого промывали клетки 2х, используя окрашивающий буфер (554656, Becton Dickinson), центрифугировали при 3000 об/мин в течение 2 мин, отбрасывали надосадочный раствор и добавляли следующие антитела: античеловеческое CD4 РЕ, 1:100 (12-0048, eBioscience), античеловеческое CD33 eFluor® 450,1:50 (48-0337, eBioscience), фосфо-STAT5 (Tyr694) (C71E5) кроличье mAb, 1:100 (Alexa Fluor® 488, конъюгат) (3939, Cell Signalling) и фосфо-STAT3 (Tyr705) (D3A7) ХР™ кроличье mAb 1:200, (Alexa Fluor® 647, конъюгат) (4324, Cell Signalling). Инкубировали антитела в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре, затем промывали клетки 2х и считывали на цитометре Macsquant (Miltenyi Biotec). Получали данные на CD4+ (лимфоциты) и CD4Low CD33Hi (моноциты) для измерения флуоресценции в клетках, экспрессирующих pSTAT3 и pSTAT5 соответственно. Анализировали данные с помощью FlowJo версии 10 и нормировали среднюю флуоресценцию относительно максимального и минимального сигнала для определения значений IC50. Для построения кривых зависимости ответа от дозы использовали программу Graph Pad prism 5.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрировало значение IC50 2,40±0,64 мкМ (n=3) для JAK1 и IC50 13,0±3,2 мкМ (n=3) для JAK2. Полученные результаты демонстрируют, что соединение примера 1 демонстрирует примерно в 5 раз более высокую эффективность в отношении JAK1 по сравнению с JAK2 в анализе цельной крови человека.
Анализ мышиного IVTI (JAK1) pSTAT3.
Цель данного анализа заключалась в измерении способности исследуемых соединений ингибировать фосфорилирование STAT3 (активацию STAT3) в мышиной модели ксенотрансплантата H1975. Клетки H1975 выращивали в соответствии со спецификацией Американской коллекции типовых культур (АТСС) при минимальном возможном количестве пересевов. Выращивали и поддерживали клетки в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и инкубировали при 37°С в 5% CO3. Собирали клетки стандартными способами и смешивали с матрицей базальной мембраны BD Biosciences (MATRIGEL®), чтобы достичь в клеточной суспензии отношения клеток к матрице 1:1, с получением объема для инокуляции 0,2 мл клеток в матричной суспензии, содержащей 5е6 клеток. В течение процедуры инокуляции клеточные суспензии выдерживали на льду и начинали имплантацию в течение 1 ч после сбора клеточной культуры. Все имплантаты вводили подкожно в правый задний бок самок бестимусных голых мышей, приобретенных у компании Harlan. Всех мышей кормили ad libitum кормом Harlan Teklad № 2920Х и обеспечивали воду в гелевых пакетах. Обеспечивали возможность роста имплантированных опухолевых клеток до солидных опухолей и дважды в неделю измеряли вместе с массой тела, начиная через 5-9 дней после имплантации. Объем опухоли определяли по уравнению: 0,536xLxWA2. По достижении объема опухоли около 200-250 мм3, животных рандомизировали, используя многозадачное устройство для блочной рандомизации, и помещали в группу, которую лечили носителем, содержащую 6-10 животных, и в несколько экспериментальных групп, содержащих по 6 животных. Исследуемые соединения составляли в композиции в 1% растворе носителя ГЭЦ, содержащем 0,25% Tween 80 и 0,05% противопенного агента
- 15 033572 с 1,1 мол. экв. метансульфоновой кислоты для in situ образования соли. В контрольную группу, которую лечили носителем, кислоту не добавляли. Дозы рассчитывали на основании последних данных измерения средней массы в группе. Соединения вводили через ротовой зонд для проведения исследований зависимости ответа от дозы и для определения периода действия препарата. Исследования зависимости ответа от дозы проводили посредством введения однократной дозы за 2 ч до извлечения, переработки и замораживания опухоли. Исследования для определения периода действия препарата проводили посредством введения однократной дозы, равной TED70, определенной в исследовании зависимости ответа от дозы.
Переработка опухолевой ткани.
Собирали и разрезали опухоли с получением фрагмента размером около 150-250 м3 и сразу опускали в пробирку размером 12x75 мм, содержащую 1 мл ледяного лизисного буфера MSD Tris (Meso Scale Discovery, кат. № R60TX-2) и 1X HALT (Thermo Scientific, продукт № 1861281). Гомогенизировали образцы в течение примерно 15 с, используя одноразовый наконечник-гомогенизатор образцов для твердых тканей Omni (Omni International, кат. № 3_750Н), и оставляли стоять на влажном льду в течение следующих 15-25 мин, затем переносили в морозильную камеру при -60°С и выдерживали в течение ночи. Вынимали образцы из морозильной камеры и оставляли стоять при комнатной температуре для инициации оттаивания. Как только образцы начинали таять, их переносили на влажный лед и продолжали оттаивать. По завершении оттаивания образцы перемешивали на вортексе и переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 мл. Центрифугировали лизаты при 14000Xg в течение 30-60 мин при 4°С. Переносили лизаты (200 мкл) в 96-луночный полипропиленовый планшет (Costar, кат. № 3879). Определяли концентрацию белка с помощью набора для анализа белка Pierce BCA (кат. № 23225), как описано ниже. Вкратце, вычерчивали стандартную кривую, используя стандарт BSA, разбавленный в лизисном буфере RIPA, содержащем 1X HALT, с получением рабочего диапазона от 2000 до 25 мкг/мл. Все лизаты разбавляли 1:10 в лизисном буфере RIPA, содержащем 1X HALT. Отбирали пипеткой 25 мкл стандартных и экспериментальных образцов в 96-луночный планшет (Falcon, кат. № 353072) и добавляли 200 мкл рабочего реагента в каждую лунку и тщательно перемешивали планшет на встряхивателе для планшета в течение 30 с. Планшет закрывали и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Планшет охлаждали до комнатной температуры и измеряли поглощение при 562 нм или около указанного значения с помощью прибора Molecular Devices Spectra Max. Концентрации белка для каждого образца определяли с помощью программного обеспечения SoftMax Pro 6.3. После количественного анализа образов опухоли замораживали лизаты при -80°С в 96-луночном полипропиленовом планшете и анализировали позже.
Измерение pSTAT3.
Анализ pSTAT3 (Tyr705) проводили следующим образом.
Использовали аналитический набор pSTAT3 MSD производства компании Meso Scale Discovery (кат. № K150DID-2). Вместо набора ингибиторов фосфатазы и протеазы можно использовать 100Х ингибиторы протеазы и фосфатазы HALT на основании простоты применения и проведения работы. Получали лизисный буфер MSD Tris, добавляя 100Х ингибитора протеазы и фосфатазы HALT до 1X конечной концентрации, который обозначали как полный лизисный буфер MSD. Вынимали образцы опухоли из морозильной камеры при -80°С и оставляли стоять при комнатной температуре для инициации оттаивания. Во время оттаивания образцов блокировали накопительный планшет с pSTAT3 Tyr705 (кат. № K150DID-2) с помощью 150 мкл блокирующего раствора в течение не менее 1 ч при комнатной температуре на встряхивателе для планшетов при энергичном встряхивании (300-1000 об/мин). Перед встряхиванием закрывали планшеты клейкой крышкой планшета. Блокирующий раствор имел отношение Blocker А (кат. № R93BA-4) 600 мг : 20 мл 1X промывочного буфера MSD Tris (кат. № R61TX-2). Как только образцы начинали таять, их переносили на влажный лед и продолжали оттаивать. По завершении оттаивания слегка перемешивали смесь в пипетке, используя многоканальную пипетку. Нормализовали образцы в ледяном полном лизисном буфере MSD до концентрации белка 0,4 мкг/мл X 100 мкл. Выдерживали все нормализованные образцы опухоли на льду в 96-луночном полипропиленовом планшете до их добавления в накопительный планшет pSTAT3. После блокирования накопительного планшета pSTAT3 промывали 4Х, используя 250-300 мкл 1X промывочного буфера MSD Tris, используя устройство для промывания планшетов Multidrop 384 компании Thermo Labsystems. После последнего промывания планшет слегка постукивали для удаления оставшегося промывочного буфера. Добавляли общий объем 25 мкл (10 мкг) нормализованного лизата опухоли на лунку и инкубировали еще 2-3 ч при комнатной температуре на встряхивателе для планшетов при энергичном встряхивании (300-1000 об/мин). Во время инкубации разбавляли детекторное антитело антифосфо-STAT 3 с меткой сульфо-TAG, которое представлено в указанном наборе в буфере для разбавления антитела (1 мл блокирующего раствора, смешанного с 2 мл 1X промывочного буфера MSD), добавляя 60 мкл детекторного антитела антифосфо-STAT3 с меткой сульфо-TAG к 2,94 мл буфера для разбавления антитела. Полученный раствор антитела выдерживали на влажном льду до использования. После инкубации лизата опухоли промывали планшет 4Х, используя 250-300 мкл 1X промывочного буфера MSD Tris. После последнего промывания постукивали планшет для удаления оставшегося промывочного буфера и добавляли 25 мкл/лунку детекторного анти
- 16 033572 тела антифосфо-БТАТЗ с меткой Sulfo-TAG. Инкубировали планшет еще 1 ч при комнатной температуре на встряхивателе для планшетов при энергичном встряхивании (300-1000 об/мин). Во время инкубации разбавляли 4Х считывающий буфер Т MSD с поверхностно-активным веществом (кат. № R92TC-3) до 1X, используя деионизированную воду, и выдерживали при комнатной температуре. По завершении инкубации детекторного антитела промывали планшет 4Х, используя 250-300 мкл 1X промывочного буфера MSD Tris. После последнего промывания слегка постукивали планшет для удаления оставшегося промывочного буфера и добавляли общий объем 150 мкл/лунку 1X считывающего буфера Т MSD с поверхностно-активным веществом. Считывали планшет на приборе Meso Quick Plex SQ 120. Анализировали данные, как описано ниже.
Расчет процентного ингибирования pSTAT3.
Копировали и вставляли исходные данные планшета из Meso Quick Plex SQ 120 непосредственно на рабочий лист Microsoft Excel версии 2010. Систематизировали данные в подходящем формате (зависимость ответа от дозы или период действия), копировали и вставляли непосредственно в программу JMP версии 11 для расчета процентного ингибирования pSTAT3 (см. приведенную ниже формулу).
|[1 - (сигнал обработанного образца / средний сигнал контрольного образца с носителем)] * 100.
Определяли среднее значение в экспериментальной группе с помощью одностороннего дисперсионного анализа и сравнивали со средним значением в контрольной группе с носителем, используя критерий Даннетта.
Расчеты TED.
Определяли значения TED50 и TEC50 на основании исследования зависимости ответа от дозы. TED50 представляет собой дозу, необходимую для достижения 50% ингибирования pSTAT3, a TEC50 представляет собой концентрацию в плазме для достижения 50% ингибирования pSTAT3, соответственно, через 2 ч.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрировало значение TED50 3 5 мг/кг и TEC50 11,1 мкМ (n=1). Полученные результаты демонстрируют, что соединение примера 1 эффективно ингибирует передачу сигналов JAK1-STAT3 (с применением pSTAT3 в качестве считываемого параметра) in vivo через 2 часа после перорального введения дозы. Полученные результаты демонстрируют, что соединение примера 1 также имеет ФК/ФД активность, коррелирующую с TEC50.
Анализ крысиного IVTI (JAK1) pSTAT3.
Цель данного анализа заключалась в измерении способности исследуемых соединений ингибировать экспрессию pSTAT3 в крысиной модели ксенотрансплантата H1975. Клетки H1975 выращивали в соответствии со спецификацией Американской коллекции типовых культур при минимальном возможном количестве пересевов. Выращивали и поддерживали клетки в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и инкубировали при 37°С в 5% СО2. Собирали клетки стандартными способами и смешивали с матрицей базальной мембраны BD Biosciences (MATRIGEL®) для достижения отношения клеток к матрице 1:1, с получением объема для инокуляции 0,2 мл клеток в матричной суспензии, содержащей 2е6 клеток. В течение процедуры инокуляции клеточные суспензии выдерживали на льду, и начинали имплантацию в течение 1 ч после сбора клеточной культуры. Все имплантаты вводили подкожно в правый задний бок самок голых крыс NIH, приобретенных у компании Taconic. Всех крыс кормили ad libitum кормом Harlan Teklad Global Diets № 2920X и обеспечивали водой из бутылок. Обеспечивали возможность роста имплантированных опухолевых клеток до солидных опухолей и дважды в неделю измеряли вместе с массой тела. Измерение массы тела и объема опухоли начинали на 5-9 день после имплантации. Объем опухоли определяли по уравнению 0,536xLxWA2. По достижении объема опухоли около 350-400 мм3, животных рандомизировали, используя многозадачное устройство для блочной рандомизации и помещали в группу, которую лечили носителем, содержащую 6 животных, и в несколько экспериментальных групп, содержащих по 6 животных. Исследуемые соединения составляли в композиции в 1% растворе носителя ГЭЦ, содержащем 0,25% Tween 80 и 0,05% противопенного агента с 1,1 мол.экв. метансульфоновой кислоты для in situ образования соли (1,1 мл 1н. раствора метансульфоновой кислоты на 1 мг соединения). В контрольную группу, которую лечили носителем, кислоту не добавляли. Дозы рассчитывали на основании последних данных измерения средней массы в группе. Все соединения вводили через ротовой зонд для проведения исследований зависимости ответа от дозы и для определения периода действия препарата. Исследования зависимости ответа от дозы проводили посредством введения однократной дозы за 2 ч до извлечения, переработки и замораживания опухоли. Исследования для определения периода действия препарата проводили посредством введения однократной дозы, равной TED70, определенной в исследовании зависимости ответа от дозы. В нескольких временных точках проводили удаление, переработку и замораживание опухоли, как описано ниже.
Переработка опухолевой ткани.
Собирали и разрезали опухоли с получением фрагментов размером около 200-250 м3 и сразу опускали в пробирку размером 12x75 мм, содержащую 1 мл ледяного лизисного буфера MSD Tris (Meso Scale Discovery, кат. № R60TX-2) и 1X HALT (Thermo Scientific, продукт № 1861281). Гомогенизировали об
- 17 033572 разцы в течение около 15 с, используя одноразовый наконечник-гомогенизатор образцов для твердых тканей Omni (Omni International, кат. № 3_750Н) и оставляли стоять на влажном льду в течение следующих 15-25 мин, затем переносили в морозильную камеру при -60°С и выдерживали в течение ночи. Вынимали образцы из морозильной камеры и оставляли стоять при комнатной температуре для инициации оттаивания. Как только образцы начинали таять, их переносили на влажный лед и продолжали оттаивать. По завершении оттаивания образцы перемешивали на вортексе и переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 мл. Центрифугировали лизаты при 14000Xg в течение 30-60 мин при 4°С. Переносили лизаты (200 мкл) в 96-луночный полипропиленовый планшет (Costar, кат. № 3879) в соответствии с дизайном 96-луночной матрицы образцов. Определяли концентрацию белка с помощью набора для анализа белка Pierce ВСА (кат. № 23225), как описано ниже. Вкратце, вычерчивали стандартную кривую, используя стандарт BSA, разбавленный в лизисном буфере RIPA, содержащем 1X HALT, с получением рабочего диапазона от 2000 до 25 мкг/мл. Все лизаты разбавляли 1:10 в лизисном буфере RIPA, содержащем 1X HALT. Отбирали пипеткой 25 мкл стандартных и экспериментальных образцов в 96луночный планшет (Falcon, кат. № 353072) и добавляли 200 мкл рабочего реагента в каждую лунку и тщательно перемешивали планшет на встряхивателе для планшета в течение 30 с. Планшет закрывали и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Планшет охлаждали до комнатной температуры и измеряли поглощение при 562 нм или около указанного значения с помощью прибора Molecular Devices Spectra Max. Концентрации белка для каждого образца определяли с помощью программного обеспечения SoftMax Pro 6.3. После количественного анализа образы опухоли замораживали при -80°С в 96-луночном полипропиленовом планшете и анализировали позже.
Измерение pSTAT3.
Анализ pSTAT3 (Tyr705) проводили следующим образом.
Использовали аналитический набор pSTAT3 MSD производства компании Meso Scale Discovery (кат. № K150DID-2). Вместо набора ингибиторов фосфатазы и протеазы можно использовать 100Х ингибиторы протеазы и фосфатазы HALT на основании простоты применения и проведения работы. Использовали все остальные реагенты из набора. Получали лизисный буфер MSD Tris, добавляя 100Х ингибитора протеазы и фосфатазы HALT до 1X конечной концентрации (обозначенный как полный лизисный буфер MSD). Вынимали образцы опухоли из морозильной камеры при -80°С и оставляли стоять при комнатной температуре для инициации оттаивания. Во время оттаивания образцов блокировали накопительный планшет с pSTAT3 Tyr705 (кат. № K150DID-2) с помощью 150 мкл блокирующего раствора в течение не менее 1 ч при комнатной температуре на встряхивателе для планшетов при энергичном встряхивании (300-1000 об/мин). Перед встряхиванием закрывали планшеты клейкой крышкой планшета. Блокирующий раствор должен иметь отношение Blocker A (кат. № R93BA-4) 600 мг: 20 мл 1X промывочного буфера MSD Tris (кат. № R61TX-2). Как только образцы начинали таять, их переносили на влажный лед и продолжали оттаивать. По завершении оттаивания слегка перемешивали смесь в пипетке, используя многоканальную пипетку. Нормализовали образцы в ледяном полном лизисном буфере MSD до концентрации белка 0,4 мкг/мкл X 100 мкл. Выдерживали все нормализованные образцы опухоли на льду в 96-луночном полипропиленовом планшете до их добавления в накопительный планшет pSTAT3. После блокирования накопительного планшета pSTAT3 промывали 4Х, используя 250-300 мкл 1X промывочного буфера MSD Tris, используя устройство для промывания планшетов Multidrop 384 компании Thermo Labsystems. После последнего промывания планшет слегка постукивали для удаления оставшегося промывочного буфера. Добавляли общий объем 25 мкл (10 мкг) нормализованного лизата опухоли на лунку и инкубировали еще 2-3 ч при комнатной температуре на встряхивателе для планшетов при энергичном встряхивании (300-1000 об/мин). Во время инкубации разбавляли детекторное антитело антифосфо-STAT3 с меткой сульфо-TAG, которое представлено в указанном наборе в буфере для разбавления антитела (1 мл блокирующего раствора, смешанного с 2 мл 1X промывочного буфера MSD), добавляя 60 мкл детекторного антитела антифосфо-STAT3 с меткой сульфо-TAG к 2,94 мл буфера для разбавления антитела. Полученный раствор антитела выдерживали на влажном льду до использования. После инкубации лизата опухоли промывали планшет 4Х, используя 250-300 мкл 1X промывочного буфера MSD Tris. После последнего промывания слегка постукивали планшет для удаления оставшегося промывочного буфера и добавляли 25 мкл/лунку детекторного антитела антифосфо-STAT3 с меткой SulfoTAG. Инкубировали планшет еще 1 ч при комнатной температуре на встряхивателе для планшетов при энергичном встряхивании (300-1000 об/мин). Во время инкубации разбавляли 4Х считывающий буфер Т MSD с поверхностно-активным веществом (кат. № R92TC-3) до 1X, используя деионизированную воду, и выдерживали при комнатной температуре. По завершении инкубации детекторного антитела промывали планшет 4Х, используя 250-300 мкл 1X промывочного буфера MSD Tris. После последнего промывания слегка постукивали планшет для удаления оставшегося промывочного буфера и добавляли общий объем 150 мкл/лунку 1X считывающего буфера Т MSD с поверхностно-активным веществом. Считывали планшет на приборе Meso Quick Plex SQ 120. Анализировали данные, как описано ниже.
Расчет процентного ингибирования pSTAT3.
Копировали и вставляли исходные данные планшета из Meso Quick Plex SQ 120 непосредственно на
- 18 033572 рабочий лист Microsoft Excel версии 2010. Систематизировали данные в подходящем формате (зависимость ответа от дозы или период действия). Копировали и вставляли непосредственно в программу JMP версии 11 для расчета процентного ингибирования pSTAT3 (см. приведенную ниже формулу).
|[1 - (сигнал обработанного образца / средний сигнал контрольного образца с носителем)] * 100.
Определяли среднее значение в экспериментальной группе с помощью одностороннего дисперсионного анализа и сравнивали со средним значением в контрольной группе с носителем, используя критерий Даннетта.
Расчеты TED.
Определяли значения TED50 и TEC50 на основании исследования зависимости ответа от дозы. TED50 представляет собой дозу, необходимую для достижения 50% ингибирования pSTAT3, a TEC50 представляет собой концентрацию в плазме, необходимую для достижения 50% ингибирования pSTAT3, соответственно, через 2 ч.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрировало значение TED50 9 мг/кг и TEC50 3,9 мкМ (n=1). Полученные результаты демонстрируют, что соединение примера 1 поражает мишень в крысиной модели IVTI Н1975.
Исследование эффективности в модели ксенотрансплантата опухоли НСС827.
Цель данного анализа заключалась в измерении способности соединений ингибировать рост опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата НСС827. Клетки НСС827 (АТСС № CRL-2868, партия № 59392891) выращивали в соответствии со спецификацией Американской коллекции типовых культур при минимальном возможном количестве пересевов. Выращивали и поддерживали клетки в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и инкубировали при 37°С в 5% СО2. Собирали клетки из колб с помощью TryPLE, дважды промывали в DPBS, повторно суспендировали в HBSS и смешивали с матрицей базальной мембраны BD Biosciences (MATRIGEL®), чтобы достичь в клеточной суспензии отношения клеток к матрице 1:1, с получением объема для инокуляции 0,2 мл клеток в матричной суспензии, содержащей 5е6 клеток. В течение процедуры инокуляции клеточные суспензии выдерживали на льду и начинали имплантацию в течение 1 ч после сбора клеточной культуры. Имплантаты вводили подкожно в правый задний бок самок мышей СВ17 SCID, приобретенных у компании Harlan (18-20 г). Мышей кормили ad libitum кормом Harlan Teklad Protein Extruded 2920X и обеспечивали доступ к воде в подвесной поилке. Обеспечивали возможность роста имплантированных опухолевых клеток до солидных опухолей и дважды в неделю измеряли вместе с массой тела, начиная с седьмого дня после имплантации. Объем опухоли определяли по уравнению: 0,536xLxWA2. По достижении объема опухоли около 150-200 мм3 животных рандомизировали и распределяли на группы, содержащие по 5-8 животных. Исследуемые соединения составляли в композиции в 1% растворе носителя ГЭЦ, содержащем 0,25% Tween 80 и 0,05% противопенного агента с 1,1 мол.экв. метансульфоновой кислоты для in situ образования соли (1,1 мл 1н. раствора метансульфоновой кислоты на (вставьте молекулярную массу) 1 мг соединения). Хранили исследуемое соединение при комнатной температуре. Один раз в неделю составляли композиции соединения и хранили при комнатной температуре. В контрольную группу, которую лечили носителем, кислоту не добавляли. Дозы рассчитывали на основании последних данных измерения средней массы в группе. Вводили соединения через ротовой зонд в течение 28 дней по схеме BID (два раза в сутки) или QD (один раз в сутки), в зависимости от дозы.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрировало ингибирование роста опухоли на 31% в дозе 30 мг/кг BID, регрессию опухоли на 22% в дозе 60 мг/кг BID и регрессию опухоли 22% в дозе 120 мг/кг QD. Полученные результаты демонстрируют, что соединение примера 1 приводит к регрессии опухоли в модели ксенотрансплантата опухоли НСС827.
Claims (10)
1. Соединение, выбранное из группы, состоящей из
F,C .ОН
NH
HN
СН3
- 19 033572 или его фармацевтически приемлемой соли и
или его фармацевтически приемлемой соли.
2. Соединение по п.1, представляющее собой
или его фармацевтически приемлемую соль.
3. Соединение по п.1, представляющее собой
4. Фармацевтическая композиция для ингибирования Янус-киназы 1 (JAK1), содержащая соединение или соль по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомога тельное вещество.
5. Применение соединения или его соли по любому из пп.1-3 для лечения рака путем ингибирования JAK1.
6. Применение по п.5, отличающееся тем, что рак выбран из группы, состоящей из рака легкого, включая немелкоклеточный рак легкого и аденокарциному легкого, аденокарциномы, гепатоцеллюлярной карциномы, включая гепатоцеллюлярную карциному жителей Азии, колоректального рака, рака молочной железы и лейкоза, включая острый лимфоцитарный лейкоз.
7. Применение по п.6, отличающееся тем, что рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого.
8. Применение по п.6, отличающееся тем, что рак представляет собой аденокарциному легкого.
9. Применение по п.6, отличающееся тем, что рак представляет собой рак молочной железы.
10. Применение по п.6, отличающееся тем, что рак представляет собой гепатоцеллюлярную карциному жителей Азии.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562200684P | 2015-08-04 | 2015-08-04 | |
PCT/US2016/044410 WO2017023672A1 (en) | 2015-08-04 | 2016-07-28 | 4-(3-pyrazolylamino)-benzimidazole compounds and their use as jak1 inhibitors |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201792676A1 EA201792676A1 (ru) | 2018-07-31 |
EA033572B1 true EA033572B1 (ru) | 2019-11-06 |
Family
ID=56618268
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201792676A EA033572B1 (ru) | 2015-08-04 | 2016-07-28 | Бензимидазольные соединения в качестве ингибиторов jak1 |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9556153B1 (ru) |
EP (1) | EP3331873B1 (ru) |
JP (1) | JP6470869B2 (ru) |
KR (1) | KR102032792B1 (ru) |
CN (1) | CN108026076B (ru) |
AR (1) | AR105400A1 (ru) |
AU (1) | AU2016302748B2 (ru) |
BR (1) | BR112017028240B1 (ru) |
CA (1) | CA2990471C (ru) |
CY (1) | CY1121909T1 (ru) |
DK (1) | DK3331873T3 (ru) |
EA (1) | EA033572B1 (ru) |
ES (1) | ES2743499T3 (ru) |
HR (1) | HRP20191227T1 (ru) |
HU (1) | HUE047037T2 (ru) |
LT (1) | LT3331873T (ru) |
MA (1) | MA44383B1 (ru) |
MD (1) | MD3331873T2 (ru) |
ME (1) | ME03451B (ru) |
MX (1) | MX2018001306A (ru) |
NZ (1) | NZ738247A (ru) |
PL (1) | PL3331873T3 (ru) |
PT (1) | PT3331873T (ru) |
RS (1) | RS58974B1 (ru) |
SI (1) | SI3331873T1 (ru) |
TW (1) | TW201718555A (ru) |
WO (1) | WO2017023672A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA038129B1 (ru) | 2016-07-14 | 2021-07-09 | Эли Лилли Энд Компани | Производные пиразолиламинобензимидазола в качестве ингибиторов jak |
GB201717260D0 (en) * | 2017-10-20 | 2017-12-06 | Galapagos Nv | Novel compounds and pharma ceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory disorders |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015110378A1 (en) * | 2014-01-23 | 2015-07-30 | Galapagos Nv | Benzimidazole derivatives and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory disorders |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013025628A1 (en) * | 2011-08-15 | 2013-02-21 | Ligand Pharmaceuticals Incorporated | Janus kinase inhibitor compounds and methods |
WO2013188184A1 (en) * | 2012-06-14 | 2013-12-19 | Eli Lilly And Company | Inhibitor of jak1 and jak2 |
-
2016
- 2016-07-20 AR ARP160102192A patent/AR105400A1/es unknown
- 2016-07-21 TW TW105123089A patent/TW201718555A/zh unknown
- 2016-07-28 EP EP16750326.7A patent/EP3331873B1/en active Active
- 2016-07-28 LT LTEP16750326.7T patent/LT3331873T/lt unknown
- 2016-07-28 ME MEP-2019-196A patent/ME03451B/me unknown
- 2016-07-28 HU HUE16750326A patent/HUE047037T2/hu unknown
- 2016-07-28 EA EA201792676A patent/EA033572B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2016-07-28 DK DK16750326.7T patent/DK3331873T3/da active
- 2016-07-28 US US15/221,649 patent/US9556153B1/en active Active
- 2016-07-28 PT PT16750326T patent/PT3331873T/pt unknown
- 2016-07-28 RS RS20190876A patent/RS58974B1/sr unknown
- 2016-07-28 MA MA44383A patent/MA44383B1/fr unknown
- 2016-07-28 WO PCT/US2016/044410 patent/WO2017023672A1/en active Application Filing
- 2016-07-28 CA CA2990471A patent/CA2990471C/en active Active
- 2016-07-28 PL PL16750326T patent/PL3331873T3/pl unknown
- 2016-07-28 JP JP2018502720A patent/JP6470869B2/ja active Active
- 2016-07-28 SI SI201630314T patent/SI3331873T1/sl unknown
- 2016-07-28 BR BR112017028240-2A patent/BR112017028240B1/pt active IP Right Grant
- 2016-07-28 MX MX2018001306A patent/MX2018001306A/es active IP Right Grant
- 2016-07-28 CN CN201680045255.7A patent/CN108026076B/zh active Active
- 2016-07-28 NZ NZ738247A patent/NZ738247A/en unknown
- 2016-07-28 ES ES16750326T patent/ES2743499T3/es active Active
- 2016-07-28 AU AU2016302748A patent/AU2016302748B2/en active Active
- 2016-07-28 MD MDE20180584 patent/MD3331873T2/ro unknown
- 2016-07-28 KR KR1020187003079A patent/KR102032792B1/ko active IP Right Grant
-
2019
- 2019-07-08 HR HRP20191227TT patent/HRP20191227T1/hr unknown
- 2019-08-16 CY CY20191100882T patent/CY1121909T1/el unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015110378A1 (en) * | 2014-01-23 | 2015-07-30 | Galapagos Nv | Benzimidazole derivatives and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory disorders |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2692766C1 (ru) | Пролекарства пиридонамидов, применяемые в качестве модуляторов натриевых каналов | |
JP7348906B2 (ja) | フェロトーシス誘導活性を有する化合物およびそれらの使用方法 | |
EA037419B1 (ru) | Соединения 1-тетрагидропиранилкарбонил-2,3-дигидро-1h-индола для лечения рака | |
CA3144859A1 (en) | Quinazolin-4-one derivatives useful for the treatment of braf-associated diseases and disorders | |
JP2018513173A (ja) | Syk阻害剤を用いた慢性移植片対宿主病の処置 | |
CA3186343A1 (en) | 4-oxo-3,4-dihydroquinazolinon compounds for the treatment of braf-associated diseases and disorders | |
HUE033711T2 (en) | Preparations and methods for treating alcohol related disorders, pain and other diseases | |
US20190084988A1 (en) | Wdr5 inhibitors and modulators | |
EA033572B1 (ru) | Бензимидазольные соединения в качестве ингибиторов jak1 | |
CN109476643B (zh) | 作为jak抑制剂的吡唑基氨基苯并咪唑衍生物 | |
JP2024522184A (ja) | Setd2阻害剤との併用療法 | |
WO2021041536A1 (en) | Benzimidazole and hydrogenated carbazole derivatives as gpx4 inhibitors | |
US20210145840A1 (en) | T-cell lymphoma treatments | |
UA126452C2 (uk) | Похідні ізоіндолу | |
RU2774952C2 (ru) | Соединения | |
JPWO2021168313A5 (ru) | ||
RU2811402C2 (ru) | Пролекарства пиридонамидов, применяемые в качестве модуляторов натриевых каналов |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |